[go: up one dir, main page]
More Web Proxy on the site http://driver.im/

PL190393B1 - Konstrukt chimerowy zawierający gen chimerowy elementarny, wektor, komórka roślinna, roślina, sposób nadawania oporności na herbicydy roślinom, sposób uzyskiwania roślin o tolerancji na wiele herbicydów oraz sposób działania herbicydem na rośliny - Google Patents

Konstrukt chimerowy zawierający gen chimerowy elementarny, wektor, komórka roślinna, roślina, sposób nadawania oporności na herbicydy roślinom, sposób uzyskiwania roślin o tolerancji na wiele herbicydów oraz sposób działania herbicydem na rośliny

Info

Publication number
PL190393B1
PL190393B1 PL97331165A PL33116597A PL190393B1 PL 190393 B1 PL190393 B1 PL 190393B1 PL 97331165 A PL97331165 A PL 97331165A PL 33116597 A PL33116597 A PL 33116597A PL 190393 B1 PL190393 B1 PL 190393B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
gene
sequence
plants
herbicide
resistance
Prior art date
Application number
PL97331165A
Other languages
English (en)
Other versions
PL331165A1 (en
Inventor
Ken Pallett
Richard Derose
Bernard Pelissier
Alain Sailland
Original Assignee
Bayer Cropscience Sa
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=9494283&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=PL190393(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Bayer Cropscience Sa filed Critical Bayer Cropscience Sa
Publication of PL331165A1 publication Critical patent/PL331165A1/xx
Publication of PL190393B1 publication Critical patent/PL190393B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N43/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds
    • A01N43/72—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds having rings with nitrogen atoms and oxygen or sulfur atoms as ring hetero atoms
    • A01N43/80—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds having rings with nitrogen atoms and oxygen or sulfur atoms as ring hetero atoms five-membered rings with one nitrogen atom and either one oxygen atom or one sulfur atom in positions 1,2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N57/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic phosphorus compounds
    • A01N57/02—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic phosphorus compounds having alternatively specified atoms bound to the phosphorus atom and not covered by a single one of groups A01N57/10, A01N57/18, A01N57/26, A01N57/34
    • A01N57/04—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic phosphorus compounds having alternatively specified atoms bound to the phosphorus atom and not covered by a single one of groups A01N57/10, A01N57/18, A01N57/26, A01N57/34 containing acyclic or cycloaliphatic radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8274—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for herbicide resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8274—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for herbicide resistance
    • C12N15/8275—Glyphosate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8274—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for herbicide resistance
    • C12N15/8277—Phosphinotricin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0069—Oxidoreductases (1.) acting on single donors with incorporation of molecular oxygen, i.e. oxygenases (1.13)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1085—Transferases (2.) transferring alkyl or aryl groups other than methyl groups (2.5)
    • C12N9/1092—3-Phosphoshikimate 1-carboxyvinyltransferase (2.5.1.19), i.e. 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Catching Or Destruction (AREA)

