PT1456380E - Inibidores smad7 para o tratamento de doenças do snc - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "INIBIDORES SMAD7 PARA O TRATAMENTO DE DOENÇAS DO SNC" A presente invenção refere-se a um inibidor específico de função ou expressão de Smad7 para utilização na prevenção, na melhoria ou no tratamento de esclerose múltipla ou isquemia cerebral, em que o referido inibidor específico é selecionado a partir do grupo que consiste em anticorpos intracelulares ou fragmentos de anticorpo, aptâmeros, intrâmeros, ARNi (ARN de cadeia dupla) e moléculas antisense anti-Smad7. 0 modelo atual para a iniciação da doença inflamatória mediada por células T do SNC inclui a ativação de células T periféricas específicas do antigénio e a diferenciação de Thl (Martin, 1992; Miller, 1994; Zamvil, 1990). Uma etapa de ativação de células T periféricas parece ser necessária para as células T autorreativas entrarem no SNC através da barreira hematoencefálica (Wekerle, 1986). O processo de formação de lesão é ainda regido por um padrão complexo de expressão de citocinas e quimocinas na reestimulação de células T autorreativas in situ (Hoffman, 1998; Karpus, 1999). É largamente aceite que as células Thl, críticas para a imunidade mediada por células devido à respetiva produção de IL-2, IFN-gama, TNF-alfa e linfotoxina, sejam envolvidas na imunopatologia da doença autoimune específica do órgão (Liblau, 1995; Raine, 1995; Steinman, 1997). Foi sugerido um papel de reguladores para as células Th2 (Mathisen, 1997; Nicholson, 1995; Racke, 1994) e para as células que produzem o Fator de crescimento de transformação-beta (TGF-beta) (Chen, 1996; 1994; 0'Garra, 1997; Weiner, 1994) . O TGF-beta pertence a uma família de péptidos com efeitos pleiotrópicos amplamente distribuídos por todo o corpo (Spom, 1989) e em particular no sistema imunitário 2 (Letterio, 1998). Além dos TGF-betas, as proteínas morfogenéticas do osso (BMP) e a ativina constituem a superfamília de BMP (Miyazono, 2001).

Os três TGF-betas isotípicos são extremamente bem conservados nas espécies com uma identidade superior a 99% entre as sequências TGF-betal maturas de várias espécies mamíferas (Derynck, 1986; 1987). Os TGF-betas têm papéis importantes na diferenciação e no crescimento de células, desenvolvimento de órgãos, formação de matrizes, reparação de feridas e função imunitária (Blobe, 2000; Chen, 2001; Letterio, 2000) . O TGF-beta regula os processos celulares através da ligação a três recetores de superfície celular de alta afinidade conhecidos como tipos I, II e III. Os recetores de tipo III são o tipo de recetor mais abundante. O TFG-beta é ligado e transferido para os respetivos recetores de ligação, os recetores de tipo I (RI) e II (RII). Durante a ligação de um ligando a um recetor de tipo II, o recetor quinases de tipo II fosforila resíduos de serina e treonina no domínio GS (rico em glicina e serina) intracelular dos recetores de tipo I, originando a ativação do recetor de tipo I. Em seguida, o RI TGF-beta ativado interage com uma molécula adaptadora SARA (Smad anchor for receptor activation - âncora Smad para ativação de recetores) (Tsukazaki, 1998), o que facilita o acesso de determinados membros da família Smad de proteínas, denominados Smads regulados por recetor (R-Smads), aos recetores TGF-beta ativados. Em seguida, o recetor quinases de tipo I ativado fosforila R-Smads de forma diferente em dois resíduos de serina no respetivo C-terminal extremo (resumido em Itoh, 2000). Os R-Smads incluem proteínas Smadl, -2, -5 e -8. Os Smad2 e -3 mediam a sinalização de TGF-beta e ativinas; e o Smad8 media a sinalização do recetor quinases ALK-2 (Baker, 1996; Lagna, 1996; Liu, 1996; Zhang, 1996, 1997).

Os Smads inibitórios (Ι-Smads) consistem em Smad6 e 3

Smad7 vertebrados e Dad (Drosophila daughters against dpp). Ao contrário dos R-Smads, gue aumentam a sinalização de moléculas TGF-beta, os I-Smads inibem a sinalização da superfamilia TGF-beta. Enguanto o Smad6 parece inibir preferencialmente a sinalização de BMP, o Smad7 funciona como um inibidor geral de sinalização da família TGF-beta (Itoh, 1998; Souchelnytskyi, 1998; Ishisaki, 1999). Os I-Smads podem ligar-se de forma estável ao domínio intracelular dos recetores de tipo I ativados, inibindo assim ainda mais a transdução de sinal mediante a prevenção da fosforilação de R-Smads através do recetor (Imamura, 1997; Inoue, 1998; Souchelnytskyi, 1998). A expressão de I-Smads parece fazer parte de uma estrutura de realimentação positiva. A expressão de Smad6 e -7 pode ser induzida rapidamente e, em alguns casos, diretamente através de BMP, ativina e/ou TGF-beta em células cultivadas. Além disso, Smad3 e -4 podem ligar-se diretamente ao promotor de Smad7 para mediar a ativação deste promotor através de ativina ou TGF-beta. (Nagarajan, 1999; von Gersdorff, 2000). Além da estimulação através da via TGF-beta-Smad, a expressão de Smad7 também pode ser induzida por intermédio de IFN-gama através da via Jak/Stat (Ulloa, 1999), por intermédio de TNF-alfa através da ativação de NF-kappaB (Bitzer, 2000) e por intermédio de norepinefrina igualmente através de NF-kappaB (Kanamaru, 2001) .

Além da função de Smad7 como inibidor da fosforilação de R-Smads através de recetores de tipo I no limite da membrana celular/citoplasma, também foi detetado que o Smad7 ocorre abundantemente nos núcleos de determinadas células e é exportado a partir do núcleo durante a estimulação de TGF-beta ou uma alteração no substrato celular (Itoh, 1998; Zhu, 1999). Pulaski (2001) mostrou que a mutação num local de fosforilação maior de Smad7 em Ser-249 não afetou o efeito inibitório de Smad7 na sinalização 4 ΒΜΡ7 ou TGF-beta e não interferiu com a localização nuclear de Smad7. Em vez disso, a fosforilação de Smad7 em Ser-249 mostrou ser importante para a respetiva capacidade independente do ligando de regular a transcrição.

Os ratinhos que sobre-expressam Smad7 apresentam respostas de células T defeituosas a TGF-betal, mostram uma produção de citocinas nitidamente superior in vitro, e mostram um aumento na inflamação das vias aéreas induzida por antigénio (Nakao, 2000). O Smad7 mostrou ser sobre-expresso na mucosa em doença inflamatória do intestino (DII) e em células T purificadas da mucosa. Num sistema in vitro, os oligonucleótidos antisense específicos para Smad7 reduziram a expressão de proteínas Smad7 nas células isoladas de pacientes com DII, permitindo que as células respondessem ao TGF-beta exógeno (Monteleone, 2001). O documento WO 97/30065 identifica ADNc (fchd540) que codifica Smad7 e descreve o aumento de Smad7 nos estados da doença cardiovascular. As doenças visadas pelos métodos descritos no documento WO 97/30065 referem-se a distúrbios cardiovasculares, em particular arteriosclerose, isquemia/reperfusão, hipertensão, reestenose e inflamação arterial, bem como distúrbios oncogénicos fibroproliferativos, incluindo retinopatia diabética, cancro, tumorigénese, vascularização de tumores, angiogénese, arteriosclerose, inflamação e fibrose. O documento WO 98/53068 descreve igualmente moléculas de ácido nucleico que codificam Smad7 e fornece métodos para diminuir ou aumentar a transdução de sinal da superfamília TGF-beta nas células mamíferas com base nos genes Smad7-alvo, produtos de gene ou parceiros de interação. Além disso, são descritos métodos de tratamento de um sujeito que sofre de cancro do pulmão caracterizado por uma expressão elevada de um gene Smad6 ou um gene Smad7. Estes métodos envolvem a administração no sujeito de uma quantidade de um ácido nucleico antisense que liga ao 5 produto de expressão do gene Smad6 ou Smad7 eficaz para reduzir a expressão do gene.

Além disso, são divulgados métodos médicos para reduzir os defeitos oculares num embrião mamífero em desenvolvimento. Estes métodos incluem a colocação das células do embrião em contacto com um agente que reduz a expressão ou atividade de uma molécula de ácido nucleico Smad7 ou um produto de expressão da mesma. 0 documento WO 01/53313 descreve compostos antisense e composições e fornece métodos para modular a expressão de Smad7. A invenção descreve um método de tratamento de um ser humano com uma doença ou condição associada a Smad7 que compreende a administração ao referido animal de uma quantidade terapêutica ou profilaticamente eficaz do composto antisense, de modo a que a expressão de Smad7 seja inibida. Nas seguintes "sub-reivindicações", a referida doença ou condição é um distúrbio do desenvolvimento, um distúrbio cardiovascular, um distúrbio hiperproliferativo ou um distúrbio de cicatrização de feridas. O documento WO 01/21794 descreve polipéptidos de associação a Smad identificados através de rastreio de dois híbridos em levedura. É referido que esta invenção fornece ainda métodos para reduzir ou aumentar a transdução de sinal da família TGF-beta numa célula. É mencionado que, in vivo, esses métodos são úteis para modular o crescimento, por ex. para tratar o cancro e a fibrose. Além disso, é indicado que esses métodos também são úteis no tratamento de condições que resultam da transdução de sinal TGF excessivo ou deficiente. No documento WO 00/77168, são divulgados os antagonistas das vias de sinalização BMP e TGF-β, em que estes antagonistas se referem a Smurfl e Smurf2, capazes de interagir com Smadl, 5 e 7. Smurfl e Smurf2 são ubiquitina ligases E3 do tipo HECT, que contêm o domínio N-terminal C2, seguido de domínios WW e do domínio C-terminal HECT. O domínio HECT é responsável pelas 6 atividades da ligase E3 de Smurfs. A interação de Smurfs com I-Smads conduz à exportação nuclear dos segundos. No citoplasma, o dominio C2 pode orientar I-Smads para a membrana celular e facilitar a interação de I-Smads com recetores TGF-beta. Os Smurfs não só reconhecem I-Smads como substratos, como também capturam recetores TGF-beta como os respetivos alvos, originando assim a degradação de ambos os I-Smads e dos complexos recetores (Ebisawa, 2001, Kavsak, 2000, Suzuki, 2002). O documento WO 00/77168 descreve uma proteina Smurf2 que induz a degradação dos recetores TGF-beta e Smad7. De acordo com a referida aplicação, o Smurf2 interage diretamente com Smad7 através de um motivo PPXY no Smad7. O Smurf2 está envolvido com a degradação do recetor TGF-beta que funciona em parceria com o Smad7 como um antagonista ou regulador negativo da sinalização TGF-beta. A ativação da sinalização TGF-beta resulta no recrutamento dependente de Smad7 de Smurf2 para o complexo recetor TGF-beta. Na ausência do complexo recetor TGF-beta ativado, o Smurf2 não altera o nível de estado estável nem a mobilidade de Smad7. O recrutamento de Smurf2 para o recetor TGF-beta através de Smad7 provoca a degradação do complexo recetor Smad7-TGF-beta por intermédio de ambas as vias proteassoma e lisossoma. É indicado que a sobre-expressão de Smurfs através de terapia de genes pode ser utilizada para corrigir condições clínicas que resultam de sinalização Smad excessiva.

Outras proteínas que interferem com Smad7 compreendem YAP65 e TIEG. A proteína YAP65 (Yes-Associated Protein) é uma fosfoproteína rica em prolina identificada originalmente como uma proteína que liga ao domínio SH3 do produto de proto-oncogene Yes (Sudol, 1994). Ferrigno et ai. identificaram YAP65 como uma nova proteína de interação com Smad7 através de rastreio de dois híbridos em levedura (Ferrigno, 2002). Foi mostrado nas células COS-7 que YAP65 7 potência a atividade inibidora de Smad7 contra a transativação de genes dependente de Smad3/4 e induzida por TGF-beta. Além disso, YAP65 mostrou aumentar a associação de Smad7 a moléculas de recetor tipo 1 TGF-beta ativado. 0 gene prematuro induzido por TGF-beta (TIEG) é um fator de transcrição de tipo Kruppel (KLF) de dedo de zinco e é induzido por TGF-beta em muitos tipos de célula (Subramaniam, 1995, Subramaniam, 1998). A sobre-expressão de TIEG imita os efeitos de TGF-beta em muitos tipos de célula (Chalaux, 1999, Hefferan, 2000, Ribeiro, 1999, Tachibana, 1997) . O TIEG mostrou modular a via de sinalização TGF-beta/Smad através da ligação ao promotor Smad7 e reprimindo assim a transcrição de Smad7. Além disso, o TIEG aumenta a transcrição do gene Smad2. Uma ubiquitina ligase E3, homólogo 1 Seven in Absentia (SIAH1), funciona como uma proteína de interação com TIEG1 e induz a degradação de TIEG1, limitando assim a duração e/ou magnitude das respostas TGF-beta (Johnsen, 2002a, Johnsen, 2002b, Johnsen, 2002c). O documento WO 98/45467 descreve outros genes da via TGF-β e o documento WO 01/16604 descreve um método de rastreio para agentes que são capazes de modular a sinalização de células TGF-β.

Relevantes para a doença autoimune no sistema nervoso central (SNC), tal como a esclerose múltipla (EM), os efeitos imunossupressores de TGF-beta foram extensivamente investigados in vitro utilizando células T autoimunes específicas da mielina e, in vivo, tirando partido da encefalomielite autoimune experimental (EAE), que é o primeiro modelo para a doença humana EM.

A EAE pode ser induzida em estirpes de animais suscetíveis (por ex. roedores e primatas) quer através de imunização (= EAE ativa) com um antigénio da mielina no adjuvante de Freund completo ou incompleto (CFA) quer através de transferência sistémica adotiva de células T autorreativas obtidas a partir de animais previamente imunizados e ativados in vitro com o autoantigénio respetivo (EAE-ta) (Brocke, 1996; Zamvil, 1990). A produção de TGF-beta endógena foi mostrada pela maioria dos autores como sendo aumentada no SNC e desempenha presumivelmente um papel de redução da modulação durante a fase de recuperação da EAE aguda (Khoury, 1992; Racke, 1992; Issazadeh, 1995; Issazadeh, 1998). Não foi detetado nenhum aumento de TGF-beta por Okuda (1995). Contudo, em trabalhos posteriores, foi detetada uma redução da expressão de TGF-beta na fase pré-clinica e aguda nas células de gânglios linfáticos de ratinhos imunizados com antigénio da mielina no CFA (Adjuvante de Freund Completo) em comparação com os ratinhos de controlo tratados apenas com CFA (Okuda, 1998). A imunização de ratos DA (ratos Dark Agouti) com medula espinal de rato em adjuvante de Freund incompleto origina um curso recorrente e crónico prolongado de EAE que inclui uma desmielinização extensa. Embora a expressão de TGF-beta tenha sido descrita como sendo aumentada no SNC de ratos Lewis durante a fase de remissão da EAE (monofásica), não foi detetada nenhuma expressão significativa de citocinas reguladoras, tal como TGF-beta (e IL-4 e IL-10), nos tecidos linfoides ou no SNC do rato DA em vários momentos (Issazadeh, 1996) . A análise de citocinas demonstrou que a expressão de ARNm de IL-10 e TGF-betal foi geralmente baixa na EAE aguda e no primeiro ataque de EAE crónica e aumentou em estádios posteriores da EAE crónica. Foi sugerido que as citocinas anti-inflamatórias desempenhem apenas um pequeno papel na recaída (Tanuma, 2000). A recuperação da doença em ratinhos transgénicos para um recetor de células T específicas de MBP induzido para desenvolver EAE foi associada a um desvio imune de células T Thl relativamente a células que segregaram IL-4, IL-10 e TGF-beta na periferia e no SNC [Chen, 1998]. Kiefer et al. 9 realizaram um estudo sistemático da expressão de TGF-beta (Kiefer, 1998). Na EAE monofásica ativamente induzida no rato Lewis, a hibridização in situ revelou uma forte expressão de TGF-betal nos infiltrados mononucleares meningeos e perivasculares no inicio da doença, uma expressão continuada nos infiltrados perivasculares e nas células mononucleares disseminadas na gravidade máxima da doença, e uma expressão nas células parenquimatosas disseminadas durante a recuperação. A expressão celular de TGF-betal através de células T, macrófagos e micróglias resumiu uma elevação de longa duração de ARNm TGF-betal que se estende satisfatoriamente para a fase de recuperação. Embora se pensasse que o TGF-betal expressado antecipadamente na doença através de células T contribuía para o desenvolvimento da lesão inflamatória, foi sugerido que a respetiva expressão através de células microgliais contribuísse potencialmente para a recuperação (Kiefer, 1998) . 0 TGF-betal recombinante humano administrado em 2 pg diariamente i.p durante duas semanas após a última de diversas imunizações de ratinhos SJL com substância homogeneizada de medula espinal no CFA adiou, mas não preveniu nem melhorou significativamente a gravidade do primeiro episódio da doença neste modelo de EAE. 0 tratamento após o primeiro ataque durante um protocolo de imunização de repetição reduziu a gravidade dos segundos episódios induzidos por imunização de reforço. As injeções de TGF-betal iniciadas após o início de um episódio agudo de EAE não influenciaram visivelmente o curso desse episódio (Kuruvilla, 1991). Contudo, no mesmo modelo, as recaídas espontâneas foram bloqueadas de modo muito eficaz através do tratamento diário iniciado 35 dias após o início do primeiro ataque e mantido durante 4 semanas (Kuruvilla, 1991). Através da utilização de TGF-betal purificado de plaquetas humanas foi subsequentemente mostrado que 1 pg de 10 TGF-betal administrado i.v. nos dias 1 a 5 após a transferência de células de gânglios linfáticos encefalitogénicas nos ratinhos SJL preveniu parcialmente a EAE e melhorou significativamente os resultados da doença, sobretudo durante o primeiro e segundo ataques da doença (Racke, 1991). A histologia dos ratinhos tratados com TGF-betal sacrificados no dia 7 pós-transferência revelou uma inflamação nitidamente reduzida e uma ausência de desmielinização em comparação com os ratinhos tratados com placebo. Quando o tratamento com TGF-betal foi iniciado nos primeiros sinais da doença clinica e continuado durante 5 dias, a gravidade das recaídas subsequentes foi reduzida (Racke, 1991; Johns 1991). O tratamento com TGF-beta 2 recombinante simiano resultou numa inibição semelhante da proliferação e ativação de células T in vitro.

Os estudos recentes mostraram que a transferência adotiva de clones Thl específicos de MBP ativados transformados em TGF-betal latente segregado adiou e melhorou os sinais de EAE nos ratinhos imunizados com PLP (Chen, 1998). Esta estratégia permitiu a ministração num local específico de TGF-betal ativo terapêutico nos infiltrados inflamatórios do SNC, era específica do antigénio, mas permitiu manifestamente a imunossupressão bystander através de células T ativadas in situ (Chen, 1998; Thorbecke, 2000). A EAE foi igualmente inibida com êxito através de uma única injeção de um complexo de lipossomas catiónicos-citocina de ADN (IL-4, IFN-beta ou TGF-beta) diretamente no sistema nervoso central (Croxford, 1998). Noutro estudo, foi obtida uma ministração de TGF-beta contínua prolongada através da injeção de um vetor de expressão de ADN de plasmídeo nu que codifica o TGF-betal de forma intramuscular. Isto resultou na produção de TGF-betal e na proteção contra sinais clínicos e histopatológicos de EAE induzida por MBP (Piccirillo e Prud'homme, 1999). Pequenas doses de TGF- 11 betai administradas via nasal inibiram o desenvolvimento e as recaídas de EAE recorrente crónica nos ratos DA. 0 tratamento anticorpo anti-TGF-betal in vivo agravou a gravidade de EAE (Miller, 1992; Racke, 1992; Santambrogio, 1993; Johns, 1993; Santambrogio, 1998). A expressão de ARNm de TGF-beta 1 e 2 no tecido do SNC de casos de EM, demonstrada através de hibridização in situ, foi detetada sobretudo nas células perivasculares em vez de nas células parenquimatosas, sugerindo as células inflamatórias em circulação como a fonte principal (Woodroofe, 1993). Resumindo, foi detetada uma expressão mais forte e uma distribuição celular localizada de forma diferente na EM (lesões crónicas ativas e inativas e desmielinizantes ativas) em comparação com o tecido de controlo.

Num bioensaio a partir de culturas de sangue periférico, foi detetado que a atividade tipo TGF-beta aumentou nos pacientes com doença ativa em comparação com os pacientes com doença inativa e dadores saudáveis, e tal foi detetado em particular no subgrupo testado durante a regressão dos sintomas (Beck, 1991). A menor produção de TGF-beta através de linfócitos dos pacientes com EM foi correlacionada diretamente com a atividade da doença. Os pacientes com EM com doença ativa produziram menos TGF-beta do que os pacientes com EM com doença estável. As células que produzem TGF-beta eram essencialmente células T CD8+ e células T CD45RA (Mokhtarian, 1994).

Através da utilização de uma PCR semiquantitativa, foi detetado que a expressão de TGF-beta e IL-10 diminuiu antes de uma recaída, enquanto a expressão de TNF-alfa e linfotoxinas aumentou (Rieckmann, 1995) .

Num ensaio aberto de fase 1 de 11 pacientes com EM progressiva secundária (PS), foi estimada a segurança de TGF-beta2 recombinante ativo (Calabresi, 1998). É cada vez mais claro que as propriedades anti- 12 inflamatórias potentes de TGF-beta como um regulador negativo da resposta imunitária das células T desempenham um papel fundamental na patofisiologia da isguemia cerebral e noutras patologias do SNC (Benveniste, 1998, Kulkarni, 1993). A maior expressão de TGF-beta foi demonstrada no tecido cerebral post mortem de vitimas humanas de acidentes vasculares cerebrais (Krupinski, 1996), e em biopsias cerebrais de pacientes gue sofrem de vários distúrbios neurodegenerativos agudos ou crónicos, incluindo acidente vascular cerebral, doença de Parkinson ou doença de Alzheimer (Mattson, 1997, Pratt, 1997). Por conseguinte, esta citocina é considerada um péptido relacionado com lesão e um alvo potencial para intervenção terapêutica (Krieglstein, 1998).

Os dados in vitro representam um papel neuroprotetor da via TGF-beta com particular referência à morte neuronal induzida por NMDA nos paradigmas excitotóxicos, tal como hipoxia-isquemia (Buisson, 1998, Choi, 1996, Prehn, 1993). Pelo contrário, as descobertas efetuadas a partir dos estudos in vivo descrevem consistentemente a indução da expressão de ARNm TGF-betal num espaço de horas após a isquemia cerebral focal e o aumento que se mantém durante várias semanas após o traumatismo (Lehrmann, 1998, Ruocco, 1999, Wang, 1995) . Os dados mais detalhados de Ali et al. (Ali, 2001) localizaram a expressão significativamente melhorada de TGF-betal para a penumbra isquémica, ou seja, para a zona metabólica de transição entre o núcleo isquémico e a zona peri-enfarte. Uma vez que o bloqueio da atividade biológica de TGF-beta através de um antagonista especifico aumentou as lesões excitotóxicas e isquémicas, os dados derivados de modelos de acidente vascular cerebral em roedores sugerem que a ativação da via de sinalização TGF-beta pode ser associada à neuroproteção (Ali, 2001, Ruocco, 1999) .

Os dados in vivo de um modelo de acidente vascular cerebral 13 em ratos, que identificam a fonte celular da produção de TGF-betal após a isquemia cerebral focal, demonstraram a indução antecipada bem como o aumento a longo prazo da expressão de ARNm TGF-betal limitada aos macrófagos e às micróglias ativadas. Por conseguinte, as funções mediadas por TGF-betal representam uma resposta imediata e persistente na lesão cerebral isquémica aguda e estão envolvidas na fase de remodelação do tecido após o acidente vascular cerebral (Lehrmann, 1998) . Mais detalhadamente, foi detetada uma expressão de duas fases de TGF-betal com um primeiro pico às 12 horas e aos 7 dias após a oclusão permanente da ACM no tecido enfartado, o último mais provavelmente ligado à redução da resposta inflamatória do tecido, à indução da neoangiogénese e à formação de cicatrizes gliais (Logan, 1994, Yamashita, 1999). 0 aumento da expressão de genes TGF-betal estende-se entre 3 horas e 4 dias após a isquemia do cérebro anterior transitória (Zhu, 2000), até 15 dias após a oclusão permanente da ACM (Wang, 1995), e entre 6 horas e 21 dias após a isquemia cerebral global (Lehrmann, 1995), respetivamente.

Os dados dos estudos in vivo relacionados com a aplicação intra-arterial ou intracerebroventricular de TGF-betal mostraram o tratamento antes (Gross, 1993) e após a indução da patologia (Gross, 1994, McNeill, 1994) associado a uma redução significativa da perda neuronal e do tamanho do enfarte num modelo de coelho de acidente vascular cerebral tromboembólico ou num modelo de rato de lesão cerebral hipóxica-isquémica grave, respetivamente. Na isquemia global transitória em ratos, Henrich-Noack et ai. conseguiram mostrar uma proteção significativa das células CAI piramidais através da injeção intra-hipocampal de TGF-betal antes da isquemia (Henrich-Noack, 1996). Nos ratinhos que sobre-expressam TGF-betal após a transferência de genes adenoviral, Pang et al. (2001) demonstraram uma redução do volume do enfarte, associada a uma inibição da resposta 14 inflamatória à oclusão da ACM em termos de infiltração de leucócitos e monócitos/macrófados reduzida no tecido cerebral isquémico (Pang, 2001).

