PT671934E

PT671934E - Metedo para o tratamento de lesoes ou de diminuicoes celulares

Info

Publication number: PT671934E
Application number: PT93920456T
Authority: PT
Inventors: David A Williams; Steven C Clark
Original assignee: Genetics Inst
Priority date: 1992-09-02
Filing date: 1993-09-01
Publication date: 2001-05-31
Also published as: US5460810A; CA2142879C; US5437863A; EP0671934A4; EP0671934B1; JP2828778B2; GR3035413T3; ATE198158T1; DE69329779T2; AU5099993A; JPH08500838A; EP0671934A1; DK0671934T3; WO1994005318A1; ES2155834T3; DE69329779D1; AU677236B2

Description

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Descrição “Método para o tratamento de lesões ou de diminuições celulares” O presente trabalho recebeu subsídios dos Institutos Nacionais de Saúde, a que correspondem os η- 1 POl HL45168-01A1 e 1R01 HL46528-01. O governo tem alguns direitos nesta invenção.

Campo da invenção A presente invenção proporciona um método para tratar pacientes que padeçam de doenças caracterizadas por lesões ou destruições celulares e mais especificamente diz respeito a um método de utilização de uma citoquina para regenerar populações de determinadas células, em particular as células do intestino.

Antecedentes da invenção m

Determinadas células dos mamíferos, no seu estado normal, caracterizam-se por uma divisão e uma proliferação rápidas no corpo, v.g., as células epiteliais do intestino delgado, as células do esperma, as células do cabelo e da pele e ainda os hepatócitos ou células do fígado. As lesões ou as diminuições destas células podem ter origem em determinadas doenças, infecções, exposição a agentes terapêuticos e tratamentos, exposição a outros agentes químicos ou biológicos e ferimentos ou traumas.

Por exemplo, o recurso à quimioterapia e à radioterapia para o tratamento de cancro e para a preparação de pacientes para a transplantação de medula óssea constitui um procedimento tóxico para as células epiteliais do intestino delgado. Com efeito, o intestino delgado é um dos órgãos mais danificados por esta terapia. Igualmente danificadas por esta terapia são as células da pele, as células do cabelo e as células do esperma. Esta danificação celular, em particular no que diz respeito às células do intestino, é a causa de taxas significativas de mortalidade e de morbilidade em pacientes com cancro sujeitos a terapia. Anteriormente essa toxicidade era evitada limitando a intensidade da quimioterapia ou da radiação administrada a um paciente. Por exemplo, a toxicidade sobre as células do intestino por efeito da radioterapia tem sido atenuada quer diminuindo a quantidade de radiação quer administrando a dose total subdividida em várias fracções (processo designado por terapia de ‘fraccionamento’). No entanto, a redução da intensidade da terapia também tem um efeito adverso sobre a disseminação e o crescimento do cancro contra o qual é dirigida.

Sabe-se que determinadas doenças de natureza autoimunitária do intestino, tal como a doença de Crohn e a colite ulcerativa, também danificam as células do intestino delgado que estão a revesti-lo, originando maiores taxas de morbilidade e mortalidade nos pacientes assim afectados. O tratamento de doenças de natureza autoimunitária do intestino compreende a quimioterapia e a supressão imunitária, tendo qualquer destes processos graves efeitos secundários, salientando-se entre eles uma maior danificação e uma divisão rápida das células do intestino.

As populações de células da pele e do cabelo também podem ser danificadas por doenças de natureza autoimunitária, queimaduras e alopecia. As populações de células do esperma são danificadas por oligospermia. Os hepatócitos também são danificados por radiação, quimioterapia e traumas físicos.

Os danos provocados às células do intestino e a outras células de crescimento rápido num mamífero normal saudável também podem ser consequência de traumas ou de lesões nessas zonas ou por efeito de choque. A exposição a determinados agentes químicos industriais e domésticos, entre outros, também pode danificar gravemente as populações normais saudáveis destas células. (Ver o documento WO-A-91/15227; Câncer Res. 50:2885-2890 (1990); US-A-5 082 658).

Neste domínio continua a ser necessário que haja métodos para tratar as lesões celulares, em particular os danos causados às células do intestino por doenças ou efeitos adversos da quimioterapia e da radioterapia ou por exposição a outros agentes lesionantes ou provocados por traumas nos mamíferos, em particular nos seres humanos.

Descrição abreviada da invenção

De acordo com um dos seus aspectos a presente invenção proporciona um método para tratar pacientes que possuam populações de células lesionadas ou diminuídas, seleccionadas entre o conjunto constituído pelas células epiteliais do intestino delgado, células epiteliais de revestimento do intestino grosso e do estômago, células da pele, células do cabelo, células do esperma e células epiteliais do figado (hepatócitos). Este método consiste em administrar a um paciente uma quantidade eficaz de uma citoquina ou de um factor de crescimento hematopoiético seleccionado.

De acordo com outro dos seus aspectos, a presente invenção proporciona um método para tratar um paciente que esteja sujeito a quimioterapia ou a radioterapia, o qual consiste em administrar-lhe uma citoquina seleccionada em simultaneidade com o início do tratamento quimioterapêutico ou radioterapêutico, ou então subsequentemente. O tratamento com a citoquina irá prosseguir até ser restabelecida uma população de células saudáveis escolhidas entre o conjunto constituído por células epiteliais do intestino delgado, células epiteliais de revestimento do intestino grosso e do estômago, células da pele, células do cabelo, células do esperma e hepatócitos.

De acordo com um outro dos seus aspectos, a presente invenção proporciona um método para restabeleça- populações de células saudáveis escolhidas entre o conjunto constituído por células epiteliais do intestino delgado, células epiteliais de revestimento do intestino grosso e do estômago, células da pele, células do cabelo, células do esperma e células epiteliais do fígado em pacientes que padeçam de doenças de natureza autoimunitária, administrando-se a esses pacientes quantidades eficazes de uma citoquina escolhida, em particular a IL-11. Desde já se afínna que estes tratamentos com citoquinas podem ser feitos em combinação com as terapias imunossupressivas actuahnente conhecidas e utilizadas. A citoquina eventualmente única ou as várias citoquinas, por si sós ou em combinação, úteis nestes métodos podem ser seleccionadas entre interleucina 11, interleucina 6, factor inibitório da leucemia (FIL, o mesmo que LIF), oncostatina M e factor neurotrófico ciliar (FNTC, o mesmo que CNTF). Entre outras citoquinas que é possível utilizar neste método refere-se as seleccionadas entre interleucina 1, interleucina 3, interleucina 12 (também conhecida por factor estimulador das células aniquiladoras naturais) e o FEC-MG (o mesmo que GM-CSF).

Outros aspectos e vantagens da presente invenção estão melhor descritos na memória descritiva minuciosa subsequente que diz respeito aos seus casos preferenciais.

Descrição abreviada dos desenhos A figura 1 é um gráfico que ilustra a sobrevivência de murganhos de contraprova e de murganhos tratados com a IL-11 a seguir a um tratamento combinado por quimioterapia e por radiação, conforme descrito no exemplo 5. A figura 2 é um gráfico de barras que ilustra o efeito da EL-11 sobre a proliferação de células IEC-6, conforme adiante descrito no exemplo 9.

Descrição minuciosa da invenção A invenção proporciona um método para a utilização de uma citoquina seleccionada para o tratamento de lesões ou diminuições de populações de células, em particular nos casos de populações de células que normalmente se dividem rapidamente. Entre estas populações estão incluídas, mas sem que isso constitua qualquer limitação, as células epiteliais do intestino delgado, as células epiteliais dc revestimento do intestino grosso e do estômago, as células epiteliais do fígado (hepatócitos), as células da pele, as células do cabelo e as células do esperma.

Os métodos da presente invenção, os quais implicam a administração de uma ou várias citoquinas escolhidas, são úteis para restabelecer as populações de tais células, independentemente da fonte ou da origem da lesão ou da diminuição da população de células. As citoquinas são proteínas reguladoras que transportam sinais entre células do sistema imunitário e que possuem efeitos reguladores sobre as células dos sistemas hematopoiético e imunitário. Uma citoquina preferida para utilização no tratamento de populações de células lesionadas é a DL-11 que é uma citoquina de mamíferos sobre a qual se sabe que é útil para o tratamento de determinadas doenças da medula óssea e para estimular directa ou indirectamente a produção ou a actividade das células B. A IL-11 está descrita minuciosamente no pedido de patente de invenção internacional PCT/US90/06803 publicado a 30 de Maio de 1991 como sendo o documento WO-A-91/07495. A sequência da IL-11 humana clonada, ilustrada no quadro I [SEQ ID NO:l e 2], foi depositada na instituição ATCC 12301 Parldawn Drive, Rovckville, Maryland, em 30 de

Março de 1990 sob a referência ATCC n° 68284. Além disso, conforme descrito nos exemplos subsequentes, também é possível produzir a IL-11 por via recombinante como uma proteína de fusão com outra proteína. O quadro Π [SEQID NO:3 e 4] apresenta tal sequência de fusão com a tiorredoxina de E. coli. Estas sequências facilitam a produção de 1L-11 num conjunto vasto de células hospedeiras por recurso às técnicas convencionais da engenharia genética. AIL-11 também pode ser obtida a partir de determinadas linhagens celulares. Foram já identificadas linhagens celulares humanas como fontes pelo menos de uma espécie de IL-11, por exemplo, a linhagem celular dos fibroblastos dos pulmões dos seres humanos, designadamente a linhagem MRC-5 (Acesso ao ATCC com o n° CCL 171) e a linhagem celular trofobláslica humana designada por TPA30-1 (Acesso ao ATCC com o n° CRL 1583). Há ainda outras fontes humanas de IL-11. Como informação complementar respeitante à produção de 11.-11 recombinante e respeitante também ao isolamento da IL-11 obtida a partir de fontes celulares refere--se o texto do pedido de patente de invenção internacional com o n° PCT/US90/06803. Não é só a IL-11 que é útil nos métodos para tratar e restabelecer as populações de células anteriormente referidas, havendo também outras citoquinas que são úteis nos mesmos métodos. Desde já se afirma que há determinadas citoquinas, caracterizadas pelo facto de possuírem circuitos de transdução do sinal comuns com os da IL-11 (istoé, efectuam a transdução através da gpl30) que são úteis para tratar pacientes em que haja lesões celulares nas populações de células seleccionadas, da mesma forma que é utilizada a IL-11, e/ou em combinação com a IL-11. Ver, N.Y. Ip et ai, ÇeU, 69:1121-1132 (1992).

Outra citoquina preferida, utilizável na presente invenção e que partilha actividades biológicas comuns com a IL-11, é a interleucina 6 (IL-6) que está descrita minuciosamente no pedido de patente de invenção PCT com o n° W088/00206 publicado a 14 de Janeiro de 1988. Há ainda uma outra citoquina, que partilha o circuito de transdução do sinal com a IL-11, que é o Factor Inibitório da Leucemia (FIL), também designado por Factor Colinérgico de Diferenciação (FCD, o mesmo que CDF), conforme descrito minuciosamente no pedido de patente de invenção PCT com o n° W090/02183 publicado a 8 de Março de 1990. Uma outra citoquina igualmente caracterizada é a oncostatina M (OSM), minuciosamente descrita no pedido de patente de invenção europeia n° 290 949, publicado a 12 de Novembro de 1988. Além disso, o Factor Neurotrófico Ciliar (FNTC) partilha este circuito de transdução do sinal e desde já se afirma que é útil nos métodos para restabelecer estas populações de células. O FNTC está descrito minuciosamente no pedido de patente de invenção PCT com o n° WO9104316, pubhcado a 4 de Abril de 1991.

Cabe agora salientar que é provável que haja outras citoquinas que também são úteis nos métodos da presente invenção, quer quando utilizadas em vez da IL-11, da IL-6 e/ou de uma ou várias das outras citoquinas anteriormente descritas quer em combinação com tais substâncias. Uma outra citoquina útil no método terapêutico ou em combinação com uma preparação farmacêutica de acordo com a presente invenção é a interleucina 1 (IL-1). A IL-1 está descrita minuciosamente no pedido de patente de invenção europeia n° 456 332, publicado a 13 de Novembro de 1991. Outra citoquina útil é o Factor Estimulador das Células Aniquiladoras Naturais (FECAN, o mesmo que NKSF), também designado por interleucina 12 (IL-12). Esta citoquina está descrita minuciosamente no pedido de patente de invenção PCT com o n° WO9205256, publicado a 2 de Abril de 1992.

Outras citoquinas que podem úteis nestes métodos para restabelecer populações de células seleccionadas entre as células epiteliais do intestino delgado, as células epiteliais que revestem o intestino grosso e o estômago, as células epiteliais do fígado, as células da pele, as células do cabelo e as células do esperma, são a interleucina 3 (IL-3) e o Factor Estimulador das Colónias de Macrófagos Granulócitos (FEC-MG). O FEC-MG está descrito minuciosamente no pedido de patente de invenção PCT com o n° W08600639, publicado a 30 de Janeiro de 1986 [ver também o pedido de patente de invenção europeia n° 281 069, publicado a 7 de Setembro de 1988], A IL-3 está descrita minuciosamente na patente de invenção norte-americana n° 4 959 455 concedida a 25 de Setembro de 1990.

Para mais informação geral sobre estas citoquinas veja-se também as obras de F. Takatsuki et al., Câncer Res.. 50:2885-2890 (1990); D. P. Gearing et al, Science, 255:1434--1437 (1992) e G. Damia et al., Câncer Res.. 52:4082-4089 (1992).