Abstract

1. Konstrukt chimerowy zawierajacy gen elementarny, z elementami regulatorowy- mi potrzebnymi do jego transkrypcji w roslinach i sekwencja kodujaca enzym nadajacy roslinom opornosc na herbicyd, znamienny tym, ze dodatkowo zawiera drugi gen ele- mentarny z elementami regulatorowymi potrzebnymi do jego ekspresji w roslinach i se- kwencja kodujaca enzym nadajacy roslinom opornosc na herbicyd, przy czym jedna z sekwencji kodujacych tego konstruktu koduje hydroksyfenylodioksygenaze pirogronia nowa (HPPD). Urzad Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest tez komórka roślinna, która zawiera dwa elementarne geny chimerowe, z których każdy zawiera sekwencję kodującą enzym nadający roślinom oporność na herbicyd, i z których jeden jest genem kodującym inhibitor hydroksyfenylodioksygenazy pirogronianowej, a korzystnie zawiera przynajmniej jeden konstrukt chimerowy według wynalazku. Dwa geny chimerowe mogą być niesione przez ten sam wektor, lub każdy może być w innym wektorze, lub mogą być także wprowadzane jako takie przez wprowadzenie do komórki za pomocą sposobów fizycznych lub fizykochemicznych, na przykład przez mikroiniekcję, elektroporację lub bombardowanie, według znanych metod.
Regeneracja komórki roślinnej według wynalazku jest uzyskiwana za pomocą dowolnego stosownego procesu, który zalezy od natury gatunku, jak na przykład opisano w powyższych zgłoszeniach.
Przedmiotem wynalazku jest dalej roślina zawierająca komórkę roślinną według wynalazku. Roślina taka toleruje przynajmniej dwa herbicydy, z których jeden jest inhibitorrem HPPD Ta roślina może być uzyskana albo przez krzyzowanie przynajmniej dwóch roślin, z których każda zawiera gen oporności na herbicyd lub przez regenerację komórki według wynalazku, takiej jak opisano powyżej. Rośliny mogą być jednoliścienne lub dwuliścienne, a w szczególności mogą to być rośliny hodowlane, jak na przykład, ale nie wyłącznie, tytoń, bawełna, rzepak, soja, burak jako dwuliścienne i kukurydza i rośliny zbozowe jako jednohscienne, iub rośliny hodowianc ogrodnicze iub Kwiaiuwc.
Rośliny według wynalazku mogą tez być otrzymane za pomocą krzyżówek roślin rodzicielskich, z których każda niesie opisane geny oporności na herbicydy
Przedmiotem wynalazku jest również sposób uzyskiwania roślin o tolerancji na wiele herbicydów, w którym:
- w pierwszym etapie wpro wadza się do poszczególnych komórek odpo wiednio jeden z genów elemektarkych, z których każdy zawiera elementy regulatorowe potrzebne do jego
190 393 transkrypcji w roślinach i sekwencję kodującą, która koduje enzym nadający roślinom oporność na herbicyd i
- następnie rośliny krzyżuje się, aby uzyskać rośliny o wielorakiej oporności.
Wprowadzanie do poszczególnych komórek można prowadzić w dowolny odpowiedni znany sposób, szeroko opisany w literaturze specjalistycznej i w szczególności w cytowanych w niniejszym zgłoszeniu zgłoszeniach patentowych.
Seria metod składa się z bombardowania komórek lub protoplastów za pomocą cząsteczek, do których są doczepione sekwencje DNA. Według wynalazku te DNA mogą być niesione przez te same cząsteczki lub przez inne bombardowania. Inna seria metod polega na stosowaniu jako sposobu przenoszenia genu chimerowego wstawionego do plazmidu Ti Agrobacterium tumefaciens lub Ri Agrobacterium rhizogenes.
Mogą być stosowane inne metody, takie jak mikroiniekcja lub elektroporacja.
Specjalista wybierze metodę odpowiednią w zalezności od charakteru rośliny, w szczególności jednoliściennej lub dwuliściennej.
Regeneracja roślin z komórek transformowanych jest uzyskiwana za pomocą dowolnego stosownego procesu, który zalezy od natury gatunku, jak na przykład opisano w powyższych zgłoszeniach. Rośliny według wynalazku mogą tez być otrzymane za pomocą krzyzówek roślin rodzicielskich, z których każdy niesie opisane geny oporności na herbicydy.
Zaobserwowano, ze rośliny uzyskane sposobem według wynalazku wykazują znaczącą oporność na inhibitory dioksygenazy fenylopirogronianowej, takie jak pewne nowe herbicydy, takie jak izoksazole opisane w szczególności we francuskich zgłoszeniach patentowych 9506800 i 95 13570 i w szczególności na 4-[4-CF3-2(metylosulfonylo)benzoilo)-5-cyklopropylojizoksazol, lub „izoksaflutol”, wybiórczy herbicyd kukurydzy, diketonitryle takie jak opisane w zgłoszeniach europejskich 0 496 630, 0 496 63i i w szczególności 2-cyjano-3-cyklopropylo-i-(2-SO2CH3-4-CH3-fenylo)propmio-i,3-dion i 2-cyjano-3-cyklo-propylo-i-(2-SO2CH^^4-2,3 Cl2-fenylo)propano-i,3-dion, triketony opisane w europejskich zgłoszeniach 0 625 505 i 0 625 508, w szczególności sulkotrion i pirazinolany. Te same rośliny według wynalazku przedstawiają znaczącą oporność na inne herbicydy, takie jak na przykład dihalogenobenzonitryle, w szczególności bromoksynil i joksynil, glifozat i jego analogi, glufozynat.
Przedmiotem wynalazku jest tez sposób działania herbicydem na rośliny według wynalazku, w którym stosuje się przy najmniej dwa herbicydy, korzystniej trzy herbicydy.
W korzystnym wykonaniu sposobu według wynalazku jeden z herbicydów jest inhibitorem HPPD, korzystniej jest izoksaflutolem, jeszcze korzystniej sulkotrionem
W innym korzystnym wykonaniu sposobu według wynalazku herbicydy stosuje się równocześnie, korzystniej w postaci jednej kompozycji gotowej do użycia jeszcze korzystniej w postaci mieszaniny przygotowanej przed użyciem.
W następnym korzystnym wykonaniu sposobu według wynalazku drugi herbicyd należy do rodziny dihydrogenohydroksybenzonitryli, korzystnie herbicyd jest wybrany z grupy zawierającej bromoksynil i joksynil.
W kolejnym wykonaniu sposobu według wynalazku drugi herbicyd jest inhibitorem EPSPS, korzystniej inhibitorem EPSPS jest glifozat lub sulfozat
Odchwaszczanie roślin, w szczególności hodowli, za pomocą herbicydu tego typu, polega na tym, ze stosuje się ten herbicyd na rośliny według wynalazku, albo przed wysianiem, przed kiełkowaniem lub po kiełkowaniu hodowli. Przez herbicydy w znaczeniu niniejszego wynalazku rozumie się aktywną substancję herbicydu samą lub połączoną z dodatkiem, który modyfikuje jego skuteczność jak na przykład czynnik wzmagający aktywność (synergistyczny) lub ograniczający aktywność (w jęz. angielskim „safener,, - „zabezpieczasz”).
w ιονιν oiuowYuiiiu pu utył j w j δοδυ ιινι υιvw sposób z substancjami pomocniczymi formuł stosowanymi zwyczajowo w agrochemii.
Różne aspekty wynalazku będą lepiej zrozumiałe na podstawie ponizszych przykładów doświadczalnych.
190 393
Przykład 1. Izolacja genu HPPD P. fluorescens A32
Na podstawie sekwencji aminokwasów HPPS Pseudomonas sp. P.J. 874 (opublikowanej przez Ruetschi U i wsp. Eur. J Biochem 205- 459 - 466) wydedukowano sekwencję różnych oligonukleotydów do amplifikacji za pomocą PCR części sekwencji kodującej HPPD P fluorescens A32 (wyizolowany przez Mc Kellar E.C. 1982 J. Appl. Bacteriol. 53'305-316). Fragment amplifikacji tej HPPD zastosowano jako sondę do przeszukania częściowego genomowego banku P. fluorescens A32 i izolacji genu kodującego ten enzym.
A) Przygotowanie genomowego DNA P. fluorescens A32
Bakterie hodowano na pożywce minimalnej M63 (KH2PO4 13,6 g/1, (NH^SCU 2g/1, MgSO4 2g/1, FeSO4 0,05 μ l pH 7 plus 10 mM L-tyrozyna jako jedyne źródło węgla w 28°C przez 48 godzin.
Po przepłukaniu komórki zawieszono w 1 ml buforu do lizy (100 mM Tris HCl pH 8,3, 1,4 M NaCl, 10 mM etEDTA) i inkubowano 10 minut w 65°C. Po traktowaniu fenolem/chloroformem (24/1) i chloroformem, kwasy nukleinowe strącono przez dodanie jednej objętości izopropanolu i następnie zawieszono w 300 pl jałowej wody i trawiono RNAzą 10 pg/ml (stężenie końcowe). DNA następnie ponownie traktowano fenolem/ chlorofor mem, chloroformem i ponownie strącono przez dodanie 1/10 objętości 3 M octanu sodu pH5 i 2 objętości etanolu. DNA następnie zawieszono w jałowej wodzie i rozporcjowano.
B) Wybór oligonukleotydów i syntezy
Na podstawie sekwencji aminokwasów HPPD Pseudomonas sp P.J. 874 wybrano pięć oligonukleotydów, dwa skierowane w kierunku N-końca białka do C-końca białka i trzy skierowane w przeciwną stronę (p. figura 1). Wybór był dyktowany przez dwie następujące reguły:
- stabilny 3' kornec oligonukleotydu. tzn. przynajmniej dwie zasady bez mejednoznaconości, - jak kajkiższa degeneracja.
Wybrane ol'gonuklnotydy mają następujące sekwencje:
P1:5' A(C/T)GA(G/A)AA(C/T)CCIATGGG3'
P2:5 'GA(G/A)ACIGGICCIATGGA3'
P3:5'AA(C/T)TGCATIA(G/A)(G/A) AA (C/T) TC (C/T) TC3'
P4:5 ’AAIGCIAC(G/A)TG(C/T)TG(T/G/A)ATICC3'
P5:5'GC(C/T)TT(A/G)AA(A7G)TTICC(C/T)TCICC3'
Zostały one zsontetozowane na sontntoznrzn „Cyclone plus DNA Sznthnsizer” firmy Millipore
Fragmenty uzyskane po amplifikacj' PGR z tymi pięcioma oligonudlnotodami, które teoretycznie powinno się otrzymać zgodnie z SEK NR ID 1, mają następujące wielkości:
z primerami P1 i P3- około 690 bp z primerami PI i P4- około 720 bp z primerami PI i P5- około 1000 bp z primerami P2 i P3- około 390 bp z primerami P2 i P4- około 420 bp z primerami P2 ' P5- około 700 bp
C) Amplifikacj a części kodującej HPPD P. fluorescens A32
Amplifikacje przeprowadzono na aparacie do PCR Perkin Elmer 9600 z polimerazą Taq Perkin Elmer, z jej buforem, w warunkach standardowych, to znaczy na 50 pl reakcji stosowano 200 pM dNTP, 20 pM primerów, 2,5 jednostek polimerazy Taq i 2,5 pg DNA P. fluorescens A32.
Stosowany program amplifikacji· 5 min w 95°C plus 35 cykli <45 sek 95°C, 45 sek 49°C. 1 min 72°C> a następnie 5 min w 72°C
W tych warunkach wszystkie fragmenty amplifikacji, które uzyskano, miały wielkość zgodną z powyżej podanymi wielkościami teoretycznymi, co jest dobrą wskazówką specyficzności amplifikacji.
Fragmenty amplifikacji uzyskane z parami primerów P1/P4, P1/P5 i P2/P4 liguje się z pBSII SK(-) po strawieniu tego plazmidu EcoRY i poddaniu działaniu terminalnej transferazy w obecności ddTTP jak opisał Holton T.A. i Graham M.W. 1991 NAR tom 19 nr 5 str. 1156.
190 393
Jeden klon każdego z tych trzech rodzajów został częściowo sekwencjonowany, co pozwoliło na potwierdzenie, ze w istocie /amplifikowano w tych trzech przypadkach część regionu kodującego HPPD P. fluorescens A32. Fragment P1/P4 zatrzymano jako sondę do przeszukania częściowego banku genomowego P. fluorescens A32 i izolacji całego genu HPPD
D) Izolacja genu
Za pomocą Southema wykazano, ze fragment 7 kb po trawieniu DNA P. fluorescens A32 enzymem restrykcyjnym BamHI hybrydyzuje z sondą HPPD P1/P4. Strawiono więc 400 pg DNA P. fluorescens A32 enzymem restrykcyjnym BamHI i oczyszczono na żelu agarozowym fragmenty DNA o wielkości około 7 kb.
Fragmenty te zligowano z pBSII SK(-) strawionym BamHI i defosforylowanym przez działanie fosfatazą alkaliczną. Po transformacji do E coli DHlOb, częściowy bank genomowy przeszukano sondą HPPD P1/P4.
Wyizolowano jeden dodatni klon i nazwano go pRP A. Na figurze 2 podano jego uproszczoną mapę. Na mapie wskazana jest pozycja części kodującej genu HPPD. Jest ona złozona z l077 nukleotydów, które kodują 358 aminokwasów (p. SEK NR ID 1) HPPD P fluorescens A32 uzyskano dobrą homologię amino kwasów z sekwencją Pseudomonas sp. szczep P.J. 874 i faktycznie między tymi białkami jest 92% identyczności (p. figura 3)
Przykład 2. Konstrukcja dwóch genów chimerowych z sekwencją HPPD
Aby nadać roślinom oporność na herbicydy hamujące HPPD skonstruowano dwa geny chimerowe:
Pierwszy polega na umieszczeniu części kodującej genu HPPD P. fluorescens A32 pod kontrolą podwójnego promotora histonu (europejskie zgłoszenie patentowe Nr 0 507 698), po którym następuje enhancer translacji wirusa „etch” tytoniu (TEV) (pRTL-GUS (Carrington i Freed, 1990; J. Virol. 62: 1590-1597)) z terminatorem genu syntazy nopaliny. Wówczas HPPD będzie zlokalizowana w cytoplazmie.
Drugi jest identyczny z pierwszym z tym, ze między aktywatorem translacji TEV i częścią kodującą HPPD wprowadza się zoptymalizowany peptyd sygnałowy (OTP) (europejskie zgłoszenie patentowe nr 0 508 909). HPPD będzie wówczas zlokalizowana w chloroplaście
A). Konstrukcja wektora pRPA-RD-153
- pRPA-RD-11. Pochodną pBS-II-SK(-) (katalog Stratagene #212206) zawierająca miejsce poliadenylacji syntazy nopaliny (NOS poliA) (europejskie zgłoszenie patentowe nr 0 652 286) sklonowano między miejscami KpnI i Sali. Miejsce KpnI przekształcono w miejsce Notl przez działanie polimerazą DNA T4 w obecności 150 μΜ deoksynukleotydotrifosforanów i następnie ligację z linkerem Notl (katalog Stratagene #1029). W ten sposób otrzymano kasetę do klonowania NOS poliA.
- pRPA-RD-127: pochodna pRPA-BL-466 (europejskie zgłoszenie patentowe nr 0337 899) sklonowana w pRPA-RD-11 tworząc kasetę ekspresyjną genu oxy i zawierająca promotor małej podjednostki rybulozo bis karboksylazy:
„promotor (SSU)-gen oxy-poliA NOS”
Aby wytworzyć ten plazmid pRPA-BL-488 strawiono Xbal i HindIII aby wyizolować fragment 1,9 kb zawierający promotor SSU i gen oxy, który zligowano z plazmidem pRPA-RD-11 strawionym odpowiednimi enzymami.
- pRPA-RD-132: Jest to pochodna pRPA-BL-488 (europejskie zgłoszenie patentowe EP nr 0 507 698) sklonowana w pRPA-RD-127, ze wytworzeniem kasety ekspresyjnej genu oxy z podwójnym promotorem histonu· „podwójny promotor histonu - gen oxy - poliA NOS”
Aby wytworzyć ten plazmid pRPA-BL-466 strawiono HindIII, poddano działaniu Klenowa a następnie ponownie strawiono Notl Oczyszczony fragment 1,35 kb zawierający podwójny promotor histonu zligowano z plazmidem pRPA-RD-127, który strawiono Xbal, poddano działaniu Klenowa i ponownie trawiono Ncol -pRPA-RD-153: Jest to pochodna pRPA-RD-132 zawierająca aktywator translacji wirusa „etch” tytoniu (TEV). pRTL-GUS (Carrington i Freed, 1990: J. Virol. 64: 1590-1597) strawiono Ncol i EcoRI i fragment 150 bp zligowano z pRPA-RD-132 strawionym tymi samymi enzymami. Tak więc wytworzono kasetę ekspresyjną zawierającą promotor:
„podwójny promotor histonu - TEV-gen oxy - poliA NOS”
190 393
B) Konstrukcja wektora pRPA-RA-1 S5
PUC19/GECA. Pochodna pUC19 (katalog Gibco #15364-011) zawierająca wiele miejsc klonowania pUC 19 strawiono EcoRI i zligowano z linkerem oligonukleotydowym 1 ·
Lmker 1:AATTGGGCCA GTCAGGCCGT TTAAACCCTA GGGGGCCCG CCCGGT CAGTCCGGCA AATTTGGGAT CCCCCGGGC TTAA
Wybrany klon zawiera miejsce EcoRI, po którym następują następujące miejsca' EcoRI, Apal, AvrII, Pmel, Sfil, SacI, KpnI, Smal, BamHI, Xbal, Sali, Pstl, Sphl i Hindin. pRPA-RD-185 jest to pochodna pUC19/GECA zawierająca zmodyfikowany polilinker. pUC19/GECA strawiono HindIII zligowano z linkerem oligonukleotydowym 2:
Linker 2: AGCTTTTAAT TAAGGCGCGC CTTCGAGCCT GGTTCAGGG AAATTA ATTCCGCGCG GAAGCTCGGA CCAAGTCCC TCGA
Wybrany klon zawiera miejsce HindIII w środku polilinkera który obecnie zawiera następujące miejsca:: EcoRI, Apal, Avril, Pmel, Sfil, SacI, KpnI, Smal, BamHI, Xbal, Sali, Pstl, Sphl, HindIII, PacI, Ascl, Xhol i EcoNI.
c) Konstrukcja wektora pRP T
- pRP O: pochodna pRPA-RD-153 zawierająca kasetę ekspresyjną HPPD, promotor podwójny histon - TEV - gen HPPD - terminator NOS. Dla wytworzenia pRP O, pRPA-RD153 trawiono HindIII, poddano działaniu polimerazy Klenowa a następnie ponownie trawiono Ncol aby usunąć gen oxy i zastąpić go genem HPPD pochodzącym od plazmidu pRP A za pomocą trawienia BstEI, działanie Klenowem i ponowne trawienie Ncol.
- p RP R: aby otrzymać plazmid p RP O strawiono PvuII i SacI, oczyszczono gen chimerowy i następnie zligowano z pRPA-RD -185 strawionym PvuII i SacI.
- pRP T. uzyskano przez ligację genu chimerowego pochodzącego od pRP R po trawieniu SacI i HindIII w plazmidzie pRPA BL 150 alfa 2 strawionym tymi samymi enzymami (europejskie zgłoszenie EP Nr 0 508 909).
Gen chimerowy wektora pRPT ma więc następującą budowę
Podwójny promotor histonu TEV region kodujący HPPD terminator nos
D) Konstrukcja wektora pRP V
- pRP P: jest to pochodna pRPA-RD-7 (europejskie zgłoszenie Nr 0 632 286) zawierająca zoptymalizowany peptyd sygnałowy a następnie gen HPPD. Został uzyskany przez ligację części kodującej HPPS uzyskanej z pRP A przez trawienie BstEII i Ncol, działanie Klenowem i plazmidu pRPA-RD-7 trawionego Sphl i Ac-cl i poddanego działaniu polimerazy DNAT4
- pRP Q: pochodna pRPA-RD-153 zawierająca kasetę ekspresyjną HPPD, podwójny promotor histonu - TEV - OTP - gen HPPD - teminator Nos. Aby go skonstruować strawiono plazmid pRPA-RD-153 Sali, działania Klenowem a następnie ponownie trawiono Ncol aby usunąć gen oxy i zastąpić go genem HPPD otrzymanym z plazmidu p RP D za pomocą trawienia BstEII, działania Klenowem i następnie trawieniu Ncol.
- pRP S: aby go uzyskać strawiono plazmid pRP Q PvuII i SacI aby wyciąć gen chimerowy, który zligowano z pRPA-RD-185 strawionym PvuII i SacI.
- pRP V: uzyskano go poprzez ligację genu chimerowego pochodzącego z pRP S potrawimiu SacI i Hindlll w plazmidzie pRPA BL 150 alpha 2 (zgłoszenie europejskie EP nr 0508 909).
Gen ch imerowv wektora nRP (W ma wr imtminara hiiHnwp m i --- -t-----xr ij-ft----c
Podwójny promotor histonu TEV OTP region kodujący HPPD terminator nos
Przykład 3. Transformacja tytoniu przemysłowego PBD6.
Aby ocenić skuteczność tych dwóch genów chimerowych, zostały one wtransformowane do tytoniu przemysłowego PBD6 według procedur transformacji i regeneracji juz opisanych w europejskim zgłoszeniu EP nr 0 508 909.
Wektor wprowadzano do nieonkogennego szczepu Agrobacterium EHA 101 (Hood i wsp 1987) niosącego cosmid pTVK 291 (Komari i wsp., 1996). Technika transformacji jest oparta na procedurze Horsch R. i wsp (1985) Science 227, 1229-1331.
2) Regeneracja
Regenerację tytoniu PBD6 (pochodzącego od SEITA France) wychodząc z eksplantatów liściowych prowadzono na pożywce według Murashige i Skoog (MS) zawierającej 30 g/l sacharozy jak i 100 ng/ml kanamycyny. Eksplantaty liściowe pobierano z roślin w szklarni lub in vitro i transformowano techniką krążków liści (Science 1985, tom 227, str. 1229-1231) w trzech kolejnych etapach, pierwszy obejmuje indukowanie kiełkowania na pożywce MS z dodatkiem 30 g/l sacharozy zawierającej 0,05 mg/l kwasu naftylooctowego (ANA) i 2 mg/ml benzylaminopuryny (BAP) przez 15 dni. Kiełki wytworzone w tym etapie następnie rozwijano przez hodowlę na pożywce MS zawierającej 30 g/l sacharozy, ale nie zawierającej hormonu przez 10 dni. Następnie pobrano kiełki i hodowano je na pożywce ukorzeniającej MS zawierającej połowę soli, witamin i cukrów i niezawierającej hormonu Po około 15 dniach ukorzeniane kiełki umieszczano w glebie. Uzyskane rośliny nazywano Co17.
Po wyjściu z in vitro transformowane roślinki tytoniu aklimatyzowano do szklarni (60% względnej wilgotności, temperatura 20°C w nocy i 23°C w dzień) podczas pięciu tygodni a następnie traktowano 4-[4-CF3-2-(metylosulfonylo)benzoilo)-5-cyklopropylo izoksazolem.
