PT1196560E

PT1196560E - Receptor de factores neurotróficos gfr-alfa-4

Info

Publication number: PT1196560E
Application number: PT00943747T
Authority: PT
Inventors: Stefan Leo Jozef Masure; Miroslav Cik; Evert Wilhelmus Hoefnagel
Original assignee: Janssen Pharmaceutica Nv
Priority date: 1999-06-29
Filing date: 2000-05-26
Publication date: 2006-12-29
Also published as: NO332214B1; KR100676229B1; EP1196560B1; ATE335079T1; US7476720B2; WO2001002557A1; GB9915200D0; IL147350A; AU779486B2; US7022818B1; KR20020069373A; JP2003504017A; EP1196560A1; CA2377607C; DE60029791D1; US20060069242A1; NZ515569A; IL147350A0; JP4810036B2; WO2001002557A8

Description

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DESCRIÇÃO "RECEPTOR DE FACTORES NEUROTRÓFICOS GFR-ALFA-4" A presente invenção diz respeito à clonagem e expressão de uma nova proteina receptora de mamífero, designada aqui GFRa-4, e, em particular, a uma sequência de ácido nucleico isolada que codifica a proteina GFRa-4, um vector de expressão compreendendo a referida sequência de ácido nucleico, uma célula hospedeiro transformada ou transfectada com esse vector, proteina GFRa4 isolada, compostos que actuam como agonistas ou antagonistas relativamente ao GFRa-4 e métodos para identificá-los, juntamente com composições farmacêuticas compreendendo o ácido nucleico isolado, a proteina receptora ou referido agonista ou antagonista.

Os factores de crescimento neurotróficos estão envolvidos na diferenciação, desenvolvimento e manutenção neuronais. Estas proteínas podem prevenir a degeneração e promover a sobrevivência de diferentes tipos de células neuronais; assim, são agentes terapêuticos potenciais para doenças neurodegenerativas. 0 factor neurotrófico derivado da linha de células gliais (GDNF) foi o primeiro membro de uma subfamília em crescimento de factores neurotróficos estruturalmente distintos das neurotrofinas. 0 GDNF é um membro afastado da superfamília de factores de crescimento do factor de transformação do crescimento β (TGF-β), caracterizado por um padrão específico de sete resíduos cisteína altamente conservados na sequência de aminoácidos (Kingsley, 1994). 0 GDNF foi originalmente purificado utilizando um ensaio baseado na sua capacidade para manter a sobrevivência e função de neurónios dopaminérgicos do mesencéfalo ventral embrionário in vitro (Lin et al., 2 1993) . Foi mostrado que outros tipos de células neuronais dos sistemas nervosos central (SNC) ou periférico (SNP) respondem aos efeitos de sobrevivência do GDNF (Henderson et al., 1994, Buj-Bello et al., 1995, Mount et al.r 1995, Oppenheim et al., 1995). O GDNF é produzido por células numa pró-forma inactiva, que é clivada especificamente num sítio de reconhecimento RXXR para produzir GDNF activo (Lin et al., 1993) . Tendo em vista os seus efeitos sobre neurónios dopaminérgicos, ensaios clínicos avaliaram o GDNF como possível tratamento para doença de Parkinson, uma perturbação neurodegenerativa comum caracterizada pela perda de uma percentagem elevada (até 70%) de células dopaminérgicas na substantia nigra do cérebro. A administração exógena de GDNF tem efeitos protectores potentes em modelos animais de doença de Parkinson (Henderson et al., 1994, Beck et al., 1995, Tomac et al., 1995, Yan et al., 1995, Gash et al., 1996, Choi-Lundberg et al., 1997, Bilang-Bleuel et al., 1997, Mandei et al., 1997) .

Recentemente foram descobertos três novos membros da família GDNF de factores neurotróficos. A neurturina (NTN) foi purificada a partir de meio condicionado de células de ovário de hamster chinês (CHO) utilizando um ensaio baseado na capacidade para promover a sobrevivência de neurónios simpáticos em cultura (Kotzbauer et al., 1996). A proteína neurturina madura é 57% semelhante ao GDNF maduro. A persefina (PSP) foi descoberta por PCR com "primers" degenerados utilizando DNA genómico. A proteína madura, tal como o GDNF maduro, promove a sobrevivência de neurónios dopaminérgicos do mesencéfalo ventral e de neurónios motores em cultura (Milbrandt et al., 1998). A semelhança entre a proteína persefina madura e o GDNF e neurturina maduros é = 50%. Muito recentemente foi clonado um quarto 3 membro utilizando informação de DNA genómico da base de dados pública EMBL, tendo sido denominado Enovina (EVN) (Masure et al., 1999) ou Artemina (ARTN) (Baloh et al., 1998b). Este factor é ± 57% semelhante à NTN e PSP e actua maioritariamente em neurónios periféricos.

Todos os quatro membros da familia GDNF requerem um complexo receptor heterodimérico para procederem à transdução do sinal intracelular a jusante. O GDNF liga-se à subunidade alfa-1 do receptor da familia GDNF (GFRa-1; também denominado GDNFRa, RETL1 ou TrnRl; Comité de Nomenclatura do GFRa, 1997), uma proteina membranar ancorada a glicosilfosfatidilinositol (GPI) (Jing et al., 1996, Treanor et al., 1996, Sanicola et al., 1997). Subsequentemente, o complexo GDNF/GFRa-1 liga-se e activa o proto-oncogene cRET, uma tirosina quinase ligada a membranas (Durbec et al., 1996, Trupp et al., 1996), resultando na fosforilação de resíduos tirosina do cRET e activação subsequente de vias de transdução do sinal a jusante (Worby et al., 1996). O GFRa-2 (também denominado RETL2, NTNR-a, GDNFR-β ou TrnR2), que é semelhante ao GFRa-1, foi identificado por alguns grupos diferentes (Baloh et al., 1997, Sanicola et al., 1997, Klein et al., 1997, Buj-

Bello et al., 1997, Suvanto et al., 1997). As subunidades do receptor humano GFRa-1 e GFRa-2 são 49% idênticas e 63% semelhantes por sequências proteicas, com 30 dos 31 resíduos cisteína conservados. Ambos os receptores contêm um domínio hidrófobo nos seus terminais carboxi envolvido na ancoragem de GPI à membrana. O GFRa-1 e GFRa-2 são amplamente expressos em quase todos os tecidos, e a expressão pode ser regulada pelo desenvolvimento (Sanicola et al., 1997, Widenfalk et al., 1997). 4 0 GFRa-1 é o receptor preferido do GDNF, ao passo que o GFRa-2 se liga preferencialmente à neurturina (Jing et al., 1996, Treanor et al., 1996, Klein et al., 1997). No entanto, também é claro que há alguma conversa cruzada entre estes factores de crescimento e receptores, pois o GDNF pode ligar-se ao GFRa-2 na presença de cRET (Sanicola et al., 1997) e a neurturina pode ligar-se ao GFRa-1 com baixa afinidade (Klein et al., 1997). Assim, o GDNF e a neurturina fazem parte de um sistema de sinalização neurotrófico pelo qual diferentes subunidades de ligação a ligandos (GFRa-1 e GFRa-2) podem interagir com a mesma subunidade de tirosina quinase (cRET).

Recentemente foi descrito um terceiro membro da familia de co-receptores GFRa, GFRa-3 (Jing et al., 1997, Masure et al., 1998, Worby et al., 1998, Naveilhan et al., 1998, Baloh et al., 1998a). A sequência de aminoácidos deste receptor é 35% idêntica ao GFRa-1 e GFRa-2. 0 GFRa-3 não é expresso no SNC em desenvolvimento ou adulto, mas é altamente expresso em vários gânglios sensoriais e simpáticos em desenvolvimento e adultos do SNP (Widenfalk et al., 1998, Naveilhan et al., 1998, Baloh et al., 1998a). Foi mostrado que o GFRa-3 é o co-receptor preferido de Enovina/artemina e também sinaliza via cRET (Masure et al., 1999, Baloh et al., 1998b). Também parece possível existir conversa cruzada entre EVN/ARTN e o GFRa-1, pelo menos in vitro.

Um quarto membro da família GFRa foi identificado em galinhas (Thompson et al., 1998) e foi mostrado que medeia a sinalização de persefina via cRET (Enokido et al., 1998). Ainda está por descobrir um homólogo funcional de mamífero que codifique um receptor de persefina de mamífero. 5

Surpreendentemente, os presentes inventores identificaram outro novo receptor de mamífero da família GDNF, designado aqui como GFRa-4. A sequência de DNA foi clonada e também foram identificadas algumas variantes de processamento que codificam o receptor.

Em conformidade, a presente invenção fornece uma forma isolada ou substancialmente pura de um ácido nucleico que codifica um receptor a-4 da família GNDF de mamífero, designado GFRa-4. 0 receptor codificado por essa molécula de ácido nucleico tem a sequência de aminoácidos representada nas ID Sequências N°s 8 ou 9.

Se bem que inicialmente, considerando o facto de serem conhecidos apenas 4 membros dos GFRas, o novo receptor tenha sido previamente denominado GFRa-5. No entanto, foi agora denominado a-4 para estar em concordância com a nomenclatura existente para os membros da família GFRa e para indicar que o receptor GFRa da presente invenção é o ortólogo de mamífero do receptor GFRa-4 de galinha.

Assim, a presente invenção refere-se a uma molécula de ácido nucleico que codifica um receptor a-4 da família GNDF de mamífero (GFRa-4), ou respectivo fragmento imunologicamente e/ou biologicamente activo, que compreende uma sequência de nucleótidos seleccionada do grupo que consiste em: (a) sequências de nucleótidos que codificam o polipéptido compreendendo a sequência de aminoácidos representada na ID SEQ NO: 8 ou 9; (b) sequências de nucleótidos compreendendo a sequência codificadora representada na ID SEQ NO: 5 ou 6; 6 (c) sequências de nucleótidos que codificam um polipéptido derivado do polipéptido codificado por uma sequência de nucleótidos de (a) ou (b) através de substituição, deleção e/ou adição de um ou vários aminoácidos da sequência de aminoácidos codificada pela sequência de nucleótidos de (a) ou (b); (d) sequências de nucleótidos cujo filamento complementar hibridiza com uma sequência de nucleótidos de qualquer um de (a) até (c); (e) sequências de nucleótidos que codificam um polipéptido cuja sequência de aminoácidos tem uma identidade de 30% ou superior com a sequência de aminoácidos do polipéptido codificado por uma sequência de nucleótidos de qualquer um de (a) até (d); (f) sequências de nucleótidos que codificam um polipéptido capaz de se ligar à persefina, compreendendo um fragmento ou uma porção contendo epitopos de um polipéptido codificado por uma sequência de nucleótidos de qualquer um de (a) até (e); (g) sequências de nucleótidos compreendendo pelo menos 15 nucleótidos consecutivos de uma sequência de nucleótidos de qualquer um de (a) até (f) e que codificam um polipéptido capaz de se ligar à persefina, e (h) sequências de nucleótidos compreendendo uma sequência de nucleótidos que é degenerada, em resultado do código genético, relativamente a uma sequência de nucleótidos de qualquer um de (a) até (g).

Vantajosamente, a molécula de ácido nucleico de acordo com a invenção pode ser utilizada para expressar a referida proteina GFRa-4, por exemplo, numa célula hospedeiro ou afins, utilizando um vector de expressão apropriado. 7

Preferivelmente, a molécula de ácido nucleico é uma molécula de DNA e ainda mais preferivelmente uma molécula de cDNA tendo uma sequência como ilustrada em qualquer uma das ID Sequências N°s 5 até 7, ou respectivos complementos.

Alternativamente, a molécula de ácido nucleico é capaz de hibridizar para as sequências da invenção em condições de restrição elevada, ou para os respectivos complementos. Restrição da hibridização, tal como é aqui utilizado, refere-se a condições nas quais os ácidos polinucleicos são estáveis. A estabilidade dos híbridos reflecte-se na temperatura de fusão (Tf) dos híbridos. A Tf pode ser aproximada pela fórmula: 81,5°C + 16,6 (logio [Na+] + 0,41 (%G&C) - 6001/1 em que 1 é o comprimento dos híbridos em nucleótidos. A Tf decresce aproximadamente por 1-1,5°C por cada decréscimo de 1% da homologia de sequências. O ácido nucleico capaz de hibridizar para moléculas de ácido nucleico de acordo com a invenção será geralmente pelo menos 70%, preferivelmente pelo menos 80 ou 90% e mais preferivelmente pelo menos 95% homólogo às sequências de nucleótidos de acordo com a invenção.

Vantajosamente, a molécula anti-sentido pode ser utilizada como sonda ou como medicamento ou numa composição farmacêutica juntamente com um transportador, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

De acordo com um segundo aspecto da invenção, é fornecido um vector de expressão de DNA compreendendo a molécula de DNA de acordo com a invenção. Este vector pode ser vantajosamente utilizado para transformar ou transfectar uma célula hospedeiro com a finalidade de obter expressão do GFRa-4 de acordo com a invenção. 8

Preferivelmente, o DNA está incluído num plasmídeo, para a transfecção ou transformação subsequente da célula hospedeiro.

