PT90816B

PT90816B - Processo para a preparacao de composicoes farmaceuticas contendo analogos de 2',5'-oligoadenilato

Info

Publication number: PT90816B
Application number: PT90816A
Authority: PT
Inventors: Wolfgang Pfleiderer; Robert J Suhadolnik
Original assignee: Univ Temple
Priority date: 1988-06-09
Filing date: 1989-06-09
Publication date: 1994-11-30
Also published as: AU637975B2; EP0716856B1; NZ229422A; IL90499A; JPH03504970A; EP0716856A3; DE68929321D1; CA1335356C; AU3740389A; DK291390A; EP0420872A1; EP0716856A2; WO1989012380A3; DK174025B1; DE68929321T2; WO1989012380A2; PT90816A; DE68927055D1; KR0141684B1; ES2016464A6

Description

DESCRIÇÃO

DA

PATENTE DE INVENÇÃO

N-° 90 816

REQUERENTE: TEMPLE UNIVERSITY - OF THE COMMONWEALTH SYS TEM OF HIGHER EDUCATION, norte-americana , com sede em Philadelphia, Pennsylvania 19122, Estados Unidos da América.

EPÍGRAFE: PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE COMPOSIÇQES

FARMACÊUTICAS CONTENDO ANÁLOGOS DE 2' ,5’-OLIGOADENILATO E DE PREPARAÇÃO DE ANÁLO GOS DE 2' ,5'-OLIGOADENILATO .

INVENTORES: Robert J.Suhadolnik e Wolfgang Pfleiderer.

Reivindicação do direito de prioridade ao abrigo do artigo 4.° da Convenção de Paris de 20 de Março de 1883.

Estados Unidos da América com o n^e.....

204.659 em 09 de Junho de 1988.

INPI. MOQ 113 RF 16732

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6056-13 (CIP) 2 PG processo para a preparação de composições farmacêuticas contendo análogos de 2’,5^l-oligoadenilato e de preparação de análogos de 25·-oligoadenilato para que

TEMPLE UNIVERSITY - OF THE COMMCNWEALTH SYSTEM· OF HIGHER EDUCATION, pretende obter privilégio de invenção em Portugal.

RESUMO

PATENTE NS.. 90 816

O presente invento refere-se ao processo para a preparação de análogos sintéticos de 2‘,5*-oligoadenilato, em que a porção ribosil aglícona e/ou o nucleósido terminal foram mo dificados, e que são agentes terapêuticos eficazes, particularmente contra infecções, por HIV. O presente invento refere -se também ao processo de preparação de composições que compre ende a combinação com um veículo farmacêutico de, pelo menos, um composto de fórmula

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6056-13 (CIP) 2 PG etn que n é um número de la 8, m é O, 1, 2 ou 3, e

R_r Iguais ou diferentes, são seleccionados a partir de hidrogénio, hidroxi, amino, alcoxi ^e -OSi(CHg) ₂C(CHg )₃ , desde que todos os grupos R não sejam hidroxi no mesmo composto, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, estando o agente activo presente na composição numa quantidade de cerca de 0,1 mg a cerca de 200 mg por ml da composição.

A

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6056—13 (CIP) 2 PG

-3MEMÓRIA DESCRITIVA âmbito do invento

O presente invento refere-se ao processo para a preparação de análogos de 2',5*-oligoadenilato, de composiçoes far macêuticas de tais análogos e suas utilizações terapêuticas.

ANTECEDENTES DO INVENTO

A nomenclatura completa da matéria objecto do presente invento envolve termos extremamente longos. É habitual, para os especialistas na matéria, abreviar estes termos duma fõrmu por eles bem conhecida. Estas abreviaturas gerais e habituais são aqui, em seguida, expostas e podem ser utilizadas no texto desta especificação.

ABREVIATURAS

A, adenosina ou adenilato ou adenililo

Cordicepina ou C ou 3*-dA, 3·-desoxiadenosino(3·-desoxiadenilato) ara-A, 9-(^-D-arabinofuranosiladenina

EHNA, eritro-9-(2-hidroxi-3-nonil)adenina

A-3·-amino, 3¹-amino-3·-desoxiadenosina tubercidina, 4-amino-7((^-D-ribofuranosil) pirrolo/72,3-/_Z7pir imidina

3*-dATP, trifosfosfato de 3·-desoxiadenosina

ATP, trifosfato de adenosina

I, inosina ou inosimato ou imosinililo

Xilo-A ou xiloadenosina, 9-(^D-xilofuranosiladenina dCF ou 2 ’ -desoxicof orwicina, (R) — 3-(2-desoxi-(3-D-eritro pentof uranosil) -3,6,7,8-tetra-hidr oltnidazo/~~4,5-d~//^1.3ydiaze pino-8-ol

2-5A ou 2^,,5^,-oligo (A) ou 25 *-oligoadenilato, oligómero de ácido adenílico com ligações 2*,5 *-fosfodiéster e um trifosfato na extremidade 5' análogo de 2',5'-cordicepina ou 2',5'-oligocordicepina, oligómero de ácido 3*-desaxiadenílico com ligações 2·,5·-fosfo

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6056-13 (CIP) 2 PG 7 diéster β um trifosfato na extremidade 5'

2‘,5·—An ou oligómero do núcleo, oligómero de ácido adenílico com ligações 2*,5*-fosfodiéster

2·,5·-Α₃ ou núcleo do trimero de 2',5'-adenilato-adenilil(2*,5 *)adenilil(2',5')adenosina

2‘,5*—A, ou núcleo do tetramero de 2‘,5*-adenilato-ade 4 — nilil(2·,5·)adenilil(2*,5*)adenilil(2»,5'Jadenosina

2‘,5*-3^,c1A₃ ou 2',5‘-C-C-C ou núcleo do trimero de 2’, 5*-cordicepina, 3‘-desoxiadeniliK 2·,5*)3·-desoxiadeniliK 2·, 5*)3'-desoxiadenosina · , 5 · -C-C-C-C ou núcleo do tetramero de 2’,5*-cordicepina , 3·-desoxiadenilil(2 *,5·)3·-desoxiadeniliK 2¹,5’)3 *-deso xiadenilil(2·,5·)3‘-desoxiadenosina · , 5‘-A₃, adenilil(3·,5*)adenilil(3*,5·)adenosina

2‘,5*-I₃ ou núcleo do trimero de 2·,5·-inosina, inosinilil(2·,5·)inosinilil(2‘,5·)inosina

EBV, vírus de Epstein-Barr

EBNA, virus de Epstein-Barr associado com antigénio nu clear precose

HIV, virus de imunodeficiência humana, incluindo HIV-1, HIV-2, e todos os outros subtipos de HIV

HBLV, virus linfotrópico de células B humano

HTLV, virus de leucemia de células T humana, incluindo HTLV-I, HTLV—II e HTLV-III, e todos os outros subtipos de HTLV

IFNCX; interferão rlFN-^A: interferãoocrecombinante

ARN, : ácido ribonucleico de cadeia dupla ac

2*,5·-A-A-Tu, adenilil(2*,5’)adenilil(2·,5*)tubercidina

2*,5·-Tu-Tu-Tu, 2',5·-tubercidilil(2’,5·Jtubercidilil(2 · , 5 · )tuberc idina

2',5‘-A-A-ara-A, adenilil(2·,5')adenilil(2^r,5')ara-A

2’,5*-C-C—A, 3'-desoxiadenilil(2·,5’)3*-desoxiadenili/ (2 *,5·)adenosina

2*,5»-A-C-C, adenilil(2*,5·)3*-desoxiadeniliK 2',5·)3·-desoxiadenosina

2',5* —A—A-C, adenilil(2*,5·)adenilil(2·,5·)3*-desoxiade

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6056-13 (CIP) 2 PG

#5* )nos ina

2*,5*-C-A-C, 3‘-desoxiadenilil(2 ’,5*)adenilil(2* -desoxiadenosina

2·,5»-C-C-A, 3*-desoxiadenilil(2*,5*)3*-desaxiadenilil (2 *,5‘)adenosina

2*,5* -A-C-A, adenilil(2',5·)3'-desoxiadeniliK 2 *,5' ) adenosina

2·₁5·-xilo-A^, xiloadeni111(2·,5»)xiloadenilil(2·,5’) xiloadenosina

2*,5*-xilo—A^, xiloadeni111(2’,5’)xiloadenilil(2 *,5')xiloadenilil(2*,5’)xiloadenosina

Ac, acetilo Bz, benzilo

MMTr, 5*-0-£-metoxitritilo

2* ,5'-tritil-C^^ 5*-0-£-metoxitritil-3·-desoxiadenili/ (2’,5’)3’-desoxiadenilil(2*,5*)3’-desoxiadenosina

2‘,5·-tritil-A₃, 5*-0-£-metoxitritiladenilil(2',5’)ade nilil(2*,5·)adenosina · ,5*-C-C-dCF _t 3 *-desoxiadenilil(2·,5’)3·-desoxiadenilil(2',5*) 2'-desoxicoformicina

2*,5’-A-A-A-3*-amino, adenilil(2*,5’)adenilil(2‘,5*)3* -amino-3*-desoxiadenosina

SiTBD, t-butildimetilsilil ou -Si(CH₃)₂C(CH₃)₃

2* ,5* ^_A(si) ~^A* 3* -O-t-butildimetilsililadenilil(2* ,5’ )-O-t^-butildimetils ililadenilil(2 * ,5' )adenosina

2* ,5*-A-A-A-3*-0-metilo, adenilil(2*,5*)adenilil(2‘,5*/

-0-metiladenosina

2*,5·-A-A-A-3*-0-pentilo, adenilil(2’,5*)adenilil(2*,

5*)-0-pentiladenosina

2*,5*-A-A-A-3*-0-hexilo, adenilil(2*,5')adenilil(2*,5'/ -0-hex ila de n os ina *,5 *-A-A-A-3'-O-heptilo, adenilil(2 *,5 *)adenilil(2 *,

*)3’-O-heptiladenosina

2*,5*-EHNA-A-A, eritro-9-(2-hidroxi-3-nonil)adenilil(2',5 *)adenilil(2¹,5')adenosina

A abreviatura para os compostos “tetrámeros·* compreen69 399

6056-13 (CIP) 2 PG

-6- tf dendo as porções adenililo (A) e 3 *-desoxiadenililo (C) é ilus trada pelo seguinte exemplo:

2',5*-A-A-C-C, adenilil(2‘,5*)adenilil(2*,5')3'-desoxia denilil(2·,5*)3^r-desoxiadenosina.

Com a expansão do conhecimento sobre o estado antiviral induzido pelo interferão, a atenção foi focada sobre a síntese química e enzimática e as propriedades biológicas dos 2*,5·-oligoadenilatos como mediadores da resposta antiviral. 02', 5'-oligo(A) é um componente de um mecanismo de defesa antiviral, natural e de largo espectro, em plantas e animais. A via

2-5A, também conhecida por via 2-5A/RNase L ou sistema antiviral, é largamente aceite como estando envolvida no mecanismo antiviral do interferão, e pode também estar envolvida na regu lação do crescimento celular e diferenciação. De acordo com es sa via, ο 2-5A é sintetizado a partir do ATP pela 2‘,5*-oligoadenilato sintetase //ATP: (2’,5·)oligo(A)-adeniltransferase (EC 2.7.7.19)/7, daqui em diante 2-5A sintetase. O enzima é activado por ARN_dc. 0 2-5A exerce os seus efeitos biológicos ligando-se a e activando o seu único enzima-alvo conhecido, a única endorribonuclease dependente do 2-5A, RNase L. A última cliva ARN ou ARN virai e celular, desse modo inibindo a sínm r tese proteica. Hovanessian e colab., Eur. J. Biochem. 93:515-526 (1979); Kerr e colab., Proc. Natl. Acad. Scl. USA 75:256-260 (1978). Contudo, a meia-vida curta da molécula de 2-5A au têntica em sistemas biológicos é uma desvantagem reconhecida no controlo da replicação virai.

