PT833848E - Peptidos ligantes do factor ix derivados do factor viii e sua utilizacao como inibidores da coagulacao do sangue - Google Patents
Peptidos ligantes do factor ix derivados do factor viii e sua utilizacao como inibidores da coagulacao do sangue Download PDFInfo
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DESCRIÇÃO "PÉPTIDOS LIGANTES DO FACTORIX, DERIVADOS DO FACTOR VIIIE SUA UTILIZAÇÃO COMO 1N1B1DOKES DA COAGULAÇÃO DO SANGUE "
Campo da Invenção A presente invenção relaciona-se com os métodos de preparação de anticoagulantes altamente específicos que podem ser utilizados em composições terapêuticas para o tratamento de tromboses. O ingrediente biologicamente activo da referida preparação compreende um ou mais péptidos que inibem selectivamente as vias de coagulação dependentes do Factor IX. Esta invenção proporciona métodos para obtenção desses péptidos e para a formulação de composições farmacêuticas com actividade antitrombocítica.
Antecedentes da Invenção A paragem de uma hemorragia envolve a acção concertada de vários mecanismos hemostáticos, que conduzem eventualmente à formação de trombos. Os trombos são deposições de constituintes do sangue na superfície das paredes dos vasos, e são constituídos principalmente por plaquetas sanguíneas agregadas e fibrina reticulada insolúvel. A formação da fibrina ocorre por proteólise limitada do ffibrinogénio pela trombina. Esta enzima é o produto final da cascata de coagulação, uma sequência de activações de zimogéneos que ocorre à superfície de plaquetas e leucócitos activados, e uma diversidade de células vasculares (para uma revisão ver K.G. Mann et al., Blood Vol. 76, 1990, pp 1-16).
Normalmente a formação do trombo permanece localizada em sítios de lesão vascular, uma vez que a agregação e adesão plaquetárias são mediadas por agonistas associados ao trombo em desenvolvimento, tais como a trombina formada localmente. No entanto, em determinadas condições patológicas, a formação destas deposições não permanece limitada ao sítio da lesão. Os trombos podem então ocorrer em artérias e veias em qualquer sítio da circulação, que pode em último caso resultar na obstrução do vaso e paragem da circulação sanguínea. Isto proporciona o mecanismo subjacente a uma variedade de distúrbios trombocíticos, compreendendo trombose de veias profundas, embolia pulmonar, coagulação intravascular disseminada, doença arterial periférica, enfartes do miocárdio e derrames cerebrais. (J.F. Mustard et ai, em: A.L. Bloom e D.P. Thomas (Eds.), Haemostasis and Thrombosis, 2nd edition, Churchill-Livingstone, Edinburgh, 1987, pp 503-526).
Foram desenvolvidas numerosas estratégias para o tratamento de distúrbios trombocíticos. Estas terapêuticas antitrombocíticas têm em comum o facto de se basearem na interferência com o sistema hemostático. Esta abordagem transporta o risco inerente de hemorragia, uma vez que o sistema hemostático já não responderá totalmente a uma potencial lesão. Portanto, os benefícios antitrombocíticos estão inevitavelmente associados a riscos anti-hemostáticos. Na tentativa de aumentar a relação benefício-risco, estão continuamente a ser desenvolvidos novos agentes antitrombocíticos. As variadas estratégias antitrombocíticas têm sido amplamente revistas noutros locais, e algumas estão brevemente resumidas adiante para ilustrar os vários desenvolvimentos nesta área. Estas compreendem: (a) Inibidores gerais da formação de trombina. Uma estratégia bem estabelecida consiste numa terapêutica oral anticoagulante administrando antagonistas da 3 3
/13 vitamina K. Isto interfere na biossíntese dos chamados factores de coagulaçEo dependentes da vitamina K, que compreendem os Factores VII, IX, X e pró-trombina. Esta terapêutica no entanto não é específica, uma vez que afecta tanto as vias de coagulação intrínseca como extrínseca (ver Figura 1). Embora amplamente utilizada, a anticoagulação oral requer uma monitorização intensiva para reduzir os riscos de hemorragia associados a esta terapêutica (ver J. Hirsh et ai, em: R.W. Colman et ai, (Eds.), Hemostasis and Thrombosis, Basic Principies and Clinicai Practice, 3rd edition, Lippincott, Philadelphia, 1994, pp 1567-1583). Uma terapêutica igualmente não-específica consiste na administração de heparina. Este composto acelera a inactivação de um número de componentes, incluindo a trombina e as formas activadas dos Factores IX e X (Factores IXa e Xa), pelo seu inibidor natural Antitrombina III. Nas duas últimas décadas, na tentativa de reduzir o risco de hemorragia associado a esta terapêutica, têm sido desenvolvidos derivados da heparina de baixo peso molecular, os quais demonstram uma especificidade crescente para o Factor Xa em relação à inibição da trombina (ver T.W. Barrowcliffe e D.P. Thomas, em: A.L. Bloom et al. (Eds), Haemostasis and Thrombosis, 3rd edition, Churchill-Livingstone, Edinburgh, 1994, pp 1417-1438). (b) Inibidores específicos da trombina. Como a trombina é a enzima chave na activação plaquetária, na formação de fibrina, e na activação dos cofactores Factores V e VIII (ver Figura 1), pode parecer um alvo atraente para a terapêutica antitrombocítica. Numerosos estudos têm sido dedicados à pequena proteína de sanguessuga chamada hirudina, e a péptidos seus derivados (J. M. Maraganore, Thromb. Haemostasis Vol. 70, 1993, pp 208-211). Apesar de estes componentes serem mais eficazes do que por exemplo a heparina em modelos animais de trombose experimental, os ensaios clínicos inicialmente revelaram uma frequência inesperadamente elevada de hemorragias, demonstrando que a abordagem directa à trombina pode produzir um efeito anti-hemostático significativo, com uma razão benelicio-risco relativamente desfavorável (L.A. Harker, Biomedical Progress Vol. 8, 1995, pp 17-26). (c) Inibidores específicos do Factor Xa. A supressão da formação de trombina pode efectivamente ser alcançada inibindo o Factor Xa, que é a enzima activadora da pró-trombina na cascata de coagulação (ver Figura 1). Teoricamente, isto tem a vantagem de inibir a formação de trombos vasculares mas permitindo ainda que seja produzida uma quantidade pequena, mas hemostaticamente importante de trombina. Dois péptidos de ocorrência natural inibidores do Factor Xa foram recentemente desenvolvidos, o péptido anticoagulante de carraça (G.P. Vlasuk, Thromb Haemostasis Vol. 70, 1993, pp 212-216) e antistasina, um anticoagulante de sanguessuga (G.P. Tuszynsky et al., J. Biol. Chem. Vol. 262, 1987, pp 9718-9723). Estes polipéptidos e vários oligopéptidos seus derivados (N. Ohta et al., Throm. Haemostasis Vol. 72, 1994, pp 825-830) podem proporcionar uma razão benefício-risco mais favorável do que os agentes com uma especificidade mais ampla. (d) Inibidores da activação e adesão plaquetárias. Numerosos estudos têm sido dirigidos a esta estratégia, que tem a vantagem teórica de interromper especificamente o recrutamento de plaquetas dependentes de trombina nos sítios de lesão vascular, enquanto restringem a produção de fibrina (ver L. A. Harker et al, em: R. W. Colman et al. (Eds), Hemostasis and Thrombosis, Basic Principies and Clinicai Practice, 3rd edition, Lippincott, Philadelphia, 1994, pp 1638-1660). Esta estratégia pode ser realizada por vários agentes, incluindo antagonistas sintéticos dos receptores de trombina, ou anticorpos monoclonais ou péptidos que interferem com o processo de adesão. Embora esta abordagem pareça particularmente útil nas tromboses arteriais, continuam a ser descritos episódios de hemorragia, sugerindo que a especificidade desta estratégia pode não ter eliminado satisfatoriamente o risco anti-hemostático.
