PL204419B1

PL204419B1 - Kompozycja farmaceutyczna, oligosacharyd, sposób wytwarzania oligosacharydu i zastosowanie oligosacharydu

Info

Publication number: PL204419B1
Application number: PL357301A
Authority: PL
Inventors: Pierre Mourier; Elisabeth Perrin; Christian Viskov
Original assignee: Aventis Pharma Sa
Priority date: 2000-03-28
Filing date: 2001-03-26
Publication date: 2010-01-29
Also published as: MEP88408A; DE60109279T2; CN1183149C; HUP0300330A2; AU782713B2; BR0109617A; YU72802A; EA200201024A1; CN1426419A; WO2001072762A1; SK286745B6; PT1272499E; AR034251A1; NZ521558A; PL357301A1; FR2807043B1; KR20030001394A; AU4663901A; EP1272499A1; HK1056564A1

Description

Przedmiotem wynalazku jest kompozycja farmaceutyczna, oligosacharyd, sposób wytwarzania oligosacharydu i zastosowanie oligosacharydu.

Oligosacharydy o wzorze (I),

w którym wartość n wynosi 0, oraz albo R1, R6 i R8 stanowią atom wodoru, R7 stanowi rodnik SO3M lub COCH3, a M stanowi atom sodu, albo R1 i R6 stanowią atom wodoru, R7 stanowi rodnik COCH3, R8 stanowi rodnik SO3M, a M stanowi atom sodu, albo R6 stanowi atom wodoru, R1, R7 i R8 stanowią rodnik SO3M, a M stanowi atom sodu, zostały już opisane przez G.H. Lee i wsp., J. Chromat. 212, 65-73 (1981), nie opisywano jednak żadnych właściwości farmakologicznych tych produktów.

Oligosacharydy o wzorze (I), w których wartość n wynosi 0 i albo R6 i R7 stanowią atomy wodoru, R1 i R8 stanowi rodnik SO3M, a M stanowi atom sodu, albo R1, R6 i R7 stanowi atom wodoru, R8 stanowi rodnik SO3M, a M stanowi atom sodu, zostały opisane przez MW McLean i wsp., Eur. J. Biochem., 1984, 145, 607, bez żadnych wzmianek na temat ich ewentualnej aktywności farmakologicznej.

Przedmiotem wynalazku jest kompozycja farmaceutyczna, która jako składnik czynny zawiera oligosacharyd o wzorze:

w którym n oznacza liczbę całkowitą 1; R1, R2, R3, R5, R7 i R8 oznaczają rodnik SO3M, R4 i R6 oznaczają atom wodoru i M oznacza atom sodu, w którym n oznacza liczbę całkowitą 2, R1, R2, R3, R5, R7 i R8 oznaczają rodnik SO3M, R4 i R6 oznaczają atom wodoru i M oznacza atom sodu, w którym n oznacza liczbę całkowitą 3, R1, R2, R3, R5, R7 i R8 oznaczają rodnik SO3M, R4 i R6 oznaczają atom wodoru i M oznacza atom sodu, w którym n oznacza liczbę całkowitą 4, R1, R2, R3, R5, R7 i R8 oznaczają rodnik SO3M, R4 i R6 oznaczają atom wodoru i M oznacza atom sodu.

Przedmiotem wynalazku jest oligosacharyd o wzorze (I) w którym n oznacza liczbę całkowitą 1; R1, R2, R3, R5, R7 i R8 oznaczają rodnik SO3M, R4 i R6 oznaczają atom wodoru i M oznacza atom sodu, w którym n oznacza liczbę całkowitą 2, R1, R2, R3, R5, R7 i R8 oznaczają rodnik SO3M, R4 i R6 oznaczają atom wodoru i M oznacza atom sodu, w którym n oznacza liczbę całkowitą 3, R1, R2, R3, R5, R7 i R8 oznaczają rodnik SO3M, R4 i R6 oznaczają atom wodoru i M oznacza atom sodu,

PL 204 419 B1 w którym n oznacza liczbę całkowitą 4, R1, R2, R3, R5, R7 i R8 oznaczają rodnik SO3M, R4 i R6 oznaczają atom wodoru i M oznacza atom sodu.

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania oligosacharydu o wzorze (I), w którym poddaje się reakcji borowodorek metalu alkalicznego lub borowodorek czwartorzędowego związku amonowego z oligosacharydami o wzorze:

w którym n oznacza liczbę całkowitą od 1 do 4, R1, R3, R4, R5, są takie same lub różne, oznaczają atom wodoru lub rodnik SO3M, R2 i R6, takie same lub różne, oznaczają atom wodoru lub rodnik SO3M, a M oznacza atom sodu, i izoluje się oligosacharyd.

Korzystnie reakcję prowadzi się w środowisku wodnym w temperaturze zbliżonej do 25°C i w pH 7-10, korzystniej pH reakcji wynosi 9-10.

Jako borowodorek metalu alkalicznego lub borowodorek czwartorzędowego związku amonowego stosuje się borowodorek litu, sodu, potasu lub tetrabutyloamoniowy.

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie oligosacharydu o wzorze (I) do wytwarzania leków do zapobiegania i leczenia chorób zapalnych wywołujących wytwarzanie tlenku azotu, korzystnie do wytwarzania leków do zapobiegania i leczenia niedokrwienia mózgu, serca lub naczyń obwodowych, zapalenia stawów i kości, urazów ośrodkowego układu nerwowego, urazów czaszki i/lub rdzenia kręgowego, stwardnienia rozsianego, bólów neuropatycznych i neuropatii obwodowych, chorób neuronu ruchowego, stwardnienia zanikowego bocznego, AIDS układu nerwowego, choroby Alzheimera, choroby Parkinsona i pląsawicy Huntingtona, do wytwarzania leków do zapobiegania i leczenia chorób związanych z przeżyciem i wzrostem neuronów ruchowych.

Kompozycję według wynalazku można podawać dożylnie, podskórnie, doustnie, doodbytniczo, miejscowo lub drogą wziewną (do oskrzeli).

Jałowe kompozycje do podawania dożylnego lub podskórnego wytwarza się zwykle w postaci wodnych roztworów. Kompozycje te mogą również zawierać adiuwanty, zwłaszcza środki zmiękczające, nadające izotoniczność, emulgujące, dyspergujące i stabilizujące. Lek można wyjaławiać na wiele sposobów, na przykład poprzez filtrację wyjaławiającą, włączając do kompozycji środki wyjaławiające, poprzez napromieniowanie. Leki te można również wytwarzać w postaci jałowych kompozycji stałych do rozcieńczenia bezpośrednio przed użyciem w wodzie jałowej lub innym jałowym płynie do wstrzyknięć.

Jako kompozycje stałe do podawania doustnego można stosować tabletki, pigułki, proszki (kapsułki żelatynowe, saszetki) lub granulaty. W kompozycjach tych składnik czynny miesza się z jednym lub więcej obojętnych rozcieńczalników, takich jak skrobia, celuloza, sacharoza, laktoza lub krzemionka, w strumieniu argonu. Kompozycje te mogą również zawierać substancje inne niż rozcieńczalniki, na przykład jeden lub kilka środków poślizgowych, takich jak stearynian magnezowy lub talk, środek zwiększający wchłanianie po podaniu doustnym, barwnik, powłokę (drażetki) lub lakier.

Jako kompozycje płynne do podawania doustnego można stosować farmaceutycznie dopuszczalne roztwory, zawiesiny, emulsje, syropy i eliksiry, zawierające obojętne rozcieńczalniki, takie jak woda, etanol, glicerol, oleje roślinne lub olej parafinowy. Kompozycje te mogą zawierać środki inne niż rozcieńczalniki, na przykład środki zmiękczające, słodzące, zwiększające objętość, zapachowe lub stabilizujące.

Kompozycjami do podawania doodbytniczego są czopki lub kapsułki doodbytnicze, zawierające, poza produktem czynnym, zaróbki, takie jak masło kakaowe, glicerydy półsyntetyczne lub polietylenoglikole.