“vírus linfotrópico B humano, também conhecido como virus linfotrópico de células B humano (HBLV), o qual é cara eterizado por um genoma de ADN de cadeia dupla de grande peso molecular, é morfológicamente semelhante a vírus da família do vírus do herpes, mas é prontamente distinguível dos vírus do herpes humanos e de primatas não-humanos conhecidos pelo domínio dos hospedeiros, efeitos biológicos in vitro, característi cas antigénicas e genoma. Salahuddin e colab., Science 234:596 -601 (1986); Josephs e colab., Science 234:601-602 (1986). Obser

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6056-13 (CIP) 2 PG . -,.-rrCÇSS*

-' V-?**

-7- tf <· vou-se que o virus infectava selectivamente células B humanas recentemente isoladas# as quais são convertidas em células mo no- ou binucleadas, grandes e refractárias# com corpos de inclusão nucleares e citoplasmáticos. Suspeita-se que o HBLV se ja a causa de uma síndrome semelhante à mononucleose crónica, caracterizado por fadiga crónica persistente durante mais que um ano.

O virus de imunodeficiência humana (HIV), também conhecido como vírus da leucemia de células T humana III (HTLV -III), o agente etiológico da síndrome de imunodeficiência adquirida, é um retrovírus do tipo D. Tal como em todos os re trovírus, uma característica essencial da replicação do HIV é a transcrição inversa do genoma de ARN de cadeia dupla em ADN, um processo que necessita de uma polimerase de ADN dependente de ARN, a transcriptase inversa. Este enzima é codificado pelo virus e encontra-se associado com o ARN genómico nos viriÕes de HIV maduros. A exclusividade da transcriptase inversa para retrovírus e virus exigindo um passo de transcrição inversa curto, torna a transcriptase inversa o alvo principal para a intervenção terapêutica antiviral, e particularmente antiretroviral.

O que é necessário é um método para controlar o HIV, a fadiga crónica causada pelo HBLV, e outras situações de doença caracterizadas por um defeito na via 2-5A, utilizando compostos que são metabólicamente mais estáveis e activos que o

2-5A autêntico.

SUMáRIO DO INVENTO

De acordo com o presente invento, é fornecido um processo para a preparação de um composto utilizado num método para o tratamento de um mamífero com uma doença caracterizada por um defeito na via 2-5A. 0 método compreende a administração a esse mamifero de, pelo menos, um composto de fórmula:

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6056-13 (CIP) 2 PG

etn que n é um número inteiro positivo de 1 a 8 m é O, 1, 2 ou 3, e cada R, igual ou diferente, é seleccionado a partir de hidrogénio, hidroxi, amino, alquoxi C^-C^ ^e -OSi(CH₃)₂C(CH₃)₃, desde que todos os grupos R não sejam hidroxi no mesmo composto, ou um seu sal farmacêuticamente aceitável.

Preferivelmente, n é de la 3, mais preferivelmente 1 ou 2. O mais preferivelmente, o grupo R no nucleótido terminal

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6C56-13 (CIP) 2 PG

...

_g_ Ço

2* é outro que nao hidroxi, isto é, o nucleótido terminal 2* é outro que não adenosina.

Exemplos de compostos para utilização no método de acor do com o invento incluem os seguintes compostos do núcleo, os seus 5' mono—, di- e trifosfatos correspondentes, e os sais farmacêuticamente aceitáveis de qualquer um deles:

Compostos em que R é seleccionado a partir de hidrogénio e hidroxi :

2’ ,5‘-C-C-C,

2*,5*-A-A-C,

2‘,5*-A-C-C,

2',5»-C-C-A,

2* , 5'-C-A-C,

2‘,5*-C-C—A, e

2’,5'-A-C-A, além das várias combinações de tetrâmeros de A e C, incluindo mas não estando limitadas a,

2* ,5»-A-A-A-C

2' ,5*-A-A-C-C

2’,5'-A-A-C-A, e similares.

Compostos em que R é seleccionado a partir de hidroxi e alquoxiC^-C₁₀, em particular alquoxiC₁~C₇, tais como:

2',5*-A-A-A-3‘-O-metilo *,5‘-A-A-A-3 *-O-pentilo

2‘,5*-A-A-A-3·-O-hexilo

2’,5·-A-A-A-3·-O-heptilo.

Compostos em que R é seleccionado a partir de hidroxi e amino, tal como:

2*,5·-A-A-A-3*-amino.

Compostos em que R é seleccionado a partir de hidroxi e

OSi(CH₃ ) ₂C(CH₃)₃ , tal como:

²’'⁵'^A(Si)^A(Si)^A

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-10Num invento relacionado, um método para o tratamento de um mamífero com uma doença caracterizada por um defeito na via 2-5A, compreende a administração a esse mamífero de, pelo menos, um composto seleccionado a partir do grupo de

2’,5*-A-A-ara-A,

2’ ,5*-A-A-Tu,

2’ ,5·-Tu-Tu-Tu,

2’,5·-Ι₃,

2’,5·-xilo-A₃,

2*,5'-xilo-A₄,

2’ , 5* -C-C—dCF,

2*,5-EHNA-A-A, e ribosido de 5,6-diclorobenzioiidazilil(2‘,5‘)5,6-diclorobenzimidazilil(2* ,5* ) 5,6-diclorobenzimidazoI, ou o seu 5‘ mono-, di- e trifosfato, ou um sal farmacêu ticamente aceitável de qualquer um deles.

O presente invento refere-se ainda ao processo para a preparação de composições farmacêuticas para o tratamento de um mamífero cora qualquer doença caracterizada por um defeito na via 2-5A, compreendendo, pelo menos, um dos compostos aqui descritos e um veículo farmacêuticamente aceitável.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

A Figura 1 mostra o efeito de inibição da transcriptase inversa de HIV-1 pelos seguintes análogos de 2·5»-oligoade nilato: P₂ ^C3 (círculos cheios); pC^ (círculos vazios); p^c₃(quadrados cheios); pC₃ (quadrados vazios); C₃ (triângulos cheios); e A-C-A (triângulos vazios). As reacçoes de transcri ptase inversa continham poli(A)-(dT) ₅ como primer-molde, lisados de HTLV-III activados com Triton X-100 como enzima, e foram monitorizadas por incorporação de /7 H_7dTTP, tal como descrito no Exemplo 9. Os valores de controlo foram, em média, de 129 000 cpm, enquanto que os valores de base foram, em média, de 10 000 cpm.

A Figura 2 mostra o efeito dos seguintes na infecção por HIV—1 in vitro: (I) cordicepina, (II) 2·,5·-Α₃, (III) 2*,5*-C^,

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e (IV) 2·,5*-ρΟ₃, (V) (2»,5')-A-C-A, e (VI) As cé lulas MT-2 foram disputadas com HTLV-IIIg em presença e ausência de efectores. O efeito citopático foi quantificado pe la apreensão de corante vital,, tal conto descrito no Exemplo 9. Cada ponto de dados representa a média de três valores. Os desvios padrão foram menores do que 10% dos valores médios.

A Figura 3 é um gráfico do efeito anti-HIV-1 combinado de 2',5'-C3 cont, quer rIFN-OÍA (A) quer ARN_dc de eraparelhamento imperfeito (B). Um indice de combinação de drogas foi calculado a partir da inclinação das curvas dose-efeito, e marca do contra os valores de protecção em percentagem, ou fracção afectada. As concentrações foram de 3,1-100/Ig/ml para 2* ,5’ -C₃, 9,8-312,5 U.I./ml para rIFN-ctZA e 1,6-25 /Jg/ml para o ARN_dc de emparelhamento imperfeito.

DESCRIÇÃO DETALHADA DO INVENTO

A administração de análogos de 2-5A exógenos, metabóli camente estáveis, dará protecção aumentada contra doenças caracterizadas por um defeito 2-5A, particularmente protecção contra infecção por retrovírus em animais e humanos.Defeito

2-5A, tal como aqui utilizado, significa qualquer manifestação, condição ou interrupção da via 2-5A que resulte numa diminuição da produção do 2-5A autêntico, e/ou a interrupção da activação dependente do 2-5A da RNase L. As doenças caracteri zadas por um defeito 2—5A incluem, por exemplo, as seguintes: infecção por retrovírus, particularmente infecção por HTLV, mais particularmente infecção por HIV, fadiga crónica e linfo ma de células T cutâneo; leucemia mielogénica crónica; leucemia aguda; cancro; leucemia de células T; doença de Alzheimer; doença de Parkinson; esc lerose múltipla; doença autoimune; e disfunção imune induzida por cirurgia ou outro trauma.

O defeito é evidente em doenças, tais como as acima, causadas por infecção virai crónica, defeitos das células imu nes ou ambos. Os defeitos 2-5A são particularmente manifestos em doenças caracterizadas por ambos, infecção virai crónica e defeitos das células imunes.

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6056-13 (CIP) 2 PG

-12A modificação estrutural da molécula de 2-5A nos grupos hidroxilo 3’ e noutro local, fornece análogos de 2-5A com esta bilidade metabólica as 2'-fosfodiesterases e nucleases celulares marcadamente aumentada, enquanto mantêm a capacidade de activar a RNase L. Igualmente, a modificação do 2-5A nativo por substituição do nucleótido terminal resulta numa molécula mais estável. A concentração intracelular dos análogos de 2-5A metabólicamente estáveis, alta e presistente, é uma consequência da sua estabilidade aumentada.

A actividade farmacológica mais duradoura dos análogos de 2-5A oferece um índice terapêutico mais favorável. Isto per mite uma diminuição da frequência de administração em relação ao 2-5A, o qual é metabólicamente instável. A redução da frequência de administração é importante dada a natureza crónica de muitas doenças caracterizadas por defeitos na via 2-5A.

Os análogos de 2-5A são particularmente úteis no trat£ mento de infecções causadas por retrovírus. O defeito da via 2-5A associado com a infecção por retrovírus compreende a ina. ctivação da via causada pela interferência do virus com a a eti. vação da 2-5A sintetase pelo ARN^_C. Na ausência de activação da 2-5A sintetase, a produção do 2— 5A, por consequência a activação da RNase L, está reduzida. De acordo com o presente invento, o análogo de 2-5A exógeno, metabólicamente estável, é administrado para neutralizar este defeito causado pelos retro vírus na via 2-5A. Os análogos de 2-5A, tal como ο 2-5A autêntico, são capazes de activar a RNase L, a qual cliva o ARN virai.

Os análogos de 2-5A são particularmente úteis na prote£ ção contra infecções por vários vírus da leucemia de células T humana (colectivamente HTLV”), tais como o HTLV-I, o qual cau sa o linfoma de célula T cutâneo; o HTLV-II, o qual causa o linfoma de Sézany; o HTLV—III; e o HTLV-IV, o qual presentemen te se acredita ser o agente etiológico da esclerose múltipla. Cada um dos vírus HTLV é um retrovírus também conhecido por HIV-1, o HTLV-III é responsável por causar a síndrome de

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-13imunodeficiência humana (SIDA). Acredita-se ainda que os com postos são úteis no tratamento da infecção pelo HTV-2, um segundo subtjpo de HIV serológicamente distinto. Daqui em diante (HIV) significará, quer HIV-1 quer HIV-2, e quaisquer outros subtipos de HTV agora ou daqui em diante conhecidos.

Os doentes infectados pelo HTLV, em particular os doentes infectados pelo HIV-1, demonstraram possuir níveis excepcionalmente baixos de 2-5λ e/ou actividade da RNase L nas célu las mononucleares do sangue. Em contraste, as células mononucleares do sangue de indivíduos saudáveis apresentavam níveis de 2-5A mai^ elevados, em média, e a actividade da RNase L era prontamente detectada. De modo idêntico, as células mononuclea res do sangue de indivíduos afectados por fadiga crónica exib/ am níveis de 2-5A baixos, e evidenciavam o aparecimento de novos produtos de clivagem do ARN, distintos dos produtos de cli vagem específicos observados nas células mononucleares do sangue de indivíduos normais.

Enquanto que a aplicação prática do invento é aqui ilus trada com respeito ao tratamento da infecção por HIV-1, o qual é geralmente considerado como um retrovírus prototípico, o método de acordo com o invento tem aplicação para o tratamento de quaisquer doenças em que o agente etiológico compreenda um retrovírus. Outros retrovírus que infectam o homem incluem, por exemplo, os vários vírus HTLV não-HIV, discutidos acima.

