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PT2274414E - Tricoderma atroviride sc1 para a luta biológica contra as doenças fúngicas das plantas - Google Patents

Tricoderma atroviride sc1 para a luta biológica contra as doenças fúngicas das plantas Download PDF

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Publication number
PT2274414E
PT2274414E PT87637856T PT08763785T PT2274414E PT 2274414 E PT2274414 E PT 2274414E PT 87637856 T PT87637856 T PT 87637856T PT 08763785 T PT08763785 T PT 08763785T PT 2274414 E PT2274414 E PT 2274414E
Authority
PT
Portugal
Prior art keywords
soil
sci
atroviride
plant
trichoderma
Prior art date
Application number
PT87637856T
Other languages
English (en)
Inventor
Ilaria Pertot
Claudia Maria Longa
Daniele Prodorutti
Lorenza Michelon
Federica Savazzini
Original Assignee
Trentino Sviluppo Spa
Edmund Mach Fond
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Trentino Sviluppo Spa, Edmund Mach Fond filed Critical Trentino Sviluppo Spa
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Description

DESCRIÇÃO
TRICODERMA ATROVIRIDE SCI PARA A LUTA BIOLÓGICA CONTRA AS DOENÇAS FÚNGICAS DAS PLANTAS
Campo da invenção 0 campo da presente invenção é o controlo biológico de doenças de plantas causadas por fungos patogénicos por um agente de biocontrolo, representado por uma nova estirpe de Trichoderma atroviride .
Antecedentes da invenção A substituição ou a redução de fungicidas químicos tem sido conseguido através do uso de fungicidas de base biológica, uma abordagem que cai dentro da definição de controlo biológico, tal como proposto por Cook e Baker (1983) : "controlo biológico é a redução da quantidade de inoculo ou atividade de produção de doença dum agente patogénico realizado por ou por intermédio de um ou mais organismos com exceção do homem". Essa definição ampla inclui o uso de variantes menos virulentas do agente patogénico, cultivos mais resistentes do hospedeiro, e antagonistas microbianos "que interferem com a sobrevivência ou atividades patogénicas causadoras de doenças". É necessária uma avaliação mais complexa das interações ambientais, para utilizar esses agentes de biocontrolo (BCA). Na verdade as condições ambientais afetam não só a sobrevivência de BCAs, mas também a sua eficácia contra os agentes patogénicos (Paulitz, 2000). BCAs que são mais flexíveis em termos de adaptação ambiental podem ser mais facilmente desenvolvidos em produtos comerciais, como as suas aplicações e mercados-alvo podem ser maiores do que as de BCAs que exiqem condições ambientais específicas. A seleção de antagonistas de estirpes de Trichoderma com maior tolerância a condições ambientais adversas, pode aumentar a fiabilidade de programas de biocontrolo baseados em Trichoderma (Kredics et al. , 2000). É também importante notar que os BCA mais eficazes para o uso contra os agentes patógenos de plantas são aqueles que têm uma melhor tolerância ao stress do que os agentes patogénicos alvo (Kredics et al, 2000; 2004). A Trichoderma é um gÉnero cosmopolita, que pode colonizar solos, rizosfera e filoesferas. Espécies de Trichoderma são frequentemente encontradas em decomposição em material de madeira e produtos hortícolas. Vários Trichoderma isolados são produtores economicamente importantes de enzimas industriais.
As estirpes de Trichoderma já foram utilizadas como agentes de biocontrolo contra vários agentes patogénicos de plantas e muito poucos têm sido desenvolvidos para uso como produtos de biocontrolo comerciais (ou seja, Trichoderma harzianum, conhecido como Trichodex®) para culturas de campo e estufa (Elad, 2000; Harman, 2000) .
No entanto existe uma grande variabilidade em termos de atividade de controlo biológico, especificidade, mecanismo de ação, produção de metabólitos e sobrevivência no solo ou na planta entre as espécies de Trichoderma, que afetam o seu uso como BCAs (Benitez et al., 2004). Além disso ainda há várias patologias importantes, tais como as causadas pelo género Armillaria na vinha para o qual os agentes de biocontrolo totalmente eficazes nem foram isolados nem caracterizados.
Breve descrição dos desenhos
Figura 1. Crescimento radial de Trichoderma atroviride SCI a diferentes temperaturas. Trichoderma atroviride SCI foi cultivado em agar de dextrose de batata (PDA) e incubado a diferentes temperaturas: 10 (0), 15 (·) , 20 () , 25 (Δ) e 30°C (x) . Não houve crescimento em -1, 5, 37 ou 40°C. Os pontos de dados são meios de dez repetições. Valores seguidos pela mesma letra não são significativamente diferentes (P do.05) de acordo com o teste de Tukey. O período antes do início do crescimento (período de latência) foi de 1 dia a 20, 25 e 30°C, 2 dias a 15°C e 3 dias a 10°C.
Figura 2. Efeito do pH no crescimento radial de Trichoderma atroviride SCI. O crescimento foi realizado em agar de dextrose de batata (PDA) a diferentes níveis de pH. pH 3 (Δ), 4 (□), 5 (A), 6 ( + ), 7 (·), 8 (0), 9 (x) e 10 () . Os pontos de dados são meios de dez repetições. Valores seguidos pela mesma letra não são significativamente diferentes (P d 0,05) de acordo com o teste de Tukey.
Figura 3 . Efeito da atividade da água na taxa de crescimento de Trichoderma atroviride SCI. Trichoderma atroviride SCI foi cultivado em agar de dextrose de batata modificado com glicerol com os níveis de atividade de água de 0, 998 (A), 0, 990 () , 0, 980 (Δ) , 0, 960 (x), 0, 940 (·) e 0, 910 (o) . Os pontos de dados são meios de dez repetições. Valores seguidos pela mesma letra não são significativamente diferentes (P d 0,05) de acordo com o teste de Tukey. O período antes do início do crescimento (período de desfasagem) foi um dia em 0,998, 0,990 e 0,980, 2 dias a 0,940 e de 4 dias a 0,910.
Figura 4. Amplificação múltipla ech42 e tga3. A amplificação foi efetuada utilizando a sonda específica ech42 () e a sonda geral tga.3 (o) de ADN de Trichoderma atroviride SCI puro. As duas curvas de diluição sobrepõem-se e têm a mesma eficiência, coeficiente de determinação (R2) e declive.
Figura 5. Recuperação de ADN de Trichoderma atroviride SCI por PCR em Tempo Real. A quantidade de ácido nucleico é expresso como o número de cópias de genomas haplóides num grama de solo inoculado com uma quantidade conhecida de conídios. 0 desvio-padrão (%) foi calculado a partir de seis quantificações independentes.
Figura 6. Sobrevivência de Trichoderma atroviride SCI na folha de morango avaliada como unidades formadoras de colónias (UFC) . As folhas foram inoculadas no dia 0 por pulverização de uma suspensão de conídios em água (106 UFC· mL-1) . Os pontos de dados representam as médias de dez repetições. Os dados foram transformados por log (x) . As barras de erro representam os desvios padrão dos meios.
Figura 7. Sobrevivência de Trichoderma atroviride SCI em microcosmos estáticos de solo. 0 fungo foi aplicado a uma taxa de 106 UFC -g-1 solo no dia 0 a três diferentes solos estéril (a) e não-estéril (b): Solo 1 (·) Solo 2 (□) e solo 3 (Δ) , pontos de dados representam as médias das cinco repetições e foram transformados por log (x). Letras diferentes para cada dia indicam valores que são significativamente diferentes (P < 0,05) de acordo com o teste de Tukey.
Figura 8. Efeito do Trichoderma atroviride SCI sobre a gravidade da infeção de oídio. Plantas de pepino (painel A) e curgete (painel B) artificialmente inoculadas com conídios Podosphaera xanthii e comparação com não dois padrões de biocontrolo tratado e enxofre (Trichoderma harzianum T39-nome comercial Trichodex® - e T. atroviride F122). As avaliações foram feitas duas semanas após a inoculação de pontuação de severidade (percentagem de tecido foliar infetado). Cinco repetições (plantas) por tratamento foram classificados. Colunas com a mesma letra não são significativamente diferentes de acordo com a HSD de Tukey (P <0.05). Para a inoculação, cerca de 5 ml de uma suspensão aquosa de conidios (107conidios ml-1) foram pulverizadas sobre cada planta. As aplicações diárias foram iniciadas 12 horas após a inoculação.
Figura 9. Eficácia de Trichoderma atroviride SCI sobre o crescimento dos três principais agentes causais da doença de Esca. (Phaeomoniella chlamydospora: painel A; Phaeoacremonium aleophilum: painel B; Fomitiporia mediterrânea: painel C) . A eficácia de controlo foi calculada de acordo com a fórmula: [ (CT)/C] xlOO, em que C é o crescimento do agente patogénico sem o tratamento e T é o crescimento com o tratamento por Trichoderma atroviride SCI. A inoculação de agentes causais Esca e T. atroviride SCI foram feitas, em agar de dextrose de batata em placas de Petri. Os gráficos representam a média de cinco repetições (placas de Petri).
Figura 10. Crescimento micelar de Armillaria mellea e Armillaria gallica (agentes causais da podridão da raiz) na presença de Trichoderma atroviride SCI e sem (sem tratamento). A experiência Efeito de Trichoderma harzianum T39 - Trichodex® - é aqui apresentada como comparação padrão. 0 crescimento é expresso como a média de diâmetro de cinco repetições cultivadas em pedaços de madeira em PDA em placas de Petri a 20°C.
Figura 11. Percentagem de plantas de morango infetadas com mellea Armillaria e A. gallica. (mortas) após o tratamento do solo. 0 efeito de Trichoderma atroviride SCI foi comparado com o não tratado. Trichoderma harzianum T39 -Trichodex® - foi usada como comparação para o A. gallica e T. atroviride F122 é usado como comparação para A. mellea. Os valores são percentagens calculadas em repetição de 10 plantas.
