PT86885B

PT86885B - Processo de preparacao de compostos que inibem o crescimento de celulas neoplasticas para utilizacao no tratamento de doencas cancerigenas

Info

Publication number: PT86885B
Application number: PT86885A
Authority: PT
Inventors: Daniel R Twardzik; Anthony F Purchio; Shiu-Lok Hu; Hans Marquardt; Joseph P Brown; George J Todaro; A Gregory Bruce; Timothy M Rose; Suo Win Liu; Thomas J Franceschini; David Lee
Original assignee: Oncogen
Priority date: 1987-03-02
Filing date: 1988-03-02
Publication date: 1995-08-09
Also published as: ATE123061T1; NZ223696A; ES2074049T3; IE69678B1; AU1492488A; FI885031A; IE880591L; IL85613A; FI885031A0; IL85613A0; EP0281363B1; AU623589B2; GR3017041T3; DE3853842D1; JPH01503513A; PT86885A; FI100336B; DE3853842T2; EP0281363A2; KR890700672A

Description

Referência Remissiva a Pedidos Relacionados Este pedido é uma continuação em parte do Pedj_ do de N⁵. de série 115.139, depositado em 30 de Outubro de 1987, e do Pedido de N^e. de série 020.609, depositado em 2 de Março de 1 987, sendo o último uma divisão do P_e dido de N^Q. de série 912.407, depositado em 26 de Setem bro de 1986, que é uma divisão do Pedido de Ν^ρ. de série 712.302, depositado em 15 de Março de 1985, presentemen_ te Patente Americana N^e.4.645.828, emitida em 24 de Fevereiro de 1987, que é uma continuação em parte do Pedido N^Q. de série 592.969, depositado em 23 de Março de 1 984, prese_n temente Patente Americana N^?. 4.590.003, emitida em 20 de Maio de 1986, cujos pedidos estão aqui incorporados como referência.

INTRODUÇÃO

Campo Técnico

São reveladas composições reguladoras do cres. cimento celular, onde os compostos inibem, preferencia_l_ mente o crescimento de células neoplásticas.

Antecedente s

A complexidade da regulação de diferenciação e proliferação de, e por células hematopoiéticas estâ a tornar-se cada vez mais aparente pois a lista de factores isolados que controla estes acontecimento continua a crescer. Na maioria, estes factores estão presentes em quantidades extraordinariamente exactas, em associação com numerosas outras proteínas que servem uma vasta variedade de funções. Os factores que foram isolados e demonstraram ter actividade incluem polipetídeos e proteínas tais como Y-interferão , o factor de crescimento derivado das plaquetas, o factor estimulante de colónia, inter1eucina-2, eritropoietina , assim como muitas outras linfoquinas. 0 isolamento, a purificação e a caracterização destes componentes do sangue, assim como a pre paração eficiente de grandes quantidades destes peptídeos tem um grande interesse devido à sua possível utilização no tratamento do cancro, assim como a sua utilização no estudo de doenças como o cancro.

Literatura importante

Ηo 11ey e outros , Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1980) 7/:5989-5992, descreve a purificação de inibidores do crescimento de células epiteliais. Nelsen-Hami1ton e Holley, ibidem ( 1 983) 80: 5636-5640, descrevem o efeito de um inibidor do crescimento e factor de crescimento epidé_r mico na incorporação de metionina marcada rad i oact i vame_n te em proteínas segregadas por células de macacos verdes africanos (BSC-1). Morgan e outros, Thromb. Haemost. (1980) 42:1652-60 providenciaram a sequência aminoácida para o factor 4 das plaquetas humanas. Dawes e outros, Thromb. Res. ( 1983 ) 29:569-81 e Schernthaner e outros, Acta Med. Austríaca (suplemento) ( 1 979 ) _6 : 3 7 5 - 9 remetem anticorpos policlonais ao factor 4 das plaquetas. Lawler, Thromb. Res. (1981) 2/:121-7 compara as sequências e estruturas de B-tromboglobulina com o factor 4 das plaquetas. Taylor e outros, Nature (1982) 297:307-312 revelou que o factor 4 das plaquetas produz uma zona avascular na membra na corioalantoica do pinto e que os inibidores angiogénicos podem ser possivelmente usados clinicamente para tratar neoplasmas altamente angiogénicos tais como os tumores cere brais. No entanto, foi provado que a protamina, um outro —:

inibidor angiogénico, não tem citotoxicidade directa nas células tumorais de cultura e, nalguns casos, até estinw la o seu crescimento. Machin e outros, J. Mol. Bio 1. (1984) 172:221-222 revelou a crista1ização do factor 4 das plaquetas, Folkman e outros em Ciba Symposium 100 (1983) p. 132-139 (Pitman Books, London) revelou que o factor 4 das plaquetas inibe a angiogénese promovida por heparina.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

São obtidas composições de polipetídeos e méto dos para a sua utilização, e estes caracterizam-se por ter, pelo menos, uma das seguintes propriedades: capacidade de inibição do crescimento do tumor, não inibindo o crescimento das células normais, capacidade de estimular a autofosforilação pp60 src, capacidade de produzir segregações de proteínas 52 kD a partir de células tumorais; e tendo uma sequência de aminoácidos substancia 1 mente equivalente a, pelo menos, uma porção de um polipetídeo isolável de plaquetas mamíferas e contendo, pelo menos, uma das propriedades previamente indicadas. Os métodos de preparação i_n cluem clonagem e expressão em células procarióticas.

BREVE DESCRIÇÃO DOS GRÁFICOS

A Figura 1 é uma tabela comparando o efeito do factor 4 das plaquetas no crescimento de um tumor em ratos at ím i cos .

A Figura 2 é um mapa restritivo do gene sintético do factor 4 das plaquetas; e

A Figura 3 é a sequência DNA do factor 4 das pl_a quetas indicando os aminoácidos previstos.

DESCRIÇÃO DAS INCORPORAÇDES ESPECÍFICAS

São obtidas composições contendo polipetídeos, de rivados, fragmentos, ou seus análogos e formulações conte_n do tais composições que inibem o crescimento de células neo plásticas de mamíferos. Estes polipetídeos estão relacio3 nados com um polipetídeo que ocorre naturalmente chamado factor 4 das plaquetas, presente na fracção etanóica HC1 obtida por extracção de plaquetas.

factor 4 das plaquetas humanas tem a seguinte sequência:

E-A-E-E-D-G-D-L-Q-C-L-C-V-K-T-T-S-Q-V-R-P-R-H-I-TS-L-E-V-I-K-A-G-P-H-C-P-T-A-Q-L-I-A-T-L-K-N-G-R-KI-C-L-D-L-Q-A-P-L-Y-K-K-I-I-K-K-L-L-E-S

Os polipetídeos são estáveis a temperaturas mo deradas (0-25°C), a um pH baixo, geralmente abaixo de mais ou menos pH 3, estando normalmente em pH 2. Os polipetídeos têm um peso molecular na medida dos, mais ou menos, 5.000-8.000, mais exactamente na medida dos, mais ou menos, 6.000-7.500, particu 1armente à volta dos 7.000. 0 factor das plaquetas é obtido de plaquetas de mamíferos superio res, especialmente primatas, principa1 mente humanos.

Os compostos de polipetídeos utilizados terão de cerca de 15 a 80 aminoâcidos, em que os respectivos polipetídeos ocorrendo naturalmente e os seus análogos miméticos terão de cerca de 60 a cerca de 75 aminoâcidos, mais frequentemente de cerca de 65 a cerca de 72 aminoâcidos, eri quanto os fragmentos normalmente variarão de cerca de 15 a cerca de 60 aminoâcidos, mais frequentemente de cerca de 15 a cerca de 35 aminoâcidos. São de particular interesse os polipetídeos contendo de cerca de 58 a cerca de 72 aminoác_i_ dos, especialmente 69, 70 ou 71 aminoâcidos. Estes polipetídeos podem ser ligados a outros compostos, tais como antigénios, receptores e marcadores ou outros.

São também obtidos materiais como o factor 4 das plaquetas, incluindo fragmentos do factor 4 das plaquetas, mutantes do polipetídeo, assim como peptídeos de fusão, com —“Μ—r preendendo ο factor 4 das plaquetas ou uma sua porção fun cional, tendo a actividade biológica do factor 4 das plaquetas intacto, incluindo a actividade moduladora do cre_s cimento celular, a actividade de ligação aos receptores e a actividade imunológica.

Os polipetídeos desta invenção incluem congéneres do factor 4 das plaquetas, nomeadamente compostos teji do, pelo menos, uma actividade biológica correspondente à do factor 4 das plaquetas, e tendo, pelo menos, uma sequén cia de aminoácido com substancialmente a mesma sequência de aminoácidos que o factor 4 das plaquetas em que o congénere pode ser de maior ou menor número de aminoácidos que o factor 4 das plaquetas. A actividade biológica inlui reactividade imunológica cruzada com o factor 4 das pia quetas obtido naturalmente, ou ligação do factor 4 das pl_a quetas a moléculas receptoras com alta afinidade. Por reactividade imunológica cruzada entende-se que um anticorpo induzido por um novo polipetídeo desta invenção irá reagir em cruzado com o factor 4 das plaquetas intacto, pe los menos quando o factor 4 das plaquetas está em estado desnaturado. Por alta afinidade entende-se uma constante dissociação (K^) de, pelo menos, cerca de Por receptor do factor 4 das plaquetas entende-se um local de ligação à superfície duma célula que liga, especificamente, o factor 4 das plaquetas com alta afinidade, sendo a ligação saturável e não inibida por polipetídeos estruturalmente não relacionados. Alguns dos polipetídeos podem também travar a actividade moduladora do crescimento das células do factor 4 das plaquetas obtido natura 1 mente, a qual inclui a i n i bj_ ção do crescimento de células neoplásticas. A actividade moduladora do crescimento de células pode ser diferente da do factor 4 das plaquetas obtido naturalmente, normalmente reduzida. Os polipetídeos terão pelo menos uma sequência biologicamente activa, por exemplo, imunológica ou epitópj_ ca, e podem ter mais de uma sequência biologicamente activa, sequência essa que pode competir com um produto que ocorre naturalmente, para a propriedade biológica.

As definições dos	aminoácidos estão abaixo desi
gnadas.
Neutro (Ne)
alifático (Al )
não substituido	G,	A, V, L, I , P
substituido
ox i	s,	T
t i 0	c,	M
amido	N,	Q
aromático (Ar)
não substituido	F
substituido	Y
heteroc í c1i co	H,	W
Carregado (a pH 6,0)
básico	K,	R
ac í d i co	D,	E

As abreviações entre parênteses referem-se aos grupos aminoácidos específicos. Por não substituido entende-se nenhuns outros heterosubstituintes além do grupo carboxilo e amino presente na glicina. Os aminoácidos são os L-aminoácidos que ocorrem naturalmente.

Os aminoácidos neutros podem ser também descritos como tendo grupos-R apoiares ou polares (mas sem car ga). Os aminoácidos que se enquadram nesta definição são os seguintes:

Aminoácidos apoiares A, V, L, I, P, M, F, W Aminoácidos polares G, S, T, C, Y, N, Q

As composições em análise terão uma extremidade

N-terminal acídica (aniónica), e uma extremidade C-Terminal básica (catiónica), em que as regiões com carga podem ter de 6 a 15 aminoácidos, normalmente 6 a 12 aminoácidos, em que a região incluirá uma sequência de aminoácidos de 6 a 8 aminoácidos, na qual pelo menos 50%, normalmente 60% são aminoácidos iónicos, e normalmente não mais de 90% são aminoácidos iónicos.

Essas composições tendo pelo menos cerca de 60 aminoácidos terão as zonas carregadas separadas por, pelo menos, 25 aminoácidos, normalmente pelo menos 40 aminoácj_ dos e menos de cerca de 70, normalmente menos de cerca de 65 aminoácidos. A sequência de ligação de aminoácidos que separa as zonas carregadas terá normalmente um excesso de aminoácidos catiónicos sobre aminoácidos aniónicos, tendo geralmente de cerca de 1,5 para 3, normalmente de um rácio de cerca de 2 para 1, com o pK do composto na medida de cerca de 6,5 para 8, particularmente à volta de 7,4.

Haverá normalmente duas pontes bisulfito na sequência de ligação onde os bisulfitos que estabelecem as pontes são de cerca de 20 a 45, estando normalmente 22 a 40 aminoácidos isolados, de preferência separados por ce_r ca de 25 a 39 aminoácidos,. As cisteinas proximais à extre midade N-terminal serão de cerca de 8 a 16 aminoácidos da extremidade N-terminal, sendo as cisteinas proximais da extremidade C-terminal, de cerca de 12 a 45 aminoácidos, normalmente de cerca de 16 a 40 aminoácidos da extremidade C-terminal.