Um vector de expressão de acordo com a invenção inclui um vector tendo um ácido nucleico de acordo com a invenção operativamente ligado a sequências reguladoras, como regiões promotoras, que são capazes de efectuar a expressão desses fragmentos de DNA. 0 termo "operativamente ligado" refere-se a uma justaposição em que os componentes descritos estão relacionados de uma forma que lhes permite funcionarem do seu modo pretendido. Esses vectores podem ser transformados numa célula hospedeiro adequada para proporcionar a expressão de um polipéptido de acordo com a invenção. Assim, num aspecto suplementar, a invenção proporciona um processo para preparar receptores de acordo com a invenção que compreende cultivar uma célula hospedeiro, transformada ou transfectada com um vector de expressão como descrito acima, em condições para proporcionar a expressão pelo vector de uma sequência codificadora que codifica os receptores, e recuperar os receptores expressos.

Os vectores podem ser, por exemplo, vectores plasmídicos, de vírus ou fago fornecidos com uma origem da replicação, opcionalmente um promotor para a expressão desses nucleótidos e opcionalmente um regulador do promotor. Os vectores podem conter um ou mais marcadores seleccionáveis, tais como, por exemplo, resistência à ampicilina.

Elementos reguladores necessários para a expressão incluem sequências promotoras para a ligação de RNA polimerase e sequências de iniciação da transcrição para a ligação de ribossomas. Por exemplo, um vector de expressão bacteriano pode incluir um promotor, como o promotor lac, e 9 para iniciação da transcrição na sequência Shine-Dalgarno e o codão de inicio AUG. De modo semelhante, um vector de expressão eucariótico pode incluir um promotor heterólogo ou homólogo para RNA polimerase II, um sinal de poliadenilação a jusante, o codão de inicio AUG e um codão de terminação, para a separação do ribossoma. Esses vectores podem ser obtidos comercialmente ou reunidos a partir das sequências descritas por métodos bem conhecidos na área.

Moléculas de ácidos nucleicos de acordo com a invenção podem ser inseridas nos vectores descritos numa orientação anti-sentido, para proporcionar a produção de RNA anti-sentido. RNA anti-sentido ou outros ácidos nucleicos anti-sentido podem ser produzidos por meios sintéticos.

De acordo com a presente invenção, um ácido nucleico definido inclui não só o ácido nucleico idêntico mas também quaisquer variações de bases amino, incluindo, em particular, substituições em bases que resultam num codão sinónimo (um codão diferente que especifica o mesmo residuo de aminoácido), devido ao código degenerado, em substituições de aminoácidos conservativas. 0 termo "sequência de ácido nucleico" também inclui a sequência complementar a qualquer sequência de filamentação simples determinada relativamente a variações de bases.

Vantajosamente, a presente invenção também fornece sequências de ácidos nucleicos com pelo menos aproximadamente 10 nucleótidos contiguos de um ácido nucleico de acordo com a invenção e, preferivelmente, desde 10 até 50 nucleótidos. Estas sequências podem ser vantajosamente utilizadas como sondas ou "primers" para iniciar a replicação, ou afins. Essas sequências de ácidos nucleicos podem ser produzidas de acordo com técnicas bem conhecidas na área, tais como por meios sintéticos ou 10 recombinantes. Também podem ser utilizadas em estojos de diagnóstico, ou afins, para detectar a presença de um ácido nucleico de acordo com a invenção. Estes testes compreendem geralmente fazer com que a sonda entre em contacto com a amostra em condições de hibridizaçao e detectar a presença de qualquer formação de hélice dupla ou tripla entre a sonda e qualquer ácido nucleico presente na amostra.

De acordo com a presente invenção, estas sondas podem ser ancoradas a um suporte sólido. Preferivelmente estão presentes numa série de modo que múltiplas sondas possam hibridizar simultaneamente para uma única amostra biológica. As sondas podem ser colocadas em sitios da série ou podem ser sintetizadas in situ na série. (Ver Lockhart et al., Nature Biotechnology, volume 14, Dezembro 1996 "Expression monitoring by hybridisation into high density oligonucleotide arrays".) Uma única série pode conter mais de 100, 500 ou mesmo 1 000 sondas diferentes em localizações discretas.

As sequências de ácidos nucleicos de acordo com a invenção podem ser produzidas utilizando meios recombinantes ou sintéticos, tais como, por exemplo, utilizando mecanismos de clonagem por PCR, que envolvem geralmente produzir um par de "primers", que podem ter desde aproximadamente 10 até 50 nucleótidos até uma região do gene que se deseja clonar, fazer com que os "primers" entrem em contacto com mRNA, cDNA ou DNA genómico de uma célula humana, realizar uma reacção em cadeia de polimerase em condições que conduzem à amplificação da região desejada, isolar a região ou fragmento amplificado e recuperar o DNA amplificado. Em geral, essas técnicas tal como são definidas aqui são bem conhecidas na área, como descrito em Sambrook et al. ("Molecular Cloning: a Laboratory Manual", 1989). 11

Os ácidos nucleicos ou oligonucleótidos de acordo com a invenção podem conter uma etiqueta de revelação. Etiquetas adequadas incluem radioisótopos, como 32P ou 35S, etiquetas enzimáticas ou outras etiquetas proteicas, como biotina, ou marcadores fluorescentes. Essas etiquetas podem ser adicionadas aos ácidos nucleicos ou oligonucleótidos da invenção e podem ser detectadas utilizando técnicas conhecidas per se. A presente invenção também compreende no seu âmbito proteínas ou polipéptidos codificados pelas moléculas de ácidos nucleicos de acordo com a invenção.

Preferivelmente, a proteína compreende a sequência de aminoácidos das ID Sequências N°s 8 e 9.

Também são descritas formas híbridas e modificadas do receptor GFRa-4 de acordo com a invenção, incluindo proteínas de fusão e fragmentos. As formas híbrida e modificada incluem, por exemplo, quando certos aminoácidos foram sujeitos a alguma modificação ou substituição, tal como, por exemplo, por mutação pontual, mas que ainda assim resultam numa proteína que possui a mesma especificidade de receptor do receptor GFRa-4 da invenção.

Neste contexto, entende-se que os termos actividade biológica, especificidade do receptor e receptor (fragmento) funcional incluem, preferivelmente, a capacidade para se ligar a persefina, preferivelmente e especificamente, e que o GFRa-4 da invenção tem nenhuma ou substancialmente nenhuma actividade de ligação sobre o GDNF, NTN e/ou EVN/ART. A actividade biológica, especificidade e/ou funcionalidade do receptor, por exemplo, actividade de ligação do GFRa-4 da invenção, respectivas variantes, derivados e fragmentos, podem ser determinadas de acordo com métodos bem conhecidos na área, 12 preferivelmente como descrito nos exemplos em anexo. Preferivelmente, o KD do GFRa-4 da invenção para a persefina é 1 até 10 χ 10-9, particularmente preferido 5,9 ± 2,8 x 10”9, quando determinado de acordo com os exemplos descritos abaixo; ver a descrição da Tabela 6.

Proteínas ou polipéptidos de acordo com a invenção incluem suplementarmente variantes dessas sequências, incluindo variantes alélicas de ocorrência natural que são substancialmente homólogas às referidas proteinas ou polipéptidos. Neste contexto, homologia substancial é considerada como uma sequência que tem pelo menos 90% de homologia de aminoácidos com as proteinas ou polipéptidos codificados pelas moléculas de ácidos nucleicos de acordo com a invenção.

Deve considerar-se que homologia substancial significa que as sequências de nucleótidos e de aminoácidos do GFRa-4 da invenção exibem um certo grau de identidade de sequências. Partilham uma identidade superior a 90% e, preferivelmente, é desejada mais de 95% relativamente às sequências de nucleótidos ou aminoácidos representadas nas ID Seq. N°s 5 até 9, respectivamente. Um método preferido para determinar a melhor correspondência global entre uma sequência de busca (uma sequência da presente invenção) e uma sequência motivo, também referida como alinhamento global de sequências, pode consistir em utilizar, por exemplo, o programa computacional FASTDB baseado no algoritmo de Brutlag et al. (Comp. App. Biosci. 6 (1990), 237-245) . Num alinhamento de sequências, as sequências de busca e motivo são ambas sequências de DNA. Pode comparar-se uma sequência de RNA convertendo U's em T's. O resultado desse alinhamento global de sequências é apresentado em identidade percentual. Outros programas que podem ser utilizados para determinar a homologia/identidade são 13 descritos abaixo e nos exemplos. As sequências que são homólogas às sequências descritas acima são, por exemplo, variações dessas sequências que representam modificações com a mesma função biológica, em particular proteinas codificadoras com a mesma ou substancialmente a mesma especificidade de receptor, isto é, especificidade de ligação. Podem ser variações de ocorrência natural, como sequências de outros mamiferos, ou mutações. Estas mutações podem ocorrer naturalmente ou podem ser obtidas por técnicas de mutagénese. As variações alélicas podem consistir em variantes alélicas de ocorrência natural, bem como variantes produzidas sinteticamente ou manipuladas geneticamente. Numa especificação preferida, as sequências são derivadas de ratinho, mais preferivelmente de humano. Estas sequências também podem ser recuperadas de bases de dados existentes com sequências de nucleótidos de função ainda desconhecida. Por exemplo, uma busca por BLAST na base de dados EMBL utilizando como sequência de busca as sequências identificadas de GFRa-4 de rato deu origem a uma sequência genómica de ratinho (n° de acesso AF155960) e a uma sequência genómica humana (n° acesso AC017113, contendo sequências contíguas derivadas de DNA genómico humano) com partes quase idênticas a partes da sequência do GFRa-4 de rato (exões 2, 3 e 4).

Outro aspecto da invenção compreende a própria célula hospedeiro transformada com o vector de expressão de DNA descrito aqui, cuja célula hospedeiro compreende preferivelmente uma célula eucariótica, que pode ser, por exemplo, uma célula de mamífero, uma célula de insecto ou célula de levedura ou afins. Numa especificação, a célula compreende uma célula da linha celular HEK293. Alternativamente, a célula pode compreender fibroblastos de 14 ratinho NIH/3T3 ou células de ovário de hamster chinês (CHO) ou células COS-7. É suplementarmente fornecida pela presente invenção uma célula, tecido ou organismo transgénico não humano compreendendo um transgene capaz de expressar o GFRa-4 de acordo com a invenção, ou de expressar um equivalente funcional, derivado ou bioprecursor desse receptor. 0 termo "transgene capaz de expressão", tal como é aqui utilizado, significa uma sequência de ácido nucleico adequada que conduz à expressão de um receptor humano com a mesma função e/ou actividade do GFRa-4. 0 transgene pode incluir, por exemplo, ácido nucleico genómico isolado de células de rato ou ácido nucleico sintético, incluindo cDNA, integrado no genoma ou num estado extra-cromossómico. Preferivelmente, o transgene compreende a sequência de ácido nucleico que codifica o GFRa-4 de acordo com a invenção, ou um fragmento funcional desse ácido nucleico. Um fragmento funcional desse ácido nucleico deve ser tomado como significando um fragmento do gene ou cDNA que codifica o receptor GFRa-4, ou um equivalente funcional ou bioprecursor desse GFRa-4, cujo fragmento é capaz de ser expresso para produzir uma proteina receptora funcional. Por exemplo, o gene pode compreender deleções de mutações mas ainda codificar um receptor funcional. A presente invenção também se refere à inibição do GFRa-4 in vivo utilizando tecnologia anti-sentido. Pode utilizar-se tecnologia anti-sentido para controlar a expressão do gene através da formação de hélice tripla ou DNA ou RNA anti-sentido, em que ambos os métodos se baseiam na ligação de um polinucleótido a DNA ou RNA.

Por exemplo, utiliza-se a porção codificadora 5' da sequência proteica madura, que codifica para a proteina da 15 presente invenção, para conceber um oligonucleótido RUA anti-sentido com 10 até 40 pares de bases de comprimento. Um oligonucleótido de DNA é concebido de modo a ser complementar a uma região do gene envolvida na transcrição (hélice tripla - ver Lee et al., Nucl. Acids Res., _6: 3073 (1979); Cooney et al., Science, 241: 456 (1988), e Dervan et al., Science, 251: 1360 (1991)), desse modo prevenindo a transcrição e a produção de GFRa-4. O oligonucleótido de RNA anti-sentido hibridiza para o mRNA in vivo e bloqueia a tradução de uma molécula de mRNA no receptor GFRa-4.

Também são fornecidos anticorpos para o receptor GFRa-4 de acordo com a invenção, que podem ser utilizados num medicamento ou numa composição farmacêutica.

