PT1694714E - Novos polissacáridos com pequena massa molecular possuindo actividade anti -trombótica - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO

"NOVOS POLISSACÁRIDOS COM PEQUENA MASSA MOLECULAR POSSUINDO ACTIVIDADE ANTI-TRGMBÓTICA"

OBJECTO DA INVENÇÃO A invenção presente diz respeito a novos polissacáridos com massa molecular pequena derivados do polissacárido K5, exibindo uma boa actividade sobre os parâmetros de coagulação com um pequeno risco hemorrágico, úteis como medicamentos para a regulação da coagulação e para a prevenção e o tratamento da trombose. Mais em especial, a invenção refere-se a novos N,O-sulfatos de epiK5 com pequena massa molecular (PMM) com um grau de sulfatação de entre 2,7 e 2,9, que se podem obter tratando novos N-sulfatos de epiK5 com PMM (por sua vez , obtidos por despolimerização nitrosa dos N-sulfatos de epiKS), com um agente de O-sulfatação em condições de sobressulfataçâo em 0, submetendo o O-sobressulfato de epiKS-amina com PMM que desta forma se obteve a uma 0-dessulfatação selectiva, tratando o produto parcialmente O-dessulfatado que desta forma se obteve de modo a se obter uma 6-0-sulfatação e por ultimo tratando o produto 6-0-ressulfatado que desta forma se obtém com um agente de sulfatação em condições de sulfatação em N. Para além disto, a invenção diz respeito a um processo para a preparação dos referidos N,O-sulfatos de epiK5 com PMM apresentando um grau de sulfatação de entre 2,3 e 2,9, e a novos intermediários. 2

ESTADO DOS CONHECIMENTOS À DATA DA INVENÇÃO

As glicosaminoglicanas, tais como a heparina, o sulfato de heparana, o sulfato de dermatana, o sulfato de condroitina e o ácido hialurónico são biopolimeros que são industrialmente extraídos a partir de diversos órgãos de animais. A heparina em especial, obtida sobretudo por extracção a partir da mucosa intestina de suíno ou do pulmão bovino, é um copolímero polidisperso com uma distribuição de massa molecular de entre aproximadamente 3.000 e aproximadamente 30.000 D, constituído por uma mistura de cadeias que são basicamente constituídas por um ácido urónico (ácido glucurónico ou ácido idurónico) e por uma derivado amínico de um açúcar (glucosamina) ligados por ligações a-1 -> 4 ou β-l -> 4. Na heparina, a unidade urónica pode ser sulfatada em O na posição 2 e a unidade de glucosamina é acetilada em N ou sulfatada em N, sulfatada em 6-0, e sulfatada em 3-0, em aproximadamente 0,5 % das unidades de glucosamina presentes.

As propriedades e a biossíntese natural da heparina em mamíferos foram descritas por Lindahl· et al., 1986 em Lane, D. e Lindahl, U. (Editores) "Heparin! Chemical and Biological Properties; Clinicai Applications", Edward Arnold, Londres, Páginas 159-190, por Lindahl, U, Feingold D. S. e Roden L, 1986 TIBS, 11, 221-225 e por Conrad Η. E. "Heparin Binding Proteins", Capítulo 2: Structure of Heparinoids, Academic Press, 1998. A biossíntese da 3 heparina ocorre a partir do seu precursor, N-acetil-heparosana, que é constituída por uma mistura de cadeias consistindo na unidade dissacarídica repetitiva glucuronil-p-l->4-N-acetilglucosamina. 0 referido precursor sofre modificações enzimáticas que hidrolisam parcialmente o grupo N-acetilo, o substituem por um grupo SQ3-, epimerizam o carboxilo na posição 5 de parte das unidades glucurónicas, as t-ransformam em unidades idurónicas e introduzem grupos O-sulfato para se obter um produto que, uma vez extraído industrialmente, tem aproximadamente o dobro dos grupos sulfato em relação ao número de grupos carboxilo por unidade de dissacárido. Estas modificações enzimáticas levam, entre outras coisas, à formação da região de ligação pentassacarídica antitrombina III (ATUI) , o assim denominado pentassacárido activo, que é a estrutura necessária para a ligação de alta afinidade da heparina com o ATUI e que é fundamental para a actividade antícoagulante e antitrombótica da heparina. Este pentassacárido, presente apenas dentro de algumas- das cadeias que formam a heparina, contém uma unidade de glucosamina sulfatada na posição 3 e um ácido glucurónico no espaço compreendido entre dissacáridos contendo ácidos idurónicos.

Na natureza, a formação do pentassacárido activo é tornada possível pela reacção de epimerização do carboxilo de uma parte das unidades glucurónicas a unidades idurónicas, que é proporcionada pela D-glucuronil C5-epimerase (epimerização em C5) e por uma sulfatação adequada que também leva à introdução de um grupo sulfato no hidroxilo 4 da posição 3 da glucosamina. Mais em especial, na natureza, a formação do pentassacárido activo é tornada possível pelo facto de que a epimerização em C5 ocorre em agregados, isto é, sobre porções de cadeias, e de forma extensiva, de que resulta um produto que contém mais unidades idurónicas do que unidades glucurónicas. A heparina comercial, de facto, contém aproximadamente 70 % de unidades idurónicas e 30 % de unidades glucurónicas.

DESCRIÇÃO DA TÉCNICA ANTERIOR

Sabe-se que o polissacárido capsular K5 isolado de Escherichia coli, descrito por Vann W. F. et al., em European Journal of Biochemistry, 1981, 116, 359-364 ("Vann 1981"), consiste numa mistura de cadeias formadas pela unidade dissacarídica repetitivo glucuronil-p~l->4-N-acetilglucosamina e portanto evidencia a mesma unidade dissacarídica repetitiva (A)

coo çh2ohI— Q i— Q

OH NHCOCHg (A) da N-acetil-heparosana precursora da heparina. 0 polissacárido capsular K5, doravante referido apenas como "polissacárido K5", ou mais simplesmente por "K5", foi quimicamente modificado por Lormeau et al. tal como se encontra descrito na US 5.550.116 e por Casu et al. tal como descrito em Carbohydrate Research, 1994, 263, 271-284. 5

Estão descritos O-sulfatos de K5 com propriedades antitumorais, antimetastáticas, antivirais, em especial anti-HIV, na EP 333.243 e no WO 98/34.958. Também se modificou K5 utilizando meios químicos e enzimáticos para se obterem produtos com o mesmo tipo de actividade biológica sobre a coagulação in vitro do que a da heparina tal como extraída dos órgãos de animais (heparina extractiva). A obtenção de produtos que tenham uma actividade sobre a coagulação que seja do mesmo tipo que a da heparina extractiva ocorre por processos que mimetizam aqueles que ocorrem na natureza e que incluem o passo chave de epimerização em C5 com D-glucuronil C5 epimerase.

Os processos descritos na IT 1.230.785, no WO 92/17.507, no WO 96/14.425 e no WO 97/43.317 utilizam K5 como matéria-prima. Ο K5 proveniente de uma fermentação . é submetido a uma N-desacetilação seguida por uma N-sulfatação e, no N-sulfato de K5 que desta forma ' se obtém, por uma epimerização em C5 com uma C5-epimersse, obtida quer por cromatografia de uma solução de enzimas microssomais do mastocitoma murino (IT 1.230.785), quer de fígado bovino (WO 92/17.507, WO 96/14.425 e WO 97/43.317), que se leva a cabo em solução. A D-glucuronil C5-epimerase do fígado de bovino foi purificada por Campbell, P. et ai. em J. Biol. Chem., 1994, 269/43, 26953-26958 ("Campbell 1994") que também descreveu a sua composição em aminoácidos e descreveu a sua 6 utilização em solução- para a transformação de um N-sulfato de K5 no produto correspondente epimerizado a 30 %, demonstrando a formação de ácido idurónico por um método de HPLC a seguir a uma despolimerização nitrosa total, até um dissacárido. O documento WO 98/48.006 descreve a sequência de ADN que codifica para. a D-glucuronil-C5-epimerase e uma D-glucurohil-C-5 epimerase recombinante, obtida a partir de um vector de expressão recombinante contendo o ADN referido, subsequentemente purificada por Campbell et al. tal como evidenciado por Jin-Ping L. et al. em J. Biol. Chem. 2001, 276, 20069-20077 {"Jin-Ping 2001"). A sequência completa da C5-epimerase foi descrita por Crawford B. E. et al. em J. Biol. Chem., 2001, 276 (24), 21538-21543 (Crawford 2001). O documento WOOl/72.848 descreve um método para a preparação de derivados N-desacetilados, N-sulfatados de um polissacárido K5, epimerizado em pelo menos 40 % de ácido idurónico em relação ao total de ácidos urónicos, apresentando uma massa molecular de entre 2.000 e 30.000, contendo entre 25 e 50 % de cadeias com elevada afinidade para ATUI e possuindo uma actividade anticoagulante e antitrombótica, expressa sob a forma de razão HCII/anti-Xa, de entre 1,5 e 4. O processo referido, que inclui em sequência a preparação de K5 a partir de Escherichla coli, a N-desacetilação e a 7 N-sulfatação, a epimerização em C5, a sobressulfatação, a O-dessulfatação selectiva, a 6-0-sulfatação e a N-> sulfatação, proporciona uma epimerização em C5 levada a cabo com uma C5 epimerase, em solução ou imobilizada, na presença de catiões divalentes específicos. De acordo com o documento WO 01/72.848, a epimerização em C5 pode ser levada a cabo indiferentemente com um enzima natural ou recombinante, imobilizado ou em solução, a uma temperatura de entre 30 e 4 0°C durante um período de tempo de entre 1 e 24 horas.

Para além disto, o documento referido descreve uma reacção de despolimerização com ácido nitroso, levada a cabo sobre o produto final no fim da sequência reaccional mencionada acima. 0 documento US 2002/0062019 descreve um processo para a preparação de N,O-sulfatos de epiK5, activos na regulação da coagulação, tendo um grau de sulfatação de entre 2,3 e 2,9 e uma massa molecular de entre 2.000 e 30.000, ou de entre 4.000 e 8.000, ou entre 18.000 e 30.000. O processo mencionado envolve os passos: (s-a) uma N-desacetilação do polissacárido K5 e uma N-sulfatação da amina K5 resultante, (s-b) uma epimerização do N-sulfato de K5, (s-c) uma O-sobressulfatação do N-sulfato de epiK5, (s-d) um 0-dessulfatação parcial, (s-e) uma 6-0-sulfatação selectiva, (s-f) uma N-sulfatação do produto assim obtido, sendo qualquer dos produtos obtidos no fim de qualquer um dos passo (s-b) a (s-f) susceptível de ser submetido a uma despolimerização. O documento referido descreve um N,0- 8 sulfato de epiK5 com uma massa molecular de 7.400, obtido pelos passos acima mencionados (s-a) a (s-f) seguidos por uma despolimerização nitrosa no final dos passos (s-f), com um grau de sulfatação de entre 2,3 e 2,9. O mesmo documento também descreve uma fracção de K5 com uma massa molecular de aproximadamente 5.000, que também pode ser submetida aos passos (s-a) a (s-f).