Resumo da invenção
Uma forma de realização da presente invenção é uma Trichoderma atroviride SCI, CBS n° 122089, como um agente de controlo biológico, isto é, para o tratamento de doenças fúngicas das plantas. A segunda forma de realização da presente invenção é uma composição agrícola que compreende a Trichoderma atroviride SCI como o princípio ativo numa quantidade eficaz As composições da presente invenção podem compreender ainda um segundo agente de controlo biológico e/ou um aditivo, um emulsionante, um nutriente para as plantas, um agente molhante, um micronutriente para plantas ou um substrato, em que o referido substrato é selecionado a partir do grupo que consiste em: um meio de cultura nutriente, um cereal ou um seu derivado, um corretor, um vegetal ou uma parte do mesmo, turfa, madeira ou um pedaço dela, argila ou cascas.
Uma outra forma de realização é um método para o tratamento ou prevenção de uma doença de plantas causada por um fungo patogénico selecionado a partir do grupo dos referidos causando: doenças da madeira (Phaeomoniella chlamydospora, Phaeoacremonium aleophilum e Fomitiporia mediterrânea), doenças foliares (o agente causal do oídio Podosphaera xanthii), doenças de frutas e flores (Botrytís cinerea) e doenças radiculares causadas pelo género Armillaria (Armillaria mellea e A. gallica). 0 tratamento pode ser realizado diretamente sobre a planta ou sobre uma parte da planta, ou indiretamente através da aplicação de substratos enriquecido de Trichoderma atroviride SCI, CBS n° 122089 no solo ou sobre ele, na proximidade da planta. As plantas que beneficiam deste tratamento são preferencialmente selecionadas a partir do grupo que consiste em: Cucurbitaceae, Rosaceae, Vitaceae, Crucifereae, Compositae, Ubelliferae, Solanaceae e Liliaceae. Outras formas de realização da presente invenção são substratos compreendendo uma quantidade eficaz de o microrganismo Trichoderma atroviride SCI ou tratadas com composições que compreendem uma quantidade eficaz da referida estirpe. Um substrato preferido é representado pela casca ou arroz cozido.
Uma outra forma de realização é representado por um método molecular para a deteção específica de Trichoderma atroviride SCI onde a amplificação paralela do gene endoquitinase 42 (ech42) n° de aceso GenBank AB041753.1 e o gene da subunidade α duma proteína G (tga3) n° de acesso GenBank AF452097.1 é conseguido com conjuntos de iniciadores apropriados e em que são observadas numa amostra compreendendo os referidos dois nucleótidos polimórficos de Trichoderma atroviride SCI na posição 185 e 196 do gene de endoquitinase 42.
Descrição detalhada da invenção
Um objeto da presente invenção é proporcionar um agente de biocontrolo pertencente à espécie Trichoderma atroviride, estirpe SCI, para a supressão do desenvolvimento de doenças fúngicas na parte aérea das plantas, e em raizes.
De acordo com uma modalidade preferida, a Trichoderma atroviride, estirpe SCI, foi depositada em 27 de novembro de 2007, ao abrigo do Tratado de Budapeste na CBS (Centraalbureeau voor Schimmelcultures) sob N° CBS 122089.
De acordo com o aspeto principal da presente invenção a Trichoderma atroviride, estirpe SCI, é proposta para suprimir e prevenir o desenvolvimento de agentes patogénicos de plantas, em particular: podridão de frutas e da raiz, tais como aguelas causadas por Botrytis cinerea e Armillaria spp, oidio, doenças da madeira (doença Esca), de acordo com uma forma de realização preferida, a invenção proporciona um método de supressão ou prevenção do desenvolvimento de doenças provocadas por fungos em plantas, caracterizado por utilizar as composições que compreendem uma quantidade eficaz de Trichoderma atroviride SCI, numa quantidade de pelo menos 102 -103 conidios por ml-1 ou g_1 quando é usada uma composição sólida.
Trichoderma atroviride SCI é um fungo mesófilo como a maioria das Trichoderma spp. (Klein e Eveleingh, 1998) . É capaz de utilizar uma grande variedade de compostos como únicas fontes de carbono e azoto. O crescimento fúngico no meio de cultura é superior com algumas fontes de azoto tais como extrato de Levedura, nitrito, triptona, peptona, glutamina e asparagina ou algumas fontes de carbono, tais como, manose, galactose, sacarose, extrato de malte, celobiose glicose e trealose. T. atroviride SCI sobrevive numa gama de temperatura compreendida entre -1 e 35°C e cresce numa gama de temperaturas compreendidas entre 5 e 30°C. A temperatura ótima de crescimento é de 25°C ± 1°C, embora o crescimento radial dos fungos a 20°C não seja significativamente diferente do crescimento observado a 25°C. A temperatura máxima para a sobrevivência de T . atroviride SCI (30°C) é mais baixa do que a temperatura do corpo humano, o que é uma boa indicação de que este fungo é não patogénico para seres humanos.
Os níveis de tolerância de pH de T. atroviride SCI caem dentro da gama comum das estirpes de Trichoderma, isto é, um intervalo de pH compreendido entre 3 e 10. O limite mínimo de tolerância de atividade da água (aw) de T. atroviride SCI é 0,910. O valor preferido de atividade de água é de 0, 998, o que corresponde a valores elevados de humidade relativa, condições preferidas pela maioria dos agentes patogénicos fúngicos de plantas (90-100%). A Trichoderma atroviride SCI é caracterizada pelas seguintes propriedades: é particularmente ativa contra doenças causadas por Armillaria spp. e contra os agentes causais da "doença esca", para os quais não conhecidos pesticidas químicos eficazes. De acordo com a invenção, o termo Armillaria spp. abrange nomeadamente, Armillaria mellea e Armillaria gallica, o termo "doença esca" cobre os mais importantes agentes patogénicos causadores da doença esca, em particular chlamydospora Phaeomoniella, Phaeoacremonium aleophilum e Fomitiporia mediterrânea. A Armillaria spp. afeta mais de 400 espécies de plantas (culturas e árvores florestais) . Os patogénicos da "Doença Esca" afetam a videira. - é mais eficaz contra oídio (causado pela Podosphaera xanthii) do que outras estirpes Trichoderma conhecidas, tais como Trichoderma harzianum T39 (nome comercial Trichodex®) ou t. atroviride F122 (Longa, 2007) . Oídios são doenças fúngicas causadas por muitas espécies diferentes de fungos na ordem Erysiphales (Spencer, 1978) e causam danos de importância económica, em particular à uva, maçã, morango, culturas hortícolas e frutícolas; - persiste no solo em níveis eficazes por períodos longos (mais de um ano) - pode ser facilmente disperso em vegetais ou partes de madeira, onde sobrevive como um agente antifúngico por mais do que um ano. Vários testes realizados com T. atroviride SCI, que serão melhor descritos na parte experimental, permitem que seja proposto como um agente de controlo biológico ideal para a supressão de doenças fúngicas em plantas.
De acordo com uma forma de realização preferida, a preparação de composições agrícolas de T. atroviride SCI é levada a cabo por inoculação de t. atroviride SCI (poucos esporos lavados a partir de placas de cultura são geralmente suficientes) sobre um substrato nutriente comum em suspensão líquida ou em substrato sólido para se obter pelo menos 102-103 conídios/ml-1 ou g_1 de substrato (concentração ativa). 0 meio líquido ou semissólido mais utilizado compreende: caldo nutritivo, agar de dextrose de batata (PDA) , agar nutriente, agar de extrato de malte, agar de malte, caldo LB e semelhante conhecido pelos especialistas na matéria, onde os fungos são cultivados sob agitação contínua, durante pelo menos 48, de preferência 72 horas, ou até que os conídios sejam produzidos, a uma temperatura ótima de crescimento compreendida entre 20 e 30°C ou de preferência de 22 a 26°C ou a cerca de 25° C ± 1°C, durante pelo menos 48 h. Nestas condições, os primeiros conídios são produzidos após pelo menos 48 horas.
Um substrato sólido preferido compreende um cereal esterilizado (tais como trigo ou arroz cozido), ou farinha de cereais moídos, ou um substrato rico em hidratos de carbono semelhante, onde T. atroviride SCI é inoculado e incubado durante pelo menos uma semana a partir de 20 a 30°C ou de preferência de 22 a 26°C ou cerca de 25°C ± 1°C. Os derivativos de cereais, tais como farinha ou cereais moídos são também adequados.
Tratamento da planta e/ou prevenção é realizado utilizando-se culturas de T. atroviride SCI cultivadas em meios líquidos ou semissólidos ou sobre um substrato sólido e aplicando tal suspensão de T. atroviride SCI para as partes da planta ou aplicando substrato enriquecido com SCI no solo nas proximidades da planta em necessidade dum tal tratamento. O tratamento pode ser realizado mediante a aplicação de composições agrícolas para as plantas, nas folhas das plantas, em feridas feitas durante o corte ou poda, ou para o solo para suprimir o desenvolvimento de doenças fúngicas nas raízes. Os tratamentos são aplicados por pulverização sobre as plantas como um fungicida comum, com uma periodicidade que deve ser adaptada à doença especifica (isto é, antes da infeção, numa fase fenológica especifica das plantas, tais como o transplante, flor, pós-colheita) . 0 tratamento pode também ser pulverizado ou injetado no solo, misturado com o solo em vários substratos e formulações diferentes (isto é, grânulos, misturado com argila ou outros produtos semelhantes, cascas, vegetal ou outros materiais orgânicos ou semelhante ou derivados). Os tratamentos podem ser aplicados durante o período vegetativo da planta ou durante a dormência. 0 tratamento pode ser pulverizado depois da poda ou aplicado diretamente às feridas de poda para evitar infeções. 0 tratamento pode ser aplicado semanalmente ou com maior frequência, bem como uma vez por ano. 0 tratamento pode ser aplicado uma vez (ou seja, o tempo de plantio em solo) ou repetido conforme necessário.
Uma elevada persistência no solo e a facilidade de dispersão em suportes sólidos, tais como cascas torna o presente microrganismo particularmente adequado para o tratamento de plantas e/ou zonas que compreendem plantas, minimizando o número de tratamentos.
Por substrato de cultura entende-se um apoio à cultura orgânica, que pode ser líquido, sólido, semissólido (gelatinoso) e que pode ser orgânico, tais como arroz, casca ou pedaços de madeira ou corretores vegetais, tais como turfa, ou inorgânico (i.e. mineral), tais como barro. 0 substrato pode ter quer um nutriente ou uma função de matriz, ou ambos. Partes de madeira, cascas ou substratos inorgânicos são de preferência pré-tratados com um nutriente antes da inoculação com SCI.