Para utilização nos métodos de tratamento divulgados na presente invenção, as citoquinas anteriormente descritas, ou os seus fragmentos biologicamente activos, podem ser preparadas por técnicas da engenharia genética, conforme divulgado nas obras anteriormente referidas. Além do mais, conjuntamente com as técnicas recombinantes, também é possível produzir os polipeptidos de citoquinas anteriormente descritos, recorrendo a técnicas convencionais de síntese química. Os métodos para construir os polipeptidos úteis na presente invenção por via sintética são conhecidos pelos especialistas na matéria. Convém afirmar desde já que as sequências polipeptídicas das citoquinas construídas por via sintética, devido ao facto de partilharem características estruturais primárias, secundárias ou terciárias e conformacionais com os polipeptidos de citoquinas naturais possuem actividades biológicas comuns às destes. Tais sequências polipeptídicas de citoquinas construídas por via sintética, ou os seus fragmentos que dupliquem total ou parcialmente a sua funcionalidade, também são utilizáveis como substitutos biologicamente activos ou imunológicos das citoquinas purificadas naturais, úteis na presente invenção.

As modificações existentes nas proteínas, nos péptidos ou nas sequências de ADN destas citoquinas ou dos seus fragmentos activos também podem produzir proteínas eventualmente utilizáveis nos métodos da presente invenção. Tais citoquinas modificadas podem ser produzidas por um especialista na matéria, recorrendo a técnicas conhecidas. As modificações relevantes nas sequências das citoquinas, v.g., na sequência da IL-11, podem ser a substituição, a inserção ou a supressão de um ou vários resíduos aminoácidos nas sequências codificadoras. As técnicas mutagénicas para tais substituições, inserções ou supressões são bem conhecidas pelos especialistas na matéria. [Ver, v.g., a patente de invenção norte-americana n° 4 518 584].

Outras mutações específicas das sequências dos polipeptidos de citoquinas que podem ser terapeuticamente úteis, conforme aqui descrito, podem ser, v.g, a inserção de um ou vários locais de glicosilação. Um local de reconhecimento de glicosilação ligado ao resíduo asparagina pode ser inserido na sequência por supressão, substituição ou adição de aminoácidos na sequência peptídica ou de nucleótidos na sequência de ADN. Tais modificações podem ser realizadas em qualquer local da molécula que seja modificado por adição de hidratos de carbono ligados ao átomo de oxigénio. A expressão de tais sequências peptídicas ou nucleotídicas modificadas produz variantes que podem ser glicosiladas nesses locais.

Um especialista na matéria também pode produzir facilmente outros análogos e derivados da sequência da citoquina seleccionada que presumivelmente pudessem conservar ou prolongar a sua actividade total ou parcialmente, o que se admite que venha a ser útil no método da presente invenção. Uma tal modificação pode ser o acoplamento de polietileno--glicol (PEG) aos resíduos lisina existentes na sequência da citoquina ou a inserção de um ou vários resíduos Usina ou de outros resíduos aminoácidos, que possam reagir com o PEG ou com derivados de PEG, dentro da sequência por meio de técnicas convencionais para facifitar o acoplamento de radicais PEG.

Outros análogos destas citoquinas seleccionadas também podem ser caracterizados por variações alélicas nas sequências de ADN que os codificam ou por variações induzidas nas sequências de ADN que os codificam. Desde já se afirma que na presente invenção serão igualmente úteis todos os análogos divulgados nas obras anteriormente referidas, incluindo aqueles que se caracterizam por sequências de ADN capazes de hibridarem com as sequências das citoquinas descritas, em condições de hibridação rigorosas ou em condições de hibridação não rigorosas [Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratorv Manual.. 2a edição, Cold Spring Harbor Laboratory, Nova Iorque (1989)].

Nestes métodos também se consideram úteis as moléculas de fusão, preparadas fundindo a sequência, ou um fragmento biologicamente activo da sequência de uma citoquina, com outra citoquina ou com um agente terapêutico proteináceo, v.g., a IL-11 fundida com a IL-6 [ver, v.g., os métodos para a fusão descritos no pedido de patente de invenção PCT com o n° WO92/04455, publicado a 19 de Março de 1992]. Em alternativa, é possível administrar combinações das citoquinas conjuntamente, em conformidade com o método.

Sendo assim, nos locais de descrição dos métodos da presente invenção em que uma citoquina particular seja mencionada pelo seu nome, os especialistas na matéria devem subentender que a citoquina mencionada abrange a proteína produzida pelas sequências presentemente conhecidas na especialidade, v.g., as sequências para a IL-11, pelas sequências do quadro I e do quadro II, e também as proteínas caracterizadas pelas modificações anteriormente descritas e que conservem uma actividade praticamente idêntica em termos de restabelecimento das células de uma ou várias populações de células aqui identificadas.

Assim, a presente invenção diz respeito ao tratamento de pacientes que tenham lesões ou diminuições de populações de células seleccionadas entre as células epiteliais do intestino delgado, as células epiteliais de revestimento do intestino grosso e do estômago, as células epiteliais do fígado, as células da pele, as células do cabelo e as células do esperma O tratamento consiste em administrar traia quantidade eficaz de uma citoquina seleccionada num veículo farmacêutico. Este tratamento facilita o restabelecimento ou a regeneração da população de células onde houve lesões ou diminuições, principalmente pela estimulação, directa ou indirecta, de todas as células progenitoras não danificadas. As células progenitoras são estimuladas de modo a diferenciarem-se dentro da população de células que tenha sido lesionada ou diminuída.

Os agentes citotóxicos utilizados nas transplantações de medula óssea e na terapia do cancro afectam rapidamente as células proliferativas, tanto da medula óssea como do intestino delgado, dando origem a toxicidades graves e frequentemente limitativas das doses. A presente invenção vem resolver este problema, tal como adianto exemplificado a propósito do tratamento de células epiteliais do intestino delgado (células de revestimento), danificadas por quimioterapia ou por radioterapia, sendo utilizada como citoquina seleccionada a IL-11 e/ou a IL-6. Nos exemplos 4 a 9, a análise da mucosa do intestino delgado demonstrou uma recuperação rápida do comprimento das vilosidades e uma maior actividade proliferativa dentro das células foliculares de murganhos tratados com a IL-11 ou de murganhos tratados com a IL-6, comparativamente com murganhos de contraprova. Por exemplo, nesses exemplos, no caso dos murganhos, a IL-11 e/ou a EL-6 tiveram um efeito positivo sobre a sobrevivência dos murganhos após a exposição ao agente 5-flúor-uracilo e irradiação, sem nenhum efeito sobre o número de neutrófilos periféricos (glóbulos brancos ou leucócitos). Além disso, estes estudos permitiram tirar conclusões sobre a rápida recuperação da mucosa do intestino delgado. Assim sendo, a IL-11 e a IL-6 têm efeitos positivos sobre a recuperação de diversos tecidos onde haja toxicidades limitativas das doses a seguir a terapias citoablativas.

No caso de haver lesões ou diminuições das células do intestino delgado ou de outras populações de células, provocadas por terapias, o tratamento da presente invenção pode ter lugar simultaneamente com a terapia, v.g., quimioterapia ou radioterapia, ou a seguir a tal terapia Por exemplo, é possível administrar num veículo farmacêutico adequado quantidades eficazes de IL-11 por si só, EL-6 por si só, outra citoquina por si só ou então uma combinação de citoquinas.

De preferência, o tratamento começa em simultaneidade ou quase logo a seguir ao início do tratamento por quimioterapia ou por radioterapia e prossegue até ao momento em que o nível das células do intestino ou de outras células retome valores aceitáveis. No entanto, a citoquina escolhida, v.g., a E^l 1, a IL-6 ou uma combinação de citoquinas, pode ser administrada durante um intervalo de tempo adequado, antes do inicio do tratamento por quimioterapia ou por radioterapia, para melhorar a eficácia com que a citoquina, v.g., aIL-11 ou a 1L-6, estimula as células progenitoras que vão diferenciar-se em células perfeitamente desenvolvidas no intestino. A invenção também proporciona métodos para tratar pacientes atingidos por lesões ou diminuições de populações de células seleccionadas entre as células epiteliais do intestino delgado, as células epiteliais de revestimento do intestino grosso e do estômago, as células epiteliais do fígado, as células da pele, as células do cabelo e as células do esperma, sendo essas lesões ou diminuições provocadas por doenças de natureza autoimunitária. Por exemplo, a doença de Crohn destrui e faz diminuir a população de células do intestino que normalmente se dividem com rapidez. Há outras doenças de natureza autoimunitária que também podem afectar dc forma idêntica as células do intestino grosso ou do estômago, do fígado, da pele, do cabelo e do esperma. A presente invenção compreende também o tratamento de tais doenças mediante a administração de doses eficazes de uma citoquina seleccionada, v.g., a IL-11, a IL-6 ou uma combinação de citoquinas.

De igual modo, as infecções, traumas ou choques também podem danificar ou originar uma diminuição das populações normais de células do intestino e também de outras células aqui referidas, o que requer a administração de quantidades eficazes de uma ou várias citoquinas, em particular a IL-11 ou a IL-6.

De acordo com uma variante da presente invenção, utiliza-se uma citoquina seleccionada, tal como a IL-11 ou a IL-6, obtida por expressão recombinante ou preparada por via sintética e purificada até se conseguir homogeneidade, que é combinada com um veículo farmacêutico adequado para administração interna. Realiza-se a purificação recorrendo a técnicas convencionais (ver, v.g., o documento PCT/US90/06803 e os exemplos seguintes).

Os veículos adequados farmaceuticamente aceitáveis facilitam a administração da citoquina, v.g., a IL-11 ou a IL-6, e são bem conhecidos na especialidade. Como exemplos de veículos retêre-se as substâncias estéreis seleccionadas entre solutos salinos, lactose, sacarose, fosfato de cálcio, gelatina, dextrina, gelose, pectina, óleo de amendoim, azeite, óleo de sésamo e água. Além disso, o veículo ou diluente contém um material retardador, tal como o mono-estearato de glicerilo ou o diestearato de glicerilo, cada um deles utilizado por si só ou em conjunto com uma cera. Também é possível utilizar formulações poliméricas de libertação lenta. As matrizes adequadas de libertação prolongada contêm o ingrediente activo misturado com uma ou várias das substâncias seguintes: bentonite sódica, etil-celulose, ácido esteárico, estearato de cálcio, ácido adípico, ácido fumárico, polietileno-glicol, quitina desacetilada e acetato de celulose. É possível incorporar nessas matrizes agentes adequados conservantes e/ou estabilizadores.

Em alternativa, a citoquina seleccionada, v.g., a IL-11 ou a IL-6, pode ser combinada com quaisquer outros agentes convencionais que sejam úteis para mitigar os sintomas associados à quimioterapia, tais como agentes antieméticos, antioxidantes e outros factores de crescimento hematopoiéticos. O método terapêutico da presente invenção também pode compreender a co-administração ou a combinação de uma citoquina seleccionada com outros factores humanos conhecidos pelos especialistas na matéria. Como exemplos de citoquinas ou de hematopoeitinas para tais fins refere-se as citoquinas especificamente referenciadas antes. Os factores de crescimento, tais como o factor de crescimento das células B, o factor de diferenciação das células B ou os factores de diferenciação dos eosinófílos, também podem ser úteis quando co-administrados com estas citoquinas. Como exemplos de outros agentes para co-administração é possível referir outros fármacos e agentes químicos farmaceuticamente eficazes, v.g., os agentes para combater as infecções. O regime de dosagem adiante enunciado pode ser ajustado para compensar a quantidade desses componentes aditivos na composição terapêutica. A evolução do paciente tratado pode ser verificada por métodos convencionais.

Os agentes citotóxicos utilizados na transplantação da medula óssea e na terapia do cancro afectam as células rapidamente proliferantes, quer na medula óssea quer no intestino delgado, dando origem a toxicidades graves e frequentemente limitadoras das doses. Nos exemplos 4 a 9, as análises às mucosas do intestino delgado demonstraram uma recuperação rápida do comprimento das vilosidades e um aumento da actividade proliferativa das células foliculares de murganhos tratados com a IL-11 ou com a IL-6, comparativamente com os murganhos de contraprova Assim sendo, a IL-11 e a IL-6 têm efeitos positivos sobre a recuperação de diversos tecidos em que houve toxicidades limitadoras das doses a seguir a terapias citoablativas.

Sem se pretender estabelecer nenhnm paralelismo com qualquer teoria, os inventores admitem que o tratamento de lesões ou de diminuições de células epiteliais do intestino, que normalmente se dividem de uma forma rápida, tratamento esse efectuado com a IL-11 ou a IL-6 ou outra citoquina, proporciona duas vantagens importantes aos métodos actuais de tratar o problema da toxicidade ao nível do intestino. Em primeiro lugar, a citoquina, v.g., a IL-11 ou a IL-6, melhora a integridade do intestino ao estimular as células progenitoras no sentido de ser restabelecida uma população de células saudáveis, evitando consequentemente a admissão de bactérias e de fungos no sangue do paciente tratado. O tratamento de pacientes com a 1L-11 ou com a IL-6 pode reduzir assim as taxas de morbilidade e de mortalidade associadas às lesões intestinais induzidas por quimioterapia e por radioterapia. Além disso, a Π -11 ou a IL-6 ou outras citoquinas aqui identificadas também podem permitir a aplicação de regimes mais intensos de quimioterapia e de radioterapia nos tratamentos dos cancros, o que constitui um efeito altamente desejável, uma vez que isto pode aumentar as taxas de sobrevivência de pacientes com determinados cancros que normalmente são fatais.

De igual modo, no tratamento de doenças de natureza autoimunitária do intestino delgado, presume-se que uma citoquina, tal como a IL-11 ou a IL-6, restabeleça a população de células, melhorando assim as taxas de cura e reduzindo as taxas de morbilidade e de mortalidade sem os efeitos secundários deletérios das terapias conhecidas.

