PL201879B1

PL201879B1 - Białko hybrydowe i jego zastosowanie

Info

Publication number: PL201879B1
Application number: PL344752A
Authority: PL
Inventors: Hans Bigalke; Jürgen FREVERT
Original assignee: Biotecon Ges Fuer Biotechnologische Entwicklung & Consulting Mbh
Priority date: 1998-05-13
Filing date: 1999-05-12
Publication date: 2009-05-29
Also published as: MXPA00011148A; CZ20004161A3; CN1241945C; WO1999058571A3; DE59903410D1; DK1084146T3; EP1084146A2; WO1999058571A2; NO20005637L; CU22997A3; PL344752A1; HUP0103601A3; ATE227739T1; IL139478A; BR9910359A; HUP0103601A2; HK1036994A1; AU4260599A; PT1084146E; JP2002514659A

Abstract

Wynalazek dotyczy bia lka hybrydowego, sk ladaj acego si e z (i) bia lka, które wiaze si e z komór- kami tucznymi i/lub granulocytami zasadoch lonnymi i/lub jest wch laniane przez te komórki, oraz (ii) proteazy, która rozszczepia jedno lub wi eksz a liczb e bia lek aparatu wydzielniczego komórek tucznych i/lub granulocytów zasadoch lonnych. Wynalazek dotyczy równie z zastosowania tego bia lka hybrydo- wego do wytwarzania leku do hamowania degranulacji komórek tucznych. PL PL PL PL

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest białko hybrydowe i jego zastosowanie.

Natychmiastowe reakcje alergiczne charakteryzują się tym, że dotknięci nimi pacjenci mają wytworzone przeciwciała typu IgE przeciw alergenom (np. pyłkom, kurzowi domowemu, roztoczom, sierści zwierząt). Przeciwciała te krążą nie tylko we krwi, ale są także związane z komórkami obecnymi w tkankach, zawierają cymi w bł onie komórkowej specyficzny receptor dla części czą steczki IgE, fragment Fc (Fishman i Lorberboum-Galski 1997; Hamawy 1997). Komórkami z receptorami dla IgE są wyłącznie komórki tuczne i granulocyty zasadochłonne. Komórki te są komórkami, w których zachodzi reakcja alergiczna typu wczesnego. Przechowują one pęcherzyki zawierające naczyniowoczynne aminy, prostaglandyny i leukotrieny (pochodne kwasu arachidonowego). Uwolnienie tych substancji, powodujące degranulację komórek tucznych, zachodzi na drodze specyficznego i niespecyficznego mechanizmu. Gdy komórki są zniszczone mechanicznie, np. przez zadrapanie skóry, histamina jest uwalniana niespecyficznie. Wokół rany skóra staje się czerwona. Powstają podrażnienia (obrzęki) i skóra swędzi (potrójna odpowiedź). Substancje uwalniające specyficznie histaminę są skuteczne w stosunkowo niskim stężeniu i wyzwalają następującą kaskadę odpowiedzi (kaskadę sygnałową ): aktywacja fosfolipazy C - tworzenie wtórnych przekaźników „diacyloglicerolu” i „IP3” - uruchomienie wapnia z magazynów wewnątrzkomórkowych - fuzja ziarenek z błoną komórkową - egzocytoza ziarenek bez cytolizy - wymiana sodu na dodatnio naładowaną histaminę w kompleksie z heparyną i zasadowym białkiem - uwolnienie histaminy z macierzy ziarenek. Gdy zaistnieje kontakt pomiędzy komórkami tucznymi alergika i alergenem, cząsteczki IgE na powierzchni komórek wiążą ten alergen. Gdy cząsteczki alergenu są związane w wystarczającej ilości, zachodzi skupianie się receptorów w błonie komórkowej. Skupianie się jest specyficznym bodźcem do wywołania opisanej powyżej kaskady sygnałowej we wnętrzu komórki. Uwalniane substancje wywołują objawy alergiczne (zapalenie spojówek, zapalenie śluzówki nosa, astmę, obrzęk krtani, pokrzywkę, spadek ciśnienia krwi aż do wyraźnego wstrząsu anafilaktycznego). Peptydy zawarte w toksynie pszczół, takie jak peptyd degranulujący komórki tuczne (MCD), także wywołują degranulację komórek tucznych. Ponadto niektóre środki lecznicze wywołują specyficzne uwolnienie histaminy jako niepożądany efekt. Uwalnianie histaminy u ludzi opisano dla środków rozluźniających mięśnie, dekstranów, kwasu acetylosalicylowego (aspiryny), morfiny, antybiotyków, środków kontrastujących w radiografii, obcych surowic itd.

