PT1539977E

PT1539977E - Produção de tiacumicina

Info

Publication number: PT1539977E
Application number: PT37847662T
Authority: PT
Original assignee: Optimer Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2002-07-29
Filing date: 2003-07-15
Publication date: 2015-01-14
Also published as: FR15C0028I2; WO2004014295A3; WO2004014295A2; SI1539977T1; EP1539977B1; CN100519757C; NL300727I2; BE2015C017I2; EP1539977A2; JP2013208131A; US7507564B2; KR20050053598A; US20060257981A1; JP5729919B2; CN1688707A; JP2010178760A; AU2003251902B2; CA2494742C; FR15C0028I1; EP1539977A4

Description

DESCRIÇÃO

PRODUÇÃO DE TIACUMICINA

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

As tiacumicinas são uma família de compostos estruturalmente relacionados que contêm o anel macrólido de 18 membros mostrado abaixo.

Actualmente, vários tiacumicinas distintas foram identificadas e seis destas (tiacumicina A-F) são definidas pelo seu padrão particular de substituintes R1, R2, e R3 (Patente US 4918174; J. Antibiotics, 1987, 575-588).

As Lipiarmicinas são uma família de produtos naturais estreitamente relacionados com os tiacumicinas. Dois membros da família das Lipiarmicinas (A3 e B3) são idênticas às tiacumicinas B e C, respectivamente, (J. Antibiotics, 1988, 308-315; J. Chem. Soc. Perkin Trans I, 1987, 1353-1359).

As tiacumicinas e as Lipiarmicinas foram caracterizadas por vários métodos físicos. As estruturas químicas destes compostos relatados são baseadas na espectroscopia (UV-VIS, infravermelho, NMR e 13C), espectrometria de massa e análise elementar (Ver, por exemplo: J. Antibiotics, 1987, 575-588; J. Antibiotics, 1983, 1312-1322).

As tiacumicinas são produzidas por bactérias, incluindo Dactylosporatigium aurantiacum subespécie hamdenensis, que podem ser obtidas a partir da coleção de Patentes ARS do Northern Regional Research Center, United States Department of Agriculture, 1815 North University Street, Peoria, IL 61604, número de acesso NRRL 18085. As características da estirpe AB 718C-41 são dadas em J. Antibiotics, 1987, 567-574 e na Patente US 4918174 .

As Lipiarmicinas são produzidas por bactérias incluindo Actinoplanes deccanensis (Patente US 3978211). Estudos taxonómicos da estirpe do tipo A/10655, que foi depositado na ATCC sob o número 21983, são discutidos em J. Antibiotics, 1975,247-25.

As tiacumicinas, especificamente a tiacumicina B, apresentam atividade contra uma variedade de agentes patogénicos bacterianos e, em particular contra Clostridium difficile, uma bactéria Gram-positiva (Antimicrob. Agents Chemother., 1991, 1108-1111). A Clostridium difficile é uma bactéria formadora de esporos anaeróbicos que provoca uma infeção do intestino. A diarreia é o sintoma mais comum, mas a dor abdominal e febre também podem ocorrer. A Clostridium difficile é um dos principais agentes causadores da colite (inflamação do cólon) e diarreia, que pode ocorrer após a ingestão de antibióticos. Esta bactéria é adquirida principalmente em hospitais e centros de cuidados crónicos. Porque a tiacumicina B mostra uma atividade promissora contra a C. difficile, espera-se que seja útil no tratamento de infeções bacterianas, especialmente aquelas do trato gastrointestinal, em mamíferos. Exemplos desses tratamentos incluem, mas não estão limitados a tratamento da colite e tratamento da síndroma do intestino irritável. As tiacumicinas podem também encontrar uso para o tratamento de cancros gastrointestinais.