As composições em estudo terão normalmente uma sequência proximal da extremidade N-terminal, a qual tem a fórmula do pentapeptídeo E-A-E-E-D, mais correntemente o decapeptídeo E-A-E-E-D-G-D-L-Q-C, frequentemente o pentadecapeptídeo E - A - E - E - D - G - D - L - Q - C - L· - C - V - K - T, e tendo mais frequentemente a seguinte fórmula:

E-A-E-E-D-C-D-L-Q-C-L-C-V-K-T-T-S-Q-V-R-P-R-HEm que as letras têm o seguinte significado como conven7

c i onado:
A	- a 1an i na	P -	prolina
C	- c i ste i na	Q -	g 1 utam i na
D	- ácido aspártico	R -	arg i n i na
E	- ácido glutâmico	S -	seri na
G	- g1i c i na	T -	treon i na
H	- hi st id i na	V -	va1i n a
L	- leucina
	Deve-se compreender que	podem	ser feitas subs-
t i tu i ções	conservativas de aminoácidos.	As alterações

conservativas incluem substituições envolvendo D e E; F e Y; K e R; G e A; N e Q; V,1 e R, e outras semelhantes. Em alguns casos, serão de desejar trocas não-conservativas, por exemplo, substituindo K ou R por N ou Q. Esta substituição é de particular interesse pois está presente num lo cal de clivagem de protease aminoacídica dibásica, por exem pio, K-R, em que a substituição protege o local contra clivagem proteolítica.

Podem ser também envolvidas inserções ou deleções em que estas envolverão de 1 a 2 aminoácidos, particula_r mente 1 aminoácido.

Novos polipetídeos em estudo terão, na maioria, a seguinte fórmula:

^AcR ’ ^MR ’ ^BaR em que:

Ac_r (região acídica) é a região de extremidade N-terminal e é caracterizada por ter de 10 a 20 aminoácidos dos quais de quatro a cinco são acídicos, pelo menos dois do primeiros três aminoácidos são acídicos, dois aminoácidos acídicos estão atrás um do outro, e outros dois aminoácidos acídicos estão separados por um aminoácido alifático neutro; estão presentes dois resíduos C separados por um único aminoácido alifático neutro; 0 C-X-C está separa

do de D ou de E-X-D ou de E por, de dois a seis aminoácj dos ;

M_R é a região média, sendo tanto um pequeno gru po de ligação de 2 a 30 átomos de carbono, como tendo de cerca de 25 a 40 aminoácidos·, tendo dois resíduos C sep_a rados das cisteinas de Ac_R por pelo menos 10, normalmente não menos de 20 aminoácidos, e formando cada um destes re síduos C uma ponte bisulfito com um dos resíduos C em Ac_R. tendo de cinco a sete aminoácidos básicos, e de dois a cinco, normalmente de três a quatro aminoácidos acídicos;

Ba_R (região básica) é a região de extremidade C-terminal, e é caracterizada por ter de 12 a 30 aminoácidos; tendo dois pares de aminoácidos básicos, cada um sucedido por, de dois a três aminoácidos alifáticos neutros; ou polares ou apoiares, normalmente apoiares; tendo um resíduo P de 10 a 15 aminoácidos do aminoâcido de extremid_a de C-termina 1.

E desejável que Ac_R tenha a seguinte fórmula (onde dois aminoácidos estão indicados no mesmo local, ou o aminoâcido pode estar presente nesse mesmo local):

(H)-aa¹-aa²-aa^-£-X¹-£-aa⁶-^-aa⁸-aa⁹-X²-C-aa¹¹-C-aa¹⁸-_R-X⁸

Em que:

(H) significa hidrogénio na extremidade N-termi-

3 nal; aa ’ pode ser uma ligação ou um aminoâcido alifâtico de, desde 2 a 6 átomos de carbono, normalmente um aminoácç do acídico ou um aminoâcido apoiar de, desde 2 a 3 átomos de carbono;

3 aa ’ pode ser uma ligação ou um aminoâcido alifático de, desde 2 a 6 átomos de carbono, normalmente um aminoâcido acídico ou um aminoâcido apoiar de 2 a 3 átomos de carbono;

aa pode ser uma ligação ou um aminoâcido alifático de 2 a 6 átomos de carbono, normalmente um aminoáci9

do básico, aminoácido polar de 3 a 5 átomos de carbono, ou um aminoácido apoiar de 2 a 3 átomos de carbono;

X é uma ligação ou uma sequência aminoácida de 1 a 2 aminoácidos, ou de 2 a 6, normalmente de 4 a 6 átomos de carbono, os quais são apoiares alifáticos ou aminoác_i_ dos polares;

a é 0 ou 1 ;

aa^ é um aminoácido alifático de 2 a 6, normalmente de 2 a 4 átomos de carbono que pode ser apoiar ou polar , ou um aminoácido acídico;

Q aa é um aminoácido alifático de 2 a 6, normalmente de 5 a 6 átomos de carbono, normalmente apoiar;

-· 9 aa é um aminoácido alifático de 2 a 6, normalmen te de 4 a 5 átomos de carbono, especia 1 mente carboxamida polar.radical ou bás i ca ;

X é uma ligação ou uma sequência aminoácida de 1 a 2 aminoácidos alifáticos de 2 a 6 átomos de carbono, principalmente aa aminoácidos neutros;

é um aminoácido alifático de 2 a 6, normal

mente	de
lares	ou
mente	de
de 1	a 3
ácida	de

a 6 átomos de carbono, os quais podem ser apopo1 ares;

3 aa é um aminoácido alifático de 2 a 6, normaj_ 5 a 6 aminoácidos, principal mente apoiares;

X é uma ligação, um grupo hidroxilo, alcoxilo átomos de carbono, amino, ou uma sequência amino 1 a 6, normalmente de 1 a 3 aminoácidos, normalmente alifáticos neutros e tanto apoiares como polares, principalmente polares, sendo normalmente neutros os três 3 primeiros aminoácidos, em que X pode terminar a molécula ou ser uma ligação para M_R, Ba_R, ou um antigénio.

Os aminoácidos preferidos para os símbolos são os seguintes:

3 aa ¹ - 1 igação, D, Ε, G, A;

aa - 1 igação, G, A, K, R, S, T;

X - ligação, (S ou T)_Q-(V, L ou I) ;

aa⁶ - S, T, G, A, D, E;

aa⁸ - V, L, I;

aa⁸ - N, Q, K, R;

X² - (G ou A) -(D ou E) -(V, L ou I) : 11 a a a aa - V, L, I, M, S, T;

3 a a ⁰ - V, L, I ;

X³ - ligação-(S ou A, ^{N ou} Q)_a ou L) -(K, R, N, Q, H F ou Y) : Q d a é 0 ou 1 ; e b é um número inteiro de 0 a 3.

seguinte fórmula:

Desejavelmente, Ba_R terá a

	51 _r 53	D	55		56	57 _n
aa	-C-aa	-_E-aa	aa	-aa	-P-aa
K	K 63	64	64a	K	K	67 68
R	_R-aa -aa	-aa	R	-_R-aa -aa

Em que:

56 aa ’ são um aminoácido alifático acídico ou seu amido de 4 a 5 átomos de carbono;

aa sao aminoácidos alifáticos, principa1 mente apoiares, de 2 a 6, principalmente de 5 a 6 átomos de carbono;

aa é um aminoácido alifático de 2 a 6 átomos de carbono, principal mente apoiar de 4 a 6 átomos de car bono, ou um aminoácido básico;

aa é um aminoácido alifático de 3 a 5 átomos de carbono, principalmente polar , tendo um radical hidroxil ou amida, ou acídico;

aa é um aminoácido alifático neutro de 2 a 6 átomos de carbono, tanto apoiar, principalmente de 4 a 6 átomos de carbono, como polar de 4 a 5 átomos de carbono tendo uma funcionalidade carboxamida ;

aa é um aminoácido alifático de 2 a 6 átomos de carbono, principalmente apoiar de 2 a 3 átomos de car bono, ou um aminoácido básico;

9 aa é um aminoácido al ifático de 2 a 6 , norma_l_ mente de 4 a 6 átomos de carbono, normalmente apoiar ou t á s i c o ;

aa⁶⁰ é um aminoácido alifático ou aromático, principalmente, se alifático, de 4 a 6 átomos de carbono;

aa^^4a é uma ligação ou um aminoácido alifático polar de 4 a 5 átomos de carbono, principa1 mente radical carboxamida;

r o aa é um aminoácido alifático de 2 a 6 átomos de carbono, principalmente apoiar;

X é um hidroxilo, alcoxilo de 1 a 3 átomos de carbono, arnino, ou uma sequência de aminoácido de 1 a 4, normalmente de 1 a 2 aminoácidos, principalmente aminoác_i_ dos alifáticos, principalmente aminoácidos polares e acídicos, tendo de 0 a 1 aminoácido apoiar, de 2 a 3 átomos de carbono, de 0 a 3 aminoácidos acídicos, e de 0 a 3 am_i_ noácidos alifáticos com radical hidroxil, em que X⁴pode terminar a molécula ou ser uma ligação a um antigénio ou a uma imunog1obu1ina.

São de particular interesse os símbolos que têm as seguintes definições: a/»·⁵⁶aa⁴¹aa⁴⁷aa⁵⁵aa⁵⁷„45,59 d d aa⁶⁰ aa^64a aa⁶⁸ X⁴ - (G (0 a é 0 ou 1; e

D, E, N,

Q;

,42,51,53,63,64,67

V, L ou I;

N, Q,	s,	T,	D,	E;
N, 0,	P,	L,	I ,	V,
G, A,	K o	u R	J
- v,	L,	I,	K,	R;
V, L,	I,	F,	H,	Y;
1 igaç	ãO ,	N	ou	Q;
G, A,	P,	L,	I ,	V;
, A, D	ou	E)	a	(
ou E)	c	(T	ou	S

a ’ , T, D, A, G ou E) d particularmente P ou L;

c é de 0 a 2.

De preferência, incluirá uma sequência de, pelo menos, cerca de 15 aminoácidos incluídos na seguinte fórmu1 a :

Em que:

aa é um aminoácido aromático ou um aminoácido alifático polar de 3 a 5 átomos de carbono, principalmente um aminoácido de radical amida;

aa é um aminoácido alifático apoiar de 2 a 6, normalmente de 5 a 6 átomos de carbono;

aa é um aminoácido alifático polar de 3 a 5 át£ mos de carbono, principalmente um aminoácido de radical amida ou hidroxil;

29 30 aa ’ ’ são aminoácidos alifáticos apoiares de 5 a 6 átomos de carbono;

aa é um aminoácido alifático de 2 a 6 átomos de carbono, ou apoiar de 2 a 3 átomos de carbono, ou básico;

aa é um aminoácido alifático de 3 a 6, normalmente de 3 a 5 átomos de carbono, que é apoiar ou polar, pr i nc i pa 1 mente -radical hidroxil;

aa é um aminoácido alifático de 2 a 6, normalmente de 3 a 5 átomos de carbono, que é apoiar ou polar, principa1 mente radical prolina ou carboxamida;

o o aa é um aminoácido alifático polar de 3 a 5 át£ mos de carbono, normalmente radical amida ou hidroxil;

9 aa é um aminoácido alifático apoiar de 2 a 6 áto mos de carbono;

aa é um aminoácido alifático acídico ou seu am_i_ do de 4 a 5 átomos de carbono;

aa é um aminoácido apoiar alifático de 5 a 5 áto mos de carbono; e

X é uma ligação, hidroxil , alcoxi, de 1 a 3 áto mos de carbono, em que X pode terminar a sequência, e ser uma ligação a Ba_R ou a um antigénio.

São de particular interesse as seguintes deH nições para os símbolos:

a a	F,	H,	Y,	N,	Q;
24,27,29,30,41 α α	—	v,
-...25,38 α α		s,	T,	N,	Q;
aa³’·³²	-	G,	A,K,	R;
aa³⁴ -	P,	s,	T;
aa³⁷ -	p,	N,	Q;
aa³⁸ -	s,	T,	N,	Q;
aa³⁹ -	6,	A,	p,	v,	L,
aa⁴⁰ -	D,	E,	N,	Q;	e
aa⁴¹ -	V,	K,	ou	U

L, I;

Como é evidente pelas fórmulas acima indicadas, podem ser feitas várias substituições conservativas nas s_e quências acima indicadas, sem afectar significativamente a actividade fisiológica do polipetídeo. Podem também ser empregues deleções ou inserções de 1 a 2 aminoácidos. No_r malmente, não mais que 5, geralmente não mais que 3 alterações (substituição, deleção, ou inserção) serão feitas na mesma sequência.

