PT104879A - Hidrogel de dextrino para aplicações biomédicas - Google Patents

Abstract

A INVENÇÃO CONSISTE EM FORMULAÇÃO DE HIDROGÉIS DE DEXTRINO OXIDADO RETICULADO COM DIHIDRAZIDA DO ÁCIDO ADÍPICO, PODENDO INCLUIR NA SUA FORMULAÇÃO POLISSACARÍDEOS, PROTEÍNAS, NANOGEIS, GRANULADOS BIOACTIVOS OSTEOGÉNICOS OU CÉLULAS PARA REGENERAÇÃO DE TECIDOS E LIBERTAÇÃO CONTROLADA DE AGENTES BIOACTIVOS. ESTA INVENÇÃO CONSISTE EM HIDROGÉIS QUE PODEM SER INJECTÁVEIS, DE ELEVADA BIOCOMPATIBILIDADE E BIODEGRADÁVEIS, PARA UTILIZAÇÃO EM MEDICINA REGENERATIVA COMO VEÍCULO DE MATERIAIS GRANULADOS E CÉLULAS, FUNCIONANDO SIMULTANEAMENTE COMO SISTEMA DE LIBERTAÇÃO CONTROLADA DE FÁRMACOS, E.G. DE MOLÉCULAS HIDROFÓBICAS E DE PROTEÍNAS TERAPÊUTICAS.

Description

9 A patente W02005042048A2, da autoria de Hill et al., publicada a 12 de Maio de 2005, descreve a produção de hidrogéis à base de proteínas e polissacarídeos, permitindo a obtenção de materiais injectáveis (com tempos de gelificação de cerca de 2 horas) , permitindo a incorporação de fármacos, para aplicação em regeneração óssea, entre outras. 0 conceito subjacente à gelificação reside na reactividade entre grupos amina das proteínas e os polissacarídeos (no caso de polissacarídeos neutros é necessária a sua oxidação prévia). Desta forma, a gelificação é um processo relativamente lento, ao contrário do proposto na presente invenção, que permite uma gelificação rápida através da utilização da dihidrazida do ácido adípico. A patente japonesa JP2005/298644A2, desenvolvida por Akiyoshi et al., descreve a produção de um hidrogel híbrido, feito de pululano. Este hidrogel é obtido por polimerização radicalar usando uma mistura de pululano metracriloilado com nanogel de pululano, igualmente metracriloilado. O nanogel auto-organiza-se por interacção hidrofóbica estabelecida entre moléculas de colesterol enxertadas no polissacarídeo. Desta forma, obtém-se um hidrogel onde se encontra disperso um nanogel com aptidão para actuar como sistema de libertação controlada, em particular de proteínas. A presente invenção contempla igualmente a incorporação de um nanogel como dispositivo de libertação controlada, diferindo no entanto em aspectos fundamentais da invenção de Akyioshi e colegas. No caso do material desenvolvido por Akiyoshi e colegas, utiliza-se pululano de elevado peso molecular (cerca de lOOkDa), sendo a reticulação/incorporação do nanogel no hidrogel conseguida por polimerização radicalar, usando como agente 10 iniciador da polimerização o 2,2'-Azobis [2-(2-imidazolina-2-il) propano. Embora a patente seja omissa quanto às propriedades do material obtido em matéria de injectabilidade, a utilização de pululano de elevado peso molecular levanta dúvidas quanto à eficiência da remoção deste material, a que se junta a incógnita quanto à degradabilidade das ligações intermoleculares estabelecidas entre os grupos metracrilicos. De facto, conforme foi reportado para os hidrogéis obtidos a partir de dextrano metracrilato, é provável que também os hidrogéis de pululano-metracrilato não sejam degradados in vivo (Cadée et al. , 2000) Por outro lado, é reconhecida a toxicidade do agente iniciador (Ameer et al., 2001). Assim, a utilização do hidrogel de dextrino, bem como do nanogel de dextrino, associados ao método de gelificação baseado na oxidação do dextrino e utilização do ácido adipico como agente reticulante afigura-se claramente vantajoso, do ponto de vista da biocompatibilidade e excretabilidade. Numa patente posterior (JP2007000326099) Akiyoshi et al., descrevem a utilização do mesmo hidrogel como sistema de libertação de citoquinas. A nova invenção é única na medida em que apresenta um hidrogel à base de dextrino, hidrogel obtido a partir de processos químicos simples, expeditos, económicos e sem recorrência a iniciadores tóxicos ou catalizadores. Estes processos dão origem a velocidades de gelificação que proporcionam o manuseio, injecção e ajuste dos hidrogéis ao defeito tecidular que se pretende regenerar, e permitem a obtenção de hidrogéis com propriedades mecânicas e de biodegradabilidade adaptáveis a cada aplicação. Estas caracteristicas viabilizam ainda a fácil incorporação de cerâmicos bioactivos, biomoléculas e células, assim como 11 nanogeis de dextrino, estes últimos dotando o material compósito multidimensional (fase hidrofóbica dispersa no hidrogel à nanoescala) de uma versatilidade acrescida, na óptica da sua utilização como sistema de transporte e libertação de moléculas bioactivas. A presente invenção baseia-se na produção de hidrogéis de dextrino oxidado e ácido adipico, que pode ser injectável, visando a sua aplicação como 1) matriz para regeneração de tecidos; 2) veiculo de microesferas bioactivas, e.g. sustentação para compostos granulados bioactivo osteogénicos; 3) encapsulação de células; 4) transporte de moléculas bioactivas (nomeadamente proteínas ou polissacarídeos, e.g. colagénio) que favorecem a adesão e proliferação celular e 5) sistema de libertação controlada de fármacos, associado a nanogeis auto-organizados (e.g. de dextrino) .

Nesta invenção utiliza-se uma metodologia expedita para preparar hidrogéis degradáveis de dextrino oxidado (oDex) e dihidrazida do ácido adipico, sem recorrer a iniciadores de polimerização. Obtêm-se tempos de gelificação de 1-30 minutos, dependendo da concentração dos componentes. A cadeia homopolissacarídica do dextrino pode ser oxidada usando ácido periódico, ao nível dos grupos hidroxilo, nomeadamente nas posições C2 e C3 dos anéis glicopiranosídicos. São assim disponibilizados grupos funcionais reactivos, i.e. aldeído, que reagem com moléculas como a dihidrazida do ácido adipico (AAD), que actua como agente reticulante originando hidrogéis. Alterando a quantidade de agente reticulante, bem como o grau de oxidação, assiste-se a uma variação da densidade 12 das ligações intermoleculares, que, por sua vez, influencia as propriedades mecânicas, de degradação e de gelificação dos hidrogéis. Todavia, a quantidade de AAD deve ser optimizada tendo em conta o número de resíduos oxidados disponíveis, de modo criar o maior número de ligações viáveis possível, em detrimento da ocorrência de grupos pendentes. Por outro lado, a existência de grupos reactivos em excesso pode comprometer as propriedades mecânicas dos hidrogéis, ao inviabilizar interligações por efeitos de impedimento estérico, pelo que o grau de funcionalização da cadeia polimérica deve ser moderado.

Os hidrogéis de ODex/AAD são degradáveis, tanto a nível das suas ligações intermoleculares covalentes, por hidrólise, como a nível das suas ligações glicosídicas, por clivagem enzimática pela α-amilase. Dependendo da densidade das ligações, podem obter-se diferentes perfis de degradação. A malha destes hidrogéis é relativamente apertada, possuindo poros com diâmetro na ordem das centenas de nanometros. 0 aumento rápido da porosidade, acompanhando o processo de degradação, sugere que o hidrogel poderá ser rapidamente invadido por células, depois de injectado, especialmente se exibir sinais quimioatractivos ou péptidos de adesão, que podem ser introduzidos no mesmo.

Em termos de biocompatibilidade, os hidrogéis de dextrino revelam-se não tóxicos. As células não só aderem aos hidrogéis, como proliferaram sobre e em torno da sua interface, permitindo perspectivar uma boa interacção com os tecidos, in vivo. Adicionalmente, os hidrogéis de dextrino não são hemolíticos. 13

Existem vantagens importantes na utilização de hidrogéis de ODex/AAD, em alternativa a outros hidrogéis conhecidos, de entre as quais se destacam: 1) metodologia de produção muito simples e acessível; 2) ausência de iniciadores químicos (geralmente tóxicos); 3) baixo peso molecular dos seus componentes - o que facilita uma boa biodegradação e eliminação renal; 4) biocompatibilidade; 5) possibilidade de inclusão/encapsulamento de moléculas/células específicas; 6) matéria-prima económica, de origem natural (de fácil obtenção) e disponível com grau de pureza elevado (grau médico); 7) potencial para funcionar como transportador de sistemas microparticulado, nomeadamente materiais cerâmicos bioactivos e osteogénicos; 8) elevado potencial para funcionar como sistema para libertação controlada de fármacos, tanto de biofármacos (e.g. proteínas terapêuticas) como de pequenas moléculas pouco hidrosolúveis.