Os processos de fermentação são usados para obter antibióticos, incluindo tiacumicinas. Os antibióticos podem ser produzidos por cultura de um microrganismo num meio contendo fontes de carbono facilmente assimiladas, azoto, e sais inorgânicos sob condições de fermentação aeróbicas submersas, até que uma quantidade substancial de atividade antibiótica seja produzida conforme se deduz a partir de análises em-processo. Por causa do aumento da procura mundial por antibióticos, existe uma necessidade continua de métodos aperfeiçoados para a produção de antibióticos.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Figura 1 mostra um cromatograma de HPLC dos produtos de fermentação em bruto produzidos de acordo com o Exemplo 1; A tiacumicina B tem um tempo de retenção de aproximadamente 12,6 min. A Figura 2 mostra um cromatograma de HPLC dos produtos de fermentação produzidos de acordo com o Exemplo 2; A tiacumicina B tem um tempo de retenção de aproximadamente 11,8 min. A Figura 3 mostra um cromatograma de HPLC de tiacumicina B purificada (por HPLC) produzida por fermentação de acordo com o Exemplo 2; A tiacumicina B tem um tempo de retenção de aproximadamente 12,0 min. A Figura 4 mostra um cromatograma de HPLC de tiacumicina B produzida por fermentação e purificada por cromatografia liquida de média pressão de fase inversa seguida de trituração de acordo com o Exemplo 3; a tiacumicina B tem um tempo de retenção de aproximadamente 10,1 min.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO O objeto da invenção é definido nas reivindicações anexas.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A menos que de outro modo definido, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados têm o mesmo significado que o normalmente entendido por um vulgar perito na técnica à qual esta invenção pertence. Exemplos de métodos e materiais estão descritos abaixo.

As composições que contêm a tiacumicina B produzida utilizando o processo da invenção podem ser administradas para tratamentos profiláticos e/ou tratamentos terapêuticos. Em aplicações terapêuticas, as composições são administradas a um paciente que já sofre de uma infeção, tal como descrito acima, numa quantidade suficiente para curar ou pelo menos parar parcialmente os sintomas da infeção. Uma quantidade adequada para conseguir isto é definida como "quantidade ou dose terapeuticamente eficaz". Quantidades eficazes para esta utilização dependerão da gravidade e evolução da infeção, terapia anterior, estado de saúde do paciente e da resposta aos medicamentos, e o julgamento do médico assistente. Em aplicações profiláticas, as composições contendo a tiacumicina B produzida pelo processo da invenção são administrados a um paciente suscetível a, ou de outro modo em risco de uma infeção particular. Uma tal quantidade é definida como sendo uma "quantidade profilaticamente eficaz ou dose". Nesta utilização, as quantidades precisas dependem novamente do estado do paciente de saúde, peso, e outros semelhantes.

Uma vez que a melhoria das condições do paciente tenha ocorrido, uma dose de manutenção é administrada, se necessário. Subsequentemente, a dosagem ou a frequência de administração, ou ambas, podem ser reduzidas, como uma função dos sintomas, para um nivel no qual a condição melhorada é retida. Quando os sintomas foram aliviados até ao nivel desejado, o tratamento pode cessar. Os pacientes podem, contudo, necessitar de tratamento intermitente numa base de longo prazo após qualquer recorrência dos sintomas da doença.

Em geral, uma dose eficaz adequada da tiacumicina B produzida pelo processo da presente invenção irá estar na gama de 0,1 a 1000 miligramas (mg) por recipiente por dia, preferivelmente na gama de 1 a 500 mg por dia. A dosagem desejada é preferivelmente apresentada em uma, duas, três, quatro ou mais sub-doses administradas em intervalos apropriados ao longo do dia. Estas sub-doses podem ser administradas como formas de dosagem unitária, por exemplo, contendo 5 a 1000 mg, de preferência 10 a 200 mg de ingrediente ativo por forma de dosagem unitária. De preferência, os compostos da invenção serão administrados em quantidades entre cerca de 1,0 mg/kg a 250 mg/kg de peso corporal do paciente, entre cerca de uma a quatro vezes por dia.

Uma "composição farmacológica" refere-se a uma mistura de uma ou mais das tiacumicinas aqui descritas, ou seus sais fisiologicamente aceitáveis, com outros componentes químicos, tais como transportadores e/ou excipientes fisiologicamente aceitáveis. 0 objetivo de uma composição farmacológica é para facilitar a administração de um composto a um organismo. "Sais farmaceuticamente aceitáveis" dos compostos da invenção incluem os derivados de ácidos inorgânicos e orgânicos farmaceuticamente aceitáveis e bases. Exemplos de ácidos apropriados incluem ácidos clorídrico, bromídrico, sulfúrico, nítrico, perclórico, fumárico, maleico, fosfórico, glicólico, glucónico, láctico, salicílico, succínico, tolueno-p-sulfónico, tartárico, acético, cítrico, metanossulfónico, fórmico, benzóico, malónico, naftaleno-2-sulfónico, benzenossulfónico, 1,2 etanossulfónico (edisilato), ácido galactosil-D-glucónico, e semelhantes. Outros ácidos, tais como ácido oxálico, embora não sejam eles próprios farmaceuticamente aceitáveis, podem ser empregues na preparação de sais úteis como intermediários na obtenção do composto produzido pelo processo da presente invenção e os seus sais de adição de ácido farmaceuticamente aceitável. Os sais derivados de bases apropriadas incluem metal alcalino (por exemplo, sódio), metal alcalino-terroso (por exemplo, magnésio), amónio e sais N (C1-C4 alquilo) 4+, e outros semelhantes. Exemplos ilustrativos de alguns destes incluem hidróxido de sódio, hidróxido de potássio, hidróxido de colina, carbonato de sódio, e outros semelhantes.