São de particular interesse para utilização ne_s ta invenção os compostos tendo a seguinte sequência:

E-A-E-E-D-G-D-L-Q-C-L-C-V-K-T-T-S-Q-V-R-P-R-H-I-TS-L-E-V-I-K-A-G-P-H-C-P-T-A-Q-L-I-A-T-L-K-N-G-R-KI-C-L-D-L-Q-A-P-L-Y-K-K-I-I-K-K-L-L-E-S ou seus análogos, principalmente os análogos ou fragmentos que incluem os quatro resíduos C, aproximadamente nas suas respectivas posições, e os 12 aminoácidos na ou proximais da extremidade C-terminal, principalmente os 10 aminoácidos proximais da extremidade C-terminal, e especialmente os 8 aminoácidos proximais da extremidade C-terminal, que

inclui quatro aminoácidos básicos e quatro alifáticos neutros. Os análogos da composição acima indicada terão normalmente, pelo menos, cerca de 80%, mais corre_n temente, pelo menos, cerca de 85% e, de preferência pelo menos cerca de 90% dos mesmos aminoácidos da sequência acima indicada ou parte da mesma sequência.

Preparação do Factor 4 das Plaquetas e Congéneres do mesmo

As composições de polipetídeos ocorridos natura_l_ mente, utilizadas nesta invenção, podem ser obtidas com grande grau de pureza como estabelecido por bioensaios de grande sensibilidade. As composições de polipetídeos oco_r ridos naturalmente terão menos de cerca de 20%, mais corre£ temente menos de cerca de 10%, e de preferência menos de 5% por peso de polipetídeos, além do principal constituinte presente na composição, cujos polipetídeos contaminadores estão associados- com plaquetas.

factor 4 das plaquetas pode ser obtido por extracção de plaquetas com, aproximadamente, uma solução etanólica de ácido clorídrico 0,3 M. Como inibidores contra a degradação podem ser também incluídos o fluoreto de fenilmeti1su1feni 1 e aproteinina, o primeiro em concentrações de cerca de 1-10% por peso da composição de extracção, e o último em concentrações de cerca de 0,1-1 UIT/mg (UIT- unidades de i n i b_i_ ção de tripsina) da composição de extracção. Depois de el_e var o pH até cerca de 5, utilizando hidróxido de amónio aquo so, é adicionada uma pequena quantidade de acetato de amónio e a solução é clarificada por centrifugação ou outros meios convenientes.

A proteína é então precipitada pelo emprego de eta noi frio (95%) seguido de éter, o precipitado é colectado e dialisado contra 0,1-0,5 M de ácido acét i co ,· empregando uma membrana de diálise com uma porosidade superior a cerca de 3,000 Mr. 0 resíduo é liofilizado, resuspendido em 1 M de ácido acético, clarificado e está então pronto para uma nova

purificação por cromatografia de impregnação de gel, utilizando-se Biogel P-10. 0 produto é eluido com cerca de

M de ácido acético e as várias fracções são controladas empregando um ensaio técnico apropriado, por exemplo, a inibição do crescimento de tumores.

As fracções contendo actividade inibidora do crescimento são 1 iofi 1 izadas , resuspendidas em ácido trifluoracético (TFA) aquoso diluído, pH 2-3, clarificadas, e então cromatografadas em cromatografia líquida de alta pressão (HPLC), em que o recheio sílica tem revestimento de uma longa cadeia al ifática de cerca de 16 a 20 átomos de carbono, por exemplo, 18 átomos de carbono. A coluna é equilibrada com TFA diluído (0,02-0,1%), e o produto elu_i_ do com um gradiente de acetonitrilo de mais de 60% de acetonitrilo em diluição (0,01-0,1, normalmente cerca de 0,04-0,05%) TFA. E utilizado um fluxo relativamente lento de, geralmente cerca de 0,5 para 1 ml/min. em temperaturas ambientes. As fracções podem ser ensaiadas pe la experiência de inibição do crescimento tumoral, ou outro bioensaio. Para maior purificação, o produto obtido da coluna pode ser purificado através da utilização de gel de alta pressão de cromatografia de exclusão.

pico da actividade do factor 4 das plaquetas di_s solvidas por Novapak fase invertida de HPLC é 1 iofi 1 iz_a do e resuspendido em 100 ^1 de 40% de acetonitrilo contendo 0,1% de TFA. A amostra é injectada numa coluna de gel pol_i_ éter hidroxilada (BioRad TSK-250) e eluida numa fase móvel consistindo em 40% de acetonitrilo em 0,1% de TFA. São liofilizadas e testadas as aliquotas de cada fracção para a actividade do factor 4 das plaquetas; a actividade inibidora das células tumorais elui simultaneamente com o pico máximo de peptídeos (R^-0,9), que também corresponde em peso molecular ao de 6.000 Mr marcador de insulina, utilizado para calibrar este sistema de cromatografia.

produto obtido da coluna pode ser sujeito a e 1 ectroforese pelo emprego de SDS-PAGE. A banda de peso molecular de cerca de 6.000-8.000 é isolada. Provou-se que a banda tem uma forte actividade inibidora do crescimento contra células neoplásticas de mamíferos.

Em vez de isolar o factor 4 das plaquetas de fo£ tes naturais, ou de sintetizar o polipetídeo ou seus congé. neres num suporte sólido, o factor 4 das plaquetas e seus fragmentos ou análogos, assim como proteínas de fusão em que o factor 4 das plaquetas é fundido com, por exemplo, uma sequência principal de um gene procariótico, pode ser preparada por tecnologia do DNA híbrido. 0 gene estrutural para o factor 4 das plaquetas' pode ser obtido a partir do genoma de células hospedeiras utilizando padrões preparados baseados na sequência aminoácida. Pode procurar-se um património genético usando o padrão (que pode ser convenientemente redundante), hibridizando os fragmentos isolados e os fra mentos reduzidos em tamanho e caracterizados por mapeamento por restrição e sequênciação.

Alternativamente, um património cDNA pode ser procurado analogamente ao património genético, e se os genes estruturais completos ou parciais estão isolados estes podem ser usados, os últimos pela utilização de um adaptador para substituir quaisquer codões que faltem.

Convenientemente, um gene sintético pode ser sintetizado. Consegue-se uma substancial flexibilidade através da utilização de um gene sintético, pelo que podem ser empr£ gues codões preferidos de hospedeiros, e introduzidos locais de restrição únicos ou raros. Os locais de restrição adici£ nam um grau de flexibilidade ao modificar várias porções do gene, introduzindo deleções, transições, transversões, inse_r ções e outras. E conseguida uma estratégia utilizando fragme_n tos de sobreposição em cadeia simples que podem ser misturados num meio de hibridação e ligação, sem interferir na formação de heteroduplexes. A dupla cadeia de genes daí re sultante pode então ser clonada e purificada. E demonstrada uma sequência exemplar na secção experimental.

E de desejar que os términos dos genes sejam d_i_ ferentes para assegurar uma boa orientação na inserção. 0 gene pode ser inserido num vector de expressão apr£ príado para expressão. Está disponível um grande número de vectores para expressão em procariotas e eucariotas, tais como fungos, por exemplo, leveduras, células de mam_í_ feros, por exemplo, células de rato, células de primatas, etc. 0 sistema de replicação pode derivar de plasmídeos, viroses ou cromossomas. Sistemas de replicação ilustrat_i_ vos incluem ColE1,X, RSF1O1O, 2 plasmídeos ym, SV40, adeno virus, virus do papiloma bovino, baculovirus, etc.

Uma vez identificado um gene completo, tal como cDNA ou DNA de cromossoma, este pode então ser manipulado numa variedade de formas para ser preparado para expressão. Podem ser utilizados tantos hospedeiros procarióticos como hospedeiros eucarióticos, o que pode incluir bactérias, levedura, células de insecto, e células de mamíferos, por exem_ pio, células _E. Co 1 i COS, células CHO, células de rim de m_a caco e células de bicho da seda (sf9). Portanto, onde o ge_ ne vai ser expresso num hospedeiro que reconhece as regiões reguladoras de tipo selvagem transcricionais e translacionais de Oncostatina M, todo o gene com as suas regiões reg_u ladoras de tipo selvagem 5'- e 3¹- pode ser introduzido num vector de expressão apropriado. Existem variados vectores de expressão empregando sistemas de replicação de viroses de mamíferos, tais como virus de símio 40, adenovirus, virus do papiloma bovino, virus da vaccinia, baculovirus de insecto, etc. Estes sistemas de replicação foram desenvolvidos para conseguir marcadores que permitem a selecção de transfectantes, assim como conseguem locais de restrição nos quais o gene pode ser inserido.

Quando o gene vai ser expresso num hospedeiro que não reconhece as regiões reguladoras transcricionais e trans1acionais de tipo selvagem obtidas naturalmente, pode ser necessária mais manipulação. Convenientemente, uma variedade de regiões reguladoras transcricionais 3'são conhecidas e podem ser inseridas a juzante dos codões stop. A região não-codificadora 5' a montante do gene e_s trutural pode ser removida por restrição de endonuc1ease, recessão Ba 1 31 , ou outras. Alternativamente, quando um local de restrição conveniente está presente perto da extremidade 5'-terminal do gene estrutural, este pode ser limitado e pode utilizar-se um adaptador para ligar o gene estrutural à região promotora, onde o adaptador consegue os nucleotídeos perdidos do gene estrutural. Podem utilizar-se várias estratégias para se conseguir uma sequência de expressão (cassette de expressão) que tem, na direcção da transcrj_ ção 5'-3'- uma região reguladora transcricional e uma reg^ ão de iniciação da translação, as quais podem também incluir sequências reguladoras que permitem a indução da regulação; o gene estrutural sob o controlo transcricional e translaci_o nal da região de iniciação; e uma região de terminação trans cricional e translacional.

A escolha das sequências reguladoras apropriadas terá em conta os seguintes factores que afectam a expressão. Em termos de regulação tran sc r i c i ona 1 , a quantidade e a e_s tabilidade do mensageiro RNA são factores importantes que influenciam a expressão de produtos do gene. A quantidade de mRNA é determinada pelo número de cópias de um determinado gene, a eficiência relativa do seu promotor e os factores que’regulam o promotor, tais como activadores ou repressores. A estabilidade do mRNA é determinada pela susceptibi1idade do mRNA a enzimas ribonuc1eases. Em geral, a digestão de exonuclease é inibida pela presença de motivos estruturais nas extremidades do mRNA; estruturas palindrómicas, nucleotídeos alterados, ou sequências nucleotídeas específicas. Crê-se que a digestão de endonuclease ocorre em locais específicos de reco19 nhecimento entre o mRNA, e que os mRNAs estáveis não est_a riam nestes locais. Há também algumas evidências de que os mRNAs que sofrem altos níveis de translação também são protegidos da degradação pela presença de ribossomas no mRNA.

Em termos de regulação trans1acional, dada a pre sença do mRNA, a expressão pode ser regulada influenciando o índice de iniciação (ribossoma ligado ao mRNA), o índice de elongação (translocação do ribossoma através do mRNA), o índice de modificações pós-trans1acionais e a estabilidade do produto do gene. 0 índice de elongação é provavelmente afectado pelo uso de codões, pelo que a utilização de codões em tRNAs raros pode reduzir o índice de translação. Crê-se que a iniciação ocorre na região mesmo a montante do começo da sequência de codificação. Em procariotas, geralmente, esta região contém uma sequência nucleotídica de consensus de AGGA, designada sequência de Shine-Dalgarno. Enquanto esta sequência caracteriza o local de ligação ribossomal.é evidente que ambas as sequências, a montante e a juzante, p_o dem influenciar uma iniciação de sucesso. Foram detectadas sequências activadoras trans1acionais que regulam a expressão. E também evidente a presença de sequências nucleotídeas na região codificadora, que pode afectar a ligação de ribossomas, possivelmente pela formação de motivos estruturais através dos quais o ribossoma reconhece o local de ini_ ciação. A posição da sequência AGGA com respeito ao codão ATG de iniciação pode influenciar a expressão. E então a interacção de todos estes factores que determina um índice particular de expressão. Genes de expressão elevada têm desenvolvido uma combinação de todos estes factores para produzir um particular índice de expressão. 0 projecto de um sistema de expressão para produzir níveis elevados de produto do gene deve ter em consideração não só as regiões específicas que se se determinou influenciarem a expressão, mas também como estas regiões (e portanto as suas sequências) se influenciam entre si.

Os promotores ou as regiões reguladoras transcricionais ilustrativas incluem, para bactérias, o prom£ tor B-gal, o promotor TAC, promotores do lambda esquerdo e direito, promotores trp e lac, o promotor de fusão trp-lac, etc; para leveduras, promotores do enzima glicolítj_ co, tais como promotores ADH-I e -II, o promotor GPK, e o promotor PGI, o promotor TRP, etc; para células de mamífe ros, promotores antecipados e tardios SV40, principais promotores tardios do adenovirus, etc.

A região reguladora transcricional pode adicionalmente incluir sequências reguladoras que permitem que o tempo de expressão do gene estrutural seja modulado, por exemplo, pela presença ou ausência de nutrientes ou prod_u tos de expressão nomeio de crescimento , temperatura, etc. Por exemplo, a expressão do gene estrutural pode ser reg_u lada pela temperatura, utilizando-se uma sequência regul_a dora compreendendo o promotor P^ do bacteriófago lambda, o operador 0_L do bacteriófago lambda e o repressor sensível à temperatura CI857. A regulação do promotor é conseguida através da interacção do repressor e operador.