As várias doenças caracterizadas por um defeito na via 2-5A, em particular a infecção por retrovírus, mais particular mente a infecção por HIV, podem, portanto, ser tratadas pela administração de análogos de 2-5A exógenes, metabolicamente es táveis, para neutralizar o defeito do sistema 2-5A associado com o estado de doença.

Para uso farmacêutico, os análogos de 2’,5·-oligoadenilato podem ser associados com veículos farmacêuticamente aceitáveis. Tais veículos para a preparação de composições farmacêuticas de acordo com o invento podem ser de natureza orgânica ou inorgânica, sólida ou líquida. Veículos sólidos adequados

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-14incluem gelatina, celulose microcristalina, lactose, amidos, e estearato de magnésio. Veículos líquidos adequados incluem água e álcoois tais como etanol, álcool benzílico e polifetilenoglicóis). Os veículos líquidos preferidos para preparações injectá veis incluem água, soro fisiológico, solução de dextrose e solu ções de glicol tais como propileno glicol aquoso ou poli(etileno glicol)aquoso. As propriedades das formulações podem ser aumentadas pela adição de um ou mais adjuvantes, possuindo proprieda des como incrementadores da viscosidade, surfactantes, modifica^ dores do pH, conservantes, adoçantes, incrementadores da estabj. lidade, agentes corantes, agentes de suspensão, agentes de granulação, agentes de revestimento, modificadores da desintegração, propulsores, agentes emulsionantes e umectantes . As composições resultantes podem estar sob a forma de soluções, suspensões, comprimidos, cápsulas, pomadas, elixires, composições injectáveis e similares.

A dosagem administrada depende da gravidade da infecção ou doença e da estatura e peso do sujeito. A dosagem pode variar sobre uma larga escala, dependendo da natureza da doença, e da estatura e peso do sujeito. De acordo com uma concretização, os compostos são preparados como uma solução de 0,1-100 mg/ml em água, soro fisiológico tamponado com fosfato ou outro fluído apropriado, ou podem ser preparados como um comprimido contendo 0,01-1 grama de composto activo.

Os compostos podem ser administrados sob a forma de sais solúveis em água. Sais solúveis em água farmacêuticamente aceitáveis incluem, por exemplo, os sais de sódio, potássio e amónio dos compostos activos. A formulação pode conter agentes adi cionais, tal como um açúcar ou uma proteína, para manter o balanço osmótico.

Os analogos de 2*,5 *-oligoadenilato podem ser administra dos em doses de cerca de 0,1 mg a cerca de 1 grama a animais ou humanos sofrendo de, ou suspeito de sofrer de, ou em risco de sofrer de, qualquer das várias condições caracterizadas por um defeito na via 2-5A. A dosagem diária total pode variar, por

9 3 99

6056-13 (CIP) 2 PG exemplo, de cerca de 0,001 grama a cerca de 1 grama, apesar de quantidades menores ou maiores poderem ser administradas. Uma dose diária preferida é de cerca de 0,01 grama a cerca de 0,lg do ingrediente activo. Os compostos podem ser administrados por qualquer de diversas vias, incluindo, mas não estando litni tadas a, injecção intravenosa, intraperitoneal ou intramuscular, e administração oral. As técnicas para a execução de tal administração são rotineiras e conhecidas na especialidade médica. A administração pode ser tão frequente como diversas vezes ao dia ou tão infrequente como semanal, para injecção intravenosa, particularmente para o tratamento de infecção por HIV, é preferida uma solução contendo cerca de 0,1 a cerca de 1,0 miligramas do ingrediente activo por ml.

fí também contemplado que os análogos de 2’,5*-oligoadenilato podem ser administrados por via tópica para tratar lesões da pele associadas com qualquer um dos estados de doença caracterizados por um defeito na via 2-5A. Uma quantidade suficiente de uma preparação contendo um ou mais dos análogos de 2',5·-oligoadenilato pode ser aplicada para cobrir a lesão ou área afectada. Uma concentração eficaz do agente activo é de —3 —4 cerca de 10 M, sendo preferida de 10 M.

Além da administração com veículos convencionais, os análogos de 2-5A podem ser administrados por uma variedade de técnicas de libertação de oligonucleótido ou de ácido nucleico especializadas, tais como encapsulaçâo em lipossomas unilamela_ res ou envólucros de virus sendai reconstituídos, ou por conju gação com moléculas portadoras como poli(L-lisina). Tais métodos são revelados no comummente designado requerimento de Paten te dos E.U.A. co-pendente 112 591, correspondendo ao Requerimen to de Patente Internacional WO89/O3683, cuja descrição completa é aqui incorporada por referência.

Os análogos de 2 *,5’-oligoadenilato podem ser sintetizados quimicamente como se segue. Um adenosino-2·—fosfodiéster bloqueado é preparado por bloqueio da amina em posição 6 com benzoila, bloqueio da posição 5· com p-metoxitritilo e, facul69 399

6056-13 (CIP) 2 PG /ν'

-16tativamente, bloqueio da posição 3* com t-butildimetilsililo.

Um nucleósido bloqueado é preparado por bloqueio das posições 2' e 3* com acetilo, benzoila ou t-butildimetilsililo. A preparação de adenosino-2*-fosfodiésteres bloqueados adequados é efectuada por adição do grupo t-butildimetilsililo ao grupo 3·-O-t^-butildimetilsilil-isomérico-3 ’-hidroxilo da N⁶-benzoil-5*-0-(4-metoxitritil)adenosina por condensação do último composto com cloreto de t-butildimetilsililo utilizando imidazol em piridina para produzir o derivado de 3·-O-t-butildimetilsililo. A fosforilação do derivado é realizada utilizando fosfotriazoleto de 2·,5·-diclorofenilo em piridina para produzir um adenosino-2*-fosfodiéster bloqueado adequado. Esta preparação está descrita em Charubala, R., Uhlmam, E., e Pfleiderer, W., Lieblgs Ann, Chem., 2392 (1981) e Charubala, R., Pfleiderer,

W., Tetrahedron Lett. 21, 4077 (1980), os quais são especifica_ mente aqui incorporados por referência, o adenosino-2 ’-f osf odi^ éster bloqueado é condensado com o nucleósido bloqueado em pre sença de um agente de condensação, o qual causa bloqueio das funções fosfato para formar um dinucleósidomonofosfotriéster completamente protegido.

condensado completamente protegido resultante é então destritilado na posição terminal 5' com um agente de destritilação, é condensado com mais um adenosino-2·-fosfodiéster, bl£ queado como descrito acima, para formar um 2’,5’-trinucleósido difosfotriéster completamente protegido ou um núcleo do trímero 2’,5*. o núcleo do trímero completamente protegido é, em se guida, tratado com os reagentes da desprotecção apropriados pa ra alcançar a desprotecção completa e conversão em núcleo do trímero 2' ,5' .

Alternativamente, aqueles análogos de 2’,5‘-oligoadenilato, que são formados a partir de nucleótidos, os quais são su bstractos para a 2-5A sintetase, podem ser preparados enzimáticamente, de acordo com o método da Patente dos E.U.A. 4 464 359, cuja descrição completa é aqui incorporada por referência.

A preparação do núcleo do trímero 2*,5’-A-A-ara-A é rela

399

6056-13 (CIP) 2 PG

tada em Engles J., Tetrahedron Lett, 21, 4339 (1980), o qual é aqui específicamente incorporado por referência. Consequen temente, o nucleósido N⁶, 2‘-O-, 3*-O-tribenzoilarabino-fura nosiladenina é condensado com o N^, 3·-O-dibenzoil-5*-O-tritiladenilil(2'-O-tribromoetil-5·)N⁶, 3·-O-dibenzoiladenosino -2·-(tribromoetilcianoetilfosfato) completamente protegido, utilizando, como reagente de conjugação, 3-nitro-l,2-4-triazoleto de quinolina-8-sulfonilo. A desprotecção final do tr/ mero de triéster resultante é efectuada por destritilação com trifluoreto de boro/metanol seguida por desbloqueamento e lectroquímico (CH^CN, tubo de Hg, NaHCO-j no anólito) da porção tribromoetilo. A desbenzoilação do diéster é realizada utilizando butilamina/metanol para formar adenilil(2·,5·)adenilil(2*,5·)-g-f^-D-arabinofuranosiladenina.

A preparação de 2*,5'-I₃ é descrita em Charubala e colab., Tetrahedron Lett. 23, 4789 (1982), o qual é aqui espec/ ficamente incorporado por referencia.

A preparaçSo do núcleo do trímero 2',5*-xilo-A^ e do núcleo do tetrâmero 2',5'-xilo-A^ é relatada em Grosselin, G. e Imbach, J.L., Tetrahedron Lett. 22, 4699 (1981), o qual é aqui incorporado por referência. Consequentemente, os núcleos do trímero e do tetrâmero xilo-A^ e xilo-A^, são sintetizados por tratamento da xilofuranose N -3 *-O-dibenzoilada com clore to de t-butildimetildililo para produzir o derivado sililado de xilofuranose N^-3'-O-dibenzoilada, o qual é desbenzoilada com metóxido de sódio para formar o derivado 2‘-sililo. 0 hidroxilo primário do derivado 2‘-sililo é protegido com um gru po raonometoxitritilo, e o derivado 2‘-sililo tritilado em 5’ resultante reage com um equivalente equimolar de anidrido ben zóico dissolvido em piridina em presença de 4-dimetilaminopiridina para produzir o derivado N⁶ e 3-0-benzoilado-5‘-tritilado-2·-sililado. A remoção do grupo t-butildimetilsililo com fluoreto de tetrabutilamónio origina o derivado e 3-0-dibe zoilado-5‘-tritilado, o qual é sucessivamente benzoilado e de tritilado para produzir N⁶, 2*,3*-O-tribenzoilxiloadenosina.

cl ot|

399

6056-13 (CIP) 2 PG

O derivado N^ e 3-0-dibenzoilado—5 *-tritilado anterior reage também com um excesso de fosforo-di-(1,2,4-triazoleto) de O-clorofenilo numa mistura de acetonitrilo-piridina seguida por uma reacção com trietilamina aquosa para formar o 2‘-fosfotriéster. O fosfotriéster é condensado com N^,2’,3’-O-tribenzoilxiloadenosina em presença de 1-mesitilenosulfonil-3-nitro-l,2,4-triazol para produzir o dinucleosidof osf ottriés ter completamente protegido, o qual é destritilado por tratamento com ácido £-toluenossulfónico numa mistura de clorofórmio e metanol (4:3), A condensação final entre o produto destritilado e o fosfotriéster e a purificação por cromatografia em gel de silica produz o trinucleósidodifosfotriéster comple tamente protegido (trímero do núcleo bloqueador)· O trímero do núcleo completamente desbloqueado é obtido por tratamento do trímero do núcleo bloqueado com tetrametilguanidlnio-syn-4-nitrobenzaldoximato, amónia aquosa, e ácido acético a 80%.

A EHNA é preparada de acordo com Evans e colab., J. Am. Chem. Soc. 92:4751 (197o). Pode ser, seguidamente, condensada com uma adenosina bloqueante apropriada por, após a protecção métodos de condensação e desprotecção aqui descritos, para formar 2’,5·-EHNA-A-A. Do mesmo modo, a 2*,5·-C-C-dCF é prepa rada a partir de dCF e adenosina. Os métodos para a preparação da dCF estão descritos na Patente dos EUA 3 923 785 e em Baken e colab., J. Am, Chem. Soc., 101:6127 (1979), ambos aqui incor porados por referência. De modo idêntico, o análogo de 2-5A, ribosido de 5,6-diclorobenzimidazilil(2 ·, 5* ) 5,6-diclorobenzinri dazilil(2*,5·)5,6-diclorobenzimidazol, é preparado por condensação do ribósido de 5,6-diclorobenzimidazol comercialmente disponível (sigma, ns. cat. D5893) de acordo com métodos semelhantes .

A preparação dos análogos de 2· ,5’-oligoadenilato utili zados na aplicação prática do invento é ilustrada pelos exemplos seguintes não-limitantes.