Um "transportador fisiologicamente aceitável" refere-se a um veículo ou diluente que não provoca irritação significativa num organismo e não anula a atividade biológica e propriedades do composto administrado.

Um "excipiente" refere-se a uma substância inerte adicionada a uma composição farmacológica para facilitar ainda mais a administração de um composto. Exemplos de excipientes incluem, mas não estão limitados a, carbonato de cálcio, fosfato de cálcio, vários açúcares, e tipos de amido, derivados de celulose, gelatina, óleos vegetais e polietilenoglicóis. 0 termo "meio nutriente", tal como aqui utilizado descreve uma mistura de ingredientes sintéticos ou que ocorrem naturalmente. Em geral, um meio nutriente compreende uma fonte de carbono, uma fonte de azoto, elementos de rastreio tais como sais inorgânicos, e, opcionalmente vitaminas, ou outros fatores de crescimento, e um adsorvente. 0 termo "caldo" como aqui utilizado refere-se ao meio de cultura fluido como obtido durante ou depois da fermentação. Caldo compreende uma mistura de água, o antibiótico desejado (s) , nutrientes, não utilizados ou organismos vivos mortos, produtos metabólicos, e o adsorvente com ou sem produto adsorvido. 0 termo "tiacumicina" como aqui utilizado refere-se a uma familia de compostos os quais compreendem o anel macrólido de 18 membros mostrado abaixo:

0 termo "tiacumicina B" refere-se a uma molécula que tem a estrutura mostrada abaixo:

0 termo "rendimento", tal como aqui utilizado refere-se a uma quantidade de tiacumicina em bruto reconstituída em metanol para o mesmo volume do caldo de fermentação inicial. 0 rendimento é determinado usando técnicas de HPLC convencionais. 0 rendimento é reportado em unidades de mg/L.

De acordo com uma forma de realização da invenção, a tiacumicina B é recuperada com um rendimento excecional (> 100 mg de caldo/1) a partir do caldo de fermentação por absorção de resina e eluído a partir da resina por lavagem e micélio com solventes de diferentes polaridades. A purificação pode ser favorecida por extração com solvente e/ou separação cromatográfica, tal como Sephadex, gel de sílica, cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) ou cromatografia líquida de média pressão de fase reversa e/ou recristalização com um ou mais solventes e/ou trituração com um ou mais solventes.

Um microrganismo utilizado na presente invenção foi identificado como pertencendo à família Actinoplanaceae, género Dactylosporangium (Journal of Antibiotics, 1987, p 567-574 e Patente US 4918174).

Foi designado Dactylasporangium aurantiacum, subespécie hamdenensis 718C-41. A subcultura foi obtida a partir da coleção de Patentes ARS do Northern Regional Research Center, United States Department of Agriculture, 1815 North University Street, Peoria, IL 61604, EUA, onde foi atribuído o número de acesso NRRL 18085. As caracteristicas da estirpe AB 718C- 41 são dadas no Journal of Antibiotics, 1987, p. 567-574 e na Patente US 4918174.

Microrganismos adicionais capazes de produzir tiacumicinas incluem espécies mutantes, que mostram propriedades vantajosas comparadas com as espécies conhecidas na técnica. Estas estirpes bacterianas podem ser geradas por mutagénese de uma estirpe parental. Estratégias e métodos de mutagénese, procedimentos de rastreio e isolamento de estirpes bacterianas mutantes, composições de meios utilizados para produzir as estirpes mutantes da invenção são conhecidos na técnica. Os microrganismos designados como estirpes podem incorporar vantagens, tais como uma maior produção do macrólido desejado, uso mais eficiente do meio nutriente, ou diminuição da necessidade de oxigénio para o crescimento aeróbio.

