PL235422B1 - Method for increasing catalytic activity of 1,3-propanediol oxidoreductase enzyme, microorganism able to produce mutated oxidoreductase, method for producing the enzyme and application - Google Patents
Method for increasing catalytic activity of 1,3-propanediol oxidoreductase enzyme, microorganism able to produce mutated oxidoreductase, method for producing the enzyme and application Download PDFInfo
- Publication number
- PL235422B1 PL235422B1 PL414372A PL41437215A PL235422B1 PL 235422 B1 PL235422 B1 PL 235422B1 PL 414372 A PL414372 A PL 414372A PL 41437215 A PL41437215 A PL 41437215A PL 235422 B1 PL235422 B1 PL 235422B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- propanediol
- enzyme
- microorganism
- oxidoreductase
- glycerol
- Prior art date
Links
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
Opis wynalazkuDescription of the invention
Przedmiotem wynalazku jest sposób modyfikacji struktury białka enzymu oksydoreduktazy (dehydrogenazy) 1,3-propanodiolowej zwiększająca aktywność katalityczną enzymu, mikroorganizm zdolny do produkcji oksydoreduktazy 1,3-propanodiolowej o zwiększonej aktywności, sposób produkcji zmutowanej oksydoreduktazy 1,3-propanodiolowej o zwiększonej aktywności i wykorzystanie zmodyfikowanego białka w procesie mikrobiologicznej konwersji glicerolu lub aldehydu 3-hydroksypropionowego do 1,3-propanodiolu. Wynalazek należy do obszaru biotechnologii przemysłowej i inżynierii białek.The subject of the invention is a method of modifying the structure of the protein of 1,3-propanediol oxidoreductase (dehydrogenase) enzyme, increasing the catalytic activity of the enzyme, a microorganism capable of producing 1,3-propanediol oxidoreductase with increased activity, a method of producing a mutant 1,3-propanediol oxidoreductase with increased activity and the use of of a modified protein by the microbial conversion of glycerol or 3-hydroxypropionaldehyde to 1,3-propanediol. The invention is in the field of industrial biotechnology and protein engineering.
1,3-propanodiol (synonim: glikol 1,3-propylenowy) jest ważnym związkiem chemicznym o szerokich zastosowaniach. Jest on używany jako rozpuszczalnik organiczny, czynnik przeciw zamarzaniu, surowiec wyjściowy do syntezy poliuretanów i poliestrów, w tym polietylenotetraftlanu. Z tego ostatniego polimeru wytwarza się tekstylia, plastiki, błony, laminaty, materiały wygłuszające, utrwalacze barw i wiele innych. Związek ten może być produkowany na drodze syntezy chemicznej i biosyntezy mikrobiologicznej.1,3-propanediol (synonym: 1,3-propylene glycol) is an important chemical compound with wide applications. It is used as an organic solvent, antifreeze, starting raw material for the synthesis of polyurethanes and polyesters, including polyethylene terephthalate. The latter polymer is used to manufacture textiles, plastics, films, laminates, soundproofing materials, color fixers and many others. This compound can be produced by chemical synthesis and microbial biosynthesis.
W ostatnich latach obserwuje się duży wzrost zainteresowania mikrobiologiczną konwersją glicerolu (gliceryny) i glukozy do 1,3-propanodiolu. Jest to jeden z najwcześniej poznanych metabolitów drobnoustrojowych otrzymywanych na drodze mikrobiologicznej. Jedynym, naturalnym substratem do mikrobiologicznego wytwarzania tego związku chemicznego jest glicerol. Zdolność do jego biosyntezy posiadają przede wszystkim bakterie beztlenowe lub względnie beztlenowe należące do takich rodzajów, jak Clostridium, Klebsiella, Citrobacter, Lactobacillus i Enterobacter.In recent years, there has been a large increase in interest in the microbial conversion of glycerol (glycerin) and glucose to 1,3-propanediol. It is one of the earliest known microbial metabolites obtained by microbiology. The only natural substrate for the microbial production of this chemical compound is glycerol. Ability to biosynthesize it is possessed primarily by anaerobic or relatively anaerobic bacteria belonging to such genera as Clostridium, Klebsiella, Citrobacter, Lactobacillus and Enterobacter.
Kluczowe geny biorące udział w metabolizmie glicerolu u tych mikroorganizmów znajdują się w regulonie dha. W jego skład wchodzą geny ghaB dla dehydratazy glicerolowej, dhaT dla oksydoreduktazy 1,3-propanodiolowej, dhaD dla dehydrogenazy glicerolowej i dhaK dla kinazy dihydroksyacetonowej.The key genes involved in the metabolism of glycerol in these microorganisms are found in the dha regulon. It includes the ghaB genes for glycerol dehydratase, dhaT for 1,3-propanediol oxidoreductase, dhaD for glycerol dehydrogenase and dhaK for dihydroxyacetone kinase.
Glicerol pobierany z pożywki hodowlanej przez te mikroorganizmy jest metabolizowany na dwóch szlakach. Część glicerolu jest przekształcana do pirogronianu w reakcjach utleniania, podobnie jak cukry. Na tej drodze komórki dobywają energię potrzebną do życia i do tworzenia struktury komórkowej. W reakcjach bierze udział dinukleotyd nikotynoamidoadeninowy (NAD), którego rolą jest odebranie od związku organicznego atomów wodorkowych i przejście w formę zredukowaną (NADH2). NAD jest koenzymem dużej grupy enzymów - oksydoreduktaz i ich podgrupy dehydrogenaz. W ten sposób dochodzi do utleniania glicerolu i przekształcenie go stopniowo do pirogronianu. Nadmiar NADH2 powstający w tych reakcjach musi ulec ponownemu utlenieniu na drodze przekazania przenoszonych atomów wodorkowych innej substancji organicznej. W komórkach mikroorganizmów metabolizujących glicerol tworzony jest równolegle drugi szlak przemian biochemicznych o charakterze redukcyjnym, w którym glicerol jest najpierw odwodniony do aldehydu 3-hydroksypropionowego, a ten jest następnie redukowany przy udziale NADH2 do 1,3-propanodiolu. Pierwsza reakcja jest katalizowana przez enzym dehydratazę glicerolową (EC 4.2.1.30), a druga reakcja przez oksydoreduktazę (dehydrogenazę) 1,3-propanodiolową (EC 1.1.1.202) (Równania 1 i 2). Utleniona cząsteczka NAD wraca do szlaku oksydacyjnych przemian glicerolu do pirogronianu. W ten to sposób tworzenie 1,3-propanodiolu może być traktowane, jako sposób utrzymania równowagi oksydoredukcyjnej w komórce mikroorganizmu metabolizującego glicerol.The glycerol taken up from the culture medium by these microorganisms is metabolized by two pathways. Some glycerol is converted to pyruvate in oxidative reactions, as are sugars. In this way, cells obtain the energy needed for life and for the formation of cellular structure. The reactions involve nicotinamide adenine dinucleotide (NAD), the role of which is to remove hydride atoms from the organic compound and transform it into a reduced form (NADH2). NAD is a coenzyme of a large group of enzymes - oxidoreductases and their subgroups of dehydrogenases. This oxidizes glycerol and converts it gradually to pyruvate. The excess NADH2 formed in these reactions must be re-oxidized by transferring the transferred hydride atoms to another organic substance. In the cells of glycerol metabolizing microorganisms, a second pathway of biochemical transformations of a reductive nature is created in parallel, in which glycerol is first dehydrated to 3-hydroxypropionic aldehyde, which is then reduced to 1,3-propanediol with NADH2. The first reaction is catalyzed by the enzyme glycerol dehydratase (EC 4.2.1.30) and the second reaction by 1,3-propanediol oxidoreductase (EC 1.1.1.202) (Equations 1 and 2). The oxidized NAD molecule returns to the oxidative metabolism of glycerol to pyruvate. In this way, the formation of 1,3-propanediol can be regarded as a means of maintaining the redox balance in the cell of the glycerol metabolizing microorganism.
Glicerol > aldehyd 3-hydroksypropionowy + H2O (dehydrataza glicerynowa) (Równanie 1)Glycerol> 3-hydroxypropionaldehyde + H2O (glycerin dehydratase) (Equation 1)
3HP + NADH+H+ > 1,3-propanodiol + NAD+ (oksydoreduktaza 1,3-PDO) (Równanie 2)3HP + NADH + H +> 1,3-propanediol + NAD + (1,3-PDO oxidoreductase) (Equation 2)
Wytworzony 1,3-PDO jest wydzielany z komórki do pożywki hodowlanej, gdzie się kumuluje.The 1,3-PDO produced is secreted from the cell into the culture medium, where it accumulates.
Fermentacja glicerolu do 1,3-PDO zachodzi w warunkach beztlenowych. Tlen potrzebny do rozmnażania się komórek jest pozyskiwany z atomów tlenu zawartych w glicerolu. Energia potrzebna na cele życiowe pozyskiwana jest przez komórki z przemiany części glicerolu do pirogronianu. Na szlaku tym powstaje ATP.Fermentation of glycerol to 1,3-PDO occurs under anaerobic conditions. The oxygen needed for cell reproduction is obtained from the oxygen atoms in glycerol. The energy needed for life purposes is obtained by cells from the conversion of some glycerol into pyruvate. This pathway produces ATP.
Szybkość produkcji 1,3-propanodiolu (1,3-PDO) zależy od aktywności katalitycznej enzymu. Ta zaś jest determinowana budową chemiczną i sprawnością współdziałania cząsteczki białka enzymatycznego z cząsteczką koenzymu NAD. Zwykle wydajność 1,3-PDO z glicerolu sięga 0,5-0,6 mola/mol. Na efektywność całego procesu mikrobiologicznej syntezy 1,3-PDO wpływa wiele różnych czynników, jak indywidualne predyspozycje szczepu produkcyjnego wynikające z jego genomu, sposób i warunki hodowli mikroorganizmu, dobór składników pożywki oraz stopień czystości gliceryny zawierającej glicerol.The production rate of 1,3-propanediol (1,3-PDO) depends on the catalytic activity of the enzyme. This, in turn, is determined by the chemical structure and efficiency of interaction of the enzyme protein molecule with the NAD coenzyme molecule. Usually the yield of 1,3-PDO from glycerol is 0.5-0.6 mol / mol. The effectiveness of the entire process of microbiological synthesis of 1,3-PDO is influenced by many different factors, such as the individual predisposition of the production strain resulting from its genome, the method and conditions of the microorganism's cultivation, the selection of medium components and the degree of purity of glycerin containing glycerol.
PL 235 422 B1PL 235 422 B1
Dla danego szczepu produkcyjnego można zoptymalizować warunki procesu biosyntezy, co pozwala na zwiększenie szybkości i wydajności syntezy do pewnego, maksymalnego poziomu, który w praktyce stanowi nieprzekraczalne maksimum, możliwe do osiągnięcia w warunkach technicznych przez dziki szczep mikroorganizmu. Dalszy wzrost wydajności biosyntezy wymaga ingerencji człowieka w budowę molekularną bakterii-producenta 1,3-PDO poprzez zmiany genetyczne w genomie drobnoustroju. Najczęściej wykorzystywaną drogą jest inżynieria genetyczna polegająca na przenoszeniu genów kodujących enzymy szlaku metabolicznego glicerolu między mikroorganizmami i konstrukcja zrekombinowanych genetycznie szczepów uzyskujących w ten sposób zdolność syntezy 1,3-PDO. Działania takie są przedstawione w licznych publikacjach naukowych [Celińska 2010, Saxena i in. 2012].For a given production strain, the conditions of the biosynthesis process can be optimized, which allows the rate and yield of synthesis to be increased to a certain maximum level, which in practice is the maximum that cannot be exceeded under technical conditions by a wild strain of a microorganism. Further increase in the biosynthesis efficiency requires human intervention in the molecular structure of the 1,3-PDO producer bacteria through genetic changes in the microbial genome. The most frequently used route is genetic engineering involving the transfer of genes encoding the enzymes of the glycerol metabolic pathway between microorganisms and the construction of genetically recombinant strains obtaining the ability to synthesize 1,3-PDO in this way. Such activities are presented in numerous scientific publications [Celińska 2010, Saxena et al. 2012].
Znanych jest szereg rekombinantów, uzyskanych w wyniku inżynierii genetycznej, zdolnych do produkcji 1,3-PDO z glicerolu [Gonzalez-Pajuelo i in. 2005, Huang, Y i in. 2012, Nakamura i Whited 2003, Przystałowska H i in. 2015, Tang X. i in. 2009, Zhang X. i in. 2006]. W opisie CN102199570 skonstruowano genetycznie zmodyfikowaną bakterię z rodzaju Klebsiella, do genomu której wprowadzono gen kodujący enzym pozwalający na przekształcenie pirogronianu do kwasu jabłkowego. Gen był wprowadzany do bakterii za pomocą wektora pRT28a indukowanego przez IPTG. Zrekombinowane bakterie były następnie użyte do produkcji 1,3-propanodiolu na drodze fermentacyjnej.A number of genetically engineered recombinants capable of producing 1,3-PDO from glycerol are known [Gonzalez-Pajuelo et al. 2005, Huang, Y et al. 2012, Nakamura and Whited 2003, Przystałowska H et al. 2015, Tang X. et al. 2009, Zhang X. et al. 2006]. In the description CN102199570 a genetically modified bacterium of the genus Klebsiella was constructed, into the genome of which a gene encoding an enzyme allowing the conversion of pyruvate to malic acid was introduced. The gene was introduced into the bacteria with the IPTG-induced vector pRT28a. The recombinant bacteria were then used to produce 1,3-propanediol by fermentation.
