PL199497B1 - Wyizolowany polipeptyd, jego immunogenny fragment, wyizolowany polinukleotyd, wektor ekspresyjny, komórka gospodarza, błona komórki gospodarza, sposób wytwarzania polipeptydu lub immunogennego fragmentu, sposób wyrażania polinukleotydu, kompozycja szczepionki, przeciwciało, zastosowanie kompozycji zawierającej polipeptyd, zastosowanie kompozycji zawierającej polinukleotyd, kompozycja terapeutyczna oraz sposób diagnozowania zakażenia Moraxella catarrhalis - Google Patents

Abstract

Przedmiotem wynalazku jest wyizolowany polipeptyd u zyteczny w szczepionce przeciwko zaka- zeniom Moraxella catarrhalis obejmuj acy sekwencj e aminokwasow a o co najmniej 85% identyczno sci z sekwencj a wybran a z grupy obejmuj acej SEKW. ID Nr: 4 i SEKW. ID Nr 6, wyizolowany immuno- genny fragment tego polipeptydu, wyizolowany polinukleotyd koduj acy ten peptyd lub jego fragment, wektor ekspresyjny obejmuj acy ten polinukleotyd, komórka gospodarza obejmuj aca ten wektor eks- presyjny i b lona komórki gospodarza wyra zaj aca wyizolowany polipeptyd. Wynalazek obejmuje rów- nie z sposób wytwarzania polipeptydu lub jego immunogennego fragmentu oraz sposób wyra zania polinukleotydu. Przedmiotem wynalazku s a tak ze kompozycje szczepionki obejmuj ace polipeptyd b ad z jego fragment lub polinukleotyd wed lug wynalazku oraz ich zastosowanie. W zakres wynalazku wchodzi równie z przeciwcia lo immunospecyficzne dla polipeptydu, sposób diagnozowania zaka zenia Moraxella catarrhalis oraz kompozycja terapeutyczna. PL PL PL PL

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest wyizolowany polipeptyd, jego immunogenny fragment, wyizolowany polinukleotyd, wektor ekspresyjny, komórka gospodarza, błona komórki gospodarza, sposób wytwarzania polipeptydu lub immunogennego fragmentu, sposób wyrażania polinukleotydu, kompozycja szczepionki, przeciwciało, zastosowanie kompozycji zawierającej polipeptyd, zastosowanie kompozycji zawierającej polinukleotyd, kompozycja terapeutyczna oraz sposób diagnozowania zakażenia Moraxella catarrhalis.

Opisane w wynalazku polinukleotydy określane są dalej jako „polinukleotyd(y) BASB020”, a kodowane przez nie polipeptydy określane są jako „BASB020” lub „polipeptyd(y) BASB020”.

Moraxella catarrhalis (zwana także Branhamella catarrhalis) jest Gram-ujemną bakterią często izolowaną z górnych dróg oddechowych człowieka. Bakteria ta jest odpowiedzialna za kilka patologii, z których główne to zapalenie ucha środkowego u niemowląt i dzieci oraz zapalenie płuc u osób starszych. Jest też odpowiedzialna za zapalenie zatok, zakażenia szpitalne i rzadziej za choroby inwazyjne.

Zapalenie ucha środkowego jest ważną chorobą wieku dziecięcego zarówno ze względu na liczbę przypadków jak i możliwe konsekwencje. W Stanach Zjednoczonych co roku odnotowuje się ponad 3,5 milionów przypadków tej choroby i szacuje się, że 80% dzieci przechodzi przynajmniej jeden epizod zapalenia ucha przed osiągnięciem 3 lat (Klein, JO (1994) Clin. Inf. Dis. 19: 823). Jeśli choroba nie jest leczona lub jeśli stanie się przewlekła, może doprowadzić do utraty słuchu przejściowego (w przypadku nagromadzania się płynu w uchu środkowym) lub trwałej (jeśli nerw słuchowy jest zniszczony). U niemowląt taka utrata słuchu może być odpowiedzialna za opóźnioną naukę mowy.

Z ucha środkowego dzieci z objawami zapalenia ucha środkowego izoluje się głównie trzy gatunki bakterii: Streptococcus pneumoniae, nieoznaczony Haemophilus influenzae (NTHi) i M. catarrhalis. Są one obecne w 60 do 90% przypadków zachorowań. Przegląd ostatnich badań wykazuje, że

S. pneumoniae i NTHi razem stanowią około 30%, a M. catarrhalis około 15% przypadków zapalenia ucha środkowego (Murphy, TF (1996) Microbiol. Rev. 60: 267). Można również wyizolować inne bakterie z ucha środkowego (H. influenzae typ B, S. pyogenes itd.), ale ze znacznie niższą częstością (2% przypadków lub mniej).

Dane epidemiologiczne wskazują, że do rozwoju zapalenia ucha dla patogenów spotykanych w uchu środkowym jest absolutnie wymagana kolonizacja górnych dróg oddechowych, ale do rozwoju choroby muszą być spełnione również inne wymagania (Dickinson, DP i wsp. (1988) J. Infect. Dis. 158: 205; Faden, H.L. et al. (1991) Ann. Otorhinol. Laryngol. 100: 612). Są one ważne dla wywołania migracji bakterii do ucha środkowego przez trąbki Eustachiusza, po której następuje inicjacja procesu zapalnego. Czynniki te są obecnie nieznane. Postulowano, że przejściowe zaburzenie układu immunologicznego, na przykład, po zakażeniu wirusowym, może spowodować niezdolność do kontroli kolonizacji układu oddechowego (Faden, H.L. et al. (1994) J. Infect. Dis. 169: 1312). Inne wyjaśnienie jest takie, że ekspozycja na czynniki środowiskowe pozwala na większą kolonizację u niektórych dzieci, które następnie stają się podatne na rozwój zapalenia ucha środkowego ze względu na utrzymującą się obecność patogenów ucha środkowego (Murphy, TF (1996) Microbiol. Rev. 60: 267).

Odpowiedź immunologiczna na M. catarrhalis jest słabo scharakteryzowana. Analiza szczepów izolowanych kolejno z nosogardzieli niemowląt badanych od 0 do 2 lat życia wskazuje, że częstym zjawiskiem jest nabywanie i eliminacja nowych szczepów. Wskazuje to, na występowanie skutecznej odpowiedzi immunologicznej przeciw tym bakteriom u skolonizowanych dzieci (Faden, HL et al. (1994) J. Infect. Dis. 169: 1312).

U większości zbadanych osób dorosłych zidentyfikowano przeciwciała bakteriobójcze (Chapman AJ et al. (1985) J. Infect. Dis. 151: 878). Szczepy M. catarrhalis są różne pod względem swej oporności na aktywność bakteriobójczą surowicy. Na ogół izolaty z osób chorych są bardziej oporne niż z po prostu skolonizowanych (Hol, C. et al. (1993) Lancet 341: 1281, Jordan KL et al. (1990) Am. J. Med 88 (suppl 5A): 28S). Oporność na surowicę mogłaby więc być uważana za czynnik wirulencji bakterii. Zaobserwowano aktywność opsonizującą w surowicy dzieci po przejściu zapalenia ucha środkowego.

Antygeny, na które działają u ludzi różne odpowiedzi immunologiczne, nie były zidentyfikowane z wyją tkiem OMP B1, biał ka 84 kDa, którego ekspresja jest regulowana przez ż elazo, i które jest rozpoznawane przez surowicę pacjentów z zapaleniem płuc (Sethi, S. et al. (1995) Infect. Immun. 63: 1516) i UspA1 i UspA2 (Chen D. et al. (1999) Infect. Immun. 67: 1310).

PL 199 497 B1

Scharakteryzowano kilka innych białek błonowych obecnych na powierzchni M. catarrhalis stosując metodę biochemiczną, lub pod kątem ich potencjalnego znaczenia w wytwarzaniu ochronnej odporności (przegląd patrz Murphy, TF (1996) Microbiol. Rev. 60: 267). W modelu zapalenia płuc u myszy obecność przeciwciał na niektóre z nich (UspA, CopB) sprzyja szybszemu usuwaniu zakaż enia płuc. Inny polipeptyd (OMP CD) jest wysoce konserwowany wśród szczepów M. catarrhalis i wykazuje homologie do poryny Pseudomonas aeruginosa, co okazało się być skuteczne w stosunku do tej bakterii w modelach zwierzęcych.

Częstość zakażeń Moraxella catarrhalis wzrosła dramatycznie w ciągu kilku ostatnich dziesięcioleci. Przypisywano to pojawieniu się szczepów opornych na wiele antybiotyków i zwiększającej się populacji ludzi z osłabionym układem odpornościowym. Wyizolowanie szczepów Moraxella catarrhalis, które są oporne na część lub wszystkie antybiotyki standardowe, nie jest już czymś niezwykłym. To zjawisko spowodowało niezaspokojoną potrzebę medyczną i zapotrzebowanie na nowe środki przeciw mikroorganizmom, szczepionki, metody badań przesiewowych leków i testy diagnostyczne dla tego organizmu.

Wyizolowany polipeptyd użyteczny w szczepionce przeciwko zakażeniom Moraxella catarrhalis według wynalazku obejmuje sekwencję aminokwasową, o przynajmniej 85%, korzystnie 95% identyczności z sekwencją aminokwasową wybraną z grupy składającej się z SEKW. ID NR: 4 i SEKW. ID NR: 6 na całej długości odpowiednio SEKW. ID NR: 4 i SEKW. ID NR: 6.

Korzystnie polipeptyd obejmuje sekwencję aminokwasową, która jest wybrana z grupy składającej się z SEKW. ID NR: 4 i SEKW. ID NR: 6.

Wynalazek również dotyczy wyizolowanego polipeptydu użytecznego w szczepionce przeciwko zakażeniom Moraxella catarrhalis, który składa się z sekwencji aminokwasowej wybranej z grupy składającej się z SEKW. ID NR: 4 i SEKW. ID NR: 6.

Polipeptydy BASB020 przedstawione na SEKW. ID NR: 2, 4, 6 lub 8 są polipeptydami BASB020 ze szczepów Moraxella catarrhalis MC2931 (ATCC 43167), MC2912, MC2913 i MC2969.

W zakres wynalazku wchodzi również polipeptyd według wynalazku, który jest częścią większego białka fuzyjnego.

Wynalazek ponadto dotyczy wyizolowanego immunogennego fragmentu polipeptydu według wynalazku, który jest zdolny do wywołania odpowiedzi immunologicznej, rozpoznającej polipeptyd o SEKW. ID NR: 4 i SEKW. ID NR: 6, przy czym w razie potrzeby jest on sprzężony z nośnikiem.

Immunogenny fragment według wynalazku, który jest częścią większego białka fuzyjnego również wchodzi w zakres wynalazku.

Immunogenny fragment polipeptydu oznacza ciągłą część polipeptydu BASB020, która ma tę samą lub zasadniczo tę samą immunogenną aktywność jak polipeptyd zawierający sekwencje aminokwasów SEKW ID NR: 2, 4, 6 lub 8 (ewentualnie połączony z nośnikiem), tzn. jest zdolny do wywołania odpowiedzi odpornościowej, która rozpoznaje polipeptyd BASB020. Taki immunogenny fragment może, na przykład, obejmować polipeptyd BASB020 pozbawiony N-końcowej sekwencji liderowej i/lub domeny transbłonowej i/lub C-końcowej domeny kotwiczącej.

Przez fragment należy rozumieć polipeptyd mający sekwencję aminokwasową, która jest taka sama jak część dowolnej sekwencji aminokwasowej dowolnego peptydu według wynalazku, ale nie jest całą sekwencją. Jak w przypadku polipeptydów BASB020, fragmenty mogą być wolne lub zawarte w większym polipeptydzie, którego tworzą część lub region, korzystnie jako pojedynczy ciągły region w wię kszym polipeptydzie.

Korzystne fragmenty obejmują, na przykład, obcięte polipeptydy mające część sekwencji aminokwasowej z SEKW ID NR: 2, 4, 6 lub 8 lub jego wariantów, takich jak ciągła seria reszt, która zawiera sekwencję aminokwasów N- lub C- końcową. Korzystne są też formy degradacji polipeptydów wytwarzane przez lub w komórce gospodarza. Również korzystne są fragmenty charakteryzujące się strukturalnymi lub funkcjonalnymi cechami takimi jak fragmenty, które zawierają regiony alfa helisy i tworzące alfa helisy, kartki beta i regiony tworzące kartki beta, skręty i regiony tworzą ce skręty, zwoje i regiony tworzą ce zwoje, regiony hydrofilowe, regiony hydrofobowe, regiony alfa amfipatyczne, regiony beta amfipatyczne, regiony elastyczne, regiony tworzące powierzchnię, regiony wiążące substrat oraz wysoce antygenowe regiony wskaźnikowe.

Inne korzystne fragmenty zawierają izolowany polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową mającą 15, 20, 30, 40, 50 lub 100 przylegających aminokwasów z sekwencji aminokwasowej z SEKW ID NR: 2, 4 lub wyizolowany polipeptyd zawierają cy sekwencję aminokwasową mają c ą 15,

PL 199 497 B1

20, 30, 40, 50 lub 100 przylegających aminokwasów obciętych lub wydeletowanych z sekwencji aminokwasowej z SEKW ID NR: 2, 4, 6 lub 8.

Fragmenty polipeptydów według wynalazku mogą być stosowane do wytwarzania odpowiednich polipeptydów pełnej długości za pomocą syntezy peptydów, tak więc fragmenty te mogą być stosowane jako substancje wyjściowe do wytwarzania peptydów według wynalazku o pełnej długości.

Szczególnie korzystne są warianty, w których kilka, 5-10, 1-5, 1-3, 1-2 lub 1 aminokwas są podstawione, usunięte lub dodane w dowolnej kombinacji.

Polipeptydy lub fragmenty immunogenne według wynalazku mogą być w postaci „dojrzałego” białka lub mogą być częścią większego białka, takiego jak białko prekursorowe lub fuzja białkowa. Często korzystne jest włączenie dodatkowej sekwencji aminokwasów, która zawiera sekwencje wydzielnicze lub liderowe, prosekwencje, sekwencje, które pomagają w oczyszczaniu, takie jak wielokrotne reszty histydynowe, lub dodatkowa sekwencja dla stabilności w czasie produkcji rekombinanta. Co więcej, również możliwe jest dodanie egzogennego polipeptydu lub ogona lipidowego lub sekwencji polinukleotydu do zwiększenia potencjału immunogennego ostatecznej cząsteczki.

Wynalazek dotyczy też polipeptydu lub immunogennego fragmentu według wynalazku, który jest częścią większego białka fuzyjnego.

Można wytworzyć rozpuszczalne fuzje białkowe uzyskane technikami inżynierii genetycznej zawierające polipeptyd lub jego fragment według wynalazku i różne części stałych regionów ciężkich lub lekkich łańcuchów immunoglobulin różnych podklas (IgG, IgM, IgA, IgE). Korzystna jako immunoglobulina jest stała część ludzkiego łańcucha ciężkiego IgG, szczególnie IgG1, w której fuzja odbywa się w regionie zawiasowym. W konkretnym wykonaniu, część Fc moż e być po prostu usunię ta przez włączenie sekwencji cięcia, która może być przecięta przez czynnik krzepliwości krwi Xa.

Wynalazek umożliwia procesy przygotowania takich fuzji białkowych za pomocą inżynierii genetycznej i ich stosowanie do poszukiwania leków, diagnozy i terapii. Przykłady technologii fuzji białkowych można znaleźć w międzynarodowych zgłoszeniach patentowych WO 94/29458 i WO 94/22914.

Białka mogą być chemicznie koniugowane lub wyrażane jako zrekombinowane fuzje białkowe, co umożliwia zwiększenie poziomu ich wytwarzania w układzie ekspresyjnym w porównaniu z białkami, które nie są fuzyjne. Partner w fuzji może pomóc w dostarczeniu epitopów dla komórek pomocniczych T (partner fuzji immunologicznej), korzystnie epitopów dla komórek pomocniczych T rozpoznawanych przez ludzi, lub pomaga w ekspresji białka (wzmacniacz ekspresji) z wyższymi wydajnościami niż natywne białko rekombinowane. Korzystnie partner w fuzji będzie zarówno partnerem fuzji immunologicznej, jak i partnerem wzmagającym ekspresję.

Partnerzy fuzji obejmują białko D z Haemophilus influenzae i niestrukturalne białko wirusa grypy, NS1 (hemaglutynina). Innym partnerem fuzji jest białko znane jako LytA. Korzystnie stosowana jest C-końcowa część cząsteczki. LytA pochodzi ze Streptococcus pneumoniae, który syntetyzuje amidazę N-acetylo-L-alaninową, amidazę LytA (kodowaną przez gen lytA (Gene, 43 (1986) strony 265-272)), autolizynę, która specyficznie degraduje pewne wiązania w szkielecie peptydoglikanu. C-końcowa domena białka LytA jest odpowiedzialna za powinowactwo do choliny lub pewnych analogów choliny, takich jak DEAE. Ta właściwość była wykorzystana do opracowania plazmidów E. coli wyrażających C-LytA, przydatnych do ekspresji fuzji białkowych. Opisano oczyszczenie hybrydowych białek zawierających fragment C-LytA na N-końcu (Biotechnology: 10 (1992) strony 795-798). Możliwe jest stosowanie powtórzonej części cząsteczki LytA spotykanej na C-końcu zaczynając od reszty 178, na przykład reszty 188-305.

Niniejszy wynalazek umożliwia również uzyskanie wariantów wymienionych uprzednio polipeptydów, to znaczy polipeptydów, które różnią się od referencyjnych konserwatywnymi podstawieniami aminokwasów, przez co określona reszta jest podstawiona przez inną o podobnych cechach. Typowe takie podstawienia są pomiędzy Ala, Val, Leu i Ile; pomiędzy Ser i Thr; pomiędzy kwaśnymi resztami Asp i Glu; pomiędzy Asn i Gln; i pomiędzy zasadowymi resztami Lys i Arg; lub aromatycznymi resztami Phe i Tyr.

Polipeptydy według niniejszego wynalazku mogą być wytworzone w dowolny odpowiedni sposób. Takie polipeptydy obejmują naturalnie występujące polipeptydy, polipeptydy wytworzone przez rekombinację, syntetycznie wytwarzane polipeptydy lub polipeptydy wytworzone przez kombinację tych metod. Sposoby wytwarzania takich polipeptydów są dobrze znane w dziedzinie.

Najbardziej korzystnie, polipeptyd według wynalazku pochodzi z Moraxella catarrhalis, jednak może korzystnie być otrzymany z innych organizmów tego samego rodzaju taksonomicznego. PoliPL 199 497 B1 peptyd według wynalazku może też być uzyskany na przykład z organizmów tej samej rodziny taksonomicznej lub tego samego rzędu.

W zakres wynalazku wchodzi również wyizolowany polinukleotyd, który koduje polipeptyd lub immunogenny fragment według wynalazku oraz wyizolowany polinukleotyd obejmujący sekwencję nukleotydową kodującą polipeptyd użyteczny w szczepionce przeciwko zakażeniom Moraxella catarrhalis, którego sekwencja ma przynajmniej 85% identyczności z sekwencją aminokwasową o SEKW. ID NR: 4 i SEKW. ID NR: 6 na całej długości odpowiednio SEKW. ID NR: 4 i SEKW. ID NR: 6, lub sekwencję nukleotydową komplementarną do wyizolowanego polinukleotydu.

W zakres wynalazku również wchodzi wyizolowany polinukleotyd, który obejmuje sekwencję nukleotydową, o przynajmniej 85% identyczności z sekwencją nukleotydową kodującą polipeptyd o SEKW. ID NR: 4 i SEKW. ID NR: 6 na obszarze całego regionu kodującego, użyteczny w szczepionce przeciwko zakażeniom Moraxella catarrhalis, lub sekwencję nukleotydową komplementarną do tego wyizolowanego polinukleotydu.

Wynalazek również dotyczy wyizolowanego polinukleotydu, który obejmuje sekwencję nukleotydową, o przynajmniej 85% identyczności z SEKW. ID NR: 3 lub SEKW. ID NR: 5 na całej jej długości, lub sekwencję nukleotydową komplementarną do tego wyizolowanego polinukleotydu.

Korzystnie identyczność z SEKW. ID NR: 3 lub SEKW. ID NR: 5 wynosi przynajmniej 95%.

Wynalazek dotyczy również wyizolowanego polinukleotydu, który obejmuje sekwencję nukleotydową kodującą polipeptyd o SEKW. ID NR: 4 lub SEKW. ID NR: 6 lub jego immunogenny fragment.

Wynalazek również dotyczy wyizolowanego polinukleotydu, który obejmuje polinukleotyd o SEKW. ID NR: 3 lub SEKW. ID NR: 5.

Ponadto w zakres wynalazku również wchodzi wyizolowany polinukleotyd, który obejmuje sekwencję nukleotydową kodującą polipeptyd o SEKW. ID NR: 4 lub SEKW. ID NR: 6, użyteczny w szczepionce przeciwko zakażeniom Moraxella catarrhalis, który uzyskuje się przeszukując w ostrych warunkach hybrydyzacji odpowiednią bibliotekę przy pomocy znakowanej sondy o sekwencji określonej w SEKW. ID NR: 3 lub SEKW. ID NR: 5 lub jej fragmentu.

Polinukleotydy BASB020 przedstawione na SEKW ID NR: 1, 3, 5 lub 7 są polinukleotydami BASB020 ze szczepów MC2931 (ATCC 43617), MC2912, MC2913 i MC2969 Moraxella catarrhalis.

Wyizolowane cząsteczki kwasu nukleinowego kodujące i/lub wyrażające polipeptydy i polinukleotydy BASB020, szczególnie polipeptydy i polinukleotydy BASB020 Moraxella catarrhalis obejmują na przykład nieobrobione RNA, RNA rybozymu, mRNA, cDNA, genomowy DNA, B- i Z- DNA. Rozwiązania według wynalazku umożliwiają wytworzenie polinukleotydów, które są pożyteczne biologicznie, diagnostycznie, klinicznie, lub terapeutycznie jak i polipeptydów, i ich wariantów oraz kompozycji je zawierających.

Wykorzystując dostarczone tu informacje takie jak sekwencje polinukleotydów można uzyskać polinukleotyd kodujący polipeptyd BASB020 stosując standardowe sposoby klonowania i skriningu, takie jak stosuje się przy klonowaniu i sekwencjonowaniu chromosomalnych fragmentów DNA z bakterii, a następnie uzyskać klony pełnej długości wykorzystując komórki Moraxella catarrhalis Catlin jako materiał wyjściowy. Na przykład, aby uzyskać opisaną sekwencję polinukleotydu, taką jak sekwencja polinukeotydowa podana w SEKW ID NR: 1, 3, 5 lub 7 typowa biblioteka klonów chromosomalnego DNA Moraxella catarrhalis Catlin w E. coli lub jakimś innym odpowiednim gospodarzu, jest przeszukiwana znakowanym radioaktywnie oligonukleotydem, korzystnie 17-merowym lub dłuższym, pochodzącym z częściowej sekwencji. Klony niosące DNA identyczny do sondy można odróżnić stosując ostre warunki hybrydyzacji. Możliwe jest rozszerzenie poznanej sekwencji polinukleotydu w obu kierunkach tak, aby ustalić sekwencję całego genu. W tym celu sekwencjonuje się poszczególne zidentyfikowane klony przez hybrydyzację ze starterami do sekwencjonowania, które zaprojektowano na podstawie sekwencji oryginalnego polipeptydu lub polinukleotydu. Takie sekwencjonowanie można dogodnie przeprowadzić stosując, na przykład, zdenaturowany dwuniciowy DNA przygotowany z klonu plazmidowego. Odpowiednie techniki opisane są przez Maniatis, T., Fritsch. E.F. i Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, wyd. 2, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989) (zobacz szczególnie Screening By Hybridization 1.90 i Sequencing Denatured Double Stranded DNA Templates 13.70). Można też przeprowadzić bezpośrednie sekwencjonowania genomu, aby uzyskać sekwencje genu pełnej długości. Każdy polinukleotyd przedstawiony w SEKW ID NR: 1, 3, 5 lub 7 był znaleziony w bibliotece DNA pochodzącej z Moraxella catarrhalis.