Jeżeli fuzja pęcherzyków z błoną komórkową jest skutecznie hamowana, nie występuje uwalnianie amin i pochodnych kwasu arachidonowego. Zatem nie jest wywoływana reakcja alergiczna. Kilka białek (białek fuzyjnych) jest związanych z procesami odpowiednio wydzielania i uwalniania, przy czym białka te mogą być związane z błonami pęcherzyków wydzielniczych i/lub z błoną komórkową. Podobnie mogą one występować w cytozolu. Przykładami takich białek są odpowiednio SNAP 25, synaptobrewina (VAMP), syntaksyna oraz jej izoformy. Białka te tworzą kompleks (kompleks fuzyjny) mocujący pęcherzyki wydzielnicze do wewnętrznej strony błony komórkowej. Umocowanie poprzedza fuzję pęcherzyków z błoną komórkową, przy czym ta fuzja jest wywoływana przez dopływ Ca⁺⁺ wyzwalany przez IgE. W wyniku inaktywacji jednego z tych białek, np. przez rozkład proteolityczny, następuje zahamowane tworzenie kompleksu.

Wiadomo, że wymienione białka fuzyjne są cząsteczkami docelowymi (substratami) lekkich łańcuchów neurotoksyn wytwarzanych przez laseczkę Clostridium botulinum w komórkach nerwowych (Ahnert-Hilger i Bigalke, 1995; Bigalke 1999 w druku). Jak dotychczas znanych jest siedem różnych typów toksyn jadu kiełbasianego (A, B, C1, D, E, F i G). Ponadto wspomniana synaptobrewina jest cząsteczką docelową dla TeNT (Link i inni, 1993) wytwarzanej przez Clostridium tetani, a także dla proteazy z Neisseria gonorrhoeae (Binscheck i inni, 1995). Toksyny, z wyjątkiem ostatniej, zawierają co najmniej dwie domeny funkcyjne. C-końcowa część białka (ciężki łańcuch) odpowiada za wiązanie jej z komórką nerwową, podczas gdy N-końcowa (lekki łańcuch) cechuje się opisaną powyżej wysoce specyficzną aktywnością proteolityczną. Toksyny wiążą się z komórkami nerwowymi poprzez swój ciężki łańcuch i docierają do cytozolu przez endocytozę z udziałem receptora, oraz następujące po niej przemieszczenie, gdzie rozszczepiają one jedno lub większą liczbę wspomnianych białek fuzyjnych, będących z kolei składnikami kompleksu fuzyjnego. Po rozszczepieniu odpowiedniego białka, hamowane jest wydzielenie odpowiednio acetylocholiny lub innych przekaźników z komórek nerwowych (Binscheck i Wellhoner, 1997).

Hamowanie uwalniania przekaźników stosowano terapeutycznie w przeszłości w leczeniu dystonicznych zaburzeń ruchowych oraz tłumieniu nadmiernej aktywności przywspółczulnej (Benecke

PL 201 879 B1 i Kessler, 1995). Dla neurotoksyn laseczkowych nie są znane biologiczne substraty inne niż biał ka fuzyjne. Ciężkie łańcuchy mają wysokie powinowactwo do komórek nerwów obwodowych, tak że związane z nimi lekkie łańcuchy docierają tylko do tych komórek i stają się skuteczne tylko w tych komórkach - inne typy komórek, takie jak komórki tuczne i granulocyty zasadochłonne, w których zachodzą procesy wydzielnicze, mają wspomniane powyżej substraty, jednak nie mają mechanizmu wchłaniania proteazy (Marxen i inni, 1989).

Wynalazek dotyczy białka hybrydowego, składającego się z (i) białka, które wiąże się z komórkami tucznymi i/lub granulocytami zasadochłonnymi i/lub jest wchłaniane przez te komórki, oraz (ii) proteazy, która rozszczepia jedno lub większą liczbę białek aparatu wydzielniczego komórek tucznych i/lub granulocytów zasadochłonnych.