Anticorpos para o GFRa-4 da invenção podem ser vantajosamente preparados por técnicas que são conhecidas na área. Por exemplo, podem preparar-se anticorpos policlonais inoculando um animal hospedeiro, como um ratinho, com o polipéptido de acordo com a invenção, ou respectivo epitopo, e recuperando soro imunológico. Podem preparar-se anticorpos monoclonais de acordo com técnicas conhecidas, como descrito por Kohler R. e Milstein C., Nature (1975) 256, 495-497.

Anticorpos de acordo com a invenção também podem ser utilizados num método para detectar a presença de GFRa-4, fazendo reagir o anticorpo com uma amostra e identificando qualquer proteina ligada àquele. Também pode fornecer-se um estojo para pôr em prática esse método, que compreende um anticorpo de acordo com a invenção e meios para fazer reagir o anticorpo com essa amostra.

Vantajosamente, o anticorpo de acordo com a invenção também pode ser utilizado como medicamento ou na preparação de um medicamento para tratar doenças associadas à 16 expressão do GFRa-4 da invenção. A invenção também fornece suplementarmente uma composição farmacêutica compreendendo esse anticorpo juntamente com um transportador, diluente ou excipiente para aquele farmaceuticamente aceitável.

Podem identificar-se proteínas que interaqem com o polipéptido da invenção investigando interacções proteína-proteína utilizando o sistema vectorial de dois hibridos primeiramente proposto por Chien et al. (1991), Proc. Natl. Acad. Sei. USA 8_8: 9578-9582.

Esta técnica baseia-se na reconstituição funcional in vivo de um factor de transcrição que activa um gene repórter. Mais particularmente, a técnica compreende fornecer a uma célula hospedeiro apropriada uma construção de DNA compreendendo um gene repórter sob o controlo de um promotor regulado por um factor de transcrição possuindo um domínio de ligação de DNA e um domínio de activação, expressar na célula hospedeiro uma primeira sequência de DNA híbrida que codifica uma primeira fusão de um fragmento ou da totalidade de uma sequência de ácido nucleico de acordo com a invenção e quer o referido domínio de ligação de DNA quer o referido domínio de activação do factor de transcrição, expressar no hospedeiro pelo menos uma segunda sequência híbrida de DNA, como uma biblioteca ou afim, que codifica proteínas de ligação putativas a serem investigadas juntamente com o domínio de ligação de DNA ou de activação do factor de transcrição que não está incorporado na primeira fusão; detectar qualquer ligação das proteínas a serem investigadas a uma proteína de acordo com a invenção, por detecção da presença de qualquer produto de gene repórter na célula hospedeiro; opcionalmente, isolar as segundas sequências híbridas de DNA que codificam a proteína de ligação. 17

Utilizando esta técnica podem identificar-se proteínas que se ligam ao receptor GFRa-4. As proteínas identificadas também podem ser utilizadas para identificar compostos que actuem como agonistas/antagonistas destas proteínas. A estrutura do receptor também pode ser utilizada para conceber agonistas ou antagonistas do receptor. A presente invenção também se refere a um agonista ou antagonista do receptor GFRa-4 humano de acordo com a invenção, cujo agonista ou antagonista também pode ser vantajosamente utilizado como medicamento ou numa composição farmacêutica juntamente com um transportador, diluente ou excipiente para aquele farmaceuticamente aceitável.

Podem identificar-se agonistas ou antagonistas fazendo com que uma célula que expressa o GFRa-4 entre em contacto com um composto a ser testado e monitorizando o grau de qualquer resposta funcional ou biológica mediada pelo GFRa-4, tal como, por exemplo, monitorizando o nível de fosforilação nessa célula, ou por Cytosensor, ou ensaios de ligação de ligandos na presença de cRET ou proteínas semelhantes da via de transdução do sinal. Preferivelmente, a célula pode ser uma célula hospedeiro ou célula transgénica de acordo com a invenção como definida aqui. Também podem identificar-se agonistas e antagonistas do GFRa-4, por exemplo, fazendo com que uma preparação membranar compreendendo GFRa-4 entre em contacto com o composto a ser testado na presença de cRET ou outras proteínas semelhantes envolvidas na via de transdução do sinal da qual o GFRa-4 é um componente, e monitorizando a interacção do GFRa-4 com cRET ou referidas proteínas semelhantes. Vantajosamente, quaisquer compostos ou moléculas identificados como agonistas ou antagonistas 18 relativamente ao GFRa-4 podem, eles próprios, ser utilizados numa composição farmacêutica como definida acima, ou como medicamento.

Também se descrevem moléculas ou compostos que actuam na via de transdução do sinal à qual pertence o GFRa-4 ou equivalente funcional. Alternativamente, as moléculas podem interferir com a formação de complexos ou interacção do GFRa-4, ou seu equivalente funcional, com cRET ou proteina semelhante da via de transdução do sinal da qual o GFRa-4 é um componente.

Suplementarmente, a presente invenção refere-se a um método para produzir um antagonista ou agonista do GFRa-4 de acordo com a invenção, compreendendo os passos de qualquer um dos métodos de rastreio descritos acima e, adicionalmente: (i) sintetizar o composto obtido ou identificado nesse método, ou respectivo análogo ou derivado fisiologicamente aceitável, numa quantidade suficiente para fornecer a um paciente esse antagonista ou agonista numa quantidade terapeuticamente eficaz, e/ou (ii) combinar o composto obtido ou identificado nesse método, ou respectivo análogo ou derivado, com um transportador farmaceuticamente aceitável.

Os compostos isolados pelos métodos acima também servem como compostos líder para o desenvolvimento de compostos análogos. Os análogos devem ter uma configuração electrónica e conformação molecular estabilizadas que permitam que grupos funcionais chave sejam apresentados ao receptor GFRa-4 substancialmente do mesmo modo do composto líder. Em particular, os compostos análogos têm 19 propriedades electrónicas espaciais que são comparáveis à região de ligação, mas podem ser moléculas mais pequenas do que o composto lider, frequentemente com um peso molecular inferior a cerca de 2 kD e preferivelmente inferior a cerca de 1 kD. A identificação de compostos análogos pode ser feita utilizando técnicas tais como análise de campo auto-consistente (SCF), análise de interacção de configuração (Cl) e análise dinâmica de modos normais. Estão disponíveis programas computacionais para implementar estas técnicas, por exemplo, Rein, "Computer-Assisted Modeling of Receptor-Ligand Interactions" (Alan Liss, Nova Iorque, 1989). Métodos para a preparação de derivados químicos e análogos são bem conhecidos dos experimentados na área e estão descritos, por exemplo, em Beilstein, "Handbook of Organic Chemistry", edição da Springer New York Inc., 175 Fifth Avenue, Nova Iorque, N.I. 10010 E.U.A., e "Organic Synthesis" Wiley, Nova Iorque, E.U.A. Suplementarmente, esses derivados e análogos podem ser testados quanto aos seus efeitos de acordo com métodos conhecidos na área, ver também supra. Suplementarmente, podem utilizar-se péptido-miméticos e/ou concepção auxiliada por computador de derivados e análogos apropriados.

Compostos identificados como agonistas ou antagonistas relativamente ao GFRa-4, ou como ligandos ou compostos que interferem com a via de transdução do sinal da qual faz parte o GFRa-4, podem ser vantajosamente utilizados na preparação de um medicamento para o tratamento de doenças neurodegenerativas, tais como, por exemplo, doença de Alzheimer, doença de Parkinson, Doença do Neurónio Motor, neuropatia periférica, lesão da espinal-medula, doença de Hirschsprung familiar, para além de vários carcinomas, tais como, por exemplo, em cancro gastrointestinal, e também no tratamento de doenças que possam estar associadas a 20 disfunção do GFRa-4. Compostos identificados como antagonistas podem ser vantajosamente utilizados na preparação de um medicamento para o tratamento de carcinoma ou para atenuar dor. A presente invenção também compreende suplementarmente um método para identificar ligandos do GFRa-4 de acordo com a invenção, cujo método compreende fazer com que esse receptor entre em contacto quer com um extracto celular quer, alternativamente, com um composto a ser testado quanto ao seu potencial como ligando do GFRa-4, e isolando quaisquer moléculas ligadas ao GFRa-4. A presente invenção também fornece um estojo de diagnóstico, cujo estojo compreende uma sonda incluindo qualquer um entre uma molécula de ácido nucleico que codifica uma proteina GFRa-4 de acordo com a invenção, uma molécula capaz de hibridizar para aquela em condições de restrição elevada, um fragmento desses ácidos nucleicos, uma molécula anti-sentido de acordo com a invenção, juntamente com meios para fazer com que o material biológico a ser testado entre em contacto com essa sonda de ácido nucleico. Um estojo de diagnóstico de acordo com a invenção também pode compreender um agonista ou antagonista relativamente ao GFRa-4, ou um anticorpo, preferivelmente um anticorpo monoclonal, para o GFRa-4. Assim e vantajosamente, o estojo pode ser utilizado, consoante o apropriado, para identificar, por exemplo, células que expressam ou que não têm o referido receptor ou defeitos genéticos ou afins, ou para determinar se um composto é um agonista ou um antagonista do receptor GFRa-4. Estojos para determinar se um composto é um agonista ou um antagonista relativamente ao GFRa-4 podem compreender uma célula ou preparação membranar que expressa esse receptor 21 de acordo com a presente invenção, meios para fazer com que essa célula entre em contacto com esse composto e meios para monitorizar o nivel de qualquer resposta funcional ou biológica mediada pelo GFRa-4, por exemplo, medindo o nivel de fosforilação nessa célula, ou por Cytosensor, ou ensaios de ligação de ligandos na presença de cRET ou proteínas semelhantes envolvidas na via de transdução do sinal da qual o GFRa-4 é um componente. A presente invenção pode ser mais claramente entendida a partir da seguinte especificação exemplificativa com referência às figuras em anexo, nas quais:

Figura 1: é uma ilustração da estrutura do gene GFRa-4 de rato. A linha de cima mostra uma escala em pares de bases. A linha abaixo mostra a estrutura genómica do gene GFRa-4 de rato. Os exões estão representados por caixas e estão numerados, as sequências de intrões estão representadas como linhas. As dimensões (em pares de bases) de intrões e exões estão indicadas acima do diagrama. O codão de início da tradução está indicado por uma seta e o codão de terminação por um asterisco. As sequências de cDNA das variantes A e B obtidas por remoção por processamento das sequências de intrões estão apresentadas abaixo da sequência genómica. O processamento alternativo do intrão 5 resulta num codão de terminação anterior na variante de processamento B. As sequências proteicas previstas das variantes A e B estão mostradas na parte de baixo. 0 péptido de sinal previsto, um sítio putativo de N-glicosilação e uma região COOH-terminal hidrófoba precedida por um ou dois sítios possíveis para clivagem por GPI (apenas na variante A) estão indicados nos diagramas. 22

Figura 2: é um alinhamento das sequências proteicas previstas das variantes de processamento A e B do GFRa-4 de rato. As sequências das variantes de processamento A e B do GFRa-4 de rato foram alinhadas utilizando o programa de alinhamento ClustalW (EMBL, Heidelberg, Alemanha). Os residuos de aminoácidos conservados entre as 2 variantes estão incluídos nas áreas a preto. Os residuos de aminoácidos estão numerados à direita. As linhas tracejadas indicam hiatos introduzidos nas sequências para optimizar o alinhamento.

Figura 3: é um alinhamento das sequências proteicas previstas de membros da familia GFRa. As sequências das variantes A e B do GFRa-4 de rato, GFRa-1 de rato (EMBL n° de acesso U59486), GFRa-2 de rato (EMBL n° de acesso AF003825), GFRa-3 de ratinho (EMBL n° de acesso AB008833) e GFRa-4 de galinha (EMBL n° de acesso AF045162) foram alinhadas utilizando o programa de alinhamento ClustalW (EMBL, Heidelberg, Alemanha). Os residuos de aminoácidos conservados entre todas as 6 proteinas estão incluidos nas áreas a preto. Os residuos conservados entre 4 ou 5 das sequências estão sombreados a cinzento. Os residuos cisteina conservados entre todos os seis GFRa's estão indicados com um asterisco acima da sequência. Os residuos de aminoácidos estão numerados à direita. As linhas tracejadas indicam hiatos introduzidos nas sequências para optimizar o alinhamento.

Figura 4: Análise de coloração "Northern" da expressão de mRNA do GFRa-4 de roedores. Avaliou-se a expressão do mRNA do GFRa-4 de rato e ratinho em diferentes 23 tecidos utilizando uma sonda correspondente à sequência codificadora do GFRa-4 de rato para analisar colorações de RNA rico em poli (A) . (A) coloração "Northern" de Múltiplos Tecidos (MTN) de rato/ (B) coloração MTN de ratinho e (C) coloração MTN de embrião de ratinho. As dimensões aparentes estão indicadas (em milhares de pares de bases) por linhas horizontais à esquerda de cada painel.

Figura 5. 0 gene GFRa-4 de rato está localizado no cromossoma 3q36. Utilizou-se uma mistura de duas sondas de GFRa-4 de rato para a análise de FISH. (A) Sinais de FISH de manchas duplas na parte média-distal do cromossoma 3 de rato (setas) . (B) Posição do locus do gene GFRa-4 no cromossoma 3q36 de rato.

