PL189044B1

PL189044B1 - Spongy dressings for superficial wounds and method of making such dressings

Info

Publication number: PL189044B1
Application number: PL98329265A
Authority: PL
Inventors: Jacek Grzybowski; Zygmunt Pojda; Jerzy Strużyna; Marek Janiak; Ewa Ołdak
Original assignee: Wojskowy Inst Higieny I Epidem
Priority date: 1998-10-19
Filing date: 1998-10-19
Publication date: 2005-06-30
Also published as: PL329265A1

Abstract

1. Spongy dressings for surface wounds, especially those infected with pathogenic microorganisms, are prepared on the basis of collagen or polyurethane sponge. They are characterised in that they consist of a collagen or polyurethane tampon with pore size under 0.5 mm and at least one cytokine in a protective buffer solution. The cytokine concentration in the dressing is at the level of 0.1-50 μg/cm2>. 5. The method of producing spongy dressings for surface wounds, especially those infected with pathogenic micro-organisms, characterised in that a 1-6 mm thick collagen or polyurethane tampon with pore size under 0.5 mm is saturated with at least one cytokine in a protective buffer solution with pH 4-7.8. The solution contains substances, which protect cytokines against denaturation and/or irreversible adsorption. Then, the tampon is dried and packed into a laminated foil wrapping, closed by heat sealing. It may be subjected to sterilisation by radiation. The dressings are stored at the temperature of 0 - 8 degrees Celsius.

Description

Przedmiotem wynalazku są gąbczaste opatrunki na powierzchniowe rany, zwłaszcza zakażone drobnoustrojami patogennymi oraz sposób wytwarzania tych opatrunków. Opatrunki te, sporządzone z biomateriałów o wysokiej czystości, jakimi są gąbka kolagenowa lub poliuretanowa, można stosować na powierzchnię ran u ludzi i zwierząt (ssaków). Rany pozbawione częściowo naskórka lub skóry narażone są na utratę wody, wpływy środowiska a przede wszystkim na kontaminację bakteryjną. Opatrunki gąbczaste według wynalazku są plastyczne i przybierają kształt powierzchni rany, są jałowe mikrobiologicznie i charakteryzują się odpowiednią wytrzymałością mechaniczną.The present invention relates to spongy dressings for superficial wounds, especially those infected with pathogenic microorganisms, and to a method of producing these dressings. These dressings, made of high-purity biomaterials, such as collagen or polyurethane sponge, can be applied to the surface of wounds in humans and animals (mammals). Wounds partially devoid of epidermis or skin are exposed to water loss, environmental influences and, above all, to bacterial contamination. The spongy dressings according to the invention are plastic and take the shape of the wound surface, are microbiologically sterile and have an appropriate mechanical strength.

W praktyce medycznej znane jest stosowanie opatrunków z gąbki kolagenowej lub poliuretanowej na rany bez zakażenia klinicznego. W przypadku ran, których gojenie powikłane jest zakażeniem, używa się niekiedy gąbczastych opatrunków kolagenowych zawierających antybiotyki lub antyseptyki. Jednakże wiele tych leków powoduje występowanie reakcji uczu189 044 leniowych a także niektóre z nich powodują zwolnienie procesów gojenia ran. Od szeregu lat prowadzone są poszukiwania leków, którymi można by świadomie regulować bardzo złożone procesy gojenia ran. Substancjami, które mogą spełniać te oczekiwania są biologicznie czynne białkowe substancje regulacyjne zwane cytokinami, wchodzące w skład tak zwanej „sieci cytokinowej”. Jej działanie polega na przekazywaniu sygnałów regulatorowych między różnymi komórkami skóry i układu leukocytów. Cytokiny mogą pobudzać komórki skóry do odpowiednio ukierunkowanej, zwiększonej lub zmniejszonej aktywności.It is known in medical practice to use collagen or polyurethane sponge dressings on wounds without clinical infection. In the case of wounds whose healing is complicated by infection, spongy collagen dressings containing antibiotics or antiseptics are sometimes used. However, many of these drugs cause allergic reactions and some of them slow down wound healing. For many years, a search has been conducted for drugs that could consciously regulate very complex wound healing processes. The substances that can fulfill these expectations are biologically active protein regulatory substances called cytokines, which are part of the so-called "cytokine network". It works by transmitting regulatory signals between various cells in the skin and the leukocyte system. Cytokines can stimulate skin cells to targeted, increased or decreased activity.