Wynalazek dotyczy również białka hybrydowego, składającego się z (i) białka, które wiążą się z komórkami tucznymi i/lub granulocytami zasadochłonnymi i/lub jest wchłaniane przez te komórki, które to białko (i) jest wybrane z grupy obejmującej:

IgE;

fragment IgE, w szczególności fragment Fc IgE;

przeciwciało przeciw receptorowi IgE komórek tucznych i/lub granulocytów zasadochłonnych; fragment przeciwciała przeciw receptorowi IgE komórek tucznych i/lub granulocytów zasadochłonnych, w szczególności fragment Fab; przeciwciało przeciw specyficznemu dla komórek tucznych kanałowi potasowemu; oraz nieaktywny, ale wiążący peptyd MCD; oraz (ii) proteazy rozszczepiającej jedno lub większą liczbę białek aparatu wydzielniczego komórek tucznych i/lub granulocytów zasadochłonnych.

Wynalazek dotyczy także białka hybrydowego, składającego się z (i) białka, które wiąże się z komórkami tucznymi i/lub granulocytami zasadochłonnymi i/lub jest wchłaniane przez te komórki, oraz (ii) proteazy rozszczepiającej jedno lub większą liczbę białek aparatu wydzielniczego komórek tucznych i/lub granulocytów zasadochłonnych, przy czym proteaza (ii) jest wybrana z grupy obejmującej:

lekki łańcuch toksyny Clostridium botulinum, w szczególności toksyn typu A, B, C1, D, E, F oraz G; katalitycznie aktywny fragment lekkiego łańcucha toksyny Clostridium botulinum, w szczególności toksyny typu A, B, C1, D, E, F oraz G; lekki łańcuch toksyny tężca (TeNT); katalitycznie aktywny fragment lekkiego łańcucha toksyny tężca; proteazę IgA z Neisseria gonorrhoeae; oraz katalityczną domenę proteazy IgA z Neisseria gonorrhoeae.

Korzystnie białko (i) i proteaza (ii) są wybrane z grup określonych powyżej.

Korzystnie N-końcowa część ciężkiego łańcucha odpowiedniej toksyny (fragment HN) lub jej fragment może stanowić część białka hybrydowego, oprócz lekkiego łańcucha toksyny Clostridium botulinum lub toksyny tężca.

Wynalazek dotyczy ponadto zastosowania białka hybrydowego zdefiniowanego powyżej do wytwarzania leku do hamowania degranulacji komórek tucznych.

Gdyby komórki tuczne zostały zabite, istniałoby niebezpieczeństwo, że zostanie wywołany szok alergiczny, gdy umierające komórki tuczne uwolnią zmagazynowane endogenne aminy. Ponadto spadek liczby komórek tucznych będzie stymulował syntezę de novo tych komórek, które, z kolei znowu będą dostępne do reakcji alergicznych. Zatem białko hybrydowe według wynalazku zasadniczo różni się od koniugatu IgE-Fc/egzotoksyna pseudomonas, hamującego syntezę białek przez aktywność rybozylacji ADP, a tym samym wywołującego śmierć komórki (Fishman i Lorberboum-Galski, 1997). W przeciwień stwie do tego, biał ko hybrydowe wedł ug wynalazku nie sł u ż y do zabijania komórek tucznych. Komórka pozostaje raczej żywotna po wystawieniu jej na działanie białka hybrydowego według wynalazku i traci jedynie swoją zdolność do uwalniania amin zwężających naczynia.

Nie następuje stymulacja syntezy de novo. Przy stosowaniu terapeutycznym unika się możliwych toksycznych skutków ubocznych, oczekiwanych przy stosowaniu koniugatu opartego na całkowitej cytotoksycznej toksynie pseudomonas lub porównywalnej cytotoksynie.

Zgodnie z wynalazkiem można stosować koniugat (białko hybrydowe) składający się z (i) białka lub peptydu (transportującego białka/peptydu) wykazującego wysokie powinowactwo do komórek

PL 201 879 B1 tucznych/granulocytów zasadochłonnych oraz (ii) specyficznej proteazy, który to koniugat blokuje odpowiednio degranulację oraz mechanizm wydzielniczy komórek.

Koniugat znajduje zastosowanie w terapii/profilaktyce reakcji alergicznych typu wczesnego.