Tytoń kontrolny nietransformowany i traktowany 4-j4-CF3-2-(metvlosulfonylo)benzoilo)-5-cyklopropylo izoksazolem w dawkach od 50 do 400 g/ha rozwija po około 72 godzinach chlorozy, które się nasilają i po około tygodniu przechodzą w bardzo wyraźne nekrozy (pokrywające około 80% końcowych liści).
Po transformacji tego samego tytoniu, który nadeksprymuje HPPD P. fluorescens jest bardzo dobrze chroniony przed działaniem 4-[4-CF3-2-(metylosulfonylo)benzoilo)-5-cyklopropylo izoksazolu w dawce 400 g/ha.
Jeśli enzym jest nadeksprymowany w chloroplaście to znaczy jeśli transformacja została przeprowadzona za pomocą genu niesionego przez wektor pRP V roślina jest idealnie chroniona i nie wykazuje żadnych objawów.
Przykład 4. Transformacja tytoniu przemysłowego PBD6 genem EPSPS dla -> konstruktu 173.
Izolacja cDNA kodującego EPSPS kukurydzy:
Różne etapy, które prowadziły do uzyskania cDNA EPSPS kukurydzy, który służył jako substrat do wprowadzenia dwóch mutacji są opisane poniżej. Wszystkie czynności opisane poniżej podane są jako przykłady i odpowiadają wyborowi dokonanemu między różnymi dostępnymi metodami aby uzyskać ten sam cel. Ten wybór nie ma żadnego wpływu na jakość wyniku i w konsekwencji każda odpowiednia metoda będzie mogła być stosowana przez specjalistę aby uzyskać ten sam wynik. Większość metod inżynierii fragmentów DNA jest opisana w „Current Protocols in Molecular Biology” tomy 1 i 2. Ausubel F M. i wsp., publikowane przez Greene Publishing Associates i Wiley Interscience (1989) (Dalej odnośniki do protokołów opisanych w tym dziele będą oznaczane „odnośnik CPMB”). Operacje dotyczące DNA, które były przeprowadzone według protokołów opisanych w tym dziele są w szczególności następujące: ligacja fragmentów DNA, działanie na DNA polimerazą Klenowa i polimerazą DNA T4, przygotowanie DNA plazmidów i bakteriofaga X albo jako minipreparaty lub maksipreparaty, analizy DNA i RNA odpowiednio według technik Southema i Northerna. Inne metody opisane w tej pracy były tez stosowane i poniżej podano tylko znaczące modyfikacje lub dodatki do tych protokołów.
A1. Uzyskanie fragmentu EPSPS Arabidopsis thaliana
a) dwa oligomery 20-nukieotydowe o następujących sekwencjach:
'-GCTCTGCTCATGTCTGCTCC-3' '-GCCCGCCCTTGACAAAGAAA-3' zostały zsyntetyzowane na podstawie sekwencji genu EPSPS Arabidopsis thaliana (Klee H J. i wsp. (1987) Mol. Gen. Genet. 210,437-442). Te dwa oligonukleotydy są odpowiednio w pozycjach 1523 do 1543 i 1737 do 1717 opublikowanej sekwencji w orientacji zbieznej.
b) Całkowity DNA Arabidopsis thaliana (odmiana Columbia) uzyskana od Clontech (odnośnik katalog: 6970-1).
190 393
Mieszano 50 nanogramów (ng) DNA z 300 ng każdego z oligonukleotydów i poddano 35 cyklom amplifikacji aparatem Perkin- Elmer 9600, w warunkach środowiska standarowych dla amplifikacji specyflkowanych przez dostawcę. Powstały fragment 204 bp stanowi fragment EPSPS Arabidopsis thaliana.
2. Konstrukcja biblioteki cDNA z linii komórkowej kukurydzy BMS.
a) Rozdrobniono 5 g filtrowanych komórek w ciekłym azocie i wyekstrahowano całkowite kwasy nukleinowe metodą opisaną przez Shure i wsp. z następującymi modyfikacjami:
- pH buforu do lizy doprowadzono do pH 9,0;
- po strąceniu izopropanolem osad zawieszono w wodzie i po rozpuszczeniu doprowadzono do 2,5 M LiCl. Po inkubacji przez 12 godz w °C, ponownie rozpuszczono osad z wirowania przy 15 minut w 30000 g w 4°C. Powtórzono etap strącania LiCl. Ponow nierozpuszczony osad stanowi frakcję RNA całkowitych kwasów nukleinowych.
b) Frakcję RNA polyA+ frakcji RNA uzyskiwano za pomocą chromatografu na kolumnie z oligo-dT celulozy takiej jak opisano w „Current Protocols in Molecular Biology”.
c) Synteza cDNA dwuniciowego z syntetycznym EcoRI jest przeprowadzana według protokołu dostarczonego przez producenta różnych odczynników potrzebnych do tej syntezy w formie ze stawu „copy kit” firmy In Vitrogen.
Dwa oligonukleotydy jednoniciowe częściowo komplementarne o następujących sekwencjach:
'-AATTCCCCiCGm'
5'-CCCGGG-3' (drugi oligonukleotyd jest ufosforylowany) ligowano z dwuniciowymi cDNA o tępych końcach.
Ta ligacja adapterów daje powstanie miejsc Smal połączonych z dwuniciowym cDNA i EcoRI w formie lepkich końców na każdym końcu cDNA dwuniciowego cDNA.
d) Stworzenie biblioteki cDNA mające na swoich końcach syntetyczne lepkie końce EcoRI ligowano z DNA bakteriofaga XgtlO strawionego EcoRI i defosforylowanego według protokołu dostawcy New England Biolabs. Próbkę reakcji ligacji poddano pakowaniu in vitro za pomocą ekstraktów do pakowania Gigapack Gold według instrukcji dostawcy, bibliotekę tę mianowano stosując bakterię E coli C600hft, w ten sposób otrzymaną bibliotekę /amplifikowano i przechowywano według instrukcji tego samego dostawcy i stanowi ona bibliotekę cDNA zawiesiny komórkowej kukurydzy BMS.
3. Przeszukiwanie biblioteki cDNA zawiesiny komórkowej kukurydzy BMS za pomocą sondy EPSPS Arabidopsis thaliana.
Stosowany protokół jest według „Current Protocols in Molecular Biology” tomy 1 i 2. Ausubel F.M. i wsp., publikowane przez Greene Publishing Associates i S (1989) (CPMB) Po krotce około 1(0’ zrekombinowanych fagów wysiewano na płytkę LB ze średnią gęstością 100 fagów/cm2. Łysinki replikowano w powtórzeniach na membranę Hybond N firmy Amersham.
h) DNA związano z filtrami przez działanie UV 1600 kJ (Stratalinker firmy Stratagene). Filtry prehybrydyzowano w 6xSSC/0,1%SDS/0,25 odtłuszczone mleko podczas 2 godz w 65°C. Sondę EPSPS Arabidopsis thaliana wyznakowano ^P-dCTP za pomocą „losowych primerów” według instrukcji dostawcy (Kit Ready to Go firmy Pharmacia). Uzyskiwano aktywność specyficzną rzędu 108 cpm na pg fragmentu. Po denaturacji przez 5 min w 100°C sondę dodawano do mieszaniny do prehybrydyzacji i hybrydyzację prowadzono przez 14 godzin w 55°C. Filtry poddano fiuorografii 48 godzin w 80°C za pomocą filmu Kodak XAR5 i ekranów wzmacniających Hyperscreen RPN firmy Amersham Umiejscowienie dodatnich plam na filtrze z płytek, z których pochodzą pozwala na pobranie na płytce obszarów odpowiadających fagom dającym dodatnią odpowiedź hybrydyzacji z sondą EPSPS Arabidopsis thaliana. Te etapy wysiewania, transferu, hybrydyzacji, odzyskiwania powtarzano aż wszystkie łysinki płytki kolejno oczyszczonych fagów okazały się dodatnie w 100% przy hybrydyzacji. Wówczas pobrano łysinkę pochodzącą od niezależnego faga do roztworu rozcieńczającego X, (Tris-Cl pH 7,5; 10 mM MgSO^; 0,1 M NaCl; żelatyna 0,1%) te fagi w roztworze stanowią pozytywne klony dla EPSP zawiesiny komórkowej kukurydzy BMS.
190 393
Przygotowano i analiza DNA klonów nPwPS sawiczmy komórkowej kayurodzy BMS , ,
Dodano około 5.108 fagów do 20 ml bakterii CóOOhfl o OD 2 600 nm/ml i in0ubowano 15 minut 37°C. Tę zawiysrkę następnie rozcieńczano w 200 ml pożywki do hodowli bakterii w kolbie Erlekmeoyra 11 i wytrząsano w wytrząsarce rotacyjnej przy 250 obr/min Lizę stwierdzano za pomocą rozjaśnienia pożywki, co odpowiada lizie mętnych bakterii i zachodzi po około 4 godzin wytrząsania. Ten sudyrkatakt następnie traktowano tak jak opisano w „Current Protocols in Molecular Biology”. DNA otrzymany odpowiada klonom EPSP zawiesiny komórkowej kukurydzy BMS.
Jeden do dwóch fig tego DNA trawiono EcoRI i rozdziylako w żelu 0,8% agamz^^ym LGTA/TBE (odnośnik CPMB). Ostatnie sprawdzenie polega na określeniu czy oczyszczony DNA rzeczywiście daje sygnał przy hybrydyzacji z sondą EPSPS Arabidopsis thaliana. Po elektroforezie fragmenty DNA przenoszone są na membranę 1 Ubond N firmy Amersham według protokołu Smithema opisanego w „Current Protocols in Molecular Biologo”. Filtr poddawano hybrydyzacji sondą EPSPS Arabidopsis thaliana według warunków opisanych w akapicie 3 powyżej. Klon prezentujący sygnał hybrydyzacji z sondą EPSPS Arabidopsis thaliana i zawierający najdłuzszy fragment EcoRI miał wielkość ocenia nąna żelu na około 1,7 kb. 5.
5. Otrzymanie klonu pRPA-ML-711
Dziesięć 10 fig DNA klonu fagowego zawierającego wstawkę 1,7 kb trawiono za pomocą EcoRI i rozdzielono w żelu z 0,8% agarozy LGTA/TBE (odnośnik CPMB). Fragment żelu zawierąjąco wstawkę 1,7 kb wycinano z żelu za pomocą barwienia BET i fragment poddano działaniu p-agarazy według protokołu dostawcy New a Biolabs. Oczyszczony DNA fragmentu 1,7 kb zligowako w 12°C przez 14 godzin z DNA plazmidu pUC 19 (New England Biolabs) strawionego EcoRI za pomocą protokołu ligacji opisanych w „Currokt Protocols m Molecular Biologo”. Dwa fil mieszakika powyższej mieszakiko ligacojnej zastosowano do transformacji próbki ylyetroeompetontnoj E coli DH10B9; transformację przeprowadzono się za pomocą elektroporacji stosując następujące warunki: mieszakikę bakterii kompetentnych i buforu do ligacji wprowadzono do kuwety do elyktroporacji o grubości 0,2 cm (Biorad) uprzednio schłodzonej do 0°C. Warunki fizyczne elektroporacji stosującej elektroporator firmy Biorad to 2500 Voltów, 25 (^Faradów i 200 £2. W tych warunkach średni czas rozładowania kondensatora jest rzędu 4,2 milisekund. Bakterie następnie zawieszano w 1 ml SOC (odnośnik CPMB) i mieszane przez 1 godz w 200 obr/min na wytrząsarce rotacyjnej w 15 ml probówkach Corning. Po wysianiu na pożywkę LB agar uzupełnioną 100 pg/ml karbekicylino, mini-preparaty klonów bakteryjnych, które przez noc rosły w 37°C przeprowadzano według protokołu opisanego w „Current Protocols in Molocular Biology”. Po trawieniu DNA EcoRI i rozdziale w 0,8% żalu agarozowym LGTA/TBE (odnośnik CPMB) zachowano Ο/ί?. mające wstawkę 1,7 kb. Ostatnia weryfikacja polegała na ustaleniu, ze oczyszczony DNA daje sygnał hybrydyzacji z sondą EPSPS Arabidopsis thaliaka. Po elektroforezie fragmenty DNA przemesioko na błonę Hybond N Amersham według protokołu Southema opisanego w „Current Protocols in Mnlycular Biology”. Filtr hobrodyzowako z sondą ESPSP Arabidopsis thaliana według warunków opisanych w akapicie 3 dOwazeJ. Klon plazmidowy mający wstawkę 1,7 kb i hobrydozująca z sondą EPSPS Arabidopsis thaliana przygotowano na większą skalę i DNA powstający z lizy bakterii oczyszczono na gradiencie CsCl jak opisano w „Current Protocols in Molecular Biologo”. Oczyszczony DNA poddano częściowemu sykwencJOkowania za pomocą zestawu Pharmacia według instrukcji dostawcy stosując jako startery pumety uniwersalne M13 bezpośredni i odwrócony nabyte u tego samego dostawcy. Uzyskana częściowa sekwencja pokrywa około 0,5 kb. Pochodna sekwencja aminokwasów w obszarze dojrzałego białka (około 50 reszt amikokwaspw) ma 100% ieektoczkości z sekwencją amiko kwasów odpowiadającą dojrzałej EPSPS kukurydzy opisanej w patencie amerykańskim USP 4 971 908. Ten klon odpowiadający fragmentowi EcoRI 1,7 kb DNA EPSP z zawiesiny komórkowej kukurydzy BMS został nazwany pRPA-ML-711. Kompletna sekwencja tego klonu została ustalona na dwóch niciach stosując protokół z zestawu Pharmacia i syntezę oligonu0lyotodPw komplementarnych i w odwrotnych kierunkach co koło 250 bp. Całkowitą uzyskaną sekwencją klonu 1713 bp przedstawiono jako SEK NR ID 2
190 393
Uzyskanie klonu pRPA-ML-715
Analiza sekwencji klonu pRPA-ML-711 i w szczególności porównanie pochodnej sekwencji aminokwasów z sekwencją kukurydzy wykazuje przedłużenie sekwencji o 92 bp powyżej kodonu GCG kodującego N-końcową alaninę dojrzałej części EPSPS kukurydzy (patent amerykański USP 4 971 908). Podobnie obserwuje się przedłużenie 288 bp poniżej kodonu AAT kodującego C-końcową asparaginę dojrzałej części EPSPS kukurydzy (patent amerykański USP 4 971 908). Te dwie części mogłyby odpowiadać przedłużeniu N-końcowego części sekwencji peptydu sygnałowego dla lokalizacji plastydowej i dla przedłużenia C-końcowego obszaru 3' cDNA nieulegającego translacji.
Aby uzyskać cDNA kodujący dojrzałą część DNA EPSPS kukurydzy takiej jak opisano w USP 4 971 908 przeprowadzono następujące czynności
a) Eliminacja obszaru 3' nie ulegającego translacji: konstrukcja pRPA-ML-712Klon pRPA-ML-711 przecięto enzymem restrykcyjnym Asel i końce powstałe z tego cięcia stępiono za pomocą działania fragmentem Klenowa polimerazy I DNA według protokołu opisanego CPMB. Następnie strawiono enzymem restrykcyjnym SacII Powstały DNA rozdzielono za pomocą elektroforezy w 1%> żelu agarozowym LGTA/TBE (odnośnik CPMB).
Fragment żelu zawierający wstawkę „Asel-końce tępe/SacII” o wielkości 0,4 kb wycięto z żelu i oczyszczono za pomocą protokołu opisanego w akapicie 5 powyżej. DNA klonu pRPA-ML-711 strawiono enzymem restrykcyjnym HindIII w polilinkerze wektora do klonowania pUC 19 i powstałe końce stępiono za pomocą działania fragmentem Klenowa polimerazy I DNA. Następnie strawiono enzymem restrykcyjnym Sacl. DNA powstały w wyniku tych manipulacji rozdzielono za pomocą elektroforezy w żelu 0,7% agarozowym LGTA/TBE (odnośnik CPMB).
Fragment żelu zawierający wstawkę HindIII-końce tępe/SacII około 3,7 kb wycięto z żelu i oczyszczono za pomocą protokołu opisanego w akapicie 5 powyżej.
Dwie wstawki ligowano i 2 pl mieszaniny ligacyjnej użyto do transformacji E coli DH10B jak opisano powyżej w akapicie 5.
Analiza zawartości DNA plazmidowego różnych klonów według procedury opisanej dla pRPA-ML-711. Jeden z zachowanych klonów plazmidowych zawiera wstawkę EcoRI-HindIII o około 1,45 kb. Sekwencja końcowych obszarów tego klonu wykazuje, że koniec 5' wstawki odpowiada dokładnie końcowi odpowiadającemu pRPA-ML-711 i ze koniec 3' ma następującą sekwencję:
„5 '-ĄATTAAGCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAAGCTT-3
Sekwencja podkreślona odpowiada kodonowi C-końcowego aminokwasu asparaginy, następny kodon odpowiada sygnałowi stop translacji. Nukleotydy poniżej odpowiadają elementom sekwencji polilinkera pUC 19. Ten klon zawiera sekwencję pRPAML-711 az do miejsca terminacji translacji dojrzałej ESPS kukurydzy, po której następują sekwencje polilinkera pUC 19 aż do miejsca HindIII i została nazwana pRPA-ML-712.
b) Modyfikacje końca 5' pRPA-ML-712: konstrukcja pRPA-ML-715
Klon pRPA-ML-712 strawiono enzymami restrykcyjnymi PstI i HindIII. Powstały DNA w wyniku tych manipulacji rozdzielono a pomocą elektroforezy w 0,8% żelu z agarozy LGTA/TBE (odnośnik CPMB) 0,8%. Fragment żelu zawierający wstawkę Pstl/EcoRl o wielkości 1,3 kb wycięto z żelu i oczyszczono za pomocą protokołu opisanego w akapicie 5 powyżej. Tę wstawkę zligowano w obecności ekwimolarnej ilości każdego z dwóch oligonukleotydów częściowo komplementarnych, o sekwencji:
Oligo 1: 5 '-GAGCCGAGCTCCATGGCCGGCGCCGAGGAGATCGTGCTGCA-3' s άγ δγΓτΔΤΓΤΓΓτγπ ar^raarr δ τ^δ ΠΓΤΓ ΠΠΓΤΓ.Ι '
Olinn 9 a także w obecności DNA plazmidu pUC 19 strawionego enzymami restrykcyjnymi BamHI i HindIII.
Dwa μΐ mieszaniny ligacyjnej wykorzystano do transformacji E coli DH10B jak opisano powyżej w akapicie 5. Po analizie zawartości plazmidowego DNA różnych klonów według procedury opisanej powyżej w akapicie 5 jeden z klonów o wstawce o wielkości około 1,3 kb zachowano do dalszej analizy. Sekwencja 5' końca zachowanego klonu wykazała, ze sekwencja DNA w tym obszarze jest następująca: sekwencja polilinkera pUC 19 od miejsc EcoRI do
190 393
BamHI a następnie sekwencja oligonukleotydów stosowanych do klonowania, a następnie reszta sekwencji obecnej w pRPAML-712. Klon ten nazwano pRPA-ML-713 Ten klon posiada kodon metioninowy ATG włączony w miejscu Ncol powyżej N-końcowego kodonu alaniny dojrzałej syntazy EPSPS. Co więcej kodony alaniny i glicyny N-końca zostały zachowane, ale zmodyfikowane w trzeciej zmiennej zasadzie: wyjściowy GCGGGT daje zmodyfikowany GCCGGC.
Klon pRPA-ML-713 strawiono enzymem restrykcyjnym HikdΠI i końce tego fragmentu stępiono za pomocą fragmentu Klenowa polimerazy I dNa Następnie przeprowadzono cięcie za pomocą enzymu restrykcyjnego Sacl. Powstały w wyniku tych manipulacji DNA rozdzielono za pomocą elektroforezy w żelu z 0,8% agarozy LGTA/TBE (odnośnik CPMB). Fragment żelu zawierający wstawkę „HindIII-tępe końce/SacI” o wielkości 1,3 kb wycięto z żelu i oczyszczono według protokołu opisanego w akapicie 5 powyżej. Tę wstawkę poddano ligacj' w obecności DNA plazmidu pUC 19 strawionego enzymem restrykcyjnym Xbal i końce tego cięcia stępiono za pomocą działania fragmentu Klenowa polimerazy I DNA. Następnie strawiono enzymem Sacl. Dwa pl mieszaniny ligacyjkej wykorzystano do transformacji E coli DH10B jak opisano wyżej w akapicie 5. Po analizie zwartości DNA plazmidowego różnych klonów według procedury opisanej powyżej w akapicie 5, jeden z klonów zawierający wstawkę o wielkości 1,3 kb został zachowany do dalszych celów. Sekwencja końców tego zatrzymanego klonu pokazuje, ze sekwencja DNA jest następująca' sekwencja pUC 19 od miejsc EcoRI do Sacl, następnie sekwencja oligonukleotydów stosowanych do klonowania z delecją 4 bp GAATCC oligonukleotydu 1 opisanego powyżej a następnie reszta sekwencji obecnej w pRPA-ML-712 az do miejsca HikdIlI i sekwencja polilinkera pUC19 od Xbal do Hikalll. Klon ten nazwano pRPA-ML-715.
7) Uzyskanie cDNA kodującego zmutowaną EPSPS kukurydzy
Wszystkie etapy mutagenezy przeprowadzono za pomocą zestawu do mutageknzz U.S.E. Pharmacia według zaleceń dostawcy.
Zasada tego systemu mutagnkezy jest następująca: plazmidówy DNA jest denaturowany za pomocą temperatury i reasocjowany w obecności molowego nadmiaru jednej częśc' ol'gonukleotydu stosowanego do mutagenezy a z drugiej strony oligokukleotydu pozwalającego na eliminację unikalnego miejsca restrykcyjnego obecnego w polil'kkerze. Po etapie reasocjacji przeprowadzono syntezę nici komplementarnej za pomocą polime^zy T4 DNA w obecności ligazy T4 DNA i białka genu 32 w odpowiednim do starczonym buforze. Produkt syntezy ikkubowako w obecności enzymu restrykcyjnego, którego miejsce powicco było zniknąć pomutagenezie. Jako gospodarza do transformacji tego DNA stosowano szczep E coli mający w szczególności mutację mutS Po wzroście w pożywce płynnej przygotowuje się całkowity DNA plazmidowy, inkubowaky w obecności uprzednio stosowanego enzymu restrykcyjnego Następnie szczep E coli DH10B stosowano jako gospodarza do transformacji Plazmidowy DNA izolowanych klonów przygotowywano i sprawdzono obecność wprowadzonej mutacji za pomocą sekwnncjokowania.
A) modyfikacje miejsc lub sekwencji bez przewidywania występowania wpływu na charakter oporności SPSPS kukurydzy na produkty hamujące kompetytywne aktywności syntazy EPSP; eliminacja miejsca Ncol wewnętrznego pRPA-ML-715.
Sekwencja pRPA-ML-715 jest numerowana arbitralnie umieszczając pierwszą zasadę kodom N-końcowego alaniny GCC w pozycj' 1. Ta sekwencja posiada miejsce Ncol w pozycji 1217. Oligonukleotyd modyfikacji miejsca ma sekwencję:
'-CCACAGGATGGCGATGGCCTTCTCC-3'
Po sekwekcjonowakiu według odnośników podanych poniżej sekwencja czytana po mutagenezie odpowiada sekwencji stosowanego oligokukleotydu Miejsce Ncol zostało rzeczywiście wyeliminowane i translacja aminokwasów w tym obszarze zachowuje sekwencję wyjściową obecną w pRPA-ML-715.
Klon ten nazwano pRPA-ML-716.
Sekwencję 1340 bp tego klonu przedstawiono w SEK NR ID 3 i SEK NR ID 4.