Inne rozwiązanie zaproponowano w opisie CN103789248. Polega ono na wprowadzeniu do genomu bakterii Escherichia coli BL12 genu dhaT, kodującego oksydoreduktazę 1,3-propanodiolową, który pobrano od bakterii fermentacji mlekowej Lactobacillus brevis CICC6239. Do transferu genu zastosowano wektor PSE380. W wyniku modyfikacji genetycznej aktywność enzymu wzrosła 16 razy. W fermentacji zastosowano mieszaną kulturę bakterii mlekowych i rekombinanta. Wydajność konwersji glicerolu do 1,3-PDO osiągnęła 80,6%.Another solution has been proposed in CN103789248. It consists in introducing into the genome of Escherichia coli BL12 the dhaT gene encoding 1,3-propanediol oxidoreductase, which was collected from lactic acid fermentation bacteria Lactobacillus brevis CICC6239. The vector PSE380 was used for the gene transfer. As a result of genetic modification, the activity of the enzyme increased 16 times. A mixed culture of lactic bacteria and recombinant was used in the fermentation. The efficiency of the conversion of glycerol to 1,3-PDO reached 80.6%.
Podobne rozwiązanie zaproponowano w opisie KR20040104164. W tym przypadku gen oksydoreduktazy 1,3-propanodiolowej pobrany z chorobotwórczego mikroorganizmu Pseudomonas aeruginosa wprowadzono do genomu bakterii Escherichia coli. Dzięki temu zwiększyła się wydajność produkcji 1,3-PDO.A similar solution was proposed in the description KR20040104164. In this case, the 1,3-propanediol oxidoreductase gene taken from the pathogenic microorganism Pseudomonas aeruginosa was introduced into the genome of Escherichia coli. As a result, the production efficiency of 1,3-PDO has increased.
W opisie US6013494 przedstawiono metodę transformacji bakterii za pomocą genów dehydrogenazy glicerolo-3-fosforanu, glicerolo-3 fosfatazy, dehydratazy glicerolowej (dhaB) i dehydrogenazy 1,3-propanodiolowej (dhaT), a następnie wykorzystanie rekombinanta do produkcji 1,3-PDA z różnych substratów, w tym z substratów mieszanych. Rozwiązanie to przewiduje możliwość wykorzystania glukozy, która jest przekształcana w komórkach mikroorganizmów do glicerolu, a ten dalej do 1,3-propanodiolu. Autorzy patentu przewidzieli możliwość klonowania wymienionych genów w dużej grupie mikroorganizmów przemysłowych.US6013494 describes a method of transforming bacteria using the genes glycerol-3-phosphate dehydrogenase, glycerol-3-phosphatase, glycerol dehydrogenase (dhaB) and 1,3-propanediol dehydrogenase (dhaT), and then the use of recombinant for the production of 1,3-PDA from various substrates, including mixed substrates. This solution allows for the use of glucose, which is converted in the cells of microorganisms to glycerol, and then to 1,3-propanediol. The authors of the patent predicted the possibility of cloning these genes in a large group of industrial microorganisms.
W innym rozwiązaniu, CN103305543, zwiększenie syntezy 1,3-PDO przez bakterie Klebsiella pneumoniae uzyskano przez wyciszenie genu syntazy octano-mleczanowej. Pozwoliło to na zablokowanie bocznego szlaku metabolicznego prowadzącego do syntezy 2,3-butanodiolu. W wyniku powyższej modyfikacji uzyskano rekombinant zdolny do produkcji 72 g PDO/l.In another embodiment, CN103305543, an increase in the synthesis of 1,3-PDO by Klebsiella pneumoniae bacteria was achieved by silencing the acetate lactate synthase gene. This allowed blocking the metabolic side pathway leading to the synthesis of 2,3-butanediol. As a result of the above modification, a recombinant capable of producing 72 g PDO / l was obtained.
Zablokowanie szlaków przemian biochemicznych, prowadzące do syntezy zbytecznych metabolitów ubocznych, zastosowano w rozwiązaniu znanym z opisu US8338148. W wyniku tego zmniejszono zużycie zredukowanej formy kofaktora NADH2 na syntezę niepotrzebnych metabolitów i skierowanie kofaktora do reakcji przekształcania aldehydu 3-hydroksypropionowego do 1,3-PDO. Cel osiągnięto przez inaktywację genu kodującego aktywator transkrypcji lub gen kinazy dihydroksyoctanowej w organizmie posiadającym naturalną zdolność do konwersji glicerolu do 1,3-PDO.Blocking the pathways of biochemical transformations, leading to the synthesis of unnecessary side metabolites, was applied in the solution known from the description of US8338148. As a result, the consumption of the reduced form of the NADH2 cofactor for the synthesis of unnecessary metabolites and directing the cofactor to the reaction of 3-hydroxypropionaldehyde to 1,3-PDO was reduced. The goal was achieved by inactivating the gene encoding the transcription activator or the dihydroxyacetate kinase gene in an organism with the natural ability to convert glycerol to 1,3-PDO.
W opisie US8236994 przedstawiono produkcję 1,3-propanodiolu przy użyciu zrekombinowanego szczepu Clostridium, w którym wyłączono gen dehydrogenazy mleczanowej, zmniejszając tym samym ilość wytwarzanych metabolitów ubocznych.US8236994 describes the production of 1,3-propanediol using a recombinant strain of Clostridium in which the lactate dehydrogenase gene has been turned off, thus reducing the amount of byproducts produced.
U niektórych mikroorganizmów reakcja dehydratacji glicerolu do aldehydu 3-hydroksypropionowego wymaga obecności witaminy B12, która w tym przypadku wchodzi w skład enzymu, pełniąc rolę kofaktora. Ponieważ dodatek witaminy podnosi koszty produkcji poszukiwane są rozwiązania eliminujące tę niedogodność. W amerykańskim opisie patentowym US7074608 opisano wynalazek polegający na jednoczesnym przeniesieniu genów kodujących syntezę witaminy B12 z jej prekursora oraz regulonu dha, zawierającego komplet genów niezbędnych do konwersji glicerolu do 1,3-PDO. Dzięki temu rozwiązaniu rekombinant jest zdolny do jednoczesnej syntezy niezbędnej witaminy B12 i konwersji glicerolu do 1,3-PDO. Przeniesienie zestawu obejmującego wszystkie wymienione geny do mikroorganizmu, który potrafi metabolizować nie tylko glicerol, ale również cukry, pozwala na rozszerzenie puli surowcowej stosowanej do fermentacji.In some microorganisms, the dehydration reaction of glycerol to 3-hydroxypropionic aldehyde requires the presence of vitamin B12, which in this case is part of the enzyme, acting as a cofactor. Since the addition of vitamin increases the production costs, solutions are sought to eliminate this inconvenience. The US patent description US7074608 describes an invention involving the simultaneous transfer of genes coding for the synthesis of vitamin B12 from its precursor and the dha regulon, containing a set of genes necessary for the conversion of glycerol to 1,3-PDO. Thanks to this solution, the recombinant is able to simultaneously synthesize the essential vitamin B12 and convert glycerol to 1,3-PDO. Transferring the set of all these genes to a microorganism that is able to metabolize not only glycerol but also sugars allows for the expansion of the raw material pool used for fermentation.
PL 235 422 B1PL 235 422 B1
Z kolei w opisie US20070148749 przedstawiono metodę uzyskania rekombinanta, do którego genomu wprowadzono zestaw podjednostek dehydratazy glicerolu i zastosowanie tego rekombinanta do produkcji 1,3-PDO lub aldehydu 3-hydroksypropionowego.In turn, US20070148749 describes a method of obtaining a recombinant into the genome of which a set of glycerol dehydratase subunits was introduced and the use of this recombinant for the production of 1,3-PDO or 3-hydroxypropionic aldehyde.
Znane są także konstrukty genetyczne mikroorganizmów pozwalające na produkcję 1,3-PDO z glukozy, mimo że naturalne mikroorganizmy wytwarzają 1,3-PDO wyłącznie z glicerolu [Chen Z. i in. 2014]. Aktualnie na tej drodze firma DuPont wraz z firmą Genencor Inc. uzyskały najbardziej wydajny szczep bakteryjny produkujący 1,3-PDO, znacznie przewyższający wydajnością wszystkie znane dzikie szczepy produkujące ten związek chemiczny [Kaur i in. 2012]. Technologia ta znana jest z opisów US7067300 i US6514733.There are also genetic constructs of microorganisms that allow the production of 1,3-PDO from glucose, although natural microorganisms only produce 1,3-PDO from glycerol [Chen Z. et al. 2014]. Currently, DuPont and Genencor Inc. obtained the most efficient bacterial strain producing 1,3-PDO, significantly exceeding the yield of all known wild strains producing this chemical compound [Kaur et al. 2012]. This technology is known from US7067300 and US6514733.
W opisie CA2733616 przedstawiono wynalazek polegający na przeniesieniu genów dhaR, orfY, dhaT, orfX, orfW, dhaB1, dhaB2, dhaB3 i orfZ z regulonu dha bakterii Klebsiella pneumoniae do bakterii Escherichia coli z zachowaniem tej samej aranżacji genów jak w wyjściowym szczepie. Następnie uzyskany rekombinant genetyczny E. coli został użyty do produkcji 1,3-propanodiolu z glukozy.CA2733616 describes the invention to transfer the dhaR, orfY, dhaT, orfX, orfW, dhaB1, dhaB2, dhaB3 and orfZ genes from the Klebsiella pneumoniae dha regulon to Escherichia coli while maintaining the same gene arrangement as in the original strain. The resulting genetic recombinant E. coli was then used to produce 1,3-propanediol from glucose.
Podobne rozwiązanie przedstawiono w opisi e EP1586647. W tym przypadku do genomu Escherichia coli wprowadzono geny dhaR, orfY, dhaT, orfX, dhaBI, dhaB2, dhaB3 i orfZ, należące do regulonu dha Klebsiella pneumoniae. Uzyskany rekombinant został wykorzystany do produkcji 1,3-PDO z glukozy.A similar solution is presented in EP1586647. In this case, the dhaR, orfY, dhaT, orfX, dhaBI, dhaB2, dhaB3 and orfZ genes belonging to the dha Klebsiella pneumoniae regulon were inserted into the Escherichia coli genome. The recombinant obtained was used for the production of 1,3-PDO from glucose.
W opisie WO2011069033 zastosowano metodę modyfikacji genetycznej bakterii polegającą na wklonowaniu do bakterii genów transportera sacharozy, gen fruktokinazy i gen hydrolazy sacharozowej. Dzięki tym enzymom rekombinant uzyskał zdolność produkcji glicerolu z sacharozy. Jeśli powyższy zestaw genów zostanie wprowadzony do drobnoustroju posiadającego naturalną zdolność przekształcania glicerolu do 1,3-PDO, wówczas finalny produkt może być produkowany z surowców zawierających sacharozę.In the description of WO2011069033, a method of genetic modification of bacteria was used, consisting in cloning into bacteria the genes of the sucrose transporter, the fructokinase gene and the sucrose hydrolase gene. Due to these enzymes, the recombinant obtained the ability to produce glycerol from sucrose. If the above set of genes is introduced into a microorganism having the natural ability to convert glycerol to 1,3-PDO, then the final product can be produced from raw materials containing sucrose.
Rozwinięciem przenoszenia naturalnych genów z jednego organizmu do innego i tworzenia mikroorganizmów rekombinowanych jest modyfikacja struktury samych białek enzymatycznych w celu zwiększania ich aktywności katalitycznej. Głównym efektem tych modyfikacji jest ułatwienie połączenia się w centrum aktywnym enzymu trzech elementów decydujących o jego właściwościach katalitycznej: miejsca dokowania, substratu ikofaktora. Dziedzina ta nazywana jest inżynierią białek i jest oparta na metodach ukierunkowanej ewolucji i racjonalnego projektowania białek [Abatemarco i in. 2013, Bottcher i Bornscheuer 2010, Cherry i Fidantseft 2003, Dalby 2011]. Dzięki tym metodom możliwe jest kształtowanie centrum aktywnego i jego otoczenia w białku enzymatycznym, a nawet tworzenie, nowych, sztucznych białek o określonych właściwościach katalitycznych.The development of the transfer of natural genes from one organism to another and the formation of recombinant microorganisms is the modification of the structure of the enzyme proteins themselves in order to increase their catalytic activity. The main effect of these modifications is to facilitate the assembly of three elements determining its catalytic properties in the active site of the enzyme: the docking site, the substrate and the factor. This field is called protein engineering and is based on directed evolution and rational design of proteins [Abatemarco et al. 2013, Bottcher and Bornscheuer 2010, Cherry and Fidantseft 2003, Dalby 2011]. Thanks to these methods, it is possible to shape the active center and its surroundings in an enzyme protein, and even create new, artificial proteins with specific catalytic properties.