EXEMPLO 1

Preparação de Núcleos de Trímeros de 2',5¹-Adenllato Estruturalmente Modificados

399

6056-13 (CIP) 2 PG

-19 —

Os vários novos análogos do núcleo do trímero de 2',5£ -adenilato estruturalmente modificados podem ser, geralmente, preparados como se segue.

Uma mmole de adenosino-2’-fosfodiéster bloqueado apropriado, tendo a fórmula geral do reagente (I), foi preparada a partir de adenosina ou cordicepina de acordo com o método de Charubala, R., Uhlroann, E., e Pfleiderer, W., Liebigs Ann. Chem., 2392 (1981), e Charubala, R., e Pfleiderer, W., Tetrahedron Lett. 21, 4077 (1980). Exemplos de adenosino-2'-fosfodiéstères bloqueados s3o representados pelos compostos 3. e 2^, re gistados na Tabela 1.

Reagente (I)

Nome do Composto

NS. do R

Composto

N^benzoil-3* -O-t-butildimeti2_ silil-5· -O-p-metoxitritilade- _1 OSiTBD 2-clorofenilo nosina-2-(2-clorofenil) -f osf a. to de piridinio

N⁶-benzoil-5‘ -O-jo-metoxitritiJ.

-3·-desoxiadenosino-2-(2-clo- / H 2-clorofenilo rofenil)fosfato de piridinio

O reagente (I) foi combinado com um nucleósido bloquea do, tendo a fórmula geral do reagente (II) abaixo. O reagente (II) é exemplificado pelos compostos 3-9 registados na Tabe69 399

6056-13 (CIP) 2 PG

TABELA 2

Nome do Composto	NS. do Composto	R	R¹	X
N^-benzoil-2‘,3‘-di-0-t-butildimetilsilil-	3_	OSiTBD	SiTBD	N
-adenosina N⁶,2 *-O-dibenzoil-3 · -	£	H	Bz	N
-desoxiadenosina N⁶-benzo±l-2· -0-acetil.	£	H	Ac	N
-3·-desoxiadenosina N^,2¹-0-dibenzoil-3·-0	6	0-n-C₅ ^Hn	Bz	N
-n-pentiladenosina Ν⁶,2·-O-dibenzoil-3·-0	7	O-n-C₇H₁₅	Bz	N
-n-he pt ila denos ina N⁶-benzoil-2¹-0-t-butildimetilsili1-3 · -g- -nitrofenil-etoxicar-	8	NHCOOCH^CH^^y-NO? SiTBD	N
bonilamino-3 *-desoxia denosina 2‘,3·-di-O-t-butildi-	9	OSiTBD	SiTBD	CH
metilsilil-tuberc idina

399

6056-13 (CIP) 2 PG

-21Os compostos 3 e 9 são preparados tratando a adenosina 6 - —

N -benzoilada com cloreto de monometoxitritilo em piridina pa ra produzir o derivado 5·-monometoxitritilo. O derivado é tra tado com cloreto de t-butildimetilsililo numa mistura de pir/ dina e metilimidazol para formar a N^-benzoil-2*,3*-di-O-t-bu tildimetilsilil-5* -monometoxitritiladenosina . o grupo tritilo é removido com ácido acético para produzir o composto /. O composto 9 é sintetizado de forma análoga, partindo de tubercidina -benzoilada. Este método de preparação está descrito em Charubala e colab., Liebigs Ann. Chem. 2392 (1981).

O composto 4_ é preparado por tratamento de 3’-desoxiade nosina N -benzoilada com cloreto de monometoxitritilo para pro duzir N^-benzoil-5‘-O-monometoxitritil-3·-desoxiadenosina, a qual é convertida em N⁶-2‘-O-dibenzoil-3·-desoxiadenosina por benzoilação do grupo hidroxilo 2* com cloreto de benzoíla, seguida por destritilação com ácido acético a 80% durante 30 minutos. Este método de preparaçSo está descrito em Tetrahedron Lett. 21, 4077 (1980).

O composto / é preparado por conversão da N^-benzoiladenosina, cora t-butildifenilclorosilano, ao nucleósido silila do, em piridina. o nucleósido sililado em 5’ é tratado com ortoacetato de trietilo, seguido por trifluoreto de boro/éter dietílico e iodeto de sódio em CH₃CN (osc, 1 hora), para produ zir o derivado 3·-iodoacetilo. O derivado 3*-iodoacetilo é con vertido no composto _5 por tratamento com tributilhidreto de es tanho em tolueno (802C, 1 hora) e dessililação com tetrabutilfluoreto de amónio em tetra-hidrofurano. Este método de preparação é tal como descrito por Engles, J., em Tetrahedron Lett. 21, 4339 (1980), o qual é aqui incorporado por referência.

Os compostos 6 e 7 são preparados por tratamento da N -benzoiladenosina com cloreto de tritilo em piridina, e coloca ção sob refluxo durante 2 horas. A N⁶-benzoil-5 * -trit iladenosi. na é isolada por extracção com clorofórmio. A água da fase do clorofórmio e removida por secagem com sulfato de sódio. AN-benzoil-2’,5·-di-0—tritiladenosina e a N⁶-benzoil-3·,5*-di-069 399

6056-13 (CIP) 2 PG ' X

-22-tritiladenosina são isoladas com cloreto de n-pentilo e cloreto de n-heptilo, respectivamente, sob refluxo numa suspensão de hidróxido de sódio em benzeno. A solução é neutralizada por colocação sob refluxo em ácido acético, seguida pela adição de éter dietílico e água. Os produtos de reacção foram extraídos com clorofórmio, seguido por cromatografia em camada fina com clorofórmio:metanol (4:1) em placas de gel de silica. Os grupos tritilo e benzoíla são removidos por colocação sob refluxo em ácido acético durante uma hora, arrefecimento, extracção com éter dietílico, seguida por concentração e arrefecimen to para produzir os compostos / e / cristalinos. Este método de preparação é realizado de acordo com Blank, H.U., Franne,

D., Myles, A., e Pfleiderer, W.,. Justus Lieblgs Ann. Chem.

742, 34 (1970), o qual é aqui incorporado por referência.

O composto Q foi preparado como se segue. Uma mmole de 3'-amino-3*-desoxiadenosina reagiu com 1,2 mmole de cloreto de 1-metil-3-nitrofeniletoxi carboxilimidazólio em metildi-selaza^ no para bloquear as posições 2*,5* e amino em 6. Foi adicionada 1,1 mmole de cloreto de benzoíla em piridina â temperatura ambiente para produzir N^-benzoil-2*,5·-di-sililadenosina bloqueada. A mistura reaccional foi vertida em metanol-NH^ para remover os grupos sililo em 2* e 5‘. A reacção com cloreto de MMTr em piridina produziu o derivado 5'-MMTr. Cloreto de tert-butildimetilsililo numa mistura de piridina e 1-metilimidazol foi então adicionado ao derivado 5'-MMTr e destritilado em 5‘, tal como no Exemplo 1, para formar o composto £3.

Os reagentes (I) e (II) foram combinados para produzir o intermediário, tendo a fórmula geral do dímero (III), como se segue. 0,95 mmole do reagente (ΙΓ) e os reagentes de conden sação, cloreto de 2,4,6-triisopropilbenzeno-sulfonilo (2 mmole) e 1-metilimidazol (6 mmole), foram combinados e agitados duran te 1 hora à temperatura ambiente. A reacçao foi parada pela adição de 30 ml de tampão de fosfato aquoso de pH 7, e extraída com 150 ml de clorofórmio. A camada do clorofórmio foi lavada, duas vezes, com 50 ml de água, seca sobre sulfato de sódio durante cerca de 1-2 horas e filtrada. O clorofórmio foi evapora

399

6056-13 (CIP) 2 PG tf /

-23 — do até um pequeno volume e, em seguida, aplicado a uma coluna de gel de silica (20 x 2,5 cm) para purificação. A cromatogra fia foi realizada, primeiro com clorofórmio e em seguida, com cloroformio/etanol (99/1, v/v) para eluir o produto dinucleósidomonofosfotriéster completamente protegido da fórmula geral do dímero (III). A evaporação originou uma espuma sólida do dí_ mero (III) exemplificado pelos compostos 10-17 (Tabela 3).

Dímero (III)

TABELA 3

NS do	R R¹	R²	R³	X	NS do	R
Composto					Composto
10	MMTr OSiTBD	OBZ	Bz	N	18	H
11	MMTr OSiTBD	H	Ac	N	19	H
12	MMTr OSiTBD	OSiTBD	SiTBD	CH	20	H
1/	MMTr OSiTBD	0-n-C₅ ^Hn	Bz	N	21	H
14	MMTr OSiTBD	⁰-n-C7^H15	Bz	N	22	H
15	MMTr H	OBz	Bz	N	23	H
16	MMTr H	H	Bz	N	24	H
12	MMTr OSiTBD	nhcooch₂ch-^^no₂	SiTBD	N	25	H

399

6056-13 (CIP) 2 PG

-24- - <·

Uma mmole do dímero (III) completamente protegido foi agitado, à temperatura ambiente, durante 3o minutos em 20 ml de ácido p-tolueno-sulfónico a 2% em diclorometano/metanol (4/1, v/v) para destritilaçâo. Foram adicionados 20 ml do tam pão de fosfato de pH 7, e subsequentemente extraídos, diversas vezes, com 200 ml de diclorometano. A fase organica foi lavada com água, seca sobre sulfato de sódio, evaporada até um pequeno volume e, em seguida, aplicada a uma coluna de gel de sílica (20x2,5 cm) para purificação. A eluição foi efectua da com clorofórmio (400 ml) seguido por clorofórmio/metanol (98/2, v/v). A evaporação da fracção principal permitiu um rendimento de 80-90% do dinucleósido monofosfotriéster destri. tilado (dimero (III)), exemplificado pelos compostos 18 a 25 (Tabela 3) .

2·,5’-trinucleósidodifosfoditriéster completamente protegido, tendo a fórmula geral do trímero (IV) e exemplificado pelos compostos 26-34 (Tabela 4, abaixo), foi preparado a partir do dímero (III) destritilado em 5* como se segue.

NHBz

Trímero (IV)

R

C

Cl CH 2

NHBz

399

6056-13 (CIP) 2 PG

TABELA 4

N». do Composto	R	R¹	R²	R³	X
26	H	OSiTBD	OBz	Bz	N
27	H	OSiTBD	H	Ac	N
28	OSiTBD	OSiTBD	OSiTBD	SiTBD	CH
29	OSiTBD	OSiTBD	0-n-C₅H_i:L	Bz	N
30	OSiTBD	OSiTBD	Ο-η-ΟγΗ^δ	Bz	N
31	OSiTBD	OSiTBD	OBz	Bz	N
32	H	H	OBZ	Bz	N
33	OSiTBD	H	H	Bz	N
34	OSiTBD	OSiTBD	NHCOOCT^ChM'	-N0₂ SiTBD	N

1,05 mmole do adenosino-2*-fosfodiéster (reagente (I)) de partida foram condensadas com 1 mmole do dímero (TTl) des tritilado em 5· (compostos 18-25) em 10 ml de piridina absolu ta, utilizando 3 mmole de cloreto de 2,4,6-triisopropilbenzeno-sulfonilo e 9 mmole de 1-metilimidazol como agentes de con densação. A análise foi efectuada após 2 horas da maneira des crita acima. A neutralização com tampão de fosfato, seguida por extracção com diclorometano e cromatografia em gel de sílica com clorofórmio e clorofórmio/metanol (99/1 a 98/2, v/v) rendeu 70-90% do trímero (IV) completamente protegido (compos tos 26-34), como um pó amorfo cromatográficamente puro.

O 2*,5*-trinucleósidodifosfoditriéster completamente protegido, trímero (IV), foi desprotegido para núcleo do trímero (V) como se segue.