Em resumo, a avaliação das estratégias antitrombocíticas actuais em termos de benfícios antitrombocíticos versus riscos anti-hemostáticos revela que a razão benefício-risco tende a ser mais favorável em estratégias que interferem num passo específico do que numa fase mais genérica do sistema hemostático (L. A. Harker, Biomedical Progress Vol. 8, 1995, 17-26). Embora o desenvolvimento de inibidores específicos para o Factor Xa pareça ser um melhoramento promissor, esta abordagem ainda bloqueia as vias comuns (intrínseca e extrínseca) de produção de trombina (ver Figura 1), e deste modo também a activação das plaquetas dependente de trombina. Portanto existe uma necessidade urgente de agentes antitrombocíticos mais específicos que inibam apenas uma via hemostática, ao mesmo tempo que não afectam outras vias.
Uma inibição mais selectiva do sistema hemostático deve ser exequível se existirem agentes que interfiram exclusivamente na via intrínseca de activação do Factor X. Isto deixaria intacta a via extrínseca, permitindo a formação de uma quantidade pequena, mas hemostaticamente importante de Factor Xa e trombina. Embora a formação do tampão de plaquetas associado à fase inicial de detenção da hemorragia permanecesse não-afectada, a formação de grandes quantidades de trombina e fibrina seria suprimida (ver Figura 1). Uma estratégia potencialmente bem sucedida para alcançar uma inibição selectiva da via de coagulação intrínseca pode consistir na utilização do Factor VIII como modelo para conceber péptidos antagonistas que contrariem a sua função biológica. Foi descrita uma tentativa que utiliza péptidos sintéticos mimetizando o domínio de ligação de fosfolípidos do Factor VIII (T.S. Zimmerman et al., Pedido de Patente Internacional, WO 90/15615, publicado em 27 de Dezembro de 1990). Esta região, que está localizada no mais afastado C-terminal da proteína do Factor VIII (o chamado domínio C2, ver adiante), compreende uma sequência que se liga aos fosfolípidos específicos (fosfatidilserina) na superfície 6
das plaquetas, leucócitos ou células vasculares activados (P.A. Foster et al, Blood Vol. 75, 1990, pp 1999-2004). Estes péptidos ligados a fosfolípidos impedem o Factor VIII de participar no processo de coagulação sanguínea e assim podem actuar como anticoagulantes. No entanto, devido ao facto de outros factores de coagulação além do Factor VIII, incluindo o Factor V, Factor VII, Factor IX, Factor X e pró-trombina (ver Figura 1) partilharem a mesma exigência de membranas contendo fosfatidilserina (ver K.G. Mann et al., Blood Vol. 76, 1990, pp 1-16), estes péptidos que se ligam a fosfolípidos afectam passos múltiplos no sistema de coagulação. Consequentemente, esta abordagem não tem a especificidade desejada para a via de coagulação intrínseca. Essa inibição selectiva deve ser realizável utilizando compostos que interferem na interacção Factor VIII-Factor IX, por exemplo bloqueando o sítio de ligação do Factor VIII no Factor IX imediatamente após a sua formação durante a resposta hemostática. Seria ainda mais preferível se esses compostos bloqueassem o sítio de ligação do Factor VIII no Factor IX antes da sua conversão em Factor IXa, permitindo deste modo também aplicação profilática. A concepção desses agentes, porém, até agora tem sido dificultada pela falta de conhecimento respeitante aos sítios moleculares envolvidos na interacção Factor VIII(a)-Factor IX(a).
Em relação aos sítios de ligação envolvidos na interacção entre os Factores VIII e IX, até agora foram publicadas apenas algumas referências. Estas focaram-se no Factor VIII, que é o cofactor do Factor IXa no complexo de activação do Factor X (ver Figura 1). O Factor VIII é sintetizado como uma cadeia polipeptídica simples com 2332 amino ácidos, com a estrutura típica do domínio A1-A2-B-A3-C1-C2 (G. A. Vehar et al. Nature Vol. 312, 1984, pp 337-342; J. J. Toole et al., Nature Vol. 312, 1984, pp 342-347). Devido ao processamento endoproteolítico, o Factor VIII circula no plasma como um complexo heterodimérico de cadeias leve e pesada. A cadeia leve compreende resíduos de amino ácidos 1649-2332, e contém os domínios A3-C1-C2. A cadeia 7
pesada contém os domínios A1-A2-B (resíduos 1-1648) e é heterogéneo devido à proteólise limitada a um número de posições dentro do domínio B. Lenting et al. (J. Biol. Chem. Vol. 269, 1994, pp 7150-7155) descreveram que o Factor IXa se liga especiíicamente à cadeia leve do Factor VIII. Subsequentemente, os mesmos investigadores descreveram estudos semelhantes utilizando os produtos da clivagem da cadeia leve do Factor VIII, e concluíram que o sítio de ligação do Factor IXa devia estar localizado entre os resíduos 1722 e 2332 na cadeia leve do Factor VIU (M. J. S. H. Donath et al, J. Biol. Chem. Vol. 270, 1995, pp 3648-3(>55). Adicionalmente observou-se que a interaeção entre o Factor IXa e a cadeia leve do Factor VIII é inibida por um anticorpo monoclonal, designado CLB-CAg A, que é dirigido contra o domínio A3 do Factor VIII (P. J. Lenting et al.. J. Biol. Chem. Vol. 269, 1994, pp 7150-7155), e mais especificamente contra uma região que abrange os resíduos 1801-1823 (J.W. van de Loo et al., Annual Report 1992, Dr. Karl Landsteiner Foundation, Amsterdam, p 1).
Embora estas observações sugiram que o domínio A3 do Factor VIII contribui para a ligação do Factor IX, outros investigadores têm divulgado dados que indicam que a cadeia leve do Factor VIII não é uma região importante de ligação ao Factor IX. Fulcher et al. (Scientific Report 1992-1993, Scripps Research Institute, La Jolla, U.S.A., p 159) descreveram que um anticorpo monoclonal contra a região 701-750 da cadeia pesada do Factor VIII, ou péptidos sintéticos derivados dos resíduos 698-710 ou 698-712, inibem os ensaios funcionais dependentes do Factor IXa. O mesmo estudo refere que estes péptidos interactuam directamente com o Factor IXa, apoiando portanto o conceito de que a região 698-710 do domínio A2 do Factor VIII representa um sítio de ligação ao Factor IXa funcionalmente importante (J.I. Jorquera et al., Circulation Vol. 86, 1992, p 685). Provas adicionais do envolvimento do domínio A2 da cadeia pesada do Factor VTTT na ligação ao Factor IXa, embora num sítio diferente, têm sido referidas por outros investigadores (P.J. Fay et al, J. Biol. Chem. Vol. 269, 1994, ρ 20522-20527). Neste último estudo, um péptido sintético correspondente aos resíduos 558-565 do domínio A2 têm sido utilizados para identificar esta região como o sítio de interacção do Factor IXa.