Co więcej, każda sekwencja DNA przedstawiona na SEKW ID NR: 1, 3, 5 lub 7 zawiera otwartą ramkę odczytu kodującą białko mające w przybliżeniu liczbę reszt aminokwasów przestawioną na

PL 199 497 B1

SEKW ID NR: 2, 4, 6 lub 8 z wydedukowaną masą cząsteczkową, która może być wyliczona na podstawie wartości mas cząsteczkowych reszt aminokwasów dobrze znanych specjalistom.

Polinukleotyd z SEKW ID NR: 1, między kodonem start przy nukleotydzie 1 i kodonem stop, który rozpoczyna się przy nukleotydzie numer 841 w SEKW ID NR: 1, koduje polipeptyd z SEKW ID NR: 2.

Polinukleotyd z SEKW ID NR: 3, między kodonem start przy nukleotydzie 1 i kodonem stop, który rozpoczyna się przy nukleotydzie numer 841 w SEKW ID NR: 3, koduje polipeptyd z SEKW ID NR: 4.

Polinukleotyd z SEKW ID NR: 5, między kodonem start przy nukleotydzie 1 i kodonem stop, który rozpoczyna się przy nukleotydzie numer 841 w SEKW ID NR: 5, koduje polipeptyd z SEKW ID NR: 6.

Polinukleotyd z SEKW ID NR: 7, między kodonem start przy nukleotydzie 1 i kodonem stop, który rozpoczyna się przy nukleotydzie numer 841 w SEKW ID NR: 7, koduje polipeptyd z SEKW ID NR: 8.

Polinukleotyd kodujący polipeptyd według niniejszego wynalazku, w tym homologi i ortologi z gatunków innych niż Moraxella catarrhalis, moż na uzyskać w procesie, który obejmuje etapy przeszukiwania odpowiedniej biblioteki w ostrych warunkach hybrydyzacji (na przykład stosując temperaturę w zakresie 45-65°C i stężenie SDS od 0,1 - 1%) ze znakowaną lub wykrywalną sondą złożoną z, lub zawierającą sekwencję SEKW ID NR: 1, 3, 5 lub 7 lub jej fragment, i izolację genu pełnej długości i/lub klonów genomowych zawierających tę sekwencje polinukleotydu.

W opisie przedstawiona jest sekwencja polinukleotydu identyczna na całej swojej długości do sekwencji kodującej (otwarta ramka odczytu) przedstawionej w SEKW ID NR: 1, 3, 5 lub 7. Pozwala to na wytworzenie sekwencji kodującej dojrzały polipeptyd lub jego fragment połączonej w ramce odczytu z inną sekwencją kodującą, taką jak sekwencja kodująca sekwencję lidera lub sekrecyjna, sekwencja białka pre-, pro- lub pre-pro-. Taki polinukleotyd może też zawierać przynajmniej jedną sekwencję niekodującą, obejmującą na przykład, ale bez ograniczania się do, przynajmniej jedną niekodującą sekwencję 5' i 3', taką jak transkrybowane, ale nie ulegające translacji sekwencje, sygnały terminacji (takie jak rho-zależne i rho-niezależne sygnały terminacji), miejsca wiązania rybosomu, sekwencje Kozak, sekwencje, które stabilizują mRNA, introny i sygnały poliadenylacji. Sekwencja polinukleotydu może też zawierać dodatkowe sekwencje kodujące, które kodują dodatkowe aminokwasy. Na przykład, może to być zakodowana sekwencja markera, która ułatwia oczyszczanie fuzji polipeptydowej. W niektórych wykonaniach wynalazku, sekwencja markera jest peptydem heksahistydynowym, jaki jest dostarczony w wektorze pQE (Qiagen, Inc.) i opisany w Gentz et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 821-824 (1989) lub znacznikiem peptydowym HA (Wilson et al., Cell 37: 767 (1984)), z których oba mogą być użyteczne w oczyszczaniu połączonych z nimi sekwencji polipeptydów. Polinukleotydy według wynalazku także obejmują, ale nie są ograniczone do, polinukleotydów zawierających strukturalny gen i jego naturalnie zasocjowane sekwencje kontrolujące ekspresję genu.

Sekwencja nukleotydów kodująca polipeptyd BASB020 z SEKW ID NR: 2, 4, 6 lub 8 może być identyczna z polipeptydem kodowanym przez nukleotydy 1 do 840 SEKW ID NR: 1, 3, 5 lub 7. Alternatywnie, może być to sekwencja, która w wyniku nadmiarowości (degeneracji) kodu genetycznego koduje polipeptyd z SEKW ID NR: 2, 4, 6 lub 8.

Określenie „polinukleotyd kodujący polipeptyd” jest tu stosowane do polinukleotydów, które obejmują sekwencję kodującą polipeptyd według wynalazku, w szczególności polipeptyd bakteryjny, a bardziej szczególnie polipeptyd Moraxella catarrhalis BASB020 o sekwencji aminokwasowej z SEKW ID NR: 4 lub 6. Określenie to obejmuje także polinukleotydy, które zawierają jeden ciągły region lub nieciągłe regiony kodujące polipeptyd (na przykład polinukleotydy przerywane przez włączonego faga, włączoną sekwencję insercyjną, włączoną sekwencję wektora, włączoną sekwencję transpozonu, czy też ze względu na redagowanie RNA lub reorganizację genomowego DNA) wraz z dodatkowymi regionami, które mogą też zawierać sekwencje kodujące i/lub niekodujące.

Przedstawione w opisie rozwiązania umożliwiają uzyskanie wariantów polinukleotydów tu opisanych, które kodują warianty polipeptydu mającego wydedukowaną sekwencję aminokwasów SEKW ID NR: 4 lub 6. Fragmenty polinukleotydów według wynalazku, mogą być stosowane, na przykład, do syntezy polinukleotydów według wynalazku o pełnej długości.

Rozwiązania według wynalazku umożliwiają uzyskanie polinukleotydów kodujących warianty BASB020, które mają sekwencję aminokwasową polipeptydu BASB020 SEKW ID NR: 2, 4, 6 lub 8, w której podstawiono, zmodyfikowano, usunięto i/lub dodano, w dowolnej kombinacji kilka, 5 do 10, 1 do 5, 1 do 3, 2, 1 lub żadną resztę aminokwasu. Szczególnie korzystne wśród zmian są milczące podstawienia, addycje i delecje, które nie zmieniają właściwości i aktywności polipeptydu BASB020.

Korzystnymi postaciami polinukleotydów są polinukleotydy kodujące polipeptydy, które zachowują zasadniczo tę samą funkcję biologiczną lub aktywność jak dojrzały polipeptyd. W niniejszym

PL 199 497 B1 opisie przedstawione są polinukleotydy, które hybrydyzują z sekwencją opisanych polinukleotydów według wynalazku. Szczególnie dotyczy to polinukleotydów, które hybrydyzują do opisanych tu polinukleotydów w warunkach ostrych. Stosowane określenie „warunki ostre” i „ostre warunki hybrydyzacji” oznacza hybrydyzację zachodzącą tylko, gdy jest przynajmniej 95% i korzystnie przynajmniej 97% identyczności między sekwencjami. Konkretnym przykładem ostrych warunków hybrydyzacji jest inkubacja przez noc w 42°C w roztworze zawierającym 50% formamid, 5 x SSC (150 mM NaCl, 15 mM cytrynian trisodu), 50 mM fosforan sodu (pH 7,6), 5 x roztwór Denhardta, 10% siarczan dekstranu i 20 mikrogramów/ml zdenaturowanego, pofragmentowanego DNA spermy łososia, a nastę pnie płukanie nośnika hybrydyzacji w 0,1 x SSC w około 65°C. Warunki hybrydyzacji i płukania są dobrze znane i ich przykłady podano w Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, wydanie 2. Cold Spring Harbor, N.Y. (1989) w szczególności w Rozdziale 11. Przedstawione w niniejszym opisie sekwencje polinukleotydów mogą być stosowane w hybrydyzacji w takich roztworach.

W opisie przedstawione są polinukleotydy składające się z, lub obejmujące sekwencję polinukleotydu uzyskaną przez przeszukanie odpowiedniej biblioteki zawierającej cały gen pod kątem wyszukania sekwencji obejmującej polinukleotydy przedstawione w SEKW ID NR: 1, 3, 5 lub 7 w ostrych warunkach hybrydyzacji, z sondą o sekwencji polinukleotydu przedstawionej w SEKW ID NR: 1, 3, 5 lub 7 lub jej fragmentem; i izolację tych sekwencji polinukleotydu. Fragmenty pożyteczne do uzyskania takiego polinukleotydu obejmują na przykład opisane sondy i startery.

Jak przedyskutowano w części opisu dotyczącej oznaczeń polinukleotydów według wynalazku takie polinukleotydy mogą być stosowane jako sonda do hybrydyzacji z RNA, cDNA i genomowym DNA w celu izolacji cDNA pełnej długości jak i genomowych klonów kodujących BASB020. Takie polinukleotydy można też stosować, aby wyizolować cDNA i genomowe klony innych genów, które mają wysoki stopień identyczności, w szczególności, które mają wysoką identyczność sekwencji do genu BASB020. Sondy takie będą na ogół obejmowały przynajmniej 15 reszt nukleotydów lub par zasad. Korzystnie takie sondy będą miały przynajmniej 30 reszt nukleotydów lub par zasad i mogą mieć przynajmniej 50 reszt nukleotydów lub par zasad. Szczególnie korzystne sondy będą miały przynajmniej 20 reszt nukleotydów lub par zasad i będą miały mniej niż 30 reszt nukleotydów lub par zasad.

Region kodujący genu BASB020 można być wyizolować przez przeszukiwanie, stosując sekwencję DNA dostarczoną w SEKW ID NR: 1, 3, 5 lub 7 do syntezy sondy oligonukleotydowej. Wyznakowany oligonukleotyd mający sekwencję komplementarną do genu ujawnionego w wynalazku jest wówczas stosowany do przeszukiwania biblioteki cDNA, genomowego DNA lub mRNA, tak by określić, do których klonów w bibliotece hybrydyzuje sonda.

Istnieje kilka metod dostępnych i dobrze znanych specjalistom do uzyskania DNA pełnej długości lub przedłużania krótkich DNA, na przykład opartych na metodzie szybkiej amplifikacji końców cDNA (Rapid Amplification of cDNA ends - RACE) (zobacz na przykład, Frohman et al., PNAS USA 85: 8998-9002, 1988). Niedawne modyfikacje tej techniki, których przykładem jest technologia Marathon™ (Clontech Laboratories Inc.) znacznie uprościły poszukiwania dłuższych cDNA. W technologii Marathon™ cDNA przygotowano z mRNA wyizolowanego z wybranej tkanki i do każdego końca dołączono sekwencję „adaptora”. Następnie przeprowadzono amplifikację kwasów nukleinowych (PCR) aby powielić „brakujący” koniec 5' DNA stosując kombinację starterów oligonukleotydów specyficznych w stosunku do genów i adaptorów. Następnie powtarzano reakcję PCR stosując „wewnętrzne” startery, to znaczy startery, zaprojektowane tak, aby hybrydyzowały w obrębie amplifikowanego produktu (typowo starter specyficzny dla adaptora, który hybrydyzuje dalej w stronę 3' w sekwencji adaptora i starter specyficzny dla genu, który hybrydyzuje dalej w stronę 5' w wybranej sekwencji genu). Produkt tej reakcji może wówczas zostać zanalizowany przez sekwencjonowanie DNA, a DNA pełnej długości skonstruowany albo przez połączenie produktu bezpośrednio do istniejącego DNA, aby uzyskać pełną sekwencję, albo przez prowadzenie oddzielnego PCR, w celu uzyskania DNA pełnej długości stosując nową informację o sekwencji do zaprojektowania startera 5'.

Polinukleotydy i polipeptydy według wynalazku mogą być stosowane, na przykład, jako odczynniki do badań i materiały do odkrywania środków do leczenia i diagnostyki chorób, w szczególności chorób ludzkich, jak jest tu dalej omówione w odniesieniu do oznaczeń polinukleotydowych.

Polinukleotydy, które są oligonukleotydami pochodzącymi z sekwencji SEKW ID NR: 1-8, mogą być stosowane w opisanych tu procesach, ale korzystnie można je stosować w reakcji PCR w celu określenia, czy właśnie te polinukleotydy w całości lub częściowo, są transkrybowane w bakteriach obecnych w zakażonej tkance. Uważa się również, że takie sekwencje będą też użyteczne w diagnostyce stadium zakażenia i typu zakażenia, jakie osiągnął patogen.

PL 199 497 B1

W opisie patentowym przedstawione są również polinukleotydy kodują ce polipeptyd, który jest dojrzałym białkiem zawierającym dodatkowe N- lub C- końcowe aminokwasy albo aminokwasy wewnątrz dojrzałego polipeptydu (na przykład, gdy dojrzała postać ma więcej niż jeden łańcuch polipeptydowy). Takie sekwencje, mogą między innymi, odgrywać rolę w obróbce białka z prekursora do postaci dojrzałej, mogą umożliwiać transport białek, mogą wydłużać lub skracać okres półtrwania białka lub ułatwiać manipulację białkiem w celu jego oznaczania lub wytwarzania. Dodatkowe aminokwasy mogą, jak ma to na ogół miejsce in vivo, być usuwane z dojrzałego białka przez enzymy komórkowe.

Dla każdego ujawnionego w wynalazku polinukleotydu dostarczony jest komplementarny do niego polinukleotyd. Korzystnie te komplementarne polinukleotydy są w pełni komplementarne z każdym polinukleotydem, z którym są komplementarne.

Białko prekursora, mające dojrzałą postać polipeptydu w postaci fuzji z jedną lub więcej presekwencjami, może być nieaktywną postacią polipeptydu. Gdy usuwa się presekwencje nieaktywne prekursory, na ogół ulegają aktywacji. Część lub wszystkie presekwencje mogą być usunięte przed aktywacją. Na ogół takie prekursory nazywa się probiałkami.

Oprócz standardowych oznaczeń A, G, C T/U dla nukleotydów, określenie „N” może być też stosowane do opisu polinukleotydów. „N” oznacza że dowolny z czterech nukleotydów DNA lub RNA może pojawić się w takiej określonej pozycji w sekwencji DNA lub RNA, przy czym korzystnie N nie jest kwasem nukleinowym, który wraz z przyległymi nukleotydami, gdy czytany jest we właściwej ramce odczytu, będzie w niej generował przedwczesny kodon terminacyjny.

Podsumowując ujawnione polinukleotydy mogą kodować dojrzałe białko, dojrzałe białko plus sekwencję liderową, (która może być również określana jako prebiałko), prekursor dojrzałego białka mający jedną lub więcej prosekwencji, które nie są sekwencjami liderowymi prebiałka, lub preprobiałko, które jest prekursorem probiałka, mające sekwencję lidera i jedną lub więcej prosekwencji, które są na ogół usuwane w czasie etapów obróbki w trakcie tworzenia aktywnych i dojrzałych postaci polipeptydu.

Polinukleotydy według wynalazku mogą być stosowane do celów terapeutycznych lub profilaktycznych, w szczególności immunizacji.

Stosowanie polinukleotydu według wynalazku w immunizacji genetycznej będzie korzystnie wymagało odpowiedniego sposobu dostarczenia, takiego jak bezpośrednia iniekcja DNA plazmidowego do mięśni (Wolff et al., Hum. Mol. Genet. (1992) 1: 363, Manthorpe et al., Hum. Gene Ther. (1983) 4: 419), dostarczenie DNA skompleksowanego ze specyficznymi nośnikami białkowymi (Wu et al., J Biol Chem (1989): 16985), koprecypitacja cDNA z fosforanem wapnia (Benvenisty i Reshef, PNAS USA, (1986) 83: 9551), kapsułkowanie DNA w różnych postaciach liposomów (Kaneda et al., Science (1989) 243: 375), bombardowanie cząsteczkami (Tang et al., Nature (1992) 356: 152, Eisenbraun et al., DNA Cell Biol (1993) 12: 791) i zakażenie in vivo z użyciem sklonowanych wektorów retrowirusowych (Seeger et al., PNAS USA (1984) 81: 5849).

Wektory, komórki gospodarza, systemy ekspresji

Wynalazek dotyczy również wektora ekspresyjnego, który obejmuje wyizolowany polinukleotyd według wynalazku.

Korzystny wektor ekspresyjny jest w postaci żywego rekombinowanego mikroorganizmu.

W zakres wynalazku wchodzi również komórka gospodarza, która obejmuje wektor ekspresyjny według wynalazku.

Wynalazek dotyczy również błony komórki gospodarza według wynalazku, przy czym komórka gospodarza wyraża wyizolowany polipeptyd. Bezkomórkowe układy translacji mogą być także stosowane do produkcji białek z użyciem RNA pochodzącego z konstruktów DNA według wynalazku.

Wynalazek dotyczy również sposobu wytwarzania polipeptydu lub immunogennego fragmentu według wynalazku, który obejmuje hodowanie komórki gospodarza według wynalazku w warunkach wystarczających do wytwarzania polipeptydu lub immunogennego fragmentu i odzyskanie polipeptydu lub immunogennego fragmentu z podłoża hodowlanego.

Ponadto wynalazek dotyczy sposobu wyrażania polinukleotydu według wynalazku, który obejmuje transformację komórki gospodarza wektorem ekspresyjnym obejmującym co najmniej jeden polinukleotyd i hodowlę komórki gospodarza w warunkach odpowiednich dla wyrażania dowolnego z polinukleotydów. W celu wytworzenia zrekombinowanych peptydów według wynalazku, można technikami inżynierii genetycznej wytworzyć komórki gospodarza tak, aby zawierały systemy ekspresji lub ich części lub polinukleotydy według wynalazku. Wprowadzenie polinukleotydu do komórek gospodarza może być przeprowadzone sposobami opisanymi w wielu podstawowych podręcznikach

PL 199 497 B1 laboratoryjnych, takich jak Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, (1986) i Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, wyd. 2, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Habror, N.Y. (1989), takimi jak transfekcja z fosforanem wapnia, transfekcja z udziałem DEAEdekstranu, transwekcja, mikroiniekcja, transfekcja z udziałem kationowych lipidów, elektroporacja, transdukcja, „scrape loading”, wprowadzanie balistyczne i zakażenie.

Reprezentatywne przykłady odpowiednich komórek gospodarzy obejmują komórki bakterii, takie jak komórki gronkowców, paciorkowców, enterokoków, E. coli, streptomyces, sinic, Bacillus subtilis, Neisseria meningitidis i Moraxella catarrhalis; komórki grzybów, takie jak komórki drożdży, Kluveromyces, Saccharomyces, podstawczaków, Candida albicans i Aspergilllus, komórki owadów, takie jak komórki Drosophila S2 i Spodoptera Sf9, komórki zwierząt, takie jak CHO, COS, HeLa, C127, 3T3, BHK, 293, CV-1 i komórki czerniaka Bowes, oraz komórki roślinne, takie jak komórki roślin nagonasiennych lub okrytonasiennych.

Do wytwarzania polipeptydów według wynalazku można stosować wiele różnych systemów ekspresyjnych, które zaopatrzone są w odpowiednie wektory. Takie wektory obejmują, między innymi wektory pochodzące z chromosomów, episomów i wirusów, na przykład wektory pochodzące z plazmidów bakteryjnych, z bakteriofaga, z transpozonów, z episomu drożdży, z elementów insercyjnych, z elementów chromosomów droż dż y, z wirusów, takich jak bakulowirusy, papowawirusy, takie jak SV40, wirusy krowianki, adenowirusy, wirusy ospy ptasiej, wirusy pseudo-wścieklizny, pikornawirusy, retrowirusy, i alfawirusy i wektory pochodzące z ich kombinacji, takie jak pochodzące z elementów genetycznych plazmidów i bakteriofagów, takie jak kosmidy i fagemidy. Konstrukty systemu ekspresji mogą zawierać regiony kontrolne, które zarówno regulują, jak i powodują ekspresję. Na ogół może być stosowany dowolny system lub wektor odpowiedni do utrzymania, namnażania lub ekspresji polinukleotydów i/lub ekspresji polipeptydu w gospodarzu. Odpowiednia sekwencja DNA może być wstawiona do systemu ekspresji za pomocą różnych dobrze znanych i rutynowych technik, jak na przykład opisane w Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (powyżej).

W rekombinowanych układach ekspresyjnych u eukariota odpowiednie sygnały sekrecyjne mogą być włączone do ulegającego ekspresji polipeptydu w celu uzyskania sekrecji ulegającego translacji białka do światła retikulum endoplazmatycznego, do przestrzeni peryplazmatycznej lub do środowiska zewnątrzkomórkowego. Sygnały mogą być endogenne dla polipeptydu albo mogą być sygnałami heterologicznymi.

Polipeptydy według niniejszego wynalazku mogą być odzyskane z hodowli zrekombinowanych komórek za pomocą dobrze znanych metod obejmujących strącanie siarczanem amonu lub etanolem, ekstrakcję kwasem, chromatografię jonowymienną anionową lub kationową, chromatografię na fosfocelulozie, chromatografię interakcji hydrofobowych, chromatografię powinowactwa, chromatografię na hydroksyloapatycie i chromatografię z lektyną. Najbardziej korzystnie do oczyszczania stosuje się chromatografię powinowactwa do jonów metalu (IMAC). Można stosować dobrze znane techniki ponownego zwijania białek w celu regeneracji konformacji aktywnej, jeśli peptyd ulega denaturacji w czasie wewnątrzkomórkowej syntezy, izolacji lub oczyszczania.

Układ ekspresji może być także zrekombinowanym żywym mikroorganizmem, takim jak wirus lub bakteria. Gen będący przedmiotem zainteresowania może być wstawiony do genomu żywego zrekombinowanego wirusa lub bakterii. Inokulacja i zakażenie in vivo tym żywym wektorem doprowadzi do ekspresji in vivo antygenu i indukcji odpowiedzi immunologicznych. Przykładowe wirusy i bakterie stosowane w tym celu to wirusy ospy (np. krowianka, ospa ptasia, ospa kanarków), alfawirusy (wirus Sindbis, wirus Semliki Forest, wirus wenezuelskiego zapalenia opon mózgowych koni), adenowirusy, wirusy związane z adenowirusami, pikornawirusy (wirus polio, wirus nieżytu nosa), wirusy opryszczki (wirus varicella zoster itd), Listeria, Salmonella, Shigella, Neisseria, BCG. Wirusy i bakterie mogą być wirulentne, lub atenuowane na różne sposoby tak, by uzyskać żywe szczepionki. Rozwiązania według wynalazku umożliwiają również wytworzenie takich żywych szczepionek.

Oznaczenia diagnostyczne, prognostyczne, serotypowania i testy mutacji

Wynalazek również dotyczy sposobu diagnozowania zakażenia Moraxella catarrhalis, który obejmuje identyfikację polipeptydu lub immunogennego fragmentu według wynalazku lub przeciwciała, które jest immunospecyficzne dla tego polipeptydu, obecnego w biologicznej próbce od zwierzęcia podejrzanego o takie zakażenie.