B) modyfikacje sekwencji pozwalające na zwiększenie charakteru oporności EPSPS kukurydzy na produkty kompetytywkych inhibitorów aktywności sy^azy EPSP.
190 393
Stosowano następujące oligonukleotydy:
a) mutacja Thr 102->Ile '-GAATGCTGGAATCGCAATGCGGCCATTGACAGC-3'
b) mutacja Pro 106->Ser '-GAATGCTGGAACTGCAATGCGGTCCTTGACAGC-3'
c) mutacje Gly 101->Ala i The 102 ->Ile '-CTTGGGGAATGCTGCCATCGCAATGCGGCCATTG-3' mutacja Thrl02->Ile i Pro 106 -> Ser
-GGGGAATGCTGGAATCGCAATGCGGTCCTTGACAGC-3'
Po sekwencjonowaniu sekwencja odczytana po mutagenezie na trzech fragmentach zmutowanych była identyczna z sekwencją rodzicielskiego DNA pRPA-ML-716 z wyjątkiem obszaru mutagenizowanego, która odpowiada sekwencji oligonukleotydów stosowanych do mutagenezy. Te klony nazwano pRPA-ML-717 dla mutacji The 102-> Ile, pRPA-ML-718 dla mutacji Pro 106->Ser, pRPA-ML-719 dla mutacji Gly 101->Ala i The 102->Ile i pRPA-ML-720 dla mutacji Thr 102->Ile i Pro 106 -> Ser
Sekwencję 1340 bp pRPA-ML-720 przedstawiono jako SEK NR ID 5 i SEK NR ID 6
Wstawka Ncol-HindIII o wielkości 1395 bp jest podstawą wszystkich konstruktów stosowanych do transformacji roślin do wprowadzania oporności na herbicydy będące inhibitorami współzawodniczącymi EPSPS i w szczególności oporności na glifozat. Ta wstawka będzie dalej określana w opisach jako „po dwójny mutant EPSPS kukurydzy”.
B Tolerancja na glifozat różnych mutantów in vitro
2.a. Ekstrakcja syntazy EPSP
Różne geny syntaz EPSP wprowadzono w postaci kasety Ncol-HindIII do wektora plazmidowego pTrc99a (Pharmacia, od nośnik: 27-5007-01) strawionego Ncol i HindIII. Zrekombinowane E coli DH10B nadeksprymujące rożne syntazy ESPS poddano sonikacji w 40 ml buforu na 10 g komórek osadzonych i przepłukanych tym samym buforem (Tris HCl 200 mM pH 7,8, 50 mM merkaptoetanol, 5 mM EDTA i 1 mM PMSF), do których dodaje się 1 g poliwinylopyrrolidonu. Zawiesinę wytrząsano przez 15 minut w 4°C a następnie wirowano przez 20 minut w 27000 g i 4°C
Do supernatantu dodano siarczan amonu do doprowadzania roztworu do 40% nasycenia siarczanem amonu. Mieszaninę wirowano przez 20 minut w 27000g i 4°C. Do nowego supernatantu dodano siarczan amonu do doprowadzenia roztworu do 70% nasycenia siarczanem amonu. Mieszaninę wirowano 30 minut w 27000 g i 4°C. Syntazę EPSP obecną w tym osadzie białkowym zawieszono w 1 ml buforu (20 mM Tris HCl i 50 mM merkaptoetanol). Ten roztwór dializowano przez noc wobec dwóch litrów tego samego buforu w 4°C.
2b. Aktywność enzymatyczna
Aktywność każdego enzymu jak i jego oporność na glifozat mierzono in vitro przez 10 minut w 37°C w następującej mieszaninie reakcyjnej: 100 mM kwas maleinowy pH 5,6, 1 mM fosfoenolopirogronian, 3 mM 3'fosforan szikimianu (przygotowany według Knowles P.F. i Spinson D.B. 1970. Methods in Enzymol. 17A, 351-352 ze szczepu Aerobacter aerogenes szczep ATCC 25597) i fluorku potasu 10 mM. Ekstrakt enzymatyczny dodawano w ostatniej chwili po dodaniu glifozatu, którego końcowe stężenie waha się od 0 do 20 mM
Aktywność mierzono za pomocą ilości uwolnionego fosforanu według metody Tausky H.A. i Schorr E. 1953. J. Biol. Chem. 202, 675-685. '
W tych warunkach dziki enzym (WT) jest hamowany w 85% od stężenia 0,12 mM glifozatu. W tym stężeniu enzym zmutowany Ser 106 jest hamowany zaledwie w 50% i trzy pozostałe mutanty Ilel02, Ilel02/Serl06, Ala101 /Ile 102 nie są wcale lub są słabo hamowane.
Należy zwiększyć stężenie glifozatu dziesięć razy to znaczy d.o 1,2 mM aby zahamować zmutowany enzym Ile 102 w 50% a mutanty Ile102/Ser106, Ala/Ile i Ala nadal nie są hamowane.
Należy zauwazyć, ze aktywność mutantów Ala/Ile i Ala nic jest hamowana aż do stężeń 10 mM glifozatu i aktywność mutan ta Ilel02/Serl06 nie jest obniżona nawet jeśli stężenie glifozatu jest dwukrotnie większe czyli 20 mM.
C
Oporność transformowanych roślin tytoniu
190 393
0-1 Konstrukcja plazmidów pRPA-RD-124' Dodanie sygnału poliadenylacji „nos” do pRPA-ML-720, otrzymanego poprzednio, ze stworzeniem kasety do klonowania zawierającej gen EPSPS podwójnie zmutowany z kukurydzy (Thr 102 -> Ile i Pro 106 ->Ser). pRPA-ML-720 trawiono Hin-dlll, poddano działaniu fragmentu Klenowa polimerazy I E coli aby wytworzyć tępe końce. Następnie przeprowadzono drugie trawienie Ncol i fragment EPSPS oczyszczono. Gen EPSPS następnie ligowano z pRPA-RD-12 (kaseta do klonowania zawierająca sygnał poliadenylacji syntazy nopaliny) aby otrzymać pR-PA-RD-124. Aby uzyskać uzyteczny oczyszczony wektor pRPA-rD-12 było konieczne strawienie go Sali, działanie polimerazą DNA Klenowa a następnie ponowne trawienie Ncol.
RPA-RD-125: Dodanie zoptymalizowanego peptydu sygnałowego (OTP) pRPA-RD-124 za pomocą tworzenia kasety do klonowania zawierającej docelowy gen EPSPS na plazmidach. pRPA-RD-7 (europejskie zgłoszenie patentowe EP 652 286) strawiono SphI, poddano działaniu polimerazy DNA T4, a następnie strawiono Spel i oczyszczono fragment OTP. Ten fragment OTP sklonowano w pRPA-RD-124, który uprzednio strawiono Ncol, poddano działaniu polimerazy DNA Klenowa aby usunąć jednoniciowy koniec 3' a następnie strawiono Spel. Klon ten następnie zsekwencjonowano aby ustalić poprawną fuzję translacyjną między OTP i genem EPSPS. Uzyskano wówczas pRPA-RD-125.
pRPA-RD-159: Dodanie podwójnego promotora histonu Arabidopsis H4A748 (europejskie zgłoszenie patentowe EP 507 698) do pRPA-RD-i25 ze stworzeniem kasety do ekspresji w roślinach do ekspresji genu „OTP-gen EPSPS podwójnie zmutowany” w tkankach dwuliściennych, pRPA-RD-132 (kaseta zawierająca promotor podwójny H4A748 (europejskie zgłoszenie patentowe EP 507 698)) strawiono Ncol i Sacl. Oczyszczony fragment promotora następnie sklonowano w strawionym EcoRI i Sacl.
pRPA-RD-173: dodatek genu „promotor H4A748-OTP-gen podwójnego mutanta EPSPS pRPA-RD-159 do plazmidu pRPA-BL-150A (europejskie zgłoszenie patentowe EP 508 909) ze stworzeniem wektora transformacji Agrobacterium tumefaciens. pRPA-RDA strawiono Notl i poddawano działaniu polimerazy Klenowa. Ten fragment następnie klonowano w pRPA-BL-150A za pomocą Smal
-1 -Transformacj a
Wektor pRPA-RD-173 wprowadzono do szczepu Agrobacterium i, tumefaciens EHA101 (Hood i wsp., 1987) niosącego cosmid pTVK291 (Komari i wsp. 1986). Technika transformacji jest oparta na procedurze Horscha i wsp. (1985).
1-2-Regeneracja
Regenerację tytoniu PBD6 (pochodzącego od SEITA z Francji) z eksplantatów liściowych uzyskano na pożywce opartej na Murashige i Skoog (MS) zawierającej 30 g/l sacharozy jak i 200 ng/ml kanamycyny. Ekplantaty liści pobrano z roślin hodowanych w szklarni in vitro i transformowanych według techniki krążków liściowych (Science 1985, tom 227, str 1229-1231) w trzech kolejnych etapach: pierwszy obejmował indukowanie kiełkowania na pożywce MS z dodatkiem 30 g/l sacharozy zawierającej 0,05 mg/l kwasu naftylooctowego (ANA) i 2 mg/ml benzylaminopuryny (BAP) przez 15 dni. Kiełki wytworzone w tym etapie następnie rozwijano przez hodowlę na pożywce MS zawierającej 30 g/l sacharozy, ale niezawierającej hormonu przez 10 dni. Następnie pobrano kiełki i hodowano sieje na pożywce ukorzeniającej MS zawierającej połowę soli, witamin i cukrów i nie zawierającej hormonu. Po około 15 dniach ukorzeniane kiełki umieszczano w glebie.
-3 Oporność na glifozat
Dwadzieścia roślin transformowanych zregenerowano i umieszczono w szklarni w celu konstrukcji pRPAMRD-173. Te rośliny poddano działaniu w szklarni w stadium 5 liści roztworem wodnego RoundUp odpowiadającej 0,8 kg czynnego glifozatu na hektar.
Wyniki odpowiadają obserwacji wskaźników fitotoksyczności dokonanych 3 tygodni po traktowaniu. W tych warunkach stwierdzono, że rośliny transformowane przez konstrukt pRPA-RD-173 wykazują bardzo dobrą oporność, podczas gdy rośliny kontrolne nietransformowane są całkowicie niszczone.
Wyniki te wskazują jasno na polepszenie przyniesione przez stosowanie genu chimerowego według wynalazku dla tego samego genu kodującego oporność na glifozat.
190 393
Przykład 5. Transformacja tytoniu przemysłowego genem nitrylazy (aby -> konstrukt 238).
Tytoń ten uzyskuje się sposobem według europejskiego zgłoszenia patentowego nr 0 337 899 strona 6 linia 50 i dalej na podstawie konstruktu 238, który jest opisany pod nazwą pR-PA-BL-23 8.
Przykład 6. Krzyżowanie przez zapylanie
Krzyzuje się w szklarni odpowiednio linie Col7, 173 i 238.
- Co17 z 238 aby uzyskać rośliny tytoniu PBD6 do badania pod kątem podwójnej oporności na izoksaflutol i bromoksynil („rośliny HPPD + OXY”)
- Co 17 z 173 aby uzyskać rośliny tytoniu PBD6 do badania pod kątem podwójnej oporności na izoksaflutol i glifozat („rośliny HPPD + EPSPS”).
Trzy linie są homozygotyczne pod względem istotnego genu: w związku z tym potomstwo jest hemizygotyczne względem każdego genu wprowadzanego przez krzyżowanie
Krzyżowane rośliny uzyskuje się po sześciu tygodniach
Przykład 7. Pomiar oporności tytoniu przy traktowaniu przed kiełkowaniem izoksaflutolem i po kiełkowaniu bromoksynilem lub glifozatem.
W tej próbie każdy test przeprowadzano na 10 roślinach i pozostawiano 10 nie traktowanych roślin.
Wszystkie traktowania przeprowadzano w formie rozpylania 500 litrów roztworu na hektar.
Dla traktowania po kiełkowaniu rośliny wysiewano a następnie pikowano rośliny w pojemnikach 9 cm x 9 cm.
Traktowanie po kiełkowaniu przeprowadza się w dobrze rozwiniętym stadium (3-4 liście). Próbki roślin odpowiednio dzikich i transformowanych genetycznie uzyskanych powyżej dzielono na kilka grup.
a) próba nie traktowaną,
b) inne próby traktowane odpowiednio pojedynczym herbicydem,
- izoksaflutolem po kiełkowaniu w dwóch dawkach (odpowiednio 200 i 400 g/ha),
- bromoksynilem po kiełkowaniu w dwóch dawkach (odpowiednio 400 i 800 g/ha),
- glifozatem po kiełkowaniu w dwóch dawkach (odpowiednio 800 i 1200 g/ha),
c) inne próby są traktowane odpowiednio dwoma herbicydami, po kiełkowaniu w mieszankach przyrządzanych odręcznie.
- izoksaflutol i bromoksynil w dwóch dawkach (odpowiednio 200/400 i 400/800 g/ha),
- izoksaflutol i glifozat w dwóch dawkach (odpowiednio 200/800 i 400/1200 g/ha),
Traktowanie przeprowadzono z następującymi środkami: izoksaflutol 75%, bromoksynil (produkt handlowy PARDNER) w formie oktanianu i emulgowalnego koncentratu przy 225 g/l i glifozatem (Round-UP).
W tych warunkach obserwowano po 17 dniach po traktowaniu następujące fitotoksyczności wyrażone w procentach zniszczenia w poniższej tabeli, jak i ilość roślin na poletku i dawki herbicydu (ów) wyrażonych w ilości aktywnej substancji na hektar.
Traktowanie po kiełkowaniu izoksaflutolem i po kiełkowaniu bromoksynilem lub glifozatem.
Herbicyd w g/l Rośliny z genami tolerancji
l 2 3 4 5 6 7
* HPPD + QXY * HPPD + EPSPS * BEZ = DZIKI
Kontrole 10 10 10
tylko izoksaflutol 200 400 20 20 4% 5% 20 20 2% 3% 10 75% 85%
tylko bromoksynil 400 800 10 10 3% 0% 10 10 0% 0%
190 393 cd tabeli
1 2 3 4 5 6 7
tylko glifozat 800 1200 20 20 0% 0% 10 10 100% 100%
izoksaflutol + bromoksynil 200 400 20 20% 10 100%
izoksaflutol + bromoksynil 400 800 20 30% 10 100%
izoksaflutol + glifozat 200 800 40 5% 10 100%
izoksaflutol + glifozat 200 1200 40 10% 10 100%
*ilość roślin
Przykład 8.
W celu zbadania czy gen HPPD Pseudomonas fluorescens może być wykorzystany jako gen markera w trakcie cyklu „transformacja-regeneracja” gatunku rośliny przekształcono tytoń genem chimerowym złożonym z genu HPPD i genu EPSPS podwójnie zmutowanego z opornością na glifozat i rośliny transformowane oporne naraz na izoksaflutol i glifozat uzyskano po selekcji na izoksaflutolu.
Materiał i metody i wyniki.
Gen chimerowy pRP2012 opisany poniżej przeniesiono do tytoniu przemysłowego PBD6 według procedur transformacji i regeneracji juz opisanych w europejskim zgłoszeniu patentowym EP nr 0 508 909.
Chimerowy gen wektora pRP 2012 ma następującą budowę A-B, w której A jest
Podwójny promotor hitonu TEV OTP region kodujący HPPD teinunatoi nos
a B jest
Podwójny promotor histonu TEV OTP region kodujący EPSPS terminator nos
taki jak stosowano w wektorze pRPA-RD-173.
Chimerowy gen pRP 2012 wprowadzono do tytoniu.
1) Transformacja
Wektor wprowadzono do szczepu nieonkogennego Agrobacterium EHA 101 (Hood i wsp., 1987) niosącego kosmid pTVK 291 (Komari i wsp., 1986). Technika transformacji jest oparta na procedurze Horscha i wsp. (1985).
2) Regeneracja 2) Regeneracja
Regenerację tytoniu PBD6 (pochodzącego od SEITA France) wychodząc z eksplantatów liściowych prowadzono na pożywce według Murashige i Skoog (MS) zawierającej 30 g/l sacharozy jak i 350 mg/l cefatoksymu i 1 mg/l izoksaflutolu. Eksplantaty liściowe są pobierane z roślin w szklarni lub in vitro i transformowane techniką krążków liści (Science 1985, tom 227, str. 1229-1231) w trzech kolejnych etapach: pierwszy obejmuje indukowanie kiełkowania na nożvwce MS 7 dodatkiem 30 p/l sacharozy zawieraiarei 0 05 ma/l kwasu naftylooctowego (ANA) i 2 mg/ml benzylaminopuryny (BAP) przez 15 dni i 1 mg/l izoksaflutolu. Zielone kiełki wytworzone w tym etapie następnie rozwijano przez hodowlę na pożywce MS zawierającej 30 g/l sacharozy i 1 mg/l izoksaflutolu, ale nie zawierającej hormonu przez 10 dni. Następnie pobrano kiełki i hodowano je na pożywce ukorzeniającej MS zawierającej połowę soli, witamin i cukrów i 1 mg/l izoksaflutolu nie zawierającej hormonu Po około 15 dniach ukorzeniane kiełki umieszczono w glebie.
190 393
Wszystkie rośliny otrzymane według tego protokółu analizowano techniką PCR z primerami specyficznymi dla HPPD P. fluoryscens. Ta analiza PCR pozwoliła na potwierdzenie, ze wszystkie tak uzyskane rośliny w istocie mają wintogrowano gen HPPD i ze tolerują one zarówno izoksaflutol i glifozat w warunkach opisanych w przykładzie 7.
Na koniec doświadczenie to potwierdza, ze gen HPPD może być stosowany jako gen markerowy i ze w połączeniu z tym genem izoOsaflutkl może być dobrym czynnikiem selekcyjnym.
Przykład 9. Roślina z genem HPPD i genem bar, oporna na izoksaflutol i fosfmotriconę.
1. Konstrukcja genu chimerowego z sekwencją HPPD
Plazmid pRPA-RD-104 przedstawiony na figurze 4 został uzyskany przez wstawiome genu chimorowogo oporności na izoksazole do plazmidu pUC 19 o wielkości 2686 bp, sprzedawane przez New England Biolabs (Yakkish-Perrok, C., Viera, J. i Messing J. (1985) Gene 33, 103-119 i zawierającego oporność na ampicylinę.
Różne elementy genu chimerowygo to, w kierunku translacji: ·
- promotor histonu H3C4 kukurydzy o wielkości 1020 bp opisany w zgłoszeniu EP 0 507 698
- iktrok genu dehydrogenazy alkoholowej i kukurydzy opisano przez Sachs M. i wsp. Gynytics 113:449-467 (1986) i złozony z 536 bp.
- zoptymalizowany peptod sygnałowy (OTP) opisany w zgłoszeniu patentowym 0 508 909; i OTP jest stworzony z 171 bp peptydu sygnałowego małej podjedkostki rybulozo 1,5 bis karboksolazo/nksogekazo Heliakthus annuus (Wa0smak G, i wsp. 1987, Nucleic Acids Res 15:7181) a następnie 66 bp dojrzałej części małej pkdjedkostki robulozo 1,5 bis karboksylazo/oksygekazo Zea mays (Lebrun i wsp. 1987. Nucleic Acids Res. 15: 4360) a następnie 150 bp pop-odu sygnałowego małej podjodkostki rybulozo 1,5 bis karboksolazo/oOsygekazo Zea mays (Lobrun i wsp. 1987 Nucloic Acids Res. 15:4360) Całość ma więc 387 bp;
- region kodujący HPPD Pseudomokas flunrescens opisany powa zej;
- terminator genu syntazy nopaliiw (nos) (region poliadenylacji genu nos wyizolowanego z pTi37, 250 bp (Bevan M. i wsp. NucIoic Acids Res 11:369-385)).
2. Konstrukcja genu chimerowego oporności na fosfimotriconę (gen bar)
Acntylotraksforaza fosfmotricoky (PAT) kodowana przez gen bar jest enzymem, który ikaktywujn herbicyd, fosfmotricykę (PPT). PPT hamuje syntezę glutaminy i powoduje szybką akumulację amoniaku w komórkach, co prowadzi do ich śmierci (Tachibana i wsp. 1986)
Plazmid stosowano So wprowadzenia oporności na fosfinotricano jako czonniOa selekcji otrzymano przez wstawienie genu chimerowogo pDM 302 do wektora pSP72 o wielkości 2462 bp, sprzedawanego przez Promoga Corp. (numer dostępu Genbank/DDBJ Χ65332) i zawierającego gen oporności na ampicylinę.
Plazmid pDM 302 o wielkości 4700 bp został opisany przez Cao, J. i wsp. Plant Cell Report 11: 586-591 (1992).
Różne plemonty tego plazmidu to:
- promotor genu aktywny razu opisano przez McElroy i wsp. Plant Molecular Biology 15 257-268 (1990) złozony z 840 bp;
- pierwszy ekson gonu aOtyko ryzu złozoną 80 bp;
- pierwszy mtron gonu aktyny ryzu złozony z 450 bp;
- rogion kodujący gonu bar o wielkości 600 bp wycięta z plazmidu pIJ41404 opisany przez Whito i wsp., Nuci. Acids Res. 18: 1862(1990);
- terminator gonu samta/o nopalina (nos) (obszar poliadekolacji gen nos izolowano z, ΎΒ Ua piu / , v up (ΐκναη m.
ut i-i-, a te _ _ i -ι oorw wap. iNuuicic rvułUb 11 .juy-joj)}.
3. Transformacja
Do wprowadzenia OokstruOtu genetycznego stosowana jost technika bombardowania. Plazmidy oczyszczano na kolumnie Quiagon i współs-rącam na cząsteczkach wolframu M10 wodług procedura Kloin (Nature 327:70-73, 1987).
Mioszakika cząstoczok motalu i dwóch plazmidów opisanych po niżej jest następnie bombardowana do komórok ombriogoniczkoch kukurydzą wodług protokółu
190 393
4. Regeneracja i stosowanie genu bar jako czynnika selekcji
Kalusy bombardowane selekcjonowano na glufozymanie az do pojawienia się zielonych sektorów. Kalusy dodatnie następnie przekształcono w zarodki somatyczne. Młode rośliny przenoszono do szklarni do produkcji ziaren
Analiza molekularna przeprowadzona na roślinach wykazuje, ze:
- przynajmniej 4 kalusy wybrane na fosfinotricynie dały rośliny wykazujące obecność genu HPPS za pomocą PCR.
- przynajmniej 5 kalusów wybranych na fosfinotricynie dało rośliny wykazujące obecność HPPD za pomocą techniki Southema;
- przynajmniej 5 kalusów wybranych na fosfinotricynie dało rośliny wykazujące obecność zrekombinowanego białka za pomocą techniki typu Western;
- gen chimerowy HPPD i białko heterologiczne są nieobecne w kalusach nietransformowanych.
Wyniki te wykazują skuteczność genu chimerowego bar dla selekcji kalusów transformowanych zawierających inny gen interesujący agronomicznie.
5. Analiza potomstwa roślin transformowanych
Rośliny transformowane uzyskane powyżej wydały pyłek uznany za częściowo transgeniczny, którym zapłodniono komórki jajowe dzikiej nietransgenicznej kukurydzy. Uzyskane ziarna wybrano na piasku po działaniu izoksaflutolem. Protokół selekcji był następujący:
800 ml piasku z Fontainebleau umieszczono w kuwecie 15 x 20 cm. Kuwety następnie spryskano wodą i nawodniono za pomocą podania roztworu odzywczego złozonego z 5 ml Quinoligo (La Quinoleine) na litr wody. 20 ziaren kukurydzy umieszczano na kuwetach, które następnie poddano działaniu izoksaflutolu z rozpryskiwaniem 100 do 200 g aktywnego czynnika na hektar (300 do 600 fig aktywnego związku na kuwetę). Kuwety następnie umieszczano w hodowli w szklarni. Uzyskane wyniki są zestawione w następującej tabeli:
Genotypy Izoksaflutol (g/ha) Ilość wysianych ziaren Ilość wykiełkowanych roślin Ilość martwych roślin Ilość przezywających roślin
me transgeniczne 0 20 20 0 20
100 20 20 20 0
261 2B 459 100 10 10 5 5
200 10 9 4 5
261 2D2 100 10 9 6 3
200 10 10 7 3
261 2A2 100 10 5 3 2
200 10 7 7 0
Te wyniki wykazują skuteczność genu HPPD dla selekcji roślin opornych kukurydzy. Wykazują one także, ze nadekspresja HPPD Pseudomonas w tkance kukurydzy nadaje oporność na izoksaflutol.
Zilustrowane sekwencje są następujące:
SEK NR ID 1
Sekwencja genu HPPD Pseudomonas fluorescens A32.
SEK NR ID 2
Sekwencja cDNA EPSPS Arabidopsis thaliana.
SEK NR ID 3 i 4 odpowiednio sekwencja genu i białka EPSPS zmutowanej kukurydzy część 1340 bp klonu pRPA-ML-716. '
SEK NR ID 5 i SEK NR ID 6 odpowiednio sekwencja genu i białka EPSPS zmutowanej kukurydzy część 1340 bp klonu pRPA-ML-720.
Załączone figury ilustrują wynalazek.
190 393
Figura 1 przedstawia sekwencję białka HPPD szczepu Pseudomonas sp szczep P.J 874 ' teoretyczną sekwencję kuklnotydową odpowiedniej części kodującej, pięć oligokukleotzaów wybranych, aby dokonać amplifikacji części tego obszaru kodującego są przedstawione przez p'ęć strzałek.
Figura 2 przedstawia mapę plazmidu z fragmentem genomowym 7 kb zawierającym gen HPPD P. fluorescens A32.
Figura 3 podaje porównanie sekwencji aminokwasów HPPD P fluorescens A32 i HPPD Pseudomonas sp. szczep P. J. 874 (tylko aminokwasy odmienne w obu sekwencjach są wskazane) jak i sekwencję najwyzszej zgodności.
190 393
LISTA SEKWENCJI
SEK. NR ID.:1
ATGGCAGATC TATACGAAAA CCCAATGGGC CTGATGGGCT TTGAATTCAT CGAATTCGCG 60
TCGCCGACGC CGGGTACCCT GGAGCCGATC TTCGAGATCA TGGGCTTCAC CAAAGTCGCG 120
ACCCACCGTT CCAAGAACGT GCACCTGTAC CGCCAGGGCG AGATCAACCT GATCCTCAAC 180
AACGAGCCCA ACAGCATCGC CTCCTACTTT GCGGCCGAAC ACGGCCCGTC GGTGTGCGGC 240
ATGGCGTTCC GCGTGAAGGA CTCGCAAAAG GCCTACAACC GCGCCCTGGA ACTCGGCGCC 300
CAGCCGATCC ATATTGACAC CGGGCCGATG GAATTGAACC TGCCGGCGAT CAAGGGCATC 360
GGCGGCGCGC CGTTGTACCT GATCGACCGT TTCGGCGAAG GCAGCTCGAT CTACGACATC 420
GACTTCGTGT ACCTCGAAGG TGTGGAGCGC AATCCGGTCG GTGCAGGTCT CAAAGTCATC 480
GACCACCTGA CCCACAACGT CTATCGCGGC CGCATGGTCT ACTGGGCCAA CTTCTACGAG 540
AAATTGTTCA ACTTCCGTGA AGCGCGTTAC TTCGATATCA AGGGCGAGTA CACCGGCCTG 600
ACTTCCAAGG CCATGAGTGC GCCGGACGGC ATGATCCGCA TCCCGCTGAA CGAAGAGTCG 660
CCCAAGGGCG CGGGGCAGAT CGAAGAGTTC CTGATGCAGT TCAACGGCGA AGGCATCCAG 720
CACGTGGCGT TCCTCACCGA CGACCTGGTC AAGACCTGGG ACGCGTTGAA GAAAATCGGC 780
ATGCGCTTCA TGACCGCGCC GCCAGACACT TATTACGAAA TGCTCGAAGG CCGCCTGCCT 840
GACCACGGCG AGCCGGTGGA TCAACTGCAG GCACGCGGTA TCCTGCTGGA CGGATCTTCC 900
GTGGAAGGCG ACAAACGCCT GCTGCTGCAG ATCTTCTCGG AAACCCTGAT GGGCCCGGTG 960
TTCTTCGAAT TCATCCAGCG CAAGGGCGAC GATGGGTTTG GCGAGGGCAA CTTCAAGGCG 1020
CTGTTCGAGT CCATCGAACG TGACCAGGTG CGTCGTGGTG TATTGACCGC CGATTAA
1077
190 393
SEK. NR ID. :2
AATCAATTTC ACACAGGAAA CAGCTATGAC CATGATTACG AATTCGGGCC CGGGCGCGTG 60
ATCCGGCGGC GGCAGCGGCG GCGGCGGTGC AGGCGGGTGC CGAGGAGATC GTGCTGCAGC 120
CCATCAAGGA GATCTCCGGC ACCGTCAAGC TGCCGGGGTC CAAGTCGCTT TCCAACCGGA 180
TCCTCCTACT CGCCGCCCTG TCCGAGGGGA CAACAGTGGT TGATAACCTG CTGAACAGTG 240
AGGATGTCCA CTACATGCTC GGGGCCTTGA GGACTCTTGG TCTCTCTGTC GAAGCGGACA 300
AAGCTGCCAA AAGAGCTGTA GTTGTTGGCT GTGGTGGAAA GTTCCCAGTT GAGGATGCTA 360
AAGAGGAAGT GCAGCTCTTC TTGGGGAATG CTGGAACTGC AATGCGGCCA TTGACAGCAG 420
CTGTTACTGC TGCTGGTGGA AATGCAACTT ACGTGCTTGA TGGAGTACCA AGAATGAGGG 480
AGAGACCCAT TGGCGACTTG GTTGTCGGAT TGAAGCAGCT TGGTGCAGAT GTTGATTGTT 540
TCCTTGGCAC TGACTGCCCA CCTGTTCGTG TCAATGGAAT CGGAGGGCTA CCTGGTGGCA 600
AGGTCAAGCT GTCTGGCTCC ATCAGCAGTC AGTACTTGAG TGCCTTGCTG ATGGCTGCTC 660
CTTTGGCTCT TGGGGATGTG GAGATTGAAA TCATTGATAA ATTAATCTCC ATTCCGTACG 720
TCGAAATGAC ATTGAGATTG ATGGAGCGTT TTGGTGTGAA AGCAGAGCAT TCTGATAGCT 780
C-GGACAGATT CTACATTAAG GGAGGTCAAA AATACAAGTC CCCTAAAAAT GCCTATGTTG 840
AAGGTGATGC CTCAAGCGCA AGCTATTTCT TGGCTGGTGC TGCAATTACT GGAGGGACTG 900
TGACTGTGGA AGGTTGTGGC ACCACCAGTT TGCAGGGTGA TGTGAAGTTT GCTGAGGTAC 960
TGGAGATGAT GGGAGCGAAG GTTACATGGA CCGAGACTAG CGTAACTGTT ACTGGCCCAC 1020
CGCGGGAGCC ATTTGGGAGG AAACACCTCA AGGCGATTGA TGTCAACATG AACAAGATGC 1080
CTGATGTCGC CATGACTCTT GCTGTGGTTG CCCTCTTTGC CGATGGCCCG ACAGCCATCA 1140
GAGACGTGGC TTCCTGGAGA GTAAAGGAGA CCGAGAGGAT GGTTGCGATC CGGACGGAGC 1200
TAACCAAGCT GGGAGCATCT GTTGAGGAAG GGCCGGACTA CTGCATCATC ACGCCGCCGG 1260
AGAAGCTGAA CGTGACGGCG ATCGACACGT ACGACGACCA CAGGATGGCC ATGGCCTTCT 1320
CCCTTGCCGC CTGTGCCGAG GTCCCCGTCA CCATCCGGGA CCCTGGGTGC ACCCGGAAGA 1380
CCTTCCCCGA CTACTTCGAT GTGCTGAGCA CTTTCGTCAA GAATTAATAA AGCGTGCGAT 1440
ACTACCACGC AGCTTGATTG AAGTGATAGG CTTGTGCTGA GGAAATACAT TTCTTTTGTT 1500
CTGTTTTTCT CTTTCACGGG ATTAAGTTTT GAGTCTGTAA CGTTAGTTGT TTGTAGCAAG 1560
TTTCTATTTC GGATCTTAAG TTTGTGCACT GTAAGCCAAA TTTCATTTCA AGAGTGGTTC 1620
GTTGGAATAA TAAGAATAAT AAATTACGTT TCAGTGAAAA ΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑ ΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑ 1680
ΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑ ΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑ AACCCGGGAA TTC
1713
190 393
SEK. NR ID :3
CCATG GCC GGC GCC GAG GAG ATC GTG CTG CAG CCC ATC AAG GAG ATC 47
Ala Gly Ala Glu Glu Ile Val Leu Gln Pro Ile Lys Glu Ile
10
TCC GGC ACC GTC AAG CTG CCG GGG TCC AAG TCG CTT TCC AAC CGG ATC 95
Ser 15 Gly Thr Val Lys Leu 20 Pro Gly Ser Lys Ser 25 Leu Ser Asn Arg Ile 30
CTC CTA CTC GCC GCC CTG TCC GAG GGG ACA ACA GTG GTT GAT AAC CTG 143
Leu Leu Leu Ala Ala 35 Leu Ser Glu Gly Thr 40 Thr Val Val Asp Asn 45 Leu
CTG AAC AGT GAG GAT GTC CAC TAC ATG CTC GGG GCC TTG AGG ACT CTT 191
Leu Asn Ser Glu 50 Asp Val His Tyr Met S5 Leu Gly Ala Leu Arg 60 Thr Leu
GGT CTC TCT GTC GAA GCG GAC AAA GCT GCC AAA AGA GCT GTA GTT GTT 239
Gly Leu Ser 65 Val Glu Ala Asp Lys 70 Ala Ala Lys Arg Ala 75 Val val Val
GGC TGT GGT GGA AAG TTC CCA GTT GAG GAT GCT AAA GAG GAA GTG CAG 287
Gly Cvs 80 Gly Gly Lys Phe Pro 85 Val Glu Asp Ala Lys 90 Glu Glu Val Gln
CTC TTC TTG GGG AAT GCT GGA ACT GCA ATG CGG CCA TTG ACA GCA GCT 335
Leu 95 Phe Leu Gly Asn Ala 100 Gly Thr Ala Met Arg 105 Pro Leu Thr Ala Ala 110
GTT ACT GCT GCT GGT GGA AAT GCA ACT TAC GTG CTT GAT GGA GTA CCA 383
Val Thr Ala Ala Gly 115 Gly Asn Ala Thr Tyr 120 Val Leu Asp Gly Val 125 Pro
AGA ATG AGG GAG AGA CCC ATT GGC GAC TTG GTT GTC GGA TTG AAG CAG 431
Arg Met Arg Glu 130 Arg Pro Ile Gly Asp 135 Leu Val Val Gly Leu 140 Lys Gln
CTT GGT GCA GAT GTT GAT TGT TTC CTT GGC ACT GAC TGC CCA CCT GTT 479
Leu Gly Ala 145 Asp Val Asp Cys Phe 150 Leu Gly Thr Asp Cys 155 Pro Pro Val
CGT GTC AAT GGA ATC GGA GGG CTA CCT GGT GGC AAG GTC AAG CTG TCT 527
Arg Val 160 Asn Gly Ile Gly Gly 165 Leu Pro Gly Gly Lys 170 Val Lys Leu Ser
GGC TCC ATC AGC AGT CAG TAC TTG AGT GCC TTG CTG ATG GCT GCT CCT 575
Gly 175 Ser Ile Ser Ser Gln 180 Tyr Leu Ser Ala Leu 185 Leu Met Ala Ala Pro 190
TTG GCT CTT GGG GAT GTG GAG ATT GAA ATC ATT GAT AAA TTA ATC TCC 623
Leu Ala Leu Gly Asp 195 Val Glu Ile Glu lle 200 Ile Asp Lys Leu Ile 205 Ser
ATT CCG TAC GTC GAA ATG ACA TTG AGA TTG ATG GAG CGT TTT GGT GTG 671
Ile Pro Tyr Val 210 Glu Met Thr Leu Arg 215 Leu Met Glu Arg Phe 220 Gly Val
AAA GCA GAG CAT TCT GAT AGC TGG GAC AGA TTC TAC ATT AAG GGA GGT 719
Lys Ala Glu 225 His Ser Asp Ser Trp 230 Asp Arg Phe Tyr Ile 235 Lys Gly Gly
CAA AAA TAC AAG TCC CCT AAA AAT GCC TAT GTT GAA GGT GAT GCC TCA 757
Gln Lys 240 Tyr Lys Ser Pro Lys 245 Asn Ala Tyr Val Glu 250 Gly Asp Ala Ser
190 393
SEK. NR ID. 3 (ciąg dalszy)
AGC GCA AGC TAT TTC TTG GCT GGT GCT GCA ATT ACT GGA GGG ACT GTG 815
Ser 255 Ala Ser Tyr Phe Leu 260 Ala Gly Ala Ala Ile Thr Gly Gly Thr Val
265 270
ACT GTG GAA GGT TGT GGC ACC ACC AGT TTG CAG GGT GAT GTG AAG TTT 863
Thr Val Glu Gly cys Gly Thr Thr Ser Leu Gln Gly Asp Val Lys Phe
275 280 285
GCT GAG GTA CTG GAG ATG ATG GGA GCG AAG GTT ACA TGG ACC GAG ACT 911
Ala Glu Val Leu Glu Met Met Gly Ala Lys Val Thr Trp Thr Glu Thr
290 295 300
AGC GTA ACT GTT ACT GGC CCA CCG CGG GAG CCA TTT GGG AGG AAA CAC 959
Ser Val Thr Val Thr Gly Pro Pro Arg Glu Pro Phe Gly Arg Lys His
305 310 315
CTC AAG GCG ATT GAT GTC AAC ATG AAC AAG ATG CCT GAT GTC GCC ATG 1007
Leu Lys Ala Ile Asp Val Asn Met Asn Lys Met Pro Asp Val Ala Met
320 325 330
ACT CTT GCT GTG GTT GCC CTC TTT GCC GAT GGC CCG ACA GCC ATC AGA 1055
Thr Leu Ala Val Val Ala Leu Phe Ala Asp Gly Pro Thr Ala Ile Arg
335 340 345 350
GAC GTG GCT TCC TGG AGA GTA AAG GAG ACC GAG AGG ATG GTT GCG ATC 1103
Asp Val Ala Ser Trp Arg Vał Lys Glu Thr Glu Arg Met Val Ala Ile
355 360 365
CGG ACG GAG CTA ACC AAG CTG GGA GCA TCT GTT GAG GAA GGG CCG GAC 1151
Arg Thr Glu Leu Thr Lys Leu Gly Ala Ser Val Glu Glu Gly Pro Asp
370 375 380
TAC TGC ATC ATC ACG CCG CCG GAG AAG CTG AAC GTG ACG GCG ATC GAC 1199
Tyr Cys Ile Ile Thr Pro Pro Glu Lys Leu Asn Val Thr Ala Ile Asp
385 390 395
ACG TAC GAC GAC CAC AGG ATG GCC ATG GCC TTC TCC CTT GCC GCC TGT 1247
Thr Tyr Asp Asp His Arg Met Ala Met Ala Phe Ser Leu Ala Ala Cys
400 405 410
GCC GAG GTC CCC GTC ACC ATC CGG GAC CCT GGG TGC ACC CGG AAG ACC 1295
Ala Glu Val Pro Val Thr Ile Arg Asp Pro Gly Cys Thr Arg Lys Thr
415 420 425 430
TTC CCC GAC TAC TTC GAT GTG CTG AGC ACT TTC GTC AAG AAT 1337
Phe Pro Asp Tyr Phe Asp Val Leu Ser Thr Phe Val Lys Asn
435 440
TAA
1340
190 393
SEK. NR ID. 4
Ale Gly Ala Glu Glu 5 Ile Val Leu Gln Pro 10 Ile Lys Glu Ile Ser 15 Gly
Thr Val Lys Leu 20 Pro Gly Ser Lys Ser 25 Leu Ser Asn Arg Ile 30 Leu Leu
Leu Ala Ala 35 Leu Ser Glu Gly Thr 40 Thr Val Val Asp Asn 45 Leu Leu Asn
Ser Glu 50 Asp Val His Tyr Met 55 Leu Gly Ala Leu Arg 60 Thr Leu Gly Leu
Ser 65 Val Glu Ala Asp Lys 70 Ala Ala Lys Arg Ala 75 Val Val Val Gly Cys 80
Gly Gly Lys Phe Pro 85 Val Glu Asp Ala Lys 90 Glu Glu Val Gln Leu 95 Phe
Leu Gly Asn Ala 100 Gly Thr Ala Met Arg 105 Pro Leu Thr Ala Ala 110 Val Thr
Ala Ala Gly 115 Gly Asn Ala Thr Tyr 120 Val Leu Asp Gly Val 125 Pro Arg Met
Arg Glu 130 Arg Pro Ile Gly Asp 135 Leu Val Val Gly Leu 140 Lys Gln Leu Gly
Ala 145 Asp Val Asp Cys Phe 150 Leu Gly Thr Asp Cys 155 Pro Pro Val Arg Val 160
Asn Gly Ile Gly Gly 165 Leu Pro Gly Gly Lys 170 Val Lys Leu Ser Gly 175 Ser
Ile Ser Ser Gln 180 Tyr Leu Ser Ala Leu 185 Leu Met Ala Ala Pro 190 Leu Ala
Leu Gly Asp 195 Val Glu Ile Glu Ile 200 Ile Asp Lys Leu Ile 205 Ser Ile Pro
Tyr Val 210 Glu Met Thr Leu Arg 215 Leu Met Glu Arg Phe 220 Gly Val Lys Ala
Glu 225 His Ser Asp Ser Trp 230 Asp Arg Phe Tyr Ile 235 Lys Gly Gly Gln Lys 240
Tyr Lys Ser Pro Lys 245 Asn Ala Tyr Val Glu 250 Gly Asp Ala Ser Ser 255 Ala
Ser Tyr Phe Leu 260 Ala Gly Ala Ala Ile 265 Thr Gly Gly Thr Val 270 Thr Val
Glu Gly Cys 275 Gly Thr Thr Ser Leu 280 Gln Gly Asp Val Lys 285 Phe Ala Glu
Val Leu 290 Glu Met Met Gly Ala 295 Lys Val Thr Trp Thr 300 Glu Thr Ser Val
Thr 305 Val Thr Gly Pro Pro 310 Arg Glu Pro Phe Gly 315 Arg Lys His Leu Lys 320
Ala Ile Asp Val Asn 325 Met Asn Lys Met Pro 330 Asp Val Ala Met Thr 335 Leu
Ala Val Val Ala 340 Leu Phe Ala Asp Gly 345 Pro Thr Ala Ile Arg 350 Asp Val
190 393
SEK. NR ID. 4 (ciąg dalszy)
Ala Ser Trp Arg 355 Val Lys Glu Thr Glu Arg Met Val Ala Ile Arg Thr 360 365
Glu Leu Thr Lys 370 Leu Gly Ala Ser Val Glu Glu Gly Pro Asp Tyr Cys 375 380
Ile Ile Thr Pro 385 Pro Glu 390 Lys Leu Asn Val Thr Ala Ile Asp Thr Tyr 395 400
Asp Asp His Arg Met Ala 405 Met Ala Phe Ser Leu Ala Ala Cys Ala Glu 410 415
Val Pro Val Thr 420 Asp Tyr Phe Asp 435 Ile Arg Val Leu Asp Pro Gly Cys Thr Arg Lys Thr Phe Pro 425 430 Ser Thr Phe Val Lys Asn 440
190 393
SEK. NR ID. 5
CCATG GCC GGC GCC GAG GAG ATC GTG CTG CAG CCC ATC AAG GAG ATC 47
Ala Gly Ala Glu Glu Ile Val Leu Gln Pro Ile Lys Glu Ile
1 5 10
TCC GGC ACC GTC AAG CTG CCG GGG TCC AAG TCG CTT TCC AAC CGG ATC 95
Ser 15 Gly Thr Val Lys Leu 20 Pro Gly Ser Lys Ser 25 Leu Ser Asn Arg Ile 30
CTC CTA CTC GCC GCC CTG TCC GAG GGG ACA ACA GTG GTT GAT AAC CTG 143
Leu Leu Leu Ala Ala 35 Leu Ser Glu Gly Thr 40 Thr Val Val Asp Asn 45 Leu
CTG AAC AGT GAG GAT GTC CAC TAC ATG CTC GGG GCC TTG AGG ACT CTT 191
Leu Asn Ser Glu 50 Asp Val His Tyr Met 55 Leu Gly Ala Leu Arg 60 Thr Leu
GGT CTC TCT GTC GAA GCG GAC AAA GCT GCC AAA AGA GCT GTA GTT GTT 239
Gly Leu Ser 65 Val Glu Ala Asp Lys 70 Ala Ala Lys Arg Ala 75 Val Val Val
GGC TGT GGT GGA AAG TTC CCA GTT GAG GAT GCT AAA GAG GAA GTG CAG 287
Gly Cys 80 Gly Gly Lys Phe Pro 85 Val Glu Asp Ala Lys 90 Glu Glu Val Gln
CTC TTC TTG GGG AAT GCT GGA ATC GCA ATG CGG TCC TTG ACA GCA GCT 335
Leu 95 Phe Leu Gly Asn Ala 100 Gly Ile Ala Met Arg 105 Ser Leu Thr Ala Ala 110
GTT ACT GCT GCT GGT GGA AAT GCA ACT TAC GTG CTT GAT GGA GTA CCA 383
Val Thr Ala Ala Gly 115 Gly Asn Ala Thr Tyr 120 Val Leu Asp Gly Val 125 Pro
AGA ATG AGG GAG AGA CCC ATT GGC GAC TTG GTT GTC GGA TTG AAG CAG 431
Arg Met Arg Glu 130 Arg Pro Ile Gly Asp 135 Leu Val Val Gly Leu 140 Lys Gln
CTT GGT GCA GAT GTT GAT TGT TTC CTT GGC ACT GAC TGC CCA CCT GTT 479
Leu Gly Ala 145 Asp Val Asp Cys Phe 150 Leu Gly Thr Asp Cys 155 Pro Pro Val
CGT GTC AAT GGA ATC GGA GGG CTA CCT GGT GGC AAG GTC AAG CTG TCT 527
Arg Val 160 Asn Gly Ile Gly Gly 165 Leu Pro Gly Gly Lys 170 Val Lys Leu Ser
GGC TCC ATC AGC AGT CAG TAC TTG AGT GCC TTG CTG ATG GCT GCT CCT 575
Gly 175 Ser Ile Ser Ser Gln 180 Tyr Leu Ser Ala Leu 185 Leu Met Ala Ala Pro 190
TTG GCT CTT GGG GAT GTG GAG ATT GAA ATC ATT GAT AAA TTA ATC TCC 623
Leu Ala Leu Gly Asp 195 Val Glu Ile Glu Ile 200 Ile Asp Lys Leu Ile 205 Ser
ATT CCG TAC GTC GAA ATG ACA TTG AGA TTG ATG GAG CGT TTT GGT GTG 671
Ile Pro Tyr Val 210 Glu Met Thr Leu Arg 215 Leu Met Glu Arg Phe 220 Gly Val
AAA GCA GAG CAT TCT GAT AGC TGG GAC AGA TTC TAC ATT AAG GGA GGT 719
Lys Ala Glu 225 His Ser Asp Ser Trp 230 Asp Arg Phe Tyr Ile 235 Lys Gly Gly
CAA AAA TAC AAG TCC CCT AAA AAT GCC TAT GTT GAA GGT GAT GCC TCA 767
Gln Lys 240 Tyr Lys Ser Pro Lys 245 Asn Ala Tyr Val Glu 250 Gly Asp Ala Ser
190 393
SEK. NR ID. 5 (ciąg dalszy)
AGC Ser 255 GCA AGC TAT TTC TTG GCT GGT Ala Gly GCT GCA ATT ACT GGA GGG ACT GTG 815
Ala Ser Tyr Phe Leu 260 Ala Ala Ile 265 Thr Gly Gly Thr Val 270
ACT GTG GAA GGT TGT GGC ACC ACC AGT TTG CAG GGT GAT GTG AAG TTT 863
Thr Val Glu Gly Cys Gly Thr Thr Ser Leu Gln Gly Asp Val Lys Phe
270 275 280 285
GCT GAG GTA CTG GAG ATG ATG GGA GCG AAG GTT ACA TGG ACC GAG ACT 911
Ala Glu Val Leu Glu Met Met Gly Ala Lys Val Thr Trp Thr GlU Thr
290 295 300
AGC GTA ACT GTT ACT GGC CCA CCG CGG GAG CCA TTT GGG AGG AAA CAC 959
Ser Val Thr Val Thr Gly Pro Pro Arg Glu Pro Phe Gly Arg Lys His
305 310 315
CTC AAG GCG ATT GAT GTC AAC ATG AAC AAG ATG CCT GAT GTC GCC ATG 1007
Leu Lys Ala Ile Asp Val Asn Met Asn Lys Met Pro Asp Val Ala Met
320 325 330
ACT CTT GCT GTG GTT GCC CTC TTT GCC GAT GGC CCG ACA GCC ATC AGA 1055
Thr Leu Ala Val Val Ala Leu Phe Ala Asp Gly Pro Thr Ala Ile Arg
335 340 345 350
GAC GTG GCT TCC TGG AGA GTA AAG GAG ACC GAG AGG ATG GTT GCG ATC 1103
Asp Val Ala Ser Trp Arg Val Lys Glu Thr /-'I .. u Arg Met Val Ala Ile
355 360 365
CGG ACG GAG CTA ACC AAG CTG GGA GCA TCT GTT GAG GAA GGG CCG GAC 1151
Arg Thr Glu Leu Thr Lys Leu Gly Ala Ser Val Glu Glu Gly Pro Asp
370 375 380
TAC TGC ATC ATC ACG CCG CCG GAG AAG CTG AAC GTG ACG GCG ATC GAC 1199
Tyr Cys Ile Ile Thr Pro Pro Glu Lys Leu Asn Val Thr Ala Ile Asp
385 390 395
ACG TAC GAC GAC CAC AGG ATG GCG ATG GCC TTC TCC CTT GCC GCC TGT 1247
Thr Tyr Asp Asp His Arg Met Ala Met Ala Phe Ser Leu Ala Ala Cys
400 405 410
GCC GAG GTC CCC GTC ACC ATC CGG GAC CCT GGG TGC ACC CGG AAG ACC 1295
Ala Glu Val Pro Val Thr Ile Arg Asp Pro Gly Cys Thr Arg Lys Thr
415 420 425 430
TTC CCC GAC TAC TTC GAT GTG CTG AGC ACT TTC GTC AAG AAT 1337
Phe Pro Asp Tyr Phe Asp Val Leu Ser Thr Phe Val Lys Asn
435 440
TAA
1340
190 393
SEK.NR ID. 6
Ala 1 Gly Ala Glu Glu 5 Ile Val Leu Gln Pro 10 Ile Lys Glu Ile Ser 15 Gly
Thr Val Lys Leu 20 Pro Gly Ser Lys Ser 25 Leu Ser Asn Arg Ile 30 Leu Leu
Leu Ala Ala 35 Leu Ser Glu Gly Thr 40 Thr Val Val Asp Asn 45 Leu Leu Asn
Ser Glu 50 Asp Val His Tyr Met 55 Leu Gly Ala Leu Arg 60 Thr Leu Giy Leu
Ser 65 Val Glu Ala Asp Lys 70 Ala Ala Lys Arg Ala 75 Val Val Val Gly cys 80
Gly Gly Lys Phe Pro 85 Val Glu Asp Ala Lys 90 Glu Glu Val Gln Leu 95 Phe
Leu Gly Asn Ala 100 Gly Ile Ala Met Arg 105 Ser Leu Thr Ala Ala 110 Val Thr
Ala Ala Gly Gly 115 Asn Ala Thr Tyr 120 Val Leu Asp Gly Val 125 Pro Arg Met
Arg Glu 130 Arg Pro Ile Gly Asp 135 Leu Val Val Gly Leu 140 Lys Gln Leu Gly
Ala 145 Asp Val Asp Cys Phe 150 Leu Gly Thr Asp Cys 155 Pro Pro Val Arg Val 160
Asn Gly Ile Gly Gly 165 Leu Pro Gly Gly Lys 170 Val Lys Leu Ser Gly 175 Ser
Ile Ser Ser Gln 180 Tyr Leu Ser Ala Leu 185 Leu Met Ala Ala Pro 190 Leu Ala
Leu Gly Asd 195 Val Glu Ile Glu Ile 200 Ile Asp Lys Leu Ile 205 Ser Ile Pro
Tyr Val 210 Glu Met Thr Leu Arg 215 Leu Met Glu Arg Phe 220 Gly Val Lys Ala
Glu 225 His Ser Asp Ser Trp 230 Asp Arg Phe Tyr Ile 235 Lys Gly Gly Gln Lys 240
Tyr Lys Ser Pro Lys 245 Asn Ala Tyr Val Glu 250 Gly Asp Ala Ser Ser 255 Ala
Ser Tyr phe Leu 260 Ala Gly Ala Ala Ile 265 Thr Gly Gly Thr Val 270 Thr Val
Glu Gly Cys 275 Gly Thr Thr Ser Leu 280 Gln Gly Asp Val Lys 285 Phe Ala Glu
Val Leu 230 Glu Met Met Gly Ala 295 Lys Val Thr Trp Thr 300 Glu Thr Ser Val
Thr 305 Val Thr Gly Pro Pro 310 Arg Glu Pro Phe Gly 315 Arg Lys His Leu Lys 320
Ala Ile Asp Val Asn Met Asn Lys Met Pro Asp Val Ala Met Thr Leu
325 330 335
Ala Val Val Ala Leu Phe Ala Asp Gly Pro Thr Ala Ile Arg Asp Val 340 345 350
190 393
SEK.NR ID.6 (ciąg dalszy)
Ala Ser Trp 355 Arg Val Lys Glu Thr 360 Glu Arg Met Val Ala 365 Ile Arg Thr
Glu Leu 370 Thr Lys Leu Gly Ala 375 Ser Val Glu Glu Gly 380 Pro Asp Tyr Cys
Ile 385 Ile Thr Pro Pro Glu 390 Lys Leu Asn Val Thr 395 Ala Ile Asp Thr Tyr 400
Asp Asp His Arg Met 405 Ala Met Ala Phe Ser 410 Leu Ala Ala Cys Ala 415 Glu
Val Pro Val Thr 420 Ile Arg Asp Pro Gly 425 Cys Thr Arg Lys Thr 430 Phe Pro
Asp Tyr Phe Asp Val Leu Ser Thr Phe Val Lys Asn
435 440
190 393
Fig 2
190 393 φ φ σι
Φ Φ<Λ φ φ σ» ©σ» ΙΠ ΜΦ
Φ <Μ β> σ» φ σ> <Μ «Η φ ©σι <λ unt γμ ww
.5?
υ \ω
Ο
C
Ό
Ο άϋ
Ν
Ό
Φ
Ν
0)
Ν
Ο ° I 31 c
(0
Γ3
Ο
C φ
Λί
Φ ω
ο κω ο
C
Ό
Ο ίώ
Ν
Ό
Φ
Ν
W •Μ >» *
Ό
Φ
C
Φ
Ό ϋ
C
Φ
Λί
Φ
C0
• *» 0.0.
οο.<£ φ
Ν
W
Ν >»
Ό <α c
φ •ο ο
c φ
2Ć
Φ
W
Ο
Φ
C
Φ
Ο ο
c
Φ «
Φ ω
ο υ
c φ
Φ ω
190 393 ο α» en © ©σ» m m rst m tnm ¢0 «Ν <Λ ΙΛ ΙΛ
ΓΊ .£Ρ <0
Ό hfl αΤ •Η
Ο ο
ν«
Ο
C η
ο h0
Ν
Τ3 φ
Ν (0 •Ν >χ ϊ
Ό
C <0
Ό ϋ
C
Φ *
Λί
Φ ω
>0 ή. Μ
C » C
ο V
υ 3 Μ 5 ·τ4 Ο u «1 φ
«. *» \to b
ο 9 g ο ο α ο 9
Ό
Ο *0
Ν
CU g
Cl ο§ ** ο*8 §εΐ sM
Γ3
Φ ¢4 ϋΐ •Ν >>
* ό
φ
C
TU.O.
Φ
Ν
Ν >* •ο φ
C (0 ο
ο
C φ
X φ
ω
Φ
Τ) ο
C φ
2*ί
Φ ω
190 393
ΙΛ &
<η s?
3“ η
ιη tn ts.
u>
Z M . s z m
i g* M
X M fc >· MM > <
C9
t*.
M
M M oc o
V
M <
oe
Stu z
y <=t δ
ut >-
er Ul at
3~
OO {X,
z jK VI
F
5W 2H 3 u> £ *« χ
B:
M
V O.
z wr \a >3 Q
Z
M
MO.
Z
S-*
3H δχ
M
WT <
tn
3c *a
190 393
CĆ fić z
3 Ul 3 o* o X AC
z <Λ g B
V»
V\ VI gu 3 >- o*
<d <d<d 3ui 3 £3
>- 5C
3 o Pu. O 25 ee
<0
TJ hO &β • «M
UJ 3 o fc*J 3q o id id
ps δ S « «<
u/1 5* id <d 3C
w id td o 5 X CC
Departament Wydawnictw UP RP Nakład 50 egz. Cena 6,00 zł

