PT100027B - Processo para a preparacao de composicoes detergentes granulares compactas com celulase de elevada actividade destinadas a lavagem de tecidos numa maquina de lavar - Google Patents
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PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE COMPOSIÇÕES DETERGENTES GRANULARES COMPACTAS COM CELULASE DE ELEVADA ACTIVIDADE, DESTINADAS À LAVAGEM DE TECIDOS NUMA MÁQUINA DE LAVAR presente invento refere-se a um processo para a obtenção de composições detergentes granulares contendo celulasez que têm forma compacta, isto é têm uma densidade relativamente elevada e contêm uma quantidade relativamente baixa de sal de enchimento inorgânico, em comparação com as composições detergentes convencionais. Nestas composições de tergentes, a celulase é constituída por uma celulase de elevada actividade, definida pelo método C14CM aqui descrito. Preferivelmente a celulase é uma endoglucanase específica de componente único.
Enquadramento do Invento
A necessidade de produziii composições detergentes que apresentem, não apenas boas propriedades de limpeza, mas tam bém um bom desempenho de amaciamento dos tecidos e outros benefícios de tratamento dos tecidos/ está bem estabelecida pela técnica.
A eficácia dos enzimas celulóticos, isto é, celulases, em termos de limpeza de têxteis e de agentes redutores de as péreza em tecidos é reconhecida desde há algum tempo; as patentes GB-A-2.075.028, GB-A-2.095.275 e GB-A-2.094.826, descrevem composições detergentes com celulase para um melhor desempenho de lavagem; a GE—A—1.368.599 descreve a utilização de celulase para redução da aspereza dos tecidos que contêm algodão; a U.S. 4.435.307 descreve a utilização de um enzima celulótico derivado de Humicola insolens bem como de uma: ' fracção, designada por ACXI, como aditivo detergente redutor da aspereza.
A patente EP-A-0 269 168 descreve composições deter
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gentes optimizadas que contêm celulase, as quais são formuladas numa gama de pH ligeiramente alcalino proporcionando um desempenho combinado de limpeza, amaciamento e tratamentc dos tecidos.
Na patente WO 89109259 foram descritas preparações de ©elulase úteis para redução da aspereza dos tecidos que contêm algodão , constituídas por um componente de endoglucanase possuidor de uma elevada actividade de endoase e de uma afinidade em relação à celulase.
A exploração prática das celulases tem, no entanto,re trocedido devido ao facto das preparações de celulase descri tas nos deccmentos da técnica anterior acima referidos, se15
Mod. 71 - 20.000 ex. - 90/08 rem misturas complexas, possuindo apenas determinada fracção com eficácia no contexto do tratamento dos tecidos, é, portanto difíci].;.®arálarinaustria.„;.de_-détergeútés.<impléméiitar umapsodução industrial de celulase, que seja eficaz quanto aos custos; e teriam;de..seriaplicadas .grandes .quantidades de tai preparações de celulase para se obterem os desejados efeitos nos tecidos.
Os aperfeiçoamentos na produção da celulase também não provaram, muitas vezes, serem suficientemente indentificáveis em termos de aplicabilidade aos detergentes. A defini ção de um critério relevante de selecção da celulase para a aplicação em detergentes foi tornado possivel pelo método C14CMC descrito na EP-A-350 098. Verificou-se que um mínimo de 10% de remoção de carboximetilcelulose imobilizada radio, activamente marcada proporcionava uma celulase de elevada actividade. Um grupo de celulase preferido, que é agrangido pela definição de alta actividade de acordo com o presente invento, foi descrito no Pedido de Patente Dinamarguês co-pendente Ns 1159/90, depositado em 5 de Maio de 1990: Nele é descrita uma preparação de celulase constituindo essencial mente num componente de endoglucanase homogéneo, que é imuno reactiva com um anticorpo monoclonal criado contra uma celulase 43kD parcialmente purificada, derivada de Humicola in35
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A descoberta de que este particular componente endoglucanase de celulase é vantajoso para o tratamento dos materiais que contêm celulose, permite agora produzir a celulase de uma forma eficaz quanto aos custos, por exemplo, por meio do emprego de técnicas de ADN recombinante, e permite aplicar-se apenas uma pequena quantidade de preparação de celulase e obterem-se os desejados efeitos sobre os tecidos.
Por outro lado, está agora a ser comercializada uma nova geração de composições detergentes, que podem ser melhor descritos como detergentes compactos embora lhes tenha sido dada uma variedade de nomes comerciais, tais como Ultra, Supra, Micro... A particularidade de tais composições detergentes é a sua elevada densidade em comparação com as composições detergentes convencionais e a sua capacidade para conseguirem a mesma eficiência que as composições detergentes convencionais, utilizando uma quantidade consideravelmente menor de composição detergente compacta. Esta partícula:rldade é melhor reflectida, em termos de composição, por uma quantidade relativamente baixa de sal de enchimento inorgânico. A eficiência de tais composições detergentes compactas atinge-se melhor eliminando-se o ciclo de pré-lavagem e utilizando-se dispositivos de dispersão e difusão, que são colocados directamente no tambor da máquina de lavar no inicio do ciclo principal de lavagem
Constitui um objecto do presente invento proporcionar composições detergentes numa forma compacta, tendo uma densidade relativamente elevada e contendo uma baixa quantidade de sal inorgânico de enchimento, representando uma eficácia óptima de celulase.
Na EP-A-381 397 descreveu-se o efeito da baixa resistência iónica s©bre o desempenho do enzima, particularmente da lipase.
Foi, no entanto, supreendentemente verificado que o efeito da matriz compacta sobre os enzimas seleccionados do
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presente invento, é muito mais elevado do que poderia esperar-se das celulases da técnica actual, tais como descritas na EP-A-381 397.
Constitui um outro objecto do presente invento propor cionar um método para o tratamento de tecidos numa máquina de alvar, consistindo na utilização das presentes composições detergentes em níveis baixos para o ciclo principal de lavagem.
Resumo do Invento presente invento refere-se a composições detergentes granulares que contêm um agente tensio-activo, um activa dor um enzima e se desejado, aditivos convencionais, caracte rizados por o enzima consistir numa preparação de celulase que proporciona pelo menos 10% de remoção de carboximetilcelulose imobilizada radioactivamente marcada de acordo com o método C14 CMC, a 25xl0~^% em peso de proteína de celulase na solução de ensaio de lavagem.
Preferivelmente o composto de celulase consiste, essencialmente, num componente homogéneo de endoglucanase que é imuno-reactivo com um anticorpo monoclonal criado contra uma celulase parcialmente purificada cerca de 43kD derivada deHUmicola insolens,DSM 1800, ou que seja homólogo à re ferida endoglucanase>^43kD.
Descrição Pormenorizada do Invento
As presentes composições detergentes são em forma gra nular e são caracterizadas pela sua densidade,que é mais ele vada do que a densidade de composições detergentes convencionais. A densidade das composições aqui tratadas varia entre 550 a 950g/litro, preferivelmente 650 a 850g/litro de composição, medidos a 202C.
A forma compacta das composições presentes é melhor
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reflectida, em termos de composição, pela quantidade de sal de enchimento inorgânico; os sais inorgânicos de enchimento são ingredientes convencionais de composições detergentes em forma de pó; em composições detergentes convencionais, os sais de enchimento encontram-se presentes em quantidades substanciais, tipicamenet em 17-35% do peso total da composi10 ção
Nas presentes composições, o sal de enchimento encontra-se presente em quantidades que não excedem 15% do total da composição, preferivelmente não excedendo 10% e mais preferivelmente não excedendo 5% do peso da composição.
0s sais de enchimento inorgânico, tais como se definem nas presentes composições, são seleccionados de entre c sais de metais alcalinos e alcalino-terrosos de sulfatos e
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Um sal de enchimento preferido é o sulfato de sódio.
AGENTE TENSIO—ACTIVO
Uma grande variedade de agentes tensio-activos pode ser usada nas composições detergentes. Uma listagem típica das classes aniónica, não-iónoca, anfolítica e switteriónica e de espécies desses agentes tensio-activos é fornecida na Patente US 3.664.961 publicada a favor de Norris em 23 de Maio de 1972.
As misturas de agentes tensio-activos aniónicos são particularmente adequadas aqui, especialmente misturas de agentes tensio-activos de sulfonato, numa proporção de peso de 5:1 a 1:2, preferivelemnte de 3:1 a 2:3, mais preferivelmente de 3:1 a 1:1. Os sulfonatos preferidos incluem sulfonatos alquil -benzeno contendo 9 a 15, especialmente 11 a 1Ξ átomos dèscarbono no radical alquilo e ésteres de ácidos^ gordos metil alfa-sulfonados em que o ácido gordo é derivadc de uma fonte gorda C „-C1o, preferivelmente de uma fonte goi da Cir-Cin. Em todos os casos o catião é um metal alcalino
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Case CM 356 M preferivelmente sódio, o® agentes tensio-activos de sulfato preferidos são sulfatos alquilo tendo entre 12 a 18 átomos de carbono no radical alquilo, opcionalmente em mistura com
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sulfatos etoxi contendo entre 10 a 20, preferivelmente 10 a 16 átomos de carbono no radical alquilo e um grau iflédwtdeétõxilaçâo de 1 a 6.Exemplos de sulfatos alquilo preferidos neste invento são o sulfato alquilo de sebo, sulfato alquilo de coco e os sulfatos alquilo Em cada caso,o catião é de novo um catião de metal alcalino, preferivelmente sódio. Uma classe de agentes tensio-activos não iónicos útei presente invento são os condensados de óxido de etileno com uma porção hidrófoba para proporcionarem um agente tensio«activo com um equilibrio hidrófilo-lipófilo (EHL) variando entre 8 e 17, preferivelmente entre 9,5 e 13,5, mais preferivelmente entre 10 e 12,5. A porção hidrófoba (lipófila) pode ser denatureza alifática ou aromática e a extensão do grupo polioxietileno que é condensado com qualquer hidrófobc particular pode ser facilmente ajustada para proporcionar un composto solúvel na água, com o desejado grau de equilíbrio entre elementos hidrófilos e hidrófobos.
Agentes tensio-activos não iónicos especialmente preferidos deste tipo são os etoxilatos de álcool primários Cg que contêm 3-8 moles de óxido de etileno por mole de álcool, particularmente os álcoois primários C^^ que cor têm 6-8 moles de óxido de etileno por mole de álcool, e os álcoois primários contendo 3-5 moles de óxido de etileno por mole de álcool.
Outra classe de agentes. tensio4aetivos não iónicos compreende os compostos de polígiucósido alquilo da fórmula geral
R0 (CnH2n0)tZx em que z é uma porção derivada de glucose; R é um grupo alquilo hidrófobo saturado que contém entre 12 a 18 átomos de
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carbono; t é de 0 a 10 e n é de 2 ou23;x é de 1,3 a 4, inclu indo os compostos menos de 10% de álcool gordo não reagido e menos 50% de poliglucósidos alquilo de cadeia curta. Compostos deste tipo e sua utilização em detergentes são descritos nas EP-B- 0 070 077, 0 075 996 e 0 094 118.
Igualmente adequados como tensio-activos não iónicos são tensio-activos de amidos poli hidróxi de ácidos gordos da fórmula
1
R -C-N-Zrem que R é H
R1
C^ hidrocarbilo, 2-hidroxi etilo, 2-hidroxi propilo ou uma sua mistura, R2 é Cc , ... _ , . . ,
5-31 hidrocarbilo e Z e um poli-hidroxihidrocarbilo com uma cadeia hidrocarbilo linear com pelo menos 3 hidroxilos directamente ligados à cadeia, ou um seu de 1 2 rivado alcoxilado. Preferivelmente, R é metilo, R é uma 11-15 cadeia alquilo ou alcenilo recta C tal como alquilo de coco ou suas misturas, e Z é derivado de um açúcar redutor, tal como glucose, frutose, maltose, -lactose, numa reacção redutora de aminação.
Uma outra classe de agentes tensio-activos são os agentes tensio-activos semi-polares tais como os óxidos de amina. Os óxidos de amina adequados são escolhidos de entre os óxidos de amina mono C Con, preferivelemente C C. . N -alquilo ou alcenilo e dióxidos de propileno-1,3-diamina em que as restantes posições N são substituídas por grupos metilo, hidroxietilo ou hidroxipropilo.
Outra classe de agentse tensio-activos são os agentes tensio-activos anfotéricos, tais como espécies baseadas na poliamina. Agentes tensio-activos catiónicos podem também ser usados nas presentes composições detergentes e agentes tensio-activos amónio quaternários adequados são seleccionados de entre os agentgg tensio-activos amónio mono Co Cic, preferivelemente N-alquilo ou alcenilo , em que as restantes posições N são substituídas por grupos metilo, hi3
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xietilo ou hidroxipropilo.
Preferem-se mistunas de tipos de agentes tensio-activos, mais especialmente misturas aniónico-não iónico e também misturas aniónico-não iónico-catiónico. Misturas particularmente preferidas sao as descritas na Patente Britânica N- 2040987 e Pedido de Patente Europeia Publicado N2 0 087 914. As composições detergentes podem compreender entre 1%70% em peso de agente tensio-activo, mas usualmente o agente tensio activo encontra-se presente nas composições do pre sente invento numa quantidade entre 1% e 3%, mais preferivelmente de 10-25% em peso.
Activador
Materiais activadores encontrar-se-ao, tipicamente, presentes entre 10% e 60% das presentes composições detergentes. As presentes composições não têm ou praticamente nãc têm activadores contendo fosfato (não ter praticamente é aqui definido como constituindo menos de 1% do total do sistema activador do detergente),
presente
stema activadcr é constituído por activadores solúveis na água, activadores insolúveis na água ou suas mistuars.
Os activadores insolúveis na ágiua podem ser um material de troca de iões inorgânicos, geralmente um material de silicato de alumínio hidratado inorgânico, mais particular mente um zeolito sintético hidratado tal como Zeolito hidra tado Α,Χ,Β ou HS.
Os materiais de troca de iões de silicato de alúmínic preferidos têm a fórmula unitária de célula
Mz [(A102)z (SiO2) ] xH20 em que M é um catião de troca de cálcio, z e y são pelo me nos 6; o rácio molar de z pagã y é entre 1,0 a 0,5 exé pelo menos 5, preferivelmente entre 7,5 e 276, mais preferi-
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velmente de 10 e 264. Os materiais de silicato de alumínio encontram-se sob forma hidratada e são preferivelmente cristalinos, contendo entre 10% e 28%, mais preferivelmente de 18% a 22% de água.
Os materiais de troca de iões de silicato de alumínic acima indicados sao além disso caracterizados por um tamanhc do diâmetro de particula entre 0,1 e 10 micrómetros, preferivelmente entre 0,2 e 4 micrómetros. 0 termo tamanho do diâmetro da partícula representa aqui o tamanho médio do diâmetro da particula de um determinado material de troca de iões, determinado por meio de técnicas analíticas convencionais tais como, por exemplo, determinação microscópica utili. zando um microscópio de rastreio eletrónico. Os materiais de troca de iões dé’silicato de alumínio caracterizam-se ainda pela sua capacidade de troca de iões de cálcio, que é de pelo menos 200 mg de equivalentes de endurecedor de água CaC03/g de silicato de alumínio, calculados numa base anidrc e que geralmente se situam na gama entre 300 mg eq./g e 352 mg eq./g. Os materiais de troca de iões de silicato de alumínio aqui indicados sao ainda caracterizados pelo seu rácic de troca de iões de cálcio, que é descrito pormenorizadamente na GB-1.429.143.