Em resumo, vários sítios de ligação potenciais do Factor IXa têm sido identificados: pelo menos dois sítios distintos no domínio A2 da cadeia pesada do Factor VIII, e um ou mais sítios adicionais na região 1722-2332 da cadeia leve do Factor VIII, presumivelmente no domínio A3. Estes dados divergentes implicam que existem sítios múltiplos que estão envolvidos na ligação do Factor VIII, ou que sequências múltiplas contribuem para a formação de um único sítio de ligação do Factor IXa. Assim, continua a ser difícil identificar conclusivamente um sítio predominante como um modelo adequado para a concepção de agentes anti-hemostáticos eficazes. Para além disso, descrições do estado da técnica têm sido limitadas à interacção do Factor VTII com a enzima Factor IXa. A pró-enzima Factor IX não-activada, que pode apresentar exigências de ligação significativamente diferentes, não foi anteriormente abordada.
Sumário da Invenção
Esta invenção proporciona um péptido com uma sequência de amino ácidos derivada do Factor VIII e capaz de se ligar ao Factor IX activado e ao seu precursor não-activado. A referida sequência de amino ácidos é preferencialmente derivada do Factor VIII humano. Mais especificamente, a referida sequência de amino ácidos é derivada de um exosítio do Factor VIII, em particular de um exosítio localizado no domínio A3 do Factor VIII, tal como o exosítio I do domínio A3 do Factor VIII humano como apresentado na Figura 2.
Preferencialmente, a referida sequência de amino ácidos compreeende dois resíduos de amino ácidos básicos separados por entre 3 a 6 resíduos de amino ácidos adicionais, sendo pelo menos dois dos resíduos referidos de amino ácidos adicionais seleccionados do grupo que consiste em resíduos de amino ácidos hidrófobos e aromáticos. Mais preferencialmente, a referida sequência de amino ácidos compreende a sequência Glu- Thr- Lys- Thr-Tyr- Phe- Trp- Lys.
Geralmente o péptido terá um comprimento desde 8 até 200 fragmentos de amino ácidos, tais como desde 8 até cerca de 150, preferencialmente desde 8 ou 9 até 55, e mais preferencialmente desde 10 até 20 resíduos de amino ácidos.
De acordo com uma forma de realização preferida da invenção, o péptido é um fragmento de desde 10 até 20 resíduos de amino ácidos da sequência de amino ácidos Gly-Ala-Glu-Pro-Arg-Lys-Asn-Phe-Val-Lys-Pro-Asn-Glu-Thr-Lys-Thr-T yr-Phe-T rp-Lys-V al-Gln-His-His-Met-Ala-Pro-Thr-Lys-Asp-Glu-Phe, incluindo a sequência Glu- Thr-Lys- Tht- Tyr- Phe- Trp- Lys.
De acordo com outra forma de realização preferida da invenção, o péptido é um fragmento de desde 10 até 20 amino ácidos pertencentes à sequência de amino ácidos Gly-Ala-Glu-Pro-Arg-Lys-Asn-Phe-Val-Lys-Pro-Asn-Glu-Thr-Lys-Thr-T yr-Phe-T rp-Lys-V al-Gln-His-His-Met-Ala-Pro-Thr-Lys-Asp-Glu-Phe, compreendendo o referido fragmento a sequência Glu- Thr- Lys-Thr- Tyr- Phe- Trp-Lys. A matéria da invenção proporciona ainda uma composição farmacêutica compreendendo um péptido tal como aqui definido e um veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Em particular, a referida composição farmacêutica é para o tratamento de distúrbios trombocíticos e compreende o(s) péptido(s) numa quantidade eficaz para inibir a via de coagulação sanguínea intrínseca. A invenção também proporciona um método de tratamento de um mamífero, em particular um ser humano contra distúrbios trombocíticos. compreendendo a administração ao referido indivíduo de um péptido tal como aqui definido numa quantidade eficaz para inibir a via de coagulação sanguínea intrínseca.
Breve Descrição dos Desenhos A Figura 1 mostra uma síntese dos mecanismos envolvidos na formação de um trombo. Uma lesão vascular conduz à exposição do Factor Tecidular, e desencadeia a activação do Factor X pela via extrínseca. Complexado com o Factor V activado, o Factor Xa converte a pró-trombina em trombina, a enzima chave na resposta hemostática. A trombina induz a formação de um trombo primário através da activação plaquetária e da conversão de fibrinogénio em fibrina. Depois de uma demora inicial, a trombina activa adicionalmente os co-factores Factor V e Factor VIII, sendo o último um co-factor essencial na via de coagulação intrínseca. Após a activação do Factor IX tanto pelo Factor VIIa/Factor Tecidular como pelo Factor Xla, este conduz à resposta hemostática secundária por trombina adicional e Factor Xa formados pelo complexo Factor IXa/Factor VHIa (indicado a cheio) da via intrínseca. Este mecanismo secundário é o alvo dos compostos anticoagulantes da presente invenção. A Figura 2 mostra um gráfico de hidropatia do domínio A3 do /<5 ·- 11
Factor Vlll. O gráfico foi construído tal como descrito no Exemplo I. O gráfico revela a existência de três regiões discretas com valores baixos de hidropatia, o que reflecte a natureza hidrófila associada a exosítios potencialmente expostos. Estes estão indicados como I, II e ΠΙ. A estrutura primária destes exosítios também está listada. A sequência primária destes exosítios também está listada. O exosítio I adicionalmente contém um sítio para a glicosilação ligada a N (Asn na posição 1810, ver G.A. Vehar et al., Nature Vol. 312,1984, pp 337-342). Esta posição dentro do exosítio I está sublinhada (N). A Figura 3 sumaria a identificação do sítio de ligação do Factor IXa ao domínio A3 do Factor VIII utilizando uma série de péptidos parcialmente sobrepostos. Os péptidos foram sintetizados utilizando o método descrito no Exemplo II. A ligação do Factor IXa foi avaliada tal como descrito no Exemplo III. A Figura 4 mostra a interacção do Factor IXa ( símbolos a cheio) ou Factor IX não-activado (símbolos abertos) com um péptido sintético imobilizado (quadro A) e com a cadeia leve completa do Factor VIII imobilizado (quadro B). Os pormenores são dados no Exemplo IV. A comparação dos quadros A e B demonstra que o péptido sintético não distingue entre o Factor IXa e o Factor IX não-activado, enquanto que a cadeia leve completa do Factor VIII mostra uma preferência elevada para se ligar à forma activada, o Factor IXa. A Figura 5 mostra o efeito de um péptido sintético ligante ao Factor IX no sistema hemostático. O composto KNFVKPNETKTYFWK foi testado em ensaios correntes para as vias de coagulação intrínseca (APTT) e extrínseca (PT) tal como descrito no Exemplo VII. Foram executados ensaios utilizando plasma humano (quadro A) e de coelho (quadro B). Os dados mostram que o composto KNFVKPNETKTYFWK ligante ao Factor IX inibe a via de coagulação intrínseca, enquanto não afecta a via de coagulação extrínseca.