Na forma de realização preferida, o cultivo de Dactylosporangium aurantiacum, subespécie hamdenensis AB 718C-41 NRRL 18085 para a produção de tiacumicina B é realizado num meio contendo fontes prontamente assimiláveis de carbono, fontes de azoto, sais inorgânicos e outros ingredientes orgânicos com um ou mais absorventes sob condições de aeração adequada e misturados num ambiente estéril. As composições de meios nutrientes utilizados na produção de antibióticos da invenção serão descritas em detalhe nos exemplos.

As fontes de carbono capazes de suportar o crescimento de microrganismos incluem, mas não estão limitados a glucose, sacarose, galactose, frutose, amido, melaços, extratos de malte, dextrinas, soro de leite, glicerol, lipidos, farinha de milho e outros semelhantes e suas combinações. De acordo com uma forma de realização da invenção, a fonte de carbono está presente na gama de entre 0,2-10% em peso. Quantidades de fontes de carbono de acordo com uma forma de realização da invenção são apresentadas na Tabela 2.

As fontes de azoto capazes de suportar o crescimento de microrganismos incluem, mas não estão limitados a extrato de carne, farinha de soja, farelo de algodão, levedura completa, extrato de levedura, farinha de soja, peptona, casaminoácido, pó de peixe, licor de infusão de milho, sais de amónio, caserna, aminoácidos e similares e suas combinações. De acordo com uma forma de realização da presente invenção, o meio nutritivo contém pó de peixe (farinha de peixe de primeira qualidade 999, proteina de peixe TripelNine, a.m.b.a. Fiskerihavnsgade 35, 6700 Esbjerg, Demark) como fonte de azoto. De acordo com uma forma de realização da invenção, a fonte de azoto está presente no intervalo entre 0,1-5,0% em peso. Valores de fontes de azoto de acordo com uma forma de realização da invenção são apresentados na Tabela 2.

Oligoelementos essenciais necessários para o crescimento e desenvolvimento do organismo podem ocorrer como impurezas noutros constituintes do meio em quantidades suficientes para satisfazer os requisitos do crescimento e biossintéticos do organismo. No entanto, pode ser benéfico incorporar no meio de cultura sais inorgânicos nutrientes solúveis adicionais capazes de ajudar ao crescimento de microrganismos. Os sais inorgânicos capazes de suportar o crescimento de microrganismos incluem, mas não estão limitados a K2HPO4, MgSCg .7H2O, KC1, CaCC>3 e semelhantes. Oligoelementos essenciais estão presentes, preferencialmente na gama entre 0,02-2,0% em peso. As quantidades de elementos essenciais individuais de acordo com uma forma de realização da invenção são apresentadas na Tabela 2.

Resinas adsorventes disponíveis comercialmente foram encontradas para melhorar o rendimento e eficiência de recuperação de tiacumicina B durante a fermentação. Tais adsorventes incluem, mas não estão limitados a Amberlite® XAD16, XAD16HP, XAD2, XAD7HP, XAD1180, XAD1600, e IRC50 (todos Rohm & Haas Co., EUA), Duolite® XAD761 (Rohm & Haas Co. , EUA) e similares. Os adsorventes estão preferencialmente presentes na gama de entre 0,5-15% em peso. As quantidades de adsorventes de acordo com uma forma de realização da invenção são apresentadas na Tabela 2.

Como é usual em processos de cultura aeróbicos submersos, o ar estéril é disperso através do meio de cultura. A concentração de oxigénio foi mantida a superior a 3% (sensores InPro 6000 série S2, Mettler Toledo). Sob estas condições, o crescimento de células é mantido a um nível que impede as condições de crescimento se tornem anaeróbias. Em algumas formas de realização, o componente limitante é escolhido a partir de uma fonte de carbono, fonte de azoto, ou qualquer outro componente requerido pelas células (por exemplo, no meio de alimentação).

As bactérias são cultivadas sob condições de crescimento adequadas. Tais condições de crescimento adequadas são caracterizadas através da limitação da disponibilidade de um componente do meio de crescimento e/ou meio de alimentação de tal modo que são mantidas condições aeróbias para o crescimento da referida bactéria. Tais condições podem também ser caracterizadas por exemplo, por manutenção de um nível de oxigénio dissolvido a uma concentração de entre cerca de 2% a 30%. Tais níveis de oxigénio dissolvido podem variar dependendo do equipamento técnico específico utilizado para o crescimento de bactérias e da medição da concentração de oxigénio dissolvido.

