[go: up one dir, main page]
More Web Proxy on the site http://driver.im/

PL192104B1 - Syntetyczny gen kodujący białko czynnika VIII, wektor ekspresji, komórka ssaka i sposób wytwarzania syntetycznego genu - Google Patents

Syntetyczny gen kodujący białko czynnika VIII, wektor ekspresji, komórka ssaka i sposób wytwarzania syntetycznego genu

Info

Publication number
PL192104B1
PL192104B1 PL376940A PL37694097A PL192104B1 PL 192104 B1 PL192104 B1 PL 192104B1 PL 376940 A PL376940 A PL 376940A PL 37694097 A PL37694097 A PL 37694097A PL 192104 B1 PL192104 B1 PL 192104B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
gene
codons
synthetic gene
cag
synthetic
Prior art date
Application number
PL376940A
Other languages
English (en)
Inventor
Brian Seed
Jürgen Haas
Original Assignee
Gen Hospital Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=24881447&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=PL192104(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Gen Hospital Corp filed Critical Gen Hospital Corp
Publication of PL192104B1 publication Critical patent/PL192104B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
    • C07K14/43595—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from coelenteratae, e.g. medusae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • C07K14/755—Factors VIII, e.g. factor VIII C (AHF), factor VIII Ag (VWF)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/67—General methods for enhancing the expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
    • C12N2740/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Abstract

1. Syntetyczny gen kodujacy bialko czynnika VIII pozbawione centralnej domeny regionu B, w którym co najmniej jeden niekorzystny lub mniej korzystny kodon w naturalnym genie kodujacym to bialko zastapiono korzystnym kodonem kodujacym ten sam aminokwas, przy czym wspomniane korzystne kodony wybrane sa z grupy obejmujacej gcc, cgc, aac, gac, tgc, cag, ggc cac atc, ctg, aag, ccc, ttc, agc, acc, tac, gtg, i mniej korzystne kodony sa wybrane z grupy obejmujacej ggg, att, ctc, tcc, gtc i agg i wspomniane nie korzystne kodony sa wszystkimi kodonami innymi niz wspo- mniane korzystne kodony i mniej korzystne kodony. PL PL PL