Sumário da invenção A presente invenção foi desenvolvida tendo em conta o estado da arte acima descrito; são objecto da presente invenção formulações de hidrogéis de dextrino oxidado reticuladas com dihidrazida do ácido adípico, de acordo com a figura seguinte:

que possui aptidão para incorporar diversas substâncias na sua malha polimérica. 14 0 hidrogel pode incorporar polissacarideos como o quitosano, o ácido hialurónico, entre outros; proteínas, como o colagénio, fibronectina, caseína, entre outras; nanogeis; materiais granulares, moléculas bioactivas e células.

Noutra materialização preferencial, podem ser incluídas proteínas numa percentagem entre 0-20% da composição do hidrogel, em peso seco, e polissacarideos numa percentagem entre 0-20% da composição, em peso seco. O hidrogel da presente invenção é injectável, não é tóxico nem hemolítico.

Noutra materialização o hidrogel é obtido a partir de dextrino com grau de oxidação entre 10-50%, preferencialmente entre 25-35%, dextrino esse de baixo grau de polimerização, entre 1200-8000Da e possuindo uma estrutura porosa continua, com um diâmetro de cerca de Ιμια.

Adicionalmente, a biodegradação do hidrogel ocorre tanto superficialmente como em bloco, sendo caracterizada por um perfil de degradação não-linear acompanhado por aumento do tamanho dos poros.

Noutra materialização preferencial, a degradação do hidrogel ocorre hidroliticamente, ao nível das ligações covalentes intermoleculares, ou enzimaticamente, por acção das amilases presentes nos fluidos humanos ou adicionadas na formulação.

Outro objecto da presente invenção reside na sua formulação, que compreende as seguintes etapas: a) oxidação 15 de dextrino com ácido periódico; b) remoção do periodato que não reagiu; c) gelificação (num período entre 1 e 30 minutos) por adição de um agente reticulante (por exemplo a dihidrazida do ácido adipico) preferencialmente num pH entre 5,0 - 7,5, usando uma concentração no intervalo 3-10%, numa base molar relativamente aos resíduos de glucose.

Numa materialização preferencial a concentração de dextrino oxidado é de 5-40%, preferencialmente 25-30% (p/v).

Noutra materialização preferencial um nanogel é incorporado no hidrogel numa proporção entre 1-25% da massa de dextrino, antes da adição de AAD, possuindo o nanogel dimensões entre lO-lOOOnm.

Noutra materialização preferencial o hidrogel é carregado com fármacos.

Outro objecto da presente invenção relaciona-se com o emprego do hidrogel para regeneração de tecidos e libertação controlada de fármacos.

Outro objecto da presente invenção é o biomaterial compreendendo o hidrogel.

Adicionalmente, a presente invenção relaciona-se com um substituto sintético de osso compreendendo o hidrogel.

Outro objecto da presente invenção é um sistema para libertação controlada de fármacos compreendendo o hidrogel.

Outro objecto da presente invenção é um implante ósseo compreendendo o hidrogel. 16

Adicionalmente, a presente invenção relaciona-se com uma composição que compreende o hidrogel.

Finalmente, a presente invenção relaciona-se com próteses médicas compreendendo o hidrogel da presente invenção.

Breve Descrição das Figuras

Figura 1: Oxidação do dextrino com ácido periódico, resultando em dois grupos aldeído nas posições C2 e C3 do resíduo de D-glucose.

Figura 2: Espectro 1H RMN do dextrino oxidado (GO 25%)

Figura 3: Reacção de polimerização do oDex com AAD e produtos de degradação por hidrólise

Figura 4: Variação dos tempos de reticulação com o grau de oxidação e concentração da dihidrazida do ácido adipico. ( + ) mais de lh de gelificação ( + +) gelificação em menos do que 30 min ( + + +) gelificação em menos do que 1 min. Considerou-se o material gelificado quando não escorre ao longo da parede do tubo inclinado 90°. * Calculado como a razão molar de periodato de sódio por resíduo de glucose no dextrino. ** calculado numa base molar, tendo como referência o número de resíduos de glucose no dextrino Figura 5: Curva de compressibilidade típica obtida com uma amostra de hidrogel de oDex GO 35% reticulado com 4% de AAD.

Figura 6: Módulo de compressibilidade dos hidrogéis de ODex-AAD (A) em função da concentração de agente reticulante (em razão molar, tomando como referência o número de resíduos de glucose no dextrino). Todos os hidrogéis foram preparados com soluções de oDex G035% [30% (p/v)] em tampão fosfato 0.1M, pH 6.0. (B) Módulo de compressibilidade dos hidrogéis de oDex-AAD em função do grau de oxidação do dextrino. Todos os hidrogéis foram 17 preparados com soluções de oDex GO 35%, 30% (p/v) e 5% de AAD, em tampão fosfato 0.1M, pH 6.0. Resultados apresentados como a média±DP, n=3, ns: não-significante -p>0.05; 1 p<0.01, comparativamente com a concentração mais elevada de AAD usada).

Figura 7: Módulo de compressibilidade dos hidrogéis de oDex-AAD em função da concentração do solvente utilizado. Todos os hidrogéis foram preparados com soluções de oDex a 30% (p/v) e 5% de AAD. Os resultados são apresentados como a médiaiDP, n=3, ns: não significante, p >0.05, *p<0.05, comparativamente com o solvente onde o hidrogel é preparado).

Figura 8: Valores de absorvância do ensaio MTT obtidos 48h após incubação de células 3T3 em contacto directo com (A) diferentes concentrações de agente reticulante AAD e (B) diferentes concentrações de dextrino oxidado. Os resultados são uma médiaiDP, n=3. 1p<0.01, tomando como referência o controlo T0 (24h após a sementeira).

Figura 9: Valores de absorvância do ensaio MTT obtidos 48h após incubação de células 3T3 em contacto directo com produtos de degradação (diluição 1:1, 1:2 e 1:4) de hidrogel oDex (GO 35% e 40%) . Os resultados são uma médiaiDP, n=3. ns: não significativo, p>0.05; *p<0 . 05; 1 p<0.01, tomando como referência o controlo T0.

Figura 10: Avaliação morfológica de células T3T em contacto directo com hidrogéis de dextrino (GO 35%) . TCPS placa de cultura de células (controlo), gel de agarose (controlo negativo) e borracha de latex (controlo positivo) (ampliação de lOx).

Figura 11: Valores de absorvância do ensaio MTT obtidos 48h após incubação de células 3T3 em hidrogéis de oDex (GO 35% e 40%). Os resultados são uma médiaiDP, n=3. 1 p<0.01, tomando como referência o controlo T0. 18

Figura 12: Imagens obtidas por Cryo-SEM do interior de hidrogéis de ODex35% e ODex 40% (30%, p/v) com 5% AAD, (A) antes e (B) depois de submersos em PBS (pH 7.4) à temperatura ambiente, durante 24h; (C, D) oDex-nanogel hidrogel. As setas mostram a localização do nanogel de dextrino.

Figura 13: Perfis de degradação (perda de massa) e libertação cumulativa de nanogel com marcador fluorescente de: oDex, oDex-nanogel (1 mg/ml) e oDex-nanogel (3 mg/ml). Os resultados são uma média+DP, n=6

Descrição Detalhada da Invenção

Os biomateriais estão presentes num crescente número de aplicações clinicas, desempenhando um papel central em novas tecnologias como a engenharia de tecidos, a entrega dirigida e libertação controlada de fármacos, a medicina regenerativa, etc. A biocompatibilidade desses materiais é um requisito essencial. Idealmente, entre outras propriedades, deverão ser não-tóxicos, não-imunogénicos, apresentar uma interacção favorável com células e tecidos, atendendo à aplicação em vista. Para muitas aplicações, tal como engenharia de tecidos e entrega de fármacos, a biodegradabilidade/excreção são altamente desejáveis. O dextrino, embora disponível de forma abundante a baixo custo, disponível também em grau médico, tem sido considerado um material promissor por um número muito reduzido de cientistas. De facto, o dextrino apresenta excelente biocompatiblidade, sendo eficientemente eliminado pelos sistemas biológicos, devido ao seu baixo peso molecular e degradabilidade pelas amilases. Esta invenção descreve um hidrogel feito de dextrino com interessantes propriedades para aplicações biomédicas, nomeadamente entrega de fármacos e regeneração de tecidos. O simples 1

DESCRIÇÃO "HIDROGEL DE DEXTRINO PARA APLICAÇÕES BIOMÉDICAS"

Campo da Invenção A presente invenção enquadra-se no campo dos biomateriais com aplicação em regeneração de tecidos vivos, focando mais especificamente a produção de novos hidrogéis à base de dextrino oxidado, que pode ser injectável, com potencialidade para inclusão e transporte de biomoléculas, fármacos, nanogeis de dextrino e compostos granulados, bem como encapsulamento de células.