Síntese de oliqonucleótidos para PCR e sequenciação de DNA

Todos os "primers" oligonucleotídicos utilizados foram adquiridos à Eurogentec (Seraing, Bélgica). Os "primers" de sequenciação especificos para inserções (15- e 16-meros) e "primers" para utilização em reacções de PCR foram concebidos manualmente. 0 DNA foi preparado em colunas de permuta aniónica de ponta 20 ou 100 ou colunas de rotação Qiaquick da Qiagen (Qiagen, GmbH, Dusseldorf, Alemanha) e recuperado das colunas em 30 μΐ de tampão TE (Tris HC1 10 mM, EDTA (sal de sódio) 1 mM, pH 8,0) . As reacções de sequenciação foram efectuadas em ambos os filamentos utilizando o estojo de sequenciação ABI Prism BigDye Terminator Cycle e foram conduzidas no sequenciador da Applied Biosystems 377XL (Perkin Elmer, ABI Division, Foster City, CA, E.U.A.). Utilizou-se o "software" 24

Sequencher™ para a reunião de sequências e edição manual (GeneCodes, AnnArbor, MI, E.U.A.).

Identificação de uma sequência de cDNA que codifica um novo membro da familia GFRa

Utilizando o DNA ou sequências proteicas do GFRa-1, GFRa-2 ou GFRa-3 humanos como sequência de busca, efectuaram-se buscas por BLAST (Ferramenta Básica de Busca de Alinhamentos Locais ("Basic Local Alignment Search Tool"); Altschul et al., 1990) nas actualizações diárias da base de dados pública EMBL. Uma sequência EST (marcador de sequência expressa) de ratinho, com o número de acesso EMBL AU035938, exibiu homologia para o GFRa-1, GFRa-2 e GFRa-3. As probabilidades de menor soma (SSP) obtidas pelas análises de BLAST estão resumidas na Tabela 1.

Tabela 1: Resultados de BLAST

Sequência de busca DNA/PROTEÍNA SSP GFRa-1 proteína 7,5e-25 GFRa-2 proteína 1,3e-12 GFRa-3 proteína 2,2e-20 GFRa-1 DNA 6,6e-09 GFRa-2 DNA >0,011 GFRa-3 DNA 0,0096 A sequência AU035938 (sequência 1) é uma sequência de 7 92 pares de bases derivada de uma biblioteca de cDNA de cérebro de ratinho. Para obter homologia consistente com outros membros da familia GFRa por tradução é necessário 25 inserir um deslocamento do quadro de leitura perto da posição 165 da sequência de DNA. Não é claro se isto se deve a um erro da sequenciação ou se há outra explicação. Utilizando esta sequência EST como sequência de busca, repetiu-se a busca por BLAST contra a base de dados pública EMBL. Um clone adicional (n° de acesso AA823200; sequência 2) deu origem a uma SSP significativa de le-18. Por inspecção deste clone de 497 pares de bases, que foi derivado de uma biblioteca de cDNA de glândulas mamárias de ratinho, apenas os primeiros 61 pares de bases eram idênticos a parte da AU035938 (posições 353 até 415) . 0 resto da sequência de AA823200 era diferente de AU035938 mas continha partes cujas sequências de aminoácidos traduzidas exibiram homologia com os outros GFRa's. Em consequência, pôs-se a hipótese de AU035938 e AA823200 poderem representar duas formas variantes do mesmo receptor, que foi denominado GFRa-4.

Clonagem de cDNA do GFRg-4 de ratinho

Em primeiro lugar, tentámos amplificar um fragmento do cDNA do GFRa-4 de ratinho em cDNAs Marathon Ready™ (Clontech Laboratories, Paio Alto, CA, E.U.A.) derivados de cérebro de ratinho e de embrião de ratinho. Os "primers" foram concebidos, utilizando as sequências EST (EMBL n° de acesso AU035938 e AA823200), para amplificar um fragmento de 274 pares de bases de GFRa-4 de ratinho. Os "primers" utilizados para a amplificação do GFRa-4 de ratinho estão apresentados na tabela abaixo. 26

Tabela 2: "Primers" utilizados para a amplificação de sequências de DNA do GFRa-4 de ratinho

Nome Sequência h RATINHO-GFRa4-sp2 CGCGTTGTGTGCGCÍjTCTACG 21 RATINHO-GFRa4-sp3 CGGGGCGAâGAATGCGAAGC 20 RATINHO-GFRa4-ap2 CACCCACGTACCAT GGCATGT GC 23

As reacções de PCR foram conduzidas utilizando o sistema de Taq polimerase (Boehringer Mannheim, Mannheim, Alemanha). As reacções de PCR foram realizadas num volume total de 50 μΐ contendo 1 χ tampão de reacção de PCR Taq, dNTP 0,25 mM, 0,5 μΜ dos "primers" RATINHO-GFRa4-sp2 e RATINHO-GFRa4-ap2, 1 μΐ de Taq polimerase e 2 μΐ de cDNA Marathon Ready™ de embrião de ratinho ou cérebro de ratinho. As amostras foram aquecidas para 95°C durante 5 minutos e aplicaram-se ciclos durante 30 segundos a 94°C, 1 minuto a 60°C e 45 segundos a 72°C durante 35 ciclos, com um passo final de 7 minutos a 72°C. Depois efectuou-se uma PCR semi-encaixada em 1 μΐ da reacção de PCR primária com os "primers" RATINHO-GFRa4-sp3 e RATINHO-GFRa4-ap2. As reacções de PCR foram realizadas num volume total de 50 μΐ contendo 1 χ tampão de reacção de PCR Taq, dNTP 0,25 mM, 0,5 μΜ dos "primers" RATINHO-GFRa4-sp3 e RATINHO-GFRa4-ap2, 1 μΐ de Taq polimerase e 1 μΐ de de produto de PCR primária. As amostras foram aquecidas para 95°C durante 5 minutos e aplicaram-se ciclos durante 30 segundos a 94°C, 1 minuto a 60°C e 45 segundos a 72°C durante 35 ciclos, com um passo final de 7 minutos a 72°C. Os produtos de PCR foram analisados num gel de agarose 1% (p/v) em 1 χ tampão TAE (Tris-acetato 40 mM, EDTA (sal de sódio) 1 mM, pH 8,3). 27

Um fragmento de PCR com a dimensão esperada (270 pares de bases) foi excisado do gel e purificado com o estojo de extracção de gel Qiaquick (Qiagen GmbH, Hilden, Alemanha). Sequenciaram-se os fragmentos de PCR para confirmar a sua identidade. A sequência obtida correspondeu às sequências da base de dados de EST.

Para determinar as sequências codificadoras a montante e a jusante do GFRa-4 de ratinho, efectuaram-se experiências 5' e 3' RACE. Uma vez que estas experiências não funcionaram como esperado e porque, nalguns pontos, foi necessário introduzir deslocamentos do quadro de leitura na sequência do GFRa-4 de ratinho para se obter homologia consistente com outros GFRa's após a tradução, decidimos mudar para a clonagem do homólogo de rato do GFRa-4 de ratinho.

Identificação e clonagem de sequências de cDNA do GFRg-4 de rato

Utilizaram-se as sequências de cDNA com o número de acesso AU035938 e AA823200 descritas acima como sequência de busca em buscas por BLAST das bases de dados registadas LifeSeq e ZooSeq (Incyte Pharmaceuticals, Paio Alto, CA, E.U.A.). Identificaram-se dois clones de rato com elevada homologia para as sequências GFRa-4 de ratinho: número 701290919H1 (270 pares de bases; acerto com AU035938 (SSP = l,le-32) e com AA823200 (SSP = l,3e-21)) e número 701291473H1 (250 pares de bases; acerto apenas com AA823200 (SSP = 4,3e-42)). Por comparação das sequências proteicas traduzidas derivadas dos clones 701291473H1 e 701290919H1 com as sequências proteicas de GFRa conhecidas, foi possível deduzir que a sequência 701290919H1 estava provavelmente localizada a 5' da sequência 701291473H1 e 28 que estas sequências eram quase adjacentes entre si na sequência de cDNA completa do GFRa-4. Em consequência, conceberam-se dois "primers" directos (RAT0-GFRa4-spl e RATO-GFRa4-sp2) na região 5' da sequência 701290919H1 e dois "primers" reversos (RAT0-GFRa4-apl e RATO-GFRa4-ap2) na região 3' da sequência 701291473H1. Todas as sequências dos "primers" utilizados em experiências de PCR estão resumidas na Tabela 3.

Tabela 3: "Primers" utilizados para a amplificação de sequências de GFRa-4 de rato. Os "primers" RACE-apl e RACE-ap2 estão incluídos no estojo de cDNA Marathon Ready™.

Nome Sequência n RAT0-GFRa4-spl GTGGTQACCCCCAACT.ACCT GG 22 RATO-GFRa4-sp2 GCCTTCCGCMGCTTITrAGAAGG 24 RATO-GFRa4-sp3 GCTCTTCTGCGOATGCGAAGGC 22 RATO-GFRa4-sp4 AGCTGCCGGGTTTACTGATGCIAC 24 RATO-GFRa4-sp5 SATGCTACTCTCCCAAGGTCAGGC 24 RATO-GFRa4-sp6 CTÕGTMGCTTTAAGGCAGAGGAQACC 27 RAT0-GFRa4-apl CATGGGAGTCAGCTGTGTTGTCC 23 RATO-GFRa4-ap2 CAGCT GTGTTGTCCATGGTT CÀOC 24 RATO-GFRa4-ap3 TGGTTGGeAGCTOTCAAAGGCTTGWGGC 30 RATO-GFRa4-ap4 GQGGTTCCTTGTAAAAAGCTTGGGGAAGGG 30 RATO-GFRa4-ap5 GGTCGAAGGGCTTCAGGCAGGAAGG 25 RATO-GFRa4-ap6 GCCTTCgCATCCGCAGAAGAGC 22 RATO-GFRa4-ap7 CCAGGTAGTTGGGGGTGACCAGG 23 RATO-GFRa4-ap7b CCCAGGCATTGCGCCACGTA 20 RATO-GFRa4-ap8 CATTGCGCCACGTACTCGG.AGC 22 RATO-GFRa4-ap9 GACCTGAGGGCAAGGGAGTTTCA. 23 RATO-GFRa4-aplO GCAAGGGACfFTTCAGTTCAGTGAGC 25 29 (continuação)

Nome Sequência n RACE-apl CCAICCTAATACGáCTCAGTATAGOSC 27 RACE-ap2 ACTCACTATAGGGCTCGAGCGGC 23

Depois realizou-se uma PCR utilizando os "primers" RAT0-GFRa4-spl e RATP-GFRa4-apl em cDNA Quickclone de cérebro de rato (Clontech Laboratories, Paio Alto, CA, E.U.A.), para confirmar a presença de GFRa-4 de rato em cDNA derivado do cérebro. Uma vez que a sequência de DNA que codifica para a sequência do GFRa-4 de rato tem um teor G+C elevado nesta reqião, as reacções de PCR foram conduzidas utilizando o estojo de PCR Advantage-GC (Clontech). As reacções de PCR foram efectuadas num volume total de 50 μΐ contendo 1 χ tampão de reacção de PCR de cDNA GC, dNTP 0,2 mM, GC-MELTã 1 M, 200 nM dos "primers" RATO-GFRa4-spl e RATO-GFRa4-apl, 1 μΐ de mistura de Taq polimerase Advantage Klen e 1 μΐ de cDNA Quickclone de cérebro de rato. As amostras foram aquecidas para 95°C durante 1 minuto e aplicaram-se ciclos durante 1 minuto a 95°C, 1 minuto a 56°C e 1 minuto a 72°C durante 30 ciclos, com um passo final de 7 minutos a 72°C. Depois efectuou-se uma PCR encaixada em 1 μΐ da reacção de PCR primária com os "primers" RATO-GFRa4-sp2 e RATO-GFRa4-ap2. As reacções de PCR foram conduzidas num volume total de 50 μΐ contendo 1 χ tampão de reacção de PCR de cDNA GC, dNTP 0,2 mM, GC-MELTã 1 M, 200 nM dos "primers" RATO-GFRa4-sp2 e RATO-GFRa4-ap2, 1 μΐ de mistura de Taq polimerase Advantage Klen e 1 μΐ de produto de PCR primária. As amostras foram aquecidas para 95°C durante 1 minuto e aplicaram-se ciclos durante 30 segundos a 95°C, 1 minuto a 56°C e 1 minuto a 72°C durante 25 ciclos, com um passo final de 7 minutos a 72°C. Os 30 produtos de PCR foram analisados num gel de agarose 1% (p/v) em 1 x tampão TAE (Tris-acetato 40 mM, EDTA (sal de sódio) 1 mM, pH 8,3). Dois fragmentos de PCR de, aproximadamente, 1100 e 200 pares de bases, respectivamente, foram excisados do gel e purificados com o estojo de extracção de gel Qiaquick (Qiagen GmbH, Hilden, Alemanha). Sequenciaram-se os fragmentos de PCR para confirmar a sua identidade. O fragmento mais pequeno deu origem a uma sequência de 211 pares de bases correspondente às sequências reunidas 701290919H1 e 701291473H1. O fragmento maior deu origem a uma sequência de 1049 pares de bases das quais 18 pares de bases na extremidade 5', 59 pares de bases na extremidade 3' e uma extensão interna de 92 pares de bases correspondeu à sequência do fragmento de 211 pares de bases, mas com extensões de sequências adicionais intercaladas. Este fragmento representou uma variante do GFRa-4 de rato.