Foram igualmente detetados niveis altamente elevados de ARNm TGF-betal para a penumbra isquémica nas amostras de cérebro de vitimas humanas de acidentes vasculares cerebrais (Krupinski, 1996). Além disso, a expressão melhorada de diversas isoformas de TGF-beta e da proteína do recetor de tipo I em processos reativos em torno das lesões cerebrais isquémicas foi demonstrada na autópsia humana e no material da biópsia (Ata, 1997). Embora os níveis de soro de TGF-betal não fossem significativamente diferentes em pacientes com acidentes vasculares cerebrais e voluntários saudáveis, foi detetada uma correlação próxima entre os níveis de TGF-betal e os parâmetros clínicos e neurorradiológicos da lesão cerebral (Kim, 1996, Slevin, 2000, Stanzani, 2001). A lesão cerebral traumática (LCT) experimental resulta numa necrose rápida e significativa do tecido cortical no local da lesão. Nas horas e nos dias seguintes, a lesão secundária agrava a lesão primária que resulta na destruição significativa do tecido e na disfunção neurológica (Faden, 1993). As alterações nos aminoácidos excitantes, um maior stress oxidativo e uma maior apoptose contribuem para a morte neuronal progressiva a seguir à LCT (resumido em (Sullivan, 2002) e referências relacionadas). Rimaniol et al. descreveram uma produção de duas fases de TGF-beta a seguir ao traumatismo cerebral, com um primeiro pico após 30 min. e um segundo pico 48 h após a lesão (Rimaniol, 1995) . Lindholm et al. mostraram uma maior produção de ARNm TGF-betal no córtex cerebral do rato após uma lesão cerebral penetrante (Lindholm, 1992) . Neste documento demonstraram que o TGF-betal expressado no cérebro lesionado pode desempenhar um papel na regeneração do nervo através da estimulação da produção do fator de 15 crescimento do nervo (NGF) e do controlo da extensão da proliferação dos astrócitos e da formação de cicatrizes. Logan et al. mostraram um aumento difuso de proteínas e ARNm TGF-betal em torno da ferida cerebral causada por estocada em 1, 2 e 3 dias; e 7 e 14 dias após a lesão, a distribuição estava mais localizada na região da cicatriz glial (Logan, 1992). Foi sugerida a utilização de antagonistas TGF-betal para limitar a patogénese associada ao depósito de matriz na ferida do SNC. Kriegelstein et al. mostraram que a sobrevivência que provoca o efeito do fator neurotrófico derivado de linhas celulares gliais (GDNF) in vivo e in vitro necessita da presença de TGF-beta (Krieglstein, 1998). Num estudo muito recente, Peterziel et al. demonstraram que a recetividade GDNF induzida por TGF-beta nos neurónios é causada pelo recrutamento induzido por TGF-beta do recetor GDNF de âncora glicosil-fosfatidil-inositol (GFR)alfal para a membrana de plasma (Peterziel, 2002) . O TGF-beta está presente nas placas senis de amiloide que se encontram no SNC e é sobre-expressado no cérebro com doença de Alzheimer em comparação com os controlos (Finch, J. Cell Biochem 53 (1993), 314-322). O TGF-beta foi implicado na patogénese da doença de Alzheimer's (Wyss-Coray, Nature 389 (1997), 603-606; Flanders, Neurology 45(8) (1995), 1561-1569; van der Wal, Neuroreport 4 (1993), 69-72) pelas seguintes razões: acelera o depósito de amiloide num modelo animal da doença de Alzheimer; ou seja, ratinhos transgénicos que co-expressam o TGF-betal humano e a proteína precursora amiloide (PPA) mutante (Finch, (1993) loc. cit.; Wyss-Coray, (1997), loc. cit.; Wyss-Coray, Ann. N.Y. Acad. Sei. 903 (2000), 317-323). O TGF-beta aciona a sobre-expressão astrocítica de codificação de ARNm para a PPA. Num nível molecular, a ativação de TGF-beta de complexos de proteínas Smad provoca a transcrição do gene PPA (Burton, Biochem. Biophys. Res. Commun. 295 (2002), 16 702-712; Burton, Biochem. Biophys. Res. Commun. 295 (2002); 713-723). Contudo, foi mostrado em contraste por Wyss-Coray et al. (2001) que um simples aumento na produção de TGF-betal astroglial nos ratinhos transgénicos velhos que expressam o beta-PPA humano reduz significativamente o número de placas parenquimatosas de amiloide e toda a carga de beta-amiloide cortical e diminui o número de neurite distrófica (Wyss-Coray, Nat. Med. 7(5) (2001), 612-618). Nos ratinhos que expressam PPA/TGF-betal humano, o beta-amiloide acumulou-se substancialmente nos vasos sanguíneos cerebrais, mas não nas placas parenquimatosas (Wyss-Coray, (2001) loc. cit.). Nos casos humanos de Alzheimer, a imunorreatividade de beta-amiloide associada às placas foi inversamente correlacionada com níveis vasculares de beta-amiloide e corticais de ARNm TGF-betal. A redução de placas parenquimatosas nos ratinhos PPA/TGF-betal humano estava associada a uma forte ativação de micróglias e a um aumento nos mediadores inflamatórios. O TGF-betal recombinante estimulou a remoção de beta-amiloide nas culturas de células microgliais (Wyss-Coray, (2001), loc. cit.).

Contudo, o estudo sobre o TGF-beta revelou efeitos ambíguos ou prejudiciais do TGF-beta e, por último, mas não menos importante, da perspetiva da terapia autoimune, o TGF-beta é considerado na técnica como uma "faca de dois gumes". Kiefer (1998), através da análise da expressão de TGF-beta na EAE monofásica do rato Lewis, revelou indícios de expressão antecipada nas células T, o que contribui possivelmente para o desenvolvimento da lesão inflamatória, enquanto foi sugerido que a expressão que ocorre posteriormente nas micróglias desempenhe um papel de redução da modulação. Quando os clones e as linhas celulares T murinas específicas de Ag foram cultivados na presença de TGF-beta, a função efetora destas células autorreativas e a formação de lesões desmielinizantes durante a transferência adotiva na encefalomielite 17 autoimune experimental foram nitidamente melhoradas (Weinberg 1992). Noutro modelo de EAE, foi mostrado que os efeitos de TGF-beta na expressão de doenças autoimunes variam consoante o tempo do tratamento relativamente à indução da doença. As injeções i.p. diárias de 0,2 a 2 pg de TGF-beta 1 ou TGF-beta 2 nos dias 5 a 9 após a imunização foram altamente protetoras, contrariamente às injeções nos dias 1 a 5 ou 9 a 13. O tratamento com TGF-beta nos dias 5 a 9 impediu a acumulação de células T no cérebro e na medula espinal, conforme ensaiado nos dias 15 a 20. O anti-TGF-beta acelerou e agravou a EAE quando administrado nos dias 5 e 9, mas não no dia 12. Foi concluído que o efeito protetor de TGF-beta é exercido ao nível do órgão-alvo, SNC e/ou respetivo endotélio vascular e que existiu uma pequena abertura de 4 dias na qual o TGF-beta exerceu o respetivo efeito protetor (Santambrogio, 1993) .

Foi observada uma

Foi detetado que os ratinhos orientados geneticamente para sobre-expressar o TGF-betal bioativo especificamente nos astrócitos mostravam um fenótipo com uma patologia do SNC grave em níveis elevados de expressão. Embora os ratinhos transgénicos heterozigóticos não manipulados de uma linha de expressão baixa não tenham mostrado essas alterações, o aumento da expressão de TGF-beta 1 nesta linha através de ativação astroglial induzida por lesão ou geração de linhagem homozigótica resultou no fenótipo anormal (Wyss-Coray, 95). A sobre-expressão astroglial de TGF-beta 1 não foi associada à infiltração do SNC óbvia através de células hematógenas (Wyss-Coray, 1995). Contudo, estes ratinhos eram mais suscetíveis à indução de EAE com uma inflamação do SNC mais prematura e mais grave. Deste modo, a expressão local de TGF-beta 1 no parênquima do SNC pode melhorar a infiltração de células imunes e intensificar a disfunção do SNC que resulta das respostas autoimunes acionadas perifericamente (Wyss-Coray 1997). 18 patologia tipo doença de Alzheimer com astrocitose perivascular e depósito de amiloide nos vasos sanguíneos cerebrais nos ratinhos mais velhos que expressam níveis baixos de TGF-beta ativo transgénico (Wyss-Coray, 2000). Várias estratégias que foram bem-sucedidas na modulação de EAE e que sugeriram o TGF-beta como parte do efeito protetor provaram não ser eficazes ou mostraram uma toxicidade considerável nos ensaios clínicos. Num ensaio aberto de fase 1 de 11 pacientes com EM progressiva secundária (PS), foi estimada a segurança de TGF-beta2 recombinante ativo (Calabresi, 1998). Os grupos de pacientes foram tratados num esquema de aumento de dose com 0,2 pg/kg, 0,6 pg/kg ou 2,0 pg/kg. O tratamento foi administrado i.v. três vezes por semana durante quatro semanas, exceto se interrompido mais cedo. Desenvolveu-se um decréscimo reversível na taxa de filtração glomerular em cinco pacientes (três com 0,6 pg/kg, dois com 2,0 pg/kg), anemia suave transitória a moderada em sete, hipertensão em dois e uma maculopatia num paciente. É provável que a nefrotoxicidade e a anemia estivessem relacionadas com o tratamento com TGF-beta. Não foi observado nenhum efeito benéfico nem nenhum efeito nos parâmetros clínicos ou de imagiologia (Calabresi, 1998).

Estas indicações de efeitos secundários sistémicos diminuem consideravelmente o interesse no TGF-beta como uma ferramenta terapêutica para EM (Calabresi 1998; Wiendl 2000). Além disso, num ensaio clínico de fase III de indução de tolerância oral de mielina em EMRR, nem os parâmetros de resultados clínicos nem de IRM foram significativamente diferentes entre os pacientes tratados com mielina e placebo (Panitch 97, Francis 97).

Contudo, também foi mostrado que é consideravelmente mais difícil tratar a EAE existente através de indução de tolerância das mucosas (descrição em Xu 2000) ou do próprio TGF-beta (descrição em Thorbecke 2000) do que prevenir a 19 doença .

Embora o TGF-beta seja uma das substâncias inibitórias do crescimento mais potentes para a maioria dos tipos de célula, estimula a proliferação de fibroblastos e osteoblastos. É igualmente um potente estimulador de produção de matriz extracelular através de fibroblastos e osteoblastos (Massague, 1987; Sporn, 1987), inibe a degradação da matriz e aumenta os recetores para a interação da matriz. 0 TGF-betal foi implicado como um fator causal essencial na patogénese da fibrose do fígado (Border, 1994; Friedman, 1993) e, pelo menos, como um mediador crucial dos efeitos benéficos e prejudiciais da ciclosporina A no sistema imunitário e no rim (revisto em (Khanna, 1999)). Além disso, vários distúrbios fibróticos, progressivos e crónicos do rim nos seres humanos e modelos experimentais - sejam eles glomerulares ou tubulointersticiais - mostraram estar associados à estimulação do sistema TGF-beta (Bitzer, 1998). A administração de um anticorpo anti-TGF-beta neutralizante resultou na prevenção da falha renal, expressão de genes de excesso de matriz e expansão de matriz mesangial glomerular em ratinhos diabéticos db/db (Ziyadeh, 2000). O aumento de TGF-beta crónico desempenha um papel central na acumulação de matriz progressiva e na insuficiência renal observada na neuropatia diabética (revisto em Sharma e McGowan, 2000). A patologia da administração multidose sistémica de TGF-betal recombinante humano em ratos e coelhos foi descrita por Terrell (1993): foi efetuado um estudo-piloto de 14 dias em ratos utilizando rhTGF-betal produzido em células A293 humanas. Após a administração de 1000 yg/kg i.v., morreram dois ratos ao fim de 5 dias. Os restantes ratos foram sacrificados nesse momento. Os grupos de dose média e dose baixa receberam 100 yg/kg e 10 yg/kg i.v. diariamente durante 14 dias, respetivamente. Os eventos adversos foram 20 mais surpreendentes no grupo de dose elevada, mas foram observadas alterações qualitativamente semelhantes ao nível da dose média, embora menos graves e adiadas no início. Além de determinadas alterações histopatológicas, os ratos apresentaram um peso corporal reduzido (a partir do dia 3) e um maior hematócrito no dia 3 com uma diminuição subsequente. Na descrição das respetivas descobertas, Terrell e associados referiram que a rapidez e gravidade relativas com as quais algumas das alterações observadas -tanto clínicas como histopatológicas, tais como a involução hepática e a enostose - ocorreram nas preparações de dose elevada foram excecionais (Terrell, 1993). A utilização de TGF-beta para imunomodulação nos seres humanos é severamente limitada devido à respetiva toxicidade, incluindo a estimulação excessiva da produção de matriz, nefrotoxicidade e outros efeitos prejudiciais. O TGF-beta tem potencial oncogénico e tem sido implicado em glomerulopatias, fibrose pulmonar, esclerodermia e doença do enxerto contra hospedeiro crónica. Além disso, embora o TGF-beta seja uma citocina imunossupressora extremamente potente, diversas linhas de evidência indicam que a estimulação crónica da expressão de TGF-beta - relacionada com a doença ou em modelos de animais transgénicos - pode conduzir paradoxalmente à inflamação autoimune ou melhorá-la .

Recentemente, foi apresentada uma possível explicação que sugere que o aumento da modulação do Smad7 conduz a uma paralisia da sinalização TGF-beta (Monteleone, 2001) . A análise in vitro realizada por Monteleone 2001 propõe que o bloqueio de Smad7 pode ser benéfico na doença inflamatória intestinal crónica, um distúrbio que não está relacionado nem associado a distúrbios do SNC. Contudo, imunologicamente, a doença inflamatória intestinal crónica (DIIC) difere em muitos aspetos importantes da inflamação autoimune do SNC. Embora o SNC esteja anatomicamente 21 separado e protegido da maioria das células em circulação e dos agentes exógenos pela barreira hematoencefálica gue transmite o chamado "privilégio imunológico" do SNC, o intestino normal contém um grande compartimento linfoide que mantém uma inflamação fisiológica induzida e mantida pela flora entérica e pelos antigénios alimentares. 0 sistema imunitário do intestino funciona constantemente para induzir a tolerância do indivíduo contra os alimentos ingeridos e a flora entérica normal. Esta função é mediada pelo tipo especial de reações imunitárias induzidas no intestino, está relacionada com o aumento acentuado de TGF-beta após um estímulo oral específico do antigénio (Gonnella 1998) e representa os antecedentes imunológicos da "indução de tolerância oral" contra os antigénios indutores de autoimunidade de outros tecidos (tais como componentes de mielina) (Garside 2001). A inflamação fisiológica do intestino transforma-se numa inflamação destrutiva persistente na doença inflamatória intestinal crónica (Fiocchi 1998). Por conseguinte, embora as doenças inflamatórias intestinais crónicas se desenvolvam na interface regular entre o mundo externo e o sistema imunitário e causem com frequência outras manifestações sistemicamente (tais como distúrbios de coagulação) ou noutros órgãos, tal como doença da pele ou da articulação, a inflamação autoimune e as manifestações de esclerose múltipla estão limitadas a um órgão bastante isolado, o SNC. Além disso, nos ratinhos knockout TGF-betal, foram detetadas lesões inflamatórias em massa em diversos órgãos, incluindo o cólon, mas não foram observadas quaisquer lesões histológicas significativas no cérebro (Kulkarni, 1993) .

Steinbrecher et al., (2001, J. Immunol. Vol. 166, páginas 2041 a 2048) referem-se à dipeptidil peptidase IV (CD26)-alvo para suprimir a encefalomielite autoimune e aumentar a secreção de TGF-B1 in vivo. 22

Por conseguinte, embora o estado da técnica tenha proposto a utilização de TGF-beta ou um aumento das vias de sinalização TGF-beta para o tratamento de infeções, inflamações ou até formação de tumores, um aumento sistémico correspondente de TGF-beta tem efeitos secundários graves conforme aqui descrito acima.

Existe uma necessidade na técnica de desenvolver fármacos eficazes para o tratamento de distúrbios do SNC para a terapia in vivo. A solução para o referido problema técnico é alcançada através das formas de realização caracterizadas nas reivindicações.

Por conseguinte, a presente invenção refere-se a um inibidor especifico de função ou expressão de Smad7 para utilização na prevenção, no melhoramento ou no tratamento de esclerose múltipla ou isquemia cerebral, em que o referido inibidor especifico é selecionado a partir do grupo que consiste em anticorpos intracelulares ou fragmentos de anticorpo, aptâmeros, intrâmeros, ARNi (ARN de cadeia dupla) e moléculas antisense anti-Smad7. A presente invenção refere-se igualmente à utilização de um inibidor especifico de função ou expressão de Smad7 para a preparação de uma composição farmacêutica para prevenção, melhoramento ou tratamento de esclerose múltipla ou isquemia cerebral, em que o referido inibidor especifico é selecionado a partir do grupo que consiste em anticorpos intracelulares ou fragmentos de anticorpo, aptâmeros, intrâmeros, ARNi (ARN de cadeia dupla) e moléculas antisense anti-Smad7. uma

De acordo com a presente invenção, foi surpreendentemente detetado que a neutralização ou antagonização de Smad7 restaura e/ou modifica positivamente as vias de sinalização TGF-beta nas células do sistema nervoso sem os efeitos secundários do tratamento com TGF-beta. Por conseguinte, uma intervenção médica que 23 compreende antagonistas/inibidores Smad7 conforme aqui descrito é terapeuticamente benéfica no tratamento de doenças do sistema nervoso, em particular de distúrbios neurodegenerativos, doenças autoimunes conforme aqui descrito, traumatismos ou acidentes vasculares cerebrais. Surpreendentemente, a intervenção médica e terapêutica conforme aqui descrito não está associada à toxicidade deletéria em vários órgãos que foram documentados no estado da técnica como sendo afetados pelo tratamento sistémico com TGF-beta.

Os exemplos em anexo documentam claramente a supressão sistémica benéfica de Smad7 que conduz a um melhoramento significativo das doenças do SNC, em particular das doenças autoimunes, tal como esclerose múltipla (EM), bem como das condições nas quais uma resposta inflamatória contribui secundariamente para a reparação ou lesão do tecido, tais como traumatismo ou acidente vascular cerebral (isquémico).

Sem quaisquer restrições, parte-se do principio de que as vias como a transdução de sinal TGF-beta (BMP) -Smad, a orientação dos recetores TGF-beta (BMP) para degradação proteolitica através de vias Smurf/ubiquitina ligase, ou a modulação nuclear (ou citoplásmica) de eventos de transcrição são positivamente moduladas através da utilização de inibidores/antagonistas Smad7 conforme aqui descrito.

Os termos "tratamento", "tratar" e afins são aqui utilizados como significando geralmente a obtenção de um efeito farmacológico e/ou fisiológico desejado. 0 efeito pode ser profilático em termos de prevenção completa ou parcial de uma doença ou sintoma da mesma e/ou pode ser terapêutico em termos de cura parcial ou completa de uma doença e/ou efeito adverso atribuído à doença. 0 termo "tratamento" conforme aqui utilizado abrange qualquer tratamento de uma doença num mamífero, particularmente um ser humano, e inclui: (a) a prevenção da doença num sujeito 24 predisposto para a mesma, mas que ainda não lhe foi diagnosticada; (b) a inibição da doença, ou seja, deter o respetivo desenvolvimento; ou (c) o alívio da doença, ou seja, causar a regressão da doença. 0 inibidor/antagonista específico a ser utilizado no contexto da presente invenção pode compreender moléculas Smad7 truncadas e/ou mutantes que interferem com o Smad7 e que, como tal, inibem a função de Smad7.

As moléculas inibitórias para Smad7 podem ser deduzidas através de métodos existentes na técnica. Esses métodos compreendem por exemplo, mas não se limitam a, métodos em que um conjunto de substâncias é testado relativamente à interação com Smad7 ou com fragmentos do mesmo, e em que as substâncias que são verificadas como positivas relativamente à interação num sistema de leitura correspondente são ainda testadas in vivo, in vitro ou in silico relativamente aos respetivos efeitos inibitórios na função ou expressão de Smad7. 0 referido "teste relativamente à interação de Smad7" do método descrito acima pode ser realizado através de ensaios imunológicos, biológicos moleculares e/ou bioquímicos específicos bem conhecidos na técnica e que compreendem, por ex., ensaios homogéneos e heterogéneos conforme aqui descrito abaixo.

Os referidos ensaios de interação que utilizam sistemas de leitura são bem conhecidos na técnica e compreendem, entre outros, rastreios de dois híbridos (conforme descrito, entre outros, nos documentos EP-0 963 376, WO 98/25947, WO 00/02911), colunas GST-pull-down, ensaios de coprecipitação de extratos de células conforme descrito, entre outros, em Kasus-Jacobi, Oncogene 19 (2000), 2052-2059, sistemas "interaction-trap" (conforme descrito, entre outros, no documento US 6.004.746), clonagem de expressões (por ex., lamda gtll), tecnologia de Phage Display (conforme descrito, entre outros, no 25 documento US 5.541.109), ensaios de ligação in vitro e afins. Outros métodos de ensaio de interação e sistemas de leitura correspondentes são, entre outros, descritos nos documentos US 5.525.490, WO 99/51741, WO 00/17221, WO 00/14271, WO 00/05410, ou ensaios de quatro híbridos em levedura conforme descrito em Sandrok & Egly, JBC 276 (2001), 35328-35333.

Os referidos ensaios de interação para Smad7 compreendem igualmente ensaios para ensaios FRET, TR-FRETs (em "A homogenius time resolved fluorescence method for drug discovery", em: High throughput screening: the discovery of bioactive substances. Kolb, (1997) J.Devlin. NY, Mareei Dekker 345-360) ou ensaios disponíveis comercialmente, tal como "Amplified Luminescent Proximity Homogenous Assay", BioSignal Packard. Além disso, o sistema de dois híbridos em levedura (Y2H) pode ser utilizado para elucidar outros parceiros de interação e associação particulares e específicos de Smad7. Os referidos parceiros de interação/associação são ainda rastreados relativamente aos respetivos efeitos inibitórios.

Igualmente, as moléculas de interação, por exemplo (poli)péptidos, podem ser deduzidas através de técnicas baseadas em células bem conhecidas na técnica. Estes ensaios compreendem, entre outros, a expressão de construções de genes repórteres ou ensaios "knock-in" conforme descrito, por exemplo, para a identificação de fármacos/pequenos compostos que influenciam a expressão (de genes) de Smad7. Os referidos ensaios "knock-in" podem compreender "knock-in" de Smad7 (ou fragmentos do mesmo) nas células de cultura de tecidos, bem como em animais (transgénicos). Os exemplos de "knock-ins" bem-sucedidos são conhecidos na técnica (consulte, entre outros, Tanaka, J. Neurobiol. 41 (1999), 524-539 ou Monroe, Immunity 11 (1999), 201-212). Além disso, podem ser utilizados ensaios bioquímicos que compreendem, sem limitação, a ligação do 26

Smad7 (ou fragmentos do mesmo) a outras moléculas/(poli)péptidos, péptidos ou a ligação do Smad7 (ou fragmentos do mesmo) a si mesmos (dimerizações, oligomerizações, multimerizações) e o ensaio das referidas interações através de, entre outros, o ensaio de proximidade de cintilação (SPA) ou o ensaio de fluorescência com resolução temporal homogéneo (HTRFA). 0 referido "teste de interação" também pode compreender a medição de uma formação complexa. A medição de uma formação complexa é bem conhecida na técnica e compreende, entre outros, ensaios heterogéneos e homogéneos. Os ensaios homogéneos compreendem ensaios em gue os parceiros de ligação permanecem na solução e compreendem ensaios, tais como ensaios de aglutinação. Os ensaios heterogéneos compreendem ensaios, tais como, entre outros, imunonensaios, por exemplo, ELISAs, RIAs, IRMAs, FIAs, CLIAs OU ECLs.

Conforme descrito abaixo, a interação das moléculas inibidoras de ARNm Smad7 e proteína Smad7 ou fragmentos da mesma também podem ser testados através de métodos biológicos moleculares, tais como ensaios de dois, três ou guatro híbridos, ensaios de proteção de ARN, Northern Blot, Western Blot, microarrays, macroarrays e arrays de proteína ou anticorpo, ensaios Dot Blot, hibridização in situ e imunohistoquímica, PCR quantitativa, coprecipitação, Far Western Blot, clonagem de expressão baseada em bacteriófagos, medições de ressonância de plasma de superfície, rastreio de um híbrido em levedura, DNAse I, análise de pegadas, ensaios de ligação de ADN de mudança de mobilidade, cromatografia de filtração em gel, cromatografia de afinidade, imunoprecipitação, eletroforese em gel unidimensional ou bidimensional, tecnologias de aptâmeros, bem como métodos de rastreio e síntese de alta produtividade.

Parte-se do princípio de que os compostos 27 identificados e/ou obtidos de acordo com os métodos descritos acima, em particular inibidores de Smad7 ou fragmentos do mesmo, são bastante benéficos como agentes nas composições farmacêuticas aqui divulgadas e que serão utilizados para fins médicos, em particular, no tratamento dos distúrbios do SNC aqui descritos.

Os compostos que podem funcionar como inibição especifica de Smad7 compreendem igualmente (pequenos) compostos orgânicos, tais como os compostos que podem ser utilizados de acordo com a presente invenção e que incluem, entre outros, péptidos, proteínas, ácidos nucleicos, incluindo bibliotecas de expressão de ADNc, compostos orgânicos pequenos, ligandos, PNAs e afins. Os referidos compostos também podem ser análogos ou derivados funcionais. Os métodos de preparação de análogos e derivados quimicos são bem conhecidos dos peritos na técnica e são descritos, por exemplo, em Beilstein, "Handbook of Organic Chemistry", Edição Springer Nova Iorque, ou em "Organic Synthesis", Wiley, Nova Iorque. Além disso, os referidos derivados e análogos podem ser testados relativamente aos respetivos efeitos, ou seja, os respetivos efeitos inibitórios de Smad7 de acordo com os métodos conhecidos na técnica. Além disso, é possível utilizar peptidomimética e/ou conceção assistida por computador de inibidores apropriados de Smad7. Os sistemas informáticos apropriados para a conceção assistida por computador de, por ex., proteínas e péptidos são descritos no estado da técnica, por exemplo, em Berry, Biochem. Soc. Trans. 22 (1994), 1033-1036; Wodak, Ann. N. Y. Acad. Sei. 501 (1987), 1-13; Pabo, Biochemistry 25 (1986), 5987-5991. Os resultados obtidos a partir da análise informática descrita acima podem ser utilizados em conjunto com o método da invenção, por ex., para otimizar moléculas, substâncias ou compostos conhecidos. Os compostos apropriados também podem ser identificados por intermédio 28 da síntese de bibliotecas combinatórias peptidomiméticas através de modificação química sucessiva e teste dos compostos resultantes, por ex., de acordo com os métodos aqui descritos. Os métodos de geração e utilização de bibliotecas combinatórias peptidomiméticas são descritos no estado da técnica, por exemplo em Ostresh, Methods in Enzymology 267 (1996), 220-234 e Dorner, Bioorg. Med. Chem. 4 (1996), 709-715. Além disso, a estrutura tridimensional e/ou cristalográfica de inibidores de Smad7 pode ser utilizada para a conceção de inibidores (peptidomiméticos) de Smad7 (Rose, Biochemistry 35 (1996), 12933-12944; Rutenber, Bioorg. Med. Chem. 4 (1996), 1545-1558).

Conforme aqui mencionado acima, o inibidor de função ou expressão de Smad7 pode compreender igualmente um aptâmero. No contexto da presente invenção, o termo "aptâmero" compreende ácidos nucleicos, tais como ARN, ssADN (ss = "single stranded" - cadeia única), ARN modificado, PNAs ou ssADN modificado, que ligam uma diversidade de sequências-alvo com uma alta especificidade e afinidade. Os aptâmeros são bem conhecidos na técnica e, entre outros, descritos em Famulok, Curr. Op. Chem. Biol. 2 (1998), 320-327. A preparação de aptâmeros é bem conhecida na técnica e pode envolver, entre outros, a utilização de bibliotecas de ARN combinatórias para identificar locais de ligação (Gold, Ann. Rev. Biochem. 64 (1995), 763-797).