0,01 mmole do trímero (IV) foi tratada com uma solução de 0,073 g de p-nitrobenzaldoxina e O,07 g de tetrametiIguani dina em 2 ml de díoxano/água (1/1, v/v), durante 16 horas à temperatura ambiente, para desbloquear o grupo 0-clorofenilo. Após evaporação até à secura e co-evaporação, quatro vezes, com água, foram adicionados 20 ml de hidróxido de amónio con69 399

6056-13 (CIP) 2 PG centrado e a solução foi agitada durante 2 dias, à temperatu ra ambiente, para desproteger os grupos acilo. A solução foi então novamente evaporada, e o resíduo foi dissolvido em 25 ml de água e lavado, quatro vezes, com 10 ml de clorofórmio de cada vez. A camada de água foi evaporada atá à secura e co -evaprada, dez vezes, com 10 ml de piridina absoluta de cada vez. O resíduo foi então tratado com 2 ml de uma solução 0,5m de fluoreto de tetrabutilamónio anidro em piridina absoluta, durante 16 horas, para remover os grupos t-butildimetilsililo. Após evaporação, o tratamento do resíduo com 5 ml de ácido acé tico a 80%, durante 6 horas à temperatura ambiente, conduziu à clivagem do grupo p-metoxitritilo. A solução foi novamente eva porada, o residuo dissolvido em 15 ml de água, e extraído, qua. tro vezes, com 5 ml de clorofórmio de cada vez. A camada aquosa foi evaporada e, em seguida, co-evaporada diversas vezes com água até que o cheiro do ácido acético desaparecesse. 0 re síduo foi dissolvido em 10 ml de água e aplicado a uma coluna DEAE—Sephadex A-25 (60x1 cm) para uma cromatografia de permuta de iões com um gradiente de bicarbonato de trietilamónio de 0,001-0,5 Μ. A fracção principal foi evaporada, e em seguida co-evaporada diversas vezes com água, o núcleo do trimero (V), um 2*,5'-trinucleósidodifosfato completamente desprotegido, foi isolado por liofilização da solução aquosa, rendendo 7090% de um sólido amorfo. O núcleo do trimero (V) é exemplificado pelos compostos 35-45 (Tabela 5).

399

6056-13 (CIP) 2 PG

r³oh

TABELA. 5

Nome do Composto	N®.do Composto	R	R¹	R²	R³	X
2*,5'-A-A-C	35	H	OH	OH	H	N
2’ ,5’ -C-A-C	36	H	H	OH	H	N
2 · , 5 · -A-A-Tu	37	H	OH	OH	OH	CH
2* ,5' -A-A-A- -3‘-0-pentilo	38	H	OH	OH		N
2',5*-A-A-A- -3'-O-heptilo	39	H	OH	OH	O-n-C₇ ^H15	N
^2,'^S,-^A(_SÍ>- ^A(Si)^_A	40	H	0S1TBD	OSiTBD OH	N
2' ,5* -C-C-A	41	H	H	H	OH	N

399

6056-13 (CIP) 2 PG

-2 8TABELA 5 (CONT.)

Nome do N^e. do R R¹

Composto Composto

2' ,5' -A-C-C	42	H	OH	H	H	Ν
2',5*-A-A-3'-	43	H	OH	OH	nh₂	N
-amino
2*,5'-Tritilo -^A3	44	MMTr	OH	OH	OH	N
2*,5·-Tritilo ^3	45	MMTr	H	H	H	N
2* ,5* -C-C-C- -5’-monofosfato	46	^H2°3^P	H	H	H	N

EXEMPLO 2

Preparação de 3*-0-t-butildimetilsililadenilf2 · ,5· )3‘ -0-t-bu_tildimetilsililadenilil(2*,5*)adenosina_

0,01 Mmole de N^-benzoil-3·-0-t-butildimetilsili1-5*-0-£-metoxitritiladenilil(2·-o-clorofenil-5·)N^—benzoil-3¹-0-tbutildimetilsililadenilil(2'-£-clorofenil-5')N^, 2*-O, 3·-0-tribenzoiladenosina (Compostos 31, Tabela 4) foi tratada de acordo com o processo do Exemplo 1, excepto que o passo de des protecção do tratamento com fluoreto de tetrabutilamónio foi omitido, a fim de produzir 2 · , 5 · -A “^A(si) ”^A (composto 40, Tabela 5).

EXEMPLO 3 preparaçao de adenilil(2‘,5*)adenilil(2',5·)3’-amino-3’-desoxia^ _denosina_

0,01 Mmole de N⁶-benzoil-3 · -O-t-butildimetilsilil-5·-0-£-metoxitritiladenilil(2’-o-clorofenil-5*)N^-benzoil-3·-0-t-butildimetilsilíladenllil(2·-o-clorofenil-5*)N⁶-benzoil-2 *-0-t^-but ildimetilsi li 1-3 · -£-nitrofeniletoxicarbonilamino-3 * -deso xiadenosina (composto 34, Tabela 4) foi tratada de acordo com

399

6056-13 (CIP) 2 PG r-29- ' o processo de desprotecção do Exemplo 1 em que o grupo p-nitro feniletoxicarbonilo foi clivado simultânea me nte com o grupo si. lilo por fluoreto de tetrabutilamónio num processo de (3-elimina ção . A descarboxilação posterior produziu 2·,5·-A-A-3¹-amino (composto 43 , Tabela 5).

EXEMPLO 4

Preparação de 5·-O-p-raetaxitritiladenilil(2 *,5·)adenilil(2·,5 *)_adenilil(2*,5*)adenoslna_

0,01 Mmole de N^-benzoil—3*-0-t-butildimetilsilil-5*-0-p-metoxitritiladenilil(2 *-o-clorofeni1-5*)N^-benz oil-3·-0-t-butildimetilsililadenili1(2»-o-clorofenil-5·)N⁶,N⁶-2»-O, 3*-0-tetrabenzoil adenosina, preparada de acordo com o método de Charubala, R., Uhlmann, E., e Pfleiderer, W., Liebigs Ann,

Chem., 2392 (1981), foi tratada de acordo com o processo de de£ protecção do Exemplo 1, excepto que o último passo de tratamento com ácido acético foi omitido. O produto, 2¹,5’-tritil-A^ (composto 44, Tabela 5), foi isolado, purificado por cromatogra^ fia em DEAE-Sephadex A-25, e liofilizado para formar o composto 44 puro amorfo, como um pó, com rendimento de 85%.

EXEMPLO 5

Preparação de 5*-0-p-metoxitritil-3*-desoxiadenilil(2¹,5*)3·_-desoxiadenilil(2 *,5 *)3 *-desoxiadenosina_

0,01 Mmole de N⁶-benzoil-5’-O-p-raetoxitritil-3·-desoxiadenilil(2·-o-clorofenil-5‘)N⁶-benzoil-3·-desoxiadenilil(2·-o-clorofenil-5¹)N^,N^-2·-O-Tribenzoil-3*-desoxiadenosina, preparada de acordo com o método de Charubala, R., e Pfleiderer, W., Tetrahedron Lett. 21, 4077 (1980), foi tratada de acordo com o processo de desprotecção do Exemplo 1, excepto que os passos de tratamento com fluoreto de tetrabutilamónio e ácido acético foram omitidos. 0 produto, 2’,5*-tritil-C^ (composto 45, Tabela 5) foi isolado, purificado por cromatografia em DEAE-Sephadex A-25, e liofilizado para formar o composto puro amorfo.

Os 5¹-monofosfatos das moléculas do núcleo do trímero de acordo com o presente invento podem ser preparados a partir do

399

6056-13 (CIP) 2 PG

-302‘,5*-trinucleósidodifosfoditriéster completamente bloqueado, por destritilação como no Exemplo 1, seguida por reacção com cloreto de di-£-nitrofeniletilfosforilo. A extracção, cromato grafia e desbloqueio de acordo com o Exemplo 1 resultam no isolamento dos trímeros de 5*-monofosfato. A preparação está exemplifi^ca^^{a no} método do Exemplo 6.

EXEMPLO 6

Preparação de 5*-0-fosforil-3*-desoxiadenilil(2*,5·)3¹-desoxia. _denilll(2*,5')3*-desoxíadenosina_

0,1 Mmole de N^-benzoil-5*-0-p-metoxitritil-3·-desoxiadenilil(2 *-o-clorofeni1-5·)N^-benzoIl-3 *-desoxiadenilil(2·-o-clorofenil-5·)N⁶,N⁶,2‘-0-tribenzoil-3·-desoxíadenosina é preparada a partir de 3'-desoxíadenosina por benzoilação, tosilação em 5·, e fosforilação em 2’, com formação do dinucleósido fosfotriéster, N^-benzoil(2·-o-clorofenilfosforil-5)3‘-desoxia^ denosina, por tratamento dos produtos da reacção, N⁶-benzoil(2-trietilamónio-o-clorofenilf osf oril-5) -5 ’ -tosil-3 ' -desoxiade nosina e 2·-cianoetilfosforil-o-clorofenil-3'-desoxíadenosina, com nitro—1,2,4-triazoleto de triisopropilbenzeno-sulfonilo. O dímero completamente protegido assim formado é condensado cora N^,2·-0-dibenzoi1-3*-desoxíadenosina para formar o trímero.

0,01 mM deste trímero, preparado de acordo com o método de Ch£ rubala, R., e Pfleiderer, W., Tetrahedron Lett. 21, 4077 (1980), foi tratada com 2 ml de uma solução de ácido ^-tolueno -sulfónico a 2% em diclorometano/metanol (7/3, v/v), durante 30 minutos à temperatura ambiente), para remover o grupo jo-metoxitritilo. A purificação por cromatografia em gel de sílica numa placa preparativa com clorofórmio/metanol (95/5, v/v) orj. ginou um rendimento de 90% do análogo desprotegido em 5'.

Este produto foi dissolvido em 1 ml de piridina absoluta , e tratada com 0,25 mmole de cloreto de di-p-nitrofeniletil. fosforilo, tal como descrito por Himmelsbach, F., e Pfleiderer, W., Tetrahedron Lett. 23, 4 973 (1982), durante 1 hora a tempera tura ambiente. Após diluição com 15 ml de clorofórmio, a mistura reaccional foi extraída, três vezes, com tampão fosfato de

399

6056-13 (CIP) 2 PG

pH 7. A camada orgânica foi seca sobre sulfato de sódio, filtr£ da, evaporada e co-evaporada, três vezes, com 10 ml de tolueno de cada vez. O resíduo foi purificado por cromatografia em gel de sílica em placas preparativas com clorofórmio/metanol (9/1, v/v) para render 81% de 5’ -0-di-£-nitrofeniletilf osf oril-Z-benzoil-3· -desoxiadenilil(2 ’-o-clorofenil-5')N⁶,N⁶,2 *-0-triben zoil-3·-desoxiadenosina, sob a forma de um sólido amorfo.

0,01 Mmole do último material foi tratada com o-nitroben zaldoxiraato, de acordo cora o processo de desprotecção do Exemplo 1, para remover os grupos bloqueadores o-clorofenilo. Após evaporação até à secura e diversas co-evaporações com piridina absoluta, o produto desprotegido foi dissolvido em 10 ml de uma solução 0,5 M de diazabiciclo/ 4.3.0 /undeceno em piridina abso luta e agitado, durante 36 horas â temperatura ambiente, para clivar o grupo £-nitrofeniletilo por ^-eliminação . A solução foi novamente evaporada e, em seguida, tratada com 20 ml de h_i dróxido de amónio concentrado, durante 24 horas a temperatura ambiente. A purificação e isolamento do 5’-monofosfato do núcleo do trímero (composto 46, Tabela 5) foi efectuada por croma tografia em DEAE-Sephadex e liofilização da fracção principal.

As moléculas do núcleo tetrámero de acordo com o presente invento podem ser preparadas seguindo o método dos Exemplos 7 ou 8.

EXEMPLO 7 preparação de adenilil(2’,5·)adenilil(2·,5')3*-desoxiadenilil(2',5 *)3 *-desoxiadenosina

0,5 Mmole do composto 47 completamente protegido tendo a fórmula (VI) e 0,4 mmole de N⁶-benzoil-3‘-desoxiadenilil(2'-o-clorofenil-5·)N⁶, 2¹-0-dibenzoil-3·-desoxiadenosina (compos to 24, Tabela 3) foram dissolvidas em 5 ml de piridina absoluta .