W ostatnich latach przedstawiono nowe, innowacyjne sposoby zwiększania aktywności katalitycznej enzymów biorących udział w przemianach glicerolu do 1,3-propanodiolu, w których są wykorzystywane metody inżynierii białek.In recent years, new, innovative methods of increasing the catalytic activity of enzymes involved in the conversion of glycerol to 1,3-propanediol have been presented, in which protein engineering methods are used.
W chińskim opisie patentowym CN101643739 opisano modyfikację specyficzności koenzymu oksydoreduktazy 1,3-propanodiolowej z Klebsiella pneumoniae i zastosowanie zrekombinowanego szczepu bakteryjnego, zawierającego zmodyfikowany gen, do produkcji 1,3-propanodiolu. Do modyfikacji koenzymu zastosowano metodę racjonalnego projektowania białek. Zmodyfikowany gen wprowadzono następnie do mikroorganizmu za pomocą odpowiedniego wektora. W wyniku użycia zmodyfikowanego mikroorganizmu uzyskano 10-50% wzrost produkcji 1,3-PDO.Chinese patent specification CN101643739 describes modification of the specificity of the 1,3-propanediol oxidoreductase coenzyme from Klebsiella pneumoniae and the use of a recombinant bacterial strain containing the modified gene to produce 1,3-propanediol. The method of rational protein design was used to modify the coenzyme. The modified gene was then introduced into the microorganism with an appropriate vector. As a result of the use of the modified microorganism, a 10-50% increase in the production of 1,3-PDO was achieved.
Inne rozwiązanie opisano w US6558933. Autorzy tego rozwiązania przedstawili zmutowaną formę enzymu pozyskanego z bakterii Escherichia blattae, charakteryzujący się bardzo wysoką wartością Km, przewyższającą pod tym względem trzykrotnie dziki szczep. Wartość Km określa powinowactwo enzymu do substratu. Im mniejsza jest wartość Km, tym łatwiej enzym łączy się z substratem. Zmutowane białko charakteryzowało się zmianą aminokwasu histydyny w pozycji 105 na leucynę. Gen kodujący muteinę wklonowano do innych mikroorganizmów, w tym Citrobacter, Clostridium, Klebsiella, Acetobacter, Lactobacillus, Saccharomyces, Candida, Kluyveromyces, Mucori Pichia.Another solution is described in US6558933. The authors of this solution presented a mutated form of the enzyme obtained from the Escherichia blattae bacterium, characterized by a very high Km value, three times higher than the wild strain. The Km value determines the affinity of the enzyme for the substrate. The lower the Km value, the easier the enzyme binds to the substrate. The mutant protein was characterized by a change of the histidine amino acid at position 105 to leucine. The mutein gene was cloned into other microorganisms including Citrobacter, Clostridium, Klebsiella, Acetobacter, Lactobacillus, Saccharomyces, Candida, Kluyveromyces, Mucori Pichia.
W rozwiązaniu znanym z opisu CN 101177687 zmodyfikowano strukturę genu kodującego oksydoreduktazę metodą ukierunkowanej ewolucji wykorzystując technikę error-prone PCR i skrining uzyskanych izoform enzymu. Na podstawie analizy sekwencji aminokwasowej stwierdzono, że uzyskano izoformę enzymu (muteinę), w której w strukturze białka asparagina w pozycji 99 została podstawiona przez glutaminę, a asparagina w pozycji 147 przez histydynę. Wymieniony mutant odznaczał się zwiększoną aktywnością katalityczną przy przekształceniu aldehydu 3-hydroksypropionowego do 1,3-PDO.In the solution known from the description of CN 101177687, the structure of the gene encoding the oxidoreductase was modified by the method of directed evolution using the error-prone PCR technique and screening of the obtained enzyme isoforms. Based on the analysis of the amino acid sequence, it was found that the enzyme isoform (mutein) was obtained, in which in the protein structure asparagine at position 99 was replaced by glutamine, and asparagine at position 147 by histidine. Said mutant showed increased catalytic activity in the conversion of 3-hydroxypropionaldehyde to 1,3-PDO.
PL 235 422 B1PL 235 422 B1
W opisie CN101633928 zastosowano mutowanie genu reduktazy aldehydowej do pozyskania izoform tego enzymu. Geny izolowano z Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Bacillus subtilis i Salmonella sp. Mimo różnic w sekwencji nukleotydowej geny z tych mikroorganizmów miały taką samą budowę centrum aktywności. Zmutowane geny klonowano w innych mikroorganizmach, a następnie rekombinanty wykorzystano do produkcji 1,3-propanodiolu w procesie fermentacji. W wyniku dokonanych transformacji genetycznych uzyskano wzrost wydajności fermentacji o 10-50%.In the description CN101633928, mutation of the aldehyde reductase gene was used to obtain isoforms of this enzyme. The genes were isolated from Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Bacillus subtilis and Salmonella sp. Despite the differences in the nucleotide sequence, genes from these microorganisms had the same structure of the center of activity. The mutated genes were cloned into other microorganisms and the recombinants were then used to produce 1,3-propanediol by a fermentation process. As a result of the genetic transformations, the fermentation efficiency was increased by 10-50%.
W literaturze przedmiotu wynalazku można także znaleźć opisy wykorzystania oksydoreduktazy 1,3-propanodiolowe do enzymatycznej syntezy 1,3-propanodiolu. Nemeth i in (2008) opisali próbę wykorzystania dehydratazy glicerynowej i oksydoreduktazy 1,3-propanodiolowej, pozyskanych z komórek bakterii Klebsiella pneumoniae i Clostridium butyricum do konwersji glicerolu do 1,3-propanodiolu. Stosowane enzymy pozyskali z naturalnych szczepów bakterii, a więc struktura tych enzymów nie była modyfikowana na drodze inżynierii białkowej. Autorzy ci rozwinęli tę technologię stosując enzymy unieruchomione na nośniku chitozanowym (Balassy i in. 2009). Oba rozwiązania opisano w węgierskich opisach P0500961 (2005) oraz P0900193 (2009).Descriptions of the use of 1,3-propanediol oxidoreductases for the enzymatic synthesis of 1,3-propanediol can also be found in the literature on the subject of the invention. Nemeth et al (2008) described an attempt to use glycerin dehydratase and 1,3-propanediol oxidoreductase, obtained from Klebsiella pneumoniae and Clostridium butyricum bacterial cells, to convert glycerol to 1,3-propanediol. The enzymes used were obtained from natural strains of bacteria, so the structure of these enzymes was not modified by protein engineering. These authors developed this technology using enzymes immobilized on a chitosan support (Balassy et al. 2009). Both solutions are described in the Hungarian descriptions P0500961 (2005) and P0900193 (2009).
Opisane wyżej sposoby tworzenia rekombinowanych genetycznie mikroorganizmów oraz sposoby modyfikacji struktury białek biorących udział w przemianie glicerolu do 1,3-propanodiolu, a szczególnie oksydoreduktazy 1,3-propanodiolowej, nie wyczerpują możliwości tworzenia dalszych, nieznanych dotąd rozwiązań. Nieoczekiwanie okazało się, że inne zmiany w strukturze genów kodujących oksydoreduktazę 1,3-propanodiolową również mogą przyczynić się do zwiększenia aktywności tego enzymu.The above-described methods of creating genetically recombinant microorganisms and methods of modifying the structure of proteins involved in the transformation of glycerol into 1,3-propanediol, and especially 1,3-propanediol oxidoreductase, do not exhaust the possibilities of creating further, previously unknown solutions. Unexpectedly, it turned out that other changes in the structure of genes encoding 1,3-propanediol oxidoreductase may also contribute to an increase in the activity of this enzyme.
Istotą sposobu zwiększenia aktywności redukującej enzymu oksydoreduktazy 1,3-propanodiolowej według wynalazku jest zamiana aminokwasu alaniny w pozycji 278 na walinę (A278V), przez co zmieniło się powinowactwo tak zmodyfikowanego enzymu do zredukowanej formy kofaktora NADH2 i wyraźnie wzrosła jego aktywność katalityczna. W sposobie według wynalazku modyfikację struktury białka oksydoreduktazy 1,3-propanodiolowej przeprowadzono poprzez dokonanie mutacji w genie kodującym ten enzym, w wyniku czego uzyskano zmodyfikowane formy genu, kodujące izoenzymy (muteiny).The essence of the method of increasing the reducing activity of the 1,3-propanediol oxidoreductase enzyme according to the invention is the replacement of the amino acid alanine at position 278 with valine (A278V), which changed the affinity of such a modified enzyme for the reduced form of the co-factor NADH2 and significantly increased its catalytic activity. In the method according to the invention, the modification of the structure of the 1,3-propanediol oxidoreductase protein was carried out by making a mutation in the gene encoding this enzyme, which resulted in obtaining modified forms of the gene encoding isoenzymes (muteins).
Pierwszym krokiem do pozyskania izoenzymów było wyizolowanie genu dhaT z materiału biologicznego i jego amplifikację metodą PCR z użyciem odpowiednio zaprojektowanych starterów, według znanych technik biologii molekularnej. Jako matrycę do amplifikacji genu dhaT użyto DNA wyizolowane z jednej z następujących bakterii: Clostridium butyricum, C. pasteurianum, Klebsiella pneumoniae, K. oxytoca, Citrobacter freundii, Enterobacter agglomerans, Lactobacillus reuterii, L. diolivorans, L. brevis, L. buchnerii, Bacillus welchii. W wyniku takiego postępowania uzyskano gen dhaTdla oksydoreduktazy 1,3-propanodiolowej.The first step to obtain isoenzymes was the isolation of the dhaT gene from the biological material and its amplification by PCR with the use of appropriately designed primers, according to the known techniques of molecular biology. DNA isolated from one of the following bacteria was used as a template for dhaT gene amplification: Clostridium butyricum, C. pasteurianum, Klebsiella pneumoniae, K. oxytoca, Citrobacter freundii, Enterobacter agglomerans, Lactobacillus reuterii, L. diolivorans, L. brevis, L. buchnerii, Bacillus welchii. As a result of this procedure, the dhaT gene was obtained for 1,3-propanediol oxidoreductase.
Zsyntetyzowany gen dhaT wprowadzono następnie do wektora ekspresyjnego podlegającego ekspresji w komórkach odpowiednich bakterii, zdolnych do syntezy tego enzymu, korzystnie w Escherichia coli, korzystnie wielokopijnego, i sklonowano go w kompetentnym szczepie tych bakterii według jednej ze znanych i stosowanych procedur klonowania genów. W ten sposób uzyskano rekombinowane bakterie zawierające w komórkach wiele kopii genu dhaT dla oksydoreduktazy 1,3-propanodiolowej. Etap ten stanowił sposób powielenia ilościowego wektora z wprowadzonym genem dhaT.The synthesized dhaT gene was then introduced into an expression vector expressed in cells of suitable bacteria capable of synthesizing this enzyme, preferably in Escherichia coli, preferably multi-copy, and cloned into a competent strain of these bacteria according to one of the known and used gene cloning procedures. In this way, recombinant bacteria containing multiple copies of the dhaT gene for 1,3-propanediol oxidoreductase in cells were obtained. This step was a method to amplify the quantitative vector with the introduced dhaT gene.
Kolejnym krokiem w opisywanym sposobie według wynalazku było wywołanie mutacji w strukturze genu dhaT metodą error-prone PCR. Mutacje wywoływane tą metodą obejmowały insercje, delecje i substytucje nukleotydów w strukturze genu dhaT. Mutacje te miały charakter chaotyczny i zachodziły w losowych miejscach genu dhaT.The next step in the described method according to the invention was to induce a mutation in the structure of the dhaT gene by error-prone PCR. Mutations produced by this method included insertions, deletions, and nucleotide substitutions in the structure of the dhaT gene. These mutations were chaotic in nature and took place at random places in the dhaT gene.
Proces mutacji genu przeprowadzano w trakcie amplifikacji w reakcji PCR odcinka wektora zawierającego gen dhaT. Aby wywołać mutacje, do mieszaniny reakcyjnej dodawano czynnik zaburzający prawidłowy przebieg procesu amplifikacji DNA (stąd nazwa metody: error-prone PCR = reakcja PCR podatna na błędy). W ten sposób uzyskiwano kopie genu z licznymi błędami. Dzięki takiemu postępowaniu osiągano jednocześnie dwa cele: zwiększanie ilości kopii genów dhaT, wynikające z namnożenia w reakcji PCR, oraz mutacje tego genu w trakcie amplifikacji, wynikające z zakłócenia warunków r eakcji.The gene mutation process was carried out during PCR amplification of a section of the vector containing the dhaT gene. To induce mutations, a factor disrupting the proper course of the DNA amplification process was added to the reaction mixture (hence the name of the method: error-prone PCR = error-prone PCR reaction). In this way, copies of the gene with numerous errors were obtained. Thanks to this procedure, two goals were achieved simultaneously: increasing the number of copies of the dhaT genes, resulting from amplification in the PCR reaction, and mutations of this gene during the amplification, resulting from disturbing the reaction conditions.