Bactérias produtoras de tiacumicina podem ser cultivadas em recipientes que vão desde frascos de agitação até grandes fermentadores em "lote", por métodos conhecidos na técnica. Para a produção de quantidades substanciais de tiacumicinas, é utilizada a fermentação aeróbica submersa em tanques. No entanto, as pequenas quantidades podem ser obtidas por cultura de frasco agitado. Para a fermentação do tanque é preferível usar um inoculo vegetativo. O inoculo vegetativo é preparado por inoculação de um pequeno volume de meio de cultura com a forma de esporo, fragmentos de micélio, ou uma pastilha liofilizada do organismo para obter uma cultura em crescimento ativo fresco do organismo. O inoculo vegetativo é então transferido para um tanque maior, onde, depois de um tempo de incubação adequado, o antibiótico tiacumicina é produzido com rendimento muito melhorado.

Pode ser necessário adicionar pequenas quantidades de um agente anti-espuma aos meios de fermentação em grande escala, se a formação de espuma se tornar um problema. A produção prossegue num meio de controlo com outros ingredientes/aditivos para melhorar a produção. Um processo de cultura agitada submersa líquida é utilizado para a produção de tiacumicinas. A fermentação é realizada a uma gama de temperatura de 25°C a 37°C. O consumo da fonte de carbono é rigorosamente controlada e uma quantidade adicional da fonte de carbono é adicionada conforme necessário. 0 pH da fermentação é preferivelmente mantido entre cerca de 6,0 a cerca de 8,0. A tiacumicina B é produzida e acumulada entre 3 e 15 dias após a inoculação da fermentação. O meio de controlo padrão consiste nos seguintes ingredientes, nas seguintes quantidades: Pó de peixe 0,1% a 5%

Glucose 0,2% a 10% K2HPO4 0,02% a 0,5%

MgSO4.7H20 0,02% a 0,5% KC1 0,01% a 0,3%

CaCO3 0,1% a 2%

Outros aditivos/ingredientes consistem em: Ácido casamino 0,05% a 2%

Extrato de levedura 0,05% a 2%

Resina XAD-16 0,5% a 15%

Após a conclusão da fermentação, a massa sólida (incluindo a resina adsorvente) é separada a partir do caldo por peneiração. As tiacumicinas são eluidas a partir da resina com solventes orgânicos, tais como acetato de etilo, metanol, acetonitrilo ou uma mistura de dois ou mais solventes orgânicos. O extrato é em seguida concentrado sob pressão reduzida. Este residuo é ainda purificado por trituração com solventes de baixa polaridade, tais como hexanos, heptanos, metilciclo-hexano, ou por partição entre as duas fases de sistemas solventes tais como: acetato de etilo/água; acetato de etilo/solução aquosa de cloreto de sódio; metanol/hexano, acetonitrilo/hexano ou outras misturas de dois ou mais solventes em várias proporções e combinações ou por cromatografia em coluna de Sephadex eluindo com um sistema solvente orgânico adequado. Se

necessário, as tiacumicinas pode ser adicionalmente purificadas quer por cristalização, e/ou separação cromatográfica e/ou cromatografia liquida de alto desempenho (HPLC) e/ou particionamento liquido e/ou trituração.

EXEMPLOS

Como pode ser apreciado a partir da revelação acima, a presente invenção tem uma ampla variedade de aplicações. Por conseguinte, os seguintes exemplos são oferecidos como forma de ilustração, não como forma de limitação.

Exemplo de Referência 1

Dactylosporangium aurantiacum subsp. hamdenensis AB 718C-41 NRRL 18085 (-20°C stock) , foi mantida em 1 ml de meio N° 104 (Tabela 1) . Após as condições de esterilização normalizadas (30 min., 121°C, 1,05 kg/cm2 ) o balão de cultura (250 mL) contendo Meio N° 104 (50 ml) foi inoculado com AB 718C-41 NRRL 18085 num agitador (set @ 250 rpm) a 30°C durante 72 h. Cinco por cento de inoculo vegetativo a partir do balão de cultura de primeira passagem foi em seguida transferido assepticamente para um balão de fermentação contendo os mesmos ingredientes como na Tabela 1.