Estado da Arte 0 aumento da esperança média de vida implica um esforço acrescido para os tecidos e órgãos. Nos últimos anos, uma grande variedade de hidrogéis - classe de materiais poliméricos altamente hidratados (conteúdo em água >30% do peso total) - tem sido desenvolvida e utilizada na regeneração de tecido vivos. Estes materiais são compostos por cadeias poliméricas hidrofilicas, que podem ter origem sintética ou natural, e são naturalmente apelativos para as estratégias de engenharia de tecidos, devido à possibilidade de reproduzir de as estruturas químicas dos tecidos biológicos e as suas propriedades em geral.

Tanto os polímeros sintéticos como os naturais têm sido explorados como transportadores de fármacos. Infelizmente, a maioria dos polímeros utilizados clinicamente na actualidade são sintéticos e não biodegradáveis, e.g. poli (etilenoglicol) (PEG) (Fuertges & Abuchowski, 1990) e co-polímeros de N-(2-hidroxipropil) metacrilamida (HPMA) (Vasey et ai., 1999) . Por isso, de modo a assegurar uma boa 19 facto de o hidrogel ser feito de dextrino representa uma relevante vantagem. A presente invenção proporciona uma formulação de hidrogéis de dextrino oxidado reticulado com dihidrazida do ácido adipico, os quais podem incluir na sua estrutura polissacarideos, proteínas, nanogeis ou células, para regeneração de tecidos e libertação controlada de agentes bioactivos.

Os hidrogéis de dextrino são obtidos a partir de processos químicos mais simples, mais expeditos e mais económicos, comparativamente a outras formulações existentes, e não necessitam de iniciadores tóxicos ou de catalizadores para despoletar a gelificação. A utilização de dextrino representa uma vantagem comparativamente com outros polissacarideos, pois devido ao seu baixo peso molecular e degradabilidade, é eficientemente excretado.

Oxidação do Dextrino

No âmbito desta invenção, utiliza-se o dextrino, um polímero natural, como matéria-prima para produção de hidrogéis. 0 dextrino é um polissacarídeo constituído por unidades de glicose-D, maioritariamente unidas por ligações glicosídicas oí-1,4, contendo também algumas ramificações a-1,6 (<5%) . Esta molécula tem a mesma fórmula geral do amido, sendo, no entanto, mais pequena e menos complexa.

Nesta invenção o dextrino é oxidado por ácido periódico, sendo sujeito à clivagem específica da ligação C2-C3 dos anéis glicopiranosídicos, e originando dois grupos aldeído por unidade de glicose. A quantificação destes grupos, i.e. grau de oxidação (GO), pode ser feita recorrendo ao método 20 do t-butil carbazato - os carbazatos reagem com os grupos aldeído para formar carbazonas, do mesmo modo que as hidrazonas são formadas na presença de hidrazidas, tornando viável a detecção dos grupos aldeído por espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear (RMN). 0 grau de oxidação pode ser facilmente controlado pela quantidade relativa de agente oxidante utilizada, permitindo dispor de grupos aldeído reactivos, não só para a ligação covalente de moléculas reticulantes, como por exemplo o ADH, mas também para o acoplamento de péptidos para adesão celular (e.g. GRGDY) ou de fármacos para libertação controlada em tecidos alvo, como por exemplo o Bonelike®.

Gelificação - Hidrogel ODex/ADH 0 grau de polimerização médio do dextrino é de cerca de 10-12. Para que haja uma reticulação eficiente, cada molécula deve participar em duas ligações a moléculas diferentes. O estabelecimento de mais do que duas ligações não se traduz necessariamente numa melhoria das propriedades mecânicas (ver Exemplo 2) . A modificação excessiva da cadeia polimérica original, com a disponibilização de um grande número de grupos oxidados reactivos, pode inclusivamente ser prejudicial ao rearranjo da nova estrutura polimérica em formação e ao estabelecimento das ligações intermoleculares, por efeitos de impedimento estérico. Assim, nesta invenção o dextrino oxidado possui um grau de oxidação entre 10-50%, preferencialmente entre 25 e 35%, ou seja, possuindo uma média de dois a três resíduos de glicose oxidados por molécula. Graus de oxidação acima dos 50% originam soluções viscosas que reagem rapidamente com o AAD, impedindo a formação de um hidrogel homogénio. 21 A dihidrazida do ácido adipico reage com os grupos aldeído do dextrino oxidado, formando pontes hidrazona (Figura 3) e originando uma matriz polimérica tridimensional de ligações covalentes - um hidrogel. Quando aquelas ligações são quebradas, o dextrino pode difundir nos tecidos humanos sendo eliminado por via renal devido ao seu baixo peso molecular (~40,000Da). Assim, além das ligações glicosídicas, as ligações hidrazona proporcionam um nível adicional de controlo das propriedades mecânicas do hidrogel. A percentagem de ácido adipico para produção destes hidrogéis situa-se preferencialmente entre 3 e 40%, preferencialmente entre 3 e 10% (na proporção molar de ácido adipico para resíduos de glucose oxidada). No Exemplo 2 apresenta-se o estudo da influência da concentração de AAD nas propriedades mecânicas dos hidrogéis de ODex. Quanto maior a quantidade de agente reticulante, maior a velocidade de gelificação e, consequentemente, menor a difusividade do agente reticulante através da rede polimérica. Assim, se concentração de AAD for excessiva, dificilmente se obterá uma matriz polimérica homogénea com boas propriedades mecânicas. Por outro lado, quantidades excessivas desta molécula homobifuncional não polimerizada podem tornar-se citotóxicas, pelo que a sua concentração deve ser minimizada, em detrimento da concentração de polímero e do grau de oxidação deste.

Nesta invenção, a concentração ideal de dextrino oxidado situa-se entre 5 e 40% (p/v), preferencialmente entre 25% e 30% (p/v). Acima destas concentrações é praticamente inviável a solubilização do dextrino e abaixo das mesmas a velocidade de gelificação é demasiado baixa (i.e. superior a 24h). 22

Geralmente a reactividade de grupos hidrazida com grupos aldeído é óptima a valores de pH baixos. Sob condições acídicas, os aldeídos são protonados e mais susceptíveis a ataque nucleofílico por parte dos grupos hidrazida. Já a pH neutro ou básico, as cinéticas de reacção são mais lentas, sendo por isso necessários períodos de tempos mais longos para que a reacção ocorra, o que resulta numa diminuição do número de interligações funcionais. Não obstante, os hidrogéis de dextrino aqui descritos podem ser preparados a pH fisiológico, sem comprometimento das suas propriedades mecânicas e gelificando em l-30min. Este intervalo de tempo proporciona ao cirurgião uma margem muito satisfatória para a injecção dos hidrogéis e seu devido ajuste às fronteiras do defeito que de pretende regenerar. Os hidrogéis aqui descritos não necessitam de solventes especiais - todos os seus componentes são solúveis em água, à temperatura ambiente.

Perfis de degradação de hidrogéis oDex/AAD

As pontes hidrazona são susceptíveis a clivagem hidrolítica, tornando os hidrogéis de ODex/AAD degradáveis a nível das ligações que se estabelecem aquando da sua gelificação. Uma vez quebradas estas ligações, as diidrazidas e o dextrino oxidado podem difundir-se rapidamente através dos tecidos e ser eliminados pelo organismo, graças aos seus baixos pesos moleculares, pelo que o seu perfil de biodegrabilidade é especialmente interessante para aplicações biomédicas, em que se pretende uma bioabsorção gradual do biomaterial implantado e sua substituição por tecido vivo regenerado. No Exemplo 3 apresenta-se o estudo do perfil de degradação dos hidrogéis desta invenção. 23

Biocompatibilidade A biocompatibilidade dos hidrogéis constitui uma questão de extrema importância, na perspectiva da sua aplicação farmacêutica ou biomédica. Um material é considerado biocompativel se verificar um conjunto complexo e vasto de condições (ISO 10993, 1992), entre as quais se destacam a

ausência de citotoxicidade e se não estimular uma resposta inflamatória exacerbada nem qualquer resposta colateral que diminua a sua função (De Groot et ai., 2001). Em geral, os hidrogéis evidenciam bons níveis de biocompatibilidade. A determinação do potencial citotóxico dos biomateriais pode ser qualitativa e/ou quantitativa (ISO 10993-5, 1992). A avaliação qualitativa baseia-se na observação microscópica das células, para concluir quanto às alterações na morfologia em geral, vacuolização, adesão celular e lise membranar. A avaliação quantitativa baseia-se em índices de morte, crescimento, inibição e proliferação celular, ou formação de colónias. No Exemplo 4 estão apresentados estudos de biocompatibilidade in vitro dos hidrogéis apresentados nesta invenção, sendo aplicados os dois tipos de avaliação mencionados. Os hidrogéis de dextrino revelam-se não tóxicos. As células não só aderem aos hidrogéis, como proliferaram sobre e em torno da sua interface, permitindo perspectivar uma boa interacção com os tecidos, in vivo.