Digno de nota, o crescimento em pedaços de casca não é possível com outras estirpes de t. atroviride, tais como a estirpe 122F. Por conseguinte, esta forma de realização constitui uma outra caracteristica distintiva da estirpe SCI de acordo com a presente invenção.
Os conidios de T. atroviride SCI podem também ser recolhidos (isto é, por um fluxo de ar ou por lavagem de um substrato de cultura) e dispersos num liquido ou um nutriente liquido. Tal suspensão, ou composição agrícola, é aplicada diretamente à planta ou ao solo em estreita proximidade com a planta. É de preferência aplicado em combinação com nutrientes, tais como uma fonte de carbono (ou seja, um açúcar) e uma fonte de azoto, tais como aminoácidos, péptidos, fatores de nutrientes ou micronutrientes de plantas para uma melhor manutenção dos microrganismos in situ. A composição pode ainda compreender agentes emulsionantes, tais como lecitina, saponinas, agentes molhantes, tais como Tween 80, ou semelhante, protetores de UV, antioxidantes com agentes emulsionantes, diluentes, agentes humectantes, adjuvantes de pulverização. Para os fins da presente invenção qualquer substrato de cultura sólido ou líquido, que compreende uma quantidade eficaz de 102-103 conidios por ml-1 ou g_1 de t. atroviride SCI é considerado uma composição agrícola.
As suspensões ou composições que compreendem pelo menos 102-103 por ml-1 ou g_1 de conidios são aplicadas diretamente sobre as partes da planta ou plantas, tais como raízes, folhas, sementes ou frutos, ou indiretamente no solo, de preferência, nos suportes sólidos acima mencionados.
Nas composições agrícolas acima, a estirpe SCI pode ser opcionalmente misturada com um segundo ou mais agentes de controlo biológico, suplementos minerais, fertilizantes, hormonas de plantas, corretores para o crescimento das plantas, pesticidas químicos não tóxicos para o t. Atroviride SCI ou ceras para proteger feridas de poda na água de irrigação.
Um dos métodos mais preferido para o tratamento do solo com o t. atroviride SCI é permitir que esta estirpe cresça num substrato, tal como um cereal, (ou seja, o arroz cozido), ou casca ou pedaços de madeira ou corretores vegetais tais como turfa e distribuir os referidos suportes no interior ou sobre o solo em estreita proximidade com a planta/plantas a serem tratadas. 0 crescimento de uma quantidade eficaz de cultura de T. atroviride SCI ( 102-103 conídios por ml-1 ou g-1) sobre o referido substrato sólido (isto é, pedaços de casca) é preferencialmente levada a cabo por pré-tratamento com meios microbiológicos (tal como caldo de dextrose de batata, extrato de malte, caldo nutriente ou semelhante) ou qualquer substância contendo um nutriente de carbono e uma fonte de azoto (tais como extrato de carne, peptona, cereais moídos, extrato de levedura, sacarose ou semelhante), inoculando tal substrato com T.atroviride SCI e incubando-o na condição acima descrito durante, pelo menos, uma semana ou até que seja obtida a colonização. A composição pode também ser preparada por lavagem de conídios fora das placas ou substratos de cultura infetadas e pulverizar essas suspensões sobre as partes aéreas da planta antes de uma infeção patogénica, semanalmente, em algum estágio de fenologia da planta específica ou depois de algumas práticas agrícolas, tais como a poda, corte, plantação.
Plantas às quais a composição é aplicada com sucesso, são preferencialmente selecionadas a partir do grupo que consiste em: Cucurbitaceae, Rosaceae, Vitaceae,
Crucifereae, Compositae, Ubelliferae,
Solanaceae e Liliaceae. Plantas particularmente preferidas são Cucurbitaceae, Rosaceae, Vitaceae. 0 tratamento, quer por um substrato sólido inoculado (ou seja, cascas ou corretores vegetais) ou por outros meios tais como a pulverização, é levada a cabo em qualquer momento do cultivo de plantas para proporcionar o controlo de agentes patogénicos habitantes do solo existentes ou para impedir novas infeções.
Um método preferido para o tratamento da rizosfera com o agente de biocontrolo da presente invenção é conseguido através do crescimento de T. atroviride SCI em arroz cozido esterilizado (ou outro cereal) por alguns dias (no mínimo uma semana, geralmente 15 dias) a uma temperatura compreendida dentro do intervalo ótimo, de preferência a cerca de 25°C ± 1°C, até uma dose ótima de inoculo no intervalo de 107-108 conídios/100 g de arroz cozido ou 1 x 106 ufc por g_1 do solo ser obtido. De acordo com esta forma de realização o agente de controlo biológico é aplicado diretamente como uma matriz de arroz enriquecida com fungos.
De modo a monitorizar o destino e comportamento de um microrganismo libertado no ambiente, o que é de extrema importância para o controlo de BCA, foi desenvolvida uma abordagem molecular (PCR em tempo real) e representa uma outra forma de realização da presente invenção.
Este método permite o acompanhamento e de quantificação de T. atroviride SCI no ambiente, identificando especificamente a estirpe libertada, distinguindo-a da comunidade microbiana nativa e rastreamento da sua dinâmica populacional ao longo do tempo.
Na verdade, o registo de um agente de controlo biológico especifico (BCA) como um pesticida na Europa exige uma avaliação do risco focada na persistência e multiplicação do BCA no meio ambiente, além de uma avaliação de qualquer possível contaminação (resíduos BCA viáveis e não viáveis) de géneros alimentícios. 0 teste molecular desenvolvido de acordo com uma outra forma de realização da presente invenção baseia-se no gene da endoquitinase T. atroviride SCI (ech42) (Carsolio et ai., 1994). Assim, os iniciadores de PCR em tempo real, o conjunto de sonda TaqMan específicos da estirpe (Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri) foram concebidos com base em dois desemparelhamentos de nucleótidos na cadeia 3' do gene ech42, na posição 185 e 196 de acordo com a numeração da sequência com o n° de acesso GenBank AB041753.1. Um segundo conjunto de iniciadores e sonda TaqMan foram concebidos para o gene tga3, que codifica a subunidade α da proteína G (Tabela 1). PCR utilizando os iniciadores ech42 e tga3 resultou em produtos de amplificação específicos de todo o ADN das estirpes de Trichoderma spp., mas não outros fungos a partir de amostras de solo (ou seja, Asperigillus spp., Penicillium spp., Cladosporium spp.). Os produtos deram um único pico de fusão para cada gene, o que indica que os iniciadores só amplificam produtos ech42 e tga3.
Por outro lado, quando a PCR em tempo real é realizada também na presença de uma sonda ech42 TaqMan contendo as duas mutações pontuais específicas SCI da sequência do gene ech42 (de preferência a SEQ ID N° 3) apenas T. atroviride SCI produz um único sinal e nenhum produto de hibridação da amplificação da sonda ocorre para os outros fungos (estirpes F122 e SB18 incluídas) em amostras de videira e do solo, confirmando a alta especificidade da sonda ech42. A amplificação dupla da sonda ech42 e da sonda tga3 TaqMan para a série de concentrações de ADN de T. atroviride SCI ocorreu ao mesmo limite para cada dada concentração. Isto demonstra que existe uma única cópia do fragmento amplificado de ech42 no genoma e uma única cópia do gene Tga3 , e que estas duas sequências têm curvas padrão semelhantes, de modo que elas representam conjuntos de iniciadores de amplificação adequados, como confirmado pelo facto de que as reações de PCR para cada uma destas duas sequências prosseguiram com níveis semelhantes de eficiência (Figura 4).
Este método produz um limite de deteção (LOD) e um limite de quantificação (LOQ) de 5 cópias de genoma por reação de PCR. Para as amostras de solo, o LOD calculado aumentou para 35 cópias por mistura de reação, o equivalente a 6,2 χ 103 conídios por g do solo, e o LOQ variou de 2 χ 104 a 3 χ 104 g_1 do solo. A precisão do método é muito alta nos cinco níveis de concentração de conídios testados como mostrado na Parte Experimental. 0 perito a partir das variações alélicas na Ech42 P identificadas no presente método pode identificar facilmente os conjuntos de iniciadores alternativos e diferentes sondas compreendendo ainda os dois desemparelhamentos identificados específicos para a estirpe SCI. Além disso, diferentes sondas moleculares são possivelmente ligadas à sonda e/ou ao iniciador.
Os iniciadores de PCR em tempo real e sondas concebidas para a deteção e quantificação de T. atroviride SCI são mostrados na tabela abaixo. Os desencontros de base na sonda ech42 TaqMan estão a negrito.
Os seguintes exemplos não limitativos são fornecidos para ilustrar adicionalmente a presente invenção.
PARTE EXPERIMENTAL
Exemplo 1. Isolamento e crescimento de
Trichoderma atroviride SCI A estirpe fúngica T. atroviride SCI foi isolada no norte da Itália a partir de madeira de avelã deteriorada e obtida em cultura pura pelo método de esporos único. Foi mantida em agar de dextrose de batata (PDA; Oxoid, Cambridge, Reino Unido) a 4°C na Coleção SafeCrop Micoorganism (Istituto di Agrário San Michele all'Adige) e depositado na coleção CBS sob o Tratado de Budapeste (CBS 122089) . A estirpe foi morfologicamente identificada como Trichoderma atroviride P. Karst, e a sua identidade foi confirmada através da sua análise de sequência ITS utilizando a ferramenta de identificação TrichOKEY, versão 2.0 (www.isth.info). T. atroviride SCI é capaz de utilizar uma grande variedade de compostos como fontes de carbono e azoto únicos. 0 crescimento fúngico foi significativo em meios superiores quando foi fornecido com algumas fontes de azoto tais como extrato de Levedura, nitrito, triptona, peptona, glutamina e asparagina ou algumas fontes de carbono, tais como manose, galactose, sacarose, extrato de malte celobiose glicose e trealose.
Sorbitol, lactose, frutose maltose, xilose e arabinose e NH4NO3, KNO3, NH4CI, serina, arginina e glutamina não promovem o crescimento de micélio.