Por conseguinte, os aptâmeros são oligonucleótidos derivados de um processo de evolução in vitro denominado SELEX (evolução sistemática de ligandos por enriquecimento exponencial). São selecionados pools de ARN selecionado aleatoriamente ou sequências de ADN de cadeia única em oposição a determinados alvos. As sequências de ligação mais estreita com os alvos são isoladas e amplificadas. A seleção é repetida utilizando o pool enriquecido derivado da seleção da primeira série. Diversas séries deste processo dão origem a sequências decisivas denominadas 29 "aptâmeros" ou "ligandos". Os aptâmeros desenvolveram-se para ligar proteínas gue estão associadas a vários estados de doença. Mediante a utilização deste método, podem ser encontrados muitos antagonistas potentes dessas proteínas. Para estes antagonistas funcionarem em modelos animais de doença e em seres humanos, normalmente é necessário modificar os aptâmeros. Em primeiro lugar, são necessárias modificações de açúcar dos nucleosídeos trifosfatos para apresentar os aptâmeros resultantes resistentes a nucleases encontradas no soro. A alteração dos grupos 2 ΌΗ de ribose para grupos 2'F ou 2'NH2 produz aptâmeros de vida longa no sangue. 0 peso molecular relativamente baixo dos aptâmeros (8000 a 12.000) origina uma rápida remoção do sangue. Os aptâmeros podem ser mantidos na circulação desde horas a dias através da respetiva conjugação com veículos de peso molecular superior. Quando modificados, os aptâmeros conjugados são injetados nos animais e inibem funções fisiológicas conhecidas por estarem associadas às respetivas proteínas-alvo. Os aptâmeros podem ser aplicados sistemicamente em animais e seres humanos para tratar doenças específicas dos órgãos (Ostendorf, 2001). O primeiro aptâmero gue avançou para os estudos clínicos de fase I é o NX-1838, um inibidor de angiogénese injetável que pode ser potencialmente utilizado para tratar cegueira induzida por degeneração macular. (Sun, 2000). A expressão citoplasmática de aptâmeros ("intrâmeros") pode ser utilizada para inibir alvos intracelulares (Blind, 1999; Mayer, 2001). Os referidos intrâmeros são considerados igualmente para a utilização no contexto desta invenção.

Os referidos (outros) recetores de Smad7 podem, por exemplo, derivar de anticorpos em oposição a Smad7 através de peptidomimética. A especificidade do reconhecimento implica que outras proteínas e moléculas conhecidas não estejam ligadas. Além disso, os recetores Smad7 que podem funcionar no contexto desta invenção são SARA (Wu, 2000), 30 STRAP (Datta, 2000), recetores TGF-beta ou BMP ou Smad2 (Kavasak, 2000). Em particular, é considerada a utilização dos fragmentos de péptidos desses recetores Smad7 "naturais". A abordagem ARNi é igualmente considerada no contexto desta invenção para ser utilizada na preparação de uma composição farmacêutica para o tratamento de doenças do SNC aqui divulgadas. 0 termo ARN de interferência (ARNi) descreve a utilização de ARN de cadeia dupla para orientar mARNs específicos para degradação, silenciando assim a respetiva expressão. O ARN de cadeia dupla (dsARN) que corresponde a uma sequência de genes é sintetizado in vitro e introduzido numa célula. O dsARN é introduzido num processo natural, mas apenas parcialmente compreendido, incluindo a nuclease dicer altamente conservada (Hutvàgner, 2001; Grishok, 2001), que cliva as moléculas precursoras dsARN em pequenos ARNs de interferência (siARNs). A geração e a preparação de siARNs, bem como o método de inibição da expressão de um gene-alvo, são, entre outros, descritos no documento WO 02/055693, Wei (2000) Dev. Biol. 15, 239-255; La Count (2000), Biochem. Paras. 111, 67-76, Baker (2000) Curr. Biol. 10, 1071-1074, Svoboda (2000), Development 127, 4147-4156 ou Marie (2000) Curr. Biol. 10, 289-292. Em seguida, estes siARNs constroem a parte específica da sequência de um complexo silenciador induzido por ARN (RISC), uma nuclease multicomplexa que destrói ARNs mensageiros homólogos do acionador silenciador. Uma parte da proteína do complexo de ribonucleoproteina foi identificada como Argonauta2 (Hammond, 2001). Elbashir (2001) mostrou que podem ser utilizados duplexes de ARNs de 21 nucleótidos na cultura de células para interferir com a expressão de genes nas células mamíferas.

Os métodos para deduzir e construir siARNs fazem parte da técnica e são descritos em Elbashir et al., 2002, nos 31 sítios da Internet dos fornecedores comerciais de siARN, por ex. Xeragon Inc. (www.xeragon.com/siRNA support.html); Dharmacon (www.dharmacon.com) ; Xeragon Inc. (www.xeragon.com); e Ambion (www.ambion.com) ou no sítio da Internet do grupo de investigação de Tom Tuschl (htt://www.mpibpc.gwdg.de/abteilungen/100/105/sirna.html). Além disso, os programas estão disponíveis online para deduzir siARNs a partir de uma determinada sequência de ARNm (por ex. http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA finder.html ou hftp://katahdin.cshl.org:9331/RNAi/). Estes foram utilizados para deduzir as moléculas siARN listadas abaixo (ARNi 1 a 20, SEQ. ID N.°s 44 a 83). Os resíduos de uridina no 3' overhang de 2 nt podem ser substituídos por 2'deoxitimidina sem perda de atividade, o que reduz significativamente os custos da síntese de ARN e também pode melhorar a resistência dos duplexes de siARN quando aplicados nas células mamíferas (Elbashir, 2001). Esta modificação é igualmente incorporada nas SEQ. IDs 44 a 83 citadas (consulte abaixo) do presente pedido de patente. Os siARNs também podem ser sintetizados enzimaticamente utilizando T7 ou outras ARN polimerases (Donze, 2002). Os pequenos duplexes de ARN que mediam o ARN de interferência eficaz (esiARN) podem igualmente ser produzidos através de hidrólise com Escherichia coli Rnase III (Yang, 2002). Além disso, os vetores de expressão foram desenvolvidos para expressar siARNs de cadeia dupla ligados através de estruturas ARN pequenas do tipo hairpin nas células eucarióticas (por ex. (Brummelkamp, 2002)). Todas estas construções podem ser desenvolvidas com a ajuda dos programas mencionados acima. Além disso, as ferramentas de predição de sequências comercialmente disponíveis incorporadas nos programas de análise de sequências ou vendidas separadamente, por ex. a Ferramenta de Conceção de siARN proposta por www.oligoEngine.com (Seattle, WA), podem ser utilizadas para a predição de sequências de siARN. 32

Por conseguinte, a presente invenção também está preparada para a utilização de ARNs de interferência específicos como inibidores de função e/ou expressão de Smad7. Preferencialmente, os referidos (pequenos) ARNs de interferência (siARNs) compreendem pelo menos 10, mais preferencialmente pelo menos 12, mais preferencialmente pelo menos 14, mais preferencialmente pelo menos 16 e mais preferencialmente pelo menos 18 nucleótidos. Numa forma de realização particularmente preferida, estes siARNs são selecionados a partir do grupo que consiste em: ARNil2: nt 298-318 5'-GUUCAGGACCAAACGAUCUGC-3', (SEQ. ID N. ° 44) nt 318-296 5'-GCAGAUCGUUUGGUCCUGAACAU-3' , (SEQ. : ID N. . ° 45) nt 578-598 5'-CUCACGCACUCGGUGCUCAAG-3', (SEQ. ID N. ° 46) nt 598-576 5'-CUUGAGCACCGAGUGCGUGAGCG-3' ; (SEQ. : ID N. . ° 47) nt 209-227 5'-CUCGGCGCCCGACUUCUUCuu-3', (SEQ. ID N. ° 48) nt 227-207 5'-GAAGAAGUCGGGCGCCGAGUU-3', (SEQ. ID N. ° 49) nt 266-284 5'-ACGACUUUUCUCCUCGCCUuu-3', (SEQ. ID N. ° 50) nt 284-264 5'-AGGCGAGGAGAAAAGUCGUUU-3'; (SEQ. ID N. ° 51) nt 310-328 5'-ACGAUCUGCGCUCGUCCGGuu-3', (SEQ. ID N. ° 52) nt 328-308 5'-CCGGACGAGCGCAGAUCGUUU-3'; (SEQ. ID N. ° 53) nt 574-592 5'-GGCGCUCACGCACUCGGUGuu-3', (SEQ. ID N. ° 54) nt 592-572 5'-CACCGAGUGCGUGAGCGCCUU-3'; (SEQ. ID N. ° 55) nt 607-625 5'-GGAGCGGCAGCUGGAGCUGuu-3', (SEQ. ID N. ° 56) nt 625-605 5'-CAGCUCCAGCUGCCGCUCCUU-3', (SEQ. ID N. ° 57) nt 778-796 5'-AGUGUUCAGGUGGCCGGAUuu-3', (SEQ. ID N. ° 58) nt 796-776 5'-AUCCGGCCACCUGAACACUuu-3', (SEQ. ID N. ° 59) nt 815-833 5'-GUCAAGAGGCUGUGUUGCUuu-3', (SEQ. ID N. ° 60) nt 833-813 5'-AGCAACACAGCCUCUUGACUU-3', (SEQ. ID N. ° 61) nt 820-838 5'-GAGGCUGUGUUGCUGUGAAuu-3', (SEQ. ID N. ° 62) nt 838-818 5'-UUCACAGACACACAGCCUCUU-3', (SEQ. ID N. ° 63) nt 839-857 5'-UCUUACGGGAAGAUCAACCuu-3', (SEQ. ID N. ° 64) nt 857-837 5'-GGUUGAUCUUCCCGUAAGAUU-3', (SEQ. ID N. ° 65) nt 850-868 5'-GAUCAACCCCGAGCUGGUGuu-3'. (SEQ. ID N. ° 66) nt 868-848 5'-CACCAGCUCGGGGUUGAUCUU-3', (SEQ. ID N. ° 67) ARNil: ARNÍ2: ARNÍ3: ARN i 4: ARNÍ5: ARNÍ6: ARNÍ7: ARNÍ8: ARNÍ9: ARNilO ARNill 33 ARNil3: nt 856-874 5'-CCCCGAGCUGGUGUGCUGCuu-3', (SEQ. ID N. ° 68) nt 874-854 5'-GCAGCACACCAGCUCGGGGUU-3', (SEQ. ID N. ° 69) ARNil4: nt 1008-1026 5'-CGAAUUAUCUGGCCCCUGGuu-3', (SEQ. ID N. ° 70) nt 1026-1006 5'-CCAGGGGCCAGAUAAUUCGUU-3', (SEQ. ID N. ° 71) ARNil5: nt 1046-1064 5'-CUUCUUCUGGAGCCUGGGGuu-3', (SEQ. ID N. ° 72) nt 1064-1044 5'-CCCCAGGCUCCAGAAGAAGUU-3', (SEQ. ID N. ° 73) ARNil6: nt 1177-1195 5'-UGGCUUUUGCCUCGGACAGuu-3', (SEQ. ID N. ° 74) nt 1195-1175 5'-CUGUCCGAGGCAAAAGCCAUU-3', (SEQ. ID N. ° 75) ARNil7: nt 1201-1219 5'-UUCGGACAACAAGAGUCAGuu-3', (SEQ. ID N. ° 76) nt 1219-1199 5'-CUGACUCUUGUUGUCCGAAUU-3', (SEQ. ID N. ° 77) ARNil8: nt 1297-1315 5'-CCGCAGCAGUUACCCCAUCuu-3', (SEQ. ID N. ° 78) nt 1315-1295 5'-GAUGGGGUAACUGCUGCGGUU-3', (SEQ. ID N. ° 79) ARNil9: nt 1324-1342 5'GUCCGCCACACUGGACAACuu-3', (SEQ. ID N. ° 80) nt 1342-1322 5'-GUUGUCCAGUGUGGCGGACUU-3', (SEQ. ID N. ° 81) ARN i 2 0: nt 1342-1360 5'-CCCGGACUCCAGGACGCUGuu-3', (SEQ. ID N. ° 82) nt 1360-1340 5'-CAGCGUCCUGGAGUCCGGGUU-3', (SEQ. ID N. ° 83)

Os sARNi são utilizados em combinações de pares. Os pares acima compreendem SEQ. ID N.° 44 combinada com SEQ. ID N.° 45 (ARNil), e SEQ. ID N.° 46 combinada com SEQ. ID N. ° 47 (ARNi2), e são úteis para o tratamento de pacientes humanos. Outros pares considerados sao: SEQ. ID N. 0 48 combinada com SEQ. ID N.° 49, SEQ. ID N.° 50 combinada com SEQ. ID N.° 51, SEQ. ID N.° 52 combinada com SEQ. ID N. 0 53, SEQ. ID N.° 54 combinada com SEQ. ID N. 0 55, SEQ. ID N. 0 56 combinada com SEQ. ID N.° 57, SEQ. ID N. 0 58 combinada com SEQ. ID N.° 59, SEQ. ID N.° 60 combinada com SEQ. ID N.° 61, SEQ. ID N.° 62 combinada com SEQ. ID N. 0 63, SEQ. ID N.° 64 combinada com SEQ. ID N. 0 65, SEQ. ID N. 0 66 combinada com SEQ. ID N.° 67, SEQ. ID N. 0 68 combinada com SEQ. ID N.0 69, SEQ. ID N.° 70 combinada com SEQ. ID N.° 71, SEQ. ID N.° 72 combinada com SEQ. ID N. 0 73, SEQ. ID N.° 74 combinada com SEQ. ID N. 0 75, SEQ. ID N. 0 76 combinada com SEQ. ID N.° 77, SEQ. ID N. 0 78 combinada com SEQ. ID N.° 79, SEQ. ID N.° 80 combinada com 34 SEQ. ID N.° 81, SEQ. ID N.° 82 combinada com SEQ. ID N.° 83.

Conforme ilustrado nos exemplos em anexo, os siARNs são uma abordagem forte no tratamento de distúrbios do SNC.

Além disso, os novos métodos para identificar moléculas úteis para inibir ARN Smad7 ou proteina/ARN Smad7 (complexos RNP Smad7), incluindo ressonância magnética nuclear (RMN) e ensaios de ligação de fluorescência, foram resumidos em (Hermann, 2000) e (DeJong, 2002), e nas referências ai citadas. O recetor ou parceiro de ligação intracelular de função e/ou expressão de Smad7 é um anticorpo intracelular.

Os anticorpos intracelulares são conhecidos na técnica e podem ser utilizados para neutralizar ou modular a atividade funcional da molécula-alvo. Esta abordagem terapêutica baseia-se na expressão intracelular de fragmentos de anticorpo recombinante, Fab ou Fv de cadeia única, orientados para o compartimento de células desejado utilizando sequências-alvo apropriadas (resumido em

Teillaud, 1999) .

Conforme aqui mencionado acima, de preferência o inibidor de função e/ou expressão de Smad7 é uma molécula antisense. Preferencialmente, a referida molécula antisense anti-Smad7 compreende uma molécula de ácido nucleico que é a cadeia complementar de uma cadeia complementar inversa da região de codificação de Smad7.

As regiões de codificação de Smad7 são conhecidas na técnica e compreendem, entre outros, as entradas Smad7 GenBank para Smad7 de ratinhos NM_008543, AJ00551, AJ000550, as sequências de Smad7 de ratos NM_030858, AH 0 0 8 2 4 3, AF156730, AF156729, AF156728, AF156727, AF156726, AF042499 ou as entradas de sequências de Smad7 de seres humanos em GenBank como XM_033746, XM_008803, AF015261 ou AF010193. O perito na técnica pode deduzir facilmente a região de codificação relevante de Smad7 nestas entradas 35

GenBank, o que também pode compreender a entrada de ADN genómico, bem como ARNm/ADNc.

Além disso, parte-se igualmente do principio de que as moléculas antisense contra a função ou expressão de Smad7 interferem especificamente com as regiões promotoras de Smad7. Essas regiões promotoras são conhecidas na técnica e compreendem, entre outros, entradas GenBank AF254791 (ser humano), AF156731 (ser humano) ou AF188834 (rato).

Parte-se do principio de que as moléculas antisense a serem utilizadas de acordo com a presente invenção inibem a função ou expressão de Smad7, em particular de Smad7 humano, e interagem com Smad7, conforme expressado pelas regiões de codificação, mARNs/cADNs, conforme depositado nos números de acesso GenBank acima mencionados, bem como com Smad7, conforme expressado através de isoformas e variantes do referido Smad7. As referidas isoformas ou variantes podem, entre outros, compreender variantes alélicas ou variantes de união.

Neste contexto, o termo "variante" significa que a sequência de nucleótidos Smad7 e a sequência de aminoácidos Smad7 codificada, respetivamente, diferem das sequências distintas disponíveis nos referidos números de acesso GenBank, através de mutações, por ex. deleções, adições, substituições, inversões, etc.

Por conseguinte, a molécula antisense a ser utilizada de acordo com a presente invenção hibridiza/interage especificamente com uma ou mais moléculas de ácido nucleico que codificam Smad7. Preferencialmente, a referida molécula de ácido nucleico é ARN, ou seja, pré-ARN-m ou ARNm. 0 termo "hibridiza/interage especificamente com uma ou mais moléculas de ácido nucleico que codificam Smad7" refere-se, no contexto desta invenção, a moléculas antisense que são capazes de interferir com a expressão de Smad7. Conforme ilustrado nos exemplos em anexo, as construções antisense, como "Smad7-mut4-as" (uma construção antisense que 36 compreende 4 mutações) não são capazes de hibridizar e/ou interagir especificamente com uma ou mais sequências de ácidos nucleicos que codificam Smad7. Por conseguinte, as construções antisense anti-Smad7 altamente mutantes, que não são capazes de hibridizar ou interagir especificamente com moléculas de ácido nucleico de codificação de Smad7, não se destinam à utilização nas aplicações da presente invenção. 0 perito na técnica pode deduzir facilmente se uma construção antisense hibridiza/interage especificamente com sequências de codificação de Smad7. Estes testes compreendem, mas não se limitam a, ensaios de hibridização, ensaios de proteção de RNAse, Northern Blot, North Western Blot, ressonância magnética nuclear e ensaios de ligação de fluorescência, Dot Blot, microarrays e macroarrays e PCR quantitativa. Além disso, esse rastreio pode não ser restrito a moléculas ARNm Smad7, mas também pode incluir complexos de proteína (RNP)/ARNm Smad7 (Hermann, 2000; DeJong et al., 2002) . Além do mais, os testes funcionais, conforme fornecido nos exemplos em anexo, são considerados para testar se uma determinada construção antisense é capaz de hibridizar/interagir especificamente com as moléculas de ácido nucleico que codificam Smad7. Estes ensaios funcionais compreendem ensaios de ativação de células T in vitro; consulte, entre outros, o exemplo 11. Estes testes funcionais também podem incluir Western Blot, immnohistoquímica, ensaio de immnoprecipitação e bioensaios baseados nos promotores recetivos TGF-beta.

Contudo, conforme igualmente documentado nos exemplos em anexo, as construções antisense mutantes e/ou modificadas também podem ser utilizadas de acordo com esta invenção, desde que as referidas construções antisense mutantes e/ou modificadas sejam capazes de hibridizar e/ou interagir especificamente com as sequências de codificação de Smad7.

As moléculas antisense de Smad7 foram descritas no estado da técnica. Por exemplo, o documento US 6.159.697 37 descreve compostos antisense que compreendem essas moléculas antisense. Contudo, o documento US 6.159.697 utiliza os referidos compostos no tratamento de doenças associadas à expressão de Smad7. Em oposição, a presente invenção está preparada para uma intervenção médica/terapêutica especifica, onde não são tratadas quaisquer doenças/condições associadas à expressão de Smad7, mas sim os distúrbios específicos do sistema nervoso central, onde a administração sistémica de TGF-beta mostrou ser prejudicial. 0 termo "molécula antisense" conforme aqui utilizado compreende, em particular, oligonucleótidos antisense. Os referidos oligonucleótidos antisense também podem compreender nucleótidos modificados, bem como ligação internucleosídeo modificada, conforme descrito, entre outros, em US 6.159.697.

Mais preferencialmente, os oligonucleótidos antisense da presente invenção compreendem pelo menos 8, mais preferencialmente pelo menos 10, mais preferencialmente pelo menos 12, mais preferencialmente pelo menos 14 e mais preferencialmente pelo menos 16 nucleótidos. A dedução e a preparação das moléculas antisense são bem conhecidas na técnica. A dedução das moléculas antisense é, entre outros, descrita em Smith, 2000. Os métodos habituais são "gene walking" (caminhar ao longo do gene), mapeamento de RNaseH, mapeamento de RNase L (Leaman e Cramer, 1999), arrays de oligonucleótidos combinatórios no suporte sólido, determinação da análise de estrutura secundária através de métodos computacionais (Walton, 2000), oligonucleótidos de aptâmero orientados para ácidos nucleicos estruturados (aptastruc), sondas de oligonucleótidos fixas, oligonucleótidos de formação foldback triplex (FTFOs) (Kandimalla, 1994) e seleção de sequências com ligação não específica minimizada (Han, 1994).

Preferencialmente, as moléculas antisense da presente 38 invenção são estabilizadas contra a degradação. Esses métodos de estabilização são conhecidos na técnica e, entre outros, descritos em US 6.159.697. Outros métodos descritos para proteger os oligonucleótidos contra a degradação incluem oligonucleótidos unidos por ligandos (Vorobjev, 2001), moléculas minimamente modificadas de acordo com a atividade de nuclease das células (Samani, 2001), oligonucleótidos 2'O-DMAOE (Prakash, 2001), 3'5'-dipeptidil oligonucleótidos (Schwope, 1999), h-fosfonatos e fosfonamiditos de 3'metileno timidina e 5-metiluridina/citidina (An, 2001), bem como encapsulamento de lipossoma aniónico (De Oliveira, 2000) ou aminolípido ionizável (Semple, 2001).

Numa forma de realização preferida da invenção, a molécula antisense é uma molécula de ácido nucleico que é a cadeia complementar de uma cadeia complementar inversa da região de codificação de Smad7 selecionada a partir do grupo que consiste na SEQ. ID N.° 1, SEQ. ID N.° 3 ou SEQ. ID N.° 5. As sequências conforme é retratado nas SEQ. ID N.°s 1, 3 ou 5 representam regiões de codificação ilustrativas (ARNm) de Smad7 de ser humano, ratinho ou rato. As SEQ. ID N.°s 2, 4 e 6 representam Smad7 traduzidos de ser humano, ratinho ou rato, respetivamente. Por conseguinte, no contexto desta invenção e conforme aqui realçado acima, os inibidores Smad7 a utilizar nas aplicações aqui descritas, de preferência, interagem com as regiões promotoras e/ou de codificação das moléculas de ácido nucleico que codificam ou originam a expressão de moléculas Smad7 conforme ilustrado nas SEQ. ID N.°s 2, 4 ou 6. Parte-se igualmente do principio de que, por ex., as construções antisense concebidas e utilizados de acordo com esta invenção inibem a expressão de homólogos funcionais, variantes (por exemplo variantes alélicas) ou isoformas de moléculas Smad7, conforme ilustrado nas SEQ. ID N.°s 2, 4 ou 6. 39

No contexto desta invenção, o termo "região de codificação de Smad7" compreende não só a região traduzida de Smad7 cds, como também compreende regiões não traduzidas. Por conseguinte, a molécula antisense anti-Smad7 a ser utilizada de acordo com esta invenção pode ser uma molécula antisense que ligue a/interaja com sequências de ARNm que compreendem a região não traduzida. Em conformidade, a "região de codificação de Smad7" conforme é retratado nas SEQ. ID N.°s 1, 3 e 5 compreende as sequências de ARNm completas de Smad7.

Numa forma de realização mais preferida da presente invenção, a molécula antisense anti-Smad7 a ser utilizada nas aplicações da invenção ou nos métodos aqui descritos é selecionada a partir de uma molécula de ácido nucleico, conforme ilustrado no quadro seguinte.

Preferencialmente, os Oligonucleótidos Smad7-Antisense derivados de sequências de ratinhos (5'-3'-direção) são: cttcggctgccccacccg (SEQ. ID N. ° 7) NM_ .008543, nt 1179-1196, 5'UT atcgtttggtcctgaacat (SEQ. ID N. ° 8) NM. .008543, nt 1437-1455, cds ccctcctcctcgtcctcg (SEQ. ID N. ° 9) NM. .008543, nt 1499-1516, cds gtcgccccttctccccgcag (SEQ. ID N. ° 10) NM. .008543, nt 1545-1564, cds gccgtccgtcgccccttc (SEQ. ID N. ° 11) NM. .008543, nt 1554-1571, cds agcaccgagtgcgtgagc (SEQ. ID N. ° 12) NM. .008543, nt 1718-1735, cds agttcacagagtcgacta (SEQ. ID N . ° 13) NM. .008543, nt 2030-2047, cds ggcaaaagccattcccct (SEQ. ID N . ° 14) NM. .008543, nt 2311-2328, cds gccgatcttgctccgcac (SEQ. ID N . ° 15) NM_0 08543, nt 2373-2430, cds, o

As entradas Smad7 Genbank de ratinho relevantes são NM_008543 (sequência de ARNm) e AJ000551 (ARNm, variação Smad7B, não tem "cag") (nt 2104-2106 em NM_008543).

Mais preferencialmente, os Oligonucleótidos Smad7-Antisense de Sequências humanas (5 '-3'-direção) são: ctccggctgccccacccc cgaacatgacctccgcac

(SEQ. ID N.° 16) AF010193, n t 38 -54, 5 'UT (SEQ. ID N.° 17) AF010193, n t 243-250, 5 MJT 40

atcgtttggtcctgaacat (SEQ. ID N. ° 18) AF 010193, n t 296-314, cds ccctcctcctcgtcctcg (SEQ. ID N. ° 19) AF010193, n t 358-375, cds gtcgccccttctccccgcag (SEQ. ID N. ° 20) AF010193, n t 404-423, cds gctgtccgtcgccccttc (SEQ. ID N. ° 21) AF010193, n t 413-430, cds agcaccgagtgcgtgagc (SEQ. ID N. ° 22) AF010193, n t 577-594, cds agttcgcagagtcggcta (SEQ. ID N. ° 23) AF010193, n t 889-906, cds ggcaaaagccattcccct (SEQ. ID N. ° 24) AF010193, n t 1170-1187, cds gccgattttgctccgcac (SEQ. ID N. ° 25) AF010193, n t 1232-1249, cds ctgccccttcttccaaaa (SEQ. ID N. ° 26) AF010193, nt 1790-1807, 3'UT actcacacacactcctga (SEQ. ID N. ° 27) AF010193, nt 1905-1928, 3'UT tgcccaggtactgcctct (SEQ. ID N. ° 28) AF010193, nt 2076-2093, 3'UT gagatccaggagcagatg (SEQ. ID N. ° 29) AF010193, nt 2310-2327, 3'UT

Aqui, as entradas Smad7 Genbank humanas mais relevantes são AF 010193 (ARNm Smad7, cds completo), XM_033746 (ARNm MADH7, variaçao 1213: /alelo="C" /alelo="T") e XM_0 0 8803 (ARNm MADH7, variação 1500: /alelo="C" /alelo="T").