Wynalazek umożliwia stosowanie ujawnionych polinukleotydów i polipeptydów BASB020 według wynalazku jako odczynników diagnostycznych. Wykrycie polinukleotydów i/lub polipeptydów BASB020 u eukarionta, w szczególności ssaka, a szczególnie człowieka, dostarczy metody diagno10

PL 199 497 B1 stycznej do rozpoznania choroby, określenia etapu choroby lub odpowiedzi organizmu wywołującego chorobę na leki. Eukarionty, szczególnie ssaki, a zwłaszcza ludzie, w szczególności zakażeni lub podejrzewani o zakażenie organizmem zawierającym gen lub białko BASB020 mogą zostać zdiagnozowani za pomocą testów opartych na badaniu poziomu kwasu nukleinowego lub białka za pomocą dobrze znanych technik jak i opisanych tutaj metod.

Polipeptydy i polinukleotydy do prognozowania, diagnozowania lub innej analizy mogą być uzyskane z materiałów pobranych z tkanki od przypuszczalnie zakażonego i/lub zakażonego osobnika. Polinukleotydy z dowolnego z tych źródeł, w szczególności DNA lub RNA, mogą być stosowane bezpośrednio do wykrywania lub amplifikowane enzymatycznie PCR lub dowolna inną techniką amplifikacji przed analizą. RNA, szczególnie mRNA, cDNA i genomowy DNA mogą też być używane w tych sposobach. Charakterystykę gatunku i szczepu zakaźnego lub rezydującego organizmu, który jest obecny u osobnika, można uzyskać przez analizę jego genotypu przeprowadzając w tym celu amplifikację i analizę określonego polinukleotydu. Delecje i insercje mogą być wykryte przez zmianę wielkości amplifikowanego produktu, w porównaniu z produktem uzyskiwanym dla genotypu sekwencji referencyjnej wybranej z pokrewnego organizmu, korzystnie innego gatunku tego samego rodzaju lub innego szczepu tego samego gatunku. Mutacje punktowe można zidentyfikować przez hybrydyzację zamplifikowanego DNA do znakowanych sekwencji polinukleotydowych BASB020. Idealnie lub znacznie sparowane sekwencje można odróżnić od niedoskonale lub nieznacznie sparowanych sekwencji przez trawienie DNazą lub RNazą, odpowiednio dla DNA lub RNA, lub przez detekcję różnic w temperaturze topnienia lub kinetyce renaturacji. Różnice w sekwencji polinukleotydów moż na też wykryć przez zmiany w ruchliwości elektroforetycznej fragmentów polinukleotydowych w żelach, w porównaniu z sekwencją referencyjną . Moż e to być przeprowadzone z lub bez czynników denaturujących. Różnice w polinukleotydach mogą być też wykryte przez bezpośrednie sekwencjonowanie DNA lub RNA. Zobacz na przykład Myers et al., Science 230: 1242 (1985). Zmiany sekwencji w specyficznych miejscach można również wykryć przez oznaczenia ochrony przed nukleazą, takie jak oznaczenie ochrony przed RNazą, V1 i S1 lub metodą cięcia chemicznego. Zobacz na przykład Cotton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 4397-4401 (1985).

Rozwiązania według wynalazku pozwalają na wytworzenie zestawu oligonukleotydowych sond zawierającego sekwencje nukleotydów BASB020 lub ich fragmenty. Taki zestaw może być przeznaczony do przeprowadzenia skutecznego poszukiwania, na przykład, mutacji genetycznej, serotypu, klasyfikacji taksonomicznej lub identyfikacji. Metody technologii wykorzystujących macierze są dobrze znane i można je szeroko stosować do uzyskiwania odpowiedzi na różne pytania stawiane genetyce molekularnej, które dotyczą ekspresji genów, sprzężenia genetycznego i zmienności genetycznej (zobacz na przykład Chee et al., Science 274: 610 (1996)).

Taki zestaw będzie przydatny między innymi w diagnozie choroby lub podatności na chorobę.

Polinukleotydy według niniejszego wynalazku mogą być stosowane jako odczynniki diagnostyczne. Detekcja zmutowanej postaci polinukleotydu według wynalazku, który jest związany z chorobą lub patogennością, dostarczy narzędzia diagnostycznego, które może określić chorobę lub podatność na chorobę, która jest skutkiem słabej ekspresji, nadmiernej ekspresji lub zmienionej ekspresji polinukleotydu. Organizmy, szczególnie organizmy zakaźne, niosące mutacje w takim polinukleotydzie, mogą być wykryte na poziomie polinukleotydu za pomocą wielu technik, takich jak przedstawione w niniejszym opisie.

Komórki z organizmu niosącego mutacje lub polimorfizmy (warianty alleliczne) w polinukleotydzie i/lub polipeptydzie można też wykryć na poziomie polinukleotydu lub polipeptydu za pomocą wielu technik, co na przykład umożliwi serotypowanie. Przykładowo, RT-PCR można stosować do detekcji mutacji w RNA. Szczególnie korzystne stosowanie RT-PCR w połączeniu ze zautomatyzowanymi systemami detekcji, takimi jak na przykład GeneScan. W tym samym celu można stosować RNA, cDNA lub genomowy DNA. Przykładowo do identyfikacji i analizy mutacji można stosować startery PCR komplementarne do polinukleotydu kodującego polipeptyd BASB020.

W opisie wynalazku przedstawione są również startery z 1, 2, 3 lub 4 nukleotydami usuniętymi z 5' i/lub 3' końca. Te startery mogą być stosowane, między innymi, do amplifikacji DNA i/lub RNA BASB020 izolowanego z próbki pochodzącej od osobnika, takiej jak materiał z ciała. Startery mogą być stosowane do amplifikacji polinukleotydu wyizolowanego z zakażonego osobnika, tak że polinukleotyd może być poddany różnym technikom prowadzącym do wyjaśnienia sekwencji polinukleotydów. W ten sposób można wykryć mutacje w sekwencjach polinukleotydowych i metody te można

PL 199 497 B1 stosować do diagnostyki/prognozowania zakażenia, jego stadium lub przebiegu, jak również do serotypowania i/lub klasyfikacji czynnika zakaźnego.

Zwiększoną lub zmniejszoną ekspresję polinukleotydu BASB020 można mierzyć stosując dowolną z metod dobrze znanych w dziedzinie ilościowego oznaczania polinukleotydów, taką jak na przykład amplifikacja, PCR, RT-PCR, ochrona przed RNazą, technika Northern, spektrometria i inne metody hybrydyzacji.

Ponadto, diagnostyczne oznaczenia służące do wykrycia nadmiernego wyrażania polipeptydu BASB020, w porównaniu z normalnymi próbkami kontrolnymi z tkanki, można, na przykład, stosować do wykrycia zakażenia. Techniki oznaczeń, które mogą być stosowane do określenia poziomów polipeptydu BASB020 w próbce pochodzącej od gospodarza, takiej jak materiał z ciała, są dobrze znane specjalistom. Takie sposoby oznaczania obejmują oznaczenia radioimmunologiczne, oznaczenia współzawodniczenia o wiązanie, analizę typu Western, oznaczenia przeciwciał metodą immunometryczną i oznaczenia ELISA.

Polinukleotydy według wynalazku mogą być stosowane jako składniki mikromacierzy polinukleotydowych, korzystnie macierzy o wysokiej gęstości, lub matryc. Takie macierze o wysokiej gęstości są szczególnie użyteczne dla celów diagnostycznych i prognostycznych. Przykładowo, aby określić obecność konkretnej sekwencji nukleotydowej lub pokrewnej sekwencji u osobnika można stosować zestaw plamek, przy czym każda zawiera inny gen, a ponadto taki zestaw zawiera polinukleotyd lub polinukleotydy według wynalazku. Zestaw może być stosowany do przeszukiwania np. przez hybrydyzację lub amplifikację kwasu nukleinowego przy użyciu sondy uzyskanej lub pochodzącej z próbki z ciał a. Taka obecność moż e oznaczać obecność patogenu, w szczególnoś ci Moraxella catarrhalis, i może być użyteczna w diagnozie i/lub prognozowaniu przebiegu choroby. Korzystne są również matryce zawierające wiele wariantów sekwencji polinukleotydowej z SEKW ID NR: 1, 3, 5 lub 7. Także korzystna jest matryca zawierająca wiele wariantów sekwencji polinukleotydowej kodującej sekwencję polipeptydową z SEKW ID NR: 2, 4, 6 lub 8.

Przeciwciała

Polipeptydy i polinukleotydy według wynalazku lub ich warianty albo wyrażające je komórki, można zastosować jako immunogeny do wytwarzania przeciwciał immunospecyficznych odpowiednio wobec takich polipeptydów lub polinukleotydów.

Niniejszy wynalazek dotyczy również przeciwciała immunospecyficznego dla polipeptydu składającego się z sekwencji aminokwasowej o przynajmniej 85% identyczności z sekwencją aminokwasową wybraną z grupy składającej się z: SEKW. ID NR: 4 i SEKW. ID NR: 6 na całej ich długości, lub jego immunogennego fragmentu, które to przeciwciało rozpoznaje polipeptyd o SEKW. ID NR: 4 i SEKW. ID NR: 6, przy czym immunogenny fragment jest zdolny do wywoł ania odpowiedzi immunologicznej i, w razie potrzeby, jest on sprzężony z nośnikiem.

Korzystne przeciwciało jest immunospecyficzne w stosunku do polipeptydu lub immunogennego fragmentu, które są częścią większej fuzji białkowej.

Przeciwciała przeciw polipeptydom lub polinukleotydom kodującym polipeptydy według wynalazku można otrzymać przez podawanie polipeptydów lub polinukleotydów według wynalazku lub fragmentów niosących epitop jednego z nich lub obydwu, analogów jednego z nich lub obydwu, albo komórek wyrażających jeden z nich lub obydwa, analogi jednego z nich lub obydwu, lub komórek wyrażających jeden z nich lub obydwa, zwierzętom, korzystnie nie będącym człowiekiem, z zastosowaniem rutynowych procedur. Do wytwarzania monoklonalnych przeciwciał można zastosować dowolną technikę znaną w tej dziedzinie, która dostarcza przeciwciał wytwarzanych przez ciągłe hodowle linii komórkowych. Przykłady obejmują różne techniki, takie jak opisane w Kohler, G. and Milstein, C., Nature 256: 495-497 (1975); Kozbor et al., Immunology Today 4: 72 (1983); Cole et al., str. 77-96 w MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc. (1985).

Techniki wytwarzania przeciwciał jednołańcuchowych (Patent USA Nr 4,946,778) można zaadaptować do wytwarzania przeciwciał jednołańcuchowych wobec polipeptydów lub polinukleotydów kodujących polipeptydy według wynalazku. Ponadto do wyrażania humanizowanych przeciwciał immunospecyficznych wobec polipeptydów lub polinukleotydów kodujących polipeptydy według wynalazku można stosować transgeniczne myszy i inne organizmy lub zwierzęta, takie jak inne ssaki. Alternatywnie, do selekcji genów kodujących przeciwciała wykazujące aktywności wiązania polipeptydów według wynalazku można stosować technologie prezentacji na fagach. Selekcja może być prowadzona na zbiorze powielonych reakcji PCR genów v uzyskanych z limfocytów od ludzi zbadanych pod kątem posiadania anty-BASB020 lub z bibliotek uzyskanych od osób, które nie miały kontaktu

PL 199 497 B1 z antygenem (McCaffeny, el al., (1990). Nature 348, 552-554; Marks, el al., (1992) Biotechnology 10, 779-783). Powinowactwo tych przeciwciał można również zwiększyć np. przez zamianę łańcuchów (Clackson et al., (1991) Nature 352: 628).

Opisane powyżej przeciwciała można wykorzystać do izolowania i do identyfikowania klonów wyrażających polipeptydy i polinukleotydy według wynalazku, jak i do oczyszczania polipeptydów i polinukleotydów, na przykład przez chromatografię powinowactwa.

A zatem, przeciwciała według wynalazku mogą być wykorzystane, między innymi, do leczenia infekcji, szczególnie infekcji bakteryjnych.

W opisie wynalazku przedstawione są również warianty polipeptydowe obejmujące antygenowe, epitopowo lub immunologicznie równoważne warianty.

Korzystnie, przeciwciało lub jego wariant jest zmodyfikowany w celu zmniejszenia immunogenności u danego osobnika. Przykładowo, jeżeli tym osobnikiem jest człowiek, najkorzystniej przeciwciało to jest „humanizowane”, przy czym region lub regiony określające swoistość przeciwciała pochodzącego z hybrydomy zostają przeniesione do przeciwciała ludzkiego, na przykład jak opisano w Jones et al. (1986), Nature 321, 522-525 lub Tempest et al., (1991) Biotechnology 9, 266-273.

Antagoniści i agoniści - testy i cząsteczki

Polipeptydy i polinukleotydy według wynalazku można również zastosować do testowania wiązania małych cząsteczek będących substratami i ligandami np. w komórkach, preparatach wolnych od komórek, bibliotekach chemicznych i mieszaninach produktów naturalnych. Substraty te i ligandy mogą być naturalnymi substratami i ligandami, bądź też strukturalnymi lub funkcjonalnymi imitacjami. Patrz. Coligan et al., Current Protocols in Immunology 1 (2): Chapter 5 (1991). Sposoby przeszukiwania mogą po prostu polegać na pomiarach wiązania związku-kandydata z polipeptydem albo polinukleotydem, z komórkami albo błonami zawierającymi polipeptyd lub polinukleotyd, albo z fuzją białkową polipeptydu przy użyciu znacznika bezpośrednio albo pośrednio połączonego ze związkiemkandydatem. Alternatywnie, metoda przeszukiwania może obejmować współzawodnictwo z wyznakowanym czynnikiem współzawodniczącym. Ponadto, w metodach przeszukiwania można testować, czy związek-kandydat daje sygnał wytworzony przez aktywację lub hamowanie polipeptydu lub polinukleotydu. Inhibitory aktywacji testuje się na ogół w obecności znanych agonistów i obserwuje się efekt aktywacji przez agonistę w obecności związku-kandydata. W metodach przeszukiwania odwrotnych agonistów lub inhibitorów można zastosować konstytutywnie aktywne polipeptydy i/lub konstytutywnie wyrażane polipeptydy lub polinukleotydy. Takie poszukiwanie prowadzi się w nieobecności agonisty lub inhibitora, przez testowanie, czy związek-kandydat daje hamowanie polipeptydu lub polinukleotydu. Ponadto, metody poszukiwania mogą obejmować etapy mieszania związku-kandydata z roztworem zawierającym polipeptyd lub polinukleotyd według wynalazku w celu wytworzenia mieszaniny, następnie mierzenie aktywności polipeptydu lub polinukleotydu w mieszaninie i porównanie aktywności polipeptydu lub polinukleotydu BASB020 w mieszaninie ze standardem. W celu zidentyfikowania antagonistów polipeptydu lub polinukleotydu według niniejszego wynalazku, jak również polipeptydów spokrewnionych filogenetycznie i/lub funkcjonalnie można również zastosować do wysokowydajnych testów przesiewowych fuzje białkowe, takie jak utworzone z części Fc i polipeptydu BASB020, jak te opisane wcześniej (patrz D. Bennett et al., J Mol Recognition. 8: 52-58 (1995); and K. Johanson et al., J Biol Chem, 270 (16): 9459-9471 (1995)).

Polinukleotydy, polipeptydy i przeciwciała, które wiążą się lub oddziałują z polipeptydem według niniejszego wynalazku, mogą być również stosowane do opracowania metod wykrywania wpływu dodawanych związków na wytwarzanie mRNA i/lub polipeptydu w komórkach. Przykładowo, w oparciu o znane metody moż na opracować test ELISA do pomiaru poziomu polipeptydu wydzielanego lub związanego z komórkami przy użyciu monoklonalnych lub poliklonalnych przeciwciał. Test ten można stosować do wykrycia czynników, które mogą hamować lub wzmacniać wytwarzanie polipeptydu (zwanego odpowiednio również antagonistą lub agonistą), w poddanych odpowiednim manipulacjom komórkach lub tkankach.

Przedstawione w niniejszym opisie wynalazki pozwalają również na prowadzenie przeszukiwania związków w celu zidentyfikowania tych, które wzmacniają (agonista) lub blokują (antagonista) działanie polipeptydów lub polinukleotydów BASB020, szczególnie związków, które są bakteriostatyczne i/lub bakteriobójcze. Sposób przeszukiwania może obejmować wysokowydajne techniki. Przykładowo, w celu poszukiwania agonistów i antagonistów syntetyczna mieszanina reakcyjna, kompartment komórkowy, taki jak błona, otoczka komórkowa lub ściana komórkowa, lub preparat dowolnej z nich, zawierający polipeptyd BASB020 i wyznakowany substrat lub ligand takiego polipeptydu inkubuje się

PL 199 497 B1 w nieobecności albo obecności cząsteczki-kandydata, który może być agonistą lub antagonistą BASB020. Zdolność cząsteczki-kandydata do działania agonistycznego lub antagonistycznego wobec polipeptydu BASB020 przejawia się zmniejszeniem wiązania wyznakowanego ligandu lub zwiększeniem wytwarzania produktu z każdego z substratów. Cząsteczki, które wiążą się bezinteresownie, tj. bez wywołania działania polipeptydu lub polinukleotydu, będą najprawdopodobniej dobrymi antagonistami. Cząsteczki, które są agonistami wiążą się dobrze, i przykładowo, zwiększają szybkość wytwarzania produktu z substratu, zwiększają przekazywanie sygnału lub aktywność kanałów chemicznych. Wykrywanie szybkości lub poziomu, jak w przypadku wytwarzania produktu z substratu, przekazywania sygnału lub aktywności kanałów chemicznych, można zwiększyć przez zastosowanie systemu reporterowego. Systemy reporterowe, które mogą być przydatne pod tym względem, obejmują, między innymi, kolorymetryczny, wyznakowany substrat przekształcany w produkt, gen reporterowy, który odpowiada na zmiany aktywności polipeptydu lub polinukleotydu BASB020, oraz testy wiązania znane w tej dziedzinie.

Innym przykładem testu, który można przeprowadzić w celu wyszukania agonistów BASB020, jest test współzawodnictwa, w którym łączy się BASB020 i potencjalnych agonistów z cząsteczkami wiążącymi BASB020, zrekombinowanymi cząsteczkami wiążącymi BASB020, naturalnymi substratami lub ligandami, naturalnymi substratami lub ligandami albo imitacjami substratów lub ligandów w odpowiednich warunkach dla testu hamowania kompetycyjnego. BASB020 można wyznakować, np. przy użyciu związków radioaktywnych lub kolorymetrycznych, tak, że liczba cząsteczek związanych z wiążącą się cząsteczką, lub przekształcanym produktem, może być oznaczona precyzyjnie w celu przetestowania skuteczności potencjalnych agonistów.

Potencjalni agoniści obejmują, miedzy innymi, małe cząsteczki organiczne, peptydy, polipeptydy i przeciwciała, które wiążą się do polipeptydu lub polinukleotydu według wynalazku i w ten sposób hamują lub eliminują jego aktywność lub ekspresję. Potencjalnymi agonistami mogą być również małe cząsteczki organiczne, peptyd, polipeptyd, taki jak ściśle spokrewnione białko lub przeciwciało, które wiążą się do tych samych miejsc na cząsteczce wiążącej, bez indukowania aktywności zależnych od BASB020. Wiązanie takie zapobiega działaniu lub ekspresji polipeptydów lub polinukleotydów BASB020 przez wyeliminowanie polipeptydów lub polinukleotydów BASB020 z wiązania.

Potencjalni agoniści obejmują małe cząsteczki, które wiążą się i zajmują miejsce wiązania polipeptydu, zapobiegając w ten sposób wiązaniu do komórkowych cząsteczek wiążących, tak, że przeciwdziała się ich normalnej aktywności biologicznej. Przykłady małych cząsteczek obejmują małe cząsteczki organiczne, peptydy i cząsteczki podobne do peptydów. Inni potencjalni antagoniści obejmują cząsteczki antysensowne (patrz Okano, J Neurochem. 56: 560 (1991) Oligodeoxynuclotides as antisense inhibitors of gene expression;, CRC Press. Boca Raton. FL (1988)). Korzystni potencjalni antagoniści obejmują związki pokrewne i warianty BASB020.

Opisane w wynalazku rozwiązania umożliwiają wytworzenie na drodze inżynierii genetycznej rozpuszczalnych fuzji białkowych zawierających polipeptyd według niniejszego wynalazku lub jego fragment i różne części regionów stałych ciężkich i lekkich łańcuchów immunoglobulin różnych podklas (IgG, IgM, IgA, IgE). Korzystna jako immunoglobulina jest stała część ciężkiego łańcucha IgG, szczególnie IgG1, przy czym fuzja ma miejsce w regionie zawiasowym. Przykładowo, część Fc może być usunięta przez wstawienie przecinanej sekwencji, która może być cięta czynnikiem krzepliwości krwi Xa. Opisane rozwiązania umożliwiają specjalistom wytworzenie fuzji białkowych na drodze inżynierii genetycznej i ich zastosowanie do testowania leków, diagnozy i leczenia. Przykłady technologii fuzji białkowych można znaleźć w międzynarodowych zgłoszeniach patentowych nr WO 94/29458 i WO 94/22914.

Każdą z przedstawionych w opisie sekwencji polipeptydów, można zastosować do wykrycia i opracowania związków antybakteryjnych. Wyrażone białko można stosować jako białko docelowe do przeszukiwania leków antybakteryjnych. Ponadto, sekwencje polinukleotydowe kodujące aminokońcowe regiony kodowanego białka lub sekwencje Shine-Delgarno lub inne sekwencje ułatwiające translację odpowiedniego mRNA, można zastosować do konstrukcji sekwencji antysensownych do kontrolowania ekspresji sekwencji kodującej.

Rozwiązania według wynalazku umożliwiają również zastosowanie polipeptydu, polinukleotydu, agonisty lub antagonisty do zapobiegania wytworzenia fizycznych oddziaływań odpowiedzialnych za skutki infekcji, takich jak oddziaływania pomiędzy patogenem lub patogenami i eukariotycznym, korzystnie ssaczym gospodarzem. W szczególności takie cząsteczki mogą być zastosowane: do zapobiegania adhezji bakterii, w szczególności gram dodatnich i/lub gram ujemnych bakterii do eukario14

PL 199 497 B1 tycznych, korzystnie ssaczych, białek substancji pozakomórkowej. Dotyczy to blokowania adhezji do założonych na stałe urządzeń, do białek substancji pozakomórkowej w ranach, do blokowania adhezji bakteryjnej pomiędzy eukariotycznymi, korzystnie ssaczymi, białkami substancji pozakomórkowej i bakteryjnymi białkami BASB020, które pośredniczą w uszkodzeniu tkanki i/lub blokują normalny rozwój patogenezy w infekcjach zapoczątkowywanych w inny sposób niż przez wszczepienie zakładanych na stałe urządzeń lub przez inne techniki chirurgiczne.

Przedstawione w opisie rozwiązania umożliwiają również wytworzenie mimotopów polipeptydów według wynalazku. Mimotop jest sekwencją peptydową, wystarczająco podobną do natywnego peptydu (pod względem sekwencji lub struktury), która może być rozpoznawana przez przeciwciała, rozpoznające natywny peptyd, lub jest zdolna do indukowania przeciwciał, które rozpoznają natywny peptyd po połączeniu z odpowiednim nośnikiem.