Os efeitos das fontes de azoto (NS) , NH4NO3, NH4C1, KNO3, NaN03, NaN02, serina, arginina, glutamina, asparagina, triptona e peptona (Sigma, St. Louis, MO, EUA) e fontes de carbono (CS), sorbitol, lactose, maltose, frutose, arabinose, xilose, trealose, glicose, celobiose, extrato de malte, sacarose, galactose e manose (Sigma), no peso micelial seco de T. atroviride SCI foram testados. NS e CS foram esterilizados por filtração e acrescentados, a uma taxa de 2 g 1_1 (NS) e 20g · 1_1 (CS) , autoclavados em meio líquido Czapek Dox (Oxoid) alterado com glicose (lOg
• l-1) (Sigma) ou glicina (1 g · l-1) (Sigma), ao testar NS e CS, respetivamente. Os frascos que contêm 100 ml de cada um dos meios de nutrientes foram cada um inoculados com um tampão de agar a partir de um período de sete dias da cultura de T. atroviride SCI. Após uma incubação de 13 dias, os micélios foram colhidas através de papel de filtro e secos, e os seus pesos secos foram medidos usando um equilíbrio de hidratação AMB110 (Adam Equipment, UK). Cinco lotes foram inoculados em cada tratamento e o fator estudado. A experiência foi repetida duas vezes. T. atroviride SCI foi capaz de crescer a temperaturas entre 10°C e 30°C. A temperatura ótima para o crescimento foi de 25°C. A esta temperatura, a taxa de crescimento foi significativamente maior (P < 0,05) do que para as outras temperaturas (Figura 1) . Portanto, o crescimento ótimo foi alcançado a 25°C. Os primeiros conídios foram produzidos no terceiro dia após a inoculação. 0 crescimento radial fúngico a 20°C, não foi significativamente diferente do crescimento observado a 25°C. T. atroviride SCI não cresceu a temperaturas de 35°C ou superiores. Após 30 dias de incubação a 35°C, o fungo foi considerado morto porque não foi capaz de crescer, mesmo depois da temperatura ser baixada até à temperatura ótima de 25°C. Temperaturas de -1 e 5°C também inibiram o crescimento micelial. No entanto, após 30 dias a -1°C e 5°C, o fungo foi ainda capaz de crescer quando incubado novamente a 25°C. A fase de latência, com pouco ou nenhum crescimento observável, era mais longo a 10°C (2 dias) e 15°C (3 dias). T. atroviride SCI é tolerante com uma vasta gama de níveis de pH (Figura 2), Com o crescimento ótimo observado em meio ácido (pH 4-6). O crescimento micelial de t . atroviride SCI foi significativamente (P < 0,05) reduzido em meio alcalino (pH >8) e esporulação foi reduzida a pH 3, assim como os valores de pH acima de 8. A fase de latência era a mesma (1 dia) para todos os níveis de pH testados.
As taxas de crescimento foram também influenciadas pelas mudanças na atividade da água (aw) que é uma medida do estado de energia da água de um sistema, ou seja, a pressão de vapor de água dividida pela água pura à mesma temperatura (Figura 3) . O mais alto nível de aw testado (0, 998) foi o nível ideal para o crescimento de fungos. Quando este parâmetro foi reduzido abaixo dos 0.990, a taxa de crescimento foi reduzida significativamente (P < 0,05) em comparação com a do meio de PDA não modificado (aw = 0,998). O crescimento limitado foi observado a 0,910. A fase lag foi maior quando aw foi diminuído abaixo de 0,940 (2 dias) e 0,910 (4 dias).
Condições experimentais
Os efeitos da temperatura, pH e atividade da água (aw) em t. atroviride SCI foram testados em culturas crescidas em placas de Petri de 90 milímetros contendo PDA. Cada placa foi inoculada com um círculo de agar (5 mm de diâmetro), recolhida a partir da margem de uma cultura de sete dias de idade. O círculo de inoculo foi colocado no centro de cada placa. O crescimento micelial foi avaliado diariamente. Dez placas replicadas foram inoculadas para cada nível dos parâmetros estudados.
No ensaio de temperatura, as placas foram incubadas no escuro a -1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 37 e 40°C, com um pH médio de 5. No ensaio de pH, os níveis de pH dos meios foram ajustados para 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 e 10 após a autoclavagem por adição de soluções estéreis de 1 N de HC1 ou 2 N de NaOH. Para testar o efeito de aw, os meios foram modificados por adição de guantidades crescentes de glicerol para se obter níveis de aw de 0,990, 0,980, 0, 960, 0, 940 e 0,910. O pH do meio foi ajustado para 4,5 com 1 N de HC1 ou 2 N de NaOH antes da autoclavagem. Os valores de aw de todos os meios foram medidos com um instrumento AguaLab série 3 (Decagon, Pullman, Washington EUA). Para os ensaios de pH, e aw, as placas foram incubadas no escuro a 25°C. O crescimento radial foi avaliado no terceiro dia de incubação, o que é aproximadamente o tempo que o fungo precisa para colonizar completamente uma placa de Petri com este tamanho sob condições ótimas.
Exemplo 2. Deteção e quantificação de t. atroviride SCI. PCR em tempo real usando os iniciadores ech42 e tga3 resultaram em produtos de amplificação a partir de ADN de todos as estirpes de Trichoderma spp., outros fungos e amostras de solo. Os produtos deram um único pico de fusão para cada gene, o que indica que os iniciadores só amplificam produtos ech42 e tga3. Por outro lado, na presença da sonda ech42 TaqMan contendo as duas mutações pontuais específicas SCI da sequência do gene ech42, apenas t. atroviride SCI produziu um único sinal de hibridização e nenhum produto de amplificação ocorreu para a sonda e outros fungos (estirpe F122 e SB18 incluídas), amostras de videira e do solo, confirmando a alta especificidade da sonda ech42. Um controlo interno (reação dupla), que consiste na sonda tga3, confirmou a precisão do processo de produção dum sinal nos exames da PCR em tempo real de todas as amostras de Trichoderma spp. A amplificação dupla da sonda ech42 e tga3 TaqMan para a série de concentrações de ADN de T. atroviride SCI ocorreu ao mesmo limite para cada concentração dada. Isto demonstrou que existe uma única cópia do fragmento amplificado ech42 no genoma e uma única cópia do gene Tga3, e que estas duas sequências têm curvas padrão semelhantes. Os nossos resultados também mostraram que as reações de PCR para cada uma destas duas sequências prosseguiram com níveis semelhantes de eficiência (Figura 4) .
Este método produz um LOD de 5 cópias de genoma por reação de PCR. Para as amostras de solo, o LOD calculado aumentou para 35 cópias por reação de mistura, equivalente a 6,2 x 103 conídios por g de solo, e o LOQ foi de 2 x 104 a 3 x 104 g_1 de solo , este último delineado na série de solos diferencialmente inoculados (Tabela 2). 0 LOD absoluto varia de 8,5 x 103 a 1,2 x 104 cópias por reação de PCR (Tabela 2). A precisão do método é muito elevada para os cinco níveis de concentração de conídios testados (Figura 5) resultando na quantificação de T. artroviride SCI pelo método molecular em quantidades compreendidas entre 102 e 107 conídios g_1.
Condições experimentais
Iniciadores de PCR em tempo real e sonda: o gene endoquitinase de T. atroviride SCI (ech42) (Carsolio et ai., 1994) foi amplificado utilizando iniciadores de consenso baseados em sequências já presentes no NCBI GenBank. A sequência completa obtida foi comparada e alinhada com as 34 sequências da mesma base de dados utilizando o programa BLAST (Altschul et ai., 1997) e o programa ClustalW (disponível no European Bioinformatics Institute, European Molecular Biology Laboratory [http:// www.ebi.ac.uk/clustalw/]), respetivamente. Foram observadas algumas diferenças em sequências de nucleótidos (em particular, dois desemparelhamentos de nucleótidos no primeiro intrão de um determinado gene foram anotados) e apenas uma sequência na base de dados (número de acesso NCBI GenBank AB041753.1 referindo-se a T. harzianum SK-55 isolado no Japão) foi idêntico ao nosso isolado. Por isso, os iniciadores de PCR em tempo real e o conjunto de sonda TaqMan específico da estirpe (Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri) foram desenhados com base nestas duas coincidências nucleotídicas sobre a cadeia 3' do gene ech42 , utilizando o software Primer Express v2. (PE Applied Biosystems, Foster City, Califórnia) (Tabela 1). Um segundo conjunto de iniciadores e sonda TaqMan foram concebidos para o gene tga3, que codifica a subunidade α da proteína G (Tabela 1). PCR em tempo real: As reações foram realizadas em 20 μΐ de volume final contendo: tampão IQ Multiplex Power Mix (Bio-Rad, Hercules, Califórnia), 0,3 μΜ de cada um dos iniciadores ech42 e a sonda, 0,4 μΜ da sonda tga3 e de 0,6 μΜ cada um dos iniciadores tga3. A PCR em tempo real foi realizado num termociclador MJ Chromo4 (MJ Research, Waltham, Massachusetts) usando o seguinte programa padrão: 2 min 30 s a 95°C para desnaturação inicial, 40 ciclos de 15 s a 95°C e 1 min a 61°C durante um passo de extensão no qual o sinal de fluorescência foi medido e analisado pelo software Opticon2 (MJ Research, Waltham, Massachusetts). Quando as amostras foram analisadas pela química SYBR Green I, foi usado o SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystem, Foster City, Califórnia), juntamente com 0,3 μΜ do conjunto de iniciadores ech42 e 0,3 μΜ do conjunto de iniciadores tga3. As condições de amplificação foram então alteradas para: um arranque a quente a 10 min a 95°C, 40 ciclos de 15 s a 95°C e 1 min a 61°C para extensão, com uma curva de fusão final a partir de 40° a 90°C, durante o qual as amostras foram lentamente aquecidas (0,5°C a cada 10 segundos). A quantificação das amostras de ADN foi realizada por interpolação dos valores do ciclo limiar (Ct) da amostra com os valores de Ct de uma curva de regressão padrão de concentrações conhecidas de ADN genómico purificado de T.atroviride SCI previamente quantificado utilizando o fluorímetro Qubit (Invitrogen Life Technologies, Carisbad, Califórnia). A curva padrão foi baseada em oito diluições em série 1:3 de ADN genómico SCI e incluída em cada ensaio de PCR. As curvas resultantes tinham declives variando entre 3,0 e 3,5, coeficientes de determinação superiores a 0,9 e 100% de eficiência de PCR. A quantificação de SCI foi expressa em número de cópias do genoma haplóide, considerando que o tamanho de cópia única do genoma Trichoderma é 0,034 pg.