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6056-13 (CIP) 2 PG

-3 2-

Reagente (VI)

Após a adição de 1 mmole de cloreto de 2,4,6-triisopro pilbenzeno-sulfonilo e 3 mmole de 1-metilimidazona, a mistura foi agitada durante 2 horas a temperatura ambiente. A solução foi diluída com 400 ml de água e, em seguida, a camada orgânji ca foi seca sobre sulfato de sódio, filtrada e evaporada até à secura. O resíduo foi co-evaporado, duas vezes, com 50 ml de tolueno. A purificação foi efectuada por cromatografia numa co luna de gel de sílica (20x2,5 cm), primeiro com clorofórmio e, em seguida, com um gradiente de clorofórmio/metanol de 99/1 a 98/2 (v/v) . Por evaporação, a fracção principal originou o com posto 48 (Tabela 6), como uma espuma sólida, com rendimento de 80%. 0 composto 4 8 é um 2’,5·-tetranucleósidotrifosfotritriéster completamente bloqueado, de acordo com a fórmula geral do núcleo do tetrámero (VII, abaixo). A desprotecção dos grupos blOqueantes foi efectuada de acordo com o processo do Exemplo

399

6056-13 (CIP) 2 PG

-3 349, Tabela 6) . A cro liofilização resul80%.

1, para produzir 2', 5 ·-A-A-C-C (composto matografia em DEAE-Sephadex, evaporação e taram num sólido amorfo com rendimento de

NHR

H OR

Núcleo do Tetrâmero (VII)

TABELA 6

N^e, do C omposto

Bz

MMTr SiTBD 2-clorofenilo

399

6056-13 (CIP) 2 PG &

-34EXEMPLO 8

Preparação de 3 *-desoxiadenilil (2·,5 *)3‘-desoxiadenilil(2·,5 * _3*-desoxiadenilll(2*,5*)3»-desoxiadenosina_

0,1 Mmole de N⁶-benzoil-5'-0-£-metoxitritil-3·-desoxiadenilil ( 2 * -c>-c lorof enil—5 ' )N^-benz oil-3 · -desoxiadenilil(2 · -o-clorofenil-5* ,W⁶ ,N⁶, 2 * -0-tribenzoil-3 · -desoxiadenosina (composto 50, Tabela 7), um 2',5'-trinucleósidodifosfoditriêster completamente bloqueado, de acordo com fórmula geral do reagen te (VIII),

N®. do Composto

K OBz

TABELA 7

R

Reagente (VIII)

MMTr

H

399

6056-13 (CIP) 2 PG

-35foi tratada com 2 ml de uma solução a 2% de ácido £-tolueno-sulfónico em diclorometano/metanol (4/1, v/v), durante 30 rni nutos á temperatura ambiente. A reacção parou pela adição de 20 ml de tampão de fosfato de pH 7. A solução foi extraída, di. versas vezes, com 200 ml de clorofórmio. A camada orgânica foi lavada com agua, seca sobre sulfato de sódio, filtrada e evapo rada até um pequeno volume para purificação em placas de gel de sílica preparativas com clorofórmio/metanol (95/5, v/v). A banda principal foi eluida com clorofórmio/metanol (4/1, v/v) para produzir o composto 51 destritilado em 5¹ (Tabela 7) após evaporação, com rendimento de 80%.

0,05 Mmole do composto 51 (Tabela 7) foi então condensa da com 0,1 mmole de N⁶-benzoil-5·-O-p-metoxitritil-3*-desoxiadenosino-2· -(2-o-clorofenil)fosfato de piridinio (composto 2., Tabela 1) em 0,6 ml de piridina absoluta em presença de 0,2 mmole de cloreto de 2,4,6-triisopropilbenzeno-sulfonilo e 0,6 mmole de 1-metilimidazol, durante 2 horas à temperatura ambien te. A solução foi diluída com 100 ml de clorofórmio, lavada du as vezes com água, seca sobre sulfato de sódio e evaporada até um pequeno volume para separação em placas de gel de sílica pre parativas com clorofórmio/metanol (95/5, v/v). A banda principal foi eluida com cloroformio para originar, por evaporação o 2',5'-tetranucleósidotrifosfotritriéster completamente prote gido, composto 52 (Tabela 8, abaixo), como um sólido amorfo, com rendimento de 84%.

Os grupos bloqueantes do composto 52 foram removidos de acordo com o processo do Exemplo 1, seguido por cromatografia em DEAE-Sephadex e liofilização. O núcleo do tetrâmero, 2’,5'-C-C-C-C (composto 53 , Tabela 8), resultou como um sólido amor fo, com rendimento de 70%. A estrutura do composto 53 está de acordo com a fórmula geral do núcleo do tetrâmero (IX).

Os 5·-0-monofosfatos das moléculas do núcleo do tetrame ro de acordo com o presente invento podem ser preparados a par tir do 2·,5·-tetranucleósidotrifosfotritriéster completamente bloqueado, por destritilação em 5' como no Exemplo 1, seguida por reacção com cloreto de di-j3-nitrofeniletilf osf orilo. A ex69 399

6056-13 (CIP) 2 PG

-36* te» tracção, cromatografia e desbloqueio de acordo com o Exemplo 1 resultaram no isolamento dos tetrâmeros de 5'-0-monofosfato. A preparação está exemplificada no Exemplo 6, acima.

Núcleo do Tetrámero (IX)

NHR

N^s. do Composto

R

TABELA 8

R

Bz MMTr 2-clorofenilo

Η Η H

O 5'-difosfato e o 5·-monofosfato das moléculas dos nú cleos do trimero e do tetrámero de acordo com o presente inven to podem ser preparados pela adição de 0,5 mM de pirofosfato de tributilamónio dissolvido em 5 ml de dimetilformamida 0,1

399

6056-13 (CIP) 2 PG

-37mM do núcleo monofosforilado, como o sal de tributilamónio ani dro, em 1 ml de dimetilformamido e 0,5 mM de 1,1'-carbonildiimidazol. Após 20 horas à temperatura ambiente, os reagentes foram tratados com 5 ml de metanol, evaporados até â secura e submetidos a cromatografia numa coluna celulose DEAE de 2x20 cm. Os 5’-di e trifosfatos foram isolados seguindo um gradiente linear (0-0,4 M em 3 1 a pn 7,5) de bicarbonato de trietila mónio. Este é o método de Hoard, D.E., e Ott, D.G., J. Amer. Chem, Soc, 87, 1785-1788 (1965), o qual é aqui incorporado por referência. Os 5’-difosfatos e os 5·-trifosfatos podem então ser purificados por cromatografia etn DEAE-Sephadex A2 5 e Sepha. dex G-lO.

A modificação estrutural da molécula de 2·,5·-oligoadenilato no nucleósido terminal 2‘, na porção aglícona e/ou ribosil, forneceu moléculas que são inibidores potentes da repl/ cação virai, particularmente da replicação de retrovírus, tal como o HIV. Estas moléculas sintéticas são biológicamente mais activas e metabólicamente mais estáveis do que a molécula de 2',5'-oligoadenilato que ocorre naturalmente.

A actividade antirretrovira1 dos compostos de acordo com o presente invento é demonstrada pelos métodos experimentais se guintes, nos quais qualquer um dos compostos do núcleo de acordo com o invento, ou os seus 5* mono-, di-, ou trifosfatos correlativos, pode substituir qualquer um dos análogos nas experiências seguintes, com a eficácia revelada para tais compostos na descrição.

De acordo com a experiência seguinte, observou-se que os análogos de 2*,5'-oligoadenilato inibiam a actividade da transcriptase inversa de HIV-1 e protegiam, in vitro, as células-alvo da infecção por HIV-1.

EXEMPLO 9

Inibição, In Vitro, da Actividade da Transcriptase Inversa de HIV-1

Células e Virus. células da linha de células T altamente per69 399

6056-13 (CIP) 2 PG

-3 8missiva ao HIV-1, MT-2 (Miyoshi, e colab., Nature 2 94 :770-771 (1981)) foram utilizadas como células-alvo para infecção com o HIV-1 (HTLV-III-,) produzido em células H (Popovic e colab., b y

Science 224:497-500 (1984)). As culturas armazenadas foram cul tivadas, mantidas em RPMI-1640 contendo 12% de soro bovino fetal inactivado pelo calor e 50 microgramas de gentamicina/ml e incubadas a 37SC. Os títulos virais neste estudo, os quais são fornecidos como uma multiplicidade da infecção (isto ê, partículas virais infecciosas/célula), foram calculados a partir de 50% dos valores da dose infecciosa da cultura de tecido obtidos por microtitulaçâo no /^uraçSoem células Mt-2, como descrito em Montefiori e colab., J. Clin. Microbiol. /6:231-235 (1987).

Ensaios da Transcriptase Inversa. O vírus foi concentrado a partir dos sobrenadantes das culturas de H9/HTLV-III_B condicio nadas livres de células (0,45 micromolar-filtradas), por centrifugação a 18 OOO r.p.m., durante 4 horas a 20^sC, num rotor Beckman JA-20. Um sedimento virai obtido a partir de 50 ml do fluído da cultura condicionada foi dissolvido em 0,5 ml de uma solução contendo Tris-HCl 17 mM (pH 7,8), ditiotreitol (DTT) mM, KC1 55 mM, Triton X-lOO a 0,32% p/v e glicerol a 33%. Es te lisado virai foi armazenado a -202c e usado como fonte de transcriptase inversa de HIV-1. As reacções de Transcriptase inversa foram realizadas em volumes reaccionais de 100 1 contendo Tris-HCl 40 mM (pH 7,8), DTT 4 mM, KC1 50 mM, MgCl^ 10 mM, Triton X-100 0,0325% p/v, /7^{* 3}3HJ7dTTP 3 micromolar (80 ci/ /mmol, NEN) e o primer molde poli (A).(dT)₁₅ (2,5 micrograma/ /ml), após aadição de 10 microlitro de enzima. Os inibidores foram adicionados a várias concentrações após ajustamento dos volumes de água de modo que os volumes reaccionais permanecessem constantes. As reacções foram incubadas a 37ec durante 1 ho ra num ambiente humidificado, e pela adição de 2 ml de ácido tricloroacético a 10% frio. 0 precipitado foi colectado em filtros Millipore de acetato de celulose de 0,45 mícron, os quais foram, em seguida dissolvidos em 10 ml de cintilante aquoso 3a 70B e as contagens por minuto quantificadas utilizando um espectómetro de cintilação líquido BecKman LS68OO.

Ensaios de Infecção. As actividades anti-HIV-1 de vários compos

399

6056-13 (CIP) 2 PG

-3 9tos foram detectadas e quantificadas por um ensaio de infecção de microtítulo in vitro, como anteriormente descrito por Monte fiori, acima. Resumidamente, as células MT-2 foram adicionadas a placas de microtitulação de 96 poços contendo 2 vezes mais diluições em série do efector em triplicado. O virus foi adicionado numa multiplicidade de infecção de I, e as placas incu badas a 37sc num ambiente de ar/CO^ a 5% humidificado durante 4 dias. As células viáveis foram então quantificadas por apreensão de corante vital (vermelho neutro) de células aderentes a poli-L-lisina, como uma medida do efeito citopático. A esta altura, os poços de controlo do vírus (células e vírus na ausên cia de efectores) exibiam citólise maior do que 90%. A protecção em percentagem foi definida pela variação das leituras a A^_4o ocorrendo entre poços de controlo de células (células na ausência de vírus e efectores) e poços de controlo de vírus.

Ensaios de Toxicidade Celular. As toxicidades celulares foram quantificadas utilizando células MT-2 em placas de microtitula. ção, tal como descrito acima, com as excepções de omitir os ví rus e substituir os poços de controlo dos vírus por poços vazios (brancos). A variação das leituras a ^A54O ocorrendo entre os poços de controlo de células e os poços brancos foi utiliza^ da para calcular a percentagem de células viáveis em poços de teste, após três dias de incubação.