(i) Korzystnymi składnikami koniugatów o wysokim powinowactwie do komórek tucznych są odpowiednio immunoglobuliny typu E (IgE) oraz ich fragmenty (np. fragment Fc). Ponadto stosuje się przeciwciała przeciw specyficznym cząsteczkom powierzchniowym komórek tucznych/granulocytów zasadochłonnych, które to przeciwciała wybiórczo wiążą się z błoną komórkową takich komórek. Taką rolę spełniają przede wszystkim przeciwciała przeciw receptorowi IgE. Ponadto nieaktywne, ale wiążące mutanty peptydu degranulującego komórki tuczne można stosować jako białka/peptydy transportujące w białku hybrydowym. Te transportujące białka/peptydy służą do wprowadzania proteazy do komórki. Ta proteaza rozszczepia białka w kompleksie fuzyjnym komórek tucznych w wysoce specyficzny sposób, które to białka inicjują mechanizm degranulacji komórek.

(ii) Jako wysoce specyficzna proteaza znajduje zastosowanie metaloproteaza, np. lekki łańcuch toksyny jadu kiełbasianego typu A, B, C1, D, E, F lub G (BoNT/X) oraz toksyny tężca (TeNT) lub proteaza IgA z Neisseria gonorrhoeae. Te proteazy rozszczepiają białko związane z synaptosomem (MR 25000) (SNAP 25), synaptobrewinę lub syntaksynę. Jeżeli tylko jedno z tych białek/peptydów ulega rozszczepieniu, hamowana jest degranulacja komórek tucznych. W wyniku tego nie zachodzi wydzielanie histaminy, prostaglandyn i leukotrienów i objawy alergiczne nie mogą już wystąpić.

Zgodnie z wynalazkiem nietoksyczne lekkie łańcuchy toksyn mogą być dołączone do transportujących białek wiążących się wyłącznie odpowiednio z komórkami tucznymi i granulocytami zasadochłonnymi, a zatem mogą być pobrane przez te komórki, dzięki czemu lekkie łańcuchy - gdy są transportowane jako białka przenoszone - docierają do komórek. Nie mogą one dokonywać inwazji w komórkach nerwowych oraz innych typach komórek organizmu, a zatem działanie jest ograniczone do komórek tucznych i granulocytów zasadochłonnych. Jeżeli jeden z substratów jest rozkładany proteolitycznie, nie występują objawy alergiczne będące wynikiem kontaktu tych obciążonych IgE komórek z alergenem lub jednym z wyżej wymienionych środków farmaceutycznych.

Jako białka specyficznie wiążące się z komórkami tucznymi stosuje się:

1) immunoglobuliny typu E oraz ich fragmenty typu Fc;

2) przeciwciała przeciw receptorowi IgE;

3) peptyd degranulujący komórki tuczne; oraz

4) przeciwciało przeciw specyficznemu dla komórek tucznych kanałowi potasowemu.

W odniesieniu do wymienionych biał ek przytacza się nastę pują ce pozycje literaturowe:

- IgE Helman (1995)

- fragment IgE-Fc Helman (1995)

- przeciwciał a przeciw receptorowi IgE komórek tucznych/granulocytów zasadochł onnych, przeciwciała przeciw specyficznemu dla komórek tucznych kanałowi potasowemu, fragment Fab przeciwciała: opisano standardowe sposoby w

Liddel i Weeks (1995)

- peptydy MCD Gmachel i Krell (1995)

- nieaktywny, ale wiążący mutant zmutowany peptyd wytwarza się standardowym sposobem:

Nichol D.S.T. (1995)

- lekkie łańcuchy toksyn jadu kiełbasianego typów A-G:

Binz i inni (1990)

- lekki ł a ń cuch toksyny tężca Eisel i inni (1989)

- proteaza IgA Bruscheck i inni (1995)

Połączenie obu składników (białka transportującego i proteazy) zachodzi różnymi drogami. Najpierw lekki łańcuch toksyny oczyszcza się chromatograficznie. Lekki łańcuch jest całkowicie nietoksyczny, gdyż po oddzieleniu od ciężkiego łańcucha, neurotropowego białka transportującego, nie może on dotrzeć do komórek nerwowych, a zewnątrzkomórkowy substrat nie istnieje. Następnie lekki łańcuch wiąże się chemicznie z jednym z czterech białek wiążących komórki tuczne z wytworzeniem koniugatu, który z kolei przyjmowany jest przez cytozol komórek tucznych. Lekki łańcuch rozszczepia tam swój substrat, przy czym rozszczepianie hamuje wydzielanie histaminy i innych substancji. Drugą drogą wytworzenia koniugatu jest fuzja genu lekkiego łańcucha i genu jednego z czterech białek wiążących komórki tuczne, tak że białko hybrydowe jest eksprymowane w odpowiednich komórkach

PL 201 879 B1 gospodarzach. To biotechnologicznie wytwarzane białko hybrydowe powinno blokować procesy wydzielnicze komórek tucznych analogicznie do koniugatu wytwarzanego z dwóch składników białkowych.