Especificidade: A especificidade do método foi testada em 50 isolados de Trichoderma spp. a partir de coleções de cultura (26 isolados de CBS, um de ATCC, 13 da Universidade de Pavia e dois da SafeCrop, ou seja, F122 e SB18), dois isolados usados como biofungicidas comerciais (T. harzianum T39 e T. harzianum T22) e seis de
Trichoderma isolados de solo recolhido num vinhedo comercial no norte da Itália (coordenadas GIS: N46° 10897' e OEll° 06983') . Sete dos isolados analisados foram identificados como T. atroviride. A especificidade também foi testada em géneros de fungos comumente presentes em solos: Aspergillus, Cladosporium, Penicillium, Fusarium, pullulans, Mucor, Gliocladium, Rhizopus,
Acremonium, Coelomycetes, Geotricum,
Plasmopara e Armillaria das coleções SafeCrop (21) ou CBS (1), ou isolados (7) a partir de solos.
Todos os fungos isolados foram cultivados em agar de dextrose de batata (PDA, Oxoid, Basingstoke, Reino Unido) . O ADN foi extraido diretamente de 50-100 mg de micélios utilizando o DNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN, Hilden, Alemanha). A especificidade do método para a t. atroviride SCI foi testada comparando os produtos de amplificação e curvas de fusão obtidas com os testes SYBR Green I com os resultados obtidos utilizando as sondas TaqMan especificas para ech42 e tga3.
Dez amostras de solo, quatro de Trentino e seis de outras regiões italianas (Marche, Valle d'Aosta, Emilia-Romagna e
Calábria), também foram incluídas no teste de especificidade. 0 ADN, se não indicado de outra maneira, foi sempre extraído a partir de amostras de solo de 200 mg secas durante a noite, de acordo com o protocolo prescrito para o kit de isolamento de ADN PowerSoil (Mo Bio, Carlsbad, Califórnia). ADN de Vitis vinifera cv. Cabernet foi incluído no ensaio para controlar a especificidade para a amplificação de ADN a partir de material de raiz presente em solos tratados com T. atroviride SCI. O ADN da planta foi extraído utilizando o DNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN, Itália) . Na análise de RT-PCR do ADN genómico de T . atroviride SCI, foram carregadas outros fungos e ADNs de videira utilizadas como controlos a aproximadamente 0,2-1 ng, enquanto 1-5 ng de ADN (a quantidade total extraído de cada uma de 4 mg da amostra de solo) foi colocado em cada reação de PCR.
Repetibilidade, precisão e sensibilidade: A repetibilidade do nosso procedimento PCR em tempo real foi estimada para uma suspensão de ADN de T. atroviride SClpuro e ADN total extraído a partir de 7,5 g de solo previamente inoculado com o fungo (107 conídios g_1) e eluíu-se em 4 ml, seguindo as instruções do fabricante para o PowerSoil Mega Prep kit de isolamento de ADN (Mo Bio, Carlsbad, Califórnia) . A precisão do método foi estimada utilizando os solos que contêm diferentes concentrações de T. atroviride SCI. Para esta estimativa, lotes de 50 g de solo arenoso peneirado, esterilizado foram misturados com 10 ml de suspensões conidiais de t. atroviride SCI para atingir as concentrações finais de 107, 106, 104 e 102 conídios por g_1 de solo. O ADN foi extraído a partir de três amostras independentes para cada concentração de tratamento, quando o solo tinha sido seco durante a noite a 60°C (200 mg) e as suas respetivas concentrações de conídios foram quantificadas em duas PCR em tempo real independentes. A precisão do método de quantificação foi calculada comparando cópias do genoma estimadas com a concentração de conídios esperada.
Sensibilidade: A sensibilidade do método de PCR em tempo real foi definida pelo limite de deteção (LD) e o limite de quantificação (LOQ). LOD corresponde ao número mais baixo de cópias na amostra para o desvio padrão sob condições de repetibilidade é de 33% ou inferior. LOQ corresponde ao número de cópias mais baixo na amostra para o desvio padrão sob condições de repetibilidade é de 25% ou inferior. 0 LOD absoluto do método foi calculado como o menor número de cópias que devem estar presentes na amostra para garantir a precisão, pelo menos, 95%.
Tabela 1 Iniciadores de PCR em tempo real e sondas concebidas para a deteção e quantificação de Trlchoderma atroviride SCI. Os desencontros de base na sonda ech42 TaqMan estão a negrito
Tabela 2. O limite de deteção (LOD) e limite de quantificação (LOQ) determinada utilizando o desvio padrão relativo (RSDr) do número de cópias do genoma (CN) determinada a partir de duas séries de diluição de ADN de T. atroviride SCI puro, duas séries de diluição de ADN total extraído de uma amostra de solo inoculado com o log 107 conídios g”1 de solo e a análise do ADN total extraído a partir de uma série de solos inoculados com quantidades decrescentes de conídios. O LOD e LOQ foram fixados em 33% e 25% do desvio padrão relativo (RSDr), respetivamente. 0 LOD absoluto corresponde a vim nível de deteção de ADN de 95%.
Exemplo 3. Métodos para a produção e para o tratamento. T. atroviride SCI foi cultivada com sucesso em diferentes meios de laboratório comum como agar de dextrose de batata, caldo nutriente, ágar de extrato de malte.
Aplicou-se com um dos seguintes três métodos conhecidos: cultivadas em caldo de cultura, de arroz ou de cascas/turfa.
Os três métodos fornecram 99% de propágulos viáveis de T. atroviride SCI. T. atroviride SCI produzido em arroz ou cultivados em cascas sobrevive durante pelo menos um ano a 15°C em 98% RH. Foram observadas diferenças com T. atroviride SCI cultivadas em corretores vegetais ou cascas com outras estirpes de T. atroviride, em particular T. atroviride F122 não sobreviveu em cascas ou turfa nas condições acima mencionadas.
Condições experimentais A preparação de uma composição agrícola foi realizada de acordo com um dos seguintes métodos: a) inoculação com micélio de T. atroviride SCI ou conídios (pelo menos 102 conídios/L) de caldo de cultura (caldo nutriente ou caldo de extrato de malte) e incubação sob agitação contínua, foi realizada a uma temperatura entre 20 a 25°C, por pelo menos 48 h. O caldo de cultura filtrado ou não filtrado foi pulverizado para plantas ou incorporada no solo. b) o arroz cozido esterilizado (ou cereal equivalente) foi inoculado com conídios de micélio de T. atroviride SCI ou conídios (pelo menos 102 conídios/100 g) e incubado durante 21 dias a 25°C. Para tratamentos do solo o arroz com T. atroviride SCI foi misturado com o solo tendo uma dose de inoculo de 1 x 106 ufc g_1 de solo nos primeiros 3 cm de solo. Para tratamentos foliares os conídios de T. atroviride SCI foram recolhidos a partir do arroz por lavagem com água e aplicados com ou sem a adição de outros adjuvantes de pulverização (agentes molhantes, emulsionantes, etc.); c) T. atroviride SCI foi cultivado em pedaços de casca preventivamente tratados ou não com um meio de crescimento microbiológico (caldo nutriente) ou substâncias nutrientes contendo fontes de carbono e de azoto (arroz moído). As cascas foram inoculadas com T. atroviride SCI (pelo menos 102 conídios/100 g), incubadas durante pelo menos dois dias ou até à colonização a 20-25°C. As cascas inoculadas podem ser utilizadas como corretores em qualquer momento do cultivo de plantas fornecendo o controlo do agente patogénico de desinfestação do solo existente ou para prevenir novas infeções. Os corretores vegetais (turfa) foram inoculados sem substâncias nutrientes como é feito para as cascas.
Exemplo 4. Sobrevivência de t. atroviride SCI no filoplano de morango.
As densidades populacionais de conidios viáveis de T. atroviride SCI no filoplano de morango diminuíram rapidamente durante a primeira semana após a inoculação. A população de fungos mostrou um declínio contínuo até a 15° dia após a aplicação, depois que uma baixa concentração de CFU ser mantida até o 45 dia em que a experiência foi encerrada (Figura 6). T. atroviride SCI não causou fitotoxicidade nem é patogénico para as folhas de morango, flores ou frutas e sobreviveu por mais de um mês, em folhas de morango.
Condições experimentais
As suspensões de conidios de T. atroviride SCI foram obtidas por lavagem de culturas com 21 dias de idade, cultivadas em arroz cozido com 0,01% de Tween 80 (Sigma) em água destilada estéril (ADE). A suspensão de esporos foi filtrada através de três camadas de tecido esterilizado para remover fragmentos de micélio. A concentração de esporos foi determinada usando um hemocitómetro Thomas e ajustada a uma concentração de 106 conídios · ml-1. A concentração de conídios viáveis no inoculo foi determinada pela contagem de unidades formadoras de colónias (CFUs) numa diluição em série em PDA alterada com 2 Ml-1-1 de Triton X-100 (Sigma). As colónias foram contadas após a incubação das culturas a 25°C durante sete dias.
Folhas de 10 plantas de morango mantidas sob condições de estufa (25 ± 2°C, UR = 60 ± 10%) foram uniformemente pulverizadas com o inoculo de T. atroviride SCI utilizando um pulverizador manual. Uma folha selecionada aleatoriamente foi removida a partir de cada planta a 0, 1, 3, 7, 15, 30 e 45 dias após a inoculação. Um disco (25 mm de diâmetro) foi cortado de cada folha, usando uma sonda esterilizada. Os discos foram transferidos para tubos Falcon contendo 5 ml de Tween 80 (0,01%), agitados durante 4 minutos e em seguida deixados repousar durante 1 min. Uma série de diluição em água desionizada foi plaqueada num meio de cultura semi-seletiva que consiste de PDA alterada com rosa bengala (100 ppm), estreptomicina (100 ppm) e cloranfenicol (50 ppm), para minimizar a presença de bactérias. UFC foram contadas sobre as diluições adequadas e os resultados foram expressos em UFC-mm-2 folha. Contagens de UFC das placas de diluição foram convertidas para UFC por mm-2 de folha. Esta experiência foi realizada duas vezes e não foi observada diferença significativa experimental entre as duas experiências.