Description

Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest syntetyczny gen kodujący białko czynnika VIII, wektor ekspresji, komórka ssaka i sposób wytwarzania syntetycznego genu geny. W wynalazku rozwiązywany jest problem uzyskania ekspresji eukariotycznych i wirusowych białek w dużych ilościach w komórkach eukariotycznych.
Ekspresja produktów eukariotycznych genów w prokariontach jest niekiedy ograniczana obecnością kodonów rzadko używanych w E. coli. Ekspresja takich genów może być polepszona przez systematyczną substytucję endogennych kodonów kodonami nadreprezentowanymi w dających silną ekspresję prokariotycznych genów (Robinson i in., Nucleic Acids Res. 12:6663, 1984). Przypuszcza się pospolicie, że rzadkie kodony powodują pauzowanie rybosomu, co prowadzi do nieukończenia powstającego łańcucha polipeptydowego i rozkojarzenia transkrypcji i translacji. Pauzowanie rybosomuma prowadzić do odsłonięcia końca 3' mRNA na działanie komórkowych rybonukleaz.
Przedmiotem wynalazku jest syntetyczny gen kodujący białko normalnie ulegające ekspresji w komórce ssaka lub innej eukariotycznej komórce, w którym co najmniej jeden niekorzystny lub mniej korzystny kodon w naturalnym genie kodującym białko zastąpiono korzystnym kodonem kodującym ten sam aminokwas.
Korzystnymi kodonami są: Ala (gcc); Arg (cgc); Asn (aac); Asp (gac); Cys (tgc); Gln (cag); Gly (ggc); His (cac); Ile (atc); Leu (ctg); Lys (aag); Pro (ccc); Phe (ttc); Ser (agc); Thr (acc); Tyr (tac) i Val (gtg). Mniej korzystnymi kodonami są: Gly (ggg); Ile (att); Leu (ctc); Ser (tcc); Val (gtc) i Arg (agg). Wszystkie kodony, które nie mieszczą się w opisie korzystnych kodonów lub mniej korzystnych kodonów, oznaczają niekorzystne kodony. Ogólnie, stopień preferencji konkretnego kodonu jest wskazywany przez przeważanie kodonu w ludzkich genach o wysokiej ekspresji, jak wskazano w tabeli 1 pod nagłówkiem Wysoka Np., atc reprezentuje 77% kodonów Ile genów ssaka o wysokiej ekspresji ijest korzystnym kodonem Ile; att reprezentuje 18% kodonów Ile genów ssaka o wysokiej ekspresji i oznacza mniej korzystny kodon Ile. Sekwencja ata reprezentuje tylko 5% kodonów Ile ludzkich genów o wysokiej ekspresji jako niekorzystny kodon Ile. Zastąpienie kodonu innym kodonem przeważającym w ludzkich genach o wysokiej ekspresji będzie ogólnie zwiększało ekspresję genu w komórkach ssaka. Odpowiednio, wynalazek obejmuje zastąpienie mniej korzystnego kodonu korzystnym kodonem, jak też zastąpienie niekorzystnego kodonu korzystnym lub mniej korzystnym kodonem.
Przez białko normalnie ulegające ekspresji w komórce ssaka rozumie się białko, które ulega ekspresji w ssaku w naturalnych warunkach. Termin obejmuje geny w genomie ssaka, takie jak kodujące czynnik VIII, czynnik IX, interleukiny i inne białka. Termin obejmuje także geny, które ulegają ekspresji w komórce ssaka w warunkach choroby, takie jak onkogeny, jak też geny, które są kodowane przez wirusa (w tym retrowirusa) i które ulegają ekspresji w komórkach ssaka po infekcji. Przez białko normalnie ulegające ekspresji w eukariotycznej komórce rozumie się białko, które ulega ekspresji w eukarioncie w warunkach naturalnych. Termin obejmuje także geny, które ulegają ekspresji w komórce ssaka w warunkach choroby.
W korzystnych odmianach syntetyczny gen jest zdolny do ekspresji białka ssaka lub eukariotycznego na poziomie, który wynosi co najmniej 110%, 150%, 200%, 500%, 1000%, 5000% lub nawet 10000% poziomu ekspresji dla naturalnego (lub natywnego) genu w układzie kultury komórek ssaka in vitro w identycznych warunkach (to jest, ten sam typ komórki, te same warunki kultury, ten sam wektor ekspresji).
Odpowiednie układy kultur komórkowych do mierzenia ekspresji syntetycznego genu i odpowiedniego naturalnego genu opisano poniżej. Inne odpowiednie układy ekspresji wykorzystujące komórki ssaka są dobrze znane specjalistom i są opisane w np., standardowych publikacjach informacyjnych z dziedziny biologii molekularnej wspomnianych poniżej. Wektory odpowiednie do ekspresji syntetycznych i naturalnych genów opisano poniżej i w standardowych publikacjach informacyjnych opisanych poniżej. Przez ekspresje rozumie się ekspresję białka. Ekspresję można mierzyć stosując przeciwciało specyficzne dla danego białka. Takie przeciwciała i techniki pomiaru są dobrze znane specjalistom. Przez naturalny gen i natywny gen rozumie się sekwencję genu (w tym naturalnie występujące warianty allelowe) która naturalnie koduje białko, to jest, natywną lub naturalną sekwencję kodującą.
W innych korzystnych odmianach co najmniej 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% lub 90% kodonów w naturalnym genie to niekorzystne kodony.
PL 192 104 B1
W innych korzystnych odmianach co najmniej 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, lub 90% niekorzystnych kodonów w naturalnym genie zastępuje się korzystnymi kodonami lub mniej korzystnymi kodonami.
W innych korzystnych odmianach co najmniej 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% lub 90% niekorzystnych kodonów w naturalnym genie zastępuje się korzystnymi kodonami.
W korzystnej odmianie białko jest retrowirusowym białkiem. W bardziej korzystnej odmianie białko jest białkiem lentiwirusowym. W jeszcze bardziej korzystnej odmianie białko jest białkiem HIV. W innych korzystnych odmianach białko jest białkiem gag, pol, env, gp120 lub gp160. W innych korzystnych odmianach białko oznacza białko ludzkie. W bardziej korzystnych odmianach białko jest ludzkim czynnikiem VIII i białko jest ludzkim czynnikiem VIII z wyciętym regionem B.
W różnych korzystnych odmianach co najmniej 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% i 95% kodonów w syntetycznym genie to korzystne lub mniej korzystne kodony.
Przedmiotem wynalazku jest także wektor ekspresji obejmujący syntetyczny gen.
W innym aspekcie przedmiotem wynalazku jest komórka zawierająca syntetyczny gen. W różnych korzystnych odmianach komórka oznacza prokariotyczną komórkę i komórka oznacza komórkę ssaka.
W korzystnych odmianach syntetyczny gen obejmuje mniej niż 50, mniej niż 40, mniej niż 30, mniej niż 20, mniej niż 10, mniej niż 5, lub nie obejmuje sekwencji cg.
Przedmiotem wynalazku jest także sposób wytwarzania syntetycznego genu kodującego białko normalnie ulegające ekspresji w komórce ssaka lub innej komórce eukariotycznej. Sposób obejmuje identyfikację niekorzystnych i mniej korzystnych kodonów w naturalnym genie kodującym białko i zastąpienie jednej lub kilku niekorzystnych i mniej korzystnych kodonów korzystnym kodonem kodującym ten sam aminokwas co zastąpiony kodon.
W pewnych okolicznościach (np., aby pozwolić na wprowadzenie miejsca restrykcji) może być pożądane zastąpienie niekorzystnego kodonu mniej korzystnym kodonem, a nie korzystnym kodonem.
Nie jest konieczne zastępowanie wszystkich mniej korzystnych lub niekorzystnych kodonów korzystnymi kodonami. Zwiększoną ekspresję można uzyskać nawet przy częściowym zastąpieniu mniej korzystnych lub niekorzystnych kodonów korzystnymi kodonami. W pewnych okolicznościach może być pożądane tylko częściowe zastąpienie niekorzystnych kodonów korzystnymi lub mniej korzystnymi kodonami w celu uzyskania pośredniego poziomu ekspresji.
W innych korzystnych odmianach przedmiotem wynalazku są wektory (w tym wektory ekspresji) obejmujące jeden lub więcej syntetycznych genów.
Przez wektor rozumie się cząsteczkę DNA, pochodzącą, np., z plazmidu, bakteriofaga lub wirusa ssaka lub owada, do której można wstawiać lub klonować fragmenty DNA. Wektor będzie zawierał jedno lub kilka unikalnych miejsc restrykcji i może być zdolny do autonomicznej replikacji w zdefiniowanym gospodarzu lub organizmie przenoszącym tak, że klonowana sekwencja reprodukuje się. Tak więc przez wektor ekspresji rozumie się dowolny autonomiczny element zdolny do kierowania syntezą białka. Takie wektory ekspresji DNA obejmują plazmidy ssaka i wirusy.
Przedmiotem wynalazku są także fragmenty syntetycznego genu kodujące żądaną część białka. Takie fragmenty syntetycznego genu są podobne do syntetycznych genów według wynalazku poza tym, że kodują tylko część białka. Takie fragmenty genów korzystnie kodują co najmniej 50, 100, 150 lub 500 przylegających aminokwasów białka.
Przy konstruowaniu syntetycznych genów według wynalazku może być pożądane unikanie sekwencji CpG, ponieważ te sekwencje mogą powodować milknięcie genu. Tak więc w korzystnej odmianie region kodujący syntetycznego genu CpG nie obejmuje sekwencji cg.
Przesunięcie kodonowe obecne w genie env gp120 HIV jest także obecne w genach gag i pol. Tak więc zastąpienie części niekorzystnych i mniej korzystnych kodonów w tych genach korzystnymi kodonami powinno dawać gen zdolny do wyższego poziomu ekspresji. Znaczna część kodonów w ludzkich genach kodujących Czynnik VIII i czynnik IX są niekorzystnymi kodonami lub mniej korzystnymi kodonami. Zastąpienie części tych kodonów korzystnymi kodonami powinno dać geny zdolne do wyższego poziomu ekspresji w kulturze komórek ssaka.
Syntetyczne geny według wynalazku można wprowadzać do komórek żywego organizmu. Np., wektory (wirusowy lub niewirusowy) można stosować do wprowadzania syntetycznego genu do komórek żywego organizm w celu terapii genowej.
Odwrotnie, może być pożądane zastępowanie korzystnych kodonów w naturalnie występującym genie mniej korzystnymi kodonami jako środkiem obniżania ekspresji.
PL 192 104 B1
Standardowe pozycje literaturowe opisujące ogólne zasady techniki rekombinacji DNA obejmują Watsona i in., Molecular Biology of the Gene, tomy I i II, wydawca Benjamin/Cunmings Publishing Company, Inc., Menlo Park, CA (1987); Darnella i in., Molecular Cell Biology, wydawca Scientific American Books, Inc., New York, N.Y. (1986); Olda i in., Principles of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Engineering, wyd. 2, wydawca University of California Press, Berkeley, CA (1981); Maniatisa i in., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, wyd. 2, wydawca Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989); oraz Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel i in., Wiley Press, New York, NY (1992).
Przez transformowaną komórkę rozumie się komórkę, do której (lub jej przodka) wprowadzono, metodą technik rekombinacyjnych DNA, wybraną cząsteczkę DNA, np., syntetyczny gen.
Przez ustawioną do ekspresji rozumie się, że cząsteczka DNA, np., syntetyczny gen, jest umieszczony w sąsiedztwie sekwencji DNA, która kieruje transkrypcją i translacją sekwencji to jest, ułatwia wytwarzanie białka kodowanego przez syntetyczny gen.
Figura 1 pokazuje sekwencję syntetycznego genu gp120 i syntetycznego genu gp160, w których kodony zastąpiono znajdowanymi w ludzkich genach o wysokiej ekspresji.
Figura 2 jest schematem syntetycznego genu gp120 (HIV-1 MN).Zacienione części oznaczone v1 do v5 wskazują regiony silnie zmienne. Wypełniony prostokąt wskazuje miejsce wiązania CD4. Pokazano ograniczoną liczbę unikalnych miejsc restrykcji: H (Hind3), Nh (Nhe1), P (Pst1), Na (Nae1), M (Mlu1), R (EcoR1), A (Age1) i No (Not1). Chemicznie zsyntetyzowane fragmenty DNA służące jako wzorce PGR pokazano poniżej sekwencji gp120, wraz z lokacjami starterów użytych do ich wzmacniania.
Figura 3 jest fotografią wyników prób przejściowej transfekcji użytych do pomiaru ekspresji gp120. Elektroforeza żelowa immunoprecypitowanych supernatantów komórek 293T transfekowanych plazmidami ekspresji gp120 kodowanymi przez izolat IIIB HIV-1 (gp120IIIb), izolat MN HIV-1 (gp120mn), izolat MN HIV-1 zmodyfikowany przez substytucję endogennego liderowego peptydu peptydem antygenu CD5 (gp120mnCD5L), lub chemicznie zsyntetyzowanym genem kodującym wariant MN HIV-1 z ludzkim CDSLeader (syngp120mn). Supernatanty zbierano po 12 godzinach znakowania 60 godzin po transfekcji i immunoprecypitowano fuzyjnym białkiem CD4:IgGl i Sepharose białka A.
Figura 4 jest wykresem ilustrującym wyniki prób ELISA użytych do pomiaru poziomów białka w supernatantach przejściowo transfekowanych komórek 293T. Supernatanty komórek 293T transfekowanych plazmidami ekspresji gp120 kodowanego przez izolat IIIB HIV-1 (gp120Illb), izolat MN HIV-1 (gp120mn), izolat MN HIV-1 zmodyfikowany przez substytucję endogennego liderowego peptydu peptydem antygenu CD5 (gp120mnCD5L), lub chemicznie zsyntetyzowanym genem kodującym wariant MN HIV-1 z ludzkim CDSLeader (syngp120mn) zebrano po 4 dniach i testowano w ELISA gp120/CD4. Poziom gp120 wyrażono w ng/ml.
Figura 5A jest fotografią żelu ilustrującą wyniki próby immunoprecypitacj i użytej do pomiaru ekspresji natywnego i syntetycznego gp120 w obecności rev w pozycji trans i RRE w cis. W tym eksperymencie komórki 293T były przejściowo transfekowane przez wspólstrącanie z fosforanem wapnia 10 mg plazmidu dającego ekspresję: (A) syntetycznej sekwencji gp120MN i RRE w cis, (B) części gp120 IIIB HIV-1, (C) części gp120 IIIB HIV-1 i RRE w cis, wszystkie w obecności lub nieobecności ekspresji rev. Konstrukty RRE gp120IIIbRRE i syngp120mnRRE wytworzono stosując fragment Eag1/Hpa1 RRE klonowany metodą PCR z prowirusowego klonu HXB2 HIV-1. Każdy plazmid ekspresyjny gp120 kotransfekowano 10 mg plazmidu DNA pCMVrev lub CDM7. Supernatanty zbierano 60 godzin po transfekcji, immunoprecypitowano fuzyjnym białkiem CD4:IgG i agarozą białka A, i wprowadzono na 7% redukującą SDS-PAGE. Czas wystawiania na żel przedłużano, aby wykazać indukcję gp120IIIbrre przez rev.
Figura 5B jest fotografią z krótszym naświetlaniem podobnego eksperymentu, w którym syngp120mnrre kotransfekowano z lub bez pCMVrev.
Figura 5C jest schematem konstruktów użytych na fig. 5A.
Figura 6 jest porównaniem sekwencji dzikiego typu genu ratTHY-1 (wt) i syntetycznego genu ratTHY-1 (env) skonstruowanego metodą syntezy chemicznej i mającego większość przeważających kodonów znajdowanych w genie env HIV-1.
Figura 7 jest schematem syntetycznego genu ratTHY-1. Pełny czarny prostokąt oznacza peptyd sygnałowy. Zacieniony prostokąt oznacza sekwencje w prekursorze, które kierują przyłączaniem zakotwiczenia glikanu fosfatydylo-inozytolowego. Unikalne miejsca restrykcji użyte do składania konstrukPL 192 104 B1 tów THY-1 oznakowano H (Hind3), M (Mlu1), S (Sad) i No (Not1).Pozycję syntetycznych oligonukleotydów stosowanych w konstrukcji pokazano na dole figury.
Figura 8 jest wykresem ilustrującym wyniki analizy cytometrii przepływowej. Wtym doświadczeniu komórki 293T przejściowo transfekowane dzikiego typu plazmidem ekspresyjnym ratTHY-1 (gruba linia), ratTHY-1 z plazmidem ekspresji kodonów otoczki (cienka linia), lub tylko wektorem (kropkowana linia) metodą współstracania z fosforanem wapnia. Komórki zabarwiano monoklonalnym przeciwciałem OX7 anty-ratTHY-1, następnie poliklonalnym sprzężonym z FITC anty-mysim przeciwciałem IgG 3 dni po transfekcji.
Figura 9A jest fotografią żelu ilustrującą wyniki analizy immunoprecypitacji supernatantów ludzkich komórek 293T transfekowanych syngp120mn (A) lub konstruktem syngp120mn.rTHY-1env, który zawiera gen rTHY-1env w nietranslowanym regionie 3' genu syngp120mn (B). Konstrukt syngp120mn.rTHY-1env wytworzono wstawiając adapter Not1 do lepkiego miejsca Hind3 plazmidu rTHY-1env. Następnie fragment Notl 0,5 tys. par zasad zawierający gen rTHY-1env klonowano do miejsca Notl plazmidem syngp120mn i testowano dla zapewnienia poprawnej orientacji. Supernatanty 35 znakowanych 35S komórek zebrano 72 godziny po transfekcji, strącono fuzyjnym białkiem CD4:IgG i agarozą białka A, i wprowadzono na 7% redukującą SDS-PAGE.
Figura 9B jest schematem konstruktów użytych w eksperymencie zilustrowanym na fig. 9A.
Figura 10A jest fotografią komórek COS transfekowanych wektorem nie wykazującym tylko fluorescencji GFP.
Figura 10B jest fotografią komórek COS transfekowanych plazmidem ekspresyjnym CDM7 kodującym natywny GFP przetworzoną tak, aby zawierała sekwencję zgodności inicjacji translacji.
Figura 10C jest fotografią komórek COS transfekowanych plazmidem ekspresyjnym mającym takie same flankujące sekwencje i sekwencje zgodności inicjacji jak na fig. 10B, ale niosącym sekwencję genu optymalizowaną co do sekwencji.
Figura 10D jest fotografią komórek COS transfetowanych plazmidem ekspresyjnym jak na fig. 10C, ale niosącym Thr jako resztę 65 w miejsce Ser.
Figura 11 ilustruje sekwencję genu natywnego ludzkiego czynnika VIII pozbawionego centralnej domeny B (aminokwasy 760-1639, włącznie) (SEKW. NR ID.:41).
Figura 12 ilustruje sekwencję syntetycznego genu ludzkiego czynnika VIII pozbawionego centralnej domeny B (aminokwasy 760-1639, włącznie) (SEKW. NR ID.:42).
Przykład 1
Konstrukcja syntetycznego genu gp120 mającego kodony znajdowane w ludzkich genach o wysokiej ekspresji
Tabela częstotliwości kodonów dla prekursora otoczki podtypu LAV HIV-1 wytworzona z użyciem oprogramowania opracowanego przez University of Wisconsin Genetics Computer Group. Wyniki tego tablicowania zestawiono w tabeli 1z wzorem użycia kodonów ze zbioru ludzkich genów o wysokiej ekspresji. Dla dowolnego aminokwasu kodowanego przez zdegenerowane kodony, najkorzystniejszy kodon genu o wysokiej ekspresji jest różny od najkorzystniejszego kodonu prekursora otoczki HIV. Ponadto prosta zasada opisuje wzór korzystnych kodonów otoczki, gdzie się ona stosuje: korzystne kodony maksymalizują liczbę reszt adeninowych w wirusowym RNA. We wszystkich przypadkach poza jednym oznacza to, że kodon, w którym trzecia pozycja oznacza A, jest najczęściej stosowany. W specjalnym przypadku seryny, trzy kodony jednakowo stosują jedną resztę A w mRNA; razem te trzy stanowią 85% serynowych kodonów istotnie stosowanych w transkryptach otoczki. Szczególnie uderzający przykład tendencji A znajduje się w doborze kodonów dla argininy; gdzie tryplet AGA stanowi 88% kodonów argininy. Poza przewaga reszt A, widać znacząca preferencje dla urydyny pośród zdegenerowanych kodonów, których trzecia reszta musi być pirymidyna. Na koniec, niespójności pośród rzadziej używanych wariantów można przypisać obserwacji, że dinukleotyd CpG jest niedoreprezentowany; tak więc trzecia pozycja mniej prawdopodobnie jest G, podczas gdy drugą pozycja jest C, jak w kodonach dla alaniny, proliny, seryny i treoniny; a tryplety CGX dla argininy są w zasadzie nieużywane.
PL 192 104 B1
Tabe l a 1:
Częstość występowania kodonów w genie env Illb HIV-1 i w ludzkich genach o wysokiej ekspresji.
Wysoka Env Wysoka Env
Ala GC C 53 27 Cys TG C 68 16
T 17 18 T 32 84
A 13 50
G 17 5 Gln
CA A 12 55
Arg CG C 37 0 G 88 45
T 7 4 Glu
A 6 0 GA A 25 67
G 21 0 G 75 33
AG A 10 88
G 18 8 Gly GG C 50 6
Asn T 12 13
AA C 78 30 A 14 53
T 22 70 G 24 28
Asp GA C 75 33 His CA C 79 25
T 25 67 Ile T 21 75
AT C 77 25
T 18 31
A 5 44
Leu Ser
CT C 26 10 TC C 28 8
T 5 7 T 13 8
A 3 17 A 5 22
G 58 17 G 9 0
TT A 2 30 AG C 34 22
G 6 20 T 10 41
Lys AA A 18 68 Thr AC C 57 20
G 82 32 T 14 22
A 14 51 G 15 7
Pro CC C 48 27 Tyr TA C 74 8
T 19 14 T 26 92
A 16 55
G 17 5
Phe Val
TT C 80 26 GT C 25 12
T 20 74 T 7 9
A 6 62
G 64 18
PL 192 104 B1
Częstość kodonów obliczono stosując program GCG wykonany przez University of Wisconsin Genetics Computer Group. Liczby oznaczają procent przypadków, w których występuje konkretny kodon. Częstości stosowania kodonów genów otoczki innych izolatów wirusa HIV-1 są porównywalne i wykazują podobną tendencję.
W celu wytworzenia genu gp120 zdolnego do wysokiego poziomu ekspresji w komórkach ssaka skonstruowano syntetyczny gen kodujący segment gp120 HIV-1 (syngp120mn), oparty na sekwencji najpospolitszego północnoamerykańskiego podtypu, HIV-1 MN (Shaw i in., Science 226:1165, 1984; Gallo i in., Nature 321:119, 1986). W tym syntetycznym genie gp120 prawie wszystkie natywne kodony zastąpiono systematycznie kodonami najczęściej stosowanymi w ludzkich genach o wysokiej ekspresji (fig. 1). Ten syntetyczny gen zestawiono z chemicznie zsyntetyzowanych oligonukleotydów mających po 150 do 200 zasad długości. Jeśli oligonukleotydy przekraczające 120 do 150 zasad zsyntetyzuje się chemicznie, procent pełnej długości produktu może być niski, a znaczna większość materiału składa się z krótszych oligonukleotydów. Ponieważ te krótsze fragmenty hamują klonowanie i procedury PCR, może być bardzo trudne stosowanie oligonukleotydów przekraczających pewną długość. W celu zastosowania surowego materiału z syntezy bez wcześniejszego oczyszczania, jednoniciowe grupy oligonukleotydów wzmacniano PCR przed klonowaniem. Produkty PCR oczyszczano na żelach agarozowych i stosowano jako wzorce w dalszym etapie PCR. Dwa sąsiadujące fragmenty można wspólnie wzmacniać ze względu na nakładające się sekwencje na końcu każdego fragmentu. Te fragmenty, które miały pomiędzy 350 i 400 par zasad, subklonowano do pochodzącego z pCDM7 plazmidu zawierającego sekwencję liderową powierzchniowej cząsteczki CD5, a następnie polilinker Nhe1/Pst1/Mlu1/EcoR1l/BamH1. Każdy z enzymów restrykcyjnych w tym polilinkerze oznacza miejsce obecne na końcach 5' lub 3' wytworzonych w PCR fragmentów. Tak więc przez kolejne subklonowanie każdego z 4 długich fragmentów zestawiono cały gen gp120. Dla każdego fragmentu subklonowano trzy do sześciu różnych klonów i sekwencjonowano przed składaniem. Schematyczny szkic sposobu użytego do konstruowania syntetycznego gp120 pokazano na fig. 2. Sekwencja syntetycznego genu gp120 (i syntetycznego genu gp160 utworzonego z użyciem tego samego podejścia) przedstawiono na fig. 1.
Szybkość mutacji była znacząca. Najczęściej spotykane mutacje były delecjami krótkimi (1nukleotyd) i długimi (do 30 nukleotydów). W pewnych przypadkach była konieczna wymiana części z syntetycznymi adapterami lub kawałkami innycli subklonów bez mutacji w tym konkretnym regionie. Pewne odchylenia od ścisłego trzymania się optymalizowanego zastosowania kodonów wykonano dla przystosowania do wprowadzenia miejsca restrykcji do powstałego genu dla ułatwienia zastępowania różnych segmentów (fig. 2). Te unikalne miejsca restrykcji wprowadzono do genu w odstępach około 100 par zasad. Natywną sekwencję liderowa HIV wymieniono na wysoce wydajny liderowy peptyd ludzkiego antygenu CD5 dla ułatwienia sekrecji (Aruffo i in., Cell 61:1303, 1990) Plazmid użyty do konstrukcji jest pochodna wektora ekspresji ssaka pCDM7 transkrybującego wstawiony gen pod kontrolą silnego ludzkiego natychmiastowego wczesnego promotora CMV.
Dla porównania dzikiego typu i syntetycznej sekwencji kodującej gp120, syntetyczną sekwencję kodującą gp120 wstawiono do wektora ekspresji ssaka i testowano w próbach przejściowej transfekcji. Kilka różnych natywnych genów gp120 użyto jako kontrolnych dla wykluczenia wahań w poziomach ekspresji pomiędzy różnymi izolatami wirusa i artefaktami indukowanymi przez odmienne sekwencje liderowe. Konstrukt gp120 HIV Illb użyty jako kontrolny wytworzono metodą PCR stosując fragment otoczki HXB2 HIV-1 Sal1/Xho1 jako wzorzec. Dla wykluczenia indukowanych PCR mutacji, fragment Kpn1/Ear1 zawierający około 1,2 tys. par zasad genu wymieniono na odpowiednią sekwencję prowirusowego klonu. Dzikiego typu konstrukty gp120mn użyte jako kontrolne klonowano metodą PCR z zainfekowanych HIV-1 MN komórek C8166 (AIDS Repository, Rockville, MD) i otrzymywano ekspresję gp120 z natywną otoczką lub sekwencją liderową CD5. Ponieważ prowirusowe klony nie były dostępne w tym przypadku, dwa klony każdego konstruktu testowano dla uniknięcia artefaktów PCR. Dla określenia wielkości sekrecji gp120 półilościowe supernatanty komórek 293T przejściowo transfekowane przez współstrącanie z fosforanem wapnia immunoprecypitowano rozpuszczalnym fuzyjnym białkiem CD4:immunoglobulina i Sepharose białka A.
Wyniki tej analizy (fig. 3) pokazują, że syntetyczny produkt genowy ulega ekspresji na bardzo wysokim poziomie w porównaniu z natywnym kontrolnym gp120. Masa cząsteczkowa syntetycznego genu gp120 była porównywalna z masą kontrolnych białek (fig. 3) i mieściła się w zakresie od 100do 110 kDa. Nieco szybsza migracja może być wyjaśniona faktem, że w pewnych liniach komórkowych nowotworów, np., 293T, glikozylowanie jest niekompletne lub zmienione do pewnego stopnia.
PL 192 104 B1
Dla porównania ekspresji dokładniej poziomy białka gp120 oceniono ilościowo stosując ELISA gp120 z CD4 w unieruchomionej fazie. Ta analiza pokazuje (fig. 4), że dane ELISA były porównywalne z danymi z immunoprecypitacji, ze stężeniem gp120 około 125 ng/ml dla syntetycznego genu gp120 i mniejszym niż wartość tła (5 ng/ml) dla wszystkich natywnych genów gp120. Tak więc ekspresja syntetycznego genu gp120 okazuje się być co najmniej jeden rząd wielkości wyższa niż dzikiego typu genów gp120. W pokazanym eksperymencie wzrost był co najmniej 25-krotny.