Znane są próby stosowania cytokin w doświadczalnym leczeniu ran, przez podawanie miejscowe, w postaci wielokrotnego nastrzykiwania tkanek rany. Dwie z przebadanych cytokin, G-CSF oraz GM-CSF, są zarejestrowane jako leki krwiotwórcze i stosowane są ogólnoustrojowo w onkologii, w przypadku leukopenii. Wykorzystuje się je do pobudzania szpiku kostnego do wzmożonej produkcji komórek leukocytamych. Jednakże leki te wykazują również inne rodzaje aktywności, działają na dojrzałe leukocyty, które pobudzane są do wzmożonej fagocytozy tkanek martwicznych oraz mikroorganizmów zakażających rany i do ich zabijania wewnątrzkomórkowego, ponadto pobudzają komórki skóry do szybszej proliferacji, której efektem jest zwiększenie szybkości procesów naskórkowania, będącego najważniejszym ze sposobów gojenia ran. Jednakże kontrolowane ich podawanie do ran w potrzebnej ilości i z kontrolowaną kinetyką nie zostało jak dotąd opracowane. Wiąże się to częściowo z labilnością cytokin.There are known attempts to use cytokines in experimental wound healing by topical administration in the form of multiple injections of wound tissues. Two of the tested cytokines, G-CSF and GM-CSF, are registered as hematopoietic drugs and are used systemically in oncology, in the case of leukopenia. They are used to stimulate the bone marrow to increase the production of leukocytes. However, these drugs also show other types of activity, they act on mature leukocytes, which are stimulated to increase phagocytosis of necrotic tissues and microorganisms that infect wounds and to kill them intracellularly, and they stimulate skin cells to proliferate faster, which results in an increase in the speed of epithelialization, which is the most important with ways of healing wounds. However, controlled administration to wounds in the required amount and with controlled kinetics has not yet been developed. This is due in part to the lability of the cytokines.

Podczas prób laboratoryjnych nieoczekiwanie okazało się, że cytokiny można wykorzystać do leczenia ran w postaci gąbczastych opatrunków według wynalazku, jeśli pozostaną one w odpowiednim roztworze substancji zabezpieczających przed denaturacją i/lub przed nieodwracalną adsorpcją o zdefiniowanym składzie chemicznym.During laboratory tests, it was surprisingly found that cytokines can be used in the treatment of wounds in the form of spongy dressings according to the invention, if they remain in an appropriate solution of substances protecting against denaturation and / or against irreversible adsorption with a defined chemical composition.

Materiałem wyjściowym do wytwarzania opatrunków są dwa (alternatywne) biomateriały o grubości 1 do 6 mm. Jednym z nich jest gąbka sporządzona z kolagenu zwierzęcego o wysokiej czystości, drugim gąbka poliuretanowa.The starting material for the production of dressings are two (alternative) biomaterials with a thickness of 1 to 6 mm. One is a sponge made of high-purity animal collagen, the other is a polyurethane sponge.