Białka hybrydowe wytwarza się znanym sposobem, szczególnie w dziedzinie leczenia nowotworów (Vogel C.W., 1987; Magerstadt M., 1991). W tej koncepcji terapeutycznej przeciwciała przeciw białkom powierzchniowym komórek rakowych dołącza się do białka cytotoksycznego, np. rycyny, toksyny błonicy, w celu zabicia komórek rakowych. Nowym rozwiązaniem zgodnie z wynalazkiem jest zastosowanie odpowiednio specyficznych proteaz i domen proteolitycznych w białkach hybrydowych do hamowania degranulacji komórek tucznych, a zatem do terapii przeciwalergicznej. Te białka hybrydowe można stosować nie tylko do zapobiegania ciężko osłabiającym objawom alergicznym (gorączka sienna, astma oraz atopowe zapalenie skóry). Można je podawać profilaktycznie w celu zapobiegania reakcjom alergicznym podczas stosowania środków leczniczych ratujących życie. Ponadto mogą one zapobiec objawom alergicznym występującym podczas odczulania.

P r z y k ł a d 1. Synteza białka hybrydowego z IgE i lekkiego łańcucha BoNT/A

Oczyszczoną toksynę jadu kiełbasianego (5,0 mg) typu A wprowadzono, po zrównoważeniu w 15 mM tetraboranie sodu i 30 mM fosforanie o pH 8,4, do kolumny QAE Sephadex (1,0 x 3,0 cm), zrównoważonej tym samym buforem. Następnie kolumnę przemyto 10 ml 120 mM ditioerytrolu, 2 M mocznika i 1 mM EDTA i inkubowano przez noc. Lekki łańcuch wymyto z kolumny z użyciem 10 mM buforu boranowego i dializowano względem 20 mM fosforanu o pH 7,0.

Immunoglobulinę E (szczurzą) zakupiono. Porcję 10 mg immunoglobuliny rozszczepiono z użyciem 50 μg papainy w 1 ml buforu fosforanowego (4°C przez noc). Fragment Fc oczyszczono w kolumnie do filtracji żelowej (Sephacryl S200). Oczyszczony fragment Fc w ilości 3,0 mg inkubowano z 3,0 mg oczyszczonego lekkiego łańcucha toksyny jadu kiełbasianego, z 10 mM propionianem ditiobissukcynimidylu (środek dwufunkcyjny) w 2 ml fosforanu sodu, pH 7,0, przez okres 16 godzin. Tak zsyntetyzowane białko hybrydowe oczyszczono przez filtrację żelową (Sephacryl S200) i zanalizowano pod względem czystości metodą elektroforezy w żelu zawierającym SDS.

Hamowanie degranulacji komórek tucznych badano dwiema różnymi metodami doświadczalnymi. W pierwszej metodzie doświadczalnej wyizolowane komórki tuczne szczura inkubowano z cząsteczką hybrydową. Następnie stymulowano uwalnianie histaminy. Stymulacja zachodzi odpowiednio przez specyficzne związki uwalniające histaminę, takie jak peptyd MCD i konkanawalina A (z których druga jest stosowaną doświadczalnie substancją) oraz przez bezpośrednie zwiększanie wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia. Ostatnią z możliwości osiąga się wstrzykując wapń do oddzielnych komórek tucznych. Zwiera się w ten sposób opisaną powyżej kaskadę sygnałową, gdyż wzrost stężenia wapnia jest tym etapem procesów wydzielniczych, po którym zachodzi fuzja pęcherzyków. Degranulację komórek tucznych, pociągającą za sobą uwolnienie histaminy, można śledzić za pomocą mikroskopu z kontrastem fazowym. Następnie można ilościowo oznaczyć uwolnioną histaminę na podstawie pomiarów fluorescencji. Ponadto powiększenie komórek tucznych, spowodowane włączeniem błon pęcherzyków do błony komórkowej podczas degranulacji, można określić elektrofizjologicznie. W komórkach poddanych działaniu białka hybrydowego zaobserwuje się, w odróżnieniu od komórek kontrolnych, (1) brak zmian morfologicznych, (2) brak nasilenia fluorescencji w supernatancie komórki oraz (3) brak powiększenia komórki. Można w ten sposób potwierdzić, że uwalnianie histaminy jest blokowane przez białko hybrydowe.