Mimotopy peptydowe można zaprojektować do konkretnych celów przez dodanie, usunięcie lub podstawienie wybranych aminokwasów. A zatem peptydy można modyfikować dla celów łatwego łączenia się z białkiem nośnikowym. Przykładowo, może być pożądane w niektórych metodach koniugacji chemicznej dołączenie końcowej cysteiny. Ponadto, może być wskazane dla peptydów połączonych z białkiem nośnikowym dołączenie hydrofobowego końca oddalonego od połączonego końca peptydu, tak, aby wolny, nie uczestniczący w połączeniu, koniec peptydu pozostał związany z powierzchnią białka nośnikowego. Peptyd jest wtedy prezentowany w konformacji, która najbardziej przypomina peptyd obecny w całej cząsteczce natywnej. Przykładowo, peptydy mogą być zmienione tak, aby N-końcowa cysteina i C-końcowy koniec hydrofobowy były amidowane. Alternatywnie, można dodać lub podstawić D-izoschizomerem jeden lub więcej aminokwasów, w celu utworzenia korzystnej pochodnej, na przykład tak, aby zwiększyć stabilność peptydu.

Mimotopy peptydowe można również identyfikować przy użyciu przeciwciał, które same mają zdolność do wiązania polipeptydów według niniejszego wynalazku. Identyfikację prowadzi się np. stosując techniki, takie jak prezentowanie na fagach (EP 0552 267 B1). W technice tej wytworzona zostaje duża liczba sekwencji peptydowych, które imitują strukturę natywnych peptydów, a zatem są zdolne do wiązania przeciwciał przeciw natywnym peptydom, ale same nie muszą koniecznie wykazywać homologii sekwencji z natywnym polipeptydem.

Szczepionki

Wynalazek również dotyczy kompozycji szczepionki, która obejmuje skuteczną ilość polipeptydu lub immunogennego fragmentu według wynalazku i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.

Zakresem wynalazku jest również objęta kompozycja szczepionki, która obejmuje skuteczną ilość polinukleotydu według wynalazku i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.

Korzystna kompozycja szczepionki obejmuje co najmniej jeden inny antygen Moraxella catarrhalis.

Rozwiązania według wynalazku umożliwiają również indukowanie odpowiedzi immunologicznej u osobników, szczególnie ssaków, a korzystnie ludzi. W tym celu prowadzi się szczepienie osobnika polipeptydem i/lub polinukleotydem BASB020 lub jego fragmentem albo wariantem tak, aby wytworzyć przeciwciało i odpowiedź immunologiczną komórek T w celu ochrony takiego osobnika przed infekcją, szczególnie infekcją bakteryjną, a konkretnie infekcją Moraxella catarrhalis. Taka odpowiedź immunologiczna spowalnia również replikację bakteryjną. Indukowanie odpowiedzi immunologicznej u osobnika, może również polegać na dostarczeniu takiemu osobnikowi sekwencji kwasu nukleinowegowektora, rybozymu do kierowania ekspresją polinukleotydu i/lub polipeptydu BASB020 lub jego fragmentu albo wariantu in vivo w celu indukowania odpowiedzi immunologicznej, takiej jak wytwarzanie przeciwciała i odpowiedzi immunologicznej komórek T obejmującej, na przykład, komórki T wytwarzające cytokinę lub cytotokstyczne komórki T. Indukcję prowadzi się w celu ochrony osobnika, korzystnie człowieka, przed chorobą. Jednym z przykładów podawania genu jest dostarczenie go do pożądanych komórek na cząstkach w postaci opłaszczonej, lub w inny sposób. Taki kwas nukleinowy - wektor może obejmować DNA, RNA, rybozym, zmodyfikowany kwas nukleinowy, hybrydę DNA/RNA, kompleks białkowy DNA-białko lub kompleks białko-RNA.

Rozwiązania według wynalazku umożliwiają również wytworzenie kompozycji immunologicznej, która po wprowadzeniu do osobnika, korzystnie człowieka, u którego można zaindukować odpowiedź immunologiczną, indukuje odpowiedź immunologiczną u takiego osobnika wobec polinukleotydu BASB020 i/lub kodowanego przez niego polipeptydu. Kompozycja taka zawiera zrekombinowany polinukleotyd BASB020 i/lub kodowany przez niego polipeptyd i/lub zawiera DNA i/lub RNA, który koduje i wyraż a antygen takiego polinukleotydu BASB020, kodowanego przez niego polipeptydu lub innego polipeptydu według wynalazku. Odpowiedź immunologiczną można zastosować leczniczo lub profilakPL 199 497 B1 tycznie i może ona przyjąć postać odporności humoralnej i/lub odporności komórkowej, takiej jak odpowiedź komórkowa pochodząca od T-komórek CTL lub CD4⁺.

Polipeptyd BASB020 lub jego fragment można połączyć z innym białkiem lub cząsteczką chemiczną, która może lub nie sama wytwarzać przeciwciała, lecz która jest zdolna do stabilizowania pierwszego białka i wytwarzania fuzji białkowej, albo do białka zmodyfikowanego, które może mieć właściwości antygenowe i/lub immunogenne oraz korzystnie właściwości ochronne. Korzystne jest, jeżeli zrekombinowana fuzja białkowa ponadto zawiera antygenowe białko wspomagające, takie jak lipoproteina D z Haemophilus influenzae, S-transferaza glutationowa lub beta-galaktozydaza lub dowolne inne stosunkowo duże białko wspomagające, które zwiększa rozpuszczalność białka, a przez to ułatwia jego wytwarzanie i oczyszczanie. Ponadto, białko wspomagające może działać jako adiuwant w znaczeniu dostarczania ogólnej stymulacji systemu immunologicznego organizmu otrzymują cego białko. Białko wspomagające może być przyłączone do aminowego lub karboksylowego końca pierwszego białka.

Polipeptydy i polinukleotydy lub ich fragmenty według wynalazku, dla których wykazano, że kodują stałe regiony powierzchniowych białek bakteryjnych mogą być zastosowane w konstruktach polinukleotydowych. Konstrukty takie mogą być stosowane w genetycznych doświadczeniach immunizacyjnych na zwierzęcych modelach infekcji Moraxella catarrhalis. Doświadczenia takie są szczególnie przydatne w identyfikacji epitopów białkowych zdolnych do prowokowania profilaktycznej albo leczniczej odpowiedzi immunologicznej. Uważa się, że to podejście umożliwi wytworzenie monoklonalnych przeciwciał o szczególnej wartości, wywodzących się z narządu zwierzęcia, które jest odporne albo z powodzeniem likwiduje infekcję . Możliwe jest również wytworzenie czynników profilaktycznych lub odpowiedniego postępowania profilaktycznego wobec infekcji bakteryjnej, w szczególności infekcji Moraxella catarrhalis u saków, szczególnie ludzi.

Ponieważ polipeptydy i polinukleotydy mogą być rozkładane w żołądku, korzystne jest podawanie każdego z nich pozajelitowo, włączając w to podawanie podskórne, domięśniowe, dożylne lub doskórne. Kompozycje odpowiednie do podawania pozajelitowego obejmują wodne i niewodne sterylne roztwory do wstrzyknięć, które mogą zawierać przeciwutleniacze, bufory, związki bakteriostatyczne i substancje rozpuszczone, które powodują, że kompozycja jest izotoniczna wobec płynów ustrojowych, korzystnie wobec krwi osobnika. Kompozycje takie mogą również zawierać wodne i niewodne sterylne zawiesiny, które mogą zawierać czynniki zwieszające lub czynniki zagęszczające. Kompozycje mogą być przygotowane w dawkach jednostkowych lub pojemnikach wielodawkowych, na przykład szczelnych ampułkach i fiolkach i mogą być przechowywane w postaci liofilizowanej, wymagającej jedynie dodatku sterylnego, płynnego nośnika bezpośrednio przed użyciem.

Kompozycja szczepionki według wynalazku może również zawierać system adiuwantów, który służy do wzmocnienia immunogenności kompozycji. Korzystnie adiuwanty indukują preferencyjnie odpowiedź typu TH1.

Odpowiedź immunologiczną można ogólnie podzielić na dwie odrębne kategorie, czyli odpowiedź humoralną i komórkową (tradycyjnie odpowiednio charakteryzowane jako mechanizmy obrony przez przeciwciała i efektory komórkowe). Te kategorie odpowiedzi zostały nazwane odpowiedziami typu TH1 (odpowiedź komórkowa) i odpowiedziami immunologicznymi typu TH2 (odpowiedź humoralną).

Skrajne odpowiedzi immunologiczne typu TH1 można scharakteryzować przez wytwarzanie specyficznych dla antygenu, cytotoksycznych limfocytów T o ograniczonym haplotypie i naturalnej odpowiedzi komórek zabijających. U myszy odpowiedzi typu TH1 często charakteryzują się wytwarzaniem przeciwciał podtypu IgG2a, podczas gdy u ludzi odpowiada to przeciwciałom typu IgG1. Odpowiedzi immunologiczne typu TH2 charakteryzują się wytwarzaniem szerokiego zakresu izotypów immunoglobulin, włączając w to IgGl, IgA i IgM u myszy.

Można przyjąć, że cytokiny są odpowiedzialne za te dwa typy odpowiedzi immunologicznej. Wysokie poziomy cytokin typu TH1 prowadzą do faworyzowania indukcji humoralnych odpowiedzi immunologicznych, podczas gdy wysokie poziomy cytokin typu TH2 faworyzują indukcję humoralnych odpowiedzi immunologicznych na antygen.

Rozróżnienie między odpowiedziami immunologicznymi typu TH1 i TH2 nie jest całkowite. W rzeczywistości u osobnika moż e wytworzyć się odpowiedź immunologiczna, która jest opisana jako będąca głównie TH1 lub głównie TH2. Jednakże często korzystne jest traktowanie rodzin cytokin w kategoriach opisanych dla mysich klonów CD4+ komórek T przez Mosmanna i Coffmana (Mosmann T.R. and Coffman. R.L. (1989) TH1 and TH2 cells: different patterns of lymphokine secretion lead to different functional properties. Annual Review of Immunology; 7, str. 145-173). Tradycyjnie, odpowie16

PL 199 497 B1 dziom typu TH1 towarzyszy wytwarzanie cytokin INF-γ i IL-2 przez limfocyty T. Inne cytokiny, takie jak IL-12, często bezpośrednio związane z indukcją odpowiedzi immunologicznej typu TH1, nie są wytwarzane przez komórki T. W przeciwieństwie do tego, odpowiedziom typu TH2 towarzyszy wydzielanie IL-4, IL-5, IL-6 i IL-13.

Wiadomo, że niektóre adiuwanty szczepionkowe są szczególnie przydatne do stymulowania odpowiedzi cytokin bądź typu TH1, bądź TH2. Tradycyjnie najlepsze wskaźniki proporcji TH1:TH2 w odpowiedzi immunologicznej po zaszczepieniu lub infekcji obejmują bezpośredni pomiar wytwarzania cytokin TH1 lub TH2 przez limfocyty T in vitro po powtórnej stymulacji antygenem i/lub pomiar stosunku IgG1:IgG2 w uzyskanych przeciwciałach specyficznych wobec antygenu.

A zatem adiuwant typu TH1 jest takim, który preferencyjnie stymuluje populację izolowanych komórek TH1 do wytwarzania wysokich poziomów cytokin typu TH1, kiedy są powtórnie stymulowane antygenem in vitro, jak również promuje rozwój zarówno cytotoksycznych limfocytów T, jak i specyficznych wobec antygenu odpowiedzi immunoglobulinowych związanych z izotypem TH1.

Adiuwanty, które są zdolne do preferencyjnej stymulacji odpowiedzi komórkowej TH1 są opisane w zgłoszeniach patentowych WO 94/00153 i WO 95/17209.

Jednym z takich adiuwantów jest 3 de-O-acylowany monofosforylolipid A (3D-MPL). Jest on znany z GB 2220211 (Ribi). Chemicznie jest to mieszanina 3 de-O-acylowanego monofosforylolipidu A z 4, 5 lub 6 acylowanymi łańcuchami i jest on wytwarzany przez Ribi Immunochem, Montana. Korzystna postać 3 de-O-acylowanego monofosforylolipidu A jest ujawniona w Patencie Europejskim 0 689 454 B1 (SmithKline Beecham Biologicals SA).

Korzystne jest jeżeli 3D-MPL są dostatecznie małe, aby mogły być filtrowane przez filtr o wielkości 0,22 mikronów (Patent europejski numer 0 689454).

3D-MPL jest w zakresie 10 μg - 100 μg, korzystnie, 25-50 μg na dawkę, podczas gdy antygen zazwyczaj jest w zakresie 2-50 μg na dawkę.

Inny korzystny adiuwant zawiera QS21, oczyszczoną przez HPLC nietoksyczną frakcję pochodzącą z kory Quillaja Saponaria Molina. Frakcja ta ewentualnie może być zmieszana z 3 de-O-acylowanym monofosforylolipidem A (3D-MPL), ewentualnie łącznie z nośnikiem.

Sposób wytwarzania QS21 jest ujawniony w Patencie USA Nr 5,057,540.

Nie wywołujące reakcji kompozycje adiuwantowe zawierające QS21 zostały wcześniej opisane (WO 96/33739). Wykazano, że takie kompozycje zawierające QS21 i cholesterol, po zmniejszaniu razem z antygenem są adiuwantami skutecznie stymulującymi TH1.

Inne adiuwanty, które są korzystnymi stymulatorami odpowiedzi komórkowej TH1, obejmują immunomodulatorowe oligonukleotydy, na przykład niezmetylowane sekwencje CpG, jak ujawniono w WO 96/02555.

Kombinacje różnych adiuwantów stymulujących TH1, takich jak wspomniane powyżej, są również uwzględniane jako adiuwant, który jest korzystnym stymulatorem odpowiedzi komórkowej TH1. Przykładowo, QS21 można zmieszać razem z 3D-MPL. Stosunek QS21 : 3D-MPL będzie zazwyczaj rzędu od 1 : 10 do 10 : 1; korzystnie 1 : 5 do 5 : 1, a często zasadniczo 1 : 1. Korzystny zakres odpowiedniego współdziałania wynosi od 2,5 : 1 do 1 : 1 3D-MPL : QS21.

Korzystnie w kompozycji szczepionki będzie również obecny nośnik. Nośnik może być emulsją olejową albo wodną lub solą glinu, taką jak fosforan glinu albo wodorotlenek glinu.

Korzystne emulsje w wodzie zawierają metabolizowany olej, taki jak skwalen, alfa tokoferol i Tween 80. W szczególnie korzystnie w takiej emulsji antygeny w kompozycji szczepionki łączy się z QS21 i 3D-MPL. Dodatkowo olej w emulsji wodnej może zawierać span 85 i/lub lecytynę i/lub trikaprylinę.

Typowo przeznaczone do podawania ludziom QS21 i 3D-MPL będą obecne w szczepionce w zakresie 1 μg - 200 μg, jak 10 μg - 100 μg, korzystnie, 10 μg - 50 μg na dawkę. Typowo olej w wodzie będzie zawierał od 2 do 10% skwalenu, od 2 do 10% alfa tokoferolu i od 0,3 do 10% Tweenu 80. Korzystnie, stosunek skwalen : alfa tokoferol jest równy lub mniejszy od 1, co daje bardziej stabilną emulsję. Span 85 może być również obecny na poziomie 1%. W niektórych przypadkach korzystne jest, aby szczepionki ponadto zawierały stabilizator.

Nietoksyczne emulsje olejowe w wodzie zawierają nietoksyczny olej, taki jak skwalen, lub skwalen i emulgator np. Tween 80 w wodnym nośniku. Wodnym nośnikiem może być na przykład roztwór soli buforowany fosforanem.

Szczególnie silna kompozycja adiuwanta zawierająca QS21 i 3D-MPL oraz emulsję tokoferolu w wodzie jest opisana w WO 95/17210.

PL 199 497 B1

Rozwiązania według wynalazku umożliwiają wytworzenie kompozycji poliwalentnej szczepionki zawierającej kompozycję szczepionki według wynalazku w kombinacji z innymi antygenami, w szczególności antygenami przydatnymi w leczeniu raków, chorób autoimmunologicznych i pokrewnych stanów chorobowych. Takie kompozycje poliwalentnej szczepionki mogą zawierać adiuwant indukujący TH1, taki jak opisano powyżej.

Wynalazek również dotyczy zastosowania kompozycji obejmującej immunologicznie skuteczną ilość polipeptydu według wynalazku do wytwarzania leku do wywołania odpowiedzi immunologicznej u zwierzęcia.

Ponadto w zakres wynalazku wchodzi zastosowanie kompozycji obejmującej immunologicznie skuteczną ilość polinukleotydu według wynalazku do wytwarzania leku do wywołania odpowiedzi immunologicznej u zwierzęcia.

Kompozycje, zestawy i podawanie

Kompozycje według wynalazku zawierające polipeptyd BASB020 i/lub polinukleotyd BASB020 są odpowiednie do podawania do komórki lub organizmom wielokomórkowym.

Polipeptydy i polinukleotydy według wynalazku można stosować w kombinacji z niesterylnym albo sterylnym nośnikiem lub nośnikami przeznaczonymi do stosowania z komórkami, tkankami lub organizmami, takimi jak farmaceutycznie dopuszczalny nośnik odpowiedni do podawania osobnikowi. Takie kompozycje zawierają na przykład dodatek podłoża lub skuteczną ilość polipeptydów i polinukleotydów według wynalazku i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik lub zaróbkę. Nośniki mogą obejmować między innymi sól fizjologiczną, buforowaną sól fizjologiczną, dekstrozę, wodę, glicerol, etanol lub ich kombinację. Właściwie dobrana kompozycja powinna odpowiadać sposobowi podawania. Kompozycje według wynalazku umożliwiają wytworzenie diagnostycznych i farmaceutycznych pakietów i zestawów zawierających jeden lub więcej pojemników wypełnionych jednym lub większą liczbą składników wspomnianych wcześniej kompozycji.

Polipeptydy i polinukleotydy według wynalazku można stosować pojedynczo lub w połączeniu z innymi zwi ą zkami, przykładowo zwią zkami leczniczymi.

Kompozycje można podawać w skuteczny, wygodny sposób, który może polegać na podawaniu drogą miejscową, doustną, doodbytową, dopochwową, dożylną, dootrzewnową, domięśniową, podskórną, donosową, przezskórną jak i inną.

W leczeniu lub profilaktycznie, aktywny czynnik może być podawany osobnikowi jako kompozycja do wstrzyknięcia, na przykład jako sterylna zawiesina wodna, która korzystnie jest izotoniczna.

Wynalazek również dotyczy kompozycji terapeutycznej zawierającej substancję czynną przydatną do leczenia ludzi z chorobą powodowaną przez Moraxella catarrhalis i dopuszczalny farmaceutycznie nośnik, która jako substancję czynną zawiera co najmniej jedno przeciwciało według wynalazku.

Nośnikami mogą być między innymi sól fizjologiczna, buforowana sól fizjologiczna, dekstroza, woda, glicerol, etanol lub ich kombinacja. Kompozycje terapeutyczne według wynalazku rozwiązania można wykorzystać do wytworzenia zestawów diagnostycznych i farmaceutycznych oraz zestawów zawierających jeden lub więcej pojemników wypełnionych jednym lub większą liczbą składników wspomnianych wcześniej kompozycji terapeutycznych według wynalazku.

Skład i forma kompozycji będzie dostosowana do drogi podawania, na przykład drogi ogólnoustrojowej lub doustnej. Korzystne formy podawania ogólnoustrojowego obejmują wstrzyknięcie, typowo przez wstrzyknięcie dożylne. Można zastosować inne drogi wstrzyknięcia, takie jak podskórne, domięśniowe i dootrzewnowe. Alternatywne sposoby podawania ogólnoustrojowego obejmują podawanie przezśluzówkowe i przezskórne przy zastosowaniu czynników przenikających, takich jak sole żółciowe lub kwasy fusydowe lub innych detergentów. Ponadto, jeżeli polipeptyd lub inne związki według niniejszego wynalazku będą przygotowane w formie dojelitowej lub w postaci kapsułkowanych kompozycji, możliwe jest również podawanie doustne. Podawanie tych związków może być również miejscowe i/lub zlokalizowane, w postaci maści, past, żeli, roztworów, pudrów i temu podobnych.

Przy podawaniu ssakom, a szczególnie ludziom, należy się spodziewać, że dzienna dawka czynnika aktywnego będzie w zakresie od 0,01 mg/kg do 10 mg/kg, typowo około 1 mg/kg. Lekarz w każdym przypadku będzie określał aktualną dawkę , która będzie najbardziej odpowiednia dla określonego osobnika. Powyższe dawki są jedynie przykładowymi. Mogą istnieć oczywiście indywidualne przypadki, w których niezbędne są wyższe lub niższe zakresy dawkowania.

Wymagana dawka zależy od wybranego peptydu, drogi podawania, natury kompozycji, stanu chorobowego i oceny biegłego w tej dziedzinie. Odpowiednie dawkowanie pozostaje jednakże w zakresie 0,1 - 100 μg/kg osobnika.

PL 199 497 B1

Dogodne jest, jeżeli kompozycja szczepionki jest w postaci przeznaczonej do iniekcji. Tradycyjne adiuwanty można stosować do wzmocnienia odpowiedzi immunologicznej. Odpowiednia jednostkowa dawka antygenu do szczepienia wynosi 0,5 - 5 mikrogramów/kg i korzystnie taką dawkę podaje się 1 - 3 krotnie w odstępach od 1 do 3 tygodni. We wskazanym zakresie dawki nie powinno się obserwować niekorzystnych efektów toksykologicznych, które wykluczałyby stosowanie odpowiednim osobnikom.

Można się jednakże spodziewać szerokiego zróżnicowania niezbędnej dawki w związku z różnorodnością dostępnych związków i uzyskiwaną efektywnością wynikającą z różnych dróg podawania. Przykładowo, można oczekiwać, że podawanie doustne będzie wymagało wyższych dawek niż podawanie przez wstrzyknięcie dożylne. Zróżnicowanie w tych poziomach dawek można regulować stosując standardowe empiryczne sposoby optymalizacji, co jest dobrze znane w tej dziedzinie.

Bazy danych sekwencji, sekwencje na trwałym nośniku i algorytmy

Sekwencje polinukleotydowe i polipeptydowe tworzą wartościowe źródło informacji dla określania ich 2- i 3-wymiarowych struktur, jak również identyfikowania dalszych sekwencji homologicznych. Takie podejście ułatwia przechowywanie sekwencji na odczytywalnym przez komputer nośniku, a następnie użycie tych danych w znanych programach dotyczących struktur makromolekularnych. Dane dotyczące sekwencji mogą być również wykorzystane, w celu przeszukiwania baz danych sekwencji, przy zastosowaniu dobrze znanych narzędzi do poszukiwań, takich jak pakiet programów GCG.

Korzystne sposoby analizy sekwencji obejmują, na przykład, sposoby analizy homologii sekwencji, takie jak analiza identyczności i podobieństwa DNA, RNA i analiza struktury białka, składanie sekwencji, analiza kladystyczna, analiza motywów występujących w sekwencji, określanie otwartych ramek odczytu, wywoływanie zasad kwasu nukleinowego, analiza stosowania kodonów, przycinanie zasad kwasu nukleinowego, analiza pików w chromatogramach przy sekwencjonowaniu.

Poniżej przedstawiony jest komputerowy sposób przeprowadzania identyfikacji homologii. Sposób ten obejmuje etapy: dostarczania pierwszej sekwencji polinukleotydowej zawierającej sekwencję polinukleotydową według wynalazku na nośniku odczytywalnym przez komputer i porównywanie takiej pierwszej sekwencji polinukleotydowej z co najmniej jedną drugą sekwencją polinukleotydową lub sekwencją polipeptydową w celu zidentyfikowania homologii.