Kompozycjami do podawania miejscowego są na przykład kremy, płyny, krople do oczu lub nosa, płyny do płukania ust i aerozole.

PL 204 419 B1

Dawki zależeć będą od pożądanego efektu, czasu trwania leczenia i drogi podawania; zawierać się będą ogólnie między 0,5 mg i 10 mg na kg dziennie drogą podskórną, co odpowiada 3-60 mg dziennie u osoby dorosłej o masie ciała 60 kg.

Ogólnie, lekarz określi dawkowanie w zależności od wieku, masy ciała i wszystkich innych czynników indywidualnych dla danego pacjenta.

Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie oligosacharydów według wynalazku do wytwarzania leku korzystnego do zapobiegania lub leczenia chorób związanych z procesem zapalnym, powodującym wytwarzanie tlenku azotu (NO) lub korzystnego dla przeżycia i wzrostu neuronów ruchowych.

Korzystne jest zastosowanie oligosacharydów o wzorze (I) do wytwarzania leków korzystnych w zapobieganiu i leczeniu niedokrwienia mózgu, serca lub naczyń obwodowych, zapalenia stawów i kości, urazów ośrodkowego układu nerwowego, urazów czaszki i/lub rdzenia kręgowego, stwardnienia rozsianego, bólów neuropatycznych i neuropatii obwodowych, chorób neuronu ruchowego, stwardnienia zanikowego bocznego, AIDS układu nerwowego, choroby Alzheimera, choroby Parkinsona i pląsawicy Huntingtona.

Oligosacharydy o wzorze (I) można wykorzystywać do zapobiegania i/lub leczenia chorób związanych z procesem zapalnym, powodującym wytwarzanie substancji cytotoksycznych, takich jak tlenek azotu (NO) i chorób związanych z przeżyciem i wzrostem neuronów ruchowych, zapobiegania i/lub leczenia chorób zwyrodnieniowych układu nerwowego, w których zapalenie mózgu odgrywa niekorzystną rolę, prowadzących do zgonu; do takich chorób należą: niedokrwienie mózgu, serca (zawał mięśnia serca), niedokrwienie obwodowe, uraz ośrodkowego układu nerwowego, zwłaszcza uraz czaszki i/lub rdzenia kręgowego, stwardnienie rozsiane, bóle neuropatyczne i neuropatie obwodowe, choroby neuronu ruchowego, takie jak stwardnienie zanikowe boczne, postępujący zanik rdzeniowy, niemowlęcy zanik mięśniowy i pierwotne stwardnienie boczne, AIDS układu nerwowego, choroba Alzheimera, choroba Parkinsona i pląsawica Huntingtona oraz niektóre postacie zapalenia stawów i kości, zwłaszcza o lokalizacji stawowej, zapobiegania i/lub leczenia chorób neuronu ruchowego, takich jak stwardnienie zanikowe boczne, postępujący zanik rdzeniowy, niemowlęcy zanik mięśniowy i pierwotne stwardnienie boczne.

Oligosacharydy o wzorze (I) można wytwarzać przez działanie borowodorku metalu alkalicznego lub borowodorku czwartorzędowego związku amonowego na oligosacharydy o wzorze:

w którym n stanowi liczbę całkowitą od 0 do 25, R1, R3, R4, R5, R6 i R8, takie same lub różne, stanowią atom wodoru lub rodnik SO3M, R2 i R7, takie same lub różne, stanowią atom wodoru lub rodnik SO3M lub COCH3, a M stanowi atom sodu, wapnia, magnezu lub potasu.

Reakcja ta zachodzi w środowisku wodnym, w temperaturze zbliżonej do 25°C, w pH wynoszącym od 7 do 10, korzystnie, od 9 do 10, przez cały czas trwania reakcji. Utrzymanie pH osiąga się przez dodawanie roztworu wodorotlenku sodowego w stężeniu 0,5 mol/l. Reakcję przerywa się przez zakwaszenie środowiska reakcji, na przykład poprzez dodanie kwasu octowego do uzyskania pH zawartego między 4 a 5.

Borowodorkiem metalu alkalicznego jest na przykład borowodorek litu, sodu i potasu.

Borowodorkiem czwartorzędowego związku amonowego jest na przykład borowodorek tetrabutyloamoniowy.

Oligosacharydy o wzorze (II) można wytwarzać poprzez chromatograficzne rozdzielanie na żelu mieszaniny oligosacharydów (III), wytworzonej poprzez enzymatyczną depolimeryzację heparyny lub

PL 204 419 B1 depolimeryzacją zasadową estru benzylowego heparyny lub półsyntetycznego estru benzylowego heparyny.

Chromatografię prowadzi się na kolumnach napełnionych żelem typu poliakrylamid-agaroza, takim jak na przykład żel dostępny na rynku pod nazwą Ultrogel ACA202R (Biosepra). Korzystnie, stosuje się baterię kolumn z żelem poliakrylamidowo-agarozowym. Liczbę kolumn dostosowuje się do objętości, żelu i rozdzielanych oligosacharydów. Mieszaninę eluuje się roztworem zawierającym bufor fosforanowy i chlorek sodowy. Korzystnie, roztwór buforu fosforanowego jest roztworem w stężeniu 0,02 mol/l NaH2PO4/Na2HPO4 (pH 7), zawierającym 0,1 mol/l chlorku sodowego. Wykrywanie poszczególnych frakcji odbywa się poprzez spektrometrię UV (254 nm) i jonową (IBF). Tak wytworzone frakcje można ewentualnie na koniec oczyszczać, na przykład poprzez chromatografię SAK (wymiana silnych anionów), sposobami znanymi specjalistom, zwłaszcza sposobami opisanymi przez K.G. Rice i R.J Linhardt, Carbohydrate Research 190, 219-233 (1989), A. Larnkjaer, S.H. Hansen i P.B. Ostergaard, Carbohydrate Research, 266, 37-52 (1995) i w patencie WO90/01501 (przykład 2). Frakcje są następnie liofilizowane i odsalane na kolumnie wypełnionej żelem, takiej jak kolumna żelowa Sephadex GIOR (Pharmacia Biochemicals).

Kiedy oczyszczanie prowadzi się inną metodą, niż chromatografia SAX, liofilizaty można ewentualnie oczyszczać poprzez strącanie proste lub frakcjonowane, sposobami znanymi specjalistom, szczególnie sposobem opisanym w patencie FR2548672. Ogólnie, prowadzi się je następująco:

Liofilizowaną frakcję, poddawaną oczyszczeniu, rozpuszcza się w temperaturze 25°C w około dziesięciu objętościach wody destylowanej. Dodając metanol lub etanol strąca się pożądany oligosacharyd, regulując jego wzbogacanie poprzez HPLC (chromatografię cieczową wysokosprawną). Ilość dodawanego metanolu lub etanolu określa się w zależności od oczekiwanej czystości i wydajności danego oligosacharydu. Reakcję tę można prowadzić w kilku kolejnych etapach, poczynając od pierwotnego roztworu liofilizatu. W tym celu dodaje się małymi porcjami środek nadający nierozpuszczalność (metanol lub etanol) i po każdorazowym dodaniu izoluje się wytworzony osad. Tak wytworzone osady analizuje się w HPLC. W zależności od pożądanej czystości i wydajności, zbiera się odpowiednie frakcje osadu.

Według jednej z odmian niniejszego wynalazku, oczyszczaną frakcję liofilizowaną można rozpuścić w 10-200 objętościach wody, zawierającej od 0 do 30% octanu sodowego. Odsetek octanu sodowego będzie się uprzednio dostosowywać w zależności od rodzaju poddawanego obróbce oligosacharydu (w zależności od jego rozmiaru). Dodając metanol powoduje się strącenie pożądanego oligosacharydu, regulując jego wzbogacanie przez chromatografię HPLC (chromatografia cieczowa wysokosprawna). Ilość dodawanego metanolu określa się w zależności od oczekiwanej czystości i wydajno ś ci danego oligosacharydu. Proces ten moż na również przeprowadzić w kilku kolejnych etapach, poczynając od pierwotnego roztworu liofilizatu. W tym celu dodaje się małymi porcjami środek nadający nierozpuszczalność (metanol) i po każdorazowym dodaniu izoluje się wytworzony osad. Tak wytworzone osady analizuje się w HPLC. W zależności od pożądanej czystości i wydajności, zbiera się odpowiednie frakcje osadu.