Para uniformizar a terminologia e tornar o texto mais compreensível, na descrição presente utilizar-se-ão termos ou expressões convencionais, no singular ou no plural. Em especial: com o termo "K5" ou "polissacárido K5" pretende signíficar-se um polissacárido capsular da Escherichia coli obtido por fermentação, isto é, uma mistura de cadeias constituídas por unidades de. dissacárido (A) contendo opcionalmente uma ligação dupla na extremidade não redutora tal como se ilustra acima, mesmo assim preparada e purificada de acordo com os métodos descritos na literatura, em especial de acordo com Vann 1981, de acordo com Manzoni M. et al.r Journal of Bioactive Compatible Polymers, 1996, 11, 301-311 ("Manzoni 1996") ou de acordo com o método descrito no WO 01/72.848, no US 2002/0062.019; é óbvio para um especialista da técnica que quanto se expõe doravante neste, documento pode' ser aplicado a qualquer N-acetil-heparosana; - por "epimerase C5" pretende significar-se a D-glucuronil 9 C5 epimerase, extractiva ou recombinante, preparada seja como for, isolada e purificada, em especial tal como e descreveu em Campbell 1994, no WO 98/48.006, em Jin-Ping L. e tal. em J. Biol. Chem. 2001, 276, 20069-20077 ("Jin-Ping 2001) ou em Crawford 2001. - amina K5 significa uma K5 pelo menos 95 % N-desacetilada, preferivelmente completamente N-desacetilada, nomeadamente na qual não são detectáveis grupos N-acetilo com um aparelho normal de RMN; - "N-sulfato de K5" significa uma K5 pelo menos 95 % desacetilada, preferivelmente 100 % N-desacetilada, e :N-sulfatada, uma vez que não são detectáveis grupos N-acetilo com um aparelho normal de RMN; - "epiK5" significa K5 e os seus derivados em que 40 % a 60 % das unidades glucurónicas estejam epimerizadas em C5 a unidades idurónicas; - "N-sulfato de epiK5" significa um N-sulfato de K5 em que 40 % a 60 % das unidades glucurónicas estejam epimerizadas em C5 a unidades idurónicas; - "O-sobressulfato de epiK5-amina" significa um N,O-sulfato de epiKó-amina com um grau de sulfatação de pelo menos 2; - "N,O-sulfato de epiK5" significa um N,O-sulfato de K5 em que 40 % a 60 % das unidades glucurónicas estejam epimerizadas em C5 a unidades idurónicas, com um grau de 10 sulfatação de entre 2,3 e 2,9; - os termos e expressões convencionais que se definiram acima neste documento referem-se a K5 tal como é isolado após fermentação, em geral com uma distribuição de massa molecular de entre aproximadamente 1.500 e aproximadamente 50.000, com uma massa molecular média de entre 12.000 e 25.000, vantajosamente 15.000 a 25.000; - a não ser que a massa molecular seja especificada de uma outra forma, os termos e as expressões convencionais que se definiram acima neste documento, quando qualificados pelo termo "PMM" (pequena massa molecular), em especial N-sulfato de epiK5 de PMM, O-sobressulfato de epiK5-amina de PMM, N,O-sulfato de epiK5 de PMM, designam produtos com baixa massa molecular com uma massa molecular média de entre cerca de 1.500 e cerca de 12.000: - quando qualificados pelo termo "derivados de", os termos e as expressões convencionais tal como se definiram acima neste documento, indicam tanto os derivados de K5 nativo como os de K5 com baixa massa molecular, em conjunto; - a expressão "N-sulfato de epiK5 com PMM despolimerizado" designa um N-sulfato de epiK5 com PMM obtido de acordo com a sequência (i) -> (ii) ou com a sequência (ii) -> (i) tal como se ilustra adiante neste documento; de forma análoga, as expressões "O-sobressulfato de epiK5-amina com PMM despolimerizado" e "N,O-sulfato de epiK5 com PMM despolimerizado" designam respectivamente um O- 11 sobressulfato de epiK5-amina com PMM e um N,O-sulfato de epiK5 com PMM que foram obtidos a partir de um N-sulfato de epiK5 com PMM despolimerizado ; - o prefixo "epi", que precede "K5" nos termos e nas expressões convencionais tal como se definiram acima neste documento, indica tanto os produtos provenientes de K5 nativo como os de. epiKõ (epimerizado a entre 40 e 60 %) , tal como se definiu acima, em conjunto.

Para além disto: a não ser aonde se indica especificamente algo em contrário, a expressão "massa molecular" ou "massa molecular média" indica.a massa molecular determinada por HPLC em relação ao padrão de heparina e a heparina com baixa massa molecular; - o termo "aproximadamente" e a expressão "cerca de", quando se referem à massa molecular, significam a massa molecular medida por viscosimetria ± a massa molecular teórica de uma unidade de dissacárido, incluindo a massa do sódio, calculada como sendo 4 61 no caso de um derivado de N-sulfato de epiK5 e como sendo 644 no caso de um derivado N,O-sulfato de epiK5 com um grau de sulfatação de 2,8; - a expressão "espécie preponderante" significa o composto que, na mistura que constitui o N-sulfato de epiKS com PMM, o O-sobressulfato de epiK5-amina com PMM ou o N,O-sulfato epiKS com PMM, é a espécie mais representada, determinada 12 pelo pico da massa molecular medida por HPLC; a não ser quando se afirme especificamente algo em contrário, "grau de sulfatação" significa a razão S03~/C00”, que também pode ser expressa através do número de grupos sulfato por unidade de dissacárido, medida pelo método de condutividade descrito por Casu B. et al. em Carbohydrate Research, 1975, 39, 158-176 (Casu 1975); - "condições de sobressulfatação" significa uma 0- sulfatação extrema levada a cabo, por exemplo, de acordo com o Método C descrito por B. Casu et al. em Carbohydrate Research, 1994, 263, 271-284 (Casu 1994); —. o termo "alquilo" significa um alquilo linear ou ramificado, enquanto que "tetrabutilamónio" denota o grupo tetra(n-butil)amónio.

Por último, deve anotar-se que, na literatura, o polissacárido K5 (K5) também é denominado "acetilaminoheparosana". Desta forma, a K5-amina corresponde à "aminoheparosana", o N-sulfato de K5 corresponde à "sulfaminoheparosana", e assim por diante, enquanto, quando estes produtos são epimerizados, os termos acima na literatura são sucedidos pelo termo "epimerizada". Neste contexto, a descrição presente refere-se a "K5" com o intuito de enfatizar a origem dos produtos que são descritos neste documento.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO

No pedido de patente PCT/IB03./02338 descrevem-se derivados' 13 de O-sobressulfato de epiK5-amina úteis a titulo de intermediários na preparação de derivados de N,O-sulfato de epiKS com actividades antiangiogenética e antiviral. Os derivados de O-sobressulfato de epiK5~amina são preparados por um processo que inclui tratar-se um derivado N-sulfato de epiKS com, preferivelmente, hidróxido de tetrabutilamónio, deixando a mistura reaccional repousar durante um período de tempo de 30-60 minutos a um pH de cerca de 7 e isolando o sal, preferivelmente o sal' de tetrabutilamónio, que desta forma se obtém; e tratando o sal referido com um agente de O-sulfatação sob condições de O-sobressulfatação. O documento mencionado acima descreve a preparação de O-sobressulfatos de epiK5-amina com PMM a partir de um N-sulfato de epiK5 com PMM. O mesmo documento PCT/IB03/02338, bem como os documentos IT MI2002A001346 e IT MI2002A001854, descrevem pela primeira vez N-sulfatos de epiK5 com PMM, preferivelmente isentos de grupos N-acetilo, em que o conteúdo em ácido idurónico em relação ao total de ácidos urónicos é de 40 % a 60 %, preferivelmente cerca de 50 %. Os referidos N-sulfatos de epiK5 com PMM são intermediários úteis na preparação de N,O-sulfatos de epiK5 com PMM contendo um elevado grau de actividade em diversos parâmetros biológicos, em especial em parâmetros de coagulação (IT MI2002A001346). A preparação dos referidos N-sulfatos de epiK5 com PMM está descrita em pormenor nos três documentos referidos acima.

Para além disto, o PCT/IB03/02339 descreve composições farmacêuticas contendo, sob a forma de ingrediente activo, 14 um derivado O-sobressulfato de epiK5-amina ou um seu sal aceitável do ponto de vista farmacêutico, que se pode obter por um processo que inclui: - tratar-se um derivado de N-sulfato de (epi)K5, sob forma acidica, com uma base orgânica terciária ou quaternária, deixando a mistura reaccional repousar durante um período de tempo de 30-60 minutos, mantendo o pH da solução a um valor dé aproximadamente 7' pela adição da referida base orgânica terciária ou quaternária e isolando o sal com a referida base'orgânica; e - tratar-se o referido sal de base orgânica do referido derivado N-sulfato de (epi)K5 com um reagente, de 0-sulfatação em condições de O-sobressulfatação e isolando o derivado de O-sobressulfato de (epi)K5-amina.

Ao preparar derivados N,O-sulfatados, .N-desacetilados do polissacárido K5, pelo menos 4 0 % epimerizados a ácido idurónico no que toca aos ácidos urónicos totais e tendo uma massa molecular pequena tal como foi descrito no WO 01/72.848 e no US 2002/0062.019, observou-se que a despolimerização do produto com massa molecular elevada obtido no final do passo (g) do. processo descrito no WO 01/72.848 e no final do passo (vi) do processo descrito no US 2002/0062.019 se podem obter resultados não uniformes uma vez que, em geral, dele resultam produtos despolimerizados com uma actividade muito menor sobre todos os parâmetros de coagulação do que os produtos com massa molecular elevada de que eles derivam. Assume-se que isto 15 sucede porque a degradação com ácido nitroso é influenciada pela presença dos grupos sulfato. Em especial, a presença de sulfatos na posição 3 da glucosamina origina produtos heterogéneos, tal como foi descrito por Nagasawa et al. em Thrombosis Research, 1992, 65, 463-467 (Nagasawa 1992). No US 2002/0062.019, o inconveniente tem sido ultrapassado levando a cabo um passo de O-dessulfatação selectiva mantendo o período reaocional do produto sobressulfatado com sulfóxido de dimetilo /metanol na gama de 135-165 minutos, preferivelmente a cerca de 60°C durante 150 minutos. Este método específico, vantajoso, está descrito em pormenor no WO 02/50.125.

Verificou-se agora que se podem preparar N,O-sulfatos despolimerízados de epiK5 com PMM com um grau de sulfatação de entre cerca de 2,3 e 2,9 e com uma boa actividade sobre os parâmetros de coagulação submetendo um N-sulfato despolimerizado de epiK5 com PMM a uma reacção de 0-sobressulfatação, por exemplo de acordo com o Método C descrito por B. Casu et al. em Carbohydrate Research, 1975, 39, 168-176 {Casu 1975), para se obter um O-sobressulfato despolimerizado de epiK5-amina com PMM, pelo tratamento do produto despolimerizado e sobressulfatado a uma 0-dessulfatação selectiva, e depois a uma 6-O-sulfatação e por último tratando o produto parcialmente dessulfatado, despolimerizado ' que assim se obteve com um agente de sulfatação sob as condições de uma N-sulfatação, para se isolar o N,O-sulfato despolimerizado de epi-K5 com PMM que se pretendia com um grau de sulfatação de entre cerca de 2,3 e cerca de 2,9. 16

Também se verificou que, trabalhando a partir de um Ν'-sulfato despolimerizado de epiK5 com PMM, a O-dessulfatação parcial selectiva com sulfóxido de dimetilo/metanol pode ser levada a cabo numa gama mais larga de períodos de aquecimento, obtendo-se desta forma, de uma forma reprodutível, N,O-sulfatos despolimerizados de epiK5 tendo sempre parâmetros de coagulação com uma actividade elevada, embora variáveis em função dos períodos de O-dessulfatação selectiva empregues.

Em especial, veríficou-se de forma surpreendente que, quando se submete a uma O-sobressulfatação um N-sulfato despolimerizado de epiK5 com PMM com uma massa molecular média de cerca de 6.000 a uma O-dessulfatação selectiva, o O-sobressulfato despolimerizado de epiKS-amina assim obtido a uma O-dessulfatação selectiva, o produto despolimerizado e parcialmente O-dessulfatado a um 6-0-sulfatação e depois a uma N-sulfataçâo sob condições semelhantes as descritas no WO 02/50.125, se obtém um N,O-sulfato despolimerizado de K5 com PMM, que apresenta uma massa molecular média de cerca de 6.000, um grau de sulfatação de 2,7 a 2,9, uma actividade anti-Xa e uma actividade anti-IIa que são ambas tão elevadas como metade .da actividade do padrão de heparina de pequena massa molecular (pHPMM), nomeadamente com uma razão de actividades anti-Xa/anti-IIa idêntica com a do pHPMM, mas com uma capacidade de aumentar o período de coagulação entre 5 a 8 vezes inferior do que a do pHPMM. Deste modo, foi obtido pela primeira vez uma glicosaminoglicana derivada do polissacárido K5 que pode ser assimilada ao pHPMM, no que toca à razão de actividades 17 anti-Xa/anti-IIa e que, a dosagens iguais, apresenta um risco hemorrágico que é 2,5 a 4 vezes inferior que o de pHPMM.

Para além disto, verificou-se que todos os O-sobressulfatos despolimerizados de epiK5-amina com PMM que se podem obter pelo processo que inclui o tratamento de um N-sulfato despolimerizado de epiK5 com PMM com um agente de 0-sulfatação em. condições de O-sobressulfatação, são substancialmente isentos de actividade anticoagulante e apresentam uma boa actividade microbicida, tal como a dos O-sobressulfatos de epiK5-amina com PMM descritos no PCT/IB03/02339.

Por último, verificou-se que todos os derivados de 0-sobressulfato de (epi)K5-amina possuindo um grau de sulfatação de entre 2 e 4, obtidos por tratamento dos correspondentes derivados de N-sulfato de (epi)K5 com um agente de O-sulfatação em condições de O-sobressulfataçâo, são substancialmente isentos de actividade anticoagulantes, possuem uma boa actividade microbicida, è são portanto ingredientes activos para a preparação de composições farmacêuticas. As composições farmacêuticas referidas destinam-se ao tratamento de infecções de origem microbiana, em particular virai.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS Ά Figura 1 ilustra o espectro de RMN de 13C do O-sulfato despolimerizado de epiK5-amina com PMM do Exemplo l(b). 18 A Figura 2 ilustra o espectro de RMN de 13C do O-sulfato despolimerizado de epiKS-amina com PMM contendo 80 % do 6-O-sulfato do Exemplo 1(c) . A Figura 3 ilustra o espectro de RMN de 13C do N, O-sulfato despolimerizado final de epiKS-amina com PMM do Exemplo l(d), indicando a presença de unidades de 2,5-anidromanitol sulfatadas.

DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DA INVENÇÃO É portanto um objecto da invenção, presente proporcionar um processo para a preparação de novos N,O-sulfatos despolimerizados de epiKS com PMM, com um . grau se sulfatação de entre 2,3 e .2,9, e dos seus sais aceitáveis do ponto de vista farmacêutico, que inclua: (a) tratar-se um sal com uma base orgânica terciária ou quaternária de um N-sulfato despolimerizado de epiK5 com PMM em condições de O-sobressulfatação para se obter um 0-sobressulfato despolimerizado de epiK5-amina com PMM; (b) submeter-se o O-sobressulfato despolimerizado de epiKS-amina com PMM · que dessa forma se obteve a uma 0-dessulfatação selectiva para .sé obter um 0-sulfato despolimerizado de epiKS-amina; (c) tratar-se um sal com uma base orgânica terciária ou quaternária do O-sulfato despolimerizado de epiK5-amina que desta forma se obteve çom um agente de 0-sulfatação para se 19 obter um O-sulfato despolimerizado de epiK5-amina contendo pelo menos 80 % de 6-O-sulfato; (d) submeter-se o O-sulfato despolimerizado de epiK5-amina contendo pelo menos 80 % de 6-O-sulfato que daquela forma se obteve por uma reacção de N-sulfatação e isolar-se o N,O-sulfato despolimerizado de epiK5 que assim se obtém, preferivelmente sob a forma de um seu sal sódico que opcionalmente se pode transformar noutro sal aceitável do ponto de vista farmacêutico.

Os sais com metais alcalinos, em especial com sódio ou com potássio, com metais alcalino-terrosos, em especial com cálcio e com magnésio, com alumínio e com zinco, são sais preferidos aceitáveis do ponto de vista farmacêutico.

Os N-sulfatos despolimerizados de epiKS com PMM de que se parte podem ser preparados submetendo um N-sulfato de epiK5 a uma despolimerização nitrosa seguida por uma redução com borohidreto de sódio.- Os N-sulfatos de epiK5 utilizados para a preparação dos N-sulfatos despolimerizados de epiK5 com PMM de que se parte são aqueles que possuem um conteúdo em ácido idurónico de 40-60 % e que contêm pelo menos 95 % de grupos N-sulfato, tal como por exemplo os descritos no WO 01/72.848, no US 2002/0062.019 ou no WO 02/068.477.

Mais em particular, os N-sulfatos despolimerizados de epiK5 com PMM de que se parte tal como se ilustraram acima são preparados por um processo que inclua submeter-se um N-sulfato de K5, sob uma ordem qualquer, 20 (i) a uma epimerização em C5 com uma D-glucuronil C5-epimerase, um isolamento, uma purificação·, em solução ou imobilizados sobre um suporte sólido, a um pH de aproximadamente 7, a uma temperatura de aproximadamente 30°C e durante um período de tempo de aproximadamente 12-24 horas na presença de pelo menos um ião divalente seleccionado de entre cálcio, magnésio,'bário e manganês; e (ii) a' uma despolimerização. nitrosa seguida por uma redução, normalmente com borohidreto de sódio. A expressão "por uma ordem qualquer" significa que o processo pode indiferentemente ser levado a cabo quer na direcção (i) -> (ii) , isto é, pela sequência mencionada acima, quer na direcção reversa, isto é (ii) -> (i) , submetendo portanto primeiro o N-sulfato de K5 à reacção de despolimerização nitrosa, seguida pela redução com borohidreto de sódio, e depois a uma epimerização em C5 nas condições mencionadas acima. A ordem preferida é a configurada pela direcção (i) -> (ii) . A sequência (ii) -> (i) é utilizada de preferência partindo de N-sulfatos de K5 com PMM com uma massa molecular média superior a 4.000, preferivelmente a partir de cerca de 6.000. Por exemplo, pode determinar-se a quantidade de nitrito de sódio que, partindo de 1 g de N-sulfato de epiKS, permite obter-se um N-sulfato de epiK5 com PMM com uma massa molecular média superior a 4.000, em especial de no mínimo 6.000, para se obterem intermediários úteis para a preparação dos correspondentes N,O-sulfatos de epiK5 com PMM com um grau de sulfatação de entre 2,3 e 2,9. De facto, neste caso, no 21 passo (ii), a percentagem de epimerização óptima é obtida. Assim, quando a preparação do N-sulfato despolimerizado de ep±K5 com PMM é levada a cabo de acordo com a sequência (ii) -> (i) , a epimerização ocorre de . um modo óptimo caso seja levada a cabo sobre um N-sulfato despolimerizado de K5 com PMM que tenha uma massa molecular média superior a 4.Ó0Ô, vantajosamentedé' entre 5.000 e 7.500, preferivelmente de entre 6.000 e 7.500.

Os simbolos (i). e (ii) , tal como utilizados adiante neste documento, designam o passo de despolimerização e, respectivamente o passo de epimerização em C5, qualquer que seja a ordem que se utiliza para levar a cabo estes passos*

Pode utilizar-se a epimerase C5 em solução ou imobilizada sobre um suporte sólido inerte. Neste último caso, a epimerase C5, preferivelmente recombinante, isolada e purificada por exemplo de acordo com Campbell 1994, WO 98/48.006, Jin-Ping 2001 ou com Crawford 2001, é imobilizada sobre um suporte inerte na presença do substrato, isto é, na presença do N-sulfato de K5 de que se parte ou de N-sulfato de K5 com PMM, este último apresentando normalmente uma massa molecular média superior a 4.000, vantajosamente de entre 4.000 e 7.500, mais vantajosamente de entre 5.000 e 7.500, preferivelmente de pelo menos. 6.000. A imobilização é levada a cabo de acordo com métodos convencionais, por exemplo tal como descrito no WO 01/72.848. A reacção de epimerização em C5 é . levada a cabo 22 recirculando 20-1.000 mL de uma solução de HEPES 25 mM a um pH de. aproximadamente 7, contendo 0,001-10 g de substrato (N-sulfato de K5 ou N-sulfato de K5 com PMM, este último apresentando normalmente uma massa molecular média superior a 4.000, em especial de entre 4.000 e 7.500) e umcatião seleccionado de entre cálcio., magnésio, bário, e manganês a uma concentração de entre 10 e 60 mM, através de uma coluna contendo entre 1,2 xlO7 e 3 xlO11 cpm do enzima imobilizado, mantendo o pH a aproximadamente 7, a aproximadamente, 30°C, a um caudal de 30-220 mL/hora durante um .período de tempo de 12-24, horasvantajosamente de 15-24 horas. A solução . referida é preferivelmente recirculada a um caudal de aproximadamente 200 mL/hora de um dia para o outro (15-20 horas). Purifica-se o produto obtido e separa-se de acordo com métodos conhecidos, por exemplo por ultrafiltração e precipitação com etanol. 0 produto que se obtém deste modo consiste quer em N-sulfato de epiK5 (e num tal caso ele é dissolvido em água e submetido a uma despolimerização) ou em N-sulfato de epiK5 com PMM (e num tal caso ele é o produto final) . A percentagem de epimerização, na prática a quantidade de unidades idurónicas em relação à de unidades glucurónicas, é calculada utilizando RMN de 1H de acordo com o método descrito no WO 96/4.425. A reacção de despolimerização nitrosa é levada a cabo de acordo com métodos conhecidos de despolimerização da heparina, por exemplo de acordo com o método descrito na EP 37.319, no WO82/03.627 ou de acordo com o método de 23 despolimerização de ura N-sulfato de K5 descrito na EP 544.592, mas partindo de um N-sulfato de K5 ou de um N-sulfato de epiK5 contendo entre 0 e não mais do que 5 % de grupos acetilo. A despolimerização, levada a cabo com nitrito de sódio e com ácido clorídrico sobre um N-sulfato de epiK5, é seguida por uma redução in si tu com borohidreto de sódio.

Na prática, leva-se uma solução aquosa fria de N-sulfato de (epi)K5a um pH ácido (aproximadamente 2) com ácido clorídrico e, ainda a frio, trata-se com nitrito de sódio, mantendo a temperatura (aproximadamente 4°0) e o pH (aproximadamente 2) constantes e, terminando a despolimerização (aproximadamente 15-30 minutos) neutraliza-se a solução com hidróxido de sódio e trata-se, ainda a aproximadamente 4°C, com uma solução aquosa de borohidreto de sódio. Quando termina a redução (aproximadamente 4 horas) destrói-se o. excesso. de borohidreto de sódio com ácido clorídrico, neutraliza-s.e a solução com hidróxido de sódio e o produto despolimerizado 8e reduzido) é isolado de acordo com métodos conhecidos, por exemplo por uma simples precipitação com etanol ou com acetona. O produto obtido no final da despolimerização pode ser quer um N-sulfato de epiK5 com PMM (e nesse caso ele constitui o produto final) ou um N-sulfato de K5 de PMM (e nesse caso é directamente submetido a uma epimerização em C5 tal como se delineou acima neste documento, após o seu isolamento), em especial quando ele tem uma massa molecular média superior 24 a 4.000, vantajosamente entre 4.000 e 7.500, mais vantajosamente entre 5.000 e 7.500, preferivelmente de pelo menos 6.000. Controlando, adequadamente a reacção de despolimerização, em especial utilizando diversas quantidades de nitrito de sódio/ácido clorídrico, obtêm-se N-sulfatos de epiK5 com PMM possuindo uma massa molecular média em todo o intervalo de entre aproximadamente 1.500 e aproximadamente 12.000, vantajosamente entre aproximadamente 1.500 e aproximadamente 10.000, preferivelmente entre aproximadamente 1.500 e aproximadamente 7.500, calculados no espectro de RMN de 13C pela integração do sinal atribuido ao C2 do 2,5-anidromanitol, em relação ao do carbono anoméríco da glucosamina dentro da cadeia polissacarídica:

De acordo com um modo geral de proceder, partindo por exemplo de 1 g de N-sulfato de epiK5, dissolve-se a matéria-prima em 100-200 mL de água desionizada e termostatiza-se a 4°C. Em' seguida adiciona-se uma quantidade de nitrito de sódio de modo a obter-se a massa molecular média pretendida. Para se obter, por exemplo, um N-sulfato de (epi)K5 com PMM com uma massa molecular media de entre cerca de 2,000 e cerca de 4.000 partindo de um N-sulfato de (epi). K5 com uma massa molecular média, de cerca de 2 0.000 (medida com o método por HPLC equipado com uma coluna BioRad BioSil 250 e utilizando um padrão de heparina com massa molecular conhecida), será necessária a adição de 330 a 480 mg de nitrito de sódio dissolvido, numa solução aquosa a 0,2 %. Leva-se a solução contendo o N-sulfato de (epi)K5 e o nitrito de sódio, mantida a 4°C, a um pH 2 por 25 adição de HC1 0,1 N arrefecido a 4°C. Deixa-se reagir sob uma agitação suave durante 20-40 minutos, depois neutraliza-se com NaOH 0,1 N. Aquece-se a solução contendo o produto que desta forma se obteve até à temperatura ambiente e trata-se com um agente redutor tal como, por exemplo, borohidreto de sódio (250-500 mg dissolvidos em 50-100 mL de água) e deixa-se reagir durante 4-8 horas. Elimina-se o excesso de borohidreto de sódio levando o pH a 5-5,5 com HC1 0,1 N e deixando a mistura repousar durante' rnais 2-4 horas. No final, neutraliza-se a mistura com NaOH 0,1 N e recupera-se o produto por precipitação com acetona ou com etanol depois de se haver concentrado o produto por evaporação sob pressão reduzida.

De uma forma análoga, podem determinar-se as quantidades de nitrito de sódio que, partindo de 1 g de N-sulfato de K5 ou de N-sulfato de epiK5, permitem obter um N-sulfato de K5 despolimerizado com PMM ou um N-sulfato de epiK5 despolimerizado com PMM, tendo uma massa molecular média de entre cerca de 4.000 e cerca de 12.000, vantajosamente entre cerca de 4.000 e cerca de 7.500, em especial de cerca de 6.000-7.500.

Os N-sulfatos de K5 despolimerizados que desta forma se obtêm, .com um conteúdo em ácido idurónico de entre' 40 % e 60 %, vantajosamente de 50-55 %. e preferivelmente praticamente. isentos de grupos NH2 e N-acetilo, tendo uma massa molecular média de entre aproximadamente 1.500 e aproximadamente 12.000-, vantajosamente de entre aproximadamente 1.500 e aproximadamente 10.000, 26 26 e preferivelmente entre aproximadamente 1.500 aproximadamente 7.500, bem como os seus sais aceitáveis do ponto de vista químico e farmacêutico, são matérias-primas para a preparação dos N,O-sulfatos de K5 despolimerizados com PMM da invenção presente.

De forma vantajosa, as matérias-primas para a preparação dos N,O-sulfatos de K5 despolimerizados com PMM da invenção presente são- derivados de N,O-sulfato de epiK5 despolimerizados com PMM constituídos por uma mistura de cadeias na qual pelo menos 90 % das cadeias referidas têm a fórmula I

NHSOg ÓH Π (I) em que 40 % a 60 %, preferivelmente 50 % a 55 % das unidades de ácido urónico são constituídas por ácido idurónico, n é um inteiro de entre 2 e 20, vantajosamente entre 3 e 15, e o catião correspondente é um catião aceitável do ponto de vista químico e farmacêutico.