W sposobie według wynalazku kolejnym krokiem było wycięcie sekwencji nukleotydowych genu dhaT enzymami restrykcyjnymi z powielonych, zmutowanych amplikonów uzyskanych w reakcji errorprone PCR.In the method according to the invention, the next step was the excision of the nucleotide sequences of the dhaT gene with restriction enzymes from the amplified, mutated amplicons obtained in the errorprone PCR reaction.
Mikroorganizm zdolny do produkcji oksydoreduktazy 1,3-propanodiolowej o zwiększonej aktywności według wynalazku został otrzymany przez wprowadzenie do niego zmutowanych form genu dhaT za pomocą wektora ekspresyjnego i sklonowanie ich w mikroorganizmie, korzystnie zdolnym do sekrecjiA microorganism capable of producing 1,3-propanediol oxidoreductase with enhanced activity according to the invention was obtained by introducing mutant forms of the dhaT gene into it with an expression vector and cloning them in a microorganism, preferably capable of secreting
PL 235 422 B1 wytworzonych izoenzymów oksydoreduktazy 1,3-propanodiolowych poza komórkę, do pożywki. Gen ten wprowadzono do mikroorganizmów wybranych spośród należących do rodzaju Klebsiella, Citrobacter, Clostridium, Enterobacter, Aerobacter, Escherichia, Lactobacillus, Methylobacteria, Salmonella, Aspergillus, Saccharomyces, Zygosaccharomyces, Hansenula, Torulopsis, Candida, Pichia i Mucor. W ten sposób uzyskano zrekombinowane mikroorganizmy zdolne do biosyntezy zmutowanych form enzymu. Rekombinowane białka miały dołączoną na końcu N część fuzyjną złożoną z sześciu histydyn (His-Tag), ułatwiającą oczyszczanie białek enzymu i izoenzymów oksydoreduktazy. Populacja wyhodowanych komórek takich mikroorganizmów stanowiła bibliotekę (zbiór) losowo zmutowanych genów dhaT.1,3-propanediol oxidoreductase isoenzymes were produced outside the cell into the medium. This gene was introduced into microorganisms selected from the genus Klebsiella, Citrobacter, Clostridium, Enterobacter, Aerobacter, Escherichia, Lactobacillus, Methylobacteria, Salmonella, Aspergillus, Saccharomyces, Zygosaccharomyces, Hansenula, Torulopsis, Candida, Pichia and Mucoria. Thus, recombinant microorganisms capable of biosynthesis of the mutated forms of the enzyme were obtained. The recombinant proteins had an N-terminally attached six histidine (His-Tag) fusion portion to facilitate purification of the enzyme proteins and oxidoreductase isoenzymes. The population of the cultured cells of such microorganisms constituted a library (set) of randomly mutated dhaT genes.
Powyższą procedurę wykonano w następujący sposób. Uzyskane produkty reakcji error-prone PCR, tj. zmutowane sekwencje genu dhaT, poddano reakcji hydrolizy enzymami restrykcyjnymi dobranymi do wycięcia rejonu kodującego genu dhaT. Reakcję tę przeprowadzano według standardowych procedur. Wycięte sekwencje nukleotydowe zmutowanych form genu dhaT wprowadzano do wektora ekspresyjnego, zdolnego do namnażania i ekspresji w wybranym mikroorganizmie.The above procedure was performed as follows. The obtained error-prone PCR reaction products, ie the mutated dhaT gene sequences, were subjected to the hydrolysis reaction with restriction enzymes selected to excise the dhaT gene coding region. This reaction was performed according to standard procedures. The excised nucleotide sequences of the mutated forms of the dhaT gene were inserted into an expression vector capable of multiplication and expression in the selected microorganism.
Mieszaninę komórek zrekombinowanego mikroorganizmu wysiewano na podłoże selekcyjne w celu wyłonienia rekombinantów zawierających zmutowane formy genu dhaT. Jako czynniki selekcyjne zastosowano dodatkowe geny, zlokalizowane w wektorze ekspresyjnym, pozwalające na odróżnienie komórek zrekombinowanych od komórek niezrekombinowanych. W sposobie według wynalazku preferowane są czynniki selekcyjne (geny markerowe) nie antybiotykowe. Z kolonii wskazujących na obecność wektora ekspresyjnego izolowano komórki i tworzono z nich bank rekombinantów zawierających zmutowane formy genu dhaT. W opisywanym wynalazku przewiduje się możliwość wytwarzania zrekombinowanych mikroorganizmów zawierających zmutowane geny dhaT w kilku etapach, z użyciem kilku różnych wektorów genetycznych.The recombinant microorganism cell mixture was plated on the selection medium to select recombinants containing mutant forms of the dhaT gene. Additional genes, located in the expression vector, were used as selection factors, allowing for the distinction of recombinant cells from non-recombinant cells. In the method according to the invention, non-antibiotic selection factors (marker genes) are preferred. Cells were isolated from the colonies indicating the presence of the expression vector and a recombinant bank containing mutant forms of the dhaT gene was made up. The present invention envisages the possibility of producing recombinant microorganisms containing mutant dhaT genes in several steps, using several different genetic vectors.
W sposobie według wynalazku uzyskane rekombinanty poddano skriningowi pod kątem aktywności oksydacyjnej i redukcyjnej zmutowanych form wyprodukowanej przez nie oksydoreduktazy 1,3-propanodiolowej, z wykorzystaniem 1,3-propanodiolu i propanalu jako substratów dla tych reakcji enzymatycznych. Odniesieniem dla izoform enzymu był rekombinant wyjściowy, do którego wklonowano tą samą metodą natywny gen dhaT. Jako kryterium wyboru najlepszego mutanta zastosowano największą aktywność katalityczną izoenzymu produkowanego przez dany rekombinant.In the method of the invention, the recombinants obtained were screened for oxidative and reductive activity of mutant forms of 1,3-propanediol oxidoreductase produced by them, using 1,3-propanediol and propanal as substrates for these enzymatic reactions. The reference for the enzyme isoforms was the starting recombinant into which the native dhaT gene was cloned by the same method. The highest catalytic activity of the isoenzyme produced by a given recombinant was used as a criterion for selecting the best mutant.
W tym celu przeprowadzono hodowle poszczególnych klonów drobnoustroju, pobranych z kolonii zawierających gen dhaT, w optymalnych warunkach dla rozwoju zrekombinowanego mikroorganizmu. Po określonym czasie, separowano komórki z płynu pohodowlanego, izolowano enzymy metodą chromatografii powinowactwa na złożu wiążącym końcówkę histydynową enzymów i określano aktywność enzymów. W celu uwolnienia enzymów z wnętrza komórek, przeprowadzano dezintegrację komórek metodą nie niszczącą wyprodukowanych enzymów, korzystnie metodą zamrażania-rozmrażania, sonikacji, mechanicznej dezintegracji lub wysokociśnieniowej homogenizacji komórek.For this purpose, the individual clones of the microorganism were cultured, taken from the colonies containing the dhaT gene, under optimal conditions for the development of the recombinant microorganism. After the specified time, cells were separated from the culture fluid, enzymes were isolated by affinity chromatography on the matrix binding the histidine end of the enzymes, and the activity of the enzymes was determined. In order to release the enzymes from inside the cells, the disintegration of the cells was performed by a method which did not destroy the enzymes produced, preferably by freeze-thaw, sonication, mechanical disintegration or high-pressure homogenization of the cells.
W wyniku skriningu wytypowano mutant o największej aktywności oksydoreduktazy 1,3-propanodiolowej. Na podstawie analizy struktury molekularnej tego białka wykryto, że największą szybkość maksymalną reakcji (Vmax) i największą aktywność redukującą wykazała izoforma enzymu, w której nastąpiła substytucja alaniny w pozycji 278 na walinę. Miejsce substytucji i jej rodzaj określono na podstawi e sekwencjonowania DNA. Izoenzym ten odznaczał się zwiększoną maksymalną szybkością katalizowanej reakcji i zwiększoną aktywnością redukcyjną w porównaniu do enzymu wyjściowego, nie poddanego procedurze mutagenizacji metodą error-prone PCR.As a result of screening, the mutant with the highest activity of 1,3-propanediol oxidoreductase was selected. Based on the analysis of the molecular structure of this protein, it was found that the enzyme isoform showed the highest maximum reaction rate (Vmax) and the highest reducing activity, in which there was a substitution of alanine at position 278 with valine. The site of substitution and its type were determined by DNA sequencing. This isoenzyme was characterized by an increased maximum rate of the catalyzed reaction and an increased reduction activity as compared to the starting enzyme, which was not subjected to the error-prone PCR mutagenization procedure.
Analizy bioinformatyczne (dokowanie mikromolekularne, dynamika molekularna) wykazały, że izoenzym zawierający w pozycji 278 walinę cechuje wyższe powinowactwo do kofaktora w porównaniu do enzymu natywnego. Symulacja dynamiki molekularnej białka z mutacją 278V wykazała, że zmienione białko wykazuje dużo stabilniejszą strukturę. Reszty dynamiczne w strukturze nie podlegają silnym ruchom, co ma miejsce w przypadku białka natywnego.Bioinformatic analyzes (micromolecular docking, molecular dynamics) showed that the isoenzyme containing valine at position 278 has a higher affinity for the cofactor compared to the native enzyme. The simulation of the molecular dynamics of the protein with the 278V mutation showed that the altered protein has a much more stable structure. Dynamic residues in the structure are not subject to strong movements, which is the case with the native protein.
Sposób produkcji zmutowanej oksydoreduktazy 1,3-propanodiolowej o zwiększonej aktywności według wynalazku polega na zastosowaniu wyłonionego rekombinanta, zawierającego zmutowany gen dhaT (A278V), jako mikroorganizmu produkcyjnego do wytwarzania preparatu enzymu oksydoreduktazy 1,3-propanodiolowej. Rekombinant był hodowany w pożywce ciekłej w warunkach faworyzujących biosyntezę oksydoreduktazy 1,3.The method of producing a mutant 1,3-propanediol oxidoreductase with enhanced activity according to the invention is based on the use of the selected recombinant containing the mutant dhaT gene (A278V) as the production microorganism for the production of the 1,3-propanediol oxidoreductase enzyme preparation. The recombinant was grown in a liquid medium under conditions that favored 1,3 oxidoreductase biosynthesis.
Sposób produkcji zmutowanej oksydoreduktazy 1,3-propanodiolowej o zwiększonej aktywności według wynalazku polega na zastosowaniu wyłonionego rekombinanta, zawierającego zmutowany genThe method of producing a mutant 1,3-propanediol oxidoreductase with increased activity according to the invention is based on the use of an emerged recombinant containing the mutated gene
PL 235 422 B1 dhaT (A278V), jako mikroorganizmu produkcyjnego do wytwarzania preparatu enzymu oksydoreduktazy 1,3-propanodiolowej. Rekombinant był hodowany w pożywce ciekłej w warunkach faworyzujących biosyntezę oksydoreduktazy 1,3-propanodiolowej, po czym biomasę komórkową separowano z pożywki i poddawano dezintegracji, według ogólnie znanych metod, najlepiej metod nieniszczących cząsteczek białka enzymatycznego. Uzyskany roztwór stanowił źródło enzymu. Z roztworu usuwano zawiesiny stałe, a ciecz poddawano zagęszczeniu. Do tak przygotowanego preparatu dodawano substancje stabilizujące, w tym nośnik, przeciwutleniacze i konserwanty.DhaT (A278V) as a production microorganism for the production of the 1,3-propanediol oxidoreductase enzyme preparation. The recombinant was cultivated in a liquid medium under conditions favoring the biosynthesis of 1,3-propanediol oxidoreductase, after which the cellular biomass was separated from the medium and disintegrated according to generally known methods, preferably by non-destructive enzyme protein methods. The resulting solution was the source of the enzyme. Solid suspensions were removed from the solution and the liquid was concentrated. Stabilizing substances, including the carrier, antioxidants and preservatives, were added to the preparation prepared in this way.
Zastosowanie zmutowanego enzymu w produkcji 1,3-propanodiolu według wynalazku polega na fermentacyjnej konwersji glicerolu do 1,3-propanodiolu przy użyciu rekombinowanego mikroorganizmu, zawierającego zmutowany gen dhaT (A278V), kodujący zmutowanej oksydoreduktazy 1,3-propanodiolowej o zwiększonej aktywności. Mikroorganizm ten był zdolny do jednoczesnej syntezy dehydratazy glicerolowej. Mikroorganizm hodowano metodą wgłębną w warunkach beztlenowych w pożywce ciekłej zawierającej glicerol w stężeniu 10-150 g/l. Proces fermentacji prowadzono jedną ze znanych metod, korzystnie metodą okresową z zasilaniem (fed-batch). W przypadku prowadzenia procesu fermentacji metodą okresową z zasilaniem lub metodą ciągłą stężenie glicerolu w pożywce utrzymywano na poziomie 5-70 g/l. W zależności od rodzaju użytego rekombinanta proces fermentacji prowadzono w temperaturze 20-60°C, przy pH 3-9, przy napowietrzaniu 0-2 vvm i mieszaniu pożywki z szybkością 10-500 obr/min. Po zakończeniu hodowli biomasę komórkową usuwano jedną ze znanych metod, korzystnie przez wirowanie lub mikrofiltrację, a finalny produkt fermentacji, tj. 1,3-propanodiol izolowano z pożywki i oczyszczano z użyciem znanych metod inżynierii procesowej.The use of the mutant enzyme in the production of 1,3-propanediol according to the invention is based on the fermentative conversion of glycerol to 1,3-propanediol using a recombinant microorganism containing a mutant dhaT gene (A278V) encoding a mutant 1,3-propanediol oxidoreductase with increased activity. This microorganism was able to synthesize glycerol dehydratase simultaneously. The microorganism was grown using the submerged method under anaerobic conditions in a liquid medium containing glycerol at a concentration of 10-150 g / l. The fermentation process was carried out by one of the known methods, preferably by the fed-batch method. In the case of the fermentation process with the fed or continuous method, the concentration of glycerol in the medium was maintained at the level of 5-70 g / l. Depending on the type of recombinant used, the fermentation process was carried out at a temperature of 20-60 ° C, at pH 3-9, with 0-2 vvm aeration and mixing of the medium at a speed of 10-500 rpm. After completion of the culture, the cellular biomass was removed by any known method, preferably by centrifugation or microfiltration, and the final fermentation product, i.e. 1,3-propanediol, was isolated from the medium and purified using known process engineering methods.