Tabela 1: Ingredientes do Meio N° 104

Os frascos de fermentação foram incubados num agitador rotativo a 30°C durante 3 a 12 dias. As amostras de todo o caldo de cultura de fermentação foram filtradas. 0 bolo de filtração foi lavado com MeOH e os solventes foram removidos sob pressão reduzida. 0 resíduo foi reconstituído em metanol, para o mesmo volume do caldo de fermentação inicial. A análise foi realizada por meio de um sistema de acoplamento Waters BRISA HPLC com detetores Waters 2487 de 2 canais UV/Vis. As tiacumincins foram testadas numa coluna de 50 x 4,6 mm ID, 5 mm YMC ODS-A (catálogo YMC # CCA AS05-0546WT) com uma fase móvel consistindo em 45% de acetonitrilo em água contendo ácido fosfórico a 0,1% a uma taxa de fluxo de 1,5 ml/minuto. As tiacumicinas foram detetadas a 2 66 nm. Um cromatograma de HPLC de um produto em bruto (tempo de retenção da tiacumicina B @ 12,6 minutos) é mostrado na Fig. 1. Neste exemplo, o rendimento em bruto da tiacumicina B foi cerca de 250 mg/L, após 7 dias. Após purificação por HPLC, o rendimento da tiacumicina B foi cerca de 100 mg/L.

Exemplo 2

Após as condições de esterilização normalizadas (30 min, 121°C, 1,05 kg/cm2) o frasco de cultura (250 mL) contendo Meio N° 104 (50 ml) foi inoculado com AB 718C-41 NRRL 18085 e incubado num agitador (conjunto @ 250 rpm) a 30°C durante 72 h. Cinco por cento de inoculo vegetativo a partir do balão de cultura de primeira passagem foi transferido assepticamente para um frasco de cultura contendo os mesmos ingredientes como na Tabela 1 e foi incubado num agitador rotativo a 30 ° C durante 72 h. Cinco por cento do inoculo os balões de semente segunda passagem foi em seguida utilizado para inocular com AB 718C-41 NRRL 18085, num fermentador de 5 litros contendo Meio N° 104 (2,5 L) . A formação de espuma excessiva foi controlada por adição de um agente anti-espuma (Sigma A-6426) . Este produto é uma

mistura de agentes anti-espuma de silicone não-orgânicos em uma dispersão de poliol. 0 consumo de glucose foi monitorizado como um parâmetro de crescimento e o seu nivel foi controlado pela adição do meio de alimentação. 0 meio de alimentação e as condições do Exemplo 2 foram os seguintes:

Tabela 2

Meio de fermentação: N° 104

Volume de fermentação: 5 litros

Esterilização: 40 minutos 121°C, 1,05 kg/cm2

Temperatura de incubação: 30°C.

Taxa de arejamento: 0,5-1,5 volumes de ar por volume de cultura e minuto

Agitação da fermentação: 300-500 rpm A fermentação foi realizada durante 8 dias e a resina XAD-16 foi separada do caldo de cultura por peneiração. Depois de se lavar com água a resina XAD-16 foi eluida com metanol (5-10 x volume de XAD-16) . O metanol foi evaporado e o residuo oleoso foi extraido três vezes com acetato de

etilo. Os extratos foram combinados e concentrados sob pressão reduzida para um residuo oleoso. O residuo oleoso foi seco e lavado com hexano para dar o produto bruto na forma de um pó castanho claro e o seu cromatograma por HPLC (tempo de retenção da tiacumincin B @ 11,8 minutos) é

mostrado na Figura 2. Este foi purificado por coluna de silica gel (mistura de acetato de etilo e hexano como eluente) e o material resultante foi ainda purificado por RP-HPLC (HPLC de fase reversa) para dar tiacumicina B como um sólido branco. A pureza foi determinada como sendo> 95% por cromatografia de HPLC e o cromatograma (tempo de retenção da Tiacumincin B @ 12,0 minutos) é mostrado NA figura 3. Análise da tiacumincin B isolada deu dados NM>R 3H e 13C idênticos aos relatados em J.Antibiotics, 1987, 575-588, e estes encontram-se resumidos abaixo.