W drugiej metodzie doświadczalnej białko hybrydowe wstrzykiwano żywym szczurom. Szczury uśmiercano po kilku dniach i w standardowy sposób izolowano ich komórki tuczne. Degranulację i uwalnianie histaminy określano odpowiednio w sposób opisany powyżej. W tej metodzie badano, czy koniugat potrafi dotrzeć do kompartmentu także w żywym zwierzęciu, w którym to kompartmencie zlokalizowane są komórki tuczne, oraz czy koniugat inaktywuje komórki tuczne w żywym zwierzęciu.

P r z y k ł a d 2. Wytwarzanie zrekombinowanego białka hybrydowego przez funkcyjne połączenie genu kodującego lekki łańcuch Clostridium botulinum typu A odpowiednio z genem kodującym immunoglobulinę E oraz z jednym z jego fragmentów (fragmentem Fc)

Gen kodujący lekki łańcuch toksyny jadu kiełbasianego typu A wyizolowano z użyciem odpowiednich starterów drogą PCR (reakcji łańcuchowej polimerazy). Przygotowano hodowlę Clostridium botulinum typu A, z której wyodrębniono DNA. Z opublikowanej sekwencji genu toksyny (Binz i inni) wyprowadzono parę starterów i gen lekkiej podjednostki zamplifikowano drogą PCR. Następnie ten gen wkolonowano do dostępnego w handlu wektora ekspresyjnego pQE, zgodnie z zaleceniami producenta.

PL 201 879 B1

Gen kodujący fragment Fc ludzkiej immunoglobuliny E (Helman L.) wyizolowano drogą PCR z dostępnej w handlu biblioteki cDNA i poddano fuzji w konstrukcie wektorowym z lekkim łańcuchem toksyny jadu kiełbasianego typu A.

Tym konstruktem stransformowano kompetentne komórki M15 (E. coli). Ze względu na to, że w tym układzie ekspresyjnym wstawione geny są wyposażone w „znacznik his”, zrekombinowane białko oczyszczano w kolumnie o powinowactwie do Ni. Oczyszczanie w celu otrzymania białka o dużej czystości przeprowadzono metodą filtracji żelowej na Sephacryl S300.

Pomiary aktywności biologicznej wykonano ponownie na izolowanych komórkach tucznych in vitro.

P r z y k ł a d 3. Wytwarzanie zrekombinowanego białka hybrydowego przez funkcyjne połączenie genu kodującego podjednostkę lekką toksyny tężca ze zmutowanym genem kodującym peptyd degranulujący komórki tuczne (MCD)

Znana jest sekwencja „peptydu degranulującego komórki tuczne”, o 22 merach (Gmachl, M., i Kreil, G.). W oparciu o ni ą zsyntetyzowano odpowiedni peptyd.

W celu wyizolowania sekwencji lekkiej podjednostki toksyny tężca przygotowano hodowlę C. tetani i otrzymano z niej DNA. Dla znanej sekwencji kwasu nukleinowego toksyny tężca otrzymano starter do PCR, a tym samym gen lekkiej podjednostki toksyny.

Tak jak opisano w przykładzie 1, obie sekwencje kwasów nukleinowych zfuzowano w wektorze ekspresyjnym pQU, a następnie wyeksprymowano w E. coli. Białko hybrydowe, które z kolei zawierało znacznik his, oczyszczono metodą chromatografii powinowactwa, a następnie filtracji żelowej. Oczyszczony gen kodujący peptyd degranulujący komórki tuczne zsyntetyzowano chemicznie tak, by zawierał on punktową mutację w aktywnej domenie peptydu. Gen połączono funkcyjnie z genem kodującym lekki łańcuch toksyny tężca. Białko hybrydowe wyeksprymowano w E. coli i oczyszczono. Wytworzone w ten sposób biał ko hybrydowe badano in vitro w teście degranulacji komórek tucznych.