Rola rev w ekspresji gp120
Ponieważ rev wydaje się wywierać działanie na kilka etapów ekspresji wirusowego transkryptu, zbadano możliwą rolę nietranslacyjnych efektów w polepszonej ekspresji syntetycznego genu gp120. Po pierwsze, dla wykluczenia możliwości, że elementy sygnalizacji negatywnej powodujące zwiększoną degradację mRNA lub retencję jądrową usunięto zmieniając sekwencję nukleotydową, zbadano cytoplazruatyczne poziomy mRNA. Cytoplazmatyczny RNA wytworzono przez lizę NP40 przejściowo transfekowanych komórek 293T i następną eliminację jąder przez odwirowanie. Cytoplazmatyczny RNA wytworzono następnie z lizatów metodą wielokrotnej ekstrakcji fenolem i strącania, umieszczono na nitrocelulozie stosując szczelinowy aparat do hybrydyzacji i na koniec hybrydyzowano ze specyficzną dla otoczki sondą.
Krótko, cytoplazmatyczny mRNA z komórek 293 transfekowanych CDM&, gp120IIIB lub syngp120 wydzielono 36 godzin po transfekcji. Cytoplazmatyczny RNA komórek Hela infekowanych dzikiego typu wirusem krowianki lub rekombinacyjnym wirusem z ekspresją gp120IIIb lub syntetycznego genu gp120pod kontrolą promotora 7.5 wydzielono 16 godzin po infekcji. Równe ilości umieszczono na nitrocelulozie stosując szczelinowy aparat do hybrydyzacji i hybrydyzowano ze stochastycznie znakowanymi fragmentami 1,5 tys. par zasad gp120IIIb i syngp120 lub ludzką beta-aktyną. Poziomy ekspresji RNA oceniono ilościowo przeglądając hybrydyzowane membrany fosfoimagerem. Procedury użyte opisano dokładniej poniżej.
Ten eksperyment wykazał, że nie było znaczącej różnicy w poziomach mRNAkomórek transfekowanych natywnym lub syntetycznym genem gp120. Istotnie, w pewnych eksperymentach cytoplazmatyczne poziomy mRNA syntetycznego genu gp120były nawet niższe niż dla natywnego genu gp120.
Te dane potwierdził pomiar ekspresji rekombinacyjnego wirusa krowianki. Ludzkie komórki 293 lub komórki Hela zainfekowano wirusem krowianki z ekspresją dzikiego typu gp120IIIb lub syngp120mn w liczebności infekcji co najmniej 10. Supernatanty zebrano 24 godziny po infekcji i immunoprecypitowano fuzyjnym białkiem CD4 : immunoglobina i Sepharose białka A. Procedury użyte wtym doświadczeniu są opisane bardzie szczegółowo poniżej.
Ten eksperyment pokazał, że zwiększona ekspresja syntetycznego genu była nadal obserwowana, gdy endogenny produkt genowy i syntetyczny produkt genowy poddano ekspresji z rekombinantów wirusa krowianki pod kontrolą silnego mieszanego wczesnego i późnego promotora 7.5k. Ponieważ mRNA wirusa krowianki są transkrybowane i translowane w cytoplazmie, zwiększona ekspresja syntetycznej otoczki genu w tym doświadczeniu nie może być przypisana polepszonemu eksportowi z jądra. Ten eksperyment powtórzono w dwu dodatkowych typach ludzkich komórek, linii komórek raka nerki 293 i komórek HeLa. Jak dla transfekowanych komórek 293T, poziomy mRNA były podobne w komórkach 293 infekowanych rekombinacyjnym wirusem krowianki. Użycie kodonów w lentiwirusie
Ponieważ okazuje się, że użycie kodonów ma znaczący wpływ na ekspresję w komórkach ssaka, zbadano częstość kodonów w genach otoczki innych retrowirusów. To studium nie dało wyraźnego wzoru preferencji kodonów ogólnie pomiędzy retrowirusami. Jednakże gdy wirusy z rodzaju lentiwirusów, do których należy HIV-1, zanalizowano odrębnie, znaleziono tendencję użycia kodonów prawie identyczną jak dla HIV-1. Utworzono tablicę częstotliwości kodonów z otoczki glikoproteinowej różnych (głównie typu C) retrowirusów poza lentiwirusami i porównano częstości kodonów z tabeliutworzonej dla sekwencji otoczki czterech lentiwirusów nie związanych zbyt ściśle z HIV-1(wirus koziego zapalenia stawów i mózgu, koński wirus zakaźnej anemii, koci wirus braku odporności, oraz wirus visna) (tabela2). Wzór użycia kodonów dla lentiwirusów jest uderzająco podobny do wzoru dla HIV-1, we wszystkich przypadkach poza jednym, korzystny kodon dla HIV-1jest taki sam jak korzystny kodon dla innych lentiwirusów. Wyjątkiem jest prolina, która jest kodowana przez CCT w 41% reszt otoczek lentiwirusowych nie-HIV, i przez CCA w 40% reszt, sytuacja także jasno odzwierciedlająca znaczącą preferencję dla trypletu kończącego się na A. Wzór użycia kodonów przez nielentiwirusowe białka otoczki nie pokazuje podobnej przewagi reszt A, i nie jest także przesunięty w kierunku reszt z trzecią pozycją C i G, jak dla użycia kodonów ludzkich genów o wysokiej ekspresji. Ogólnie nielentiwirusowe retrowirusy wydają się wykorzystywać różne kodony bardziej równomiernie, według wzoru dzielonego z ludzkimi genami o słabszej ekspresji.
PL 192 104 B1
T a b e l a 2:
Częstość kodonów w genie otoczki lentiwirusów (lenti) i nie-lentiwirusowych retrowirusów (inne)
inne lenti inne lenti
Ala Cys
GC C 45 13 TG C 53 21
T 26 37 T 47 79
A 20 46
G 9 3 Gln
CA A 52 69
Arg G 48 31
CG C 14 2
T 6 3 Glu
A 16 5 GA A 57 68
G 17 3 G 43 32
AG A 31 51
G 15 26 Gly
GG C 21 8
Asn T 13 9
AA C 49 31 A 37 56
T 51 69 G 29 26
Asp His
GA C 55 33 CA C 51 38
T 51 69 Ile T 49 62
AT C 38 16
T 31 22
A 31 61
Leu Ser
CT C 22 8 TC C 38 10
T 14 9 T 17 16
A 21 16 A 18 24
G 19 11 G 6 5
TT A 15 41 AG C 13 20
G 10 16 T 7 25
Lys Thr
AA A 60 63 AC C 44 18
G 40 37 T 27 20
A 19 55 G 10 8
Pro Tyr
CC C 42 14 TA C 48 28
T 30 41 T 52 72
A 20 40
G 7 5
Phe Val
TT C 52 25 GT C 36 9
T 48 75 T 17 10
A 22 54 G 25 27
PL 192 104 B1
Częstość kodonów obliczono stosując program GCG opracowany przez University of Wisconsin Genetics Computer Group. Liczby oznaczają procent, w którym jest używany konkretny kodon. Użycie kodonów nielentiwirusowych retrowirusów zestawiono z sekwencji prekursora otoczki bydlęcego wirusa białaczki, kociego wirusa białaczki, ludzkiego wirusa białaczki komórek T typu I, ludzkiego limfotropowego wirusa komórek T typu II, izolatu wirusa mysiej białaczki nakierowanego na komórki norki (MuLV), izolatu Rauschera nakierowanego na komórki śledziony, izolatu 10A1, amfotropowego izolatu 4070A i izolatu wirusa białaczki szpikowej, oraz wirusa białaczki szczura, wirusa mięsaka małpy, wirusa małpiej białaczki komórek T, leukemogennego retrowirusa T1223/B i wirusa małpiej białaczki gibbona. Tabele kodonów dla lentiwirusów nie-HIV, nie-SIV zebrano z sekwencji prekursora otoczki dla wirus koziego zapalenia stawów i mózgu, końskiego wirusa zakaźnej anemii, kociego wirus braku odporności, oraz wirusa visna.
Poza przewagą kodonów zawierających A, lentiwirusowe kodony trzymają się wzorca HIV silnego niedoreprezentowania CpG, tak że trzecia pozycja trypletów alaniny, proliny, seryny i treoniny rzadko jest G. Tryplety retrowirusowej otoczki pokazują podobne, lecz słabiej zaznaczone, niedoreprezentowanie CpG. Najbardziej oczywista różnica pomiędzy lentiwirusami i innymi retrowirusami ze względu na przewagę CpG leży w użyciu wariantu CGX trypletów argininy, który jest dość często reprezentowany pośród sekwencji kodującej retrowirusowej otoczki, lecz prawie nigdy nie jest obecny w porównywalnych sekwencjach lentiwirusa.
Różnice w zależności od rev pomiędzy natywnym i syntetycznym gp120
Dla zbadania, czy regulacja przy pomocy rev jest związana z użyciem kodonów HIV-1, zbadano wpływ rev na ekspresję natywnego i syntetycznego genu. Ponieważ regulacja przy pomocy rev wymaga miejsca wiązania rev RRE w cis, utworzono konstrukty, w których to miejsce wiązania było klonowane do nietranslowanego regionu 3' natywnego i syntetycznego genu. Te plazmidy współtransfekowano rev lub kontrolnym plazmidem w trans do komórek 293T, i mierzono poziomy ekspresji gp120 w supernatantach półilościowo metodą immunoprecypitacji. Procedury zastosowane w tym doświadczeniu opisano szczegółowo poniżej.
Jak pokazano na fig. 5A i fig. 5B, rev reguluje w górę natywny gen gp120, ale nie ma wpływu na ekspresje syntetycznego genu gp120. Tak więc działanie rev nie jest oczywiste na substracie pozbawionym sekwencji kodującej endogenne wirusowe sekwencje otoczki.
Ekspresja syntetycznego genu ratTHY-1 z kodonami HIV otoczki
Powyżej opisany eksperyment sugeruje, że w istocie sekwencje otoczki muszą być obecne dla potrzeby regulacji rev. W celu sprawdzenia tej hipotezy, syntetyczną wersję genu kodującego małe, typowo o dużej ekspresji białko powierzchni komórki, antygen ratTHY-1. Syntetyczną wersję genu ratTHY-1 zaprojektowano z użyciem kodonów takim, jak w gp120 HIV. Przy projektowaniu tego genu unikano syntetycznych sekwencji AUUUA, które są związane z niestabilnością mRNA. Ponadto wprowadzono dwa miejsca restrykcji dla uproszczenia manipulacji powstałym genem (fig. 6). Syntetyczny gen z użyciem kodonów otoczki HIV (rTHY-1env) wytworzono stosując trzy mające 150 do 170 merów oligonukleotydy (fig. 7).W przeciwieństwie do genu syngp120mn, produkty PCR bezpośrednio klonowano i złożono w pUC12, i z kolei klonowano do pCDM7.
Poziomy ekspresji natywnego rTHY-1 i rTHY-1 z kodonami otoczki HIV oceniono ilościowo metodą immunofluorescencji przejściowo transfekowanych komórek 293T. Figura 8 pokazuje, że ekspresja natywnego genu THY-1 jest prawie o dwa rzędy wyższa od poziomu tła kontrolnych transfekowanych komórek (pCDM7). Przeciwnie, ekspresja syntetycznego ratTHY-1 jest znacząco niższa niż ekspresja natywnego genu (pokazana przez przesunięcie piku w kierunku niższego numeru kanału).
Dla wykazania, że nie wprowadzono nieodwracalnie negatywnych elementów sekwencji promujących degradację mRNA, wytworzony konstrukt, w którym gen rTHY-1env był klonowany na końcu 3' z syntetycznym genem gp120 (fig. 9B). W tym doświadczeniu komórki 293T transfekowano genem syngp120mn lub fuzyjnym genem syngp120/ratTHY-1env (syngp120mn.rTHY-1env). Ekspresję mierzono metodą immunoprecypitacji z fuzyjnym białkiem CD4 : IgG i agarozą białka A. Procedury użyte w tym doświadczeniu opisano szczegółowo powyżej.
Ponieważ syntetyczny gen gp120 ma kodon stopu UAG, rTHY-1env nie jest translowany z tego transkryptu. Jeśli negatywne elementy powodujące przyspieszoną degradację są obecne w sekwencji, poziomy białek gp120 z ekspresji z tego koristruktu powinny zmniejszyć się w porównaniu z konstruktem syngp120mn bez rTHY-1env. Figura 9A pokazuje, że ekspresja obu konstruktów jest podobna, wskazując na to, że niska ekspresja musi być związana z translacją.
PL 192 104 B1
Zależna od rev ekspresję syntetycznego genu ratTHY-1 z kodonami otoczki
Dla zbadania, czy rev może regulować ekspresję genu ratTHY-1 mającego kodony env, wykonano konstrukt z miejscem wiązania rev na końcu 3' otwartej ramki odczytu rTHY-1env. Dla zmierzenia odpowiedzi na rev konstruktu ratTHY-1env mającego 3' RRE, ludzkie komórki 293T współtransfekowano ratTHY-1envrre i CDM7 lub pCMVrev. W 60 godzin po transfekcji komórki odłączono 1 mM EDTA w PBS i zabarwiono mysim monoklonalnym przeciwciałem OX-7 anty-rTHY-1 i drugorzędowym sprzężonym z FITC przeciwciałem. Natężenie fluorescencji mierzono stosując cytofluorometr EPICS XL. Te procedury opisano szczegółowo powyżej.
W powtórzonych eksperymentach wykryto słaby wzrost ekspresji rTHY-1env, jeśli rev współtransfekowano genem rTHY-1env. Dla dalszego zwiększenia wrażliwości układu próby wytworzono konstrukt dający ulegającą ekspresji i sekrecji wersję rTHY-1env. Ten konstrukt powinien dawać pewniejsze dane, ponieważ łączna ilość ulegającego sekrecji białka w supernatancie odzwierciedla wynik wytwarzania białka przez dłuższy czas, w przeciwieństwie do białka z ekspresją powierzchniową, które wydaje się silniej odzwierciedlać bieżącą szybkość wytwarzania. Gen zdolny do ekspresji ulegającej sekrecji formy wytworzono metodą PCR stosując startery normalne i odwrotne zgrzewające koniec 3' endogennej sekwencji liderowej i koniec 5' motywu sekwencji koniecznego do zakotwiczenia glikanu fosfatydylo-inozytolu, odpowiednio. Produkt PCR klonowano do plazmidu, który już zawierał sekwencję liderową CDS, tworząc w ten sposób konstrukt, w którym wycięto zakotwiczenie membrany i sekwencję liderową wymieniono na heterologiczny (i zapewne bardziej skuteczny) peptyd liderowy.
Odpowiedź na rev ulegającej sekrecji formy ratTHY-1env mierzono metodą immunoprecypitacji supernatantów ludzkich komórek 293T współtransfekowanych plazmidem ekspresji ulegającej sekrecji formy ratTHY-1env i sekwencji RRE w cis (rTHY-1envPI-rre) i CDM7 lub pCMVrev. Konstrukt rTHY1envPI-RRE wytworzono metodą PCR stosując oligonukleotyd: cgcggggctagcgcaaagagtaataagtttaac (SEKW. NR ID.:38) jako starter normalny, oligonukleotyd: cgcggatcccttgtattttgtactaata (SEKW. NR
ID.:39) jako starter odwrotny, i syntetyczny konstrukt rTHY-1env jako wzorzec. Po trawieniu Nhe1 i Not1 fragment PCR klonowano do plazmidu zawierającego lider CD5 i sekwencje RRE. Supernatan35 ty znakowanych 35S komórek zbierano 72 godziny po transfekcji, strącono mysimi monoklonalnymi przeciwciałami OX7 wobec rTHY-1 i anty-mysią Sepharose IgG, i podano na 12% redukującą SDSPAGE.
W tym doświadczeniu indukcja rTHY-1env przez rev była znacznie wyraźniejsza i wyrazista niż w powyżej opisanym eksperymencie i silniej sugeruje, że rev może translacyjnie regulować transkrypty, które są tłumione przez kodony rzadziej stosowane.
Niezależna od rev ekspresja białka fuzyjnego rTHY-1env:immunoglobulina
Dla sprawdzenia, czy rzadziej stosowane kodony muszą być obecne w całej sekwencji kodującej lub wystarczy krótki region dla nadania reaktywności na rev, wytworzono fuzyjne białko rTHY-1env : immunoglobulina. W tym konstrukcie gen rTHY-1env (bez motywu sekwencji odpowiedzialnej za zakotwiczenie glikanu fosfatydylo-inozytolu) jest związany z zawiasem ludzkiej IgG1, domenami CH2 i CH3. Ten konstrukt wytworzono metodą kotwiczącego PCR stosując startery z miejscami restrykcji Nhe1 i BamH1 oraz rTHY-1env jako wzorcem. Fragment PCR klonowano do plazmidu zawierającego sekwencję liderową powierzchniowej cząsteczki CD5 i zawias, części CH2 i CH3 ludzkiej immunoglobuliny IgG1. Fragment Hind3/Eag1 zawierający insert rTHY-1enveg1 klonowano następnie do pochodzącego z pCDM7 plazmidu z sekwencją RRE.
Dla zmierzenia odpowiedzi fuzyjnego genu rTHY-1env/immunoglobina (rTHY-1enveg1rre) na ludzkie komórki 293T rev współtransfekowane rTHY-1enveg1rre i pCDM7 lub pCMVrev. Konstrukt rTHY-1enveg1rre utworzono metodą kotwiczącego PCR z użyciem normalnych i odwrotnych starterów z miejscami restrykcji Nhe1 i BamH1, odpowiednio. Fragment PCR klonowano do plazmidu zawierają35 cego lider CD5 i ludzki zawias IgG1, domeny CH2 i CH3. Supernatanty znakowanych 35S komórek znakowano 72 godziny po transfekcji, strącono mysim monoklonalnym przeciwciałem OX7 wobec rTHY-1 i anty-mysią Sepharose IgG, i wprowadzono na 12% redukującą SDS-PAGE. Użyte procedury opisano szczegółowo powyżej.
Jak przy produkcie genu rTHY-1envPI-, to fuzyjne białko rTHY-1env/immunoglobulina ulega sekrecji do supernatantu. Tak więc ten gen powinien odpowiadać za indukcję rev. Jednakże w przeciwieństwie do rTHY-1envPI-, współtransfekcja rev w trans indukuje żaden lub tylko pomijalny wzrost ekspresji rTHY-1enveg1.
Ekspresję fuzyjnego białka rTHY-1 : immunoglobulina z natywnymi kodonami otoczki rTHY-1 lub HIV mierzono metodą immunoprecypitacji. Krótko, ludzkie komórki 293T transfekowano rTHY12
PL 192 104 B1
-1enveg1 (kodony env) lub rTHY-1wteg1 (kodony natywne). Konstrukt rTHY-1wteg1 wytworzono w sposób podobny do zastosowanego dla konstruktu rTHY-1enveg1, poza tym, że plazmid zawierają35 cy natywny gen rTHY-1 użyto jako wzorzec. Supernatanty znakowanych 35S komórek zebrano 72 godzin po transfekcji, strącono mysim monoklonalnym przeciwciałem OX7 wobec rTHY-1 i antymysią Sepharose IgG, i wprowadzono na 12% redukującą SDS-PAGE. Użyte procedury opisano szczegółowo poniżej.
Poziomy ekspresji rTHY-1enveg1 zmalały w porównaniu z podobnym konstruktem z dzikiego typu rTHY-1 jako fuzyjnym partnerem, lecz były wciąż znacznie wyższe niż dla rTHY-1env. Odpowiednio, obie części fuzyjnego białka wpływały na poziomy ekspresji. Dodanie rTHY-1env nie ogranicza ekspresji do równych poziomów, jak widać dla samego rTHY-1env. Tak więc regulacja przez rev wydaje się być nieskuteczna, jeśli białko ekspresyjne nie jest prawie całkowicie wytłumione.
Preferencja kodonów w genach otoczki HIV-1
Bezpośrednie porównanie pomiędzy częstotliwością użycia kodonów w otoczce HIV i ludzkich genach o silnej ekspresji ujawnia uderzającą różnicę dla wszystkich 20 aminokwasów. Jedną prostą miarą statystycznego znaczenia tej preferencji kodonów jest stwierdzenie, że pośród 9 aminokwasów z podwójną degeneracją kodonów korzystną trzecią resztą jest A lub U we wszystkich dziewięciu. Prawdopodobieństwo, że wszystkie 9 z dwu równie prawdopodobnych wyborów będą takie same, wynosi około 0,004, a więc w dowolnej konwencjonalnej mierze dobór trzeciej reszty nie może być uważany za przypadkowy. Dalsze dowody tendencji w preferencji kodonów znajdują się pośród bardziej zdegenerowanych kodonów, gdzie można widzieć silną selekcję trypletów niosących adeninę. Jest to przeciwieństwem wzoru dla genów o silnej ekspresji, która faworyzuje kodony niosące C, lub rzadziej G, w trzecim położeniu kodonów z potrójną lub wyższą degeneracją.
Systematyczna wymiana natywnych kodonów na kodony ludzkich genów o silnej ekspresji dramatycznie zwiększała ekspresję gp120. Ilościowa analiza metodą ELISA pokazała, że ekspresja syntetycznego genu była co najmniej 25-krotnie wyższa w porównaniu z natywnym gp120 po przejściowej transfekcji do ludzkich komórek 293. Poziomy stężeń w eksperymencie ELISA okazały się raczej niskie. Ponieważ ELISA użyta do kwantyfikacji była oparta na wiązaniu gp120 do CD4, wykryto tylko natywny, nie denaturowany materiał. Może to wyjaśnić pozorną niską ekspresję. Pomiar poziomów cytoplazmatycznego mRNA pokazuje, że różnica w ekspresji białka jest spowodowana różnicami w translacji, a nie trwałością mRNA.
Retrowirusy ogólnie nie wykazują podobnej preferencji dla A i T, jaką znaleziono dla HIV. Lecz gdy tę rodzinę podzielono na dwie podgrupy, lentiwirusy i nielentiwirusowe retrowirusy, wykryto podobną preferencję dla A i, rzadziej, T, na pozycji trzeciego kodonu dla lentiwirusów. Tak więc dowody sugerują, że lentiwirusy zachowują charakterystyczny wzór otoczki kodonów, nie z powodu nieodłącznej przewagi odwrotnej transkrypcji lub replikacji takich reszt, lecz z pewnego powodu osobliwego z punktu widzenia fizjologii tej klasy wirusów. Główną różnicą pomiędzy lentiwirusami i niekompleksowymi retrowirusami są dodatkowe regulacyjne i nie zasadnicze pomocnicze geny w lentiwirusach, jak już wspomniano. Tak więc jedno proste wyjaśnienie restrykcji dla ekspresji otoczki może być takie, że może być oparty na niej ważny regulacyjny mechanizm jednej z tych dodatkowych cząsteczek. W istocie, wiadomo, że jednego z tych białek, rev, które najprawdopodobniej ma homologi we wszystkich lentiwirusach. Tak więc dane użycia kodonów w wirusowym mRNA stosuje się do utworzenia klasy transkryptów, które są podatne na stymulujące działanie rev. Tę hipotezę sprawdzono stosując podobną strategię jak powyżej, lecz tym razem dane użycia kodonów zmieniły się w kierunki przeciwnym. Użycie kodonów z komórkowego genu o silnej ekspresji zamieniono na najczęściej stosowane kodony w otoczce HIV. Jak zakładano, poziomy ekspresji były wyraźnie niższe w porównaniu z natywną cząsteczką, prawie o dwa rzędy wielkości, gdy analizowano je metodą immunofluorescencji cząsteczki z ekspresją na powierzchni. Jeśli rev ulegał współekspresji w trans i element RRE był obecny w cis, dla powierzchniowej cząsteczki wykrywano tylko słabą indukcję, jednakże jeśli THY-1 ulegał ekspresji jako ulegająca sekrecji cząsteczka, indukcja przez rev była znacznie bardziej wyraźna, wspierając powyższą hipotezę. Można to zapewne wyjaśnić akumulacją sekrecyjnego białka w supernatancie, co znacząco wzmacnia wpływ rev. Jeśli rev indukuje ogólnie tylko mały wzrost dla powierzchniowych cząsteczek, indukcja otoczki HIV przez rev nie może mieć na celu zwiększenia występowania na powierzchni, lecz zwiększenia wewnątrzkomórkowego poziomu gp160. Zupełnie nie wiadomo obecnie, dlaczego tak powinno być.
PL 192 104 B1
Dla zbadania, czy małe niecałkowite elementy genu są dostateczne do ograniczenia ekspresji i spowodowania jej zależności od rev, wytworzono fuzyjne białka rTHY-1env : immunoglobulina, gdzie tylko około jednej trzeciej całego genu wykazywało użycie kodonów jak w otoczce. Poziomy ekspresji tego konstruktu miały poziom pośredni, wskazując, że negatywny element sekwencja rTHY-1env nie jest dominujący nad częścią immunoglobulinową. To fuzyjne białko nie reagowało lub reagowało słabo na rev, co wskazuje, że tylko geny prawie całkowicie stłumione mogą reagować na rev.
Inną charakterystyczną cechą odkrytą w tabelach częstości kodonów jest zaskakujące niedoreprezentowanie trypletów CpG. W porównawczym studium użycia kodonów w E. coli, drożdżach, muszkach owocowych i naczelnych wykazano, że w znacznej liczbie zanalizowanych genów naczelnych 8 ostatnio użytych kodonów zawiera wszystkie kodony z sekwencją dwu nukleotydową CpG. Unikanie kodonów zawierających ten dwunukleotydowy motyw odkryto także w sekwencji innych retrowirusów. Wydaje się możliwe, że powodem niedoreprezentowania niosących CpG trypletów ma coś wspólnego z unikaniem uciszania genu przez metylowanie cytozyn CpG. Spodziewana liczba dwunukleotydów CpG dla HIV jako całości wynosi około jednej piątej wartości spodziewanej na podstawie zasadniczej kompozycji. Może to wskazywać, że możliwość wysokiej ekspresji jest zachowywana, i że gen w istocie musi mieć silną ekspresję w pewnym punkcie podczas wirusowej patogenezy.
Wyniki przedstawione tutaj jasno wskazują, że preferencja kodonów ma silny wpływ na poziomy białka i sugerują, że wydłużenie translacyjne kontroluje ekspresję genu ssaka. Jednakże inne czynniki mogą grać tutaj rolę. Po pierwsze, nadmiar wcale nie w pełni obciążonych mRNA w eukariotycznych komórkach wskazuje, że inicjacja ogranicza szybkościowo translację w co najmniej pewnych przypadkach, ponieważ przeciwnie wszystkie transkrypty będą całkowicie pokryte rybosomami. Ponadto jeśli wyłączanie rybosomu i dalsza degradacja mRNA byłoby tym mechanizmem, zahamowanie przez rzadkie kodony nie mogłoby być prawdopodobnie odwracane żadnym regulacyjnym mechanizmem, takim jak przedstawiony tutaj. Jednym możliwym wyjaśnieniem dla wpływu inicjacji i wydłużania na translacyjną aktywność jest to, że szybkość inicjacji lub dostępu do rybosomów, jest kontrolowana częściowo przez elementy sterujące rozłożone w RNA, tak że lentiwirusowe kodony predysponują RNA do umieszczenia w puli słabo inicjowanych RNA. Jednakże takie ograniczenie nie musi być kinetyczne; np., dobór kodonów może wpływać na prawdopodobieństwo, że dany produkt translacji, raz zainicjowany, jest poprawnie kończony. Przy tym mechanizmie nadmiar mniej faworyzowanych kodonów spowoduje znaczące kumulatywne prawdopodobieństwo nieudanego zakończenia rozpoczętego łańcucha polipeptydowego. Zamaskowany RNA uzyska następnie zwiększoną szybkość inicjacji pod działaniem rev. Ponieważ reszty adeninowe występują w nadmiarze w reagujących na rev transkryptach, może być tak, że metylowanie adeniny RNA pośredniczy w tym hamowaniu translacji.
Szczegółowe procedury
Następujących procedur użyto w powyżej opisanych eksperymentach.
Analiza sekwencji
Analiza sekwencji wykorzystywała oprogramowanie opracowane przez University o f Wisconsin Computer Group.
Konstruowanie plazmidów
Konstruowanie plazmidów wykorzystywało następujące sposoby. Wektory i insert DNA trawiono w stężeniu 0,5 mg/10 ml w odpowiednim buforze restrykcyjnym przez 1-4 godziny (łączna objętość reakcji około 30 ml). Trawiony wektor potraktowano 10% (objętościowo) 1 mg/ml zasadowej fosfatazy zjelit cielęcych przez 30 minut przed elektroforezą żelową. Wektor i insert po trawieniu (5 do 10 ml każdego) podano na 1,5% niskotopliwy żel agarozowy z buforem TAE. Paski żelu zawierające potrzebne pasma przeniesiono do probówki reakcyjnej 1,5 ml, stopiono w temperaturze 65°C i bezpośrednio podano do ligacji bez usuwania agarozy. Ligacje typowo prowadzono w łącznej objętości 25 ml w 1x niskiego bufora 1x dodatków ligacji z 200-400 U ligazy, 1 ml wektora i 4 ml insertu. Gdy to konieczne, nawisające końce 5' wypełniano dodając 1/10 objętości 250 mM dNTP i 2-5 U polimerazy Klenowa do dezaktywowanych przez ogrzanie lub ekstrahowanych fenolem produktów trawienia iinkubacji przez około 20 minut w temperaturze pokojowej. Gdy to konieczne, nawisające końce 3' wypełniono dodając 1/10 objętości 2,5 mM dNTPs i 5-10 U polimerazy DNA T4 do dezaktywowanych przez ogrzanie lub ekstrahowanych fenolem produktów trawienia, następnie inkubując w temperaturze 37°C przez 30 minut. Następujących buforów użyto w tych reakcjach: 10x niski bufor (60 mM Tris HCl, pH 7,5, 60 mM MgCl2, 50 mM NaCl, 4 mg/ml BSA, 70 mM b-merkaptoetanolu, 0,02% NaN3); 10x średni bufor (60 mM Tris HCl, pH 7,5, 60 mM MgCl2, 50 mM NaCl, 4 mg/ml BSA, 70 mM b-merkaptoetanolu, 0,02% NaN3); 10x wysoki bufor (60 mM Tris HCl, pH 7,5, 60 mM MgCl2, 50 mM