Opatrunki według wynalazku złożone są z tamponu kolagenowego lub poliuretanowego 0 porach poniżej 0,5 mm oraz z co najmniej jednej cytokiny w ochronnym roztworze buforowym. Roztwór buforowy zawiera substancje białkowe takie jak albuminę surowiczą, surowicę ludzką, żelatynę oraz inne dodatki fizjologicznie akceptowalne, zwłaszcza glikole, mannitol, metylocelulozę; korzystne pH roztworu wynosi 4 - 7,8. Stężenie cytokin w opatrunku jest zależne od rodzaju cytokiny i może się wahać od 0,1 do 50 pg na cm² opatrunku. Nie zaleca się stosowania wyższych stężeń, gdyż w niektórych przypadkach mogą być niekorzystne dla chorego. Opatrunki według wynalazku mogą zawierać dodatkowo przeciwdrobnoustrojowe chemioterapeutyki, np. sól srebrową sulfadiazyny, które nie hamują procesów gojenia i nie wchodzą w interakcje z cytokinami. W opatrunku według wynalazku cytokiny zachowują dużą część swojej wyjściowej aktywności; można ją wykazać w ekstrakcie z opatrunku, w odpowiednich układach testowych. Aktywność ta ujawnia się po związaniu z odpowiednim receptorem na komórce docelowej.Dressings according to the invention consist of a collagen or polyurethane pad with pores less than 0.5 mm and at least one cytokine in a protective buffer solution. The buffer solution contains protein substances such as serum albumin, human serum, gelatin and other physiologically acceptable additives, especially glycols, mannitol, methylcellulose; the preferred pH of the solution is 4-7.8. The concentration of cytokines in the dressing depends on the type of cytokine and may vary from 0.1 to 50 pg per cm ^{2 of the} dressing. It is not recommended to use higher concentrations as in some cases they may be unfavorable for the patient. The dressings according to the invention may additionally contain antimicrobial chemotherapeutic agents, e.g. silver sulfadiazine, which do not inhibit the healing process and do not interact with cytokines. In the dressing according to the invention, cytokines retain a large part of their original activity; it can be demonstrated in the dressing extract in appropriate test systems. This activity is revealed upon binding to the appropriate receptor on the target cell.

Sposób wytwarzania gąbczastych opatrunków według wynalazku polega na tym, że tampon kolagenowy lub poliuretanowy o grubości 1 - 6 mm nasącza się co najmniej jedną cytokiną w ochronnym roztworze buforowym, korzystnie o pH 4 - 7,8, zawierającym środki chroniące cytokiny przed denaturacją i/lub nieodwracalną adsorpcją, następnie suszy i pakuje w wysterylizowane opakowania z laminowanej folii, zgrzewa ewentualnie poddaje sterylizacji radiacyjnej i przechowuje w temperaturze 0 - 7°C. W sposobie według wynalazku korzystnie nasączony roztworem cytokin tampon poddaje się liofilizacji, to znaczy szybkiemu głębokiemu zamrożeniu w temperaturze od -70 do -180°C i suszy w próżni w niskich temperaturach tak, aby temperatura końcowa suszenia wynosiła poniżej 20°C. Początkowa temperatura suszonych opatrunków powinna wynosić poniżej 0°C przez około 5 pierwszych godzin procesu liofilizacji. Można też roztwór cytokin rozprowadzić w kremie, korzystnie eucerynowym, i tak otrzymaną mieszaninę nanieść na powierzchnię gąbki kolagenowej lub poliuretanowej. Tak otrzymany opatrunek pokrywa się cienką, jałową mikrobiologicznie folią z tworzywa sztucznego o grubości poniżej 0,3 mm i przepuszczalności pary wodnej poniżej 3,5 mg/cm2-h, poddaje się lekkiemu sprasowaniu w temperaturze 35 - 45°C i szybko schładza się do temperatury poniżej 4°C.The method of producing spongy dressings according to the invention consists in soaking a 1-6 mm thick collagen or polyurethane tampon in at least one cytokine in a protective buffer solution, preferably with a pH of 4-7.8, containing agents that protect the cytokines against denaturation and / or by irreversible adsorption, then dried and packed in sterilized packages made of laminated foil, sealed, or subjected to radiation sterilization and stored at 0 - 7 ° C. In the process according to the invention, the pad soaked in a cytokine solution is preferably freeze-dried, i.e. deep-freeze, at a temperature of -70 to -180 ° C and dried in a vacuum at low temperatures so that the final drying temperature is below 20 ° C. The initial temperature of the dried dressings should be below 0 ° C for about the first 5 hours of the lyophilization process. It is also possible to spread the cytokine solution in a cream, preferably eucerin, and apply the mixture obtained to the surface of a collagen or polyurethane sponge. The dressing obtained in this way is covered with a thin, microbiologically sterile plastic film with a thickness of less than 0.3 mm and a water vapor permeability of less than 3.5 mg / cm2-h, lightly pressed at a temperature of 35 - 45 ° C and quickly cooled down to temperatures below 4 ° C.