W przypadku związków poś rednich o wzorze (II), w którym wartość n wynosi 0, 1 lub 2, korzystne jest wychodzenie od mieszaniny (III), wytworzonej przez depolimeryzację enzymatyczną.

Depolimeryzację tę przeprowadza się z użyciem heparynazy I (EC 4.2.2.7) w roztworze buforu fosforanowego o pH 7, w obecności chlorku sodowego i BSA (bydlęcej albuminy surowicy) w temperaturze od 10 do 18°C, korzystnie, w temperaturze 15°C, przez 8-10 dni, korzystnie, 9 dni. Depolimeryzację przerywa się na przykład poprzez ogrzewanie środowiska reakcji do temperatury 100°C przez 2 minuty, po czym mieszaninę odtwarza się przez liofilizację. Korzystnie, stosuje się 7 j.m. heparynazy I na 25 g heparyny. Roztwór buforu fosforanowego zawiera zwykle 0,05 mol/l NaH2PO4/Na2HPO4 (pH 7) w obecności 0,1 mol/l chlorku sodowego. Stężenie BSA wynosi zwykle 2%.

W przypadku związków pośrednich o wzorze (II), w którym wartość n wynosi 0, 1, 2, 3 lub 4, korzystne jest wychodzenie od mieszaniny (III), wytworzonej przez depolimeryzację estru benzylowego heparyny.

Ester benzylowy heparyny można wytwarzać sposobami opisanymi w patentach US5389618, EP40144, FR2548672. Stopień estryfikacji będzie wynosił korzystnie od 50 do 100%, korzystniej, od 70 do 90%.

Depolimeryzacja zachodzi w środowisku wodnym, pod wpływem wodorotlenku metalu alkalicznego (na przykład wodorotlenku litu, sodu, potasu lub cezu) lub wodorotlenku czwartorzędowego związku amonowego (na przykład wodorotlenku tetrabutyloamoniowego), korzystnie, o molarności od

PL 204 419 B1

0,1 do 0,2 mol/l, w temperaturze 40-80°C, przez 5-120 minut. W korzystnym wykonaniu proces prowadzi się przez 5-15 minut, w temperaturze 60-70°C, z 0,15 mol/l roztworem wodorotlenku sodowego. Reakcję depolimeryzacji zatrzymuje się poprzez zobojętnienie dodaniem kwasu, takiego jak kwas octowy. Po dodaniu 10% (masa/objętość) octanu sodowego, mieszaninę oligosacharydów strąca się przez dodanie metanolu, korzystnie, w stosunku 2 objętości na 1 objętość środowiska reakcyjnego i filtruje si ę .

Według korzystnego aspektu wynalazku, mieszaninę oligosacharydów, wytworzoną przez depolimeryzację chemiczną, w postaci roztworu wodnego, wzbogaca się poprzez ultrafiltrację na błonach z odpowiednim nominalnym progiem przepuszczania (typu Pellicon z regenerowanej celulozy, produkcji firmy Millipore), przy czym typ błony dobiera się w zależności od typu odzyskiwanych wzbogaconych oligosacharydów. W przypadku oligosacharydów (II), dla których wartość n = 0, stosuje się błonę o nominalnym progu przepuszczalności 1 kDa, w przypadku oligosacharydów (II), dla których wartość n = 1, stosuje się błonę 1 kDa lub 3 kDa, w przypadku oligosacharydów (II), dla których wartość n = 2, stosuje się błonę 3 kDa, w przypadku oligosacharydów (II), dla których wartość n = 3 lub 4, stosuje się błonę 5 kDa. W procesie tym zbiera się przesącz, a odrzuca osad. Frakcja produktu wzbogaconego stanowi od 50 do 10% początkowej mieszaniny oligosacharydów, przy zachowaniu co najmniej 80% pożądanego oligosacharydu.

W przypadku związków poś rednich o wzorze (II), w którym wartość n wynosi 0-25, korzystne jest wychodzenie od mieszaniny (III), wytworzonej przez depolimeryzację półsyntetycznego estru benzylowego polisacharydu siarczanowego. Półsyntetyczny ester benzylowy polisacharydu siarczanowego wytwarza się z półsyntetycznych polisacharydów siarczanowych, wytwarzanych z polisacharydu K5 i sposobami opisanymi w patentach WO94/29352 i WO96/14425. Warunki estryfikacji, depolimeryzacji i odzyskiwania są takie same, jak opisane uprzednio dla estru benzylowego heparyny.

We wszystkich omówionych powyżej sposobach heparyna może być pochodzenia świńskiego, owczego, koziego lub bydlęcego i może pochodzić ze śluzu, płuc lub skóry zwierząt. Korzystnie, stosuje się heparynę pochodzącą ze śluzu świń lub owiec lub z płuc bydła, korzystniej, ze śluzu świń lub z płuc bydła.

Oligosacharydy o wzorze (I) wykazują właściwości przeciwzapalne i można je również wykorzystywać do zapobiegania lub leczenia chorób związanych z procesem zapalnym, powodującym wytwarzanie substancji cytotoksycznych, takich jak tlenek azotu (NO), którego postać indukowalna uwalniana jest zwłaszcza przez neutrofile lub makrofagi w czasie ich migracji i aktywacji na poziomie tkankowym. Do migracji, aktywacji i adhezji neutrofili dochodzi na poziomie tkanek niedokrwionych w wyniku zamknięcia lub skurczu tętnicy unaczyniającej tę tkankę. Do takiego niedokrwienia może dochodzić w mózgu (naczyniowe incydenty mózgowe), mięśnia serca (zawał mięśnia serca) lub kończyn dolnych (tak zwane niedokrwienie obwodowe). Oligosacharydy o wzorze (I) można również stosować do zapobiegania i/lub leczenia chorób zwyrodnieniowych układu nerwowego, w których zapalenie w obrębie mózgu odgrywa niekorzystną rolę i które mogą prowadzić do zgonu, takich jak niedokrwienie mózgu, niedokrwienie serca (zawał mięśnia serca), niedokrwienie obwodowe, urazy ośrodkowego układu nerwowego, zwłaszcza urazy czaszki i/lub rdzenia kręgowego, stwardnienie rozsiane, bóle neuropatyczne i neuropatie obwodowe, choroby neuronu ruchowego, takie jak stwardnienie zanikowe boczne, postępujący zanik rdzeniowy, niemowlęcy zanik mięśniowy i pierwotne stwardnienie boczne, AIDS układu nerwowego, choroba Alzheimera, choroba Parkinsona i pląsawica Huntingtona oraz niektóre postacie zapalenia stawów i kości, zwłaszcza o lokalizacji stawowej.

Aktywności przeciwzapalnej tych produktów dowiedziono in vivo w teście NOx (azotynu i azotanu), wywołanym przez lipopolisacharyd (LPS) pochodzący z E. coli, sposobem opisanym przez M. Yamashita i wsp., Eur. J. Pharmacol, 338, 2, 151-158 (1997) lub J.E. Shellito i wsp. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 13, 1, 45-53 (1995).