PL 192 104 B1
NaCl, 4 mg/ml BSA, 70 mM b-merkaptoetanolu, 0,02% NaN3) ; 10x dodatki ligacji (1mM ATP, 20 mM DTT, 1mg/ml BSA, 10 mM sperntidyny) ; 50x TAE (2 M octan Tris, 50 mM EDTA).
Synteza i oczyszczanie oligonukleotydów
Oligonukleotydy wytworzono w syntezatorze Milligen 8750 (Millipore). Kolumny eluowano 1 ml 30% wodorotlenku amonu i eluowane oligonukleotydy odblokowywano w temperaturze 55°C przez 6 do 12 godzin. Po odblokowaniu, wytrącono 150 ml oligonukleotydu 10x objętością nienasyconego n-butanolu w 1,5 ml probówkach reakcyjnych, następnie odwirowano przy 15000 obr. na minutę w mikrowirówce. Peletkę przemyto 70% etanolem i umieszczono w zawiesinie w 50 ml H2O. Stężenie określono mierząc optyczną gęstość przy 260 nm w rozcieńczeniu 1:333 (1 OD260 = 30 mg/ml).
Następujących oligonukleotydów użyto do konstrukcji syntetycznego genu gp120 (wszystkie sekwencje pokazane w tymtekście są w kierunku 5' do 3').
oligo 1 normalny (Nhel) : cgc ggg eta gcc acc gag aag ctg
(SEKW. NR ID.:1).
oligo 1: acc gag aag ctg tgg gtg acc gtg tac tac ggc gtg
CCC gtg tgg aag ag ag gcc acc acc acc ctg ttc tgc gcc agc gac
gcc aag gcg tac gac acc gag gtg cac aac gtg tgg gcc acc cag
gcg tgc gtg ccc acc gac ccc aac ccc cag gag gtg gag ctc gtg
aac gtg acc gag aac ttc aac at (SEKW. NR ID.:2).
oligo 1 wsteczny : cca cca tgt tgt tct tcc aca tgt tga
agt tct c (SEKW. NR ID.: 3) .
oligo 2 normalny : gac ega gaa ctt caa cat gtg gaa gaa
caa cat (SEKW. NR ID.: 4)
oligo 2: tgg aag aac aac atg gtg gag cag atg cat gag gac
atc atc agc ctg tgg gac cag agc ctg aag ccc tgc gtg aag ctg
acc cc ctg tgc gtg acc tg aac tgc acc gac ctg agg aac acc acc
aac acc aac ac agc acc gcc aac aac aac agc aac agc gag ggc
acc atc aag ggc ggc gag atg (SEKW. NR ID.:5).
oligo 2 wsteczny (Pstl) : gtt gaa get gca gtt ctt cat ctc
gcc gcc ctt (SEKW. NR ID.:6) •
oligo 3 normalny (Pstl) : gaa gaa ctg cag ctt caa cat cac
cac cag c (SEKW. NR ID.:7)
PL 192 104 B1
oligo 3: aac atc acc acc age atc ege gac aag atg cag aag
gag tac gcc ctg ctg tac aag ctg gat atc gtg agewate gac aac
gac age acc age tac ege ctg atc tcc tgc aac acc age gtg atc
acc cag gcc tgc ccc aag atc age ttc gag ccc atc ccc atc cac
tac tgc gcc ccc gcc ggc ttc gcc (SEKW . NR ID.:8).
oligo 3 wsteczny: gaa ctt ctt gtc ggc ggc gaa gcc ggc
ggg (SEKW. NR ID.:9).
oligo 4 normalny: gcg ccc ccg ccg get teg cca tcc tga
agt gca acg aca aga agt te (SEKW. NR ID.:10)
oligo 4: gcc gac aag aag ttc age ggc aag ggc age tgc aag
aac gtg age acc gtg cag tgc acc cac ggc atc cgg ccg gtg gtg
age acc cag etc ctg ctg aac ggc age ctg gcc gag gag gag gtg
gtg atc ege age gag aac ttc acc gac aac gcc aag acc atc atc
gtg cac ctg aat gag age gtg cag atc ( SEKW. NR ID. : 11)
oligo 4 wsteczny (Mlul): agt tgg gac gcg tgc agt tga tct
gca ege tct c (SEKW. NR ID.:12).
oligo 5 normalny (Mlul): gag age gtg cag atc aac tgc acg
cgt ccc (SEKW. NR ID.:13).
oligo 5: aac tgc acg cgt ccc aac : tac aac aag ege aag ege
atc cac atc ggc ccc ggg ege gcc ttc tac acc acc aag aac atc
atc ggc acc atc ctc cag gcc cac tgc aac atc tct aga (SEKW. NR ID.:14) oligo 5 wsteczny: gtc gtt cca ctt ggc tct aga gat gtt gca (SEKW. NR ID.:15).
oligo 6 normalny: gca aca tct eta gag cca agt gga acg ac (SEKW. NR ID. : 16) .
oligo 6 : gcc aag tgg aac gac acc ctg ege cag atc gtg age
aag ctg aag gag cag ttc aag aac aag acc atc gtg ttc ac cag
age age ggc ggc gac ccc gag atc gtg atg cac age ttc aac tgc
i ggc ggc (SEKW. NR ID.:17)
PL 192 104 B1
oligo 6 wsteczny (EcoRl) : gca gta gaa gaa ttc gcc gcc
gca gtt ga (SEKW. NR ID.: 18).
oligo 7 normalny (EcoRl) : tca act gcg gcg gcg aat tct
tct act gc (SEKW. NR ID.:19).
oligo 7: ggc gaa ttc ttc tac tgc aac acc agc ccc ctg ttc
aac agc acc tgg aac ggc aac aac acc tgg aac aac acc acc ggc
agc aac aac aat att acc ctc cag tgc aag atc aag cag atc atc
aac atg tgg cag gag gtg ggc aag gcc atg tac gcc ccc ccc atc
gag ggc cag atc cgg tgc agc agc (SEKW. NR ID. : 20)
oligo 7 wsteczny: gca gac cgg tga tgt tgc tgc tgc acc
gga tct ggc cct c (SEKW. NR ID.:21).
oligo 8 normalny: ega ggg cca gat ccg gtg cag cag caa
cat cac cgg tct g (SEKW. NR ID.:22).
oligo 8 : aac atc acc ggt ctg ctg ctg acc cgc gac ggc ggc
aag gac acc gac acc aac gac acc gaa atc ttc cgc ccc ggc ggc
ggc gac atg cgc gac aac tgg aga tct gag ctg tac aag tac aag
gtg gtg acg atc gag ccc ctg ggc gtg gcc ccc acc aag gcc aag
cgc cgc gtg gtg cag cgc gag aag cgc ( SEKW. NR ID. : 23) •
oligo 8 wsteczny (Notl): cgc ggg cgg ccg ctt tag cgc ttc
teg cgc tgc acc ac (SEKW. NR ID.:24).
Następujących oligonukleotydów użyto do konstrukcji genu ratTHY-1env.
oligo 1 normalny (BamHl/Hind3) : cgc ggg gga tcc aag ctt acc atg att cca gta ata agt (SEKW. NR ID,:25).
oligo 1: atg aat cca gta ata agt ata aca tta tta tta agt
gta tta caa atg agt aga gga caa aga gta ata agt tta aca gca
tct tta gta aat caa aat ttg aga tta gat tgt aga cat gaa aat
aat aca aat ttg cca ata caa cat gaa ttt tca tta acg (SEKW ♦ NR
ID.:26)
PL 192 104 B1 oligo 1 wsteczny (EcoRl/Mlul) : cgc ggg gaa ttc acg cgt taa tga aaa ttc atg ttg (SEKW. NR ID.:27).
oligo 2 normalny (SamHl/Mlul): cgc gga tcc acg cgt gaa
aaa aaa aaa cat (SEKW. NR ID.:28).
oligo 2: cgt gaa aaa aaa aaa cat gta tta agt gga aca tta
gga gta cca gaa cat aca tat aga agt aga gta aat ttg ttt agt
gat aga ttc ata aaa gta tta aca tta gca aat ttt aca aca aaa
gat gaa gga gat tat atg tgt gag (SEKW . NR ID. :29) •
oligo 2 wsteczny (EcoRl/Sacl): cgc gaa ttc gag ctc aca
cat ata atc tcc (SEKW. NR ID.:30).
oligo 3 normalny (BamHl/Sacl): cgc gga tcc gag ctc aga
gta agt gga caa (SEKW. NR ID.:31).
oligo 3: ctc aga gta agt gga caa aat cca aca agt agt aat
aaa aca ata aat gta ata aga gat aaa tta gta aaa tgt ga gga
ata agt tta tta gta caa aat aca agt tgg tta tta tta tta tta
tta agt tta agt ttt tta caa gca aca gat ttt ata agt tta tga
(SEKW. NR ID.:32).
oligo 3 wsteczny (EcoRl/Notl) : cgc gaa ttc gcg gcc gct
tca taa act tat aaa atc (SEKW. NR ID. : 33)
Reakcja łańcuchowa polimerazy
Krótkie, nakładające się 15 do 25-merowe oligonukleotydy zgrzewane na obu końcach użyto do wzmacniania długich oligonukleotydów metodą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR). Typowe warunki PCR to: 35 cykli, 55°C temperatura zgrzewania, 0,2 s czas wydłużania. Produkty PCR oczyszczono na żelu, ekstrahowano fenolem i użyto w dalszym PCR do generowania dłuższych fragmentów obejmujących dwa sąsiadujące małe fragmenty. Te dłuższe fragmenty klonowano do pochodzącego z CDM7 plazmidu zawierającego sekwencję liderową powierzchniowej cząsteczki CD5, następnie polilinker Nhe1/Pst1/Mlu1/EcoR1/BamH1.
Następujących roztworów użyto w tych reakcjach: 10x bufor PCR (500 mM KCl, 100 mM Tris HCl, pH 7,5, 8 mM MgCl2, 2 mM każdego dNTP). Końcowy bufor uzupełniono 10% DMSO dla zwiększenia dokładności polimerazy Taq.
Małoskalowe wytwarzanie DNA
Transformowane bakterie hodowano w 3 ml kulturze LB przez ponad 6 godzin lub przez noc. Około 1,5 ml każdej kultury wylano do 1,5 ml probówek wirówkowych, wirowano przez 20 s do stanu peletki i zawieszono ponownie w 200 ml roztworu I. Następnie dodano 400 ml roztworu II i 300 ml roztworu III. Probówki wirówkowe zakryto, mieszano i wirowano przez >30 s. Supernatanty przeniesiono do świeżych probówek i raz ekstrahowano fenolem. DNA wytracono przez napełnienie probówek izopropanolem, zmieszanie i odwirowanie w mikroprobówce przez >2 minuty. Peletki przepłukano w 70% etanolu i zawieszono ponownie w 50 ml dH2O zawierającej 10 ml RNAse A. Następujących pożywek i roztworów użyto w tych procedurach: pożywki LB (1,0% NaCl, 0,5% ekstrakt drożdży, 1,0% trypton);
PL 192 104 B1 roztworu I (10 mM EDTA pH 8,0); roztworu II (0,2 M NaOH, 1,0% SDS); roztworu III (2,5 M KOAc,
2,5 M lodowaty kwas octowy); fenolu (pH ustawione na 6,0, zalane TE); TE (10 mM Tris HCl, pH 7,5, 1mM EDTA pH 8,0).
Wielkoskalowe wytwarzanie DNA
Jednolitrowe kultury transformowanych bakterii hodowano 24 do 36 godzin (MC1061p3 transformowane pochodnymi pCDM) lub 12 do 16 godzin (MC1061 transformowane pochodnymi pUC) wtemperaturze 37°C w bakteryjnej pożywce M9 (pochodne pCDM) lub LB (pochodne pUC). Bakterie odwirowano w 1l butlach stosując wirówkę Beckman J6 przy 4200 obrotach na minutę przez 20 minut. Peletkę zawieszono ponownie w 40 ml roztworu I. Następnie dodano 80 ml roztworu II i 40ml roztworu III i butle wytrząsano dość energicznie do pojawienia kawałków 2 do 3 mm. Butlę odwirowano przy 4200 obrotach na minutę przez 5 minut i supernatant wylano przez tkaninę do 250 ml butli.
Izopropanol dodano na wierzch i butlę odwirowano przy 4200 obrotach na minutę przez 10 minut. Peletkę zawieszono ponownie w 4,1 ml roztworu I i dodano do 4,5 g chlorku cezu, 0,3 ml 10 mg/ml bromku etydiowego i 0,1 ml roztworu 1% Triton X100. Probówki odwirowano w ultrawirówce Beckman J2 przy 10000 obrotach na minutę przez 5 minut. Supernatant przeniesiono do probówek do ultrawirowania Beckman Quick Seal, które następnie zamknięto i wirowano w ultrawirówce Beckman stosując rotor o stałym kącie NVT90 przy 80000 obrotach na minutę przez >2,5 godziny. Pasmo ekstrahowano w świetle widzialnym stosując 1 ml strzykawkę i igłę numer 20. Równą objętość dH2O dodano do ekstrahowanego materiału. DNA ekstrahowano raz n-butanolem nasyconym 1 M chlorkiem sodu, następnie dodano równą objętość 10 M octanu amonu/1 mM EDTA. Materiałwylano do 13 ml zatrzaskiwanej probówki, którą napełniono do wierzchu absolutnym etanolem, mieszano i odwirowano w wirówce Beckman J2 przy 10000 obrotach na minutę przez 10 min. Peletkę przepłukano 70% etanolem i zawieszono ponownie w 0,5 do 1ml H2O. Stężenie DNA określono mierząc gęstość optyczną przy 260 nm w rozcieńczeniu 1:200 (1OD260 = 50 mg/ml).
Następujących pożywek i buforów użyto w tych procedurach: bakteryjną pożywkę M9 (10 g soli M9, 10 g kwasów kazaminowych (hydrolizowanych), 10 ml dodatków M9, 7,5 mg/ml tetracykliny (500 ml 15 mg/ml roztworu podstawowego), 12,5 mg/ml ampicyliny (125 ml 10 mg/ml roztworu podstawowego); dodatki M9 (10 mM CaCl2, 100 mM MgSO4, 200 mg/ml tiaminy, 70% gliceryny); pożywkę LB (1,0% NaCl, 0,5% ekstrakt drożdży, 1,0% trypton) ; roztworu I (10 mM EDTA pH 8,0); roztworu II (0,2 M NaOH 1,0 % SDS); roztworu III (2,5 M KOAc 2,5 M HOAc)
Sekwencjonowanie
Syntetyczne geny sekwencjonowano metodą didezoksynukleotydową Sangera. W skrócie, 20do 50 pg dwuniciowego plazmidu DNA denaturowano w 0,5 M NaOH przez 5 minut. Następnie DNA strącono 1/10 objętości octanu sodu (pH 5,2) i 2 objętościami etanolu i odwirowano przez 5 minut. Peletkę przemyto 70% etanolem i zawieszono ponownie w stężeniu 1 mg/ml. Reakcję zgrzewania prowadzono z 4 mg wzorca DNA i 40 ng startera w 1x bufora zgrzewania w końcowej objętości 10 ml. Reakcję ogrzewano do 65°C i powoli ochłodzono do 37°C.
W oddzielnej probówce 1 ml 0,1 M DTT, 2 ml mieszanki znakującej, 0,75 ml dH2O, 1 ml [35S]dATP (10 mCi) i 0,25 ml Sequenase™ (12 U/ml)dodano do każdej reakcji. 5 ml tej mieszanki dodano do każdej wygrzanej probówki ze starterem-wzorcem i inkubowano przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Dla każda reakcji znakowania dodano 2,5 ml każdej z mieszanek kończących 4 na płytce Terasaki iogrzano wstępnie w temperaturze 37°C. Na koniec okresu inkubacji dodano 3,5 ml znakującej mieszaniny reakcyjnej do każdej z 4 mieszanek kończących. Po 5 minutach dodano 4 ml roztworu kończącego do każdej reakcji i płytkę Terasaki inkubowano w temperaturze 80°C przez 10 minut w piecu. Reakcje sekwencjonowania prowadzono na 5% denaturującym żelu poliakryloamidowym. Roztwór akrylamidu wytworzono dodając 200 ml 10x bufora TBE i 957 ml dH2O do 100 g akrylamidu:bisakrylamidu (29:1). Wytworzono 5% poliakrylamid 46% mocznik i 1x żel TBE łącząc 38 ml roztworu akrylamidu i 28 g mocznika. Polimeryzację rozpoczęto dodatkiem 400 ml 10% nadtlenodisiarczanu amonu i 60 ml TEMED. Żele wylano stosując silanizowane szklane płytki i zębate grzebienie irozwijano w 1x buforze TBE przy 60 do 100 W przez 2 do 4 godzin (w zależności od regionu czytanego). Żele przeniesiono na sączki Whatmana, suszono w temperaturze 80°C przez około 1 godzinę i umieszczono przy filmie rentgenowskim w temperaturze pokojowej. Typowy czas ekspozycji wynosił 12 godzin. Następujących roztworów użyto w tych procedurach: 5x bufora zgrzewania (200 mM Tris HCl, pH 7,5, 100 mM MgCl2, 250 mM NaCl); mieszanki znakującej (7,5 mM każdej dCTP, dGTP i dTTP); mieszanek kończących (80 mM każdej dNTP, 50 mM NaCl, 8 mM ddNTP (po jednej)); roztworu zatrzymującego (95% formamid, 20 mM EDTA, 0,05 % błękitu bromofenolowego, 0,05 % ksylenoPL 192 104 B1 cyjanolu); 5x TBE (0,9 M boranu Tris, 20 mM EDTA); roztworu poliakrylamidu (96,7 g poliakrylamidu, 3,3 g bisakrylamidu, 200 ml 1x TBE, 957 ml dH2O).
Wydzielanie RNA
Cytoplazmatyczny RNA wydzielono z transfekowanych fosforanem wapnia komórek 293T 36 godzin po transfekcji i z zakażonych krowianką komórek Hela 16 godzin po infekcji dokładnie jak opisuje Gilman. (Gilman Preparation of cytoplasmic RNA from tissue culture cells. W Current Protocols in Molecular Biology, wyd. Ausubel i in., Wiley & Sons, New York, 1992). Krótko, komórki lizowano w 400 ml bufora lizy, jądra odwirowano i SDS oraz proteazę K dodano do 0,2% i 0,2 mg/ml odpowiednio. Cytoplazmowe ekstrakty inkubowano w temperaturze 37°C przez 20 minut, ekstrahowano dwukrotnie fenolem/chloroformem i wytrącono. RNA rozpuszczono w 100 jal bufora 1 i inkubowano wtemperaturze 37°c przez 20 minut. Reakcję zatrzymano dodając 25 ml bufora kończącego i wytrącono ponownie.
Następujących roztworów użyto w tej procedurze: bufora lizy (TRUSTEE zawierający 50 mM Tris pH 8,0, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 0,5% NP40); bufora 1 (bufor TRUSTEE z, 10 mM MgCl2, 1mM DTT, 0,5 U/ml łożyskowego inhibitora RNAse, 0,1 U/ml DNAse 1 bez RNAse); bufora kończącego (50 mM EDTA 1,5 M NaOAc 1,0% SDS).
Szczelinowa analiza hybrydyzacyjna
Dla szczelinowej analizy hybrydyzacyjnej 10 pg cytoplazmatycznego RNA rozpuszczono w 50 ml dH2O, do której dodano150 ml 10x SSC/18% formaldehydu. Roztworzony RNA inkubowano następnie w temperaturze 65°C przez 15 minut i umieszczono w szczelinowym aparacie do hybrydyzacji. Radioaktywnie znakowane sondy 1,5 tys. par zasad z fragmentów gp120IIIb i syngp120mn użyto do hybrydyzacji. Każdy z dwu fragmentów stochastycznie znakowano w 50 ml reakcji z 10 ml 5x bufora oligoznakujacego, 8 ml 2,5 mg/ml BSA, 4 pl [a32P]-dCTP (20 mCi/ml; 6000 Ci/mmol), oraz 5 U fragmentu Klenowa. Po 1 do 3 godzinach inkubacji w temperaturze 37°C dodano 100 pl TRUSTEEi niezwiązany [a32p]-dCTP usunięto stosując kolumnę wirówkową G50. Aktywność mierzono licznikiem beta Beckmana, i użyto równych aktywności właściwych do hybrydyzacji. Membrany prehybrydyzowano przez 2 godziny i hybrydyzowano przez 12 do 24 godzin w temperaturze 42°C z sondą 0,5 x 106 cpm na ml płynu hybrydyzacyjnego. Membranę przemyto dwukrotnie (5 min) buforem myjącym I w temperaturze pokojowej, przez godzinę buforem myjącym II w temperaturze 65°C, a następnie zetknięto z filmem rentgenowskim. Podobne wyniki otrzymano stosując fragment 1,1 tys. par zasad Not1/Sfi1 pCDM7 zawierający nietranslowany region 3. Kontrolne hybrydyzacje wykonano równolegle z sondą ze stochastycznie znakowanej ludzkiej beta-aktyny. Ekspresję RNA oceniono ilościowo przeglądając hybrydyzowane membrany nitrocelulozowe fosfoimagerem Magnetic Dynamics.
Następujących roztworów użyto w tej procedurze: 5x bufora oligo-znakującego (250 mM Tris HCl, pH 8,0, 25 mM MgCl2, 5 mM b-merkaptoetanolu, 2 mM dATP, 2 mM dGTP, mM dTTP, 1 M Hepes pH 6,6, 1 mg/ml heksanukleotydów [dNTP]6); roztwór hybrydyzacyjny (0,05 M fosforan sodu, 250 mM NaCl, 7% SDS, 1 mM EDTA, 5% siarczan dekstranu, 50% formamidu, 100 mg/ml denaturowanego DNA spermy łososia); bufora myjącego 1 (2x SSC, 0,1% SDS); bufora myjącego II (0,5x SSC, 0,1% SDS); 20x SSC (3 M NaCl, 0,3 M Na3cytrynian, pH ustawione na 7,0).
Rekombinacja w krowiance
Rekombinacja w krowiance stosuje modyfikację sposobu opisanego przez Romeo i Seeda (Romeo i Seed, Cell, 64: 1037, 1991). Krótko, komórki CV1 przy 70 do 90% zlewaniu zakażono 1 do 3 ml dzikiego typu krowianki WR (2 x 108 pfu/ml) przez 1 godzinę w pożywce kultury bez surowicy cielęcej. Po 24 godzinach komórki transfekowano z fosforanem wapnia z 25 mg DNA plazmidu TKG na naczynie. Po dodatkowych 24 do 48 godzinach komórki zdrapano z płytki, odwirowano i zawieszono ponownie w objętości 1 ml. Po 3 cyklach zamrożenia/rozmrożenia dodano trypsynę do 0,05 mg/ml i lizaty inkubowano przez 20 minut. Serii rozcieńczeń 10, 1 i 0,1 ml tego lizatu użyto do zainfekowania małych naczyń (6 cm) z komórkami CV1, które wstępnie potraktowano 12,5 mg/ml kwasu mykofenolowego, 0,25 mg/ml ksantyny i 1,36 mg/ml hipoksantyny przez 6 godzin. Infekowane komórki hodowano przez 2 do 3 dni, a następnie zabarwiono monoklonalnym przeciwciałem NEA9301 wobec gp120 i sprzężonym z zasadową fosfatazą drugorzędowym przeciwciałem. Komórki inkubowano z 0,33 mg/ml NBT i 0,16 mg/ml BCIP w buforze AP i na koniec pokryto 1% agarozą w PBS. Pozytywne łysinki pobrano i zawieszono ponownie w 100 ml Tris pH 9,0. Oczyszczanie łysinek powtórzono raz. Dla utworzenia roztworów o wysokim, mianie infekcję powoli przeskalowano w górę. Na koniec, jedną dużą płytkę komórek Hela zainfekowano połową wirusa z poprzedniej rundy. Zainfekowane komórki odłączono w 3 ml PBS, lizowano w homogenizatorze Dounce i oczyszczono z większych resztek
PL 192 104 B1 przez odwirowanie. Zapas rekombinacyjnej krowianki VPE-8 otrzymano dzięki uprzejmości składnicy AIDS, Rockville, MD, z ekspresją HIV-1 IIIB gp120 z mieszanym wczesnym/późnym promotorem 7.5 (Earl i in., J. Virol., 65:31, 1991). We wszystkich eksperymentach z rekonabinacyjnymi komórkami z krowianką zakażano przy krotności infekcji co najmniej 10.
Następującego roztworu użyto w tej procedurze: bufor AP (100 mM Tris HCl, pH 9,5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2)
Kultura komórek
Linie komórkowe raka nerki małpy CV1 i Cos7, linię komórkową ludzkiego raka nerki 293T i linię komórkową ludzkiego raka szyjki macicy Hela otrzymano z American Tissue Typing Collection i trzymano w uzupełnionym IMDM. Trzymano je na 10 cm płytkach do kultur i typowo dzielono 1:5 do 1:20 co 3 do 4 dni. Następujące pożywki użyto w tej procedurze: uzupełnionego IMDM (90% zmodyfikowana przez Iscove pożywka Dulbecco, 10% surowica cielęca, uzupełniona w żelazo, zdezaktywowana ciepłem 30 minut, 56°C, 0,3 mg/ml L-glutaminy, 25 mg/ml gentamycyny 0,5 mM b-merkaptoetanolu (pH ustawione 5 M NaOH, 0,5 ml)).
Transfekcja
Transfekcję fosforanem wapnia komórek 293T przeprowadzo no metodą powolnego dodawania z mieszaniem 10 mg plazmidu DNA w 250 ml 0,25 M CaCl2 do tej samej objętości 2x bufora HEBS z mieszaniem. Po inkubacji przez 10 do 30 minut w temperaturze pokojowej osad DNA dodano do małego naczynia zlanych w 50 do 70% komórek. W eksperymentach współtransfekcji z komórkami rev transfekowano 10 mg gp120IIIb, gp120IIlbrre, syngp120mnrre lub rTHY-1enveg1rre i 10 mg pCMVrev lub plazmidu DNA CDM7.
Następujących roztworów użyto w tej procedurze: 2x bufora HEBS (280 mM NaCl, 10 mM KCl,
1,5 mM sterylnie przesączonego); 0,25 mM CaCl2(autoklawowany).
Immunoprecypitacja
Po 48 do 60 godzinach pożywkę wymieniono i komórki inkubowano przez dodatkowe 12 godzin w wolnej od Cys/Met pożywce zawierającej 200 mCi znacznika 35S-trans. Supernatanty zebrano i odwirowano przez 15 minut przy 3000 obrotach na minutę dla usunięcia resztek. Po dodaniu inhibitorów proteazy, leupeptyny, aprotyniny i PMSF do 2,5 mg/ml, 50 ug/ml, 100 mg/ml odpowiednio, 1 ml supernatantu inkubowano z 10 ml upakowanej Sepharose białka A (rTHY-1 enveg1 rre) lub Sepharose białka A i 3 mg oczyszczonego fuzyjnego białka CD4/immunoglobulina (grzeczność Behring) (wszystkie konstrukty gp120) wtemperaturze 4°C przez 12 godzin na wirówce. Następnie kulki białka A przemyto 5 razy przez 5 do 15 minut za każdym razem. Po końcowym przemyciu dodano 10 ml bufora obciążającego zawierającego, próbki gotowano przez 3 minuty i nałożono na 7% (wszystkie konstrukty gp120) lub 10% (rTHY-1enveg1rre) żele poliakryloamidowe SDS (TRIS pH 8,8 bufor do rozwijania, TRIS pH 6,8 bufor w żelu magazynowym, TRIS-glicyna bufor bieżący, Maniatis i in., supra 1989). Żele utrwalano w 10% kwasie octowym i 10% metanolu, inkubowano z Amplify przez 20 minut, osuszono i wystawiono na 12 godzin.
Następujące bufory i roztwory użyto w tej procedurze: bufor myjący (100 mM Tris, pH 7,5, 150mM NaCl, 5 mM CaCl2, 1% NP-40); 5x bufor bieżący (125 mM Tris, 1,25 M glicyny, 0,5% SDS); bufor obciążający (10 % gliceryny, 4% SDS, 4% b-merkaptoetanolu, 0,02 % błękitu bromofenolowego).
Immunofluorescencja
Komórki 293T transfekowano metodą współstrącania z fosforanem wapnia i zanalizowano na powierzchniową ekspresję THY-1 po 3 dniach. Po odłączeniu 1 mM EDTA/PBS, komórki zabarwiono monoklonalnym przeciwciałem OX7 w rozcieńczeniu 1:250 w temperaturze 4°C przez 20 minut, przemyto PBS i następnie inkubowano z rozcieńczeniem 1:500 sprzężonej z FITC koziej anty-mysiej immunoglobulinowej antysurowicy. Komórki przemyto ponownie, zawieszono ponownie w 0,5 ml roztworu utrwalającego i zanalizowano na cytofluorometrze EPICS XL (Coulter).
Następujących roztworów użyto w tej procedurze: PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 4,3 mM Na2HPO4, 1,4 mM KH2PO4, pH ustawione na 7,4); roztworu utrwalającego (2% formaldehydu w PBS).
ELISA
Stężenie gp120 w supernatantach kultury określono stosując powlekane CD4 płytki ELISA i kozie anty-gp120 antysurowice w fazie rozpuszczalnej. Supernatanty komórek 293T transfekowane metodą z fosforanem wapnia zebrano po 4 dniach, odwirowano przy 3000 obrotach na minutę przez 10 minut dla usunięcia resztek i inkubowano przez 12 godzin w temperaturze 4°C na płytkach. Po 6 przemywaniach PBS dodano 100 ml kozich anty-gp120 antysurowic rozcieńczonych 1:200 na 2 godziny. Płytki przemyto ponownie i inkubowano przez 2 godziny ze sprzężonym z peroksydazą króliczą anty-kozią IgG antysurowicą 1:1000. Następnie płytki przemyto i inkubowano przez 30 minut ze
PL 192 104 B1
100 ml roztworu substratu zawierającego 2 mg/ml ofenylenodiaminy w buforze cytrynianu sodu. Reakcję na koniec zatrzymano 100 ml 4 M kwasu siarkowego. Płytki odczytano przy 490 nm czytnikiem mikropłytek Coulter. Oczyszczony rekombinacyjny gp120lllb użyto jako kontrolę. Następujące bufory iroztwory użyto w tej procedurze: buforu myjącego (0,1 % NP40 w PBS); roztworu substratu (2 mg/ml ofenylenodiaminy w buforze cytrynianu sodu).
Przykład II
Projektowanie genu z optymalizacją kodonów do ekspresji ludzkiego czynnika VIII pozbawionego centralnej domeny B
Zaprojektowano syntetyczny gen kodujący dojrzały ludzki czynnik VIII pozbawiony reszt aminokwasowych 760 do 1639, włącznie (reszt 779 do 1658, włącznie, prekursora). Syntetyczny gen utworzono wybierając kodony odpowiadające faworyzowanym przez ludzkie geny o silnej ekspresji. Pewnych odchyleń od ścisłego naśladowania wzoru korzystnych reszt dokonano dla wprowadzenia wgenie unikalnych miejsc rozcinania enzymów restrykcyjnych dla ułatwienia przyszłych manipulacji. W celu wytworzenia syntetycznego genu sekwencję podzielono następnie na 28 segmentów po 150par zasad i 29 segment z 161 parami zasad.
Syntetyczny gen ekspresji ludzkiego czynnika VIII pozbawionego centralnej domeny B skonstruowano jak następuje. Zsyntetyzowano 29 par wzorca oligonukleotydów (patrz poniżej). Wzorcowe oligonukleotydy 5' miały długość 105 zasad i oligonukleotydy 3' miały długość 104 zasad (poza ostatnim oligonukleotydem 3', który miał 125 reszt). Wzorcowe oligonukleotydy zaprojektowano tak, aby każda zgrzewana para złożona z jednego oligonukleotydu 5' i jednego oligonukleotydu 3', tworzyła dwuniciowe regiony 19 par zasad.