Komputerowy sposób przeprowadzania identyfikacji homologii może też obejmować etapy: dostarczania pierwszej sekwencji polipeptydowej zawierającej sekwencję polipeptydową według wynalazku na nośniku odczytywalnym przez komputer i porównywanie takiej pierwszej sekwencji polipeptydowej z, co najmniej jedną, drugą sekwencją polinukleotydową lub sekwencją polipeptydową w celu zidentyfikowania homologii.

Wszystkie publikacje i odnośniki, włączając w to między innymi patenty i zgłoszenia patentowe, cytowane w tym opisie są niniejszym włączone w całości jako odniesienia, tak jakby każda indywidualna publikacja lub odnośnik zostały wskazane indywidualnie. Referencje stanowi również dowolne zgłoszenie patentowe, z którego to zgłoszenie zastrzega pierwszeństwo, które niniejszym jest również włączone w całości jako odniesienie, w sposób analogiczny opisany dla publikacji i odnośników.

Definicje „Identyczność”, w dziedzinie, jest pokrewieństwem pomiędzy dwiema lub większą liczbą sekwencji polipeptydowych lub polinukleotydowych, i jest określona przez porównanie sekwencji. W tej dziedzinie techniki „identyczność” oznacza również stopień pokrewieństwa sekwencji pomiędzy sekwencjami polipeptydowymi i polinukleotydowymi, która jest ustalana przez dopasowanie ciągów takich sekwencji. „Identyczność” może być łatwo policzona znanymi metodami, włączając w to, ale nie ograniczając się do tych opisanych w (Computational Molecular Biology; Lesk, A.M., wyd., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Część I, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., wyd. Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heine, G. Academic Press, 1987; oraz Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux. J. wyd. M Stockton Press, New York, 1991; oraz Carillo, H., and Lipman. D., SIAM J Applied Math., 48: 1073 (1988)). Sposoby określania identyczności są tak opracowane, aby znajdowały największe dopasowanie pomiędzy badanymi sekwencjami. Ponadto, sposoby określania identyczności są zakodowane w publicznie dostę pnych programach komputerowych. Sposoby zastosowania programów komputerowych do określania identyczności między dwiema sekwencjami obejmują między innymi program GAP w pakiecie programów GCG (Devereux, J. et al., Nucleic Acids Research 12(1): 387 (1984), BLASTP, BLASTN (Altschul, S.F. et al., J. Molec. Biol. 215: 403-410 (1990) oraz FASTA (Pearson and

PL 199 497 B1

Lipman Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444-2448 (1988). Rodzina programów BLAST jest dostępna publicznie z NCBI i innych źródeł (BLAST Manual, Altschul. S. et al., NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894; Altschul. S., et al., J Mol. Biol. 215: 403-410 (1990). Do określenia identyczności można również zastosować dobrze znany algorytm Smith Waterman.

Parametry do porównywania sekwencji polipeptydowych obejmują co następuje:

Algorytm: Needleman i Wunsch. J. Mol Biol. 48: 443-453 (1970)

Tablice podstawień: BLOSSUM62 z Henikoff i Henikoff.

Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89: 10915-10919 (1992)

Kara za przerwę: 8

Kara za długość przerwy: 2

Przydatnym programem z tymi parametrami jest publicznie dostępny program „gap” z Genetics Computer Group, Madison WI. Wymienione powyżej parametry są domyślnymi parametrami przy porównywaniu peptydów (łącznie z brakiem kary za przerwy końcowe).

Parametry do porównywania sekwencji polinukleotydowych obejmują co następuje:

Algorytm: Needleman and Wunsch. J. Mol Biol. 48: 443-453 (1970)

Tablice podstawień: zgodność = +10, niezgodność = 0

Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89: 10915-10919 (1992)

Kara za przerwę: 50

Kara za długość przerwy: 3

Dostępny jako: Program „gap” z Genetics Computer Group, Madison WI. Są to standardowe parametry przy porównywaniu kwasów nukleinowych.

Korzystne znaczenia terminu „identyczność” dla polinukleotydów i polipeptydów, są przedstawione w poniższych punktach (1) i (2).

(1) Polinukleotyd, który dodatkowo zawiera wyizolowany polinukleotyd obejmujący sekwencję polinukleotydu, która jest co najmniej w 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 97 lub 100% identyczna z sekwencją referencyjną SEKW ID NR: 1, przy czym taka sekwencja polinukleotydowa może być identyczna z sekwencją odniesienia SEKW ID NR: 1 lub moż e obejmować pewną liczbę cał kowitą zmian nukleotydowych w porównaniu do sekwencji referencyjnej, a zmiany są wybrane z grupy składającej się z co najmniej jednej delecji nukleotydowej, podstawienia, włączając w to tranzycję i transwersję, albo insercję, przy czym zmiany mogą wystąpić w pozycjach 5'- lub 3'-końcowych referencyjnej sekwencji nukleotydowej lub w innym miejscu między tymi sekwencjami, przy czym zmiany rozmieszczone są albo pojedynczo wśród nukleotydów w sekwencji stanowiącej odniesienie albo w ciągłych grupach w obrę bie sekwencji stanowi ącej odniesienie. Taka liczba zmian nukleotydowych jest okreś lona przez pomnożenie całkowitej liczby nukleotydów w SEKW ID NR: 1 przez liczbę całkowitą określającą procent identyczności podzieloną przez 100, a następnie odjęcie tego wyniku od całkowitej liczby nukleotydów w SEKW ID NR: 1, albo nn < Xn - (Xn · y), w którym nn jest liczbą zmian nukleotydowych, xn jest cał kowitą liczbą nukleotydów w SEKW ID NR: 1, y wynosi 0,50 dla 50%, 0,60 dla 60%, 0,70 dla 70%, 0,80 dla 80%, 0,85 dla 85%, 0,90 dla 90%,

0,95 dla 95%, 0,97 dla 97% lub 1,00 dla 100%, a · jest symbolem mnożenia, i w którym nie będąca liczbą całkowitą wartość xn i y jest zaokrąglana w dół do najbliższej liczby całkowitej przed odjęciem jej od xn. Zmiany sekwencji polinukleotydowej kodującej polipeptyd z SEKW ID NR: 2 mogą prowadzić do powstania mutacji nonsens, missens lub mutacji zmiany ramki odczytu w tej sekwencji kodującej, zmieniając zatem polipeptyd kodowany przez polinukleotyd po takich zmianach.

Jako przykład, sekwencja polinukleotydowa według niniejszego wynalazku może być identyczna w 100%, albo może zawierać do pewnej liczby całkowitej zmian nukleotydowych w porównaniu do sekwencji stanowiącej odniesienie, tak, że procent identyczności wynosi mniej niż 100% identyczności. Takie zmiany są wybrane z grupy składającej się z co najmniej jednej delecji nukleotydowej, podstawienia, włączając w to tranzycję i transwersję, albo insercji, przy czym takie zmiany mogą wystąpić w pozycjach 5'- lub 3'-końcowych sekwencji nukleotydowej stanowiącej odniesienie, rozmieszczonych albo pojedynczo wśród nukleotydów w sekwencji stanowiącej odniesienie albo w ciągłych grupach w obrębie sekwencji stanowiącej odniesienie. Liczba zmian w kwasie nukleinowym dla danego procentu identyczności jest określona przez pomnożenie całkowitej liczby nukleotydów w SEKW ID NR: 1 przez liczbę całkowitą określającą procent identyczności podzieloną przez 100, a następnie odjęcie tego wyniku od całkowitej liczby nukleotydów w SEKW ID NR: 1, albo nn < xn - (xn · y),

PL 199 497 B1 w którym nn jest liczbą zmian nukleotydowych, xn jest całkowitą liczbą nukleotydów w kwasie nukleinowym w SEKW ID NR: 1, y wynosi na przykład 0,70 dla 70%, 0,80 dla 80%, 0,85 dla 85% itd., • jest symbolem mnożenia, w którym nie będąca liczbą całkowitą wartość Xn i y jest zaokrąglana w dół do najbliższej liczby całkowitej przed odjęciem jej od xn.

(2) Polipeptydy mogą obejmować ponadto wyizolowany polipeptyd mający co najmniej 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 97 lub 100% identyczności z referencyjną sekwencją SEKW ID NR: 2, przy czym sekwencja polipeptydowa może być identyczna z sekwencją odniesienia SEKW ID NR: 2 lub może zawierać do pewnej liczby całkowitej zmiany aminokwasowe w porównaniu z sekwencją stanowiącą odniesienie, przy czym takie zmiany są wybrane z grupy składającej się z co najmniej delecji jednego aminokwasu, podstawienia, włączając w to podstawienia konserwatywne i niekonserwatywne, albo insercji, i zmiany mogą wystąpić w pozycjach amino- lub karboksy- końcowych sekwencji polipeptydowej stanowiącej odniesienie lub w innych miejscach między końcami, przy czym mogą być rozmieszczone albo pojedynczo wśród aminokwasów w sekwencji stanowiącej odniesienie albo w ciągłych grupach w obrębie sekwencji stanowiącej odniesienie, a liczba zmian aminokwasowych jest określona przez pomnożenie całkowitej liczby aminokwasów w SEKW ID NR: 2 przez liczbę całkowitą określającą procent identyczności podzieloną przez 100, a następnie odjęcie tego wyniku od całkowitej liczby aminokwasów w SEKW ID NR: 2, albo n_a < Xa - (Xa · y), w którym na jest liczbą zmian aminokwasowych, xa jest całkowitą liczbą aminokwasów w SEKW ID NR: 2, y wynosi 0,50 dla 50%, 0,60 dla 60%, 0,70 dla 70%, 0,80 dla 80%, 0,85 dla 85%, 0,90 dla 90%, 0,95 dla 95%, 0,97 dla 97% lub 1,00 dla 100%, a • jest symbolem mnożenia i gdzie nie będąca liczbą całkowitą wartość xa i y jest zaokrąglana w dół do najbliższej liczby całkowitej przed odjęciem jej od xa.

Jako przykład, sekwencja aminokwasowa według niniejszego wynalazku może być identyczna z sekwencją referencyjną SEKW ID NR: 2, to znaczy może być identyczna w 100%, albo może zawierać do pewnej liczby całkowitej zmian aminokwasowych w porównaniu z sekwencją stanowiącą odniesienie, tak, że procent identyczności wynosi mniej niż 100% identyczności. Takie zmiany są wybrane z grupy składającej się z co najmniej jednej delecji aminokwasowej, podstawienia, włączając w to podstawienia konserwatywne i niekonserwatywne, albo insercji, przy czym takie zmiany mogą wystąpić w pozycjach końcowych amino- lub karboksy- sekwencji polipeptydowej stanowiącej odniesienie, lub w innych miejscach między końcami, które to zmiany są rozmieszczone albo pojedynczo wśród aminokwasów w sekwencji stanowiącej odniesienie albo w ciągłych grupach w obrębie sekwencji stanowiącej odniesienie. Liczba zmian aminokwasowych dla określonego % identyczności jest określona przez pomnożenie całkowitej liczby aminokwasów w SEKW ID NR: 2 przez liczbę całkowitą określającą procent identyczności podzieloną przez 100, a następnie odjęcie tego wyniku od całkowitej liczby aminokwasów w SEKW ID NR: 2, albo na < xa - (xa • y), gdzie na jest liczbą zmian aminokwasowych, xa jest całkowitą liczbą aminokwasów w SEKW ID NR: 2, y wynosi na przykład 0,70 dla 70%, 0,80 dla 80%, 0,85 dla 85% itd., • jest symbolem mnożenia, przy czym nie będąca liczbą całkowitą wartość xa i y jest zaokrąglana w dół do najbliższej liczby całkowitej przed odjęciem jej od xa.

„Osobnik(i)” jak jest w niniejszym opisie stosowane w odniesieniu do organizmu oznacza wielokomórkowego eukarionta, obejmując, ale nie ograniczając się do wielokomórkowca, ssaka, jajorodnych, bydląt, małp, naczelnych i człowieka.

„Wyizolowany” oznacza „zmieniony ręką ludzką” ze stanu naturalnego, tzn. jeśli występuje w naturze został zmieniony lub wyjęty ze swojego oryginalnego środowiska, lub jednocześnie i wyjęty i zmieniony. Na przykład polinukleotyd lub polipeptyd naturalnie obecny w żywym organizmie nie jest „izolowany”, ale ten sam polinukleotyd lub polipeptyd oddzielony od współistniejących materiałów swego naturalnego stanu jest „izolowany” i w takim znaczeniu jest tu to określenie stosowane. Co więcej, polinukleotyd lub polipeptyd, który jest wprowadzony do organizmu za pomocą transformacji, manipulacji genetycznej lub za pomocą dowolnej innej metody rekombinacyjnej jest „izolowany”, nawet jeśli jest nadal obecny w tym organizmie, który to organizm może być żywy lub nieżywy.

„Polinukleotyd(y)” ogólnie dotyczy dowolnego polirybonukleotydu lub polideoksyrybonukleotydu, który może być niezmodyfikowanym RNA lub DNA lub zmodyfikowanym RNA lub DNA obejmującym regiony jedno- i dwuniciowe.

PL 199 497 B1 „Wariant” dotyczy polinukleotydu lub polipeptydu, który różni się od referencyjnego polinukleotydu lub polipeptydu, ale zachowuje zasadnicze właściwości. Typowy wariant polinukleotydu różni się sekwencją nukleotydów od innego polinukleotydu referencyjnego. Zmiany w sekwencji nukleotydów wariantu mogą zmieniać sekwencję aminokwasów polipeptydu kodowanego przez referencyjny polinukleotyd albo też nie. Zmiany nukleotydów mogą skutkować podstawieniami aminokwasów, addycjami, delacjami, fuzjami i skróceniem polipeptydu kodowanego przez sekwencję referencyjną, jak przedyskutowano poniżej. Typowy wariant polipeptydu różni się sekwencją aminokwasów od innego polipeptydu referencyjnego. Na ogół różnice są ograniczone tak, że sekwencje referencyjnego polipeptydu i wariantu są zasadniczo podobne, i w wielu regionach są identyczne. Wariant i polipeptyd referencyjny mogą różnić się w sekwencji aminokwasów pod względem jednej lub większej liczby substytucji, addycji, delecji i dowolnej ich kombinacji. Podstawiona lub wstawiona reszta aminokwasu może być lub nie być taką, która jest kodowana przez kod genetyczny. Wariant polinukleotydu lub polipeptydu może być naturalnie występujący, taki jak wariant alleliczny, lub może być wariantem, który nie występuje naturalnie. Nie występujące naturalnie warianty polinukleotydów i polipeptydów mogą być przygotowane za pomocą technik mutagenezy lub za pomocą syntezy bezpośredniej.

Termin „Choroba (choroby)” oznacza dowolną chorobę spowodowaną przez, lub związaną z zakaż eniem przez bakterie, włączają c w to przykł adowo, zapalenie ucha ś rodkowego u niemowlą t i dzieci, zapalenie pł uc u osób starszych, zapalenie zatok, zakaż enia szpitalne i choroby inwazyjne, przewlekłe zapalenie ucha środkowego z utratą słuchu, akumulację płynu w uchu środkowym, uszkodzenie nerwu słuchowego, opóźnioną nauką mowy, zakażenie górnych dróg oddechowych i stan zapalny ucha środkowego.

Przykłady

Przykłady poniżej przeprowadzone są standardowymi technikami, które są dobrze znane i rutynowe dla specjalistów, o ile nie jest inaczej szczegółowo podane. Przykłady są ilustracjami, ale nie ograniczają wynalazku.

P r z y k ł a d 1: Odkrycie i sekwencjonowanie DNA genu BASB020 ze szczepu Moraxella catarrhalis ATCC 43617

Gen BASB020 SEQ ID NO: 1 najpierw wykryto w bazie danych Incyte PathoSeq zawierającej nieskończone sekwencje genomowego DNA Moraxella catarrhalis szczep ATCC 43617 (określany jako szczep Mc2931). Translacja sekwencji polinukleotydu BASB020 przedstawionej na SEQ ID NO: 2 wykazała znaczące podobieństwo (36% identyczności w zachodzącej sekwencji 227 aminokwasów) do białka hemolizyny TlyC Serpulina hyodysenteriae.

Sekwencję genu BASB020 dalej potwierdzono eksperymentalnie. W tym celu genomowy DNA wyekstrahowano z 10¹⁰ komórek szczepu M. catarrhalis (szczep ATCC 43617) stosując zestaw do ekstrakcji genomowego DNA QIAGEN (Qiagen Gmbh) i 1 μg tego materiału poddano amplifikacji DNA reakcją łańcuchową polimerazy stosując startery E475781a (5' - ACT TGA ATA AAA CCG AGT G-3') (SEQ ID NO: 9) i E47582a' (5'- GAC ATT GGC CGC AAC ATG C-3') (SEQ ID NO: 10). Ten produkt PCR oczyszczono na Biorobot 9600 (Quiagen Gmbh) i poddano sekwencjonowaniu DNA stosując zestaw Big Dye Cycle Sequencing (Perkin-Elmer) i sekwenser DNA ABI 373A/PRISM. Sekwencjonowanie DNA przeprowadzono na obu niciach z nadmiarem 2 i sekwencję pełnej długości zmontowano stosując program SegMan z pakietu oprogramowania DNASTAR Lasergene. Wynikła sekwencja DNA okazała się w 100% identyczna z SEQ ID NO: 1.

P r z y k ł a d 2. Analiza zmienności genu BASB020 u kilku szczepów Moraxella catarrhalis

2A. Analiza długości fragmentów restrykcyjnych (RFLP)

Genomowy DNA wyekstrahowano z 16 szczepów M. catarrhalis (przedstawionych w Tabeli 1) jak opisano poniżej. M. catarrhalis wysiewano na pojedyncze kolonie na płytkach z agarem BHI i hodowano przez noc w 37°C. Pobierano trzy lub cztery pojedyncze kolonie i stosowano do inokulacji hodowli wyjściowej ok. 1,5 ml na bulionie BHI (wyciąg z mózgu i serca), którą hodowano przez noc w wytrząsającym inkubatorze ok. 300 obr./min. w 37°C. Kolbę erlenmeyera zawierającą ok. 150 ml bulionu BHI zaszczepiono hodowlą wyjściową i hodowano przez ok. 12-16 godzin w 37°C w wytrząsającym inkubatorze, ok. 175 obr./min., aby uzyskać masę komórek do izolacji DNA. Komórki zbierano przez wirowanie w rotorze Sorvall GSA przy ok. 2000 x g przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Supernatant usunięto i osad komórek zawieszono w ok. 5,0 ml sterylnej wody. Do komórek dodano równą objętość buforu do lizy (200 mM NcCl, 20 mM EDTA, 40 mM Tris-HCl, pH 8,0, 0,5% (masa/obj.) SDS, 0,5% (obj./obj.) 2-merkaptoetanol, i 250 μg/ml proteinazy K i komórki zawieszono przez delikatne wytrząsanie i rozdrabnianie. Zawiesinę komórek następnie inkubowano ok. 12 godzin w 50°C aby

PL 199 497 B1 zlizować bakterie i uwolnić chromosomalny DNA. Białkowy materiał strącano przez dodanie 5,0 ml nasyconego NaCl (ok. 6,0 M w sterylnej wodzie) i wirowanie przy ok. 5500 x g w rotorze Sorvall SS34 w temperaturze pokojowej. DNA chromosomalny strącono z klarowanego supernatantu przez dodanie dwóch objętości 100% etanolu. Zagregowany DNA zebrano i przepłukano stosując łagodne mieszanie w małej objętości roztworu 70% etanolu. Oczyszczony chromosomalny DNA zawieszono w sterylnej wodzie i pozwolono mu na rozpuszczenie/rozproszeniu przez noc w 4°C przed delikatne wytrząsanie. Stężenie rozpuszczonego DNA określono spektrofotometrycznie przy 260 nm stosując współczynnik ekstynkcji 1,0 jednostka OD ok. 50 μg/ml.

Materiał następnie poddano amplifikacji PCR stosując oligonukleotydy MC-Hly3-BamF (5' - AAG GGC CCA ATT ACG GAG AGG GGA TCC ATG CGT GGT CTT AGG CGT TGG TTA TCC ACC G-3' ) (SEQ ID NO: 11) i MC-Hly3-SalRC (5' AAG GGC CCA ATT ACG GAG AGG GTC GAC TTA TTA TTC AGC ATT CTC AAG CTG TGG TAT CAG-3') (SEQ ID NO: 12). Odpowiednie amplikony genu BASB020 następnie poddano niezależnie hydrolizie stosując enzymy restrykcyjne (AciI, Alul, Hphl, Msel, Nlalll, Tsp5091) i produkty trawienia rozdzielono za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym lub poliakryloamidowym stosując standardowe procedury biologii molekularnej jak opisano w „Molecular Cloning: a Laboratory Manual, wydanie 2, Red. Sambrook, Fritsch i Maniatis, Cold Spring Harbor Press 1989). Fotografie powstałych żeli przedstawiono na Fig. 1. Dla każdego żelu określono wzory odpowiadające 6 enzymom restrykcyjnym i połączono je. Następnie zdefiniowano grupy mające identyczne kombinacje wzorów RFLP. Stosując tę metodologię szczepy badane w tej pracy podzieliły się na 6 grup genomowych (Grupa 1: Mc2904, Mc2905, Mc2906, Mc2969; Grupa 2: Mc2907, Mc2913; Grupa 3: Mc2908, Mc2909, Mc2931, Mc2975; Grupa 4: Mc2910, Mc2912, Mc2956; Grupa 5: Mc2911; Grupa 6: Mc2926). Dane te potwierdzają, że stosowana w badaniach populacja Moraxella catarrhalis wykazuje pewną różnorodność sekwencji dla genów BASB020.

2B. Sekwencjonowanie DNA w innych szczepach

Szczep ATCC 43617 (Mc2931) stosowany do określenia sekwencji BASB020 był zaklasyfikowany za pomocą RFLP do grupy numer 3. Stosując procedurę eksperymentalną opisaną w przykładzie 1, określono sekwencję genu BASB020 w szczepach Moraxella catarrhalis reprezentujących trzy inne genomowe grupy RFLP (Gr. 1 (Mc2969), Gr. 2 (Mc2913) i Gr. 4 (Mc2912). Sekwencja polinukleotydów genu BASB020 szczepów Mc2912, Mc2913 i Mc2969 jest przedstawiona odpowiednio w SEQ ID NO: 3, 5 i 7. Te sekwencje polinukleotydów poddano translacji do sekwencji aminokwasów, które są przedstawione odpowiednio w SEQ ID NO: 4, 6 i 8. Stosując program MegAlign pakietu DNASTAR Lasergene dokonano wielokrotnego przyrównania sekwencji polinukleotydów SEQ ID NO: 1, 3, 5 i 7 i jest ona przedstawiona na Fig. 2. Porównanie parami identyczności jest podsumowane w Tabeli 2 pokazując, że cztery sekwencje nukleotydów genu BASB020 są wszystkie podobne przy poziomie identyczności równym lub większym od 99%. Stosując ten sam program przeprowadzono wielokrotne przyrównanie sekwencji polipeptydów SEQ ID NO: 2, 4, 6 i 8 i przedstawiono je na Fig. 3. Porównanie identyczności parami jest przedstawione w Tabeli 3, pokazuje, że wszystkie sekwencje białka BASB020 są podobne na poziomie identyczności równym lub większym od 99%.