A sequência de expressão (cassette de expressão) pode ser incluída num sistema de replicação para manutenção epissomal numa hospedeira celular apropriada, ou pode ser conseguida sem um sistema de replicação, onde pode ser i_n tegrada no genoma hospedeiro. 0 DNA pode ser introduzido no hospedeiro de acordo com técnicas conhecidas, tal como a transformação, utilizando DNA de precipitado de fosfato de cálcio, transfecção através de contacto com células com o virus, microinjecção do DNA em células, ou outras.

Uma vez que o gene estrutural tenha sido introd_u zido no hospedeiro apropriado, este pode multiplicar-se para expressar o gene estrutural. Em alguns casos é de de sejar obter-se uma sequência sinal (lider de secrecção) a montante de, e em fase com o gene estrutural o que propor ciona a secreção do gene estrutural. Os lideres de secre ção ilustrativos que foram descritos incluem os lideres de secreção da penici1inase , factor-α, imunog1obu1inas, receptores de células T, proteínas exteriores de membrana, e outras. Pela fusão em fase apropriada, o factor 4 das plaquetas maturo ou seu congénere pode ser segregado no meio.

Os aminoácidos adicionais podem ser inseridos e£ tre o gene estrutural e a sequência lider que proporciona um local de clivagem enzimática ou química, para clivagem do lider de secreção, para conseguir o polipetídeo maturo no sobrenadante. Alternativamente, a proteína de fusão compreendendo a sequência do lider de secreção e o produto do gene estrutural pode ter uso, sem clivagem do polipetídeo maturo.Em adição um agente citotóxico, tal como um fragmento de toxina de cadeia A ou uma molécula agressiva, tal como uma hormona ou um anti-corpo, pode ser ligado covalentemente à sequência lider com efeitos mínimos na actividade biológica do produto do gene estrutural.

produto construído contendo o gene estrutural e regiões ladeadoras proporcionando a regulação da expressão pode ser introduzido no hospedeiro de expressão por quaisquer meios convenientes, por exemplo, transformação com, por exemplo, precipitado DNA de fosfato de cálcio, transfec ção, transdução, conjugação, microinjecção, etc. 0 hospe deiro pode então ter crescido para uma elevada densidade num meio nutriente apropriado. Quando o promotor é i_n duzível, serão empregues então condições permissivas, como por exemplo, a alteração de temperatura, exaustão ou excesso de um nutriente ou produto metabólico, ou outros.

Quando o produto está retido na célula hospedeira, as células são colhidas, lísadas, e o produto é isolado e purificado por extracção, precipitação, cromatografia, electro forese, etc. Quando o produto é segregado, o meio nutrien- 22 -

te pode ser colectado e o produto isolado por meios convencionais, por exemplo cromatografia de afinidade.

Os produtos recombinantes podem ser glicosilados ou não glicosilados, tendo o tipo'sei vagem ou outra g1icosi1 ação. Em geral, a glicosilação irá diferir por não mais de cerca de 50%, normalmente por não mais de cer ca de 20% da glicosilação de tipo selvagem. A quantidade de glicosilação irá depender em parte da sequência do peptídeo particular, assim como do organismo no qual é produzido. Assim, a expressão do produto em células E.coli resultará num produto não-g1icosi1ado, e a expressão do pro duto em células de insecto resultará, em geral, em menos glicosilação do que a expressão do produto em células de mamíferos.

Utilizações Para o Factor 4 das Plaquetas e Congéneres As composições de polipetídeos desta invenção demonstram uma variedade de actividades fisiológicas. As composições em estudo podem ser utilizadas para inibir o crescimento de tumores in vitro e i n vivo. As composições em estudo podem também ser utilizadas para estimular a ajj tofosfori1 ação de pp60 src. Estas mesmas composições podem assim servir de substrato para o enzima pp60 src, e podem ser fosforiladas na posição de tirosina (resíduo 60) no polipetídeo. Também as células tumorais podem ser induzidas a libertar uma proteína 52 kD (p52) quando tratada com o factor 4 das plaquetas. Em adição, o factor 4 das plaquetas ou análogos, seus fragmentos ou proteínas de fusão contendo subsequências (fragmentos) contendo propriedades imunolõgicas competitivas, podem ser usados para produzir anticorpos monoclonais ou activar como um reage_n te em ensaios diagnósticos para a detecção do factor 4 das plaquetas, ou compostos imunologicamente competitivos ou a presença de receptores de células de superfície para o factor 4 das plaquetas.

Os compostos em estudo têm actividade elevada' para a inibição de tumores. As composições em estudo p_o dem ser utilizadas i n vitro ou i n vivo para reduzir o íri dice de crescimento de células neoplásticas. As compos/ ções de polipetídeos podem proporcionar aos níveis 1 ng, pelo menos cerca de 20% de inibição de crescimento de células tumorais, particu1armente de carcinomas e sarcomas, por exemplo, do pulmão, mama, pele, etc. Preferive/ mente as composições de polipetídeos proporcionarão, pelo menos, cerca de 40%, e mais preferivelmente pelo menos cer ca de 50% de inibição do crescimento de células tumorais, de acordo com o teste de inibição de colónias descrito na secção experimental.

As composições em estudo podem ser usadas in vivo ao serem administradas num hospedeiro suspeito de ter neoplasia. As mesmas composições podem ser aplicadas num local neoplástico, por exemplo, um melanoma, para reduzir o índice de pro1iferação. Os métodos de aplicação podem incluir a injecção, introdução por cateter, aplicação directa ou outros, dependendo do local do tumor, da formulação da composição em estudo, o nível de dosagem e outros. A dos_a gem irá variar dependendo do facto de ser sistemática ou local, sendo as concentrações da dosagem, geralmente de cerca de 0,1 y<g a 1,000 /ig/Kg, e as dos agens · tota i s para mamíferos grandes incluindo primatas, de cerca de 0,01 a cerca de 10 mg por dose de tratamento.

Materiais como o factor 4 das plaquetas, inclui_n do o factor 4 das plaquetas e seus congéneres podem ser for mulados em meios fisiológicamente aceitáveis, tais como o tampão fosfato salino, água destilada, excipientes, ou outros, ou podem ser empregues puros.

factor 4 das plaquetas e os seus congéneres p_o dem ser empregues indirectamente para detectar a presença de células neoplásticas. Onde as células tumorais estão

sujeitas a concentrações do agente activo de cerca de 1 a cerca de 500 ng/ml, preferivelmente de cerca de 50 a 350 ng/ml do agente activo, é segregado p52. Portanto, pode detectar-se a presença de células neoplásticas detectando-se a secreção do p52 no meio externo , Dor exemplo, o meio nutriente, sangue, urina ou outro fluido fisiológico. 0 factor 4 das plaquetas pode, portanto, ser utilizado p_a ra controlar o estado dum hospedeiro e a existência ou a_u sência de uma condição neoplástica. 0 factor 4 das plaquetas pode ser utilizado para diagnosticar se existe um tumor em cirurgia controlada, níveis de metastase ou ou_z tros. A substância tipo factor 4 das plaquetas pode ser administrada i n vitro ou i n vivo (meio de. cultura ou ho_s pedeiro) numa quantidade suficiente para proporcionar a indução da secrecção de p52. Seria então controlado o fluj_ do associado com o sistema, para a presença de p52 como uma indicação da presença de células neoplásticas.

Os materiais tipo factor 4 das plaquetas podem ser também usados para estimular o sistema imunológico, só zinhos ou preferivelmente em conjunto com outras linfoquç nas, por exemplo, mais particularmente Ύ-interferão. Portanto, os materiais tipo factor 4 das plaquetas podem ser formulados com outros polipetídeos e administrados a uma \ hospedeira que é imunosuprimida, de forma a estimular o sistema imunológico. Sabe-se que o Gama-interferão induz a expressão Ia em monocitos e macrofagos, assim como outros tecidos, tais como o endotélio e fibroblastos. Os materiais tipo factor 4 das plaquetas induzem a expressão Ia e estimulam a inducção Ia do Ύ-i nterf erão, activando a efic_á cia de uma dada dose de Ύ-i nterf erão. A quantidade de m_a teriais tipo factor 4 das plaquetas será geralmente empregue para proporcionar uma concentração no meio, na medida dos cerca de 1 a 200, de preferência de 2 a 70 ng/ml. A quantidade de Ύ-interferão será convencional quanto ao seu uso como uma linfoquina, sendo geralmente da medida dos cerca de 0,5 a 200 ng/ml. Activações na expressão Ia,

pelo menos cerca de 1,5, normalmente pelo menos duplas,

Dodem ser conseguidas com materiais tipo factor 4 das p l_a quetas quando utilizados sózinhos ou em conjunto com outras linfoquinas. A administração pode ser utilizada como previamente descrito.

Os materiais tipo factor 4 das plaquetas podem ser também utilizados em conjunto com quinases, particularmente pp60 src para modificar a especificidade do sub_s trato do enzima. Em particular, por contacto com o enzima em pequenas quantidades de um material tipo factor 4 das plaquetas, particularmente em concentrações de cerca de 0,05 a 50 jjig/ml, a actividade do quinase pode ser activada, incluindo uma mudança nos aminoácidos observados,, que são fosfori1ados, principa1 mente , além da tirosina ser fosforilada, a serina também o é. Desta forma, a combin_a ção de pp60 src ou quinases análogos pode ser utilizada para modificar polipetídeos contendo aminoácidos de tirosy na e serina, conseguindo a fosforilação da tirosina e da serina a índices activados.

Os materiais tipo factor 4 das plaquetas em e_s tudo, podem ser também utilizados como haptenos ou antigénios, como haptenos ligados a um potenciador imunogénico, por exemplo, uma partícula de antigénio ou outros, para a produção de anticorpos monoclonais ou sera policlonal. Os anticorpos têm uma vasta utilização, particularmente p_a ra fins diagnósticos. Os anticorpos podem ser utilizados isolados ou em conjunto com materiais tipo factor 4 das plaquetas, como reagentes para a detecção do factor 4 das plaquetas e receptores do factor 4 das plaquetas, incluindo anticorpos para o factor 4 das plaquetas.

Estão disponíveis uma vasta variedade de proto colos e técnicas para determinar análises de interesse. Estas técnicas envolvem uma vasta variedade de marcadores incluindo enzimas, núcleos radioactivos , substâncias fluo26

rescentes, substâncias luminescentes, substractos de e_n zima, inibidores de enzima, partículas e outros. Os mé todos podem envolver uma etapa de separação (heterogénia) ou não (homogénia). 0 marcador pode ser ligado covalente mente ao material tipo factor 4 das plaquetas ou ao anticorpo para o factor 4 das plaquetas (anti-factor 4 das plaquetas), ou pode ser conjugado com um anticorpo d i r i g_i_ do ao anti-factor 4 das plaquetas, por exemplo, ao Fc do anti-factor 4 das plaquetas. Pode ser utilizado o anticorpo na totalidade ou seus fragmentos incluindo Fab, F(ab) *2» Fv» ou semelhantes. Foram emitidas algumas pate_n tes dos Estados Unidos, descrevendo uma vasta variedade de técnicas diagnósticas que podem ser utilizadas nesta inve_n ção. São exemplares destas patentes as Patentes Americanas N^es: 3.766.162; 3.791.932; 3.817.837; 3.996.345; e 4.233.402. Tipos particulares de experiências incluem RIA, EIA, EMIT (Marca Registada), ELISA, SLFIA, FIA, tendo todas elas encontrado uma aplicação comercial e para as quais e_s tão disponíveis reagentes para outras análises. Os vários reagentes podem encontrar-se em kits, em que a natureza dos reagentes e as suas quantidades relativas são seleccionados para optimizar a sensibilidade da experiência.

Os anticorpos podem ser preparados de formas convencionais, de acordo com a preparação de anticorpos πω noclonais ou se‘ra policlonal. Em cada um dos casos, um hospedeiro apropriado será injectado com um imunogénio con tendo um ou mais local .(locais) epitópicos de interesse, normalmente seguidos de uma ou mais injecções de reforço. Para a antisera policlonal, a hospedeira pode ser sangrada e a fracção de globulina isolada. A fracção de globulina po de ser mais purificada por c romatograf i a de afinidade. P_a ra anticorpos monoclonais, a hospedeira será imunizada, co mo anteriormente, mas neste caso o baço será, normalmente, removido e fundido com um parceiro de fusão apropriado. Depois da selecção de hibridomas expressando o anticorpo desejado, os hibridomas serão sujeitos a diluição limitante, seguida de selecçãc- e cionagem, e também caracterização.