Samcom myszy CD1 (Charles River, 25-35 g) wstrzykiwano w T0 dożylnie bolus 0,5 mg/kg oligosacharydu, i w T+15 minut podskórnie 1 lub 2 mg/kg oligosacharydu. W T+30 minut, podawano 100 mg/kg lipopolisacharydu (LPS) pochodzącego z E. coli (Sigma L3129, serotyp 0127:B8). W T+3 godziny ponownie wstrzykiwano podskórnie 1 lub 2 mg/kg oligosacharydu. W T+5 godzin 30 minut, pobierano próbkę krwi przez nakłucie oka i oznaczano stężenie NOx (azotynu i azotanu) w osoczu metodą kolorymetryczną Griessa po redukcji azotanu do azotynu reduktazą azotanową w następujący sposób: 12 ml próbki osocza mieszano z 88 ml dejonizowanej wody i inkubowano w ciemności 1 godzinę w temperaturze otoczenia z 40 ml buforu fosforanowego (0,31M, pH 7,5), 20 ml (3NADPH (zredukowany fosforan dwunukleotydu nikotynamidoadeninowego)(0,86 mm), 20 ml FDA (dwunukleotyd

PL 204 419 B1 flawinoadeninowy) (0,11 mm) i 20 ml reduktazy azotanu (2j/ml) (Boehringer Mannheim). Dodawano 10 ml ZnSO4 (1M) w celu strącenia białek i po zmieszaniu próbki odwirowuje się przy 20000 g przez 5 minut. Na koniec inkubowano 50 ml supernatantu przez 10 minut w temperaturze otoczenia z 100 ml odczynnika Griessa (sulfanilamid w 1% stężeniu w 0,1% mieszaninie kwasu fosforowego/naftyloetylenodiaminy w wodzie dejonizowanej (obj.). Mierzono gęstość optyczną przy długości fali 540 nm za pomocą spektrofotometru mikropłytkowego; każdy punkt oznaczano dwukrotnie. Jako normę metody kolorymetrycznej stosowano KNO3 i NaNO2.

W teście tym oligosacharydy według wynalazku hamują o ponad 50% tworzenie się NOx.

Ponadto oligosacharydy o wzorze (I) zwiększają czas przeżycia i nasilają wzrost neuronów ruchowych, są zatem szczególnie korzystne w zapobieganiu i leczeniu chorób neuronu ruchowego, takich jak stwardnienie zanikowe boczne, postępujący zanik rdzeniowy, niemowlęcy zanik mięśniowy, pierwotne stwardnienie boczne.

Wiadomo, że hodowle neuronów ruchowych obumierają na drodze apoptozy, jeżeli prowadzi się je bez dodatku substancji troficznych (na przykład BDNF, NT5). Obecnie stwierdzono, że oligosacharydy według wynalazku umożliwiają przeżycie i wzrost neuronów ruchowych. Aktywność tę badano na wspólnych hodowlach astrocytów i neuronów ruchowych, pozbawionych czynników neurotroficznych, w następujący sposób:

Hodowle wzbogacone w neurony ruchowe:

Hodowle wzbogacone w neurony ruchowe wytwarzano sposobem odwirowania, opisanym przez R.L. Schnaar i A.E. Schaffner, J. Neurosci., 1, 204-217 (1981) i zmodyfikowanym przez W. Camu i CE. Henderson, J. Neurosci. Methods, 44, 59-70 (1992). W warunkach jałowych przecinano rdzeń kręgowy zarodków szczurzych E15 i wydostawano go z odcinka grzbietowego kręgosłupa. Następnie cięto te rdzenie i inkubowano przez 15 minut w temperaturze 37°C w PBS (sól fizjologiczna zbuforowana fosforanem: NaCl 137 mm, KCl 2,68 mm, Na2HPO4 6,45 mm, KH2PO4 1,47 mm) z dodatkiem 0,05% trypsyny. Rozdzielenie komórek uzupełniano roztarciem końcem 1 ml pipety w pożywce hodowli z dodatkiem 0,1% bydlęcej albuminy surowicy (BSA) i 0,1 mg/ml DNAzy. Zawiesinę komórek rozmieszczano na prążku metrizamidu 6,5% masa/objętość w pożywce L15 (produkcji firmy Gibco BRL) i odwirowuje przy 500 g przez 15 minut. Prążek powierzchni granicznej, zawierający neurony ruchowe, zbierano, rozcieńczano w pożywce L15 i inkubowano przez 45 minut w temperaturze otoczenia w pojemnikach do hodowli, uprzednio powleczonych mysim anty-IgG i hybrydowym supernatantem MC 192 (Chandler CE i wsp., J. Biol. Chem., 259, 6882 (1984). Zawieszone komórki przepłukiwano pożywką L15 i neurony ruchowe eluowano, słabo wstrząsając, hybrydowym supernatantem MC 192. Neurony ruchowe rozmieszczano z gęstością 650 komórek na 24 mm w pojemnikach do hodowli na pojedynczych warstwach astrocytów w pożywce L15 z dodatkiem dwuwęglanu sodowego (22 mm), koalbuminy (0,1 mg/ml), putrescyny (0,1 mm), insuliny (5 μg/ml), seleninu sodowego (31 nm), glukozy (20 mm), progesteronu (21 nm), penicyliny (100 j.m./ml) i streptomycyny (100 ug/ml). Hodowle prowadzono w temperaturze 37°C w atmosferze 5% CO2.

Hodowla astrocytów rdzenia kręgowego

Astrocyty wytwarzano z zarodków szczurzych sposobem R.P. Saneto i J. De Vellis, opisanym w: Neurochemistry, a practical approach (A.J. Turner i H.S. St John) IRL Press, Oxford-Washington DC, str. 27-63 (1987), z niewielkimi zmianami. Rdzenie kręgowe wycinano w jałowych warunkach, pozbawiano opon i zwojów grzbietowych. 5-10 rdzeni kręgowych przenoszono do PBS (sól fizjologiczna zbuforowana fosforanem: NaCl 137 mm, KCl 2,68 mm, Na2HPO4 6,45 mm, KH2PO4 1,47 mm) i cięto przed inkubacją w temperaturze 37°C przez 25 minut w PBS z dodatkiem 0,25% trypsyny. Obróbkę enzymatyczną hamowano dodaniem 10 ml zmodyfikowanej pożywki Dubelcco-Eagle (DMEM) z dodatkiem 10% płodowej surowicy cielęcej (FCS) i komórki zbierano przez odwirowanie. Kolejny etap rozdzielania mechanicznego wykonywano za pomocą zakończenia 1 ml pipety. Komórki rozmieszczano z gęstością 1,5 x 10⁶ na 25 cm² pożywki hodowlanej w DMEM z 10% FCS. Po 2 dniach in vitro do hodowli dodawano substancje odżywcze codziennie przez cały czas trwania badania. Po uzyskaniu widocznej pojedynczej warstwy komórek, hodowle mieszano przez 48 godzin przy 250 obr./min. i następnego dnia pojedyncze warstwy poddawano działaniu arabinozydu cytozyny (10-20 M) przez 48 godzin. Pojedyncze warstwy astrocytów następnie namnażano do gęstości 5/35 mm na płytkach do hodowli w przypadku 25 cm² butelek do hodowli na początku badania.

Hodowle astrocytów rdzeniowych utworzone są z ponad 98% komórek immunoreaktywnych na kwaśne włókienkowe białko glejowe (GFAP).

PL 204 419 B1

Pojedyncze warstwy astrocytów eksponuje się na działanie samego PBS (kontrola) lub badanego produktu w roztworze PBS, przez 24 godziny, w stężeniu od 0,1 ng/ml do 10 ng/ml. Pojedyncze warstwy astrocytów płucze się następnie DMEM i utrzymuje przez 2 godziny w pożywce hodowlanej, do której dodano neurony ruchowe.

W dwie godziny po dodaniu substancji odżywczych i przez 2 lub 3 dni do pożywki hodowlanej dodaje się jeszcze zaróbkę lub produkt badany.

Immunochemiczna identyfikacja neuronów ruchowych

Komórki utrwala się w 4% paraformaldehydzie i 0,1% aldehydu glutarowego w PBS (pH 7,4-4°C przez 15 minut). Hodowle następnie poddaje się płukaniu, a miejsca nieswoiste blokuje 2% bydlęcą albuminą surowicy (BSA) w PBS i 0,1% Triton X100R. Hodowle te następnie kolejno inkubuje się z przeciwciałami p75^lngrf (uprzednio cytowana praca Chandlera) przez noc w temperaturze 4°C i z biotynylowaną surowicą kozią (1/125 Gibco) i streptawidynoperoksydazą (1/200, Gibco) przez 60 minut. Przeciwciała uwidacznia się za pomocą reakcji DAB/nadtlenek wodoru.