PL 199 497 B1

T a b e l a 1. Cechy szczepów Moraxella catarrhalis stosowanych w tych badaniach

Szczep	Izolowany w	z
Mc2904	USA	nakłucie błony bębenkowej
Mc2905	USA	nakłucie błony bębenkowej
Mc2906	USA	nakłucie błony bębenkowej
Mc2907	USA	nakłucie błony bębenkowej
Mc2908	USA	ostre zapalenie ucha nakłucie błony bębenkowej
Mc2909	USA	nakłucie błony bębenkowej
Mc2910	USA	nakłucie błony bębenkowej
Mc2911	USA	ostre zapalenie ucha nakłucie błony bębenkowej
Mc2912	USA	ostre zapalenie ucha nakłucie błony bębenkowej
Mc2913	USA	ostre zapalenie ucha nakłucie błony bębenkowej
Mc2926	USA	nakłucie błony bębenkowej
Mc2931/ATCC	USA	aspirat przeztchawicowy
Mc2956	Finlandia	Płyn ucha środkowego
Mc2960	Finlandia	Płyn ucha środkowego
Mc2969	Norwegia	Nosogardziel (zapalenie gardła/nieżyt nosa)
Mc2975	Norwegia	Nosogardziel (nieżyt nosa)

T a b e l a 2: Identyczność par sekwencji polinukleotydowych BASB020 (w %)

	Seq lD Nr: 3	Seq lD Nr: 5	Seq lD Nr: 7
Seq lD Nr: 1	99,5	99,2	99,3
Seq lD Nr: 3		99,6	99,3
Seq lD Nr: 5			99,4

T a b e l a 3: Identyczność par sekwencji polipeptydowych BASB020 (w %)

	Seq lD Nr: 4	Seq lD Nr: 6	Seq lD Nr: 8
Seq lD Nr: 2	99,6	99,6	100
Seq lD Nr: 4		100	99,6
Seq lD Nr: 6			99,6

P r z y k ł a d 3: Konstrukcja plazmidu do wyrażania zrekombinowanego BASB020

A. Klonowanie BASB020

Miejsca restrykcyjne BamHI i SalI wprowadzono do starterów do amplifikacji, lewego ([SEQ ID NO: 12]) i prawego ([SEQ ID NO: 12]), odpowiednio, umożliwiając ukierunkowane klonowanie produktu PCR wielkości 504 bp w dostępnym handlowo plazmidzie ekspresyjnym pQE30 (QiaGen, oporny na ampicylinę), tak, że dojrzałe białko BASB20 mogło być wyrażane jako fuzja białkowa zawierająca znacznik (His) 6 do chromatografii powinowactwa na końcu N. Produkt PCR BASB20 oczyszczano z reakcji powielania przy zastosowaniu krzemionkowych kolumn do wirowania (QiaGen) zgodnie z instrukcjami producenta. W celu uzyskania wymaganych do klonowania koń ców BamHI i SalI, oczyszczony produkt PCR całkowicie trawiono kolejno enzymami restrykcyjnymi BamHI i SalI, jak rekomendowano przez producenta (Life Technologies). Po pierwszej reakcji trawienia produkt PCR

PL 199 497 B1 oczyszczano przez kolumnę do wirowania tak, jak wyżej w celu usunięcia soli i wymywano sterylną wodą przed trawieniem drugim enzymem. Strawione fragmenty DNA oczyszczano ponownie przy użyciu krzemionkowych kolumn do wirowania przed ligacją z plazmidem pQE30.

B. Wytwarzanie wektora ekspresyjnego

W celu wytworzenia wektora ekspresyjnego pQE30 do ligacji, strawiono go cał kowicie w podobny sposób BamHI i SalI, a następnie traktowano fosfatazą z jelita cielęcego (CIP, ~0,02 jednostki/pmoli końców 5', Life Technologies) zgodnie z zaleceniami producenta dla zapobieżenia samoligacji. Około 5-krotny molowy nadmiar przygotowanego strawionego wektora użyto do przeprowadzenia reakcji ligacji. Przeprowadzono standardową reakcję w objętości ~20 μΐ (~16°C, ~16 godzin), stosując metody dobrze znane w tej dziedzinie, z zastosowaniem ligazy DNA T4 (~2,0 jednostek/reakcję, Life Technologies). Próbki ligacji (~5 μθ użyto do transformacji elektrokompetentnych komórek M15 (PREP4) zgodnie z metodami dobrze znanymi w tej dziedzinie. Po 2-3 godzinach okresu wzrostu w 37°C w ~1,0 ml bulionu LB transformowane komórki wysiewano na płytki z agarem LB zawierającym kanamycynę (50 μg/ml) i ampicylinę (100 μg/ml). Obydwa antybiotyki znajdowały się w podłożu selekcyjnym, aby zagwarantować, że wszystkie transformowane komórki niosą obydwa plazmidy: plazmid pREP4 (KnR), który niesie gen laclq niezbędny do represji ekspresji białek, których ekspresja z pQE30 jest indukowana przez IPTG, oraz plazmid pQE30-BASB020 (ApR). Płytki inkubowano przez noc w 37°C przez ~16 godzin. Pojedyncze kolonie KnR/ApR pobierano sterylnymi wykałaczkami używano do „rozmazu” na świeżych płytkach LB KnR/ApR, jak również zaszczepienia ~1,0 ml hodowli w bulionie LB KnR/ApR. zarówno płytki, jak i hodowle bulionowe inkubowano przez noc w 37°C w standardowym inkubatorze (płytki) lub łaźni wodnej z wytrząsaniem.

Analizę PCR w oparciu o całe komórki zastosowano do sprawdzenia, czy transformanty zawierają wstawkę DNA BASB020. W tym przypadku, ~1,0 ml nocnej hodowli w bulionie LB Kn/Ap przenoszono do 1,5 ml probówki polipropylenowej i komórki zbieranino poprzez wirowanie w mikrowirówce Beckmann (~3 min., temp. pokojowa, -12000 X g). Osad komórkowy zawieszano w ~200 μl sterylnej wody i próbki ~10 μl użyto do przygotowania mieszaniny reakcyjnej do PCR o końcowej objętości ~50 μl PCR zawierającej obydwa, lewy i prawy, startery BASB020 do amplifikacji. Końcowe stężenie składników reakcji PCR było zasadniczo takie samo jak opisane w Przykładzie 2 z tą różnicą, że użyto ~5,0 jednostek polimerazy Taq.

Wyjściowy etap denaturacji w 95°C wydłużono do 3 minut dla zapewnienia termicznego rozbicia komórek bakteryjnych i uwolnienia plazmidowego DNA. Termocykler ABI Model 9700 i 32 cykle z trójstopniowym termicznym profilem amplifikacji tj., 95°C; 45 sek.; 55-58°C, 45 sek., 72°C, 1 min., zastosowano do powielenia fragmentu PCR MC-P6 z próbek zlizowanych transformantów. Próbki ~20 μl mieszaniny reakcyjnej analizowano poprzez elektroforezę w żelu agarozowym (0,8% agaroza w buforze Tris-octan-EDTA (TAE)). Fragmenty DNA uwidaczniano poprzez naświetlenie UV po elektroforezie i barwieniu bromkiem etydyny. Standard wielkości cząsteczek DNA (1 Kb ladder, Life Technologies) poddano elektroforezie równolegle z próbkami testowymi i użyto do oszacowania wielkości produktów PCR. Transformanty, które dawały spodziewany produkt PCR o wielkości 504 bp identyfikowano jako szczep zawierający konstrukt ekspresyjny BASB020. Ekspresję szczepów zawierających plazmidy analizowano następnie pod kątem indukowalnej ekspresji zrekombinowanych BASB020.

C: Analiza ekspresji w transformantach PCR-pozytywnych.

Dla każdego transformanta PCR-pozytywnego zidentyfikowanego powyżej, ~5,0 ml bulionu LB zawierającego kanamycynę (50 μg/ml) i ampicylinę (100 μg/ml) zaszczepiono komórkami z rozmazów na szalkach i hodowano przez noc w 37°C z wytrząsaniem (~250 obr./min.). Próbkami hodowanej przez noc hodowli (~1,0 ml) zaszczepiano 125 ml butelki Erlenmeyera zawierające ~25 ml bulionu LB Kn/Ap i hodowano w 37°C z wytrząsaniem (~250 obr./min.) aż do osiągnięcia gęstości optycznej O.D.600 ~0,5, tj. fazy wzrostu logarytmicznego (zwykle około 1,5 - 2,0 godziny). Wtedy około połowy hodowli (~12,5 ml) przenoszono do drugiej 125 ml butelki i indukowano ekspresję zrekombinowanego białka BASB020 indukowano poprzez dodanie IPTG (1,0 M roztwór wyjściowy w sterylnej wodzie, Sigma) do stężenia końcowego 1,0 mM. Inkubację z indukowanymi IPTG i nieindukowanymi hodowlami kontynuowano przez dodatkowe ~4 godziny w 37°C z wytrząsaniem. Próbki (~1,0 ml) zarówno z zaindukowanych, jak i niezaindukowanych hodowli pobierano po okresie indukcji i komórki zbierano poprzez wirowanie w mikrowirówce w temperaturze pokojowej ~3 minuty. Odrębne osady komórkowe zawieszano w ~50 μl sterylnej wody, a następnie mieszano z równą objętością buforu do próbek

X Laemelli SDS-PAGE, zawierającego 2-merkaptetanol i umieszczano we wrzącej łaźni wodnej na min. w celu denaturacji białka. Równe ilości (~15 μΓ> zaindukowanych IPTG i niezaindukowanych

PL 199 497 B1 surowych lizatów komórkowych nałożono w powtórzeniu na 12% żel poliakryloamidowy Tris/glicyna (Mini-żele, 1 mm grubości, Novex). Próbki zaindukowanych IPTG i niezaindukowanych lizatów poddawano elektroforezie razem z barwionym wstępnie markerem masy cząsteczkowej (SeeBlue, Novex) w standardowych warunkach, stosując standardowy bufor do elektroforezy SDS/Tris/glicyna (BioRad). Po elektroforezie jeden żel barwiono Commassie brilliant blue R250 (BioRad), a następnie odbarwiano w celu uwidocznienia nowych indukowanych IPTG białek BASB020. Drugi żel przenoszono metodą elektrotransferu na filtr PVDF (rozmiar porów 0,45 mikron, Novex) przez ~2 godz. w 4°C przy użyciu aparatu BioRad Mini-Protean II i buforu do transferu Towbina z metanolem (20%). Blokowanie filtra i inkubację z przeciwciałem przeprowadzono zgodnie z metodami dobrze znanymi w tej dziedzinie. Monoklonalne przeciwciało anti-RGS (His)3 i następnie drugie anty-mysie przeciwciało królicze skoniugowane z HRP (QiaGen) użyto do potwierdzenia ekspresji i tożsamości zrekombinowanego białka BASB020. Uwidocznienie wzoru będącego wynikiem reakcji z przeciwciałami anty-His uzyskano stosując bądź nierozpuszczalny substrat ABT bądź używając Hyperfilm w systemie chemiluminescencji Amersham ECL.

D. Potwierdzenie sekwencji

W celu dalszego sprawdzenia, że wyrażane zrekombinowane białko BASB020 indukowalne IPTG jest prawidłową otwartą ramką odczytu, a nie fałszywą cząsteczką powstającą jako artefakt klonowania (tj. zmiany ramki odczytu), określono sekwencję DNA sklonowanej wstawki. Sekwencję DNA genu BASB020 M. catarrhalis uzyskano z jednej nici stosując metodologię konwencjonalnego asymetrycznego cyklicznego sekwencjonowania z zastosowaniem PCR (ABI Prism Dye-Termninator Cycle Sequencing, Perkin-Elmer). Reakcje sekwencjonowania zaprojektowano z nie-trawionym DNA plazmidu ekspresyjnego (~0,5 μg/rxn) jako matrycą i odpowiednimi specyficznymi dla wektora pQE30 i specyficznymi dla ORF starterami do sekwencjonowania (~3,5 pmol/rxn). Poza matrycą i starterami do sekwencjonowania, każda reakcja sekwencjonowania (~20 μθ zawierała, cztery różne dNTPs (tj. A, G, C i T) oraz cztery odpowiadające im terminatorowe nukleotydy ddNTP (tj. ddA, ddG, ddC i ddT); gdzie każdy terminator jest skoniugowany z jednym z czterech barwników fluorescencyjnych, Joe, Tam, Rox lub Fam. Produkty wydłużania z sekwencjonowania jednej nici kończyły się w losowych pozycjach wzdłuż matrycy na skutek włączenia wyznakowanych barwnikiem terminatorów ddNTP. Fluorescencyjne wyznakowane barwnikiem produkty terminacji oczyszczano przy zastosowaniu mikrowirówkowych kolumn do sączenia molekularnego (Princeton Genetics), suszono pod próżnią, zawieszano w buforze Template Resuspension Buffer (Perkin-Elmer) do elektroforezy kapilarnej lub dejonizowanym formamidzie do PAGE, denaturowano w 95°C przez ~5 min. i analizowano poprzez elektroforezę kapilarną o wysokiej rozdzielczości (ABI 310 Automated DNA Sequenator. Perkin-Elmer) lub PAGE o wysokiej rozdzielczości (ABI 377 Automated DNA Sequenator) zgodnie z zaleceniami producenta. Dane o sekwencji DNA uzyskane z pojedynczych reakcjach zbierano i względne intensywności pików fluorescencji analizowano automatycznie na komputerze PoweMAC przy użyciu oprogramowania ABI Sequence Analysis Software (Perkin-Elmer). Indywidualnie analizowane sekwencje DNA były wpisywane ręcznie w celu uniknięcia błędu przed złożeniem ich w jednoniciowy ciąg sekwencji pryz użyciu oprogramowania AutoAssembler (Perkin-Elmer). Sekwencjowanie wykazało, że plazmid ekspresyjny zawierał prawidłową sekwencję we właściwej otwartej ramce odczytu.

P r z y k ł a d 4. Wytwarzanie zrekombinowanego BASB020

Szczep bakteryjny

Szczep E. coli M15 (pREP4) do ekspresji zrekombinowanych białek zawierający plazmid (pQE30) kodujący BASB020 z M. catarrhalis zastosowano do wytwarzania masy komórkowej do oczyszczania zrekombinowanego białka. Szczep do ekspresji hodowano na płytkach z agarem LB zawierającym 50 μg/ml kanamycyny („Kn”) i 100 μg/ml ampicyliny („Ap”) dla upewnienia się, że zarówno plazmid kontrolny pREP4 laclq, jak i konstrukt ekspresyjny pQE30-BASB020 są zachowywane. Do przechowywania w stanie zamrożonym w -80°C, szczep hodowano w bulionie LB zawierającym takie samo stężenia antybiotyków, a następnie mieszano z równą objętością bulionu LB zawierającego 30% (wag./obj.) glicerolu.

Pożywki

Pożywka fermentacyjna stosowana do wytwarzania zrekombinowanego białka składała się z bulionu

X YT (Disco) zawierającego 50 μg/ml Kn i 100 μg/ml Ap. Do pożywki w fermentorze dodawano czynnika zapobiegającego pienieniu Antifoam w stężeniu 0,25 ml/l (Antifoam 204, Sigma). W celu

PL 199 497 B1 zaindukowania ekspresji zrekombinowanego białka BASB020 do fermentora dodawano IPTG (Izopropylo-e-D-tiogalaktopiranozyd) 1 mM, końcowe stężenie).

Fermentacja

500 ml butelkę Erlenmeyera zawierającą 50 ml objętości pożywki zaszczepiano 0,3 ml szybko rozmrożonej hodowli lub kilku koloniami z hodowli na selekcyjnych płytkach agarowych i inkubowano przez około 12 godzin w 37 ± 1°C na platformie wytrząsarki przy 150 rpm (Innova 2100, New Brunswick Scientific). Tą hodowlę użyto następnie do zaszczepienia fermentora zawierającego 5 l bulionu 2X YT oraz antybiotyki Kn i Ap. Fermentor (Bioflo 3000, New Brunswick Scientific) był nastawiony na 37 = 1°C, ze skraplaniem powietrza 0,2 - 0,4 VVM, 250 rpm w wirniku Rushton. pH nie było kontrolowane w żadnej z butelek hodowlanych ani w fermentorze. W czasie fermentacji pH w fermentorze pozostawało w zakresie 6,5 do 7,3. IPTG (1,0 M roztwór wyjściowy, przygotowany w sterylnej wodzie) dodawano do fermentora kiedy hodowla osiągała stadium wzrostu logarytmicznego (~0,7 jednostek OD 600). Komórki indukowano przez 2-4 godziny, a następnie zbierano poprzez odwirowanie, stosując albo wirówkę 28RS Heraeus (Sepetach) albo szybkoobrotową wirówkę RC5C (SorvalI Instruments). Pastę komórkową przechowywano przed obróbką w -20°C.

Oczyszczanie

Odczynniki i materiały

Imidazol, chlorowodorek guanidyny, Tris (hydroksymetyl) i EDTA (kwas etylenodiaminotetraoctowy) jakości biotechnologicznej albo lepszej były otrzymane z Ameresco Chemcial, Solon, Ohio. Tryton X-100 (t-Octylofenoksypolietoksy-etanol), fosforan sodowy jednozasadowy i mocznik jakości do reakcji lub lepsze i były otrzymane z Sigma Chemical Company, St. Louis, Missouri. Lodowaty kwas octowy i kwas solny otrzymano z Mallincrodt Baker Inc., Phillipsburg, New Jersey. Metanol otrzymano z Fisher Scientific, Fairlawn, New Jersey. Pefabloc^®S.C. (4-(2aminoetylo)-benzenosulfonylofluorek), tabletki z mieszaniną proteaz - Complete protease inhibitor i PMSF (fenylometylo-sulfonylofluorek) otrzymano z Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, Indiana. Bestatynę, Pepstattynę A i inhibitor proteaz E-64 otrzymano z Calbiochem. LaJolla, California. Roztwór soli Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (1 x PBS) otrzymano z Quality Biological, Inc., Gaithersburg, Maryland. Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (10 x PBS) otrzymano z BioWhittaker, Walkersville, Maryland. Przeciwciało Penta-His, wolne od BSA otrzymano z QiaGen, Valencia, California. Kozie anty-mysie IgG AffiniPure koniugowane z peroksysdazą otrzymano z Jackson Immuno Research, West Grove, Penn. Roztwór AEC otrzymano z Zymed, South San Francisco, California. Wszystkie inne odczynniki były chemicznie czyste lub lepsze. Żywicę Ni-NTA Superflow otrzymano z QiaGen Inc., Valencia, California. Gotowe 4-20% i 10-20% żele poliakryloamidowe Tris-Glicyna, wszystkie bufory do elektroforezy i roztwory, barwione standardy SeeBlue, standard MultiMark Multi-Colored i filtry do transferu PVDF otrzymano z Novex, San Diego, California. Zestaw SDS-PAGE Silver Stain otrzymano z Daiichi Pure Chemicals Company Limitef, Yokyo, Japa. Coomassie Stain Solution otrzymano z Bio-Rad Laboratories, Hercules, California. Filtry strzykawkowe Acrodisc® PF 0,2 μm otrzymano z Pall Gelman Science, Ann Arbor, Michigan. Jednorazowe filtry strzykawkowe GDIX 25 mm otrzymano z Whatman Inc. Clifton, New Jersey. Worki dializacyjne 8,000 MWCO otrzymano z BioDesign Inc. od New York, Carmal New York. BCA Protein Assay Reagents i worki dializacyjne Snake Skin 3,500 MWCO otrzymano z Pierce Chemical Co. Rockford, Illinois.

Protokół ekstrakcji

Pastę komórkową rozmrażano w temperaturze pokojowej przez 30 do 60 minut. Pięć do sześciu gramów materiału odważono w 50 ml jednorazowych probówkach wirowniczych. Do tego dodawano pięć ml/gram buforu z chlorowodorkiem guanidyny (Gu-HCl) (6 M chlorowodorek guanidyny, 100 mM fosforan sodowy jednozasadowy, 10 mM Tris i 0,05% Tryton X-100, pH 8,0). Postać komórkową zawieszano przy użyciu homogenizatora PRO300D, 1 mocy przez jedną minutę. Mieszaninę ekstrakcyjną umieszczano następnie w temperaturze pokojowej z łagodnym mieszaniem na 60 do 90 minut. Po 60 do 90 minutach mieszaninę ekstrakcyjną wirowano przy 15800 x g przez 15 minut (wirówka Sorvall RC5C, 11500 rpm). Supernatant (S1) dekantowano i zachowywano do dodatkowego oczyszczania. Osad (P1) zachowywano do analizy.

Wiązanie BASB020 do żywicy nikiel-NTA

Do S1 dodawano trzy do czterech ml żywicy Ni-NT. To umieszczano następnie w temperaturze pokojowej z łagodnym mieszaniem na jedną godzinę. Po jednej godzinie S1/Ni-NTA nakładano na kolumnę XK16 Pharmacia. Kolumnę następnie przemywano 1 M buforem Gu-HCl (6 M chlorowodorek guanidyny, 100 mM fosforan sodowy jednozasadowy, 10 mM Tris i 0,05% Tryton X-100, pH 8,0). Po

PL 199 497 B1 tym następowało przemywanie buforem fosforanowym (100 mM fosforan sodowy jednozasadowy, 10 mM Tris i 0,05% Tryton X-100, pH 6,3). Białko wymywano z kolumny buforem z 250 mM imidazolem (250 mM imidazol, 100 mM fosforan sodowy jednozasadowy, 10 mM Tris i 0,05% Tryton X-100, pH 5,9).

Ostateczne ustalanie składu

Skład BASB020 ustalano poprzez dializowanie przez noc wobec trzech zmian 0,1% Tryton X-100 i 1 x PBS, pH 7,4 celem usunięcia resztek Gu-HCl i imidazolu. Oczyszczone białko charakteryzowano i używano do wytwarzania przeciwciał, jak opisano niżej.

Charakterystyka biochemiczna

SDS-PAGE i analiza Western

Zrekombinowane oczyszczone białko rozdzielano na 4-20% żelu poliakryloamidowym i przenoszono elektroforetycznie na filtry PVDF przy 100 V przez 1 godzinę jak opisano wcześniej. (Thebaine et al. 1979. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 4350-4354). Filtry PVDF traktowano wstępnie 25 ml buforowanego fosforanem roztworu soli Dulbecco zawierającego 5% odtłuszczone mleko. Wszystkie następujące dalej inkubacje przeprowadzono używając takiego buforu do wstępnej inkubacji.

Filtr PVDF inkubowano z 25 ml rozcieńczenia 1:500 surowicy przed szczepieniem albo surowicy królika z przeciwciałami anty-His przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Filtry PVDF płukano następnie dwukrotnie buforem do płukania (20 mM bufor Tris, pH 7,5, zawierającym 150 mM chlorek sodowy i 0,05% Tweed-20). Filtry PVDF inkubowano z 25 ml rozcieńczenia 1:5000 wyznakowanych peroksydazą kozich antykróliczych IgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Filtry PVDF płukano następnie cztery razy buforem do płukania i wywoływano przy użyciu 3-amino-9-etylokarbazolu i nadtlenku mocznika dostarczonego przez Zymed (San Francisco, CA), każdy przez 10 minut.

Wyniki SDS-PAGE (Fig. 4) pokazują obecność białka około 32-35 kDa oczyszczonego w ponad 90%, które reaguje z przeciwciałami anty-RGS (His) na filtrach Western (Fig. 5) po SDS-PAGE.

Sekwencjonowanie białka

Sekwencjonowanie oczyszczonego białka od końca aminowego przeprowadzono w celu potwierdzenia wytwarzania prawidłowego zrekombinowanego białka przy użyciu dobrze zdefiniowanych protokołów chemicznych na sekwentatorze Hewlett-Packard model G1000A z modelem 1090 LC i na sekwentorze Hewlett-Packard model 241 z modelem 1100 LC.

