PT95065A - Processo para a sintese enzimatica de componentes glicoproteicas galactosiladas - Google Patents

Description

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Descrição da patente de invenção de HOECHST AKTIENGESEL-LSCHAFT, alemã, industrial e comercial/ com sede em D-6230 Franlcfurt am Main 80, Repú-buica Federal Alemã, (inventores? Prof. Dr. Joachim Thiem e Torsten Wiemann, residentes na Alemanha Ocidental), para "PROCESSO PARA A SINffiSS ENZIMÁTICA DE COMPONENTES GLI-CO PROTEICAS GALACTO SI LAPAS "

Doscrição

As glicoproteinas desempenham um papel central nos processos biológicos de reconhecimento, tais como na génese tumoral, nas infecções bacterianas e virais, no reconhecimento célula-célula, no crescimento celular e na diferenciação celular. C0nsfcituem a base da classificação dos grupos sanguíneos e são responsáveis pela internaiização de diferentes compostos macro-moleculares e medicamentos, um importante campo de utilização das glicoproteinas e, portanto, por exemplo a direcção selectiva de fármacos contra os órgãos em objectivo, bem como a protecção de medicamentos contra a catabolização proteolítica (N. Sharon, H. Lis, Qhem. Eng. News 59 (13) (1981) 21; H. Schachter, Clinicar Bioche- mistry Γ7, (1984) 3).

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Consoante o tipo de ligação entre o componente peptídica e a componente de hidrato de carbono, as glicoproteinas são divididas em glicoproteinas O-glicosidi-cas e N-glicosidicas. Estas ultimas apresentam como unidade central de ligação quase exclusivamente uma ligação de N--acetilglucosamina com asparagina. No contexto das funçSes das glicoproteinas anteriormeate referidas, a síntese de aspartil-N-acetilglucosaminas glicosiladas detem uma importância especial. A síntese de tais componentes glicopro-teicas com enzimas que seguem in vitrò a via da biosintese de tais substâncias tem a vantagem da elevada estereo-sele-tividade e selectividade regional, bem como de evitar o recurso a uma dispendiosa química de grupos de protecção, assegurando-se assim na maior parte dos casos um bom rendimento em comparação com a síntese quimiaacomposta por numerosos passos. A galactosil-transferase (SC 2.4.1.22) transfere a galactose para a N-acetilglucosamina de forma estereo e regionalmente específica, formando-se uma ligação |3(1 4). Substratos jfaturais da galactosil-transferase são a glucose, que no entanto apenas é aaceite pelo enzima na presença de α-lactalbumina, bem como N-glicoproteinas com N--acetilglutosamina no final da molécula.

Reacções do enzima com substratos não naturais são descritas nas seguintes publHicaçães: \ 1. H.Ai Nunez, R. Barker : Biochemistry 19, 489 (1980) 2. J. Ihiem, W. Treder, T. Wiemmann i Dechema Biotechnologi Conferences, Vol. 2, 189 (1988); Editor: D. Behrens, VCH-Verlagsgesellchaft, Weinheim 3. C. Auge, S. David, C. Hathieu, G. Gautheron: Tetraftedron Lett. 25, 1467 (1984) 4. u. Zehavi, M. Herchman: Carbohidr. Res. 128, 16o (1984) - 2 -

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5. TJ. Zehavi, S. Saci eh, M. Herchman: Carbohydr. Res. 124 23 (1983) 6. U. Zehavi, M. Herchmaní Garbohydr. Res. 133, 339 (1984) 7. C. Auge, C. Mathieu, G. Merienneí Carbohydr. Res. 151, 147 (1986) 8. M.M.Palcic, O.P. Srivastava, O. Hindsgaul: Carbohydr.

Res. 159, 315 (1987).

Os sacarídeos ou oligossacarideos são aqui transformados com glucose ou então com N-acetil-glu-cosamina no topo terminal, com o auxílio do enzima, Glico--conjugados de aminoácidos e hidratos de carbono, em especial os respectivos derivados da asparagina, não foram ate agora utilizados como substratos.

Descoforiu-se agora que a galactosil--transferase também permite a síntese das glico-asparaginas das formulas gerais I e II, podendo a parte não galactosí-dica ser primeiro sintetizada quimicamente através da combinei· ção de métodos conhecidos.

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-Asn (i) surge na sua forma completa/ portanto na sua forma também bloqueada na componente aminoácidO/ na urina de doentes que sofrem de aspartil-glucosiminil-ureia (R. J. Pllitt/ K. M. Pretty, Biochem. J. 141 (1974), 141). A Gal-β(1““^ 4)-GlcNAc-β(1-N)-L-Asn (II) encontra-se na membrana dos eritroeitos. Foi sugerida a hipótese de constituir ai o local receptor da robinia--lectina (A. M. Leseney, R. Bourrillon/ S. Kornfeld, Arch. Biochem. Biophys. 153/ (1972) 831).