P r z y k ł a d 4. Wytwarzanie zrekombinowanego biał ka hybrydowego przez połączenie genu kodującego fragment Fc IgE z genem kodującym proteazę IgA

Gen kodujący fragment Fc IgE wyizolowano w sposób opisany w przykładzie 1.

Gen kodujący proteazę IgA z N. gonorrhoeae jest znany. Wyprowadzono z niego startery, a gen kodujący specyficzną proteazę uzyskano drogą PCR z preparatu kwasu nukleinowego z N. gonorrhoeae.

Oba kwasy nukleinowe połączono w dostępnym w handlu wektorze, zgodnie z zaleceniami producenta, a białko hybrydowe oczyszczono metodą chromatografii powinowactwa (patrz przykład 2).

Aktywność hamowania ponownie potwierdzono in vitro na izolowanych komórkach tucznych (patrz powyżej).

P r z y k ł a d 5. Wytwarzanie białka hybrydowego zawierającego fragment Fab przeciwciała przeciw receptorowi IgE oraz lekki łańcuch toksyny jadu kiełbasianego typu B

Zakupiono przeciwciało monoklonalne przeciw receptorowi IgE na komórkach tucznych i dokładniej oczyszczono je chromatograficznie. Przeciwciało w ilości 0,5 mg skoniugowano z 0,4 g oczyszczonego lekkiego łańcucha toksyny jadu kiełbasianego F. Lekką podjednostkę wyizolowano przez rozszczepienie neurotoksyny, a następnie oczyszczanie metodą chromatografii jonowymiennej, przy czym neurotoksynę wytworzono sposobem opisanym w przykładzie 1.

Oba białka (lekką podjednostkę toksyny typu F oraz przeciwciało monoklonalne) połączono ze sobą z użyciem środka dwufunkcyjnego. W tym celu wyizolowane białka inkubowano z 10 mM estrem maleimidobenzoilo-N-hydroksysukcynimidu. Następnie białko hybrydowe oczyszczono od białek nie będących koniugatami metodą filtracji żelowej na Sephacryl S300.

Ponownie wyizolowane komórki tuczne zastosowano do wykazania, że zsyntetyzowane białko hybrydowe hamowało wydzielanie histaminy.

Odniesienia do innych opisów patentowych

Patent nr 4902495

IgE Fc directed delivery systems

Novel Agent Controlling Cell Activity

Zgłoszenie PCT WO 94/21300

Literatura

1) Ahnert-Hilger G., Bigalke H. (1995)

Molecular aspects of tetanus and botulinum neurotoxin poisoning, Progress in Neurobiology 46:

83-96

2) Benecke R., Kessler K.R. (1995)

PL 201 879 B1

Botulinumtoxin A, Akt. Neurol 22: 209-213

3) Bigalke, H. (1999 w druku)

Clostridial Toxins, Handbook of Experimental Pharmacology and Toxicology, red. Just i Aktories, Springer Verlag

4) Binscheck T., Bartels F., Bergel H., Bigalke H., Yamasaki S., Hayashi T., Niemann H., Polner

J. (1995)

IgA protease from Neisseria gonorrhoeae inhibits exocytosis in bovine chromaffin cells like tetanus toxin, J. biol. Chem. 270: 1770-1774

5) Binscheck T., Wellhoner H.H. (1997)

Tetanus and botulinum toxins - zinc proteases - synaptotagmin - exocytosis w: Toxins and signal transduction (red.: Gutman Y., Lazarovici P.) 1: 457-487

6) Binz, T., Kurazono, H., M., Frevert, J., Wernars K. i Niemann, H. (1990)

The complete sequence of botulinum toxin A and comparison with other clostridial neurotoxins, J. Biol. Chem. 265: 9153-9158

7) Cardoso, F. i Jancovic, J. (1995)

Clinical use of botulinum neurotoxins, Current Topics Microbiol. Immunol. 195: 123-141

8) Fishman, A., Lorberboum-Galski, H. (1997)

Targeted elimination of cells expressing the highaffinity receptor for IgE (Fc epsilon RI) by a Pseudomonas exotoxin-based chimeric protein, Eur. J. Immunol., 27: 486-494

9) Gmachl, M. i Kreil, G. (1995)

The precursors of the bee venom constituents apamin and MCE peptide are encoded by two genes in tandem which share the same 3'-exon, J. Biol. Chem. 270 (21): 12704-12708

10) Helman, L. (1995)