P r z y k ł a d 5

Wytwarzanie surowic przeciwko zrekombinowanemu BASB020

Poliwalentne surowice skierowane przeciwko białku BASB020 wytworzono poprzez zaszczepienie dwóch królików oczyszczonym zrekombinowanym białkiem BASB020. Każde zwierzę otrzymało razem około trzech immunizacji domięśniowo (i.m.) z około 20 μg białka BASB020 na zastrzyk (na początku z kompletnym adiuwantem Freunda, a następnie z niekompletnym adiuwantem Freunda, a następnie z niekompletnym adiuwantem Freunda) w odstępach około 21 dni. Zwierzęta skrwawiano przed pierwszą immunizacją („wstępne skrwawienie”) w dniu 35 i 57. Miana przeciwciała anty-białko BASB020 mierzono poprzez test ELISA stosując oczyszczone zrekombinowane białko BASB020 (0,5 μg/studzienkę). Miano definiowano jako największe rozcieńczenie równe lub większe niż 0,1, jak obliczono z zastosowaniem następującego równania: średnie OD z dwóch testowanych próbek antysurowicy - średnie OD dwóch testowanych próbek buforu. Miana po trzech immunizacjach wynosiły pomiędzy 3000 i 8000.

Antysurowice użyto jako pierwsze przeciwciało do zidentyfikowania białka w analizie Western jak odpisano w Przykładzie 4, powyżej. Analiza Western wykazała obecność przeciwciał antyBASB020 w surowicy immunizowanych zwierząt.

P r z y k ł a d 6. Charakterystyka immunologiczna

Analiza Western

Kilka szczepów M. catarrhalis włączając w to ATCC 49143 i ATCC 43617, jak również izolaty kliniczne z różnych regionów geograficznych hodowano na płytkach z agarem czekoladowym przez 48 godzin w 35°C w 5% CO2. Kilka kolonii użyto do zaszczepienia 25 ml bulionu Muller Hinton w 250 ml butelce. Hodowle hodowano przez noc i zbierano przez wirowanie. Komórki upłynniano następnie poprzez zawieszenie 30 μg komórek w 150 μl buforu do próbek PAGE (360 mM bufor Tris, pH 8,8, zawierający 4% sodowy siarczan dodecylu i 20% glicerol) i inkubowano zawiesinę w 100°C przez 5 minut. Upłynnione komórki rozdzielano w 4-20% żelach poliakryloamidowych i rozdzielone białka przenoszono elektroforetycznie na filtry PVDF przy 100V przez 1 godzinę jak opisano wcześniej

PL 199 497 B1 (Thebaine et al. 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 4350-4354). Filtry PVDF traktowano wstępnie 25 ml buforowanym fosforanem roztworem soli Dulbecco zawierającym 5% odtłuszczone mleko. Wszystkie następujące dalej inkubacje przeprowadzono używając takiego buforu do wstępnej inkubacji.

Filtry PVDF inkubowano z 25 ml rozcieńczenia 1:500 surowicy przed szczepieniem albo surowicy królika z przeciwciałami przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Filtry PVDF płukano następnie dwukrotnie buforem do płukania (20 mM bufor Tris, pH 7,5, zawierający 150 mM chlorek sodowy i 0,05% Tween-20). Filtry PVDF inkubowano z 25 ml rozcieńczenia 1:5000 wyznakowanych peroksydazą kozich antykróliczych IgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Filtry PVDF płukano następnie cztery razy buforem do płukania i wywoływano przy użyciu 3-amino-9-etylokarbazolu i nadtlenku mocznika dostarczonego przez Zymed (San Francisco, CA), każdy przez 10 minut.

Białko o wielkości około 32-35 kDa (odpowiadające spodziewanej masie cząsteczkowej BASB020), które reaguje z anty-surowicą jest wykrywane we wszystkich szczepach Moraxella.

P r z y k ł a d 7:

Obecność przeciwciał wobec BASB020 w ludzkiej surowicy rekonwalescentów.

Analizę Western dla oczyszczonego zrekombinowanego BASB020 przeprowadzono tak, jak opisano w Przykładzie 4 i 6 powyżej, z tą różnicą, że pulę ludzkiej surowicy od dzieci zainfekowanych M. catarrhalis użyto jako preparat pierwszego przeciwciała. Wyniki pokazują, że anytysurowice z naturalnie zakażonych osób reagują z oczyszczonym zrekombinowanym białkiem, jak pokazano na Fig. 6.

P r z y k ł a d 8: Skuteczność szczepionki BASB020: zwiększenie oczyszczania płuc z M. catarrhalis u myszy.

Zdolność ochronna oczyszczonego zrekombinowanego białka BASB020 testowano w modelu mysim. Ten model mysi opiera się na analizie inwazji płucnej przez M. catarrhalis po standardowej donosowej prowokacji zaszczepionej myszy. Grupy 6 myszy BALB/c (6-tygodniowe samice) immunizowano podskórnie 100 μl szczepionki odpowiadającej dawce 10 μq i podawano dawkę przypominającą 2 tygodnie później. Tydzień po podaniu dawki przypominającej, myszy prowokowano poprzez wprowadzenie 50 μl zawiesiny bakteryjnej (+/-106 CFU/50 μθ do lewego nozdrza pod narkozą (myszy usypiano kombinacją anastetyków ketaminy u ksylazyny, 0,24 mg ksylazyny (Rompun) i 0,8 mg ketaminy (Imalgene)/100 μ^. Myszy zabijano 4 godziny po prowokacji i pobierano aseptycznie płuca i indywidualnie homogenizowano. Log10 średniej ważonej liczby CFU/płuco określa się poprzez liczenie kolonii rosnących na płytkach agarowych Mueller-Hinton, na które wysiewa się 20 μl 5 seryjnych rozcieńczeń homogenatu. Średnią arytmetyczną log10 średniej ważonej liczby CFU/płuco i odchylenia standardowe oblicza się dla każdej grupy.

Wyniki analizuje się statystycznie poprzez zastosowanie 1-ścieżkowego ANOVA po założeniu równości wariancji (sprawdzonej w teście Browna i Forsytha) i normalności (sprawdzonej przy zastosowaniu testu Shapiro-Wilk). Różnice między grupami analizowano przy użyciu testu Dunneta, testu Tukeya z zakresie studentyzowanym (HSD) i testu Student-Newman-Keuls.

W tym doświadczeniu grupy myszy immunizowano bądź BASB020 adsorbowanym na AlPO4 (10 μg BASB020 na 100 μg AlPO₄), bądź preparatem zabitych całych komórek (kwc) szczepu AYCC 43617 M. catarrhalis zaadsorbowanych na AlPO₄ (5 x 10⁸ komórek na 100 μg AlPO₄) albo 100 μg AlPO4 bez antygenu. Myszy prowokowano 10⁶ CFU żywego szczepu ATCC 43617 baterii M. catarrhalis.

Log10 średniej ważonej liczby CFU/płuco i odchylenia standardowe obliczono cztery godziny po prowokacji dla każdej grupy log10. Rzekomo immunizowane myszy miały 5,5 (+/- 0,23) log10 CFU/płuco 4 godziny po prowokacji.

Preparat kwc indukował znaczące oczyszczanie płuc w porównaniu z grupą kontrolną (różnica 1,74 log). Szczepionka BASB020 indukowała różnice 0,62 log w odczyszczaniu płuc w porównaniu z grupą kontrolną, która była znacząco różna od kontroli.

Analiza Western przy użyciu zrekombinowanego białka BASB020 i połączonych surowic z myszy immunizowanych białkiem BASB020 i zebranych przed prowokacją wykazała obecność przeciwciała wobec białka BASB020 (Fig. 7).

P r z y k ł a d 9. Wytwarzanie peptydów BASB020, antysurowic i ich reaktywność

Dwa krótkie peptydy o aminokwasach specyficznych dla BASB020 mające sekwencję CNEEAWSQNRRAELSY (SEQ ID NO: 13) i YTGVAPLVDNDETV (SEQ ID NO: 14) wytworzono w laboratorium stosując znane powszechnie metody. Peptydy te, połączone z KHL, użyto do wytworzenia przeciwciał w 12-tygodniowych wolnych od patogenu samic królika New-Zealand Specific Pathogen Free. Króliki dostały w odstępach około 3 tygodni 4 zastrzyki z 200 μg peptydu-KLH w kompletnym

PL 199 497 B1 (pierwszy zastrzyk) lub niekompletnym (2-gi, 3-ci i 4-ty zastrzyk) adiuwancie Freunda. Zwierzęta skrwawiano przed pierwszą immunizacją i miesiąc po 4-tym zastrzyku.

Miana przeciwciał anty-peptyd ze środkowych punktów mierzono poprzez test ELISA przy użyciu wolnych peptydów. Miano przeciwciał anty-peptyd ze środkowych punktów miesiąc po czwartej immunizacji przewyższało 41000. Filtry Western dla oczyszczonego zrekombinowanego BASB020, przy użyciu przeciwciała anty-peptyd jako pierwszego przeciwciała przygotowano jak opisano w Przykładach 4 i 6. Wyniki są przedstawione na Fig. 8.

Lista sekwencji <110> SmithKline Beecham Biologicale S_A<i2o> Związki z Moraxella catharraiis <130> BM45320 <16O> 14 <170> FastSEQ for Windows Version 3.0 <210> 1 <211> 843 <2l2> DMA <213> Bacteria <400> 1

	<“ ł- J> I-Vi—t~t *- ^-*-3	ι-rt· f a 1- z-«—a »-<· » -------	rf ł* A i—<-1-CTA Λ A J----— 5» — — —	/tctTaCTatreja — ’ ”=7 ---—’	r.rcarcaaag	60
ctggcteaag	actctcgcca	gttcetacrag	cctgatacgg	ttgatatgct	tgaaggggtg	120
cttgatctgc	cagcaaccca	agtgegcgag	attatgaoac	cacgcccgca	ggtgcatgcg	ieo
attgccagcg	atgatgattt	atctgatatt	ttatcggtgg	tgcttgaaac	agagcattct	240
cgctatccfcg	ttttfcgacag	tttagatgafc	gatgctgtgg	ctgggatttt	gctgattaag	300
gacttaatac	catacccaaa	agccaaagct	gacggtaaag	agcagccgct	caaaccggct	360
gatattgtac	gaaagccgtt	gtacattagc	gagacggcac	gctcagatac	actgcfcacgc	420
tcacttcaaa	aagcccaagt	gcataoggcg	attgtggttg	atgaattcgg	ctcggfcccct	480
ggtgtggtga	caatggagga	ttcgcttgag	gagatcgteg	gtgacattgt	tgatgaacat	540
gatgacattg	acgaggacag	cgacattaat	aacaccattc	aacaccctga	taaatcaggc	600
gtntggttgg	tgcaagcfcte	cacaccGacc	agtgattgca	atgagatttt	aggcagtcat	660
ttcgatgata	cagatgttga	Łaeaatgggc	ggtfctggtca	cgcaagcatt	gggcctcgtt	720
agccarcttc	aaggtgcggt	tgttcaaafcc	gacgaafcggc	aaattaccgt	ggttgatgtt	7BO
gaggcacgar	ttatreatct	gctggagctt	gtgccgatac	cacagcttga	gaacgctgaa	840
taa						843

<210> 2 <211> 2B0

PL 199 497 B1

«212> <213>

PRT Bacteria

<400>

2

Mec

Arg

Gly

Leu

Arg

Arg

Trp

Leu

Ser

Thr

Ala

Pro

Glu

Thr

Arg

Asp

X

5

10

1S

Asp

Leu

Leu

Lys

Leu

Val

Gin

Asp

Ser

Arg

Gin

Phe

Leu

Glu

Pro

Asp

20

25

30

Thr

Val

Asp

Mec

Leu

Glu

Gly

Val

Leu

Asp

Leu

Pro

Ala

Thr

Gin

Val

35

40

45

Arg

Glu

Ile

Mec

Thr

Pro

Arg

Pro

Gin

Val

His

Ala

Ile

Ala

Ser

Asp

50

55

60

Asp

Asp

Leu

Ser

Asp

Ile

Leu

Ser

Val

Val

Leu

Glu

Thr

Glu

His

Ser

65

70

75

Θ0

Arg

Tyr

Pro

val

Phe

Asp

Ser

Leu

Asp

Asp

Asp

Ala

vai

Val

Gly

Ile

as

30

95

Leu

Leu

Ile

Lys

ASp

Leu

Ile

Pro

Tyr

Leu

Lys

Ala

Lys

Ala

Asp

Gly

100

105

110

Lys

Glu

Gin

Pro

Leli

Lya

Leu

Ala

Asp

Ile

Val

Arg

Lys

Pro

Leu

Tyr

115

120

125

Ile

Ser

Glu

Thr

Ala

Arg

Ser

Asp

Thr

Leu

Leu

Arg

Ser

Leu

Gin

Lys

13 0

135

140

Ala

Gin

Val

His

Met

Ala

Ile

Val

Val

Asp

Glu

Phe

Gly

Ser

val

Ser

145

150

155

160

Gly

Val

Val

Thr

Met

Glu

Asp

Leu

Leu

Glu

Glu

Ile

Val

Gly

Asp

Ile

165

170

175

Val

Asp

Glu

His

Asp

Asp

Ile

Asp

Glu

ASp

Ser

ASp

Ile

Asn

Asn

Ile

ιβο

1S5

190

ile

Pro

His

Pro

Asp

Lys

Ser

Gly

val

τχρ

Leu

val

Gin

Ala

Ser

Thr

1S5

200

205

Leu.

Ile

Ser

Asp

Cys

Asn

Glu

Ile

Leu

Gly

Ser

His

Phe

Asp

Asp

Thr

210

215

220

Asp

Val

Asp

Thr

Mec

Gly Gly

Leu

val

Met

Gin

Ala

Leu

Gly

Phe

val

225

230

235

240

Ser

His

Leu

Gin

Gly

Ala

Val

Val

Gin

Ile

Aep

Glu

Trp

Gin

ile

Thr

245

250

2S5

Val

Val

Asp

Val

Glu

Ala

Arg

Phe

Ile

His

Leu

Leu

Glu

Leu

Val

Leu

260

265

270

Ile

Pro

Gin

Leu

Glu

ftan

Ala

Glu

PL 199 497 B1

275
<210?	3
<211?	843
<212?	DNA
<213?	Bacteria
<400?	3

atgcgtggtc	ttaggcgtcg	gtcatccacc	^Cacctgaaa	ctcgagatga	cttattaaag	60
ccggttcaag	accctcgcca	gttcttagag	cctęfatacg-g	ttgatatgct	tgaaggggcg	120
cttgatctge	cagcaaccca	agtgcgtgag	attatgacac	cacgcccgca	ggtgeatgeg	180
attgccagcg	atgatgattt	atctgatatt	ttatcggtgg	Łgcttgaaac	agagcattct	240
cgctatcctg	tttctgacag	cttggatgat	gatgctgtgg	ttgggatctt	gctgattaag	300
gacttaatac	catacctaaa	agocaaagCt	gacggtaaag	agcagccgct	caaattggct	360
gatatcgtac	gaaagccgtt	gtatattagc	gagacggcac	gctcagacac	actgctacgc	420
tcacctcaaa	aagcccaagt	acacatggcg	actgttgttg	atgaatttgg	ctcggtctct	480
ggtgtggcga	caatggagga	tttgcttgag	gagattgtcg	gcgatattgt	tgatgaacat	540
gatgatattg	acgaggacag	cgacatcaat	aacatcattc	cacaccctga	taaatcaggc	600
gtttggttgg	cgcaagcttc	cacactcatc	agtgattgca	acgagatttt	aggcagtcac	660
tttgatgata	cagatgctga	tacaatgggc	ggtttggtca	tgcaagcatt	gggctttgtt	720
agccatcttc	aaggtgcggt	tgttcaaacc	gacgaatggc	aaattaccgt	ggttgatgtc	780
gaggcacgat	ttattcatct	gttggagctt	gtgctgacac	cacagcttga	gaatgctgaa	840

caa 843 <210? 4 <211? 280 <212? PRT <213? Bacteria <400? 4

Met Arg· Gly Leu Arg Arg Trp Leu Ser Thr Ala Pro Glu Thr Arg Asp 15 10 15

Asp Leu Leu Lys Leu val Gin Asp Ser Arg Gin Phe Leu Glu Pro Aap 20 25 30

Thr Val Asp Met Leu Glu Gly Val Leu Asp Leu Pro Ala Thr Gin Val 35 40 45

Arg Glu Ile Met Thr Pro Arg Pro Gin Val Ηίε Ala Ile Ala Ser Asp 50 55 60

Asp Αερ Leu Ser Asp Ile Leu Ser Val Val Leu Glu Thr Glu His Ser

PL 199 497 B1

70 75 BO

Axg

Tyr Pro

Val

Phe 85

Asp

Ser Leu Asp

Asp 90

Asp

Ala

Val

Val

Gly 95

Ile

Leu

Leu Ile

Lys

Asp

Leu

Ile Pro Tyr

Leu

Lys

Ala

Lys

Ala

Asp

Gly

100

105

110

Lys

Glu Gin

Pro

Leu

Lys

Leu Ala Asp

Ile

Val

Arg

Lys

Pro

Leu

Tyr

115

120

125

ile

Ser Glu

Thr

Ala

Arg

Ser Asp Thr

Leu

Leu

Arg

Ser

Leu

Gin

Lys

13 0

135

140

Ala

Gin Val

His

Het

Ala

Ile val Val

Asp

Glu

Phe

Gly

Ser

Val

Ser

145

150

155

160

Gly

val Ala

Thr

Met

Glu

Asp Leu Leu

Glu

Glu

Ile

Val

Gly

Asp

Ile

165

170

175

Val

Asp Glu

His

Asp

Asp

Ile Asp Glu

Asp

Ser

Asp

Ile

Asn

Asn

ile

ISO

185

190

Ile

Pm His

Pm

Asn

Lys

Ser Gly Vąl

Tm

Leu

val

Gin

Ala

Ser

Thr

..... i.

195

200

205

Leu

Ile Ser

Asp

Cys

Asn

Glu Ile Leu

Gly

Ser

His

Phe

Aap

Asp

Thr

210

215

220

Asp

Val Asp

Thr

Met

Gly

Gly Leu Val

Met

Gin

Ala

Leu

Gly

Phe

Val

225

230

23 5

240

Ser

His Leu

Gin

Gly

Ala

val val Gin

Ile

A&p

Glu

Trp

Gin

Ile

Thr

245

250

255

Val

Val Asp

Val

Glu

Ala

Arg Phe Ile

His

Leu

Leu

Glu

Leu

val

Leu

260

265

270

Ile

Pro Gin

Leu

Glu

Asn

Ala Glu

275

200

«210»

5

«211»

843

«212»

DNA

«213»

Bacteria

«400»

5

acgcgtggcc tcaggcgttg gctacccaec gcacctga&a cccgagatga cttattaaag 60 ctggttcaag actctcgcca gcttttagag cctgacacgg ttgatatgct tgaaggggtg 120 cctgatccgc eagcaaccca agtgcgtgag attatgacac cacgcccaca ggtgcatgcg 180 attgecagcg atgatgattt atctgatatt ttatcggcgg tgctcgaaac agagcatcct 240 cgctatcctg tttttgacag tttggatgat gatgctgtgg ctgggatttt gctgatcaag 300

PL 199 497 B1

gacttaacac	cataoetaaa	agccaaagct	gacggtaaag	^gcagecgct	caaatcjgct	360
gacattgtac	gaa^gccgtt	gtatattagc	gagacggcac	gctcagatac	actgctacgc	420
tcacttcaaa	eagoccaagt	acatatggcg	attgttgttg	atgaatttgg	ctcggtctcc	400
ggtgtggcga	caatggagga	tttgcttgag	gagattgccg	gcgatattgt	tgatgaacat	540
gatgatactg	acgaggacag	cgacattaat	aacatcatcc	cacaccctga	taaatcaggc	600
gcttggttgg	tgcaagcttc	cacactcatc	agtgattgea	atgagatctc	aggcagtcat	660
tttgacgata	cagatgttga	tacaatgggc	ggcctggtca	tgcaageatt	gggctttgtt	720
	~“~33 -3^33			aaaćtacęęft
	v L-ααα u u.	yaLyadLgjc	ggctgatgct	7B0
gaggcacgat	ttattcatct	gttggagctt	gtgctgatac	cacagcttga	gaatgctgaa	. Θ40
taa						Θ42

c210>	6
<211>	200
c212>	PRT
<213>	Bacteria

<400>

6

Met

Arg Gly

Leu

Arg

Arg

Trp

Leu

Ser

Thr

Ala

Pro

Glu

Thr

Arg

Aep

1

5

10

15

Asp

Leu Leu

Lya

Leu

Val

Gin

Asp

Ser

Arg

Gin

Phe

Leu

Glu

Pro

Asp

20

25

30

Thr

Val Asp

Met

Leu

Glu

Gly

Val

Leu

Asp

Leu

Pro

Ala

Thr

Gin

Val

35

40

45

Arg

Glu Ile

Met

Thr

Pro

Arg

Pro

Gin

Val

His

Ala

Ile

Ala

Ser

Aap

55 60

Αερ Aso Leu Ser Asp Ile leu Ser Val Val Leu Glu Thr Glu His Ser ⁶⁵ 70 75 BO

Arg Tyr Pro Val Phe Aap Ser Leu Asp Asp Asp Ala Val Val Gly Ile

Θ5 90 95

Leu Leu Ile Lys Asp Leu Ile Pro Tyr Leu Lys Ala Lys Ala Aap Gly

100 105 110

Lys Glu Gin Pro Leu Lys Leu Ala Asp Ile V_al Arg Lys Pro Leu Tyr

115 120 125

Ile Ser Glu Thr Ala Arg Ser Asp Thr Leu Leu Arg Ser Leu Gin Lys

130 135 140

Ala Gin Val His MeC Ala Ile Val Val Aep Glu Phe Gly Ser val Ser

145 150 15S 160

Gly Val Ala Thr Met Glu Asp Leu Leu Glu Glu Ile V_al Gly Asp Ile

165 170 17S

PL 199 497 B1

Val Asp Glu His

Asp Asp

Ile Asp Glu 185

Asp Ser Asp

Ile Asn Asn 190

ile

iao

Ile

Pro

His

Pro

Asp

Lys

Ser

Gly

Val

Trp

Leu

val

Gin

Ala

Ser

Thr

195

200

205

Leu

Ile

Ser

Asp

Cys

Asn

Glu

Ile

Leu

Gly

Ser

His

Phe

Asp

Asp

Thr

210

215

220

Asp

Val

Asp

Thr

Met

Gly

Gly

Leu

Val

Met

Gin

Ala

Leu

Gly

Phe

Val

225

230

235

240

Ser

His

Leu

Gin

Cly

Ala

val

Val

Gin

Ile

Asp

Glu

Trp

Gin

Ile

Thr

245

250

255

Val

Val

ASp

Val

Glu

Ala

Arg

Phe

Ile

His

Leu

Leu

Glu

Leu

Val

La u

260

265

270

Ile

Pro

Gin

Leu

Glu

Asn

Ala

Glu

275

280

<210» Ί <211> 843 <212> DNA <213> Bacteria <4D0> 7

atgegtggtc	ttaggcgfcrg	gctatccacc	gcacctgaaa	ctcgagatga	tttatraaag	60
ctggttcaag	actctcgcca	gtttttagag	cctgatacgg	ttgatatgct	tgaaggggrg	120
cttgatctgc	cagcaaccca	agtgcgtgag	attatgacac	cacgcccaca	ggtgcacgcg	180
attgccagcg	atgatgattt	gtctgatatc	ttatcggtgg	tgcttgaaac	agagcattct	240
cgctatcctg	tttttgacag	tttggatgat	gatgctgtgg	ttgggatttt	gctgactaag	300
gacttaarac	catacctaaa	agccaaagct	gacggtaaag	agcagccgct	caaattggct	360
gatattgtac	gaaagccgtt	gtatatragc	gagacggcac	gctcagacac	actgccacgc	420
tcacttcaaa	aagcccaagfc	gcatatggcg	attgttgttg	atgaatttgg	ctcggtctct	450
ggtgtggtga	caatggagga	Łtfcgctcgag	gagattgteg	gcgatattgc	tgatgaacat	540
gatgacattg	acgaggacag	cgacattaat	aacatcattc	cacaccctga	taaatcaggc	600
gtttggttgg	cgcaagcttc	cacactcatc	agtgattgCa	atgagatttt	aggcagtcat	660
tttgatgata	cagatgttga	tacaatgggc	ggtttggtca	tgcaagcatt	aggcrttgtt	720
agccatcttc	aaggcgcggt	cgttcaaatc	gacgaatggc	aaattaccgt	ggttgacgtt	780
gaggcaegat	ttattcatct	gttggagctt	gtgctgatac	eacagcccga	gaatgctgaa	640
taa						043