Os materiais de troca de iões de silicato e de alumínio úteis na prática do presente invento encontram-se disponíveis no mercado e podem ser materiais de ocorrência natural, mas são, de preferência, derivados sintéticos. Um método para a produção de materiais de troca de iões de silicatc de alumínio encontra-se descrito na Patente US Ns 3.985.669. Os materiais de troca de iões de silicato de alumínio cristalinos sintéticos preferidos, aqui utilizáveis, encontram-se disponíveis sob a designação Zeolite A, Zeolite B, Zeolite X, Zeolite HS e suas misturas. Numa forma de realizaçãc especialmente preferida, o material cristalino de troca de iões de silicato de alumínio é Zeolite A e tem a fórmula
IO
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Na12[(A102>12 (SÍ02>12] XH2° em que x é entre 20 e 30, especialmente 27. 0 Zeolite X de fórmula Νβθθ [(A102)θθ(SiO2)]— IO.276H2O é também adequa do bem como o Zeolite HS de fórmula Nac [(A10„)r(SiO„)r ] 7.5 ϋ Z Ό Z Ό
H2°).
Outro material activador adequado, insolúvel na água, inorgânico, é o silicato em camadas, por exemplo, SKS-6 (Hoechst).; 0 SKS-6 é silicato cristalino em camadas constituído por silicato de sódio (Na^^O^).: A elevada capacidade de ligação Ca++/Mg++ é, principalmente, um mecanismo de troca de catiões. Em água quente o material torna-se mais solúvel .
actividador solúvel na água pode ser um agente quelador de carboxilato monomérico ou oligomérico.
Os carboxilatos adequados que contêm um grupo carboxi incluem ácido láctico, ácido glicólicoe seus derivados éter, conforme descrrtcr nas Patentes Belgas N^s 831.368, 821.369 e 821.370. Policarboxilatos contendo dois grupos car boxi incluem os sais solúveis na água de ácido succínico, ácido malónico (etilenodioxi) ácido diacético, ácido maleicc, ácido diglicólico, ácido tartárico, ácido tartrónico e ácido fumárico, bem como os carboxilatos de éter descritos nas Patentes Alemãs 2.446.686 e 2.446.687 e na Patente dos E.U.A. 3.935.257 e os carboxilatos de sulfinilo descritos na Patente Belga NQ 840.623. Policarboxilatos contendo três grupos carboxi incluem, em especial, citratos, aconitratos e citraconatos solúveis em água, bem como, derivados de succinato tais como os carboximetiloxisuccinatos descritos na Patente Britânica NQ 1.379.241, lactoxisuccinatos descritos no Pedido de Patente Holandês 7205873 e os materiais de oxipolicarboxilato tais como tricarboxilatos de 2-oxa-l,1,3-propano descritos na Patente Britânica NQ 1.387.447.
Os policarboxilatos contendo quatro grupos carboxi incluem oxidisuccinatos descritos na Patente Britânica Ns
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1.261.829, tetracarboxilatos de 1,1,2,2-etano,tetracarboxilatos de 1,1,3,3,-propano e tetracarboxilatos de 1,1,2,3-pro pano. Policarboxilatos contendo substituintes de enxofre incluem os derivados de sulfosuccinato descritos nas Patentes Britânicas N^s 1.398.421 e 1.398.422 e na Patente dos E.U.A. N2 3.936.448 e os citratos sulfonados pirolisados descritos na Patente Britânica N5 1.082.179, enquanto que os policarbo xilatos contendo substituintes de fosfona são descritos na Patente Britânica Ns 1.439.000.
Os policarboxilatos alicíclicos e heterocíclicos incluem ciclopentano-cis, cis, cis-tetracarboxilato, pentacarboxilatos de ciclopentadienido, 2,3,4,5-tetra-hidrofuranocis, 2,5-tetra-hidrofuranos-cis-dicarboxilatos, 2,2,5,5-tetra-hidrofuranos-tetracarboxilatos, 1,2,3,4,5,6-hexano-hexacarboxilatos e derivados carboximetilo de álcoois poli-hidricos tais como sorbitol, manitol e xilitol. Os policarboxilatos aromáticos incluem ácido melítico, ácido piromelítico e os derivados de ácido ftálico descritos na Patente Britânica Ns 1.425.343.
De entre os acima descritos, os policarboxilatos preferidos sao hidrocarboxilatos que contêm até três grupos car boxi por molécula, mais particularmente citratos.
Os sistemas activadores preefridos para utilização nas presentes composições incluem uma mistura de activador de silicato de alumínio insolúvel na água tal como o Zeolite A e um agente quelador de carboxilato solúvel na água, tal como o ácido,cítrico.
Outros materiais activadores que podem fazer parte do sistema activador para os objectivos do presente invento, incluem materiais inorgânicos tais como carbonatos, bicarbonatos, e silicatos de metal alcalino e materiais orgânicos tais como os fosfunatos orgânicos, fosfunatos polialquileno de amino e policarboxilatos de amino.
Outros sais-orgânicos solúveis na água adequados são os ácidos homo- ou co-poliméricos ou os seus sais, em que o
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ácido policarboxílico compreende pelo menos dois radicais carboxilo separados um do outro por não mais do que dois áto mos de carbono.
Polímeros deste tipo são descritos na GB-A-1.596.756. 5 Exemplos de tais sais são poli-acrilatos de PM 2000-5000 e os seus copolímeros com anidrido maleíco, tendo esses copolí meros um peso molecular entre 20.000 e 70.000, especialmente cerca de 40.000.
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CELULASE
A actividade de enzimas e particularmente a actividade do enzima celulase foi definida para várias aplicações por diferentes métodos analíticos. Estes métodos tentam todos proporcionar uma avaliação realista do esperado desempenho zaquando da utilização ou pelo menos uma medição correlacionada com o desempenho :aquando do uso. Como foi pormenorizado, no Pedido de Patente Europeia EP-A-350098, muitos dos métodos, particularmente os utilizados frequentemente pelos fabricantes de celulase, não estão suficientemente correlacionados com o desempenho aquando da utilização da celulase em composições detergentes para lavandaria. Isto é devido às diversas outras condiçoes de utilização para estes métodos de medição da actividade foram desenvolvidos.
método descrito an EP-A-350098, foi desenvolvido para ser e para ter uma correlação previsiva quanto à hierar quização da actividade da celulase nas composições detergentes para lavandaria.
Por isso, o presente invento usa o método descrito na EP-A-350098 para selecção de celulases, a fim de distinguir celulases que são úteis no presente invento e as que não proporcionariam os objectivos do presente invento. 0 método de selecção, daqui em diante referido como Método C14CMC, que foi adaptado do método descrito na EP-A-350098, pode ser descrito como segue:
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Princípio primeiro Método C14CMC para seleccionar é medir, a uma concentração de celulase definida numa solução de lava
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gem, a remoção da carboxi-metil-celulase imobilizada (CMC) de um substrato de tecido. A remoção da CMC é medida por mei de marcação radioactiva de alguma da CMC, por meio da utilização de.carbono radioactivo C14. A simples contagem da quan tidade de C14 radioactivo no substrato de tecido e depois do tratamento com celulase, permite a avaliação da actividade da celulase.
Preparaçao de amostras:
Preparação da CMC: A solução base de CMC radioactiva é preparada de acordo com o Quadro I. A CMC radioactiva pode ser obtida por métodos referidos na EP-A-350098.
Substratos de tecidos. Os substratos de tecido.^são .mussèlina de algodão com as dimensões de 5 cm x 5 cm. São inoculados, no seu centro, com 0,35ml de solução de base de CMC radioactivamente marcada. As amostras de musselina de algodão são então secas por meio de ar.
Imobilização da CMC: Para se imobilizar a CMC radioactivamer te marcada nas amostras de musselina de algodão, utiliza-se equipamento de lavandometria Linitest Original Hanau fabricado por Original Hanau, Alemanha. Um frasco de metal do lavandómetro é cheio com 400 ml de água dura (4 mmol/litro de iões de Ca**). Pode ser usado um numero máximo de 13 amostras por frasco. 0 frasco é então incubado num ciclo de aquecimento de 20eC a 602C durante 40 minutos num equipamen to de lavandometria. Após a incubação as amostras são enxaguadas sob água corrente da torneira durante 1 minuto. Saó espremidas e deixadas secar ao ar durante pelo menos 30 minutos.
De acordo com EP-A- 350098, exemplares das amostras com CMC radioactiva imobilizada podem também ser medidas co64.264
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Mod. 71 - 20.000 ex. - 90/08 moamostras em branco sem lavagem.
Tratamento da amostra:
Ensaio da solução de lavagem: A solução de ensaio de lavagem é preparada de acordo com a composição do Quadro II. É equilibrada até atingir um pH de 7,5. A solução de ensaio de lavagem é a base a que é adicionada uma amostra de ensaio de celulase. Deverá ter-se cuidado para não se diluir a solução de ensaio dè'lavagem adicionando-se-lhe água até atingir um equilíbrio de 100%, antes de se ter determinado a quantidade de celulase a ser adicionada. A quantidade de celulase que é utilizada neste ensaio de rastrèio deverá ser acrescentada para fornecer 25x 10” em peso percentual de proteína celulase na solução de ensaio de lavagem (equivalente a 0,25 miligrama/litro a 14,5^C).
Processo de lavagem: Os retalhos assim inoculados com CMC marcado radioactivamente são depois tratados num processo de simulação de lavagem. 0 processo de lavagem é simulado num equipamento do tipo lavandómetro, Linitest,Original Hanau# de Original Hanau,Hanau Germany. Um retalho individual é coO locado numa garrafa de vidro de 20cm . A garafa é cheia com lOml de solução de ensaio de lavagem e depois selada de forma estanque . são colocadas até 5 garrafas em cada um dos frascos do lavandómetro. 0 frasco é cheio com água como meie de transferência do calor para simulação da lavagem. A simulação da lavagem é conduzida sob a forma de um ciclo de aque cimento entre 20eC e 60aC ao longo de 40 minutos.
Após o processamento das amostras os frascos são submersos em água fria e a seguir cada um dos retalhosé extraído da sua garrafa, enxaguado numa proveta sob água doce coi rente, espremido e deixado secar ao ar durante pelo menos 30 minutos.
Medição ;
A fim de se medir a remoção de CMC radioactivamente
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marcada, utiliza-se um contador de cintilação, por exemplo, um LKB 1210 Ultrabeta Scintillation Counter, A filtL de se obterem os resultados mais precisos, deverá ser seguido o ma nual dé instruções para a operação óptima desse contador de cintilação particular. Por exemplo, para o LKB 1210 Ultrabeta Scintillation Counter, deverá ser seguido o procedimento seguinte, o retalho a ser medido é colocado numa garrafa de plástico cheia com 12ml de líquido cintilador (por exemplo, cintilador 299 da Packard). 0 retalho é então deixado estabilizar durante pelo menos 30 minutos . A garrafa é então co: locada dentro de LKB 1210 Ultrabeta Scintillation Counter e obtidas as respectivas contagens de radioactividade do retalho .
A fim de se medir o valor da remoção da CMC devido apenas à celulase, é necessária a medição de um retalho que tenha sido inoculado ao mesmo tempo mas que tenha sido tratado na solução de ensaio de lavagem sem celulase. A activi dade da celulase é então expressa como percentagem de remoção da CMC radioactiavmente marcada. Essa percentagem é calculada por meio da seguinte fórmula:
% de remoção da CMC radioactiva = XO xc x 100
X0 onde X0 é a ocntagem de cintilação da redioactividade de um retalho tratado com a solução de ensaio de lavagem sem celulase
X0 é a contagem de cintilação da radioactividade de um retalho tratado com a solução de ensaio de lavngen que contém a celulase, a ser avaliada.
Considerações estatísticas, confirmação do procedimento:
A fim de se proporcionarem resultados estatisticamente válidos, deverá ser empregue análise estatística normalizada. Para o exemplo dado, com utilização do LKB 1210 Ultra16
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beta Scintillation Counter, verificou-se que podia ser utild. zado um número de amostra de 3 retalhos para cada contagem . de cintilação da radioactividade.
A fim de se confirmar o procedimento por meio de uma contravérificação interna, recomendam-se a medição e cálculo da amostra em branco de acordo com o EP-A-350098. Isso per mitirá detectar e eliminar erros.
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Interpretação de resultados.
ensaio de pesquisa descrito proporciona um método rápido, único e fiável para indentificar celulases que satis façam os critérios de actividade do presente invento em relação às celulases que não fazem parte do mesmo.
Verificou-se que uma remoção de 10% ou mais da CMC redioactivamente marcada imobilizada de acordo com o método C14CMC acima descrito, indica que a respectiva celulase satisfaz as exigências do invento.
Tornar-se-á evidente para os técnicos do ramo qua as percentagens de remoção acima de 10% indicam uma actividade mais elevada para a respectiva celulase. Considera-se portan to que uma celulase que proporcione mais de 25%, ou preferivelmente mais de 50% de remoção de CMC radioactivamente mar cad.a,à concentração de proteína da solução de ensaio de lavagem de acordo com o método C14CMC, proporcionará indicação de um desempenho ainda melhor da celulase para utilização eir detergentes de lavandaria.
Considera-se igualmente que a utilização de concentra çoes mais elevadas de celulase para o método C14CMC, proporcionará percentagens de remoção mais elevadas. No entanto não existe uma correlação linear comprovada entre a concentração da celulase e a percentagem de remoção por ela obtida
Considera-se também que a utilização de concentrações mais elevadas de celulase para o método C14CMC, proporcionará percentagens de remoção mais elevadas.
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Quadro ΙΣ :
(todas
Solução de CMC marcada com C^ radioactivo as percentagens são em peso da solução total)
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| CMC * Total (a CMC deverá ser CMC de grau de detergente com um grau de substituição entre cerca de 0,47 e 0,7) | τη 99,2 x 10 % |
| Etanol | 14985,12 x 103% |
| Água desiozinada | 84015,68 x 10-3% |
| Total : : | 100% |
* A CMC total contém CMC não-radioactiva e radioactiva, para proporcionar uma radioactividade que permita leituras suficientemente claras no contador de cintilação utilizado . por exemplo, a CMC radioactiva pode ter uma acti vidade de 0,7 milicuries/g e ser mista.
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Case CM 356M
QUADRO II : Solução de ensaio de lavagem (todàs as percentagens são em peso da solução total)
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| 5 | Benzeno íalquilo linear C12 ácido sulfónico | 0,110% * | |
| 10 | Sulfato alquilo de coco (sal de TEA) | 0,040% | |
| • | Álcool etoxilato | 0,100% | |
| c 12-15 | |||
| 15 | Ácido gordo de coco | 0,100% | |
| Ácido oleico | 0,050% ' | ||
| Ácido cítrico | 0,10% | ||
| 20 | Trietanolamina | 0,040% | |
| Etanol | 0,060% | ||
| • | Propanádiol | 0,015% | |
| 25 | |||
| Hidróxido de sódio | 0,030% | ||
| Formato de sódio | 0,010% | ||
| 30 | Protease | 0,006% | |
| Água (2 ,i5mmol/litro Ca++^' pH do agente de ajustamento | equilíbrio até 100% | ||
| 35 | (Soluções de HCL ou NaOH) e celulase |
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Case CM 356M
Mod. 71 - 20.000 ex. - 90/08
De acordo com o presente invento, as celulases preferidas são as descritas no Pedido de Patente Dinamarquesa 1159/90. Por exemplo, uma preparação de celulase útil nas composições do invento, pode ser essencialmente constituída por um componente homogéneo de endoglucanase, que seja imunereactiva com um anticorpo formado contra uma celulase 43kl altamente purificada, derivada de Humicola insolens,DSM 180C ou que seja homóloga à referida endoglucanase 43kD.