Ambos os clones 701291919H1 e 701291473H1 foram obtidos da Incyte Pharmaceuticals e as inserções foram completamente sequenciadas. As sequências estão incluídas nesta candidatura (sequência 3 = 701290919H1 e sequência 4 = 701291473H1). Ambos os clones foram derivados da mesma biblioteca de cDNA de córtex do cérebro de rato com 7 dias de idade. Ambos os clones diferem nas suas extremidades 5' (primeiros 134 pares de bases em 701291473H1 e primeiros 227 pares de bases em 701290919H1), mas depois são idênticos. Ambos contêm parte da sequência codificadora do GFRa-4 até um codão de terminação (posições 184-186 em 701291473H1 e 277-279 em 701290919H1) . Em ambos os clones está presente uma região 3' não traduzida de 549 pares de bases, seguida de uma cauda poli(A). Pusemos a hipótese de ambos os clones serem variantes diferentes do gene GFRa-4 31 de rato. Conceberam-se "primers" (RATO-GFRa4-ap3 e RATO-GFRa4-ap4) numa parte da sequência comum a ambas as variantes para efectuar experiências 5' RACE, com a finalidade de determinar a extremidade 5' do cDNA de GFRa-4 de rato.

Em primeiro lugar, efectuou-se uma reacção 5' RACE PCR em cDNA Marathon Ready™ de cérebro de rato (Clontech) . As reacções de PCR foram realizadas num volume total de 50 μΐ contendo 1 χ tampão de reacção de PCR de cDNA GC, dNTP 0,2 mM, GC-MELTá 1 M ou 1,5 M, 200 nM dos "primers" RATO-GFRa4-ap3 e RACE-apl, 1 μΐ de mistura de Taq polimerase Advantage Klen e 5 μΐ de cDNA Marathon Ready™ de cérebro de rato. As amostras foram aquecidas para 95°C durante 30 segundos e aplicaram-se ciclos durante 30 segundos a 95°C, 4 minutos a 72°C durante 5 ciclos, depois 30 segundos a 95°C, 4 minutos a 70°C durante 5 ciclos, depois 30 segundos a 95°C, 4 minutos a 68°C durante 25 ciclos, com um passo final de 7 minutos a 68°C. Depois efectuou-se uma PCR encaixada em 1 μΐ da reacção de PCR primária com os "primers" RATO-GFRa4-ap4 e RACE-ap2. As reacções de PCR foram conduzidas num volume total de 50 μΐ contendo 1 χ tampão de reacção de PCR de cDNA GC, dNTP 0,2 mM, GC-MELTá 1 M ou 1,5 M, 200 nM dos "primers" RATO-GFRa4-ap4 e RACE-ap2, 1 μΐ de mistura de Taq polimerase Advantage Klen e 1 μΐ de produto de PCR primária. Aplicaram-se ciclos utilizando exactamente os mesmos parâmetros da PCR primária. Os produtos de PCR foram analisados num gel de agarose 1% (p/v) em 1 χ tampão TAE (Tris-acetato 40 mM, EDTA (sal de sódio) 1 mM, pH 8,3).

Um fragmento de aproximadamente 350 pares de bases foi excisado do gel e clonado no vector plasmidico pCR2.1-TOPO, 32 utilizando o estojo de clonagem TOPO TA de acordo com as instruções do fabricante (Invitrogen BV, Leek, Paises Baixos). Um dos clones resultantes deu origem a uma sequência de inserção de 387 pares de bases que prolongou a sequência de GFRa-4 de rato na direcção 5'. Por tradução, esta sequência de cDNA adicional deu origem a uma sequência proteica sem quaisquer codões de terminação internos e com homologia substancial para as outras sequências de GFRa conhecidas. Uma vez que não foi possivel detectar nesta sequência adicional nenhum codão putativo de inicio ATG, conceberam-se "primers" novos (RATO-GFRa4-ap5 e RATO-GFRa4-ap6) na extremidade 5' desta sequência, para efectuar experiências de 5' RACE adicionais. Em primeiro lugar, efectuou-se uma 5' RACE PCR em cDNA Marathon Ready™ de coração de rato (Clontech) . As reacções de PCR foram realizadas num volume total de 50 μΐ contendo 1 χ tampão de reacção de PCR de cDNA GC, dNTP 0,2 mM, GC-MELTã 1 M, 200 nM dos "primers" RATO-GFRa4-ap5 e RACE-apl, 1 μΐ de mistura de Taq polimerase Advantage Klen e 5 μΐ de cDNA Marathon Ready™ de coração de rato. As amostras foram aquecidas para 95°C durante 30 segundos e aplicaram-se ciclos durante 30 segundos a 95°C, 4 minutos a 72°C durante 5 ciclos, depois 30 segundos a 95°C, 4 minutos a 70°C durante 5 ciclos, depois 30 segundos a 95°C, 4 minutos a 68°C durante 25 ciclos, com um passo final de 7 minutos a 68°C. Depois efectuou-se uma PCR encaixada em 1 μΐ da reacção de PCR primária com os "primers" RATO-GFRa4-ap6 e RACE-ap2. As reacções de PCR foram conduzidas num volume total de 50 μΐ contendo 1 χ tampão de reacção de PCR de cDNA GC, dNTP 0,2 mM, GC-MELTã 1 M, 200 nM dos "primers" RATO-GFRa4-ap6 e RACE-ap2, 1 μΐ de mistura de Taq polimerase Advantage Klen 33 e 1 μΐ de produto de PCR primária. Aplicaram-se ciclos utilizando exactamente os mesmos parâmetros da PCR primária. Os produtos de PCR foram analisados num gel de agarose 1%. Um fragmento de aproximadamente 200 pares de bases foi excisado do gel e clonado no vector plasmidico pCR2.1-TOPO, utilizando o estojo de clonagem TOPO TA como descrito acima. A sequenciação de dois clones resultantes prolongou a sequência de GFRa-4 de rato por mais 128 pares de bases na direcção 5'. Com base nesta sequência concebeu-se outro conjunto de "primers" (RATO-GFRa4-ap7 e RATO-GFRct4-ap8) para efectuar experiências de 5' RACE adicionais. A RACE PCR foi realizada em cDNA Marathon Ready™ de cérebro, coração e rim de rato. As reacções de PCR foram realizadas num volume total de 50 μΐ contendo 1 χ tampão de reacção de PCR de cDNA GC, dNTP 0,2 mM, GC-MELTá 1 M, 200 nM dos "primers" RATO-GFRa4-ap7b e RACE-apl, 1 μΐ de mistura de Taq polimerase Advantage Klen e 5 μΐ de cDNA Marathon Ready™ de coração, cérebro ou rim de rato. As amostras foram aquecidas para 95°C durante 30 segundos e aplicaram-se ciclos durante 30 segundos a 95°C, 4 minutos a 72°C durante 5 ciclos, depois 30 segundos a 95°C, 4 minutos a 70°C durante 5 ciclos, depois 30 segundos a 95°C, 4 minutos a 68°C durante 25 ciclos, com um passo final de 7 minutos a 68°C. Depois efectuou-se uma PCR encaixada em 1 μΐ da reacção de PCR primária com os "primers" RATO-GFRa4-ap8 e RACE-ap2. As reacções de PCR foram conduzidas num volume total de 50 μΐ contendo 1 χ tampão de reacção de PCR de cDNA GC, dNTP 0,2 mM, GC-MELTá 1 M, 200 nM dos "primers" RATO-GFRa4-ap8 e RACE-ap2, 1 μΐ de mistura de Taq polimerase Advantage Klen e 1 μΐ de produto de PCR primária. Aplicaram-se ciclos utilizando exactamente os 34 mesmos parâmetros da PCR primária. Os produtos de PCR foram analisados num gel de agarose 1%. Vários fragmentos de dimensão variando desde aproximadamente 200 pares de bases até 1200 pares de bases eram visiveis no gel e foram excisados e clonados no vector pCR2.1-TOPO, utilizando clonagem TOPO-TA. Sequenciaram-se as inserções de vários clones. A partir destes clones foi possível prolongar a sequência do GFRa-4 de rato na direcção 5'. Identificaram-se duas sequências diferentes. Uma sequência prolongou a sequência do GFRa-4 de rato em 215 pares de bases na direcção 5' e incluía um codão de início na estrutura precedido por um codão de terminação a montante na estrutura. A sequência proteica prevista resultante (52 resíduos de aminoácidos adicionais) inclui um péptido de sinal previsto de 29 resíduos de aminoácidos (como determinado pelo programa SPScan incluído no pacote Wisconsin versão 10.0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wisconsin, E.U.A.; pontuação 7,0, probabilidade l,171e-02). A outra sequência determinada por estas experiências de 5' RACE prolongou a sequência do GFRa-4 de rato em 552 pares de bases na direcção 5' e também incluía um codão de início na estrutura precedido por um codão de terminação a montante na estrutura. Os 79 pares de bases mais a 3' desta sequência nova eram idênticos aos 79 pares de bases a 3' da sequência de 215 pares de bases, mas o resto da sequência era diferente. No entanto, a sequência proteica prevista resultante (113 resíduos de aminoácidos adicionais) não tinha uma sequência de péptido de sinal prevista no terminal NH2 (SPScan, pacote do GCG). As diferentes sequências de cDNA parciais resultantes das subsequentes experiências de 5' RACE juntamente com as sequências da base de dados da Incyte foram comparadas e 35 reunidas em diversas variantes possiveis do GFRa-4 de rato. Para identificar quais das variantes identificadas são reais, conceberam-se "primers" a 5' do codão de inicio da tradução ("primers" RATO-GFRa4-sp4 e RATO-GFRa4-sp5 para a variante 5' "longa" resultante do fragmento de RACE de 552 pares de bases, e RATO-GFRa4-sp6 para a variante 5' "curta" resultante do fragmento de RACE de 215 pares de bases) e a 3' do codão de terminação da tradução (RATO-GFRa4-ap9 e RATO-GFRa4-aplO) . Em seguida, utilizaram-se estes "primers" para amplificar as sequências codificadoras completas do GFRa-4 utilizando cDNA derivado de diferentes tecidos de rato.

Em primeiro lugar, sequências que codificam para a variante 5' "longa" foram amplificadas por PCR. As reacções de PCR foram realizadas num volume total de 50 μΐ contendo 1 x tampão de reacção de PCR de cDNA GC, dNTP 0,2 mM, GC-MELTã 1 M, 200 nM dos "primers" RATO-GFRa4-sp4 e RATO-GFRa4-ap9, 1 μΐ de mistura de Taq polimerase Advantage Klen e 5 μΐ de cDNA Marathon Ready™ de coração, cérebro ou rim de rato. As amostras foram aquecidas para 95°C durante 1 minuto e aplicaram-se ciclos durante 45 segundos a 95°C, 1 minuto a 57°C e 1 minuto a 72°C durante 35 ciclos, com um passo final de 7 minutos a 72°C. Depois efectuou-se uma PCR encaixada na reacção de PCR primária com os "primers" RATO-GFRa4-sp5 e RATO-GFRa4-aplO. As reacções de PCR foram conduzidas num volume total de 50 μΐ contendo 1 χ tampão de reacção de PCR de cDNA GC, dNTP 0,2 mM, GC-MELTá 1 M, 200 nM dos "primers" RATO-GFRa4-sp5 e RATO-GFRa4-aplO, 1 μΐ de mistura de Taq polimerase Advantage Klen e 1 μΐ de produto de PCR primária. Aplicaram-se ciclos utilizando exactamente os mesmos parâmetros da PCR primária, com a excepção de se 36 terem realizado 30 ciclos de PCR em vez de 35. Os produtos de PCR foram analisados num gel de agarose 1%. Vários fragmentos de dimensão variando desde aproximadamente 1000 até 1250 pares de bases foram excisados do gel e clonados no vector pCR2.1-TOPO, utilizando a clonagem TOPO-TA. Sequenciaram-se as inserções de vários clones. Em seguida, as sequências que codificam para a variante 5' "curta" foram amplificadas por PCR. As reacções de PCR foram realizadas num volume total de 50 μΐ contendo 1 χ tampão de reacção de PCR de cDNA GC, dNTP 0,2 mM, GC-MELTã 1 M, 200 nM dos "primers" RATO-GFRa4-sp6 e RATO-GFRa4-ap9, 1 μΐ de mistura de Taq polimerase Advantage Klen e 5 μΐ de cDNA Marathon Ready™ de coração de rato. As amostras foram aquecidas para 95°C durante 5 minutos e aplicaram-se ciclos durante 30 segundos a 94°C, 1 minuto a 57°C e 2 minutos e 30 segundos a 72°C durante 35 ciclos, com um passo final de 7 minutos a 72°C. Os produtos de PCR foram analisados num gel de agarose 1%. Vários fragmentos de dimensão variando desde aproximadamente 1500 até 2200 pares de bases foram excisados do gel e clonados no vector pCR2.1-TOPO, utilizando a clonagem TOPO-TA. Sequenciaram-se as inserções de vários clones. A análise de todas as sequências obtidas (foram completamente sequenciados 16 clones resultantes) permitiu dividir a sequência de DNA do GFRa-4 de rato em 6 extensões de sequências comuns a todas as variantes identificadas, com 5 extensões de sequências intervenientes presentes ou ausentes, dependendo da variante. Todas as 5 sequências intervenientes contêm sitios de consenso de sítios de processamento 5' e 3' (GT na extremidade 5' e AG na extremidade 3' da sequência do intrão) (Senapathy et ai., 1990) (ver tabela 4 abaixo) e, assim, podem representar potencialmente intrões não processados. 37