Os Oligonucleótidos Smad7-Antisense de rato (5'-3'-direção) preferidos são: cttcggctgccccacccg (SEQ. ID N. ° 30) NM_0 30858, nt 1164-1181, 5'UT atcgtttggtcctgaacat (SEQ. ID N. ° 31) NM_03 0 858, nt 1422-1440, cds ccctcctcctcgtcctcg (SEQ. ID N. ° 32) NM_030858, nt 1484-1501, cds gtcgccccttctccccgcag (SEQ. ID N. ° 33) NM_030858, nt 1530-1549, cds gccgtccgtcgccccttc (SEQ. ID N. ° 34) NM_030858, nt 1539-1556, cds agcaccgagtgcgtgagc (SEQ. ID N. ° 35) NM_030858, nt 1703-1720, cds agttcacagagtcgacta (SEQ. ID N. ° 36) NM_030858, nt 2015-2032, cds ggcaaaagccattcccct (SEQ. ID N. ° 37) NM_030858, nt 2296-3013, cds gccgatcttgctcctcac (SEQ. ID N. 0 38) NM-030858, nt 2358-2375, cds

Aqui, a entrada Smad7 Genbank de rato relevante é NM 030858 (ARNm, cds completo).

Além disso, conforme documentado nos exemplos em anexo e aqui explicado, os oligonucleótidos modificados e/ou mutantes são considerados de acordo com esta invenção, e um exemplo desse oligonucleótido (5'-3'-direção) é gtcgccccttctcccccgcag (SEQ. ID N.° 39). 41

Preferencialmente, as moléculas antisense a serem utilizadas de acordo com a presente invenção são 100% complementares para o ARNm (região de codificação e/ou não codificação) de Smad7 conforme aqui ilustrado; por ex. SEQ. ID N.°s 1, 3 ou 5 ou conforme ilustrado nos números de acesso GenBank NM_008543 (ratinho), AF010193 (ser humano) , NM_030858 (rato). Todavia, parte-se igualmente do principio de que a referida molécula antisense compreende nucleótidos adicionais, nucleótidos substituídos, trocas de nucleótidos, inversões de nucleótidos ou deleções de nucleótidos. Contudo, conforme documentado nos exemplos em anexo, as moléculas antisense funcionais a serem utilizadas na presente invenção são preferencialmente mais de 85%, mais preferencialmente mais de 90% e mais preferencialmente mais de 95% complementares para o ARNm Smad7 (região de codificação e/ou não codificação). Por exemplo, as moléculas anti-Smad7/moléculas antisense mais eficazes compreendem nucleótidos que são 100% complementares para o ARNm correspondente. Todavia, conforme ilustrado igualmente nos exemplos em anexo, as moléculas antisense que compreendem, entre outros, um ou dois nucleótidos adicionais são funcionais no contexto da invenção.

Os inibidores específicos de função ou expressão de Smad7 divulgados acima são úteis num método de prevenção, melhoramento e/ou tratamento de esclerose múltipla ou isquemia cerebral num sujeito. Preferencialmente, o referido sujeito é um mamífero, mais preferencialmente o referido mamífero é um ser humano.

Um "paciente" ou "sujeito" para fins da presente invenção inclui seres humanos e outros animais, particularmente mamíferos, e outros organismos. Deste modo, os métodos são utilizados na terapia humana e em aplicações veterinárias. Na forma de realização preferida, o paciente é um mamífero, e na forma de realização mais preferida, o paciente é um ser humano. 42

Os exemplos em anexo ilustram a utilização bem-sucedida e inventiva dos inibidores Smad7, conforme aqui definido, no tratamento das doenças/distúrbios definidos acima. Preferencialmente, a referida doença autoimune é esclerose múltipla. A referida esclerose múltipla pode ser selecionada a partir do grupo que consiste em esclerose múltipla recorrente e remitente, esclerose múltipla progressiva secundária, esclerose múltipla progressiva crónica primária, neuromielite ótica (síndrome de Devic), encefalomielite disseminada aguda, esclerose múltipla fulminante (variante de Marburg), neurite ótica autoimune isolada, mielite transversa autoimune isolada, esclerose concêntrica de Balo. Todas as doenças acima mencionadas são consideradas subtipos de EM ou são doenças autoimunes do SNC relacionadas com a EM ou estádios prematuros comuns da EM antes do diagnóstico clinico claro de EM de acordo com a técnica. 0 acidente vascular cerebral isquémico e o traumatismo do SNC envolvem mecanismos patológicos que são partilhados com a EM e subtipos, por ex. perda da barreira hematoencefálica, influxo de células imunes e ativação microglial, originando uma lesão secundária mediada por inflamação no tecido cerebral que pode ser reduzida através da aplicação de moléculas anti-inflamatórias como TGF-beta. 0 acidente vascular cerebral, por ex. lesão hipóxica-isquémica focal do cérebro, é caracterizado por uma lesão no tecido necrótico central e uma "penumbra" circundante que podem ser descritas como "tecido em risco". As células neuronais nesta zona ainda estão sujeitas a morrer durante um longo periodo de tempo. A expressão de TGF-beta aumentou significativamente na penumbra (Slevin, Gunsilius, 2001) e é uma indicação da quantidade de cérebro que é possível salvar (Ali, 2001) . Parte-se do princípio de que a resposta inflamatória local aguda a seguir à isquemia cerebral provoca parte da lesão cerebral perifocal. A sobre-expressão de TGF-beta 1 mediada por adenovírus cinco dias 43 antes da oclusão da ACM resultou na inibição das quimocinas MCP-1 e ΜΙΡΙ-alfa e num volume do enfarte significativamente reduzido (Pang, 2001). Contudo, quando administrado após a indução de isquemia cerebral através da artéria carótida contralateral num modelo de coelho de acidente vascular cerebral tromboembólico, o TGF-beta não teve um efeito significativo relativamente ao tamanho do enfarte ou à produção de níveis de aminoácidos excitantes (Gross, 1994). Não obstante, o TGF-beta tem presumivelmente efeitos neuroprotetores in vivo, uma vez que o bloqueio da interação de TGF-beta com o respetivo recetor agravou o volume do enfarte num modelo de rato de acidente vascular cerebral (Ruocco, 1999). Por conseguinte, é possível prever que a amplificação da sinalização através de TGF-beta tem um efeito benéfico no acidente vascular cerebral salvando as células circundantes não danificadas de forma letal e reduzindo finalmente o volume do enfarte. Relativamente à isquemia cerebral global, o aumento da expressão de genes TGF-betal no tecido cerebral dura entre 6 horas e 21 dias (Lehrmann, 1995) . Foi observado que a indução de genes TGF-betal máxima ocorreu entre 5 e 7 dias após a isquemia (Zhu, 2000). A injeção intraparenquimatosa local de TGF-betal atenuou a apoptose e melhorou o resultado neurológico pós-isquémico (Zhu, 2002). Na isquemia global transitória em ratos, Henrich-Noack et al. conseguiram mostrar uma proteção significativa das células CAI piramidais através da injeção intra-hipocampal de TGF-betal antes da isquemia. Diversos estudos in vivo analisaram o efeito da administração intra-arterial ou intracerebroventricular de TGF-betal antes (Gross, 1993) ou após a indução de isquemia (Gross, 1994, McNeill, 1994) num modelo de coelho de acidente vascular cerebral tromboembólico ou num modelo de rato de lesão cerebral hipóxica-isquémica grave, respetivamente. Estes estudos mostraram que o regime de tratamento estava associado a uma redução significativa de 44 perda neuronal e do tamanho do enfarte. Na isquemia global transitória em ratos, Henrich-Noack et al. conseguiram mostrar uma proteção significativa das células CAI piramidais através da injeção intra-hipocampal de TGF-betal antes da isquemia (Henrich-Noack, 1996). Os efeitos semelhantes de tamanhos de lesão maiores após a aplicação de antagonistas TGF-beta em modelos animais de lesão excitotóxica ao cérebro sugerem que as abordagens que aumentam os efeitos de TFG-beta podem ser utilizadas para impedir a ocorrência da lesão excitotóxica aguda na lesão do SNC traumática (Hailer, 2001). Em alguns pacientes com lesão cerebral traumática aguda, foi detetada uma produção intracerebral de TGF-beta que atinge o ponto máximo no primeiro dia pós-traumatismo e confere possivelmente uma proteção contra a lesão cerebral secundária induzida por inflamação (Morganti-Kossmann, 1999).

Mais preferencialmente, a composição farmacêutica a ser preparada de acordo com esta invenção e que compreende inibidores de função e/ou expressão anti-Smad7 deve ser administrada através de um ou vários dos seguintes modos: a administração pode ser oral, intravenosa, intra-arterial, intratraqueal, intranasal, subcutânea, intramuscular, intracraniana (ou seja, intraventricular) ou intraespinal (intratecal), epidérmica ou transdérmica, pulmonar (por ex. inalação ou insuflação de aerossol ou pó) , através de ministração na mucosa oral ou retal, bem como ministração oftálmica. ser um

Parte-se do principio, entre outras coisas, de que os inibidores Smad7, como as moléculas/construções antisense ou siARNs aqui descritos, são administrados em conjunto com outros compostos/medicamentos. Os referidos outros compostos/medicamentos ou moléculas podem, por ex., induzir um aumento da modulação de TGF-beta ou ativar o TGF-beta latente. Os referidos outros compostos/medicamentos/moléculas também podem 45 imunomodulador ou um fármaco imunossupressor. Esses imunomoduladores são conhecidos na técnica e compreendem, entre outros, interferão-beta la humano (recombinante), interferão-beta lb humano (recombinante) ou acetato de glatiramer e outros fármacos/compostos que modulam a ativação, migração, função efetora e/ou sobrevivência das células imunes. Esses compostos podem ser anticorpos ou fragmentos de anticorpo orientados contra moléculas expressadas nas superfícies celulares (tais como moléculas de aderência, recetores de citocinas ou quimocinas ou recetores para ligandos que contribuem para a ativação de células imunes ou para as funções efetoras de células imunes) ou contra moléculas em circulação, tais como citocinas, quimocinas ou ligandos, para recetores que mediam a ativação de células imunes ou as funções efetoras de células imunes. Esses compostos também podem compreender inibidores ou agonistas sintéticos para recetores de citocinas ou quimocinas ou outras moléculas endógenas, tais como moléculas de aderência ou moléculas moduladoras de ativação ou transcrição intracelular. Esses compostos também podem compreender moléculas com o objetivo de modular respostas imunitárias específicas do antigénio (por ex. ligandos de péptidos alterados, vacinação do recetor de células T, vacinação de ADN ou outras estratégias para modificar as respostas imunitárias). As substâncias/fármacos a serem administrados com compostos anti-Smad7/inibidores Smad7 aqui descritos podem comprometer outras substâncias que suprimem o crescimento ou a ativação de células imunes, tais como azatioprina, mitoxantrona, ciclofosfamida, ciclosporina A, micofenolato mofetil, rapamicina, minociclina ou metotrexato. Outros fármacos/compostos consideraram as células imunes e/ou a ativação, migração, função efetora e/ou sobrevivência de células imunes. As substâncias/fármacos imunossupressores a serem administrados com os compostos anti-Smad7/inibidores 46

Smad7 aqui descritos podem compreender azatioprina, mitoxantrona, ciclofosfamida, ciclosporina A, micofenolato mofetil, ciclosporina A, rapamicina, minociclina ou metotrexato.

Os regimes de dosagem e administração para os inibidores Smad7 podem ser estabelecidos pelo médico. Por exemplo, para os compostos antisense, tais como os nucleótidos antisense, foram estabelecidos regimes de dosagem específicos. Esses regimes compreendem uma dosagem de 1 mg/kg até 200 mg/m2 e são, entre outros, descritos em Schreibner (2001), Gastroenterology 120, 1399-1345; Andrews (2001), J. Clin. Oncol. 19, 2189-2200; Blay (2000), Curr. Op. Mol. Ther. 2, 468-472; Cunnigham (2000), Clin. Câncer Res. 6, 1626-1631; Waters (2000), J. Clin. Oncol. 18, 1809-1811 ou Yacyshyn (1998), Gastroenterology 114, 1133-1142. Por exemplo, parte-se do principio de que os inibidores Smad7 aqui descritos, por ex. compostos antisense ou ARNi e afins, são administrados em doses únicas de 0,1 a 25 mg/kg/dia (por exemplo i.v. durante 2 a 8 horas), como dose única ou doses múltiplas dia sim, dia não ou através de infusões continuas de 0,5 a 10 mg/kg/dia durante 14 a 21 dias com uma pausa de 7 dias. É importante referir que em determinadas indicações clinicas ou médicas, pode ser aconselhável administrar os inibidores Smad7 conforme aqui divulgado numa dose única. Por exemplo, num incidente traumático agudo (traumatismo do cérebro ou da medula espinal) ou num evento isquémico no cérebro (por ex. acidente vascular cerebral), uma única administração dos inibidores Smad7 pode ser suficiente para melhorar a condição do paciente afetado, preferencialmente um paciente humano. Noutros distúrbios do SNC, tal como distúrbios imunológicos (por ex. EM), pode ser desejado um regime de tratamento de múltiplas administrações. Contudo, são considerados outros regimes de dosagem e podem ser facilmente estabelecidos por um médico. 47

As Figuras sao descritas em seguida. FIGURA 1. 0 tratamento com Smad7-as-0DN preventivo adia o inicio e alivia a gravidade clinica da EAE. Os ratinhos naive foram injetados com 30 x 106 de LNC especifica de PLP conforme descrito em Materiais e Métodos. Numa composição preventiva, foram injetados 100 pg de Smad7-as-ODN (5 mg/kg/d) no PBS ou um volume igual de PBS i.p. diariamente a partir do dia de transferência até o inicio dos sinais clínicos no grupo de controlo (dia 8). O início da doença foi adiado significativamente do dia 14,29 ± 1,10 (média ± EP) para o dia 27,43 ± 4,28 (p = 0,029; Quadro 1). FIGURA 2. O efeito do tratamento com Smad7-as-0DN é possivelmente de longa duração e pode ser dependente da dose. Os ratinhos naive foram injetados com 30 x 106 de LNC específica de PLP conforme descrito em Materiais e Métodos. Foram injetados 100 pg de Smad7-as-ODN (5 mg/kg/d) no PBS ou um volume igual de PBS i.p. diariamente a partir do dia de transferência durante 3 semanas, dia sim, dia não durante as 2 semanas seguintes e duas vezes por semana durante as restantes 5 semanas. A diferença nos resultados clínicos medianos entre os grupos experimentais foi estatisticamente significativa entre os dias 15 e 26, nos dias 28, 40, 41, 50, 53, e entre os dias 60 e 64 (p < 0,05). No dia 40, a prevalência de EAE no grupo de tratamento era de 0/6, sugerindo um tratamento contínuo de 5 mg/kg três vezes por semana como sendo suficiente para a supressão da doença. FIGURA 3. O tratamento com Smad7-as2-ODN adia o início e alivia o curso clínico da EAE. Os ratinhos naive foram injetados com 5 x 106 de LNC específica de PLP conforme descrito em Materiais e Métodos. Foram injetados 100 pg de oligonucleótidos antisense (5 mg/kg/d) no PBS ou um volume igual de PBS i.p. diariamente a partir do dia de 48 transferência até ao final da experiência. 0 inicio da doença foi adiado no grupo Smad7-as2-ODN do dia 10,4 ± 1,66 (média ± EP) para o dia 15,8 ± 3,69 (Quadro 3) . O Smad7-as2-ODN teve um efeito mais potente do que o Smad7-as-ODN, ao passo que o Smad7-mut4-as-ODN (uma construção antisense que não é capaz de hibridizar especificamente com a molécula de ácido nucleico que codifica o Smad7 relevante) deteriorou o curso clinico. FIGURA 4. O Smad7-as-ODN suprime a gravidade clinica da EAE de um modo terapêutico. Os ratinhos naive foram injetados com 30 x 106 de LNC especifica de PLP conforme descrito em Materiais e Métodos. Os ratinhos foram divididos em grupos de tratamento de incidência de EAR e resultado acumulativo iguais no pico da doença (dia 12) . Foram injetados 100 pg de Smad7-as-ODN (5 mg/kg/d) no PBS ou um volume igual de PBS i.p. diariamente do 12 ao dia 28 e subsequentemente dia sim, dia não do dia 29 ao dia 45. A diferença no resultado de EAE médio entre os dois grupos foi estatisticamente significativa entre os dias 18 e 20 e entre os dias 26 e 32 (p < 0,05) . FIGURA 5. A doença autoimune do SNC é evitável através da exposição da LNC autorreativa ao tratamento com Smad7-as in vitro. A LNC foi obtida a partir de ratinhos imunizados com PLP conforme descrito em Materiais e Métodos e reestimulada durante 96 horas com 10 pg/ml de PLP e 20 μΜ de Smad7-as-ODN ou PBS, respetivamente. A proliferação foi reduzida em aproximadamente 30% conforme medido pela absorção de 3H-citidina (não ilustrado) . Foram injetados 5 x 106 de LNC viável em ratinhos recipientes naive i.p. e o resultado clinico foi examinado durante 20 dias até ser claramente atingido o pico da doença no grupo de controlo. Os ratinhos que receberam LNC tratada com Smad7-as-ODN não desenvolveram sinais clínicos de EAE. Isto sugere que o 49 tratamento com Smad7-as-0DN pode prevenir a reativação de células T autorreativas preparadas e bloquear as respetivas propriedades indutoras da doença. FIGURA 6. 0 Smad7-as2-ODN suprime a proliferação de LNC ativada in vitro. A LNC especifica de PLP foi obtida e cultivada conforme descrito em Materiais e Métodos durante 96 horas e com concentrações crescentes de Smad7-as2-ODN ou Smad7-mut4-as-0DN, respetivamente. Os poços sem PLP ou oligonucleótidos antisense serviram como controlos. A proliferação de LNC é ilustrada como a média ± erro padrão de culturas quadruplicadas. A, o Smad7-as2-ODN reduziu a proliferação de LNC reestimulada com PLP estatisticamente de forma muito significativa nas concentrações de 20 μΜ (* p < 0,05, ** p < 0, 005). B, o Smad7-mut4-as-ODN não teve qualquer efeito na proliferação de LNC. FIGURA 7. O Smad7-as-ODN diminui a proliferação de LNC ativada in vitro. A LNC específica de PLP foi obtida e cultivada conforme descrito em Materiais e Métodos. A LNC foi reestimulada com 10 pg/ml de PLP ou 0,2 pg/ml de Con A e várias concentrações de Smad7-as-ODN durante 96 horas. Os poços sem PLP ou oligonucleótidos antisense serviram como controlos. A proliferação de LNC é ilustrada como a média ± erro padrão de culturas quadruplicadas. O efeito de Smad7-as-ODN foi estatisticamente significativo numa concentração de 1 μΜ (p < 0,05). FIGURA 8.

O Smad7-as-ODN não é tóxico contra LNC ativada. A LNC especifica de PLP foi obtida e cultivada conforme descrito em Materiais e Métodos. A LNC foi reestimulada com 10 pg/ml de PLP e concentrações crescentes de Smad7-as-ODN (inicialmente 8 x 105 de LNC) ou Smad7-as2-ODN (inicialmente 4 x 105 de LNC) durante 96 horas, respetivamente. Os poços sem oligonucleótidos antisense 50 serviram como controlos. A viabilidade de LNC é ilustrada como a média ± erro padrão de culturas triplicadas. A viabilidade das células foi medida através de exclusão por azul de tripano. FIGURA 9.

Ausência de toxicidade de Smad7-as2-ODN contra LNC ativada. A LNC especifica de PLP foi obtida e cultivada conforme descrito em Materiais e Métodos. 4 x 105 de LNC foi reestimulada com 10 pg/ml de PLP e concentrações crescentes de Smad7-as2-ODN durante 96 horas. Os poços sem oligonucleótidos antisense serviram como controlos. A viabilidade das células foi medida através de coloração com iodeto de propídio na análise de fluxo citométrico (2 x 104 de LNC cada). A viabilidade de LNC é ilustrada como a média ± erro padrão de culturas triplicadas. FIGURA 10. O tratamento com Smad7-as-0DN in vivo inibe a preparação das células T autorreativas. Os ratinhos foram imunizados com 200 pg de PLP s.c. conforme descrito acima. Nos dias 7, 8 e 9, após a imunização, os ratinhos foram tratados i.p. com 100 pg de Smad7-as-ODN ou Smad7-as2-ODN no PBS, 100 pg de um Oligonucleótido PTO aleatório de controlo 5'-atg gac aat atg tct a-3' no PBS, ou um volume igual de PBS. Os gânglios linfáticos de ratinhos tratados foram colhidos no dia 10 e a proliferação de culturas de LNC foi determinada conforme descrito acima. As células de ratinhos tratados com PBS mostram uma forte proliferação especifica do antigénio em contraste com a resposta proliferativa embotada das células de ratinhos tratados com moléculas antisense (Figura 11). As células dos ratinhos tratados com ODN aleatório proliferaram na cultura mesmo sem a adição do péptido antigénico.

Figura 11 IRM in vivo 7 dias após o acidente vascular cerebral (oclusão de 90 minutos da artéria cerebral média direita) 51 em dois animais individuais tratados com 400 pmol de oligonucleótidos antisense Smad7-as2-ODN por kg de peso corporal (Fig. 11 a,b) ou com a mesma quantidade dos respetivos oligonucleótidos sense (Fig. 11 c,d; controlo de tratamento). A IRM de inversão-recuperação demonstra uma redução nítida do volume do enfarte, especialmente através da preservação do córtex cerebral, no animal tratado com Smad7-antisense. Quatro semanas após a isquemia, foram obtidas descobertas de IRM semelhantes nestes animais. Figura 12 O tratamento com Smad7-as2-ODN reduz a inflamação do SNC. Os ratinhos representativos da experiência retratada na figura 3 foram sacrificados no dia 49; as secções de parafina do cérebro e da medula espinal foram preparadas, coloridas para H.-E. e avaliadas conforme descrito em Materiais e Métodos. (a) Animal tratado com PBS, classificação de EAE 2: secção axial da parte lombar da medula espinal (obj.-ampliação 20x). (b) Animal tratado com

Smad7-mut4-as-ODN, classificação de EAE 2,5: secção longitudinal da medula espinal torácica inferior (obj.- ampliação lOx). (c) Animal tratado com Smad7-as2-ODN, classificação de EAE 0: secção axial da medula espinal lombar (obj.-ampliação: 5x).

Em (a) e (b) , é possível observar os infiltrados perivasculares típicos de EAE que consistem essencialmente em linfócitos e monócitos; em (c) não é observada nenhuma inflamação.

Figura 13 Não foi detetada nenhuma toxicidade do órgão através da avaliação histopatológica de ratinhos tratados com Smad7-as2-ODN: os ratinhos selecionados da experiência retratada na figura 3 foram sacrificados no dia 49; as secções de parafina de diversos órgãos foram preparadas, coloridas e avaliadas conforme descrito em Materiais e Métodos. A figura ilustra as secções representativas de órgãos 52 suscetíveis a toxicidade induzida por TGF-beta de um animal tratado com Smad7-as2-ODN; fígado (H.-E., obj.-ampliação 40x), baço (H.-E. (obj.-ampliação lOx) e rim (Masson-

Goldner, (obj.-ampliação 20x). Em particular, não foi detetado nenhum aumento significativo na produção de tecido conjuntivo. No rim, foram observados uma dilatação dos túbulos renais proximais e um alargamento dos espaços capsulares glomerulares nos ratinhos de todos os grupos de tratamento, o que representa um artefacto de perfusão. No baço, foram observados macrófagos multinucleados proeminentes, tal como é típico dos animais com EAE, em todos os ratinhos independentemente do tratamento. Além dos órgãos aqui ilustrados, foram examinados a pele, o gânglio linfático, o cólon, o coração e o pulmão.

Figura 14 0 Smad7-as2-ODN diminui a proliferação das células do baço mitogenicamente ativadas.

As células do baço foram obtidas a partir de ratinhos não imunizados e cultivadas conforme descrito em Materiais e Métodos utilizando 2 yg/ml de Con A para ativar policlonalmente as células T e várias concentrações de Smad7-as2-ODN ou Smad7-mut4-as-ODN durante 96 horas. Os poços sem ODN antisense ou Con A serviram como controlos. A proliferação de células do baço é ilustrada como a média ± erro padrão de culturas quadruplicadas.

Figura 15 0 Smad7-as2-ODN suprime a proliferação de células T CD4+ e CD8+ esplénicas. 10 dias após a imunização com 200 yg de PLP139-151, os baços foram dissecados e os linfócitos isolados através de Ficoll-Paque Plus. As células T CD4+ e CD8+ foram ordenadas em colunas de EM positiva utilizando microesferas magnéticas unidas a anticorpos monoclonais para CD4 ou CD8, respetivamente. As populações de células T enriquecidas (Figura 15a), células T CD4+ (Figura 15b) e CD8+ (Figura 15c) resultantes foram estimuladas através de 53 anticorpos antirratinho-CD3 ligados a placas durante 72 horas na presença de concentrações variáveis de Smad7-as2-ODN ou Smad7-mut4-as-ODN conforme descrito em Materiais e Métodos. Os poços não revestidos ou os poços sem PTO-ODN antisense, respetivamente, serviram como controlos. Os resultados são apresentados como médias aritméticas ± erro padrão a partir de culturas organizadas, pelo menos, em triplicado. Foi observado um forte efeito supressor de Smad7-as2-ODN na proliferação nas concentrações de 10 μΜ (células T enriquecidas) ou 20 μΜ (subpopulações de células T CD4+ e CD8+ T), sendo vincado nas concentrações de 20 μΜ. Figura 16

Os efeitos do tratamento com Smad7-antisense na proliferação de células T in vitro não preveem a eficácia in vivo. A LNC especifica de PLP foi obtida e cultivada conforme descrito em Materiais e Métodos durante 96 horas e com concentrações crescentes de Smad7-as2-ODN, Smad7-as3-ODN e Smad7-as4-ODN, respetivamente. Os poços sem PLP ou ODN antisense serviram como controlos. A proliferação de LNC é ilustrada como a média ± erro padrão de, pelo menos, culturas triplicadas. Todos os ODN suprimiram dependentemente da dose a proliferação (figura 16a) . Em seguida, o Smad7-as2-ODN e o Smad7-as3-ODN foram comparados relativamente ao efeito do tratamento (figura 16b) : os ratinhos naive foram injetados com 5 x 106 de LNC especifica de PLP conforme descrito em Materiais e Métodos. Foram injetados 100 pg (5 mg/kg/d) de Smad7-as2-ODN, Smad7-as3-ODN ou Smad7-mut4-as-ODN no PBS ou um volume igual de PBS diariamente a partir do dia de transferência. O Smad7-as2-ODN tem um efeito benéfico mais forte no curso clinico do que o Smad7-as3-ODN, enquanto o Smad7-mut4-as-ODN agrava os sinais de EAE (figura 16b). No grupo tratado com Smad7-mut4-as, morreram três ratinhos prematuramente durante a experiência. Por convenção, foi-lhes atribuída uma classificação de 5 no resultado de gravidade da doença até 54 ao final da experiência.

Figura 17 0 tratamento com Smad7-as2-ODN in vivo inibe as respostas de preparação antigénica. Os ratinhos imunizados com péptido PLP conforme descrito em Materiais e Métodos foram tratados com 100 yg (5 mg/kg) de Smad7-as2 ou Smad7-mut4-as-ODN ou uma quantidade igual de PBS diariamente i.p. do dia 6 ao dia 9 após a imunização. A LNC destes grupos de ratinhos foi reestimulada com antigénio durante 96 horas e utilizada para ensaios de proliferação conforme descrito em Materiais e Métodos. A LNC de ratinhos tratados com Smad7-as2-ODN durante a preparação antigénica proliferou com menos vigor na reestimulação de péptidos especifica em comparação com a LNC de ratinhos tratados com Smad7-mut4-as-ODN. Isto sugere que uma resposta imunitária primária embotada é a causa da encefalitogenicidade de LNC reduzida observada nas experiências da figura 18.