Deverá salíentar-se que todos os enzimas celulase de acordo com o presente invento devem preencher os critérios do ensaio de rastreio acima referido. No entanto, no Pedido de Patente Dinamarquesa 1159/90 são estabelecidos critérios adicionais que permitem identificar enzimas de celulase preferidos em combinação com o presente ensaio de rastreio ,
Çreparações de celulase particularmente úteis nas con posiçoes do invento sao aquelas em que, além do ensaio de rastreio, o componente de endoglucanase exiba uma actividade CMC-endoase de pelo menos cerca de 50, preferivelmente pelo menos cerca de 60, em particularmente pelo menos cerca de 9C unidades de CMC-endoase por mg da proteína total. Um componente de endoglucanase particularmente preferido apresenta uma actividade de CMC-endoase de pelo menos‘IQWunidades de CMC-endoase por mg da proteína total.
No presente contexto, o termo actividade de CMC-endoase refere-se à actividade de endoglucanase do componente de endoglucanase, em termos da sua capacidade para degradar i;;celulose em glucose, celobiose e triose, conforme determinado por uma diminuição de viscosidade de uma solução de car boximetil celulose (CMC) após incubação com a preparação de celulase do invento, conforme se descreve mais pormenorizadamente abaixo.
A actividade da CMC-endoase (endoglucanase) pode ser determinada a partir da diminuição da viscosidade da CMC, como t ?esegue: É preparada uma solução de substrato contendo 35g/l deCMC (Hercules 7 LFD) em tampão tris a 0,1 M a um pH
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9,0. A amostra de enzima a ser analisada é dissolvida no mejL mo tampão, são misturados 10. ml de solução de substrato e 0,5 mld& solução de enzima e transferidos para um viscosímetro(por exemplo, Haake VT 181, sensor Nyr,181 rpm), com o ter mostato regulado para 402cC. As leituras de viscosidade são feitas logo que possivel após a mistura e de novo 30 minutos mais tarde. A quantidade de enzima que reduz a viscosidade para metade, sob estas condições,é definida como Ϊ unidade de actividade CMC-endoase.
AAelêcttoferese de geleia de poli-acrilamida SDS (SDS-PAGE) e a focagem iso-eléctica com proteínas marcadoras de uma forma conhecida dós técnicos do ramo, foram usados para determinar o peso molecular e o ponto iso-eléctico (pl),respectivamente, do componente de endoglucanase na preparação de celulase útil no presente contexto. Desta maneira o peso molecular de um componente específico de endoglucanase foi determinado como sendo de 43kD. 0 ponto iso-eléctrico desta endoglucanase foi determinado como sendo de cerca de 5,1.
A actividade de celo-bio-hidrólase pode ser definida como a actividade em direcção à p-nitrofenil celobiose. A actividade é determinada como umole de nitrofenilo libertada por minuto a 372C e pH 7.0. verificou-se que o presente componente de endoglucanase nao tinha praticamente nenhuma act:._ vidade de celo-bio-hidrolase.
componente de endoglucanase na preparação de celulase aqui indicado foi inicialmente isolado por meio de processos de purificação extensivos,envolvendo,entre outros , a purificação por HPLC de fase inversa de uma mistura bruta de celulase de H. insolens de acordo com a E.U.A. 4.435. 307. Este procedimento resultou, surpreendentemente, no isolamento de uma endoglucanase 43lgg como componente único com propriedades inesperadamente favoráveis, devido a uma actividade de endoglucanase surpreendentemente elavada.
Da mesma forma, além do ensaio de ras-trelo, os enzima s decelulase úteis nas presentes composições podem ainda ser
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definidos como enzimas que apresentam actividade de endoglu canase (daqui em diante referidos como enzima de endoglucanase), enzimas esses que têm a sequência de amino-ácidos apresentada na Listagem de Sequências ID#2 anexa, ou um seu homólogo que apresente actividade de endoglucanase.
No presente contexto, o termo homólogo é entendido como indicando um polipéptido codificada^'· por ADN que híbrida perante a mesma sonda que a codificação ADN para o enzima endoglucanase, com esta sequência de amino ácido, sob certas condições especificadas (tais como o embebimento prévio em 5xSSC e pré-hibridação durante 1 hora a 40BC numa solução de formamida a 20%, 5 x de solução Denhardt, 50 mM de fosfato de sódio, pH 6,8 e 50 Jug de ADN de timo de vitela so nificado desnaturado, seguida de hibridação na mesma solução, suplementada com 100 uM ATP durante 18 h a 40BC). Pretende-se que o termo inclua os derivados 'da sequência anteriormente mencionada, obtida por adição de um ou mais resíduos de amino ácidos para cada um ou ambos os terminais C- e N- da sequência nativa, substituição de um ou mais resíduos amino ácidos numa ou mais localizações da sequência nativa, apagamento de um ou mais resíduos de amino ácido em ambas ou em cada uma das extremidades da sequência de amino ácidos nativa, ou inserção deum ou mais resíduos de amino ácidos numa ou mais localizações da sequência nativa.
enzima endoglucanase aqui indicado pode ser um que seja possível de ser produzido por espécies de Humicola tal como a Humicola insolens, por exemplo estirpe DSM 1800, depositada em 1 de Outubro,1981 no Deust^ch Sammlung von Mikro organismen, Mascheroder Weg 1B, D-3300 Braunschweig, Alema-1. nha, de acordo com as disposições do Tratado de Budapest sobre o Reconhecimento Internacional do Depósito de Micro-organismos para Procedimenyo de Processos de Patente (o Tratado de Budapesfce··^ <
Sob um outro aspecto, os enzimas de celulase aqui uti lizáveis podem ainda ser definidos, para além do ensaio de rastreio, como enzimas de endoglucanase que têm a sequência
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Mod. 71 - 20.000 ex. - 90/08 de amino ácidos representada na Listagem de Sequências anexa, ou um seu homólogo (cibinforme definido acima) que apre sente actividade de endoglucanase. -0 referido enzima de glucanase pode ser um que seja possível produzir por uma espécia de Fusarium, tal como Fusarium oxysporum, por exemplo a estirpe 2672 DSM, depositada em 6 de Junho de 1983 no Deustch Sammlung vcn Microorganismen, Mascheroder Weg 1B, D-3300 Braunschewieg, Alemanha,dé acordo com as disposições do Tratado de Budapeste.
Além disso, .contempla-se que endoglucanases homólogas podem ser derivadas de outros micro-organismos que produzam enzimas celulóticas, por exemplo, espécies de Trichoderma, Myceliophtora, Phanerochaete, Schizophyllum, Penicillium, Asperqillus e Geotricim.
Para a produção industrial da presente preparação de celulase é, no entanto, preferido empregar-se técnicas recom binantes de ADN ou outras técnicas que envolvam ajustamentos de fermentações ou mutação de micro-organismos envolvidos, para assegurar a sobre-produção das desejadas actividades enzimáticas.Tais métodos e técnicas são conhecidas no ramo e podem ser facilmente postos em prática por peritos do ra mo.
componente de endoglucanase pode assim ser um que seja produzido por um método que compreende o cultivo de uma célula hospedeira transformada com um vector ADN recombinan te que é portador de uma sequência de ADN que codifica o re ferido componente endoglucanase,ou um percursor do referido componente de endoglucanase, bem como sequências ADN que codificam funções que permitam a expressão da sequência de ADN que codifica o componente endoglucanase ou um seu percursor, num meio de cultura sob condições que permitem a expressão do componente endoglucanase ou o seu percursor e a recupera ção do componente endoglucanase da cultura.
As construções de ADN que compreendem uma sequência dê‘ ADN que codifica um enzima endoglucanase conforme descrit
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acima, ou uma forma percursora do enzima, incluem as constrt ções de’ADN como uma sequência ADN coniforme representado nas
Listagens de Sequências ID^l ou ID|r3 anexas, ou uma sua modificação. Exemplos de modificações adequadas da sequência ADN são substituições de nucleótidos que não dão origem a outra sequência de amino ácido responde à utilização de codão tro do qual a contrução de ADN de nucleótido que dão origem a do endoglucanase, do organismo hospedeiro denir é introduzida ou substituiçõe uma sequência diferente de mas que cor amino ácido e por isso, possivelmente, uma estrutura de proteína diferente poderá dar origem a um mutante endoglucanase
Mod. 71 - 20.000 ex. - 90/08 com propriedades diferentes das do enzima nativo. Outros exemplos de modificações possíveis são a inserção de um ou mais nucleótidos em qualquer das extremidades da sequência ou no meio da sequência , ou o afastamento de um ou mais nucleótidos em qualquer dos extremos ou no meio da sequência.
Construções de ADN que codificam enzimas de endoglucanase utilizáveis aqui podem ser preparadas sintétiacmente por métodos padrão estabelecidos, por exemplo, o método da fosfoamidite descrito por S.L. Beaucage e M.H.Caruthers, Tetrahedron Letters 22. 1981, pp. 1859-1869, ou o método descrito por Matthes e outros., EMBO Journal 3, 1984, pp, 801-805. De acordo com o método da fosfoamidite, os oligonucleótidos são sintetizados, por exemplo num 4íntetizador automático de ADN, purificados, ligados e clonados em vectores adequados.
Uma construção de ADN que codifica o enzima endogluca nase ou um seu percursor pode, por exemplo, ser isolado por meio (Srestabelecimento de uma biblioteca de cADN ou genómicé de um micro-organismo produtor de celulase, tal como Humicola insolens, DSM 1800 e procura de clones positivos por meie de processos convencionais tais como por meio de hibridação com utilização de sondas ;õligonucleótidas sintetizadas à base da· sequência completa ou parcial de amino ácido do englucanase, de acordo com técnicas normalizadas (cf. Sambrool· e outros., Molecular Cloninq: A Laboratory Manual, 2â Ed.
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Cold spring Harbor, 1989),ou por selecção de clones que expressem a apropriada actividade do enzima (i.e. actividade CMC-endoase conforme definido acima), ou por selecção de clç nes que produzam uma proteína que é reactiva com um anticorpo contra uma celulase nativa (endoglucanase).
Finalmente, a construção de ADN pode ser de origem mista de sintético e genómico, mista de sintético e cADN ou mista genómica e cADN original, preparada por meio da ligação dos fragmentos sintéticos , genómica ou cADN original (coinforme apropriado) aos fragmentos correspondentes às várias partes de toda a construção de ADN, de acordo com técni cas normalizadas. A construção de ADN pode também ser preparada por reacção de cadeia de polimerase utilizando primáric específicos, por exemplo conforme descrito nas patentes do
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E.U. A. 4.683.202 de R.K.Saiki e outros., Science 239,1988 , pp,487-491.
Os vectores de expressão recombinantes em que as con£. truções de ADN acima são inseridas, incluem qualquer vector que possa ser convenientemente sujeito a processos recombinantes da ADN e·· a escolha do vector dependerá f:gequentemente da célula hospedeira na qual deve ser introduzido. Assim o vector pode ser um vector autonomamente replicante, isto é, um vector que existe como uma entidade extra-cromossómica, cuja replicação é independente da replicação cromossómica, por exemplo um plasmídeo. Alternativamente, o vector pode ser um que, quando introduzido numa célula hospedeira seja integeado na genoma da célula Hospedeira e replicado juntamente com os cromossoma(s) em que se tenha integrado.
No vector, a sequência de ADN que codifica o endoglucanase deverá estar ligada de forma operacional a uma sequer cia promotora e terminadora adequada. A promotora pode ser qualquer sequência de ADN que mostre actividade transcritive na célula hospedeira seleccionada e pode ser derivada de prc teínas. codificadoras, de genes, tanto homólogas;como heterólogas'da célula hospedeira. Os processos utilizados para ligar as sequências
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Mod. 71 - 20.000 ex. -90/08 de ADN que codificam o endoglucanase, respectivamente, a prç. motora e a terminadora, e para as introduzir nos vectores adequados, são bem conhecidos dos técnicos do ramo (cf., poi exemplo, Sambrook e outros, obra citada) .
As células hospedeiras que são transformadas com as construções de ADN acima ou os vectores de expressão acima indicados, podem pertencer, por exemplo, a uma espécie de Aspergillus, mais preferivelmente Aspergillus oryzae ou Asperqillus niqer. As células de fungos podem ser transformadas por um processo que envolve a formação de protoplastos e transformação dos protoplastos, seguida da regeneração da parede da célula de uma forma conhecida em si. 0 uso de Aspergillus como micro-organismo hospedeiro encontra-se descrito na EP 238 023( de Novo índustri A/S), cujos conteúdos são aqui incorporados como referência. A célula hospedeira pode também ser uma célula de levedura, por exemplo uma estirpe de Saccharomyces cerevisiae.
Alternativamente, micro-organismo hospedeiro pode ser uma^bactéria, em particular estirpes de Streptomyces e Bacillus e Ecoli. A transformação das células’-bacterianas· pode ser levada a efeito de acordo com métodos convencionais por exemplo, conforme descrito em Sambrook e outrost Molecular Cloninq: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1982.
A procura de sequências de ADN apropriadas e a construção de vectores pode também ser executada por meio de prc cessos normalizados, ef. Sambrook e outros, obra citada.
meio utilizado para cultivar as células hospedeiras transformadas, pode ser qualquer um dos meios convencionais, que seja adequado para o crescimento das células hospedeiras em questão. 0 endoglucanase expresso pode, convenientemente, ser segregado no meio de cultura e pode ser recuperado do mesmo por processos bem conhecidos , que incluem a separaçec das células do meio através de centrifugação ou filtração, precipitando-se os componentes proteicos do meio por intermédio de sal tal como o sulfatoddeamónio, seguindo-se pro35
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cessos cromatograficos tais como cromatografia de troca de iões, cromatografia de afinidade ou semelhantes.
Ao empregarem-se técnicas recombinantes de ADN cHnfor me acima indicado, técnicas de purificação proteica, técnicas de fermentação e mutação e outras técnicas que são bem conhecidas da técnica, é possivel proporcionarem-se endoglucanases de elevada pureza.
nível de celulase na presente composição, acima des crito, deverá ser tal que a quantidade de proteína enzimática a ser administrada na solução de lavagem seja de 0,005 a 40 mg/litro da solução de lavagem, preferivelmente 0,01 a 10 mg/litro da solução de lavagem.
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INGREDIENTES FACULTATIVOS
Tipicamente, as presentes composições incluirão ingre dientes facultativos que fazem normalmente parte de composi ções detergentes . Agentes anti-redeposição e suspensores de sujidade, abrilhantadores ópticos, branqueadores, activadores de branqueamento, supressores de espumas, agentes anti-viscosos, corantes e pigmentos são exemplos de tais ingredientes facultativos e podem ser adicionados em diversas quantidades, de acordo com o desejado.
Agentes anti-redeposição e suspensores de sujidade adequados para utilização no presente invento, incluem derivados de celulose tais como metilcelulose, carboxilmetilcelulose e hidroxietilcelulose e ácidos policarboxílicos homoou copoliméricos ou os seus sais. Polímeros deste tipo inclx em os poliacrilatos e os copolímeros de ácido acrílico-anidrido maleico anteriormente referidos como intensificadores, bem como copolímeros de anidrido maleico com etileno, éter metilvinílico ou ácido metacrilíco, constituindo o anidrido maleico pá'lo menos 20 mole por cento do copolímero. Estes materiais são normalmente usados cem níveis entre 0,5% e 10% em peso , mais preferivelmente entre 0,75% a 8%, e mais preferj·
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Case CM 356 M
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velmente ainda entre 1% e 6% em peso da composição .