Os anticorpos, de acordo com esta invenção, po dem ser de qualquer um dos tipos que ocorrem naturalmente, tais como IgA, IgD, IgE e lgM, particularmente IgM e os variados subtipos de IgG, por exemplo, IgG1, 2, 3 ou 4.

Os anticorpos monoclonais daí resultantes podem ser usados como imunogénios para produção de anticorpos anti-idiotipo que terão similaridade conformaciona 1 com os materiais tipo factor 4 das plaquetas. Estes podem ser então usados como reagentes substitutos dos mate riais tipo factor 4 das plaquetas , numa variedade de apH cações.

Além de serem usadas para expressão, as sequê£ cias de genes estruturais podem ser usadas como padrões para hibridação e detecção de sequências duplex. Por exemplo, a presença e quantidade de mRNA pode ser detecta da em células hospedeiras.

Os exemplos seguintes são dados como forma de ilustração e não como forma de limitação.

EXPERIMENTAL

Abreviações: DMEM = Dulbecco's modified eagle's médium; PBS = tampão fosfato salino; P/S = penici1ina/estreptomicina (0,57mg/ml cada); FCS = soro fetal de vitela; SDS-PAGE - electroforese de gel de pol iacri1amida de dodecilosulfato de sódio.

índice da Matéria

Exemplo 1: Protocolos de Bioensaios

A. Inibição da síntese de DNA

B. Soft Agar Inibidor de Colónia

C. Inibição do Crescimento de Tumores em Ratos Nús

E. pp6^msrc^{0 os}f^ori 1 ação de

F. Expressão do Antigene do Macrofago Ia

Exemplo 2: Isolamento do Factor 4 das Plaquetas das

Plaquetas Humanas

A. Extracção de ácido etanol de Plaquetas Humanas

B. Cromatografia de Empregnação de Gel

C. Cromatografia Líquida de Alta Pressão de Fase Invertida

Exemplo 3: Actividade Biológica do Factor 4 das Plaquetas Isolado das Plaquetas Humanas

A. Inibição da síntese de DNA

B. Soft Agar Inibidor do Crescimento de Colónias

C. Inibição do Crescimento de Tumores em Ratos Nús

D. Libertação Específica do polipetídeo

Mr 52K

E. Estimulação da Autofosfori1 ação pp60 s rc

Exemplo 4: Produção de Anticorpos Monoclonais e Políclonais Específicos para o Factor 4 das Plaquetas

A. Ligação Cruzada do Factor 4 das Plaquetas à Bactéria Lipopo1issacárida

B. Imunização In Vitro de Esplenócitos Balb/C com o Factor 4 das Plaquetas e Conjugado LPS

C. Produção de Anticorpos Monoclonais

D. Ensaio ELISA para o Factor 4 das Plaquetas

E. Produção de Antisoro Policlonal Anti-

-Factor 4 das Plaquetas

Exemplo 5:	Preparação de Oligonucleotídeos Sintéticos
do	Factor 4 das Plaquetas
		A.	Síntese do Gene do Factor 4 das Plaque tas
		B.	Descrição de Plasmídeos de Clonagem e de Expressão
		C.	Preparação de Genes Recombinantes do Factor 4 das Plaquetas
Exemplo	6:	Preparação do Recombinante do Factor 4 das
		Plaquetas
		A.	Isolamento do PF4 Expresso na Bactéria Recombinante
Exemp1 o	7 :	Actividade Biológica do Factor 4 das Plaque-

tas Preparado em Células Procarióticas

A. Inibição da Síntese de DNA

B Inibição do Crescimento de Tumores em Ratos Nús

Exemplo 1

Protocolos de Bioensaios

A. Inibição da síntese de DNA

Ao 2^Q dia de manhã foram instaladas células

A549 (carcinoma do pulmão humano) em placas de poços Nunc 96 (Kamstrupvej 90.DK-4.000, Roskilde, Dinamarca). Estas células foram mudadas quando eram menos de 30. Em todos, menos nos poços periféricos, foi introduzido 4x10 células/ /50 ρ-1/poço (9x10^ células/ml de meio (DMEM) com 10% FCS, P/S, glutamina). Os poços periféricos receberam 50 /a1 de PBS e toda a placa foi incubada a 37°C. A tarde os compostos do teste foram resuspendidos no meio. Todos os =4compostos foram testados em triplicado. Foram distribin dos 50 >il de composto de teste no meio utilizado em cada poço de teste, enquanto os poços de controlo recebiam só 50 μΐ do meio utilizado. Cada placa foi então incubada a 37°C por 3 dias. Ao 4⁵ dia foram adicionados 50 μΐ duma solução de I-iodo-2¹-deoxiuridine (4 Ci/mg para 0,5 mCi/ml) (1 /il isótopo/ml de meio), a cada poço, e as pl_a cas incubadas a 37°C durante a noite. Ao 5^Q dia o meio foi aspirado dos poços, e estes lavados 1* com PBS. Foram adicionados cem microlitos de metanol por 10 minutos a temperatura ambiente. 0 metanol foi aspirado e foram adicionados 200 /il de 1 M de hidróxido de sódio a cada p£ ço. A placa foi incubada durante 30 min. a 37°C, e o h_i_ dróxido de sódio retirado com rolhas titertek (Flow Labs). As rolhas foram então contadas num contador gama.

B. Soft Agar Inibidor de Colónia

Os materiais utilizados foram 5% de agar (3,75% g de Agar Nobel (Difco)), 75 ml de água destilada autoclavada numa garrafa Wheaton de 125 ml, DMEM com 10% de FCS, 100 U de penicilina, 100 U de estreptomi c i na, 200 mM de gl_u tamina e células de melanoma humanas (A375).

Os materiais a serem testados foram liofilizados num .tubo de ensaio esterilizado de 12x75 mm. Foi feita uma diluição de 1:10 dos 5% de agar, com DMEM, e aquecida para 46°C em banho de água. Foi preparada uma base de película pipetando 1 ml de 0,5% de solução de agar em cada poço de uma placa de cultura (35x14 mm) de 6 poços. A peH cuia ficou a temperatura ambiente até endurecer. Foram preparadas células SAg digeridas com tripsina, e o número de células foi contado. As células foram diluidas para uma concentração final de 1x10^ células/ml, e foi adicici nado 0,35 ml de células a cada tubo com amostra de teste.

Foi pipetado, em cada um de dez tubos com amo_s Ira de teste, 0,750 ml de 0,5% de solução de agar. A mis31

tura foi gentilmente posta em vortex, e o conteúdo do t_u bo com amostra de teste (amostra de teste, células, agar) foi deitado para a película base, e deixado durante 20 minutos a temperatura ambiente, até que o agar endureces se. As placas foram então incubadas numa incubadora hum_i_ dificada a 37°C, com 5% de dióxido de carbono/95% de ar.

As placas foram verificadas para a inibição do crescimento de colónia após 3 dias e até 10 dias, dependendo da potência do material de teste. 0 número de colónias foi contado ao microscópio de baixa potência em 8 campos alietórios. Quando as placas tiveram que se manter mais de 5 dias, 1 ml de película adicional de 0,3% da solução de agar foi deitado na película de amostra de teste, para evitar a secagem da película de amostra de teste.

C. Inibição do Crescimento de Tumores em Ratos Nús

Os ratos nús machos (Ba 1b/c-nu+/nu+) foram fo£ necidos pelo Fred Hutchinson Câncer Research Center, em Seattle, WA. As doze semanas de idade os ratos receberam injecções (s.c. na região do pescoço, com aproximadamente 1,3χ10⁶ de células de carcinoma do pulmão humano (A549) num volume de 0,2 ml de tampão fosfato salino. Os tumores palpáveis (aproximadamente 10 mm ), desenvolveram-se, em geral, em 20 dias. Cada grupo continha 5 animais. Os an_i_ mais foram injectados de 2 em 2, ou de 3 em 3 dias, no local do tumor, com 0,1 ml de PBS (grupo de controlo), ou com uma amostra de teste (injecção de 1,2 Mg) resuspendida em 0,1 ml de PBS. 0 primeiro dia pós-tratamento corresponde ao primeiro dia em que os animais foram injectados no local do tumor com os compostos de teste. As dimensões do tumor foram medidas antes da subsequente injecção nos dias indicados, e representam o tamanho médio do tumor em cada animal do grupo.

D. Libertação Específica de um Polipetídeo de 52.000 Mr

As células de carcinoma de pulmão humano ( A549) ou outra linha celular foram tratadas com uma amostra de teste (200 ng/ml de cultura) ou PBS, e foi determinado o efeito nos polipetídeos libertados no sobrenadante das células de cultura. As culturas tratadas e de controlo (sem o factor 4 das plaquetas) foram pulsadas com S-metionina (5 pCi/m1 S.A. - 800 Ci/mMol) no tempo 0 (adição do factor 4 das plaquetas ou só de meio (controlo)). Doze horas depois os sobrenadantes de cultura foram retira, dos e clarificados, primeiro a pequena velocidade (1.500 χ g por 15 min.), depois a alta velocidade (30.000x g por 1 hora). Os polipetídeos foram precipitados dos sobrenadantes clarificados com ácido tr i c 1 oroacét i co (TCA), seguj^ do de SDS-PAGE em 12,5% de placas de gel em po1iacri1amida.

A autorradiografia do gel foi então utilizada pa.

ra determinar a presença de um polipetídeo marcado com

52.000 Mr de metionina- S em sobrenadantes derivados de células A549 tratadas com a amostra de teste.

E. Estimulação da Autofosfori1 ação pp60 src pp60 src foi purificado por cromàtografia de imunoafinidade, como foi descrito (Erickson e outros, Proc, Natl. Acad. Sei, USA ( 1979) 76:6260-6264; Erickson e outros, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. (1979) 44:902-917. Foram incubados cinco microlitros de enzima purificado (aproximadamente 0,47 pM) com 100 ng de amostra de teste ou PBS, num volume de reacção final de 30 ^.1 contendo 20 mM ATP, 5 mM MgCl£, 10 mM Tris-Cl,pH 7,2 por 30 min. a 30°C. As reacções terminaram pela adicção de 2xtampão, e analizadas por SDS-PAGE, como descrito (Laemmeli, Nature (1970) 227:680-685).

F. Expressão do Antigene Ia do Macrofago

Wehi-3 é uma linha de células do macrofago de rato que pode ser induzida por gama interferão (Ύ-IFN) pa.

ra expressar antigénios Classe II. As características desta indução foram estudadas por diversos 1 aboratórios , e demonstrou-se serem uma réplica exacta da normal indução do macrofago. Estas células multiplicaram-se com ou sem uma pequena concentração de γ-IFN, e com uma das várias concen_ trações da amostra a ser testada. Tanto na presença como na ausência de Ύ-IFN, o factor 4 das plaquetas mostrou uma activação dependente da dose do antigénio Classe II, como foi medido por imunof1uorescência directa em fluorescência induzida (FACS). A magnitude do efeito do factor 4 das plaquetas foi, geralmente (-2-70 ng/ml).

Exemplo 2

Isolamento do Factor 4 das Plaquetas das Plaquetas Humanas

A. Extracção de Acido Etanol de Plaquetas Humanas As plaquetas frescas ou congeladas (50 g peso líquido), descongeladas a temperatura ambiente foram resu^s pendidas em dois volumes de: 375 ml de etanol (95%), 7,5 ml conc. de HC1, 33 mg de fluoreto de fenilmeti1su1feni1, e 1 ml de aproteinina (23 UIT/ml; de pulmão bovino, Sigma Chemical Co. A6012). A mistura foi agitada a 4°C durante a noite, centrifugada a 8.000 rpm num rotor 19 tipo Beckman, por 30 minutos, e o sobrenadante foi removido. 0 pH do sobrenadante foi ajustado com hidróxido de amónio conc. para 4,0, e o pH foi elevado para 5,2, utilizando uma diluição de hidróxido de amónio conc.

de 1:10. Depois de adicionar 1 ml de 2 M de acetato de arnó nio (pH 5,2), por 0,1 1 de sobrenadante, a solução foi centrifugada a 8.000 rpm, num rotor tipo 19, por 30 minutos. 0 sobrenadante foi removido, foi adicionado 2χ o volume de etanol 95%, seguido de 4χ o volume de éter dietílico, e a mistura foi deixada uma noite a 0°C. 0 precipitado foi co lectado por centrifugação a 8.000 rpm, num rotor tipo 19, por 30 min., e o pellet foi suspendido em cerca de 10-20 ml de 1 M de ácido acético. A dispersão de ácido acético foi .dialisada extensivamente contra 5 1* 2 mudanças de 0,2 M. de ácido acético numa entubação de membrana de diálise Spectrapor (#3) (porosidade 3.500 M_r) (American Scient_£ fic Products). 0 extracto foi liofilizado, resuspendido em 7,5 ml de 1 M de ácido acético, seguido de centrifugação a 30.000 rpm.