Tiacumicina B: pf 129-140°C (pó branco a partir de RP-HPLC); pf 166-169°C (agulhas brancas de isopropanol); [a] d2°-6, 9 (c 2,0, MeOH) ; MS m/z (ESI) 1079, 7 (M + Na)+; 3H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 7,21 (d, 1H) , 6,59 (dd, 1H) , 5,95 (ddd, 1H) , 5,83 (s largo, 1H) , 5,57 (t, 1H) , 5,13 (br d, 1H) , 5,09 (t, 1H) , 5,02 (d, 1H) , 4,71 (m, 1H) , 4,71 (s largo, 1H), 4,64 (s largo, 1H), 4,61 (d, 1H), 4,42 (d, 1H), 4,23 (m, 1H) , 4,02 (quinteto, 1H), 3,92 (dd, 1H), 3,73 (m, 2H) , 3,70 (d, 1H) , 3,56 (s, 3H) , 3,52 -3,56 (m, 2H) , 2,92 (m, 2H), 2,64-2,76 (m, 3H), 2,59 (hepteto, 1H), 2,49 (ddd, 1H), 2,42 (ddd, 1H), 2,01 (dq, 1H), 1,81 (s, 3H), 1,76 (s, 3H) , 1,65 (s, 3H) , 1,35 (d, 3H) , 1,29 (m, 1H) , 1,20 (t, 3H) , 1,19 (d, 3H) , 1,17 (d, 3H) , 1,16 (d, 3H) , 1,14 (s, 3H), 1,12 (s, 3H), 0,87 (t, 3H); 13C NMR (100 MHz, CD3OD) δ 178,4, 169, 7, 169, 1, 154, 6, 153, 9, 146, 2, 143,7, 141, 9, 137,1, 137,0, 136, 4, 134, 6, 128,5, 126, 9, 125, 6, 124, 6, 114, 8, 112,8, 108, 8, 102,3, 97,2, 94,3, 82,5, 78, 6, 76, 9, 75, 9, 74,5, 73,5, 73,2, 72,8, 71, 6, 70,5, 68,3, 63, 9, 62,2, 42,5, 37,3, 35,4, 28,7, 28,3, 26, 9, 26, 4, 20,3, 19, 6, 19, 2, 18,7, 18,2, 17, 6, 15,5, 14.6,14.0,11.4.

Exemplo 3

Uma amostra em bruto de tiacumicina B (15 g) foi obtida por fermentação como um residuo oleoso após a libertação a partir da resina como descrito no Exemplo 2. Este foi dissolvido em acetato de etilo (300 mL) a 35°C e a solução foi agitada numa funil de decantação com água (300 mL) e deixada em repouso durante 1 minuto. Foi adicionado uma sSolução de cloreto de sódio aquoso saturado (100 mL) e a mistura foi deixada em repouso durante mais 1 minuto. A fase inferior e quaisquer sólidos presentes na interface foram descartados e a fase superior foi concentrada até se obter um sólido castanho sob pressão reduzida a 35°C. A espuma resultante foi submetida a cromatografia inversa de fase liquida a média pressão utilizando um aparelho Biotage 75L acoplado a um detetor de Isco UA-6 UV/vis com os seguintes parâmetros:

Coluna: 1,2 kg, silica Biotage KP-C18-HS.

Equilibração: 50:50:1, MeCN/fhO/AcOH (6 L).

Carregando: Em metanol (20 ml) através do módulo de injeção de amostra contendo 25 g de silica Biotage KP-C18-HS.

Eluente: 50:50:1, MeCN/H2O/AcOH.

Fluxo: 230 mL/min

Pressão: Solvente-90 psi

Radial - 100 psi

Detetor/Comprimento de onda - 254 nm:

Comprimento da via - 0,1 centímetros

Sensibilidade - 2

Gráfico de velocidade 60 centímetros/h

Filtro de ruído- 5 seg.

Recolha de fração: Manual - começou a recolha logo após a inflexão entre o pico principal e pico anterior, terminando a recolha a 20% da altura do pico principal.