Wynalazek przedstawiono w przykładach wykonania.The invention is illustrated in working examples.
P r z y k ł a d 1. Mutacja w genie dhaT i uzyskanie izoenzymów z substytucją A278V oraz mikroorganizm zdolny do produkcji oksydoreduktazy 1,3-propanodiolowej o zwiększonej aktywności.Example 1. Mutation in the dhaT gene and obtaining isoenzymes with the A278V substitution and a microorganism capable of producing 1,3-propanediol oxidoreductase with increased activity.
Gen dhaT, kodujący oksydoreduktazę 1,3-propanodiolu (PDOR), otrzymano w wyniku reakcji amplifikacji prowadzonej na matrycy genomowego DNA Clostridium butyricum DSMZ 10702 z użyciem starterów: dhaT_CbutF i dhaT_CbutR (dhaT_CbutF - ATGAGAATGTATGATTATTTAGTACCAAGTG, dhat_CbutR - TTAATAAGCAGCCTTAAAAATATTTATAATATCTT).The dhaT gene, encoding 1,3-propanediol oxidoreductase (PDOR), was obtained as a result of an amplification reaction carried out on a Clostridium butyricum DSMZ 10702 genomic DNA template with the use of primers: dhaT_CbutF and dhaT_CbutR (dhaT_CbutF - ATGAGAATAGTAGATTATTATTAATAGTAGATGATTATTAATAGTAGATGATTATTAATAGTAGATGAT.
Otrzymany produkt reakcji klonowano w wektorze pGEM-T-Easy według procedury zalecanej przez producenta wektora (PROMEGA). W wyniku tego otrzymano rekombinowany plazmid pGEM-T-Easy_dhaTw znacznej liczbie kopii w komórkach E. coli JM109. Izolacje plazmidowego DNA wykonano zestawem Plazmid Minifirmy A&A Biotechnology, zgodnie z zaleceniami producenta. Otrzymane plazmidowe DNA wykorzystano jako matrycowe DNA do reakcji podatnego na błędy PCR, w celu wprowadzenia substytucji nukleotydowych w losowych miejscach w sekwencji genu dhaT. Zastosowano zestaw GeneMorph®II Mutagenesis KIT firmy Agilent Technologies, zawierający polimerazę DNA Mutazyme® II, wprowadzającą mutacje w trakcie wydłużania nici DNA w każdym cyklu reakcji PCR. Reakcję przeprowadzono dla matrycowego DNA w ilości 2,5 μg, co dało 695 ng genu dhaT na reakcję, z zastosowaniem oligonukleotydów dhaT_Cbut_BamHI F i dhaT_Cbut_Xho R dhaT_Cbut_BamHI F-AAGGGATCCTATGAGAATGTATGATTATTTAGTACCAAG, dhaT Cbut Xhol R - TAGCTCGAGTTAATAAGCAGCCTTAAAAATATTTATAATAT C). Reakcję prowadzono w termocyklerze Veriti® (Applied Biosystems), zgodnie z zaleceniami producenta dla częstotliwości mutacji od 0 do 4,5 na 1000 par zasad, w objętości 50 gL, stosując następujący profil temperaturowy: denaturacja wstępna: 95°C 5 min, denaturacja: 95°C 1 min, wiązanie starterów (zgodnie z wynikiem optymalizacji): 56,5°C 30 sek., elongacja: 72°C 1,5 min, Liczba cykli: 30, wydłużanie końcowe: 72°C 5 min, 4°C pauza.The obtained reaction product was cloned in the pGEM-T-Easy vector according to the procedure recommended by the vector manufacturer (PROMEGA). As a result, the recombinant pGEM-T-Easy_dhaT plasmid was obtained with a significant number of copies in E. coli JM109 cells. Plasmid DNA isolations were performed with the A&A Biotechnology Minifirmy Plasmid kit, according to the manufacturer's instructions. The resulting plasmid DNA was used as template DNA for error prone PCR reactions to introduce nucleotide substitutions at random locations in the dhaT gene sequence. The Agilent Technologies GeneMorph®II Mutagenesis KIT kit was used, containing the Mutazyme® II DNA polymerase, introducing mutations during DNA strand extension in each PCR cycle. The reaction was performed with template DNA of 2.5 μg, resulting in 695 ng of the dhaT gene per reaction, using the oligonucleotides dhaT_Cbut_BamHI F and dhaT_Cbut_Xho R dhaT_Cbut_BamHI F-AAGGGATCCTATGAGAATGTAGTAGTAGATAATTAGTAGTAGTAAATTAGTAGTAGTAAATTAGTAGTAGTAATCATA. The reaction was carried out in a Veriti® thermocycler (Applied Biosystems) according to the manufacturer's recommendations for a mutation frequency of 0 to 4.5 per 1000 base pairs, in a volume of 50 gL, using the following temperature profile: initial denaturation: 95 ° C 5 min, denaturation: 95 ° C 1 min, primer binding (according to optimization result): 56.5 ° C 30 sec, extension: 72 ° C 1.5 min, Number of cycles: 30, final extension: 72 ° C 5 min, 4 ° C pause.
Uzyskany produkt reakcji podatnego na błędy PCR poddano reakcji hydrolizy restryktazami Bam HI, Xhol I. Do reakcji wykorzystywano enzymy firmy Thermo Scientific Fermentas, zgodnie z zaleceniami producenta. Tak wycięty gen klonowano w wektorze ekspresyjnym pET28+ z wykorzystaniem ligazy T4 DNA firmy ThermoScientific, stosując warunki ligacji zgodne z zaleceniami producenta. Mieszaninę ligacyjną inkubowano przez noc w temperaturze 18°C.The obtained reaction product prone to errors PCR was hydrolyzed with Bam HI, Xhol I restrictionases. The reaction was performed with enzymes from Thermo Scientific Fermentas, according to the manufacturer's instructions. The gene excised in this way was cloned in the pET28 + expression vector using ThermoScientific T4 DNA ligase, using ligation conditions according to the manufacturer's instructions. The ligation mixture was incubated overnight at 18 ° C.
Uzyskane konstrukcje genetyczne namnażano w komórkach E. coli DH5a, stosując procedurę transformacji metodą szoku cieplnego opisaną poniżej. Zawiesinę komórek elektrokompetentnych E. coli DH5a rozmrażano na lodzie. Do 200 gl komórek kompetentnych coli DH5a dodano mieszaninę ligacyjną. Tak przygotowaną mieszaninę inkubowano na lodzie przez 30 min. Następnie przeprowadzono procedurę szoku cieplnego inkubując mieszaninę w temperaturze 42°C w termobloku przez 45 sekund. Po tym czasie mieszaninę ponownie przeniesiono na lód i inkubowano 2 minuty. Następnie do probówek dodano po 1 ml pożywki SOC i inkubowano przez godzinę w 37°C. Po inkubacji wirowano przy 13000 obr/min przez 20 sekund, usunięto supernatant, a osad komórkowy zawieszono w 100 glThe resulting genetic constructs were propagated in E. coli DH5a cells using the heat shock transformation procedure described below. The E. coli DH5a electrocompetent cell suspension was thawed on ice. The ligation mixture was added to 200 µl of DH5a competent coli cells. The mixture prepared in this way was incubated on ice for 30 min. The heat shock procedure was then performed by incubating the mixture at 42 ° C in a thermoblock for 45 seconds. At this time, the mixture was returned to ice and incubated for 2 minutes. Then, 1 ml of SOC medium was added to the test tubes and incubated for one hour at 37 ° C. After incubation, it was centrifuged at 13,000 rpm for 20 seconds, the supernatant was removed and the cell pellet was resuspended in 100 g.
PL 235 422 B1 świeżej pożywki SOC. Mieszaninę wysiewano metodą powierzchniową na podłoże selekcyjne, którym była pożywka LB zawierająca kanamycynę. Płytki inkubowano w 37°C przez noc (12-16 h), do momentu pojawienia się kolonii.Of fresh SOC medium. The mixture was plated by the surface method on the selection medium which was LB medium containing kanamycin. Plates were incubated at 37 ° C overnight (12-16 h) until colonies appeared.
Obecność insertu odpowiadającego wielkości genu dhaT weryfikowano metodą kolonijnego PCR z zastosowaniem polimerazy RUN (A&A, Biotechnology) w objętości 10 gL, zgodnie z opisaną procedurą. Fragment kolonii przenoszono do probówki zawierającej 50 gL buforu STET, następnie inkubowano w temperaturze 95°C przez 10 minut oraz wirowano przez 10 minut przy 15000 obr/min. Jako matrycę do reakcji PCR stosowano otrzymany supernatant. Mieszanina reakcyjna składała się z: buforu reakcyjnego RUN 1x, Taq DNA Polimerazy RUN (0.2 U), dNTP (0.2 mM każdy), starterów dhaT_ CbuttF i dhaT_Cbut R (0.5 gM każdy), matrycy DNA i H2O do objętości 10 gL. Reakcję PCR prowadzono w termocyklerze Veriti® (Applied Biosystems), stosując następujący profil temperaturowy: denaturacja wstępna: 95°C 5 min, denaturacja: 95°C 1 min, wiązanie starterów (zgodnie z wynikiem optymalizacji): 56,5°C, 30 sek., elongacja: 72°C, 1,5 min, liczba cykli 30, wydłużanie końcowe: 72°C 5 min i 4°C pauza.The presence of an insert corresponding to the size of the dhaT gene was verified by colony PCR using RUN polymerase (A&A, Biotechnology) in a volume of 10 gL according to the procedure described. The colony fragment was transferred to a tube containing 50 gL of STET buffer, then incubated at 95 ° C for 10 minutes and centrifuged for 10 minutes at 15,000 rpm. The obtained supernatant was used as a template for the PCR reaction. The reaction mixture consisted of: RUN 1x reaction buffer, Taq DNA Polymerase RUN (0.2 U), dNTP (0.2 mM each), primers dhaT_ CbuttF and dhaT_Cbut R (0.5 gM each), template DNA and H2O up to a volume of 10 gL. The PCR reaction was performed in a Veriti® thermal cycler (Applied Biosystems) using the following temperature profile: initial denaturation: 95 ° C 5 min, denaturation: 95 ° C 1 min, primer binding (according to optimization result): 56.5 ° C, 30 sec., extension: 72 ° C, 1.5 min, number of cycles 30, final extension: 72 ° C 5 min and 4 ° C pause.
Z kolonii, w których potwierdzono obecność sekwencji odpowiadającej długości genu dhaT, izolowano plazmidowe DNA zestawem Plazmid Mini firmy A&A Biotechnology, zgodnie z zaleceniami producenta. Uzyskaną biblioteką zmutowanych konstrukcji genowych transformowano komórki E. coli BL21(DE3)pLysS, zgodnie z procedurą transformacji komórek opisaną dla E. coli DH5a. Komórki E. coli BL21 (DE3)pLysS, zawierające rekombinowany plazmid ekspresyjny pET28b+_dhaT zostały zdeponowane w Polskiej Kolekcji Drobnoustrojów w Instytucie Immunologii i Terapii Doświadczalnej im. Ludwika Hirszfelda pod numerem depozytu B/00093.From the colonies in which the presence of the sequence corresponding to the length of the dhaT gene was confirmed, plasmid DNA was isolated using the Plasmid Mini kit from A&A Biotechnology according to the manufacturer's instructions. E. coli BL21 (DE3) pLysS cells were transformed with the obtained mutant gene construct library according to the cell transformation procedure described for E. coli DH5a. E. coli BL21 (DE3) pLysS cells containing the recombinant expression plasmid pET28b + _dhaT were deposited in the Polish Microbial Collection at the Institute of Immunology and Experimental Therapy. Ludwik Hirszfeld under the deposit number B / 00093.