Os abrilhantadores ópticos preferidos são de carácter aniónico, de que são exemplos 2:Z^dissulfonato de 4,4^-bis-(2-dietanolamino-4-anilino-s-triazin-6-ilamino)estilbe no dissódio,2:2^ dissulfonato de 4,-4^-bis-(2-morfolino-4-anilino-s-triazin-6-ilaminostilbeno dissódio 2:,dissulfonato de 4,4^-bis -(2,4-dianilino-s-triazin-6-ilamino)estilbeno dissódio, 2-sulfonato de 4^,4^^-bis-(2,4-dianilino-s-triazin-6-ilamino)estilbeno monossódio 2,2^dissulfonato de 4,41-bis(2-anilino-4-(N-metil-N-2-hidroxietilamino)-s-triazino-6-ilamino) estilbeno dissódio 2,2^- dissulfonato de 4,4I-bis-(4-fenil-2,1,3 ,-triazol-2-il)-estilbeno dissódio 2,2^-dissulfonato de 4,4^bis ( 2-anilino-4-(l-metil-2-hidroxietilamino)-s-triazin-6-ilamino)estilbeno dissódio e 211 sulfonato 2 (estilbil-41· ^-nafto-11,2^ : 4,5)-1,2,3-triazola de sódio.
Pode ser .usado qualquer branqueador de peridrato inorgânico, numa quantidade entre 3% e 40% em peso, mais preferivelmente entre 8% e 25% em peso e mais preferivelmen te ainda entre 12% e 20% em peso das composições. Exemplos preferidos de tais branqueadores sao mono-hidrato êetetrâe^hídrato-de-percárbòrato:dé sódio percabónato e suasmisturas.
Outro ingrediente preferido, separadamente misturadc, é um percursor de branqueador de ácido peroxi carboxilíco, geralmente referido como activador de branqueamento, que,de preferência, é adicionado numa forma cristalizada ou aglomerada. Exemplos de compostos adequados deste tipo são descritos nas Patentes Britânicas N2s 1586769 e 2143231 e um método para a sua formação numa forma cristalizada é descri to no Pedido de Patente Europeia Publicado NQ0 062 523.Exen. pios preferidos de tais compostos são a diamina tetracetil-etileno e o sulfoanto de sódio 3,5,5-trimetil-hexanoiloxibenzeno.
Os activadoes de branqueamento são normalmente empregues em níveis entre 0,5% e 10% em peso, mais frequenteemnte entre 1% e 8% e preferivelmente entre 2% e 6% da composição.
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Case CM 3656M
Mod. 71 - 20.000 ex. - 90/08
Outro ingrediente facultativo é um supressor de espumas , exemplificado pelos silicones e as misturas de sílica-silicones. Os silicones podem geralmente estar representados por materiais polisiloxanos alquilados,enquanto que a sílica é normalmente usada em formas finamentè divididas exemplifi cadas pelas aerogeleias e xero-geleias de sílica e sílicas hidrófobas de vários tipos. Estes materiais podem ser incorporados como particulados em que os supressores de espuma podem ser incorporados vantajosamenfee de forma libertável, u i num veículo impermeável detergente solúvel ou dispersável na água, substancialmente não tensio-activo. Alternativamente, o supressor de espumas pode ser dissolvido ou disperso num veículo líquido e aplicado por meio dê aspersao sobre um ou mais dos outros componentes.
Conforme referido acima os agentes dé silicones controladores das espumas úteis, podem compreender uma mistura de um siloxano alquilado, do tipo referido daqui em diante e sílica sólida. Tais misturas são preparadas por meio de afixação do silicone à superfície da sílica sólida. Um agente de silicone controlador das espumas preferido é representado por uma sílica silanadã (mais preferivelmente trimetil-silanada) hidrófoba com um tamanho de partícula situada entre 10 milimicrons e 20 milimicrons e um peso específico acj ma de 50 g/m , infimamente misturada com dimetil silicone líquido com um peso molecular situado entre cerca de 500 e cerca de 200.000 numa proporção de peso de silicone para a sílica silanada entre cerca del:l e cerca del:2.
Um agente de silicones controlador de espumas preferj_ dcpestá descrito em Bartollota e outros, Patente E.U.A. 3.931. 672. Outros supressores de espumas particularmentè úteis são os supressores de espuma de silicone auto-emulsionantes, desL critos no Pedido de Patente Alemã DTOS 2.646.126 publicado em 28 de^Abril de 1977. Um exemplo deon tal composto é o DC-544, comercializado pela Dow Corning, que é um copolímero de siloxano/glicol.
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Oase CM356 M
Mod. 71 20.000 ex. - 90/08
Os supressores de espumas acima descritos são normalmente empregues em níveis entre 0,001% a 2% em peso da composição, preferivelmente entre 0.01% a 1% em peso. A incorpo ração dos modificadores de espumas é, de preferência, feita sob a forma de particulados separados e isso permite a inclu são nos mesmos de outros materiais controladores das espumas tais como os ácidos gordos C20-C24, ceras microcristalinas e copolímeros de elevado PM de óxido de etileno e óxido de propileno, que de outro modo afectariam desfavoravelmente a dispersibilidade da matriz. Técnicas para a formação de tais particulados modificadoresdê-espumas são descritas na Patente E.U.A. N2 3.933.672 de Bartollota e outros, anteriormente referida.
Outros materiais poliméricos úteis sao os polietileno glicóis, particularmente os que têm um peso molecular de 1000-10000, mais particularmente 2000 a 8000 e mais prefervelmentfcainda cerca de-4000. Estes são usados em níveis entre 0,20% e 5%, mais pref erivelfiiente = entre 0,25% e 2,5% em pese Estes polímeros e os sais homo- ou copoliméricos de policarboxilato anteriormente referidos, são valiosos para melhorai a manutenção de brancura, a deposição de cinza nos tecidos e desempenho de limpeza sobre manchas de terra, proteicas e oxidáveis em presença de impurezas de metal de transição.
Os agentes supressores de nódoas úteis nas composições do presente invento sao. convencionalmente, copolímeros ou terpolímeros de ácido tereftálico com unidades de etilenc glicol e/ou propileno glicol em vários arranjos. Exemplos de tais polímeros são descritos nas Patentes'E.U.A. co-pendentes N9s 4116885 e 4711730 e Pedido de Patente Europeia N2 0 272 033. Um polímero especialmente preferido de acordo com a EP-A-0 272 033 tem a fórmula (CH3(PEG)43)0.75(POH)0_25rT-PO)2.8(T-PEG)o.4]T(PO-H)0j25 ((PEG)45CH3)0.75
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Case CM 356 M
Mod. 71 - 20.000 ex. -90/08
onde PEG é - (0C2H4)0-,P0 é (C03H60) é T é (pcOC H4C0).
Determinado matérias poliméricos, tais como a polivinil pirrolidona, tipicamente de PM 5000-20000,preferivelmente 10000-15000, formam também agentes úteis para a prever ção da transferência de corantes lábeis entre os tecidos,durante o processo de lavagem.
Os agentes amaciadores de tecidos podem também ser ir corporados nas composições detergentes de acordo com o presente invento. Estes agentes podem ser de tipo inorgânico ou orgânico. Agentes amaciadores inorgânicos são exemplificados pelas argilas de esmectite descritas na GB-A-1.400.89í Agentes amaciadorse de tecidos orgânicos incluem as aminas terciárias insolúveis na água conforme descrito nas GB-A-1514276 e EP-B-0 oll 340 e a sua combinação com sais mono C12-C14 amónio quaternário é descrita nas EP-B-0 026 527 e EP-B-0 026 528 e amidos de cadeia di-longa conforme descrito na EP-B-0 0242 919. Outros ingredientes orgânicos úteis de sistemas amaciadores de tecidos incluem materiais de óxido de polietileno de elevedo peso molecular conforme descrito nas EP-A-0 299 575 e 0 313 146.
Os níveis de argila de esmectite situam-se normalmente entre 5% e 20%, mais preferivelmente entre 8% e 15% em peso, com os matérias a serem adicionados ao resto da formulação sob a forma de um componente misto seco. Os agentes oi. gânicos déeamaciamento de tecidos tais como aminas terciárias insolúveis na água ou os materiais de amido de cadeia di-longa são incorporados em níveis entre 0,5% e 5% em peso, normalmente entre 1% e 3% em peso,enquanto que os materiais de óxido de polietileno de alto peso molecular e os matérias catiónicos solúveis na água são adicionados a níveis entre 0,1% e 2%, normalmente entre 0,15% e 1,5% em peso. Estes matérias são normalmenté. adicionados à porção seca pulverizadc da composição, embora nalguns casos possa ser mais convenier te adiciona-los sob a forma de um particulado misto seco,
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Case CM 356 M
Mod. 71 - 20.000 ex. -90/08 ou pulverizá-los sob a forma de um líquido fundido sobre os outros componentes sólidos da composição.
Enzimas diferentes da preparação de celulase específica aqui apresentada, tais como proteases, íipases e amilases podem estar presentes nesta composição.
PROCESSO DE FABRICO
As comoposições de acordo com o presente invento podem ser fabricadas por meio de uma variedade de métodos que incluemea mistura a secota secagem por aspersao, a aglomeração e a granulação e combinações de quaisquer destas técni·· cas.
PROCESSO DE FABRICO PREFERIDO
Um processo - preferido para o fabrico das presentes composições envolve uma combinação de secagem por pulverização. aglomeração num misturador de alta velocidade e misture a seco.
Um primeiro componente granular contendo um agente ~ tensio-activo anióníco relativamente insolúvel é seco por aspersão e parte do produto seco é separada e sujeita a uma pulverização de tensio-activo aniónico de baixo nível, antes; de ser remisturado com o restante .Um segundo componente grj. nular é fabricado por neutralização a seco de um ácido tensio-activo aniónico, utilizando-se carbonato de sódio como agente neutralizador num misturador contínuo de alta velocidade, como seja um misturador Lodige KM. Os primeiro e segundo componentes, juntamente com outros ingredientes de mií^ tura seca tais como o agente quelador de carboxilato, branqueador inorgânico de peroxigénio, intensificador de branquo amento, agente suspensor de sujidade/ siliacto e enzima são então introduzidos numa cinta tarnsportadora, da qual são transferidos para um tambor rotativo horizontalmente em que
Mod. 71 - 20.000 ex. - 90/08
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Case CM 356M /
são pulverizados sobre o produto perfume e supressor de espumas de silicones. Em composiçoes altamente preferidas, é empregue mais um passo de mistura em tambor em que um baixo nível (aprox.2%) de aluminosilicato cristalino finamente di5 vidido é introduzido para aumeistar a densidade e melhorar as características de fluxo granular.
PROCESSO DE LAVAGEM
As presentes composições detergentes compactas têm Cc pacidade para atingir a mesma eficiência que as composições detergentes convencionais, quarado uma quantidade consideravelmente menor da composição do presente invento é usada no ciclo principal de lavagem de uma máquina de lavar.
Consequentemente, numa forma de realização do invente( proporciona-se um processo para a^lavagem de tecidos numa máquina de lavar, em que uma quantidade entre 15 e 170 g de uma composição detergente de acordo com o presente invento é usada para o principal ciclo de lavagem.
Tipicamente, sob condiçoes Europeias, a utilização recomendada é entre 80 e 140 g de composição detergente paré o ciclo principal de lavagem, sem necessidade de uma pré-lavagem.
As presentes composições detergentes são, de preferêr. cia, directamente introduzidas no tambor e não indirectamente, através da caixa exterior da máquina. Isto pode conseguir -se facilmente, por meio da incorporação da composição num saco ou contentor,do qual pode ser libertada no inicio do ciclo de lavagem, em respostas à agitação, a uma subida da temperatura ou à imersãoTna água de lavagem existente no tambor. Um tal recipiente será colocado no interior do tambor, juntamente com os tecidos ae serem lavados. Alternativamente, c máquina de lavar pode ela própria estar adaptada para permi. tirraadiçao directa da composição ao tambor, por exemplo, por meio de um dispositivo fornecido na porta de acesso.
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Mod. 71 - 20.000 ex. - 90/08
Os produtos que compreendem uma composição detergente encerrada num saco ou contentor, são geralmente desenhados de tal forma que a integridade do recipiente é mantida no ee tado seco para evitar a saída do conteúdo em seco, mas estãc adapatados para libertação do conteúdo do recipiente, quandc expostos ao ambiente de lavagem, normalmente na imersão nume solução aquosa.
Geralmente o contentor será flexível como um saco ou uma bolsa. 0 saco pode ser de construção fibrosa, revestido de um material protéetor impermeável à água de forma a retei o seu conteúdo, conforme se encontra descrito no Pedido de Patente Europeia Publicado NQ0 018 687. Alternativamente, pc de ser formado por material polimérico sintético insolúvel na água, munido de umselo de aresta ou fecho destinado a ron ptíx-se em meio aquoso,conforme descrito nos Pedidos de Pater te Europeia Publicados NQs0 011 500, 0011 501, 0 011 502 e 0 011 968. Uma forma conveniente de fecho permeável à água compreende um adesivo solúvel na água, disposto ao longo e fechando uma aresta da bolsa formada por uma película polimérica impermeável à água, tal como polietileno ou polipropileno.
Numa variante com a forma de saco ou contentor do pre duto, podem ser empregues produtos de folha laminada em que uam camada central flexível é impregnada e/ou revestida com uma composição e, depois uma ou mais camadas exteriores são aplicadas para produzirem um efeitp estético semelhante e tecido. As camadãs podem ser colocadas umas às outras de for ma a manterem-se ligadas durante a utilização ou podem separar-se aquando do contacto com a água para facilitar a libertação do material revestido ou impregnado.
Uma forma laminada alternativa compreende uma camada gravada em relevo ou deformada para proporcionar uma série de contentores tipo bolsa dentro de cada um dos quais os com ponentes do detergente estão depositados em quantidades medidas, com uma segunda camada a sobrepor-se à primeira e a
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Case CM 356M
Mod. 71 - 20.000 ex. - 90/08
ela colada, nas áreas situadas entre os contentores tipo boj. sa, onde as duas camaads se contactam. Os componentes podem ser depositados em forma de partículas, pastas ou material fundido e as camadas laminadas deverão evitar a saída do cor. teúdo dos contentores tipo bolsa, antes de serem metidos na água. As camadas podem separa-se ou manter-se ligadas entre si ao contacto com a água, sendo a única exigência que a estrutura permita uma libertação rápida do conteúdo dos conter tores tipo bolsa para a solução. 0 número de contentores em forma de bolsa por unidade de área do susbtrato é uma questão de escolha, mas variará normalmente entre 500 e 25.000 por metro quadrado.
Materiais adequados para serem usados nas camadas laminadas flexíveis, neste aspecto do invento, incluem, entre outros, esponjas, papel e telas de tecido e sem ser de tecido .
No entanto, os meios preferidos para execução do processo de lavagem de acordo com o presente invento, incluem a utilização de um dispositivo de administração reutilizável com paredes que sejam permeáveis aos líquidos,mas impermeáveis à composição sólida.
Dispositivos deste tipo são descritos na Publicação dos Pedidos de Patente Europeia N9s 0 343 069 e 0 344 070. 0 último Pedido descreve um dispositivo que compreende uma folha flexível com a forma de um saco que se prolor^a a partir de um anel de suporte que define um orifício, estando o orifício adaptado para admitir no saco produto suficiente para um ciclo de lavagem, num ciclo de lavagem. Uma porção do meio de lavagem flui através do orifício para dentro do saco, dissolve o produto e a solução passa depois para o exterior, através do orifício, para o meio de lavagem. 0 anel de suporte encontra-se munido de um arranjo de cobertura para evitar a saída do produto molhado, não dissolvido, compre endendo esse arranjo, tipicamente, paredes que se prolongam radialmente a partir de uma saliência central com a configu35
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Case CM 356M
ração de roda raiada, ou uma estrutura semelhante em que as paredes tenham uma forma helicoidal.