Neste contexto, a expressão "ponto de vista químico" refere-se a um catião utilizável em .síntese química, tal como os iões sódio, amónio,, tetra-alquil (C1-C4) amónio, ou para a purificação do produto.

Os catiões vantajosos são os que derivam dos metais - 27 alcalinos, dos metais alcalino-terrosos, o amónio, os tetra-alquil(C1-C4)amónio, o alumínio e o zinco. Os catiões preferidos são os iões sódio, cálcio e tetrabutilamónio.

Os N-sulfatos despolimerizado.s de . epiK5 com PMM, constituídos por uma mistura de cadeias na qual pelo menos 90 % das cadeias· referidas têm a fórmula I acima, obtidos por despolimerizaçâo nitrosa dos N-sulfatos de epiK5 correspondentes figurados acima e por uma redução subsequente, por exemplo com borohidreto de sódio, são matérias-primas especialmente interessantes. Entre estes, os N-sulfatos' despolimerizados de epiKS com PMM constituídos por uma mistura de cadeias em que a espécie preponderante tem a fórmula I'a

NHSO3 ÒH p <I'a) na qual 4 0 % a 60 % das unidades urónicas são de ácido idurónico, p é um inteiro de entre 4 e 8 e o catião correspondente é um catião aceitável do ponto de vista químico ou farmacêutico, são matérias-primas especialmente vantajosas. A massa molecular média destes produtos é de entre cerca de 2.000 e cerca de 4-, 000. A origem destes N-sulfatos de epiKS num passo de despolimerizaçâo nitrosa seguido por uma redução com, por 28 exemplo, borohidreto de sódio, envolve, na extremidade redutora da maioria das cadeias da mistura de cadeias referida, a presença de uma unidade de 2,5-anidromanitol com a estrutura (a)

CH2OH

M \v X (a) em que X representa um grupo hidroximetilo. A extremidade redutora das cadeias é portanto representada de facto pela estrutura (b)

O em que X é tal como se definiu acima.

Outras matérias-primas vantajosas que são N-sulfatos despolimerizados de epiK5 com PMM de acordo com a invenção presente, são constituídas por misturas em que a espécie preponderante é um composto com a fórmula I'b

29 em que X. é hidroximetilo, m é 4,5 ou 6, o catião correspondente é um ião aceitável do ponto de vista químico ou farmacêutico e as unidades de ácido glucurónico e idurónico estão presentes de forma alternada, sendo a extremidade não redutora uma unidade glucurónica ou idurónica'. Num tal caso a razão glucurónico/idurónico seja de entre 45/55 e 55/45, isto é, aproximadamente 50/50. A utilização da C5-epimerase, preferivelmente recombinante, preferivelmente imobilizado sobre um suporte sólido nas condições listadas acima não permite portanto' a epimerização "agregada" dos derivados de N-sulfato de K5 a derivados de N-sulfato de epiK5 tal como ocorre na natureza, mas sim de uma forma regular.

Na preparação dos novos. N,O-sulfatos despolimerizados de epiK5 com PMM de acordo com o processo (a) - (d) ilustrado acima,, o passo (a) consiste numa O-sobressulfatação dos N-sulfatos polimerizados de epiK5 com PMM de partida, que se pode levar a cabo de acordo com qualquer um dos métodos descritos na literatura, por exemplo de acordo com o Método C descrito por Casu et-al., ou de acordo com variantes do mesmo método, por exemplo tal como as descritas no US 2002/0062.019, para se obter um O-sobressulfato despolimerizado de epiK5-amina com PMM. A origem dos O-sobressulfatos despolimerizados de epiK5-amina com PMM a partir dos N-sulfatos polimerizados de epiK5 com PMM obtidos por despolimerização nitrosa e uma redução subsequente com, por exemplo, borohidreto de sódio, 30 envolve, na extremidade redutora da maioria das cadeias na mistura de cadeias referida, a presença de uma unidade de 2,5-anidromanitol sulfatada com a estrutura (a1)

H2OS03“irT

(b‘) CHjjOSOg' em que R representa hidrogénio ou S03 .

Desta forma, a extremidade redutora da maioria das cadeias na mistura de cadeias referida é representada pela estrutura (b') .

em. que R, R' e R"representam H ou S03“ e a unidade urónica pode ser glucurónica ou idurónica.

Operando tal como se descreveu no US 2002/0062.019, arrefece-se até 10°C uma solução contendo N-sulfato despolimerizado de epiKS com PMM a uma concentração de 10 % e depois passa-se através de uma resina de permuta catiónica IR-120 .H+ ou um seu equivalente (35 - 100 mL) . Tanto a coluna como o reactor contendo o eluido são mantidos a 10°C. Depois da passagem da solução, lava-se a resina com água desionizada até o pH do permeado ser superior a 6 (cerca de 3 volumes de água desionizada). 31

Leva-se a solução ácida até à neutralidade com uma base orgânica terciária ou quaternária tal como por exemplo hidróxido de tetrabutilamónio (solução aquosa a 15 %) para se obter o sal de amónio correspondente. Concentra-se a solução até um volume minimo e liofiliza-se. Suspende-se. o produto obtido em 20-500 mL de dimetilformamida (DMF} ou de sulfóxido de dimetilo (DMSO) e 15-300 g de um agente sulfatante, tal como o aducto de pirídina com SO3, sob a forma de um sólido ou dissolvido em DMF ou em DMSO. Mantém-se a solução a 20-70°C, preferivelmente a 40-60°C durante 2-24 horas.

Adiciona-se um volume de água para se parar a reacção, leva-se o pH à neutralidade com NaOH 1 N. Recupera-se a amostra por precipitação com uma solução saturada de NaCl em acetona. Separa-se o precipitado do solvente por filtração. Dissolve-se o sólido obtido em 100 mL de água desionizada e purifica-se dos sais residuais por ultrafiltração. O produto obtido mostra uma razão de sulfato/carboxilo de entre 2 e até a um máximo de 3,2, calculada de acordo com Casu et al. Carbohydate Res. 1975, 39, 168-176. A posição 6 do amino-açúcar está sulfatada a 80-95 % e a posição 2 não está sulfatada. Os outros grupos sulfato estão presentes na posição 3 do amino-açúcar e nas posições 2 e 3 do ácido urónico.

Obtém-se um O-sobressulfato despolimerizado de epiK5-amina com PMM com um maior valor da razão sulfato/carboxilo, nomeadamente de pelo menos 3,4, vantajosamente de pelo menos 3,5, mais vantajosamente de entre 3,55 e 4, 32 preferivelmente de entre 3,55 e 3,8, levando a cabo o passo (a) acima incluindo (al) tratando um N-sulfato despolimerizado de epiK5 com PMM referido, sob forma ácida, com uma base orgânica terciária ou quaternária, deixando a mistura reaccional repousar durante um período de tempo de 30-60 minutos, mantendo o pH da solução a um valor de cerca de 7 por adição da referida base orgânica terciária ou quaternária, e isolando o seu sal com a base orgânica referida; (a2) tratando o sal com base orgânica que se referiu, do N-sulfato despolimerizado de epiK5 com PMM referido, com um agente de O-sulfatação em condições de O-sobressulfatação e isolando o O-sobressulfato despolimerizado de epiK5 com PMM referido. O O-sobressulfato despolimerizado de epiK5 com PMM obtido no final do passo (a) ou dos passos (al.) + (a2) tem um grau de sulfataçâo de entre 2 e 4 e uma massa molecular média de entre cerca de 2.500 e cerca de 12 .500, vantajosamente entre cerca de 2.500 e cerca de O 1—1 500, preferivelmente entre cerca de 2.500 e cerca de 8.000 e 0 catião correspondente é aceitável do ponto de vista químico ou do farmacêutico.

Tal como se pode anotar, apesar de se adicionarem 1-3 grupos SO3" por dissacárido, partindo de um N-sulfato despolimerizado de epiK5 com PMM com uma massa . molecular média de entre cerca de 1.500 e cerca de 12.000, obtém-se 33 no final do passo (a) um O-aobressulfato despolimerizado.de epiK5 com PMM com uma massa molecular média de entre cerca de 2.500 e cerca de 12,500, nomeadamente ligeiramente superior à da matéria-prima, em vez de uma gama de massa molecular teórica de entre cerca de 2.000 e cerca de 15.000. Esta diminuição da massa molecular é provocada por uma despolimerização suplementar devida ao meio fortemente ácido que se utiliza na realização do passo (a).

Os O-sulfatos despolimerizados de epiKS com PMM são vantajosamente constituídos por uma mistura de cadeias na qual pelo menos 90 % das cadeias referidas apresentam a fórmula II

(II) na qual 4 0 % . a 60 %, preferivelmente 50 % a 55 %, das unidades urónicas são de ácido idurónico, R, R* e R" representam hidrogénio ou um grupo S03“, para um graus de sulfatação de entre 2 e 4, q é um inteiro entre 2 e 17, vantajosamente entre 2 e 14, preferivelmente entre 2 e 11, apresenta uma unidade (a') tal como se definiu acima na extremidade redutora da maioria das suas cadeias, e o catião correspondente é aceitável do ponto de vista químico ou do farmacêutico.

Os O-sobressulfatos despolimerizados de epiKS com PMM com 34 um grau de sulfatação muito elevado (de pelo menos 3,4, vantajosamente pelo menos 3,5, mais vantajosamente entre 3,55 e 4, preferivelmente entre 3,55 e 3,8) que se podem obter de acordo com os passos acima mencionados (al) + (a2) são constituídos por uma mistura de cadeias na qual pelo menos 90 % das cadeias referidas apresentam a fórmula II, em que 4 0 % a 60 %, preferivelmente 50 % a 55 % das unidades urónicas são de ácido idurónico, R é em pelo menos 40 %, vantajosamente em 50 % a 80 %, preferivelmente em cerca de 65 % um grupo SO3”, R'. e R" são ambos S03” ou um deles é hidrogénio e o outro é 5 % a 10 % de SCb- no ácido glucurónico e 10 % a 15 % de SO3” no ácido idurónico, q é tal como definido acima e o catião correspondente é um catião aceitável do ponto de vista químico ou farmacêutico.

No passo (b) do processo da invenção presente, leva-se a cabo a Q-dessulfatação selectiva do N-sulfato despolimerizado de epiK5 com PMM obtido no final do passo (a) por tratamento do N-sulfato despolimerizado de epiKS com PMM com uma mistura de DMSO/metano a 19/1, por exemplo de acordo com os métodos descritos por A. Naggi et al,, Carbohydrate Research, 2001, 336, 283- 290, no WO 01/72.848 ou no US 2002/0062.019.

Na prática, passa-se uma solução do O-sobressulfato despolimerizado de epiK5 com PMM obtido no final do passo (a) através de uma resina de permuta catiónica tal como IR-12 0 H+ lavando com água desíonizada e leva-se o pH da solução percolada a entre 6 e 7 com uma base orgânica terciária ou quaternária, tal como piridina. Isola-se o sal 35 do O-sobressulfato despolimerizado de epiKS com PMM com a base orgânica, por exemplo o seu sal de piridina, por liofilização da solução adequadamente concentrada. Trata-se o produto obtido com uma solução de sulfóxido de dimetilo/metanol a cerca de 9/1 (em volume) e mantém-se a solução obtida a 45-90°C durante um periodo de tempo de entre 1 e 8 horas, vantajosamente de entre 2 e 4 horas, preferivelmente de entre 135 e 155 minutos. 0 produto parcialmente O-dessulfatado, constituído por um O-sulfato despolimerizado de epiK5-amina com PMM parcíalmente dessulfatado prevalentemente nos hidroxilos primários e nos hidroxilos dos ácidos urónicos, e isola-se por precipitação a partir da solução, por adição de água desionizada e, subsequentemente, de acetona, opcionalmente contendo uma quantidade de cloreto de sódio que assegure a saturação.

De acordo com uma concretização preferida, aquece-se previamente a mistura de sulfóxido de dimetilo/metanol a cerca de 9/1 (em volume) até à temperatura pretendida, adiciona-se-lhe o sal de O-sulfato despolimerizado de epiK5-amina com PMM e considera-se a duração da reacção de O-dessulfatação a partir do momento em que o conjunto dos reagentes se encontra à temperatura previamente seleccionada. 0 O-sulfato despolimerizado de epiK5-amina com PMM, parcialmente dessulfatado prevalentemente nos hidroxilos primários e nos hidroxilos dos ácidos urónicos, é isolado tal como se descreveu acima. Pode separar-se uma pequena amostra para a sua caracterização, e o produto restante é utilizado no passo de 6-0-sulfatação subsequente, (c). 36

No passo (c) lava-se o precipitado obtido de acetona com acetona, dissolve-se em água e leva-se o pH da solução a cerca de 7,5 com NaOH 2 N, passa-se em seguida através de uma resina IR-120 H+, e depois neutraliza-se com uma base orgânica terciária ou quaternária tal como a piridina ou o hidróxido de tetrabutilamónio e isola-se o sal obtido por liofilização. Leva-se a cabo a 6-0-sulfatação dissolvendo o sal acima mencionado em DMF e adicionando o solvente de sulfatação, por exemplo piridina.SO3, também dissolvido em DMF/ e numa quantidade de 2,15 gramas.por grama de produto (sal de tetrabutilamónio) . Leva-se a cabo a reacção mantendo a mistura a cerca de 0°C durante cerca de 60-120 minutos e isola-se o produto 6-O-sulfatado neutralizando a solução com NaOH e em seguida precipitando-o com acetona, contendo opcionalmente uma quantidade de cloreto de sódio que assegure a saturação. A operação de precipitação pode ser repetida diversas vezes. O O-sulfato despolimerizado de epiK5-amina com PMM 6-0-ressulfatado que se obtém deste modo tem um conteúdo em 6-0-sulfato de pelo menos 80 %.