Celem uzyskania rekombinowanego białka PDOR i mutantów, komórki E. coli BL21(DE3)pLysS zawierające rekombinowany plazmid ekspresyjny pET28b+_dhaT poddano ekspresji w systemie Tabora-Studiera, zgodnie z opisaną procedurą. Zaszczepiono 10 mL pożywki LB (kan, cam) komórkami E. coli BL21(DE3)pLysS z wektorem. Kultury hodowano przez noc, w temperaturze 37°C, w cieplarce z wytrząsaniem 250 obr/min. Przeniesiono 0,5 mL hodowli nocnej do 5 mL świeżej pożywki LB (kan, cam), hodowlę prowadzono w cieplarce w temp. 37°C, z wytrząsaniem 250 obr/min, do momentu, gdy absorbancja przy długości fali 600 nm wyniosła ~0.8. Następnie dodawano do pożywki induktor IPTG do końcowego stężenia 1 mM, w celu pobudzenia ekspresji genu dhaT. Indukcję prowadzono przez 3 godziny w cieplarce w temp. 30°C, z wytrząsaniem 250 obr/min. Po tym czasie hodowlę wirowano 10 minut przy 3500 obr/min w temp. 4°C.To obtain recombinant PDOR protein and mutants, E. coli BL21 (DE3) pLysS cells containing the pET28b + _dhaT recombinant expression plasmid were expressed in a Tabora-Studier system according to the described procedure. 10 mL of LB medium (kan, cam) were inoculated with E. coli BL21 (DE3) pLysS cells with the vector. The cultures were grown overnight at 37 ° C in a 250 rpm shaking oven. 0.5 mL of overnight culture was transferred to 5 mL of fresh LB medium (kan, cam), the culture was carried out in an incubator at 37 ° C, shaking at 250 rpm, until the absorbance at 600 nm was ~ 0.8 . Then an IPTG inducer was added to the medium to a final concentration of 1 mM to stimulate dhaT gene expression. The induction was carried out for 3 hours in an incubator at 30 ° C, with shaking at 250 rpm. After this time, the culture was centrifuged for 10 minutes at 3500 rpm and 4 ° C.
Następnie przeprowadzono procedurę izolacji izoenzymu dhaT (A278V). Supernatant pożywki odrzucono, osad komórkowy zbierano i zawieszono w 5 ml zimnego buforu fosforanowo-potasowego (20 mM, pH 7,4). Ponownie wirowano 10 minut przy 3500 obr/min w temp. 4°C. Supernatant odrzucono.The isolation procedure of the dhaT isoenzyme (A278V) was then performed. The supernatant of the medium was discarded, the cell pellet was collected and resuspended in 5 ml of cold potassium phosphate buffer (20 mM, pH 7.4). It was centrifuged again for 10 minutes at 3500 rpm and 4 ° C. The supernatant was discarded.
Dezintegrację komórek, w celu uwolnienia frakcji cytozolowej prowadzono metodą zamrażanie/rozmrażanie zgodnie z opisaną procedurą. Osad komórkowy po nadekspresji zawieszono w 5 ml zimnego buforu fosforanowo-potasowego (20 mM, pH 7,4), dodano 0,1 gl Benzonazy. Inkubowano 5 minut na lodzie. Następnie mieszaninę rozdzielono do 5 probówek typu eppendorf (po 1 ml). Probówki gwałtownie schłodzono w ciekłym azocie, a następnie przeniesiono do termobloku nastawionego na temp. 37°C. Inkubowano do momentu przejścia mieszaniny ponownie w stan ciekły. Proces powtórzono trzykrotnie. Następnie uzyskany homogenat zwirowano 30 minut przy 15000 obr/min w temp. 4°C. Zawarte w uzyskanym surowym ekstrakcie (supernatant) białka oczyszczono metodą chromatografii powinowactwa immobilizowanych jonów metali (IMAC, ang. immobilized metal affinity chromatography) na złożu zawierającym jony niklu związane z kwasem nitrylotrioctowym. Do oczyszczania wykorzystano zestaw wirówkowy HisPur Ni-NTA Purification Kit, 0.2 ml firmy Thermo Scientific. Oczyszczanie prowadzono zgodnie z zaleceniami producenta, stosując bufory: wiążący, do przemywania oraz elucyjny zawierające odpowiednio 20 mM, 100 mM i 300 mM imidazolu. Oczyszczone białko wykorzystywano bezpośrednio do pomiaru aktywności enzymatycznej. Pomiary aktywności enzymatycznej metodą ki netyczną prowadzono z zastosowaniem substratów: 1,3-propanodiol, propanal, zgodnie z opisaną procedurą. Zastosowano układ pomiarowy wykorzystujący test optyczny prosty. Metoda oznaczania aktywności PDOR polegała na pomiarze szybkości zwiększania lub zmniejszania absorbancji przy długości fali 340 nm, wskutek redukcji NAD do NADH lub utleniania NADH do NAD przez tę oksydoreduktazę.Cell disintegration to release the cytosolic fraction was performed by the freeze / thaw method according to the procedure described. The overexpressed cell pellet was suspended in 5 ml of cold potassium phosphate buffer (20 mM, pH 7.4), 0.1 g of Benzonase was added. Incubated for 5 minutes on ice. The mixture was then distributed into 5 eppendorf tubes (1 ml each). The tubes were cooled rapidly in liquid nitrogen and then transferred to a thermoblock set at 37 ° C. Incubated until the mixture was liquefied again. The process was repeated three times. Then, the obtained homogenate was centrifuged for 30 minutes at 15,000 rpm at 4 ° C. The proteins contained in the obtained crude extract (supernatant) were purified by immobilized metal affinity chromatography (IMAC) on a resin containing nickel ions bound to nitrilotriacetic acid. A HisPur Ni-NTA Purification Kit, 0.2 ml from Thermo Scientific was used for purification. Purification was performed according to the manufacturer's instructions, using binding, washing and elution buffers containing 20 mM, 100 mM, and 300 mM imidazole, respectively. The purified protein was used directly to measure the enzymatic activity. Measurements of the enzymatic activity by the kinetic method were carried out with the use of substrates: 1,3-propanediol, propanal, according to the described procedure. A measuring system using a simple optical test was used. The method of determining PDOR activity was to measure the rate of increase or decrease in absorbance at 340 nm due to the reduction of NAD to NADH or the oxidation of NADH to NAD by this oxidoreductase.
PL 235 422 B1PL 235 422 B1
Procedura prowadzenia oznaczeń aktywności enzymu w zależności od użytego substratu przebiegała w następujący sposób.The procedure for the determination of the enzyme activity, depending on the substrate used, was as follows.
a) Oznaczanie aktywności, w której substrat stanowił 1,3-propanodiol.a) Determination of the activity for which 1,3-propanediol was the substrate.
Na płytkę podano 100 μl buforu węglanowo-fosforanowego (pH 9,0), 10 mM (NH4)2SO4), 10 mM 1,3-propanodiolu, oczyszczone białko.The plate was loaded with 100 μl of carbonate-phosphate buffer (pH 9.0), 10 mM (NH4) 2SO4), 10 mM 1,3-propanediol, purified protein.
Płytkę umieszczono w czytniku i nastawiono odpowiedni, wcześniej zoptymalizowany protokół. Obejmował on następujące etapy: inkubacja 3 min w 37°C, wytrząsanie (5 sekund, ruch orbitalny amplituda 4 mm), automatyczne dozowanie roztworu NAD (0,2 mM), wytrząsanie (5 sekund, ruch orbitalny amplituda 4 mm), pomiar absorbancji (czas pomiaru 5 minut, liczba cykli 11).The plate was placed in the reader and the appropriate, previously optimized protocol was set. It included the following steps: incubation for 3 min at 37 ° C, shaking (5 seconds, orbital motion, amplitude 4 mm), automatic dosing of NAD solution (0.2 mM), shaking (5 seconds, orbital motion, amplitude 4 mm), absorbance measurement (measurement time 5 minutes, number of cycles 11).
b) Oznaczanie aktywności, w której substrat stanowił propanal.b) Determination of the activity for which the substrate was propanal.
Na płytkę podano 100 mM buforu trietanoloaminowego (pH 7,5), 30 mM propanalu, oczyszczone białko.100 mM triethanolamine buffer (pH 7.5), 30 mM propanal, purified protein was applied to the plate.
Płytkę umieszczono w czytniku i nastawiono odpowiedni, wcześniej zoptymalizowany protokół. Obejmował on następujące etapy: inkubacja 3 min w 37°C, wytrząsanie (5 sekund, ruchorbitalny amplituda 4 mm), automatyczne dozowanie roztworu NADH (2,4 mM), wytrząsanie (5 sekund, ruch orbitalny amplituda 4 mm), pomiar absorbancji (czas pomiaru 5 minut, liczba cykli 11).The plate was placed in the reader and the appropriate, previously optimized protocol was set. It included the following steps: incubation for 3 min at 37 ° C, shaking (5 seconds, motion amplitude 4 mm), automatic dosing of NADH solution (2.4 mM), shaking (5 seconds, orbital motion amplitude 4 mm), absorbance measurement ( measurement time 5 minutes, number of cycles 11).
c) W celu oznaczenia aktywności wszystkich enzymów znajdujących się w surowym ekstrakcie substrat stanowiła woda (tzw. reakcja tła).c) In order to determine the activity of all enzymes in the crude extract, the substrate was water (the so-called background reaction).
Pomiar ciągły prowadzono w temperaturze 37°C, w czytniku wielodetekcyjnym mikropłytek Tecan Infinite M200 (TK Biotech), wykorzystując płytki 96-dołkowe płaskodenne Costar 3370 (Corning).Continuous measurement was performed at 37 ° C in a Tecan Infinite M200 multisensor microplate reader (TK Biotech) using Costar 3370 96-well flat bottom plates (Corning).
Aktywność enzymatyczną obliczono według poniższej formuły:The enzymatic activity was calculated according to the following formula:
r W1 ΔΑ/min Vk r W1 ΔΑ / min V k
Im/J ε x d Va Im / J ε xd V a
AA/min - zmiana absorbancji w ciągu 1 minuty ε - współczynnik molowy ekstynkcji, (NADH 6,22 ml*Lim 1*cm 1)AA / min - absorbance change within 1 minute ε - molar extinction coefficient, (NADH 6.22 ml * Lim 1 * cm 1)
Vk - objętość końcowa mieszaniny reakcyjnej (300 μ-l)Vk - final volume of the reaction mixture (300 μ-l)
Va - objętość materiału badanego (150 Ll) d - długość drogi optycznej (0,89 cm)Va - volume of the tested material (150 Ll) d - optical path length (0.89 cm)
Do wyznaczenia aktywności właściwej, obliczoną aktywność w jednostkach standardowych [U] przeliczano na miligram białka całkowitego ekstraktu komórkowego. Miarą aktywności właściwej PDOR jest ilość Lmoli zredukowanego NAD/utlenionego NADH w czasie 1 minuty w przeliczeniu na 1 miligram całkowitego białka komórkowego (Lmole zredukowanego NAD/utlenionego NADH x min-1 x min-1 x mg białka-1).To determine the specific activity, the calculated activity in standard units [U] was converted to milligram protein of total cell extract. The measure of the specific activity of PDOR is the amount of Lmoles of reduced NAD / oxidized NADH in 1 minute per milligram of total cellular protein (Lmoles of reduced NAD / oxidized NADH x min -1 x min -1 x mg protein -1 ).
Pomiary aktywności specyficznej wykazały, że aktywność redukująca natywnego enzymu w stosunku do substratów propanal-NADH wynosiła 1,58 U/mg, podczas gdy aktywność izoenzymu (A278V) wobec tego substratu wynosiła 6,56 U/mg, a więc wzrosła ponad czterokrotnie (415%). Maksymalna szybkość reakcji enzymatycznej Vmax dla enzymu natywnego wyniosła 0,57 LM/min x 10-2, podczas gdy Vmax dla izoenzymu (A278V) wyniosła 1,83 LM/min x 10-2, natomiast stała KM dla enzymu natywnego wyniosła 10,91 mM, a dla izoenzymu (A278V) 5,84 mM.Measurements of the specific activity showed that the reducing activity of the native enzyme against propanal-NADH substrates was 1.58 U / mg, while the activity of the isoenzyme (A278V) against this substrate was 6.56 U / mg and therefore increased more than fourfold (415 %). The maximum enzyme reaction rate Vmax for the native enzyme was 0.57 LM / min x 10 -2 , while Vmax for the isoenzyme (A278V) was 1.83 LM / min x 10 -2 , while the KM constant for the native enzyme was 10.91 mM and for the isoenzyme (A278V) 5.84 mM.
P r z y k ł a d 2. Zastosowanie zmutowanej oksydoreduktazy 1,3-propanodiolowej z substytucją A278V w procesie fermentacyjnej konwersji glicerolu do 1,3-propanodiolu.Example 2. The use of mutant 1,3-propanediol oxidoreductase with A278V substitution in the fermentative conversion of glycerol to 1,3-propanediol.