Descrição Pormenorizada das Formas de Realização Preferidas A presente invenção relaciona-se com péptidos biologicamente activos que inibem especificamente a via de coagulação sanguínea dependente do Factor IX. Os referidos péptidos exercem uma função inibidora porque compreendem um padrão envolvido na ligação ao Factor IX activado ou ao seu precursor não-activado, desse modo competindo com o Factor VIII. Os referidos péptidos são baseados num padrão específico derivado de um ou mais exosítios da sequência de amino ácidos do Factor VIII. O termo "exosítio" é aqui utilizado em sentido lato, e refere-se às partes relativamente hidrófilas de proteínas que têm a probabilidade de se orientar em direcção à superfície da molécula do Factor VIII. O termo "padrão" refere-se aqui a uma sequência padrão típica de amino ácidos hidrófilos e hidrófobos, incluindo os seus análogos naturais e sintéticos, que compreende os requisitos mínimos para se ligar ao Factor IX activado ou não-activado. O termo "Factor IX" é aqui usado para designar o Factor IX de coagulação sanguínea, incluindo as suas formas activada e não-activada. O termo "derivado de" é aqui usado para designar principalmente uma sequência que ocorre na sequência do Factor VIII, mas também engloba sequências modificadas que têm características semelhantes ou até melhoradas no que respeita à ligação de Factor IX activado e/ou não-activado. Normalmente, a referida modificação consistirá numa substituição de um número limitado de resíduos de amino ácidos, por exemplo no máximo 20%, preferencialmente no máximo 10% dos resíduos de amino ácidos, por outros resíduos de amino ácidos, normalmente da mesma categoria (os amino ácidos hidrófobos são substituídos por outros amino ácidos hidrófobos, os amino ácidos básicos por outros amino ácidos básicos, etc.). As adições ou remoções de amino ácidos, no entanto, também se pretende que sejam englobadas pelo termo "modificação". O termo referido além disso engloba as formas multiméricas do péptido, tal como e.g. repetições tandem. As modificações químicas de amino ácidos particulares também são englobadas, especialmente modificações químicas do N-terminal e/ou C-terminal dos resíduos de amino ácidos, tal como o bloqueamento dos grupos amina e/ou carboxílo terminais, ou a ligação de uma molécula ou unidade contendo uma função, tal como uma função transportadora, uma função de atingir um alvo, etc. O termo "modificação" além disso engloba a adição ou remoção de resíduos glicosídicos que podem modular a exposição do padrão ligante do Factor IX.
Num primeiro conjunto de formas de realização particularmente preferidas da presente invenção, o péptido é derivado de um ou mais exosítios da sequência da molécula do Factor VIII, preferencialmente da cadeia leve do Factor VIII, e mais preferencialmente do domínio A3 do Factor VIII. Além disso, embora a invenção englobe péptidos baseados em exosítios do Factor VIII de qualquer espécie de mamífero, os referidos péptidos são preferencialmente derivados do Factor VIII humano.
De acordo com outro conjunto de formas de realização preferidas, o péptido desta invenção inclui um padrão que consiste numa repetição de pelo menos dois resíduos de amino ácidos básicos (Lys, Arg, ou seus análogos), separados por um conjunto de amino ácidos que é relativamente rico em amino ácidos hidrófobos ou aromáticos, ou seus análogos. Mais preferencialmente, o padrão consiste em dois resíduos de amino ácidos básicos separados por entre 3 e 6 outros resíduos, sendo a sua maioria hidrofóbicos ou aromáticos. Mais preferencialmente, o péptido compreende o padrão ETKTYFWK (Glu-Thr-Lys-Thr-Tyr-Phe-Trp-Lys), que corresponde aos resíduos 1811-1818 do domínio A3 do Factor VIII humano.
Noutra forma de realização particularmente preferida, o péptido que compreende o padrão ligante do Factor IX representa um fragmento da cadeia leve do Factor VIII. Este pode ser obtido a partir do heterodímero intacto do Factor VIII dissociando as cadeias leve e pesada, e isolando a cadeia leve por metodos bem conhecidos na técnica, por exemplo por cromatografia por i mu noa fin idade utilizando um anticorpo contra um dos exosítios no domínio A3 do Factor VIU. Em particular, o péptido pode consistir num fragmento proteolitico da cadeia leve do Factor VIII, mais preferencialmente do domínio A3 do Factor VIII. Esses fragmentos podem ser produzidos por métodos conhecidos pelo perito médio na matéria, por exemplo por digestão com enzimas protcolíticas tais como quimiotripsina, tripsina e outros semelhantes. A digestão cnzimatica pode além disso incluir incubação com glicosidases apropriadas para remover cspecificamente oligossacáridos dos sítios de glicosilação, incluindo o do resíduo 1810 no domínio A3. Os péptidos que contêm o padrão ligante do Factor IX podem depois ser isolados por técnicas correntes de cromatografia por imunoafinidade, utilizando um anticorpo com o seu epitopo próximo ou no padrão ligante do Factor IX.
Noutra forma de realização particularmente preferida, o padrão ligante do Factor IX que contém o péptido é obtido por técnicas de DNA recombinante, em que a porção de DNA codifícante da cadeia leve do Factor VIII ou, mais preferencialmente, do domínio A3 do Factor VIII ou de uma sua parte, é introduzido num plasmídeo apropriado para translação in vitro ou para expressão em células hospedeiras procarióticas ou eucarióticas, ou para expressão em fluidos biológicos, incluindo leite, de animais transgénicos. Um perito na matéria identificará facilmente os métodos apropriados para realizar isto. O DNA codifícante do péptido ligante do Factor IX pode conter várias 15 mutações no padrão ligante do Factor IX (ver acima), ou na sua proximidade, por exemplo no resíduo Asn que representa o sítio de glicosilação no domínio A3 do Factor VIII (ver Figura 2). Os péptidos expressos podem ser adicionalmente modificados pelos mesmos métodos enzimáticos descritos acima para a obtenção de fragmentos da cadeia leve do Factor VIII. Os péptidos expressos podem ser purificados pela mesma abordagem com cromatografia por imunoafinidade tal como especificado acima para fragmentos de proteínas gerados por proteólise limitada.
Os compostos da presente invenção podem também ser produzidos por técnicas correntes de síntese de péptidos. Os oligopéptidos que compreendem o padrão ligante do Factor IX podem ser ligados a proteínas transportadoras incluindo albumina ou outras proteínas plasmáticas para prolongar o tempo de semi-vida do péptido na circulação de quem o recebe.
Os compostos descritos na presente invenção podem ser formulados para administração por qualquer via adequada, e a invenção inclui no seu âmbito composições farmacêuticas contendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de pelo menos um péptido compreendendo o padrão ligante do Factor IX. Essas composições podem ser formuladas de um modo convencional utilizando um ou mais veículos ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis. Os veículos adequados compreendem, mas não se limitam a, diluentes ou enchimentos, meios aquosos estéreis e vários solventes orgânicos não-tóxicos. As composições podem ser formuladas na forma de comprimidos, cápsulas, pós, suspensões ou soluções aquosas, soluções injectáveis e outras semelhantes. As formas de dosagem apropriadas podem ser facilmente identificadas por um perito na matéria. O método desta invenção deve ser prefereneialmente realizado utilizando um regime de doseamento que garanta resposta terapêutica máxima até que se atinjam melhorias, e em seguida o nível de eficácia mínimo que proporciona protecção apropriada contra tromboses. Em geral, a dose dependerá do tamanho molecular do péptido utilizado. Para um oligopéptido com cerca de 15 amino ácidos, a dosagem para administração endovenosa pode variar aproximadamente entre 0,1 e 1000 mg/kg, preferencialmente entre 1 e 500 mg/kg, e mais preferencialmente entre 10 e 100 mg/kg. Para péptidos maiores, a dose pode ser aumentada em conformidade. Para administração oral, a dose pode ser substancialmente maior, considerando, evidentemente, que essa dosagem apropriada pode também estar dependente do estado geral de saúde do doente, da idade e de outros factores que podem influenciar a resposta ao fármaco. O fármaco pode ser administrado por infusão contínua, ou a intervalos regulares aproximadamente desde 4 até 50 horas para manter o efeito terapêutico a um nível desejado. A invenção é ilustrada nos Exemplos descritos subsequentemente. Embora sejam exemplificativos da presente invenção aplicada na identificação, preparação e utilização de péptidos anticoagulantes derivados da cadeia leve do Factor VIII, a invenção está concebida para ser igualmente aplicável à cadeia pesada do Factor VIII. Variações dentro da esfera de competência de um especialista na técnica são consideradas como estando dentro do âmbito da presente invenção. A não ser que seja definido de outra maneira, todos os termos técnicos e científicos aqui usados têm o mesmo significado que o comummente entendido por uma pessoa com conhecimento na técnica à qual pertence esta invenção. Embora quaisquer métodos ou materiais similares ou equivalentes aos aqui descritos possam ser utilizados na prática ou no ensaio da presente invenção, os métodos e materiais preferidos são agora descritos.