189 044189 044

Korzystny sposób wytwarzania opatrunku według wynalazku polega na tym, że po nasączeniu tamponu roztworem cytokin wilgotny opatrunek pakuje się w uprzednio wysterylizowany radiacyjnie odcinek rękawa foliowo-papierowego, zamyka się przez zgrzewanie i poddaje llofiiizacji. Papier tego rękawa jest dobrze przepuszczalny dla gazów i par. Opatnuiki cytokmowe należy sporządzać w warunkach jałowości mikrobiologicznej, stosując stoły z laminamym przepływem jałowego powietrza. Powinny być zamknięte w hermetyczne opakowania z laminowanej folii aluminiowej przez zgrzanie i przechowywane w temperaturze 0 - 8°C.An advantageous method of producing a dressing according to the invention consists in that, after soaking a tampon with a cytokine solution, the wet dressing is packed into a previously radiation-sterilized section of a foil-paper sleeve, closed by heat-sealing and subjected to film-drying. The paper of this sleeve is well permeable to gases and vapors. Cytocyte opatnuics should be prepared under microbiological sterility conditions, using tables with a laminar flow of sterile air. They should be sealed in hermetic laminated aluminum foil wrapping and stored at 0 - 8 ° C.

Zastosowanie kompozycji środków chroniących cytokiny przed nieodwracalną adsorpcją i/lub denaturacją oraz naniesienie jej na gąbkę kolagenową lub poliuretanową w sposobie według wynalazku pozwoliło na uzyskiwanie opatrunków cytokinowych wykazujących nieoczekiwane właściwości. Sprawdzenie kinetyki uwalniania z tych opatrunków cytokin oraz sprawdzenie aktywności biologicznej ekstraktów umożliwia rozwinięcie nowej dziedziny w leczeniu ran, którą można nazwać cytokinową bioterapią ran.The use of a composition of cytokine protecting agents against irreversible adsorption and / or denaturation and applying it to a collagen or polyurethane sponge in the method according to the invention made it possible to obtain cytokine dressings showing unexpected properties. Checking the kinetics of cytokine release from these dressings and checking the biological activity of the extracts enables the development of a new field in wound treatment that can be termed cytokine wound biotherapy.

Opatrunki cytokinowe oraz sposób ich wytwarzania według wynalazku bliżej ilustrują poniższe przykłady nie ograniczając zakresu ochrony wynalazku.Cytokine dressings and the method of their preparation according to the invention are illustrated in more detail by the following examples without limiting the scope of protection of the invention.

Przykład I. Mikrobiologicznie jałową gąbkę kolagenową służącą jako opatrunek biologiczny, o grubości 4 mm (np. gąbka kolagenowa BIOKOL produkcji firmy Stalmed s. c., Kielce), nasącza się roztworem cytokiny rhGM-CSF (ludzki rekombinowany czynnik stymulujący wzrost kolonii granulocytów - makrofagów) rozpuszczonej w buforze o następującym składzie: kwas cytrynowy 0,05 M, fosforan dwusodowy 0,05 M, mannitol 20 mg/ml, glikol polietylenowy 4000 20 mg/ml, białka surowicy krwi ludzkiej 60 mg/ml; pH buforu powinno wynosić 6,8. Gąbkę poddaje się liofilizacji. Ilość cytokiny wprowadzona do opatrunku wynosi 5 μ g/cm². Opatrunek pakuje się w wysterylizowaną radiacyjnie laminowaną folię aluminiową i zamyka przez zz^trze^-vwan<e. Opatrunek przechowuje się w 4°C. Opaarunek można dodatkowo wysterylizować radiacyjnie.Example I. A microbiologically sterile collagen sponge serving as a biological dressing, 4 mm thick (e.g. BIOKOL collagen sponge manufactured by Stalmed sc, Kielce), is soaked with a solution of rhGM-CSF cytokine (human recombinant granulocyte-macrophage colony stimulating factor) dissolved in buffer with the following composition: citric acid 0.05 M, disodium phosphate 0.05 M, mannitol 20 mg / ml, polyethylene glycol 4000 20 mg / ml, human serum protein 60 mg / ml; The pH of the buffer should be 6.8. The sponge is freeze-dried. The amount of cytokine introduced into the dressing is 5 μg / cm ² . The dressing is wrapped in a radiation-sterilized laminated aluminum foil and sealed with a third. The dressing is stored at 4 ° C. The fume can additionally be sterilized by radiation.