Dla ułatwienia PCR i dalszych manipulacji końce 5' par oligonukleotydów zaprojektowano jako niezmienne dla pierwszych 18 reszt, pozwalając na użycie wspólnej pary starterów PCR do wzmacniania i pozwalając na takie same warunki PCR dla wszystkich par. Pierwsze 18 reszt każdego członu 5' pary wzorcowej to: cgc gaa ttc gga aga ccc (SEKW. NR ID.: 110) i pierwszy 18 reszt każdego członu 3' pary wzorcowej to: ggg gat cct cac gtc tca (SEKW. NR ID.:43).
Pary oligonukleotydów wygrzewano i następnie wydłużano i wzmacniano metodą PGR w mieszaninie reakcyjnej jak następuje: wzorce wygrzewano przy 200 mg/ml każdego w buforze PCR (10 mM Tris-HCl, 1,5 mM MgCl2, 50 mM KCl, 100 mg/ml żelatyny, pH 8,3). Reakcje PCR zawierały 2 mg wygrzanego wzorca oligonukleotydów, 0,5 mg każdego z dwu 18-merowych starterów (opisanych poniżej), 200 mM każdego z trifosforanów dezoksynukleozydów, 10% objętościowych DMSO i bufor PCR z Boehringer Mannheim Biochemicals, w końcowej objętości 50 ml. Po dodaniu polimerazy Taq (2,5 jednostki, 0,5 ml; Boehringer Mannheim Biochemicals) wzmacnianie prowadzono na Perkin-Elmer Thermal Cycler przez 25 cykli (94°C przez 30 s, 55°C przez 30 s, i 72°C przez 30 s).Po końcowym cyklu następowało 10 minut wydłużania w temperaturze 72°C.
Wzmacniane fragmenty trawiono EcoRI i BamHI(cięcie przy końcach 5' i 3' fragmentów, odpowiednio) i ligowano do pochodnej pUC9 ciętej EcoRI i BamHI.
Indywidualne klony sekwencjonowano i zidentyfikowano zbiór plazmidów odpowiadających całej żądanej sekwencji. Klony złożono następnie metodą wielofragmentowej ligacjikorzystając z miejsc restrykcji na końcach 3 ' starterów PCR, bazpośrednio sąsiadujących ze wzmacnianą sekwencją. Starter5' PCR zawierał miejsce BbsI, a starter 3' PCR zawierał miejsce BsmBI, ustawione tak, że rozcinanie przez odpowiednie enzymy poprzedzało pierwszy nukleotyd wzmacnianej części i pozostawiało 4-zasadowy nawis 5' tworzony przez pierwsze 4 zasady wzmacnianej części. Jednoczesne trawienie BbsIi BsmBIuwalnia więc wzmacnianą część z unikalnymi 4-zasadowymi nawisami 5' na każdym końcu, które nie zawierają sekwencji startera. Ogólnie takie nawisy nie uzupełniały się same, pozwalając wielofragmentowym reakcjom ligacjina wytwarzanie żądanego produktu z wysoką wydajnością. Unikalna część pierwszych 28 wzmacnianych par oligonukleotydów miała więc 154 par zasad, i po trawieniu każda dawała fragment 150 par zasad z unikalnymi końcami. Jednakże pierwsze iostatnie fragmenty nie były manipulowane w ten sposób, ponieważ miały inne miejsca restrykcji zaprojektowane w nich dla ułatwienia insercji zestawionej sekwencja do odpowiedniego wektora ekspresji ssaka. Rzeczywisty proces zestawiania zachodził jak następuje. Zestawianie syntetycznego genu czynnika VIII
Etap 1:29 fragmentów zestawionych z wytworzeniem 10 fragmentów.
par oligonukleotydów, które tworzyły segmenty 1do 29przy sparowaniu, opisano poniżej.
Plazmidy niosące segmenty 1, 5, 9, 12, 16, 20, 24 i 27 trawiono EcoR1 i BsmBI i fragmenty 170 par zasad wydzielono; plazmidy niosące segmenty 2, 3, 6, 7, 10, 13, 17, 18, 21, 25, i 28 trawiono BbsI i BsmBI i fragmenty 170 par zasad wydzielono; i plazmidy niosące segmenty 4, 8, 11, 14, 19, 22, 26
PL 192 104 B1 i 29 trawiono EcoRI i BbsI i fragment wektora 2440 par zasad wydzielono. Fragmenty niosące segmenty 1, 2, 3 i 4 ligowano następnie dla wytworzenia segmentu A; fragmenty niosące, segmenty 5, 6, 7 i 8 ligowano dla wytworzenia segmentu B; fragmenty niosące segmenty 9, 10 i 11 ligowano dla wytworzenia segmentu C; fragmenty niosące segmenty 12, 13, i 14 ligowano dla wytworzenia segmentu D; fragmenty niosące segmenty 16, 17, 18 i 19 ligowano dla wytworzenia segmentu F; fragmenty niosące segmenty 20, 21 i 22 ligowano dla wytworzenia segmentu G; fragmenty niosące segmenty 24, 25 i 26 ligowano dla wytworzenia segmentu I; i fragmenty niosące segmenty 27, 28 i 29 ligowano dla wytworzenia segmentu J.
Etap 2:Zestawianie 10 powstałych fragmentów z etapu 1 w trzy fragmenty.
Plazmidy niosące segmenty A, D i G trawiono EcoRI i BsmBI, plazmidy niosące segmenty B, 15, 23, i I trawiono BbsI i BsmBI, i plazmidy niosące segmenty C, F, i J trawiono EcoRI i BbsI. Fragmenty niosące segmenty A, B, i C ligowano dla wytworzenia segmentu K; fragmenty niosące segmenty D, 15 i F ligowano dla wytworzenia segmentu O; i fragmenty niosące segmenty G, 23, I i J ligowano dla wytworzenia segmentu P.
Etap 3:Zestawianie końcowych trzech kawałków.
Plazmid niosący segment K trawiono EcoRI i BsmBI, plazmid niosący segment O trawiono BbsI i BsmBI, i plazmid niosący segment P trawiono EcoRI i BbsI. Trzy powstałe fragmenty ligowano dla wytworzenia segmentów.
Etap 4:Insercja syntetycznego genu w wektor ekspresji ssaka.
Plazmid niosący segment S trawiono Nhel i Notl i wstawiono pomiędzy miejsca Nhel i EagI plazmidu CD51NEg1 dla utworzenia plazmidu cd51 sf8b-.
Sekwencjonowanie i korekcja syntetycznego genu czynnika VIII
Po zestawieniu syntetycznego genu odkryto, że wystąpiły dwie niepożądane reszty kodowane w sekwencji. Jedną była reszta Arg przy 749, która występuje w sekwencji z GenBank pochodzącej z Genentech, lecz nie ma jej w sekwencji opisanej przez Genentech w literaturze. Drugą była reszta Ala przy 146, która powinna być Pro. Ta mutacja powstała na niezidentyfikowanym etapie po sekwencjonowaniu 29 składowych fragmentów. Mutację Pro749Arg skorygowano wstawiając żądaną zmianę w starter PGR (ctg ctt ctg acg cgt gct ggg gtg gcg gga gtt; SEKW. NR ID.:44) obejmującą miejsce MluI w pozycji 2335 sekwencji jak poniżej (sekwencja segmentu Hindlll do Notl) i wzmacniając pomiędzy tym starterem i starterem (ctg ctg aaa gtc tcc agc tgc; SEKW. NR ID.:44) 5' względem miejsca SgrAI przy 2225. Fragment SgrAI do Mlul wstawiono następnie do wektora ekspresji w pokrewne miejsca w wektorze, a powstałą poprawną sekwencję po zmianie zweryfikowano przez sekwencjonowanie. Mutację Pro146Ala poprawiono wprowadzając żądaną zmianę sekwencji w oligonukleotyd (ggc agg tgc tta agg aga acg gcc eta tgg cca; SEKW. NR ID.:46) niosący miejsce AflII przy reszcie 504, i wzmacniając fragment powstały z reakcji PGR pomiędzy tym oligonukleotydem i starterem mającym sekwencję cgt tgt tct tca tac gcg tct ggg gct cct cgg ggc (SEKW. NR ID.:109), odcinając powstały fragment PGR AflII i AvrII przy reszcie 989, wstawiając poprawny fragment do wektora ekspresji i potwierdzając konstrukcję przez sekwencjonowanie.
Konstrukcja dopasowanego natywnego genu do ekspresji ludzkiego czynnika VIII pozbawionego centralnej domeny B
Skonstruowano dopasowany plazmid ekspresyjny czynnika VIII z delecją domeny B mający natywną sekwencję kodonów przez wprowadzenie Nhel na końcu 5' dojrzałej sekwencji kodującej stosując starter cgc caa ggg eta gcc gcc acc aga aga tac tac ctg ggt (SEKW. NR ID.: 47), wzmacniając pomiędzy tym starterem i starterem att cgt agt tgg ggt tcc tct gga cag (odpowiadającym resztom 1067 do 1093 sekwencji pokazanej poniżej), odcinając Nhel i AflII (reszta 345 w sekwencji pokazanej poniżej) i wstawiając powstały fragment do odpowiednio pociętego plazmidu niosącego natywny czynnik VIII. Delecję domeny B utworzono metodą nakładającego PGR stosując ctg tat ttg atg aga acc g (odpowiadającego resztom 1813 do 1831 poniżej) oraz caa gacć tgg tgg ggt ggc att aaa ttg ctt t (SEKW. NR ID.:48) (2342 do 2372 na sekwencji uzupełniającej poniżej) dla końca 5' nakładki, oraz aat gcc acc cca cca gtc ttg aaa cgc ca (SEKW. NR ID.:49) (2352 do 2380 na sekwencji poniżej) i cat ctg gat att gca ggg ag (SEKW. NR ID.:50) (3145 do 3164). Produkty dwu indywidualnych reakcji PCR mieszano następnie i ponownie wzmacniano stosując najbardziej zewnętrzne startery, powstały fragment rozcinano na Asp718 (izoschizomer KpnI, 1837 na sekwencji poniżej) i Pf;MI (3100 na sekwencji poniżej), i wstawiano do odpowiednio rozciętego plazmidu ekspresyjnego niosącego natywny czynnik VIII.
PL 192 104 B1
Pełną sekwencję (SEKW. NR ID.: 41) natywnego genu ludzkiego czynnika VIII z wyciętym centralnym regionem B przedstawiono na fig. 12. Pełną sekwencję (SEKW. NR ID.: 42) syntetycznego genu czynnika VIII z wyciętym centralnym regionem B przedstawiono na fig. 13.
Wytwarzanie i próba na plazmidy ekspresyjne
Dwa niezależne plazmidowe izolaty natywnego, i cztery niezależne izolaty syntetycznego plazmidu ekspresyjnego czynnika VIII odrębnie reprodukowano w bakterii i ich DNA wytworzono metodą odwirowania z wyporem CsCl, następnie ekstrakcji fenolem. Analiza supernatantów komórek COS transfekowanych plazmidami pokazała, że syntetyczny gen dawał około czterech razy więcej czynnika VIII niż gen natywny.
Komórki COS transfekowano następnie 5 mg każdego kon-struktu czynnika VIII na 6 cm naczyniu stosując sposób z DEAE-dekstranem. W 72 godziny po transfekcji dodano 4 ml świeżej pożywki zawierającej 10% surowicy cielęcej do każdej płytki. Próbkę pożywki pobrano z każdej płytki 12 godzin później. Próbki testowano metodą ELISA stosując lekkołańcuchowe monoklonalne przeciwciało mysie anty-ludzki czynnik VIII i sprzężone z peroksydazą poliklonalne przeciwciało kozie anty-ludzki czynnik VIII. Oczyszczony ludzki czynnik VIII osocza użyto jako wzorzec. Komórki transfekowane syntetycznym konstruktem genu czynnika VIII dawały ekspresję 138 ± 20,2 ng/ml (ekwiwalent ng/ml bezdelecyjnego czynnika VIII) czynnika VIII (n=4), podczas gdy komórki transfekowane natywnym genem czynnika VIII dawały ekspresję
33,5 ± 0,7 ng/ml (ekwiwalent ng/ml bezdelecyjnego czynnika VIII) czynnika VIII (n=2).
Poniższe wzorcowe oligonukleotydy użyto do konstrukcji syntetycznego genu czynnika VIII.
rl bbs 1 dla (gcta)
ege gaa ttc gga aga ccc get age ege cac 1 rl
ccg ccg eta eta cct ggg ege cgt gga get
gtc ctg gga eta cat gca gag ega cct ggg
ega get ccc cgt gga (SEKW. NR ID.:51)
ggg gat cct cac gtc tea ggt ttt ctt gta
cac cac get ggt gtt gaa ggg gaa get ctt
ggg cac geg ggg ggg gaa geg ggc gtc cac
ggg gag etc gee ca (SEKW. NR ID. .:52)
rl bbs 2 dla (aacc)
ege gaa ttc gga aga ccc aac cct gtt cgt 2 rl
gga gtt cac ega cca cct gtt caa cat tgc
caa gee geg ccc ccc ctg gat ggg cct get
ggg ccc cac cat cca (SEKW. NR ID.:53)
ggg gat cct cac gtc tea gtg cag get gac
ggg gtg get ggc cat gtt ctt cag ggt gat
cac cac ggt gtc gta cac etc ggc ctg gat
ggt ggg gee cag ca (SEKW. NR ID. . : 54)
PL 192 104 B1
rl bbs 3 dla (gcac)
cgc gaa ttc gga aga ccc gca cgc cgt ggg
cgt gag eta ctg gaa ggc cag ega ggg cgc
ega gta ega ega cca gac gtc cca gcg ega
gaa gga gga ega caa (SEKW. NR ID.:55)
rl
ggg gat cct cac gtc tea get ggc cat agg
gee gtt etc ctt a ag cac ctg cca cac gta
ggt gtg get ccc ccc cgg gaa cac ctt gtc
gtc etc ctt etc gc i (SEKW. NR . ID. :56)
barn
rl bbs 4 dla (cagc)
cgc gaa ttc gga aga ccc cag ega ccc cct
gtg cct gac eta cag eta cct gag cca cgt
gga cct ggt gaa gga tet gaa cag cgg get
gat cgg cgc cct get (SEKW. NR ID :57)
rl
ggg gat cct cac gtc tea gaa cag cag gat
gaa ctt gtg cag ggt ctg ggt ttt etc ctt
ggc cag get gee etc gcg aca cac cag cag
ggc gee gat cag cc (SEKW r. NR . ID. :S8)
bam rl bbs 5 dla (gttc)
cgc gaa ttc gga aga ccc gtt cgc cgt gtt
ega ega ggg gaa gag ctg gca cag ega gac
taa gaa cag cct gat gca gga ccg ega cgc
cgc cag cgc ccg cgc (SEKW. NR ID.:59)
ggg gat cct cac gtc tea gtg gca gee gat
cag gee ggg cag get gcg gtt cac gta gee
rl barn
PL 192 104 B1
gtt ggc aac gct ggt ggc gtg ggc cat gt ctt ggg cca (SEKW. NR ID. ggc : 60) gcg
rl bbs 6 dla (ccac)
cgc gaa ttc gga aga ccc cca ccg caa gag
cgt gta ctg gca cgt cat cgg cat ggg cac
cac ccc tga ggt gca cag cat ctt cct gga
ggg cca cac ctt cct (SEKW. NR ID.:61)
rl
ggg gat cct cac gtc tca cag ggt ctg ggc
agt cag gaa ggt gat ggg gct gat ctc cag
gct ggc ctg gcg gtg gtt gcg cac cag gaa
ggt gtg gcc ctc ca (SEKW. NR ID. :62)
bam
rl bbs 7 dla (cctg)
cgc gaa ttc gga aga ccc cct gct gat gga
cct agg cca gtt cct gct gtt ctg cca cat
cag cag cca cca gca ega cgg cat gga ggc
tta cgt gaa ggt gga (SEKW. NR ID.:63)
rl
ggg gat cct cac gtc tca gtc gtc gtc gta
gtc ctc ggc ctc ctc gtt gtt ctt cat gcg
cag ctg ggg ctc ctc ggg gca gct gtc cac
ctt cac gta agc et (SEKW. NR ID. .:64)
bam
rl bbs 8 dla (cgac)
cgc gaa ttc gga aga ccc ega cct gac ega
cag ega gat gga tgt cgt acg ctt ega ega
ega caa cag ccc cag ctt cat cca gat ccg
cag cgt ggc caa gaa (SEKW. NR ID.:65)
rl
PL 192 104 B1
ggg gat cct cac gtc tca tac tag cgg ggc
gta gtc cca gtc ctc ctc ctc ggc ggc gat
gta gtg cac cca ggt ctt agg gtg ctt ctt
ggc cac gct gcg ga (SEKW. NR ID. . Ϊ 66)
bam
rl bbs 9 dla (agta)
cgc gaa ttc gga aga ccc agt act ggc ccc
ega ega ccg cag eta caa gag cca gta cct
gaa caa cgg ccc cca gcg cat cgg ccg caa
gta caa gaa ggt gcg (SEKW. NR ID.:67)
rl
ggg gat cct cac gtc tca gag gat gcc gga
ctc gtg ctg gat ggc ctc gcg ggt ctt gaa
agt ctc gtc ggt gta ggc cat gaa gcg cac
ctt ctt gta ctt gc (SEKW. NR ID. : 68)
bam
rl bbs 10 dla (cctc)
ege gaa ttc gga aga ccc cct cgg ccc cct
gct gta cgg ega ggt ggg ega cac cct gct
gat cat ctt caa gaa cca ggc cag cag gcc
eta caa cat eta ccc (SEKW. ; NR ID.:69)
rl
ggg gat cct cac gtc tca ctt cag gtg ctt
cac gcc ctt ggg cag gcg gcg gct gta cag
ggg gcg cac gtc ggt gat gcc gtg ggg gta
gat gtt gta ggg cc (SEKW. NR ID. . :7O)
bam rl bbs 11 dla (gaag)
ege gaa ttc gga aga ccc gaa gga ctt ccc
cat cct gcc cgg ega gat ctt caa gta caa
gtg gac cgt gac cgt gga gga cgg ccc cac
rl
PL 192 104 B1
caa gag ega ccc ccg (SEKW. NR ID.:71)
ggg gat cct cac gtc tca gcc gat cag tcc 11 barn
gga ggc cag gtc gcg ctc cat gtt cac gaa
gct gct gta gta gcg ggt cag gca gcg ggg
gtc gct ctt ggt gg (SEKW. NR ID.:72)
rl bbs 12 dla (cggc)
cgc gaa ttc gga aga ccc cgg ccc cct gct 12 rl
gat ctg eta caa gga gag cgt gga cca gcg
cgg caa cca gat cat gag ega caa gcg caa
cgt gat cct gtt cag (SEKW. NR ID.:73)
ggg gat cct cac gtc tca age ggg gtt ggg 12 barn
cag gaa gcg ctg gat gtt ctc ggt cag ata
cca gct gcg gtt ctc gtc gaa cac gct gaa
cag gat cac gtt gc (SEKW. NR ID.:74)
rl bbs 13 dla (eget)
cgc gaa ttc gga aga ccc cgc tgg cgt gca 13 rl
gct gga aga tcc ega gtt cca ggc cag caa
cat cat gca cag cat caa cgg eta cgt gtt
ega cag cct gca gct (SEKW. NR ID.:75)
ggg gat cct cac gtc tca cag gaa gtc ggt 13 bam
ctg ggc gcc gat gct cag gat gta cca gta
ggc cac ctc atg cag gca cac gct cag ctg
cag gct gtc gaa ca (SEKW. NR ID.:75)
rl bbs 14 dla (cctg)
cgc gaa ttc gga aga ccc cct gag cgt gtt 14 rl
PL 192 104 B1
ctt ctc cgg gta tac ctt caa gca caa gat
ggt gta ega gga cac cct gac cct gtt ccc
ctt ctc cgg ega gac (sekw. : NR IE i.:77)
ggg gat cct cac gtc tea gtt gcg gaa gtc
get gtt gtg gca gcc cag aat cca cag gcc
ggg gtt ctc cat aga cat gaa cac agt ctc
gcc gga gaa ggg ga (SEKW. NR . ID. : 78)
barn
rl bbs 15 < ila (caac)
cgc gaa ttc gga aga ccc caa ccg cgg cat
gac tgc cct get gaa agt ctc cag ctg ega
caa gaa cac cgg ega eta eta ega gga cag
eta ega gga cat ctc (SEKW. NR IE >. :79)
rl
ggg gat cct cac gtc tea gcg gtg gcg gga
gtt ttg gga gaa gga gcg ggg ctc gat ggc
gtt gtt ctt gga cag cag gta ggc gga gat
gtc ctc gta get gt (SEKW. NR ID. . :80)
barn
rl bbs 16 dla (ccgc)
cgc gaa ttc gga aga ccc ccg cag cac gcg
tea gaa gca gtt caa cgc cac ccc ccc cgt
get gaa gcg cca cca gcg ega gat cac ccg
cac cac cct gca aag (SEKW. NR IE i. :81)
rl
ggg gat cct cac gtc tea gat gtc gaa gtc
ctc ctt ctt cat ctc cac get gat ggt gtc
gtc gta gtc gat ctc ctc ctg gtc get ttg
cag ggt ggt gcg gg (SEKW. NR ID. . :82)
bam
PL 192 104 B1
rl bbs 17 dla (catc)
cgc gaa ttc gga aga ccc,cat eta ega ega
gga ega gaa cca gag ccc ccg etc ctt cca
aaa gaa aac ccg cca eta ctt cat cgc cgc
cgt gga gcg cct gtg (SEKW. I NR ID.:83}
rl
ggg gat cct cac gtc tea ctg ggg cac get
gee get ctg ggc gcg gtt gcg cag gac gtg
ggg get get get cat gee gta gtc cca cag
gcg etc cac ggc gg (SERW. NE . ID. : 84)
bam
rl bbs 18 dla (ccag)
cgc gaa ttc gga aga ccc cca gtt caa gaa
ggt ggt gtt cca gga gtt cac ega cgg cag
ctt cac cca gee cct gta ccg cgg ega get
gaa ega gca cct ggg (SEKW. 1 NR ID i. : 85)
rl
ggg gat cct cac gtc tea ggc ttg gtt gcg
gaa ggt cac cat gat gtt gtc etc cac etc
ggc gcg gat gta ggg gee gag cag gee cag
gtg etc gtt cag et (SEKW. NR : id. : 86)
bam
rl bbs 19 dla (agee)
cgc gaa ttc gga aga ccc age etc ccg gee
eta etc ctt eta etc etc cct gat cag eta
ega gga gga cca gcg cca ggg cgc ega gee
ccg caa gaa ctt cgt (SEKW. NR ID i. : 87)
rl
ggg gat cct cac gtc tea etc gtc ctt ggt
ggg ggc cat gtg gtg ctg cac ctt cca gaa
gta ggt ctt agt etc gtt ggg ctt cac gaa
bam
PL 192 104 B1
gtt ctt gcg ggg ct (SEKW. NR ID. : 88)
rl bbs 2 0 dla (egag)
cgc gaa ttc gga aga ccc ega gtt ega ctg
caa ggc ctg ggc eta ctt cag ega cgt gga
cct gga gaa gga cgt gca cag cgg cct gat
cgg ccc cct gct ggt (SEKW. NR IE 1. i 89)
rl
ggg gat cct cac gtc tca gaa cag ggc aaa
ttc ctg cac agt cac ctg cct ccc gtg ggg
ggg gtt cag ggt gtt ggt gtg gca cac cag
cag ggg gcc gat ca (SEKW. NR ID, .:90)
0 bam
rl bbs 21 dla (gtte)
cgc gaa ttc gga aga ccc gtt ctt cac cat
ctt ega ega gac taa gag ctg gta ctt cac
ega gaa cat gga gcg caa ctg ccg cgc ccc
ctg caa cat cca gat (SEKW. NR ID.:91)
rl
ggg gat cct cac gtc tca cag ggt gtc cat
gat gta gcc gtt gat ggc gtg gaa gcg gta
gtt ctc ctt gaa ggt ggg atc ttc cat ctg
gat gtt gca ggg gg (SEKW. NR ID. . :92)
bam
rl bbs 22 dla (cctg)
cgc gaa ttc gga aga ccc cct gcc cgg cct
ggt gat ggc cca gga cca gcg cat ccg ctg
gta cct gct gtc tat ggg cag caa ega gaa
cat cca cag cat cca (SEKW. NR ID.:93)
ggg gat cct cac gtc tca gta cag gtt gta
rl bam
PL 192 104 B1
cag ggc cat ctt gta ctc ctc ctt ctt gcg
cac ggt gaa aac gtg gcc gct gaa gtg gat
gct gtg gat gtt ct (SEKW. NR ID. .:94)
rl bbs 2 3 dla (gtac)
cgc gaa ttc gga aga ccc gta ccc cgg cgt
gtt ega gac tgt gga gat gct gcc cag caa
ggc cgg gat ctg gcg cgt gga gtg cct gat
cgg ega gca cct gca (SEKW. NR ID.:95)
rl
ggg gat cct cac gtc tca gct ggc cat gcc
cag ggg ggt ctg gca ctt gtt gct gta cac
cag gaa cag ggt gct cat gcc ggc gtg cag
gtg ctc gcc gat ca (SEKW. NR ID. . : 96)
3 bam
rl bbs 2 4 dla (cagc)
cgc gaa ttc gga aga ccc cag cgg cca cat
ccg ega ctt cca gat cac cgc cag cgg cca
gta cgg cca gtg ggc tcc caa gct ggc ccg
cct gca eta cag cgg (SEKW. NR ID.:97)
rl
ggg gat cct cac gtc tca cat ggg ggc cag
cag gtc cac ctt gat cca gga gaa ggg ctc
ctt ggt ega cca ggc gtt gat gct gcc gct
gta gtg cag gcg gg (SEKW. NR ID. . :98)
bam
rl bbs 25 dla (catg)
cgc gaa ttc gga aga ccc cat gat cat cca
cgg cat caa gac cca ggg cgc ccg cca gaa
gtt cag cag cct gta cat cag cca gtt cat
cat cat gta ctc tet (SEKW. NR ID.:99)
rl
PL 192 104 B1
ggg gat cct cac gtc tca gtt gcc gaa gaa
cac cat cag ggt gcc ggt gct gtt gcc gcg
gta ggt ctg cca ctt ctt gcc gtc tag aga
gta cat gat gat ga (SEKW. NR ID. , =100)
bam
rl bbs 2 6 dla (caac)
cgc gaa ttc gga aga ccc caa cgt gga cag
cag cgg cat caa gca caa cat ctt caa ccc
ccc cat cat cgc ccg eta cat ccg cct gca
ccc cac cca eta cag (sekw. : NR ID.:101)
6 rl
ggg gat cct cac gtc tca gcc cag ggg cat
gct gca gct gtt cag gtc gca gcc cat cag
ctc cat gcg cag ggt gct gcg gat gct gta
gtg ggt ggg gtg ca (SEKW. NR ID. .:102)
6 bam
rl bbs 27 dla (gggc)
cgc gaa ttc gga aga ccc ggg cat gga gag
caa ggc cat cag ega cgc cca gat cac cgc
ctc cag eta ctt cac caa cat gtt cgc cac
ctg gag ccc cag caa (SEKW. ] NR ID.:103)
rl
ggg gat cct cac gtc tca cca ctc ctt ggg
gtt gtt cac ctg ggg gcg cca ggc gtt gct
gcg gcc ctg cag gtg cag gcg ggc ctt gct
ggg gct cca ggt gg (SEKW. NR ID. .:104)
bam
rl bbs 28 dla (gtgg)
cgc gaa ttc gga aga ccc gtg gct gca ggt 28 rl
gga ctt cca gaa aac cat gaa ggt gac tgg
PL 192 104 B1
cgt gac gac cag cac cat cca gta ggg cgt caa gag cct get
cgt (SEKW. NR ID.:105)
ggg gat cct cac gtc tea ctt gee gtt ttg 28 bam
gaa gaa cag ggt cca ctg gtg gee gtc ctg
get get get gat cag gaa etc ctt cac gta
cat get ggt cag ca (SEKW. NR ID.:106)
rl bbs 29 dla (caag)
ege gaa ttc gga aga ccc caa ggt gaa ggt 29 rl
gtt cca ggg caa cca gga cag ctt cac acc
ggt cgt gaa cag cct gga ccc ccc cct get
gac ccg eta cct geg (SEKW. NR ID.:107)
ggg gat cct cac gtc tea geg gee get tea 29 bam
gta cag gtc ctg ggc etc gca gee cag cac
etc cat geg cag ggc gat ctg gtg cac cca
get ctg ggg gtg gat geg cag gta geg ggt
cag ca (SEKW. NR ID.:108)
Użycie kodonów dla natywnego i syntetycznego genu opisanych powyżej przedstawiono w tabelach 3 i 4, odpowiednio.
T a b e l a 3
Częstotliwość kodonów syntetycznego genu czynnika VIII z delecją domeny B
AA Kodon Liczba /1000 Ułamek
Gly GGG 7,00 4,82 0,09
Gly GGA 1,00 0,69 0,01
Gly GGT 0,00 0,00 0,00
Gly GGC 74,00 50,93 0,90
Glu GAG 81,00 55,75 0,96
Glu GAA 3,00 2,06 0,04
Asp GAT 4,00 2,75 0,05
Asp GAC 78,00 53,68 0,95
PL 192 104 B1 cd. tabeli 3
AA Kodon Liczba /1000 Ułamek
Val GTG 77,00 52,99 0,88
Val GTA 2,00 1,38 0,02
Val GTT 2,00 1,38 0,02
Val GTC 7,00 4,82 0,08
Ala GCG 0,00 0,00 0,00
Ala GCA 0,00 0,00 0,00
Ala GCT 3,00 2,06 0,04
Ala GCC 67,00 46,11 0,96
Arg AGG 2,00 1,38 0,03
Arg AGA 0,00 0,00 0,00
Ser AGT 0,00 0,00 0,00
Ser AGC 97,00 66,76 0,81
Lys AAG 75,00 51,62 0,94
Lys AAA 5,00 3,44 0,06
Asn AAT 0,00 0,00 0,00
Asn AAC 63,00 43,36 1,00
Met ATG 43,00 29,59 1,00
Ile ATA 0,00 0,00 0,00
Ile ATT 2,00 1,38 0,03
Ile ATC 72,00 49,55 0,97
Thr ACG 2,00 1,38 0,02
Thr ACA 1,00 0,69 0,01
Thr ACT 10,00 6,88 0,12
Thr ACC 70,00 48,18 0,84
Trp TGG 28,00 19,27 1,00
Bnd TGA 1,00 0,69 1,00
Cys TGT 1,00 0 ,b9 0,05
Cys TGC 18,00 12,39 0,95
End TAG 0,00 0,00 0,00
End TAA 0,00 0,00 0,00
Tyr TAT 2,00 1,38 0,03
Tyr TAC 66,00 45,42 0,97
Leu TTG 0,00 0,00 0,00
Leu TTA 0,00 0,00 0,00
Phe TTT 1,00 0,69 0,01
Phe ttc 76, 00 52,31 0,99
Ser TCG 1,00 0,69 0,01
Ser TCA 0,00 0,00 0,00
Ser tct 3,00 2,06 0,03
Ser tcc 19,00 13,08 0,16
PL 192 104 B1 cd. tabeli 3
AA Kodon Liczba /1000 Ułamek
Arg CGG 1,00 0,69 0,01
Arg CGA 0,00 0,00 0,00
Arg CGT 1,00 0,69 0,01
Arg CGC 69,00 47,49 0,95
Gin CAG 62,00 42,67 0,93
Gin CAA 5,00 3,44 0,07
His CAT 1,00 0,69 0,02
His CAC 50,00 34,41 0,98
Leu CTG 118,00 81,21 0,94
Leu CTA 3,00 2,06 0,02
Leu CTT 1,00 0,69 0,01
Leu CTC 3,00 2,06 0,02
Pro CCG 4,00 2,75 0,05
Pro CCA 0,00 0,00 0,00
Pro CCT 3,00 2,06 0,04
Pro CCC 68,00 46,80 0,91
T a b e l a 4
Częstość kodonów natywnego genu czynnika VIII z delecją domeny B
AA Kodon Liczba /1000 Ułamek
Gly GGG 12,00 8,26 0,15
Gly GGA 34,00 23,40 0,41
Gly GGT 16,00 11,01 0,20
Gly GGC 20,00 13,76 0,24
Glu GAG 33,00 22,71 0,39
Glu GAA 51,00 35,10 0,61
Asp GAT 55,00 37,85 0,67
Asp GAC 27,00 18,58 0,33
Val GTG 29,00 19,96 0,33
Val GTA 19,00 13,08 0,22
Val GTT 17,00 11,70 0,19
Val GTC 23,00 15,83 0,26
Ala GCG 2,00 1,38 0,03
Ala GCA 18,00 12,39 0,25
Ala GCT 31,00 21,34 0,44
Ala GCC 20,00 13,76 0,28
Arg AGG 18,00 12,39 0,25
Arg AGA 22,00 15,14 0,30
Ser AGT 22,00 15,14 0,18
PL 192 104 B1 cd. tabeli 4
AA Kodon Liczba /1000 Ułamek
Ser AGC 24,00 16,52 0,20
Lys AAG 32,00 22,02 0,40
Lys AAA 48,00 33,04 0,60
Asn AAT 38,00 26,15 0,60
Asn AAC 25,00 17,21 0,40
Met ATG 43,00 29,59 1, 00
Ile ATA 13,00 8,95 0,18
Ile ATT 36,00 24,78 0,49
Ile ATC 25,00 17,21 0,34
Thr ACG 1,00 0,69 0,01
Thr ACA 23,00 15,83 0,28
Thr ACT 36,00 24,78 0,43
Thr ACC 23,00 15,83 0,28
Trp TGG 28,00 19,27 1,00
End TGA 1,00 0,69 1,00
Cys TGT 7,00 4,82 0,37
Cys TGC 12,00 8,26 0,63
End TAG 0,00 0,00 0, 00
End TAA 0, 00 0,00 0, 00
Tyr TAT 41,00 28,22 0,60
Tyr TAC 27,00 18,58 0,40
Leu TTG 20,00 13,76 0,16
Leu TTA 10,00 6,88 0,08
Phe TTT 45,00 30,97 0,58
Phe TTC 32,00 22,02 0,42
Ser TCG 2,00 1,38 0,02
Ser TCA 27,00 18,58 0,22
Ser TCT 27,00 18,58 0,22
Ser TCC 18,00 12,39 0,15
Arg CGG 6, 00 4,13 0,08
Arg CGA 10, 00 6,88 0,14
Arg CGT 7,00 4,82 0,10
Arg CGC 10,00 6,88 0,14
Gin CAG 42,00 28,91 0,63
Gin CAA 25,00 17,21 0,37
His CAT 28,00 19,27 0,55
His CAC 23,00 15,83 0,45
Leu CTG 36, 00 24,78 0,29
Leu CTA 15,00 10,32 0,12
Leu CTT 24,00 16,52 0,19
PL 192 104 B1 cd. tabeli 4
AA Kodon Liczba /1000 Ułamek
Leu CTC 20,00 13,76 0,16
Pro CCG 1,00 0,69 0,01
Pro CCA 32,00 22,02 0,43
Pro CCT 26,00 17,89 0,35
Pro CCC 15,00 10,32 0,20
Zastosowanie
Syntetyczne geny według wynalazku są przydatne do ekspresji białka normalnie ulegającego ekspresji w komórkach ssaka w kulturze komórek (np. dla celów przemysłowej produkcji ludzkich białek takich jak hGH, TPA, czynnik VIII i czynnik IX).Syntetyczne geny według wynalazku są także przydatne do terapii genowej. Np., syntetyczny gen kodujący wybrane białko można wprowadzać do komórki, która może dawać ekspresję białka, dla utworzenia komórki, która może być podawana genu pacjentowi potrzebującemu tego białka. Takie oparte na komórkach techniki terapii genowej są dobrze znane specjalistom, patrz, np., Anderson, i in., opis patentowy St. Zjedn. Ameryki nr 5399349; Mulligan i Wilson, opis patentowy St. Zjedn. Ameryki nr 5460959.