EXEMPLO I: Identificação de potenciais exosítios ligantes do Factor IXa no domínio A3 do Factor VIII
Um método simples para a identificação de exosítios potencial-mcnte envolvidos na interacção proteína-proteína foi estabelecido anteriormente (J. Kytc e R.F. Doolittle, J. Mol. Biol. Vol. 157, 1982, pp 105-132). Este método proporciona um programa que avalia progressivamente a hidrofilia e hidrofobia de uma proteína ao longo da sua sequência de amino ácidos. O método utiliza uma escala dc hidropatia que reflecte a hidropatia média nos segmentos de tamanho pre-determinado ao longo da sequência de amino ácidos. As secções hidrófilas são caracterizadas por valores de hidropatia negativos, e são prováveis candidatos a serem orientados em direcção ao exterior de uma proteína que está numa solução aquosa. Aplicou-se este método à sequência conhecida do Factor VIII humano (G.A. Vehar et al., Nature Vol. 312, 1984,pp 337-342; JJ. Toole et al, Nature Vol. 312,1984, 342-347), utilizando um segmento ("janela”) com o tamanho de 19 resíduos. A partir da sequência completa do Factor VIU a região 1689-2019, que corresponde ao domínio A3 do Factor VIII, foi seleccionada para esta análise, e o gráfico de hidropatia resultante está ilustrado na Figura 2. Este método revelou três regiões discretas com valores de hidropatia baixos, que reflectem a natureza hidrófila associada a exosítios potenciais. Estes estão indicados como exosítios I, II e III na Figura 2, e englobam os resíduos de amino ácidos 1785-1839, 1887-1923 e 1957-1979 do Factor VIII, respectivamente. A estrutura primária destes exosítios também está apresentada na Figura 2. Embora este método utilize princípios que têm sido há muito compreendidos na técnica, e se baseia na sequência do Factor VIII tal como anteriormente publicado, estes exosítios hidrófilos praticamente não receberam qualquer atenção anteriormente. Entre os sítios potencialmente interactivos, o exosítio I sobressai particularmente pelo seu índice de hidropatia extremamente baixo. .
EXEMPLO Π: Síntese de péptidos que represeutam um exosítio principal do domínio A3 do Factor VIU
Dos três principais exosítios do domínio A3 do Factor VIII, o exosítio I foi seleccionado para uma avaliação mais pormenorizada da ligação do Factor IXa e do Factor IX. Este exosítio compreende os resíduos 1785-1839, cuja sequência está sumariada na Figura 2. Vários péptidos parcialmente sobrepostos desta sequência foram seleccionados com um comprimento aproximado desde 10 até 20 amino ácidos. Esses oligopéptidos podem ser sintetizados por uma variedade de métodos que são bem conhecidos na técnica. Utilizou-se um método estabelecido, o chamado "método de saqueta" (R.A. Houghton, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. Vol. 82, 1985, pp 5131-5135) e química corrente de N-9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) (W. Van’t Hof et al., Mol. Immunol. Vol. 28, 1991, pp 1225-1232). Resumidamente, o primeiro amino ácido protegido por Fmoc foi acoplado a uma resina de álcool p-benziloxibenzilo (S.S. Wang, J. Am. Chem. Soc. Vol. 95, 1973, pp 1328-1333) e selado numa saqueta de polipropileno com mesh de 64 pm. Foram efectuadas reacções de acoplamento em Ν,Ν-dimetilformamida utilizando um excesso de 10 vezes de amino ácido protegido por N-Fmoc em relação ao primeiro amino ácido imobilizado, um excesso de 10 vezes de 1-hidroxibenzotriazole para suprimir a racemização, e um excesso de 13 vezes de Ν,Ν-diisopropiletilamina. A desprotecção foi realizada com piperidina a 30% em Ν,Ν-dimetilformamida. As resinas e os amino ácidos foram obtidos de Novabiochem (Lãufelfingen, Suíça) e os solventes eram da Merk (Darmstadt, Alemanha). A protecção semi-permanente da cadeia lateral de Arg, His, e Cys foi realizada com reagentes adequados tal como descrito (W. van’t Hof et al., Mol. Immunol. Vol. 28, 1991, pp 1225-1232). Após o acoplamento final, utilizou-se ácido trifluoracético contendo 5% de tioanisole para a desprotecção da cadeia lateral e simultaneamente para a libertação de péptidos do suporte sólido. Finalmente, os péptidos foram extraídos e liofilizados. Utilizando este método, foi sintetizada uma série de vários péptidos sobrepostos cobrindo a sequência do exosítio I do domínio A3 do Factor VIII (ver Figura 2).
Uma selecção destes péptidos será adicionalmente caracterizada adiante (ver Exemplo III). Estes incluem os compostos YSSLISYEEDQGAE, GAEPRKNFVKPNETK, KNFVKPNETKTYFWK, ETKTYFWKVQ, YFWKVQHHMAPTDKDEFDCKA, e HMAPTDKDEFDCKA, os quais correspondem respectivamente às regiões 1786-1801. 1799-1813, 1804-1818, 1811-1820, 1815-1834, e 1822-1834 do domínio A3 do Factor VIII.