Os efeitos dos análogos de 2-5A sobre a actividade da transcriptase inversa de HIV-1 são apresentados na Tabela 9 e na Figura 1. A inibição dependente da concentração da activida de do enzima foi observada, por exemplo, com o núcleo do tríme ro de 2*,5*-cordicepina (C^), 5· mono-, di- e trifosfatos do trímero (pC^, ρ₂<?₃, p^C^), 5*-monof osf ato do tetramero de 2·,

5·-cordicepina (PC₄), além de 2‘,5‘-A-C-A (figura l) . o 5*-tri^ fosfato do trímero de 2*,5·-cordicepina (p^C^) foi o inibidor mais eficaz (100% de inibição a 60 micromolar), seguido pelo trímero 2‘,5· de ribósido de 5,6-diclorobenzimídazol (73% de inibição a 200 micromolar), 2*,5*-pC₄ (58% de inibição a 100 micromolar), 2',5^a-A-A-ara-A (53% de inibição a 200 micromolar) e 2*,5*-A-C-A (50% a 200 micromolar). (Tabela 9).

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6056-13 (CIP) 2 PG	-4 0- T ABE LA 9	iC-O¹ *0
Efeitos dos Análogos	de 2-5A sobre a Actividade da Transcript£ se Inversa de HIV-1
Análogo de 2-5A ou 2*	,5· Concentração (micromolar)	Percentagem de In_i bição⁹
(adenosina) A	400	O
^A3	200	O
PH	200	29
p₃a₃	200	0
cordicepina (C)	400	0
^C3	200	31
Ρ°3	200	5
P₃ ^C3	60	100
^C4	200	39
^4	100	58
A-C-C	200	42
A-A-C	2 00	16
C-A-C	200	3 6^b
A-C-A	200	58
A—A-C-C	200	35^b
A-A-C-A	2 00	7
pi₃	200	35
A-A-ara-A	200	53
Tu-Tu-Tu	200	41
xilo-A. 4	200	15
A-A-A-3 ‘ -amino	200	43
EHNA-A-A	200	36

399

6056-13 (CIP) 2 PG

-41TABELA 9 (CONT.) ribósido de 5,6-dicloroben

200 ziraidazilil(2 ‘ ,5* )-5,6-di-clorobenziraidazilil-(2* ,5‘2 -5,6-diclorobenzimidazol

a. Valores para reacções de controlo (isto é, sem inibidor presente) foram maiores do que 180 OOO cpm, enquanto que os valores da reacção branca (sem enzima presente) foram menores do que 12 000 cpm.

b. Média de duas ou mais experiências.

Os resultados dos ensaios de infecção com alguns dos anâ logos de 2-5A são apresentados na Figura 2. Com referência â Fi. gura 2, a actividade anti-HIV-1 dependente da concentração foi observada pera o núcleo do trímero de 2*,5·-cordicepina (i) e 5·-monofosfato (IV) nas concentrações exógenas de 8-250 micromolar, e para ο 2‘,5’-A-C-A (V) a 1-8 micromolar. Estas actividades foram de 84%, 80% e 81%, respectivamente, da actividade anti-HIV-1 óptima, fornecida pelo ARN, de emparelhamento impe feito (dados não mostrados). Esta é uma actividade anti-HIV ba tante significativa considerando que o ARN^_C de emparelhamento imperfeito é uma droga anti-HIV potente in vitro. Montefiori e colab., Proc. Natl, Acad. Sei. USA 84: 2985-2989 (1987). Actividade anti-HIV-1 dependente da concentração menos potente foi observada para o 2*,5·-pC₄ (VI) a 12,5-50 micromolar. Não foi observada toxicidade celular para o C₃ e o A-C-A nas concentrações mais eficazes, enquanto que foi observada toxicidade moderada para o pC₃ e o pC^ em algumas destas concentrações antioirais óptimas.

Hl n|

Em contraste, a cordicepina (I) (0,31-10 micromolar) e o núcleo do trímero de 2’,5'-oligoadenilato (II) (8-250 micromolar) não demonstraram qualquer actividade antiviral. A toxi69 399

6056-13 (CIP) 2 PG

cidade celular foi observada com concentrações exógenas maiores do que 2,5 microtnolar para a cordicepina, enquanto que não foi observada qualquer toxicidade com qualquer das concentrações de núcleo do trímero de 2 · ,5* -oligoadenilato testadas. O 5’ tnonofosfato do tetrámero de 2*,5'-cordicepina (VI) demonstrou actividade anti-HIV-1 fraca in vitro (30-38% de protecção nas concentrações exógenas de 12,5 a 50 microtnolar), enquanto que as concentrações maiores do que 50 microtnolar foram tóxicas para as células (dados não apresentados).

No mesmo ensaio de infecção, a 2·,5'-xilo-A₄ proporcionou uma inibição de 1OO% à concentração de 150 microtnolar (91% a 75 micromolar), enquanto que o 2’,5·—A—A-A—3‘—amino proporcionou uma inibição de 100% a 75 micromolar. Não foi observada qualquer toxicidade com estas dosagens.

Quando combinados com outras drogas, os análogos de 2-5A podem exibir sinergismo em relação a actividade anti-HTV, tal como demonstrado pela experiência seguinte.

EXEMPLO 10

A capacidade do 2*,5’-C₃ para potenciar ou anular as actividades antivirais in vitro do interferãoCt recombinante (RIFN-Qaa) e de um ARN^_c de emparelhamento imperfeito indutor do interferão foi testada. Uma análise de quadro em xadrez padrão foi realizada com 8 concentrações não-tóxicas de cada dro ga, sózinha e em combinação. Os dados foram analisados pelo mé todo de Chou e Talay, Adv. Enzyme Regul. 22:27-55 (1984). Sucintamente, os efeitos de drogas combinadas foram calculados a partir dos valores de protecção em percentagem. 0 índice de com binação (IC) foi calculado a partir dos declives das curvas dose-efeito, e marcado contra os valores de protecção em percenta gem, ou fracção afectada. os valores de IC de <1 indicam sinergia. Os valores / 1 indicam antagonismo. Os valores iguais a 1 indicam efeito cumulativo. Os resultados são apresentados na Fi gura 3. 0 núcleo do trímero de 2',5·-cordicepina demonstrou sinergismo forte com ambos, RIFN-^A e ARN, de emparelhamento imac perfeito, nas doses mais eficazes de cadauma das drogas testa—

399

6056-13 (CIP) 2 PG tóa-43das. 0 sinergistno foi mais forte para o RIFN-&A do que para o ARN^ç de emparelhamento deficiente.

Todas as referências aqui citadas em relação aos proces^ sos sintéticos e analíticos são aqui incorporadas por referência.

O presente invento pode ser concretizado de outras formas específicas sem se afastar do espírito ou atributos essenciais do mesmo e, consequentemente, deve ser feita referência às reivindicações anexas como indicativas do âmbito do invento, em vez de à especificação anterior.

Claims

RE IVINDICAÇOES

1 - Processo para a preparação de uma composição para o tratamento de um mamífero com um distúrbio caracterizado por um defeito na via de
2-5A, processo que compreende a com binação com um veículo farmacêutico de, pelo menos, um com- em que n é um número de 1 a 8, m é O, 1, 2 ou 3, e

R, iguais ou diferentes, são seleccionados a partir de hidrogénio, hidroxi, amino, alcoxi ^e -OSi(CH₃) ₂C (CH₃) ₃ , desde que todos os grupos R não sejam hidroxi no mesmo composto, ou um seu sal farmacêuticamente aceitável, estando o agente activo presente na composição numa quantidade de cerca de 0,1 mg a cerca de 200 mg por ml da composição.

69 399

6056-13 (CIP) 2 PG

Λ'

-452 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracte rizado por n ser 1 a 3.
3 - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracte rizado por o grupo R do nucleótido 2'-terminal ser diferente de hidroxi.
4 — Processo de acordo com a reivindicação 2, caracte rizado por cada R, iguais ou diferentes, ser seleccionado de entre hidrogénio e hidroxi.
5 - Processo de acordo com a reivindicação 4, caracte rizado por o composto ser seleccionado a partir do grupo cons tituido por 3·-desoxiadenilil(2·,5·)3 *-desoxiadenilil(2¹,5 *)3 *-desoxiadenosina, os seus 5· mono-, di-e trifosfatos e os sais farmacêuticamente aceitáveis de qualquer um deles.
6 - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracte rizado por o composto compreender o 5·-trifosfato ou um seu sal farmacêuticamente aceitável.
7 - Processo de acordo com a reivindicação 4, caracte rizado por o composto ser seleccionado a partir do grupo cons tituído por 3*-desoxiadenilil(2',5‘)3^r—desoxiadenilil(2^,,5^t)3*-desoxiadenilil(2·,5*)3‘-desoxiadenosina, os seus 5* mono-, di- e trifosfatos e os sais farmacêuticamente aceitáveis de qualquer um deles.
8 - Processo de acordo com a reivindicação 4, caracte rizado por o composto ser seleccionado a partir do grupo cons tituído por adenilil(2', 5· ) 3 ·-desoxiadeniliK 2 ‘ ,5‘ ) 3 '-desoxia^ denosina, os seus 5· mono-, di- e trifosfatos e os sais farma cêuticamente aceitáveis de qualquer um deles.
9 - Processo de acordo com a reivindicação 4, caracte rizado por o composto ser seleccionado a partir do grupo cons tituído por adenilil(2‘,5')adenilil(2’,5*)3‘-desoxiadenosina, os seus 5* mono—, di- e trifosfatos e os sais farmacêuticamen te aceitáveis de qualquer um deles.
10 - Processo de acordo com a reivindicação 4, caracte rizado por o composto ser seleccionado a partir do grupo cons

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6056-13 (CIP) 2 PG tituído por 3 * -desoxiadenilil( 2 * , 5·) adenilil(2' , 5' ) 3 ^r -desaxia^ denosina, os seus 5* mono-, di- e trifosfatos e os sais farma cêuticamente aceitáveis de qualquer um deles.
11 - processo de acordo com a reivindicação 4, caracte rizado por o composto ser seleccionado a partir do grupo cons tituido por adenilil(2',5')3·-desoxiadenilil(2·,5*)adenosina, os seus 5‘ mono-, di— e trifosfatos e os sais farmacêuticamen te aceitáveis de qualquer ura deles.
12 - Processo de acordo com a reivindicação 11, caracte rizado por o composto compreender adenilil(2·,5·)3^r-desoxiadenilil-(2·,5·Jadenosina ou um seu sal farmaceuticamente aceitável.
13 - Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por o composto ser seleccionado a partir do grupo constituído por adenilil(2‘,5^,)adenilil(2‘,5*)3‘-desoxiadenilil(2*,5*)3’-desoxiadenosina, os seus 5* mono-, di- e trifosfatos e os sais farmacêuticamente aceitáveis de qualquer um deles.
14 - Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por o composto ser seleccionado a partir do grupo constituído por adenilil(2·,5‘)adenilil(2*,5')3·-desoxiadenilil(2*,5‘)adenosina, os seus 5· mono-, di- e trifosfatos e os sais farmacêuticamente aceitáveis de qualquer um deles,
15 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por cada R, iguais ou diferentes, ser seleccionado de hidroxi e amino.
16 - Processo de acordo com a reivindicação 15, caracterizado por o composto ser seleccionado a partir do grupo const/ tuido por adenilil(2·,5·)-adenililf2·,5*)3‘-amino-3'-desoxiadenosina, os seus 5‘ mono-, di- e trifosfatos e os sais farmacêuticamente aceitáveis de qualquer um deles.
17 - Processo de acordo com a reivindicação 16, caracterizado por o composto compreender adenilil(2*,5')-adenilil(2*5·)3'-amino-3*-desoxiadenosina ou um seu sal farmacêuticamente

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-47aceitável.
18 - Processo para a preparação de uma composição para o tratamento de um mamífero com um distúrbio, caracterizado por um defeito na via 2-5A, compreendendo o processo a combinação de um veículo farmacêutico com, pelo menos, um composto seleccionado a partir do grupo constituído pelos compostos se guintes, ou os seus 5‘ mono-, di- ou trifosfatos, ou um sal farmaceuticamente aceitável de qualquer um deles:

3^l-desoxiadenilil(2 *,5*)3·-desaxiadenílil(2·,5·)-(R)-3 —( 2 -desaxi-^?-D-er itr opent of uranosil) -3,6,7,8-tetra -hidroim/ dazo/~4,5,-d/7Z7 l,3J7diazepina-8-ol, adenilil(2* ,5^r)adenilil(2·,5·)tubercidina, tubercidilil(2*,5*)tubercidilil(2 *,5·)tubercidina, adenilil(2 *,5·)adenilil(2*,5*)9-0-D-arabinofuranosiladenina;

inosinilil(2·,5*)inosinilil(2*,5·)inosina, xiloadenilil(2·,5·)xiloadenilil(2*,5·Jxiloadenosina, xiloadenilil(2*,5’)xiloadenilil(2 *,5·)xiloadenilil(2·,5* Jxiloadenosina, eritro-9(2-hidroxi-3-nonil)adenilil-(2‘,5*)adenilil(2·, 5'Jadenosina,

5,6-diclorobenzimidazilil(2 * ,5· )5,6-diclorobenzimidazilil(2 *,5*)5,6-diclorobenzimidazolo, estando o agente activo presente na composição numa quantidade de cerca de 1 mg a cerca de 200 mg por ml da composição.
19 - Processo de acordo com a reivindicação 18, caracte rizado por o composto compreender 3*-desoxiadenilil(2*,5*)3*-desoxiadenilil(2' ,5' )-(R) -3— (2-desoxi-?)-D-eritropentof uranosil) -3,6,7,8-tetra-hidroimidazo/~4,5-d_7/7l,3/7diazepina-8-ol, o seu 5 mono-, ãi-, ou trifosfato, ou um sal farmacêuticamente aceitável de qualquer um deles.
20 - Processo de acordo com a reivindicação 18, caracte rizado por o composto compreender adenilil(2‘,5')adenilil(2·, 5·)tubercidina, o seu 5· mono-, di-, ou trifosfato ou um sal

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-48farmacêuticamente aceitável de qualquer um deles.
21 - Processo de acordo com a reivindicação 18, caracte rizado por o composto compreender adenilil(2‘,5')adenilil(2‘,

5' ) -9-Ç>-D-arabinofuranosiladenina, o seu 5* mono-, di- ou trifosfato, ou um sal farmacêuticamente aceitável de qualquer um deles .
22 - Processo de acordo com a reivindicação 18, caracte rizado por o composto compreender 1ηο3ΐηϋϋ(2·,5*)1ηο8ΐηϋϋ(2*,5^r)inosina, o seu 5’ mono-, di-, ou trifosfato, ou um sal farmaceuticamente aceitável de qualquer um deles.
23 - Processo de acordo com a reivindicação 18, caracte rizado por o composto compreender xiloadenilil(2*,5*)xiloaden/ lil(2*,5·)xiloadenosina, o seu 5· mono-, di- ou trifosfato, ou um sal farmaceuticamente aceitável de qualquer um deles.
24 - Processo de acordo com a reivindicação 18, caracte rizado por o composto compreender xiloadenilil(2',5·)xiloaden/ lil(2*,5*)xiloadenilil(2·,5')xiloadenosina, o seu 5· mono-, di- ou trifosfato, ou um sal farmaceuticamente aceitável de qualquer um deles.
25 - Processo de acordo com a reivindicação 18, caracte rizado por o composto compreender tubercidilil(2·,5·)tubercid/ lil(2*,5’)tubereidina_r o seu 5* mono-, di- ou trifosfato, ou um sal farmaceuticamente aceitável de qualquer um deles.
26 - Processo de acordo com a reivindicação 18, caracte rizado por o composto compreender eritro-9-(2-hidroxi-3-nonil) adenilil(2·,5')adenilil(2*,5’)adenosina, o seu 5' mono-, diou trifosfato, ou um sal farmaceuticamente aceitável de qualquer um deles.
27 - Processo de acordo com a reivindicação 18, caracte rizado por o composto compreender ribosido de 5,6-diclorobenzi midazilil(2',5·)5,6-diclorobenzimidazilil(2·,5')5,6-dicloroben zimidazol, o seu 5’ mono-, di- ou trifosfato, ou um sal farmaceuticamente aceitável de qualquer um deles.
28 - Processo para a preparação de um composto de fórmu

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6056-13 (CIP) 2 PG em que n é 1, m é 0, 1, 2 ou 3 , e

R, iguais ou diferentes, são seleccionados a partir de hidrogénio, hidroxi, amino, alcoxi ^5*^20 ^e “^0Sif^CH3)₂ ^C^^CH33 * desde que todos os grupos R no mesmo composto não sejam seleccionados a partir de hidrogénio e hidroxi, ou de um seu sal farmaceuticamente aceitável, caracteri zado por compreender:

a) prepara ção de um adenosina-2·-fosfodiéster bloqueado, por bloqueio do amino na posição 6 com benzoilo, bloqueio da t

bloqueio

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6056-13 (CIP) 2 PG “50“ posição 5’ com p-metoxitritilo e, facultativamente, da posição 3* com t-butildimetilsililo,

b) preparação de um nucleósido bloqueado, por bloqueio do amino na posição 6 com benzoílo e bloqueio das posições 2* e 3’ com um grupo bloqueador seleccionado a partir do grupo constituído por acetilo, benzoílo e t-butildimetilsililo,

c) condensação do referido adenosina-2*—fosfodiester blo queado e do referido nucleósido bloqueado, na presença de um reagente de condensação, o qual origina bloqueio de funções fos fato para formar um dinúcleosidomonofosfotriéster completamente protegido,.

d) destritilação da posição 5· terminal do referido dinu cleosidomonofosfotriéster completamente protegido por reacção com um agente de destritilação,

e) condensação do dinucleosidomonofosfotriéster destritilado em 5* com um adenosina-2‘-fosfodiéster bloqueado, na presença de um reagente de condensação para formar um 2‘,5'-tri. nucleosidodifosfoditriéster completamente protegido, e

f) (I) desprotecção do referido 2* ,5·-trinucleosidodifos foditriéster completamente protegido por tratamento com reagentes de desprotecção para formar um 2*,5*-trinucleosidodifosfato, ou (2) destritilação do 2',5·-trinucleosidodifosfoditriéster completamente protegido, e reacção do referido 2‘,5'-trinucleosidodif osf odiéster destritilado com um reagente de fosforilação, antes de iniciar o passo f) (1).
29 - Processo de acordo com a reivindicação 28, caracterizado por m ser zero.

30 - Processo de acordo com a reivindicação 28, caracte- rizado por o grupo R do nucleótido 2*-terminal ser diferente de hidroxi. 31 - Processo de acordo com a reivindicação 28, caracte-

rizado por R ser seleccionado a partir de hidroxi e amina.

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- M

TÍ 32 - Processo de acordo com a reivindicação 31, caracte rizado por o composto preparado compreender adenilil(2*,5·)ad£ _nilil-(2‘,5*)3·-amino-3·-desoxiadenosina, os seus 5’ mono-, di- e trifosfatos, e sais farmaceuticamente aceitáveis de qual^ quer um deles,
33 - Processo de acordo com a reivindicação 32, caracte rizado por o composto preparado compreender adenilil(2*,5·)ade nilil(2‘,5*)3'-amino-3·-desoxiadenosina ou um seu sal farmaceu ticamente aceitável,
34 - Processo de acordo com a reivindicação 28, caracte rizado por o composto preparado compreender 3'-0-t-butildimetilsilil-adenilil(2 ' ,5·)adenilil(2',5·)3·-0-t-butildimetilsilil-adenilil(2·,5·)adenosina, os seus 5' mono-, di- e trifosfatos, e sais farmaceuticamente aceitáveis de qualquer um deles .
35 - Processo de acordo com a reivindicação 30, caracte rizado por cada R ser hidroxilo, excepto para o R do nucleótido 2 ‘-terminal,, sendo este R terminal seleccionado a partir do grupo de alcoxi Cg-C^,
36 - Processo para a preparação de um composto seleccio nado a partir do grupo constituído pelos compostos seguintes, ou os seus 5‘ mono-, di- ou trifosfatos, ou um sal farmaceuticamente aceitável de qualquer um deles,

3*-desoxiadenilil(2*,5 *)3·-desoxiadenilil(2 ·,5*)-(R)-3-(2-desoxI-Ç)-D-eritropentofuranosil)-3,6,7,8-tetra-hidroimidaz4,5. -d_27Z7~l, 3_27diazepina -8-ol, adenilil(2‘,5‘)adenilil(2‘,5·)tubercidina, tubercidilil(2·,5')tubercidilil(2',5·)tubercidina, eritro-9(2-hidroxi-3-nonll)adenilll(2·,5’)adenilil(2‘,

5·)adenosina, ou

5,6-diclorobenzimidazilil(2',5' )5,6-diclorobenzimidaz^ lil(2*,5*)5,6-diclorobenzimidazolo, caracterizado por compreender:

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6056-13 (CIP) 2 PG

-52a) preparação de um adenosina-2·-fosfodiéster bloqueado, por bloqueio de amino na posição 6 com benzoilo, bloqueio da posição 5* com p-metoxitritilo e, facultativamente, bloqueio da posição 3* com t-butildimetilsililo,

b) preparação de um nucleósido bloqueado, por bloqueio de amino na posição 6 com benzoilo e bloqueio das posições 2’ e 3* com um grupo bloqueador seleccionado a partir do grupo constituido por acetilo, benzoilo e t-butildimetilsililo,

c) condensação do referido adenosina-2¹-fosfodiéster bloqueado e do referido nucleósido bloqueado, na presença de um reagente de condensação, o qual origina o bloqueio das funções fosfato para formar um dinucleósido monofosfotriéster com pletamente protegido,

d) destritilação da posição 5'-terminal do referido dinucleosidomonofosfotriéster completamente protegido por reacção com um agente de destritilação,

e) condensação do dinucleósidomonofosfotriéster destriti lado em 5' com um adenosina-2·-fosfodiéster bloqueado, na presença de um reagente de condensação para formar um 2',5’-trinucleosidodifosfoditriéster completamente protegido, e

f) (1) desprotecção do referido 2',5*-trinucleosidodifo£ foditriéster completamente protegido por tratamento com reagentes de desprotecção para formar um 2’,5'-trinucleosidodifosfato, ou (2) destritilação do 25·-trinucleosidodifosfoditriéster completamente protegido, e reacção do referido 2‘,5*-trinucleosidodifosfodiéster destritilado com um reagente de fosforilação, antes de iniciar o passo f) (1).
37 - Processo de acordo com a reivindicação 36, caracte rizado por o composto compreender 3'-desoxiadenilil(2',5·)3’-desoxiadenilil(2‘ ,5’ ) —(R)-3 —(2—desoxi—(^>-D-er itropentof urano— sil)-3,6,7, 8-tetra-hidroimidazo/^-4,5, -d ~77~ 1.3 7dlazeplna-8-ol. o seu 5* mono-, di- ou trifosfato, ou um sal farmaceuticamente aceitável de qualquer um deles.

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6056-13 (CIP) 2 PG

-5338 - Processo de acordo com a reivindicação 36, caracte rizado por o composto compreender adenilil(2^r,5')adenilil(2*, 5')tubercidina, o seu 5· mono-, di- ou trifosfato, ou um sal farmaceuticamente aceitável de qualquer um deles.
39 - Processo de acordo cora a reivindicação 36, caracte rizado por o composto compreender tubercidilil(2*,5*)tubercid/ lil(2·,5’)tubercidina, o seu 5' mono-, di- ou trifosfato, ou um sal farmaceuticamente aceitável de qualquer um deles.
40 - Processo de acordo com a reivindicação 36, caracte rizado por o composto compreender eritro-9(2-hidroxi-3-nonil)adenilil(2',5')adenilil(2·,5*)adenosina, o seu 5‘ mono-, diou trifosfato, ou um sal farmaceuticamente aceitável de qualquer um deles.
41 - Processo de acordo com a reivindicação 32, caracte rizado por o composto compreender ribosido de 5,6-diclorobenz/ midazilil(2*,5·)5,6-diclorobenzimidazilil(2',5*)5,6-dicloroben zimidazolo, o seu 5' mono-, di- ou trifosfato, ou um sal farma ceuticamente aceitável de qualquer um deles.