Exemplo 5. Sobrevivência de T. atroviride SCI no solo T. atroviride SCI foi capaz de sobreviver em, pelo menos, três diferentes tipos de solos. Após a sua introdução nos solos, T. atroviride SCI sobreviveu até ao final da experiência (45 dias), como indicado pela sua recuperação em placas de diluição dos solos estéreis e não-estéreis, como mostrado na Figura 7. As diferentes caracteristicas dos solos também influenciaram a sobrevivência do fungo. Os resultados obtidos para os solos argilosos arenosos (2 e 3) com níveis elevados de matéria orgânica eram semelhantes uns aos outros, mas diferentes dos resultados obtidos para a marga de argila (1 solo), que também tinha menos matéria orgânica. A esterilização do solo em autoclave foi associada com maior sobrevida de T. atroviride SCI. Nos solos estéreis, a concentração fúngica aumentou por quase uma ordem de magnitude no terceiro dia, atingindo uma concentração máxima de 107 CFU · g_1 de solo seco no Solo estéril 1, e um pouco menos nos Solos 2 e 3. Após o que, a concentração de T. atroviride ficou entre 106 e 107 UFC · g_1 solo seco até 45 dias após a inoculação (Figura 7a) em todos os tipos de solos. As concentrações de fungos finais no solo esterilizado foram significativamente maiores (P < 0,05) para os solos 2 e 3 do que para o solo 1. Houve diferenças significativas entre os valores de UFC para os tratamentos estéreis e não estéreis para cada tipo de solo em cada data de avaliação, com exceção do solo 1 a 30 dias após a inoculação. Os valores de UFC de Γ. atroviride SCI aumentaram no solo esterilizado. Os valores de UFC no solo não estéril 2 foram semelhantes aos do solo não estéril 3. No solo não tratado 1, houve um pequeno aumento do número de UFC no primeiro dia após a inoculação, mas a concentração de conídios na final da experiência em todos os tipos de solo foi menor do que a do inoculo inicial. A concentração de conídios final (CFU) em solos não tratados foi significativamente maior ( P < 0,05) para o Solo 1 de que para os Solos 2 e 3. O efeito da esterilização do solo sobre a sobrevivência de T. atroviride SCI foi mais pronunciado nos solos 2 e 3 do que no solo 1.
Nos microcosmos não tratados (não-inoculados) utilizados como controlo, foi detetado um nivel muito baixo de Trichoderma spp. nativo (1 a 3 102 UFC g-1) , mas nenhum dos CFUs foram identificados como T.atroviride.
Condições experimentais 0 ensaio de sobrevivência do solo foi baseado no método descrito por Bennett et ai. (2003), com algumas modificações. Foram utilizados três tipos de solo do norte da Itália (região de Trentino), com diferentes caracteristicas físicas e químicas (Tabela 1) . O solo foi seco à temperatura ambiente e peneirado (malha <2 mm) . O solo peneirado (100 g) foi colocado em garrafas de 500 ml de polipropileno e as amostras foram deixadas sem tratamento (não estéril) à temperatura ambiente ou autoclavadas (121°C durante 30 min) duas vezes em dias consecutivos (estéreis). O inoculo foi preparado como descrito acima. A experiência foi realizada em condições estéreis. Os conídios foram adicionados ao solo para se obter uma concentração final de 106 conídios · g_1 de solo e misturados com uma espátula esterilizada. Os frascos foram incubados a temperatura ambiente. Cinco repetições foram criadas para cada combinação de tipo de solo X tratamento do solo (não-estéril e estéril).
Uma subamostra de solo (1 g) foi removida assepticamente a partir de cada frasco de amostra usando uma colher de amostra estéril (PBI Internacional, Whitstable, Reino Unido) e colocada em 10 mL de 0,01% de Tween 80, agitou-se durante 4 minutos e deixou-se repousar durante 1 min. Uma série de diluições foram criadas e plaqueadas em meio de cultura semi-seletivo como descrito acima. CFU foram contados nas placas de diluição apropriadas depois de sete dias de incubação a 25°C e expresso em CFU · g_1 de solo seco. Avaliações do UFC nas amostras de solo foram realizadas imediatamente após a inoculação e em 1, 5, 10, 20, 30 e 45 dias após a inoculação. Contagens de UFC das placas de diluição foram expressas como CFU por grama de solo seco (CFU · g_1) .
Exemplo 6. Sobrevivência de T. atroviride SCI num solo de vinha A sobrevivência no solo também foi verificada num vinhedo comercial durante um ano inteiro. A experiência foi repetida duas vezes. T. atroviride SCI foi capaz de sobreviver a uma concentração elevada de conidios (108 UFC. g_1 de solo seco ) sobre a primeira camada de solo (superfície do solo) por um longo período de tempo (pelo menos 18 semanas após o tratamento) em ambos os anos. T. atroviride SCI migra verticalmente no solo muito rapidamente após o tratamento (uma semana), atingindo uma profundidade de 0,4 m. Então a concentração de CFU manteve valores estáveis durante dois anos, até à avaliação sobre na 18a semana. Um gradiente em densidades populacionais esteve presente em ambos os anos, a partir da superfície para as camadas de solo em profundidade. O maior número de CFU detetado foi de 105 UFC g_1 de solo seco até 0,1 m de profundidade do solo, cerca de 104 a 0,2 m e 103 CFU g_1 de solo seco com 0,3 a 0,4 m. As diferenças significativamente diferentes na dinâmica da população entre os dois anos estavam presentes apenas na concentração de CFU na superfície do solo cinco e nove semanas após o tratamento (teste de Tukey; a = 0,05) . Em particular após 9 semanas de T. atroviride SCI CFU na superfície do solo aumentou ainda mais do que o inoculo inicial (109 UFC g_1 de solo seco), após uma diminuição inicial na 5a semana. Um ano após a inoculação do solo, T. atroviride SCI foi detetado a uma concentração de 102-103 UFC g_1 de solo seco para ambas as experiências a concentração comparáveis a Trichoderma spp. Indígena na área não tratada. O método de PCR em tempo real confirmou a ausência da estirpe antes da sua introdução no solo e a persistência da estirpe nas camadas do solo. A relação linear (y = 0,1105 + 0,8472x, R2 = 0,6794) entre os resultados obtidos com os dois métodos de contagem (CFU) e método molecular confirma a eficiência da deteção molecular de T. atroviride SCI.
Após 9 semanas do seu lançamento no solo, T. atroviride SCI foi encontrada a uma distância de 0,5 m e 2 m a partir dos furos tratados na superfície do solo, até 0,1 me 0,3 m de profundidade do solo. O UFC foi significativamente maior (teste de Tukey; a = 0,05) do que a população indígena de Trichoderma spp. isolada na zona tratada, na superfície do solo, a 0,5 e 2 m dos buracos tratados e a 10 cm de profundidade do solo a 0,5 m de distância dos buracos tratados. A concentração de conídios SCI nas demais camadas do solo a 0,5 e 2m de distância dos buracos tratados não foi significativamente maior (teste de Tukey; a = 0,05) do que a população indígena de Trichoderma spp. isolada na área não tratada. A frequência de ocorrência de T. atroviride SCI foi alta (respetivamente 100% a 0,5 m dos furos tratados em toda a profundidade do solo) e diminuiu para 90, 70 e 30% em 2 m de distância dos buracos tratados respetivamente na superfície do solo, em 0,1 e 0,3 m de profundidade do solo.
Dezoito semanas após a sua introdução no solo, ainda foi possível recuperar T. atroviride SCI na superfície do solo tanto aos 2 e 4 m de distância dos orifícios tratados. Estas concentrações de UFC não foram significativamente diferentes (teste de Tukey; α = 0,05) comparadas com a concentração de conídios de Trichoderma spp. indígena obtida a partir da área não tratada. Mesmo se concentrações baixas foram detetadas após 18 semanas, a frequência da ocorrência de T. atroviride SCI foi alta (respetivamente 80 e 70% aos 2 e 4 m a partir dos furos tratados). Γ. atroviride SCI foi encontrado em folhas de videiras plantadas no solo tratado. O número de CFU mm2 de folha-1 de T. atroviride SCI foi significativamente maior (teste de Tukey; α = 0,05) sobre as folhas das plantas no solo tratado do que a de Trichoderma spp. indígena isolada nas plantas nas áreas não tratadas. Houve diferença significativa (teste de Tukey; α = 0,05) em CFU de T. atroviride SCI por unidade de superfície (mm2) entre as folhas superior e inferior de plantas em áreas tratadas
Dezoito semanas após o plantio nos buracos tratados a concentração de T. atroviride SCI na rizosfera da vinha foi de 107 UFC g de solo seco. O número de folhas, número de brotos, peso da raiz seca, comprimento do caule e comprimento total das plantas de videira, não demonstraram diferenças significativas entre as videiras plantadas em solo não tratado ou tratado com T. atroviride SCI (teste de Tukey; α = 0,05, dados não mostrados), indicando que o fungo é não patogénico para a cultura da vinha. 0 isolamento de T. atroviride SCI um ano após a inoculação indica que pode tolerar baixas temperaturas de inverno e as flutuações de humidade no solo. A concentração de T. atroviride SCI no solo um ano após a inoculação semelhante à Trichoderma spp. indígena indica que pode estabelecer-se no solo.
Os mesmos testes foram realizados em 2006, com uma estirpe diferente, T. atroviride F122. Esta estirpe foi detetada apenas até 18 semanas após a inoculação e não foi detetada um ano após a inoculação. A incapacidade de sobreviver de T. atroviride F122 em condições de crescimento comparáveis um ano após inoculações demonstrou a superioridade de T. atroviride SCI em relação a outras estirpes.