EXEMPLOS
Mod. 71 - 20.000 ex. - 90/08
Os exemplos seguintes ilustram o invento e facilitam a sua compreensão.
As abreviaturas para os ingredientes individuais têm o seguinte significado:
LAS: sal sédiào de sulfonato linear de dodecil benzeno
TAS: sal sódico de sulfato álcool de sebo
AS: sal sódico sulfato de alquilo (C14 - C15)
A0: óxido C12-C14 de alquiLdimetilamina
FA45E7: álcool gordo (C14-C15) etoxilado com cerca de '7 moles de óxido de'metileno
CAT: cloreto de C12 alquil-trimetil-amónio
Argila: argila de esmectite
Zeolito 4A: sal sódico de zeolito 4A com um tamanho médio de partícula entre 1-10 micrómetros
SKS-6: silicato cristalino em camada (Hoechst)
Copolimero AA/MA: c&polimero de ácido acrílico e ácido malej co
PAA: ácido poliacrílico PM 1000—10000
CMC: carboximetilcelulose
Fosfonato : sal sódico de ácido etilenodiamino-tetrametilenc
-fosfónico
EDTA: sal sódico de tetra acetato de etilenodiamina
PB1: NaB02.H202
PB4: NaB02.H202.3H20
TAED: tetra acetil-etileno-diamina
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Case CM 356M
NOBS: sulfonato de -nonanoílo-oxibenzeno-sódio
P.A.: ftalocianino sulfonado de zinco
Silicato (R = n): SiO2/Na2O = n
Mod. 71 - 20.000 ex. - 90/08
Amilase: Termamyl 60T
Lipase: Lipolase 100T
Protease: Savinase 4T (Novo-Nordisk) (Novo-Nordisk) (Novo-Nordisk)
SSS: Sistema Supressor de Espumas (sílica/mistura de silicones)
EXEMPLO I
Pontos críticos do parâmetro de desempenho da celulase da reivindicação 1
Levou-se a efeito o seguinte ensaio:
Condições de ensaio:
Temperatura de lavagem: 603C (ciclo de aquecimento)
Tempo, de lavagem: 40 min.
pH= 7,5
Dureza da água: 4 mmol/L
Concentração de detergente: 1%
Composição do detergente: conf. EPA 350 098 ex. 1
Celulases :
1) Celluzyme fornecido por Novo Nordisk = referência
2) endoglucanase 43kD = celulase de acordo com o invento
Resultados do ensaio:
% Remoção de C14-CMC pela Celulase
| Detergente | sem celulase ( =referência) | 0 |
| Detergente | + CelluzymeR | |
| 0,25 | mg proteína/L | abaixo de 3 |
| 0,9 | mg proteína/L | 10 |
| 1,5 | mg proteína/L | 12,7 |
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Case CM 356M
3,0 mg proteína/L
4,5 mg proteína/L
Detergente+ 43kD endoglucanese 5 0,3 mg proteína/L
0/25 mg Proteína/L
17,7
2.1/5
20,3
18,5
Discussão dos resultados+
Os dados acima demostram claramente os pontos críticos do parâmetro reivindicado para as celulases do invento através da comercialmente disponível Celluzyme.
EXEMPLO II
Foram preparadas as seguintes composições base:
Mod. 71 - 20.000 ex. - 90/08
COMPOSIÇOES:
(todos os níveis em % do peso)
LAS
TAS
FA45E7
Citrato Na de/ ácido citrio
Zeolito 4A
Copolimero AA/MA
Fosfonato
Carbonato de Na
Silicato ( R = 2)
Protease
Sulfato
SSS
| Compacto | Nao-Compacto |
| Detergente | Detergente |
| 9,40 | 6,27 |
| 3,00 | 2,00 |
| 2,65 | 1,77 |
| 18,50 | 12,33 |
| 32 ,i65 | 21,77 |
| 4,90 | 3,27 |
| 0,19 | 0,13 |
| 3,00 | 2,00 |
| 2.90 | 1,93 |
| 1,62 | 1,08 |
| 4,50 | 30,00 |
| 0,40 | 0,27 |
3£
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Case CM 356M
COMPOSIÇÕES; (continuação) (todos os níveis em % de peso)
Menores + Água
Densidade (g/L a 20eC)
Compacto
Detergente
Não-Compacto
Detergente resto para 100%
680
415
Utilização recomendada do produto
Lavagem
120
180
Ensaio de Rejuvenescimento das Cores
Mod. 71 - 20.000 ex. - 90/08
Condiçoes de ensaio:
Temperatura de lavagem: 40QC
Tempo de lavagem: 3h
Número de ciclos de lavagem; 2 pH = detergente não compacto 8,2 detergente compacto 8,5
Dureza da água : 15gr/3,96gr/L
Concentração do detergente:
0,75% para o detergente não compacto
0,66% para o detergente compacto
Tecido de ensaio: pijama de algodão azul debotado (90/10 algodão/;Poliester) p Celulases : 1) Celluzymz fornecido por Novo Nordisk (=;referência)
2) endoglucanase 43kD - celulase de acordo com o presente invento
Ensaio de lavagem: Retalhos de 8g de tecido de pijama azul debotado foram tratados com as diferentes soluçoes de lava gem. Após secagem por enrolamento, os tecidos foram graduadospara efeitos de clarificação de cor por meio de comparaçao directa das duas diferentes matrizes de detergentes a níveis iguais de celulase. A graduação visual por avaliadores especialistas utilizando uma escala de 0 a 4 foi a pre3^
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Case CM 356M
ferida. (Ó significa nanhuma diferença e 4 significa uma dife rença muito grande,)
Resultados do ensaio:
I) Detergente Nao Compacto
PSU
Nenhuma celulase
Celluzyme
138mg proteína/L + 2,;3 endoglucanase 43kD
18,6 mg proteína/L + 2,2 mg de proteína/PSU
8,5
Mod. 71 - 20.000 ex. - 90/08
II) Detergente Compacto
Nenhuma celulase
Celluzyme
165 mg proteína/L
Endoglucanase 43kD
3,4 mg proteína/
PSU mg de proteína/PSU
| 0 | |
| +='-3,8 | 43 |
| + 3,4 | 1,0 |
LSD (diferença Menos Significativa) = 0,5 PSU
A partir do resultado mg proteína/PSU,foram calculados os seguintes factores de eficiência:
Factor de eficiência de endoglucanase 43kD em relação à
Celluzyma:
Em detergente Nao-compacto Em detergente Compacto
60/8,5 = 7 43/1,0 = 43
Factor de eficiência no Detergente Compacto relativamente ao Detergente não compacte · f : 1 e \ · : ei
Da Celluzyma
60/43 = 1,4
Conclusões:
de endoglucanase 43kD
8,5/1 = 8,5
MÔ
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Case CM 356M
resultados acima mostram que uma celulase seleccionada de acordo com o presente invento é 43 vezes mais eficaz do que a celulase da técnica actual na matriz compacta reivindicada , Além disso, os resultados acima mostram que a melhoria do desempenho devido à matriz compacta reivindicada, observado com as celulases seleccionadas, é surpreendentemente muito mais alto do que o que pode ser obtido com a celulase da tée nica actual.
Mod. 71 - 20.000 ex. -5Ό/0Β
EXEMPLO III
ENSAIO DE REMOÇÃO DE MANCHA DE TERRA os enzimas de celulase são também muito eficientes na remoção de nódoas de terra dos tecidos. Esta característica particular de desempenho foi verificada para a endoglucanase 43kD nas duas composições detergentes fornecidas no exemplo II.
Condições;
Equipamento de ensaio dè tecidos- Linitest
Lavagem a 60eC (ciclo dèeaqueciment°)
Tempo de lavagem:4Q- minutos
Dureza da água: Agua da cidade de Bruxelas
Concentrações de detergente :
0,66% para o detergente compacto
1,0% para o detergente não compacto
Concentrações de celulase: 1,55; 3,10; 4,65; e 6,2mg de prc>
t.eína7.enzimática/L de licor de lavagem
Ensaio de lavagem
Um tecido de algodão árabe foi manchado com terras de origem natural de duas diferentes localizações (EUA; GB). 0 desempenho da celulase foi avaliada pela comparação das manchas de terra lavadas com igual nível de celulase nas duas diferentes composições detergentes. A escala de graduação visual
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Case CM 356M usada no exemplo II foi de novo preferida.
Resultados
| Nível de celulase | 1,55 | 3,1 | 4,7 | 6,2 |
| (mg de prot.enz./L | de licor | de lavagem) | ||
| Detergente compacto | ||||
| Terra dos EUA | + 1,50 | + 2,50 | +2,D0 | + 1,50 |
| Terra da GB | +0,50 | + 1,00 | + 1,50 | +2,.50 |
| Detergente não composto | ||||
| (=referência) | 0 | 0 | 0 | 0 |
| LSD (diferença menos significativa) | = 0,42 | a 95% de | confian- |
Mod. 71 - 20.000 ex. - 90/08 ça . 0 desempenho de remoção de nódoas de terra da celulase seleccionadâ de acordo com o presente invento, na composiçãc dé-detergente compacto do invento, é significativamente superior ao desempenho da mesma.:.celulase na composição detergente não:compacta, convencional
EXEMPLOS IV-XI são também preparadas compsições detergentes compactas:
64.264
Case CM 356 M
| 1 | o | o | in l | 1 o | O | l in |
| Η’ 1 | cn | o | i | 1 o | O | i sr |
| Η 1 | X | X | - 1 | 1 - | X | 1 |
| X 1 | cn | CD | CM 1 | 1 LO | o | l cn |
| 1—1 | CM |
| o | in | O 1 1 | 1 o | o | i in | |
| H | in | CM | CM 1 1 | 1 o | o | 1 Ν' |
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| X | ' X | ' 1 1 | 1 - l | l | X |
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Case CM 356M
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64.264
Case CM 356M
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| 5 | m | Ui | o | + | O |
64.264
Case CM 356M
Mod. 71 - 20.000 ex. - 90/08
INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA DE ID N9 1:
(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) Comprimento: 1060 pares de base (B) Tipo: ácido nucleíco (C) Forma do cordão: simples (D) Topologia: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (iii) HIPOTÉTICO: Nao (iv) FONTE ORIGINAL (A) organismo: Humicola insolens (B) estirpe: DSM 1800 (ix) CARACTERÍSTICA (A) Nome/Chave: péptido de estrutura aleatória (B) Localização: 73..927 (ix) CARACTERÍSTICA (A) Nome/Chave: péptido sig.
(B) Localização : 10..72 (ix) CARACTERÍSTICA (A) Nome/Chave: CDS (Bj Localização: 10..927
INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID Ν^2:
(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) Comprimento: amino ácidos 305 (B) Tipo: amino ácido (D) Topologia: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Proteína
64.264 case CM 356M
Mod. 71 - 20.000 ex. - 90/08
INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA DE ID Ne 3:
(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) Comprimento: 1473 pares base (B) Tipo-í ácido nucleíco (C) Foramto do cordão:simples (D) Topologia: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (iii) HIPOTÉTICO: Não (iv) ANTI-SENTIDO: Nao (vi) FONTE ORIGINAL (A) Organismo: fusarius oxysporum (B) Estirpe: DSM 2672 (ix) CARACTÍSTICAS (A) Nome/CÓdigo: CDS (B) Localização: 97..1224
INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA DE ID N2 4:
(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) Comprimento: 376 amino ácidos (B) Tipo: amino ácido (C) Topologia: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Proteína.