Liczenie komórek i analiza statystyczna

Komórki immunoreaktywne wobec receptora neutrofinowego o słabej aktywności p75^lngrf, o neurytach dłuższych, niż średnica 4 komórek, uważa się za żywe neurony ruchowe. Liczbę neuronów ruchowych ocenia się, zliczając komórki zaznaczone na powierzchni 0,825 cm² pod mikroskopem o powię kszeniu 200 x. Warto ś ci wyraża się jako liczbę neuronów ruchowych na cm² lub odsetek liczby neuronów ruchowych obecnych w hodowlach prowadzonych w nieobecności czynnika troficznego w porównaniu z kontrolą . Doś wiadczenia prowadzono co najmniej 3-krotnie.

Analizę statystyczną przeprowadzono z użyciem testu t-Studenta.

Wstępna obróbka oligosacharydami spowodowała wzrost liczby neuronów ruchowych, rosnących na pojedynczej warstwie astrocytów, z 20 do 50%.

Poniższe przykłady są ilustracją wytwarzania oligosacharydów o wzorze (I) i związków pośrednich.

W przykł adach uż yto nastę pują cych skrótów:

Δ^: (kwas 4-dezoksy-2-O-sulfo-a-L-treo-heksa-enopiranozylourono)-(1 >4)-2-dezoksy-2-sulfoamino-6-O-sulfo-a-D-glukopiranoza, sól czterosodowa lub AUAp2S-(1 >4)-a-D-GlcNp2S6S

Is: (kwas 2-sulfo-a-L-idopiranozylourono)-(1 >4}-2-dezoksy-2-sulfoamino-6-O-sulfo-a-D-glukopiranoza, sól czterosodowa (kwas 2-sulfo-a-1-Lidopiranozylourono)-(1 >4)-2-dezoksy-6-O-sulfo-2-sulfoamino-a-D-glukopiranoza, sól czterosodowa lub a-L-idoAp2S-(1 >4)-a-D-GlcNp2S6S

IIs: (kwas a-L-idopiranozylourono)-(1 >4)-2-dezoksy-6-O-sulfo-2-sulfoamino-a-D-glukopiranoza, sól trójsodowa lub a-L-idoAp-(1 >4)-a-D-GlcNp2S6S

I IIs: (kwas 2-sulfo-a-L-idopiranozylourono)-(1 >4)-2-dezoksy-2-sulfoamino-a-D-glukopiranoza, sól trójsodowa lub a-L-idoAp2S-(1 >4)-a-D-GlcNp2S6S

IdoAp : kwas idopiranozylouronowy

GlcNp: 2-amino-2-dezoksy-glukopiranoza

ΔUap : kwas 4-dezoksy-a-L-treo-heksaenopiranozylouronowy

S: siarczan.

Przykłady wytwarzania mieszanin związków pośrednich o wzorze (II)

P r z y k ł a d A - wytwarzanie oligosacharydów o wzorze (II), w którym wartość n = 0, 1 i 2 przez depolimeryzację enzymatyczną i rozdzielanie

Rozpuszczono 25 g heparyny w 250 ml roztworu buforu fosforanowego, zawierającego 0,05 mol/l NaH2PO4/Na2HPO4 (pH = 7), 0,2 mol/l chlorku sodowego i 2% BSA (bydlęcej albuminy surowicy). Do mieszaniny dodano 7 j.m. heparynazy I: (EC 4.2.2.2.7) i uzyskany roztwór schłodzono do temperatury 15°C, po czym utrzymywano w tej temperaturze przez cały czas trwania reakcji depolimeryzacji. Postęp reakcji śledzono, pobierając cyklicznie próbki i analizując je w chromatografii permeacyjnej żelowej. Po 9 dniach reakcję enzymatyczną przerwano, ogrzewając środowisko reakcji do temperatury 100°C przez dwie minuty. Schłodzoną mieszaninę poddano następnie liofilizacji. Uzyskano w ten sposób mieszaninę oligosacharydów (III)

Wytworzoną mieszaninę oligosacharydów (III) poddano następnie chromatografii następującym sposobem: chromatografię wykonano na kolumnach napełnionych żelem poliakrylamidowo-agarozowym, znanym pod nazwą Ultrogel ACA 202 i mieszaninę eluowano roztworem zawierającym bufor fosforanowy (0,02 mol/l NaH2PO4/Na2HPO4) pH=7 i 0,1 mol/l chlorku sodowego. Detekcję prowadzono metodą spektrometrii UV (254 nm) i jonowej (IBF). Produkty można ostatecznie oczyszczać metodą chromatografii SAX (wymiana silnych anionów) lub przez strącanie frakcjonowane, sposobem opisaPL 204 419 B1 nym w patencie FR 2548672. Odzyskane frakcje produktu liofilizuje się i następnie odsala na kolumnie żelowej Sephadex G10^R (Pharmacia Biochemicals).

Tym sposobem wytwarza się 3 g disacharydu Δ^, 1100 mg mieszaniny heksasacharydu, zawierającej typowo 55% pochodnej Δ^-^-^, 35% Δ^-^-^ i 10% Δ^-^-Η^. Tę ostatnią mieszaninę można oczyszczać sposobami znanym specjalistom, aby oddzielić z niej poszczególne składniki, lub stosować w stanie niezmienionym do transformacji do zredukowanych pochodnych o wzorze (I).

P r z y k ł a d B - wytwarzanie oligosacharydów o wzorze (II), w którym wartość n = 0, 1, 2, 3 lub 4, przez depolimeryzację estru benzylowego heparyny i rozdzielanie

A - Wytwarzanie estru benzylowego heparyny

Ester benzylowy heparyny wytwarza się sposobem opisanym w przykładzie 3 patentu US 5,389,618.

B - Depolimeryzacja

100 g estru benzylowego heparyny rozpuszczono w 1,9 l wody zdemineralizowanej. Mieszaninę ogrzano do temperatury 60°C, wstrząsając. Po wytworzeniu jednolitego roztworu wprowadzono jednorazowo około 35 ml 23% roztworu wodorotlenku sodowego. Po 10 minutach reakcji mieszaninę schłodzono i zobojętniono, dodając 80 ml roztworu kwasu octowego około 2 N. Do tego roztworu dodano 10% masa/obj. octanu sodowego. Mieszaninę oligosacharydów strącono, dodając około 2 objętości metanolu. Osad izolowano przez filtrację, przepłukano dwukrotnie metanolem i suszono pod zmniejszonym ciśnieniem w temperaturze 50°C. Po wysuszeniu uzyskano 73,8 g mieszaniny oligosacharydów (II).

C - Wzbogacanie w oligosacharyd o n = 1 g mieszaniny oligosacharydów wytworzonych uprzednio rozpuszczono w około 35 objętościach wody. Roztwór ten poddano ultrafiltracji przez błonę 3 kDa (Pellicon). Po uzyskaniu 600 ml przesączu, osad rozcieńcza się 500 ml wody. Proces prowadzono do uzyskania dodatkowych 450 ml przesączu. Obie frakcje przesączu połączono, po czym zatężono na sucho pod zmniejszonym ciśnieniem. Uzyskano 6,1 g białożółtawej substancji stałej. Analiza substancji stałej przez chromatografię permeacyjną na żelu wykazała zawartość około 30% oligosacharydu o wzorze(II), w którym n = 1.