Admite-se desde já que o tratamento de um paciente com uma citoquina seleccionada, tal como a IL-11 ou a IL-6 ou uma combinação de citoquinas, tem os mesmos efeitos sobre outras populações de células, v.g., sobre as células da pele, do cabelo, do esperma, dos revestimentos do estômago e do intestino grosso e sobre as células epiteliais do fígado, nas quais há lugar a lesões ou diminuições do seu número devido a doenças, infecções, choques ou traumas. Em termos teóricos, a citoquina restabelece as populações saudáveis, estimulando as células progenitoras e levando-as a diferenciarem-se em populações de células perfeitamente desenvolvidas.

No tratamento de quaisquer doenças que tenham como consequência lesões ou diminuições das populações de células, a citoquina, v.g. a 1L-11 ou a IL-ó, pode ser administrada por qualquer via adequada, mas é administrada preferencialmente de forma sistémica, isto é, por via parentética. Entre as vias parentéticas são preferíveis as vias subcutânea e intraperitoneal. Havendo quimioterapia, pode eventualmente ser desejável a administração intravenosa. O médico assistente pode determinar um regime de tratamento adequado para os pacientes sujeitos a quimioterapia ou a radioterapia ou para os pacientes que tenham já lesões ou diminuições celulares devidas a traumas ou doenças, dependendo esse regime de tratamento de factores tais como a idade, o sexo, o peso corporal e o estado geral de saúde do paciente. Em geral, uma dose adequada de uma citoquina, v.g., a IL-11, irá estar compreendida entre cerca de 1 μg/kg de peso corporal e cerca de 100 pg/kg de peso corporal. Se desejado, estas doses podem ser transformadas em unidades. Uma unidade representa convenientemente a concentração do polipeptido que proporciona metade do valor máximo da estimulação numa experiência conveniente, v.g., no caso da IL-11, a experiência TI 165 descrita no documento PCT/US90/06803. Uma outra dose conveniente de citoquina, v.g. a IL-11, pode estar compreendida no intervalo entre cerca de 10 pg/kg e cerca de 1000 pgfcg e mais preferencialmente entre cerca de 100 pg/kg e cerca de 500 pg/kg de peso corporal. Tais doses podem ser administradas diariamente durante um período compreendido entre 1 dia e 6 meses, ou durante período mais longos, conforme venha a ser necessário, dependendo isso da natureza das lesões ou das diminuições celulares.

Os regimes de dosagem para outras citoquinas aqui descritas podem ser idênticos ou ajustados sucessivamente, dependendo isso da toxicidade da citoquina escolhida. Por exemplo, a IL-1 poderia ser administrada segundo um regime de dosagem compreendido entre cerca de 10 ng/kg de peso corporal e cerca de 1 pg/kg de peso corporal, devido à sua toxicidade. O ajustamento do regime de dosagem é uma questão da competência dos especialistas da matéria, tomando por base as toxicidades conhecidas das citoquinas úteis na presente invenção.

Quando utilizadas para tratar doenças de natureza autoimunitária, a composição de citoquinas, v.g., de IL-11, pode ser formulada de modo a conter outros agentes úteis para mitigar os sintomas de tais doenças, incluindo, v.g., as substâncias prednisona, ciclosporina, ciclo-íbsfamida e azatioprina e ainda outr os agentes conhecidos.

Além disso, se o tratamento tiver por objectivo as células da pele e do cabelo, é possível preparar uma composição farmacêutica utilizando agentes de tipo convencional para a administração tópica de substâncias terapêuticas à pele e ao cabelo, v.g., para administração sistémica ou local ou tópica. Os veículos farmacêuticos adequados para uma composição tópica da presente invenção podem incorporar diversos ingredientes convencionais para a produção de cremes, loções, geles ou unguentos. Tais ingredientes convencionais são incluídos nos cremes ou nos óleos para a pele para administração tópica para o tratamento de diversas doenças da pele. Essas composições podem ser utilizadas como sistemas de administração de fármacos para se transmitir a IL-11 através da pele ou para facilitar a absorção da IL-11 pela pele, ou aplicadas sobre uma escoriação ou sobre qualquer outra erupção de pele. [Ver, v.g., as patentes de invenção norte-americanas r^ 3 981 996; 4 731 241; 4 164 563; 3 924 004; 3 888 995; 3 592 930 e 4 753 958],

Os exemplos seguintes ilustram a produção de IL-11 e das suas proteínas de fusão (exemplos 1 a 3) e esclarecem os métodos da presente invenção em que a citoquina seleccionada

é a IL-11 ou a IL-6, sendo os modelos de populações de células de crescimento rápido (exemplos 4 a 9) os casos em que houve lesões e diminuições das populações de células do intestino. No entanto, estes exemplos não limitam o âmbito da presente invenção.

EXEMPLO 1 - IL-11 HUMANA O isolamento e a clonagem da IL-11 humana vêm descritos minuciosamente no pedido de patente de invenção PCT publicado com o n° US90/06803, agora conhecido na especialidade. No quadro I subsequente está indicada a sequência completa da IL-11 humana já determinada. Esta proteína caracteriza-se pela sequência do quadro I [SEQID NO.l e 2],

Quadro I 5’AGCTGGGAAGGGTTAAAGGCCCCCGGCTCCCTGCCCCCTGCCCTGG(1)

GGAACCCCT GGCCCTGCGGGGAC ATG AAC TGT GTT TGC CGC M N C V C R CTG GTC CTG GTC GTG CTG AGC CTG TGG CCA GAT ACA L V L V V L S L W P D T GCT GTC GCC CCT GGG CCA CCA CCT GGC CCC CCT CGA A V A P G P P P G P P R GTT TCC CCA GAC CCT CGG GCC GAG CTG GAC AGC ACC V S P D P R A E L D S T GTG CTC CTG ACC CGC TCT CTC CTG GCG GAC ACG CGG V L L T R s L L A D T R CAG CTG GCT GCA CAG CTG AGG GAC AAA TTC CCA GCT Q L A A Q L R D K F P A GAC GGG GAC CAC AAC CTG GAT TCC CTG CCC ACC CTG D G D H N L D S L P T L GCC ATG AGT GCG GGG GCA CTG GGA GCT CTA CAG CTC A M S A G A L G A L Q L CCA GGT GTG CTG ACA AGG CTG CGA GCG GAC CTA CTG P G V L T R L R A D L L

TCC TAC CTG CGG CAC GTG CAG TGG CTG CGC CGG GCA s Y L R H V Q W L R R A GGT GGC TCT TCC CTG AAG ACC CTG GAG CCC GAG CTG G G s S L K T L E P E L GGC ACC CTG CAG GCC CGA CTG GAC CGG CTG CTG CGC G T L Q A R L D R L L R CGG CTG CAG CTC CTG ATG TCC CGC CTG GCC CTG CCC R L Q L L M S R L A L P CAG CCA CCC CCG GAC CCG CCG GCG CCC CCG CTG GCG Q P P P D P P A P P L A CCC CCC TCC TCA GCC TGG GGG GGC ATC AGG GCC GCC P P s s A W G G I R A A CAC GCC ATC CTG GGG GGG CTG CAC CTG ACA CTT GAC H A I L G G L II L T L D TGG GCC GTG AGG GGA CTG CTG CTG CTG AAG ACT CGG W A V R G L L L L K T R

CTG TGA CCCGAGGCCCAGAGCCACCACCGTCCTTCCAAAGCCACA L

TCTT ATTT ATTT ATTT ATTT CGGT ACTGGGGGCG A A AC AGCC AGGT G

ATCCCCCTGCCTTTAGCTCCCCCTAGTTAGAGACAGTCCTTCCGTGA

GGCTGGGGGGCATCTGTGCCTTATTTATACTTATTTATTTCAGGAGC

GGGGGTGGGCTCCTGGGTCCCCGAGGAGGAGGGAGCTGGGGTCCCGG

ATTCTTGTGTCCACAGACTTCTGCCCTGGCTCCTCCCCCTCGAGGCC

TGGGCAGGAATACATACTATTTATTTAAGAGCTC EXEMPLO 2 - MOLÉCULA DE FUSÃO DE TIORREDOXINA-IL-11

Preparou-se a IL-11 também numa molécula de fusão para utilização no método da presente invenção. A molécula de fusão continha tíoiredoxina de E. coli e a IL-11 recombinante, obtida conforme descrito no pedido de patente de invenção PCT com o n° US90/06803 [ver também a obra de Paul et dProc. Natl. Acad Stà. U.S.A.. 82:7512-7516 (1990) e a publicação da patente de invenção PCT com o n° W091/07495 de 30 de Maio de 1991],

Efectuou-se a clonagem do gene da tiorredoxina de E. coli (trxA), tomando por base a sua sequência já publicada [Lim etal., X Bacteriol.. 163:311-316 (1985)] e utilizou-se para a construção de diversos plasmídeos de expressão de E. coli congéneres, tendo para tal sido utilizadas técnicas convencionais de manipulação do ADN, exaustivamente descritas por Sambrook, Fritsch e Maniatis na obra Molecular Cloning, A Laboratory Manual. 2a edição, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989). (Os nucleótidos 2242-2568 do quadro Π codificam a proteína tiorredoxina de E. Coli).

Construiu-se um plasmídeo de expressão pALtrxA-781 contendo o gene trxA de E. coli sem fusão com outra sequência. Este plasmídeo, que comanda a acumulação de mais de 10% da proteína celular total sob a forma de tiorredoxina numa estirpe hospedeira GI724 de E. coli, foi ainda manipulado para permitir a construção de uma sequência de fusão trxA/EL-11, daí resultando o vector de expressão pALtrxA/EK/DL-1 ΙΔΡτο-581. A sequência completa do vector plasmídico de expressão, o pALtrxA/EK/IL-11 ΔΡτο-5 81 [SEQ ID NO:3 e SEQ ED NO:4] está ilustrada no quadro Π e contém as particularidades a seguir indicadas.

Os nucleótidos 1-2060 contêm as sequências de ADN com origem no plasmídeo pUC-18 [Norrander et al, Gene. 26:101-106 (1983)] que inclui as sequências que contêm o gene da β-lactamase que confere resistência ao antibiótico ampicilina nas estirpes hospedeiras de E. Coli, e uma origem de replicação proveniente de colEl. Os nucleótidos 2061-2221 contêm sequências de ADN para o promotor principal à esquerda (pL) do bacteriófago λ [Sanger et al, X Mol. Biol.. 162:729-773 (1982)], incluindo três sequências do operador, OlI, Ol2 e Ol3. Os operadores são os locais de ligação para a proteína repressora Acl, cujos níveis celulares controlam a quantidade de início de transcrição a partir do pL. Os nucleótidos 2222-2241 contêm uma sequência de forte ligação ribossómica obtida a partir da sequência do gene 10 do bacteriófago T7 [Dunn e Studier, J. Mol. Biol.. 166:477-535 (1983)].

Os nucleótidos 2242-2568 contêm uma sequência de ADN que codifica a proteína tiorredoxina de E coli [Lim et d, J. Bacteriol.. 163:311-316 (1985)]. Não há codão de terminação da tradução na extremidade da sequência de codificação da tiorredoxina neste plasmídeo.

Os nucleótidos 2569-2583 contêm uma sequência de ADN que codifica a sequência de aminoácidos para um péptido separador que é curto, hidrofílico e flexível, designado por “--GSGSG--”. Os nucleótidos 2584-2598 proporcionam a sequência de ADN que codifica a sequência de aminoácidos para o local de reconhecimento de clivagem da enterocinase (EC 3.4.4.8), designada por “-DDDDK--” [Maroux et d., J. Biol. Chem.. 246:5031-5039 (1971)].

Os nucleótidos 2599-3132 contêm uma sequência de ADN que codifica a sequência de aminoácidos de uma forma modificada da IL-11 humana perfeitamente desenvolvida [Paul et d., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 87:7512-7516 (1990)]; o resíduo prolilo do terminal N noimalmente existente na proteína natural foi suprimido. Assim, estes nucleótidos codificam a IL-11 a começar no aminoácido n° 2 da sequência natural perfeitamente desenvolvida. A sequência inclui um codão de terminação da tradução na extremidade 3’ da sequência da IL-11.

Os nucleótidos 3133-3159 proporcionam uma sequência de ADN “ligadora” que contém os locais de restrição das endonucleases. Os nucleótidos 3160-3232 proporcionam uma sequência de terminação da transcrição com base na sequência do gene aspA de E. coli [Takagi et d., Nucl. Acids Res.. 13:2063-2074 (1985)]. Os nucleótidos 3233-3632 são sequências de ADN obtidas a partir do pUC-18.