Claims (17)

1. Syntetyczny gen kodujący białko czynnika VIII pozbawione centralnej domeny regionu B, w którym co najmniej jeden niekorzystny lub mniej korzystny kodon w naturalnym genie kodującym to białko zastąpiono korzystnym kodonem kodującym ten sam aminokwas, przy czym wspomniane korzystne kodony wybrane są z grupy obejmującej gcc, cgc, aac, gac, tgc, cag, ggc cac atc, ctg, aag, ccc, ttc, agc, acc, tac, gtg, i mniej korzystne kodony są wybrane z grupy obejmującej ggg, att, ctc, tcc, gtc i agg i wspomniane nie korzystne kodony są wszystkimi kodonami innymi niż wspomniane korzystne kodony i mniej korzystne kodony.
2. Syntetyczny gen według zastrz. 1, znamienny tym, że syntetyczny gen jest zdolny do ekspresji białka na poziomie, który wynosi co najmniej 110% poziomu ekspresji naturalnego genu w układzie kultury komórek ssaka in vitro w identycznych warunkach.
3. Syntetyczny gen według zastrz. 1, znamienny tym, że syntetyczny gen jest zdolny do ekspresji białka na poziomie, który wynosi co najmniej 150% poziomu ekspresji naturalnego genu wukładzie kultury komórek ssaka in vitro w identycznych warunkach.
4. Syntetyczny gen według zastrz. 1, znamienny tym, że syntetyczny gen jest zdolny do ekspresji białka na poziomie, który wynosi co najmniej 200% poziomu ekspresji naturalnego genu w układzie kultury komórek ssaka in vitro w identycznych warunkach.
5. Syntetyczny gen według zastrz. 1, znamienny tym, że syntetyczny gen jest zdolny do ekspresji białka na poziomie, który wynosi co najmniej 500% poziomu ekspresji naturalnego genu w układzie kultury komórek ssaka in vitro w identycznych warunkach.
6. Syntetyczny gen według zastrz. 1, znamienny tym, że syntetyczny gen jest zdolny do ekspresji białka na poziomie, który wynosi co najmniej 1000% poziomu ekspresji naturalnego genu wukładzie kultury komórek ssaka in vitro w identycznych warunkach.
7. Syntetyczny gen według zastrz. 1, znamienny tym, że syntetyczny gen zawiera mniej niż 5 wystąpień sekwencji CG.
8. Syntetyczny gen według zastrz. 1, znamienny tym, że co najmniej 10% kodonów w naturalnym genie to niekorzystne kodony.
9. Syntetyczny gen według zastrz. 1, znamienny tym, że co najmniej 50% kodonów w naturalnym genie to niekorzystne kodony.
10. Syntetyczny gen według zastrz. 1, znamienny tym, że co najmniej 50% niekorzystnych kodonów i mniej korzystnych kodonów obecnych w naturalnym genie zastąpiono korzystnymi kodonami.
11. Syntetyczny gen według zastrz. 1, znamienny tym, że co najmniej 90% niekorzystnych kodonów i mniej korzystnych kodonów obecnych w naturalnym genie zastąpiono korzystnymi kodonami.
PL 192 104 B1
12. Syntetyczny gen według zastrz. 1, znamienny tym, że co najmniej 20% kodonów to korzystne kodony.
13. Syntetyczny gen według zaostrz. 1, znamienny tym, że gen ma sekwencję kodującą przedstawioną na SEKW. NR ID.:42.
14. Wektor ekspresji, znamienny tym, że obejmuje syntetyczny gen jak zdefiniowano w zastrz. 1.
15. Wektor ekspresji według zastrz. 14, znamienny tym, że jest wektorem ekspresji ssaka.
16. Komórka ssaka mieszcząca syntetyczny gen jak zdefiniowano w zastrz. 1.
17. Sposób wytwarzania syntetycznego genu kodującego białko czynnika VIII jak zdefiniowano w zastrz. 1, pozbawione centralnej domeny regionu B, znamienny tym, że identyfikuje się niekorzystne i mniej korzystne kodony w naturalnym genie kodującym białko czynnika VIII pozbawione centralnej domeny regionu B i zastępuje jeden lub więcej niekorzystnych i mniej korzystnych kodonów korzystnym kodonem kodującym ten sam aminokwas, co zastąpiony kodon.
PL376940A 1996-09-20 1997-09-18 Syntetyczny gen kodujący białko czynnika VIII, wektor ekspresji, komórka ssaka i sposób wytwarzania syntetycznego genu PL192104B1 (pl)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08717294 US6114148C1 (en) 1996-09-20 1996-09-20 High level expression of proteins
PCT/US1997/016639 WO1998012207A1 (en) 1996-09-20 1997-09-18 High level expression of proteins