No passo (d), trata-se o O-sulfato despolimerizado de epiK5-amina com PMM 6-0-ressulfatado com um agente de sulfatação nas condições clássicas de N-sulfatação. Em especial, leva-se a cabo a operação tratando uma solução aquosa do O-sulfato despolimerizado de epiK5-amina com PMM 6-0-ressulfatado obtido no final do passo (c) com carbonato de sódio e depois com um agente de sulfatação tal como a piridina.*S03 a uma temperatura de 35-45°C e isola-se o produto final, constituído pelo N,O-sulfato despolimerizado de epiK5 com PMM que apresenta um grau de sulfatação de 37 entre 2,3 e 2,9, sob a forma de um sal de sódio, por exemplo por diafiltração. Pode repetir-se a reacção de N-sulfatação.

Pode transformar-se o sal sódico do N,O-sulfato despolimerizado de epiKS com PMM que apresenta um grau de sulfatação de entre 2,3 e 2,9 noutro sal aceitável do ponto de vista farmacêutico, tal como um sal de outro metal alcalino, de um sal alcalino-terroso, de alumínio ou de zinco, de acordo com métodos conhecidos, por exemplo por permuta iónica com uma resina adequada, por precipitação com solventes ou por ultrafiltração através de membranas adequadas. São sais vantajosos os sais de sódio, de potássio, de magnésio, de cálcio, de alumínio e de zinco. São preferidos os sais de sódio e de cálcio.

De acordo com uma concretização preferida, a invenção presente proporciona um processo para a preparação de N,0-sulfatos despolimerizados de epiK5 com PMM que apresenta um grau de sulfatação de entre 2,3 e 2,9, e dos seus sais aceitáveis do ponto de vista farmacêutico, que inclui (ii) submeter-se um N-sulfato de K5 a uma despolimerização nitrosa para se obter um N-sulfato despolimerizado de K5 com PMM tendo uma massa molecular média superior a 4.000, vantajosamente entre cerca de 5.000 e cerca de 7.500, preferivelmente entre cerca de 6.000 e cerca de 7.500; (i) submeter-se o N-sulfato despolimerizado de K5 que desta forma se obteve a uma epimerização em C5 com D-glucuronil- 38 C5-epiraerase para se obter o correspondente N-sulfato despolimerizado de K5 cora PMM contendo entre 4 0 % e60 % de unidades idurónicas; (a) tratar-se um sal com uma. base orgânica terciária ou quaternária do N-sulfato despolimerizado de epiKS que desta forma se obteve com um agente de sulfatação sob condições de O-sobressulfatação para se obter um O-sobressulfato despolimerizado de epiK.5-amina com PMM; (b) submeter-se o O-sobressulfato despolimerizado de epiK5-amina com PMM que desta forma se obteve a uma 0-dessulfatação selectiva para se obter um 0-sulfato despolimerizado de epiK5-amina com PMM; (c) tratar-se um sal do 0-sulfato despolimerizado de epiK5-amina com PMM com uma base orgânica terciária ou quaternária com um agente de O-sulfatação para se obter um 0-sulfato despolimerizado de epiK5-amina com PMM contendo pelo menos 80 % de· 6-0-sulfato; (d) submeter-se o 0-sulfato despolimerizado de epiKS-amina com PMM contendo pelo menos 80 % de 6-O-sulfato que desta forma se obteve a uma reacção de N-sulfatação e isolar-se o N,O-sulfato despolimerizado de epiKS com PMM que deste modo se obtém sob a sua forma de sal sódico que se transforma opcionalmente noutro sal aceitável do ponto de vista farmacêutico.

De acordo com este processo preferido, são. obtidos N,0- 39 sulfatos despolimerizados de.epiKS com PMM apresentando um grau de sulfatação de entre 2,3 e 2,9 e uma massa molecular média de pelo menos 6.000, em especial de entre cerca de 6.000 e cerca de 12.000, vantajosamente entre cerca de 6.000 e cerca de 11.000.

Os N,O-sulfatos despolimerizados de epiK5 com PMM apresentando um grau de sulfatação de entre 2,3 e 2,9 e os seus sais aceitáveis do ponto de vista farmacêutico, que se podem obter por este processo preferido, representam outra concretização preferida da invenção presente. Os sais preferidos são aqueles que se mencionaram acima, em especial os sais de sódio e de cálcio.

De acordo com mais uma concretização preferida, a invenção presente proporciona um processo que, partindo de um N-sulfato de K5, pela sequência (i) -> (ii), permite a preparação de N,O-sulfatos despolimerizados de epiKS com PMM apresentando um grau de sulfatação de entre 2,3 e 2,9 e com uma massa molecular média todo ao longo da gama de entre cerca de 1.000 e cerca de 12.000.

Este processo, que é especialmente adequado para a preparação dos N,O-sulfatos despolimerizados de epiK5 com PMM apresentando uma massa molecular média muito pequena (entre cerca de 2.000 e cerca de 5.000) que não se podem obter pelo processo conduzido pela sequência (ii) -> (i) , inclui (i) submeter-se um N-sulfáto de K5 a uma epimerização em C5 40 com uma D-glucuronil C5-epimerase, isolada e purificada em solução ou imobilizada sobre um suporte sólido, a um pH de cerca de 7, a uma temperatura de cerca de 30°C e durante um período de tempo de 12-24 horas na presença de pelo menos um ião divalente seleccionado de entre cálcio, magnésio, bário e manganês para se obter um N-sulfato de epiK5 com um conteúdo de entre 40 % e 60 % de ácido idurónico; (ii) submeter-se o N-sulfato de epiK5 que dessa forma se obteve a uma despolimerização nitrosa seguida por uma redução, normalmente com borohidreto de sódio, para se obter um N-sulfato despolimerizado de epiK5 com PMM; (a) tratar-se um sal com uma base orgânica terciária ou quaternária do N-sulfato despolimerizado de epiK5 que desta forma se obteve com um agente de sulfatação sob condições de O-sobressulfatação para se obter um O-sobressulfato despolimerizado de epiKS-amina com PMM; (b) submeter-se o O-sobressulfato despolimerizado de epiKS-amina com PMM que desta forma se obteve a uma 0-dessulfatação selectiva para se obter um O-sulfato despolimerizado de epiK5-amina com PMM; (c) tratar-se um sal'do O-sulfato despolimerizado de epiKS-amina com PMM com uma base orgânica terciária ou quaternária com um agente de O-sulfatação para se obter um O-sulfato despolimerizado de epiKS-amina com PMM contendo pelo menos 80 % de 6-O-sulfato; 41 (d) submeter-se o O-sulfato despolimerizado de epiK5-amina com PMM contendo pelo menos 80 % de 6-O-sulfato que desta forma se obteve a uma reacção de N-sulfataçâo e isolar-se o N,O-sulfato despolimerizado de epiK5 com PMM que deste modo se obtém sob a sua forma de sal sódico que se transforma opcionalmente noutro sal aceitável do ponto de vista farmacêutico.

Os N,O-sulfatos despolimerizados de epiKS com PMM apresentando um grau de sulfatação de entre 2,3 e 2,9 e os seus sais aceitáveis do ponto de vista farmacêutico, que se podem obter por este processo preferido, representam outra concretização preferida da invenção presente. Os sais preferidos são aqueles que se mencionaram acima, em especial os sais de sódio e de cálcio.

Em especial, de acordo com mais este aspecto, a invenção presente refere-se a novos N,O-sulfatos despolimerizados de epiK5 com PMM que apresentam um grau de sulfatação de entre 2,3 e 2,9, e aos seus sais aceitáveis do ponto de vista farmacêutico, que tenham uma massa molecular média de entre 1.500 e cerca de 12.000, mas, em especial, menos do que 5.000, preferivelmente menos do que 4.000, vantajosamente entre cerca de 1.500 e cerca de 5.000, preferivelmente entre cerca de 1.500 e cerca de 4.000.

Deve anotar-se que a massa molecular dos novos N,O-sulfatos despolimerizados de epiK5 com PMM é aproximadamente igual à dos N-sulfatos despolimerizados de epiK5 com PMM devido à despolimerização parcial que ocorre no passo de O- 42 sobressulfatação (a) ou em (al) + (a2).

Mais especif icamente, de acordo com a sua concretização mais preferida, a invenção presente diz respeito a N,0-sulfatos despolimerizados de epiK5 com PMM que apresentam um grau de sulfatação de entre 2,3 e 2,9, vantajosamente de entre 2,5 e 2,9, preferivelmente entre 2,7 e 2,9, e uma massa molecular média de entre cerca de 1.500 e cerca de 12.000, vantajosamente entre cerca de 1.500 e cerca de 10.000, preferivelmente entre cerca de 1.500 e cerca de 8.000 e caracterizados pela presença da estrutura (a') na extremidade redutora da maioria da suas cadeias, e os seus sais aceitáveis do ponto de vista farmacêutico. Um· N,0-sulfato despolimerizado de epiK5 com PMM, ou um seu sal aceitável do ponto de vista farmacêutico, que exiba uma actividade anti-trombótica interessante, comparável com a de HPMM mas com um risco de indução de hemorragia 2,5 a 4 vezes inferior do que HPMMr tem uma massa molecular média de cerca de 6.000. Preferivelmente, este N,O-sulfato despolimerizado de epiK5 com PMM tem um grau de sulfatação de entre 2,7 e 2,9, um conteúdo de 80 a 95 % em 6-0-sulfato de glucosamina, de 95 a 100 % em N-sulfato de glucosamina, de 45 a 55 % em 3-sulfato de glucosamina, de 35 a 45 % em 3-O-sulfato de ácido glucurónico, de 15 a 25 % em 2_0-sulfato de ácido idurónico e apresenta uma unidade (a')/ tal como se definiu acima, na extremidade redutora da maioria das suas cadeias.

De forma vantajosa, os N,O-sulfatos despolimerizados de epiK5 com PMM da invenção presente são constituídos por 43

misturas de cadeias nas quais pelo menos 80 % das cadeias referidas têm a fórmula III

(III) em que as unidades urónicas são 40 % a 60 % constituídas por ácido idurónico, q é um inteiro de entre 2 e 17, va.ntaj osamente entre 2 e 14, preferivelmente entre 2 e 11, R, R' e R" são hidrogénio ou S03_, conferindo um grau de sulfatação de entre 2,3 e 2,9, e a extremidade redutora da maioria das cadeias apresenta uma estrutura de 2,5-anidromanitol sulfatado {a')

em que R representa hidrogénio ou SO3·, e o catião correspondente é aceitável do ponto de vista químico ou farmacêutico.

Um N,O-sulfato despolimerizado de epiK5 com PMM, ou um seu sal aceitável do ponto de vista farmacêutico, é constituído por uma mistura de cadeias na qual a espécie preponderante é um composto com a fórmula III em que qé8ou9, Ré 45% a 55 % de S03”, R' é 35 % a 45 % de S03”em ácido 44 glucurónico, R" é 15 % a 25 % de S03” em ácido idurónico, apresentando um grau de sulfatação de entre 2,7 e 2,9, e a extremidade redutora da maioria das cadeias apresenta uma estrutura de 2,5-anidromanitol sulfatado (a') tal como se definiu acima.