B. Cromatografia de Impregnação de Gel

Biogel P-10 (200-400 mesh; BioRad Labs) foi distendido uma noite em 1 M de ácido acético, inteirameri te suspendido, e então deitado numa coluna de vidro s i l_i_ conizada de 100x2,5 cm, e deixou-se a equilibrar uma noj_ te com 1 M de ácido acético. Todas as soluções foram suspendidas antes de serem utilizadas.

Os peptídeos solubi 1 izados do ácido etanol (50-70 mg de proteína) de 25 g de plaquetas humanas foram dissolvidos em 7,5 ml de 1 M de ácido acético, e aplicados à coluna acima indicada. As fracções (3,5 ml) foram colectadas e as aliquotas liofilizadas e testadas para a 125 inibição da incorporação 5- I-iodo-2'-deoxiuridina em células do carcinoma de pulmão humano A549.

C. Cromatografia Líquida de Alta-Pressão de Fase-Invertida \ A fracção contendo o pico da actividade inibidora do crescimento tumoral (cerca de 200 ng de proteína) da coluna já indicada foi liofilizada e resuspendida em 0,05% (v/v) de TFA. A coluna foi então eluida com 0,60% de um gradiente de acetonitrilo linear, em 0,045% de TFA, a um fluxo de 0,8 ml/min. a 23°C. As aliquotas de cada fracção foram liofilizadas e experimentadas em triplicado, como acima descrito.

A(s) fracção (fracções) contendo actividade inibidora fo ram então dissolvidas em 40% de acetonitrilo contendo 0,1% de TFA, e aplicadas a uma coluna de gel poliéter hidroxil_a da (BioRad TSK-250), e eluidas com uma fase móvel de 40%.

—w de acetonitri1 o em 0,1% de TFA. As fracções foram colectadas, 1iofi1izadas, e experimentadas em triplicado, para a actividade inibidora do crescimento. A actividade elui na fracção onde elui o marcador de insulina, e corre_s ponde a um peso molecular de 6-8 kD.

Estas fracções contendo a mais elevada actividade foram então submetidas a e 1 ectroforese, utilizando o SDS-PAGE da seguinte maneira: o peptídeo correspondendo à maior actividade do factor 4 das plaquetas, da fase de purificação da fase invertida de HPLC foi liofilizado, re suspenso e fervido (2 min.) em 0,03 ml de uma amostra de preparado de tampão contendo 12,5 mM de Tris-Cl, pH 6,7, 4% de SDS, 10% de js-mercaptoetano 1 , 20% de glicerol e 0,01% de azul de bromofenol. A amostra foi carregada para 5% de camadas de gel de poliacri1amida, deitado sobre de 17 a 27% de uma placa de gel em gradiente de poliacri1amida contendo 0,1% de SDS, a um pH de 8,8. 0 gel passou a 10 milliampéres , até as amostras migrarem através das camadas de gel, e a 20 milliampéres, até a frente do corante migrar para o fundo do gel. Os geis foram fixados e mergulhados, uma noite, numa solução de 0,2% de azul de Coomassie, 50% de metanol, e 9% de ácido acético. Depois de retirado o gel, as bandas positivas de Coomassie foram locaH zadas através da utilização de um densímetro Hoffer. Os marcadores incluíram insulina (6.000 Mr), tripsinogénio (24.500 M_r) , RNase ( 13.700 M_r) , e aproteinina (6.500 M_r). 0 maior peptídeo comigrou com o padrão de aproteinina 6.500 Mr sob estas condições de e1ectroforese.

Exemplo 3

Actividade Biológica do Factor 4 das Plaquetas

Isolado das Plaquetas Humanas

A. Inibição da síntese de DNA efeito do factor 4 das plaquetas na síntese de DNA foi testado utilizando um número de linhas celula36

res, tanto transformadas como não-transformadas, usando a experiência descrita no Exemplo 1A. 0 composto em estudo inibiu uma variedade de células tumorais humanas de cultura, mas não os normais, não-transf ormados, fibrobla_s tos do prepúcio humanos, como demonstrado na seguinte t_a bela.

Tabela I

Efeito do Factor 4 das Plaquetas na Síntese de

DNA in vitro nas Células Humanas de Cultura

% Máxima* Inibição ^Incorporação de Linha Celular I-deoxiuridina
Transformada
Carcinoma humano do pulmão (A549)	100
Adenocarcinoma humano do pulmão (H125)	41
Melanoma humano (A375)	67
Carcinoma humano da mama (MCF-7)	37
Não-transformada
Fibroblasto do prepúcio humano (HuF_p6)	0

* Utilizando as condições de experiência descritas, a má

125 “ xima inibição da incorporação de I-deoxiuridina em cjé lulas A549, observadas em concentrações de saturação do factor 4 das plaquetas (-100 ng/poço) não excede os 50%, relativamente a culturas de controlo não tratadas.

B. Soft Agar Inibidor do Crescimento de Colónias método acima indicado foi empregue utiliza_n do concentrações variáveis do factor 4 das plaquetas pur_i_ ficado. A tabela seguinte indica os resultados, sendo a quantidade do factor 4 das plaquetas indicada, a quantid_a de liofilizada introduzida no tubo de ensaio. Os result_a dos são relatados como inibição máxima em percentagem.

Tabela II

Factor 4 das Plaquetas	%
(ng)	Inibição Máxima
0,8	45
2,6	73
20,0	81
60,0	100

E evidente por estes resultados que o polipet_í_ deo em estudo é um potente inibidor do crescimento celular. Com base nos resultados obtidos com as células do melanoma, é suficiente cerca 1 ng para se obter cerca de 50% de inibição. 0 composto em estudo pode, portanto, encontrar uma variedade de utilizações na inibição do crescimento celular, incluindo o crescimento celular neoplástico.

C. Inibição do Crescimento Tumoral em Ratos Nús

A injecçao , tanto do soro de albumina bovino (0,2 mg) como de um peptídeo sintético (200 ng), correspo_n dendo a uma região não-empare1hada do factor de crescimento epidermal (resíduos EGF 11-21) em PBS não inibiu o cres cimento tumoral.

D. Libertação Específica do Polipetídeo Mr 52K

As células do pulmão humanas (A549) foram tratadas com o factor 4 das plaquetas, como foi descrito no Exemplo 1D, acima. Analizados por SDS-PAGE, os sobrenadari tes de células tratadas continham uma proteína 52K Mr, mar cada radioactivamente. Células cancerosas não tratadas libertaram quantidades mínimas desta proteína ' (verificou-se, pelo menos, um aumento décuplo, após o tratamento com o factor 4 das plaquetas). Não se verificaram outras dife renças qualitativas ou quantitativas entre as culturas tra tadas e as de controlo.

Ε . Estimulação da Autofosfori1ação pp60 src

A autofosfori1 ação de pp60 src foi analisada de acordo com o método delineado no Exemplo 1E. Seguindo o tratamento com o factor 4 das plaquetas, a autorradiogra fia das placas de gel indicou uma estimulação dupla aparente na autofosfori 1 ação do pp60 src. 0 aumento na fo_s forilação não se restringiu a resíduos de tirosina, sendo também verificado nas posições da serina, no enzima src.

Exemplo 4

Produção de Anticorpos Monoclonais e Policlonais Específicos para o Factor 4 das Plaquetas

A. Ligação Cruzada do Factor 4 das Plaquetas à Bactéria

Lipopolissacárida processo para ligar o factor 4 das plaquetas à lipopolissacárida bacteriana é uma modificação do método desenvolvido por Primi e Cazenave, J. Immuno1. (1982) 1299(3):1124-1129.

Foram diluídas dez ng de factor 4 das plaquetas e 12,5 ng de lipopolissacárida bacteriana (LPS; Sigma #L-253 ), para um volume de 500 /ú com água destilada. Fo ram adicionados cinquenta de 2,5% de glutaraldeido em PBS, e a mistura foi incubada por 30 min. a temperatura ambie_n te. A reacção parou pela adicção de 50 μΐ de 2 M de glicina em PBS, e pela incubação da mistura a temperatura am biente por 1 hora. 0 conjugado LPS-factor 4 das plaquetas foi diluido com 10 ml de linfócito misturado condici£ nado (MLC) de meio (ver abaixo), depois foi esterilizado por filtro, para uso numa imunização in vitro.

B. Imunização In Vitro de Esplenócitos Balb/C com o

Factor 4 das Plaquetas e Conjugado LPS

Os esplenócitos não-imunes foram imunizados ut_i_ lizando-se o conjugado LPS-factor 4 das plaquetas in vitro, através duma alteração do processo descrito por Reading,

Immunol. Meth. (1982) 53:261-269.

O meio MLC foi preparado através da cultura de igual número (4χ10^δ células/ml) de células de timo de rato Dreto C57 e Balb/C, em DMEM, contendo 2% de soro de coelho por 48 h. 0 meio foi colectado e armazenado a -20°C.

Foram colectadas células peritoniais de exsud_a ção (PEC), por aspiração num rato Balb/C tiogl icol isado com PBS esterilizado. As células PEC foram colocadas em cu_l_ tura com o equivalente a 1 rato em esplenócitos , e 10 ml de meio de MLC contendo 10 ng de conjugado LPS-factor 4 das plaquetas. As células foram cultivadas por 7 dias.

C. Produção de Anticorpos Monoclonais

Os esplenócitos imunizados foram colectados e fundidos com células de mieloma SP2/0, num rácio de 1:1, para produzir hibridomas que sintetizam os anticorpos monoclonais específicos do factor 4 das plaquetas. Os hibridomas foram testados para a produção de anticorpos do factor 4 das plaquetas, por um imunoensaio ligado a enz_i_ mas (ELISA). Foram clonados, duas vezes, hibridomas positivos através da limitação de diluição. Os clones foram expandidos, testados para a classe de imunoglobulina e injectados em ratos Balb/C, para a produção de ascites.

Foram expandidos e retestados , inicia 1 mente, quarenta clones de hibridoma positivos, para a actividade anti-factor 4 das plaquetas. Sete dos clones mais react_i_ vos foram usados para produzir fluido de ascites em ratos Balb/C. Os restantes clones foram expandidos e congelados. Os ascites foram testados para especificidade contra o factor 4 das plaquetas, um conjugado KLH-peptídeo do factor 4 das plaquetas, e BSA em ELISA. Os ascites reagiram tanto com o factor 4 das plaquetas como numa extensão menor, com o peptídeo do factor 4 das plaquetas, em diluições de 1 para 3.000. As imunog1obu1inas foram

purificadas pelo método de precipitação de ácido capríH co descrito por Russo, e outros, Anal. Biochem. (1983)

6^5:269-27 1 . Análises padrão das imunoglobulinas e das análises Ouchterlony de dupla-difusão demonstraram que todas as imunoglobulinas eram do tipo IgM.

D. Experiência ELISA para o Factor 4 das Plaquetas factor 4 das plaquetas foi diluido em 0,1 M de ácido acético, e foram pipetadas 10 ng/poço, numa placa Dynatech Immulon de poço-96. A solução foi seca a tem peratura ambiente durante uma noite. A placa foi bloque_a da pela incubação dos poços com 2,5%' de FCS em PBS. 0 meio de hibridoma, a imunog1obu1ina ou o antisoro foi então adicionado numa diluição apropriada. As placas foram então incubadas a 37° C por duas horas, e lavadas três ve zes com 3,5% de FCS em PBS. Os reagentes Vector Labs avidin-biotin horseradish peroxidase (HRP) utilizados no método ELISA foram manuseados de acordo cem as instruções do fabricante. Os poços foram lavados com 2,5% de FCS em PBS, entre cada etapa. Os poços positivos foram visualizados pela adição de 0,4 mg/ml de £-f en i 1 d i am i n a , em 0,1 M de solução de cj_ trato de sódio, contendo quatro bactérias LPS de 30% de peróxido de hidrogénio/10 ml de solução. A reacção pôde continuar, por 30 min., à temperatura ambiente. A reacção parou pela adição de 50 LPS bacteriano 1,4 N F^SO^/poço.

E. Produção de Antisoro Policlonal Anti-Factor 4 das

PIaquetas

Foram imunizados ratos Balb/C com factor 4 das plaquetas, imobilizado em ni troce 1 u 1 ose. 0 objectivo de_s te protocolo de imunização é o de evitar a rápida libert_a ção do polipetídeo pelo hospedeiro. Desta forma, a imun_i_ zação pode ser efectuada por quantidades muito pequenas de factor 4 das plaquetas.