Publications (1)

Publication Number Publication Date
PL192104B1 true PL192104B1 (pl) 2006-08-31

Family

ID=24881447

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL332431A PL191300B1 (pl) 1996-09-20 1997-09-18 Syntetyczny gen kodujący białko fluoryzujące na zielono, wektor ekspresji, komórka ssaka oraz sposób wytwarzania genu
PL376940A PL192104B1 (pl) 1996-09-20 1997-09-18 Syntetyczny gen kodujący białko czynnika VIII, wektor ekspresji, komórka ssaka i sposób wytwarzania syntetycznego genu

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL332431A PL191300B1 (pl) 1996-09-20 1997-09-18 Syntetyczny gen kodujący białko fluoryzujące na zielono, wektor ekspresji, komórka ssaka oraz sposób wytwarzania genu

Country Status (19)

Country Link
US (1) US6114148C1 (pl)
EP (1) EP0929564B1 (pl)
JP (1) JP2001503252A (pl)
KR (1) KR100490321B1 (pl)
CN (1) CN1307195C (pl)
AT (1) ATE389666T1 (pl)
AU (1) AU737122B2 (pl)
BR (1) BR9712077A (pl)
CA (1) CA2265976C (pl)
CZ (1) CZ96899A3 (pl)
DE (1) DE69738586T2 (pl)
DK (1) DK0929564T3 (pl)
ES (1) ES2304791T3 (pl)
HU (1) HUP9904239A3 (pl)
MX (1) MX259447B (pl)
PL (2) PL191300B1 (pl)
RU (1) RU2233329C2 (pl)
TR (1) TR199900624T2 (pl)
WO (1) WO1998012207A1 (pl)

Families Citing this family (255)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5786464C1 (en) * 1994-09-19 2012-04-24 Gen Hospital Corp Overexpression of mammalian and viral proteins
US6534312B1 (en) 1996-02-22 2003-03-18 Merck & Co., Inc. Vaccines comprising synthetic genes
US6696291B2 (en) * 1997-02-07 2004-02-24 Merck & Co., Inc. Synthetic HIV gag genes
EE9900343A (et) * 1997-02-07 2000-02-15 Merck & Co., Inc. Sünteetiline polünukleotiid, immuunvastuste tekitamise meetod, immunogeenne kompositsioon, anti-HIV immuunvastuste indutseerimise meetod, meetod antigeeni tekitava raku indutseerimiseks ja farmatseutiline kompositsioon
CA2296067C (en) * 1997-07-09 2008-10-07 The University Of Queensland Nucleic acid sequence and method for selectively expressing a protein in a target cell or tissue
AUPP807899A0 (en) * 1999-01-08 1999-02-04 University Of Queensland, The Codon utilization
US6602677B1 (en) * 1997-09-19 2003-08-05 Promega Corporation Thermostable luciferases and methods of production
EP1025244A2 (en) * 1997-10-20 2000-08-09 Genzyme Transgenics Corporation NOVEL MODIFIED MSP-1 NUCLEIC ACID SEQUENCES AND METHODS FOR INCREASING mRNA LEVELS AND PROTEIN EXPRESSION IN CELL SYSTEMS
GB9803351D0 (en) 1998-02-17 1998-04-15 Oxford Biomedica Ltd Anti-viral vectors
GB9810752D0 (en) * 1998-05-19 1998-07-15 Glaxo Group Ltd Cystosine deaminase gene
WO2000015819A1 (en) * 1998-09-11 2000-03-23 The Children's Medical Center Corporation Packaging cell lines for hiv-derived retroviral vector particles
US6958226B1 (en) 1998-09-11 2005-10-25 The Children's Medical Center Corp. Packaging cells comprising codon-optimized gagpol sequences and lacking lentiviral accessory proteins
US6924365B1 (en) 1998-09-29 2005-08-02 Transkaryotic Therapies, Inc. Optimized messenger RNA
US20090017533A1 (en) * 1998-09-29 2009-01-15 Shire Human Genetic Therapies, Inc., A Delaware Corporation Optimized messenger rna
US20050037335A1 (en) * 1998-11-07 2005-02-17 Wolfgang Hillen Method for identifying novel transcriptional regulatory proteins
PT1141315E (pt) 1998-12-31 2008-05-05 Novartis Vaccines & Diagnostic Polipéptidos do envelope (env) de hiv modificados
WO2000039304A2 (en) 1998-12-31 2000-07-06 Chiron Corporation Polynucleotides encoding antigenic hiv type c polypeptides, polypeptides and uses thereof
US7935805B1 (en) 1998-12-31 2011-05-03 Novartis Vaccines & Diagnostics, Inc Polynucleotides encoding antigenic HIV Type C polypeptides, polypeptides and uses thereof
WO2000039302A2 (en) * 1998-12-31 2000-07-06 Chiron Corporation Improved expression of hiv polypeptides and production of virus-like particles
AUPP807799A0 (en) * 1999-01-08 1999-02-04 University Of Queensland, The Polynucleotide and method
AU778809B2 (en) * 1999-03-29 2004-12-23 Statens Serum Institut Method for producing a nucleotide sequence construct with optimised codons for an HIV genetic vaccine based on primary, early HIV isolate and synthetic envelope BX08 constructs
PL351988A1 (en) * 1999-04-26 2003-07-14 Leuven K U Res & Dev Synthetic gene for expressing active retroviral protein in eukaryotes
US20050271689A1 (en) * 2003-07-11 2005-12-08 Chun-Ming Huang Novel targets and compositions for use in decontamination, immunoprophylaxis, and post-exposure therapy against anthrax
WO2000075347A2 (en) * 1999-06-07 2000-12-14 Wolfgang Hillen Tet repressor-based transcriptional regulatory proteins
EP2275559A3 (en) 1999-09-28 2011-03-23 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Optimized messenger RNA
WO2002064799A2 (en) * 1999-09-28 2002-08-22 Transkaryotic Therapies, Inc. Optimized messenger rna
US7668658B2 (en) 1999-10-13 2010-02-23 Sequenom, Inc. Methods for generating databases and databases for identifying polymorphic genetic markers
US20030096778A1 (en) * 2002-06-13 2003-05-22 Shiver John W Polynucleotide vaccines expressing codon optimized hiv-1 nef and modified hiv-1 nef
US20040063653A1 (en) * 2000-12-21 2004-04-01 Shiver John W. Polynucleotide vaccines expressing codon optimized hiv-1 pol and modified hiv-1 pol
US6656706B2 (en) * 1999-12-23 2003-12-02 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Molecular clones with mutated HIV gag/pol, SIV gag and SIV env genes
KR20010102331A (ko) * 1999-12-24 2001-11-15 요트.게.아. 롤페즈 인장 마스크를 포함하는 컬러 음극선관
US6502774B1 (en) * 2000-03-08 2003-01-07 J + L Fiber Services, Inc. Refiner disk sensor and sensor refiner disk
EP1136553A1 (en) * 2000-03-22 2001-09-26 Octagene GmbH Production of recombinant blood clotting factors in human cell lines
AU2001254715B2 (en) * 2000-03-22 2006-02-02 Octaphama Ag Production of recombinant blood clotting factors in human cell lines
GB0017990D0 (en) * 2000-07-21 2000-09-13 Glaxo Group Ltd Papilloma virus sequences
US7879540B1 (en) * 2000-08-24 2011-02-01 Promega Corporation Synthetic nucleic acid molecule compositions and methods of preparation
US20030157643A1 (en) * 2000-08-24 2003-08-21 Almond Brian D Synthetic nucleic acids from aquatic species
DE10055545A1 (de) * 2000-11-09 2002-07-25 Deutsches Krebsforsch Für Expression in Eukaryonten optimierte HPV 16-L1 und HPV 16-L2 kodierende DNA Sequenzen
ATE464317T1 (de) 2001-06-05 2010-04-15 Curevac Gmbh Stabilisierte mrna mit erhöhtem g/c-gehalt für die gentherapie
EP2110385A1 (en) 2001-06-14 2009-10-21 The Scripps Research Institute Stabilized factor VIII with engineered disulfide bonds
WO2003004620A2 (en) * 2001-07-05 2003-01-16 Chiron, Corporation Polynucleotides encoding antigenic hiv type c polypeptides, polypeptides and uses thereof
EP1409694A4 (en) * 2001-07-05 2006-02-08 Chiron Corp POLYNUCLEOTIDES ENCODING ANTIGENIC POLYPEPTIDES OF HIV SUBTYPE B AND / OR SUBTYPE C, POLYPEPTIDES AND USES THEREOF
EP1427806A4 (en) * 2001-08-31 2006-04-26 Chiron Corp ANTIGENIC HIV-TYPE B POLYPEPTIDE-CODING POLYNUCLEOTIDES, POLYPEPTIDES, AND USES THEREOF
US20030170614A1 (en) * 2001-08-31 2003-09-11 Megede Jan Zur Polynucleotides encoding antigenic HIV type B polypeptides, polypeptides and uses thereof
DE10162480A1 (de) 2001-12-19 2003-08-07 Ingmar Hoerr Die Applikation von mRNA für den Einsatz als Therapeutikum gegen Tumorerkrankungen
US6911538B2 (en) * 2002-01-16 2005-06-28 Washington University Engineered open reading frame for p53
US7316925B2 (en) * 2002-07-16 2008-01-08 Vgx Pharmaceuticals, Inc. Codon optimized synthetic plasmids
US20040146987A1 (en) * 2002-09-16 2004-07-29 Promega Corporation Rapidly degraded reporter fusion proteins
EP1578969B1 (en) * 2002-11-08 2010-04-07 The University Of Queensland A method for optimising gene expression using synonymous codon optimisation
WO2005007808A2 (en) * 2003-05-15 2005-01-27 Chiron Corporation Hiv polynucleotides and polypeptides derived from botswana mj4
GB0325379D0 (en) * 2003-10-30 2003-12-03 Oxford Biomedica Ltd Vectors
AU2004293798B2 (en) * 2003-11-20 2008-10-23 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Improved methods of in vitro protein synthesis
US20050112551A1 (en) * 2003-11-24 2005-05-26 Agouron Pharmaceuticals, Inc. Dual assay for evaluating activity and cytotoxicity of compounds in the same population of cells
NZ551447A (en) 2004-05-18 2010-08-27 Intrexon Corp Methods for dynamic vector assembly of DNA cloning vector plasmids
EP1766002B1 (en) * 2004-06-21 2015-11-18 Novozymes A/S Stably maintained multiple copies of at least two orf in the same orientation
US7825233B2 (en) * 2004-06-30 2010-11-02 Allergan, Inc. Optimizing expression of active Botulinum Toxin type E
JP2008508886A (ja) * 2004-08-04 2008-03-27 アラーガン、インコーポレイテッド 活性ボツリヌス毒素ａ型の発現の最適化
US7728118B2 (en) * 2004-09-17 2010-06-01 Promega Corporation Synthetic nucleic acid molecule compositions and methods of preparation
US20060194214A1 (en) * 2005-02-28 2006-08-31 George Church Methods for assembly of high fidelity synthetic polynucleotides
US20070122817A1 (en) * 2005-02-28 2007-05-31 George Church Methods for assembly of high fidelity synthetic polynucleotides
AU2005295351A1 (en) * 2004-10-18 2006-04-27 Codon Devices, Inc. Methods for assembly of high fidelity synthetic polynucleotides
US7846720B2 (en) * 2005-01-26 2010-12-07 Vgx Pharmaceuticals, Inc. Optimized high yield synthetic plasmids
ES2370040T3 (es) 2005-10-07 2011-12-12 Istituto Di Ricerche Di Biologia Molecolare P. Angeletti S.R.L. Vacuna de metaloproteinasa 11 de la matriz.
CA2638897A1 (en) * 2005-10-14 2007-04-26 Arena Pharmaceuticals, Inc. Gpr22 and methods relating thereto
EP1997830A1 (en) 2007-06-01 2008-12-03 AIMM Therapeutics B.V. RSV specific binding molecules and means for producing them
PT2612868T (pt) 2007-11-01 2018-10-24 Astellas Pharma Inc Ácidos nucleicos e polipéptidos imunosupressores
US8126653B2 (en) * 2008-07-31 2012-02-28 Dna Twopointo, Inc. Synthetic nucleic acids for expression of encoded proteins
US7561973B1 (en) 2008-07-31 2009-07-14 Dna Twopointo, Inc. Methods for determining properties that affect an expression property value of polynucleotides in an expression system
US7561972B1 (en) 2008-06-06 2009-07-14 Dna Twopointo, Inc. Synthetic nucleic acids for expression of encoded proteins
US8401798B2 (en) * 2008-06-06 2013-03-19 Dna Twopointo, Inc. Systems and methods for constructing frequency lookup tables for expression systems
EP2600901B1 (en) 2010-08-06 2019-03-27 ModernaTX, Inc. A pharmaceutical formulation comprising engineered nucleic acids and medical use thereof
MX2013003681A (es) 2010-10-01 2013-11-20 Moderna Therapeutics Inc Ácidos nucleicos manipulados y métodos de uso de los mismos.
DE102010056289A1 (de) 2010-12-24 2012-06-28 Geneart Ag Verfahren zur Herstellung von Leseraster-korrekten Fragment-Bibliotheken
PT2665818T (pt) 2011-01-17 2017-07-05 Philip Morris Products Sa Expressão de proteínas em plantas
JP6073247B2 (ja) 2011-01-17 2017-02-01 フィリップ・モーリス・プロダクツ・ソシエテ・アノニム 植物で核酸を発現させるベクター
US10183069B2 (en) 2011-03-21 2019-01-22 Altimmune Inc. Rapid and prolonged immunologic-therapeutic
DE12722942T1 (de) 2011-03-31 2021-09-30 Modernatx, Inc. Freisetzung und formulierung von manipulierten nukleinsäuren
ES2752081T3 (es) 2011-06-16 2020-04-02 Univ California Complejos génicos sintéticos
US9464124B2 (en) 2011-09-12 2016-10-11 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
EP2768607B1 (en) 2011-09-26 2021-08-18 Thermo Fisher Scientific GENEART GmbH Multiwell plate for high efficiency, small volume nucleic acid synthesis
KR102014061B1 (ko) 2011-10-03 2019-08-28 모더나 세라퓨틱스, 인코포레이티드 변형된 뉴클레오사이드, 뉴클레오타이드, 및 핵산, 및 이들의 용도
RS57315B1 (sr) 2011-10-28 2018-08-31 Prothena Biosciences Ltd Humanizovana antitela koja prepoznaju alfa-sinuklein
JP2015501844A (ja) 2011-12-16 2015-01-19 モデルナ セラピューティクス インコーポレイテッドＭｏｄｅｒｎａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ． 修飾ヌクレオシド、ヌクレオチドおよび核酸組成物
KR102086061B1 (ko) 2012-01-27 2020-03-11 프로테나 바이오사이언시즈 리미티드 알파-시누클레인을 인식하는 인간화된 항체
JP2015518704A (ja) 2012-04-02 2015-07-06 モデルナ セラピューティクス インコーポレイテッドＭｏｄｅｒｎａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ． 膜タンパク質の産生のための修飾ポリヌクレオチド
US9572897B2 (en) 2012-04-02 2017-02-21 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins
US9878056B2 (en) 2012-04-02 2018-01-30 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of cosmetic proteins and peptides
US9283287B2 (en) 2012-04-02 2016-03-15 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of nuclear proteins
US20130274129A1 (en) 2012-04-04 2013-10-17 Geneart Ag Tal-effector assembly platform, customized services, kits and assays
UA118441C2 (uk) 2012-10-08 2019-01-25 Протена Біосаєнсиз Лімітед Антитіло, що розпізнає альфа-синуклеїн
US9694050B2 (en) * 2012-10-21 2017-07-04 University Of Rochester THY1 (CD90) as a novel therapy to control adipose tissue accumulation
HRP20220607T1 (hr) 2012-11-26 2022-06-24 Modernatx, Inc. Terminalno modificirana rna
MY190711A (en) 2013-02-20 2022-05-12 Novartis Ag Treatment of cancer using humanized anti-egfrviii chimeric antigen receptor
ES2814962T3 (es) 2013-02-20 2021-03-29 Novartis Ag Fijación eficaz como objetivo de la leucemia humana primaria utilizando células T modificadas con receptor de antígeno quimérico anti-CD123
SG10201707855YA (en) 2013-03-13 2017-10-30 Prothena Biosciences Ltd Tau immunotherapy
US8980864B2 (en) 2013-03-15 2015-03-17 Moderna Therapeutics, Inc. Compositions and methods of altering cholesterol levels
UY35468A (es) 2013-03-16 2014-10-31 Novartis Ag Tratamiento de cáncer utilizando un receptor quimérico de antígeno anti-cd19
US9719106B2 (en) 2013-04-29 2017-08-01 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Tissue preferential codon modified expression cassettes, vectors containing same, and uses thereof
EP3816625A1 (en) 2013-05-06 2021-05-05 Scholar Rock, Inc. Compositions and methods for growth factor modulation
US10513555B2 (en) 2013-07-04 2019-12-24 Prothena Biosciences Limited Antibody formulations and methods
US9850302B2 (en) 2013-07-12 2017-12-26 Prothena Biosciences Limited Antibodies that recognize IAPP
US9951131B2 (en) 2013-07-12 2018-04-24 Prothena Biosciences Limited Antibodies that recognize IAPP
CA2926218A1 (en) 2013-10-03 2015-04-09 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotides encoding low density lipoprotein receptor
CA2925021A1 (en) 2013-11-01 2015-05-07 Curevac Ag Modified rna with decreased immunostimulatory properties
EP3071974A2 (en) 2013-11-19 2016-09-28 Prothena Biosciences Limited Monitoring immunotherapy of lewy body disease from constipation symptoms
CN106459989B (zh) 2013-12-19 2023-02-17 诺华股份有限公司 人间皮素嵌合抗原受体及其用途
EP3116906A1 (en) 2014-03-12 2017-01-18 Prothena Biosciences Limited Anti-laminin4 antibodies specific for lg1-3
TW201623331A (zh) 2014-03-12 2016-07-01 普羅帝納生物科學公司 抗黑色素瘤細胞黏著分子（ｍｃａｍ）抗體類及使用彼等之相關方法
KR20160131073A (ko) 2014-03-12 2016-11-15 프로테나 바이오사이언시즈 리미티드 Lg4-5에 대해 특이적인 항-라미닌4 항체
WO2015136469A1 (en) 2014-03-12 2015-09-17 Prothena Biosciences Limited Anti-mcam antibodies and associated methods of use
EP3119423B1 (en) 2014-03-15 2022-12-14 Novartis AG Treatment of cancer using chimeric antigen receptor
EP3888674B1 (en) 2014-04-07 2024-04-03 Novartis AG Treatment of cancer using anti-cd19 chimeric antigen receptor
WO2015155694A1 (en) 2014-04-08 2015-10-15 Prothena Biosciences Limited Blood-brain barrier shuttles containing antibodies recognizing alpha-synuclein
JP6881813B2 (ja) 2014-04-23 2021-06-02 モデルナティーエックス， インコーポレイテッド 核酸ワクチン
EP3193915A1 (en) 2014-07-21 2017-07-26 Novartis AG Combinations of low, immune enhancing. doses of mtor inhibitors and cars
JP6831777B2 (ja) 2014-07-21 2021-02-17 ノバルティス アーゲー Ｃｄ３３キメラ抗原受容体を使用する癌の処置
BR112017002781A2 (pt) 2014-08-13 2017-12-19 Sabatino Denise cassete de expressão aprimorado para acondicionamento e expressão de variantes do fator viii para o tratamento de distúrbios de hemostasia
CN107108744B (zh) 2014-08-19 2020-09-25 诺华股份有限公司 抗cd123嵌合抗原受体(car)用于癌症治疗
US9879087B2 (en) 2014-11-12 2018-01-30 Siamab Therapeutics, Inc. Glycan-interacting compounds and methods of use
JP6951973B2 (ja) 2014-11-12 2021-10-20 シージェン インコーポレイテッド グリカン相互作用化合物及び使用方法
CN115927293A (zh) 2014-12-09 2023-04-07 生命技术公司 高效小体积核酸合成
RU2021118125A (ru) 2014-12-29 2022-04-06 Новартис Аг Способы получения экспрессирующих химерный антигенный рецептор клеток
TWI718121B (zh) 2015-01-28 2021-02-11 愛爾蘭商普羅佘納生物科技有限公司 抗甲狀腺素運送蛋白抗體
TWI769570B (zh) 2015-01-28 2022-07-01 愛爾蘭商普羅佘納生物科技有限公司 抗甲狀腺素運送蛋白抗體
TWI718122B (zh) 2015-01-28 2021-02-11 愛爾蘭商普羅佘納生物科技有限公司 抗甲狀腺素運送蛋白抗體
US20180140602A1 (en) 2015-04-07 2018-05-24 Novartis Ag Combination of chimeric antigen receptor therapy and amino pyrimidine derivatives
TWI746437B (zh) 2015-04-08 2021-11-21 瑞士商諾華公司 Ｃｄ２０療法、ｃｄ２２療法及與表現ｃｄ１９嵌合抗原受體（ｃａｒ）之細胞的組合療法
ES2948133T3 (es) 2015-04-17 2023-08-31 Novartis Ag Métodos para mejorar la eficacia y expansión de células que expresan un receptor de antígeno quimérico
CN108064176A (zh) 2015-04-22 2018-05-22 库瑞瓦格股份公司 用于治疗肿瘤疾病的含有rna的组合物
WO2016172583A1 (en) 2015-04-23 2016-10-27 Novartis Ag Treatment of cancer using chimeric antigen receptor and protein kinase a blocker
EP3294885B1 (en) 2015-05-08 2020-07-01 CureVac Real Estate GmbH Method for producing rna
PT4108769T (pt) 2015-05-29 2023-10-10 Curevac Mfg Gmbh Um método para produção e purificação de rna, compreendendendo pelo menos um passo de filtração por fluxo tangencial
WO2017011602A1 (en) 2015-07-13 2017-01-19 Pivot Bio, Inc. Methods and compositions for improving plant traits
US10829735B2 (en) 2015-07-21 2020-11-10 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods for improving the efficacy and expansion of immune cells
WO2017046774A2 (en) 2015-09-16 2017-03-23 Prothena Biosciences Limited Use of anti-mcam antibodies for treatment or prophylaxis of giant cell arteritis, polymyalgia rheumatica or takayasu's arteritis
JP2018530540A (ja) 2015-09-16 2018-10-18 プロセナ バイオサイエンシーズ リミテッド 巨細胞動脈炎、リウマチ性多発筋痛症又は高安動脈炎の処置又は予防のための抗ｍｃａｍ抗体の使用
WO2017062412A1 (en) 2015-10-05 2017-04-13 Massachusetts Institute Of Technology Nitrogen fixation using refactored nif clusters
JP7066613B2 (ja) 2015-11-12 2022-05-13 シージェン インコーポレイテッド グリカン相互作用化合物および使用方法
TWI850587B (zh) 2015-11-13 2024-08-01 日商武田藥品工業股份有限公司 用於ａ型血友病基因治療之編碼表現增加之重組ｆｖｉｉｉ變異體之病毒載體
MY190067A (en) 2015-11-13 2022-03-24 Baxalta Inc Viral vectors encoding recombinant fviii variants with increased expression for gene therapy of hemophilia a
CN108603200B (zh) 2015-11-23 2022-08-19 诺华股份有限公司 优化的慢病毒转移载体及其用途
CN109153975A (zh) 2015-12-28 2019-01-04 诺华股份有限公司 制备嵌合抗原受体表达细胞的方法
KR20180099768A (ko) 2015-12-30 2018-09-05 노파르티스 아게 증진된 효능을 갖는 면역 이펙터 세포 요법
ES2847155T3 (es) 2016-01-21 2021-08-02 Novartis Ag Moléculas multiespecíficas que fijan como objetivo CLL-1
WO2017149513A1 (en) 2016-03-03 2017-09-08 Prothena Biosciences Limited Anti-mcam antibodies and associated methods of use
WO2017153953A1 (en) 2016-03-09 2017-09-14 Prothena Biosciences Limited Use of anti-mcam antibodies for treatment or prophylaxis of granulomatous lung diseases
WO2017153955A1 (en) 2016-03-09 2017-09-14 Prothena Biosciences Limited Use of anti-mcam antibodies for treatment or prophylaxis of granulomatous lung diseases
EA201891909A1 (ru) 2016-03-11 2019-02-28 Сколар Рок, Инк. TGFβ1-СВЯЗЫВАЮЩИЕ ИММУНОГЛОБУЛИНЫ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
US11549099B2 (en) 2016-03-23 2023-01-10 Novartis Ag Cell secreted minibodies and uses thereof
KR20180134385A (ko) 2016-04-15 2018-12-18 노파르티스 아게 선택적 단백질 발현을 위한 조성물 및 방법
PL3452507T3 (pl) 2016-05-02 2023-01-09 Prothena Biosciences Limited Immunoterapia tau
SG11201809331RA (en) 2016-05-02 2018-11-29 Prothena Biosciences Ltd Antibodies recognizing tau
EP3452508A1 (en) 2016-05-02 2019-03-13 Prothena Biosciences Limited Antibodies recognizing tau
US20210322543A1 (en) * 2016-06-02 2021-10-21 Hoyu Co., Ltd. Egg allergy antigen
WO2017210617A2 (en) 2016-06-02 2017-12-07 Porter, David, L. Therapeutic regimens for chimeric antigen receptor (car)- expressing cells
WO2017208210A1 (en) 2016-06-03 2017-12-07 Prothena Biosciences Limited Anti-mcam antibodies and associated methods of use
WO2018007922A2 (en) 2016-07-02 2018-01-11 Prothena Biosciences Limited Anti-transthyretin antibodies
EP3478716A2 (en) 2016-07-02 2019-05-08 Prothena Biosciences Limited Anti-transthyretin antibodies
EP3478715A2 (en) 2016-07-02 2019-05-08 Prothena Biosciences Limited Anti-transthyretin antibodies
JP7219376B2 (ja) 2016-07-15 2023-02-08 ノバルティス アーゲー キメラ抗原受容体をキナーゼ阻害薬と併用して使用したサイトカイン放出症候群の治療及び予防
MX2019001469A (es) 2016-08-01 2019-10-02 Novartis Ag Tratamiento del cáncer usando un receptor de antígeno quimérico en combinación con un inhibidor de una molécula de macrófago pro- m2.
TWI797091B (zh) 2016-10-07 2023-04-01 瑞士商諾華公司 利用嵌合抗原受體之癌症治療
EP3541847A4 (en) 2016-11-17 2020-07-08 Seattle Genetics, Inc. COMPOUNDS INTERACTING WITH GLYCANE AND METHODS OF USE
WO2018111340A1 (en) 2016-12-16 2018-06-21 Novartis Ag Methods for determining potency and proliferative function of chimeric antigen receptor (car)-t cells
CN110382530A (zh) 2017-01-06 2019-10-25 供石公司 亚型特异性、背景许可性TGFβ1抑制剂及其用途
ES2912408T3 (es) 2017-01-26 2022-05-25 Novartis Ag Composiciones de CD28 y métodos para terapia con receptores quiméricos para antígenos
US20200048359A1 (en) 2017-02-28 2020-02-13 Novartis Ag Shp inhibitor compositions and uses for chimeric antigen receptor therapy
JP2020510671A (ja) 2017-03-03 2020-04-09 シアトル ジェネティックス， インコーポレイテッド グリカン相互作用化合物および使用の方法
WO2018201056A1 (en) 2017-04-28 2018-11-01 Novartis Ag Cells expressing a bcma-targeting chimeric antigen receptor, and combination therapy with a gamma secretase inhibitor
US11958896B2 (en) 2017-05-02 2024-04-16 Prothena Biosciences Limited Antibodies recognizing tau
KR102551733B1 (ko) 2017-05-22 2023-07-06 다케다 야쿠힌 고교 가부시키가이샤 B형 혈우병 유전자 요법을 위한 증가된 발현을 가지는 재조합 fix 변이체를 암호화하는 바이러스 벡터
EP3652535A1 (en) 2017-07-10 2020-05-20 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Identification and use of cytotoxic t lymphocyte (ctl) antigen-specific target cell killing enhancer agents
EP3658583A1 (en) 2017-07-28 2020-06-03 Scholar Rock, Inc. Ltbp complex-specific inhibitors of tgf-beta 1 and uses thereof
SG11202000840YA (en) 2017-07-31 2020-02-27 Reflection Biotechnologies Ltd Cellular models of and therapies for ocular diseases
WO2019064053A1 (en) 2017-09-28 2019-04-04 Prothena Biosciences Limited DOSAGE REGIMES FOR THE TREATMENT OF SYNUCLEINOPATHIES
AU2018355427A1 (en) 2017-10-25 2020-04-30 Novartis Ag Methods of making chimeric antigen receptor-expressing cells
KR20200088342A (ko) 2017-10-25 2020-07-22 피벗 바이오, 인크. 질소를 고정하는 유전자조작 미생물을 개선하는 방법 및 조성물
WO2019089798A1 (en) 2017-10-31 2019-05-09 Novartis Ag Anti-car compositions and methods
WO2019118518A2 (en) 2017-12-11 2019-06-20 Senti Biosciences, Inc. Inducible cell receptors for cell-based therapeutics
EP3768858A1 (en) 2018-03-19 2021-01-27 Modernatx, Inc. Assembly and error reduction of synthetic genes from oligonucleotides
GB201804701D0 (en) 2018-03-23 2018-05-09 Gammadelta Therapeutics Ltd Lymphocytes expressing heterologous targeting constructs
EP3784351A1 (en) 2018-04-27 2021-03-03 Novartis AG Car t cell therapies with enhanced efficacy
US20210396739A1 (en) 2018-05-01 2021-12-23 Novartis Ag Biomarkers for evaluating car-t cells to predict clinical outcome
US20210213063A1 (en) 2018-05-25 2021-07-15 Novartis Ag Combination therapy with chimeric antigen receptor (car) therapies
EP3802825A1 (en) 2018-06-08 2021-04-14 Intellia Therapeutics, Inc. Compositions and methods for immunooncology
MX2020013875A (es) 2018-06-27 2021-08-11 Pivot Bio Inc Composiciones agricolas que comprenden microbios remodelados de fijacion de nitrogeno.
AR116109A1 (es) 2018-07-10 2021-03-31 Novartis Ag Derivados de 3-(5-amino-1-oxoisoindolin-2-il)piperidina-2,6-diona y usos de los mismos
US11130803B2 (en) 2018-07-11 2021-09-28 Scholar Rock, Inc. Isoform-selective TGFβ1 inhibitors and use thereof
EP3820896A1 (en) 2018-07-11 2021-05-19 Scholar Rock, Inc. TGFbeta1 INHIBITORS AND USE THEREOF
CA3105988A1 (en) 2018-07-11 2020-01-16 Abhishek Datta High-affinity, isoform-selective tgf.beta.1 inhibitors and use thereof
BR112021000695A2 (pt) 2018-07-16 2021-04-20 Baxalta Incorporated métodos para tratar hemofilia a e para monitorar a eficácia da terapia gênica de fator viii de hemofilia a.
MX2021002393A (es) 2018-08-31 2021-07-15 Novartis Ag Metodos de preparacion de celulas que expresan receptores de antigenos quimericos.
WO2020047449A2 (en) 2018-08-31 2020-03-05 Novartis Ag Methods of making chimeric antigen receptor-expressing cells
US20220047633A1 (en) 2018-09-28 2022-02-17 Novartis Ag Cd22 chimeric antigen receptor (car) therapies
WO2020069409A1 (en) 2018-09-28 2020-04-02 Novartis Ag Cd19 chimeric antigen receptor (car) and cd22 car combination therapies
BR112021007765A2 (pt) 2018-10-23 2021-08-03 Scholar Rock, Inc. inibidores seletivos de rgmc e uso dos mesmos
KR20210094610A (ko) 2018-11-26 2021-07-29 포티 세븐, 인코포레이티드 c-Kit에 대한 인간화 항체
EP3897637A1 (en) 2018-12-20 2021-10-27 Novartis AG Dosing regimen and pharmaceutical combination comprising 3-(1-oxoisoindolin-2-yl)piperidine-2,6-dione derivatives
BR112021013157A8 (pt) 2019-01-03 2022-12-06 Inst Nat Sante Rech Med Usos de um inibidor de nrp-1, uso de uma combinação, uso de um anticorpo multiespecífico, método ex vivo para predizer, uso de um inibidor, anticorpo multiespecífico, população de células modificadas, método ex vivo de produção e uso de uma população de células t
TWI851647B (zh) 2019-01-16 2024-08-11 日商武田藥品工業股份有限公司 用於a型血友病基因治療之編碼表現增加之重組fviii變異體的病毒載體
MX2021009175A (es) 2019-01-30 2021-09-14 Scholar Rock Inc Inhibidores especificos del complejo de ltbp de tgf? y usos de los mismos.
CN113329792B (zh) 2019-02-15 2024-06-28 诺华股份有限公司 取代的3-(1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮衍生物及其用途
US20220144807A1 (en) 2019-02-15 2022-05-12 Novartis Ag 3-(1-oxo-5-(piperidin-4-yl)isoindolin-2-yl)piperidine-2,6-dione derivatives and uses thereof
SG11202107825WA (en) 2019-02-25 2021-09-29 Novartis Ag Mesoporous silica particles compositions for viral delivery
BR112021016947A2 (pt) 2019-03-03 2021-11-03 Prothena Biosciences Ltd Anticorpos que reconhecem tau
WO2020210678A1 (en) 2019-04-12 2020-10-15 Novartis Ag Methods of making chimeric antigen receptor-expressing cells
EP3769816A1 (en) 2019-07-25 2021-01-27 Ospedale Pediatrico Bambino Gesù Car-cd123 vector and uses thereof
CN114761037A (zh) 2019-11-26 2022-07-15 诺华股份有限公司 结合bcma和cd19的嵌合抗原受体及其用途
CN114981299A (zh) 2019-12-12 2022-08-30 武田药品工业株式会社 使用编码具有增加的表达的重组fviii变体的病毒载体的a型血友病的基因疗法
WO2021123902A1 (en) 2019-12-20 2021-06-24 Novartis Ag Combination of anti tim-3 antibody mbg453 and anti tgf-beta antibody nis793, with or without decitabine or the anti pd-1 antibody spartalizumab, for treating myelofibrosis and myelodysplastic syndrome
JP2023511255A (ja) 2020-01-11 2023-03-17 スカラー ロック インコーポレイテッド ＴＧＦ－β阻害剤及びその使用
MX2022008609A (es) 2020-01-11 2022-11-10 Scholar Rock Inc Inhibidores de tgf¿ y uso de los mismos.
WO2021163618A1 (en) 2020-02-14 2021-08-19 Novartis Ag Method of predicting response to chimeric antigen receptor therapy
EP4110376A2 (en) 2020-02-27 2023-01-04 Novartis AG Methods of making chimeric antigen receptor-expressing cells
CN115397460A (zh) 2020-02-27 2022-11-25 诺华股份有限公司 制备表达嵌合抗原受体的细胞的方法
IL298262A (en) 2020-06-23 2023-01-01 Novartis Ag A dosage regimen that includes derivatives of 3-(1-oxoisoindolin-2-yl)piperidine-2,6-dione
EP4171743A4 (en) 2020-06-24 2024-07-24 Prothena Biosciences Ltd SORTILIN-RECOGNIZING ANTIBODIES
PE20231093A1 (es) 2020-07-16 2023-07-18 Novartis Ag Anticuerpos anti-betacelulina, fragmentos de los mismos, y moleculas de union multiespecificas
JP2023536164A (ja) 2020-08-03 2023-08-23 ノバルティス アーゲー ヘテロアリール置換３－（１－オキソイソインドリン－２－イル）ピペリジン－２，６－ジオン誘導体及びその使用
WO2022029080A1 (en) 2020-08-03 2022-02-10 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Population of treg cells functionally committed to exert a regulatory activity and their use for adoptive therapy
CA3188978A1 (en) 2020-08-21 2022-02-24 Sandeep Tharian Koshy Compositions and methods for in vivo generation of car expressing cells
KR20230107617A (ko) 2020-11-13 2023-07-17 노파르티스 아게 키메라 항원 수용체(car)-발현 세포를 사용한 병용 요법
US20240175873A1 (en) 2021-03-23 2024-05-30 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Methods for the diagnosis and treatment of t cell-lymphomas
WO2022204581A2 (en) 2021-03-26 2022-09-29 Scholar Rock, Inc. Tgf-beta inhibitors and use thereof
US11795207B2 (en) 2021-03-30 2023-10-24 AAVnerGene Inc. Modified plasma clotting factor VIII and method of use thereof
CN117157316A (zh) 2021-03-30 2023-12-01 艾诺健基因治疗股份有限公司 修饰的血浆凝血因子viii及其使用方法
TW202304979A (zh) 2021-04-07 2023-02-01 瑞士商諾華公司 抗ＴＧＦβ抗體及其他治療劑用於治療增殖性疾病之用途
EP4320153A1 (en) 2021-04-09 2024-02-14 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for the treatment of anaplastic large cell lymphoma
WO2022229853A1 (en) 2021-04-27 2022-11-03 Novartis Ag Viral vector production system
WO2022256723A2 (en) 2021-06-03 2022-12-08 Scholar Rock, Inc. Tgf-beta inhibitors and therapeutic use thereof
JP2024527252A (ja) 2021-06-14 2024-07-24 武田薬品工業株式会社 発現の増加した組み換えｆｖｉｉｉバリアントをコードするウイルスベクターを用いた、血友病ａの遺伝子療法
US20240301073A1 (en) 2021-07-14 2024-09-12 Scholar Rock, Inc. LTBP COMPLEX-SPECIFIC INHIBITORS OF TGFb1 AND USES THEREOF
WO2023069790A1 (en) 2021-10-22 2023-04-27 Sana Biotechnology, Inc. Methods of engineering allogeneic t cells with a transgene in a tcr locus and associated compositions and methods
WO2023144303A1 (en) 2022-01-31 2023-08-03 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Cd38 as a biomarker and biotarget in t-cell lymphomas
WO2023156587A1 (en) 2022-02-18 2023-08-24 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Use of tcr-deficient car-tregs in combination with anti-tcr complex monoclonal antibodies for inducing durable tolerance
WO2023183313A1 (en) 2022-03-22 2023-09-28 Sana Biotechnology, Inc. Engineering cells with a transgene in b2m or ciita locus and associated compositions and methods
WO2023198648A1 (en) 2022-04-11 2023-10-19 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Methods for the diagnosis and treatment of t-cell malignancies
WO2023198874A1 (en) 2022-04-15 2023-10-19 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Methods for the diagnosis and treatment of t cell-lymphomas
TW202400658A (zh) 2022-04-26 2024-01-01 瑞士商諾華公司 靶向ｉｌ—１３和ｉｌ—１８的多特異性抗體
WO2023214325A1 (en) 2022-05-05 2023-11-09 Novartis Ag Pyrazolopyrimidine derivatives and uses thereof as tet2 inhibitors
WO2023220502A1 (en) 2022-05-12 2023-11-16 AAVnerGene Inc. Compositions and methods for recombinant parvovirus production
WO2023237663A1 (en) 2022-06-09 2023-12-14 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Use of the f359l missense irf4 variant for increasing the stability of regulatory t cells
WO2024003310A1 (en) 2022-06-30 2024-01-04 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Methods for the diagnosis and treatment of acute lymphoblastic leukemia
WO2024018003A1 (en) 2022-07-21 2024-01-25 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Extracellular vesicles functionalized with an erv syncitin and uses thereof for cargo delivery
WO2024018046A1 (en) 2022-07-22 2024-01-25 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Garp as a biomarker and biotarget in t-cell malignancies
WO2024023283A1 (en) 2022-07-29 2024-02-01 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Lrrc33 as a biomarker and biotarget in cutaneous t-cell lymphomas
WO2024047110A1 (en) 2022-08-31 2024-03-07 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Method to generate more efficient car-t cells
WO2024050450A1 (en) 2022-08-31 2024-03-07 Gigamune, Inc. Engineered enveloped vectors and methods of use thereof
WO2024052318A1 (en) 2022-09-06 2024-03-14 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Novel dual split car-t cells for the treatment of cd38-positive hematological malignancies
TW202423983A (zh) 2022-09-15 2024-06-16 瑞士商諾華公司 使用嵌合抗原受體療法的自體免疫性障礙的治療
WO2024079192A1 (en) 2022-10-12 2024-04-18 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Cd81 as a biomarker and biotarget in t-cell malignancies
WO2024089639A1 (en) 2022-10-26 2024-05-02 Novartis Ag Lentiviral formulations
WO2024187051A1 (en) 2023-03-07 2024-09-12 Scholar Rock, Inc. Tgf-beta inhibitors for use for treating resistant or unresponsive cancer in patients
WO2024209036A1 (en) 2023-04-07 2024-10-10 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Generating highly pure glutamatergic neuronal populations using the pro-neural factor ascl1
WO2024213767A1 (en) 2023-04-14 2024-10-17 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Engraftment of mesenchymal stromal cells engineered to stimulate immune infiltration in tumors