Figura 18 O tratamento com Smad7-as2-ODN in vivo suprime a indução de células T encefalitogénicas autorreativas. Os ratinhos imunizados com péptido PLP conforme descrito em Materiais e Métodos foram tratados com 100 yg (5 mg/kg) de Smad7-as2 ou Smad7-mut4-as-ODN ou uma quantidade igual de PBS diariamente i.p. do dia 6 ao dia 9 após a imunização. A LNC destes grupos de ratinhos foi subsequentemente reestimulada com antigénio durante 96 horas e utilizada para a transferência adotiva (5 x 106 de LNC por ratinho recipiente) conforme descrito em Materiais e Métodos. São ilustradas duas experiências separadas. A LNC de ratinhos tratados com Smad7-as2-ODN induziu um curso clinico altamente atenuado (figura 18a, compare o número de mortes) ou não induziu absolutamente a EAE (figura 18b).

Figura 19 O tratamento preventivo com pequenos ARNs de interferência (siARNs) específicos de Smad7 alivia os sinais clínicos de 55 EAE-ta. 5 x IO6 de LNC específica de PLP139_151, gerada conforme descrito em Materiais e Métodos, foi transferida de forma adotiva em ratinhos naive. Os ratinhos recipientes foram tratados duas vezes por dia com 20 pmol de ARNil ou ARNÍ2 ou um volume igual de PBS i.p. Os ratinhos tratados com ARNil e ARNÍ2 mostram um curso de doença aguda melhorado em comparação com os ratinhos tratados com PBS. Figura 20 O tratamento com Smad7-antisense preventivo melhora o curso clínico num segundo modelo de doença relevante para a esclerose múltipla: EAE induzida por MOG em ratos. As fêmeas de ratos DA foram imunizadas com 65 pg de MOG1-125 recombinante no CFA i.c. conforme descrito em Materiais e Métodos. Os ratos foram tratados i.p. com 5mg/kg de Smad7-as2-ODN ou Smad7-mut4-as-ODN ou uma guantidade igual de PBS (250 μΐ) diariamente a começar no dia 2 antes da imunização. O desenvolvimento de sinais clínicos é adiado nos ratos tratados com Smad7-as2-ODN em comparação com os ratos tratados com PBS.

Figura 21 0 tratamento com Smad7-as2-ODN local reduz o volume do enfarte conforme medido pela volumetria de RM após a oclusão transitória da artéria cerebral média no rato. A volumetria de enfarte RM foi efetuada para medir os volumes do enfarte nos ratos. A oclusão da artéria cerebral média foi efetuada conforme descrito em Materiais e Métodos. A infusão do ODN na artéria carótida interna foi iniciada começando com a reperfusão após a isquemia de 90 min; os ratos foram tratados com 400 pmol de Smad7-as2-ODN por kg de peso corporal (n=8) ou Smad7-sense-ODN (n=8) conforme descrito em Materiais e Métodos. A volumetria de enfarte in vivo através de IRM foi efetuada 7 dias e 3 mês após a cirurgia conforme descrito em Materiais e Métodos. Em ambos os momentos, o volume do enfarte nos ratos tratados com Smad7-as2-ODN em comparação com Smad7-sense-ODN foi 56 significativamente reduzido (7 dias: 1,18 ± 0,26 cm3 vs. 0,49 ± 0,25 cm3 (p< 0,001); 3 meses: 1,36 ± 0,42 cm3 vs. 0,60 ± 0,28 cm3, (p< 0,001 teste t de Student)).

Figura 22 0 tamanho do enfarte conforme visualizado pela IRM e a histopatologia é consideravelmente reduzido através do tratamento com Smad7-as2-ODN local após a oclusão

transitória da artéria cerebral média do rato. A imagem por RM (sequências de recuperação inversa; orientação coronal e axial) 7 dias e 3 meses após a isquemia e a histologia post mortem, incluindo a imunocoloração para GFAP (proteína ácida fibrilar glial), foi efetuada conforme descrito em Materiais e Métodos em dois ratos individuais tratados com Smad7-sense-ODN (a,b,e,f,i,j) ou Smad7-as-ODN (c,d,g,h,k,1), respetivamente. Partes desta figura correspondem à figura 11. (figura 22a = 11 c; 22b = 11 d; 22c = 11 a; 22d = 11b).

Figura 23 SEQ. ID N.° 1, ARNm Smad7 humano

As sequências-alvo de Oligonucleótidos Smad7-Antisense humano, SEQ. ID N.°s 16 a 29, estão sublinhadas e uma sequência parcialmente sobreposta, correspondente à SEQ. ID N.° 21, é ilustrada em itálico.

Figura 24 SEQ. ID N.° 2, sequência de nucleótidos Smad7 humano CDS 296..1576 /gene="SMAD7" /codão_início=l /produto="gene SMAD7 relacionado com MAD"

Figura 25 SEQ. ID N.° 3, ARNm Smad7 de ratinho

As sequências-alvo de Oligonucleótidos Smad7-Antisense de ratinho, SEQ. ID N.°s 7 a 15, estão sublinhadas e uma sequência parcialmente sobreposta, correspondente à SEQ. ID N.° 11, é ilustrada em itálico. 57

Figura 26 SEQ. ID N.° 4, sequência de Aminoácidos Smad7 de ratinho CDS 1437..2717 /gene="Madh7" /codão_início=l

Figura 27 SEQ. ID N.° 5, ARNm Smad7 de rato

As sequências-alvo de Oligonucleótidos Smad7-Antisense de rato, SEQ. ID N.°s 30 a 38, estão sublinhadas e uma sequência parcialmente sobreposta, correspondente à SEQ. ID N.° 34, é ilustrada em itálico.

Figura 28 SEQ. ID N.° 6, sequência de Aminoácidos Smad7 de rato CDS 1422..2702 /gene="Madh7" /codão_início=l

Figura 29 O tratamento com Smad7-as2-ODN, mas não com Smad7-mut4-as-ODN, suprime a expressão de ARNm Smad7 induzida por TGF-beta em células T Jurkat. As células T Jurkat foram tratadas com Smad7-as2-ODN, Smad7-mut4-AS-ODN ou PBS durante 4 horas e, em seguida, incubadas com ou sem TGF-beta durante 30 minutos. As quantidades relativas normalizadas da expressão de ARNm Smad7 foram estimadas conforme descrito em Materiais e Métodos (Exemplo 19).

Os Exemplos ilustram a invenção.

Exemplo 1: parte metodológica dos outros exemplos

Materiais e Métodos

Animais

As fêmeas de ratinhos SJUJ foram obtidas em Harlan Winkelmann (Borchen, Alemanha) e Charles River (Sulzfeld, Alemanha). Os ratinhos tinham entre 8 e 20 semanas de idade quando as experiências foram iniciadas. Todos os procedimentos foram realizados de acordo com os protocolos aprovados pela comissão de proteção dos animais na 58

Universidade de Regensburg. Os ratinhos foram alojados em gaiolas normais com acesso livre a alimentos e água; foi concedido um acesso mais fácil aos alimentos e à água aos ratinhos paralisados.

Antigénios

Um péptido substituído por serina 139-151 da proteína do proteolípido (PLP) , PLP139_151, foi preparado através da síntese da fase sólida de fluxo contínuo de acordo com a sequência para PLP murino (HSLGKWLGHPDKF SEQ. ID N.° 40) pelo Instituto de Microbiologia, Universidade de Regensburg, Alemanha. A composição de aminoácidos do péptido foi verificada através da análise de aminoácidos e a pureza foi confirmada através da espetroscopia de massa. Indução da EAE de transferência adotiva

Cada ratinho recipiente foi injetado i.v. com 5 a 30 x 106 de células de gânglios linfáticos (LNC) específicas de PLP 139-151 ativadas conforme indicado para as experiências individuais. As linhas celulares T específicas de PLP139_151 a curto prazo foram geradas através da imunização de ratinhos SJUJ s.c. em quatro locais do flanco com 200 pg de PLPi39_i51 emulsionado 1:1 com CFA contendo 800 pg e Micobactéria tuberculose H37Ra (Difco Laboratories, Detroit, Michigan, EUA) num volume total de 200 pl/animal. Depois de dez a onze dias, as células de gânglios linfáticos (LNC) derivadas de gânglios linfáticos axilares e inguinais de drenagem foram colhidas e cultivadas com 10 pg/ml de PLPi39_151 em placas de 24 poços. O meio de cultura baseou-se em RPMI 1640 (Life Technologies Inc.), complementado com 10% de soro bovino fetal inativado por calor (Biochrom KG, Berlim, Alemanha), 2 mM de L-glutamina, 100 U/ml de penicilina, 100 pg/ml de estreptomicina, 5 x 10-5 de M2-ME, 1 mM de piruvato de sódio, 12,5 mM de HEPES, e 1% de aminoácidos não essenciais (tudo de Life Technologies Inc.) de acordo com um protocolo anteriormente descrito [Rajan, 2000]. Após 96 horas, a LNC foi colhida e 59 injetada em recipientes SJUJ naive.

Avaliação clinica

Os ratinhos foram examinados diariamente relativamente a sinais de doença e classificados numa escala de gravidade crescente de 0 a 5 como se segue: 0 sem sinais; 0,5 fraqueza parcial da cauda; 1 cauda fraca ou ligeira lentidão ao endireitar-se a partir do decúbito dorsal; 1,5 cauda fraca e ligeira lentidão ao endireitar-se; 2 fraqueza parcial do membro posterior ou nítida lentidão ao endireitar-se; 2,5 arrastamento do(s) membro(s) posterior(es) sem paralisia completa; 3 paralisia completa de, pelo menos, um membro posterior; 3,5 paralisia do membro posterior e ligeira fraqueza dos membros anteriores; 4 fraqueza grave do membro anterior; 5 moribundo ou morto. Os ratinhos que obtiveram um resultado de 5 foram sacrificados. Foi definida uma recaída como um aumento contínuo de, pelo menos, um aspeto inteiro durante 2 ou mais dias depois de o animal ter melhorado anteriormente, pelo menos, um aspeto e ter estabilizado durante, pelo menos, 2 dias. 0 dia do início dos sinais clínicos, o resultado máximo médio em cada grupo de tratamento que atingiu o resultado máximo por cada animal em qualquer momento, e os resultados acumulativos de todos os animais de cada grupo de tratamento durante períodos definidos de tempo foram determinados como medições da gravidade da doença. O número de recaídas num grupo dividido pelo número de ratinhos desse grupo foi determinado como a taxa de recaídas.

Oligonucleótidos PTO Antisense e tratamento

Foram utilizados os seguintes Oligonucleótidos (ODN) fosforotioato (PTO) Smad7-antisense de cadeia única derivados de Smad-7-ARNm humano, GenBank AF010193 a começar na posição 404 a partir do fim ARNm-5': Smad-7-as-ODN, 5'-gtc gcc cct tct ccc ccg cag-3' (SEQ. ID N.° 39), Smad7- antisense-ODN 5'-gtc gcc cct tct ccc cgc ag-3' (SEQ. ID N.° 60 20), e Smad7-mut4-antisense-ODN de controlo 5'-gtc gca ccg tct cac ag cag-3' (SEQ. ID N.° 41) foram sintetizados por MWG-Biotech (Ebersberg, Alemanha) e fornecidos em forma liofilizada. Os ODN PTO foram purificados por HPSF®. A composição de aminoácidos e a pureza foram confirmadas por espetrometria de massa MALDI-TOF (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization - Time of Flight - Ionização e Dessorção a Laser Assistida por Matriz - Tempo de Voo) . Para as experiências descritas, os Oligonucleótidos PTO foram dissolvidos no PBS em 0,4 pg/pl e ajustados para pH neutro. Nas experiências do tratamento, foram injetados 100 pg de Oligonucleótidos PTO Smad7-antisense i.p. diariamente (5 mg/kg/d) , dia sim, dia não ou duas vezes por semana conforme indicado nas experiências. A distribuição para os grupos de tratamento foi efetuada através de seleção aleatória. Os ratinhos injetados com quantidades iguais de PBS ou Oligonucleótido PTO Smad7-mut4-antisense serviram como controlos.

Transferência de LNC tratada com Oligonucleótido PTO in vitro

Os ratinhos foram imunizados com 200 pg de PLP s.c. conforme descrito acima. No dia 10, os gânglios linfáticos foram colhidos e a LNC foi cultivada com 20 pM de Oligonucleótido PTO Smad7-antisense e 10 pg/ml de PLP conforme indicado acima. Após 96 horas, a LNC foi colhida e injetada em recipientes SJUJ naive.

Ensaios de proliferação de células T in vitro

As células de gânglios linfáticos de drenagem e do baço foram dissecadas a partir de animais imunizados com 200 pg de PLP139_i5i emulsionado em 200 pl de CFA com 250 pg de Micobactéria tuberculose H37Ra 10 a 11 dias antes. A LNC foi cultivada em placas de 96 poços (Corning-Costar, Cambridge, MA, EUA) em 4 x 105 de células viáveis/poço num volume total de 200 pl de meio baseado em RPMI 1640, conforme descrito acima. As células foram cultivadas a 37 61 °C em 100% de humidade e 5% de C02 na presença ou ausência de PLP139_151 numa concentração de 10 yg/ml. Foi utilizada Concanavalina A (Sigma Chemical Co. ) numa concentração de 0,2 a 0,5 yg/ml. Para determinar o efeito dos

Oligonucleótidos PTO antisense, foram adicionadas concentrações variáveis numa concentração antigénica fixa. Foram utilizados como controlos poços sem Oligonucleótidos PTO antisense ou péptido antigénico, respetivamente. A LNC foi agitada com 1 yCi de 3H-timidina (NEN Life Science Products, Boston, MA, EUA) após 72 horas, colhida em 96 horas, e a absorção de 3H-timidina foi detetada utilizando um contador de cintilação de microplacas Packard Topcount (Packard Instrument Co., Meriden, Connecticut, EUA). Os resultados são apresentados como médias aritméticas ± erro padrão a partir de culturas organizadas, pelo menos, em triplicado.

Estudos de preparação

Os ratinhos foram imunizados com 200 yg de PLP s.c. conforme descrito acima. Nos dias 7, 8 e 9, após a imunização, os ratinhos foram tratados i.p. com 100 yg de Smad7-as-ODN ou Smad7-as2-ODN no PBS, 100 yg de um

Oligonucleótido PTO aleatório de controlo 5'-atg gac aat atg tct a-3' (SEQ. ID N.° 42) no PBS, ou um volume igual de PBS. Os gânglios linfáticos de ratinhos tratados foram colhidos no dia 10 e a proliferação de culturas de LNC for determinada conforme descrito acima.

Ensaios de toxicidade e análise de fluxo citométrico A LNC preparada com PLPi39_i51 foi derivada conforme descrito acima e cultivada com ou sem 10 yg/ml de péptido PLP em placas de microtitulação de 96 poços em 4 ou 8 x 105 de células viáveis/poço em 200 yl de meio RPMI 1640, conforme descrito acima. Os Oligonucleótidos PTO Smad7-antisense foram adicionados nas concentrações crescentes. Após 96 horas, a viabilidade das células foi medida através de exclusão por azul de tripano e citometria de fluxo 62 utilizando iodeto de propídio (104 células/amostra) respetivamente. A recolha de dados e a análise foram efetuadas num citómetro de fluxo FACSCalibur (Becton Dickinson, Franklin Lakes, Nova Jersey, EUA). Os resultados são apresentados como médias aritméticas ± erro padrão a partir de culturas organizadas, pelo menos, em triplicado. Histologia

Os ratinhos selecionados foram mortos com CO2. Os tecidos do cérebro, da medula espinal, do gânglio linfático, do baço, do fígado, do rim, do cólon, do coração, do pulmão e da pele foram fixados em 4% de PFA. As secções de parafina (4 a 6 pm) foram criadas e coloridas com hematoxilina-eosina, luxol fast blue, e pelas colorações Bielschofsky e Masson-Goldner, de acordo os protocolos padrão. Pelo menos 2 secções coronais de três níveis cerebrais rostrocaudais e pelo menos 2 secções longitudinais e coronais de níveis cervicais, torácicos e lombossacrais da medula espinal foram avaliadas de modo cego. Para efetuar o rastreio relativamente ao tratamento de toxicidade, pelo menos 2 secções coronais de todos os outros tecidos foram avaliadas de modo cego por um veterinário experiente.

Análise Estatística

As diferenças nos resultados clínicos de ratinhos e proliferação celular entre grupos foram analisadas através do teste t de Student relativamente a amostras ímpares. Os valores P inferiores a 0,05 foram considerados significativos. Relativamente às parcelas, foram calculados o valor médio e o erro padrão da média (EP).

Exemplo 2: o tratamento com Smad7-antisense preventivo adia o início e alivia o curso clínico da EAE-at A EAE de transferência adotiva foi induzida nos ratinhos SJL através de injeção de LNC específica de PLPi39_ 151 ativada. A doença clínica começou após 8 a 15 dias, seguida de recuperação parcial e uma ou mais recaídas 63 (Figs. 1 a 4) . Em três experiências consecutivas, foi testado o efeito de Oligonucleótidos PTO Smad7-as (Smad7-as-ODN) in vivo no desenvolvimento de EAE-ta. A seguir à transferência de LNC, os ratinhos foram inicialmente tratados com 100 pg de Smad7-as-ODN diariamente a partir do dia 0 (5 mg/kg/d) até ao início dos sinais clínicos em cada grupo de controlo (Fig. 1). Curiosamente, o início da doença foi adiado guase duas semanas (Quadro 1) . Subsequentemente, embora não existisse nenhuma diferença na incidência de EAE, no resultado máximo por animal e na taxa de recaídas, o curso clínico foi mitigado, conforme documentado pelos resultados acumulativos da doença, em particular durante o estádio crónico da EAE (dias 61 a 90, Quadro 1, Fig. 1). QUADRO 1.

Smad7-as PBS tamanho do grupo n=7 n=7 incidência de EAE 7/7 7/7 prevalência de EAE (dia 16) 1/7 6/7 prevalência de EAE (dia 43) 5/7 7/7 prevalência de EAE (dia 90) 1/7 4/7 dia de início (média ± EP) 27,43 ± 4,28 14,29 ± 1,10 resultado máx. (média ± EP) 2,86 ± 0,24 3, 0 ± 0,59 resultado acumulativo (d 1-30) 101,5 209 resultado acumulativo (d 31-60) 220 307, 5 resultado acumulativo (d 61-90) 103,5 300,5 taxa de recaídas (média ± EP) 0,71 ± 0,33 0,57 ± 0,19 recaída (número/animais) 5/3 4/4

Efeitos do tratamento com Smad7-as-ODN preventivo no curso clínico da EAE (I) . Foram tratados grupos de sete ratinhos com 100 pg de Smad7-as-ODN (5 mg/kg/d) no PBS ou um volume igual de PBS i.p. diariamente a partir do dia de transferência até o início dos sinais clínicos no grupo de controlo. O curso clínico foi mitigado por Smad7-as-ODN, conforme indicado pelo resultado da EAE (consulte a Figura 1), os resultados acumulativos da doença e a prevalência de EAE nos dias 16, 43 e 90. Não existia nenhuma diferença na incidência de EAE, no resultado máximo médio e na taxa de recaidas. O inicio do tratamento no dia de transferência, mas com alargamento do período de tratamento durante o estádio crónico da doença, conforme indicado na Fig. 2, revelou que o efeito do tratamento é possivelmente de longa duração e pode ser dependente da dose ou da frequência de aplicação, respetivamente (Fig. 2, Quadro 2) . Apenas quando as administrações foram reduzidas de, inicialmente, todos os dias para, por fim, duas vezes por semana durante as últimas 6 semanas de observação, pareceu existir um ligeiro aumento na atividade da doença (Fig. 2) com o ratinho inicialmente doente tendo 2 recaídas e um outro um primeiro agravamento. No geral, foi observada uma redução excecional na incidência de EAE, no resultado máximo médio, no número absoluto de recaídas (2 vs. 10) e na taxa de recaídas (0,33 ± 0,30 vs. 1,67 ± 0,30) (Quadro 2). QUADRO 2.

Smad7-as PBS tamanho do grupo n=6 n=6 incidência de EAE 2/6 6/6 prevalência de EAE (dia 14) 1/6 5/6 prevalência de EAE (dia 35) 0/6 2/6 prevalência de EAE (dia 60) 2/6 6/6 resultado máx. (média ± EP) 0, 67 ± 0, 45 2, 42 + 0,14 taxa de recaidas (média ± EP) 0, 33 ± 0,30 1, 67 ± 0,30 recaída (número/animais) 2/1 - 10/6 65

Efeitos do tratamento com Smad7-as-0DN preventivo no curso clinico da EAE (II) . Foram tratados grupos de seis ratinhos com 100 pg de Smad7-as-ODN (5 mg/kg/d) ou PBS diariamente e, em seguida, reduzido para, por fim, duas vezes por semana conforme indicado na Figura 2. Foram observadas diferenças significativas entre os grupos relativamente ao resultado máximo médio (p = 0,015) e à taxa de recaídas (p = 0,018) .

Esta experiência sugeriu que um regime de tratamento de 5 mg/kg três vezes por semana é suficiente para obter uma supressão de longa duração dos sinais clínicos.

Enquanto o Smad7-as-ODN continha uma citidina adicional entre a posição 124 e 125 de Smad7-ARNm humano, o 20mer Smad7-as2-ODN não tem esta citidina. O tratamento com a molécula Smad7-as2-ODN totalmente complementar pareceu ser muito mais eficaz posteriormente em comparação com Smad7-as-ODN. Contudo, a molécula antisense que compreende um nucleótido adicional ainda pareceu ser um reagente valioso durante momentos anteriores; consulte a Fig. 3. Todavia, o Smad7-as2-ODN documentado provou ter um efeito de tratamento mais potente relativamente à incidência de EAE, ao dia de início e ao resultado máximo médio em comparação com o veículo ou Smad7-as-ODN (Quadro 3). Apesar disso, o Quadro 3 em anexo documenta claramente o potente efeito das moléculas antisense mutantes, bem como as de "tipo selvagem". O Oligonucleótido PTO Smad7-mut4-as de controlo, que é alterado em 4 nucleótidos em comparação com Smad7-as2-ODN, não teve nenhum efeito protetor no desenvolvimento da doença aguda (Figura 3) . A administração de 100 pg de Smad7-mut4-as diariamente resultou num primeiro agravamento mais prematuro, mais grave e prolongado em comparação com os grupos que recebem Smad7-as2-ODN, Smad7-as-ODN ou PBS (Quadro 3). 66 QUADRO 3. Smad7-as Smad7-as2 PBS Smad7-mut4- as tamanho do grupo n=7 n=6 n=6 n=6 incidência de EAE 6/7 5/6 5/6 5/6 prevalência de EAE (dia 12) 5/7 3/6 4/6 5/6 prevalência de EAE (dia 30) 6/7 2/6 4/6 5/6 dia de inicio (média + EP)* 10,67+0,81 15,80+3,69 10,40+1,66 8,33±1,12 resultado máx. (média ± EP) 2,36±0,37 1,67±0,35 2,58±0,61 3,25±0,68 mortes 0 0 1 2 * apenas animais doentes

Efeitos do tratamento com Smad7-as-0DN preventivo no curso clinico da EAE (III) . Foram tratados grupos de seis ratinhos com 100 pg de Smad7-as-ODN, Smad7-as2-ODN, Smad7-mut4-as-ODN de controlo mutante (5 mg/kg/d cada) ou PBS diariamente a partir do dia de transferência conforme ilustrado na Figura 3. O resultado máximo médio e a prevalência de EAE nos dias 12 e 30 foram extraordinariamente reduzidos no grupo Smad7-as2-ODN. O tratamento com Smad7-as-ODN resultou num resultado máximo médio ligeiramente reduzido sem ocorrerem quaisquer mortes relacionadas com EAE.

Histologia

O cérebro e a medula espinal dos ratinhos representativos da experiência retratada na figura 3 foram avaliados histologicamente. Os ratinhos tratados com PBS mostraram infiltrados mononucleares típicos na medula espinal e no cérebro. A extensão da inflamação do SNC correlacionou-se com os resultados clínicos, com os resultados elevados associados a muitos infiltrados densos que se estendem a partir da região submeníngea até à matéria branca. Os ratinhos tratados com Smad7-as2-ODN 67 mostraram uma inflamação do SNC menor do que os ratinhos tratados com Smad7-mut4-as-ODN ou PBS. 0 tratamento com Smad7as no pico da doença alivia o curso clinico na EAE-ta

Foi efetuada uma experiência adicional para examinar se a administração de Smad7-antisense-0DN é terapeuticamente eficaz (Fig. 4) . 0 tratamento com 100 pg de Smad7-as-ODN iniciado no pico da doença aguda e administrado uma vez por dia durante 17 dias e, em seguida, dia sim, dia não durante 17 dias diminuiu parcialmente a gravidade da doença clinica. Após 18 dias de tratamento, três de quatro ratinhos recuperaram completamente da doença clinica (Quadro 4). O resultado da EAE diminuiu significativamente entre os dias 18 e 20 (ou seja, aproximadamente 1 semana após o inicio do tratamento) e os dias 26 e 32 pós-transferência. O melhor resultado dos ratinhos tratados com Smad7-as-ODN é confirmado ao comparar os resultados acumulativos da doença dos dias 12 a 60, ou seja, o fim do periodo de observação (Quadro 4). Isto documenta o potencial terapêutico dos Oligonucleótidos PTO Smad7-as para a doença do SNC autoimune existente. QUADRO 4.

Smad7-as PBS tamanho do grupo n=5 n=5 incidência de EAE 5/5 5/5 prevalência de EAE (dia 12) 4/5 3/5 prevalência de EAE (dia 30) 1/5 5/5 prevalência de EAE (dia 50) 1/5 3/5 resultado acumulativo (d 1-12) 24 24, 5 resultado acumulativo (d 12-60) 137, 5 239,5 taxa de recaidas (média ± EP) 0,4 ± 0,22 0, 4 ± 0,22 recaída (número/animais) 2/2 2/2 68

Efeitos do tratamento com Smad7-as-0DN terapêutico no curso clinico da EAE. Foram tratados grupos de cinco ratinhos com 100 pg de Smad7-as-ODN ou PBS a começar no pico da doença (Figura 4). Após 18 dias de tratamento, 3 de 4 ratinhos doentes recuperaram clinicamente por completo. O resultado acumulativo da doença mostrou uma redução excecional no grupo Smad7-as-ODN.

Exemplo 3: a transferência de LNC tratada com Smad7-antisense in vitro não consegue induzir EAE—at

Foi igualmente investigado se o tratamento com Smad7-as-ODN interfere com a reativação de células T especificas de PLP in vitro e altera a encefalitogenicidade destas células. Por conseguinte, a LNC recentemente isolada de ratinhos SJL imunizados com PLP foi reestimulada com PLP(139-151) durante 96 horas adicionando 20 μΜ de Smad7-as-ODN. A proliferação de células cultivadas na presença de Smad7-as-ODN foi reduzida em aproximadamente 30% em comparação com as células tratadas com PBS (dados não ilustrados) . Enquanto a injeção de 5 x 106 de LNC tratada com PBS em recipientes naive induziu sinais de EAE típicos a começar no dia 9, a transferência de LNC tratada com Smad7-as-ODN não conseguiu induzir sinais clínicos durante o período de observação de 3 semanas (Fig. 5). Isto sugere que o tratamento com Smad7-as-ODN pode prevenir a reativação de células T autorreativas preparadas e bloquear as respetivas propriedades indutoras da doença.