Os novos N,O-sulfatos despolimerizados de epiK5 com PMM da invenção presente possuem uma actividade muito interessante sobre os parâmetros da coagulação. De facto, eles possuem actividades elevadas anti-Xa e anti-IIa e envolvem um risco muito pequeno de induzir hemorragia em pacientes que necessitem de um tratamento com heparina para regular a coagulação. Os N,O-sulfatos despolimerizados de epiK5 com PMM que apresentam uma massa molecular média de cerca de 6.000, são N-sulfatados em 95 a 100 %, com 80 a 95 % de .6-O-sulfatação na glucosamina, 45 a 55 % de 3-O-sulfatação na glucosamina, 35 a 45 % de 3-O-sulfatação no ácido glucurónico, 15 a 25 % de 2-O-sulfatação no ácido idurónico, conferindo-lhes um grau de sulfatação de entre 2, 7 e 2,9, e apresentam uma unidade (a') na extremidade redutora da maioria das suas cadeias, e os seus sais aceitáveis do ponto de vista farmacêutico, são especialmente interessantes. Um destes os N,O-sulfatos despolimerizados de epiK5 com PMM, que se ilustra adiante neste documento no Exemplo 1, foi testado pelos testes clássicos para determinação das actividades anti-Xa e anti-IIa, e o seu efeito Sobre o Período Parcial de Tromboplastina Activada (APTT) também foi testado. :Os ensaios de determinação de actividade que se utilizam 45 para a determinação das actividades anti-IIa e anti-Xa são baseados na inibição dos enzimas de coagulação pelo complexo formado pela heparina e pela antitrombina III (ATUI) . A ATIII e o factor lia ou o factor Xa são adicionados em excesso. 0 enzima de coagulação residual reage com um substrato resultando uma libertação da paranitroanilina que se pode medir

espectrofotometricamente, sendo o seu teor inversamente proporcional ao teor em enzima de coagulação. Os tampões que se utilizam são: NaCl a 0,9 % para a determinação da actividade anti-Xa e Tris 0,05 M + NaCl 0,15 M com 1 % de BSA {Albumina de Soro Bovino) na determinação da actividade anti-IIa. A actividade do N,O-sulfato despolimerizado de epiK5 com PMM e as dos compostos de referência (uma heparina não fraccionada comercial, e HPMM comercial), foram medidas em relação à do padrão Internacional de HPMM em termos das suas actividades anti -Xa e anti-IIa. Por diluição obteve-se uma indicação de determinação de uma actividade de aproximadamente ( 0,5 U/mL em termos da actividade anti-Xa e de cerca de i_n o < o U/mL para a actividade anti-IIa. Assumiu-se para os cálculos uma actividade especifica de 160 U/mL para a heparina não fraccionada. O efeito do N,O-sulfato despolimerizado de epiK5 com PMM da invenção, e os dos produtos de referência, sobre o APTT, foi medido utilizando o estojo "IL Test™ APTT Lyophilized Silica Kit". Inicia-se a coagulação em plasma citrado pela adição de fosfolipidos que são necessários para formar complexos que activam o Factor X e a protrombina. Utiliza- 46 se um activador de contacto para estimular a produção de Factor Xlla proporcionando uma superfície para a função do quininogénio de massa molecular elevada, da calicreína e do Factor Xlla. Adiciona-se cálcio para despoletar maís reacções. Mede-se o período de tempo necessário para a formação de coágulos.

Na comparação do efeito dos compostos em teste e dos de referência sobre o período de coagulação, utilizou-se uma dose que se estimava provocar um período de coagulação de 100 segundos. Para se obter este valor preparou-se uma curva de dose/resposta utilizando doses que . provocavam períodos de coagulação de entre 50 e 230 segundos. Obteve-se a dose que provocava um período de coagulação de 100 segundos como uma estimativa, a partir da curva referida.

Dos testes referido, resultou que as actividades anti-Xa e anti-IIa do N,O-sulfato despolimerizado de epiK5 com PMM da invenção são de cerca de 50 % da actividade de HPMM. Em consequência, o N,O-sulfato despolimerizado de epiKS com PMM da invenção, como agente anti-trombótico, pode ser considerado como um HPMM com actividades anti-Xa e anti-IIa da mesma ordem de grandeza.

Também resultou que a potência do N,O-sulfato despolimerizado de epiK5 com PMM da invenção para aumentar a coagulação é fraca. Em comparação com a heparina não fraccionada e com HPMM, eram necessárias doses aproximadamente 5-8 vezes maiores do N,O-sulfato despolimerizado de epiK5 com PMM para induzir o mesmo 47 efeito sobre o APTT. A invenção presente proporciona portanto, pela primeira vez, um produto derivado do polissacárido K5 que mas com um menor risco de hemorragia. Os novos N,O-sulfatos despolimerizados de epiK5 com PMM da invenção presente, e os seus sais aceitáveis do ponto de vista farmacêutico, são portanto úteis como medicamentos para a regulação da coagulação e para a prevenção ou o tratamento da trombose bem como a titulo de ingredientes activos em composições farmacêuticas para as indicações que se mencionaram acima.

De acordo com mais um aspecto, a invenção presente proporciona uma composição farmacêutica que inclui, a título de ingrediente activo, uma quantidade farmacologicamente activa de um N,O-sulfato despolimerizado de epiK5 com PMM tal como se ilustrou acima, em especial de um N,O-sulfato despolimerizado de epiK5 com PMM com um grau de sulfatação de entre 2,3 e 2,9, uma massa molecular média de entre 1.500 e cerca de 12.000 e apresentando a estrutura (a')/ tal como se definiu acima, na extremidade redutora da maioria das suas cadeias, ou um seu sal aceitável do ponto de vista farmacêutico, misturado com um veículo farmacêutico.

Nas composições farmacêuticas da invenção presente para administração por via oral, subcutânea, endovenosa, transdérmica, oftálmica ou tópica, os ingredientes activos são preferivelmente administrados sob a forma de unidades de dosagem, misturados com os veículos ou portadores 48 farmacêuticos clássicos. A dose pode variar amplamente em função da idade, da massa corporal, e do estado de saúde do paciente. Esta dose inclui a administração de uma unidade de dosagem de entre 1 e 1.000 mg, vantajosamente entre 10 e 750 mg, preferivelmente entre 250 e 500 mg, uma a três vezes ao dia, por uma via endovenosa, subcutânea, oral, transdérmica, oftálmica ou tópica. Aquando da administração parenteral (subcutânea ou endovenosa), a dose preferida é de entre 5 e 100 mg.

De forma vantajosa, as composições farmacêuticas da invenção presente inçluem, na qualidade de seu ingrediente activo, um N, O-sulfato despolimerizado de epiK5 com PMM que se pode obter a partir de um N-sulfato de K5, de acordo com os passos (i.) -> (ii) -> (a) -> (d), ou (ii) -> (i) -> (a.) — (d), dos processos ilustrados acima, ou um seu sal aceitável do ponto de vista farmacêutico. Mais vantajosamente, o ingrediente activo referido é um N,0-sulfato despolimerizado de epiK5 com PMM com um grau de sulfatação de entre 2,3 e 2,9, uma massa molecular média de entre cerca de 1.500 e cerca de 12.000, e apresenta uma estrutura (a1) tal como se definiu acima na extremidade redutora da maioria das suas cadeias. Preferivelmente, o referido N,O-sulfato despolimerizado de epiK5 com PMM tem uma massa molecular média de cerca de 6.000, é 95 % a 100 % N-sulfatado, 80 % a 95 % 6-=-sulfatado na glicosamina, 45 % a 55 % 3-0-sulfatado na glucosamina, 35 % a 45 % 3-0-sulfatado no ácido glucurónico, 15 % a 25 % 2-O-sulfatado 49 no ácido idurónico, apresentando um grau de sulfatação de entre 2,7 e 2,9.

De acordo com outro dos seus aspectos, a invenção presente proporciona um método para a regulação da coagulação num mamífero, o qual inclui administrar-se ao mamífero referido que necessita da regulação da coagulação referida uma quantidade eficaz de um N,O-sulfato despolimerizado de epiK5 com PMM tal como se ilustrou acima. Para além disto, a invenção proporciona um método para se impedir ou para tratar a trombose num mamífero, o qual inclui administrar-se ao mamífero referido uma quantidade eficaz de um N,0-sulfato despolimerizado de epiK5 com PMM tal como se ilustrou acima. Para a regulação da coagulação ou para impedir ou tratar a trombose, a quantidade eficaz de N,0-sulfato despolimerizado de epiK5 com PMM é de entre 5 e 100 mg. A quantidade eficaz referida é administrada numa composição farmacêutica de entre as que foram ilustradas acima. De forma vantajosa, o N,O-sulfato despolimerizado de epiK5 com· PMM referido apresenta um grau de sulfatação de entre 2,3 e 2,9, uma massa molecular média de entre cerca de 1.500 e cerca de 12.000, e apresenta a estrutura (a1)? tal como se definiu acima, na extremidade redutora da maioria das suas cadeias.

Preferivelmente, o N,O-sulfato despolimerizado de epiK5 com PMM referido acima tem uma massa molecular média de cerca de 6.000, é 95 % a 100 % N-sulfatado, 80 % a 95 % 6-=-sulfatado na glicosamina, 45 % a 55 % 3-O-sulfatado na glucosamina, 35 % a 45 % 3-0-sulfatado no ácido 50 glucurónico, 15 % a .25 % 2-O-sulfatado no ácido idurónico, apresentando um grau de sulfatação de entre 2,7 e 2,9..

Por último, tal como se ilustrou acima neste documento, todos os derivados de Q-sobressulfato de (epi)K5-amina com um grau de sulfatação de entre 2 e 4 tê actividade microbicida e são ingredientes activos em preparações farmacêuticas para o tratamento de doenças infecciosas, em especial virais. De forma vantajosa, as composições farmacêuticas referidas incluem, a titulo de seu ingrediente activo, uma quantidade farmacologicamente eficaz de um derivado de O-sobressulfato de (epi)K5-amina, com um grau de sulfatação de entre 2 e 4, que se pode obter tratando um sal com uma base orgânica terciária ou quaternária de um N-sulfato de (epi)K5 com um agente de sulfatação em condições de O-sobressulfatação, ou um seu sal aceitável do ponto de vista farmacêutico, misturado com um veiculo farmacêutico.

Em especial, de acordo com outro dos seus aspectos, a invenção proporciona uma composição farmacêutica que inclui, a titulo de ingrediente activo, uma quantidade farmacologicamente activa de um derivado de O-sobressulfato de (epi)K5-amina com um grau de sulfatação de entre 2 e 4, ou de um seu sal aceitável do ponto de vista farmacêutico, que se possa obter tratando um sal com uma base orgânica terciária ou quaternária de um derivado de N-sulfato de (epi)K5, com um agente de O-sulfatação em condições de 0-sobressulfatação, havendo-se isolado o sal derivado de N-sulfato de (epi)K5 referido com a referida base orgânica 51 terciária ou quaternária de acordo com métodos conhecidos, em especial por liofilização, imediatamente depois da sua formação a um pH de entre cerca de 5 e cerca de 9, misturado com um veículo farmacêutico.

Mais precisamente, o derivado de O-sobressulfato de (epi)K5-amina utilizado como ingrediente activo das composições da invenção presente pode ser obtido por (al1) um tratamento do derivado de N-sulfato de (epi)K, sob a sua forma ácida, com uma base orgânica terciária ou quaternária, e isolando o seu sal com a referida base orgânica terciária ou quaternária imediatamente depois da sua formação, a um pH de entre cerca de 5 e cerca de 9; (a2T) um tratamento do sal com a base orgânica terciária ou quaternária todo referido derivado de N-sulfato de (epi)K5 com um agente de O-sulfatação nas condições de uma 0-sobressulfatação e isolando o derivado de O-sobressulfato de (epi) K5-amina sob a forma do seu sal sódico que pode subsequentemente ser transformado noutro sal.

Nas composições farmacêuticas da invenção presente para administração por via oral, subcutânea, endovenosa, transdérmica, oftálmica ou tópica, os ingredientes activos, derivados de O-sobressulfato de (epi)K5~amina preferivelmente administrados sob a forma de unidades de dosagem, misturados com os excipientes ou portadores farmacêuticos clássicos. 0 regime de dosagem pode variar .amplamente de acordo com a idade, a massa corporal e a 52 saúde do paciente. Este regime de dosagem inclui a administração de uma dose de um derivado de O-sobressulfato de (epi) K5-amina a entre 1 e 1000 mg, vantajosamente entre 10 e 750 mg, preferivelmente 250 a 500 mg, de uma a três vezes ao dia, por administração endovenosa, subcutânea, oral, transdérmica, oftálmica ou tópica.

As composições farmacêuticas incluindo um derivado de 0-sobressulfato de (epi)K5-amina tais como as que são ilustradas acima são formuladas com os veículos clássicos adequados para diferentes modos de administração. São especialmente vantajosas as formulações sob a forma de cremes, unguentos, linimentos, géis, espumas, bálsamos, pessários vaginais, supositórios, soluções ou suspensões adequadas para administração local.

Os exemplos seguintes ilustram a invenção.

PREPARAÇÃO I (i) Epimerizaçâo a N-sulfato de epiK5

Dissolvem-se dez gramas de N-sulfato de K5 obtido tal como se descreve nos passos (i) e (ii) do Exemplo 2 do WO 02/068.477, cujo espectro de RMN de 1H não evidenciava sinais de grupos acetilo nem de NH2, em 600 mL de tampão HEPES 25 mM a pH 7, contendo CaCl2 a uma concentração de 50 mM, e recircula-se a solução que desta forma se obteve através de uma coluna de 50 mL cheia com resina Sepharose 4B contendo 5 g de C5-epimerase recombinante (WO 96/14.425) 53 imobilizada tal como descrito no Exemplo 1 do WO 01/72.848. Leva-se a cabo a reacção a 30°C e a pH 7 com um caudal de 200 mL/h durante 24 horas. Purifica-se o produto obtido por ultrafiltração e por precipitação com etanol. Desta forma obtém-se um N-sulfato de epiKS com um conteúdo em ácido idurónico de 54 % (ii) Despolimerízação do N-sulfato de epiKS.