Hidrogel ODex/AAD-Fármacos, moléculas bioactivas e células

As propriedades mecânicas dos hidrogéis e a sua interacção com as células e os tecidos, in vivo, podem ser favorecidas pela inclusão de proteínas (0-20% da composição do hidrogel em peso seco) e polissacarídeos (0-20% da composição do hidrogel em peso seco) na formulação do hidrogel. A maior densidade obtida, associada aos efeitos 24 de reticulação, aumentará previsivelmente a estabilidade mecânica do hidrogel. Proteínas como o colagénio, fibronectina, caseína, entre outras, podem permitir a alteração da densidade do hidrogel, estabelecendo ligações com grupos oxidados que não estão reticulados através dos grupos amina. Por outro lado, as proteínas (e.g. colagénio e fibronectina) possuem sequências (e.g. RGD) que permitem uma mais eficaz adesão celular, que pode ser necessária para favorecer a viabilidade e proliferação de células incorporadas no hidrogel, para favorecer os mecanismos de regeneração de tecidos, por exemplo através da libertação de factores de crescimento. A utilização de polissacarídeos como o quitosano ou o ácido hialurónico, entre outros, permite a alteração da carga do hidrogel, tornando-a positiva ou negativa (respectivamente); por outro lado, a selecção do peso molecular do polissacarídeo utilizado (degradável nos casos referidos) permite modular propriedades mecânicas e os perfis de degradação dos hidrogéis.

Hidrogel ODex/AAD-Nanogel de dextrino A incorporação de nanogeis de dextrino (ou outros polissacarídeos como o manano, quitosano ou ácido hialurónico, entre outros), obtidos por auto-organização a partir de polissacarídeos modificados com grupos hidrofóbicos, permite a incorporação no hidrogel de uma fase hidrofóbica, homogeneamente dispersa e constituída por núcleos hidrofóbicos com dimensões nanométricas, que permitem a dissolução de moléculas pouco hidrosolúveis. A incorporação dos nanogeis no hidrogel é realizado simplesmente misturando o nanogel com o dextrino oxidado, antes da adição do AAD (ver exemplo 5). 0 nanogel é previamente carregado com fármacos (e.g. estatinas, 25 antiinflamatórios, entre outros). A utilização do nanogel permite assim a incorporação de moléculas que, por serem pouco hidrosolúveis, seriam dificilmente incorporadas no material altamente hidratado. Por outro lado, a nanofase de núcleos hidrofóbicos funciona como sistema de libertação controlada. A libertação dos fármacos não é controlada apenas pela transferência de massa por difusão e pela degradação do hidrogel. A utilização de nanogeis com diferentes dimensões (10-1000nm, conforme o polissacarideo utilizado) permite o controlo da cinética de libertação de fármacos.

EXEMPLOS

Seguidamente, a presente invenção é descrita com maior detalhe e especificamente com referência aos Exemplos, os quais, no entanto, não visam limitar a presente invenção.

EXEMPLO 1 - HIDROGEL ODEX/ADH

Oxidação do dextrino. Foram oxidadas soluções aquosas de dextrino (2% p/v) com uma solução de m-periodato de sódio (Panreac), cuja concentração variou de acordo com o grau de oxidação teórico (G0t) pretendido. Os recipientes foram isolados da luz e a reacção deu-se durante 2 Oh, à temperatura ambiente e sob agitação permanente. Ao fim deste período adicionou-se uma quantidade equimolar de dietilenoglicol para parar a reacção de oxidação, por inactivação de resíduos de periodato não reagidos. Seguidamente, as soluções resultantes foram exaustivamente dialisadas ao longo de 3 dias em água destilada, em membranas de diálise com um MWCO de 1000 Da. Por fim, as soluções foram liofilizadas durante 72h. 26

Determinação dos grupos aldeido por 1H RMN. 0 grau de oxidação do dextrino é definido como o número de resíduos oxidados por 100 resíduos de glicose, sendo quantificável através do t-butil carbazato (t-BC). Dissolveu-se dextrino oxidado em tampão fosfato pH 6.0, 0.1 Μ (1 mL, 1% p/v) e adicionou-se lmL de uma solução de tBC (excesso estequiométrico de 5x), preparada separadamente. A mistura foi deixada a reagir durante 24h à temperatura ambiente e sob agitação. No final, o tBC em excesso foi removido utilizando uma PD-10 Desalting Column e o material recuperado foi liofilizado durante 48h. O produto resultante foi então dissolvido em água deuterada (D20) (7.5 mg; 1% p/v) e sujeito a análise por 1H RMN. O espectro de 1H RMN foi utilizado para determinar o GO, através da equação 1. DO (%) = (X/Y) x 100 (Eq. 1)

Onde X é o integral médio do pico a δ 7.3 ppm, correspondendo aos protões ligados aos carbonos modificados com tBC, e Y é o integral médio dos protões anoméricos a δ 4.8 ppm e δ 5.4 ppm.

Preparação de hidrogéis de dextrino oxidado. Dissolveu-se oDex em tampão fosfato pH 6.0, 0.1M (30% p/v) à temperatura ambiente e adicionou-se uma solução de ácido adípico diidrazido (ADH) a diferentes concentrações (5%, 15% e 30% em base molar, tendo em conta o número de resíduos de glicose presentes no dextrino original). A reacção de polimerização deu-se durante 2h. O material foi considerado gelificado a partir do momento que deixou de fluir ao longo de uma superfície inclinada a 90°. 27 A Figura 2 apresenta o espectro de 1HRMN de dextrino com um grau de oxidação de 25% (oDex 25%). 0 picos entre δ 4.0 e δ 3.4 atribuem-se aos protões nas posições 2,3,4,5 e 6, e o pico a δ 5.4 ao protão anomérico das unidades de glicose. Já os picos entre δ 7.4 e 7.2 ppm identificam os protões ligados aos carbonos que foram modificados com tBC, sendo o singleto a δ 1.5 ppm atribuído ao tBC. Os restantes picos que surgem entre δ 5.8 e 4.2 ppm são atribuídos essencialmente aos protões das estruturas hemiacetálicas que se formam durante o processo oxidativo, ainda que grande parte destas estruturas sejam revertidas por adição de t-BC ou ADH.

EXEMPLO 2 - PROPRIEDADES MECÂNICAS

Os ensaios mecânicos de compressão foram desenvolvidos numa Mechanical Tester - Shimadzu-AG-IS 1 kN Testing Instrument. Cada disco de hidrogel (área superficial=13mm2) foi colocado entre duas chapas metálicas circunferenciais paralelas, para que a compressão fosse uniforme em toda a amostra, e comprimido a uma velocidade de 0.5mm/min. O módulo de compressão é directamente proporcional à densidade das ligações intermoleculares. Procurando aprofundar o estudo da influência da concentração de AAD, do grau de oxidação e, ainda, do tipo de solvente utilizado, nas propriedades dos hidrogéis de ODex, recorreu-se à quantificação do módulo de compressão. Na Figura 3 está representada a curva típica de compressibilidade obtida, a partir da qual se calculou o módulo de compressão, utilizando a equação 2: 28 Módulo de compressão (KPa) = (Tensão máx. x Área superficial) x 1CT3 (Eq. 2)

Para cada condição foram analisadas amostras em triplicado; os valores apresentados nas Figuras 6 e 7 representam a média e o desvio padrão. 0 aumento da concentração de ADH resulta num aumento do módulo de compressão dos hidrogéis de oDex (Figura 6A) , sugerindo o estabelecimento de um número crescente de ligações intermoleculares, à medida que são disponibilizados mais grupos hidrazida para reagir. Este facto verifica-se também nos hidrogéis de dextrano (Maia, Ferreira, Carvalho, Ramos, & Gil, 2005) e nos hidrogéis de guluronato (Bouhadir, Hausman, & Mooney, 1999), os últimos revelando uma resistência compressiva inferior, mesmo com quantidade superiores de agente reticulante. De facto, o módulo compressivo máximo dos hidrogéis de guluronato foi 560 KPa, com 150 mM de ADH. Já os hidrogéis de oDex35% apresentaram um módulo compressivo de 600 KPa, sendo utilizados ca. 130 mM (equivalente a 10% em base molar). Os hidrogéis de dextrino apresentam, portanto, melhores propriedades mecânicas. A influência do grau de oxidação no estabelecimento de ligações intermoleculares, avaliado pelo módulo de compressibilidade, foi também estudada, não se tendo identificado uma relação de proporcionalidade directa entre o módulo compressivo e o GO. Os hidrogéis de GO 25% revelaram o valor mais alto de força compressiva (c.a 533 KPa) , embora não se verifique uma diferença significativa (p>0.05) relativamente a hidrogéis com graus de oxidação superiores (Figura 6B). 2 eliminação renal e a excluir a ameaça de acumulação destes compostos no organismo, somente polímeros com um peso molecular inferior ao limiar da capacidade de eliminação renal (40,000 Da) deveriam ser utilizados (Hrecsuk-hirst et al. , 2001) .