Exemplo 4: o tratamento com Smad7-antisense diminui a proliferação de LNC ativada in vitro

Para analisar os potenciais mecanismos do efeito do tratamento, o efeito de Smad7-as-ODN foi examinado na reestimulação com antigénio de LNC preparada com PLP in vitro. A coincubação de LNC preparada e antigénio com Smad7-as2-ODN durante 96 horas suprimiu dependentemente da dose a proliferação (Fig. 6a) , ao passo que a presença de Smad7-mut4-as-ODN, que tem apenas 80% de complementaridade 69 com o ARNm Smad7, não teve absolutamente qualquer efeito na proliferação de LNC (Fig. 6b) . A redução de proliferação através de Smad7-as2-ODN foi estatisticamente bastante significativa (p<0,005) nas concentrações de 20 μΜ. O Smad7-as-ODN também inibiu potentemente a proliferação de LNC reestimulada com PLP, bem como estimulada com Con A, numa concentração apenas com 1 μΜ (Fig. 7) . O Smad7-as-ODN não teve efeitos pró- ou antiprolif erativos na LNC em repouso em concentrações baixas (Fig. 7).

Exemplo 5: ausência de toxicidade de Oligonucleótidos Smad7-antisense contra a LNC ativada in vitro

Para excluir um efeito tóxico de Smad7-as-ODN contra LNC como uma possível explicação para a taxa de proliferação altamente reduzida in vitro, foram efetuados ensaios de toxicidade com coloração com azul de tripano. Ao comparar 20 μΜ de Smad7-as-ODN com PBS adicionado a culturas de LNC reestimuladas com péptido, não foi observada nenhuma diminuição na proporção de células viáveis. Quando a LNC preparada com PLP foi reestimulada com PLP e coincubada com Smad7-as-ODN nas concentrações crescentes durante 96 horas, não foi observada nenhuma perda significativa de viabilidade das células nas concentrações até 100 μΜ (Figs. 8 e 9). Ao utilizar Smad7-as2-ODN, só foi observada uma redução de células viáveis em > 50 μΜ (100 μΜ). Este resultado foi confirmado através de análise FACS e coloração com iodeto de propídio. Mesmo em concentrações de 50 μΜ de Smad7-as2-ODN que suprimem potentemente a proliferação de células T, a viabilidade da LNC não foi significativamente afetada.

Exemplo 6: o tratamento com Smad7-ant±sense a longo prazo não provoca efeitos secundários adversos local ou sistemicamente

Os ratinhos tratados com Smad7-as-ODN ou Smad7-as2-ODN não apresentaram alterações óbvias de comportamento nem um aspeto diferente dos ratinhos de controlo, à exceção dos 70 sinais produzidos pela própria EAE. A autópsia dos animais imediatamente após a luxação cervical não apresentou nenhuns sinais de alterações patológicas. A avaliação histológica, incluindo a coloração Masson-Goldner e HE, não mostrou nenhuns sinais de maior produção de tecido conjuntivo em todos os órgãos examinados (cérebro, medula espinal, fígado, rim, baço, pulmão, coração, pele). Foram observados uma dilatação dos túbulos renais proximais e um alargamento do espaço capsular glomerular nos rins dos animais de todos os grupos de tratamento, incluindo os ratinhos tratados com PBS. Além disso, foram detetados macrófagos multinucleados proeminentes nos baços, tal como é típico da EAE, sem nenhuma diferença entre os grupos de tratamento.

Exemplo 7: preparação O tratamento com Smad7-as-ODN in vivo inibe a indução de uma resposta das células T autorreativas. As células de ratinhos tratados com PBS mostram uma forte proliferação específica do antigénio em contraste com a resposta proliferativa embotada das células de ratinhos tratados com moléculas antisense (Figura 10). As células dos ratinhos tratados com ODN aleatório proliferaram na cultura mesmo sem a adição do péptido antigénico.

Exemplo 8: o tratamento com Smad7-antisense atenua a lesão Isquémica num modelo de isquemla cerebral focal (acidente vascular cerebral)

Os efeitos biológicos da aplicação de oligonucleótido Smad-7-antisense também foram testados num modelo de roedor de isquemia cerebral focal. Após 90 minutos de oclusão do filamento intraluminal da artéria cerebral média direita em ratos adultos, 400 pmol de oligonucleótidos antisense Smad7-as2-ODN (SEQ. ID N.° 20) por kg de peso corporal ou a mesma quantidade do respetivo oligonucleótido Smad7-sense 5'-ctgcggggagaaggggcgac-3'(SEQ. ID N.° 43) como um controlo de tratamento, respetivamente, foram infundidos na artéria 71 carótida interna direita continuamente durante os primeiros 60 minutos de reperfusão. Os ratos foram submetidos a Imagem por Ressonância Magnética (IRM) após 7 dias e 4 semanas para a volumetria de enfarte in vivo. Mais tarde, os animais foram sacrificados para a avaliação histológica da lesão cerebral isquémica.

Os dados de uma série de experiências mostraram uma redução de volume do enfarte em ratos tratados com Smad7-antisense em comparação com os controlos. 0 enfarte isquémico nos ratos tratados com Smad7-antisense restringiu-se predominantemente aos gânglios basais, ao passo que o córtex cerebral sobrejacente foi bem preservado (Fig. 11). Uma vez que este padrão de lesão isquémica é muito semelhante ao observado nas recentes experiências, utilizando compostos antiapoptóticos, a interpretação preliminar destes resultados com a aplicação de Smad7-antisense na isquemia cerebral focal sustenta fortemente a ideia de que a inibição de Smad7, ou seja, o reforço dos efeitos do fator de crescimento do tumor-beta (TGF-beta), inclui efeitos neuroprotetores anti-inflamatórios e antiapoptóticos na penumbra isquémica.

Exemplo 9: parte metodológica dos outros exemplos relacionados com experiências de EAE em ratinhos

Os Materiais e Métodos são descritos para os exemplos 10 a 14 e apenas se não tiverem sido especificados no exemplo 1. Todos os procedimentos foram realizados de acordo com protocolos aprovados pela comissão de proteção dos animais na Universidade de Regensburg. Smad7-antisense-ODN

Além do Smad7-as2-ODN (SEQ. ID N.° 20) e do Smad7-as- ODN (SEQ. ID N.° 39) utilizados nos exemplos 2 a 8, foram utilizados o Smad7-as3-ODN (SEQ. ID N.° 21) e o Smad7-as4- ODN (SEQ. ID N.° 9) para as experiências do tratamento e/ou ensaios de proliferação de células T.

Ensaios de proliferação de células T 72

Os baços foram dissecados e os linfócitos isolados através de Ficoll-Paque Plus (Amersham Biosciences, Uppsala, Suécia). As células T CD4+ e CD8+ T foram selecionadas positivamente em colunas de EM utilizando microesferas magnéticas unidas a antirratinho-CD4 ou antirratinho-CD8, respetivamente (tudo em Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemanha). As populações de células T enriquecidas (Figura 17a), células T CD4+ (Figura 17b) e CD8+ (Figura 17c) resultantes foram estimuladas em placas de microtitulação revestidas com anticorpos antirratinho-CD3 (Becton Dickinson, Two Oak Park, Bedford MA, EUA) durante 72 horas na presença de concentrações variáveis de Smad7-as2-ODN ou Smad7-mut4-as-ODN conforme descrito em Materiais e Métodos. Os poços não revestidos ou os poços sem ODN PTO antisense, respetivamente, serviram como controlos. A proliferação foi medida através de absorção de 3H-timidina conforme descrito acima. Os resultados são apresentados como médias aritméticas ± erro padrão a partir de culturas organizadas, pelo menos, em triplicado.

Estudos de preparação

Os estudos de preparação descritos nas figuras 18 e 19 e no exemplo 17, respetivamente, foram efetuados de forma semelhante aos descritos na figura 10/exemplo 7. 0 tratamento de ratinhos imunizados foi efetuado entre os dias 6 e 9 pós-imunização com 100 pg de Smad7-as2-ODN ou Smad7-mut4-as-ODN ou uma quantidade igual de PBS, respetivamente. Os ratinhos foram imunizados com 200 pg de PLP s.c. conforme descrito acima. As culturas de LNC, a transferência adotiva e os ensaios de proliferação foram efetuados conforme descrito acima.

Tratamento com pequenos ARNs de interferência (siARNs) específicos de Smad7

Foram utilizados os seguintes oligonucleótidos ARN (AF015260) Smad7: 73 ARNil: nt 3-23 5'-GUUCAGGACCAAACGAUCUGC-3', (SEQ. ID N.° 44) nt 23-1 5'-GCAGAUCGUUUGGUCCUGAACAU-3'. (SEQ. ID N.° 45) ARNi2: nt 2 83-3 03 5 '-CUCACGCACUCGGUGCUCAAG-3', (SEQ. ID N.° 46) nt 303-281 5'-CUUGAGCACCGAGUGCGUGAGCG-3' (SEQ. ID N.° 47)

Os oligonucleótidos ARN foram sintetizados quimicamente num Applied Biosystems Synthesizer (Expedite 8909) utilizando protocolos padrão de Ribopharma AG, Kulmbach. Para o recozimento de siARNs, foram incubadas cadeias únicas de 20 μΜ no tampão de recozimento durante 1 min a 90 °C seguido de 1 h a 37 °C (Elbashir, 2001 a, Elbashir, 2001 b) . A começar no dia de transferência, os ratinhos SJL de EAE induzida foram injetados duas vezes por dia i.p. com 20 pmol de moléculas ARNi recozidas solubilizadas no PBS (100 pmol/ml, pH 7,4).

Exemplo 10: histopatologia do tratamento com Smad7-antisense preventivo in vivo A histopatologia do tratamento com Smad7-antisense conforme ilustrado na figura 13 in vivo já foi descrita no exemplo 2. A avaliação histopatológica dos órgãos fora do SNC, conforme ilustrado na figura 14, é descrita no exemplo 6. As figuras ilustram que o tratamento com Smad7-as2-ODN suprime a inflamação no SNC sem induzir efeitos secundários nos órgãos que não são do SNC conhecidos por serem afetados pela administração sistémica de TGF-beta ativo.

Exemplo 11: o tratamento com Smad7-antisense suprime a proliferação de células T ativadas policlonalmente in vitro

Este exemplo demonstra que o ODN antisense especifico para Smad7 inibe dependentemente da dose a resposta proliferativa associada à ativação de células T mediada pela lectina Con A e anticorpos anti-CD3 ligados a placas. Na primeira experiência, todas as populações de células do baço foram estimuladas durante 96 horas com a lectina Con A (mediando a ativação de células T policlonais) na presença de concentrações variáveis de Smad7-as2-ODN (SEQ. ID N.° 74 20) ou Smad7-mut4-as-ODN (figura 14) . Apenas o Smad7-as2-ODN (SEQ. ID N. 0 2 0 ) reduziu significativamente a proliferação. Na segunda experiência, foram utilizados anticorpos anti-CD3 ligados a placas para estimular células T enriquecidas com Ficoll, confirmando este resultado (figura 15a) . Para determinar se este efeito é limitado a células T CD4+ ou CD8+, as respetivas subpopulações foram isoladas e estimuladas com anti-CD3; o efeito antiproliferativo de Smad7-as2-ODN estende-se a ambas as células T CD4+ ou CD8+ (figuras 15b e 15c) .

Exemplo 12: efeitos do tratamento com Smad7-ant±sense in vivo

Para rastrear outro ODN antisense especifico de Smad7 potencialmente eficaz para o tratamento da doença autoimune, o Smad7-as3-ODN (SEQ. ID N.0 21) e o Smad7-as4-ODN (SEQ. ID N. 0 9) foram testados paralelamente com Smad7-as2-0DN (SEQ. ID N,° 2 0) relativamente ao respetivo efeito na proliferação de LNC especifica de PLPi39_i5i (figura 16a) . Todo o ODN testado suprimiu dependentemente da dose a proliferação, embora com alguma variabilidade entre experiências (compare o efeito de Smad7-as2-ODN nas figuras 6, 14, 15, 16) . O Smad7-as3-ODN foi um pouco menos eficaz do que o Smad7-as2-ODN na prevenção do desenvolvimento de sinais de EAE quando administrado i.p. numa dose de 5 mg/kg diariamente a partir do dia da transferência adotiva conforme descrito em Materiais e Métodos (figura 16b, quadro 5). Este exemplo complementa os resultados do exemplo 2 (quadro 3) e do exemplo 4 ao mostrar que vários ODN específicos de Smad7 suprimem a proliferação de células T numa escala semelhante, enquanto o efeito do tratamento na EAE de transferência adotiva varia entre o ODN de sequência diferente. 75

Quadro 5

Smad7-as2 Smad7-as3 Smad7- mut4-as PBS tamanho do grupo n=7 n=7 n=7 n=7 incidência de EAE 7/7 7/7 7/7 7/7 prevalência de EAE (dia 11) 2/7 3/7 7/7 7/7 dia de início (média ± EP) 12,86±0,84 11,86±0,91 9,29±0,60 9,29±0,30 resultado máx. (média ± EP) 2,36±0,17 2,5±0,17 3,93±0,36 2,71±0,14 resultado acumulativo (d 1- 167, 0 234, 0 467, 5 280, 0 28) mortes 0 0 3 (d 7, 9, 0 11)

Efeitos do tratamento preventivo com vários Smad7-antisense-ODN. No grupo tratado com Smad7-mut4-as (uma molécula antisense que não é capaz de hibridizar ou interagir especificamente com um produto de expressão de Smad7 (ARNm) ou hibridizar/interagir especificamente com uma ou mais moléculas de ácido nucleico que codificam Smad7), morreram três ratinhos prematuramente durante a experiência. Por convenção, foi-lhes atribuída uma classificação de 5 no resultado de gravidade da doença até ao final da experiência.

Exemplo 13: o tratamento com Smad7-ant±sense suprime as respostas de preparação in vivo

Este exemplo contribui para os dados do exemplo 7 ao demonstrar que as respostas de preparação antigénica in vivo das células T autorreativas são embotadas durante o tratamento com Smad7-as2-ODN e resultam em células T de encefalitogenicidade reduzida. Os ratinhos imunizados com péptido PLP foram tratados com 100 yg (5 mg/kg) de Smad7-as2 ou Smad7-mut 4-as-ODN ou uma quantidade igual de PBS diariamente i.p. do dia 6 ao dia 9 após a imunização. A LNC destes grupos de ratinhos foi subsequentemente reestimulada com antigénio durante 96 horas e utilizada para ensaios de 76 proliferação (figura 17) e indução de EAE através de transferência adotiva (5 x 106 de LNC por ratinho recipiente) (figura 18). A LNC de ratinhos tratados com Smad7-as2-ODN durante a preparação antigénica prolifera com menos vigor na reestimulação de péptidos especifica em comparação com a LNC de ratinhos não tratados ou de ratinhos tratados com Smad7-mut4-as-ODN (figura 17).

Na figura 18, são ilustradas duas experiências separadas. Em contraste com a LNC derivada de ratinhos tratados com Smad7-mut4-as-ODN ou PBS, a LNC de ratinhos tratados com Smad7-as2-ODN induziu um curso clinico altamente atenuado (figura 18a, compare o número de mortes) ou não induziu absolutamente a EAE (figura 18b). Os resultados in vitro das figuras 10 (exemplo 7) e 17 sugerem que isto se deve à inibição parcial das respostas imunitárias primárias nos ratinhos tratados com Smad7-antisense-ODN com a consequência de, na estimulação antigénica, a capacidade indutora da doença das células T resultantes ser consideravelmente comprometida.

Exemplo 14: o tratamento preventivo com pequenos ARNs de interferência (siARNs) específicos de Smad7 alivia o curso clínico na EAE-ta A eficácia do tratamento com Smad7-antisense-ODN sugere que as abordagens que visam o ARNm Smad7 ou a proteína Smad7, resultando numa redução de ARNm e/ou proteína ou respetiva inibição funcional, podem ser igualmente eficazes para o tratamento da doença in vivo. Por conseguinte, os pequenos ARNs de interferência (siARNs) específicos de Smad7 foram sintetizados e utilizados para o tratamento da EAE de transferência adotiva (figura 19, quadro 6) . O tratamento preventivo com dois destes siARNs específicos de Smad7 (ARNil, ARN i 2) resultou num melhoramento dos sinais clínicos da EAE durante a fase aguda da doença em comparação com os ratinhos tratados com 77 PBS .

Quadro 6

Smad7-ANAil Smad7-ARNi2 PBS tamanho do grupo n=7 n=7 n=7 incidência de EAE 7/7 7/7 7/7 prevalência de EAE (dia 11) 4/7 5/7 7/7 dia de inicio (média ± EP) 11,29±0,94 11,14±0,87 9,29±0,30 resultado máx. (média ± EP) 2,36±0,19 2,5±0,2 2,71±0,14 resultado acumulativo (d 1-31) 241,5 244, 5 314, 5 Mortes 0 0 0

Tratamento preventivo com pequenos ARNs de interferência (siARNs) específicos de Smad7.

Exemplo 15: parte metodológica dos exemplos relacionados com experiências de EAE em ratos

Animais:

As fêmeas de ratos Dark Agouti (ratos DA) foram obtidas em Harlan Winkelmann (Borchen, Alemanha). Os ratos tinham 13 semanas de idade quando foram utilizados para procedimentos de imunização. Os ratos foram alojados em gaiolas normais com acesso livre a alimentos e água; foi concedido um acesso mais fácil aos alimentos e à água aos ratos paralisados.

Antigénios: 0 fragmento N-terminal da glicoproteína da mielina do oligodendrócito (MOG) de rato que contém os aminoácidos 1-125 (ADNc oferecido generosamente por C. Linington, Munique) foi expressado em Escherichia coli e purificado para homogeneidade por cromatografia de quelato conforme descrito por Amor (Amor, 1994). A sequência de aminoácidos de proteína MOG de rato recombinante (AA 1-125) retratada na SEQ. ID N.° 84 compreende ainda uma etiqueta de péptido 6xHis introduzida para facilitar a purificação. A proteína purificada em 6M de ureia foi dialisada contra PBS e as preparações obtidas foram armazenadas a -20 °C. Para 78 facilitar, este fragmento MOG utilizado é designado por "MOG" no resto desta aplicação.

Indução, tratamento e avaliação de EAE induzida por MOG:

Foi preparada uma emulsão com 65 pg de MOG no PBS e um volume igual de adjuvante de Freund incompleto complementado com 400 pg de Micobactéria tuberculose (H37RA, consulte o exemplo 1) num volume de inoculação de 200 pl por rato imunizado. As imunizações foram efetuadas em ratos anestesiados de forma intradérmica na base da cauda. O tratamento com Smad7-as2-ODN ou Smad7-mut4-as-ODN ou uma quantidade igual de PBS foi efetuado conforme indicado nos exemplos 1 e 9. Os ratos foram examinados diariamente relativamente a sinais de doença e classificados numa escala de gravidade crescente de 0 a 5 como se segue: 0 sem sinais; 0,5 fraqueza parcial da cauda; 1 cauda fraca; 2 hemiparesia ou fraqueza parcial do membro posterior; 3 paralisia completa de, pelo menos, um membro posterior; 4 fraqueza grave do membro anterior; 5 moribundo ou morto. Exemplo 16: o tratamento com Smad7-antisense preventivo melhora o curso clinico de EAE induzida por MOG ativa em ratos A EAE de transferência adotiva em ratinhos SJL é um modelo para a doença do SNC autoimune humana esclerose múltipla. Por conseguinte, os resultados do tratamento conforme demonstrado nos exemplos anteriores sugerem que os tratamentos que inibem funcionalmente a proteína e/ou ARNm Smad7, tal como ODN antisense específico de Smad7, representam uma abordagem promissora para tratar a esclerose múltipla ou doenças inflamatórias autoimunes relacionadas do SNC. Para verificar esta hipótese, foi escolhido um segundo modelo de doença relevante para esclerose múltipla. Este modelo, em que a EAE é induzida por imunização com o fragmento N-terminal de MOG, difere significativamente do modelo de transferência adotiva. Com 79 a presença da desmielinização significativa e a contribuição putativa de anticorpos durante a patogénese da lesão, provavelmente representa de forma ainda mais aproximada a doença humana do que a EAE murina (Storch, 1998). Curiosamente, o tratamento com Smad7-antisense preventivo melhorou o curso clinico de EAE induzida por MOG em ratos tratados i.p. com 5mg/kg de Smad7-as2-ODN. 0 desenvolvimento dos sinais clínicos foi adiado em comparação com os ratos tratados com PBS (figura 20, quadro 7) .

Quadro 7

Smad7-as2 Smad7-mut4- as PBS tamanho do grupo n=8 n=8 n=8 incidência de EAE 5/8 6/8 6/8 prevalência de EAE (dia 14) 1/8 6/8 6/8 prevalência de EAE (dia 17) 3/8 4/8 6/8 dia de inicio (média ± EP)* 15,20±1,66 10,20+1,42 11,50±0,61 resultado máx. (média ± EP) 1,44±0,49 1,69+0,54 2,25±0,62 resultado acumulativo (d 1-17) 23,5 57, 0 80,5 * apenas animais doentes Tratamento de EAE ativa induzida por MOD

Exemplo 17: parte metodológica dos exemplos relacionados com o acidente vascular cerebral experimental

As seguintes experiências obedeceram às diretrizes da lei alemã que determina os cuidados com os animais. Os protocolos dos animais foram aprovados pelo Comité dos Cuidados Animais do governo da Baviera e pelos comités locais de ética.

Animais

Os machos de ratos Wistar adultos (peso corporal entre 250 e 270 g) foram fornecidos por Charles River (Sulzfeld, Alemanha) e foram mantidos com acesso livre a alimentos e água a 23 °C e 50% de humidade relativa durante, pelo 80 menos, 5 dias antes da cirurgia.

Cirurgia e indução de isquemia cerebral focal A anestesia foi induzida com inalação de 4% de isoflurano e, em seguida, mantida com 1,5% de isoflurano numa mistura de gás de 70% de azoto e 30% de oxigénio após a intubação endotraqueal e a ventilação mecânica através de um respirador de animal pequeno controlado por pressão. A temperatura retal foi monitorizada continuamente durante toda a experiência e mantida a 37,0 °C através da utilização de um estádio e uma lâmpada de aquecimento regulada termostaticamente por realimentação. Após a inserção de uma cânula na artéria da cauda que fornece a monitorização da tensão arterial e dos gases sanguíneos, os ratos foram colocados numa estrutura estereotáxica. O crânio foi exposto através de uma incisão mediana e foram perfurados dois orifícios com 2 mm de diâmetro para a monitorização bilateral do fluxo sanguíneo cortical local (FSCL). Ambas as zonas de fornecimento de ACM foram continuamente monitorizadas através de fluxometria laser Doppler (MBF3D, Moor Instruments, Reino Unido), e o EEG cortical foi registado em ambos os lados. Depois de ter sido realizada uma incisão mediana do pescoço, a bifurcação carótida direita foi exposta e as ramificações extracranianas da artéria carótida interna (ACI) foram ligadas e eletrocoaguladas, assistidas por um microscópio de funcionamento (Zeiss, Oberkochen, Alemanha). Subsequentemente, a artéria carótida externa (ACE) foi ligada e cortada de forma distai em relação à artéria tireóidea superior, depois de a artéria carótida comum ter sido ocluída através de um microgrampo (Biemer FD 68, Tuttlingen, Alemanha). Em seguida, foi introduzido um monofilamento de nylon 4-0 revestido de silicone na ECA e empurrado suavemente pela ACI até a respetiva ponta ocluir a origem da ACM direita (Schmid-Elsaesser et al. 1998). Por consequência, o FSCL na zona da ACM direita desceu para 81 aproximadamente 20% dos valores de base. O filamento endovascular permaneceu no devido lugar até ser permitida a reperfusão através da supressão do filamento e a remoção do microgrampo na artéria carótida comum após 90 minutos de isquemia. Dois ratos operados ficticiamente foram processados de forma idêntica, incluindo a ligação e o corte da artéria carótida externa, à exceção da oclusão do filamento intraluminal da ACM. As variáveis fisiológicas, incluindo a tensão arterial, a frequência cardiaca, os gases sanguíneos arteriais (p02, pC02, pH, excesso de base, saturação de 02) , a glicose do plasma e o hematócrito, foram registadas 15 min antes da cirurgia e subsequentemente a cada 15 min durante toda a experiência até os animais serem novamente colocados nas respetivas gaiolas.

Administração intra-arterial local de ODN antisense específico

Foram utilizados os seguintes ODN fosforotioato (PTO) de cadeia única: Smad7-as2-ODN (SEQ. ID N.° 10) e Smad7-sense-ODN (SEQ. ID N.° 43) . A infusão de ODN a começar com a reperfusão após 90 min de isquemia foi efetuada por intermédio de um cateter PE introduzido através da artéria carótida externa na artéria carótida interna e empurrado suavemente até a respetiva ponta se encontrar diretamente no início do canal carótido. Os ratos foram tratados com 400 pmol de Smad7-as2-ODN por kg de peso corporal dissolvidos em 0,9% de NaCl com pH 7,4 (100 pmol/0,5 ml durante 1 h; tratamento, n=8) ou com 400 pmol de Smad7-sense-ODN por kg de peso corporal dissolvidos em 0,9% de NaCl com pH 7,4 (100 pmol/0,5 ml durante 1 h; controlo, n=8). Imediatamente após a infusão, o cateter foi removido, seguido da ligação do coto da artéria carótida externa e da oclusão da ferida através de sutura. Após a supressão dos anestésicos voláteis e a restituição da respiração espontânea, os animais foram extubados e monitorizados 82 continuamente relativamente aos sinais vitais, à temperatura corporal e ao desempenho neurológico, antes de serem novamente colocados nas respetivas gaiolas.

Avaliação clinica

Os défices neurológicos foram classificados de acordo com Bederson et al. (1986): 0, assintomático; 1, incapacidade de estender a pata dianteira contralateral (suave); 2, andar aos circulos para o lado contralateral (moderado); e 3, não andar ou perda do reflexo de se endireitar (grave). Apenas os animais com uma classificação de défice neurológico de 2 ou superior quando extubados e conscientes foram incluídos nas etapas subsequentes do protocolo.