Quadro Π pALtrxA/EK/IL-1 ΙΔΡιο-581 SEQID NO:3 e SEQID NO:4

GACGAAAGGG

TGTCATGATA

TTTCGGGGAA

TCTAAATACA

ACCCTGATAA

ATGAGTATTC

TTGCGGCATT

GCTGGTGAAA

CGAGTGGGTT

TCCTTGAGAG

GAGCACTTTT

CGTATTGACG

ACTATTCTCA

AGAAAAGCAT

TGCAGTGCTG

ACTTACTTCT

GATCGTTGGG

ACGAGCGTGA

GTTGCGCAAA

TCCCGGCAAC

TTGCAGGACC

GTTTATTGCT

CGCGGTATCA

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TATGGATGAA

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CCTCGTGATA

ATAATGGTTT

ATGTGCGCGG

TTCAAATATG

ATGCTTCAAT

AACATTTCCG

TTGCCTTCCT

GTAAAAGATG

ACATCGAACT

TTTTCGCCCC

AAAGTTCTGC

CCGGGCAAGA

GAATGACTTG

CTTACGGATG

CCATAACCAT

GACAACGATC

CACAACATGG

AACCGGAGCT

CACCACGATG

CTATTAACTG

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CGCCTATTTT

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TGTCGCCCTT gtttttgctc

CTGAAGATCA

GGATCTCAAC

GAAGAACGTT

TATGTGGCGC

GCAACTCGGT

GTTGAGTACT

GCATGACAGT

GAGTGATAAC

GGAGGACCGA

GGGATCATGT

GAATGAAGCC

CCTGTAGCAA

GCGAACTACT

CTGGATGGAG

TCGGCCCTTC

GAGCCGGTGA

GGGGCCAGAT

ACGACGGGGA

AGATCGCTGA

ACTGTCAGAC

TATAGGTTAA AGGTGGCACT TGTTTATTTT TGAGACAATA AAGGAAGAGT ATTCCCTTTT ACCCAGAAAC GTTGGGTGCA AGCGGTAAGA TTCCAATGAT GGTATTATCC CGCCGCATAC CACCAGTCAC AAGAGAATTA ACTGCGGCCA AGGAGCTAAC AACTCGCCTT ATACCAAACG TGGCAACAAC TACTCTAGCT GCGGATAAAG CGGCTGGCTG GCGTGGGTCT GGTAAGCCCT GTCAGGCAAC GATAGGTGCC CAAGTTTACT

CATATATACT TTAGATTGAT TTAAAACTTC ΑΤΊΤΤΤΑΑΤΤ TAAAAGGATC TAGGTGAAGA TCCTTTTTGA TAATCTCATG ACCAAAATCC CTTAACGTGA GTTTTCGTTC CACTGAGCGT CAGACCCCGT AGAAAAGATC AAAGGATCTT CTTGAGATCC TTTTTTTCTG CGCGTAATCT GCTGCTTGCA AACAAAAAAA CCACCGCTAC CAGCGGTGGT TTGTTTGCCG GATCAAGAGC TACCAACTCT TTTTCCGAAG GTAACTGGCT TCAGCAGAGC GCAGATACCA AATACTGTCC TTCTAGTGTA GCCGTAGTTA GGCCACCACT TCAAGAACTC TGTAGCACCG CCTACATACC TCGCTCTGCT AATCCTGTTA CCAGTGGCTG CTGCCAGTGG CGATAAGTCG TGTCTTACCG GGTTGGACTC AAGACGATAG TTACCGGATA AGGCGCAGCG GTCGGGCTGA ACGGGGGGTT CGTGCACACA GCCCAGCTTG GAGCGAACGA CCTACACCGA ACTGAGATAC CTACAGCGTG AGC ATT GAGA AAGCGCCACG CTTCCCGAAG GGAGAAAGGC GGACAGGTAT CCGGTAAGCG GCAGGGTCGG AACAGGAGAG CGCACGAGGG AGCTTCCAGG GGGAAACGCC TGGTATCTTT ATAGTCCTGT CGGGTTTCGC CACCTCTGAC TTGAGCGTCG ATTTTTGTGA TGCTCGTCAG GGGGGCGGAG CCTATGGAAA AACGCCAGCA ACGCGGCCTT TTTACGGTTC CTGGCCTTTT GCTGGCCTTT TGCTCACATG TTCTTTCCTG CGTTATCCCC TGATTCTGTG GATAACCGTA TTACCGCCTT TGAGTGAGCT GATACCGCTC GCCGCAGCCG AACGACCGAG CGCAGCGAGT CAGTGAGCGA GGAAGCGGAA GAGCGCCCAA TACGCAAACC GCCTCTCCCC GCGCGTTGGC CGATTCATTA ATGCAGAATT GATCTCTCAC CTACCAAACA ATGCCCCCCT GCAAAAAATA AATTCATATA AAAAACATAC AGATAACCAT CTGCGGTGAT AAATTATCTC TGGCGGTGTT GACATAAATA CCACTGGCGG TGATACTGAG CACATCAGCA GGACGCACTG ACCACCATGA ATTCAAGAAG GAGATATACA T ATG AGC GAT AAA ATT ATT CAC CTG ACT GAC GAC Met Ser Asp Lis Ile He His Leu Thr Asp Asp 1 5 10 AGT tu GAC ACG GAT GTA CTC AAA GCG GAC Ser Phe Asp Thr Asp Vai Leu Lis Ala Asp 15 20 GCG ATC CTC GTC GAT TTC TGG GCA GAG TGG Ala Ile Leu Vai Asp Phe Trp Ala Glu Trp 25 30 GGT CCG TGC AAA ATG ATC GCC CCG ATT CTG Gli Pro Cis Lis Met Ile Ala Pro He Leu 35 40 GAA ATC GCT GAC GAA TAT CAG GGC AAA CTG Glu Ile Ala Asp Glu Tir Gin Gli Lis Leu 45 50 GTT GCA AAA CTG AAC ATC GAT CAA AAC CCT Vai Ala Lis Leu Asn He Asp Gin Asn Pro 60 65 ACT GCG CCG AAA TAT GGC ATC CGT GGT ATC Thr Ala Pro Lis Tir Gli Ile Arg Gli He 70 75 ACT CTG CTG CTG TTC AAA AAC GGT GAA GTG Thr Leu Leu Leu Phe Lis Asn Gli Glu Vai 80 85 GCA ACC AAA GTG GGT GCA CTG TCT AAA GGT Ala Thr Lis Vai Gli Ala Leu Ser Lis Gli 90 95 TTG AAA GAG TTC CTC GAC GCT AAC CTG GCC Leu Lis Glu Phe Leu Asp Ala Asn Leu Ala 100 105 TCT GGT TCT GGT GAT GAC GAT GAC AAA GGT Ser Gli Ser Gli Asp Asp Asp Asp Lis Gli 115 120 CCA CCA GGT CCA CCT CGA GTT TCC CCA GAC Pro Pro Gli Pro Pro Arg Vai Ser Pro Asp 125 130 CGG GCC GAG CTG GAC AGC ACC GTG CTC CTG Arg Ala Glu Leu Asp Ser Thr Vai Leu Leu 135 140 CGC TCT CTC CTG GCG GAC ACG CGG CAG CTG Arg Ser Leu Leu Ala Asp Thr Arg Gin Leu 145 150

25 GCA CAG CTG AGG GAC AAA Ala Gin Leu Arg Asp Lis 155 160 GAC CAC AAC CTG GAT TCC Asp His Asn Leu Asp Ser 170 AT G AGT GCG GGG GCA CTG Met Ser Ala Gli Ala Leu 180 CCA GGT GTG CTG ACA AGG Pro Gli Vai Leu Thr Arg 190 CTG TCC TAC CTG CGG CAC Leu Ser Tir Leu Arg His 200 CGG GCA GGT GGC TCT TCC Arg Ala Gli Gli Ser Ser 210 215 CCC GAG CTG GGC ACC CTG Pro Glu Leu Gli Thr Leu 225 CGG CTG CTG CGC CGG CTG Arg Leu Leu Arg Arg Leu 235 CGC CTG GCC CTG CCC CAG Arg Leu Ala Leu Pro Gin 245 CCG GCG CCC CCG CTG GCG Pro Ala Pro Pro Leu Ala 255 TGG GGG GGC ATC AGG GCC Trp Gli Gli He Arg Ala 265 270 GGG GGG CTG CAC CTG ACA Gli Gli Leu His Leu Thr 280 AGG GGA CTG CTG CTG CTG Arg Gli Leu Leu Leu Leu TTC CCA GCT GAC GGG 2736 Phe Pro Ala Asp Gli 165 CTG CCC ACC CTG GCC 2769 Leu Pro Thr Leu 175 Ala GGA GCT CTA CAG CTC 2802 Gli Ala Leu 185 Gin Leu CTG CGA GCG GAC CTA 2835 Leu Arg 195 Ala Asp Leu GTG CAG TGG CTG CGC 2868 Vai Gin Trp Leu Arg 205 CTG AAG ACC CTG GAG 2901 Leu Lis Thr Leu Glu 220 CAG GCC CGA CTG GAC 2934 Gin Ala Arg Leu 230 Asp CAG CTC CTG ATG TCC 2967 Gin Leu Leu 240 Met Ser CCA CCC CCG GAC CCG 3000 Pro Pro 250 Pro Asp Pro CCC CCC TCC TCA GCC 3033 Pro Pro Ser Ser Ala 260 GCC CAC GCC ATC CTG 3066 Ala His Ala De Leu 275 CTT GAC TGG GCC GTG 3099 Leu Asp Trp Ala 285 Vai AAG Lis ACT Thr CGG Arg 295 CTG Leu TGA 3132 290

AAGCTTATCG ATACCGTCGA CCTGCAGTAA TCGTACAGGG 3172 TAGTACAAAT AAAAAAGGCA CGTCAGATGA CGTGCCTTTT 3212 TTCTTGTGAG CAGTAAGCTT GGCACTGGCC GTCGTTTTAC 3252 AACGTCGTGA CTGGGAAAAC CCTGGCGTTA CCCAACTTAA 3292 TCGCCTTGCA GCACATCCCC CTTTCGCCAG CTGGCGTAAT 3332 AGCGAAGAGG CCCGCACCGA TCGCCCTTCC CAACAGTTGC 3372 GCAGCCTGAA TGGCGAATGG CGCCTGATGC GGTATTTTCT 3412 CCTTACGCAT CTGTGCGGTA TTTCACACCG CATATATGGT 3452 GCACTCTCAG TACAATCTGC TCTGATGCCG CATAGTTAAG 3492 CCAGCCCCGA CACCCGCCAA CACCCGCTGA CGCGCCCTGA 3532 CGGGCTTGTC TGCTCCCGGC ATCCGCTTAC AGACAAGCTG 3572 TGACCGTCTC CGGGAGCTGC ATGTGTCAGA GGTTTTCACC 3612 GTCATCACCG AAACGCGCGA

Conforme se descreve no exemplo 3 subsequente, se a criação for realizada em cultura em condições adequadas numa estirpe hospedeira de E. coli conveniente, é possível comandar a produção de níveis elevados (aproximadamente 10% do valor total das proteínas celulares) de uma proteína de fusão tiorredoxina-IL-11. Pelo contrário, se não for fundida com a tiorredoxina, a IL-11 acumula-se apenas até 0,2% do valor total das proteínas celulares, quando expressa num sistema análogo hospedeiro/vector.

EXEMPLO 3 - EXPRESSÃO DE UMA PROTEÍNA DE FUSÃO

Produziu-se uma proteína de fusão tiorredoxina-ll^I I em conformidade com o protocolo a seguir descrito, tendo para tal sido utilizado o plasmídeo construído conforme descrito no exemplo 2. Transformou-se o pALtrxA/EK/IL-1 ΙΔΡτο-581 (SEQ DID NO:3) dentro da estirpe hospedeira GI724 de E. coli (F-, laclq, lacPampC::teI+) em conformidade com o procedimento de Dagert e Ehrlich, Gene, 6:23 (1979). A estirpe hospedeira GI724 de E. coli, não transformada, foi depositada na Colecção Americana de Culturas Tipo, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maiyland, a 31 de Janeiro de 1991, com a referência ATCC n° 55151 para efeitos de patentes de invenção, ao abrigo das leis e dos regulamentos aplicáveis. Os transformantes foram seleccionados sobre placas de gelose a 1,5% p/v que continham o meio IMC que é constituído por meio M9 [Miller, “Experiments in Molecular Genetics”, Cold Spring Harbor Laboratory, Nova Iorque (1972)] enriquecido com glicose na proporção de 0,5% p/v, casaminoácidos na proporção de 0,2% p/v e ampicilina na concentração de 100 pg/mL. A estirpe GI724 contém uma cópia do gene repressor Xcl de tipo natural estavelmente integrado no cromossoma no local empC, onde foi colocado sob o controlo transcricional das sequências do operador/promotor trp de Salmonella typhimurium. Na GI724, a proteína Àcl é produzida apenas durante o crescimento em meios isentos de triptofano, tais como os meios mínimos ou um meio mínimo enriquecido com casaminoácidos, por exemplo, o TMC descrito supra. A adição de triptofano a uma cultura de GI724 vai reprimir o promotor trp e impedir a síntese do Xcl, provocando graduahnente a indução da transcrição a partir dos promotores pL se estiverem presentes na célula. A GI724 transformada com pALtrxA/EK/IL-1 ΙΔΡτο-581 [SEQ DID NO:3 e SEQ ED NO:4] cresceu a 37°C até se obter um valor A550 igual a 0,5 em meio IMC. Acrescentou-se o triptofano até se obter uma concentração final de 100 pg/mL e manteve-se a cultura a incubar durante mais 4 horas. Durante este período a proteína de fusão ϋοιτβάοχΐηη-ΙΙ^ΙΙ acumulou-se até perfazer aproximadamente 10% do valor total das proteínas celulares.

Comprovou-se que toda a proteína de fusão estava na fracção celular solúvel, tendo sido purificada conforme adiante se descreve. Efectuou-se o desmembramento celular numa & ..x <

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prensa continental a trabalhar a 1,38 x 108 Pa (20 000 psi) em HEPES 50 mM a pH 8,0 contendo fluoreto de fenil-metil-sulfonilo 1 mM. Limpou-se o lisado por centrifugação a 15000 x g durante 30 minutos e aplicou-se uma carga de sobrenadante numa coluna de tipo ‘QAE-Toyopeark®’. Deitou-se fora as fracções de efluente e realizou-se a eluição da proteína de fusão com HEPES 50 mM a pH 8 contendo NaCl 100 mM. Ajustou-se o produto de eluição até à concentração de NaCl 2 M e com esse produto carregou-se uma coluna de ‘phenyl--Toyopearl®’. Mais uma vez se deitou fora as fracções de efluente e realizou-se a eluição da proteína de fusão com HEPES 50 mM a pH 8,0 contendo NaCl 0,5 M. A seguir realizou-se a diálise da proteína de fusão em presença de HEPES 25 mM a pH 8,0, tendo-se verificado que a sua pureza nesta fase era superior a 80%. Recorrendo ao bioensaio TI 165 [Paul et al., citado supra], a proteína purificada tiorredoxina-IL-11 revelou uma actividade de 8 x 105 unidades/mg. Este valor adere bastante bem, numa base molar, à actividade de 2 x 106 unidades/mg que foi o valor encontrado na mesma experiência para a IL-11 obtida a partir de células COS. Efectuou-se a clivagem de 1 mg da proteína de fusão a 37°C durante 20 horas com 1000 unidades de enterocinase de bovino (Leipmeks e Light, X Biol, Chem. 254:1677-1683 (1979)] em 1 mL de Tris-Cl 10 mM (pH 8,oyCaCl2 10 mM. Teria sido possível recuperar a IL-11 a partir dos produtos de reacção fazendo-os passar pela coluna ‘ QAE-Toyopearf em HEPES 25 mM a pH 8,0, onde foi observada a existência de IL-11 nas fracções de efluente. A proteína de fusão não clivada, a tiorredoxina e a enterocinase ficaram ligadas à coluna.