Claims (33)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Konstrukt chimerowy zawierający gen elementarny, z elementami regulatorowymi potrzebnymi do jego transkrypcji w roślinach i sekwencją kodującą enzym nadający roślinom oporność na herbicyd, znamienny tym, ze dodatkowo zawiera drugi gen elementarny z elementami regulatorowymi potrzebnymi do jego ekspresji w roślinach i sekwencją kodującą enzym nadający roślinom oporność na herbicyd, przy czym jedna z sekwencji kodujących tego konstruktu koduje hydroksyfenylodioksygenazę pirogronianową (HPPD).
  2. 2. Konstrukt chimerowy według zastrz. 1, znamienny tym, ze druga sekwencja kodująca pochodzi z genu nitrylazy Klebsiella sp. i nadaje roślinom oporność na herbicyd z rodziny dichlorowcohydroksybenzylonitryli.
  3. 3. Konstrukt chimerowy według zastrz. 2, znamienny tym, ze herbicyd jest bromoksymlem.
  4. 4. Konstrukt chimerowy według zastrz. 2, znamienny tym, ze herbicyd jest oksynilem.
  5. 5 Konstrukt chimerowy według zastrz. 1, znamienny tym, ze druga sekwencja kodująca koduje enzym oporności na ghfozat.
  6. 6. Konstrukt chimerowy według zastrz. 1, znamienny tym, ze druga sekwencja kodująca koduje EPSPS nadając oporność na herbicyd hamujący EPSPS.
  7. 7 Konstrukt chimerowy według zastrz. 6, znamienny tym, ze druga sekwencja kodująca koduje EPSPS nadając oporność na glifozat.
  8. 8. Konstrukt chimerowy według zastrz. 5, znamienny tym, ze druga sekwencja kodująca koduje oksydoreduktazę glifozatu, enzym detoksyfikacji glifozatu
  9. 9. Konstrukt chimerowy według zastrz. 1, znamienny tym, ze sekwencja kodująca HPPD pochodzi od Pseudomonas sp.
  10. 10. Konstrukt chimerowy według zastrz. 9, znamienny tym, ze sekwencja kodująca HPPD pochodzi od Pseudomonas fluorescens.
  11. 11. Konstrukt chimerowy według zastrz. 1, znamienny tym, ze sekwencja kodująca HPPD pochodzi z rośliny.
  12. 12 Konstrukt chimerowy według zastrz. 11, znamienny tym, ze sekwencja kodująca HPPD pochodzi z Arabidopsis thahana.
  13. 13. Konstrukt chimerowy według zastrz. 11, znamienny tym, ze sekwencja kodująca HPPD pochodzi od Daucus carota.
  14. 14. Wektor, znamienny tym, ze zawiera konstrukt chimerowy określony w zastrz. 1
  15. 15. Wektor według zastrz. 14, znamienny tym, ze jest plazmidem.
  16. 16. Komórka roślinna, znamienna tym, ze zawiera dwa elementarne geny chimerowe, z których każdy zawiera sekwencję kodującą enzym nadający roślinom oporność na herbicyd, i z których jeden jest genem kodującym inhibitor hydroksyfenylodioksygenazy pirogronianowej.
  17. 17 Komórka roślinna według zastrz. 16, znamienna tym, ze zawiera przynajmniej jeden konstrukt chimerowy określony w zastrz. 1.
  18. 18. Roślina, znamienna tym, że zawiera komórkę roślinną określoną w zastrz. 16.
  19. 19. Sposób nadawania oporności na herbicydy roślinom przez ich transformację, znamienny tym, ze wprowadza się do komórki roślinnej konstrukt chimerowy określony w zastrz. 1 i transformowane komórki poddaje się regeneracji.
  20. 20. Sposób uzyskiwania roślin określonych w zastrz. 18 o tolerancji na wiele herbicydów, znamienny tym, ze:
    - w pierwszym etapie wprowadza się do poszczególnych komórek odpowiednio jeden z genów elementarnych, z których każdy zawiera elementy regulatorowe potrzebne do jego
    190 393 transkrypcji w roślinach i sekwencję kodującą, która koduje enzym nadający roślinom oporność na herbicyd i
    - następnie rośliny krzyzuje się, aby uzyskać rośliny o wielorakiej oporności.
  21. 21 Sposób działania herbicydem na rośliny określone w zastrz. 18, znamienny tym, ze stosuje się dwa herbicydy.
  22. 22. Sposób według zastrz. 21, znamienny tym, ze stosuje się przynajmniej trzy herbicydy
  23. 23. Sposób według zastrz. 21 albo 22, znamienny tym, ze jeden z herbicydów jest inhibitorem HPPD.
  24. 24. Sposób według jednego z zastrz. 21 albo 22, znamienny tym, ze herbicydy stosuje się równocześnie.
  25. 25. Sposób według zastrz. 24, znamienny tym, że herbicydy stosuje się w postaci jednej kompozycji gotowej do użycia.
  26. 26 Sposób według zastrz 25, znamienny tym, ze herbicydy stosuje się w postaci mieszaniny przygotowanej przed użyciem.
  27. 27. Sposób według jednego z zastrz. 21 albo 22, znamienny tym, ze herbicydy są podawane kolejno.
  28. 28. Sposób według zastrz. 23, znamienny tym, ze herbicyd, który jest inhibitorem HPPD jest izoksaflutolem.
  29. 29. Sposób według zastrz. 23, znamienny tym, ze herbicyd, który jest inhibitorem HPPD jest sulkotrionem.
  30. 30. Sposób według jednego z zastrz. 21 albo 22, znamienny tym, że drugi herbicyd należy do rodziny dihydrogenohydroksybenzonitryli.
  31. 31. Sposób według zastrz. 30, znamienny tym, ze herbicyd jest wybrany z grupy zawierającej bromoksynil i joksynil.
  32. 32. Sposób według zastrz. 21 albo 22, znamienny tym, ze drugi herbicyd jest inhibitorem EPSPS .
  33. 33 Sposób według zastrz. 32, znamienny tym, ze inhibitorem EPSPS jest glifozat lub sulfozat.
    Niniejszy wynalazek dotyczy konstruktu chimerowego zawierającego gen chimerowy elementarny, wektora, komórki roślinnej, rośliny, sposobu nadawania oporności na herbicydy roślinom przez ich transformację, sposobu uzyskiwania roślin o tolerancji na wiele herbicydów oraz sposobu działania herbicydem na rośliny.
    W pozostałej części opisu herbicydy będą określane za pomocą nazw popularnych w szczególności podanych w „The Pesticide Manuał” 10 wydanie, British Crop Protection Council.
    Znane są rośliny, które transformowano, aby nadać im oporność na pewne herbicydy w szczególności dichłorowcohydroksybenzonitryle, w szczególności bromoksynil i oksynil, które dzięki genowi kodującemu nitrylazę degradują te herbicydy lub rośliny, które tolerują herbicydy hamujące EPSPS w szczególności glifozat, sulfozat lub fozametynę lub, które tolerują herbicydy inhibitory syntazy acetyłomleczanowej (ALS) typu sulfomoczników lub inhibitory syntazy dihydropterynianowej takie jak asulam lub tez inhibitory syntazy glutaminowej takie jak glufozynat.
    Znane są mektóic heiuicydy takie jak izoksazole opisane na przykład we francuskich zgłoszeniach patentowych 95 06800 i 95 13570 i w szczególności izoksaflutol, wybiórczy herbicyd kukurydzy, diketonitryle takie jak opisane w zgłoszeniach europejskich 0 496 630, 0 496 631, w szczególności 2-cyjano-3-cyklopropylo-1-(2-S02CH3-4-CF3-fenylo) propano-l,3-dion i 2-cyjano-3-cyklopropylo-1-(2-S^2 CH2-4-2,3-Cl2 fen_\T))propano-l,3-dion, tnketony opisane w zgłoszeniach europejskich 0 625 505 i 0 625 508, w szczególności sulkotrion lub jeszcze opisane w opisie patentowym 5 506 195 lub jeszcze pirazoliniany. Ponadto został wyizolowany gen kodujący HPPD nadający oporność na te ostatnie herbicydy i otrzy4
    190 393 mano rośliny transgeniczne, które go zawierają i wykazują znaczącą oporność i stanowią przedmiot nie opublikowanych francuskich zgłoszeń patentowych nr 95/06800, 95/13570 i 96/05944
    Jednak praktyka rolnicza wykazuje, że rolnicy chętnie stosują na rośliny, a w szczególności na hodowle, kombinacje herbicydów, zwłaszcza, gdy występują różne problemy odchwaszczania związane z zakresem działania herbicydów stosowanych pojedynczo. Poza tym może być interesujące posiadanie genu markera selekcji związanego z genem oporności na herbicyd. Istnieje, więc, zapotrzebowanie na rośliny, a w szczególności na hodowle wykazujące oporność na kilka herbicydów, korzystnie przynajmniej dwa lub trzy.
    Obecnie ujawniono, ze można nadać komórce roślinnej i roślinie oporność na wiele herbicydów
    Przedmiotem niniejszego wynalazku jest konstrukt chimerowy zawierający gen elementarny, z elementami regulatorowymi potrzebnymi do jego transkrypcji w roślinach i sekwencją kodującą enzym nadający roślinom oporność na herbicyd, który dodatkowo zawiera drugi gen elementarny z elementami regulatorowymi potrzebnymi do jego ekspresji w roślinach i sekwencją kodującą enzym nadający roślinom oporność na herbicyd, przy czym jedna z sekwencji kodujących tego konstruktu koduje hydroksyfenylodioksygenazę pirogronianową(HPPD).
    Jako drugą sekwencję kodującą konstruktu chimerowego według wynalazku można w korzystnych wykonaniach w szczególności stosować sekwencje, o których wiadomo, ze nadają roślinie oporność na pewne inhibitory takie jak:
    - sekwencja genu nitrylazy Klebsiella sp. dla oporności na dichlorowcobenzonitryle opisaną w opisie patentowym USA 481-648 i w szczególności pochodzącą z Klebsiella ozaenae, która będzie dalej określana jako gen lub sekwencja „OXY”. W korzystnym wykonaniu wynalazku herbicyd ten jest bromoksynilem, korzystniej oksynilem.
    - sekwencja kodująca enzym oporności na glifozat, korzystnie kodująca oksydoreduktazę glifozatu (patrz WO 92/00 377), enzym detoksyfikacji glifozatu
    - sekwencja EPSPS nadająca oporność na herbicyd hamujący EPSPS, taki jak glifozat, sulfozat i fozometyna korzystnie nadająca oporność na glifozat, w szczególności sekwencja białka zmutowanego lub niezmutowanego, zwłaszcza wymieniona w patentach:
    USP 4 535 060, EP 115 673, USP 4 769 061, USP 5 094 945, USP 4 971 908, USP 5 145 783, EP 293 358, EP 378 985 WO 91/04323; WO 92 044 449, WO 92 06201 Dalej, ten typ genu będzie określany jako sekwencja lub gen „EPSPS”.
    W korzystnym wykonaniu konstruktu chimerowego według wynalazku sekwencja HPPD jest taka jak opisana w nieopublikowanych francuskich zgłoszeniach patentowych nr 95/06800, 95/13570 i 96/05944 cytowanych powyżej, ta sekwencja HPPD może być dowolnego typu, szczególnie korzystnie jest pochodzenia bakteryjnego, a w szczególności z rodzaju Pseudomonas, korzystniej pochodzi od Pseudomonas fluorescens lub tez jest pochodzenia roślinnego i korzystnie pochodzi z Arabidopsis thaliana lub od marchewki (Daucus carota). Mozę być natywna lub dzika łub ewentualnie zmutowana z zachowaniem podstawowej zdolności oporności na herbicydy w stosunku do inhibitorów HPPD, takich jak herbicydy z rodziny izoksazoli lub triketonów lub pirazolinianów.
    Mogą być stosowane inne sekwencje:
    - acetylotransferazy fosfinotricyny lub syntazy glutaminowej dla oporności na glufozynat (p. EP 0 242 236)
    - syntazy dihydropterynianow^ej dla oporności na asulam (p EP 0 369 367)
    - ALS dla oporności na sulfonylomoczniki
    - oksydazy piotopoiiliogenu („Pi0t0x”) ula oporności na herbicydy z rodziny difenyioeterów takich jak acifluorofen lub oksadiazoli takich jak oksadiazon lub oksadiargil lub imidów cyklicznych takich jak chloroftalim lub fenylopirazoli takich jak TNP lub pirydyn i fenopilanów i analogów karbaminianów (p. WO 95/34659).
    Konstrukty chimerowe mogą dodatkowo zawierać geny kodujące właściwości inne niz oporność na herbicydy, takie jak na przykład geny oporności na owady, takie jak typu Bacillus thuringensis nadające oporność na różnych przedstawicieli rodziny tęgopokrywych, motyli, lub jeszcze geny nadające właściwości agronomiczne, takie jak geny różnych desaturaz biorą190 393 cych udział w produkcji kwasów tłuszczowych. Można na przykład wymienić w szczególności delta-6-desaturazę opisaną w międzynarodowym zgłoszeniu WO 93/06712.
    Jako sekwencje regulatorową promotora można uzyć każdą sekwencję promotora genu naturalnie ulegającego ekspresji w roślinach, w szczególności promotor pochodzący z bakterii, wirusów lub roślin, taki jak na przykład promotor genu małej podjednostki rybulozo-biskarboksylazy (RuBisCO) lub genu a tubuliny (zgłoszenie europejskie EP Nr 0 652 286) lub genu wirusa roślinnego, takiego jak na przykład wirus mozaiki kalafiora (CaMV 19S lub 35S), ale może być stosowany każdy odpowiedni znany promotor. Korzystnie wykorzystuje się sekwencję regulatorową promotora, która sprzyja nadekspresji sekwencji kodującej, taką jak na przykład zawierającą przynajmniej jeden promotor histonu, taki jak opisano w zgłoszeniu europejskim EP 0507698.
    Według wynalazku można także stosować w połączeniu z regulatorową sekwencją promotora inne sekwencje regulatorowe, które są położone pomiędzy promotorem i sekwencją kodującą takie jak aktywatory transkrypcji „enhancery”, jak na przykład aktywator translacji wirusa „etch” tytoniu (TEV) opisanego w zgłoszeniu WO 87/07644 lub peptydów sygnałowych, albo prostych albo podwójnych i w tym przypadku ewentualnie rozdzielonych przez sekwencję pośrednią, to znaczy zawierających w kierunku transkrypcji, sekwencję kodującą peptyd sygnałowy genu roślinnego kodującego enzym o lokalizacji plastydowej, część sekwencji dojrzałego N-końca genu roślinnego kodującego enzym o lokalizacji plastydowej, a następnie sekwencję kodującą drugi peptyd sygnałowy genu roślinnego kodującego enzym o lokalizacji plastydowej, złożonej z części sekwencji części dojrzałej N końca genu roślinnego kodującego enzym o lokalizacji plastydowej takie jak opisano w europejskim zgłoszeniu nr 0 508 909.
    Jako sekwencję regulatorową terminacji lub poliadenylacji można stosować każdą odpowiednią sekwencję pochodzenia bakteryjnego, jak na przykład terminator nos Agrobacterium tumefaciens, również pochodzenia roślinnego, jak na przykład terminator histonu m, taki jak opisano w zgłoszeniu europejskim EP nr 0 633 317.
    Wektor zawierający konstrukt chimerowy według wynalazku jest również przedmiotem wynalazku. W korzystnym wykonaniu wynalazku wektor jest plazmidem.
PL97331165A 1996-07-16 1997-07-10 Konstrukt chimerowy zawierający gen chimerowy elementarny, wektor, komórka roślinna, roślina, sposób nadawania oporności na herbicydy roślinom, sposób uzyskiwania roślin o tolerancji na wiele herbicydów oraz sposób działania herbicydem na rośliny PL190393B1 (pl)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR9609137A FR2751347B1 (fr) 1996-07-16 1996-07-16 Gene chimere a plusieurs genes de tolerance herbicide, cellule vegetale et plante tolerantes a plusieurs herbicides
PCT/FR1997/001256 WO1998002562A2 (fr) 1996-07-16 1997-07-10 Gene chimere a plusieurs genes de tolerance herbicide, cellule vegetale et plante tolerantes a plusieurs herbicides