64.264
Case CM 356M
Descrição de Sequência: Seq.de ID N® 1:
QSITCCAAQ-.ATG 'CGT TCC TCC CCC .CTC. CTC CCG TCC.GCC GTT GTG GCC 48
Met Arg Ser Ser Pro Leu Leu Pro Ser Ala Vai Vai Ala
-21 -20 -15 -10
Mod. 71 - 20.000 ex. - 90/08
| GCC | CTG | CCG GTG | TTG | GCC | CTT | GCC | GCT | GAT GGC | AGG | TCC | ACC | CGC | TAC | 96 | |
| Ala | Leu | Pro Vai | Leu | Ala | Leu | Ala | Ala | Asp Gly Arg | Ser | Thr | Arg Tyr | ||||
| -5 | 1 | 5 | |||||||||||||
| TGG | GAC | TGC TGC | AAG | CCT | TCG | TGC | GGC | TGG | GCC | AAG | AAG | GCT | CCC | GTG | 144 |
| Trp Asp Cys Cys | Lys | Pro | Ser | Cys | Gly Trp | Ala | Lys | Lys | Ala | Pro | Vai | ||||
| 10 | 15 | 20 | |||||||||||||
| AAC | CAG | CCT GTC | TTT | TCC | TGC | AAC | GCC | AAC | TTC | CAG | CGT | ATC | ACG | GAC | 192 |
| Asn | Gin | Pro Vai | Phe | Ser | Cys | Asn | Ala | Asn | Phe | Gin | Arg | Ile | Thr | Asp | |
| 25 | 30 | 35 | 40 | ||||||||||||
| TCC | GAC | GCC AAG | TCC | GGC | TGC | GAG | CCG | GGC | GGT | GTC | GCC | TAC | TCG | TGC | 240 |
| Phe | Asp | Ala Lys | Ser | Gly | Cys | Glu | Pro | Gly Gly | Vai | Ala | Tyr | Ser | Cys | ||
| 45 | 50 | 55 | |||||||||||||
| GCC | GAC | CAG ACC | CCA | TGG | GCT | GTG | AAC | GAC | GAC | TTC | GCG | CTC | GGT | TTT | 288 |
| Ala | Asp | Gin Thr | Pro | Trp | Ala | Vai | Asn | Asp Asp | Phe | Ala | Leu | Gly | Phe | ||
| 60 | 65 | 70 | |||||||||||||
| GCT | GCC | ACC TCT | ATT | GCC | GCC | AGC | AAT | GAG | GCG | GGC | TGG | TGC | TGC | GCC | 336 |
| Ala | Ala | Thr Ser | Ile | Ala | Gly | Ser | Asn | G1U | Ala | Gly Trp Cys | Cys | Ala | |||
| 75 | 80 | 85 | |||||||||||||
| TGC | TAC | GAG CTC | ACC | TCC | ACA | TCC | GGT | CCT | GTT | GCT | GGC | AAG | AAG | ATG | 384 |
| Cys | Tyr | Glu Leu | Thr | Phe | Thr | Ser | Gly | Pro | Vai | Ala | Gly Lys | Lys | Met | ||
| 90 | 95 | 100 | |||||||||||||
| GTC | GTC | CAG TCC | ACC | AGC | ACT | GGC | GGT | GAT | CTT | GGC | AGC | AAC | CAC | TTC | 432 |
| Vai | Vai | Gin Ser | Thr | Ser | Thr | Gly Gly Asp | Leu | Gly | Ser | Asn | His | Phe | |||
| 105 | 110 | 115 | 120 | ||||||||||||
| GAT | CTC | AAC ATC | CCC | GGC | GGC | GGC | GTC | GGC | ATC | TTC | GAC | GGA | TGC | ACT | 480 |
| Asp | Leu | Asn Ile | Pro | Gly Gly Gly | Vai | Gly | Ile | Phe | Asp Gly | Cys | Thr | ||||
| 125 | 130 | 135 | |||||||||||||
| CCC | CAG | TTC GGC | GGT | CTG CCC | GGC | CAG | CGC | TAC | GGC | GGC | ATC | TCG | TCC | 528 | |
| Pro | Gin | Phe Gly Gly Leu Pro Gly | Gin | Arg Tyr | Gly Gly Ile | Ser | Ser |
140 145 150
Má
64.264
Case CM 356M
Mod. 71 - 20.000 ex. - 90/08
| CGC | AAC | GAG | TGC | GAT | CGG | TTC | CCC | GAC | GCC | CTC | AAG | CCC | GGC | TGC | TAC | 576 |
| Arg | Asn | G1U | Cys Asp Arg | Phe | Pro | Asp..· Ala Leu Lys | Pro-Gly Cys | Tyr | ||||||||
| 155 | 160 | 165 | ||||||||||||||
| TGG | CGC | TTC | GAC | TGG | TTC | AAG | ACC | GCC | GAC | AAT | CCG | AGC | TTC | AGC | TTC | 624 |
| Trp Arg | Phe | Asp Trp | Phe | Lys | Asn | Ala | asp | Asn | Pro | Ser | Phe | Ser | Phe | |||
| 170 | 175 | 180 | ||||||||||||||
| CGT | CAG | GTC | CAG | TGC | CCA | GCC | GAG | CTC | GTC | GCT | CGC | ACC | GGA | TGC | CGC | 672 |
| Arg | Gin | Vai | Gin | cys | Pro | Ala | Glu | Leu | Vai | Ala | Arg | Thr | Gly | Cys Arg | ||
| 185 | 190 | 195 | 200 | |||||||||||||
| CGC | AAC | GAC | GAC | GGC | AAC | TTC | GCT | GCC | GTC | CAG | ATC | CCC | TCC | AGC | AGC | 720 |
| Arg | Asn | Asp Asp Gly | Asn | Phe | Pfo | Aia | Vai | Gin | Ile | Pro | Ser | Ser | Ser | |||
| 205 | 210 | 215 | ||||||||||||||
| ACC | AGC | TCT | CCG | GTC | AAC | CAG | CCT | ACC | AGC | ACC | AGC | ACC | ACG | TCC | ACC | 768 |
| Thr | Ser | Ser | Pro | Vai | Asn | Gin | Pro | Thr | Ser | Thr | Ser | Thr | Thr | Ser | Thr | |
| 220 | 225 | 230 | ||||||||||||||
| TCC | ACC | ACC | TCG | AGC | CCG | CCA | GTC | CAG | CCT | ACG | ACT | CCC | AGC | GGC | TGC | 816 |
| Ser | Thr | Thr | Ser | Ser | Pro | Pro | vai | Gin | Pro | Thr | Thr | Pro | Ser | Gly Cys | ||
| 235 | 240 | 245 | ||||||||||||||
| ACT | GCT | GAG | AGG | TGG | GCT | CAG | TGC | GGC | GGC | AAT | GGC | TGG | AGC | GGC | TGC | 864 |
| Thr | Ala | Glu | Arg Trp | Ala | Gin | Cys Gly Gly 'AsH | Gly Trp | Ser | Gly | Cys | ||||||
| 250 | 255 | 260 | ||||||||||||||
| ACC | ACC | TGC | GTC | GGC | AGC | ACT | TGC | ACG AAG ATT | AAT | AAT | GAC | TGG | TAC | 912 | ||
| Thr | Thr | Cys | Vai | Ala | Gly | Ser | Thr Cys Thr Lys | Ile | Asn | Asp Trp | Tyr | |||||
| 265 | 270 | 275 | 280 |
CAT CAG TGC CTG TAGACGAGG GCAGCTTGAG GGCCTTACTG GTGGCCGCAA 964
His Gin Cys Leu
285
CGAAATGACA CTCCCAATCA CTGTATTAGT TCTTGTACAT AATTTCGTCA TCCCTCCAGG 1024
GATTGTCACA TAAATGCAAT GAGGAACAAT GAGTAC
1060
64.264
Case CM 356M
Mod. 71-20.000 ex. - 90/08
| Descrição de | Sequência: Seq. | ID 2: | |
| MetArg | Ser Ser Pro Leu | Leu Pro Ser Ala Vai | Vai Ala Ala Leu Pro |
| -21 -20 | -15 | -10 | |
| Vai leu | Ala Leu Ala Ala | Asp Gly Arg Ser Thr | Arg Tyr Trp Asp Cys |
| -5 | 1 | 5 | 18 |
| Cys Lys | Pro Ser Cys Gly | Trp Ala Lys Lys Ala | Pro Vai Asn Gin Pro |
| 15 | 20 | 25 | |
| Vai Phe | Ser Cys Asn Ala | Asn Phe Gin Arg Ile | Thr Asp Phe Asp Ala |
| 30 | 35 | 40 | |
| Lys Ser | Gly Cys Glu Pro | Gly Gly Vai ala Tyr | Ser Cys Ala Asp Gin |
| 45 | 50 | 55 | |
| Thr Pro | Trp Ala Vai Asn | Asp Asp Phe Ala Leu | Gly Phe Ala Ala Thr |
| 60 | 65 | 70 | 75 |
| Ser Ile | Ala Gly Ser Asn | Glu Ala Gly Trp Cys | Cys Ala Cys Tyr Glu |
| 80 | 85 | 90 | |
| Leu Thr | Phe Thr Ser Gly | Pro Vai Ala Gly Lys | Lys Met Vai Vai Gin |
| 95 | 100 | 105 | |
| Ser Thr | Ser Thr Gly Gly | Asp Leu gly Ser Asn | His Phe Asp Leu Asn |
| 110 | 115 | 120 | |
| Ile Pro | Gly Gly Gly Vãl | Gly Tle Phe Asp Gly | Cys Thr Pro Gin Phe |
| 125 | 130 | 135 | |
| Gly Gly | Leu Pro Gly Gin | Arg Tyr Gly Gly Ile | Ser Ser Arg Asn Glu |
| 140 | 145 | 150 | 155 |
| Cys Asp | Arg Phe Pro Asp | Ala Leu Lys Pro Gly | Cys Tyr Trp Arg Phe |
| 160 | 165 | 170 | |
| Asp Trp | Phe Lys Asn Ala | Asp Asn Pro Ser Phe | Ser Phe Arg Gin Vai |
| 175 | 180 | 185 | |
| Gin Cys | Pro Ala Glu Leu | Vai Ala Arg Thr Gly | Cys Arg Arg Asn Asp |
| 190 | 195 | 200 | |
| Asp Gly | Asn Phe Pro Ala | Vai gin Ile Pro Ser | Ser Ser Thr Ser Ser |
| 205 | 210 | 215 | |
| Pro Vai | Asn Gin Pro Thr | Ser Thr Ser Thr Thr | Ser Thr Ser Thr Thr |
| 220 | 230 | 235 | |
| Ser Ser | Pro Pro Vai Gin | Pro Thr Thr Pro Ser | Gly Cys Thr Ala Glu |
| 240 | 245 | 250 |
£0
64.264
Case CM 356M
| Arg | Trp | Ala | Gin | Cys | Gly | Gly | Asn | Gly | Trp | Ser | Gly | Cys | Thr | Thr | Cys |
| 255 | 260 | 265 | |||||||||||||
| Vai | Ala | Gly | Ser | Thr | Cys | Thr | Lys | Ile | Asn | Asp | Trp | Tyr | His | Gin | Cys |
| 270 | 275 | 280 | |||||||||||||
| Leu |
Descrição de Sequência: Seq. de ID RS 3:
Mod. 71 - 20.000 ex. - 90/08
GAATTCGCGG CCGCTCATTC ACTTCATTCA TTCTTTAGAA TTACATACAC TCTCTTTCAA
| AACAGTCACT CTTTAAACAA AACAACTTTT GCAACA ATG CGA TCT Met Arg Ser | TAC ACT | CTT Leu | |||||||||||||
| Tyr | Thr 5 | ||||||||||||||
| 1 | |||||||||||||||
| CTC | GCC | CTG | GCC | GGC | CCT | CTC | GCC | GTG | AGT | GCT | GCT | TCT | GGA | AGC | GGT |
| Leu | Ala | Leu | Ala | Gly | Pro | Leu | Ala | Vai | Ser | Ala | Ala | Ser | Gly | Ser | Gly |
| 10 | 15 | 20 | |||||||||||||
| CAC | TCT | ACT | CGA | TAC | TGG | GAT | TGC | TGC | AAG | CCT | TCT | TGC | TCT | TGG | AGC |
| His | Ser | Thr | Arg Tyr Trp Asp Cys | Cys Lys | Pro | Ser | Cys | Ser | Trp | Ser | |||||
| 25 | 30 | 35 | |||||||||||||
| GGA | AAG | GCT | GCT | GCT | AAC | GCC | CCT | GCT | TTA | ACT | TGT | GAT | AAG | AAC | GAC |
| Gly Lys | Ala | Ala | Vai | Asn | Ala | Pro | Ala | Leu | Thr | Cys | Asp | Lys | Asn | Asp | |
| 40 | 45 | 50 | |||||||||||||
| AAC | CCC | ATT | TCC | AAC | ACC | AAT | GCT | GTC | AAC | GGT | TGT | GAG | GGT | GGT | GGT |
| Asn | Pro | Ile | Ser | Asn | Thr | Asn | Ala | Vai | Asn | Gly | Cys | G1M | Gly | Gly Gly | |
| 55 | 60 | 65 | 70 | ||||||||||||
| TCT | GCT | TAT | GCT | TGC | ACC | AAC | TAC | TCT | CCC | TGG | GCT | GTC | AAC | GAT | GAG |
| Ser | Ala | Tyr | Ala | Cys | Thr | Asn | Tyr | Ser | Pro | Trp | Ala | Vai | Asn | Asp | G1U |
| 75 | 80 | 85 | |||||||||||||
| CTT | GCC | TAC | GGT | TTC | GCT | GCT | ACC | AAG | ATC | TCC | GGT | GGC | TCC | GAG | GCC |
| Leu | Ala | Tyr | Gly | Phe | Ala | Ala | Thr | Lys | Ile | Ser | Gly | Gly | Ser | Glu | Ala |
| 90 | 95 | 100 | |||||||||||||
| AGC | TGG | TGC | TGC | GGT | TGC | TAT | GCT | TTG | ACC | TTC | ACC | ACT | GGC | CCC | GTC |
| Ser | Trp | Cys | Cys | Ala | Cys | Tyr | Ala | Leu | Thr | Phe | Thr | Thr | Gly | Pro | Vai |
| 105 | 110 | 115 | |||||||||||||
| AAG | GGC | AAG | AAG | ATG | ATC | GTC | CAG | TCC | ACC | AAC | ACT | GGA | GGT | GAT | CTC |
| Lys Gly Lys Lys | Met | Ile | Vai | Gin | Ser | Thr | Asn | Thr | Gly Gly Asp | Leu | |||||
| 120 | 125 | 130 |
:eo
114
162
210
258
306
354
402
450
S\
498
64.264
Case CM 356M
Mod. 71 - 20.000 ex. -90/08
| GGC GAC | AAC | CAC | TTC | GAT | CTC | ATG | ATG | CCC | GGC | GGT | GGT | GTC | GGT | ATC | |
| Gly Asp | Asn | His | Phe | Asp | Leu | Met | Met | Pro | Gly Gly Gly | Vai | giy | Ile | |||
| 135 | 140 | 145 | 150 | ||||||||||||
| TTC | GAC | GGC | TGC | ACC | TCT | GAG | TTC | GGC | AAG | GCT | CTC | GGC | GGT | GCC | ACG |
| Phe | Asp | Gly Cys | Thr | Ser | G1U | Phe | Gly Lys | Ala | Leu | Gly Gly | Ala | Gin | |||
| 155 | 160 | 165 | |||||||||||||
| TAC | GGC | GGT | ATC | TCC | TCC | CGA | AGC | GAA | TGT | GAT | AGC | TAC | CCC | GAG | CTT |
| Tyr Gly | Gly | Ile | Ser | Ser | Arg | Ser | Giu | Cys | Asp | Ser | Tyr | Pro | Gira | Leu | |
| 170 | 175 | 180 | |||||||||||||
| CTC | AAG | GAC | GGT | TGC | CAC | TGG | CGA | TTC | GAC | TGG | TTC | GAG | AAC | GCC | GAC |
| Leu | Lys | Asp Gly Cys | His | Trp Arg | Phe | Asp Trp | Phe | Glm | Asn | Ala | Asp | ||||
| 185 | 190 | 195 | |||||||||||||
| AAC | CCT | GAC | TTC | ACC | TTT | GAG | CAG | GTT | CAG | TGC | CCC | AAG | GCT | CTC | CTC |
| Asn | Pro | Asp | Phe | Thr | Phe | Glu | Gin | Vai | Gin | Cys | Pro | Lys | Ala | Leu | Leu |
| 200 | 205 | 210 | |||||||||||||
| GAC | ATC | AGT | GGA | TGC | AAG | CGT | GAT | GAC | GAC | TCC | AGC | TTC | CCT | GCC | TTC |
| Asp | Ile | Ser | Gly | Cys Lys Arg Asp Asp Asp | Ser | Sgr | Phe | Pro | Ala | Phe | |||||
| 215 | 220 | 225 | 230 | ||||||||||||
| AAG | GTT | GAT | ACC | TCG | GCC | AGC | AAG | CCC | CAG | CCC | TCC | TGC | TCC | GCT | AAG |
| Lys | Vai | Asp | Thr | Ser | Ala | Ser | Lys | Pro | Gin | Pro | Ser | Ser | Ser | Ala | Lys |
| 235 | _ : | 240 | 245 | ||||||||||||
| AAG | ACC | ACC | TCC | GCT | GCT | GCT | GCC | GCT | GAG | CCC | CAG | AAG | ACC | AAG | GAT |
| Lys | Thr | Thr | Ser | Ala | Ala | Ala | Ala | Ala | Gin | Pro | Gin | Lys | Thr | Lys | Asp |
| 250 | 255 | 260 | |||||||||||||
| TCC | GCT | CCT | GTT | GTC | CAG | AAG | TCC | TCC | ACC | AAG | CCT | GCC | GCT | CAG | CCC |
| Ser | Ala | Pro | Vai | Vai | Gin | Lys | Ser | Ser | Thr | Lys | Pro | Ala | Ala | Gin | Pro |
| 265 | 270 | 275 | |||||||||||||
| GAG | CCT | ACT | AAG | CCC | GCC | GAC | AAG | CCC | CAG | ACC | GCA | AAG | CCT | GCT | GCC |
| Glu | PEO | Thr | Lys | Pro | Alá | Asp Lys | PÊÔ | Gin | Thr | Asp | Lys | Pro | Vai | Ala | |
| 280 | 285 | 290 | |||||||||||||
| ACC | AAG | CCT | GCT | GCT | ACC | AAG | CCC | GTC | CAA | CCT | GTC | AAC | AAG | CCC | AAG |
| Thr | Lys | Pro | Ala | Ala | Thr | Lys | Pro | Vai | Gin | Pro | Vai | Asn | Lys | Pro | Lys |
| 295 | 300 | 305 | 310 | ||||||||||||
| ACA | ACC | CAG. AAG | GTC | CGT | GGA | ACC | ΆΑΑ | ACC | CGA | GGA | AGC | TGC | CCG | GCC | |
| Thr | Thr | Gin Lys | Vai | Arg Gly | Thr | Lys | Thr | Arg Gly | Ser | Cys | Pro | Ala | |||
| 315 | 320 | 325 |
546
594
642
690
738
786
834
882
930
978
1026
1074
64.264
Case CM 356M
| AAG | ACT | GAC | GCT | ACC | GCC | AAG | GCC | TCC | GTT | GTC | CCT | GCT | TAT | TAC | CAG | 1122 |
| Lys | Thr | Asp | Ala | Thr | Ala | Lys | Ala | Ser | Vai | Vai | Pro | Ala | Tyr | Tyr | Gin | |
| 330 | 335 | 340 | ||||||||||||||
| TGT | GGT | GGT | TCC | AAG | TCC | GCT | TAT | CCC | AAC | GGC | AAC | CTC | GCT | TGC | GCT | 1170 |
| Cys | Giy | Gly | Ser | Lys | Ser | Ala | Tyr | Pro | Asn | Gly | Asn | Leu | Ala | Cys | Ala | |