Adicionam-se a uma solução de 1 g do produto que desta forma se obteve, em 25 mL de água destilada, 230 mg de nitrito de sódio dissolvidos em 115 mL de água destilada. Arrefece-se então a solução até 4°C, ajusta-se o seu pH a 2 com HC1 0,1 N e mantém-se durante 30 minutos. No fim da reacção aquece-se a solução até à temperatura ambiente e o pH a 7 com NaOH 0,1 N. Adiciona-se então à solução 450 mg de NaBHí e deixa-se a reagir durante 4 horas. Recupera-se o produto por precipitação com 3 volumes de acetona a 4°C, por filtração com um funil de filtração, e seca-se a 40°C numa estufa de vazio para se obterem 900 mg de N-sulfato despolimerizado de epiKS com PMM com um conteúdo de 54 % em ácido idurónico e uma distribuição de massas moleculares de entre 1.000 e 4.000, medida pelo método de HPLC.

PREPARAÇÃO II N-sulfato despolimerizado de epiKS com PMM com massa molecular média de cerca de 5.000. Sequência (i) -> (ii) (ii) Despolimerização de N-sulfato de K5 54

Despolimerizam-se 2 g de N-sulfato de K5, obtidos tal como descrito nos passos (i) e (ii) do Exemplo 2 do WO 02/068.477, tal como se descreveu no passo (ii) da PREPARAÇÃO I, utilizando 100 mg de nitrito de sódio e 300 mg de borohidreto de sódio. Obteve-se uma quantidade de 1,8 g de N-sulfato despolimerizado de K5 com PMM com uma massa molecular média de 5.000.

(i) Epimerização de N-sulfato despolimerizado de K5 com PMM

Tratou-se 1 g de N-sulfato despolimerizado de K5 com PMM obtido no passo (ii) acima,, tal como se descreveu no passo (i) da, PREPARAÇÃO I. Obtém-se um produto epimerizado com uma razão de ácido idurónico para ácido glucurónico de 44/56 em relação a uma razão inicial de 0/100 na matéria-prima, com uma distribuição de massa molecular de entre 2.000 e 10.000 e com uma massa molecular média ode 5.000 D. O rendimento em N-sulfato despolimerizado de epiK5 com PMM, calculado medindo o conteúdo em ácidos urónicos em relação ao padrão, com o método do carbazole (Bitter e Muir, Anal. Biochem. 1971, 39, 88-92) é de 90 %.

PREPARAÇÃO III N-Sulfato despolimerizado de epiK5 com PMM. Sequência (i) - > (i±) (i) Epimerização do N-sulfato de K5

Dissolve-se uma quantidade de 2 g de N-sulfato de K5, 55 obtido tal como se descreveu nos passos (i) e (ii) do Exemplo 2 do W002/068.477, em 120 mL de tampão HEPES 25 mM, pH 7, contendo CaCl2 50 mM. Faz-se recircular a solução obtida através de uma coluna de 50 mL com enchimento de uma resina que contém o enzima imobilizado obtido tal como se descreveu no WO 96/14.425. Esta operação é levada a cabo a 30°C com um caudal de 200 mL/h durante 24 horas. Purifica-se o produto obtido por ultrafiltração através de uma membrana de 1000 D e passando sobre uma coluna de permuta iónica IR 120H+, neutralizando o eluido com NaOH 1 N. Recupera-se a amostra por precipitação com etanol ou com acetona. Obtém-se um produto epimerizado com uma razão de ácido idurónico/ácido glucurónico de 55/45 em relação à razão de 0/100 na matéria-prima. Calculou-se a percentagem de epimerização por RMN de 1H de acordo com o método descrito no WO 96/14.425. O rendimento em N-sulfato de epiK5 foi calculado medindo o conteúdo em ácidos urónicos em relação ao de um padrão pelo método do carbazole (Bitter e Muir Anal. Biochem. 39, 88-92-1971) e era de 90 %. (ii) Despolimerização do N-sulfato de epiK5

Despolimeriza-se um grama de produto obtido no passo (a) pelo método da degradação com ácido nitroso e redução subsequente do aldeído que se forma. Em particular a operação é levada a cabo dissolvendo o produto em 25 mL de água destilada e adicionando-lhe uma solução de 230 mg de nitrito de sódio em 115 mL de água destilada. Arrefece-se então a solução até 4°C e leva-se o pH a 2 com HC1 0,1 N, mantendo-se durante 30 minutos. No final da reacção aquece- 56 se a mistura reaccional até à temperatura ambiente e leva-se o pH a 7 com NaOH 0,1 M. Adiciona-se então à solução 450 mg de NaBH4 e deixa-se reagir durante 4 horas. Recupera-se o produto por precipitação com 3 volumes de acetona a 4°C, por filtração com um funil de filtração, e seca-se a 40°C numa estufa de vazio para se obter 900 mg de; N-sulfato despolimerízado de epiK5 com uma distribuição de massas moleculares medida pelo método de HPLC, a qual se encontra entre 1.000 e 4.000, e com um conteúdo de 45 % de unidades de ácido glucurónico e um conteúdo em unidades de ácido idurónico de 55 %.

PREPARAÇÃO IV N-Sulfato despolimerizado de epiK5 com PMM com uma massa molecular média de cerca de 2.000

Adiciona-se, a uma solução de 1 g do N-sulfato de epiK5 obtido tal como se descreveu nos parágrafos [0251] a [0265], Exemplo 12, no US 2002/0062.019 em 200 mL de água destilada, uma solução de 480 mg de nitrito de sódio em 240 ml de água destilada. Arrefece-se então a solução até 4°C, ajusta-se o seu pH a 2 com HC1 0,1 N e mantém-se durante 30 minutos. No final da reacção leva-se o pH da mistura a 7' com NaOH 0,1 N e depois deixa-se aquecer até à temperatura ambiente. Adiciona-se em seguida à solução 450 mg de NaBH4 e deixa-se reagir durante 4 horas. Elimina-se o excesso de NâBH4 ajustando o pH a 5-6 com HC1. Neutraliza-se o produto com NaOH 0,1 M, e recupera-se por precipitação com 3 volumes de acetona a 4°C, por filtração com um funil de 57 filtração e seca-se a 4 0°C numa estufa de vácuo. Obtêm-se 900 mg de N-sulfato despolimerizado de epiK5 com PMM com uma massa molecular média de aproximadamente 2.000, constituído por uma mistura de cadeias na qual a espécie preponderante é um composto com a fórmula I'b em que m é 4.

PREPARAÇÃO V N-sulfato despolimerizado de epiK5 com massa molecular média de 6. 000 N-Sulfato de K5 de partida

Aquece-se uma solução de 8 g de K5 com uma pureza de 95 %em 8 00 mL de NaOH 2N até 60°C durante 24 horas. Depois de arrefecer, leva-se o pH da solução 7 com HC1 6N. Adiciona-se em primeiro lugar à solução neutralizada 12,8 g de carbonato de sódio, e depois, em porções ao longo de 4 horas, 12,8 g de aducto de piridina*S03 sob a forma de um sólido. Mantém-se a mistura reaccional a 40°C durante 24 horas. Depois de se eliminarem os sais por ultrafiltração através de uma membrana Millipore Prepscale TFF com corte a 1.000 D, recupera-se o produto pretendido por precipitação com 3 volumes de acetona. Deste modo obtêm-se 8 g de N-sulfato de K5. O seu espectro de RMN de 1H denota uma N-sulfataçâo de 100 % (ausência de sinais devidos a grupos NH2 e acetilo). N-sulfato despolimerizado de epiK5. Sequência (i) -> (ii) 58 (i) Epimerização.

Dissolvem-se os 8 g de N-sulfato· de K5 que desta forma se obtiveram em 200 mL de tampão 0,25 M de pH 7 contendo CaCl2 50 mM, e trata-se em solução com 9,6 x IO10 cpm de C5-epimerase recombinante, a 30°C durante 24 horas a pH 7. No final da reacção, purifica-se a amostra por eliminação dos sais por ultrafiltração através de uma membrana Millipore Prepscale TFF com corte a 1.000 D e, nessa altura, precipita-se por adição de 3 volumes de acetona. Obtêm-se deste modo 7,5 de N-sulfato de epiK5. A sua percentagem de epimerização, na prática a quantidade de unidades de ácido idurónico em relação às unidades de ácidos glucurónico, calculada por RMN de 1H de acordo com o método descrito no WO 96/4.425, é de 52 %. (li) Despolimerização.

Dissolvem-se os 7,5 g de N-sulfato de epiK5 que deste modo se obtiveram em 150 mL de água e termostatiza-se a solução a 4°C, depois leva-se o pH a 2,2 por adição de HC1 1 M previamente arrefecido. Adiciona-se à solução 431,2 mg de nitrito de sódio, correspondendo a 21,56 mL de uma solução de nitrito de sódio a 2 % em água. Leva-se o pH a 2,2 mais uma vez e mantém-se a mistura reaccional a 4°C durante 20 minutos sob agitação. Depois de se neutralizar até pH 7,0 com HC1 6 N HC1, adiciona-se à solução 1,35 g de borohidreto de sódio. Leva-se a cabo a redução mantendo a mistura reaccional à temperatura ambiente durante 4 horas, e depois destrói-se o excesso de agente redutor levando o. 59 pH até 5 com HC1 IN, agitando-se até desaparecer a efervescência. Leva-se então o pH até 7-7.2 mais uma vez, usando NaOH 1 M. Recuperasse o produto despolimerizado por ultrafiltração através de uma membrana Millipore TFF com corte a 1.000 D e em seguida precipita-se adicionando 3 volumes de acetona. Deste modo obtêm-se 7 g de N-sulfato despolimerizado de K5 com PMM. A massa molecular média deste produto, calculada do seu HPLC, é de 6.000 D.

Exemplo 1 (a) Sobressulfatação. (al) Sal de tetrabutilamónio do N-sulfato despolimerizado de epiK5 com PMM.

Passa-se uma solução de 7 g de N-sulfato despolimerizado de epiK5 com PMM obtido na PREPARAÇÃO V em 350 mL de água, através de uma coluna de IR-120H+. O pH do eluído é de 2,91. Leva-se o pH da solução percolada até 7 com uma solução de hidróxido de tetrabutilamónio a 15 % (42,2 mL) e mantém-se durante 1 hora à temperatura ambiente com controlos para assegurar um pH de cerca de 7. Depois de se concentrar a solução do sal de tetrabutilamónio num evaporador rotativo, congela-se a amostra e liofiliza-se. Deste modo obtêm-se 10,9 g do sal de tetrabutilamónio do N-sulfato despolimerizado de epiKS de que se partiu. (a2) O-sobressulfatação. 60

Dissolveu-se o sal de tetrabutilamónio que desta forma se obteve em 158 mL de dimetilformamida, . e depois adiciona-se-lhe 28,8 g de piridina*S03 dissolvidos em 158 mL de DMF e mantém-se a mistura reaccional a 45°C durante 18 horas. Adiciona-se-lhe um volume de 316 mL de água para parara reacção e leva-se o pH a 7 com NaOH a 30 %. Recupera-se o O-sobressulfato despolimerizado de epiK5-amina com PMM por precipitação com 3 volumes de acetona saturada com NaCl (1,896 litros) e após uma diafiltração subsequente através de uma membrana Millipore TFF com corte a 1.000 D eliminam-se os sais. (b) O-Dessulfatação selectiva.