Uma solução de factor 4 das plaquetas em 0,1 M de ácido acético foi ponteada para pequenas peças de ni41 trocelulose (Schleicher & Schuell, 0,45 ^m) e foi deixada a secar. As peças de nitrocelulose foram colocadas dentro da cavidade peritoneal de 3 ratos Balb/C, para a imunização primária (0,375 ng/rato). Foi também administrada aos ratos uma injecção intraperitonea 1 de 0,1 ml de ajj xiliar de Freund completo. Os ratos foram reforçados, duas vezes, com duas semanas de intervalo, com o factor 4 das plaquetas imobilizado em nitrocelulose. Para refo_r çar, a nitrocelulose foi desfeita, homogenizada com 0,1 ml de água, e 0,1 ml de auxiliar de Freund incompleto, e injectada subcutâneamente (0,125 ng/rato). As seras de rato foram testadas para especificidade contra o factor 4 das plaquetas, pelo ensaio ELISA, previamente descrito, com proteína A conjugada com HRP, usada como reagente de segunda etapa. As seras foram testadas contra o conjugado KLH-peptídeo do factor 4 das plaquetas, e uma placa bloqueada para demonstrar especificidade.

Exemplo 5

Preparação de 01igonuc1eotídeos Sintéticos do Factor 4 das Plaquetas

A. Síntese do Gene do Factor 4 das Plaquetas

Foram designados os genes sintéticos do factor 4 das plaquetas, os quais usam codões bacterianos optimizados para níveis elevados de expressão. Em adição, a s_e quência é designada para uso em E. Co1i, e foram project£ dos um número de locais de reconhecimento de enzima de res tricção, para permitir a facilidade de alteração da sequên cia codificante. Quando possível, os novos locais de restricção mantiveram inalterada a sequência aminoácida do gene, no entanto, em alguns casos, a incorporação do novo local de restrição permitiu uma sequência aminoácida alte rada.

Foram preparadas sequências de sobreposição em cadeia simples, combinadas num meio de hibridação, e 1 ig_a

das para conseguir o gene completo com o término apropria do para inserção num vector de expressão, em fase de leitura, para preparar uma proteína fundida, da qual poderia ser isolado o factor 4 das plaquetas. Os segmentos em cadeia simples foram fosforilados em 5', com ligase de po1inuc1eotídeos T4 e hibridizados através da combinação de 200 pM de cada segmento, num volume de reacção de 30 jxl (30 mM ATP, 10 mM DTT, 10 mM MgCl^ 1 pg/ml de espermidine, 100 mM Tris-HCl, pH 7,8 e ligase de DNA T4. 0 dsDNA foi digerido com BssHI I e BamHI e purificado em 7% dum gel de poliacri1amida nativo.

Foi preparada a seguinte sequência:

GG

TAC

CTT

CGA

CTT

CTG

CCT

CTA

GAC

GTC

ACG

CGC

GCC

ATG

GAA

GCT

GAA

GAC

GGA

GAT

CTG

CAG

TGC

/ NH₂

M

E

A

. E

E

D

G

D

L

Q

C

GAC

ACG

CAT

TTT

TGA

AGA

GTC

CAT

TCC

GGA

GCA

GTG

CTG

TGC

GTA

AAA

-ACT

ACT

TCT

CAG

GTA

AGG

CCT

CGT

CAC

L

C

V

K

T

S

Q

V

R

P

R

H

TAG

TGT

AGT

GAG

CTC

CAT

TAG

TTT

CGG

CCG

GGC

GTC

ACG

GGC

ATC

ACA

TCA

CTC

GAG

GTA

ATC

AAA

GCC

GGC

CCG

CAC

TGC

CCG

I

T

S

L

E

V

U

K

A

G

P

H

C

P

TGA

CGA

GTC

GAC

TAG

CGC

TGA

GAC

TTT

TTG

CCA

GCA

TTC

ACT

GCT

CAG

CTG

ATC

GCG

ACT

CTG

AAA

AAC

GGT

CGT

AAG

T

A

Q

L

I

A

T

L

K

N

G

R

K

TAG

ACA

GAT

CTG

GAC

GTC

CGA

GGC

GAC

ATG

TTT

TAG

ATC

TGT

CTA

GAC

CTG

CAG

GCT

CCG

CTG

TAC

AAA

ATC

I

C

L

D

L

Q

A

P

L

Y

L

I

TAG

TTT

GAC

CTT

AGA

ATT

CCT

AG

ATC

AAA

CTG

GAA

TCT

TAA

G

I

K

L

E

S

** *

\

COOH

Β. Descrição de Plasmídeos de Clonagem e de Expressão

1. Plasmídeo plac/cro-g gal. Os elementos controladores do vector plac/cro-^ gal consistem na reg_i_ ão operador-promotor do operão da lactose (lac) _E. coli, assim como os locais de ligação ribossomal do 1ac e cro. Este vector é derivado de plasmídeos pTR213 (Roberts e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1978) 76:760) e PLG300 (Guarente e outros, Ce 1 1 (1980) 20:543 ).

plasmídeo plac/cro-3 gal foi construído pela ligação de um fragmento 0,96 kb Pst I -Bg 111 de pTR213 a um fragmento 5,54 kb PstI-BamHI de pLG300, na presença de um ligante oligonucleotídeo previamente digerido com BamHI e Bg111:

AAAGATCTCAGGCCTCGAGGATCC TTTCTAGAGTCCGGATCTCCTAGG

Este ligante serviu os seguintes objectivos:

(1) regenerar os locais de corte Bg 111 e BamHI dos pla_s mídeos parentais, (2) proporcionar locais adicionais para a inserção de DNA estranho, e (3) permitir que 0 DNA inserido esteja em fases correctas trans1acionais , em relação à sequência codificadora cro 5 '-gal.

2. Plasmídeo ptac/cro-f gal. 0 vector de ex pressão ptac/cro-β gal é semelhante ao plac/cro-3 gal, com a excepção que 0 promotor do ptac/cro-β gal consiste na região-35 do promotor do operão triptófano, e na Prib^ now box (região-10) do operão 1ac. Este promotor de híbridos permite um nível mais elevado de expressão que 0 plac/cro-/3 gal. 0 plasmídeo ptac/cro-j? gal é derivado do plasmídeo pDR540 (Russell e Bennett, Gene ( 1983) 20:231 ) e de plac/cro-β gal.

plasmídeo ptac/cro-/J gal foi construído em duas etapas. Primeiro foi inserido um fragmento 0,87 kb SsaI de plasmídeo plac/cro-β gal em pDr540, no local de .corte BamHI, que foi previamente convertido em extremida. des abruptas, pela acção do fragmento Klenon de polimerase I de DNA . A orientação do DNA inserido foi tal que o local de ligação ribossomal, e a sequência codificadora de cro foram localizados a juzante, do local de ligação ribossomal de 1 ac. 0 plasmídeo resultante, ptac/cro, continha locais de ligação ribossomal, tanto 1ac como cro, e as sequências codificadoras de extremidade N-terminal de cro. A segunda etapa na construção de ptac/cro-β gal foi conseguida pela ligação do 1,16 kb e o 5,54 kb dos fragme_n tos PstI-BamHI dos plasmídeos ptac/cro e pLG300, respectivamente. A estrutura do ptac/cro-β gal foi portanto semeQ· lhante à do plac/cro-β gal, à excepção da região promotora de híbridos; o plasmídeo é referido como pSM1,2/tac.

3. Plasmídeo pBM11 , descrito no Pedido Americ_a no çopendente N^{5 * * * 9} de série 115.139,por Liu e outros, permite cio nar um gene estranho a juzante das sequências de DNA, cod_£ ficando para, os 33 aminoácidos de extremidade N-terminal do bacteriófago λ N-gene numlocal de restrição BamHI. Sobre a indução do promotor ÀPL, pela inactivação do repre_s sor sensível à temperatura C1857 a 42°C, o produto do gene estranho é expresso enquanto parte da extremidade C-terminal de uma proteína de fusão, cuja sequência de extremidade N-terminal é a do N-gene.

4. Plasmídeo pBM 11M4, descrito no Pedido Amer_i_ cano çopendente N⁹. de Série 115.139, por Liu e outros, é derivado de pBM11, e permite que um gene estranho seja cl_o nado num local de restrição BamHI, directamente após a metionina de iniciação do N-gene.

5. Plasmídeo pBM11/NDP, descrito no Pedido Ame ricano çopendente N⁹. de série 115.139, por Liu e outros, é derivado de pBM11 e tem sequências codificantes DNA para um dipeptídeo ácido aspártico-prol ina (ácido lábil) i_n serido entre as sequências codificantes para o N-gene e o gene estranho.

6. Plasmídeo pBM11/PAD, descrito no Pedido Am_e ricano copendente N^s de série 115.139, por Liu e outros, é derivado do plasmídeo pBM11M4, e permite que um gene e_s tranho seja clonado num Hind111, SmaI e BamHI, a juzante, duma sequência sinal de fosfatase alcalina modificada.

7. PtrpED5-1 linearizado· 0 plasmídeo ptrpED5-1 (Hallewell e Entage, Gene ( 1980) J9:27; Tacon e outros, Mo 1. Gen. Genet. ( 1980) 177:427 ) é digerido por endonuclease BssHII e BamHI , e um fragmento de extensão completa que falta ao gene trp D, e contendo um gene trp E ladeado, é isolado por electroforese de gel preparativo.

C. Preparação de Genes Recombinantes do Factor 4 das Plaquetas

1. Construção de pTac/Cro/PF4. Foi clonado um gene sintético num plasmídeo de clonagem E. co1i apropriado, para a obtenção do plasmídeo pHC PF4. São mostrados nos esquemas um mapa restritivo (Figura 2) e uma sequência nucleotídica (Figura 3). 0 pHC PF4 foi clavado com BssH 11, na extremidade 5' do codão arg, recheado com o fragmento Klenow, clavado com BamHI, e o fragmento encodificante PF4 foi purificado por electroforese de gel de agarose. 0 fragmento foi inserido no pSM1,2/tac, o qual tinha sido clavja do com StuI e BamHI, com uma ligação em forma de anel ou múltipla, porporcionando codificante para K-D-L-R, e sendo o plasmídeo daí resultante pTac/PF4 usado para transformar o E. col i NF1829. A sequência codificante continha 21 codões de terminação cro 5', 4 codões da ligação e começava com o codão arg do PF4. Foram identificadas colónias coji tendo os plasmídeos correctos, através da digestão restritiva de DNA mini-prep.

2. Preparação de ptrpEDS-1/PF4. 0 gene do fac- tor 4 das plaquetas está ligado ao plasmídeo pTrpED5-1 li.nea rizado para obter o plasmídeo pTrp/PF4 e a mistura de ligação é usada para transformar as células E. co1i HB101.

Os transformadores são se 1eccionados por resistência à ampicilina e os plasmídeos são analizados por digestão restritiva de endonuclease.

3. Preparação de pBM11/PF4 (Factor 4 das Plaquetas autêntico). A sequência nucleotídica e a correspondente sequência aminoácida do gene sintético do factor 4 das plaquetas, expresso como uma proteína autêntica a juzante da metionina de iniciação no vector de expressão pBM11 é a seguinte:

PF4 ->

M

E

A

E

D

G

D

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L

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GAT

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R

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L

AAG

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A GA

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G

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L

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CTG

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CTG

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AAG

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ATC

AAA

AAG

CTT

CTC

GAG

S ***

TCT TGA

4. Preparação de pBM11/N/PF4 (N-gene/Factor 4 das Plaquetas). A sequência nucleotídica e a correspondente sequência aminoácida do gene sintético do factor 4 das plaquetas em fusão a j uzante das sequências nucleotídicas codificantes para os 33 primeiros aminoácidos do bacteriófago λ N-gene no vector de expressão pBM11 é a seguinte: (veja-se na folha seguinte).

N-gene

->

M

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E

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GAT

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CTG

TGC

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L

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L

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AAG

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TCT

TGA

5. Preparação de pBM11/NDP/PF4 (N-gene/DP/ Factor 4 das Plaquetas). A sequência nucleotídica e a cor respondente sequência aminoácida do gene sintético do fac tor 4 das plaquetas em fusão a juzante das sequências nucleotídicas codificantes para os 32 primeiros aminoácidos do bacteriófago λ N-gene e o dipeptídeo ácido lábil Asp-Pro ( * ♦ * ) no vector de expressão pBM11 é a seguinte:

N-gene ->

M

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« * *

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->

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CTG

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AAG

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AAG

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CTC

GAG

TCT

TGA

£. Preparação de pBM11/PAD/PF4 (sequência sinal de fos-, fatase alcalina com Asp como resíduo 2 em vez de Lys/factor 4 das PIaquetas). . A Sequência nucleotídica e a correspondente sequência aminoácida do gene sintético do factor 4 das plaquetas em fusão, a juzante das sequências nucleotídicas codificantes para um peptídeo sinal de fosfatase alcalina modificada é a seguinte. 0 local da clivagem previsto é marcado com ( * * * ).