D - Frakcjonowanie mieszanin oligosacharydów po ultrafiltracji

Wzbogaconą mieszaninę frakcjonowano na kolumnach napełnionych żelem poliakrylamidowo-agarozowym, znanym pod nazwą Ultrogel ACA 202 (stosuje się serię 4 kolumn o średnicy 10 cm i wysokości 50 cm). 5 g mieszaniny, wzbogaconej przez ultrafiltrację, rozpuszczono w 25 ml wody, po czym eluowano roztworem 0,2 mol/l chlorku sodowego z prędkością 5 ml/min. Na dole kolumny uzyskuje się frakcje po 25 ml. Detekcję produktów prowadzi się przez spektrofotometrię UV (254 nm) i jonową (IBF). Frakcje produktu o n = 1 są odzyskiwane, liofilizowane i odsalane na kolumnie wypełnionej żelem Sephadex G10. W wyniku liofilizacji uzyskuje się 1 g tetrasacharydu, zawierającego typowo 70% pochodnej Ais-is o wzorze II (R₁, R₂, R₃, R₅, R₇, R₈ = SO₃Na; R₄, R₆ = H i M = Na). Pochodną Δ^-Is można na koniec oczyszczać chromatografię SAX (wymiana silnych anionów) lub, korzystnie, poprzez strącanie frakcjonowane, sposobem opisanym w patencie FR 2548672 i według odmiany niniejszego wynalazku.

Przykłady wytwarzania oligosacharydów o wzorze (I)

P r z y k ł a d 1

Do reaktora wprowadzono roztwór o temperaturze 25°C 300 mg oligosacharydu o wzorze (II), w którym wartość n wynosi 0, R1, R7 i R8 stanowią rodnik SO3M, R6 stanowi atom wodoru, a M stanowi atom sodu, w 2 ml wody. Dodano jednorazowo, wstrząsając, 212 mg borowodorku sodowego. pH doprowadzono do wartości od 9 do 10 poprzez dodanie roztworu wodorotlenku sodowego w stężeniu 0,5 mol/l. Po 12 godzinach dodano stopniowo kwas octowy do uzyskania pH 4-5. Mieszaninę wstrząsano przez 1 godzinę, po czym pH zmieniono na 6,7, dodając 0,5 mol/l wodorotlenku sodowego. Mieszaninę zatężono następnie na sucho w temperaturze 50°C pod zmniejszonym ciśnieniem. Koncentrat rozproszono przez wstrząsanie magnetyczne w 10 ml metanolu. Po sedymentacji przez noc zawiesinę przefiltrowano przez błonę Whatman GFB. Substancję stałą na filtrze rozpuszczono przez przepuszczenie 2 porcji po 10 ml wody destylowanej. Roztwór ten zatężono następnie na sucho w temperaturze 50°C pod zmniejszonym ciśnieniem. Uzyskano 580 mg białej substancji stałej. Substancję stałą rozproszono następnie przez wstrząsanie magnetyczne w 15 ml metanolu. Po 30 minutach wstrząsania zawiesinę przefiltrowano na błonie Whatman GFB. Placek rozpuszczono poprzez przepuszczenie 2 porcji po 10 ml wody destylowanej. Wytworzono roztwór zatężano na sucho w temperaturze 50°C pod zmniejszonym ciśnieniem. Uzyskano w ten sposób 250 mg oligosacharydu o wzorze (I), w którym n wynosi 0, R1, R7 i R8 stanowią rodnik SO3M, R6 stanowi atom wodoru, a M stanowi atom sodu, pod postacią mieszaniny diastereoisomerów. Cukry składnikowe disacharydów oznaczono

PL 204 419 B1 numerami I i II, przy czym I stanowi zredukowaną resztę, a II resztę nienasyconego kwasu uronowego

[(kwas 4-dezoksy-2-0-sulfo-a-L-treo-heksa-4-enopiranozylourono(1 >4)-2-dezoksy-6-0-sulfo-2-sulfoamino-D-glucitol, sól czterosodowa); (kwas 4-dezoksy-2-0-sulfo-a-L-treo-heksa-4-enopiranozylourono-(1 >4)-2-dezoksy-6-0-sulfo-2-sulfoamino-D-mannit sól czterosodowa): Widmo protonowe w D₂O 600 MHz, T=305K, δ w ppm: 3,38 (1H, m, H-2^(I)), 3,70 i 3,75 (po 1H, odpowiednio dd, J=6 i 12Hz i dd, J=5 i 12Hz, 2H-1^(I), 3,86 (1H, t, J=5Hz, H-3^(I)), 4,13 (1H, dd, J=8 i 11Hz, H-6^(I)), 4,18 (1H, m, H-4^(I)), 4,25 (2H, m, H-6^(I) i H-3^(II)), 4,35 (1H, m, H-5^(I)), 4,65 (1H, m, H-2^(II)), 5,67 (1H, s, H-1^(II)), 6,00 (1H, d, J=5Hz, H-4^(II))].

P r z y k ł a d 2

Do reaktora wprowadzono roztwór, w temperaturze 25°C, 60 mg oligosacharydu o wzorze (II), w którym wartość n wynosi 0, R1, R2, R3, R5, R7 i R8 stanowi rodnik SO3M, R4 i R6 stanowią atom wodoru, a M stanowi atom sodu, w 1,2 ml wody. Dodano jednorazowo, wstrząsając, 18 mg borowodorku sodu. pH doprowadzono do wartości 9-10, dodając roztwór wodorotlenku sodowego w stężeniu 0,5 mol/l. Po 12 godzinach dodano stopniowo kwas octowy aż do uzyskania pH 4-5. Mieszaninę wstrząsano przez 1 godzinę, po czym dodano 5 ml metanolu. Zawiesinę filtrowano przez błonę Whatman GFB, a odzyskaną substancję stałą przepłukano dwukrotnie 0,5 ml metanolu. Po wysuszeniu uzyskano 42 mg oligosacharydu o wzorze (I), w którym wartość n wynosi 1, R1, R2, R3, R5, R7 i R8 stanowią rodnik SO3M, R4 i R6 stanowią atom wodoru, a M stanowi atom sodu, w postaci mieszaniny diastereoisomerów. Cukry składające się na ten tetrasacharyd oznacza się numerami od I do IV, przy czym I stanowi resztę zredukowaną, a IV resztę nienasyconego kwasu uronowego [(kwas 4-dezoksy-2-O-sulfo-a-L-treo-heksa-4-enopiranozylourono(1 >4)-2-dezoksy-6-O-sulfo-2-sulfoamino-a-D-glukopiranozylo-(1 >4)-kwas 2-O-sulfo-a-L-idopiranozylourono-(1 >4)-2-dezoksy-2-sulfoamino-6-O-sulfo-D-glucytol, sól ośmiosodowa); (kwas 4-dezoksy-2-0-sulfo-a-L-treo-heksa-4-enopiranozylourono-(1 >4)-2-dezoksy-6-O-sulfo-2-sulfoamino-a-D-glukopiranozylo-(1 >4)-kwas 2-O-sulfo-a-L-idopiranozylourono-(1>4)-2-dezoksy-6-O-sulfo-2-sulfoamino-D-mannit, sól ośmiosodowa): Widmo protonowe w D2O, 400MHz, T=298K, δ w ppm: 3,25 (1H, dd, J=10 i 3Hz, H-2^(III)), 3,37 (1H, m, H-2^(I)), 3,59 (1H, m, H-3^(III)), 3,75 (2H, m, 2H-1^(I)), 3,79 (1H, t, J=9Hz, H-4^(III)), 3,86 (1H, m, H3^(I)), od 4,05 do 4,40 (10H, masowe, H-4^(I)/H-5^(I)/2H-6^(I), H-2^(II)/H-3^(II)/H-4^(II)), 2H-6^(III)), H-3^(IV), 4,58 (1H, m, H-2^(IV)), 4,60 (1H, m, H-5^(II)), 5,27 (1H, d, J=4Hz, H-1^(II)), 5,42 (1H, d, J=4Hz, H-1^(III)), 5,47 (1H, d, J=2Hz, H-1^(IV)), 5,95 (1H, d, J=5Hz, H-4^(IV)}].