Medição do volume do enfarte através de IRM in vivo

Sete dias e três meses após a isquemia, os ratos foram reanestesiados para a quantificação da lesão isquémica através de IRM in vivo. As medições foram efetuadas num digitalizador 1.5 T MR (Siemens Magnetom Vision, Erlangen, Alemanha) semelhante à abordagem descrita por (Guzman, 2000) . A cabeça do rato foi colocada no orifício de uma bobina de superfície pequena (ID 5 cm) que funciona como uma bobina de volume. Foram utilizados dois tipos de sequências para digitalizar o cérebro do rato: uma sequência TSE pesada em T2 (T2: TR 2500, TE 96, ETL 7, TA 6:04, Acq 8, SL 2 mm, Gap 0, Ma 128x256, 4/8 RecFOV, FOV 84 mm) e uma sequência de inversão-recuperação pesada em Ti (IR: TR 3000, TE 60, TI 150, ETL 11, TA 5:33, Acq 10, SL 1,5 mm, Gap 0, Ma 121x256, 4/8 RecFOV, FOV 109 mm). A digitalização incluiu séries axiais e coronais de ambos os tipos de sequência (T2, IR). Um estudo completo que obedece a este protocolo durou aproximadamente 45 min do tempo de medição total. A avaliação morfométrica quantitativa da área enfartada em cada plano de IRM foi efetuada por um neurorradiologista experiente sem conhecimento dos dados experimentais, 83 utilizando um software de análise de imagem semiautomático (Image Analysis, NIH, Bethesda, MD, E.U.A.) num computador Macintosh G3. Uma vez que as sequências de inversão-recuperação permitem uma diferenciação mais clara entre o tecido enfartado e o tecido cerebral vital, as sequências IR (secções axiais e coronais) foram utilizadas para a volumetria de enfarte. Basicamente, os volumes do enfarte foram calculados em cm3 através do cálculo da soma das áreas de tecido enfartado de cada plano, multiplicada pela espessura do plano.

Histologia

Os volumes do enfarte também foram estimados semiquantitativamente através de avaliação histológica. Depois da segunda IRM, com três meses de sobrevivência e após a oclusão da ACM, os ratos foram sacrificados em anestesia profunda. Após a decapitação e a criofixação, os cérebros foram inteiramente cortados em secções coronais de 40 pm. As secções representativas da zona ACM foram montadas e coloridas com cresil violeta (coloração Nissl) ou imunocoloridas para proteína ácida fibrilar glial (GFAP; IgG de burro anticoelho 1:1000; detetado por DAB) para a estimativa da lesão isquémica através do microscópio de luz .

Análise estatística

Foi efetuada uma comparação entre grupos (Smad7-as2-ODN, Smad7-sense-ODN) através de uma análise de variância a um fator (ANOVA) com um teste Bonferroni post hoc para múltiplas comparações. Os cálculos foram efetuados através da utilização de um pacote de software (SigmaStat) num computador IBM.

Exemplo 18: o tratamento com Smad7-antisense-ODN local resulta num volume de enfarte reduzido no dia 7 e 3 meses após a isquemia cerebral focal

Imagem por ressonância magnética in vivo

Os tamanhos de lesão conforme medido pela volumetria 84 de enfarte IRM no dia 7 (3 meses) para ratos tratados com

Smad7-sense-0DN ou Smad7-as2-ODN eram de 1,32 ± 0,33 cm3 (1,55 ± 0,35 cm3) vs. 0,49 ± 0,25 cm3 (0,60 ± 0,28 cm3), respetivamente. Por conseguinte, o grau de neuroproteção nos ratos tratados com Smad7-as2 em comparação com o controlo era de 58,47% no dia 7 e 55, 88% nos três meses após a isquemia (p < 0,001) . Deste modo, o tratamento com Smad7-as foi associado a uma redução drástica da lesão isquémica em ambos os estádios agudo e crónico da isquemia cerebral focal (Figura 21).

As descobertas IRM in vivo sequenciais de dois animais representativos tratados com Smad7-sense-ODN ou Smad7-as2-ODN são ilustradas na Figura 22 a-h. Existia uma correlação próxima entre a extensão da lesão isquémica conforme demonstrado pela IRM complementar e o aspeto histológico da lesão. Inegavelmente, tanto o gânglio basal como o córtex cerebral foram significativamente mais afetados nos ratos tratados com Smad7-sense do que no grupo tratado com Smad7-as2-ODN.

Histologia A estimativa histológica semiquantitativa da lesão isquémica no espécime colorido com cresil violeta ou imunocolorido para o marcador de astrócito proteína ácida fibrilar glial (GFAP) confirmou as descobertas IRM in vivo. Os volumes de enfarte totais foram consideravelmente mais pequenos nos ratos tratados com Smad7-as2-ODN em comparação com os ratos tratados com Smad7-sense-ODN. O efeito protetor de Smad7-as2-ODN incluiu o córtex cerebral e a matéria branca subcortical, e o gânglio basal (Figura 22 i-1). Ao nível microscópico de luz, foi detetada gliose a cobrir a lesão no espécime de ambos os grupos de tratamento, mas nenhum indício de inflamação persistente 3 meses após o acidente vascular cerebral. uma

Por conseguinte, estes dados indicam que o tratamento local com ODN antisense específico de Smad7 media 85 neuroproteção significativa e reduz os volumes de enfarte após a isquemia cerebral focal. Esta proteção já foi observada após a administração de uma dose única de ODN antisense.

Exemplo 19

As células T Jurkat (ECACC N.° 88042803) cresceram no meio RPMI com 10% de FCS, lU/ml de Penicilina, 10 pg/ml de Estreptomicina e 20 mM de Glutamina. Antes do tratamento, as células foram alteradas para o meio de inanição sem FCS. Após 3 dias as células foram contadas utilizando a câmara Neubauer e colocadas em placas de 24 poços em 2 x 106 de células/poço e, em seguida, tratadas com Smad7-as2-ODN (10 μΜ) , Smad7-mut-4-AS-ODN (10 μΜ) ou PBS durante 4 horas. Depois as células foram incubadas com ou sem TGF-beta (5ng/pl) durante 30 minutos. As células foram centrif ugadas, lavadas, e uma quantidade de 1 x 107 de células foi lisada com 600 μΐ de tampão RLT de acordo com o protocolo QIAGEN RNeasy mini (Catálogo N.° 74104). Foi utilizado um total de 90 ng de ARN para a primeira etapa RT PCR, utilizando o QuantiTect SYBR Green PCR Kit de QIAGEN (Catálogo N.° 204143) utilizando primers Smad7 e, como padrão, o par de primer ARNr QuantumRNA Classic 18S de Ambion (Catálogo N.° 1716). Os primers Smad7 eram sense: 5' -ATG TTC AGG ACC AAA CGA TCT GCG-3' e antisense: 5'-AGC TGC CGC TCC TTC AGT TTC TT-3' . Para amplificação, foi utilizado o Sistema RotorGene Real Time PCR (Corbett Research), com o perfil de temperatura da primeira etapa: temperatura da transcriptase reversa 50°, 30 minutos; ativação da polimerase, 95°, 15 minutos; 45 ciclos de: temperatura de desnaturação 94°, 20 s, temperatura de recozimento 59°, 30 s, temperatura de alongamento 72°, 120 s. A medição da fluorescência foi efetuada após cada ciclo. No fim, foi efetuada uma curva de fusão (80° a 95°), foram aguardados 10 segundos e foi efetuada a medição da fluorescência para verificar a amplificação do produto PCR 86 esperado. Para medir a concentração do ADN produzido, foi utilizada uma curva padrão produzida pela amplificação de determinadas quantidades de um plasmideo Smad7 através da clonagem da região de codificação completa do ARNm Smad7 humano no vetor de clonagem pCR'4 Blunt TOPO de Invitrogen (Catálogo N.° K2875-J10). Para estimar a concentração de ARNr, foi utilizado o ARN padrão fornecido com os primers (Qiagen).

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LISTA DE SEQUÊNCIAS <110> Ribopharma AG STEINBRECHER, Andreas

<120> Inibidores Smad7 para o tratamento de doenças do SNC <13 0> F 2339 PCT <150> EP 01 12 6140.1 <151> 02-011-2001 <160> 84 <17 0> PatentIn versão <210> 1 <211> 3111 <212> ADN <213> homo sapiens <400> 1 93 ggcacgagcg gagagccgcg cagggcgcgg gccgcgcggg gtggggcagc cggagcgcag 60 gcccccgatc cccggcgggc gcccccgggc ccccgcgcgc gccccggcct ccgggagact 120 ggcgcatgcc acggagcgcc cctcgggccg ccgccgctcc tgcccgggcc cctgctgctg 180 ctgctgtcgc ctgcgcctgc tgccccaact cggcgcccga cttcttoatg gtgtgeggag 240 gtcatgttcg ctccttagca ggcaaacgac ttttctcctc gcctcctogc cccgcatgtt 300 caggaccaaa cgatctgcgc tcgtccggcg tctctggagg agccgtgcgc ccggcggcga 360 ggacgaggag gagggcgcag ggggaggtgg aggaggaggc gagctgcggg gagaaggggc 420 gacggacagc cgagcgcatg gggccggtgg cggcggcccg ggcagggctg gatgctgcct 480 gggcaaggcg gtgcgaggtg ccaaaggtca ccaccatccc cacccgccag ccgcgggcgc 540 cggcgcggcc gggggcgccg aggcggatct gaaggcgctc acgcactcgg tgctcaagaa 600 actgaaggag cggcagctgg agctgctgct ccaggccgtg gagtcccgcg gcgggacgcg 660 caccgcgtgo ctcctgctgc ccggccgcct ggactgcagg otgggcccgg gggcgcccgc 720 cggcgcgcag cctgcgcagc cgocctcgtc ctactcgctc cccctcctgc tgtgcaaagt 780 gttcaggtgg ccggatctca ggcattcctc ggaagtcaag aggctgtgtt gctgtgaatc 840 ttacgggaag atcaaccccg agctggtgtg ctgeaaeccc catcacctta gccgactctg 900 cgaactagag tctccccccc ctccttactc cagatacccg atggattttc tcaaaccaac 960 tgcagactgt coagatgctg tgccttcctc cgctgaaaca gggggaacga attatctggc 1020 ccctgggggg ctttcagatt cccaacttct tctggagcct ggggatoggt cacactggtg 1080 cgtggtggca tactgggagg agaagacgag agtggggagg ctctactgtg tccaggagcc 1140 94 94 2880 ctctctggat atcttctatg atctacctca ggggaatggc ttttgcctcg gacagctcaa 1200 ttcggacaac aagagtcagc tggtgcagaa ggtgcggagc aaaatcggct gcggcatcca 1260 gctgacgcgg gaggtggatg gtgtgtgggt gtacaaccgc agcagttacc ccatcttcat 1320 caagtccgcc acactggaca acccggactc caggacgctg ttggtacaca aggtgttccc 1380 cggtttctcc atcaaggctt tcgactacga gaaggcgtac agcctgcagc ggcccaatga 1440 ccacgagttt atgcagcagc cgtggacggg ctttaccgtg cagatcagct ttgtgaaggg 1500 ctggggtcag tgctacaccc gccagttcat cagcagctgc ccgtgctggc tagaggtcat 1560 cttcaacagc cggtagccgc gtgcggaggg gacagagcgt gagctgagca ggccacactt 1620 caaactactt tgctgctaat attttcctcc tgagtgcttg cttttcatgc aaactctttg 1680 gtegtttttt ttttgtttgt tggttggttt tcttcttctc gtcctcgttt gtgttctgtt 1740 ttgtttcgct ctttgagaaa tagcttatga aaagaattgt tgggggtttt tttggaagaa 1800 ggggcaggta tgatcggcag gacaecctga taggaagagg ggaagcagaa atccaagcac 1860 caccaaacac agtgtatgaa ggggggcggt catcatttca cttgtcagga gtgtgtgtga 1920 gtgtgagtgt gcggctgtgt gtgcacgcgt gtgcaggagc ggcagatggg gagacaacgt 1980 gctctttgtt ttgtgtctct tatggatgtc cccagcagag aggtttgcag tcccaagcgg 2040 tgtctctcct gccccttgga cacgctcagt ggggcagagg cagtacctgg gcaagctggc 2100 ggctggggtc ccagcagctg ccaggagcac ggctctgtcc ccagcctggg aaagcccctg 2160 cccctcctct ccctcatcaa ggacacgggc ctgtccacag gcttctgagc agogagcctg 2220 ctagtggccg aaccagaacc aattattttc atccttgtct tattcccttc ctgccagccc 2280 ctgccattgt agcgtctttc ttttttggcc atctgctcct ggatctccct gagatgggct 2340 tcccaagggc tgccggggca gccccctcac agtattgctc acccagtgcc ctctcccctc 2400 agcctctccc ctgcctgccc tggtgacatc aggtttttcc cggacttaga aaaccagctc 2460 agcactgcet gctcccatcc tgtgtgttaa gctctgctat taggccagca agcggggatg 2520 tccctgggag ggacatgctt agcagtcccc ttccctccaa gaaggatttg gtccgtcata 2580 acccaaggta ccatcctagg ctgacaccta actcttcttt catttcttct acaactcata 2640 cactcgtatg atacttcgac actgttctta gctcaatgag catgtttaga ctttaacata 2700 agctattttt ctaactacaa aggtttaaat gaacaagaga agcattctca ttggaaattt 2760 agcattgtag tgctttgaga gagaaaggac tcctgaaaaa aaacctgaga tttattaaag 2820 aaaaaaatgt attttatgtt atatataaat atattattac ttgtaaatat aaagacgttt 95 95 tataagcatc attatttatg tattgtgcaa tgtgtataaa caagaaaaat aaagaaaaga tgcactttgc tttaatataa atgcaaataa caaatgccaa attaaaaaag ataaacacaa gattggtgtt ttttcctatg ggtgttatca cctagctgaa tgtttttcta aaggagttta tgttccatta aacgattttt aaaatgtaca cttgaaaaaa aaaaaaaaaa a 2940 3000 3060 3111

<210> 2 <211> 426 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 2 96

Met Phe Arg Thr Lys Arg Ser Ala Leu Vai Arg Arg Leu Trp Arg Ser 15 10 15

Arg Ala Pro Gly Gly Glu Asp Glu Glu Glu Gly Ala Gly Gly Gly Gly 20 25 30

Gly Gly Gly Glu Leu Arg Gly Glu Gly Ala Ttir Asp Ser Arg Ala His 35 40 45

Gly Ala Gly Gly Gly Gly Pro Gly Arg Ala Gly Cys Cys leu Gly Lys 50 55 60

Ala Vai Arg Gly Ala Lys Gly His His His Pro His Pro Pro Ala Ala 65 70 75 80

Gly Ala Gly Ala Ala Gly Gly Ala Glu Ala Asp Leu Lys Ala Leu Thr 85 90 95

His Ser Vai Leu Lys Lys leu Lys Glu Arg Gin leu Glu Leu leu Leu 100 105 110

Gin Ala Vai Glu Ser Arg Gly Gly Thr Arg Thr Ala Cys Leu Leu Leu 115 120 125

Pro Gly Arg Leu Asp Cys Arg Leu Gly Pro Gly Ala Pro Ala Gly Ala 130 135 140

Gin Pro Ala Gin Pro Pro Ser Ser Tyr Ser Leu Pro Leu Leu Leu Cys 145 150 155 160

Lys Vai Phe Arg Trp Pro Asp Leu Arg His Ser Ser Glu Vai Lys Arg 165 170 175 97

Leu Cys Cys Cys Glu Ser Tyr Gly Lys Ile Asn Pro Glu Leu Vai Cys 180 185 190 Cys Asn Pro His His Leu Ser Arg Leu Cys Glu Leu Glu Ser Pro Pro 195 200 205 Pro Pro Tyr Ser Arg Tyr Pro Met Asp Phe Leu Lys Pro Thr Ala Asp 210 215 220 Cys Pro Asp Ala vai Pro Ser Ser Ala Glu Thr Gly Gly Thr Asn Tyr 225 230 235 240 Leu Ala Pro Gly Gly Leu Ser Asp Ser Gin Leu Leu Leu Glu Pro Gly 245 250 255 Asp Arg Ser His Trp Cys Vai Vai Ala Tyr Trp Glu Glu Lys Thr Arg 260 265 270 Vai Gly Arg Leu Tyr Cys Vai Gin Glu Pro Ser Leu Asp Ile Phe Tyr 275 280 285 Asp Leu Pro Gin Gly Asn Gly Phe Cys Leu Gly Gin Leu Asn Ser Asp 290 295 300 Asn Lys Ser Gin Leu Vai Gin Lys Vai Arg Ser Lys Ile Gly Cys Gly 305 310 315 320 Xle Gin Leu Thr Arg Glu Vai Asp Gly Vai Trp Vai Tyr Asn Arg Ser 325 330 335 Ser Tyr Pro Ile phe Ile Lys Ser Ala Thr Leu Asp Asn Pro Asp Ser 340 345 350 Arg Thr Leu Leu vai His Lys Vai“Phe Pro Gly Phe Ser Ile Lys Ala 355 360 365 Phe Asp Tyr Glu Lys Ala Tyr Ser Leu Gin Arg Pro Asn Asp His Glu 370 375 380 Phe Met Gin Gin Pro Trp Thr Gly Phe Thr Vai Gin Ile Ser Phe Vai 385 390 395 400 Lys Gly Trp Gly Gin Cys Tyr Thr Arg Gin Phe Ile Ser Ser Cys Pro 405 410 415 98

Cys Trp Leu Glu Vai Ile Phe Asn Ser Arg 420 425

<210> 3 <211> 3681 <212> ADN <213> mus musculus <400> 3 99 cgagtgcggc gcggcgagcc cccagcggcg gcagaaggac tcgagcgcca ggagagggcg 60 gacgggggac gaggaggctc cggggcgcga cgaagagagt ctccgaggaa gaggctgcga 120 gaggacaccc gggcctcctg ccgccactgt cgggtcgggg ccagcagctc atgagagcag 180 ccccggcggc cacccgcggc caggagaagg agcaccggag gcccccacac tagcctgtgc 240 cctcgggggc gagagcttgc gacccgccgg agcccgccgc cgcgccgccc tcccccgcgc 300 tgacagcccc ccggggcgca gccgccgecg cagcatcttc tgtccctgct tccccagcgc 360 ggaggaagtc cccgccgagg acctgagccc ccgggaacgc aggaggaaag accagagacrt 420 ctaaaacacc cagatacgca agattgaagc agcctagcca gacctttctg tggattaaaa 480 gaaatacgat tttttttttt tttttttggc agaagaaaag gaaaggaaga ccggctgggt 540 tcagcaagga aaaaaagggg gatgtaactc gtggatacgg tttttttccc ccacecttcc 600 aacatcttgt tttattttgt aaacattttc tcttttaaac ccgggctcca tccggtgccc 660 tccagacctc cgaggtgcga ggaggtggtg tgttttttca ttgggggctt tgcatatttt 720 ggttttgggg gttttgagag accctccaga catctcacga ggggtgaagt ctactcggtc 780 ccctcccgca agtcttcgcg tgcacagaat tcgaggagat ccggttacta aggatataga 840 agaaaaaaaa taaatcgtgc ctgccttttt tttttaattg cctgcttctc cccaccccca 900 aattaagttg cttagcaagg gggaaagagg ctttttcctc cctttagtag ctcagcctaa 960 cgtctttcgt tttttttttt tttttttttt ttttgocccc gaggatcttc catgtaggaa 1020 gccgaggctg gcgagcccga cactcgggag ecactgtagg ggggcctttt ttgggggagg 1080 cgtctaccgg ggttgcctcg gccgccccea gggaagcggc ggccgcgttc ctccagggca 1140 cgccggggcc cgaaagccgc gcagggcgcg ggccgcgccg ggtggggcag cogaagcgca 1200 gccccccgat ccccggcagg cgcccctggg cecccgcgcg cgccccggcc tctgggagac 1260 tggcgcatgc cacggagcgc ccctcgggcc gccgccgctt ctgcccgggc ccctgctgtt 1320 gctgctgtcg cctgcgcctg ctgccccaac tcggcgcccg acttcttcat ggtgtgcgga 1380 ggtcatgttc gctccttagc cggcaaacga cttttctcct cgcctcctcg ccccgcatgt 1440 100 tcaggaccaa acgatctgcg ctcgtccggc gtctctggag gagccgtgcg cccggcggcg 1500 aggacgagga ggagggcgtg gggggtggcg gcggaggagg cgagctgcgg ggagaagggg 1560 cgacggacgg ccgggcttat ggggctggtg gcggcggtgc gggcagggct ggctgctgcc 1620 tgggcaaggc agtccgaggt gccaaaggtc accaccatcc ccatccccca acctcgggtg 1680 ccggggcggc cgggggcgcc gaggcggatc tgaaggcgct cacgcactcg gtgctcaaga 1740 aactcaagga gcggcagctg gagctgctgc ttcaggccgt ggagtcccgc ggcggtacgc 1800 gcaccgcgtg cctcctgctg cccggccgec tggactgcag gctgggcccg ggggcgcccg 1860 ccagcgcgca gcccgcgcag ccgccctcgt cctactcgct ccccctcctg ctgtgcaaag 1920 tgttcaggtg gccggatctc aggcattcct cggaagtcaa gaggctgtgt tgctgtgaat 1980 cttacgggaa gatcaacccc gagctggtgt gctgcaaccc ccatcacctt agtcgactct 2040 gtgaactaga gtctccccct cctccttact ccagataccc aatggatttt ctcaaaccaa 2100 ctgcaggctg tccagatgct gtaccttcct ccgcggaaac cgggggaacg aattatctgg 2160 cccctggggg gctttcagat tcccaacttc ttctggagcc tggggatcgg tcacactggt 2220 gcgtggtggc atactgggag gagaagactc gcgtggggag gctctactgt gtccaagagc 2280 cctccctgga tatcttctat gatctacctc aggggaatgg ct 111 gcctc ggacagctca 2340 attcggacaa caagagtcag ctggtacaga aagtgcggag caagatcggc tgtggcatcc 2400 agctgacgcg ggaagtggat ggcgtgtggg tttacaaccg cagcagttac cccatcttca 2460 tcaagtccgc cacactggac aacccggact ccaggacgct gttggtgcac aaagtgttcc 2520 ctggtttctc catcaaggct tttgactatg agaaagccta çagcctgcag cggcccaatg 2580 accacgagtt catgcagcaa coatggacgg gtttcaccgt gcagatcagc tttgtgaagg 2640 gctggggcca gtgctacacc cgccagttca tcagcagctg cccgtgctgg ctggaggtca 2700 tcttcaacag ccggtagtcg gtcgtgtggt ggggagaaga ggacagggcg gatogtgagc 2760 cgagcaggcc accgttcaaa etacttgctg ctaatctttc ccgagtgatt gcttttcatg 2820 caaactcttt ggttggtgtt gttattgcca ttcattgttg gttttgtttt gttctgttct 2880 ggtttgtttt tttttttttt cctccccaag ggctgccggg acagccccag tcacagtatt 2940 gctaccccag taccctctca ggcccttcca ccgggtccca gccgtggtgg ttttttcatc 3000 aggtttctcc cagatgtgga aagtcagctc agcatcccat cccccatcct gtgtgctgag 3060 ctctgtagac cagcgagggg catcagggag ggacctgcgc agtgcccccc cttcctgctg 3120 agaagggtgt agccccgtca caacaaaggt accatccctt ggctggctcc cagcccttct 3180 101 ctcagctcat acgctcgctc gtatgatact ttgacactgt tcttagctca atgagcatgt 3240 ttagaattta acataagcta tttttctaac tacaaaggtt taaatgaaca agagaagcat 3300 tctcattgga aatttagcat tgtagtgctt tgagagagga aaggactcct taaaagaaaa 3360 aaaaagctga gatttattaa agaaaaatgt attttatgtt atatataaat atattattac 3420 ttgtaaatat aaagacgttt tataagcatc attatttatg tattgtgcaa tgtgtataaa 3480 cgagaagaat aaagaaaaga tgcactttgc tttaatataa atgtaaataa catgccaaat 3540 taaaaaaaaa aagataaaca caagattggt gtttttttct atgggtgtta tcacctagct 3600 gaatgttttt ctaaaggagt ttatgttcca ttaaacaatt tttaaaatgt taaaaaaaaa 3660 aaaaaaaaaa a 3681

<210> 4 <211> 426 <212> PRT <213> mus musculus <400> 4 102

Met Phe Arg Thr Lys Arg Ser Ala Leu Vai Arg Arg Leu Trp Arg Ser 15 10 15

Arg Ala Pro Gly Gly Glu Asp Glu Glu Glu Gly Vai Gly Gly Gly Gly 20 -25 30

Gly Gly Gly Glu Leu Arg Gly Glu Gly Ala Thr Asp Gly Arg Ala Tyr 35 40 45

Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ala Gly Arg Ala Gly Cys Cys Leu Gly Lys 50 55 60