EXEMPLO 4 - TRATAMENTO DE MURGANHOS IRRADIADOS A IL-11 utilizada nos testes a seguir indicados foi obtida no ‘Genetics Institute, Inc., Cambridge, MA’ e foi preparada em E. coli essencialmente conforme descrito nos exemplos anteriores. Depois misturou-se a IL-11 (140 pg/mL) com tampão Tris 10 mM até se obter um valor de pH aproximadamente igual a 8,0. O nível de endotoxina nesta formulação de qualidade aplicável in vivo é de cerca de 1,4 unidades de proteína por miligrama (1,4 U/mg). A preparação também contém hidroxilmato a cerca de 10% molar e tiorredoxina à razão aproximada de 3 ng/mL (0,002%). Foram utilizados murganhos da estirpe C3H/HeJ [Jackson Labs] com idades entre 8 e 10 semanas aos quais sc administrou por via intrapcritoncal (i.p.) a substância 5-flúor-uracilo (5-FU) à razão de 150 mg/kg, diluída em Solução Salina de Hanks Equilibrada (SSHE, o mesmo que HBSS) contendo tampão HEPES 0,024 M [sendo as duas substâncias da Gibco], três dias antes da irradiação subletal. A irradiação corporal total (ICT, o mesmo que TBI) foi de 6,0 grays (Gy) a partir de uma máquina de radioterapia da Siemens para raios X a 250 Kvp, filtrada com uma chapa de Cu de 1,0 mm de espessura correspondente à semi--espessura de uma chapa de Cu de 2,1 mm à DSS (o mesmo que SSD) de 50 cm e com uma actividade de 78,13 cGy/minuto. No mesmo dia em que foi administrada a dose de irradiação administrou-se aos murganhos a IL-11 humana recombinante descrita supra, de qualidade aplicável in vivo [Genetics Institute] segundo uma dose dividida (duas vezes por dia) à razão de 250 pg/kg/dia. Estas doses divididas foram administradas por via subcutânea em volumes de 0,2 mL em SSHE com Hepes e 0,1% de albumina do soro de bovino (ASB) [Boehringer-Mannheim], Os animais de contraprova receberam o mesmo volume de SSHE e de ASB sem a IL-11. O tratamento prosseguiu durante 9 a 18 dias pós-irradiação ou até os animais morrerem.

Efectuou-se uma análise hematológica para contagem do número de leucócitos e do número de plaquetas no sangue retirado das veias caudais, tendo sido utilizado para tal um Contador Coulter de modelo ZM [Coulter Electronics], a trabalhar com uma abertura de 100 pm para as determinações leucocitárias e com uma abertura de 50 pm para as determinações plaquetárias. Os eritrócitos foram desmembrados utilizando um aparelho ‘Zapglobin’ [Coulter], em conformidade com as recomendações do fabricante. Os esfregaços de sangue foram constrastados com ‘Wright-Giemsa’, tendo sido utilizados métodos convencionais, e foram examinados por análise diferencial com uma amplificação de 100X. Calculou-se os números absolutos de neutrófilos, Iinfócitos, monócitos e eosinófilos no sangue periférico multiplicando o número total de leucócitos pela percentagem de leucócitos determinada na análise diferencial. Foram obtidos os hematócritos do sangue periférico por centrifugação de tubos capilares durante 5 minutos numa centrifugadora de hematócritos de modelo ‘Clay-Adams\

Os murganhos mortos e intactos (que morreram durante a experiência ou que foram sacrificados) foram estabilizados de um dia para o outro em formalina tamponada a 10%. De cada murganho estabilizou-se um fémur em solução de Bouin. Os tecidos retirados de cada órgão (fígado, baço, rim, mesentério do intestino delgado, parede abdominal, pulmão, coração, testículos e fémur) foram mergulhados em cera de parafina, utilizando técnicas convencionais, e deles foram cortadas secções de 4 jrm que foram contrastadas com hematoxíhna e eosina. Para análise dos folículos do intestino delgado foram realizadas 10 medições independentes da altura das vilosidades, da profundidade dos folículos e das metafases/folículo em cada secção de intestino delgado, utilizando um micrómetro montado na objectiva.

Os resultados estão agrupados no quadro ΠΙ seguinte sob a forma de média ± D.P., salvo quando especificado de outro modo. Determinou-se a probabilidade de haver diferenças significativas na comparação de dois grupos congéneres, recorrendo-se para tal ao teste t de Student dos restos duplos. Determinou-se a probabilidade de haver diferenças significativas ao examinar tratamentos múltiplos, por análise da variância seguida pelos testes dos intervalos múltiplos de Student-Newman-Keuls, para se definir os subconjuntos singulares contidos no estudo.

Quadro ΠΙ

Efeito da IL-11 no modelo de modalidade combinada de infecção endógena

Exame microscópico4 ao murganho n° Dia do exame pós-irradiação1 Diarreia2 Exame macroscópico3 Focos bacterianos hepáticos ASB 1 5 + 0 +++ 2 8 - 19 ++ 3 5 + 21 +++ 4 6 - 79 +++ 5 9 - 119 +++ IL-11 1 9 + 0 + 2 4 + 0 - 3 9 - 14 -H- 4 9 - 3 + 5 9 - 0 - 1 Todos os animais foram sacrificados ao 9o dia; os outros dias são os de morte natural 2 + = existente no dia da moite natural - = ausência de diarreia 3 Havia focos superficiais no fígado estabilizado 4 Havia focos microscópicos patentes no exame de secções histológicas escolhidas aleatoriamente; + <10 focos/secção; ++ 10-50; +-H- >50.

Em três experiências separadas, todos os murganhos de contraprova morreram entre o 3o dia e o 10° dia após a irradiação, ao passo que apenas 3/13 (23%) dos murganhos tratados com aIL-11 morreram (nos 4o, 9o e 10° dias pós-irradiação). Na experiência 1 todos os animais de contraprova morreram por volta do 9o dia Os animais foram autopsiados no dia da sua morte ou então, no caso do grupo tratado, ao 9o dia tendo para tal os animais restantes sido sacrificados

(dia do exame indicado no quadro ΙΠ). Na autópsia verificou-se que 4/5 murganhos do grupo de contraprova revelavam focos infecciosos macroscópicos no fígado comparativamente com 2/5 nos murganhos tratados com a IL-11. Além disso, os focos existentes nos murganhos tratados com a IL-11 estavam patentes em menor numero e eram mais pequenos (quadro ΙΠ). Demonstrou-se posteriormente que estes focos continham bactérias E. coli, tendo esta identificação sido feita por análise microbiológica. O exame microscópico permitiu observar muitos focos (12-129/secção escolhida aleatoriamente) no fígado dos murganhos de contraprova, tendo sido observados menos (6-21/secção) nos murganhos tratados com a IL-11 (quadro ΙΠ). Também foram observados focos bacterianos idênticos no mesentério e no baço dos animais.

De forma surpreendente, estas diferenças de mortalidade e a presença de focos bacterianos nos órgãos dos murganhos não estavam associadas às diferenças existentes no número de leucócitos do sangue periférico ou aos números absolutos de neutrófilos, conforme comprovado pelos dados agrupados no quadro IV.

Quadro IV

Efeito da ILhr-11 sobre o número de corpúsculos do sangue periférico no modelo de murganho de modalidade combinada

Dia1 Tratamento N° de leucócitos x 103/mm3 N° de plaquetas x 103/mn? l°dia ASB 5,56 ± 1,80(5) 894,7 ±168,3 (5) IL-11 4,89 ±0,16(5) 770,3 ±192,6 (5) 3o dia ASB 0,49 + 0,16(10) 294,8 ±43,1 (10) IL-11 0,64 ±0,31(10) 454,1 ± 115,5 (10) 4o dia ASB 0,43+0,04(10) 237,4 ±109,6 (10) IL-11 0,49 ±0,14(10) 337,3 ± 143,2 (10) 5o dia ASB 0,30 ±0,06(9) 126,6 ±55,1 (10) IL-11 0,31 ±0,07(11) 171,9 ±76,9 (11) 6o dia ASB 0,40 ±0,24(9) 134,4 ±80,7 (9) IL-11 0,47 ±0,22(12) 257,9 ±195,2 (12) 8o dia ASB 1,19 ±0,13(2) 236,1 ±18,2 (2) IL-11 0,72 ±0,23(7) 365,6 ± 256,1(7) 9o dia ASB 1,39 ±0,32(2) 269,0 ± 100,8 (2) DL-11 1,06 + 0,45(9) 248,8 ±92,4 (9) 1 Pós-inadiação () nD de animais

* p < 0,001 comparativamente com o grupo da ASB

Uma vez que a bactéria E. coli é um organismo conhecido residente no intestino delgado, o aumento da infecção bacteriana e de mortalidade no grupo de animais de contraprova reflecte provavelmente a toxicidade intestinal resultante da irradiação e da quimioterapia A secção histológica do intestino delgado e a quantificação morfométrica do comprimento das vilosidades do intestino delgado confirmaram lesões muito disseminadas nos murganhos de

V'\ P 34 contraprova, conforme se conclui pelos dados agrupados nos quadros VA e VB. Pelo contrário, o tratamento com a IL-11 revelou uma conservação quase completa do comprimento das vilosidades (quadro VA). Além disso, os murganhos tratados com a IL-11 revelaram números próximos dos valores normais de células foliculares mitóticas, o que constitui uma outra indicação de estimulação da proliferação das células foliculares originais ou progenitoras.

Quadro VA Φ

Efeito da IL-11 sobre o epitélio do intestino dos murinos no modelo de modalidade combinada C Profundidade folicular1 V Comprimento das vilosidades C C + Vx 100% Normal (2) 84,1+21,1 477,7 ±99,8 15,4 ±5,9 5o dia ASB (5) 122,8 ±29,5 253,7 ±79,7 33,5 ±8,2 IL-11 (5) 117,1 ±14,5 512,8 + 6,7** 19,5 + 6,7** 9o dia ASB (2) 124,6 ±40,7 330,1 ±92,1 27,3 ± 1,0 IL-11 (2) 98,5 ± 7,0 405,9 ±84,3 19,9 ±4,4 () n° de animais 1 =em μτη * = p < 0,01 comparativamente com o grupo da ASB ** = p < 0,02 comparativamente com o grupo da ASB

Quadro VB

Efeito da IL-11 sobre o epitélio do intestino dos murinos no modelo de modalidade combinada

Cir. folicular Mitoses/Folículos Mitoses/folículos de 100 pm Normal (2) 162,3 ±11,6 1,8 ±0,4 1,07 ±0,14 5o dia ASB (5) 853,4 ± 62,2 0,9 ± 0,4 0,10 ±0,04 IL-11 (5) 928,2 ± 104,4 2,0 ±0,5* 0,22+ 0,06* 9o dia ASB (2) 830,0 ±28,2 1,1 ±0 0,13 ±0 IL-11 (2) 957,5 ± 10,4 2,2 ±0,6 0,23 ±0,06 () n° de animais 1 =em μτη

* = p < 0,01 comparativamente com o grupo da ASB

** = p < 0,02 comparativamente com o grupo da ASB

Estes dados comprovam que a administração da EL-11 in vivo tem efeitos positivos relevantes sobre a recuperação das células epiteliais dos folículos do intestino delgado perante os efeitos citotóxicos combinados de radiação e quimioterapia.

EXEMPLO 5 - SOBREVIVÊNCIA DE MURGANHOS A SEGUIR A UMA ACCÃO COMBINADA OUIMIOTERAPÊUTICA/RADIOTERAPÊUTICA

Foram utilizados murganhos da estirpe C3H/HeJ com 8 a 10 semanas de idade [Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME] aos quais se administrou 5-flúor-uracilo (5-FU) (diluído em Solução Salina de Hanks Equilibrada (SSHE) contendo Hepes 0,025 M) [G. R. Siber et ai, Câncer Res., 40, 3430-3436 (1980)], à razão de 150 mg/kg de peso corporal por via I.P., três dias antes da irradiação até ao nível subletal (uma irradiação corporal total de 6,0 Gy, administrada por uma máquina de terapia por raios X da Siemens de 250 KVp, filtrada com uma chapa de Cu com a espessura de 1,0 mm, o que corresponde a uma semi-espessura de uma chapa de Cu de 2,1 mm à DSS de 50 cm, e com uma actividade de 78,13 cGy/minuto). Não foram aplicadas infusões de medula óssea a estes animais. AIL-11 humana recombinante (ILhr-11) [fornecida por ‘Genetics Instituto’, Cambridge, MA, e preparada em E. coli, essencialmente conforme descrito nos exemplos anteriores], foi diluída em SSHE [o mesmo que HBSS da Gibco] contendo 0,1% de ASB [peso/volume, Boehringer-Mannheim, Indianapolis, IN] e Hepes 0,025 M [Gibco], Injectou-se a ILhr-11 (250 jog/kg de peso corporal) por via subcutânea em volumes de 0,2 mL duas vezes por dia, começando no mesmo dia da irradiação. Os murganhos de contraprova receberam o mesmo volume de SSHE/0,1% de ASB (injecções de veículo).