Para fortalecer a hipótese das variantes identificadas poderem resultar da conservação de intrões não processados em certos transcritos de mRNA, comparou-se a sequência do GFRa-4 de rato com a sequência genómica do GFRa-1 humano (Angrist et al., 1998). Desta análise ficou claro que as sequências GFRa-4 comuns a todos os transcritos coincidiram com exões em GFRa-1 (ver tabela 4 abaixo) . As sequências intervenientes ausentes nalguns transcritos coincidiram com sequências de intrões no GFRa-1 humano. Em consequência, considerámos todas as sequências intervenientes como intrões não processados. 0 intrão presente entre o exão 5 e o exão 6 pode ser removido por processamento de dois modos diferentes e resulta na presença de duas variantes de processamento diferentes do GFRa-4 de rato, que denominámos variante A e variante B. A sequência 5 mostra a sequência de consenso do GFRa-4 de rato incluindo as sequências de intrões (intrão 1: pares de bases 125 até 684; intrão 2: pares de bases 1040 até 1088; intrão 3: pares de bases 1199 até 1278; intrão 4: pares de bases 1414 até 2154; intrão 5A: pares de bases 2247 até 2385 e intrão 5B: pares de bases 2231 até 2314). Detectou-se um polimorfismo na posição 2244 da sequência 5, com T presente em 50% dos clones sequenciados e C nos outros 50%. Este polimorfismo conduz a uma alteração de aminoácidos na proteina (variante A) de W para R, na região hidrófoba envolvida na ancoragem de GPI. A Figura 1 mostra esquematicamente a estrutura do gene GFRa-4 de rato juntamente com o cDNA derivado para as variantes de processamento A e B, após remoção por processamento das sequências de intrões, e as sequências proteicas traduzidas das variantes A e B com as suas características. A Tabela 4 mostra a sequência de DNA nas fronteiras intrão-exão 38 juntamente com as dimensões dos intrões e exões identificados. A coluna da direita mostra as dimensões dos exões correspondentes na sequência genómica do GFRa-1 humano (de Angrist et ai., 1998).

Tabela 4: Estrutura intrão-exão do GFRa-4 de rato.

Exão Dimensão (pares de bases) Dimensão do intrão (pares de bases) Aceitador de processamento Dador de processamento Imensão do exão do GFRa-1 correspondente (pares de bases) 1 >124 560 — GAGgtesgçagçt — 2 355 49 cec&atcagGGT CCGgígajtgcçtç 337 3 110 80 ScsegcgcagGCC TAGglaegetggg 110 4 135 741 gtccdgcagGCA TGGgtgaggggge 135 5 92 139 (vara) 84 (varB) catàecaÊagATS CGQgtagg&tgg TGGgtgctgSttc 182 6 >137 ttgtcccasgGTG ccctctcagGCA 753 A sequência de consenso obtida por remoção dos intrões 1 até 4 e do intrão 5A (sequência 6; variante A) é traduzida numa proteina com 273 residuos de aminoácidos, com uma massa molecular calculada de 29,7 kDa e um ponto isoeléctrico de 8,92 (sequência 8). A sequência de consenso obtida por remoção dos intrões 1 até 4 e do intrão 5B (sequência 7; variante B) é traduzida numa proteina com 258 residuos de aminoácidos, com uma massa molecular calculada de 28,0 kDa e um ponto isoeléctrico de 8,91 (sequência 9). A Figura 2 mostra o alinhamento das variantes A e B do GFRa-4 de rato. Ambas as sequências proteicas são semelhantes às sequências GFRa conhecidas e diferem entre si apenas numa pequena extensão de aminoácidos no terminal carboxi. Estas duas sequências representam provavelmente 39 variantes do GFRa-4 biologicamente activas. Uma vez que todas as outras variantes sequenciadas contêm uma ou mais sequências de intrões, são provavelmente intermediários do processamento de RNA. Não é claro o motivo por que todos estes intermediários estão presentes em cDNA derivado de mRNA purificado e por que é tão dificil amplificar uma sequência de cDNA derivada de um transcrito de mRNA completamente processado. Os GFRa-1 até -4 caracterizam-se por uma sequência COOH-terminal típica de uma proteína ancorada a glicosilfosfatidilinositol (GPI), consistindo numa região hidrófoba de 17-31 resíduos de aminoácidos precedida por uma sequência hidrófila contendo uma extensão de três aminoácidos pequenos, como Asp, Cys, Ala, Ser, Gly ou Asn (Gerber et al., 1992). A sequência proteica da variante A do GFRa-4 de rato tem um terminal carboxi hidrófobo de 21 resíduos de aminoácidos (posições 253 até 273) precedido por dois possíveis sítios de clivagem de GPI (DSS na posição 234 até 236 ou NAG na posição 250-252) . A variante B tem um terminal carboxi hidrófilo mais pequeno, implicando que, para esta variante, não é possível ancoragem de GPI. Isto pode significar que a variante B é uma forma solúvel do receptor GFRa-4 de rato. Em ambas as variantes está presente um péptido de sinal previsto de 29 aminoácidos (determinado pelo programa SPScan incluído no pacote do GCG; pontuação 7,0, probabilidade l,171e-02). Adicionalmente está presente um sítio possível para glicosilação N-ligada (NVS na posição 192 até 194 da proteína).

Recentemente foi proposto um modelo para a estrutura de domínios dos GFRa's com base na comparação das sequências dos GFRa-1 até -3 de ratinho e GFRa-4 de galinha (Airaksinen et al., 1999). O modelo inclui três domínios 40 ricos em cisteína conservados reunidos por sequências adaptadoras menos conservadas. As moléculas estão ancoradas à membrana por uma âncora de GPI. O GFRa-4 de rato está parcialmente conforme a este modelo, uma vez que também contém a segunda e terceira regiões ricas em cisterna e uma possivel âncora de GPI (pelo menos para a variante A) . No entanto, difere significativamente dos outros GFRads pelo facto da primeira região rica em cisterna estar ausente. A Figura 3 mostra o alinhamento das variantes A e B do GFRa-4 de rato com o GFRa-1 de rato (EMBL n° de acesso U59486), GFRa-2 de rato (EMBL n° de acesso AF003825), GFRa-3 de ratinho (EMBL n° de acesso AB008833) e GFRa-4 de galinha (EMBL n° de acesso AF045162) . O alinhamento foi feito utilizando o programa de alinhamentos ClustalW (EMBL, Heidelberg, Alemanha). A identidade percentual e a semelhança percentual entre membros da família GFRa foram calculadas por comparação em pares das sequências utilizando a ferramenta de "software" GeneDoc (versão 2.5.000); os resultados estão apresentados na Tabela 5 abaixo.

Tabela 5: % identidade e % semelhança (entre parênteses) entre membros da família GFRa. Os números de acesso das sequências utilizadas na análise estão mencionados no texto. rGFRo-1 fGFRtt-2 ísGFRk«3 eGFR«-4 fGFRte-4 (A) rGFRtt-4 (BJ rGFRa-1 103 43 (80) 15(23) 38(55) 20 (2S) 20(28) rGFRa-2 100 18(28) 40 (56) 21 (32) 21(31} roGFR«-3 ISO 16 (25) 22(30} 20(29} cGFRa-4 100 27(37) 26(35} ?GFRa-4(A> 100 92(92) ?GFRa-4íBj 100 41

Foram identificados até à data quatro membros da familia GDNF de factores neurotróficos (GDNF, NTN, PSP, ENV/ARTN). Todos os quatro sinalizam através de ligação a um receptor GFRa especifico ligado a GPI (GFRa-1 para GDNF, GFRa-2 para NTN, GFRa-3 para EVN/ARTN e GFRa-4 (de galinha) para PSP) em combinação com uma tirosina quinase transmembranar comum, cRET. O GFRa-4, o co-receptor da PSP, só foi identificado em galinha, não se tendo ainda descoberto o correspondente de mamífero. A semelhança entre o GFRa-4 de rato descrito na presente candidatura e o GFRa-4 de galinha é 37% (27% de identidade) , sugerindo que o GFRa-4 de rato é um membro novo da família GFRa. 0 GFRa-4 pode ser o receptor da persefina de mamífero ou, alternativamente, pode ser o receptor de um membro da família GDNF não identificado.

Ligação especifica de persefina ao GFRg-4

Prepararam-se do modo seguinte construções para a expressão de proteínas de fusão GFRa-IgG-Fc solúveis. Regiões de cDNA do GFRa-1, GFRa-2 e GFRa-3 humanos, GFRa-4 de galinha e variante A do GFRa-4 de rato (que codificam para os resíduos de aminoácidos 27 até 427, 20 até 431, 28 até 371, 20 até 399 e 29 até 252, respectivamente), excluindo as sequências que codificam para o péptido de sinal e para a região hidrófoba COOH-terminal envolvida na ancoragem de GPI, foram clonados na estrutura no vector de expressão Signal plg plus (R&D Systems Europe Ltd., Abingdon, R.U.). Confirmaram-se as inserções de todas as construções por análise de sequências completas de DNA. As proteínas resultantes expressas a partir destas construções 42 contêm um péptido de sinal CD33 NH2-terminal com 17 resíduos de aminoácidos, a respectiva região da proteína GFRa e um domínio de fusão IgGi-Fc humano COOH-terminal com 243 resíduos de aminoácidos. As proteínas de fusão foram expressas em células CHO e purificadas como descrito. Células de ovário de hamster chinês (CHO) foram rotineiramente cultivadas em meio DMEM/F12 suplementado com soro fetal de vitelo inactivado pelo calor 10%. As células foram transfectadas com construções de fusão GFRa-IgGFc utilizando um método optimizado de Lipofectamina Plus. Para este fim, uma quantidade total de 6,5 μρ de DNA foi incubada com 17,5 μΐ de reagente PLUS em 750 μΐ de meio sem soro durante 15 minutos à temperatura ambiente. A lipofectamina foi diluída 50 vezes para o meio de cultura sem soro e adicionaram-se 750 μΐ desta mistura à solução de DNA. Após uma incubação de 15 minutos à temperatura ambiente, adicionaram-se 3,5 ml de meio sem soro e adicionou-se a mistura às células (numa placa de Petri de 10 mm) . As células foram incubadas durante 3 horas a 37°C em 5% de C02, após o que se adicionaram 5 ml de meio de cultura contendo soro fetal de vitelo inactivado pelo calor 20%. Passadas 24 horas, o meio foi mudado para meio de cultura regular. As eficiências da transfecção utilizando estas condições optimizadas foram tipicamente 50-60%. Para transfecções permanentes, o meio de selecção continha quer 800 μρ de G418 quer 800 μρ de G418 e 800 μρ de higromicina. Os clones resistentes aos antibióticos foram expandidos e avaliados quanto à expressão utilizando anticorpos específicos. As proteínas de fusão GFRa-IgGFc foram purificadas do meio de células CHO transfectadas permanentemente ou transitoriamente por cromatografia com proteína A. A proteína ligada foi eluída com Na-citrato 0,1 43 Μ, ρΗ 3,0, e foi recolhida em tampão Tris 1 M, pH 8,4 (razão de diluição 1:6). Estimou-se a concentração de proteína por absorvância a 280 nm, utilizando um

coeficiente de extinção de 1,5. Efectuaram-se experiências de ressonância de plasmões de superfície (SPR) a 25°C utilizando um instrumento BIACORE 3000 (Biacore AB,