EXEMPLO ΙΠ: Identificação de um motivo ligante do Factor IXa no domínio A3 do Factor VIII
Os péptidos sintéticos descritos no Exemplo II foram examinados para o ligante do Factor IXa utilizando uma técnica padrão derivada de ELISA. Os péptidos foram imobilizados em placas comuns de microtitulação (Immulon, Dynatech, Plockingen, Germany) numa quantidade de 0,8 nmol de péptido por poço. Os restantes sítios ligantes foram bloqueados utilizando 2% (p/v) de albumina sérica humana numa solução tampão contendo 0,1% (v/v) de Tween-20, 0,1 M de NaCl e 25 mM de Tris (pH 7,4). Após lavagem, os péptidos imobilizados foram incubados durante 1 hora a 37°C com 100 μΐ da mesma solução tampão contendo 50 nM de Factor IXa humano purificado (K. Mertens and R.M. Bertina, Thrornb. Haemostasis Vol. 47, 1982, pp 96-100). Após lavagem, o conteúdos dos poços foi incubado com uma quantidade adequada de anticorpos anti Factor IX humano conjugado a peroxidase do rábano silvestre pelo método de Nakane et al. {J. Histochem. Cytochem. Vol. 22, 1974, pp 1084-1091). O Factor IXa ligado finalmente foi detectado através da leitura da absorvância a 450 nm, utilizando o substracto 3-3’-5-5’-tetrametilbenzidina. A figura 3 mostra os resultados obtidos utilizando os oligopéptidos seleccionados da cadeia leve do factor VIII. Os resultados mostram que a estratégia de utilizar segmentos sintéticos sobrepostos ao longo da sequência de amino ácidos identificou com sucesso um sítio ligante do Factor IXa no exosítio I do domínio A3. Dois péptidos mostraram-se particularmente eficazes na ligação do Factor IXa: os compostos KNFVKPNETKTYFWK e ETKTYFWKVQ, que correspondem aos resíduos 1804-1818 e 1811-1820 do Factor VIII, respectivamente. O facto de estes dois compostos partilharem as mesmas propriedades ligantes do Factor IXa implica que a sequência sobreposta ETKTYFWK atinge os requisitos mínimos para a ligação do Factor IXa, e deste modo pode ser vista como o padrão ligante do Factor IXa. EXEMPLO IV: Interacção dos péptidos compreendendo o padrão ligante do Factor IXa com o Factor IX activado e não-activado
Os mesmos oligopéptidos sintéticos e imobilizados podem ser utilizados para avaliar a interacção com o zimogéneo do Factor IX não-activado mais do que com o Factor IXa (ver Exemplo ΙΠ). Com este propósito, seleccionámos o composto KNFVKPNETKTYFWK como um exemplo de um oligopéptido que compreende o padrão ligante ETKTYFWK do Factor IXa, e comparámos este composto com a cadeia leve completa do Factor VIII, o qual também contém este padrão. As condições experimentais foram conforme descrito para a ligação do Factor IXa a oligopéptidos (ver Exemplo ΠΙ) ou ao polipéptido da cadeia leve completa do Factor VIII (ver PJ. Lenting et al., J. Biol. Chem. Vol. 269, 1994, pp 7150-7155). O Factor IXa foi comparado com uma preparação de Factor IX não-activado o qual estava completamente destituído de Factor IXa (K. Mertens and J.A. van Mourik, Pedido de Patente Internacional, WO 94/05692, published 17 March 1994). Os resultados destas experiências estão apresentados na Figura 4. Uma semelhança surpreendente foi observada entre o Factor IX e o Factor IXa, no que se refere à ligaçao ao oligopéptido contendo o padrão ETKTYFWK (Figura 4A), mas não à cadeia leve completa do Factor VIII (Figura 4B). A constante de dissociação (K<j) do complexo entre o Factor IXa e a região 1649-2332 da cadeia leve completa do Factor VIII, ou seus derivados fragmentados compreendendo os resíduos 1690-2332 ou 1722-2332, foi estabelecida previamente para ser 15 nM (ver M.J.S.H. Donath et al., J. Biol. Chem. Vol. 270, 1995, pp 3648-3655) e pela Figura 4B é evidente que o Kj é significativamente elevado para o Factor IX não-activado. Para o composto KNFVKPNETKTYFWK ligante do Factor IX e do Factor IXa procedeu-se a comparação mais pormenorizada através de estudos de equilíbrio de ligação. Com esta finalidade, os Factores IX e IXa (30 nM) foram incubados com concentrações variáveis (0,2-0,6 μΜ) de composto KNFVKPNETKTYFWK numa solução tampão contendo 2% (p/v) de albumina sérica humana, 0,1% (v/v) de Tween-20, 0,1 M de NaCl e 25 mM de Tris (pH 7,4). Após incubação durante 16 horas à temperatura ambiente, foi determinada a quantidade de Factor IXa ou de Factor IX não-ligados por incubação de amostras em poços de microtitulação contendo o composto péptido imobilizado. Foi então possível que o Factor IX ou o Factor IXa não-ligados se ligassem ao péptido imobilizado, os quais foram subsequentemente quantificados utilizando um anticorpo contra o Factor IX conjugado com peroxidase, tal como descrito em pormenor no Exemplo III. Este método está bem estabelecido na técnica (B. Friguet et al., J. Immunol. Methods Vol. 77, 1985, 305-319), e fornece a constante de dissociação K<j através da expressão: A0/(A0-A) = l+Kd/c em que Ao representa a absorvância da solução original na ausência de péptido, A é a absorvância na presença de péptido, ecéa concentração utilizada de péptido. Neste método, os valores de K<j para a ligação do composto KNFVKPNETKTYFWK ao Factor IXa e ao Factor IX foram calculados para serem 0,20 + 0,02 mM e 0,23 ± 0,02 mM, respectivamente (média ± desvio padrão). Isto demonstra que, em contraste com a cadeia leve completa do Factor VIII, os seus fragmentos que compreendem o padrão ligante do domínio A3 do Factor IXa podem deixar de distinguir entre o Factor IX activado e não-activado.
EXEMPLO V: Preparação de péptidos compreendendo o padrão ligante do Factor IX por digestão enzimática da cadeia leve do Factor VIII
Visando gerar fragmentos compreendendo o padrão ligante do Factor IX, a cadeia leve completa do Factor VIII (resíduos 1648-2332, ver G.A. Vehar et ai, Nature Vol. 312, 1984, pp 337-342) pode ser submetida a digestão enzimática. Uma diversidade de enzimas podem ser úteis para este objectivo, como será evidente a partir da descrição dada adiante.
Primeiro, a porção terminal amina da cadeia leve do Factor VIII pode ser fragmentada utilizando trombina ou Factor Xa. Estas enzimas fragmentam a cadeia entre os resíduos 1689 e 1690, ou 1721 e 1722, respectivamente (G.A. Vehar et al., Nature Vol. 312, 1984, pp 337-342). Os métodos para esta realização foram previamente descritos com todo o pormenor (Donath et al., J. Biol. Chem. Vol. 270, 1995, pp 3648-3655) e será facilmente reproduzido por um qualquer técnico especialista. Resumidamente, as cadeias leves do Factor VIII purificado (310 nM) foram incubadas ou com trombina (20 nM) ou com uma combinação de Factor Xa (20 nM) e fosfolípidos (25 μΜ), num tampão contendo 100 mM de NaCl, 10 mM de CaCh, 50 mM de Tris (pH 7,4). Após incubação durante 45 min a 37°C, a reacção foi terminada por adição de uma clorometil cetona sintética inibidora de trombina ou Factor Xa numa concentração final de 30 nM, e a cadeia leve do Factor VIII fragmentada foi purificada por cromatografia de imunoafinidade conforme descrito (ver Donath et al., J. Biol. Chem. Vol. 270,1995, pp 3648-3655).
Segundo, as cadeias leves purificadas do Factor VIII (ver Lenting et al., J. Biol. Chem. Vol. 269,1994, pp 7150-7155) foram submetidas a digestão enzimática por uma glicosidase com o objectivo de remover os resíduos glicosil ligados a N, particularmente aqueles que têm os resíduos de Asn na posição 1810 (ver G.A. Vehar et al., Nature Vol. 312, 1984, pp 337-342). Para esta realização, a cadeia leve do Factor VIII (0,4 mg/ml) foi incubada com a enzima Péptido-N4-(N-acetil-P-glucosaminilo) asparagina amidase (EC 3.5.1.52, obtida como N-Glicanase a partir de Sanbio BV, Uden, The Netherlands) numa concentração final de 10 U/ml em 3mM de EDTA, 0,1 M de fosfato (pH 7,8) durante 16 horas a 37°C. Após incubação, a mistura da reacção foi analisada por electroforese de gel de poliacrilamida SDS conforme previamente descrito em pormenor (ver Donath et al., J. Biol. Chem. Vol. 270, 1995, pp 3648-3655). A desglicosilação enzimática foi evidenciada a partir de um decréscimo no tamanho molecular de aproximadamente 8 kDa.