Condições experimentais
Em todas as experiências, a concentração de T. atroviride SCI viável foi estimada por recolha de amostras de 1 g de terra de cada lote, colocando cada amostra em 10 ml de água estéril e em seguida o plaqueamento de 1 ml desta suspensão, depois de 10 diluições em série, em meios semi-seletivos. Colónias de fungos foram contadas depois de sete dias de incubação e os números populacionais foram apresentadas em termos de log UFC g_1 de solo seco. O peso do solo seco foi estimado após a incubação da amostra (ou subamostra) a 60°C durante 48 h. Os conídios em que o arroz foi utilizado como inoculo tinham sempre uma viabilidade média próxima de 100%. As colónias de T.atroviride SCI foram distinguidas de outras espécies de Trichoderma pelo seu micélio aéreo característico (branco no início, em seguida, rapidamente ficando verde amarelado a verde azeitona) . Para a identificação inequívoca do nosso isolado, a identidade de cerca de 10% das colónias de cada placa que tinha sido identificada morfologicamente como T. atroviride foi confirmada por análise de PCR utilizando iniciadores e um conjunto de sondas de Taq-Man com base numa mutação de bases do gene de endoquitinase (Ech42) que é específico para T. atroviride SCI (como no exemplo 2). As experiências consistiram em seis parcelas de 0,6 x 0,6 m cada, que foram localizadas entre as plantas de videira na linha na vinha. Três lotes foram inoculados com T.atroviride SCI e cada um recebeu 500 g do meio de arroz cozido com o fungo crescido no mesmo. O inoculo foi misturado na camada superficial do solo (cerca de 30 mm de profundidade) . A concentração inicial do inoculo de fungos nesta camada foi estimada como sendo 108 UFC g_1 de solo seco. Três lotes não inoculados adicionais foram utilizados como controlo não tratado. Em cada parcela, o solo foi amostrado por escavar a parte externa de um dos lados do lote e expondo o perfil do solo. A amostragem foi realizada através da recolha de três cenouras transversais do solo (50 ml, 300 mm de diâmetro), em diferentes profundidades (na superfície e em 0,1, 0,2, 0,3 e 0,4 m) e pontos de tempo (em tempo de inoculação e 1, 5, 9 e 18 semanas após a inoculação com T. atroviride SCI). Uma amostragem adicional do solo foi feita um ano após a inoculação da primeira experiência.
Uma subamostra de solo (1 g) foi removida a partir de cada amostra utilizando uma colher estéril. A subamostra de solo foi colocada em 10 ml de 0,01% de Tween 80 (Acros Organics, Geel, Bélgica), agitada durante 4 min, utilizando um vórtice (Heidolph Instruments, Schwabach, Alemanha) e deixada repousar durante 1 min. Uma série de diluições em água destilada estéril foram estabelecidas e as suspensões diluídas foram plaqueadas em placas de Petri contendo os meios semi-seletivos. Estas placas de Petri foram então incubadas a 25°C, foi realizada a contagem final de colónias em culturas correspondentes às diluições apropriadas (UFC dentro do intervalo de 30-300 colónias por placa), após cinco dias de incubação. Havia três repetições para cada amostra de solo. Os resultados foram expressos em UFC g_1 de solo seco. As identidades das colónias de T. atroviride SCI foram confirmadas como descrito no exemplo.
Foi usada PCR em tempo real para determinar os números de cópias do genoma de T. atroviride SCI (CN) em todas as amostras de 2006. Para a análise de RT-PCR, duas subamostras independentes foram recolhidas para cada combinação de profundidade e tempo e a extração de ADN e análise em tempo real de cada amostra de PCR foi realizada como descrito no Exemplo 2. A dispersão de conidios de T. atroviride SCI foi examinada em 2006. Buracos medindo 0,3 χ 0,3 χ 0,3 m foram escavados na linha da vinha entre as plantas de videira. Dez buracos foram preenchidos com uma mistura do solo escavado e inoculo de T. atroviride (400 g_1 por buraco ) . A concentração inicial de inoculo fúngico foi de 106 UFC g_1 de solo seco. Os outros dez buracos foram preenchidos de volta com o solo escavado não tratado. A planta da vinha de um ano de idade (Pinot Gris em Kober 5BB) foi plantada em cada buraco.
Dois conjuntos de amostras de solo foram recolhidos. A primeira recolha de amostras foi realizada às nove semanas após a inoculação em ambos os furos tratados e não tratados (0 m) e a distâncias horizontais de 0,5 e 2,0 ma partir do furo. Em cada uma destas distâncias, as amostras de solo foram recolhidas em três profundidades do solo (0, 0,1 e 0,3 m). Uma segunda amostra foi feita às 18 semanas após a inoculação e, nesse momento, as amostras de solo foram recolhidas apenas na superfície (primeiros 30 mm de solo) dos furos e a distâncias horizontais de 2,0 e 4,0 m a partir dos locais de inoculação. As amostras foram recolhidas e o número de UFC em cada amostra foi determinado como descrito anteriormente. A dispersão foi avaliada em termos de concentração de T.atroviride SCI (CFU g_1 de solo seco) e de frequência (percentagem de amostras de solo, com pelo menos um CFU). A migração de T. atroviride SCI do solo para as folhas das videiras foi avaliada 10 semanas após a inoculação do solo. Três folhas apicais e três folhas inferiores foram removidas de cada planta (cada planta teve uma média de 15 folhas) que cresceram nos buracos tratados e não tratados. Cada folha recém-colhida foi transferida para um tubo Falcon contendo 30 ml de água destilada estéril mais 0,01% de Tween 80. Estes tubos foram agitados durante 3 minutos e 1 ml de cada uma das suspensões resultantes foram então transferidos para uma placa de Petri contendo os meios semi-seletivos. CFU foram contados nos seguintes sete dias de incubação a 25°C. A área foliar foi calculada usando um programa de processamento e análise de imagem, Image Tool versão 2.0 (UTHSCSA, San Antonio, TX, EUA) . No final da experiência, as plantas foram removidas do solo. O solo que não rigidamente aderiu às raizes foi cuidadosamente removido com agitação ligeira e as raizes foram então agitadas vigorosamente num saco plástico para desalojar o solo da rizosfera. Amostragem da rizosfera e contagem de CFU para estas amostras (subamostras de 1 g; três repetições) foi feito como descrito anteriormente.
Para avaliar a influência de T. atroviride SCI no crescimento da planta, medidas de comprimento total, comprimento de caule e os números de folhas e brotos foram tomadas para cada planta nas áreas tratadas e não tratadas na nona e 18a semanas após a inoculação do solo. 0 peso seco da raiz foi também determinado para cada planta no final da experiência (18a semana após a inoculação).
Exemplo 7. Atividade de biocontrolo in vitro
No bioensaio de cultura dupla, T. atroviride SCI inibiu completamente B. cinerea e A. mellea com uma eficácia antagonística de 100%.
Condições experimentais O antagonismo de T. atroviride SCI in vitro para um patogénico foliar e fruta (Botrytis cinerea) e uma desinfestação do solo (Armillaria mellea) foi testado através do método de cultura dupla da seguinte forma: os patogénicos (B. cinerea ou A. mellea) foram inoculados a uma distância de 2 centímetros (a) de T. atroviride SCI (B) no PDA de placas de Petri (90 mm de diâmetro) . B. cinerea, A. mellea e T. atroviride SCI foram cultivadas cada sozinha como controlos não tratados. Havia pelo menos três repetições de cada combinação. Eficácia antagonística foi calculada após uma semana de incubação a 20°C, como (AD-AC) x 100/AD, em que AC e AD são o crescimento radial do patogénico com e sem T. atroviride SCI, respetivamente.
Exemplo 8. Biocontrolo de oídio T. atroviride SCI controla o oídio (Podosphaera xanthii) em culturas hortícolas como pepino e curgete no mesmo nível de enxofre, que é um dos mais amplamente utilizados fungicidas químicos e que, portanto, foi incluído como padrão (Figura 8) . Em particular, observa-se que T. atroviride SCI controla a doença, ao mesmo nível que o enxofre e melhor do que as duas estirpes de
Trichoderma utilizadas como padrões. Também na curgete a eficácia do controlo biológico estava presente (diferença significativa com não tratada).
Condições experimentais
Foram utilizadas plantas com pelo menos cinco folhas bem expandidas de cultivares suscetíveis. Os cultivares utilizados foram Afrodite ou Xara para a curgete e 807 para o pepino. As sementes foram plantadas em turfa: mistura de cascalho vulcânico envasado (1:1) em potes de 1 litro e cultivadas em estufas livres de CPM mantidas a 20-30°C com fotoperíodo natural. Havia 5-6 réplicas (vasos) de cada tratamento e cultura. O inoculo P. xanthii foi inicialmente recolhido em estufas comerciais em curgetes naturalmente infetadas e plantas de pepino e depois mantidos em plantas de pepino e curgete por infeção em plantes com três semanas e mantendo as plantas infetadas por até um mês num compartimento separado com efeito de estufa. Os conídios foram obtidos por lavagem com água fresca e os novos micélios de conídio foram imediatamente pulverizadas sobre as plantas. A concentração do inoculo foi de aproximadamente 107 conídios ml-1 e um volume de 5 ml planta-1 foi aplicado. Uma vez secas, as plantas foram incubadas durante a noite a 22°C e elevada humidade relativa (HR> 95%) . Após a inoculação artificial as condições diurnas foram de 20-30°C, com 30-70% de humidade relativa e as condições noturnas foram de 15-20°C, com 85-90% de humidade relativa. As plantas foram dispostas em blocos ao acaso. T. atroviride SCI foi cultivada em caldo nutriente (método a) , exemplo 3) e pulverizada com um pulverizador manual nas folhas. Um controlo não tratado, enxofre (Thiovit, Syngenta Crop Protection) e um agente de biocontrolo comercial (Trichoderma harzianum T39, Trichodex®), Intrachem bio) também foram incluídos na experiência. Para cada tratamento 5 ml de solução de planta-1 foi pulverizada por planta. As experiências foram repetidas pelo menos duas vezes. T. atroviride SCI e o controlo foram dispostos num bloco totalmente ao acaso. Começando sete dias após a inoculação, as folhas foram vistoriadas semanalmente para os sintomas de oídio. Quando presente, a gravidade da doença foi marcada. A gravidade da doença foi medida como a percentagem de área foliar sintomática em todas as folhas.
Análise de variância (ANOVA) foi utilizada para analisar os dados transformados e normalizados. Esta análise foi realizada utilizando Statistica, versão 7 (StatSoft, Tulsa, OK, EUA). As médias foram separadas de acordo com teste de Tukey (a = 0,05). Foi utilizado o teste não paramétrico de Kursal-Wallis quando não estavam reunidas as condições para a análise de variância.