Passa-se a solução contendo o O-sobressulfato despolimerizado de epiK5-amina com PMM que se obteve em (a.) através de uma resina de permuta iónica IR 120 H* temperatura ambiente, e leva-se o pH a 6,7 com piridina. Congela-se então a solução e submete-se a uma liofilização. Dissolve-se o sal de piridina que desta forma se obtém (10,73 g) numa mistura contendo 97 mL de sulfóxido de dimetilo e 11 mL de metanol. A adição do sal de piridina do O-sobressulfato despolimerizado de epiK5-amina com PMM é feita quando o solvente está termostatizado a 65°C. Considera-se que a reacção se inicia quando o solvente está a 65°C e, a partir deste momento, mantém-se a mistura reaccional a esta temperatura durante 2 horas e meia (numa preparação, o valor final do pH era de 2,24). Arrefece-se a mistura reaccional utilizando água gelada para se atingir uma temperatura de cerca de 30°C, e depois adicionam-se-lhe 61 4,5 mL de água. Recupera-se a amostra percolando 5 volumes de acetona pela solução e recuperando o precipitado que se forma por filtração sobre· um filtro guch G4. Lava-se então o bolo com acetona e depois dissolve-se de novo em água. Leva-se o pH a 7,5 com NaOH 2 N. 0 espectro de RMN de 13C a 300 MHz do O-sulfato despolimerizado de K5-amina com PMM que se obtém deste modo está ilustrado na. Figura 1. (c) 6^0-Sulfataçâo

Passa-se a solução através de uma resina IR 120 H+ e neutraliza-se com uma solução a 15 % de hidróxido de tetrabutilàmónio. 0 sal que desta forma se obtém é liofilizado para se obterem 12,34 g de produto parcialmente O-dessulfatado constituído pelo sal de tetrabutilàmónio acima do O-sulfato despolimerizado de K5-amina com PMM. Dissolve-se o sal de tetrabutilàmónio que deste modo se obteve em 150 mL de DMF e adiciona-se à solução uma solução de 14 g de aducto de piridina*S03 em 75 mL de DMF. Mantém-se a mistura reaccional a 0°C durante 90 minutos, e depois adiciona-se—lhe 110 mL de água para parar a reacção. O pH da mistura no final da reacção (3,4 numa preparação) é levado a 7,2 com NaOH 2 N. Recupera-se a amostra por precipitação com 3 volumes de acetona saturada com NaCl. Adicionam-se algumas gotas de acetona saturada com NaCl para favorecer a precipitação. Forma-se um precipitado branco. Numa preparação repetiu-se duas vezes a operação para se obter 6,8 g do O-sulfato despolimerizado de epiK5-amina com PMM, com um conteúdo de 8 0 % em 6-O-sulfato de glucosamina, de 50 % em 3-O-sulfato de glucosamina, de 40 % 62 em 3-0-sulfato de ácido glucurónico, e de 20 % em ácido idurónico sufatado em 2-0. 0 espectro de RMN de 13C está representado na Figura 2. (d) N-Sulfatação

Dissolve-se o 0-sulfato despolimerizado de epiK5~amina com PMM obtido no final do passo (c) em 500 mL de água ê adiciona-se-lhe uma solução de 12,8 g de carbonato de sódio em 500 mL de água. 0 valor de pH da solução após adição de água é de 10,51. Depois de se termostatizar a solução a 40°C, adiciona-se-lhe 12,8 g de piridina»S03 sólido, em porções e ao longo de 4. horas. Numa preparação o valor final do pH da solução era de 7,2. Diafiltra-se a amostra na presença de NaCl e depois com água. Obtém-se uma quantidade de 8,0 g de N,O-sulfato despolimerizado de epiK5 com PMM, com um grau de sulfatação de 2,83 e com um conteúdo de 95 a 100 % de glucosamina N-sulfatada, de 80 % de glucosamina 6-0-sulfatada, de 50 % de glucosamina 3-0-sulfatada, de 40 % de ácido glucurónico 3-0-sulfatado, e de 20 % de ácido idurónico 2-0-sulfatado. 0 espectro de RMN de 13C do N,O-sulfato despolimerizado de epiKS com PMM obtido está ilustrado na Figura 3. Na zona entre 80 e 90 ppm, os sinais que se podem atribuir aos carbonos 2, 3 e 4, e que são típicos das estruturas de 2,5-anidromanitol (Casu B., Nouv. Rev. Fr. Hematol., 1984, 26, 211-19) estão presentes. O espectro mostra um deslocamento dos sinais na zona de entre 80 e 90 ppm o qual indica a sulfatação do átomo de carbono nas posições 1, 3 e 6, do referido 2,5- 63 anidromanitol.,

Exemplo 2

Operando tal como se descreveu no Exemplo 1, submetendo o N-sulfato despolimerizado de K5 com PMM com uma massa molecular média de 5.000 que se obteve na PREPARAÇÃO II a uma O-sobressulfatação tal como em (a) , tratando o sal. de piridina do O-sobressulfato dé epiK5-amina com PMM assim obtido com uma mistura de DMSO/me.tanol a cerca de 9/1 a 70°C durante 150 minutos tal como em (b), tratando o sal de tetrabutilamónio do produto parcialmente O-dessulfatatado que assim se obteve com piridina*S03 a 0°C durante 90 minutos tal como em (c), e por último tratando o produto 6-O-ressulfatado em primeiro lugar com carbonato de sódio e depois com piridina*S03 tal como em (d), obtém-se um N;0-sulfato despolimerizado de epiK5 com PMM com uma massa molecular média de 5.000, um grau de sulfatação de 2,8 e um conteúdo de 95 a 100 % em glucosamina N-sulfatada, de 85 % em glucosamina 6-0-sulfatada, de 48 % em glucosamina 3-0-sulfatada, de 38 % em ácido glucurónico 3-O-sulfatado e de 20 % em ácido idurónico. 2-0-sulfatado.

Lisboa, 29 de Abril de 2008

Claims (22)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Um processo para a preparação de um N,0-sulfato despolimerizado de epiK5 com PMM contendo40 % a 60 % de unidades idurónicas e possuindo um grau de sulfatação de entre 2,3 e 2,9, sendo caracterizado por apresentar na extremidade redutora da maioria das suas cadeias uma estrutura (a')

CHjOSOj" (a') na qual R represente hidrogénio ou' SO3", que inclua (a) tratar-se um sal com uma base. orgânica, terciária ou quaternária de um N-sulfato despolimerizado de epiK5 com PMM em condições de O-sobressulfatação para se obter um 0-sobressulfato despolimerizado de epiK5-amina com PMM; (b) submeter-se o O-sobressulfato despolimerizado de epiK5- amina com PMM que dessa forma se obteve a uma 0-dessulfatação selectiva para se obter um O-sulfato despolimerizado de epiK5-amina; (c) tratar-se um sal com uma base orgânica terciária ou quaternária do 0-sulfato despolimerizado de epiKS-amina que desta forma se obteve com um agente de O-sulfatação para se 2 obter um O-sulfato despolimerizado de epiK5-amina contendo pelo menos 80 % de 6-O-sulfato; (d) submeter-se o O-sulfato despolimerizado de epiK5-amina contendo pelo menos 80 % de 6-O-sulfato que daquela forma se obteve por uma reacção de N-sulfatação e isolar-se o N,O-sulfato despolimerizado de epiK5 que assim se obtém.

2. Processo de acordo com a reivindicação 1, no qual o N,O-sulfato despolimerizado de epiK5 com PMM que por ele se obtém seja isolado sob a sua forma de sal sódico que seja opcionalmente transformado noutra sua. forma salina aceitável do ponto de vista farmacêutico.

3. Processo de acordo com a reivindicação 2, em que a referida outra forma salina seja uma forma salina envolvendo outro metal alcalino, um metal alcalino-terroso, alumínio ou zinco.

4. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que se obtenha o N-sulfato despolimerizado de epiKS com PMM que se utiliza como matéria-prima, submetendo um N-sulfato de K5, por uma ordem qualquer, (i) a uma' epimerização em C5 com uma D-glucuronil C5-epimerase, um isolamento, uma purificação, em solução ou imobilizados sobre um suporte sólido, a um pH de aproximadamente 7, a uma temperatura de aproximadamente 30°C e. durante um período de tempo de aproximadamente 12-24 3 horas na presença de pelo menos um ião divalente seleccionado de entre cálcio, magnésio, bário e manganês; e (ii) a uma despolimerização nitrosa seguida por uma redução, normalmente.com borohidreto de sódio-

5. Processo de acordo com a reivindicação 4, em que a matéria-prima, N-sulfato despolimerizado de epiKS com PMM do passo (a) seja obtida de acordo com a sequência (i) - (íi) e apresente uma massa molecular média de entre cerca de 1.500 e cerca de 12.000.

6. Processo de acordo com a reivindicação 5, em que a massa molecular média referida seja de entre cerca de 1.500 e cerca de 7.500.

7. Processo de acordo com a reivindicação 4, em que a matéria-prima, N-sulfato despolimerizado de epiK5 com PMM do passo (a) seja obtida de acordo com a sequência (ii) - (i) e apresente uma massa molecular média de entre cerca de 4.000 e cerca de 12.000.

8. Processo de acordo com a reivindicação 7, em que a massa molecular média referida seja de entre cerca de 5.000 e cerca de 7.500.

9. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, em que a matéria-prima, N-sulfato despolimerizado de epiK5 com PMM do passo (a) consista numa mistura de cadeias na qual pelo menos 90 % das cadeias 4 referidas tenham a fórmula I 4 Λ L

H (I) em que 40 % a 60 % das unidades urónicas sejam constituídas por ácido idurónico, n seja um inteiro, de entre 2 e 20. e esteja presente na extremidade redutora da maioria das cadeias da referida mistura de cadeias uma unidade de 2,5-anidromanitol com a estrutura (a.)

(a) em que X representa um grupo hidroximetilo o catião correspondente seja aceitável do ponto de vista químico ou do farmacêutico.

10. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, em que em que a matéria-prima referida, N-sulfato despolimerizado de epiK5 com PMM consista numa mistura de cadeias na qual a espécie preponderante tenha a fórmula I'a 5 5

<I'a) em que 40 % a 60 % das unidades urónicas sejam constituídas por ácido idurónico, e esteja presente na extremidade redutora da maioria das cadeias da referida mistura de cadeias uma unidade de 2,5-anidromanitol com a estrutura (a) ÇH.OH

X (a) em que X representa um grupo hidroximetilo, e p seja um inteiro de entre 4 e 8.

11. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 9a 10, em que a matéria-prima referida, N-sulfato despolimerizado de epiK5 com PMM do passo (a) consista numa mistura de cadeias na qual . a espécie preponderante tenha a fórmula I'b

(I'b) na qual X seja hidroximetilo, m seja 4, 5 ou 6, o 6 catião correspondente seja um ião aceitável do ponto de vista químico ou farmacêutico e as unidades de ácido glucurónico e idurónico estão presentes de forma alternada, sendo a extremidade não redutora uma unidade glucurónica ou idurónica, com uma razão glucurónico/idurónico de entre 45/55 e 55/45.

12. Um N,O-sulfato despolimerizado de epiK5 com PMM que se possa obter de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 to 11.

13. Um N,O-sulfato despolimerizado de epiK5 com PMM com um grau de sulfatação de entre 2,3 e 2,9, uma massa molecular média de entre 1.500 e 12.000, e apresentando na extremidade redutora da maioria das suas cadeias, a estrutura (a' )

(a'> na qual R represente hidrogénio ou SO3 , ou um seu sal aceitável do ponto de vista farmacêutico.

14. Um N,O-sulfato despolimerizado de epiK5 com PMM de acordo com a reivindicação 13, com uma massa molecular média de entre 1.500 e 8.000, e um grau de sulfatação de entre 2,5 e 2,9.

15. Um N,O-sulfato despolimerizado de epiK5 com 7 PMM de acordo com a reivindicação 14, com um grau de sulfatação de entre 2,7 e 2,9.

16. Um N,O-sulfato despolimerizado de epiK5 com PMM de acordo com a reivindicação 15, com uma massa molecular média de 6.000 ± a massa teórica de uma unidade de dissacárido·.

17. Um N,O-sulfato despolimerizado de epiKS com PMM de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 21, com uma massa molecular média de 6.000 ± a massa teórica de uma unidade de dissacárido, um grau de sulfatação de entre 2,7. e 2,9, um conteúdo de entre 80. % e 95 % de 6-O-sulfato de glucosamina, de 95 % a 100 % em N-sulfato de glucosamina., de 45 % a 55 % em 3-O-sulfato de glucosamina, de 35 % a 45 % em 3-O-sulfato de ácido glucurónico, de 15 % a 25 % em 2-O-sulfato de ácido idurónico, e. apresentando uma unidade (a') nã extremidade redutora da maioria das suas cadeias, ou um seu sal aceitável do ponto de vista farmacêutico.

18. Um N,O-sulfato despolimerizado de epiKS com PMM de acordo com a reivindicação 18, constituído por uma mistura de cadeias na qual pelo menos 80 % das cadeias referidas tem a fórmula III

(III) 8 na qual 40 % a 60 % das unidades urónicas sejam de ácido idurónico, q seja um inteiro de entre 2 e 17, R, R" e R"sejam hidrogénio ou SO3- com um grau de sulfatação de entre 2,3 e 2,9, e a extremidade redutora da maioria das cadeias da mistura de cadeias referida apresente uma unidade de 2,5-anidromanitol sulfatado com a estrutura (a') ÇH-jOSCV

(«O chzoso3· na qual R represente hidrogénio ou S03~ e o catião correspondente seja aceitável do ponto de vista químico ou farmacêutico.

19. Um N,O-sulfato despolimerizado de epiK5 com PMM de acordo com a reivindicação 18, constituído por uma mistura de cadeias na qual pelo menos 8 0 % das cadeias referidas tem a fórmula III em que q seja um inteiro de entre 2 e 14.

20. Um N,O-sulfato despolimerizado de epiKS com PMM de acordo com a reivindicação 18, constituído por uma mistura de cadeias na qual pelo menos 80 % das cadeias referidas tem a fórmula III em que q seja um inteiro de entre 2 e 11.

21. Um N,O-sulfato despolimerizado de epiKS com PMM de acordo com a reivindicação 18, constituído por uma 9 mistura de cadeias na qual a espécie preponderante seja um composto com a fórmula III na qual q seja 8 ou 9, R seja 45 % a 55 % de SO3-, R' seja 35 % a 45 % de SO3” em ácido glucurónico, R" seja 15 % a 25 % de SO3” em ácido idurónico, para um grau de sulfatação de entre 2,7 e 2,9.

22. Composição farmacêutica que inclua, a titulo de ingrediente activo, uma quantidade farmacologicamente activa de um N,O-sulfato despolimerizado de epiK5 com PMM de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 21, ou um seu sal aceitável do ponto de vista farmacêutico, misturada com um veículo farmacêutico. Lisboa, 29 de Abril de 2008