A presente invenção refere-se portanto a um processo para a preparação enzimatica de compostos com a fórmula geral I acima referida, ou de compostos com a fórmula geral II acima referida, caracterizado por se incubar um composto da fórmula geral III ou um composto da fórmula geral IV

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com uma galactosil-transferase, na presença de um dador de galactosilo.

Em seguida explicita-se pormenorizadamente a presente invenção e serão definidas as suas reivindicações, A galáGtosil-transferase, por exemplo EC 2.4.1.22, aceita as glico-asparginas das fórmulas III e IV como substratos, que são galactosilados na posição β(1—^ 4) da componente terminal N-acetil-glucosamina. Como dador de galactose, o enzima necessita de uridina-5'-difosfato-galac-tose (UDP-Gal) Egte açúcar nucletídeo é, no entanto, bastante caro, e é pois mais vantajosa a sua formação in situ, a partir de uridina-5’-difosfato-glucose (UDP-Glc) numa reac-ção catalizada pelo enzima uridina-51-difosfato-galactose-4--epimerase (SC 5.1.3.2).

Para preparação dos compostos das fórmulas gerais I ou II, os s ubstratos de partida das fórmulas III ou IV acima referidos -são tratados com galactosil-transferase em solução aquosa, junto com um dador de galactosilo, como por exemplo UDP-Gal. Os substratos de partida e o dador de galactosilo são utilizados respectivamente em concentrações equimolares, de preferência numa quantidade lo ou 15 molar. A galactosil-transferase comercializada pode ser aplicada na sua forma solúvel ou imobilizada. Quando se imobiliza dá-se preferência à silicagel como suporte, em especial por motivos de ordem eeonómica. A reacção é realizada de preferência numa solução tamponada. Como tampão utiliza-se de preferen- 5

cia cacodilato de sódio. A temperatura de incubação pode situar-se, de acordo com os limites de temperatura/actividade do enzima, dentro de limites bastante latos. De preferência a reacção e realizada a 32-37°C.

Tal como foi referido anteriormente, a reacção a que se refere a presente invenção pode ser realizada através do chamado "método contínuo", iniciando-se com a preparação de UDP-Gal a partir de UDP-Glc com o auxílio de uridina-5,-difosfato-galactose-4-epimerase# P©r "método contínuo" compreende-se que todos os substratos envolvidos bem como todos os enzimas envolvidos sejam introduzidos numa única mistura de reacção. Como é óbvio, a preparação de UDP-Gal a partir de UDP-Glc e a preparação dos compostos das formulas gerais I ou II podem também ser realizados uma a seguir à outra. No entanto, e mantendo os parâmetros de reacção acima descritos, o "método contínuo" revelou-se mais económico. A detecção da evolução da reacção faz—se por cromatografia em camada fina. A separação dos compostos finais faz-se após eliminação dos fosfatos de nucleotideo através de cromatografia com resinas de permuta iónica, como por exemplo com Dowex 1-X8 (contra-iãos Cl”), e cromatografa--se em gele, por exemplo com Bio-Gel P2, conseguindo-se um rendimento de 25-35%.

De acordo com os trab alhos de diferentes autores, os receptores de galactosilo das fórmulas III e IV, podem ser sintetizados quimicamente (D.E. Cowley, L. Hough, C. M. Peach, Carbohydr. Res. 19, (1971) 231; M. Spinola, R. W. Jeanloz, J. Biol. Chem. 245 (1970) 4158; H. Kunz, H. Waldmann, Angew. Chem. 92 (1985) 885).

No caso da aspartil-N-acetil-glucosami-na da fórmula III, a N-acetil-glucosamina é transformada com cloreto de acetilo no seu α-cloreto peracetilado, que em '- 6 -

seguida é transformada na β-azida por via catalítica de transferência de fases em água/clorofórmio. Após redução com hidrogénio e paládio de modo a obter a β-amina, pode acoplar* -se com N-acetil-asparginato de α-metilo, numa reacção de condensação suportada por etil-2-etóxi-l,2-dihidroquinolina--1-carboxilato (EEDQ), Após des-O-acetilação com metanolato de sódio obtem-se o receptor de galactosilo da fórmula geral III, que tem ainda de ser purificado por cromatografia sobre gel de antes da galactosilação enzimática. â-

Para a sintese das aspartil-chiobiosilami-na da fórmula IV procede-se em primeiro lugar à cisão aceto-lítica da chitina de modo a obter uma mistura de oligómeros, a partir da qual se pode isolar o octacetato de chtobiose atr vés de cromatografia rápida. Este é transformado no cloreto de oe-chitobiosilo peracetilado através de suspensão em cloreto de acetilo e introdução na solução de gás hidroclorídri-co. De acordo com a síntese do composto da fórmula geral III o α-cloreto é transformado com azida de sódio de modo a obter a β-azida, é depois reduzida de modo a obter a β-amina, acoplada com N-acetil-asparaginato de α-metilo e por fim 0--acetilaãa, A aspartil-chiobiosilamina da fórmula geral IV pode, após purificação por cromatografia sobre gel, ser utilizada para a galactosilação enzimática acima descrita.