Przykład II. Mikrobiologicznie jałową gąbkę poliuretanową przeznaczoną jako opatrunek na rany (np. gąbka poliuretanowa LIGAS ANO produkcji Ligamed Medical Produkte GmbH), o grubości 3 mm, nasącza się roztworem cytokiny rhG-CSF (ludzki rekombinowany czynnik stymulujący wzrost kolonii granulocytów) rozpuszczonej w buforze o następującym składzie: 0,05 M bufor octanowy sodowy pH 4,0, mannitol 20 mg/ml, Tween 80 - 0,5 mg/ml, albumina ludzka 2 mg/ml. Ilość cytokiny wprowadzona do opatrunku wynosi 50 pg/cnT. Wilgotny opatrunek pakuje się w wysterylizowany radiacyjnie odcinek rękawa foliowo-papierowego firmy WIPAK MEDICAL Steriking R40F, zamyka przez zgrzewanie i poddaje liofilizacji. Opatrunek przechowuje się w temperaturze 4°C.Example II. A microbiologically sterile polyurethane sponge intended as a wound dressing (e.g. LIGAS ANO polyurethane sponge by Ligamed Medical Produkte GmbH), 3 mm thick, is soaked with a solution of rhG-CSF cytokine (human recombinant granulocyte colony stimulating factor) dissolved in a buffer with the following composition : 0.05 M sodium acetate buffer pH 4.0, mannitol 20 mg / ml, Tween 80 - 0.5 mg / ml, human albumin 2 mg / ml. The amount of cytokine introduced into the dressing is 50 pg / cnT. The moist dressing is packed in a radiation-sterilized section of a foil-paper sleeve made by WIPAK MEDICAL Steriking R40F, closed by heat sealing and freeze-dried. The dressing is stored at 4 ° C.

Przykład III. Mikrobiologicznie jałową gąbkę kolagenową służącą jako opatrunek biologiczny, o grubości 6 mm, nasącza się roztworem cytokiny rh EGF (ludzki rekombinowany czynnik stymulujący proliferację keratynocytów) rozpuszczonej w buforze o następującym składzie: chlorek sodu 0,010 M, fosforan dwusodowy 0,01 M, mannitol 20 mg/ml, albumina ludzka 20 mg/ml; pH buforu wynosiło 6,5. Gąbkę poddawano liofilizacji. Ilość cytokiny wprowadzona do opatrunku wynosi 5 pg/cm2. Opatrunek liofilizuje się i pakuje się w wysterylizowaną radiacyjnie laminowaną folię aluminiową oraz zamyka przez zgrzewanie. Opatrunek przechowuje się w temperaturze 4°C.Example III. A microbiologically sterile collagen sponge, 6 mm thick, used as a biological dressing, is soaked with a solution of rh EGF (human recombinant keratinocyte proliferation factor) dissolved in a buffer with the following composition: sodium chloride 0.010 M, disodium phosphate 0.01 M, mannitol 20 mg / ml, human albumin 20 mg / ml; The pH of the buffer was 6.5. The sponge was freeze-dried. The amount of cytokine introduced into the dressing is 5 pg / cm2. The dressing is lyophilized and wrapped in radiation-sterilized laminated aluminum foil and closed by heat sealing. The dressing is stored at 4 ° C.

Przykład IV. Mikrobiologicznie jałową gąbkę kolagenową służącą jako opatrunek biologiczny, o grubości 6 mm, nasącza się roztworem cytokiny EGF rozpuszczonej w buforze o następującym składzie: chlorek sodu 0,010 Mj fofforan dwusodowy 0,0j Mj marmttoj 20 mg/ml, żelatyna z kolagenu bydlęcego 80 mg/ml; pH buforu wynosiło 6,5. Gąbkę poddawano liofilizacji. Ilość cytokiny wprowadzona do opatrunku wynosi 0,1 Lig/cm2. Opatrunek liofilizuje się i pakuje się w wysterylizowaną radiacyjnie laminowaną folię aluminiową oraz zamyka przez zgrzewanie. Opatrunek przechowuje się w temperaturze 4°C.Example IV. Microbiologically sterile collagen sponge serving as a biological dressing, 6 mm thick, is soaked with a solution of EGF cytokine dissolved in a buffer with the following composition: sodium chloride 0.010 Mj disodium fofforan 0.0j Mj marmtoj 20 mg / ml, bovine collagen gelatin 80 mg / ml ; The pH of the buffer was 6.5. The sponge was freeze-dried. The amount of cytokine loaded into the dressing is 0.1 Lig / cm2. The dressing is lyophilized and wrapped in radiation-sterilized laminated aluminum foil and closed by heat sealing. The dressing is stored at 4 ° C.