P r z y k ł a d 3

Do reaktora wprowadzono roztwór, w temperaturze 25°C, 100 mg oligosacharydu o wzorze (II), w którym wartość n wynosi 2, R1, R2, R3, R5, R7 i R8 stanowią rodnik SO3M, R4 i R6 stanowią atom wodoru, a M stanowi atom sodu, w 2 ml wody. Dodano jednokrotnie, wstrząsając, 2 0 mg borowodorku sodu. pH doprowadzono do wartości od 9 do 10, dodając roztwór wodorotlenku sodowego w stężeniu 0,5 mol/l. Po 12 godzinach dodano stopniowo kwas octowy aż do uzyskania pH wynoszącego 4-5. Mieszaninę wstrząsano przez 1 godzinę, następnie pH doprowadzono do wartości 6,7, dodając 0,5 mol/l wodorotlenek sodowy. Mieszaninę następnie rozcieńczono wodą destylowaną w ilości wystarczającej do uzyskania 20 ml. Dodano 2,5 g octanu sodowego i wlano 3 objętości metanolu. Zawiesinę przefiltrowano na błonie Whatman GFB i uzyskaną substancję stałą przepłukano dwukrotnie 2 ml metanolu. Po wysuszeniu uzyskano 61 mg oligosacharydu o wzorze (I), w którym n wynosi 2, R1, R2, R3, R5, R7 i R8 stanowią rodnik SO3M, R4 i R6 stanowią atom wodoru, a M stanowi atom sodu, w postaci mieszaniny diastereoisomerów. Kolejne cukry heksasacharydów oznacza się liczbami od I do VI, przy czym I oznacza resztę zredukowaną, a VI - nienasyconą resztę kwasu uronowego [(kwas 4-dezoksy-2-O-sulfo-a-L-treo-heksa-4-enopiranozylourono-(1 >4)-2-dezoksy-2-sulfoamino-6-O-sulfo-a-D-glukopiranozylo-(1 >4)-kwas 2-O-sulfo-a-L-idopiranozylourono-(1 >4)-2-dezoksy-2-sulfoamino-6-O-sulfo-a-D-glukopiranozylo-(1 >4) -kwas 2-0-sulfo-a-L-idopiranozylourono-(1 >4)-2-dezoksy-2-sulfoamino-6-O-sulfo-D-glucitol, sól dwunastosodowa); (kwas 4-dezoksy-2-O-sulfo-a-L-treo-heksa-4-enopiranozylourono-(1 >4)-2-dezoksy-6-O-sulfo-2-sulfoamino-a-D-glukopiranozylo-(1 >4)-kwas 2-O-sulfo-a-L-idopiranozylourono-(1 >4)-2-dezoksy-6-O-sulfo-2-sulfoamino-a-D-glukopiranozylo-(1 >4)kwas 2-O-sulfo-a-L-idopiranozylourono-(1 >4)-2-dezoksy-6-O-sulfo-2-sulfoamino-D-mannit sól dwunastosodowa): Widmo protonowe w D2O, 600 MHz, T=305K, δ w ppm: 3,25 (2H, m, H-2^(III) i ^(v)), 3,38 (1H, m, H-2^(I)), 3,61 (2H, t, J=10Hz, H-3^(III) i ^(V)), od 3,70 do 3,83 (4H, masowe, 2H-1^(I)) i H-4^(III)), 3,86 (1H, t, J=5Hz, H-3^(I))), 4,00 (2H, m, H-5^(III) i ^(v)), 4,07 (1H, m, H-4^(IV)), 4,08 (1H, m, H-4^(I)), od 4,10 do 4,45 (13H, masowe, H-5^(I)/2H-6^(I), H-2^(II)/H-3^(II)/H-4^(II), 2H-6^(III), H-2^(IV))/H-3^(IV), 2H-6^(v), H-3^(VI), 4,60 (1H, s, H-2^(VI)), 4,62 (1H, s, H-5^(II)))), 4,78 (1H, s, H-5^(IV)), 5,17 (1H, s, H-1^(IV)), 5,28 (1H, d, J=4Hz, H-1^(II)),

PL 204 419 B1

5,38 (1H, d, J=3Hz, H-1^(v)), 5,44 (1 H, d, J=3Hz, H-1^(III)), 5,47 (1H, d, J=2Hz, H-1^(VI)), 5,96 (1H, d, J=5Hz, H-4^(VI)]

P r z y k ł a d 4

Do reaktora wprowadzono roztwór, w temperaturze 25°C, 100 mg oligosacharydu o wzorze (II), w którym wartość n wynosi 3, R1, R2, R3, R5, R7 i R8 stanowią rodnik SO3M, R4 i R6 stanowią atom wodoru, a M stanowi atom sodu, w 2 ml wody. Dodano w dwóch porcjach, wstrząsając, 30 mg borowodorku sodu. pH doprowadzono do wartości 9-10 poprzez dodanie 0,5 mol/l roztworu wodorotlenku sodowego. Po 12 godzinach dodano stopniowo kwas octowy do uzyskania pH 4-5. Mieszaninę wstrząsano przez 1 godzinę, po czym pH doprowadzono do 6,7 poprzez dodanie 0,5 mol/l wodorotlenku sodowego. Mieszaninę rozcieńczono wodą destylowaną w ilości wystarczającej do uzyskania 20 ml. Dodano 2 g octanu sodowego i wlano 3 objętości metanolu. Zawiesinę filtrowano na błonie Whatmana GF/B i uzyskaną substancję stała dwukrotnie płukano 1 ml metanolu. Po wysuszeniu uzyskano 68 mg białej substancji stałej. Po kontroli metodą HPLC, w której stwierdzono, że produkt nie w pełni uległ redukcji, powtórzono w całości wszystkie uprzednie działania. Po wysuszeniu uzyskano 45 mg oligosacharydu o wzorze (I), w którym n wynosi 3, R1, R2, R3, R5, R7 i R8 stanowią rodnik SO3M, R4 i R6 stanowią atom wodoru, a M stanowi atom sodu, w postaci mieszaniny diastereoisomerów. Kolejne cukry oktasacharydów oznaczono jako I-VIII, przy czym I stanowi resztę zredukowaną, a VIII resztę nienasyconego kwasu uronowego [(kwas 4-dezoksy-2-O-sulfo-a-L-treo-heksa-4-enopiranozylourono-(1 »4)-2-dezoksy-6-O-sulfo-2-sulfoamino-a-D-glukopiranozylo-(1 »4)-kwas 2-O-sulfo-a-L-idopiranozylourono-(1 »4)-2-dezoksy-2-sulfoamino-6-O-sulfo-a-D-glukopiranozylo-(1 »4)-kwas 2-O-sulfo-a-L-idopiranozylourono-(1 »A)-2-dezoksy-6-O-sulfo-2-sulfoamino-a-D-glukopiranozylo-(1 »4)-kwas 2-O-sulfo-a-1-idopiranozylourono-(1 —4)-2-dezoksy-6-O-sulfo-2-sulfoamino-D-glucytol, sól szesnastosodowa); (kwas 4-dezoksy-2-O-sulfo-a-L-treo-heksa-4-enopiranozylourono-(1 —4)-2-dezoksy-6-O-sulfo-2-sulfoamino-a-D-glukopiranozylo-(1 —4)-kwas 2-O-sulfo-a-L-idopiranozylourono-(1- —4)-2-dezoksy-6-O-sulfo-2-sulfoamino-a-D-glukopiranozylo- (1 —4)-kwas 2-O-sulfo-a-L-idopiranozylourono-(1 —4)-2-dezoksy-6-O-sulfo-2-sulfoamino-a-D-glukopiranozylo- (1—4)-kwas 2-O-sulfo-a-L-idopiranozylourono-(1—4)-2-dezoksy-6-O-sulfo-2-sulfoamino-D-mannit, sól szesnastosodowa): Widmo protonowe w D2O, 600MHz, T=305K, δ w ppm: 3,25 (3H, m, H-2^(III), H-2^(v), H-2^(VII), 3,38 (1H, m, H-2^(I)), 3,61 (3H, m, H-3^(III), H-3^(v), H-3^(VII)), od 3,70 do 3,83 (5H, masowe, 2H-1^(I) i H-4^(III), H-4^(v), H-4^(VII)), 3,86 (1H, t, J=5Hz, H-3^(I)), 4,00 (3H, m, H-5^(III), H-5^(v), H-5^(VII)), 4,08 (3H, m, H-4^(I), H-4^(IV), H-4^(VI), od 4,10 do 4,45 (17H, masowe, H-5^(I)/2H-6^(I), H-2^(II)/H-3^(II)/H-4^(II), 2H-6^(III), H-2^(IV)/H-3^(IV), 2H-6^(V), H-2^(VI)/H-3^(VI), 2H-6^(VII), H-3^(VIII)), 4,59 (1H, s, H-2^(VIII)), 4,62 (1H, s, H-5^(II)), 4,78 (2H, s, H-5^(IV), H-5^(VI)), 5,17 (2H, s, H-1^(IV), H-1^(VI)), 5,28 (1H, d, J=4Hz, H-1^(II)), 5,38 (2H, m, H-1^(v)), H-1^(VII)), 5,44 (1H, d, J=3Hz, H-1^(III)), 5,47 (1H, s, H-1^(VIII)), 5,96 (1H, d, J=5Hz, H-4^(VIII))].