Seguidamente, a presente invenção é melhor ilustrada com o auxílio de alguns exemplos:

EXEMPLO

1. Processo para galactosilação das glicosil-asparaginas das fórmulas III e IV a) A reacção é realizada em tampão de cacodialto de sódio (25 mM, pH 7,7/, na presença de cloreto de Λα manganAs (5 mM). Após adição de UDP-galactose (13

O mM), glicosilasparigina (III ou IV. 13 mM), albumina 7

sériçade bovino (1 rag/ml) e desoxigenação com azoto, adiciona-se a galactosil-transferase (BC 2.4.1.22, 10 U). Ap fim de dois dias a 37°C, trata-se com resina de permuta aniónica (Dowex 1-X8, forma cloreto) e em seguida purifica-se através de cromatografia sobre gel Bio-Gel P2, b) A reacçlo é realizada em tampão de cacodilato de sódio (25 mM, pH 7,7), na presença de cloreto de manganês (5 mM). Após adição de UDP-glncose (13 mM), glico-silasparagina (III) ou IV, 13 mM), albumina seria de bovino (1 mg/ml) e desoxigenação com azoto, adicionar galactosil-transberase (EG 2.4.1.22, 1 u) e UDP--galactose-4-epimerase (EC.5.1.2.2, 10 u). Passados dois dias a 37°C tratar com resina de permuta aniónica (Dowex 1-X8, forma cloreto) e em seguida purifica através de cromatografia sobre gel Bio-Gel P2. 1.1) 2-Acetamido-4-0-.(p-D-galactopiranosil)-l-N- (N-acetil-l-metil-4^-L-aspartil) -2-desóxi-j3~D-glu-copiranosilamina (I)

Tomasi 64,5 mg (100 /umol) ODP-Gal

39 mg (100 ,umol) de composto da fórmula III

Controle por CCF : eluente n-propanol / ácido acético/ / água 85:12:3 0,08 valores de Rf : GlcNAc-Asn (III) 0,22 Gal-GlcNaCSAsn (IV)

Rendimento : 20 mg (35%) i

Dados seleccionados da “H-RMN (300 MHz, DgO)s S « 5,06 (â, 1H, H-l); 4,40 (d, 1H, H-l'); 2.95 (dd, 1H, Φ -Asn); 2/q2 (d<3, 1H, f^-Asn) > 2 “ 9#4/ Ji«2' s * 7'6? Jcc.p = 5/55; σβ.β· = 17,lí Ja.p' = 7/63 Hz* 1. 2) 2-Acetamido-4-/"’-2-acetamido-2-desóxi-4- (β-D--galactopiranosil))-β-D-glucopiranosil)-1-N-- (N-acetil-l-metil-4-L-aspartil)-2-desóxi-!p--D-glucopâranosilamina (II) - 8 -

Claims (1)

1. TQmas: 32,0 mg (50 29,0 mg (50 ;amol) UDP-Gal >imol) de composto da fórmula IV Controle por CCF : eluente n-butanol / ácido acético/' / água 2:4:1 valores de Rf: GlcNAc-GINAc-ASN (IV) 0,31 Gal-GlcNAc-GlcNAc-Aèn (II) 0,19 Rendimento: 10 mg (25%) D^dos seleccionados da ^H-RMN (330 MHz, D2O): 5= 5,09 (d, 1H, H-l); 4,62 (d, 1H, H-l'), 4,47 (d/ 1H, H-l"); 2,06, 20 2, 201 (respetivamente s, respectivamente 3H, respectivàmente NAc); J ^ 5 Hz; <1^ | 2^ J^h ^η~Ί»1 Hz» REIVINDICAÇÕES _ lâ _ Processo para a preparaçlo enzimática de compostos da fórmula geral I ou II

   caracterizado por se incubar um composto da fórmula geral III ou um composto da fórmula geral IV OH

   c°2ch3 IV com geiiactosil-transferase, na presença de um dador de galac-tosilo. 2ã - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se utilizar como dador de galactosilo UDP-Gal. 10 3 Processo de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado por a UDP-Gal ser sintetizada a partir de TJDP-Glc, sob catálise da UDP-galactose-4-epimerase. - 4§ - Processo de acordo com uma ou mais das reivindicações 1 a 3, caracterizado por a reacção ser realizada numa solução tamponada. - 5a - Processo de acordo com uma ou mais das reivindicações 1 a 4, caracterizado por a reacção ser realizada a 22-31°Q, A requerente reivindica a prioridade do pedido alemão apresentado em 23 de Agosto de 1989, sob o n2 P 39 27 801.8. Lisboa, 22 de Agosto de 1990

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