Exemplo 9. Biocontrolo de agentes de doenças da madeira (doença Esca). T. atroviride SCI controla os três agentes patogénicos principais da doença Esca. A eficácia do controle de
Phaeomoniella chlamydospora, Phaeoacremonium aleophilum e Fomitiporia mediterrânea é muito alta e perto de 100% (Figura 9) . Os gráficos representam a média de cinco repetições (placas de Petri). A eficácia do controlo de T. atroviride SCI foi sempre melhor do que o agente de controle biológico usado como padrão (Bacillus subtilis F77) .
Condições experimentais
Cada um dos três agentes patogénicos mencionados acima, foi inoculado no PDA em placas de Petri a 3 cm da borda e incubado durante uma semana a 25°C. Em seguida, T. atroviride SCI foi inoculado no lado oposto, a uma distância de 3 cm da borda. Cinco repetições foram feitas para cada agente patogénico e para o controlo. O crescimento micelial foi medido 2, 4, 9, 14, 19, 24 e 29 dias após o tratamento, em particular, C é o crescimento do não tratado (mm) e T o crescimento no tratado com T. atroviride SCI (mm). A eficácia foi calculada com a seguinte fórmula [ (CT)/C] xlOO (Sivakumar et al., 2000).
Exemplo 10. Biocontrolo de podridão da raiz
Mellea Armillaria e A. gallica são o principal agente causal de raizes apodrecidas em diversas culturas. T. atroviride SCI é eficaz contra estes dois organismos patogénicos e é também mais eficaz do T. harzianum T39 como um agente de biocontrolo padrão. Reduziu o crescimento dos agentes patogénicos e, eventualmente, matou-os. Isto é evidente em condições de experiência controlada contra os dois agentes patogénicos cultivados em peças de madeira exibidas na Figura 10, onde o crescimento micelar de Armillaria mellea e Armillaria gallica (agentes causais da podridão da raiz) na presença de Trichoderma atroviride SCI ou na sua ausência, foram comparados. 0 efeito experimental de Trichoderma harzianum T39 - nome comercial Trichodex® - é mostrado aqui para comparação. 0 crescimento é expresso como a média de diâmetro de cinco repetições cultivadas em pedaços de madeira em PDA em placas de Petri a 20°C. T. atroviride SCI também é capaz de prevenir infeções em plantas. De facto, a percentagem de plantas mortas (infetadas) foi avaliada após 6 meses a partir da primeira aplicação, que é quando os sintomas das doenças se tornam visíveis verificou-se que o T. atroviride SCI protegeu os morangueiros da A. mellea (60% de proteção) e da A. gallica (100% de proteção) . Por outro lado, T. atroviride F122 deu apenas 20% de proteção e T.harzianum T39 apenas 13% contra a doença (valores nas Figuras 10 e 11 são percentagens calculadas em 10 de plantas replicadas). No caso dos morangueiros, reduziu significativamente a doença causada por A. mellea e A.gallica, mesmo após 6 meses a partir da aplicação. T. atroviride F122 foi usado como comparação para A. mellea (Fig. 11) e verificou-se exibir uma atividade significativamente mais baixa do que a estirpe SCI.
Condições experimentais A. mellea e A. gallica foram inoculadas em peças de madeira colocadas no PDA em placas de Petri sobre um lado da peça de madeira e incubadas durante uma semana a 25°C. Então T. atroviride SCI foi inoculado no lado oposto. Cinco repetições foram feitas para cada agente patogénico e para o controlo. 0 crescimento micelar foi avaliado semanalmente após o tratamento durante 6 semanas.
Plantas de morango (Elsanta CV) foram inoculadas por colocação de três peças de madeira infetadas com A. melleaou A. gallica perto da copa das plantas. As plantas foram tratadas com T. atroviride SCI cultivada com o método b) (ver Exemplo 3) e o método c) , tal como descrito no Exemplo 3, foi utilizada em alternativa para o mesmo fim de proteger as plantas que necessitam de níveis elevados de matéria orgânica como plantas de mirtilo que dão os mesmos resultados obtidos com plantas de morango mostrados na Figura 11. As plantas foram mantidas em condições controladas de estufa.
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Claims (29)

  1. REIVINDICAÇÕES 1. Estirpe isolada de Trichoderma atroviride SCI, CBS n° 122089, como agente de biocontrolo.
  2. 2. Trichoderma de acordo com a reivindicação 1 para o tratamento de doenças fúngicas das plantas.
  3. 3. Composição agrícola que compreende Trichoderma atroviride SCI isolada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-2 como princípio ativo.
  4. 4. Composição de acordo com a reivindicação 3, que compreende uma quantidade eficaz de 102-103 conídios por ml-1 ou g_1.
  5. 5. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 3-4, compreendendo ainda um segundo agente de controlo biológico e/ou um aditivo, um emulsionante, um nutriente para as plantas, um agente molhante, um micro-nutriente para plantas ou um substrato.
  6. 6. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 3-5, em que o substrato é seleccionado a partir do grupo que consiste em: um meio de cultura nutriente, um cereal ou um seu derivado, um corretor, um vegetal ou uma parte do mesmo, turfa, madeira ou um pedaço destes, argila ou cascas.
  7. 7. Método para a preparação de uma composição agrícola que compreende uma inoculação do isolado de Trichoderma atroviride SCI de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-2, no ou sobre um substrato e permitindo que cresça a uma temperatura compreendida entre 1-30°C até à obtenção de um número de conídios de pelo menos 102-103 ml-1 ou g_1.
  8. 8. Método para a preparação de uma composição agrícola de acordo com a reivindicação 7 que compreende ainda um passo de liofilização.
  9. 9. Método de acordo com a reivindicação 7 em que o referido substrato é seleccionado a partir do grupo que consiste em: um meio de cultura nutriente, um cereal ou um seu derivado, um vegetal ou uma parte do mesmo, madeira ou um pedaço da mesma, um corretor, turfa, argila, ou casca.
  10. 10. Método de acordo com a reivindicação 9 em que o referido meio de cultura nutriente compreende pelo menos uma fonte de carbono e de azoto.
  11. 11. Método de acordo com a reivindicação 10, em que a referida fonte de carbono é seleccionada a partir do grupo que consiste em manose, galactose, sacarose, extrato de malte, celobiose glicose e trealose.
  12. 12. Método de acordo com a reivindicação 10, em que a referida fonte de azoto é selecionada a partir do grupo consistindo em: extrato de levedura, nitrito, triptona, peptona, glutamina e asparagina.
  13. 13. Método de acordo com a reivindicação 9, em que o referido cereal é arroz ou trigo.
  14. 14. Método de acordo com a reivindicação 9 em que o referido substrato é tratado com um meio de cultura nutriente antes do inoculo de Trichoderma atroviride SCI.
  15. 15. Método de acordo com a reivindicação 14 em que o referido meio de cultura nutriente é pulverizado sobre o substrato.
  16. 16. Método de acordo com a reivindicação 15 em que o referido substrato pulverizado é casca.
  17. 17. Método de proteger uma planta contra a doença causada por um fungo patogénico de plantas caracterizado pelo tratamento de pelo menos uma parte da planta ou o solo dentro da proximidade da referida planta com a composição de qualquer uma das reivindicações 2-4.
  18. 18. Método da reivindicação 17, em que a referida parte de uma planta é uma folha, um fruto, uma semente, uma ferida.
  19. 19. Método da reivindicação 17, caracterizado pelo facto da composição ser preparada de acordo com a reivindicação 6.
  20. 20. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 17-19 em que o referido fungo patogénico é seleccionado a partir do grupo que consiste naqueles que causam doenças da madeira(Phaeomoniella chlamydospora, Phaeoacremonium aleophilum e Fomitiporia Mediterrânea) , doenças foliares (o agente causal do oidio Podosphaera xanthii ), frutas e doenças de flores (Botrytis cinerea) e doenças do sistema radicular causadas pelo género Armillaria (Armillaria mellea e A. gallica).
  21. 21. Método de acordo com a reivindicação 20, em que a referida planta é seleccionada a partir do grupo que consiste em: Cucurbitaceae, Rosaceae, Vitaceae, Cruelfereae, Compositae, Umbelliferae Solanaceae e Liliaceae.
  22. 22. Método de acordo com a reivindicação 21 em que a referida planta é seleccionado no grupo que consiste em: Cucurbitaceae, Rosaceae ou Vitaceae.
  23. 23. Produto liofilizado ou uma cultura em ágar de atroviride Trichoderma SCI de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-2.
  24. 24. Substrato compreendendo uma quantidade eficaz do microrganismo de acordo com qualquer das reivindicações 1-2, ou tratado com a composição de qualquer uma das reivindicações 3-5.
  25. 25. Substrato de acordo com a reivindicação 24, obtenível de acordo com o método de qualquer uma das reivindicações 6-15.
  26. 26. Substrato de acordo com qualquer uma das reivindicações 24-25, que é casca.
  27. 27. Método para a deteção específica de Trichoderma atroviride SCI em que a amplificação paralela do gene endoquitinase 42 (ech42) n° de acesso GenBank AB041753.1 (SEQIDN0: 7) e de um gene da subunidade α da proteína G (tga3) n° de acesso GenBank AF452097.1 (SEQIDN0: 8) é obtida por PCR com conjuntos de iniciadores apropriados e em que numa amostra compreendendo os referidos Trichoderma atroviride SCI dois nucleótidos polimórficos na posição 185 e 196 do gene de endoquitinase 42 são especificamente identificados.
  28. 28. Método de acordo com a reivindicação 27, em que o conjunto de iniciadores para a amplificação do gene endoquitinase 42 (ech42) tem a sequência SEQIDN0: 1 e SEQIDN0: 2 e em que o conjunto de iniciadores para a amplificação do gene da subunidade α da proteína G (tga3) tem a sequência SEQIDN0: 4 e SEQIDN0: 5.
  29. 29. Método de acordo com a reivindicação 28 que é uma PCR em tempo real e em que a sonda para o (ech42) compreende os nucleótidos polimórficos na posição 185 e 196 do gene de endoquitinase 42, de preferência correspondente a SEQIDN0: 3.
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