Ala Vai Arg Gly Ala Lys Gly His His His Pro His Pro Pro Thr Ser 65 70 75 80

Gly Ala Gly Ala Ala Gly Gly Ala Glu Alà Asp Leu Lys Ala Leu Thr 85 90 95

His Ser Val Leu Lys Lys Leu Lys Glu Arg Gin Leu Glu Leu Leu Leu 100 105 110

Gin Ala Val Glu Ser Arg Gly Gly Thr Arg Thr Ala Cys Leu Leu Leu 115 120 125

Pro Gly Arg Leu Asp Cys Arg Leu Gly Pro Gly Ala Pro Ala Ser Ala 103 130 135 140

Gin Pro Ala Gin Pro Pro Ser Ser Tyr Ser Leu Pro Leu Leu Leu Cys 145 150 155 160

Lys Vai Phe Arg Trp Pro Asp Leu Arg His Ser Ser Glu Vai Lys Arg 165 170 175

Leu Cys Cys Cys Glu Ser Tyr Gly Lys Ile Asn Pro Glu Leu Vai Cys 180 185 190

Cys Asn Pro His His Leu Ser Arg Leu Cys Glu Leu Glu Ser Pro Pro 195 200 205

Pro Pro Tyr Ser Arg Tyr Pro Met Asp Phe Leu Lys Pro Thr Ala Gly 210 215 220

Cys Pro Asp Ala Vai Pro Ser Ser Ala Glu Thr Gly Gly Thr Asn Tyr 225 230 235 240

Leu Ala Pro Gly Gly Leu Ser Asp Ser Gin Leu Leu Leu Glu Pro Gly 245 250 255

Asp Arg Ser His Trp Cys Vai Vai Ala Tyr Trp Glu Glu Lys Thr Arg 260 265 270

Vai Gly Arg Leu Tyr Cys Vai Gin Glu Pro Ser Leu Asp Ile Phe Tyr 275 280 285

Asp Leu Pro Gin Gly Asn Gly Phe Cys Leu Gly Gin Leu Asn Ser Asp 290 295 300

Asn Lys Ser Gin Leu Vai Gin Lys Vai Arg Ser Lys Ile Gly Cys Gly 305 310 315 320

Ile Gin Leu Thr Arg Glu Vai Asp Gly Vai Trp Vai Tyr Asn Arg Ser 325 330 335

Ser Tyr Pro Ile Phe Ile Lys Ser Ala Thr Leu Asp Asn Pro Asp Ser 340 345 350

Arg Thr Leu Leu Vai His Lys Vai Phe Pro Gly Phe Ser Ile Lys Ala 355 360 365 104

Phe Asp Tyr Glu Lys Ala Tyr Ser Leu Gin Arg Pro Asn Asp Eis GlU 370 375 380 Phe Mefc Gin Gin Pro Trp Thr Gly Phe Thr Vai Gin ile Ser Phe Vai 385 390 395 400 Lys Gly Trp Gly Gin Cys Tyr Thr Arg Gin Phe Ile Ser Ser Cys Pro 405 410 415 Cys Trp Leu Glu Vai Ile Phe Asn Ser Arg 420 4 25 <2 10> 5 <2 11> 431 1 <2 12> ADN <2 13> rattus norveg icus <4 00> 5 105 tgagtgcggc gcggcgagcc cccagcggcg gcagaaggac tcgagcgcca ggagagggcg 60 gacgggggac gaggaggctc ccgggcgcga cgaagagagt ctcggaggaa gaggctgcga 120 gaggacaccc gggcctcctg ccgccactgt cgggtcgggg ccagcagctt atgcgagcag 180 ccccagcgac caccctcggc caggagaagg ggcaccggca gcccccacgc tagctagcct 240' gccgcctgtg ccctcggggg cgagagcttg cgacccgccg gagcccgccg ccgcgccgcc 300 ctcccccgcg ctgacagccc cccggggcgc agccgccgcc gcagcatctt ctgtccctgc 360 ttccccagcg cggaggaagt ccccgccgag gacctgggcc cccgggagcg caggaggaaa. 420 gaccagagac tctaaaacac ccagatacgc aagattgaag cagcctaacc agacctttct 480 gtggattaaa agaaatacga tttttttttt gacagaagaa aaggaaagga agaccggcgg 540 ggttcagcaa ggaaaaaaag gggatgtaac tcgtggatac ggtttttccc cccaccçttc 600 caacatcttg ttctactttg taaacatttt ctctttttaa accccggetc catccggtgc 660 cctccagacc tccgaggtgc gagaaggtgg tgtgtttttt cactgggggc tttgcatatt 720 tggttttggg gtttttgaga gaccctccag acatctcacg aggggtgaag tctactcggc 780 cccctccctc aagtcttcgc gtgcacagaa ttcgaggaga tccggttact aaggatatag 840 aagaaaaaaa taaatcgtgt gcctgccttt ttttttttta attgcctgct tctccccacc 900 cccaaattaa gttgcttagc gaggcttttt cctcecttca gtagctcagc 960 ctaacgtctt tcgttttttg cccctgagga tcttccatgt aggaagccga ggctggcgag 1020 ccogacactc gggagccact gtaggggggc ctttttgggg agaggcgtcg accggggctg 1080 cctcggccgc ccccagggaa gcggcggccg cgttcctcag gggcacgccg gggcccgaga 1140 106 106 2880 gccgcgcagg gcgcgggccg cgccgggtgg ggcagccgaa gcgcaggccc ccgatccccg 1200 gcgggcgccc ctgggccccc gcgcgcgccc cggcctccgg gagactggcg catgccacgg 1260 agcgcccctc gggccgccgc cgcttctgcc cgggcccctg ctgttgttgc tgtcgcctgc 1320 gcctgctgcc ccaactcggc gcccgacttc ttcatggtgt gcggaggtca tgttcgctcc 1380 ttagccggca aacgactttt ctcctcgcct cctcgccccg catgttcagg accaaacgat 1440 ctgcgctcgt ccggcgtctc tggaggagce gtgcgcccgg cggcgaggac gaggaggagg 1500 gcgtgggggg tggcggcggc ggaggcgacc tgcggggaga aggggcgacg gacggccggg 1560 cttatggggc tggtggcggc ggtgcgggca gggctggctg ctgcctgggt aaggcagtcc 1620 gaggtgccaa aggtcaccac catccccatc ccccatcctc gggtgccggg gcggccgggg 1680 gcgccgaggc ggatctgaag gcgctcacgc actcggtgct caagaaactc aaggagcggc 1740 agctggagct gctgcttcag gccgtggagt cccgcggcgg tacgcgcacc gogtgcctcc 1800 tgctgcccgg ccgcctggac tgcaggctgg gcccgggggc gcccgccagc gcgcagcccg 1860 cçcagccgcc ctcgtcctac tcgctccccc tcctgctgtg caaagtgttc aggtggccgg 1920 atctcaggca ttcctcggaa gtcaagaggc tgtgttgctg tgaatcttac gggaagatca 1980 accccgagct ggtgtgctgc aacccccatc accttagtcg actctgtgaa ctagagtctc 2040 cccctcctcc ttactccaga tacccgatgg attttctcaa accaactgca gactgtccag 2100 acgctgtacc ttcctccgat gaaaccgggg gaacgaatta tctggcccct ggggggcttt 2160 cagattccca acttcttctg gagcctgggg atcggtcaca ctggtgcgtg gtggcatact 2220 gggaggagaa gactcgagtg gggaggctct actgtgtcca agagccctcc ctggatatct 2280 tctatgatct acctcagggg aatggctttt gcctcggaca gctcaattcg gacaacaaga 2340 gtcagctggt acagaaagtg aggagcaaga tcggctgtgg catccagctg acaagggaag 2400 tggatggcgt gtgggtttac aaccgcagca gttaccccat cttcatcaag tccgccacac 2460 tggacaaccc ggactccagg acgctgttgg tgcacaaagt gttccctggt ttctccatca 2520 aggcttttga ctatgaaaag gcctacagcc tgcagcggcc caatgaccac gagttcatgc 2580 agcagccatg gaogggcttc accgtgcaga ttagcttcgt gaagggctgg ggccagtgct 2640 acacccgcca gttcatcagc agttgcccgt gctggctgga ggtcatcttc aacagccggt 2700 agtctcccgg1 tgtggggaga agaggacagg acggaggggt gagccgagca ggccaccgtt 2760 caaactactt gctgctaatc tttcatgcaa aactctttcg gtcggttttg ttgtttgcca 2820 ttcattgttg gttctgtttt gttttgtttt cctttttttt ttttcttcct tcttcttttt 107 cctcctttct tgtcactctt gtgtcctgtg tgtctcgttc tttgagaaaa tatgatgcgg 2940 atttttggtt gtgtgttttt ttttttcgtt tgtttgtttg ttgttgttgt ttgtgttttg 3000 aggtggtggt gggtgcggtt ggcaggacac occgatacaa aaacgggaag caagagtcag 3060 cactgccaag cgtggtgtgc gaaagtgggt accaccttcc cctttggatc agcatttcag 3120 ttgtcagtgt gtgtgtgtga ggggggtgta cgtgaatgac agatggggga atggcgtgct 3180 ttttttgtgt tctttatgga tgtccccagc tgagaggctt gcagttccaa gctgtgtgtc 3240 tctcactgtg tgtctctctc atgagccttt cggacatgct cggtggggca gaggctgtac 3300 ctgggcagac tggcagcagg tgtcccagea ggtgccgagc tctgctccgc tgaagctccc 3360 ccgcccccgc ccccttcccc acaggacacg ggcctatcca caggcttctg agaagccagc 3420 ctgctagaag gctgaaccag aaccaattgt tttcatccct gtottactgc ctoctgtcac 3480 cegctgccat tgtcgaaggc tgtctttttt ggccatctgc tcctggatct ctcttgagat 3540 gggcttcoca agggctgccg ggacagcccc agtcacagta ttgctacccc agtaccttct 3600 caggcccttc caccggtccc agccgtggtt ttttcatcag gtttctccca gatctggaaa 3660 gtcagctcag caccccatcc cooagoctgt gtgctgagct ctgtagacca gcgaggggca 3720 tcagggaggg acctgctcag tgcccaccca cccccccttc ccgctgagaa gggtgtagec 3780 ccgtcataac aaaggtacca tcgtaggctg gctcccagcc cttctctcgg ctcatacact 3840 cgtatgatac tctgacactg ttcttggctc aatgagcatg ctcacacttt aatataagct 3900 atttttctaa ctacaaaggt ttaaatgaac aagagaggcg ttctcatcgg aaatttagca 3960 tcgtagtgct ttgagagagg aaaggactcc ttaaaagaga aaaaaaaaag ctgagattta 4020 ttaaagaaaa aaatgtattt tatgttatat ataaatatat tattacttgt aaatataaag 4080 acgttttata agcatcatta tttatgtatt gtgcaatgtg tataaacgag aataaagaaa 4140 agatgcactt tgctttaata taaacgcaaa taacatgcca aattaaaaaa aaaaaagata 4200 aacacaagat tggtgttttt ttctatgggt gttatcacct agctgaatgt ttttctaaag 4260 gagtttatgt tccattaaac aatttttaaa atgtataaaa aaaaaaaaaa a 4311

<210> 6 <211> 426 <212> PRT <213> rattus norvegicus <400> 6 108

Met Phe Arg Thr Lys Arg Ser Ala Leu Vai Arg Arg Leu Trp Arg Ser 1 5 10 15

Arg Ala Pro Gly Gly Glu Asp Glu Glu Glu Gly Vai Gly Gly Gly Gly 20 25 30 Gly Gly Gly Asp Leu Arg Gly Glu Gly Ala Thr Asp Gly Arg Ala Tyr 35 40 45 Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ala Gly Arg Ala Gly Cys Cys Leu Gly Lys 50 55 60 Ala Vai Arg Gly Ala Lys Gly His His His Pro His Pro Pro Ser Ser 65 70 75 80 Gly Ala Gly Ala Ala Gly Gly Ala Glu Ala Asp Leu Lys Ala Leu Thr 85 90 95 His Ser Vai Leu Lys Lys Leu Lys Glu Arg Gin Leu Glu Leu Leu Leu 100 105 110 Gin Ala Vai Glu Ser Arg Gly Gly Thr Arg Thr Ala Cys Leu Leu Leu 115 120 125 Pro Gly Arg Leu Asp Cys Arg Leu Gly Pro Gly Ala Pro Ala Ser Ala 130 135 140 Gin Pro Ala Gin Pro Pro Ser Ser Tyr Ser Leu Pro Leu Leu Leu Cys 145 150 155 160 Lys Vai Phe Arg Trp Pro Asp Leu Arg His Ser Ser Glu Vai Lys Arg 165 170 175 Leu Cys Cys Cys Glu Ser Tyr Gly Lys Ile Asn Pro Glu Leu Vai Cys 180 185 190 Cys Asn Pro His His Leu Ser Arg Leu Cys Glu Leu Glu Ser Pro Pro 195 200 205 Pro Pro Tyr Ser Arg Tyr Pro Met Asp Phe Leu Lys Pro Thr Ala Asp 210 215 220 Cys Pro Asp Ala Vai Pro Ser Ser Asp Glu Thr Gly Gly Thr Asn Tyr 225 230 235 240

Leu Leu Leu Glu Pro Gly 255

Leu Ala Pro Gly Gly Leu Ser Asp Ser Gin 245 250 109

Asp Arg Ser His Trp Cys Vai Vai Ala Tyr Trp Glu Glu Lys Thr Arg 260 265 270

Vai Gly Arg Leu Tyr Cys Vai Gin Glu Pro Ser Leu Asp Ile Phe Tyr 275 280 285

Asp Leu Pro Gin Gly Asn Gly Phe Cys Leu Gly Gin Leu Asn Ser Asp 290 295 300

Asn Lys Ser Gin Leu Vai Gin Lys Vai Arg Ser Lys Ile Gly Cys Gly 305 310 315 320

Ile Gin Leu Thr Arg Glu Vai Asp Gly Vai Trp Vai Tyr Asn Arg Ser 325 330 335

Ser Tyr Pro Ile Phe Ile Lys Ser Ala Thr Leu Asp Asn Pro Asp Ser 340 345 350

Arg Thr Leu Leu Vai His Lys Vai Phe Pro Gly Phe Ser Ile Lys Ala 355 360 365

Phe Asp Tyr Glu Lys Ala Tyr Ser Leu Gin Arg Pro Asn Asp His Glu 370 375 380

Phe Met Gin Gin Pro Trp Thr Gly Phe Thr Vai Gin Ile Ser Phe Vai 385 390 395 400

Lys Gly Trp Gly Gin Cys Tyr Thr Arg Gin Phe Ile Ser Ser Cys Pro 405 410 415

Cys Trp Leu Glu Vai Ile Phe Asn Ser Arg 420 425

<210> 7 <211> 18 <212> ADN <213> mus musculus <400> 7 cttcggctgc cccacccg 18 110 <210> 8 <211> 19 <212> ADN <213> mus musculus <400> 8 atcgtttggt cctgaacat <210> 9 <211> 18 <212> ADN <213> mus musculus <400> 9 ccctcctcct cgtcctcg <210> 10 <211> 20 <212> ADN <213> mus musculus <400> 10 gtcgcccctt ctccccgcag <210> 11 <211> 18 <212> ADN <213> mus musculus <4 0 0> 11 gccgtccgtc gccccttc <210> 12 <211> 18 111

<212> ADN <213> mus musculus <400> 12 agcaccgagt gcgtgagc 1<

<210> 13 <211> 18 <212> ADN <213> mus musculus <400> 13 agttcacaga gtcgacta

<210> 14 <211> 18 <212> ADN <213> mus musculus <400> 14 ggcaaaagcc attcccct 1<

<210> 15 <211> 18 <212> ADN <213> mus musculus <400> 15 gccgatcttg ctccgcac

<210> 16 <211> 18 <212> ADN <213> homo sapiens 112 <400> 16 ctccggctgc cccacccc 18 <210> 17 <211> 18 <212> ADN <213> homo sapiens <4 0 0> 17 cgaacatgac ctccgcac 18 <210> 18 <211> 19 <212> ADN <213> homo sapiens <4 0 0> 18 atcgtttggt cctgaacat 19 <210> 19 <211> 18 <212> ADN <213> homo sapiens <4 0 0> 19 ccctcctcct cgtcctcg 18 <210> 20 <211> 20 <212> ADN <213> homo sapiens <400> 20 gtcgcccctt ctccccgcag 20 113

<210> 21 <211> 18 <212> ADN <213> homo sapiens <400> 21 gctgtccgtc gccccttc 18 <210> 22 <211> 18 <212> ADN <213> homo sapiens <400> 22 agcaccgagt gcgtgagc 18 <210> 23 <211> 18 <212> ADN <213> homo sapiens <400> 23 agttcgcaga gtcggcta 18 <210> 24 <211> 18 <212> ADN <213> homo sapiens <400> 24 ggcaaaagcc <210> 25 <211> 18 <212> ADN attcccct 18 114 <213> homo sapiens <4 0 0> 25 gccgattttg ctccgcac 18 <210> 26 <211> 18 <212> ADN <213> homo sapiens <400> 26 ctgccccttc ttccaaaa 18 <210> 27 <211> 18 <212> ADN <213> homo sapiens <400> 27 actcacacac actcctga 18 <210> 28 <211> 18 <212> ADN <213> homo sapiens <400> 28 Γ+ ο ο ο aggta ctgcctct 18 <210> 29 <211> 18 <212> ADN <213> homo sapiens <400> 29 115 gagatccagg agcagatg 18 <210> 30 <211> 18 <212> ADN <213> rattus norvegicus <400> 30 cttcggctgc cccacccg 18 <210> 31 <211> 19 <212> ADN <213> rattus norvegicus <400> 31 atcgtttggt cctgaacat 19 <210> 32 <211> 18 <212> ADN <213> rattus norvegicus <400> 32 ccctcctcct cgtcctcg 18 <210> 33 <211> 20 <212> ADN <213> rattus norvegicus <400> 33 gtcgcccctt ctccccgcag 20 <210> 34 116 <211> 18 <212> ADN <213> rattus norvegicus <400> 34 gccgtccgtc gccccttc 18 <210> 35 <211> 18 <212> ADN <213> rattus norvegicus <400> 35 agcaccgagt gcgtgagc 18 <210> 36 <211> 18 <212> ADN <213> rattus norvegicus <400> 36 agttcacaga gtcgacta 18 <210> 37 <211> 18 <212> ADN <213> rattus norvegicus <400> 37 ggcaaaagcc attcccct 18 <210> 38 <211> 18 <212> ADN <213> rattus norvegicus 117 <400> 38 gccgatcttg ctcctcac 18

<210> 39 <211> 21 <212> ADN <213> homo sapiens <400> 39 gtcgcccctt <210> 40 <211> 13 <212> PRT ctcccccgca g 21 <213> mus musculus <400> 40

His Ser Leu Gly Lys Trp Leu Gly His Pro Asp Lys Phe

1 5 10 <210> 41 <211> 20 <212> ADN <213> mus musculus <400> 41

gtcgcaccgt ctcacagcag 20 <210> 42 <211> 15 <212> ADN <213> mus musculus 118 <400> 42 atggacaata tgtct 15 <210> 43 <211> 20 <212> ADN <213> rattus norvegicus <400> 43 ctgcggggag aaggggcgac 20 <210> 44 <211> 21 <212> ARN <213> homo sapiens <400> 44 guucaggacc aaacgaucug c 21 <210> 45 <211> 23 <212> ARN <213> homo sapiens <400> 45 gcagaucguu ugguccugaa cau 23 <210> 46 <211> 21 <212> ARN <213> homo sapiens <400> 46 cucacgcacu cggugcucaa g 21 119 <210> 47 <211> 23 <212> ARN <213> homo sapiens <4 0 0> 47 cuugagcacc gagugcguga gcg 23 <210> 48 <211> 21 <212> ARN <213> homo sapiens <4 0 0> 48 cucggcgccc gacuucuucu u 21 <210> 49 <211> 21 <212> ARN <213> homo sapiens <400> 49 gaagaagucg ggcgccgagu u 21 <210> 50 <211> 21 <212> ARN <213> homo sapiens <400> 50 acgacuuuuc uccucgccuu u 21

<210> 51 <211> 21 <212> ARN 120 <213> homo sapiens <4 0 0> 51 aggcgaggag aaaagucguu u 21 <210> 52 <211> 21 <212> ARN <213> homo sapiens <400> 52 acgaucugcg cucguccggu u 21 <210> 53 <211> 21 <212> ARN <213> homo sapiens <400> 53 ccggacgagc gcagaucguu u 21 <210> 54 <211> 21 <212> ARN <213> homo sapiens <400> 54 ggcgcucacg cacucggugu u 21 <210> 55 <211> 21 <212> ARN <213> homo sapiens <400> 55 121 caccgagugc gugagcgccu u 21 <210> 56 <211> 21 <212> ARN <213> homo sapiens <400> 56 ggagcggcag cuggagcugu u 21 <210> 57 <211> 21 <212> ARN <213> homo sapiens <400> 57 cagcuccagc ugccgcuccu u 21 <210> 58 <211> 21 <212> ARN <213> homo sapiens <400> 58 aguguucagg uggccggauu u 21 <210> 59 <211> 21 <212> ARN <213> homo sapiens <400> 59 auccggccac cugaacacuu u 21 <210> 60 122 <211> 21 <212> ARN <213> homo sapiens <400> 60 gucaagaggc uguguugcuu <210> 61 <211> 21 <212> ARN <213> homo sapiens <400> 61 agcaacacag ccucuugacu <210> 62 <211> 21 <212> ARN <213> homo sapiens <400> 62 gaggcugugu ugcugugaau <210> 63 <211> 21 <212> ARN <213> homo sapiens <400> 63 uucacagaca cacagccucu <210> 64 <211> 21 <212> ARN <213> homo sapiens 123 <400> 64 ucuuacggga agaucaaccu u 21 <210> 65 <211> 21 <212> ARN <213> homo sapiens <400> 65 gguugaucuu cccguaagau u 21 <210> 66 <211> 21 <212> ARN <213> homo sapiens <400> 66 gaucaacccc gagcuggugu u 21 <210> 67 <211> 21 <212> ARN <213> homo sapiens <400> 67 21 caccagcucg ggguugaucu u 21 <210> 68 <211> 21 <212> ARN <213> homo sapiens <400> 68 21 ccccgagcug gugugcugcu u 21 124

<210> 69 <211> 21 <212> ARN <213> homo sapiens <400> 69 21 gcagcacacc agcucggggu u 21 <210> 70 <211> 21 <212> ARN <213> homo sapiens <400> 70 21 cgaauuaucu ggccccuggu u 21 <210> 71 <211> 21 <212> ARN <213> homo sapiens <400> 71 21 ccaggggcca gauaauucgu u 21 <210> 72 <211> 21 <212> ARN <213> homo sapiens <400> 72 21 cuucuucugg agccuggggu u 21

<210> 73 <211> 21 <212> ARN 125 <213> homo sapiens <400> 73 21 ccccaggcuc cagaagaagu u 21 <210> 74 <211> 21 <212> ARN <213> homo sapiens <400> 74 uggcuuuugc cucggacagu u <210> 75 <211> 21 <212> ARN <213> homo <400> 75 sapiens cuguccgagg caaaagccau u

<210> 76 <211> 21 <212> ARN <213> homo sapiens <400> 76 uucggacaac aagagucagu u <210> 77 <211> 21 <212> ARN <213> homo sapiens <400> 77 126 cugacucuug uuguccgaau u <210> 78 <211> 21 <212> ARN <213> homo sapiens <400> 78 ccgcagcagu uaccccaucu u <210> 79 <211> 21 <212> ARN <213> homo sapiens <400> 79 gaugggguaa cugcugcggu u <210> 80 <211> 21 <212> ARN <213> homo sapiens <400> 80 guccgccaca cuggacaacu u 21 <210> 81 <211> 21 <212> ARN <213> homo sapiens <400> 81 guuguccagu guggcggacu u 21 <210> 82 127

<211> 21 <212> ARN <213> homo sapiens <400> 82 cccggacucc aggacgcugu u 21 <210> 83 <211> 21 <212> ARN <213> homo sapiens <400> 83 cagcguccug <210> 84 <211> 131 <212> PRT gaguccgggu u 21 <213> rattus norvegicus <400> 84 128 128 GXy Gin Phe Arg Vai Ile Gly 1 5 Gly Asp Glu Ala Glu Leu Pro

Pro Gly His Pro Ile Arg Ala Leu Vai 10 15

Cys Arg Ile Ser Pro Gly Lys Asn Ala 20 25 30

Thr Gly Met Glu Vai Gly Trp Tyr Arg Ser Pro Phe Ser Arg Vai Vai 35 40 45

His Leu Tyr Arg Asn Gly Lys Asp Gin Asp Ala Glu Gin Ala Pro Glu 50 55 60

Tyr Arg Gly Arg Thr Glu Leu Leu Lys Glu Ser Ile Gly Glu Gly Lys 65 70 75 80

Vai Ala Leu Arg Ilè Gin Asn Vai Arg Phe Ser Asp Glu Gly Gly Tyr 85 90 95

Thr Cys Phe Phe Arg Asp His Ser Tyr Gin Glu Glu Ala Ala Vai Glu 100 105 110

Leu Lys Vai Glu Asp Pro Phe Tyr Trp Ile Asn Pro Gly His His His 115 120 125

His His His 130 129

DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de documentos referidos pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, o IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.

Documentos de patente referidos na descrição WO 9730065 A [0009] WO 9853068 A [0010] WO 0153313 A [0011] WO 0121794 A [0012] WO 0077168 A [0012] WO 9845467 A [0014] WO 0116604 A [0014] EP 0963376 A [0046] WO 9825947 A [0046] WO 0002911 A [0046] US 6004746 A [0046] US 5541109 A [0046] US 5525490 A [0046] WO 9951741 A [0046] WO 0017221 A [0046] WO 0014271 A [0046] WO 0005410 A [0046] • WO 02055693 A [0057] • US 6159697 A [0070] [0072] • EP 01126140 A [0149]

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Claims (6)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Um inibidor específico da função ou expressão de Smad7 para utilização na prevenção, na melhoria ou no tratamento de esclerose múltipla ou isquemia cerebral, em que o referido inibidor especifico é selecionado a partir do grupo que consiste em anticorpos intracelulares ou fragmentos de anticorpo, aptâmeros, intrâmeros, ARNi e moléculas antisense anti-Smad7.

2. Utilização de um inibidor específico da função ou expressão de Smad7 para a preparação de uma composição farmacêutica para prevenção, melhoria ou tratamento de esclerose múltipla ou isquemia cerebral, em que o referido inibidor específico é selecionado a partir do grupo que consiste em anticorpos intracelulares ou fragmentos de anticorpo, aptâmeros, intrâmeros, ARNi e moléculas antisense anti-Smad7.

3. 0 inibidor para a utilização de acordo com a reivindicação 1 ou a utilização de acordo coma reivindicação 2, em que a referida molécula antisense anti-Smad7 compreende uma molécula de ácido nucleico que é a cadeia complementar de uma cadeia complementar inversa da região codificante de Smad7.

4. 0 inibidor para a utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que a referida molécula antisense anti-Smad7 compreende uma molécula de ácido nucleico selecionada a partir do grupo que consiste na molécula de ácido nucleico cttcggctgccccacccg, atcgtttggtcctgaacat, ccctcctcctcgtcctcg, gtcgccccttctccccgcag, gccgtccgtcgccccttc, agcaccgagtgcgtgagc, agttcacagagtcgacta, ggcaaaagccattcccct, gccgatcttgctccgcac, ctccggctgccccacccc, cgaacatgacctccgcac, 2 atcgtttggtcctgaacat, ccctcctcctcgtcctcg, gtcgccccttctccccgcag, gctgtccgtcgccccttc, agcaccgagtgcgtgagc, agttcgcagagtcggcta, ggcaaaagccattcccct, gccgattttgctccgcac, ctgccccttcttccaaaa, actcacacacactcctga, tgcccaggtactgcctct, gagatccaggagcagatg, cttcggctgccccacccg, atcgtttggtcctgaacat, ccctcctcctcgtcctcg, gtcgccccttctccccgcag, gccgtccgtcgccccttc, agcaccgagtgcgtgagc, agttcacagagtcgacta, ggcaaaagccattcccct, gccgatcttgctcctcac, e gtcgccccttctcccccgcag.

5. 0 inibidor para a utilização ou a utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o referido ARNi é um siARN.

6. 0 inibidor para a utilização ou a utilização de acordo com a reivindicação 5, em que o referido siARN é selecionado a partir do grupo que consiste em: ARNi: nt 3-23 5'- -GU nt 23-1 5'- -GC. ARNÍ2: nt 283-303 5' nt 303-281 5' ARNÍ3: nt 209-227 5' nt 227-207 5' ARNi4: nt 266-284 5' nt 284-264 5' ARNi5: nt 310-328 5' nt 328-308 5' ARNÍ6: nt 574-592 5' nt 592-572 5' ARNi7: nt 607-625 5' nt 625-605 5' ARNi8: nt 778-796 5' nt 796-776 5' ARNi9: nt 815-833 5' nt 833-813 5' 3 ARNilO: nt 820-838 5 nt 838-818 5 ARNill: nt 839-857 5 nt 857-837 5 ARN i12 : nt 850-868 5 nt 868-848 5 ARN i13 : nt 856-874 5 nt 874-854 5 ARN i14 : nt 1008-1026 nt 1026-1006 ARN i15 : nt 1046-1064 nt 1064-1044 ARN i16 : nt 1177-1195 nt 1195-1175 ARN i17 : nt 1201-1219 nt 1219-1199 ARN i18 : nt 1297-1315 nt 1315-1295 ARN i19 : nt 1324-1342 nt 1342-1322 ARN i 2 0 : nt 1342-1360 nt 1360-1340 7. 0 inibidor para a utilização ou a utilização de acordo com a reivindicação 1, em que a referida esclerose múltipla é esclerose múltipla recorrente e remitente, esclerose múltipla progressiva secundária, esclerose múltipla progressiva crónica primária, neuromielite ótica ou esclerose múltipla fulminante. 8. 0 inibidor para a utilização ou a utilização de acordo com a reivindicação 1, em que a referida isquemia cerebral é isquemia cerebral focal, isquemia cerebral global ou lesão cerebral hipóxica-isquémica.