Os resultados destes estudos estão indicados na figura 1 subsequente. Conforme se pode concluir da figura, a seguir ao tratamento com 5-FU e após a administração de doses subletais de raios X (modalidade combinada, MC, terapia), as lesões provocadas nos intestinos delgados dos murganhos C3H/HeJ foram intensas e disseminadas e a maior parte dos animais morreu em maios de 10 dias (figura 1). Os animais moribundos revelaram fraqueza e diarreia e também cambaleavam, o que indica uma infecção do sistema nervoso central. O tratamento dos murganhos com interleucina 11 humana recombinante (ILhr-11) à razão de 250 pg/kg/dia permitiu um aumento significativo do número de animais sobreviventes a seguir a esta terapia citoablativa, apesar de não haver aumento nenhum do número de neutrófilos do sangue periférico ou das células progenitoras mielóides da medula óssea (figura 1).

Outros tratamentos em que foram administradas doses cada vez maiores de irradiação proveniente de uma fonte alternativa (137Cs) confirmaram o aumento do número de murganhos sobreviventes que haviam sido tratados com a IL-11 em intervalos de doseamento variáveis. As doses de radiação testadas nas experiências foram de 6,0, 7,0, 7,5 e 8,0 Gy (utilizando a fonte 137Cs a emitir a 95,83 cGy/minuto), conforme se disse antes (todas as doses administradas a seguir ao tratamento com 5-FXJ à razão de 150 mg/kg), tendo sido abrangida a totalidade de 135 murganhos. A taxa de sobrevivência no grupo de contraprova em todas as experiências foi de 27% comparativamente com a taxa de 62% no grupo dos murganhos tratados com a IL-11 (p<0,0001). O tratamento com a IL-11 permitiu uma redução nítida do número de focos bactcrianos em múltiplos órgãos, não havendo nenhum foco detectável em muitos murganhos após o seu sacrifício. A análise microbiológica de focos de secções histológicas retiradas dos fígados dos murganhos de contraprova demonstrou de modo uniforme que o organismo causativo era a E. coli, que é um organismo entérico vulgar nos murganhos.

EXEMPLO 6- SECÇÕES HISTOLÓGICAS DE INTESTINO DELGADO

Para se determinar a fonte potencial de organismos E. coli observados nos murganhos após o tratamento de MC, efectuou-se o exame de secções histológicas do intestino delgado de murganhos de contraprova e de murganhos tratados com a IL-11, sacrificados diariamente após a irradiação.

Os murganhos que morreram de morte natural ou que foram sacrificados a seguir à terapêutica combinada por radiação/quimioterapia (conforme descrito no exemplo 5 anterior) foram autopsiados e os seus tecidos foram estabilizados em formalina tamponada a 10%, de um dia para o outro, nas 12 horas imediatas a seguir a cada óbito. Os tecidos retirados de cada órgão (fígado, baço, rim, intestino delgado e mesentério, parede abdominal, pulmão, coração e fémur) foram embebidos em cera parafínica, utilizando técnicas convencionais. Foram cortadas secções de 4 μτη que foram contrastadas com hematoxilina/eosina (H e E). Foram efectuadas 10 medições independentes do peso das vilosidades, da profundidade dos folículos e das metafases/folículo para cada amostra de intestino delgado obtida a partir de murganhos sacrificados diariamente, tendo sido utilizado para tal um micrómetro montado na objectiva com uma amplificação de 200X. Efectuou-se a contagem dos focos bacterianos hepáticos quer por via macroscópica, enquanto colónias superficiais, quer por via microscópica em secções histológicas de fígados escolhidos aleatoriamente. A mucosa do iiitestiuo delgado dos murganhos de contraprova mostrou uma destruição nítida da estrutura das vilosidades com encurtamento do comprimento das vilosidades, vacuolização e estruturas nucleares picnóticas. Pelo contrário, nos murganhos tratados com a IL-11 foram observadas alterações ligeiras da morfologia das vilosidades do intestino delgado. A análise morfométrica dos folículos e do comprimento das vilosidades demonstrou a existência de um aumento significativo na razão entre profundidade folicular/comprimento das vilosidades nos murganhos tratados com a IL-11, comparativamente com os murganhos de contraprova (quadro VI subsequente). O encurtamento das vilosidades foi muito mais importante 24 horas após a irradiação nos dois grupos de murganhos, tendo permanecido anormal nos murganhos de contraprova sobreviventes até ao 9o dia. .3 39

Quadro VI

Efeito da IL-11 sobre a recuperação das células foliculares do intestino delgado após o tratamento com 5-FU e irradiação

PROFUNDIDADE DOS COMPRIMENTO DAS

FOLÍCULOS VILOSIDADES ASB IL-11 ASB H/l l°dia 76,8 ±9,2 71,1 ±4,7 398,6 ±45,5 479,0 ±31,8 2o dia 123,4 ±14,3 129,0 + 7,8 491,9 ±23,2 603,4 ± 41,91 3o dia 154,5 ± 10,2 141,8 ± 19,9 468,7 ±47,4 533,9 ±24,2 4o dia 141,5 ±11,9 118,5 ±14,0 500,2 ±51,3 635,0 ± 26,91 5o dia 120,6 ±11,7 117,8 ±7,7 523,2 ±17,4 661,5 ± 20,12 ASB IL-11 1° dia 0,20 ±0,01 0,15 ± 0,002 2o dia 0,25 ±0,01 0,22 ± 0,001 3o dia 0,33 ±0,01 0,27 + 0,012 4o dia 0,29 ±0,00 0,19 + 0,002 5o dia 0,23 ±0,00 0,18 ± 0,012 1

p < 0,05 no grupo da ASB cada número representa dados obtidos a partir de 3 animais 10 fblículos/animal, 10 vilosidades/animal.

EXEMPLO 7 - UTILIZAÇÃO DA IL-11 OU DA IL-6 NA TERAPIA CITOABLATTVA

Numa outra experiência diluiu-se a IL-6 humana recombinante [Preprotech, Rocky Hill, New Jersey] em SSHE [o mesmo que HBSS da Gibco] contendo 0,1% de ASB (p/v) e Hepes 0,025 Μ. A seguir injectou-se cada um de 10 murganhos C3H/HeJ por via subcutânea com a 2

p < 0,01 no grupo da ASB

IL-6 humana recombinante (250 pg/kg de peso corporal) em volumes de 0,2 mL, duas vezes por dia, começando no mesmo dia da irradiação. Dez (10) murganhos foram injectados com 1L-11 à razão de 250 pg/kg de peso corporal, conforme descrito no exemplo 5 anterior. Os murganhos de contraprova (55) receberam o mesmo volume de SSHE/0,1% de ASB. Os resultados deste estudo constam do quadro VQ seguinte.

Quadro VII

Percentagem de sobreviventes

Dia 2 4 5 6 7 8 9 10 n 12 13 ASB: 100 98 95 76 55 47 42 34 32 32 31 IL-11: 90 90 90 90 80 80 80 80 80 70 70 IL-6: 100 100 100 100 100 80 80 80 80 80 80 O tratamento dos murganhos com a interleucina 6 humana recombinantc à razão de 500 pg/kg/dia teve como resultado um aumento significativo do número de sobreviventes a seguir a esta terapia citoablativa.

EXEMPLO 8- CONTRASTACÃO DOS FOLÍCULOS DO INTESTINO DELGADO COM ANCP

Uma vez que o comprimento das vilosidades depende da proliferação e da diferenciação das células foliculares originais e progenitoras [Chwalinski et al., Am. I Anat.. 186, 397-406 (1989); Ijiri et al, Br. J. Câncer. 47, 175-185 (1983); Al-Dewachi et al., Cell Tissue Kinet., 10, 203-213 (1977)], determinou-se o índice mitótico das células foliculares nos murganhos de contraprova e nos murganhos tratados com a IL-11, sacrificados diariamente após a irradiação. 41 Λ contrastação imunoquímica do antigénio nuclear das células proliferativas (ANCP, o mesmo que PCNA) foi efectuada sobre secções de jejuno de 2 cm retiradas de murganhos do MC sacrificados diariamente entre 0 Io e o 5o dias pós-irradiação (dias 4 a 8 após o tratamento com 5-FU). Os tecidos foram estabilizados em solução de formalina a 10%, durante 6 a 12 horas e depois de mergulhados em parafina efectuou-se a secagem das secções histológicas sobre lamelas de vidro tratadas com polilisina. As lamelas foram depois desparafinizadas e novamente hidratadas. Extinguiu-se a actividade da peroxidase endógena por incubação durante 5 minutos em peróxido de hidrogénio a 3%. Recobriu-se as lamelas com soro normal de caprinos, durante 20 minutos, efecluou-se a incubação de um dia para o outro a 4°C corn o anticorpo PC-10 contra o ANCP [1:80 Dako, Santa Barbara, CA] e depois contrastou-se, durante 30 minutos, com o anti-anticorpo de murganho conjugado na cabra com biotina [Gaithersburg MD] e a seguir com estreptavidina conjugada com peroxidase [qualquer destas substâncias fornecida por Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg, MD] durante 30 minutos. Revelou--se a enzima com 3,3’-diaminobenzidina [DAB Sigma, St Louis, MO], Os núcleos positivos ao ANCP ficaram contrastados de castanho. Mediu-se a percentagem de células foliculares positivas ao ANCP e o número absoluto de células positivas ao ANCP em cada folículo, por contagem de uma selecção aleatória de folículos/secções histológicas/muiganho.

Quadro VIII

Efeito da IL-11 sobre a proliferação das células foliculares do intestino delgado com quantificação

efectuada por contrastação do ANCP ASB IL-11 núcleos +núcleos/folículos + núcleos +núcleos/folículos (%) (%) (%) (%) rdia 17,0 ±6,8 3,1 ±1,4 18,4 ±9,2 5,0 ± 1,2 2o dia 1,9 ±1,3 0,4 ±0,3 10,5 ± 1,0* 2,6 ± 0,31 3o dia 2,4 ±1,7 0,8 ±0,5 7,6 ± 1,92 2,1 ±0,52 4o dia 1,3 + 0,4 0,4 ±0,2 4,2±1,52 1,3 ± 0,42 5o dia 1,7 ±0,4 0,6 ±0,1 10,5 + 11,3 3,3 ±3,4 1 p < 0,01 para o grupo da ASB 2 p <0,05 para o grupo da ASB cada número representa os dados obtidos a partir de 3 animais, à razão de 20 fblículos/animal, para 400-600 núcleos.

Foram observados aumentos significativos do número de mitoses/folículo (2,0 ± 0,5 contra 0,9 ± 0,4, IL-11 vs contraprova, p<0,001) e também do número de mitoses/100 pm de membrana do pavimento epitelial (0,22 ± 0,06 contra 0,10 ± 0,04, p<0,01) no 5o dia após a irradiação, nos murganhos tratados com a IL-11. Os murganhos de contraprova que sobreviveram até ao 9o dia pós-irradiação revelaram números ligeiramente maiores de células foliculares mitóticas, mas o número dessas células era ainda bastante reduzido quando comparado com os murganhos normais ou com os murganhos tratados com a IL-11. O aumento da actividade do ciclo celular a seguir ao tratamento de MC e após a administração de IL-11 foi também caracterizado por contratação com o PC-10 [Hall et al., J. PathoL 162, 285-294 (1990); Zeymer et al, Am. J. Pathol., 141, 685-690 (1992); Garcia et al., Am. J. Pathol., 134, 733-739 (1989)]. O PC-10 é um anticorpo monoclonal dirigido contra o antigénio nuclear das células proliferativas (ANCP) e é um membro da familíã de ciclinas das proteínas nucleares (quadro WI). A administração da IL-11 revelou um aumento de 2 a 5 vezes no número de núcleos de células foliculares que ficam contrastados com o PC-10 entre os dias 2 e 4 a seguir à irradiação. Tomados em conjunto, estes dados demonstram que a administração da IL-11 aos murganhos a seguir a uma lesão grave das células foliculares do intestino delgado acelera a recuperação da estrutura das vilosidades devido presumivelmente a uma maior proliferação das células progenitoras foliculares. EXEMPLO 9 - EFEITO DA 1L-11 SOBRE A PROLFDERACÂO DAS CÉLULAS IEC-6

Num esforço para se determinar se o efeito da EL-11 sobre a recuperação das vilosidades do intestino delgado, observada in vivo, era um efeito directo da IL-11 sobre as células progenitoras foliculares, efectuou-se a incubação de células IEC-6 [Bamard et ai, Proc. Natl. Acad. Sei.. USA, 86. 1578-1582 (1989)], que são células de uma linhagem celular não transformada do folículo do jejuno do rato, com concentrações cada vez maiores de IL-11 (figura 2).

As células IEC-6 obtidas na Colecção Americana de Culturas Tipo [Rockville, MD; CRL 1592] cresceram em Meio de Eagle Modificado por Dulbecco [Gibco] com 10% de soro fetal de vitelo dializado. As células foram estudadas entre a passagem 20 e 35 mediante a incubação de 5 x 104 células/cavidade em placas de 96 cavidades em meios contendo ou não (contraprova) a ILhr-11 na concentração de 5-400 ng/mL. Ao fim de 72 horas de incubação mediu-se a absorvência do formazano reduzido, a 490 nm, utilizando um leitor de placas para o protocolo de EISLE (o mesmo que ELISA), num ensaio não radioactivo de proliferação celular (Cell Titer 96AQ), em conformidade com as instruções do fabricante. As amostras foram preparadas em quadruplicado e foram comparadas entre si por meio do teste t de Student (ver a figura 2 seguinte). Os resultados apresentados são as médias ± D.P. *p<0,05.