| 345 | 350 | 355 | ||||||||||||||
| ACT | GGA | AGC | AAG | TGT | GTC | AAG | CAG AAC | GAG | TAC | TAC | TCC | CAG | TGT | GTC | 1218 | |
| Thr | Gly | Ser | Lys | Cys | Vai | Lys | Gin Asn | Glu | Tyr | Tyr | Ser | Gin | Cys | Vai | ||
| 360 | 365 | 370 | ||||||||||||||
| CCC | AAC | TAAATGGTAG ATCCATCGGT TGTGGAAGAG ACTATGCGTC | TCAGAAGGGA | 1274 | ||||||||||||
| Pro | Asn |
375
TCCTCTCATG
TTGTTGTACA
CGACAACTGG
AGCAGGCTTG
TCATTGTATA
GCATGGCATC
CTGGACCAAG
TGTTCGACCC
1334
TAGTATATCT
CTACAAAAGA
TCATTGTATA
TATTTAGZCA
CATAGATAGC
CTCTTGTCAG
1394
CTTGGCAGGC
TTGTTCAATA
TTGACACAGT
TTCCTCCATA
1454
Mod. 71 - 20.000 ex. · 90/08
AAAAAAAAAA
AAAAAAAAA
Descrição de Sequência: Seq. De ID ΝΘ4:
| Wb.· Arg· Ser Tyr | Thr | Leu | Leu Alã. Leu | Ala’ | Gly Pro Leu Ala | Val | Ser | ||||||
| 1 | 5 | 10 | 15 | ||||||||||
| Ala | Ala Ser Gly | Ser | Gly | His | Ser | Thr | Arg | Tyr | Trp Asp Cys | Cys Lys | |||
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||
| Pro | Ser Cys Ser | Trp | Ser | Gly Lys | Ala | Ala | Val | Asn | Ala | Pro | Ala | Leu | |
| 35 | 40 | 45 | |||||||||||
| Thr | Cys Asp Lys | Asn | Asp | Asn | Pro | Ile | Ser | Asn | Thr | Asn | Ala | Val | Asn |
| 50 | 55 | 60 | |||||||||||
| Gly Cys Glu Gly Gly Gly | Ser | Ala | Tyr | Ala | Cys | Thr | Asn | Tyr | Ser | Pro | |||
| 65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||
| Trp | Ala Val Asn | Asp | G1U | Leu | Ala | Tyr | Gly | Phe | Ala | Ala | Thr | Lys | Ile |
| 85 | 90 | 95 | |||||||||||
| Ser | Gly Gly Ser | Glu | Ala | Ser | Trp Cys | Cys | Ala | Cys | Tyr | Ala | Leu | Thr | |
| 100 | 105 | 110 | |||||||||||
| Phe | Thr Thr Gly | Pro | Val | Lys | Gly Lys | Lys | Met | Ile | Val | Gin | Ser | Thr | |
| 115 | 120 | 125 |
64.264
Case CM 356M
Mod. 71 - 20.000 ex. - 90/08
| Asn | Thr 130 | Gly Gly Asp | Leu Gly Asp Asn His Phe Asp Leu Met Met Pro | ||||||||||||
| 135 | 140 | ||||||||||||||
| Gly Gly Gly Vai | Gly | Ile | Phe Asp Gly Cys | Thr | Ser | Glu | Phe | Gly Lys | |||||||
| 145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
| Ala | Leu | Gly Gly | Ala | Gin | Tyr Gly Gly Ile | Ser | Ser | Arg | Ser | Glu | Cys | ||||
| : -- | 165 | - | 170 | 175 | |||||||||||
| Asp | Ser | Tyr | Pro | Glu | Leu | Leu | Lys Asp Gly Cys | His | Trp Arg | Phe | Asp | ||||
| 180 | 185 | 190 | |||||||||||||
| Trp | Phe | Glu | Asn | Ala | Asp | Asn | Pro | Asp | Phe | Thr | Phe | Glu Gin | Vai | Gin | |
| 195 | 200 | 205 | |||||||||||||
| Cys | Pro | Lys | Ala | Leu | Leu | Asp | Ile | Ser | Gly Cys Lys Arg Asp Asp Asp | ||||||
| 210 | 215 | 220 | |||||||||||||
| Ser | Ser | Phe | Pro | Ala | Phe | Lys | Vai | Asp | Thr | Ser | Ala | Ser | Lys | Pro | Gin |
| 225 | 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
| Pro | Ser | Ser | Ser | Ala | Lys Lys | Thr | Thr | Ser | Ala | Ala | Ala | Ala | Ala | Gin | |
| 245 | 250 | 255 | |||||||||||||
| Pro | Gin | Lys | Thr | Lys | Asp | Ser | Ala | Pro | Vai | Vai | Gin | Lys | Ser | Ser | Thr |
| 260 | 265 | 270 | |||||||||||||
| Lys | Pro | Ala | Ala | Gin | Pro | Glu | Pro | Thr | Lys | Pro | Ala | Asp Lys | Pro | Gin | |
| 275 | 280 | 285 | |||||||||||||
| Thr | Asp Lys | Pro | Vai | Ala | Thr | Lys | Pro | Ala | Ala | Thr | Lys | Pro | Vai | Gin | |
| 290 | 295 | 300 | |||||||||||||
| Pro | Vai | Asn | Lys | Pro | Lys | Thr | Thr | Gin | Lys | Vai | Arg Gly | Thr | Lys | Thr | |
| 305 | 310 | 315 | 320 | ||||||||||||
| Arg Gly | Ser | Cys | Pro | Ala | Lys | Thr | Asp | Ala | Thr | Ala | Lys | Ala | Ser | Vai | |
| 325 | 330 | 335 | |||||||||||||
| Vai | Pro | Ala | Tyr | Tyr | Gin | Cys | Gly Gly | Ser | Lys | Ser | Ala | Tyr | Pro | Asn | |
| 340 | 345 | 350 | |||||||||||||
| Gly | Asn | Leu | ala | Cys | Ala | Thr | Gly Ser Lys | Cys | Vai | Lys | Gin | Asn | Glu | ||
| 355 | 360 | 365 | |||||||||||||
| Tyr | Tyr | Ser | Gin | cys | Vai | Pro | Asn |
370 375
Lisboa, - 8. ABR. 1992
PCIER & CAMBIE COMPANY fâiftáe iWGOÊS ÈOTÇ âjÈSfiie Oficial liá Propriedade Indusmai «» Gonosi^o. 3, l.Mlífc tMWA
Claims (16)
- REIVINDICAÇÕESMod. 71 - 20.000 ex. - 90/08Ia·- Processo para a preparação de uma composição detergente granular destinada à lavagem de tecidos numa máquina de lavar,contituída por agente tensio-activo,agente encorpante e celulase, caracterizado por a referida celulase proporcionar pelo menos 10% da remoção de carboxilmetilcelulose imobilizada, radioactivamente marcada de acordo com método C14CMC a 25x10 % em . peso· de pro^tEÍna âe;'celulase' nã : solução de ensajiy. .der. lavagem!' á arefertóapòoi«pbsiçãtr-gíaiailá& -dè- detetgenteo não icbnte r mais do que 15% em peso de sal inorgânico de enchimento, e a referida composição granular detergente ter uma ''densidade de 550 a 950g/litro de composição.
- 2a·- Processo para a preparação de uma composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o. composto de celulase ser constituído essencialmente por um componente de endoglucanase homogéneo que é imunoreactivo com um anticorpo monoclonal criado por reacção a uma celulase paraíàlmente purificada de cerca de9^43kD, derivada de Humicolc insolens, DSM 1800, ou que é homóloga à referida endoglucané se 43kD.
- 3a.- Processo para a preparação de uma composição de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por o componente endoglucanase da referida celulase ter um ponto isolem trico de cerca de 5,1.
- 4a·- Processo para a preparação de uma -composiçãc de acordo com as reivindicações 2-3, caracterizado por o referido componente endoglucanase ser produzível por um método constituido pela cultivação de uma céLu*la hospedeira transformada com um vector ADN recombinante, que transporta uma sequência ADN codificadora do referido componente endoglucanase ou um percursor do referido componente endoglucanase, bem como sequências ADN codificadoras de funções que permitem a expressão da séquêaftciáiderADNcamtíifiêcàr οι ocomponente endo-r glucanaseyiou. um .seu precursor,-. num meio de cultura sob con3564.264Case CM 356MMod. 71 - 20.000 ex. - 90/08 dições que permitem a expressão do componente endoglucanase ou do seu precursor e recuperação do componente endoglucanase da cultura.
- 5§.- Processo para a preparação de uma composição de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriorse, caracterizado por o nível de celulase ser tal, que a quantidade de proteína de enzima a ser fornecida na solução de lavagem seja de entre 6,flâ5 e 40mg/litro de solução de lavagen, preferivelmente 0,01 a 10 mg/litro de solução de lavagem.
- 6a.- Processo para a preparação de uma composição de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, cõ .. racterizado por o referido sal inorgânico de enchimento ser escolhido de entre os sais de metais alcalinos e alcalinoterrosos de sulfato de cloreto.73.- Processo para a preparação de uma composição de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, cõ racterizado por a composição não conter mais do que 10% em peso de sal inorgânico de enchimento.
- 8-.- Processo para a preparação de uma composição de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por a composição não conter mais do que 5% em peso de sal inorgânico de enchimento,
- 9a.- Processo para a preparação de uma composição de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por a composição ter uma densidade de 650 a 850g/litro .
- 10a.- Processo para a preparação de uma composiçãc de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores,cacterizado por a composição estar praticamente isenta de compostos de fosfato e o referido agente encorpante ser escolhy do de entre os permutores de iões de aluminosilicato, citratos, carbonatos e suas misturas.Ll=- 113.- processo para a preparação de uma composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o composto de celulase ser um enzima endoglucanase com a sequência64.264Case CM 356M de amino ácidos representada na listagem de sequência ID-^2:Mod. 71 - 20.000 ex. - 90/08
Met Arg Ser Ser Pro Leu Leu Pro Ser Ala Vai Vai Ala Ala Leu Pro -21 -20 15 10 Vai Leu Ala Leu Ala Ala Asp Gly Arg Ser Thr ARg Tyr Trp Asp Cys -5 1 5 10 Cys Lys Pro Ser Cys Gly Trp Ala Lys Lys Ala Pro Vai Asn Gin Pro 15 20 25 Vai Phe Ser Cys Asn Ala Asn Phe Gin Arg Ile Thr Asp Phe Asp Ala 30 35 40 Lys Ser Gly Cys Glu Pro Gly Gly Vai Ala Tyr Ser Cys Ala Asp Gin 45 50 55 Thr Pro Trp Ala Vai Asn Asp Asp Phe Ala Leu Gly Phe Ala Ala Thr 60 65 70 75 Ser Ile Ala Gly ser Asn Glu Ala Gly Trp Cys Cys Ala Cys Tyr Glu 80 85 90 Leu Thr Phe Thr Ser Gly Pro Vai Ala Gly Lys Lys Met Vai Vai Gin 95 100 105 Ser Thr Ser Thr Gly Gly Asp Leu Gly Ser AsnHi’s. Phe Asp Leu Asn 110 115 120 Ile Pro Gly Gly Gly Vai Gly Ile Phe Asp Gly Cys Thr Pro Gin Phe 125 130 135 Gly Gly Leu Pro Gly Gin Arg Tyr Gly Gly Ile Ser Ser Arg Asn Glu 140 145 150 155 Cys Asp Arg Phe Pro Asp Ala Leu Lys Pro Gly Cys Tyr Trp Arg Phe 160 165 170 Asp Trp The Lys Asn Ala Asp Asn Pro Ser Phe Ser Phe Arg Gin Vai 175 180 185 Gin Cys Pro Ala Glu Leu Vai Ala Arg Thr Gly Cys Arg Arg Asn Asp 190 195 200 Asp Gly Asn Phe Pro Ala Vai Gin Ile Pro Ser Ser Ser Thr Ser Ser 205 210 215 Pro Vai Asn Gin Pro Thr Ser Thr Ser Thr Thr Ser Thr Ser Thr Thr 220 225 230 235 Ser Ser Pro Pro Vai Gin Pro Thr Thr Pro Ser Gly Cys Thr Ala Glu 240 245 250 5}64.264Case CM356M8/0;Arg Trp Ala Gin Cys Gly Gly Asn Gly Trp Ser Gly Cys Thr Thr Cys 255 260 265 Vai Ala Gly Ser Thr Cys Thr Lys Tle Asn Asp Trp Tyr His Gin Cys 270 275 280 Leu Mod. 71 -20.000 ex.-90/08 ou é um seu homólogo que apresenta uma actividade endoglucanase . - 12a.-- Processo para a preparação de uma composição de acordo coma>reivindicação 11, caracterizado por o referido enzima endoglucanase ser produzível por uma espécie Humicola, por exemplo, Humicola insolens.
- 13a·— Processo para a preparação de uma composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o con posto de celulase ser um enzima endoglucanase com a sequência de amino ácidos representada na listagem de sequência ID^é4:
Met 1 Arg Ser Tyr Thr Leu Leu Ala Leu Ala Gly Pro Leu Ala Vai Ser 5 10 15 Ala Ala Ser Gly Ser Gly Hys Ser Thr Arg Tyr Trp Asp Cys Cys Lys 20 25 30 Pro Ser Cys Ser Trp Ser Gly Lys Ala Ala Vai Asn Ala Pro Ala Leu 35 40 45 Thr Cys Asp Lys Asn Asp Asn Pro Ile Ser Asn Thr Asn Ala Vai Asn 50 55 60 Gly Cys Glu Gly Gly Gly Ser Ala Tyr Ala Cys Thr Asn Tyr Ser Pro 65 70 75 80 Trp Ala Vai Asn Asp Gli Leu Ala Tyr Gly Phe Ala Ala Thr Lys Ile 85 90 95 Ser Gly Gly Ser GlU Ala Ser Trp Cys Cys Ala Cys Tyr Ala Leu Thr 100 105 110 Phe Thr Thr Gly Pro Vai Lys Gly Lys Lys Met Ile Vai Gin Ser Thr 115 120 125 Asn Thr Gly Gly Asp Leu Gly Asp Asn Hys Phe Asp Leu Met Met Pro 130 135 140 Gly Gly Gly Vai Gly Ile Phe Asp Gly Cys Thr Ser Giu Phe Gly Lys 145 150 155 160 sa264Case CM 356MMod. 71 -20.000 ex.-90/08Ala Leu Gly Gly Ala Gin Tyr Gly Gly Ile Ser Ser Arg Ser Gli Cys 165 170 175 Asp Ser Tyr Pro Glu Leu Leu Lys Asp Gly Cys Hys Trp Arg Phe Asp 180 185 190 Trp Phe Glu Asn Ala Asp Asn Pro Asp Phe Thr Phe Glu Gin Vai Gin 195 200 205 Cys Pro Lys Ala Leu Leu Asp Ile Ser Gly Cys Lys Arg Asp Asp Asp 210 215 220 Ser Ser Phe Pro Ala Phe Lys Vai Asp Thr Ser Ala Ser Lys Pro Gin 225 230 235 240 Pro Ser Ser Ser Ala Lys Lys Thr Thr Ser Ala Ala Ala Ala Ala Gin 245 250 255: Pro Gin Lys Thr Lys Asp Ser Ala Pro Vai Vai Gin Lys Ser Ser Thr 260 265 270 Lys Pro Ala Ala Gin Pro Gloi Pro Thr Lys Pro Ala Asp Lys Pro Gin 275 280 285 Thr Asp Lys Pro Vai Ala Thr Lys Pro Ala Ala Thr Lys Pro Vai Gin 290 295 300 Pro Vai Asn Lys Pro Lys Thr Thr Gin Lys Vai Arg Gly Thr Lys Thr 305 310 315 320 Arg Gly Ser Cys Pro Ala Lys Thr Asp Ala Thr Ala Lys Ala Ser Val 325 330 335 Vai Pro Ala Tyr Tyr Gin Cys Gly Gly Ser Lys Ser Ala Tyr Pro Asn 340 345 350 Gly Asn Leu Ala Cys Ala Thr Gly Ser Lys Cys Vai Lys Gin Asn Glu 355 360 365 Tyr Tyr Ser Gin Cys Vai Pro Asn 370 375 ou é um seu homólogo que apresenta uma actividade endoglucanase . - 14^. - Processo para a preparação de uma composição de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por o referido enzima endoglucanase ser produzível por uma espécie de Fusarium, por exemplo, Fusarium oxysporum.