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL331165A1 PL331165A1 (en) 1999-06-21
PL190393B1 true PL190393B1 (pl) 2005-12-30

Family

ID=9494283

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL97331165A PL190393B1 (pl) 1996-07-16 1997-07-10 Konstrukt chimerowy zawierający gen chimerowy elementarny, wektor, komórka roślinna, roślina, sposób nadawania oporności na herbicydy roślinom, sposób uzyskiwania roślin o tolerancji na wiele herbicydów oraz sposób działania herbicydem na rośliny

Country Status (20)

Country Link
US (5) US7250561B1 (pl)
EP (1) EP0937154A2 (pl)
JP (1) JP2000517166A (pl)
KR (1) KR20000023830A (pl)
CN (1) CN1154741C (pl)
AR (1) AR007884A1 (pl)
AU (1) AU734878B2 (pl)
BR (2) BRPI9710340B8 (pl)
CA (1) CA2261094C (pl)
CO (1) CO4770898A1 (pl)
CU (1) CU22809A3 (pl)
CZ (1) CZ11399A3 (pl)
EA (2) EA003140B1 (pl)
FR (1) FR2751347B1 (pl)
HU (1) HU223788B1 (pl)
NZ (1) NZ334188A (pl)
PL (1) PL190393B1 (pl)
TR (1) TR199900117T2 (pl)
WO (1) WO1998002562A2 (pl)
ZA (1) ZA976296B (pl)