Uma grande variedade de polímeros naturais foram utilizados para produção de hidrogéis para engenharia de tecidos, nomeadamente o colagénio, o ácido hialurónico (HA) , alginato e o quitosano. Contudo, o desempenho destes materiais in vivo não é nalguns casos o mais satisfatório, conforme enunciado no estudo de Drury et al. (Drury & Mooney, 2003). O quitosano de elevada pureza e homogeneidade é difícil de obter; por outro lado, a sua bioactividade pró-inflamatória limita a sua aplicação biomédica. No caso do colagénio, o risco de contaminação é problemático. 0 alginato é também muitas vezes referido como um polissacarídeo promissor para a produção de hidrogéis para aplicações de engenharia de tecidos, muito embora a sua dissolução seja difícil de controlar e a excreção seja dificultada pela sua não-degradabilidade. Adicionalmente, polímeros naturais, como o pululano (Nogusa et al., 1995) ou o dextrano (Nishikawa, 1996), também referenciados nesta área, sendo quase sempre inerentemente biodegradáveis, mesmo com baixos níveis de modificação (para facilitar a ligação de fármacos ou diminuir a taxa de degradação), facilmente se tornam não degradáveis (Vercautere et al., 1990). Muitos destes polímeros (incluindo o dextrano) são ainda imunogénicos, não podendo por isso ser administrados repetidamente (Hreczuk-hirst et al. , 2001) . Estudos clínicos envolvendo conjugados de dextrano-doxorubicina evidenciaram mesmo hepatoxicidade (Danauser-Reidl et al., 1993). 29

No caso dos hidrogéis injectáveis é desejável que a reacção de gelificação de prolongue in situ, ou seja, que os fluidos intersticiais e/ou o sangue não inviabilizem este processo, por exemplo, por influência do pH na reacção, e, acima de tudo, que as próprias condições necessárias à reacção não provoquem danos nos tecidos circundantes. Assim, procurou-se avaliar a influência do pH sobre a gelificação, novamente através da análise da resposta mecânica de vários hidrogéis, produzidos usando quatro solventes distintos - água destilada (pH 5.77), tampão fosfato 0.1M (pH 6.0), tampão fosfato salino (PBS, pH 7.4) e meio cDMEM (pH 7.5), respectivamente. Os resultados estão apresentados na Figura 7. É sabido que a reactividade de grupos hidrazida com grupos aldeído é óptima a valores de pH baixos. Sob condições acídicas, os aldeídos são protonados e são mais susceptíveis a ataque nucleofílico por parte dos grupos hidrazida. Já a pH neutro ou básico, as cinéticas de reacção são mais lentas, sendo por isso necessários períodos de tempos mais longos para que a reacção ocorra, o que resulta numa diminuição do número de interligações funcionais. De facto, os valores de módulo de compressão mais baixos (p<0.05) obtiveram-se no caso dos hidrogéis preparados em meio cDMEM (58 KPa) . Isto pode dever-se ao facto de os aminoácidos presentes na solução reagirem com os aldeídos do ODex, pela hidrólise das ligações hidrazona. Esta interferência pode desfavorecer substancialmente a reticulação nos hidrogéis de oDex-ADH.

EXEMPLO 3 - BIOCOMPATIBILIDADE

Cultura de fibroblastos de embrião de rato 3T3. Foram cultivados fibroblastos embrionários de rato 3T3 (ATCC CCL-164) em meio cDMEM (Dulbecco's modified Eagle's media 30 (Sigma) suplementado com 10% de newborn calf serum (Invitrogen, UK) a 37°C, num ambiente plenamente humidificado, contendo 5% de C02. Quando as células atingiram aproximadamente 80% de confluência o meio foi descartado e as células destacadas com 0.05% (p/v) de tripsina-EDTA (Sigma) e subcultivadas no mesmo meio.

Ensaio Live and Dead. Utilizou-se o kit de viabilidade/citotoxicidade LIVE/DEAD® para células mamíferas (Invitrogen, UK) para determinar a viabilidade celular. Este kit permite a identificação simultânea de células vivas e mortas com duas sondas que medem a actividade intracelular da enzima esterase e a integridade da membrana plasmática. Células embrionárias de rato 3T3 foram semeadas em placas de cultura celular de poliestireno de 6 poços (Orange Scientific), adicionando-se a cada poço uma suspensão de 2.5xl04 cells/mL. Posteriormente, removeu-se o meio de cultura e colocaram-se hidrogéis de ODex (0 4 mm, 2 mm de espessura) no centro dos poços, em contacto directo com as células. A viabilidade celular foi avaliada utilizando um microscópio de epi-fluorescência - Zeiss Axioscop recorrendo ao kit de marcação por fluorescência Live/Dead®. A morfologia celular foi avaliada através de imagens obtidas por microscópio óptico. Utilizaram-se discos de látex e de gel de agarose (U.S. Pharmacopeia) como controlos positivo e negativo, respectivamente. MTT. A viabilidade dos fibroblastos 3T3 foi determinada recorrendo ao ensaio colorimétrico com 3—[4,5— dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT, (Sigma-Aldrich, USA). Este método é baseado na 31 bioredução do composto de tetrazólio, MTT, pela enzima deidrogenase succínica, a qual se localiza nas mitocôndrias das células viáveis. Esta reacção produz um sal de formazano insolúvel em água, que é posteriormente dissolvido em DMSO, resultando numa solução roxa, espectrometricamente mensurável. Um aumento do número de células traduz-se num aumento de absorvência. A avaliação da adesão de fibroblastos embrionários de rato aos hidrogéis de dextrino oxidado foi feita recorrendo ao ensaio com MTT. Preparam-se hidrogéis de oDex em poços de placas de cultura celular de poliestireno de 96 poços. Após 2h de polimerização, foram lavados, primeiramente com PBS e seguidamente com meio DMEM completo (3x200 pL). Posteriormente, adicionou-se 100 pL de uma suspensão de fibroblastos, contendo 3xl03 células/poço, a cada poço. Para efeitos de controlo, cultivaram-se as células directamente no fundo dos poços. Ao fim de 48h, os hidrogéis foram cuidadosamente lavados com PBS (3x100 pL), para se removerem as células não aderidas e, seguidamente, procedeu-se à tripsinização da camada celular aderida aos hidrogéis (100 pL; 5min) , dando-se seguimento ao ensaio colorimétrico. A biocompatibilidade dos produtos de degradação dos hidrogéis foi também estudada. Células 3T3, da mesma linhagem utilizada anteriormente, foram cultivadas em placas de 96 poços com uma densidade de 5xl02 células/poço. Após 24h, o meio foi removido e substituído por três diluições de produtos de degradação de hidrogéis de oDex 40% (200 pL; 1:1, 1:2 e 1:4, respectivamente) . Após 48h de incubação a 37°C a viabilidade celular foi quantificada recorrendo novamente ao ensaio colorimétrico com MTT. 32

Adicionalmente, testou-se o potencial citotóxico do dextrino oxidado e do ADH isoladamente. Fibroblastos 3T3 foram transferidos para vários poços, perfazendo uma densidade celular de 5x102 células/poço. Após 24 h, o meio foi removido e as células foram expostas a concentração crescentes de ADH em meio cDMEM durante 48h a 37 °C. A citotoxidade foi novamente avaliada através do ensaio com MTT. Efectuou-se o mesmo ensaio para avaliar a citotoxicidade do dextrino oxidado, o qual foi previamente esterilizado por atmosfera de óxido de etileno (ETO). Todas as medições foram efectuadas em triplicado ou mais e os resultados representam a média.

As Figuras 8A e 8B apresentam os valores de absorvência obtidos após 48h de incubação das células com diferentes concentrações de ADH e oDex, respectivamente. A concentrações de ADH mais elevadas (2-4%, p/v) a quantidade de células drasticamente (p<0.01), denunciando morte celular, i.e. toxicidade. Todavia, a concentração de agente reticulante adoptada para a preparação dos hidrogéis de dextrino (5% em base molar) situa-se em 1%, p/v, onde não se detecta diferença significativa relativamente à quantidade de células inicial, havendo, sim, um abrandamento na proliferação celular, facilmente detectável quando comparado com o crescimento da população celular que ocorre a uma concentração de 0%, p/v, de AAD. No caso de dextrino oxidado não há evidência de morte celular, mas detecta-se uma diminuição da proliferação celular, para qualquer concentração testada. Não obstante, é de esperar que a reactividade dos compostos que já reagiram (polimerizados) seja substancialmente inferior à que se detecta quando os compostos estão isolados. Os resultados apontam, portanto, para um elevado nivel de 33 biocompatibilidade, quando aplicadas as quantidades de ADH e oDex utilizadas na preparação dos hidrogéis desta invenção.

Sob exposição a soluções aquosas, os hidrogéis podem libertar lixiviados, pelo que se torna importante avaliar a citotoxicidade dos seus produtos de degradação. Com esse propósito, expuseram-se ainda culturas de fibroblastos a várias diluições dos produtos de degradação de hidrogéis de oDex e a viabilidade celular foi quantificada recorrendo ao ensaio com MTT. Os resultados sugerem alguma toxicidade associada aos produtos de degradação (Figura 9), sendo que se detecta morte celular efectiva, quando os mesmos são colocados directamente em contacto com as células (1:1), sem qualquer diluição prévia. Nesta situação foi visível a sedimentação de partículas nos poços, o que poderá sugerir que a pressão mecânica exercida pelas mesmas terá sido letal para as células, ou até mesmo que a oxigenação e a difusão de nutrientes terá sido diminuída pela presença daquela massa.