Condicionamento da coluna: 100% de MeCN (4 L)

Solução de cloreto de sódio aquoso saturado (25% do volume de fração) foi adicionada à fração recolhida. A mistura foi agitada e deixada a separar em duas fases. A fase superior foi removida e concentrada à secura sob pressão reduzida a 30°C. O sólido resultante foi dissolvido em acetato de etilo (75 mL) e lavado com água (2 x 75 mL) para remover o cloreto de sódio. A fase orgânica foi concentrada sob pressão reduzida a 30°C para dar uma espuma amarela (recuperação: 4,56 g, 30%; pureza -93%). O material foi combinado com vários outros lotes (total: 156,0 g, 90,8% de pureza) e a este foi adicionado isopropanol (1000 mL). A mistura foi sonicada com agitação à temperatura ambiente durante 20 min. para produzir uma suspensão esbranquiçada. Neste ponto, o material foi filtrado e o bolo de filtro foi lavado com isopropanol (300 mL) . O sólido foi seco sob alto vácuo para deixar um pó branco (recuperação: 146,2 g, 94%; pureza: 91,1%) (Figura 4). Pf 156-160°C; [A]D20-8,4 (c 2,0, MeOH) ; MS m/z (ESI) 1079, 7 (Μ + Na)+; Calculado para Ο52Η74Οΐ2θι8: C, 59, 03; H, 7,05; Cl, 6,70. Encontrado: C, 58,75; H, 7,04; Cl, 6,91. A invenção aqui descrita de forma ilustrativa pode ser adequadamente praticada na ausência de qualquer elemento ou elementos, limitação ou limitações, não especificamente aqui revelados. Assim, por exemplo, os termos "compreendendo", "incluindo", "contendo", etc. devem ser lidos expansivamente e sem limitação.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Processo para a produção de tiacumicina B compreendendo: cultivar um microrganismo num meio nutriente para acumular tiacumicina B no meio nutriente; e isolar a tiacumicina B a partir do meio nutriente; em que o meio nutriente compreende pelo menos uma resina adsorvente capaz de adsorver tiacumicina B.
2. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que o meio nutriente compreende 0,5% -15% em peso da resina, pelo menos, um adsorvente capaz de adsorver a tiacumicina B.
3. Processo de acordo com a reivindicação 1 que compreende a cultura de um microorganismo tendo a capacidade de produzir tiacumicina B, num meio nutriente que compreende, pelo menos, um adsorvente capaz de adsorver tiacumicina B durante a referida cultura, em que o referido adsorvente é seleccionado de entre o grupo constituído por uma gel de sílica de fase inversa, Amberlite® XAD16, XAD16HP, XAD2, XAD7HP, XAD1180, XAD1600, IRC50 e Duolite® XAD761 e tiacumicina B acumulada no meio nutriente.
4. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que o referido microrganismo é Dactylosporangium aurantiacum NRRL 18085.
5. Processo de acordo com a reivindicação 1 em que a referido tiacumicina B é isolada a partir do referido meio nutriente usando técnicas selecionadas de entre o grupo consistindo de: peneiramento e remoção de material indesejado por eluição com, pelo menos, um solvente ou uma mistura de solventes; extracção com, pelo menos, um solvente ou uma mistura de solventes; crista1izacão: senaração cromatonráfica: croma tocrra f i a líquida de alta eficiência (HPLC); MPLC; trituração; e a extração com salmoura saturada com, pelo menos, um solvente ou uma mistura de solventes.
6. Processo de acordo com a reivindicação 1 em que o referido microorganismo é cultivado a uma temperatura de cerca de 25°C a 35°C e a um pH de cerca de 6,0 a 8,0.
7. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que o meio nutriente compreende uma ou mais fontes de carbono seleccionadas a partir do grupo que consiste em glucose, sacarose, amido, melaços, dextrinas, soro de leite, glicerol, lípidos e farinha de milho.
8. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que o meio nutriente é alimentado com uma fonte de carbono adicional, conforme necessário.
9. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que o meio nutriente compreende uma ou mais fontes de azoto/ orgânicas capazes de suportar o crescimento de microrganismos selecionados do grupo que consiste de extrato de carne, farinha de soja, levedura inteira, extrato de levedura, farinha de soja, peptona, casaminoácido, pó de peixe, licor de infusão de milho, sais de amónio, caseína e aminoácidos.
10. Processo de acordo com a reivindicação 9, em que o meio nutriente compreende pó de peixe.
11. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que o meio nutriente compreende um ou mais sais inorgânicos capazes de suportar o crescimento de microrganismos selecionados a partir do grupo que consiste de K2HPO4, MgSO4.7H2O e CaCO3.
12. Processo de acordo com a reivindicação 3, em que o gel de sílica de fase inversa é seleccionado a partir do grupo que consiste em KP-C18, KP-C-18 WP, e KP-C18HS.