Do bioreaktora o pojemności roboczej 10 l wprowadzono 7 l pożywki LB z dodatkiem 0,1 g/l kanamycyny i 0,1 g/l ampicyliny, i całość wysterylizowano w temp. 121 °C przez 30 min. Po schłodzeniu pożywki do 37°C zaszczepiono ją kulturą rekombinowanych bakterii Escherichia coli BL21(DE3)pLysS (A278V), które otrzymano metodą opisaną w przykładzie 1, w ilości 106 jtk/ml. Hodowlę prowadzono przez dobę, po czym całość kultury przeniesiono do bioreaktora o poj. 250 L wypełnionego 200 l sterylnej pożywki o składzie (g/l): glicerol - 10,0, K2HPO4 - 14,0. KH2PO4 - 6,0, ekstrakt drożdżowy - 8,0, trypton - 8,0, MgSO4x7H2O - 0,3, CoCl2x6H2O - 0,01, woda wodociągowa - do 200 L. Kwasowość pożywki pH regulowano na 7,0. W celu usunięcia tlenu przeprowadzono azotowanie pożywki przedmuchując ją przez 60 min gazowym azotem z szybkością 0,4 vvm. Po potwierdzeniu warunków beztlenowych przez pomiar potencjału oksydoredukcyjnego (-300 mV), rozpoczynano fermentację w warunkach beztlenowych przy mieszaniu pożywki z szybkością 80 obr/min. Po osiągnięciu logarytmicznej fazy wzrostu do pożywki wprowadzano ITPG w stężeniu 1 mM, w celu wzbudzenia ekspresji genu.7 l of LB medium with the addition of 0.1 g / l kanamycin and 0.1 g / l ampicillin were introduced into the bioreactor with a working capacity of 10 l, and the whole was sterilized at 121 ° C for 30 min. After cooling the medium to 37 ° C, it was inoculated with a culture of recombinant Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS (A278V) bacteria, prepared by the method described in example 1, in an amount of 106 cfu / ml. The cultivation was carried out overnight, after which the whole culture was transferred to a bioreactor with a capacity of 250 L of 200 L of sterile medium filled with the following composition (g / L): glycerol - 10.0, K2HPO4 - 14.0. KH2PO4 - 6.0, yeast extract - 8.0, tryptone - 8.0, MgSO4x7H2O - 0.3, CoCl2x6H2O - 0.01, tap water - up to 200 L. The acidity of the pH medium was adjusted to 7.0. In order to remove oxygen, nitriding of the medium was carried out by purging it with nitrogen gas at a rate of 0.4 vvm for 60 min. After confirming the anaerobic conditions by measuring the redox potential (-300 mV), the fermentation was started under anaerobic conditions while the medium was agitated at 80 rpm. After reaching the logarithmic growth phase, ITPG was introduced into the medium at a concentration of 1 mM to induce gene expression.
PL 235 422 B1PL 235 422 B1
W trakcie fermentacji pobierano próbki w celu dokonania analizy chromatograficznej składu pożywki. Stężenie glicerolu utrzymywano na poziomie 5-10 g/l przez dodatek kolejnych porcji 50% w/v roztworu glicerolu. Przez cały czas fermentacji pożywkę przedmuchiwano azotem z szybkością 0,1 vvm. Fermentacja produkcyjna była kontynuowana aż do momentu ustania syntezy 1,3-propanodiolu. W wyniku biokonwersji glicerolu do 1,3-propanodiolu uzyskano 12,3 g produktu/l. W równoległej fermentacji, prowadzonej w identycznych warunkach, z użyciem rekombinowanych bakterii, w których klonowano gen dhaT nie podany mutacji, uzyskano końcowe stężenie produktu na poziomie 10,1 g/l. Oznacza to, że dzięki wprowadzeniu izoenzymu końcowe stężenie 1,3-propanodiolu wzrosło o 21 %. Po zakończeniu procesu fermentacji całość odfermentowanej pożywki odwirowywano przy 3000 g przez 10 min uzyskując dwie frakcje: ciecz pofermentacyjną i gęstwę komórkową. Ciecz pofermentacyjną poddawano dalszej obróbce w celu wydzielenia i oczyszczenia 1,3-propanodiolu według znanych metod technologii chemicznej, natomiast biomasę komórkową wykorzystano do izolacji enzymu i pozyskania preparatu enzymatycznego.During the fermentation, samples were taken for the purpose of chromatographic analysis of the composition of the medium. The concentration of glycerol was kept at 5-10 g / L by the addition of further portions of 50% w / v glycerol solution. Throughout the fermentation, the medium was purged with nitrogen at a rate of 0.1 vvm. The production fermentation was continued until the synthesis of 1,3-propanediol ceased. As a result of the bioconversion of glycerol to 1,3-propanediol, 12.3 g of product / l were obtained. A final product concentration of 10.1 g / l was obtained in a parallel fermentation, carried out under identical conditions, with recombinant bacteria, in which the dhaT gene was cloned without the mutation indicated. This means that due to the introduction of the isoenzyme, the final concentration of 1,3-propanediol increased by 21%. After the end of the fermentation process, the whole of the fermented medium was centrifuged at 3000 g for 10 minutes, obtaining two fractions: post-fermentation liquid and cell dense. The post-fermentation liquid was further processed to isolate and purify 1,3-propanediol according to known methods of chemical technology, while the cellular biomass was used to isolate the enzyme and obtain an enzyme preparation.
P r z y k ł a d 3. Produkcja zmutowanej oksydoreduktazy 1,3-propanodiolowej o zwiększonej aktywności.Example 3. Production of 1,3-propanediol mutant oxidoreductase with increased activity.
Komórki rekombinanta BL21(DE3)pLysS (A278V) hodowano w pożywce ciekłej zawierającej dodatek glicerolu i uzyskano populację komórkową o gęstości 2x109 jkt/ml. W trakcie hodowli, w logarytmicznej fazie wzrostu bakterii, wywoływano nadekspresję izoenzymu oksydoreduktazy 1,3-propanodiolowej przez dodatek ITPG do pożywki w stężeniu 1 mM. Uzyskaną biomasę separowano przez mikrofiltrację membranową, stosując membranę polieterosulfonianową o punkcie odcięcia 0,2 μm. Zagęszczoną zawiesinę komórek schładzano do temperatury 0-4°C i w tej temperaturze prowadzono dalszą obróbkę. Wydzielone z pożywki komórki poddawano dezintegracji jedną z trzech metod: (1) komórki zawieszano w buforze EDTA, dodawano 1 mM ditiotreitolu (DTT) dla utrzymania środowiska redukcyjnego i inhibitory proteaz (koktajl inhibitorów Roche lub Sigma), i przeprowadzano sonikację stosując pulsy 5-10 sek. i przerwy 20-40 sek., (2) poddawano wysokociśnieniowej homogenizacji przy 40-100 MPa lub (3) zawiesinę komórek poddawano trzykrotnemu zamrożeniu i rozmrożeniu (-5°C/+37°C). We wszystkich stosowanych technikach przestrzegano zasady pracy niskich temperaturach (< 4°C).Recombinant BL21 (DE3) pLysS (A278V) cells were cultured in a liquid medium containing glycerol and a cell population was obtained with a density of 2x109 µg / ml. During the cultivation, in the logarithmic phase of bacterial growth, the 1,3-propanediol oxidoreductase isoenzyme was overexpressed by adding ITPG to the medium at a concentration of 1 mM. The obtained biomass was separated by membrane microfiltration using a polyethersulfonate membrane with a cut-off of 0.2 µm. The concentrated cell suspension was cooled to 0-4 ° C and further processing was carried out at this temperature. Cells isolated from the medium were disintegrated by one of three methods: (1) cells were suspended in EDTA buffer, 1 mM dithiothreitol (DTT) was added to maintain the reducing environment and protease inhibitors (Roche or Sigma inhibitor cocktail), and sonicated using pulses 5-10 knot. and 20-40 sec gaps, (2) subjected to high pressure homogenization at 40-100 MPa, or (3) the cell suspension was subjected to triple freeze and thaw (-5 ° C / + 37 ° C). In all the techniques used, the principle of low temperature operation (<4 ° C) was followed.
Uzyskany surowy ekstrakt treści komórkowej poddawano następnie wirowaniu w celu usunięcia stałych fragmentów struktur komórkowych, uzyskując klarowny roztwór cytoplazmatyczny.The obtained crude extract of cellular content was then centrifuged to remove solid fragments of cellular structures, obtaining a clear cytoplasmic solution.
Z roztworu tego rekombinowane białka izoenzymu, z dołączoną na końcu N częścią fuzyjną złożoną sześciu histydyn (His-Tag), oczyszczono metodą chromatografii powinowactwa immobilizowanych jonów metali (IMAC, ang. immobilized metal affinity chromatography) na złożu zawierającym jony niklu związane z kwasem nitrylotrioctowym. Oczyszczanie prowadzono stosując bufor wiążący, do przemywania, oraz bufor elucyjny zawierające odpowiednio 20 mM, 100 mM i 300 mM imidazolu. Oczyszczone białko zagęszczano metodą ultrafiltracji krzyżowej na membranie polieterosulfonianowej 5 kDa, uzyskując w ten sposób roztwór oczyszczonego enzymu. Do roztworu dodawano 5% glycerol, 10% maltodekstryny, i 10 mg/l alfa-tokoferolu.From this solution, the recombinant isoenzyme proteins with the N-terminally attached six histidine (His-Tag) fusion portion were purified by immobilized metal affinity chromatography (IMAC) on a resin containing nickel ions bound to nitrilotriacetic acid. Purification was performed using a binding, washing buffer and an elution buffer containing 20 mM, 100 mM and 300 mM of imidazole, respectively. The purified protein was concentrated by cross ultrafiltration on a 5 kDa polyethersulfonate membrane, thus obtaining a purified enzyme solution. 5% glycerol, 10% maltodextrin, and 10 mg / L alpha-tocopherol were added to the solution.
Cytowana literaturaLiterature cited
a) Patentya) Patents
Emptage M., Haynie S., Laffend L., Pucci J., Whited G. Process for the biological production of 1,3-propanediol with high titer. CA 2733616 A1,22.02.2001.Emptage M., Haynie S., Laffend L., Pucci J., Whited G. Process for the biological production of 1,3-propanediol with high titer. CA 2733616 A1, 02.02.2001.
Zhilong Xiu, Chengwei Ma, Le Zhang, Jianying Dai. Recombined bacterial strain for modifying specificity of 1,3-propanediol redoxase coenzyme and application thereof. CN101643739 B, 10.02.2010.Zhilong Xiu, Chengwei Ma, Le Zhang, Jianying Dai. Recombined bacterial strain for modifying specificity of 1,3-propanediol redoxase coenzyme and application thereof. CN101643739 B, 10/02/2010.
Dehua Liu, Sheng Zhou, Jian Luo. Method for improving glycerol microbial fermentation production of 1,3-propanediol by constructing gene engineering bacterium. CN 102199570A, 28.09.2011.Dehua Liu, Sheng Zhou, Jian Luo. Method for improving glycerol microbial fermentation production of 1,3-propanediol by constructing gene engineering bacterium. CN 102199570A, 28/09/2011.
Qi Xianghui, Wang Fei, Deng Wenying, Lin Jing, Wang Xu, Zhu Jingfei, Luo Yan, Wang Liang, Sun Wenjing. 1,3-propylene glycol genetically engineered bacteria and method for producing 1,3propylene glycol by converting same. Patent CN 103789248 A, 14.05.2014.Qi Xianghui, Wang Fei, Deng Wenying, Lin Jing, Wang Xu, Zhu Jingfei, Luo Yan, Wang Liang, Sun Wenjing. 1,3-propylene glycol genetically engineered bacteria and method for producing 1.3propylene glycol by converting same. Patent CN 103789248 A, May 14, 2014.
Emptage M. Process for the biological production of 1,3-propanediol with high titer. EP 1 586 647 A1. 19.10.205.Emptage M. Process for the biological production of 1,3-propanediol with high titer. EP 1 586 647 A1. 19/10/205.
PL 235 422 B1PL 235 422 B1
Myeong Ch.G., Uk K.S., Hun PY. 1,3-propanediol oxidoreductase gene derived from microorganism to produce 1,3-propanediol oxidoreductase. KR20040104164, publ. 10.12.2004Myeong Ch.G., Uk K.S., Hun PY. 1,3-propanediol oxidoreductase gene derived from microorganism to produce 1,3-propanediol oxidoreductase. KR20040104164, publ. 12/10/2004
Hwan LS, Hoon OY, Geon JJ. Recombinant microorganisms producing 1,3-propanediol and the method for preparing 1,3-propanediol using the same. KR20140145397. 23.12.2014.Hwan LS, Hoon OY, Geon JJ. Recombinant microorganisms producing 1,3-propanediol and the method for preparing 1,3-propanediol using the same. KR20140145397. 23/12/2014.
Nakamura Ch.E. iinni. Method for the production of 1,3-propanediol by recombinant microorganisms. US6013,494, 11.01.2000.Nakamura Ch.E. and others. Method for the production of 1,3-propanediol by recombinant microorganisms. US6013,494,11.2000.
Dunn-Colemn N.S., Gatenby A.A., Valle F. Method for the production of 1,3-propanediol by recombinant organisms comprising genes for coenzyme B12 synthesis. US 7,074,608 B1. 11.07.2006.Dunn-Colemn N.S., Gatenby A.A., Valle F. Method for the production of 1,3-propanediol by recombinant organisms comprising genes for coenzyme B12 synthesis. US 7,074,608 B1. July 11, 2006.