Uppsala, Suécia). O "chip" sensor CM5, o estojo de acoplamento de amina e tampões utilizados também foram adquiridos à Biacore AB. Como ligandos imobilizados utilizaram-se PSP, NTN, EVN/ART e GDNF recombinantes. O GDNF humano recombinante foi adquirido à R&D Systems Europe Ltd. (Abingdon, R.U.) . A NTN humana, PSP de rato e EVN/ART humana recombinantes com caudas de 6His NH2-terminais foram produzidos em E. coli como descrito previamente (Creedon et al., 1997). A matriz carboxilada de um "chip" sensor CM5 foi primeiramente activada com uma mistura 1:1 de N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida 400 mM e N-hidroxissuccinimida 100 mM durante 10 minutos. Os factores neurotróficos recombinantes foram aplicados na superfície activada em tampão de acetato de sódio 10 mM, pH 4,5, a uma taxa de fluxo de 5 μΐ/minuto. Os grupos carboxilo que não reagiram foram bloqueados com etanolamina-HCl 1 M. Para experiências de ligação, as proteínas GFRa-IgGFc solúveis foram super-fundidas utilizando o programa Kinject a 30 μΐ/minuto. As concentrações de GFRa-IgGFc utilizadas em experiências de cinética situaram-se entre 1 e 100 nM em solução salina tamponada com Hepes (NaCl 150 mM, sal de sódio de EDTA 3,5 mM, polissorbato 20 0,005%, Hepes 10 mM, pH 7,4). A associação dos receptores GFRa aos ligandos imobilizados foi monitorizada durante 3 minutos e a dissociação durante 1 minuto, seguida de regeneração com tampão de glicina 10 mM. A dissociação foi iniciada por 44 super-fusão com solução salina tamponada com Hepes. Para melhorar a qualidade dos dados do sensor utilizou-se referência dupla (Myszka, 1999). Os dados foram analisados utilizando uma análise global com o "software" de avaliação da BIACORE (versão 3.0.1). A análise global calcula a velocidade de associação (ka) e velocidade de dissociação (kd) simultaneamente, e depois calcula-se a constante de dissociação de equilíbrio aparente (KD) na forma de kd/ka. Utilizou-se um modelo de Langmuir 1:1 simples para ajustar os dados. Foi possivel detectar ligação especifica à PSP com ambas as proteínas de fusão GFRa-4-IgGFc de rato e galinha. A ligação observada de GFRa4-IgGFc foi especifica, pois não ocorreu ligação a GDNF, NTN ou EVN/ART. Experiências de controlo confirmaram a ligação de GFR-1 a GDNF, de GFRa-2 a NTN e de GFRa-3 a EVN/ART. A partir das curvas de ligação, obtidas utilizando três determinações a concentrações diferentes de GFRa4-IgGFc de rato e galinha, derivaram-se as constantes de ligação ka (velocidade de associação) e kd (velocidade de dissociação) (Tabela 6).

Tabela 6: Ligação de persefina a GFRa-4 de galinha e GFRa— 4 de rato

Constantes de ligação para a ligação de GFRa-4-IgGFc de galinha e GFRa-4-IgGFc de rato a persefina imobilizada determinadas por SPR. A velocidade de associação (ka) , velocidade de dissociação (kd) e constante de dissociação de equilíbrio aparente (KD) médias ± erros padrão foram derivadas das curvas de ligação obtidas utilizando 3 determinações a diferentes concentrações dos respectivos receptores solúveis. 45 kad/Ms) kd (1 / s) Kd(M) GFRa-4 de galinha 2,3 ± 2,6 x 104 8,3 ± 5,1 χ IO'4 5,4 ± 2,9 x IO'9 GFRa-4 de rato 2,7 ± 1,6 x 104 1,1 ± 0,2 χ IO'3 5,9 ± 2,8 x IO'9

Apesar dos valores KD aparentes serem muito semelhantes para ambas as proteínas de fusão, os valores de Rmax foram significativamente diferentes. Obtiveram-se rotineiramente níveis de ligação de ~1000 unidades relativas (RU) com GFRa-4-IgGFc de galinha, ao passo que os níveis de ligação do GFRa-4-IgGFc de rato foram aproximadamente 20 vezes menores, cerca de 50-60 RU. Isto pode dever-se a diferenças de concentração das proteínas de fusão activas GFR-4-IgGFc de galinha e GFRa-4-IgGFc de rato. A constante de dissociação de equilíbrio calculada KD de 5,9 ± 2,8 nM (n=3) sugere que o GFRa-4 de rato é um receptor específico para a persefina.

Análise de coloração "Northern"

Colorações "Northern" contendo 2 μρ de RNA rico em poli(A) derivado de diferentes tecidos de roedores (coloração MTN™ de ratinho, coloração MTN™ de embrião de ratinho e coloração MTN™ de rato; Clontech Laboratories) foram hibridizadas, de acordo com as instruções do fabricante, com um fragmento de 948 pares de bases etiquetado de iniciação aleatória a-[ P]-dCTP (estojo HighPrime, Roche Diagnostics) derivado da sequência codificadora do GFRa-4 de rato (como na sequência ID N° 6). Efectuaram-se lavagens de restrição em 0,1 χ SSC / 0,1% SDS a 50°C (as duas colorações de ratinho) ou 55°C (a coloração de rato). Os resultados estão apresentados na Figura 4. No rato foi possível detectar um sinal muito 46 fraco perto de 2,3 kb em coração, cérebro, fígado e testículos. Um segundo transcrito ainda mais fraco estava presente perto de 1,4 kb nos mesmos tecidos. Em ratinho, um transcrito de 1,35 kb foi o mais intenso em cérebro e testículos, com um sinal muito mais fraco presente perto de 2 kb. Expressão de mRNA muito fraca do transcrito de 1,35 kb também estava presente em embrião de ratinho de 15 dias e 17 dias. A dimensão do transcrito mais pegueno está de acordo com a dimensão prevista da seguência codificadora do GFRa-4 (± 880 pares de bases + a região 3' não traduzida de 570 pares de bases).

Localização cromossómica do GFRg-4 de rato, ratinho e humano

Um fragmento de cDNA de GFRa-4 de rato de 0,95 kb (contendo a sequência codificadora completa da variante A do GFRa-4 de rato) e um fragmento de 2,3 kb correspondente à sequência genómica do GFRa-4 de rato (ver sequência ID N° 5) foram utilizados como sondas em análise de hibridização in situ fluorescente (FISH) em cromossomas de rato. Estas sondas tinham sobreposição parcial. Uma mistura das duas sondas (1 μρ de DNA total) foi etiquetada com digoxigenina-ll-dUTP (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemanha) por tradução por cortes (Life Technologies), produzindo uma dimensão do fragmento de sonda final de 200-400 pares de bases. A sonda etiquetada foi misturada com tampão de hibridização (formamida 50%, 2 χ SSC, sulfato de dextrano 10%). Após desnaturação, a mistura foi colocada em lamelas de cromossoma de rato na metafase (Islam e Levan, 1987, Helou et al., 1998) desnaturadas a 72°C durante 2 minutos em formamida 70%, 2 χ SSC. Após hibridização 47 durante 48 horas a 37°C, as preparações foram lavadas durante 15 minutos em formamida 50%, 2 χ SSC. Procedeu-se à detecção de cromossomas etiquetados por anti-digoxigenina FITC comum. Os espalhamentos cromossómicos foram contra-corados com 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI). Os resultados foram derivados de micrografias de 100 células diferentes. Devido à pequena dimensão das sondas registou-se um fundo considerável. No entanto, a maior parte das células estudadas exibiu etiquetagem na posição RN03q36 (Figura 5) . Cerca de 35% dos estudos de metafase exibiu etiquetagem de "dupla mancha" em ambos os homólogos de RN03, ao passo que cerca de 50% tinha manchas duplas apenas num dos homólogos ou etiquetagem de "mancha simples" em ambos os homólogos. Nenhum outro sítio cromossómico exibiu etiquetagem em várias células. Com base no mapeamento comparativo, é de esperar que o locus correspondente de ratinho esteja localizado em MMU2 (banda F), ao passo que uma localização humana possível para o gene será HSA2, HSA15 ou HSA20. De acordo com isto, as sequências genómicas do GFRa-4 de ratinho e humano identificadas na base de dados EMBL (N° de Acesso AF155960 para ratinho e AC017113 para humano) derivam do cromossoma 2 de ratinho (clone BAC 389B9) e do cromossoma 2 humano (EMBL número de acesso AC013324; BAC388_K_24map2), respectivamente.

Referências

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Lista de abreviaturas ARTN artemina BLAST ferramenta básica de busca de alinhamentos locais bp pares de bases cDNA DNA complementar SNC sistema nervoso central EST marcador de sequência expressa EVN enovina GDNF factor neurotrófico derivado da linha de células gliais GFRa receptor α da família GDNF GPI glicosilfosfatidilinositol NTN neurturina PCR reacção em cadeia de polimerase SNP sistema nervoso periférico PSP persefina SSP probabilidade da menor soma TGF-β factor de transformação do crescimento β LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Janssen Pharmaceutica N.V. et al. <120> Receptor de Factores Neurotróficos <130> 53202/001 57 <140> PCT/EPOO/04918 <141> 2000-05-26 <150> GB 9915200.1 <151> 1999-05-29 <160> 9 <17 0> Patentln Versão <210> 1 <211> 792 <212> DNA <213> Mus musculus <4 0 0> 1

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<210> 5 <211> 2522 <212> DNA <213> Rattus rattus <4Ο0> 5 60 ctggtaagct ttasggcaga qgagacçtaa gsgetgag&c afcgctatgtt gagtggagcg 60 tattfcaçggg tgcfcgaatga gággceaggc eaggcagçtt tatggagtct tggatgccag 120 agaggtaagg aggtgggaaa ggaagtacta taaacctgaa ttfcggtgset tggctggatt 180 tgcstâtgtc «agtgceaag ttcagaeata gctgccgggt ttactgatge tactctccca 240 agftcâgges ttctatkttC cçctgaatgg cttttcatct gtgaettste taeatcttca 300 etgaaactac tggtàsscgt ccaggtctgfc ctcagggega agteetstgg_tetgccafcfca 360 agçctcagtg tcetgteagg tgaagctggg geggatggaa ggggtccsgt agaegètctg 420 EfSfcgcatgt çcc&gttetg gaçatggtgg tggaggct-ga acctgagctt ctggggaace 480 tcegagtact gcctccaktc acgacetggg tggatatccc taggacctgc ccatgccçgv S40 tccctcagga $a.33cgggtc acgcctatgg gccacactct ctceccttgg gtttgggfc.afc 600 ctgcccccag cccccgccaa attccggggt gtggaatgtg gagaaçcaag eacagagggc 660 tgeagrcctgc cctcccetca ccagggtcag cgagctccac tgaggggaat cgctgcgtgg ?20 -aagcsgccga ggcgfcgcaca gcagacgagc agtgccagca gctgcgctcc gagtacgtgg 180 cgcaatgcct gggccgggcg ggctggcggg gecccgggag cfcgcgtgcgc" tccegctgcc 840 gccgtgírcct gcgcçgctte ttcgcccgcg ggcctccggc gctcacgeac gcgctgctet- 900 tctgcggatg cgaaggcecc gcgtgcgccç agcçccggeg ccagacattc gcgcccgcct 960 gegcgtfcetc cggcccccag etggegecac ettostgccfc çaagccctfcg gaccgctgcg 1020 agcgaagccg ccggtgecgg tgcgtgeggg gcgggetggg ccgctcaccg gcgtccgggc 1080 gcgcgcaggc cccgtctett tgcettccag g-cckcatgcg ctcccgcgcc cggctcccge ,114© gacggctgtc cggaggaggg ggçcccgcgg tgtctgcgcg ccfcacgcagg çcttgtaggfc 1200 «cgctgggog gcctctggeg ggeggggcgg cggaggcaga ttcegggggc ccgtcacagg 1260 tectgggggt ccctgcâggc acçgtggtca cccccaacta cctggacaae gtgagcgege 1320 gcgttgcgcc ctggtgogge tgfcgaggeca gcggaaaccg gegcgaagag tgcgaagcek 1380 tccgcaagct ttttacaagg aacçoctgcfc tgggtgaggg ggctggagag cccgggcaac 1440 cásggacgte tatggcccag tetaggctgo ctggcctgtg gggaccetta aaatgttttc 1500 gtcgtgfccgt atttggtgtg gg«gatgg«c agtgtgcaeg tgceatggtg «atgggtgga 1560 agtoagagga eaacttgtca gtcitctttct accacgtggg tccccgggat agcactçggc 1620 tcatcagçtt tggtggcaag tgcctttgcç tgctgagcca tcttgctggc «gatgtgagc 1680 acstttttga tggaaagaaa ctgaggtttc csgagaeeag atagccgatc accagagaat 1340 tcgagagatg teaagaatct ettagggcta gasaggatga gttaaaacat gtxcaatgae 1800 etggagttgg ccaaggckcc çtttggcact actgaggtet tttocfceeat gtgttcccaa 1860 tttaaegccg ctgttcttgc ctcgggatg* aatagegttg ttccagattt ctgggggccc 1920 ggittgaagc ctgtctctge caettcgtag ccgegagtta aaetettatt aatcctaatt 1980 gtgttçacct gtaagggcgg ggtgtgcact tgtcaaccte actcttagca cagtgaccct 2040 ©catctcagg ccgtgccttg cagattecag ggggtgtctc attttgtctc aagggagtgg 2100 agetgtttct agggtttcct ggceaaacct tctctggate tctccactcc atagatggtg 2160 ccatacaagc ctttgaoagc te^rcaaccat cagttctgca ggaccagtgg aaoccotacc 2220 agaatgctgg gtgcfcgtttc cigtgggtag gtatggggag aggatgtgga gttggcagtt 2280 tctcatcgtt ecctfcctgta tttaccettc tcággcaggc caaggtggag gcckgagtgg 2340 ectgagaaga gatggaggea gaaa«ggtcc ccgttt«g«o ccaaggtgtc ctffgatgfccc 2400 akactcactg ccctggctct ccaggccctg ctctaattag gaaggtgaac catggaoaaç 2460 acagctgact gcgatgtctc tggattatge tcactgaacfe gaaaoteect tgeecteagg .2520 tc 2522 61