Ainda na mesma série de ensaios, testou-se também a citotoxicidade dos hidrogéis de dextrino oxidado recorrendo ao método de contacto directo. Prepararam-se pequenos discos de hidrogel (oDex 35%), bem como discos de gel de agarose e de látex utilizados como controlo negativo e positivo, respectivamente, e colocaram-se cuidadosamente sobre uma camada celular sub-confluente. Adicionalmente cultivaram-se as células apenas em contacto directo com o poliestireno (controlo) . Uma vez que os géis são ligeiramente opacos, foi necessário recorrer à marcação por fluorescência (através do kit Live/Dead®) para facilitar a avaliação qualitativa da resposta dos fibroblastos, quando 34 em contacto directo com aqueles (Figura não incluída) . Paralelamente, fez-se também a avaliação morfológica da mesma linhagem celular, recorrendo ao microscópio óptico (Figura 10) .

Conforme esperado, os discos de látex revelaram-se altamente citotóxicos - a cor predominante é o vermelho, e o seu aspecto é claramente arredondado, revelando o destacamento das células do fundo dos poços de poliestireno e a sua morte. Já no caso dos discos de hidrogel, há um claro crescimento da população de fibroblastos em torno dos mesmos (a mancha negra no extremo esquerdo das imagens do ensaio de avaliação morfológica corresponde aos discos do material em questão), ao longo das 72h de contacto directo, sendo que, ao fim de 48h, a cor destacadamente presente é o verde, não se detectando, portanto, indícios de morte celular. 0 nível de proliferação em contacto com os hidrogéis poderá não ser tão destacado como no caso do controlo, todavia as células mantêm-se claramente aderidas e com uma morfologia perfeitamente similar, pelo que se pode considerar que os hidrogéis de dextrino são atóxicos.

Na Figura 11 estão apresentados os resultados do ensaio de adesão celular aos hidrogéis de dextrino oxidado. Verifica-se que, ao fim de 48h, ambos os hidrogéis se revelaram significativamente mais adesivos que as placas de poliestireno. De facto, foram já relatados vários casos de resistência à adesão celular por parte da superfície de hidrogéis, à base de outros polissacarídeos, como o dextrano, explicada pela provável baixa adsorção de proteínas a polímeros hidrofílicos e não iónicos. Efectivamente, a adesão a biomateriais hidrofílicos, tal 35 como o ácido hialurónico ou hidrogéis à base de PEG, revela-se praticamente inexistente.

EXEMPLO 4 - HIDROGEL ODEX/AAD - NANOGEL DE DEXTRINO

Produziram-se nanogeis de dextrino dissolvendo dextrino liofilizado juntamente com acrilato de vinilo funcionalizado com 1-hexadecanotiol {Cie) (dextrino-VMA-SC16), em PBS. A dissolução deu-se durante aproximadamente 16h à temperatura ambiente e sob agitação. Paralelamente, oDex, GO 35% foi dissolvido em PBS (oDex) ou numa suspensão de nanogel (oDex-nanogel), durante aproximadamente 16h à temperatura ambiente. Seguidamente, adicionou-se 5% (em base molar) de ADH às suspensões de oDex, e a reacção de gelificação prosseguiu durante 2h à temperatura ambiente. Obteve-se assim um material anfifílico que se auto-organiza em meio aquoso, originando nanogeis com dezenas de nanómetros. Os nanogeis assim obtidos podem ser usados para incorporar fármacos hidrofóbicos ou proteínas terapêuticas, sendo incorporados nos hidrogéis de dextrino depois de carregados com a molécula bioactiva de interesse, imediatamente antes da gelificação por adição de ácido adípico.

EXEMPLO 5 - PERFIL DE DEGRADAÇÃO DOS HIDROGÉIS ODEX/ADH E LIBERTAÇÃO DO NANOGEL DE DEXTRINO/FITC

Após duas horas de polimerização, os hidrogéis foram retirados dos moldes e imediatamente pesados (Pi) . Seguidamente, uns foram submersos em PBS e outros em meio DMEM completo (ambos a pH fisiológico), e colocados numa estufa a 37°C. A determinados intervalos de tempo, os hidrogéis foram cuidadosamente retirados dos recipientes, colocados sobre papel de filtro, para remover o excesso de água, pesados (P), e novamente submersos nas soluções 36 renovadas. A percentagem de perda de massa foi calculada de acordo com a equação (3):

Perda de massa (%) = 100 - [ (Wt / Wj.) x 100 ] (Eq.3)

Preparação de nanogel de dextrino funcionalizado com FITC.

Dada a sua biocompatibilidade, o FITC é uma sonda fluorecente comummente utilizada em estudos biológicos. Para obter nanogeis funcionalizados com FITC preparou-se uma solução de nanogel (de acordo com o descrito no Exemplo 4 e em Gonçalves et al., 2007), dissolvendo 10 mg de dextrino-VMA-SCi6 em 1.3 mL de tampão fosfato de sódio 0.1M, pH 7, e agitando durante 30 min. Simultaneamente, preparou-se uma solução fluoresceinica dissolvendo 5 mg de SAMSA [5-(2-(and-3)-S-(acetylmercapto)succinoyl) amino), Invitrogen] em 0.5 mL de NaOH 0.1M sob agitação durante 15 min. Seguidamente, adicionou-se 7 μΐ de HC1 6M e 0.1 mL de tampão NaP04 0.5M, pH 7, e agitou-se durante 10 min. Finalmente, misturou-se a solução de nanogel com a solução fluoresceinica, agitando-se durante 30 min. O FITC em excesso foi descartado utilizando uma Sephadex G25 PD10 column (Amersham Biosciences), equilibrada com PBS, e o nanogel funcionalizado (nanogel/FITC) foi eluido em PBS.

Avaliação da libertação do nanogel de dextrino/FITC. 0 hidrogel de oDex-nanogel/FITC foi obtido de acordo com o descrito anteriormente, e a libertação do nanogel/FITC do mesmo foi avaliada por fluorimetria. A intensidade da fluorescência do PBS, removido dos hidrogéis a diferentes intervalos de tempo, foi medida utilizando um espectrofluorimetro (Fluorolog Horiba Jobin Yvon). Os espectros de fluorescência foram obtidos a partir de um comprimento de onda de excitação de 4 60 nm e o registo da 37 emissão foi feito entre 470 e 600 nm, com intervalos de lnm. A intensidade da fluorescência foi medida no pico máximo obtido (520 nm). Finalmente, a percentagem de nanogel/FITC libertadas do hidrogel de oDex-nanogel foi calculada a partir da equação 4:

Libertação de Nanogel/FITC (%) = [nanogel/FITC] det / [nanogel/FITC] tot x 100 (Eq. 4)

Onde [nanogel/FITC] det corresponde à intensidade da fluorescência do PBS recolhido nos vários intervalos de tempo, e [nanogel/FITC] tot corresponde à intensidade da fluorescência da totalidade de nanogel/FITC incorporada no hidrogel de oDex.

Durante o processo de degradação em solução aquosa, os hidrogéis podem sofrer uma erosão superficial ou uma erosão em bloco (bulk). No caso dos hidrogéis de oDex, observa-se uma erosão em bloco, caracterizada por um perfil de degradação não constante ao longo do tempo, com penetração de moléculas de água por toda a estrutura tridimensional. As imagens obtidas por Cryo-SEM ilustram precisamente esse facto (Figuras 12A e 12B) . Ao fim de 24h em PBS, os hidrogéis apresentam poros mais abertos, sendo nítida a erosão em toda a extensão da malha, por hidrólise das ligações hidrazona. O aumento rápido da porosidade, acompanhando o processo de degradação, sugere que o hidrogel poderá ser rapidamente invadido por células, especialmente se exibir sinais quimioatractivos ou péptidos de adesão, que podem ser introduzidos no hidrogel. A morfologia do hidrogéis de oDex exibe uma estrutura porosa contínua, com diâmetros em torno de 1 Mm. Com uma 38 maior amplificação é possível observar as partículas de nanogel presentes no hidrogel de oDex-nanogel (Figuras 12C e 12D). Comparando as formulações de hidrogéis oDex e oDex-nanogel, não são detectáveis diferenças morfologias óbvias. Todos os hidrogéis possuem uma morfologia aleatória e estrutura porosa semelhante, sendo que os nanogeis não influenciaram a morfologia da rede tridimensional dos hidrogéis de oDex.

Apesar das suas inúmeras propriedades vantajosas, os hidrogéis também apresentam algumas limitações. A sua baixa resistência à tracção limita a sua utilização em aplicações que requerem alguma resistência mecânica e, como consequência, a dissolução prematura do hidrogel pode ocorrer. Tratando-se de libertação controlada de fármacos, a maior dificuldade associada aos hidrogéis prende-se com a quantidade e homogeneidade da droga que se pretende carregar, que pode ser limitada, especialmente no caso de fármacos hidrofóbicos. Por outro lado, a quantidade de água elevada, associada ao tamanho de poro grande, resulta frequentemente numa rápida libertação do fármaco. Procurando ultrapassar estas limitações, os nanogel de dextrino, também providenciado por esta invenção, pode ser usado para produzir um novo hidrogel bidimensional. Uma vez que este nanogel é obtido pela auto-associação de molécula anfilílicas, e têm a capacidade de incorporar e estabilizar quer proteínas quer fármacos hidrofóbicos, a presença desta nanofase pode ser extremamente útil no desenvolvimento deste material como sistema de libertação controlada de fármacos.