- 15§. - Processo para a preparaçao de uma composi64.264Case CM 356MMod. 71 - 20.000 ex. - 90/08 ção de acordo com as reivindicações 11-14, caracterizado poi o referido enzima ser produzido por uma construção de ADN que compreende uma sequência de ADN que codifica o enzima.
- 16§.- Processo para a preparação de uma composiçãc de acordo com a reivindicação 15, caracterizado por a sequer cia ADN ser conforme se encontra representado na listagem de sequência ID 1:
GGATCCAAG ATG CGT TCC TCC CCC CTC CTC CCG TCC GCC GTT GTG GCC Met Arg Ser Ser Pro Leu Leu Pro ser Ala Val.Val Ala 48 96 GCC Ala CTG Leu -21 -20 CTT Leu 15 GCC GCT GAT GGC AGG TCC 10 ACC CGC TAC CCG Pro GTG TTC GCC Vai :--.5 Leu Ala Ala Ala Asp Gly Arg Ser Thr Arg Tyr . 1 5 TGG GAC TGC TGC AAG CCT TCG TGC GGC TGG GCC AAG AAG GCT CCC GTG 144 Trp Asp Cys Cys Lys Pro Ser Cys Gly Trp Ala Lys Lys Ala Pro Vai 10 15 20 AAC CAG CCT GTC TTT TCC TGC AAC GCC AAC TTC CAG CGT ATC AGC GAC 192 Asn Gin Pro Vai Phe Ser Cys Asn Ala Asn Phe Gin Arg Ile Thr Asp 25 30 35 40 TTC GACGCC AAG TCC GGC TGC GAG CCG GGC GGT GTC GCC TAC TCG TGC 240 Phe Asp Ala Lys Ser Gly Cys Glu Pro Gly Gly Vai Ala Tyr Ser Cys 45 50 55 GCC GAC CAG ACC CCA TGG GCT GTG AAC GAC GAC TTC GCG CTC GGT TTT 288 Ala Asp Gin Thr Pro Trp Ala Vai Asn Asp Asp Phe Ala Leu Gly Phe 60 65 70 GCT GCC ACC TCT ATT GCC GGC AGC AAT GAG GCG GGC TGG TGC TGC GCC 336 Ala Ala Thr Ser Ile Ala Gly Ser Asn Glm Ala Gly Trp cys Cys Ala 75 80 85 TGC TAC GAG CTC ACC TTC ACA TCC GGT CCT GTT GCT GGC AAG AAG ATG 384 Cys Tyr G1U Leu Thr phe Thr Ser Gly Pro Vai Ala Gly Lys lys Met 90 95 100 GTC GTC CAG TCC ACC AGC ACT GGC GGT GAT CTT GGC AGC AAC CAC TTC 432 Vai Vai Gin Ser Thr Ser Thr Gly Gly Asp Leu Gly Ser Asn His Phe 105 110 115 120 64.264Case CM 356MMod. 71 - 20.000 ex. - 90/08GAT CTC AAC ATC CCC GGC GGC GGC GTC GGC ATC TTC GAC GGA TGC ACT 480 Asp Leu Asn Ile Pro Gly Gly Gly Vai Gly Ile Phe Asp Gly Cys Thr 125 130 135 ccc CAG TCC GGC GGT CTG CCC GGC CAG CGC TAC GGC GGC ATC TCG TCC 528 pro Gin Phe Gly Gly Leu Pro Gly Gin Arg Tyr Gly Gly Ile Ser Ser 140 145 150 CGC AAC GAG TGC.GAT CGG TTC CCC GAC GCC CTC AAG CCC GGC TGC TAC 576 Arg ASn Glu Cys Asp Arg Phe Pro Asp Ala Leu Lys Pro Gly Cys Tyr 155 160 165 TGG CGC TTC GAC TGG TTC AAG AAC GCC GAC AAT CCG AGC TTC AGC TTC 624 Trp Arg Phe Asp Trp Phe Lys Asn Ala Asp Asn Pro Ser Phe Ser Phe 170 175 180 CGT CAG GTC CAG TGC CCA GCC GAC CTC GTC GCT CGC ACC GGA TGC CGC 672 Arg Gin Vai Gin Cys Pro Ala G1U Leu Vai Ala Arg Thr Gly Cys Arg 185 190 195 200 CGC AAC GAC GAC GCC AAC TTC CCT GCC GTC CAG ATC CCC TCC AGC AGC 720 Arg Asn Asp Asp Gly Asn Phe Pro Ala Vai Gin Ile Pro Ser Ser Ser 205 210 215 ACC AGC TCT CCG GTC AAC CAG CCT ACC AGC ACC AGC ACC ACG TCC ACC 768 Thr Ser Ser Pro Vai Asn Gin Pro Thr Ser Thr Ser Thr Thr Ser Thr 220 225 230 TCC ACC ACC TCG AGC CCG CCA GTC CAG CCT ACG ACT CCC AGC GGC TGC 816 Ser r Thr Thr Ser Ser Pro Pro Vai Gin Pro Thr Thr Pro Ser Gly Cys 235 240 245 ACT GCT GAG AGG TGG GCT CAG TGC GGC GGC AAT GGC TGG AGC GGC TGC 864 Thr Ala Gltt Arg Trp Ala Gin Cys Gly Gly Asn Gly Trp SER Gly Cys 250 255 260 ACC ACC TGC GTC GCT GGC AGC ACT TGC ACG AAG ATT AAT GAC TGG TAC 912 Thr Thr Cys Vai Ala Gly Ser Thr Cys Thr Lys Ile Asn Asp Trp Tyr 265 270 275 280 CAT CAG TGC TAGACGCAGG GCAGCTTGAG GGCCTTACTG GTGGCCGCAA 964His Gin Cys Leu285CGAAATGACA CTCCCAATCA CTGTATTAGT TCTTGTACAT AATTTCGTCA TCCCTCCAGG 1024GATTGTCACA TAAATGCAAT GAGGAACAAT GAGTAC1060264Case CM 356M a»Mod. 71 - 20.000 ex. - 90/08 ou ID 3:GAATTCGCGG CCGCTCATTC ACTTCATTCA TTCCTTTAGAA TTACATACAC TCTCTTTCAA 60AACAGTCACT CTTTAAACAA AACAACTTTT GCAACA ATG CGA TCT TAC ACT CTT Met Arg SEr Tyr Thr Leu 114 1 5 CTC GCC CTG GCC GGC CCT CTC GCC GTG AGT GCT GCT TCT GGA AGC GGT 162 Leu Ala Leu Ala Gly Pro Leu Ala Vai Ser Ala Ala Ser Gly Ser Gly 10 15 20 ?A£í'-TCT ACT CGA TAC TGG GAT TGC TGC AAG CCT TCT TGC TCT TGG AGC 210 lis Ser Thr Arg Tyr Trp Asp Cys Cys Lys Pro Ser Cys Ser Trp Ser25 30 35 GGA AAG GCT GCT GTC AAC GCC CCT GCT TTA ACT TGT GAT AAG AAC GAC 258 Gly Lys 40 Ala Ala Vai Asn Ala Pro Ala 45 Leu Thr Cys Asp Lys Asn Asp 50 ACC CCC ATT TCC AAC ACC AATSGCTAGTCAAAC 1GGT. TGT'-GAG2GGT - GGT “GGT 306 Asn Pro 55 Ile Ser Asn Thr 60 Asn Ala Vai Asn Gly Cys Glu Gly Gly Gly 65 70 TCT GCT TAT GCT TGC ACC’-. AAC TAC TCT. CCC TGG -GCT GTC AAC GAT GAG 354 Ser Ala Tyr Ala Cys 75 Thr Asn Tyr Ser Pro Trp Ala Vai Asn Asp Glu 80 85 CTT GCC TAC GGT TTC GCT GCT ACC AAG ATC TCC GGT GGC TCC GAG GCC 402 Leu Ala Tyr Gly 90 Phe Ala Ala Thr Lys 95 Ile Ser Gly Gly Ser Glu Ala 100 AGC TGG TGC TGT GCT TGC TAT GCT TTG ACC TTC ACC ACT GGC CCC GTC 450 Ser Trp Cys 105 Cys Ala Cys Tyr Ala Leu 110 Thr Phe Thr Thr Gly Pro Vai 115 AAG GGC AAG AAG ATG ATC GTC CAG TCC ACC AAC ACT GGA GGT GAT CTC 498 Lys Gly Lys 120 Lys Met Ile Vai 125 Gin Ser Thr Asn Thr Gly Gly Asp Leu 130 GGC GAC AAC CAC TTC GAT CTC ATG ATG CCCGGC GGT GGT GTC GGT ATC 546 Gly Asp 135 Asn His Phe Asp 140 Leu Met Met Pro Gly Gly Gly Vai Gly Ile 145 150 TTC GAC GGC TGC ACC TCT GAG TTC GGC AAG GCT TCT GGC GGT GCC CAG 594 Phe Asp Gly Cys Thr Ser Glu Phe Gly Lys Ala Leu Gly Gly Ala Gin 155 160 16564.264Case CM 356MMod. 71 - 20.000 eic. - 90/08TAC GGC ATC TCC TCC CGA AGC GAA TGT GAT AGC AGC TAC CCC GAC CTT 642 Tyr Gly Gly Ile Ser Ser Arg Ser G1U Cys Asp ser Tyr Pro Glu Leu 170 175 180 CTC AAG GAC GGT TGC CAC TGG CGA TTC GAC TGG TTC GAG AAC GCC GAC 690 Leu Lys Asp Gly Cys His Trp Arg Phe Asp Trp Phe Glu Asn Ala Asp 185 190 195 AAC CCT GAC TTC ACC TTT GAG CAG GTT CAG TGC CCC AAG GCT CTC CTC 738 Asn Pro Asp Phe Thr Phe Glu Gin vai Gin Cys Pro Lys Ala Leu Leu 200 205 210 GAC ATC AGT GGA TGC AAG CGT GAT GAC GAC TCC AGC TTC CCT GCC TTC 786 Asp Ile Ser Gly Cys Lys Arg Asp Asp Asp Ser Ser Phe Pro Ala Phe 215 220 225 230 AAG GTT GAT ACC TCG GCC AGC AAG CCC CAG CCC TCC AGC TCC GCT AAG 834 Lys Vai Asp Thr Ser Ala Ser Lys PÍQ Gin Pro Ser Ser Ser Ala Lys 235 240 245 AAG ACC ACC TCC GCT GCT GCT GCC GCT CAG CCC CAG AAG ACC AAG GAT 882 Lys Thr Thr Ser Ala Ala Ala Ala Ala Gin Pro Gin Lys Thr Lys Asp 250 255 260 TCC GCT CCT GTT GTC CAG AAG TCC TCC ACC AAG CCT GCC GCT CAG CCC 930 Ser Ala Pro Vai Vai Gin Lys Ser Ser Thr Lys Pro Ala Ala Gin Pro 265 270 275 GAG CCT ACT AAG CCC GCC GAC AAG CCC CAG ACC GAC AAG CCT GTC GCC 978 Glu Pro Thr Lys Pro Ala Asp Lys Pro Gin Thr Asp Lys Pro Vai Ala 280 285 290 ACC AAG CCT GCT GCT ACC AAG CCC GTC CAA CCT GTC AAC AAG CCC AAG 1026 Thr Lys Pro Ala Ala Thr Lys Pro Vai Gin Pro Vai Asn Lys Pro Lys 295 300 305 310 ACA ACC CAG AAG GTC CGT GGA ACC AAA ACC CGA GGA AGC TGC CCG GCC 1074 Thr Thr Gin Lys Vai Arg Gly Thr Lys Thr Arg Gly Ser Cys Pro Ala 315 320 325 AAG ACT GAC GCT ACC GCC AAG GCC TCC GTT GTC CCT GCT TAT TAC CAG 1122 Lys Thr Asp Ala Thr Ala Lys Ala Ser Vai Vai Pro Ala Tyr Tyr Gin 330 335 340 TGT GGT GGT TCC AAG TCC GCT TAT CCC AAC GGC AAC CTC GCT TGC GCT 1170 Cys Gly Gly Ser Lys Ser Ala Tyr Pro Asn Gly Asn Leu Ala Cys Ala 345 350 355 64.264Case CM 356MMod. 71 - 20.000 ex. - 90/08ACT GGA AGC AAG TGT GTC AAG CAG AAC GAG TAC TAC TCC CAG TGT GTC 1218Thr Gly Ser Lys Cys Vai Lys Gin Asn Glu Tyr Tyr Ser Gin Cys Vai360 365 370CCC AAC TAAATGGTAG ATCCATCGGT TGTGGAAGAG ACTATGCGTC TCAGAAGGGA 1274Pro Asn375TCCTCTCATG AGCAGGCTTG TCATTGTATA GCATGGCATC CTGGACCAAG · TGTTCGACCC 1334 TTGTTGTACA TAGTATATCT TCATTGTATA TATTTAGACA CATAGATAGC CTCTTGTCAG 1394 CGACAACTGG CTACAAAAGA CTTGGCAGGC TTGTTCAATA TTGACACAGT TTCCTCCATA 1454 AAAAAAAAAA AAAAAAAAA 1473 - 17ã. - Proceso para a preparação de uma composição de acordo com as reivindicações 11-16, caracterizado por a referida célula hospedeira ser uma estirpe de um fungo tal como Tricloderuca ou Aspergillus, preferivelmente Aspergillus oryzae ou Aspergillus niger ou uma célula de levedura pertencente a uma estirpe de Hansenula ou Saccharomyces, por exemplo, uma estirpe de Saccharomyces cerevisae.
- 18â. - Processo para a preparaçao de uma composição de acordo com as reivindicações 11-17, caracterizado por a célula hospedeira ser uma estirpe de uma bactéria, por exemplo, Bacillus, Streptomyces ou E. Coli.
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