Characterization of four novel epsilon chain mRNA and a comparative analysis of genes for immunoglobulin E in rodents and man, Eur. J. Immunol. 23 (1): 159-167

11) Liddel i Weeks (1995)

Antikorper-Techniken Spektrum, Akademischer Verlag Heidelberg

12) Link E., Edelmann L., Chou J., Binz T., Yamasaki S., Eisel U., Baumert M., Sϋdhof T.C., Niemann H. i Jahn R. (1992)

Tetanus toxin action: Inhibition of neurotransmitter release linked to synaptobrevin proteolysis, Biochem. Biophys. Res. Comm. 189: 18423-26

13) Magerstadt, M. (1991)

Antibody conjugates and malignant diseases, CRC Press

14) Hamawy M.M. (red.) (1997)

IgE Receptor (FceRI) Function w: Mast Cells and Basophils, Springer Verlag

15) Marxen P., Fuhrmann U., Bigalke H. (1989)

Gangliosides mediate inhibitory effects of tetanus and botulinum A neurotoxins on exocytosis in chromaffin cells, Toxicon 27: 849-859

16) Nichol D.S.T. (1995)

Gentechnische Methoden, Spektrum Akademischer Verlag

17) Vogel, C.W. (red.) (1987)

Immunoconjugates: Antibody conjugates in radio-immagining and therapy of cancer, Oxford UP Inc.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Białko hybrydowe, składające się z (i) białka, które wiąże się z komórkami tucznymi i/lub granulocytami zasadochłonnymi i/lub jest wchłaniane przez te komórki, oraz (ii) proteazy, która rozszczepia jedno lub większą liczbę białek aparatu wydzielniczego komórek tucznych i/lub granulocytów zasadochłonnych.
2. Białko hybrydowe według zastrz. 1, składające się z (i) białka, które wiąże się z komórkami tucznymi i/lub granulocytami zasadochłonnymi i/lub jest wchłaniane przez te komórki, które to białko (i) jest wybrane z grupy obejmującej:

IgE;

fragment IgE, w szczególności fragment Fc IgE;

PL 201 879 B1 przeciwciało przeciw receptorowi IgE komórek tucznych i/lub granulocytów zasadochłonnych; fragment przeciwciała przeciw receptorowi IgE komórek tucznych i/lub granulocytów zasadochłonnych, w szczególności fragment Fab; przeciwciało przeciw specyficznemu dla komórek tucznych kanałowi potasowemu; oraz nieaktywny, ale wiążący peptyd MCD; oraz (ii) proteazy rozszczepiającej jedno lub większą liczbę białek aparatu wydzielniczego komórek tucznych i/lub granulocytów zasadochłonnych.
3. Białko hybrydowe według zastrz. 1, składające się z (i) białka, które wiąże się z komórkami tucznymi i/lub granulocytami zasadochłonnymi i/lub jest wchłaniane przez te komórki, oraz (ii) proteazy rozszczepiającej jedno lub większą liczbę białek aparatu wydzielniczego komórek tucznych i/lub granulocytów zasadochłonnych, przy czym proteaza (ii) jest wybrana z grupy obejmującej:

lekki łańcuch toksyny Clostridium botulinum, w szczególności toksyn typu A, B, C1, D, E, F oraz G; katalitycznie aktywny fragment lekkiego łańcucha toksyny Clostridium botulinum, w szczególności toksyny typu A, B, C1, D, E, F oraz G; lekki łańcuch toksyny tężca (TeNT); katalitycznie aktywny fragment lekkiego łańcucha toksyny tężca; proteazę IgA z Neisseria gonorrhoeae; oraz katalityczną domenę proteazy IgA z Neisseria gonorrhoeae.
4. Białko hybrydowe według zastrz. 2 albo 3, znamienne tym, że białko (i) jest wybrane z grupy określonej w zastrz. 2, a proteaza (ii) jest wybrana z grupy określonej w zastrz. 3.
5. Białko hybrydowe według zastrz. 4, znamienne tym, że N-końcowa część ciężkiego łańcucha odpowiedniej toksyny (fragment HN) lub jej fragment może stanowić część białka hybrydowego, oprócz lekkiego łańcucha toksyny Clostridium botulinum lub toksyny tężca.
6. Zastosowanie białka hybrydowego zdefiniowanego w zastrz. 1 - 5 do wytwarzania leku do hamowania degranulacji komórek tucznych.