<220» 8 <211> 280

PL 199 497 B1

e212> PRT

<213> Bacteria

<400> 8

Met

Arg Gly Leu

Arg

Arg

Trp

Leu

Ser

Thr

Ala

Pro

Glu

Thr

Arg

Asp

1

5

10

15

Asp

Leu Leu Lys

Leu

Val

Gin

Asp

Ser

Arg

Gin

Phe

Leu

Glu

Pro

Asp

20

25

30

Thr

Val Asp Met

Leu

Glu

Gly

Val

Leu

Asp

Leu

Pro

Ala

Thr

Gin

Val

35

40

45

Arg

Glu Ile Met

Thr

Pro

Arg

Pro

Gin

Val

His

Ala

Ile

Ala

Ser

Asp

50

55

60

Asp

Asp Leu Ser

Asp

Ile

Leu

Ser

val

Val

Leu

Glu

Thr

Glu

His

Ser

65

70

75

80

Arg

Tyr Pro Val

Phe

Asp

Ser

Leu

Asp

Asp

Asp

Ala

Val

Val

Gly

Ile

90 95

Leu Leu Ile Lys Asp Leu Ile Pro Tyr Leu Lys Ala Lys Ala Aap Gly 100 105 110

Lys Glu Gin Pro Leu Lys Leu Ala Asp Ile Val Arg Lye Pro Leu Tyr 115 120 12S

Ile Ser Glu Thr Ala Arg Ser Asp Thr Leu Leu Arg Ser Leu Gin Lys

130 135 140

Ala Gin Val His Met Ala Ile Val Val Asp Glu Phe Gly Ser v_al Ser

145 150 155 IGO

Gly Val Val Thr Met Glu Asp Leu Leu Glu Glu Ile Val Gly ASp Ile

1G5 170 175

Val Asp Glu His Asp Asp Ile Asp Glu Asp Ser Asp Ile Asn Asn Ile

1B0 185 190

Ile Pro His Pro Asp Lys Ser Gly Val Trp Leu Val Gin Ala Ser Thr

195 200 205

Leu Ile Ser Asp Cys Asn Glu Ile Leu Gly Ser His Phe Asp Aap Thr

210 215 220

Asp Val Asp Thr Met Gly Gly Leu val Met Gin Ala Leu Gly Phe Val

225 230 235 240

Ser Hia Leu Gin Gly Ala Val Val Gin Ile Asp Glu Trp Gin Ile Thr

245 250 255

Val Val Asp Val Glu Ala Arg Phe Ile His Leu Leu Glu Leu Val Leu

260 265 270

Ile Pro Gin Leu Glu Asn Ala Glu

PL 199 497 B1

PL 199 497 B1 «220» «223» Oligonukleotyd «400» 12 aagggcccaa ttacgcagag ggccgactca ttactcagca ccctcaagct gtggtatcag εα «210» 13 · «211» 16 «212» PRT ^c213> Sekwencja sztuczna «220» <223. Peptyd «400» 13

Cyg Asn Glu Glu Ala Trp Ser Gin Asn Arg Arg Ala Glu Leu Ser Tyr 1 5 10 15 «210» 14 «211» 14 «212» PRT

------ V- X Λ <220>

«223» Peptyd «400» 14

Tyr Thr Gly val Ala Pro leu Val Asp Asn Asp Glu Thr Vul 1 S 10

PL 199 497 B1

Polinukleotydy i polipeptydy z BASB020

Id. Sekw. nr 1 sekwencja polinukleotydowa BASB020 szczepu MC2931 Moraxella catarrhalis

ATGCGTGGTCTTAGGCGTTGGTTATCCACCGCACCTGAAACTCGAGATGATTTATTAAAG

CTGGTTCAAGACTCTCGCCAGTTTTTAGAGCCTGATACGGTTGATATGCTTGAAGGGGTG cttgatctgccagcaącccaagtgcgtgagattatgacaccacgcccgcaggtgcatgcg

ATTGCCAGCGATGATGATTTATCTGATATTTTATCGGTGGTGCTTGAAACAGAGCATTCT

CGCTATCCTGTTTTTGACAGTTTAGATGATGATGCTGTGGTTGGGATTTTGCTGATTAAG gacttaataccatacctaaaagccaaagctgacggtaaagagcagccgctcaaattggct gatattgtacgaaagccgttgtatattagcgagacggcacgctcagatacactgctacgc tcacttcaaaaagcccaagtgcatatggcgattgtggttgatgaatttggctcggtctct ggtgtggtgacaatggaggatttgcttgaggagattgtcggtgatattgttgatgaacat gatgatattgacgaggacagcgacattaataacatcattccacaccctgataaatcaggc gtttggttggtgcaagcttccacactcatcagtgattgcaatgagattttaggcagtcat tttgatgatacagatgttgatacaatgggcggtttggtcatgcaagcattgggctttgtt agccatcttcaaggtgcggttgttcaaatcgatgaatggcaaattaccgtggttgatgtt gaggcacgatttattcatctgttggagcttgtgctgataccacagcttgagaatgctgaa

TAA

Id. Sekw. nr 2 sekwencja polipeptydowa BASB020 szczepu MC2931 Moraxella catarrhalis

MRGLRRWLSTAPETRDDLLKLVQDSRQFLEPDTVDMLEGVWLPATQVREIMTPRPQVHA iasdddlsdilswletehsrypvfdsldddawgillikdlipylkakadgkeqplkia

DIVRKPLYISETARSDTI.I«RSI.QKĄQVHMArvVDEFGSVSG^:VVTMEDLLEEIVGDrvDEH

DDIDEDSDINNIIPHPDKSGVWl_JVQASTLISDCNEILGSHFDDTDVr)TMGGL.VMQALGFV

SHLQGAWPIDEWOITWDVEARFIHŁLET.VT,TPQT.RłJap

Id. Sekw. nr 3 sekwencja polinukleotydowa BASB020 Moraxpll3 raf-ari-k, 1 -i „

-------- χχια,χ szczepu Mcat2912

ATGCGTGGTCTTAGGCGTTGGTTATCCACCGCACCTGAAACTCGAGATGATTTATTAAAGCTGGTTCAAG actctcgccagtttttagagcctgatacggttgatatgcttgaaggggtgcttgatctgccagcaaccca agtgcgtgagattatgacaccacgcccgcaggtgcatgcgattgccagcgatgatgatttatctgatatt ttatcggtggtgcttgaaacagagcattctcgctatcctgtttttgacagtttggatgatgatgctgtgg ttgggattttgctgattaaggacttaataccatacctaaaagccaaagctgacggtaaagagcagccgct caaattggctgatattgtacgaaagccgttgtatattagcgagacggcacgctcagatacactgctacgc

PL 199 497 B1

TCACTTCAAAAAGCCCAAGTACATATGGCGATTGTTaTTGATGAATTTGGCTCGGTCTCTGGTGTGGCGA

CAATGGAGGATTTGCTTGAGGAGATTGTCGGTGATATTGTTGATGAACATGATGATATTGACGAGGACAG

CGACATTAATAACATCATTCCACACCCTGATAAATCAGGCGTTTGGTTGGTGCAAGCTTCCACACTCATC

AGTGATTGCAATGAGATTTTAGGCAGTCATTTTGATGATACAGATGTTGATACAATGGGCGGTTTGGTCA

TGCAAGCATTGGGCTTTGTTAGCCATCTTCAAGGTGCGGTTGTTCAAATCGATGAATGGCAAATTACCGT ggttgatgttgaggcacgatttattcatctgttggagcttgtgctgataccacagcttgagaatgctgaa

TAA

Id. Sekw. nr 4 sekwencja polipeptydowa BASB020 szczepu Mcat2912 Moraxp]L· catarrhalis

MRGLRRWLSTAPETRDDLLKLVQDSRQFLEPDTVDMLEGVLDLPATQA7REIMTPRPQVHAIASDDDLSDI LSWLETEHSRYPVFDSLDDDAWGILLIKDLIPYLKAKADGKEQPLKIiADIVRKPLYISETARSDTLLR SLQKAQVHMAIWDEFGSVSGVATMEDLLEEIVGDIVDEHDDIDEDSDINNIIPHPDKSGVWLVQASTLI SDCNElŁGSHFPDTDyDTMGGLyMOALGFySHŁOGAWOIDEWOITWnyEAPFrm-.T.ET.yT.TppT.KłjaE Id. Sekw. nr 5 sekwencja polinukleotydowa BASB020 szczepu Mcat2913 Moraxella catarrhalis

ATGCGTGGTCTTAGGCGTTGGTTATCCACCGCACCTGAAACTCGAGATGATTTATTAAAGCTGGTTCAAG

ACTCTCGCCAGTTTTTAGAGCCTGATACGGTTGATATGCTTGAAGGGGTGCTTGATCTGCCAGCAACCCA

AGTGCGTGAGATTATGACACCACGCCCACAGGTGCATGCGATTGCCAGCGATGATGATTTATCTGATATT

TTATCGGTGGTGCTTGAAACAGAGCATTCTCGCTATCCTGTTTTTGACAGTTTGGATGATGATGCTGTGG

TTGGGATTTTGCTGATTAAGGACTTAATACCATACCTAAAAGCCAAAGCTGACGGTAAAGAGCAGCCGCT

CAAATTGGCTGATATTGTACGAAAGCCGTTGTATATTAGCGAGACGGCACGCTCAGATACACTGCTACGC tcacttcaaaaagcccaagtacatatggcgattgttgttgatgaatttggctcggtctctggtgtggcga

CAATGGAGGATTTGCTTGAGGAGATTGTCGGCGATATTGTTGATGAACATGATGATATTGACGAGGACAG

CGACATTAATAACATCATTCCACATCCTGATAAATCAGGCGTTTGGTTGGTGCAAGCTTCCACACTCATC

AGTGATTGCAATGAGATTTTAGGCAGTCATTTTGATGATACAGATGTTGATACAATGGGCGGTTTGGTCA

TGCAAGCATTGGGCTTTGTTAGCCATCTTCAAGGTGCGGTTGTTCAAATCGATGAATGGCAAATTACCGT

GGTTGATGTTGAGGCACGATTTATTCATCTGTTGGAGCTTGTGCTGATACCACAGCTTGAGAATGCTGAA

TAA

Id. Sekw. nr 6 sekwencja polipeptydowa BASB020 szczepu Mcat2913 Moraxella catarrhalis

MRGLRRWLSTAPETRDDLLKLVQDSRQFLEPDTVDMLEGVLDLPATQVREIMTPRPQVH Al ASDDDLSD ILSWLETEHSRYPVFDSLDDDA'WG ILLIKDLIP YLKAKADGKEOPLK

PL 199 497 B1

IADIVRKPLYISETARSDTLLRSLQKAQVHMAIVVDEFGSVSGVATMEDLLEEIVGDIV

DEHDDIDEDSDINNIIPHPDKSGVWLVQASTLISDCNEILGSHFDDTDVDTMGGLVMQA

ΕΘΓνδΗΕΟσΑννΟΙϋΕΜΟΙΤννονΕΑΗΓΙΗΕΕΕΒνΕΙΡΟΤΕΝΑΕ

Id. Sekw. nr 7 sekwencja polinukleotydowa BASB020 szczepu Mcat2969 Moraxella catarrhalis

ATGCGTGGTCTTAGGCGTTGGrrATCCACCGCACCTGAAACTCGAGATGATTTATTAAAGCTGGTTCAAG

ACTCTCGCCAGTTTTTAGAGCCTGATACGGTTGATATGCTTGAAGGGGTGCTTGATCTGCCAGCAACCCA

AGTGCGTGAGATTATGACACCACGCCCACAGGTGCATGCGATTGCCAGCGATGATGATTTGTCTGATATT

TTATCGGTGGTGCTTGAAACAGAGCATTCTCGCTATCCTGTTTTrGACAGTTTGGATGATGATGCTGTGG ttgggattttgctgattaaggacttaataccatacctaaaagccaaagctgacggtaaagagcagccgct caaattggctgatattgtacgaaagccgttgtatattagcgagacggcacgctcagatacactgctacgc

TCACTTCAAAAAGCCCAAGTGCATATGGCGATTGTTGTTGATGAATTrGGCTCGGTCTCTGGTGTGGTGA

CAATGGAGGATTTGCTTGAGGAGATTGTCGGCGATATTGTTGATGAACATGATGATATTGACGAGGACAG

CGACATTAATAACATCATTCCACACCCTGATAAATCAGGCGTTTGGTTGGTGCAAGCTTCCACACTCATC agtgattggaatgagattttaggcagtcattttgatgatacagatgttgatacaatgggcggtttggtca

TGCAAGCATTAGGCTTTGTTAGCCATCTTCAAGGTGCGGTTGTTCAAATCGATGAATGGCAAATTACCGT

GGTTGATGTTGAGGCACGATTTATTCATCTGTTGGAGCTTGTGCTGATACCACAGCTTGAGAATGCTGAA

TAA

Id. Sekw. nr 8 sekwencja polipeptydowa BASB020 szczepu Mcat2969 Moraxella catarrhalis

...................................................nn^rmmMT Γητττ .ητΌΛΤΠΙΓΡΤ’ΤΜΤΡ'Ρ

JJDrui v uwaji * -* <- - — aiasdddlsdilswletehsrypvfdsldddawgillikdlipylkakadgkeqplk

ΏΑϋίνΚΚΡΕΥΙΕΕΤΑΚδϋΤΙιΕΚεΒΟΚΑΟνΗΜΑίννΟΕΡσβνδσληΖΤΜΕηΕΕΕΕίνσΕϊν

DEHDDIDEDSD INNI IPHPDKSGVWLVQASTLISDCNEILGSHFDDTDVDTMGGLVMQA łgfvshlqgawq i demq itwdvearf ihllelvl i pqlenae

SEQ ID NO:9

ACT TGA ATA A AA CCG AGT G

SEQ ID NO;10

GAC ATT GGC CGC AAC ATG C

SEQ ID NO:II

PL 199 497 B1

AAG GGC CCA ATT ACG CAG AGG GGA TCC ATG CGT GGT CTT AGG CGT TGG TTA TCP ACC G

SEQ ID NO:12

AAG GGC CCA ATT ACG CAG AGG GTC GAC TTA TTA TTC AGC ATT CTC AAG CTG TGG TAT CAG

SEQ ID NO:13 cneeawsqnrraelsy

SEQ ID NO:14 ytgvaplvdndetv

Claims (30)

1. Wyizolowany polipeptyd uż yteczny w szczepionce przeciwko zakaż eniom Moraxella catarrhalis, znamienny tym, że obejmuje sekwencję aminokwasową, która ma przynajmniej 85% identyczności z sekwencją aminokwasową wybraną z grupy składającej się z SEKW. ID Nr: 4 i SEKW. ID Nr: 6 na całej długości odpowiednio SEKW. ID Nr: 4 i SEKW. ID Nr: 6.

2. Wyizolowany polipeptyd według zastrz. 1, znamienny tym, ż e sekwencja aminokwasową ma przynajmniej 95% identyczności z sekwencją aminokwasową wybraną z grupy złożonej z SEKW. ID Nr: 4 i SEKW. ID Nr: 6 na całej długości odpowiednio SEKW. ID Nr: 4 i SEKW. ID Nr: 6.

3. Wyizolowany polipeptyd według zastrz. 1, znamienny tym, że obejmuje sekwencję aminokwasową wybraną z grupy składającej się z SEKW. ID Nr: 4 i SEKW. ID Nr: 6.

4. Wyizolowany polipeptyd użyteczny w szczepionce przeciwko zakaż eniom Moraxella catarrhalis, znamienny tym, że składa się z sekwencji aminokwasowej wybranej z grupy składającej się z SEKW. ID Nr: 4 i SEKW. ID Nr: 6.

5. Polipeptyd okreś lony w zastrz. 1 do 4, znamienny tym, ż e jest częścią wię kszego bia łka fuzyjnego.

6. Wyizolowany immunogenny fragment polipeptydu określonego w zastrz. 1 do 4, znamienny tym, że jest zdolny do wywołania odpowiedzi immunologicznej, która rozpoznaje polipeptyd o SEKW. ID Nr: 4 i SEKW. ID Nr: 6, przy czym w razie potrzeby jest on sprzężony z nośnikiem.

7. Immunogenny fragment okreś lony w zastrz. 6, znamienny tym, że jest częścią większego białka fuzyjnego.

8. Wyizolowany polinukleotyd, znamienny tym, że koduje polipeptyd lub immunogenny fragment określony w zastrz. 1 do 7.

9. Wyizolowany polinukleotyd obejmujący sekwencję nukleotydową kodują cą polipeptyd, użyteczny w szczepionce przeciwko zakażeniom Moraxella catarrhalis, którego sekwencja ma przynajmniej 85% identyczności z sekwencją aminokwasową o SEKW. ID Nr: 4 i SEKW. ID Nr: 6 na całej długości odpowiednio SEKW. ID Nr: 4 i SEKW. ID Nr: 6, lub sekwencję nukleotydową komplementarną do wyizolowanego polinukleotydu.

10. Wyizolowany polinukleotyd, znamienny tym, że obejmuje sekwencję nukleotydową, która ma przynajmniej 85% identyczności z sekwencją nukleotydową kodującą polipeptyd o SEKW. ID Nr: 4 i SEKW. ID Nr:6 na obszarze cał ego regionu kodują cego uż yteczny w szczepionce przeciwko zakażeniom Moraxella catarrhalis, lub sekwencję nukleotydową komplementarną do tego wyizolowanego polinukleotydu.

11. Wyizolowany polinukleotyd, znamienny tym, że obejmuje sekwencję nukleotydową, która ma przynajmniej 85% identyczności z SEKW. ID Nr: 3 lub SEKW. ID Nr: 5 na całej długości odpo42

PL 199 497 B1 wiednio SEKW. ID Nr: 3 lub SEKW. ID Nr: 5, lub sekwencję nukleotydową komplementarną do tego wyizolowanego polinukleotydu.

12. Wyizolowany polinukleotyd według zastrz. 8 do 11, znamienny tym, że identyczność z SEKW. ID Nr: 3 lub SEKW. ID Nr: 5 wynosi przynajmniej 95%.

13. Wyizolowany polinukleotyd, znamienny tym, że obejmuje sekwencję nukleotydową kodującą polipeptyd o SEKW. ID Nr: 4 lub SEKW. ID Nr: 6 lub immunogenny fragment określony w zastrzeżeniu 6 albo 7.

14. Wyizolowany polinukleotyd, znamienny tym, że obejmuje polinukleotyd o SEKW. ID Nr: 3 lub SEKW. ID Nr: 5.

15. Wyizolowany polinukleotyd, znamienny tym, że obejmuje sekwencję nukleotydową kodującą polipeptyd o SEKW. ID Nr: 4 lub SEKW. ID Nr: 6, użyteczny w szczepionce przeciwko zakażeniom Moraxella catarrhalis, który uzyskuje się przeszukując w ostrych warunkach hybrydyzacji odpowiednią bibliotekę przy pomocy znakowanej sondy o sekwencji określonej w SEKW. ID Nr: 3 lub SEKW. ID Nr: 5 lub jej fragmentu.

16. Wektor ekspresyjny, znamienny tym, że obejmuje wyizolowany polinukleotyd określony w zastrz. 8 do 15.

17. Wektor ekspresyjny według zastrz. 16, znamienny tym, że jest w postaci żywego rekombinowanego mikroorganizmu.

18. Komórka gospodarza, znamienna tym, że obejmuje wektor ekspresyjny określony w zastrz. 16.

19. Błona komórki gospodarza określonej w zastrz. 18, znamienny tym, że komórka gospodarza wyraża wyizolowany polipeptyd.

20. Sposób wytwarzania polipeptydu lub immunogennego fragmentu określonego w zastrz. 1 do 7, znamienny tym, że obejmuje hodowanie komórki gospodarza określonej w zastrz. 18 w warunkach wystarczających do wytwarzania polipeptydu lub immunogennego fragmentu i odzyskanie polipeptydu lub immunogennego fragmentu z podłoża hodowlanego.

21. Sposób wyrażania polinukleotydu określonego w zastrz. 8-15, znamienny tym, że obejmuje transformację komórki gospodarza wektorem ekspresyjnym obejmującym co najmniej jeden polinukleotyd i hodowlę komórki gospodarza w warunkach odpowiednich dla wyrażania dowolnego z polinukleotydów.

22. Kompozycja szczepionki, znamienna tym, że obejmuje skuteczną ilość polipeptydu lub immunogennego fragmentu określonego w zastrz. 1 do 7 i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.

23. Kompozycja szczepionki, znamienna tym, że obejmuje skuteczną ilość polinukleotydu określonego w zastrz. 8 do 15 i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.

24. Kompozycja szczepionki według zastrz. 22 albo 23, znamienna tym, że obejmuje co najmniej jeden inny antygen Moraxella catarrhalis.

25. Przeciwciało, znamienne tym, że jest immunospecyficzne dla polipeptydu składającego się z sekwencji aminokwasowej o przynajmniej 85% identyczności z sekwencją aminokwasową wybraną z grupy składającej się z: SEKW. ID Nr: 4 i SEKW. ID Nr: 6 na całej ich długości, lub jego immunogennego fragmentu, które rozpoznaje polipeptyd o SEKW. ID Nr: 4 i SEKW. ID Nr: 6, przy czym immunogenny fragment jest zdolny do wywołania odpowiedzi immunologicznej i w razie potrzeby jest on sprzężony z nośnikiem.

26. Przeciwciało według zastrz. 25, znamienne tym, że polipeptyd lub immunogenny fragment jest częścią większej fuzji białkowej.

27. Sposób diagnozowania zakażenia Moraxella catarrhalis, znamienny tym, że obejmuje identyfikację polipeptydu lub immunogennego fragmentu określonego w zastrz. 1 do 7 lub przeciwciała, które jest immunospecyficzne dla tego polipeptydu, obecnego w biologicznej próbce od zwierzęcia podejrzanego o takie zakażenie.

28. Zastosowanie kompozycji obejmującej immunologicznie skuteczną ilość polipeptydu określonego w zastrz. 1 do 7 do wytwarzania leku do wywołania odpowiedzi immunologicznej u zwierzęcia.

29. Zastosowanie kompozycji obejmującej immunologicznie skuteczną ilość polinukleotydu określonego w zastrz. 8 do 15 do wytwarzania leku do wywołania odpowiedzi immunologicznej u zwierzęcia.

30. Kompozycja terapeutyczna zawierająca substancję czynną przydatną do leczenia ludzi z chorobą powodowaną przez Moraxella catarrhalis i dopuszczalny farmaceutycznie nośnik, znamienna tym, że jako substancję czynną zawiera co najmniej jedno przeciwciało określone w zastrz. 25 albo 26.