Foi detectada uma resposta à dose quando as células JEC-6 subconfluentes foram incubadas com a IL-11, tendo a actividade óptima oconido para a dose de 50 ng/mL. A actividade óptima com a IL-11 foi idêntica à actividade proliferativa induzida pelo factor de crescimento epidermal (FCE), que é um factor de crescimento sobre o qual se sabe que estimula as células IEC-6 [Baliga etal., Biochem. hrt’1-, 20,161-168 (1990)]. Não foi observada nenhuma actividade proliferativa quando a IL-11 foi acrescentada às células IEC-6 depois destas terem chegado à confluência, sugerindo tal facto que houve especificidade do ciclo para o efeito das IL-11 estimulador do crescimento. Assim, a EL-11 tem efeitos proliferativos sobre as células IEC-6. Há inúmeras modificações e variantes da presente invenção que estão contidas na memória descritiva anterior, esperando-se que sejam evidentes para um especialista na matéria Pressupõe--se que tais modificações e alterações respeitantes a composições e a processos da presente invenção estão abrangidas no âmbito das reivindicações anexas.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS (1) INFORMAÇÃO GERAL: (i) REQUERENTE: Genetics Institute, Inc., 87 CambridgePark Drive,

Cambridge, MA 02140, E.U.A. (ii) TÍTULO DA INVENÇÃO: “Método para o tratamento de lesões ou de diminuições celulares” (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 4 (iv) ENDEREÇO PARA CORRESPONDÊNCIA: (A) ENDEREÇO: Howson and Howson (B) RUA: Spring House Corporate Cntr, P.O. Box 457 (C) CIDADE: Spring House (D) ESTADO: Pennsylvania (E) PAÍS: E.U.A. (F) CÓDIGO POSTAL: 19477 (v) FORMA LEGÍVEL POR COMPUTADOR: (A) SUPORTE: disquete

(B) COMPUTADOR: CP compatível com IBM

(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) PROGRAMA INFORMÁTICO: Patentln Release #1.0, Versão #1.25 (vi) DADOS ACTUAIS DO PEDIDO: (A) NÚMERO DO PEDIDO: (B) DATA DE DEPÓSITO: (C) CLASSIFICAÇÃO:

46 (vii) DADOS ANTERIORES DO PEDIDO: (A) NÚMERO DO PEDIDO: US 07/941 372 (B) DATA DE DEPÓSITO: 02-SET-1992 (viii) INFORMAÇÃO SOBRE O REPRESENTANTE/AGENTE: (A) NOME: Bak, Mary E. (B) NÚMERO DO PEDIDO: 31 215 (C) REFERÊNCIA/NÚMERO DO PROCESSO: IND1 Apct (ix) INFORMAÇÃO PARA TELECOMUNICAÇÕES: Φ (A) TELEFONE: (215) 540-9206 (B) TELEFAX: (215) 540-5818 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 1: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 977 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: desconhecida φ (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (ix) PARTICULARIDADE:

(A) NOME/CÓDIGO: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 70.666 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 1: AGCTGGGAAG GGTTAAAGGC CCCCGGCTCC CTGCCCCCTG CCCTGGGGAA 50 OCOCIOGCXX TGOGGGGAC AIG AAC TCT GIT TOC Q3C CIG GIC C1G 96

Met Asn Cis Vai (is Aig Lai Vai Leu 1 5 GTC GIG CTC /VX CIG TOG CCA GAI ACA OCT GIC OOC OCT GOG 138

Vai Vai Leu Ser Leu Trp Pro Asp Thr Ala Vai Ala Pro GS 10 15 20 "7<f OCA OCA GCT GGC OOC CCT OGA GIT TOC OCA GAC OCT OGG GGC 180 Pro Pro Pro GS Pro Pro Arg Vai Ser Pro Asp Pro Arg Ala 25 30 30 GAG CIG GAC AGC AGC GIG CIC CIG ACC CGC TOT CIC CIG GOG 222 Gkl Leu Asp Ser Thr Vai Leu Leu Thr Aig Ser Leu Leu Ala 40 45 50 GAC AOG OGG CAG CIG GCT GCA CAG CIG AGG GAC AAA TIC OCA 264 Asp Thr Arg Gki Leu Ala Ala Gki Leu Arg Asp Lis Phe Pto 55 60 65 GCT GAC GQG GAC CAC AAC CIG GAT TOC CIG CGC ACC CIG GCC 306 Ala Asp Gfi Asp m Asn Leu Asp Ser Leu Pto Thr Leu Ala 70 75 ATO AGI GOG GQG GCA CIG GGA GCT CTA CAG CIC GCA GGT GIG 348 Met Ser Ala Gli Ala Leu Gfi Ala Leu On Leu Pro Gfi Vai 80 85 90 CIG ACA AGG CIG OGA GOG GAC CTA CIG TOC TAC CIG OGG CAC 390 Leu Thr Aig Leu Aig Ala Asp Leu Leu Ser Trr Leu Alg Hs 95 100 105 GIG CAG TOG CIG OOC OGG GCA GGT GGC TCT TOC CIG AAG ACC 432 Vd Gin Trp Leu Arg Arg Ala Gfi Gfi Ser Ser Leu Lis Thr 110 115 120 CIG GAG ar GAG CIG GGC AGC CIG CAG GCC OGA CIG GAC CGG 474 Leu Ou Pro Ou Leu G6 Thr Leu Gki Ala Arg Leu Asp Alg 125 130 135 CIG CIG CGC OGG CIG CAG CIC CIG ATO TOC CGC CIG GOC CIG 516 Leu Leu Aig Aig Leu On Leu Leu Met Ser Arg Leu Ala Leu 140 145 COC CAG OCA COC OOG GAC OOG OOG GOG OOC OOG CIG GGG OOC 558 Pro On Pro Pro Pro Asp Pro Pro Ala Pro Pro Leu Ala Pro 150 155 160 COC TOC TOA GGC TGG GGG GGC ATO AGG GOC GOC CAC GOC ATO 600 Pro Ser Ser Ala Tip Gfi Gfi De Arg Ala Ala Hs Ala De 165 170 175 CIG GUU GGG CIG CAL CIG ACA C1T GAC TGG GOC GIG AGG GGA 642 Leu Gli Gli Leu Hs Leu Thr Leu Asp Tip Ala Vai Alg Gli 180 185 190 CIG CIG CIG CIG AAG act OGG CIG TGACCCGAGG CCCAGAGCCA 686 Leu Leu Leu Leu Lis Thr Arg Leu 195 CCACCGTCCT TCCAAAGCCA CATCTTATTT ATTTATTTAT TTCGGTACTG 736 GGGGCGAAAC AGCCAGGTGA TCCCCCTGCC TTTAGCTCCC CCTAGTT AGA 786 GACAGTCCTT CCGTGAGGCT GGGGGGCATC TGTGCCTTAT TTATACTTAT 836 TTATTTCAGG AGCGGGGGTG GGCTCCTGGG TCCCCGAGGA GGAGGGAGCT 886 GGGGTCCCGG ATTCTTGTGT CCACAGACTT CTGCCCTGGC TCCTCCCCCT 936 CGAGGCCTGG GCAGGAATAC ATACTATTTA TTTAGAGCT C 977 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:2: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 199 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:2:

Met Asn Cis Vai Cis Arg Leu Vai Leu Vai Vai Leu Ser Leu Trp 1 5 10 15 Pro Asp Thr Ala Vai Ala Pro Gli Pro Pro Pro Gli Pro Pro Arg 20 25 30 Vai Ser Pro Asp Pro Arg Ala Glu Leu Asp Ser Thr Vai Leu Leu 30 40 45 Thr Arg Ser Leu Leu Ala Asp Thr Aig Gin Leu Ala Ala Gin Leu 50 55 60 Aig Asp Lis Phe Pro Ala Asp Gli Asp Hs Asn Leu Asp Ser Leu 65 70 75 Pro Thr Leu Ala Met Ser Ala d Ala Leu Gli Ala Leu Gin Leu 80 85 90 Pro C3i Vai Leu Thr Arg Leu Aig Ala Asp Leu Leu Ser Tír Leu 95 100 105 Arg Hs Vai Gin Trp Leu Aig Arg Ala Gli GS Ser Ser Leu Lis 110 115 120 Thr Leu Ou Pro Ou Leu Gti Thr Leu Gn Ala Arg Leu Asp Arg 125 130 135 Leu Leu Arg Arg Leu Gbi Leu Leu Met Ser Arg Leu Ala Leu Pro 140 145 150 Gin Pro Pro Pro Asp Pro Pro Ala Pro Pro Leu Ala Pro Pro Ser 155 160 165

49

Ser Ala Tip GK O 170 Be Arg Ala Leu Ilis Leu Thr Leu 185 Asp Tip Ala lis Ihr Aig Leu

Ala His 175 Ala Be Leu OS GS 180 Vai Aig 190 Gfi Leu Leu Leu Leu 195 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:3: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 3632 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (ix) PARTICULARIDADE:

(A) NOME/CÓDIGO: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 2242...3132 (ix) PARTICULARIDADE: (A) NOME/CÓDIGO: particularidade misc (B) LOCALIZAÇÃO: 2242...2568 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: /produto= “proteína tiorredoxina de E. coli” /nota= “Lim et ai, J. Bacteriol., 163:311-316 (1985)” (ix) PARTICULARIDADE:

(A) NOME/CÓDIGO: RBS (B) LOCALIZAÇÃO: 2222...2241 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: /nome_padrão= “sequência de ligação robossómica” /nota= “Dunn e Studier, J. Mol. Biol , 166:477-535 (1983)” < {? /Η 50 (ix) PARTICULARIDADE: (A) NOME/CÓDIGO: particularidade_misc (B) LOCALIZAÇÃO. 2061.. 2221 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: /função= “promotor leftward do bacteriófago lambda” /nota= “Sanger etal., J. Mol. Biol., 162:729-773 (1982)” (ix) PARTICULARIDADE: (A) NOME/CÓDIGO: particularidademisc (B) LOCALIZAÇÃO: 1.. .2060 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: /função= “derivado do plasmídeo pUC-18” /nota= “Norrander et al., Gene, 26:101-106 (1983)” (ix) PARTICULARIDADE: (A) NOME/CÓDIGO: particularidade misc (B) LOCALIZAÇÃO: 2569...2583 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: /função= “péptido spacer hidrofilico flexível e curto” (ix) PARTICULARIDADE: (A) NOME/CÓDIGO: particularidade misc (B) LOCALIZAÇÃO. 2584.2598 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: /função= “local de reconhecimento da clivagem da enterocinase” /nota= “Maroux et al., J. Biol. Chem., 246:5031-5039 (1971)” (ix) PARTICULARIDADE: (A) NOME/CÓDIGO: particularidade misc (B) LOCALIZAÇÃO. 2599 .3132 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: /produto= “forma modificada da IL11 humana madura” /nota= “Paul et al,, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87:7512-7516 (1990)” (ix) PARTICULARIDADE: (A) NOME/CÓDIGO: particularidade misc (B) LOCALIZAÇÃO: 3133...3159 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: /íimção= “sequência ligadora contendo locais de restrição da endonuclease” /nota= “Takagi etal., Nucl. Acids Res., 13:2063-2074 (1985)” (ix) PARTICULARIDADE: (A) NOME/CÓDIGO: particularidademisc (B) LOCALIZAÇÃO: 3233...3632 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: /função= “sequências de ADN derivadas de pUC-18” (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ Π> NO:3. GACGAAAGGG CCTCGTGATA CGCCTATm TATAGGTTAA TGTCATGATA 50 ATAATGGTTT CITAGACGTC AGGTGGCACI' ITíCGGGGAA ATGTGCGCGG 100 AAGCCCTATT τσπτΑτητ TCTAAATACA TTCAAATATG TATCCGCICA 150 TGAGACAATA ACCCTGATAA ATGCTTCAAT AATATTGAAA AAGGAAGAGT 200 ATGAGTATIC AACATTTCCG TGTCGCCCTT ATTCCCmT TTGCGGCATT 250 TTGCCTTCCT GTTTTTGCTC ACCCAGAAAC GCTGGTGAAA GTAAAAGATG 300 CTGAAGATCA GTTGGGTGCA CGAGTGGGTT ACATCGAACT GGATCTCAAC 350 AGCGGTAAGA TCCTTGAGAG TT1TCGCCCC GAAGAACGTT TTCCAATGAT 400 GAGCACmT AAAGTTCTGC TATGTGGCGC GGTATTATCC CGTATTGACG 450 CCGCGCAAGA GCAACTCGGT CGCCGCATAC ACTATTCTCA GAATGACITG 500 GTTGAGTACT CACCAGTCAC AGAAAAGCAT CITACGGATG GCATGACAGT 550 AAGAGAATTA TGCAGTGCTG CCATAACCAT GAGTGATAAC AC1GCGGCCA 600 ACITACTTCT GACAACGATC GGAGGACCGA AGGAGCTAAC CGLT1T1TIG 650 CACAACATGG GGGATCATGT AACrCGCdT GATCGTTGGG AACCGGAGCT 700 GAATGAAGCC ATACCAAACG ACGAGCGTGA CACCACGATG CCTGTAGCAA 750 TGGCAACAAC GTTGCGCAAA CTATTAACTG GCGAACTACT TACTCTAGCT 800 TCCCGGCAAC AATTAATAGA CTGGATGGAG GCGGATAAAG TTGCAGGACC 850 ACTTCTGCGC TOGGCCCITC CGGCTGGCTG GTTTATTGCT GATAAATCTG 900 GAGCCGGTGA GCGTGGGTCT CGCGGTATCA TTGCAGCACT GGGGCCAGAT —----^ .V V. 52- 950 GGTAAGCCCT CCCGTATCGT AGÍTATCTAC ACGACGGGGA GTCAGGCAAC 1000 TATGGATGAA CGAAATAGAC AGATCGCIGA GATAGGIGCC TCACTGATTA 1050 AGCATTGGTA ACIGTCAGAC CAAGTITACT CATATATACT TTAGATTGAT 1100 TTAAAACTTC ΑΤΠΤΓΑΑΤΤ TAAAAGGATC TAGGTGAAGA TOCTiTÍTGA 1150 TAATCTCATG ACCAAAATCC CTTAACGTGA GTTTTCGTTC CACTGAGCGT 1200 CAGACCXXGT AGAAAAGATC AAAGGATCIT CITGAGATCC TTTITTTCTG 150 CGCGTAATCT GCTGCTTGCA AACAAAAAAA CCACCGCTAC CAGCGGTGGT 1300 TTGTITGCCG GATCAAGAGC TACCAACTCT TTTKXXjAAG GTAACTGGCT 1350 TCAGCAGAGC GCAGATACCA AATACTGTCC TTCTAGTGTA GCCGTAGTTA 1400 GGCCACCACT TCAAGAACTC TGTAGCACCG CCTACATACC ICGCTCTGCT 1450 AATCCTGITA CCAGTGGCTG CTGCCAGTGG CGATAAGFTCG TGTCTTACCG 1500 GGITGGACTC AAGACGATAG TTACCGGATA AGGCGCAGCG GTCGGGCIGA 1550 ACGGGGGGTT CGTGCACACA GCCCAGCTTG GAGCGAACGA CCTACACOGA 1600 ACTGAGATAC CTACAGCGTG AGCATTGAGA AAGCGCCACG CTTCCCGAAG 1650 GGAGAAAGGC GGACAGGTAT (XGGTAAGCG GCAGGGTCGG AACAGGAGAG 1700 CGCACGAGGG AGCTTCCAGG GGGAAACGCC TGGTATCTrr ATAGTCCTGT 1750 CGGGTTTCGC CACCIGTGAC ITGAGCGTCG ATmTGTGA TGCTOGTCAG 1800 GGGGGCGGAG CCTATGGAAA AACGCCAGCA ACGCGGCCIT TTTACGGTTC 1850 CTGGCCITn GCrGGCCnr TGCTCACATG TicrmxrrG CGTTATCXjCC 1900 TGATTCTGTG GATAACCGTA TTAÍXXjGCTT TGAGTGAGCT GATACCGCTC 1950 GCCGCAGCGG AACGACCGAG CGCAGCGAGT CAGIGAGCGA GGAAGCGGAA 2000 GAGCGCCCAA TACGCAAACC Gccrcrcccc GCGCGTTGGC CGATTCATTA 2050 ATGCAGAATT GATCTCTCAC CTACCAAACA ATGCCCCCCf GCAAAAAATA 2100 AATTCATATA AAAAACATAC AGATAACCAT CTGCGGTGAT AAATTATCTC 2150 TGGCGGTGTT GACATAAATA CCACTGGCGG TGATACTGAG CACATGAGCA 2200 GGACGCACTG ACCACCATGA ATTCAAGAAG GAGATATACA T ATG AGC Met Ser 1 2247 GAT AAA ATT Asp Lis De 5 ATT CAC CIO ACT GAC Be Hs Leu Ur Asp 10 GAC AGI' TIT Asp Ser Phe GAC AOG GAT Asp Ihr Αφ 15 2289 GTA CTC AAA Vai Leu Lis GCG GAC GGG GCG ATC Ala Asp Gli Ala De 20 CTC GTC GAT Leu Vai Asp 25 TTC TGG GCA Phe Tip Ala 30 2331 ::-v f / } sí ^13 GAG TGG TGC GGT CCG TGC AAA ATG ATC GCC CCG ATT CIG GAT 2373 Giu Tip Os d Pro Os Lis Met De Ala Pro De Leu Asp 35 40 GAA ATC GCT GAC GAA TAT CAG GGC AAA CIG ACC GIT GCA AAA 2415 Gíu De Ala Asp Ou Ur Gin d Lis Leu Thr Vai Ala lis 45 50 55 CIO AAC ATC GAT CAA AAC CCT GGC ACT GOG COG AAA TAT GGC 2457 Lai Asn De Asp Gin Asn Pm Gfi Thr Ala Pro lis Tir d 60 65 70 ATC CGT GGT ATC CCG ACT CIG CIG CIG TIC AAA AAC GGT GAA 2499 De Alg GD De Pro Thr Leu Leu Leu Phe lis Asn d Ou 75 80 85 GTG GOG GCA ACC AAA GIG GGT GCA CTG TCT AAA GGT CAG TIG 2541 Vai Ala Ala Thr Lis Vai GD Ala Leu Ser Lis Oi Gin Leu 90 95 100 AAA GAG TIC CIC GAC GCT AAC CIG GCC GGT TCT GGT TCT GGT 2583 Tis Gu Phe Leu Asp Ala Aai Leu Ala Gii Ser GS Ser d 105 110 GAT GAC GAT GAC AAA GGT CCA CCA CCA GGT OCA CCT OGA GIT 2625 Asp Asp Asp Asp Lis d Pro Pro Pro 03» Pro Pro A® Vai 115 120 125 TCC OCA GAC OCT CGG GGC GAG CIG GAC AGC ACC GIG CIC CIG 2667 Ser PR) Asp Rd Alg Ala Ou Leu Asp Ser Thr Vai Leu Leu 130 135 140 AOC CGC TCT CTC CIG GOG GAC ACC CGG CAG CIG GCT GCA CAG 2709 Thr Aig Ser Leu Leu Ala Asp Thr A® Gin Leu Ala Ala Gin 145 150 155 CIO AGG GAC AAA TIC CCA GCT GAC GGG GAC CAC AAC CIG GAT 2751 Leu A® Αφ lis Phe Pro Ala Asp d Asp His Asn Leu Asp 160 165 170 TCC CIG COC ACC CIG GCC A1G AGT GOG GGG GCA CIG GGA GCT 2793 Ser Leu Pro Thr Leu Ala Met Ser Ala GS Ala Leu d Ala 175 180 CTA CAG CTC CCA GGT GTG CTG ACA AGG CIG OGA GOG GAC CTA 2835 Leu Gín Leu PR) Qi Vai Leu Thr A® Leu A® Ala Asp Leu 185 190 195 CFG TCC TAC CTG CGG CAC GIG CAG TGG CIG CGC CGG GCA GGT 2877 Leu Ser Tr Leu A® His Vai Gn Tip Leu A® A® Ala d 200 205 210 GGC TCT TCC CIO AAG ACC CIG GAG COC GAG CIG GGC ACC CIG 2919 d Ser Ser Leu Lis Ihr Leu Glu Pro Glu Leu GS Thr Leu 215 220 225 54 CAG GCC CGA CIO GAC CGG CIO CIG OGC CGG CTG CAG CIC CIG Gn Ala Aig Leu Asp Aig Leu Leu Aig Arg Leu Qn Leu Leu 230 235 240 ATG TCC OGC CIO GCC CIO CCC CAG CCA CCC CCG GAC CCG CCG Met Ser Aig Leu Ala Leu Pro Gin Pro Pro Pro Asp Pro Pro 245 250 GCG coc CCG CTG GCG CCC COC TCC TCA GCC TGG GGG GGC ATC Ala Pro Pro lai Ala Pno Pro Ser Ser Ala Tip Gfi C3i De 255 260 265 AGG GCC GCC CAC GCC ATC CIG GGG GGG CIG CAC CIG ACA CIT Arg Ala Ala Hs Ala De Leu Gfi C3i Leu Hs Leu Thr Leu 270 275 280 GAC TGG GCC GIG AGG GGA CIG CIG CIG CIG AAG ACT CGG CIG Asp Tip Ala Vai Aig Gti Leu Leu Leu Leu Lis Thr Arg Leu 285 290 295

TGAAAGCTTA TCGATACCGT CGACCTGCAG TAATCGTACA GGGTAGTACA AATAAAAAAG GCACGTCAGA TGACGTGOCT TITITCITGT GAGCAGTAAG CTTGGCACIG GCCGTCGTTT TACAACGTCG TGACTGGGAA AACCCTGGCG TTACCCAACT TAATCGCCTT GCAGCACATC CCOCnTCGC CAGCIGGCGT AATAGCGAAG AGGCCCGCAC CGATCGCCCT TCCCAACAGT TGCGCAGCCT GAATGGCGAA TGGCGCCIGA TGCGGTATTT TCTCCITACG CAICIGTGCG GTATTTCACA CCGCATATAT GGTGCACrCT CAGTACAATC TGCTCTGATG CCGCATAGTT AAGGCAGCCC CGACACCCGC CAACACCCGC TGACGCGCCC TGACGGGCTT GTCTGCTOCC GGCATOCGCT TACAGACAAG CIGIGACCGi CTCOGGGAGC TGCATGTGTC AGAGGTTTTC ACOGTCATCA CCGAAACGCG

CGA (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 4 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 296 aminoácidos (B) ΤΓΡΟ: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:4 2961 3003 3045 3087 3129 3179 3229 3279 3329 3379 3429 3479 3529 3579 3629 3632 55

Met Ser Asp Lis De De Hs Leu Thr Asp Asp Ser Phe Asp Thr 1 5 10 15 Asp Vai Leu Lis Ah Asp GB Ah De Leu Val Asp Phe Tip Ah 20 25 30 Ou Τφ Cis ca Pro Cis Tis Met De Ah Pro De Leu Asp Glu 35 40 45 lie Ala Asp Ou lír On GB Lis Leu Thr Val Ah Lis Leu Asn 50 55 60 De Asp On Asn Pro GB Thr Ah Pro Tis Tír GB De Aig GB 65 70 75 De Pro Thr Leu Leu Leu Phe Lis Asn GB Glu Val Ah Ah Thr 80 85 90 Lis Vai Gfi Ah Leu Ser Lis GB On Leu Lis Glu Phe Leu Asp 95 100 105 Aia Asn Leu Ah GB Ser GB Ser GB Asp Asp Asp Asp Lis GB 110 115 120 Pro Pro Pro GB Pro Pro Aig Vál Ser Pro Asp Pro Arg Ah Glu 125 130 135 Leu Asp Ser Thr Vai Leu Leu Thr Aig Ser Leu Leu Ah Asp Thr 140 145 150 Arg On Leu Ah Ah Gin Leu Arg Asp Lis Phe Pro Ah Asp ca 155 160 165 Asp Ks Asn Leu Asp Ser Leu Pro Thr Leu Ah Met Ser Ah GB 170 175 180 Ala Leu GB Ah Leu GSn Leu Pro GB Val Leu Thr Arg Leu Arg 185 190 195 Ala Asp Leu Leu Ser Τη- Leu Aig His Val On Tip Leu Aig Aig 200 205 210 Ala Gli GB Ser Ser Leu Lis Thr Leu CHu Pro Glu Leu GB Thr 215 220 225 Leu Gn Ala Aig Leu Asp Arg Leu Leu Arg Aig Leu Gfa Leu Leu 230 235 240 Met Ser Aig Leu Ah Leu Pro Gin Pro Pro Pro Asp Pro Pro Ah 245 250 255 Pro Pro Leu Ah Pro Pro Ser Ser Ah Tip GB GB De Arg Ah 260 265 270 Ala His Ah De Leu GB ca Leu His Leu Thr Leu Asp Tip Ah 275 280 285 Val Arg ca Leu Leu Leu Leu Lis Thr Aig Leu 290 295 Lisboa, 5 de I4àrço de 2001 Agonia Oficia í da Pr oppá adç Industriai JC )SÉ B E SAfV IPAXO

Claims

1 Reivindicações 1. Utilização de uma citoquina seleccionada entre o conjunto constituído por interleucina 11, interleucina 6, factor inibidor da leucemia, oncostatina M e factor neurotrófico ciliar, para a preparação de uma composição farmacêutica para reforçar o crescimento de uma população de células do epitélio intestinal.

2. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que a referida população de células é seleccionada entre o conjunto constituído por células epiteliais do intestino delgado e células epiteliais de revestimento do intestino grosso e do estômago.

3. Utilização de uma citoquina seleccionada entre o conjunto constituído por interleucina 11, interleucina 6, factor inibidor da leucemia, oncostatina M e factor neurotrófico ciliar, para a preparação de uma composição farmacêutica para estimular o crescimento das células do epitélio intestinal num paciente onde tenham ocorrido lesões ou diminuições das populações de células do epitélio intestinal.

4. Utilização de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 3, em que a referida composição farmacêutica incorpora também pelo menos mais uma citoquina.

5. Utilização de uma citoquina seleccionada entre o conjunto constituído por interleucina 11, interleucina 6, factor inibidor da leucemia, oncostatina M e factor neurotrófico ciliar, para a preparação de uma composição farmacêutica que permite manter uma população de 2 células de epitélio intestinal exposta a um agente citotóxico, em que o referido agente dtotóxico é preferencialmente o resultado de quimioterapia, radioterapia ou uma doença.

6. Utilização de acordo com uma qualquer das reivindicações 3 ou 4, em que as referidas lesões ou diminuições são provocadas por um agente seleccionado entre o conjunto constituído por doenças, infecções, traumas, choques, quimioterapia e radioterapia.

7. Utilização de acordo com uma qualquer das reivindicações 3 a 6, em que as referidas populações em que ocorreram lesões ou diminuições são seleccionadas entre o conjunto constituído por células do epitélio intestinal, de preferência as células epiteliais do intestino delgado, e células epiteliais de revestimento do intestino grosso è do estômago.

8. Utilização de acordo com a reivindicação 7, em que a referida citoquina é a interleucina 11.

9. Utilização de acordo com a reivindicação 7, em que a referida citoquina é a IL-6.

10. Utilização de acordo com a reivindicação 7, em que a referida população de células é constituída pelas células epiteliais do intestino delgado.