Families Citing this family (114)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2736926B1 (fr) * 1995-07-19 1997-08-22 Rhone Poulenc Agrochimie 5-enol pyruvylshikimate-3-phosphate synthase mutee, gene codant pour cette proteine et plantes transformees contenant ce gene
IL129707A0 (en) * 1996-11-07 2000-02-29 Zeneca Ltd Herbicide resistant plants
US6900012B1 (en) 1997-06-03 2005-05-31 The University Of Chicago Plant artificial chromosome compositions and methods
US7235716B2 (en) 1997-06-03 2007-06-26 Chromatin, Inc. Plant centromere compositions
US7193128B2 (en) 1997-06-03 2007-03-20 Chromatin, Inc. Methods for generating or increasing revenues from crops
US7227057B2 (en) 1997-06-03 2007-06-05 Chromatin, Inc. Plant centromere compositions
US7119250B2 (en) 1997-06-03 2006-10-10 The University Of Chicago Plant centromere compositions
ZA986574B (en) * 1997-07-23 2000-01-12 Sanford Scient Inc Improved plastid transformation of higher plants and production of transgenic plants with herbicide resistance.
US7161064B2 (en) 1997-08-12 2007-01-09 North Carolina State University Method for producing stably transformed duckweed using microprojectile bombardment
US6069115A (en) * 1997-11-12 2000-05-30 Rhone-Poulenc Agrochimie Method of controlling weeds in transgenic crops
FR2771104B1 (fr) * 1997-11-17 2000-12-08 Rhone Poulenc Agrochimie Gene chimere ayant un promoteur lumiere dependant conferant la tolerance aux inhibiteurs del'hppd
JP4788011B2 (ja) * 1998-04-30 2011-10-05 住友化学株式会社 雑草防除剤耐性の付与方法
ATE375712T1 (de) 1998-08-04 2007-11-15 Cargill Inc Promotoren der fettsäure-desaturase aus pflanzen
DE19836673A1 (de) 1998-08-13 2000-02-17 Hoechst Schering Agrevo Gmbh Herbizide Mittel für tolerante oder resistente Zuckerrübenkulturen
FR2785148B1 (fr) * 1998-11-02 2000-12-15 Rhone Poulenc Agrochimie Nouvelles compositions herbicide a base de glyphosate et d'isoxazoles
JP4570706B2 (ja) * 1999-03-09 2010-10-27 バイエルクロップサイエンス株式会社 水田雑草の防除方法
US7989202B1 (en) 1999-03-18 2011-08-02 The University Of Chicago Plant centromere compositions
JP4821038B2 (ja) * 1999-10-29 2011-11-24 住友化学株式会社 除草剤耐性植物
WO2002020741A1 (fr) * 2000-09-08 2002-03-14 Bayer Cropscience Sa Hydroxy-phenyl pyruvate dioxygenase fusionnee a un peptide signal, sequence d'adn et obtention de plantes contenant un tel gene, tolerantes aux herbicides
CA2434059C (en) 2001-02-22 2011-05-24 Rhobio Constitutive promoter from arabidopsis
BR0211610A (pt) 2001-08-09 2006-04-04 Northwest Plant Breeding Compa mudas de trigo com maior resistência a herbicidas de imidazolinona
CA2557644C (en) 2004-02-23 2016-05-24 Chromatin, Inc. Plants modified with mini-chromosomes
AU2005235111B2 (en) 2004-03-30 2010-10-28 Monsanto Technology Llc Methods for controlling plant pathogens using N-phosphonomethylglycine
ES2389843T3 (es) * 2004-04-30 2012-11-02 Dow Agrosciences Llc Nuevos genes de resistencia a herbicidas
CA2621874C (en) 2005-09-08 2014-12-16 Chromatin Inc. Plants modified with mini-chromosomes
CA2628263C (en) * 2005-10-28 2016-12-13 Dow Agrosciences Llc Aryloxyalkanoate auxin herbicide resistance genes and uses thereof
PL2465340T3 (pl) * 2006-01-12 2015-05-29 Cibus Europe Bv Mutanty EPSPS
US20100257621A1 (en) * 2006-10-03 2010-10-07 Monsanto Technology Llc Methods for Hybrid Corn Seed Production and Compositions Produced Therefrom
JP5563825B2 (ja) * 2006-12-07 2014-07-30 ダウ アグロサイエンシズ リミテッド ライアビリティー カンパニー 選択マーカー遺伝子
US8614089B2 (en) 2007-03-15 2013-12-24 Chromatin, Inc. Centromere sequences and minichromosomes
AR066787A1 (es) * 2007-05-30 2009-09-09 Syngenta Participations Ag Genes del citocromo p450 que confieren resistencia a los herbicidas
US8097712B2 (en) 2007-11-07 2012-01-17 Beelogics Inc. Compositions for conferring tolerance to viral disease in social insects, and the use thereof
CL2009001048A1 (es) * 2008-05-02 2010-10-01 Pioneer Hi Bred Int Metodo para producir lineas endogamicas de maiz con rasgos de alta pureza, y procedimiento para generar semillas hibridas de maiz.
US20110195845A1 (en) * 2008-06-11 2011-08-11 Dow Agrosciences Llc Constructs for Expressing Herbicide Tolerance Genes, Related Plants, and Related Trait Combinations
GB0816880D0 (en) * 2008-09-15 2008-10-22 Syngenta Ltd Improvements in or relating to organic compounds
WO2010135324A1 (en) * 2009-05-18 2010-11-25 Monsanto Technology Llc Use of glyphosate for disease suppression and yield enhancement in soybean
AU2010275448B2 (en) 2009-07-23 2014-03-06 Chromatin, Inc. Sorghum centromere sequences and minichromosomes
US8962584B2 (en) 2009-10-14 2015-02-24 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem, Ltd. Compositions for controlling Varroa mites in bees
RU2639520C2 (ru) 2009-11-23 2017-12-21 Байер Кропсайенс Н.В. Растения сои, устойчивой к гербицидам, и способы их идентификации
JP2013511293A (ja) * 2009-11-23 2013-04-04 バイエル・クロップサイエンス・エヌ・ヴェー 優良イベントｅｅ−ｇｍ３及び生物学的試料におけるそのようなイベントを識別するための方法及びキット
EP2504442B1 (en) 2009-11-24 2014-07-16 Katholieke Universiteit Leuven, K.U. Leuven R&D Banana promoters
AU2010334815B2 (en) * 2009-12-23 2015-07-09 Bayer Intellectual Property Gmbh Plants tolerant to HPPD inhibitor herbicides
EP2516635B1 (en) * 2009-12-23 2017-11-15 Bayer Intellectual Property GmbH Plants tolerant to hppd inhibitor herbicides
CA2785126C (en) * 2009-12-23 2019-07-02 Bayer Intellectual Property Gmbh Plants tolerant to hppd inhibitor herbicides
BR112012015706A2 (pt) * 2009-12-23 2015-09-01 Bayer Ip Gmbh Plantas tolerantes a herbicidas inibidores de hppd
WO2011076882A1 (en) * 2009-12-23 2011-06-30 Bayer Cropscience Ag Plants tolerant to hppd inhibitor herbicides
JP2010070578A (ja) * 2010-01-05 2010-04-02 Rhone Poulenc Yuka Agro Kk 水田雑草の防除方法
EP2545182B1 (en) 2010-03-08 2017-05-03 Monsanto Technology LLC Polynucleotide molecules for gene regulation in plants
AU2011289286B2 (en) 2010-08-13 2015-02-12 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods and compositions for targeting sequences of interest to the chloroplast
US20140056908A1 (en) * 2010-10-08 2014-02-27 Fraunhofer Usa Inc. Closterovirus-based nucleic acid molecules and uses thereof
BR112013013377A2 (pt) * 2010-12-03 2016-11-22 Ms Technologies Llc molécula de ácido nucléico codificante de uma sintase de ácido 5-enolpiruvil-3-fosfo-chiquímico (epsps), constructo, vetor, célula de planta, planta, método para produzir uma planta tendo
KR101856272B1 (ko) * 2010-12-28 2018-05-10 가부시키가이샤 에스디에스 바이오텍크 4-hppd 억제제에 대한 저항성 또는 감수성이 높은 식물
US10829828B2 (en) 2011-09-13 2020-11-10 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for weed control
CN103975068A (zh) 2011-09-13 2014-08-06 孟山都技术公司 用于杂草控制的方法和组合物
US9840715B1 (en) 2011-09-13 2017-12-12 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for delaying senescence and improving disease tolerance and yield in plants
EP3382027A3 (en) 2011-09-13 2018-10-31 Monsanto Technology LLC Methods and compositions for weed control
MX350774B (es) 2011-09-13 2017-09-15 Monsanto Technology Llc Métodos y composiciones para el control de malezas.
US10806146B2 (en) 2011-09-13 2020-10-20 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for weed control
WO2013040057A1 (en) 2011-09-13 2013-03-21 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for weed control
CA2848576A1 (en) 2011-09-13 2013-03-21 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for weed control comprising topical application of 4-hydroxyphenyl-pyruvate-dioxygenase (hppd)-inhibiting polynucleotides
US10760086B2 (en) 2011-09-13 2020-09-01 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for weed control
EP3434780A1 (en) 2011-09-13 2019-01-30 Monsanto Technology LLC Methods and compositions for weed control
UY34333A (es) 2011-09-13 2013-04-30 Monsanto Technology Llc ?métodos y composiciones para el control de malezas, y métodos para reducir la expresión de enzima dhps?
CN103957697B (zh) 2011-09-13 2017-10-24 孟山都技术公司 用于杂草控制的方法和组合物
US9920326B1 (en) 2011-09-14 2018-03-20 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for increasing invertase activity in plants
WO2013109754A1 (en) 2012-01-17 2013-07-25 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Plant transcription factors, promoters and uses thereof
AP2014007895A0 (en) * 2012-02-01 2014-08-31 Dow Agrosciences Llc Synthetic brassica-derived chloroplast transit peptides
WO2013138309A1 (en) 2012-03-13 2013-09-19 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Genetic reduction of male fertility in plants
CN104703998B (zh) 2012-03-13 2020-08-21 先锋国际良种公司 植物中雄性育性的遗传减少
AR091143A1 (es) 2012-05-24 2015-01-14 Seeds Ltd Ab Composiciones y metodos para silenciar la expresion genetica
WO2013188291A2 (en) 2012-06-15 2013-12-19 E. I. Du Pont De Nemours And Company Methods and compositions involving als variants with native substrate preference
AR091489A1 (es) 2012-06-19 2015-02-11 Basf Se Plantas que tienen una mayor tolerancia a herbicidas inhibidores de la protoporfirinogeno oxidasa (ppo)
US10041087B2 (en) 2012-06-19 2018-08-07 BASF Agro B.V. Plants having increased tolerance to herbicides
EP2895601A1 (en) * 2012-09-14 2015-07-22 Bayer Cropscience LP Hppd variants and methods of use
MX364070B (es) 2012-10-18 2019-04-10 Monsanto Technology Llc Métodos y composiciones para el control de plagas vegetales.
US10683505B2 (en) 2013-01-01 2020-06-16 Monsanto Technology Llc Methods of introducing dsRNA to plant seeds for modulating gene expression
AU2013371825B2 (en) 2013-01-01 2019-10-24 A.B. Seeds Ltd. Methods of introducing dsRNA to plant seeds for modulating gene expression
US10000767B2 (en) 2013-01-28 2018-06-19 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for plant pest control
US9789511B2 (en) * 2013-03-12 2017-10-17 Nordson Corporation Jetting devices
AU2014249015B2 (en) 2013-03-13 2020-04-16 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for weed control
CA2905104A1 (en) 2013-03-13 2014-10-09 Monsanto Technology Llc Control of lolium species by topical application of herbicidal composition comprising dsrna
US20140283211A1 (en) 2013-03-14 2014-09-18 Monsanto Technology Llc Methods and Compositions for Plant Pest Control
WO2014160122A1 (en) 2013-03-14 2014-10-02 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Maize stress related transcription factor 18 and uses thereof
US10568328B2 (en) 2013-03-15 2020-02-25 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for weed control
US20140283216A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Pioneer Hi Bred International Inc Compositions and methods of use of acc oxidase polynucleotides and polypeptides
RU2703498C2 (ru) 2013-07-19 2019-10-17 Монсанто Текнолоджи Ллс Композиции и способы борьбы с leptinotarsa
US9850496B2 (en) 2013-07-19 2017-12-26 Monsanto Technology Llc Compositions and methods for controlling Leptinotarsa
AU2014341879B2 (en) 2013-11-04 2020-07-23 Beeologics, Inc. Compositions and methods for controlling arthropod parasite and pest infestations
UA119253C2 (uk) 2013-12-10 2019-05-27 Біолоджикс, Інк. Спосіб боротьби із вірусом у кліща varroa та у бджіл
UA121462C2 (uk) 2014-01-15 2020-06-10 Монсанто Текнолоджі Елелсі Спосіб та композиція для боротьби із бур'янами з використанням полінуклеотидів epsps
RS62608B1 (sr) 2014-01-31 2021-12-31 Agbiome Inc Modifikovano sredstvo za biološku kontrolu i njegove primene
EP3125676A4 (en) 2014-04-01 2018-02-14 Monsanto Technology LLC Compositions and methods for controlling insect pests
EP3158067B1 (en) 2014-06-23 2020-08-12 Monsanto Technology LLC Compositions and methods for regulating gene expression via rna interference
WO2015200539A1 (en) 2014-06-25 2015-12-30 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for delivering nucleic acids to plant cells and regulating gene expression
US10378012B2 (en) 2014-07-29 2019-08-13 Monsanto Technology Llc Compositions and methods for controlling insect pests
WO2016118762A1 (en) 2015-01-22 2016-07-28 Monsanto Technology Llc Compositions and methods for controlling leptinotarsa
CN107750125A (zh) 2015-06-02 2018-03-02 孟山都技术有限公司 用于将多核苷酸递送至植物中的组合物和方法
EP3302030A4 (en) 2015-06-03 2019-04-24 Monsanto Technology LLC METHODS AND COMPOSITIONS FOR THE INTRODUCTION OF NUCLEIC ACIDS IN PLANTS
US20190062777A1 (en) * 2015-06-17 2019-02-28 BASF Agro B.V. Plants having increased tolerance to herbicides
ES2975746T3 (es) 2015-08-03 2024-07-12 Monsanto Technology Llc Métodos y composiciones para tolerancia a los herbicidas en plantas
EP4268594A3 (en) 2016-06-24 2024-02-07 Agbiome, Inc. Methods and compositions for spray drying gram-negative bacteria
WO2019023226A1 (en) 2017-07-26 2019-01-31 AgBiome, Inc. COMPOSITIONS AND METHODS FOR IMPROVING PLANT HEALTH AND CONTROL OF PLANT DISEASES AND PLANT PESTS
AR113436A1 (es) 2017-10-09 2020-05-06 Agbiome Inc Composiciones y métodos para mejorar la salud de la planta y controlar fitoenfermedades y plagas
CA3026528A1 (en) * 2017-12-15 2019-06-15 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for ppo herbicide tolerance
WO2019241370A1 (en) 2018-06-12 2019-12-19 AgBiome, Inc. Compositions and methods for improving plant health and controlling plant disease
WO2020006555A1 (en) 2018-06-29 2020-01-02 AgBiome, Inc. Compositions comprising bacteria and methods for controlling plant pests and improving plant health
WO2020077042A1 (en) 2018-10-10 2020-04-16 AgBiome, Inc. Compositions and methods for controlling plant pests and improving plant health
JP2022509508A (ja) 2018-10-30 2022-01-20 アグバイオーム， インコーポレイテッド 植物有害生物を制御するおよび植物の健康状態を改善するための細菌組成物および方法
WO2020232103A1 (en) 2019-05-13 2020-11-19 AgBiome, Inc. Dried biological control agents and their uses
WO2020247848A1 (en) 2019-06-07 2020-12-10 AgBiome, Inc. Compositions and methods for improving plant health and controlling plant disease
WO2022225925A1 (en) 2021-04-19 2022-10-27 AgBiome, Inc. Compositions and methods for improving plant health and controlling plant disease
US20240251801A1 (en) 2021-05-18 2024-08-01 AgBiome, Inc. Compositions and methods for improving plant health and controlling plant disease
WO2023211979A2 (en) 2022-04-26 2023-11-02 AgBiome, Inc. Use of bacterial strains to solubilize phosphorus for agriculture
WO2024026305A1 (en) 2022-07-26 2024-02-01 AgBiome, Inc. Compositions and methods based on pseudomonas chlororaphis for improving plant health and controlling plant disease

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4535060A (en) 1983-01-05 1985-08-13 Calgene, Inc. Inhibition resistant 5-enolpyruvyl-3-phosphoshikimate synthetase, production and use
DK175922B1 (da) 1985-08-07 2005-07-04 Monsanto Technology Llc Glyphosat-resistente planter
FR2591069B1 (fr) * 1985-12-09 1988-03-18 Produits Ind Cie Fse Produits herbicides a base d'esters de bromoxynil et/ou d'ioxynil
US7705215B1 (en) * 1990-04-17 2010-04-27 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
EP0412911B1 (en) * 1989-08-10 2001-07-18 Aventis CropScience N.V. Plants with modified flowers
DE69132939T2 (de) * 1990-06-25 2002-11-14 Monsanto Technology Llc Glyphosattolerante pflanzen
ES2089232T5 (es) * 1990-08-31 2007-03-16 Monsanto Technology Llc 5-enolpiruvilsiquimato-3-fosfato sintasas tolerantes del glifosato.
FR2673642B1 (fr) 1991-03-05 1994-08-12 Rhone Poulenc Agrochimie Gene chimere comprenant un promoteur capable de conferer a une plante une tolerance accrue au glyphosate.
FR2673643B1 (fr) 1991-03-05 1993-05-21 Rhone Poulenc Agrochimie Peptide de transit pour l'insertion d'un gene etranger dans un gene vegetal et plantes transformees en utilisant ce peptide.
CA2105990A1 (en) * 1991-03-12 1992-09-13 Gunter Donn Maize resistant to aryloxyphenoxyalkanecarboxylic acid herbicides
GB9218664D0 (en) * 1992-09-03 1992-10-21 Rhone Poulenc Agrochimie Herbicidal compositions
CA2146113A1 (en) * 1992-10-15 1994-10-15 Adrianus Johannes Van Tunen Genetic moderation of restoration or plant phenotypes
DE4305696A1 (de) 1993-02-25 1994-09-01 Hoechst Ag Nachweisverfahren zur Identifizierung von Inhibitoren
US5530187A (en) 1993-07-16 1996-06-25 The Salk Institute For Biological Studies Transgenic plants containing multiple disease resistance genes
US5491076A (en) * 1993-11-01 1996-02-13 The Texas A&M University System Expression of foreign genes using a replicating polyprotein producing virus vector
FR2712302B1 (fr) * 1993-11-10 1996-01-05 Rhone Poulenc Agrochimie Eléments promoteurs de gènes chimères de tubuline alpha.
GB9515941D0 (en) * 1995-08-03 1995-10-04 Zeneca Ltd DNA constructs
FR2734842B1 (fr) 1995-06-02 1998-02-27 Rhone Poulenc Agrochimie Sequence adn d'un gene de l'hydroxy-phenyl pyruvate dioxygenase et obtention de plantes contenant un gene de l'hydroxy-phenyl pyruvate dioxygenase, tolerantes a certains herbicides
BR9710751A (pt) * 1996-07-25 2002-05-28 American Cyanamid Co ácido nucléico, vetor de dna, célula compreendendo um vetor de dna, semente, proteìna hppd, método para identificar inibidores de herbecidas/hppd, método para identificar variantes de hppd resistentes a herbicida, proteìna hppd variante, método para prover a uma planta resistência à herbicida, método para controle de ervas daninhas
US6245968B1 (en) 1997-11-07 2001-06-12 Aventis Cropscience S.A. Mutated hydroxyphenylpyruvate dioxygenase, DNA sequence and isolation of plants which contain such a gene and which are tolerant to herbicides
US6069115A (en) * 1997-11-12 2000-05-30 Rhone-Poulenc Agrochimie Method of controlling weeds in transgenic crops

Also Published As

Publication number Publication date
HU223788B1 (hu) 2005-01-28
CU22809A3 (es) 2002-12-19
BRPI9710340B8 (pt) 2018-02-27
NZ334188A (en) 2000-09-29
US7250561B1 (en) 2007-07-31
JP2000517166A (ja) 2000-12-26
EA199900116A1 (ru) 1999-08-26
FR2751347A1 (fr) 1998-01-23
US7935869B2 (en) 2011-05-03
US20120005769A1 (en) 2012-01-05
TR199900117T2 (xx) 1999-03-22
AR007884A1 (es) 1999-11-24
KR20000023830A (ko) 2000-04-25
HUP9903774A3 (en) 2000-04-28
WO1998002562A2 (fr) 1998-01-22
FR2751347B1 (fr) 2001-12-07
CN1154741C (zh) 2004-06-23
EA200001219A1 (ru) 2001-06-25
AU3625997A (en) 1998-02-09
BR9710340A (pt) 1999-08-17
US20080028481A1 (en) 2008-01-31
BR9710340B1 (pt) 2009-12-01
WO1998002562A3 (fr) 1998-04-30
CA2261094C (fr) 2005-06-28
HUP9903774A2 (hu) 2000-03-28
CN1230996A (zh) 1999-10-06
EA003140B1 (ru) 2003-02-27
AU734878B2 (en) 2001-06-21
US20100029481A1 (en) 2010-02-04
ZA976296B (en) 1998-08-19
PL331165A1 (en) 1999-06-21
US20130157854A1 (en) 2013-06-20
CA2261094A1 (fr) 1998-01-22
CO4770898A1 (es) 1999-04-30
CZ11399A3 (cs) 1999-05-12
EA002980B1 (ru) 2002-12-26
EP0937154A2 (fr) 1999-08-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
PL190393B1 (pl) Konstrukt chimerowy zawierający gen chimerowy elementarny, wektor, komórka roślinna, roślina, sposób nadawania oporności na herbicydy roślinom, sposób uzyskiwania roślin o tolerancji na wiele herbicydów oraz sposób działania herbicydem na rośliny
JP3961566B2 (ja) 植物の形質転換に用い得るキメラ遺伝子中で調節成分として作用し得る単離されたｄｎａ配列
US6566587B1 (en) Mutated 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase, gene coding for said protein and transformed plants containing said gene
KR20200098494A (ko) Ppo 제초제 내성용 방법 및 조성물
US20090229006A1 (en) Herbicide resistant plants
CA2269666A1 (en) Herbicide resistant plants
CZ380997A3 (cs) Sekvence DNA genu hydroxyfenylpyruvát-dioxygenázy a získání rostlin obsahujících gen hydroxyfenylpyruvát-dioxygenázy a tolerantních vůči specifickým herbicidům
EP3394272B1 (en) Compositions and methods for efficient targeting of transgenes
IL81838A (en) Cells of genetically engineered plants, and plants with resistance to glutamine synthesis inhibitors. Reducers and recombinants of AND for use in plant and cell production
CZ300208B6 (cs) Transgenní rostlina tolerantní k herbicidu glyfosatu a zpusob prípravy takové rostliny
JPH0576369A (ja) 植物形質転換用キメラ遺伝子
WO2004055191A1 (en) Expression of hydroxyphenylpyruvate dioxygenase in plastids of plants for herbicide tolerance
JP4365025B2 (ja) コメアクチンの第１のイントロンに結合したトウモロコシｈ３ｃ４プロモーター、前記プロモーターを含むキメラ遺伝子及び形質転換植物
RU2797237C2 (ru) Способы и композиции для ppo-гербицидной толерантности
DE60028751T2 (de) Herbizidresistente pflanzen
MXPA99000639A (en) Chemical gene for various genes of herbicide tolerance, cell vegetable plants tolerantesa various herbici
AU5007101A (en) Herbicide resistant plants
MXPA99004200A (en) Herbicide resistant plants