Kim Ch-H., Seo J-W., Oh B.R., Heo S-Y., Seo M.Y., Choi M.H., Baek J-O., Seo P-S. Method of producing 1,3-propanediol using recombinant Klebsiella strain in which glycerol oxidative pathway has been blocked. US 8,338,148 B2. 24.12.2012.Kim Ch-H., Seo J-W., Oh B.R., Heo S-Y., Seo M.Y., Choi M.H., Baek J-O., Seo P-S. Method of producing 1,3-propanediol using recombinant Klebsiella strain in which glycerol oxidative pathway has been blocked. US 8,338,148 B2. 24/12/2012.
Yasuda S., Mukoyama M., Horikawa H., Toraya T. Morita H. Process for producing 1,3-propanediol and or/3-hydroxypropionic acid. US 2007/0148749 20 A1.28.07.2007.Yasuda S., Mukoyama M., Horikawa H., Toraya T. Morita H. Process for producing 1,3-propanediol and or / 3-hydroxypropionic acid. US 2007/0148749 20 A1.28.07.2007.
Eliot AC, Gatenby AA, Van DTK. Recombinant bacteria for producing glycerol and glycerol-derived products from sucrose. WO 2011069033A1.09.06.2011.Eliot AC, Gatenby AA, Van DTK. Recombinant bacteria for producing glycerol and glycerol-derived products from sucrose. WO 2011069033A1/09/06/2011.
Soucaille P. Process for the biological production of 1,3-propanediol from glycerol with high yield. US 8,236,994 B2. 07.08.2012.Soucaille P. Process for the biological production of 1,3-propanediol from glycerol with high yield. US 8,236,994 B2. 07/08/2012.
Hetenyi K., Nemeth A., Sevella B., Kovacs L., Bodnar Zs: Eljaras haszonnovenyek fermentacios felhasznalasara tejsav es szarmazekainak eloallitasa celjabol. Węgry P 1000061Hetenyi K., Nemeth A., Sevella B., Kovacs L., Bodnar Zs: Eljaras haszonnovenyek fermentacios felhasznalasara tejsav es szarmazekainak eloallitasa celjabol. Hungary P 1000061
Sevella B., Kupcsulik B., Nemeth A., Novak L., Poppe L., Dukai J., Nagy F. : Eljaras 1,3-propandiol eloallitasarabio transzformacioval. P 05 00961 (19.10.2005).Sevella B., Kupcsulik B., Nemeth A., Novak L., Poppe L., Dukai J., Nagy F.: Eljaras 1,3-propandiol eloallitasarabio transzformacioval. P 05 00961 (2005-10-19).
b) Publikacje naukoweb) Scientific publications
1. Abatemarco, J., Hill, A., Alper, H. S. (2013). Expanding the metabolic engineering toolbox with directed evolution. Biotechnology Journal, 8 (12), 1397-1410.1. Abatemarco, J., Hill, A., Alper, H. S. (2013). Expanding the metabolic engineering toolbox with directed evolution. Biotechnology Journal, 8 (12), 1397-1410.
2. Bottcher D., Bomscheuer U. T. (2010). Protein engineering of microbial enzymes. Current Opinion in Microbiology, 13 (3), 274-282.2. Bottcher D., Bomscheuer U. T. (2010). Protein engineering of microbial enzymes. Current Opinion in Microbiology, 13 (3), 274-282.
3. Chen, Z., Geng, F., Zeng, A. P. (2014). Protein design and engineering of a de novo pathway for microbial production of 1,3-propanediol from glucose. Biotechnology journal, 10 (2), 284289.3. Chen, Z., Geng, F., Zeng, A. P. (2014). Protein design and engineering of a de novo pathway for microbial production of 1,3-propanediol from glucose. Biotechnology journal, 10 (2), 284289.
4. Cherry J. R., Fidantsef A. L. (2003). Directed evolution of industrial enzymes: an update. Current Opinion in Biotechnology 14 (4), 438-443.4. Cherry J. R., Fidantsef A. L. (2003). Directed evolution of industrial enzymes: an update. Current Opinion in Biotechnology 14 (4), 438-443.
5. Dalby, P. A. (2011). Strategy and success for the directed evolution of enzymes. Current Opinion in Structural Biology 21 (4), 473-480.5. Dalby, P. A. (2011). Strategy and success for the directed evolution of enzymes. Current Opinion in Structural Biology 21 (4), 473-480.
6. Fenghuan, W., Huijin, Q., He, H., Tan, T. (2005). High-level expression of the 1,3-propanediol oxidoreductase from Klebsiella pneumoniae in Escherichia coli. Molecular Biotechnology, 31 (3), 211-219.6. Fenghuan, W., Huijin, Q., He, H., Tan, T. (2005). High-level expression of the 1,3-propanediol oxidoreductase from Klebsiella pneumoniae in Escherichia coli. Molecular Biotechnology, 31 (3), 211-219.
7. Gonzalez-Pajuelo, M., Meynial-Salles, F, Mendes, I., Andrade, J. C., Vasconcelos, L, Soucaille, P. (2005). Metabolic engineering of Clostridium acetobutylicum for the industrial production of 1,3-propanediol from glycerol. Metabolic Engineering, 7 (5), 329-336.7. Gonzalez-Pajuelo, M., Meynial-Salles, F, Mendes, I., Andrade, J. C., Vasconcelos, L, Soucaille, P. (2005). Metabolic engineering of Clostridium acetobutylicum for the industrial production of 1,3-propanediol from glycerol. Metabolic Engineering, 7 (5), 329-336.
8. Huang, Y., Li, Z., Shimizu, K., Ye, Q. (2012). Simultaneous production of 3-hydroxypropionic acid and 1,3-propanediol from glycerol by a recombinant strain of Klebsiella pneumoniae. Bioresource technology, 103 (1), 351-359.8. Huang, Y., Li, Z., Shimizu, K., Ye, Q. (2012). Simultaneous production of 3-hydroxypropionic acid and 1,3-propanediol from glycerol by a recombinant strain of Klebsiella pneumoniae. Bioresource technology, 103 (1), 351-359.
9. Kaur, G., Srivastava, A. K., Chand, S. (2012). Advances in biotechnological production of 1,3-propanediol. Biochemical Engineering Journal, 64, 106-118.9. Kaur, G., Srivastava, A. K., Chand, S. (2012). Advances in biotechnological production of 1,3-propanediol. Biochemical Engineering Journal, 64, 106-118.
10. Nakamura Ch.E., Whited G.M. (2003) Metabolic engineering for the microbial production of 1,3-propanediol. Current Opinion in Biotechnology 14: 454-459.10. Nakamura Ch.E., Whited G.M. (2003) Metabolic engineering for the microbial production of 1,3-propanediol. Current Opinion in Biotechnology 14: 454-459.
11. Przystałowska H., Lipiński D., Słomski R. (2015) Biotechnological conversion of glicerol from biofuels to 1,3-propanediol using Escherichia coli. Acta Biochimica Polonica. 62(1): 23-34.11. Przystałowska H., Lipiński D., Słomski R. (2015) Biotechnological conversion of glycerol from biofuels to 1,3-propanediol using Escherichia coli. Acta Biochimica Polonica. 62 (1): 23-34.
PL 235 422 B1PL 235 422 B1
12. Tang X., Tan Y., Zhu H., Zhao K., Shen W. (2009). Microbial conversion of glycerol to 1,3-propanediol by an engineered strain of Escherichia coli. Applied and Environmental Microbiology 75(6): 1628-1634.12. Tang X., Tan Y., Zhu H., Zhao K., Shen W. (2009). Microbial conversion of glycerol to 1,3-propanediol by an engineered strain of Escherichia coli. Applied and Environmental Microbiology 75 (6): 1628-1634.
13. Zhang X., Li Y., Zhuge B., Tang X., Shen W., Rao Z., Fang H., Zhuge J. (2006). Construction of a novel recombinant Escherichia coli strain capable of producing 1,3-propanediol and optimization of fermentation parameters by statistical design. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 22: 945-952.13. Zhang X., Li Y., Zhuge B., Tang X., Shen W., Rao Z., Fang H., Zhuge J. (2006). Construction of a novel recombinant Escherichia coli strain capable of producing 1,3-propanediol and optimization of fermentation parameters by statistical design. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 22: 945-952.
14. Nemeth A., Balassy A., Sevella B. 2008. Difficulties and solutions for the assays of the key enzymes of a new enzymatic glycerol bioconversion. Periodica Polytechnika 52(1): 17-22.14. Nemeth A., Balassy A., Sevella B. 2008. Difficulties and solutions for the assays of the key enzymes of a new enzymatic glycerol bioconversion. Periodica Polytechnika 52 (1): 17-22.
15. Balassy A., Nemeth A., Sevella B. (2009) Immobilized enzymes aviability for glycerol 1,3-propanediol bioconversion. Hungarian Journal of industrial Chemistry VESZPREM, 37(2):83-88.15. Balassy A., Nemeth A., Sevella B. (2009) Immobilized enzymes aviability for glycerol 1,3-propanediol bioconversion. Hungarian Journal of industrial Chemistry VESZPREM, 37 (2): 83-88.
Claims (17)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL414372A PL235422B1 (en) | 2015-10-14 | 2015-10-14 | Method for increasing catalytic activity of 1,3-propanediol oxidoreductase enzyme, microorganism able to produce mutated oxidoreductase, method for producing the enzyme and application |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL414372A PL235422B1 (en) | 2015-10-14 | 2015-10-14 | Method for increasing catalytic activity of 1,3-propanediol oxidoreductase enzyme, microorganism able to produce mutated oxidoreductase, method for producing the enzyme and application |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL414372A1 PL414372A1 (en) | 2017-04-24 |
| PL235422B1 true PL235422B1 (en) | 2020-07-27 |
Family
ID=58672032
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL414372A PL235422B1 (en) | 2015-10-14 | 2015-10-14 | Method for increasing catalytic activity of 1,3-propanediol oxidoreductase enzyme, microorganism able to produce mutated oxidoreductase, method for producing the enzyme and application |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| PL (1) | PL235422B1 (en) |
-
2015
- 2015-10-14 PL PL414372A patent/PL235422B1/en unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL414372A1 (en) | 2017-04-24 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP5315232B2 (en) | Fermentation of 4-carbon alcohol | |
| Tang et al. | Microbial conversion of glycerol to 1, 3-propanediol by an engineered strain of Escherichia coli | |
| ES2491093T3 (en) | Fermentative production of four-carbon alcohols | |
| EP2222841B1 (en) | Ketol-acid reductoisomerase using nadh | |
| EP3325608B1 (en) | Methods and microorganisms for the production of 1,3-butanediol | |
| Yun et al. | Production of 1, 3-propanediol using a novel 1, 3-propanediol dehydrogenase from isolated Clostridium butyricum and co-biotransformation of whole cells | |
| US20150218594A1 (en) | Cell-free and minimized metabolic reaction cascades for the production of chemicals | |
| Celińska et al. | Genetic engineering to improve 1, 3-propanediol production in an isolated Citrobacter freundii strain | |
| CN109609426B (en) | Method for producing 1, 3-propylene glycol by using methanol/formaldehyde and glucose as cosubstrates | |
| Kim et al. | Biosynthesis of D‐xylulose 5‐phosphate from D‐xylose and polyphosphate through a minimized two‐enzyme cascade | |
| WO2001021825A2 (en) | Novel enzymes which dehydrate glycerol | |
| CN106559997A (en) | New microbe and method for 1,2 propane diols of production is supplied based on NADPH dependent form pyruvic alcohol reductases and improved NADPH | |
| Tan et al. | Biosynthesis of optically pure chiral alcohols by a substrate coupled and biphasic system with a short-chain dehydrogenase from Streptomyces griseus | |
| Maervoet et al. | 1, 3-propanediol production with Citrobacter werkmanii DSM17579: effect of a dhaD knock-out | |
| Matsakas et al. | New trends in microbial production of 3-hydroxypropionic acid | |
| US20200181652A1 (en) | Conversion of methylglyoxal into hydroxyacetone using novel enzymes and applications thereof | |
| WO2018100097A1 (en) | Alcohol acetyl transferases for ethyl acetate production | |
| Qi et al. | Molecular cloning, co-expression, and characterization of glycerol dehydratase and 1, 3-propanediol dehydrogenase from Citrobacter freundii | |
| Radoš et al. | Stereospecificity of Corynebacterium glutamicum 2, 3-butanediol dehydrogenase and implications for the stereochemical purity of bioproduced 2, 3-butanediol | |
| PL235422B1 (en) | Method for increasing catalytic activity of 1,3-propanediol oxidoreductase enzyme, microorganism able to produce mutated oxidoreductase, method for producing the enzyme and application | |
| Rho et al. | Cofactor regeneration using permeabilized Escherichia coli expressing NAD (P)+-dependent glycerol-3-phosphate dehydrogenase | |
| Han et al. | Cloning and functional characterization of xylitol dehydrogenase genes from Issatchenkia orientalis and Torulaspora delbrueckii | |
| KR101886186B1 (en) | A recombinat organism enhanced furfural tolerance and method for production of isobutanol using the same | |
| WO2018099719A1 (en) | Alcohol acetyl transferases for alkyl alkanoate production | |
| Uria et al. | Alcohol dehydrogenases from marine hyperthermophilic microorganisms and their importance to the pharmaceutical industry |