<210> 6 <211> 953 <212> DNA <213> Rattus rattus <400> 6 ctggtaaget tatttaeggg agagggteag gcagaegagc ggetggcggg ttcgceegeg gçgtgcgceg ctçgcgccac ceccgtctcfc eeggaggagg acccccaact ageggaaaee ttggatggtg aacccctacc gccctggctc fctaaggcaga t.gctgaa r.ga cgagctccae agtfceagça gscccgggag ggcctceggc agegeeggeg cttcctgcct ttgcettcea ggggcccgcg acctggacaa ggegcgaagâ ccatacaagc agaatgctgg tceaggccct gg&gacctaa gaggccagge tgaggggaat gçtgcgetce stgegtgcgc gcfccacgcac çcagacatte gaagcccttg ggcctcatgc gtgfcctgege cgfcgagcgeg gtgegaagcc ctttgacagc gtgctgtttc gctctaatfca gagetgagac caggcagttt egctgçgtgg gagtaegtgg tçççgçtgcq gegetgetet gegcecgcct gacegetgcg gctccegcgc gcetaegeag cgcgttgege ttcegcaagc tegeaaeeat ctgtgggtgt ggasggtgaa atgcfcatgtt fcafcggagtct aageagççga cgcaatgect gçggtgccct tetgegçatg gcgcgttctc agegaágccg ccggctcccg gccttgtagg cctggtgcgq ttt Ctaeaag eagttcegea ectcgatgts ccatggacaa gagtggagcg tggatgceag ggegtgeaca gggccgggcg gcgcegcttç egaaggceec c.ggcccceag ecggtgeegg cgacggctgt caecgtggtc ctgtgaggcc gaacccetgc ggaceagtgg eat»ctc&ct caeagctgac ÊO 120 im 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 tgccatgtet ctggsttatg tfãsséteee fctgeeeteag gte 353 <210> 7 <211> 1008

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<210> 8 <211> 273 <212> PRT <213> Rattus rattus <400> 8

Met Leu Ser Gly Ala Tyr Leu Arg Vai Leu Asn. Glu Arg Pr o Gly Gin 1 5 10 15

Ala Vai Leu Trp Ser Leu Gly Cys Gin Arg Gly Ser Ala Ser Ser Thr 20 25 30 61a Gly Asrs Arg Cys Vai 61u Ala Ala G.lu Ala Cy* Thr Ala Asp 61» 35 40 45

Gin Cys Gin Gin* Leu Arg SerGiu Tyr Vai Ala Gin Cys Leu Gly Arg 50 55 '60

Ala. Gly Trp Arg Gly Pr o Gly Ser Cys Vai Arg Ser Arg Cys Arg Arg 65 70 75 80

Ala Leu Arg Arg Ph® Phe Ala Arg Gly Pro Pro Ala Leu Thr Sis Ala 05 90 55 63

Leu Leu Phe Cys Gly Cys· Glu Ciy Paro Ala Cys Aid Glu Are Are Ar® 10Õ 105 ' 110

Gin Thr Phe Ala Fro-Ala Cys Ala Phe serGly Pro Gin Leu Ala Pr o 11S 120 125

Pro Ser Cys Leu Lys Pro Leu Asp Arg Cys Glu Arg Ser Arg Arg Cys 130 135 140

Arg Pro Arg Leu Phe Ala Phsg Gin Ala Ser Cys Ais Oro Ala Oro Gly 145 150 155 1€0

Cys Pro Glu Glu Gly Gly Pro Arg Cys Leu Arg Ala 165 170 175 » VàX G.ly fhr Vai vai Tht Pro Aso Tyr Lau Asp &sn 165 190

Ser àrg Asp Gly

Arg Arg Glu Glu Cys Glu Ala Phe 210 215

Cys Leu Asp Gly Ala He Gin Ala 22S 230

Leu Gin Asp Gin Xrp Asn Pro Tyr 245

Trp Vai Ser Ser Met Ser Ile Leu. 260

Leu

<210> 9 <211> 258 <212> PRT <213> Rattus rattus

Arg Lys Léu Fhe Thr Arg Asn Pro 220

Phe Asp Ser Ser Gin Pro Ser Vai 235 240

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Ala Vai Trp Ser Leu Gly Cys Gin Arg Gly Ser 20 2S

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Gin Cys Gin Gin Leu Arg Ser Glu Tyr Vai Ala Gin Cys Leu Gly Arg 50 5S 00

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Gin Thr Pha Ala Pro Ala Cys Ala phe Ser Gly Pro Gin Leu Ala Pro U5 1^0 125

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Arg Pro Arg Leu Phe Ala Phe Gin Ala Ser Cys Ala Pro Ala Pro Gly

14S 150 155 ISO

Ser Arg Asp Gly Cys Pro Siw GXu Gly Gly Pro Arg Cys Leu Arg Ala 105 170 175

Tyr Ala Gly Leu - Vai Gly Thr Vai Vai Thr Pro Asn Tyr Leu Asp Asn 180 185 190 65 Vãi Ser Ala Arg Vâl Ale Pr* Trp X55 200

Atg Arg Slu Glu Cys Gl.u Ala Phè 210 215

Cys Lgu Asp Ciiy Ala. Xis Gin Ais 225 230.

Leu Gin Asp Gin Trp A.s'n Pro Tyr 24 S

Glu Ais

Cys City Cys Gin Ala Ser GXy As π 205

Arg Lys Leu Phô Thr Arg Asn pro 220

Pha Asp s«r Ser Gin Pr* Ser Vâl 2 35, 2 40

Gin Asn Ala Gly Gin Ala Ays Vai 250 ' 255

Lisboa, 02 de Novembro de 2006

Claims

1 REIVINDICAÇÕES 1. Forma isolada ou substancialmente pura de uma molécula de ácido nucleico que codifica um receptor a-4 da familia GDNF de mamífero (GFRa-4), cuja molécula de ácido nucleico tem uma sequência ilustrada em qualquer uma das ID SEQ N°s 5, 6 ou 7, ou partilha mais de 90% de identidade de sequências com essas sequências.

2. Molécula de ácido nucleico da Reivindicação 1 que codifica um receptor a-4 da família GDNF de mamífero (GFRa-4) com a sequência de aminoácidos ilustrada na ID Sequência N° 8 ou 9.

3. Molécula de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1 até 2, que é uma molécula de DNA.

4. Molécula de ácido nucleico de acordo com a Reivindicação 3, em que essa molécula de DNA é uma molécula de cDNA.

5. Receptor GFRa-4 isolado codificado por uma molécula de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1 até 4.

6. Vector de expressão de DNA compreendendo uma molécula de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1 até 4.

7. Célula hospedeiro transformada ou transfectada com o vector de acordo com a Reivindicação 6. 2

8. Célula hospedeiro de acordo com a Reivindicação 7, cuja célula é uma célula eucariótica.

9. Célula hospedeiro de acordo com a Reivindicação 7 ou 8, cuja célula é uma célula de mamífero.

10. Célula hospedeiro de acordo com a Reivindicação 9, cuja célula é uma célula de rim embrionário humano HEK293 ou uma célula Cos-7.

11. Célula, tecido ou organismo transgénico não humano compreendendo um transgene capaz de expressar uma proteína receptora GFRa-4, cujo transgene compreende uma molécula de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1 até 4.

12. Molécula anti-sentido capaz de prevenir a transcrição e a produção de GFRa-4, compreendendo um ácido nucleico que é capaz de hibridizar para o ácido nucleico de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1 até 4.

13. Molécula de acordo com a Reivindicação 12 para utilização como medicamento.

14. Utilização de uma molécula de acordo com a Reivindicação 13 no fabrico de um medicamento para tratar dor ou carcinoma.

15. Receptor GFRa-4 de mamífero isolado com a sequência de aminoácidos ilustrada em qualquer uma das ID SEQUÊNCIA N° 8 ou 9 ou a sequência de aminoácidos que tem pelo 3 menos 90% de homologia de aminoácidos com as sequências ilustradas nas ID SEQ N°s 8 ou 9.

16. Composição farmacêutica compreendendo uma molécula de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1 até 4 juntamente com um transportador, diluente ou excipiente para aquela farmaceuticamente aceitável.

17. Composição farmacêutica compreendendo uma molécula de acordo com a Reivindicação 12 ou um receptor de acordo com a Reivindicação 15 juntamente com um transportador, diluente ou excipiente para aquele farmaceuticamente aceitável.

18. Método para determinar se um composto é um agonista ou um antagonista relativamente a um receptor GFRa-4 de acordo com qualquer uma das Reivindicações 5 ou 15, cujo método compreende fazer com que uma célula que expressa esse receptor entre em contacto com o referido composto a ser testado e monitorizar o nivel de qualquer resposta funcional ou biológica mediada pelo GFRa-4.

19. Método de acordo com a Reivindicação 18, cuja célula é uma célula de acordo com qualquer uma das Reivindicações 7 até 10.

20. Método de acordo com a Reivindicação 18 ou 19, em que a resposta funcional ou biológica mediada pelo GFRa-4 compreende o nivel de fosforilação nessa célula. 4

21. Método para determinar se um composto é um agonista, antagonista ou um ligando relativamente ao receptor GFRa-4 de acordo com as Reivindicações 5 ou 15, cujo método compreende fazer com que uma preparação membranar de células que expressam o referido GFRa-4 entre em contacto com esse composto na presença de cRET, ou proteina semelhante que interage com o GFRa-4 na via de transdução do sinal da qual o GFRa-4 é um componente, e monitorizar o nivel de qualquer interacção do GFRa-4 com cRET ou referida proteina semelhante.

22. Anticorpo especifico para a proteina receptora GFRa-4 com uma sequência de aminoácidos como ilustrada nas ID Sequências N°s 8 ou 9.

23. Composição farmacêutica compreendendo um anticorpo de acordo com a Reivindicação 22 juntamente com um transportador, diluente ou excipiente para aquele farmaceuticamente aceitável.

24. Método para identificar ligandos para a proteina receptora GFRa-4, cujo método compreende fazer com que um receptor de acordo com a Reivindicação 5 ou 15 entre em contacto com um extracto celular ou um composto a ser testado e isolar quaisquer moléculas ligadas a esse receptor.

25. Método para determinar se um composto é um ligando para o receptor GFRa-4, cujo método compreende fazer com que uma célula que expressa esse receptor de acordo com qualquer uma das Reivindicações 7 até 10 entre em 5 contacto com esse composto e monitorizar o nivel de qualquer resposta funcional ou biológica mediada pelo GFRa-4.

26. Método de acordo com a Reivindicação 25, que compreende monitorizar o nivel de fosforilação nessa célula.

27. Estojo para determinar se um composto é um agonista ou um antagonista da proteina receptora GFRa-4, cujo estojo compreende uma célula de acordo com qualquer uma das Reivindicações 7 até 10, meios para fazer com que essa célula entre em contacto com esse composto e meios para monitorizar o nivel de resposta funcional ou biológica mediada pelo GFRa-4 nessa célula.

28. Estojo de acordo com a Reivindicação 27, em que a referida resposta funcional ou biológica mediada pelo GFRa-4 compreende o nivel de fosforilação nessa célula.

29. Estojo de diagnóstico incluindo uma sonda que compreende qualquer uma entre uma molécula de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1 até 4 ou uma molécula anti-sentido de acordo com a Reivindicação 12 e meios para fazer com que o material biológico a ser testado entre em contacto com essa sonda.

30. Estojo para determinar se um composto é um ligando da proteina receptora GFRa-4, cujo estojo compreende uma preparação membranar de células que expressam esse receptor de acordo com qualquer uma das Reivindicações 7 até 10, meios para fazer com que essa preparação 6 entre em contacto com esse composto na presença de cRET, ou proteína semelhante envolvida na via de transdução do sinal da qual o GFRa-4 é um componente, e meios para medir qualquer interacção entre o GFRa-4 e cRET ou referida proteína semelhante. Lisboa, 2 de Novembro de 2006 1/5

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