Sequência sinal

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CTC

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TCT

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Exemp1 o

6

Preparaçãc

) do

Recombinante

do

F actop

4

das Plaquetas

A. Isolamento do PF4 Expresso em Bactéria Recombinante.

1. Os. transf ormantes E . co 1 i NF1829 contendo os plasmideos pTac/PF4 multiplicaram-se durante a noite com ou sem 1% de lactose, posta a girar, fervida por 10 min. em IX tampão Laemmli SDS-PAGE e analizado por electroforese em 17,5% de gel de poliacrilamida-SDS. Para preparações em larga escala, multiplicaram-se colónias simples em 2 ml de caldo-L por 8 horas, transferiram-se para 1 L de caldo-L •'--4 contendo 1% de lactose mais antibióticos e multiplicaram-se durante a noite a 37°C. 0 recombinante do factor 4 das plaquetas, tendo 21 codões do gene cro, foi purificado da seguinte forma: um L da bactéria induzida com 1% de lactose multiplicou-se, seguido de centrifugação para formar um pellet e este congelado a -70°C. Depois de resuspender o pellet em 5-10 ml de 50 mM Tris, pH 7,9, 0,2 M NaCl, 2 mM EDTA, e 2 mM 2-mercaptoetanol, foi adiccionado lisozima a 200 )ig/ml é a mistura foi incubada por 20-30 min. em gelo enquanto era agitada. A mistura foi adiccionado triton X-100 para 1% e a mistura foi incubada por 10-20 min. em gelo enquanto era agitada, seguindo-se a adição de Zwittergent (Calbiochem) para 0,5% seguindo-se de incubação por 1020 min. em gelo enquanto era agitada. A mistura foi sonifiçada em 0,25 de banho de gelo picado, durante 2-3 minutos, enquanto palpitava, para obtenção de uma mistura que pudesse ser pipetada. A mistura foi então carregada para 10 ml 40% de sucarose em STE, posta a girar a 13.000 por 30 min. a 5°C num rotor SW28 e os sobrenadantes foram removidos. 0 pellet foi resuspendido em 5-10 ml de 0,01M de Tris, pH 7,2, 0,15 M NaCl e a amostra foi analizada por SDS-PAGE (17,5%). 0 gel foi desenvolvido por imersão em azul de Coomassie, demostrando que a proteína de fusão foi produzida em _E. co 1 i.

2. Os transformantes cresceram a 37°C para O cerca de 10 células/ml em caldo Luria e adicionou-se ácido indoliacético -3 (IAA) para cerca de 1mM e a multiplicação continuou por cerca de 1 hora. As alíquotas (1 ml) são centrífugadas por alguns segundos num centrifugador Eppendorf e os pellets são suspendidos em 500 }a1 de 7% de ácido fórmico contendo 5mg/ml de brometo de cianogénio. Após 24 horas a temperatura ambiente,as alíquotas são diluídas decuplamente em água e as amostras diluídas são experimentadas para o factor 4 das plaquetas. Desde que o factor 4 das plaquetas não tenha metionina interna, tendo uma clivagem de metio50

nina de extremidade N-terminal da proteína fundida, proporciona o factor 4 das plaquetas tendo a mesma sequência aminoácida do que o factor 4 das plaquetas occorido naturalmente.

TABELA III

Expressão do PF4 em Diferentes Sistemas de Expressão Bacterianos ’

Percentagem da proteína total
pTac/Cro/PF4	5%
pBM11/Ngene/PF4	2 0%
pBM11/Ngene/DP/PF4	20%
pBM11/PAD/PF4	15%
PBM11/PF4	2%

Exemplo 7

Actividade Biológica do Factor 4 das Plaquetas preparado em Células Rrocarióticas

A. Inibição da síntese DNA

A actividade mais elevada registada foi com a proteína de fusão do plasmídeo pBM11/Ngene/PF4 (ver exemplo IA). Cinquenta por cento da inibição máxima das células A549 foi obtida com 0,67 μg/poço.

B. Inibição do Crescimento de Tumores em Ratos Nus

Os ratos nús machos foram injectados com factor 4 das plaquetas ou tampão fosfato salino em intervalos de 2 a 3 dias, como descrito no Exemplo 1C. Como é demonstrado na Tabela IV, o factor 4 das plaquetas inibiu de forma significativa o crescimento de tumores.

Tabela IV

Efeito do Recombinante do Factor 4 das Plaquetas no Crescimento de Tumores em Ratos Nus

Dimensão do Tumor (mm )

Dias após tratamento Controlo_______Factor 4 das Plaquetas

0	17	25
6	205	25
9	275	25
14	420	40

545

635

Pelos resultados acima indicados é evidente que os compostos em estudo encontram uma vasta variedade de aplicações.Particu 1armente, os compostos podem ser utilizados em diagnósticos e tratamento de estados neoplásticos. Em terapia, os compostos podem proporcionar o abrandamento do crescimento de células tumorais, deforma a serem utilizados conjuntamente com outros métodos de tratamento para a destruição de células tumorais. Para diagnóstico, descobriu-se que estes compostos induzem a produção de p52, de forma a que, sob administração destes compostos a um hospedeiro, os níveis activados de p52 sejam um indicativo da presença de células tumorais. Isto pode ser muito importante durante o tratamento de um estado neoplãstico, para determinar se o remover das células tumorais teve sucesso ou se ocorreram metastases. Os compostos em estudo podem também ser utilizados como reagentes em experiências diagnósticas para a presença do factor 4 das plaquetas ou de receptores do factor 4 das plaquetas.

Todas as publicações e pedidos de patentes mencionados nesta descrição são indicativos do nível de aptidão destes peritos no ramo à qual esta invenção diz respeito. Todas as publicações e pedidos de patentes estão aqui incorporados como referência na mesma medida como se cada publicação individual ou pedido de patente fosse especifica e individualmente indicado para ser incorporado como referência.

Estando agora a invenção total mente descrita, será aparente para uma pessoa

normalmente perita	neste ramo,	que	podem ser	feitas muitas	alterações e
				do espírito ou	extensão das
modificações, sem,	no entanto,	nos	afastarmos
reivindicações anexas.
	R E I V	I N	D I C A Ç Õ	E S

- Processo de preparação de compostos que inibem o crescimento de células neoplásticas, para utilização no tratamento de doenças cancerígenas, caracterizado pelo facto de compreender:

Claims

1 - Processo de preparação de compostos que inibem o crescimento de células neoplásticas, para utilização no tratamento de doenças cancerígenas, caracterizado pelo facto de compreender:

o contacto das referidas células neoplásticas com uma quantidade inibidora da proliferação de um polipeptídeo incluindo uma primeira sequência compreendendo, pelo menos, oito aminoácidos incluídos na sequência completa:

M-E-A~E-E-D~G-D-L~Q-C-L-C-V-K-T-T~S-O-V-R-P-R-H-I-T-Sl-e-v-i-k-a-g-p-h-c-p-t-a-q-l-i-a-t-l-k-n-g-r-k-i-c-lD-L-Q-A-P-L-Y-L-L-I-I-K-K-L-L-E-S ou um fragmento da mesma de, pelo menos, oito aminoácidos possuindo actividade biológica do factor 4 das plaquetas.

2 - Processo de preparação de compostos que inibem o crescimento de células neoplásticas, para utilização no tratamento de doenças cancerígenas, conforme reivindicado na reivindicação 1, caracterizado pelo facto do dito polipeptídeo compreender, além disso, uma segunda sequência ligada ao terminal amino da primeira sequência referida, compreendendo a dita segunda sequência cerca de 8 a cerca de 35 aminoácidos de N-terminal, de um dos seguintes:

a . M-D-A-Q-T-R-R-R-E-R-R-A-E-K-Q-A-Q-W-K-A-AN-P-L-L-V-G-V-S-A-K-P-V-R-I-R-M;

b. M-D-A-Q-T-R-R-R-E-R-R-A-E-K-Q-A-Q-W-K-A-AN-P-L-L-V-G-V-S-A-K-P-V-R-I-D-P;

c . M-D-Q-S-T-I-A-L-A-L-L-P-L-L-F-T-P-V-T-K-A.

3 - Processo de preparação de compostos que inibem o crescimento de células neoplásticas, para utilização no tratamento de doenças cancerígenas, conforme reivindicado na reivindicação 2, caracterizado pelo facto do dito polipeptídeo possuir, substancial mente, a seguinte sequência de aminoácido:

M-D-A-Q-T-R-R-E-R-R-A-E-K-Q-A-Q-W-K-A-A-N-P-L-L-V-G-Vs-a-k-p-v-r-i-r-h-e-a-e-e-d-g-d-l-q-ol-c-v-k-t-t-s-qV-R-P-R-H-I-T-S-L-E-V-I-K-A-G-P-H~OP-T-A-Q-b-I-A-T-Lk-n-g-r-k-i-c-l-d-l-q-a-p-l-y-l-l-i-i-k-k-l-l-e-s

4 - Processo de preparação de compostos que inibem o crescimento de células neoplásticas, para utilização no tratamento de doenças cancerígenas, conforme reivindicado na reivindicação 1, caracterizado pelo facto do dito polipeptídeo possuir, substancial mente, a seguinte sequência de aminoácido:

W-E-A-E-E-D-G-D-L-Q-C-L-OV-K-T-T-S-Q-V-R-P-R-H-I-T-SD-L-Q-A-P-L-Y-L-L-I-I-K-K-L-L-E-S.

5 - Processo de preparação de um polipeptídeo, compreendendo um factor 4 das plaquetas ou um seu congénere, caracterizado pelo facto de compreender:

o crescimento, num meio nutritivo, de uma célula hospedeira contendo uma sequência de expressão (cassette de expressão) compreendendo, na direcção da transcrição, uma região reguladora da transcrição e uma região de iniciação da translação, funcionais na dita célula hospedeira;

uma sequência de DNA codificando o dito polipeptídeo, regiões de terminação da transcrição e da translação, funcionais na dita célula hospedeira, caracterizada pelo facto da dita sequência de DNA se encontrar sob o controlo regulador das ditas regiões de terminação e de iniciação, e sendo, pelo menos, uma das referidas : região reguladora da transcrição, região de iniciação da transcrição, e região de terminação da transcrição e da translação, diferente da região natural ligada ao gene estrutural para o factor 4 das plaquetas, quando a dita sequência de DNA é a sequência natural, por meio da qual é expresso o dito polipeptídeo; e o isolamento do dito polipeptídeo.

6 - Processo de preparação de um polipeptídeo, conforme reivindicado na reivindicação 5, caracterizado pelo facto da dita célula hospedeira ser uma célula £. Coli.

7 Processo de preparação de um polipeptídeo. conforme reivindicado na reivindicação 5, compreendendo um primeiro polipeptídeo ligado à extremidade-N do factor 4 das plaquetas, ou a um seu congénere, caracterizado pelo facto de compreender:

o crescimento, num meio nutritivo, de uma célula hospedeira contendo uma sequência de expressão (cassette de expressão) de DNA, compreendendo na direcção 5' -3', da transcrição, uma região reguladora da transcrição; uma região de iniciação da translação; uma primeira sequência de DNA codificando o referido polipeptídeo inicial, ligado, em fase, com uma segunda sequência de DNA codificando o dito factor 4 das plaquetas ou um seu congénere; e regiões de terminação da transcrição e da translação; e o isolamento da dita proteína de fusão.

8 · Processo de preparação de um polipeptídeo, conforme reivindicado na reivindicação 7, caracterizado pelo facto de compreender, além disso:

depois do dito isolamento, a recuperação (o enrolamento) da dita proteína de fusão.

9 - Processo de preparação de um polipeptídeo, conforme reivindicado na reivindicação 7, caracterizado pelo facto do primeiro polipeptídeo referido compreender de 8 a cerca de 35 aminoácidos de N-terminal, de um gene -N ou de um gene Cro do bacteriófago lambda, ou um gene bacteriano de fosfatase alcalina.

10 - Processo de preparação de um polipeptídeo, conforme reivindicado na reivindicação 7, caracterizado pelo facto da referida proteína de fusão compreender um segundo polipeptídeo compreendendo, pelo menos, um aminoácido, e compreendendo, além disso, a dita sequência de expressão (cassette de expressão) uma terceira sequência de DNA codificando o dito segundo polipeptideo, ligada, em fase, entre a primeira sequência de DNA e a segunda sequência de DNA.

11 - Processo de preparação de um polipeptideo, conforme reivindicado na reivindicação 10, caracterizado pelo facto do segundo polipeptideo referido compreender um local de clivagem química ou um local de clivagem enzimática.

12 - Processo de preparação de um polipeptideo, conforme reivindicado na reivindicação 11, caracterizado pelo facto do referido local de clivagem enzimática ser um ácido aspártico-prolina.

13 - Processo de preparação de um polipeptideo, conforme reivindicado na reivindicação 11, caracterizado pelo facto de compreender:

depois do dito isolamento, a clivagem da dita proteína de fusão no referido local de clivagem enzimática ou química, através da qual é liberto o dito factor 4 das plaquetas ou um seu congénere:

a separação do dito factor 4 das plaquetas ou dum congénere do mesmo de quaisquer reagentes ou produtos de clivagem: e a recuperação (o enrolamento) do dito factor 4 das plaquetas ou dum congénere do mesmo.