Este Exemplo também descreve os estudos realizados em torno do perfil de libertação dos nanogeis de dextrino δ

Na patente americana no. US 6,991,652 B2, publicada a 31 Jan., 2006 por Burg e colegas, são descritos compósitos constituídos por uma estrutura/matriz porosa (micropartícuias com geometria variável: esferas, cilindros ou malha) preferencialmente constituído por colagénio, que pode ser veiculada num meio transportador líquido ou viscoso. Nesta invenção, os compósitos são cultivados com células, que podem proliferar originando um novo tecido. Além disso, os compósitos podem ser administrados por injecção, de forma minimamente invasiva, sendo aplicáveis para uma grande variedade de aplicações na área da engenharia de tecidos. O dextrino é referido como um dos materiais que podem constituir a fase fluida que transporta a estrutura/matriz porosa, no entanto a patente é omissa quanto à forma como se pode produzir um hidrogel a partir dos materiais referidos, nomeadamente o dextrino, cuja função parece limitar-se a produzir um aumento da viscosidade da fase fluida. Na nova invenção aqui apresentada, pretende-se associar os hidrogéis de dextrino não só a cerâmicos bioactivos, biomoléculas e células, tal como Burg enuncia, mas também a nanogeis de dextrino, dotando o material compósito de uma versatilidade acrescida na óptica da utilização para o transporte e libertação de moléculas bioactivas. Além disso, esta invenção inclui uma metodologia para promover a gelificação do dextrino, permitindo a obtenção de hidrogéis com propriedades mecânicas e biodegradabilidade controláveis, o que favorece substancialmente a sua utilização como sistema de libertação controlada de fármacos e, quando é o caso, de suporte da fase sólida transportada na fase fluida num sistema injectável. 7 fármacos, que deste modo não é determinado exclusivamente pelo transporte de massa no hidrogel.

No caso da presente invenção, o problema da retenção renal do material não se coloca, uma vez que o dextrino utilizado possui baixo peso molecular, podendo a sua degradação e remoção ser controlados mediante o grau de reticulação seleccionado. Nesta medida, o dextrino oferece uma vantagem clara relativamente aos alginatos. Por outro lado, na presente invenção propõe-se também uma forma de impedir a rápida libertação inicial de fármacos, que normalmente se verifica quando se utiliza hidrogéis altamente porosos como sistema de libertação controlada. Este sistema consiste na incorporação de nanogeis com núcleos hidrofóbicos para solubilizar fármacos pouco hidrosolúveis, simultaneamente permitindo exercer um controlo adicional sobre as propriedades farmacocinéticas do sistema. Esta é uma forma substancialmente distinta e mais simples do que a proposta por Bouhadir et al., baseada na produção de conjugados covalentes fármaco-polimero. Adicionalmente, estes autores não fornecem informações relativamente ao perfil de degradação destes hidrogéis em condições fisiológicas, nem relativamente à sua porosidade, parâmetros que são fundamentais para o estudo da sua viabilidade como estruturas de libertação controlada de agentes activos. Estes hidrogéis revelam ainda propriedades mecânicas inferiores às dos hidrogéis de dextrino, sendo que, para uma mesma quantidade de agente reticulante (AAD), a resistência dos hidrogéis à acção de tensões compressivas (que é directamente proporcional à densidade de ligações intermoleculares) é menor, o que, certamente, implicará um pior desempenho em termos de perfil de biodegradação. 6 modificação dos polissacarideos utilizados, baseando-se os métodos de gelificação na utilização de agentes gelificantes. No caso do dextrino, um polímero de glucose, é necessário efectuar um pré-tratamento, por exemplo por oxidação com ácido periódico como proposto nesta invenção, de modo a permitir a sua posterior gelificação mediante a utilização de agentes de reticulação. Além disso, ainda no caso da presente invenção, a concentração de polímero que confere a textura ideal situa-se nos 30%, dando origem a um hidrogel injectável, cujo tempo de gelificação (5-30min) permite a sua manipulação e implantação, no caso da sua aplicação em cirurgias maxilofaciais, como adjuvante de compostos granulados com propriedades osteogénicas. Uma concentração de polímero abaixo de 25% dá origem a um fluido viscoso, e não a um hidrogel.

Bouhadir et al. (1999; US2007/07186413) desenvolveram hidrogéis para libertação de fármacos, tal como na presente invenção, baseando-se na gelificação por reticulação de polissacarideos com a dihidrazida do ácido adípico. É utilizado preferencialmente o alginato. O processo de obtenção deste hidrogéis consiste na oxidação parcial de alginato e posterior polimerização com a dihidrazida do ácido adípico (AAD). Desta forma, e mediante a modificação por oxidação, pretende-se obter um material de baixo peso molecular e degradável in vivo, já que a não-degradabilidade é uma limitação à utilização biomédica do alginato, impedindo a sua remoção. Pretende-se também obter um controlo na reacção de gelificação ao normalmente obtido através da gelificação ionotrópica do alginato. Noutro aspecto da patente, desenvolvem-se conjugados droga-polímero, permitindo um controlo acrescido na libertação de 5 A tolerância clínica comprovada, aliada à possibilidade de rápida degradação do dextrino (em maltose, maltotriose ou maltotetraose (a-1,6)), pela acção da α-amilase, uma enzima plasmática (Davies, 1994), sugere que este polímero pode, efectivamente, reunir excelentes características para utilização no desenvolvimento de sistemas para o transporte de fármacos. Para essa finalidade é também relevante o facto de ser um recurso abundante, disponível em grau médico e com excelente biocompatibilidade. Adicionalmente, se necessário, é possível controlar o tempo de circulação plasmática do dextrino (horas ou dias), através da modificação da cadeia principal (Hreczuk-hirst et al., 2001; Hardwicke et al., 2008; Treetharnmathurot et al., 2009) . 0 seu baixo peso molecular é também um factor crucial e determinante nesta opção, já que proporciona uma fácil eliminação renal. A patente americana no. 5, 541,234, publicada a 30 Jul., 1996, de Unger et al., descreve hidrogéis de elevada porosidade e reduzida densidade, feitos de alginato e/ou outros polissacarídeos incluindo o dextrino, em que a concentração de polímero que origina a densidade ideal para a estrutura porosa se encontra preferencialmente entre 1% e 10%. No caso do agar, carragenano, gelatinas e caseína a gelificação dá-se preferencialmente a temperaturas elevadas, inviabilizando a polimerização in situ dos hidrogéis, sob pena de danificar os tecidos envolventes, após a sua implantação. É referida também a utilização de solventes para a gelificação dos polímeros, uma clara desvantagem face aos hidrogéis de dextrino da presente invenção, do ponto de vista de aplicações biomédicas. Unger et al. não referem a possibilidade de associação de biomoléculas ou células, assim como não mencionam a 3 A injectabilidade é actualmente reconhecida como uma propriedade muito desejável no desenvolvimento de hidrogéis, pois permite a sua administração de forma minimamente invasiva. 0 tempo de gelificação é uma caracteristica essencial nestes materiais, condicionando de forma determinante as aplicações que proporciona. Um tempo de gelificação muito longo, superior a 30 minutos é incompatível, por exemplo, com utilizações de regeneração maxilo-facial.

Nesta invenção, procurando ultrapassar as dificuldades associadas aos polissacarídeos atrás referidas, utiliza-se como matéria-prima o dextrino na produção de hidrogéis injectáveis com potencialidade para a inclusão e transporte de biomoléculas, fármacos e compostos granulados, bem como para o encapsulamento de células. Simultaneamente, pretende-se obter materiais hidrogéis com tempos de gelificação e propriedades mecânicas facilmente controláveis, numa gama de propriedades alargada, através do ajuste de propriedades como o grau de oxidação e a concentração do agente reticulante. O dextrino é um polímero de glucose obtido por hidrólise do amido, sendo os resíduos de glucose unido sobretudo com ligações a-1,4. Adicionalmente, existem também ligações a-1,6, cuja proporção depende da origem do amido. Qualquer dextrino é uma mistura de polímeros de glucose com cadeias de diferentes tamanhos.

Formulações de hidrogéis de dextrino são descritas num reduzido número de artigos e patentes. O dextrino pode ser considerado uma ferramenta emergente na área biomédica por não exibir toxicidade nem imunogenicidade (Treetharnmathurot et al., 2009). Foi aprovado recentemente 39 incorporados nos hidrogéis de oDex/ADH (Figura 13) . Os nanogeis de dextrino possuem um perfil de degradação similar ao dos hidrogéis de oDex/ADH.