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4652639A (en) * 1982-05-06 1987-03-24 Amgen Manufacture and expression of structural genes
US5464774A (en) * 1984-03-05 1995-11-07 The Salk Institute For Biological Studies Bovine basic fibroblast growth factor
US5276268A (en) * 1986-08-23 1994-01-04 Hoechst Aktiengesellschaft Phosphinothricin-resistance gene, and its use
US5270171A (en) * 1987-03-06 1993-12-14 Boris Cercek Cancer-associated SCM-recognition factor, preparation and method of use
US5244797B1 (en) * 1988-01-13 1998-08-25 Life Technologies Inc Cloned genes encoding reverse transcriptase lacking rnase h activity
IL89567A0 (en) * 1988-03-28 1989-09-10 Univ Leland Stanford Junior Mutated hiv envelope protein
AP129A (en) * 1988-06-03 1991-04-17 Smithkline Biologicals S A Expression of retrovirus gag protein eukaryotic cells
US5082767A (en) * 1989-02-27 1992-01-21 Hatfield G Wesley Codon pair utilization
US5786464C1 (en) * 1994-09-19 2012-04-24 Gen Hospital Corp Overexpression of mammalian and viral proteins
US5795737A (en) * 1994-09-19 1998-08-18 The General Hospital Corporation High level expression of proteins
GB9504446D0 (en) * 1995-03-06 1995-04-26 Medical Res Council Improvements in or relating to gene expression
US5874304A (en) * 1996-01-18 1999-02-23 University Of Florida Research Foundation, Inc. Humanized green fluorescent protein genes and methods

Also Published As

Publication number Publication date
EP0929564A1 (en) 1999-07-21
CA2265976C (en) 2009-04-21
EP0929564B1 (en) 2008-03-19
CN1307195C (zh) 2007-03-28
CN1237977A (zh) 1999-12-08
AU4355697A (en) 1998-04-14
MX9902661A (en) 1999-12-31
MX259447B (en) 2008-08-08
CA2265976A1 (en) 1998-03-26
DK0929564T3 (da) 2008-07-14
HUP9904239A2 (hu) 2000-04-28
HUP9904239A3 (en) 2001-06-28
AU737122B2 (en) 2001-08-09
PL191300B1 (pl) 2006-04-28
KR20000048511A (ko) 2000-07-25
KR100490321B1 (ko) 2005-05-17
CZ96899A3 (cs) 1999-09-15
PL332431A1 (en) 1999-09-13
US6114148A (en) 2000-09-05
RU2233329C2 (ru) 2004-07-27
ES2304791T3 (es) 2008-10-16
ATE389666T1 (de) 2008-04-15
DE69738586T2 (de) 2009-05-07
US6114148C1 (en) 2012-05-01
DE69738586D1 (de) 2008-04-30
BR9712077A (pt) 2003-04-29
JP2001503252A (ja) 2001-03-13
TR199900624T2 (xx) 1999-07-21
WO1998012207A1 (en) 1998-03-26
EP0929564A4 (en) 2002-05-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
PL192104B1 (pl) Syntetyczny gen kodujący białko czynnika VIII, wektor ekspresji, komórka ssaka i sposób wytwarzania syntetycznego genu
US5786464A (en) Overexpression of mammalian and viral proteins
US5795737A (en) High level expression of proteins
WO1998012207A9 (en) High level expression of proteins
JP4180650B2 (ja) ｍＲＮＡの阻害／不安定領域の除去方法
MXPA99002661A (en) High level expression of proteins
KR20220113442A (ko) 입자 전달 시스템
US5994108A (en) Mutant TAR virus and transdominant tat mutants as pharmacological agents
KR19990087126A (ko) 합성 사람 면역결핍 바이러스 유전자
AU5543700A (en) Siv-based packaging-defficient vectors
Cleavinger Role of the long terminal repeat in transcriptional regulation of rous sarcoma virus gene expression

Legal Events

Date Code Title Description
LAPS Decisions on the lapse of the protection rights

Effective date: 20080918