Terceiro, a cadeia leve purificada do Factor VIII foi convertida em fragmentos pequenos utilizando a enzima Lisil endopeptidase (EC 4.21.50, obtida a partir de Sopar Biochem, Lunteren, The Netherlands). A cadeia leve do Factor VIII (100 pg/ml) foi incubada com Lisil endopeptidase (6,6 pg/ml) num tampão contendo 4,5% (v/v) de glicerol, 150 mM de NaCl, 50 mM de Tris (pH 7,8) a 37°C. Após vários tempos de incubação, as amostras da mistura da reacção foram removidas para análise por electroforese de gel de poliacrilamida SDS. Durante a fase inicial da reacção, a cadeia leve do Factor VIII de 80 kDa foi convertida em componentes desde entre 30 até 40 kDa. Com uma incubação mais prolongada, estes fragmentos foram adicionalmente degradados, até que um componente maioritário acumulado após 1 hora de incubação fosse de 17 kDa.
Estas condições serviram para a digestão da cadeia leve do Factor VIII numa escala preparativa. Após 1 hora de incubação, a reacção foi terminada pela adição de endopeptidase sintética inibidora Pefabloc SC (Pentapharm, Basel, Switzerland) a uma concentração final de lmM. Os péptidos do Factor VIII contendo o padrão ligante do Factor IX foram então isolados por cromatografia dc imunoafinidade utilizando o anticorpo monoclonal CLB-Cag A, que é dirigido contra os resíduos 1801-1823 dentro do domínio A3 do Factor VIII (J. Van de l.oo ci ai. Annual Report 1992, Dr. Karl Landsteiner Foundation, Amsterdam, p 1). portanto incluindo o padrão ligante ETKTYFWK do Factor IX no exosítio I. (Figura 2). O anticorpo CLB-Cag A foi imobilizado em Sepharose 4B activado por CNBr (Pharmacia, Stokholm, Sweden) a uma densidade de 1 mg/ml. A coluna foi equilibrada com um tampão contendo 2% (v/v) de glicerol, 100 mM dc NaCl, 50 mM de Tris (pH 7,8). Após estabelecimento do equilíbrio, a cadeia leve do Factor VIII digerida foi aplicada e a coluna e foi extensivamente lavada com um tampão de equilíbrio. Subsequentemente, a proteína ligada foi eluída em 55% (v/v) de etileno glicol, 100 mM de NaCl, 25 mM de lisina (pH 11,0), e o eluido foi imediatamente neutralizado por recolha em 1/5 do volume de imidazole a 1 M (pH 7,0). A análise da proteína eluída por electroforese de gel de poliacrilamida SDS revelou que consistia predominantemente em fragmentos de 17 kDa. Este fragmento do domínio A3, que compreende o epitopo do anticorpo dentro do exosítio I (resíduos 1801-1823, ver acima) foi adicionalmente caracterizado relativamente às suas propriedades anticoagulantes tal como descrito adiante (ver Exemplo VII).
Colectivamente, estas experiências de digestão demonstram que uma diversidade de métodos podem ser utilizados para converter a cadeia leve do Factor VIII em péptidos mais pequenos os quais compreendem ainda o exosítio I do domínio A3, enquanto são separados das outras partes da cadeia leve do Factor VIII ou das unidades glicosiladas aí contidas.
EXEMPLO VI: Preparação de péptidos recombinantes compreendendo o padrão ligante do Factor IX
Os péptidos que compreendem o padrão ligante do Factor IX podem também ser preparados através de uma diversidade de técnicas de DNA recombinante, nas quais o DNA codificante do péptido desejado é introduzido num plasmídeo de expressão adequada. O presente exemplo descreve a expressão in vitro de péptidos recombinantes num reticulócito lisado, mas técnicas semelhantes para expressão em células hospedeiras procarióticas ou eucarióticas serão facilmente identificadas por um qualquer especialista na técnica. A transcrição e tradução in vtro foi realizada utilizando o sistema de expressão SP6 e o plasmídeo pSP64 (Promega Corporation, Leiden, the Netherlands). O plasmídeo pSP/F8-80Kl descrito previamente (A. Leyte et al., Biochem. J. Vol. 263, 1989, pp 187-194) foi utilizado como um modelo para a construção de um fragmento truncado do Factor VIII utilizando a reacção em cadeia da polimerase (PCR). O fragmento de DNA foi produzido utilizando sondas marcadas sensoras 5’-ACG ATT TAG GTG ACA CTA TAG-3’ (contendo uma parte do promotor SP6) em combinação com sondas marcadas anti-sensoras 5’-TTA GGA TCC TCA CAT ATG ATG TTG CAC TTT-3’. As reacções de PCR desta combinação de sondas marcadas produziram as sequências de DNA do Factor VIII entre os pares de bases 4744 e 5526, que codificam os resíduos desde 1563 até 1823 do Factor VIII. As sondas marcadas anti-sensoras incluíam um sítio de restrição BamHI (sublinhado) e um codão de paragem (negro). As sondas marcadas sensoras foram concebidas para conter um sítio de restrição HindlII na terminação 5’ depois do PCR. Após digestão do produto do PCR e do plasmídeo pSP64 com HindlII e BamHI, o produto foi ligado dentro do plasmídeo. Este Factor VIII construído foi então transcrito e traduzido utilizando o sistema de expressão SP6 de acordo com o protocolo padrão de realização. Após a tradução, 26 os péptidos produzidos foram incubados com o anticorpo monodonal imobilizado CLB-Cag A tal como especificado em pormenor no Exemplo V. Após lavagem extensiva, um péptido maioritário de aproximadamente 30 kDa foi eluído. O péptido recombinante eluído foi dialisado numa solução tampão contendo 4,5% (v/v) de glicerol, 100 mM de NaCl, 10 mM de CaCl2, 50 mM de Tris (pH 7,4), e submetido a digestão proteolítica no sítio de fragmentação da trombina entre os resíduos 1689-1690 do Factor VIII (MJ.S.H. Donath et al., J. Biol. Chem. Vol. 270, 1995, pp 3648-3655). O péptido recombinante foi incubado com a trombina sob as mesmas condições conforme especificado no Exemplo V para a cadeia leve completa do Factor VIII. Após incubação durante 45 min a 37°C, a reacção foi terminada tal como descrito acima, e a mistura da reacção foi submetida a uma segunda cromatografia por imunoafinidade utilizando o anticorpo CLB-CAg A imobilizado conforme especificado no Exemplo V. Após eluição, foi obtido um péptido de aproximadamente 17 kDa. Este é compatível com a proteína que compreende os resíduos 1690-1823 do Factor VIII, incluindo o epitopo do anticorpo CLB-CAg A no exosítio I do domínio A3 do Factor VIII. EXEMPLO VII: Efeito dos péptidos ligantes do Factor IX no sistema hemostático