De acordo com os estudos de perda de massa desenvolvidos, verificou-se que a velocidade de degradação dos hidrogéis de oDex é diferente daquela evidenciada pelos hidrogéis de oDex-nanogel. Em aproximadamente 25 dias, o hidrogel de oDex dissolve-se completamente, em quanto que, para um mesmo período de tempo, o s hidrogéis de oDex-nanogel apresentam uma perda de massa de 70%. Contudo, apenas ligeiras diferenças foram detectadas entre ambas as formulações quando utilizadas diferentes quantidades de nanogel. A taxa de degradação mais baixa obtida na presença do nanogel pode ser atribuída a um processo de reticulação continuado no hidrogel.

Simultaneamente, a libertação do nanogel (funcionalizado com FITC) do hidrogel de oDex-nanogel foi avaliada por fluorimetria. O nanogel foi libertado gradual e controladamente ao longo do tempo, acompanhando a degradação do hidrogel, pelo que este compósito pode ser útil para contornar o fenómeno de erosão inicial exacerbada (burst) , frequentemente observado em sistemas de libertação controlada.

REFERENCIAS

Patentes

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Outras referências

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Lisboa, 11 de Janeiro de 2011 4 pela FDA uma solução de Icodextrino™ para diálise peritoneal. 0 icodextrino (um dextrino polidisperso de peso molecular ~20KDa) foi também desenvolvido como solução transportadora para administração intraperitoneal do agente anti-cancerigeno 5-fluororacilo (Kerr et ai., 1996). Trabalhos recentes descrevem conjugados de dextrino possuidores de actividade anti-endotóxica, bem como um papel importante na regulação da resposta inflamatória (Davtyan et ai., 2007) (Avetisyan et ai., 2006). Noutro trabalho recente, complexos de dextrina e hidroxiapatite foram usados como agente de enchimento ósseo, revelando bom desempenho (Asai et ai., 2009). Adicionalmente foi descrito recentemente um nanogel de dextrino com potencial para o transporte de fármacos (Gonçalves et ai., 2007). Um material semelhante - um nanogel de dextrino - foi também recentemente descrito por Orienti et ai. (2009; W02009/016663A1). Microesferas de dextrino foram usadas para encapsular porfirinas fotosensiveis para utilização em terapia fotodinâmica (Luz et ai., 2008) . Brown et ai. utilizaram também o dextrino para desenvolver uma formulação capaz de prevenir ou reduzir a incidência de adesões pós-operatórias (US27167404A1). Recentemente, Carvalho et ai. (2007) produziram hidrogéis de dextrino, nomeadamente dextrino-VA e dextrino-HEMA, como sistemas de libertação controlada. No entanto, os métodos usados para a produção dos hidrogéis, i.e. polimerização radicalar, requer agentes iniciadores para activação do processo de gelificação (e.g. persulfato de amónio), moléculas altamente reactivas que podem ser tóxicas. Adicionalmente, os referidos materiais gelificam rapidamente, não sendo portanto injectáveis, devido à citotoxicidade e ausência de controlo no processo de gelificação.

Claims (32)

1. reivindicações 1. Formulações de hidrogéis de dextrino oxidado reticulado com dihidrazida de ácido adipico caracterizadas por compreenderem a seguinte estrutura:

   que possui a propriedade de incorporação no interior da sua matriz tridimensional.
2. 2. Hidrogel, de acordo com a reivindicação anterior, caracterizado por incorporar polissacarideos, proteínas, nanogeis, nanopartícuias, materiais granulares, moléculas bioactivas e células.
3. 3. Hidrogel, de acordo com a reivindicação anterior, caracterizado por as proteínas serem o colagénio, fibronectina, caseína, entre outras.
4. 4. Hidrogel, de acordo com a reivindicação anterior, caracterizado por as proteínas serem incorporadas numa percentagem entre 0-20% do peso do hidrogel, em peso seco.
5. 5. Hidrogel, de acordo com as reivindicações 1-2, caracterizado por os polissacarideos serem quitosano ou o ácido hialurónico, entre outros.
6. 6. Hidrogel, de acordo com as reivindicações 1-2 e 5, caracterizado por os polissacarideos estarem incluídos numa 2 percentagem entre 1-20% da composição do hidrogel, em peso seco.
7. 7. Hidrogel, de acordo com as reivindicações anteriores, caracterizado por ser injectável.
8. 8. Hidrogel, de acordo com as reivindicações anteriores, caracterizado por ser não tóxico.
9. 9. Hidrogel, de acordo com as reivindicações anteriores, caracterizado por ser não hemolitico.
10. 10. Hidrogel, de acordo com as reivindicações anteriores, caracterizado por possuir uma estrutura porosa continua, com poros com cerca de lpm.
11. 11.Hidrogel, de acordo com as reivindicações anteriores, caracterizado por a biodegradação ocorrer por erosão superficial ou em bloco.
12. 12.Hidrogel, de acordo com as reivindicações anteriores, caracterizado por a degradação ocorrer hidroliticamente, ao nivel das ligações intermoleculares, ou enzimaticamente através da acção de α -amilases presentes em tecidos humanos ou incluída nas formulações de hidrogel.
13. 13.Hidrogel, de acordo com as reivindicações anteriores, caracterizado por a degradação do hidrogel ocorrer por erosão em bloco demonstra um perfil de degradação não linear com o aumento do tamanho dos poros. 3
14. 14. Método para a produção de formulações de hidrogéis conforme descritas nas reivindicações anteriores, caracterizado por compreender as seguintes etapas: a) Oxidação do dextrino com ácido periódico; b) Remoção do periodato que não reagiu; c) Gelificação por adição do agente reticulante, nomeadamente a dihidrazida do ácido adipico, preferencialmente a um pH entre 5,0-7,5.
15. 15. Método, de acordo com a reivindicação anterior, caracterizado por compreender um passo adicional opcional antes da gelificação, de adição de componentes complementares como nanogeis e péptidos bioactivos como por exemplo hidrolisados de matriz extracelular, entre outros.
16. 16.Método, de acordo com as reivindicações anteriores, caracterizado por utilizar um dextrino com um grau de oxidação entre 10-50%, preferencialmente entre 25-35%.
17. 17. Método, de acordo com as reivindicações anteriores, caracterizado por o dextrino conter baixo peso molecular, entre 1200 e 8000Da.
18. 18.Método, de acordo com as reivindicações anteriores, caracterizado por a percentagem de dihidrazida do ácido adipico usada ser entre 3-40%, preferencialmente 3-10%, em base molar relativamente aos resíduos de glucose.
19. 19.Método, de acordo com as reivindicações 14-18,caracterizado por a concentração de dextrino oxidado ser entre 5-40% (p/v), preferencialmente entre 25-30% (p/v). 4
20. 20. Método, de acordo com as reivindicações 14-19, caracterizado por o período de gelificação variar entre 1 e 30 minutos.
21. 21. Método, de acordo com as reivindicações 14-20, caracterizado pela incorporação de nanogel ou nanopartícuias no hidrogel.
22. 22. Método, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado por o diâmetro do nanogel ou nanopartículas variar entre 10-lOOOnm.
23. 23. Método, de acordo com as reivindicações 21-22, caracterizado por a incorporação do nanogel ou nanopartículas no hidrogel efectua-se através da mistura do nanogel ou nanopartículas com o dextrino oxidado, antes da adição do AAD.
24. 24. Método de acordo com a reivindicação 21-23, caracterizado por o nanogel ou nanopartículas serem incorporados na proporção 1-25% da massa de dextrino.
25. 25. Método de acordo com as reivindicações 21-24, caracterizado por o nanogel ou nanopartículas serem previamente carregados com fármacos.
26. 26. Utilização do hidrogel conforme descrito nas reivindicações 1 a 13 e obtido pelo método descrito nas reivindicações 14 a 25 caracterizado para a área de engenharia de tecidos e libertação de controlada de fármacos. 5
27. 27. Utilização do hidrogel conforme descrito nas reivindicações 1 a 13 e obtido pelo método descrito nas reivindicações 14 a 25 caracterizado por consistir num biomaterial.
28. 28. Utilização do hidrogel conforme descrito nas reivindicações 1 a 13 e obtido pelo método descrito nas reivindicações 14 a 25 caracterizado por consistir num substituto de osso.
29. 29. Utilização do hidrogel conforme descrito nas reivindicações 1 a 13 e obtido pelo método descrito nas reivindicações 14 a 25 caracterizado por consistir num sistema para libertação controlada de agentes activos.
30. 30. Utilização do hidrogel conforme descrito nas reivindicações 1 a 13 e obtido pelo método descrito nas reivindicações 14 a 25 caracterizado por consistir num implante ósseo.
31. 31. Utilização do hidrogel conforme descrito nas reivindicações 1 a 13 e obtido pelo método descrito nas reivindicações 14 a 25 caracterizado por consistir numa composição.
32. 32. Utilização do hidrogel conforme descrito nas reivindicações 1 a 13 e obtido pelo método descrito nas reivindicações 14 a 25 caracterizado por consistir numa prótese médica. Lisboa, 30 de Março de 2011