P r z y k ł a d 5

Do reaktora wprowadzono roztwór, w temperaturze 25°C, 65 mg oligosacharydu o wzorze (II), w którym wartość n wynosi 4, R1, R2, R3, R5, R7 i R8 stanowią rodnik SO3M, R4 i R6 stanowią atom wodoru, a M stanowi atom sodu, w 1,2 ml wody. Dodano jednokrotnie, wstrząsając, 18 mg borowodorku sodu. pH doprowadzono do wartości 9-10 poprzez dodanie 0,5 mol/l roztworu wodorotlenku sodowego. Po 12 godzinach dodano stopniowo kwas octowy do uzyskania pH 4-5. Mieszaninę wstrząsano przez 1 godzinę, po czym pH doprowadzono do 6,7 poprzez dodanie 0,5 mol/l wodorotlenku sodowego. Mieszaninę rozcieńczono 3 ml wodnego roztworu octanu sodowego i wlano 3 objętości metanolu (12 ml). Zawiesinę filtrowano i uzyskaną substancję stałą przepłukano 3 ml metanolu. Po wysuszeniu uzyskano 54 mg oligosacharydu o wzorze (I), w którym n wynosi 4, R1, R2, R3, R5, R7 i R8 stanowią rodnik SO3M, R4 i R6 stanowią atom wodoru, a M stanowi atom sodu, w postaci mieszaniny diastereoizomerów. Kolejne cukry dekasacharydów oznaczono jako I-X, przy czym I stanowi resztę zredukowaną, a X resztę nienasyconego kwasu uronowego. [(kwas 4-dezoksy-2-O-sulfo-a L-treo-heksa-4-eno-piranozylourono-(1—4)-2-dezoksy-2-sulfoamino-6-O-sulfo-a-D-glukopiranozylo-(1—4)-kwas 2-O-sulfo-a-L-idopiranozylourono-(1—4)-2-dezoksy-6-O-sulfo-2-sulfoamino-a-D-glukopiranozylo-(1 —4)-kwas 2-O-sulfo-a-L-idopiranozylourono-(1—4)-2-dezoksy-6-O-sulfo-2-sulfoamino-a-D-glukopiranozylo-(1—4)-kwas 2-O-sulfo-a-L-idopiranozylourono-(1—4)-2-dezoksy-6-O-sulfo-2-sulfoamino-a-D-glukopiranozylo-(1 —4)-kwas 2-O-sulfo-a-L-idopiranozylourono-(1 —4)-2-dezoksy-6-O-sulfo-2-sulfoamino-D-glucytol, sól eikosodowa); (kwas 4-dezoksy-2-O-sulfo-a-L-treo-heksa-4-enopiranozylourono(1—4)-2-dezoksy-6-O-sulfo-2-sulfoamino-a-D-glukopiranozylo-(1—4)-kwas 2-Osulfo-a-L-idopiranozylourono-(1—4)-2-dezoksy-6-O-sulfo-2-sulfoamino-a-D-glukopiranozylo-(1—4)kwas 2-O-sulfo-a-L-idopiranozylourono-(1—4)-2-dezoksy-6-O-sulfo-2-sulfoamino-a-D-glukopiranozy12

PL 204 419 B1 lo-(1 ^4)-kwas 2-O-sulfo-a-L-idopiranozylourono-(1^4)-2-dezoksy-6-O-sulfo-2-sulfoamino-a-D-glukopiranozylo-(1^4)-kwas 2-O-sulfo-a-L-idopiranozylourono-(1^4)-2-dezoksy-6-O-sulfo-2-sulfoamino-D-mannit, sól eikosodowa): Widmo protonowe w D2O, 600MHz, T=303K, δ w ppm: 3,23 (4H, m, H-2^(III), H-2^(v), H-2^(VII), H-2^(IX)), 3,35 (1H, m, H-2^(I)), 3,59 (4H, m, H-3^(III), H-3^(v), H-3^(VII), H-3^(IX)), od 3,65 do 3,80 (x) (II) (6H, m), 3,85 (1H, m, H-3^(I)), od 3,90 do 4,40 (29H, m), 4,57 (1H, m, H-2^(x)), 4,59 (1H, m, H-5^(II)), 4,75 (3H, m, H-5^(IV), H-5^(VI), H-5^(VIII), 5,15 (3H, m, H-1^(IV) ,H-1^(VI), H-1^(VIII)), 5,25 (1H, m, H-1^(II)), 5,37 (3H, m, 5,42 (1H, m, H-1^(III)), 5,45 (1H, m, H-1^(x)), 5,93 (1 H, d, J=5Hz, H-4^(x)).

H-1^(v), H-1

Claims

1. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że jako składnik czynny zawiera oligosacharyd o wzorze:

2. Oligosacharyd o wzorze:

3. Sposób wytwarzania oligosacharydu o wzorze (I) określonego w zastrz. 2, znamienny tym, że poddaje się reakcji borowodorek metalu alkalicznego lub borowodorek czwartorzędowego związku amonowego z oligosacharydami o wzorze:

PL 204 419 B1 w którym n oznacza liczbę całkowitą od 1 do 4, R1, R3, R4, R5, są takie same lub różne, oznaczają atom wodoru lub rodnik SO3M, R2 i R6, takie same lub różne, oznaczają atom wodoru lub rodnik SO3M, a M oznacza atom sodu, i izoluje się oligosacharyd.

4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że reakcję prowadzi się w środowisku wodnym w temperaturze zbliż onej do 25°C i w pH 7-10.

5. Sposób według zastrz. 3 albo 4, znamienny tym, że pH reakcji wynosi 9-10.

6. Sposób według zastrz. 3 albo 4, znamienny tym, że jako borowodorek metalu alkalicznego lub borowodorek czwartorzędowego związku amonowego stosuje się borowodorek litu, sodu, potasu lub tetrabutyloamoniowy.

7. Zastosowanie oligosacharydu o wzorze (I) określonego w zastrz. 2, do wytwarzania leków do zapobiegania i leczenia chorób zapalnych wywołujących wytwarzanie tlenku azotu.

8. Zastosowanie według zastrz. 7, do wytwarzania leków do zapobiegania i leczenia niedokrwienia mózgu, serca lub naczyń obwodowych, zapalenia stawów i kości, urazów ośrodkowego układu nerwowego, urazów czaszki i/lub rdzenia kręgowego, stwardnienia rozsianego, bólów neuropatycznych i neuropatii obwodowych, chorób neuronu ruchowego, stwardnienia zanikowego bocznego, AIDS układu nerwowego, choroby Alzheimera, choroby Parkinsona i pląsawicy Huntingtona.

9. Zastosowanie według zastrz. 7, do wytwarzania leków do zapobiegania i leczenia chorób związanych z przeżyciem i wzrostem neuronów ruchowych