Se a interacção dos péptidos derivados do Factor VIII com o Factor IX ou Factor IXa representava um processo fisiologicamente significativo, concentrações semelhantes dos mesmos componentes também deveriam inibir eficazmente a cascata de coagulação como um todo. Além disso, se a inibição ocorresse, devia ser limitada especificamente à via de coagulação intrínseca (cf. Figura 1). A técnica estabelecida na área de hematologia proporciona ensaios laboratoriais simples para avaliação do estado fisiológico das vias de coagulação intrínseca e extrínseca. O primeiro é conhecido na técnica como o teste APTT (Tempo Parcial de Tromboplastina Activada), e o último é conhecido como o teste PT (Tempo de Protrombina). Para avaliar o efeito dos péptidos derivados do Factor VIII no sistema de coagulação, estes compostos foram testados quanto ao seu efeito nos métodos PT e APTT estabelecidos (R. Biggs, Human Btood Coagulation, Haemostasis and Thrombosis, 2nd edition, Blackwell, Oxford, 1976, pp 310-364). O ensaio APTT foi realizado tal como se segue: num tubo de ensaio de plástico, foram misturados 400 μΐ de plasma humano com citrato, pobre em plaquetas, com 40 μΐ de uma solução de cadeia leve do Factor VIII ou o composto KNFVKPNETKTYFWK num tampão contendo 0,1 M de NaCl e 25 mM de Tris (pH 7,4). Após pré-incubação durante 15 min a 37°C, foram misturados 100 μΐ desta mistura com 100 μΐ de um reagente comercial de APTT (Baxter-Dade, DOdingen, Switzerland) contendo fosfolípidos e sílica coloidal para activar o sistema de coagulação de contacto (cf. Figura 1). Após 3 minutos, foram adicionados 100 μΐ de uma solução pré-aquecida de 0,33 M de CaC^, e foi registado o tempo de coagulação. Para o teste PT, foram encubados 400 μΐ de plasma e 40 μΐ de solução de péptido do Factor VIII durante 15 minutos a 37°C. Subsequentemente, foram misturados 200 μΐ desta mistura com 200 μΐ de um reagente PT comercial pré-aquecido (Thromborel, Behring, Marburg, Germany), e foi registado o tempo de coagulação. Conforme mostrado na Figura 5A, o composto KNFVKPNETKTYFWK demonstrou uma eficácia específica na inibição do teste APTT, enquanto que o teste PT permaneceu completamente não-afectado. Este facto demonstra que o composto KNFVKPNETKTYFWK inibe especificamente a via de coagulação intrínseca (çf Figura 1). A extensão da inibição foi ainda mais pronunciada quando foi utilizado plasma de coelho em vez de plasma humano (Figura 5B). Neste caso, o APTT foi aumentado com 5 dobras, o que parece ser pelo menos tão significativo como o efeito de outros agentes antitrombocíticos, incluindo heparina e hirudina, noutros modelos com 28
' *Λ .rs roedores (P. Klemnt et al., Thromb. Jieamostasis Yol. 68, 1992, pp 64-68). A inibição semi-máxima ocorreu a 0,3mM aproximadamente (ver Figura 5). Como esperado, este valor reflecte directamente o K<j observado para a interacção deste composto com o Factor IXa e o Factor IX (ver Exemplo IV). Foi utilizado o mesmo sistema de ensaio para a caracterização dos péptidos obtidos por digestão enzimática da cadeia leve do Factor VIII conforme descrito no Exemplo V. Os resultados desta experiência estão resumidos na Tabela I.
Tabela I: Propriedades de vários derivados da cadeia leve do Factor VIII. A actividade anticoagulante no teste APTT está expresso pelo prolongamento do tempo de coagulação em segundos. Péptido ligante do Factor IX(a) Concentração (mg/ml) (segundos) Actividade anticoagulante Cadeia leve do Factor VIII 0,03 8,6 Cadeia leve clivada por trombina 0,03 15,7 Cadeia leve desglicosilada 0,06 16,9 Fragmentos de 17 kDa isolados 0,03 14,1
Estes valores demonstram que a digestão enzimática da cadeia leve do Factor VIII aumenta a sua actividade anticoagulante numa extensão significativa. Os péptidos que compreendem o padrão ligante do Factor IX do domínio A3 do Factor VIII proporcionam deste modo um aumento substancial na cadeia leve do Factor VIII intacta relativamente à actividade inibidora na via de coagulação intrínseca.
Uma limitação da cadeia leve intacta do Faclor VIII está associada com a sua baixa afinidade para o zimogéneo não-activado do Factor IX comparativamente com a afinidade para o Factor IXa (Figura 4B). Esta limitação é ultrapassada por derivados de péptidos menores tais como os compostos KNFVKPNETKTYFWF (ver Figuras 4A e %). Portanto, a inibição efectiva da via de coagulação intrínseca é preferencialmente realizada por compostos que compreendem o padrão ligante do Factor IXa do domínio A3 do Factor VIII, mas também evidencia ligação substancial ao Factor EX não-activado. Em virtude da sua especificidade única para a via de coagulação intrínseca, os péptidos ligantes da presente invenção têm utilidade particularmente em composições farmacêuticas para o tratamento de perturbações trombocíticas.
Um especialista na técnica reconhece rapidamente que a presente invenção está bem adaptada para atingir os objectivos e alcançar os fins e as vantagens mencionadas, tal como aquelas daqui inerentes. Os compostos, os métodos e as composições aqui descritas são apresentadas como representativas das formas de realização preferidas. Estas pretendem ser exemplifícativas e não limitantes no âmbito da presente invenção. As modificações e outras utilizações que ocorrerão aos especialistas da técnica, são para ser incluídas dentro do âmbito das reivindicações anexadas.
Lisboa, 18 de Outubro de 2001
ALBERTO CANELAS Agente Oficiai da Propriedade industrial RUA VICTOR CORDON, 14 1200 LISBOA
Claims (7)
- REIVINDICAÇÕES 1. Um péptido de 8-20 aminoácidos tendo uma sequência de aminoácidos derivada do Factor VIII e sendo capaz de se ligar ao Factor IX activado e aos seus precursores não-activados, o que compreende a sequência do motivo Glu-Thr-Lys-Thr-Tyr-Phe-Trp-Lys do Factor VIII
- 2. O péptido da reivindicação 1, em que a sua sequência de aminoácidos é derivada do exosítio I do domínio A3 do Factor VIII humano como mostrado na Figura 2.
- 3. O péptido da reivindicação 1 ou da reivindicação 2, o qual tenha um comprimento de desde 10 até 20 resíduos de aminoácidos.
- 4. O péptido da reivindicação 3, o qual compreenda 10 a 20 resíduos de aminoácidos da sequência de animo ácidos Gly-Ala-Glu-Pro-Arg-Lys-Asn-Phe-.Val-Lys-Pro-Asn-Glu-Thr-Lys-Thr-Tyr-Phe-Trp-Lys-Val-Gln-His-His-Met-Ala-Pro-Thr-Lys-Asp-Glu-Phe, incluindo a sequência Glu-Thr-Lys-Thr-Tyr-Phe-Trp-Lys.
- 5. Uma composição farmacêutica compreendendo um péptido tal como reivindicado em qualquer uma das reivindicações 1-4 e um veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável.
- 6. Uma composição farmacêutica para o tratamento de perturbações trombocíticas compreendendo um péptido tal como reivindicado em qualquer uma das reivindicações 1-4 numa quantidade eficaz para a inibição da 2 via de coagulação sanguínea intrínseca e um veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável.
- 7. Utilização de um péptido tal como reivindicado em qualquer uma das reivindicações 1-4 para preparar um medicamento para o tratamento de perturbações trombocíticas num mamífero. Lisboa, 18 de Outubro de 2001 ALBERTO CANELAS Agente Oficial da Propriedade Industrial RUA VICTOR CORDON, 14 1200 LISBOA
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