Przykład V. Na mikrobiologicznie jałową gąbkę poliuretanową nanosi się warstwę antyseptycznej maści (np. preparat Flammazine produkcji Solvay Duphar B.V., Weesp, Holandia) do którego dodaje się uprzednio roztwór cytokiny rhGM-CSF rozpuszczonej w buforze jak w przykładzie I. Na gąbkę pokrytą kremem Flammazine z cytokiną nakłada się jałową mikrobiologicznie folię z polichlorku winylu o grubości 0,05 mm. Opatrunek poddaje się lekkiemu sprasowaniu w temperaturze 35°C, po czym schładza do temperatury 4°C. Ilość cyto189 044 kiny wprowadzona do opatrunku wynosi 10 pg/cm². Opatrunek pakuje się w wysterylizowaną radiacyjnie laminowaną folię aluminiową i zamyka przez zgrzewanie. Opatrunek przechowuje się w temperaturze 4°C.Example 5 A layer of antiseptic ointment (e.g. Flammazine preparation by Solvay Duphar BV, Weesp, The Netherlands) is applied to a microbiologically sterile polyurethane sponge to which a solution of rhGM-CSF cytokine dissolved in a buffer is previously added as in Example I. The sponge covered with Flammazine a sterile microbiological polyvinyl chloride foil with a thickness of 0.05 mm is applied with the cytokine. The dressing is lightly pressed at 35 ° C and then cooled to 4 ° C. The amount of cyto 189 044 applied to the dressing is 10 pg / cm ² . The dressing is packed in radiation-sterilized laminated aluminum foil and closed by heat sealing. The dressing is stored at 4 ° C.

Przykład VI. Mikrobiologicznie jałową gąbkę poliuretanową przeznaczoną jako opatrunek na rany (np. gąbka poliuretanowa LIGASANO produkcji Ligamed medical Produkte GmbH), o grubości 3 mm, nasącza się roztworem cytokiny rhG-CSF (ludzki rekombinowany czynnik stymulujący wzrost kolonii granulocytów) rozpuszczonej w buforze o następującym składzie: 0,05 M bufor octanowy sodowy pH 4,0, metyloceluloza 30 mg/ml, Tween 80 - 0,5 mg/ml, albumina ludzka 2 mg/ml. Ilość cytokiny wprowadzona do opatrunku wynosi 15 pg/cm². Wilgotny opatrunek pakuje się w wysterylizowany radiacyjnie odcinek rękawa foliowo-papierowego firmy WIPAK MEDICAL Steriking R40f, zamyka przez zgrzewanie i poddaje liofilizacji. Opatrunek przechowuje się w temperaturze 4°C.Example VI. A microbiologically sterile polyurethane sponge intended as a wound dressing (e.g. LIGASANO polyurethane sponge manufactured by Ligamed medical Produkte GmbH), 3 mm thick, is soaked with a solution of rhG-CSF cytokine (human recombinant granulocyte colony stimulating factor) dissolved in a buffer with the following composition: 0.05 M sodium acetate buffer pH 4.0, methylcellulose 30 mg / ml, Tween 80 - 0.5 mg / ml, human albumin 2 mg / ml. The amount of cytokine introduced into the dressing is 15 pg / cm ² . The moist dressing is packed in a radiation-sterilized section of a foil-paper sleeve made by WIPAK MEDICAL Steriking R40f, closed by heat sealing and freeze-dried. The dressing is stored at 4 ° C.

Przykład VII. Wyniki badania kinetyki uwalniania cytokin z opatrunków Badania in vitroExample VII. Results of the study of the kinetics of cytokine release from dressings In vitro studies

1. Kinetyka uwalniania cytokiny rhGM-CSF z 1 cm2 opatrunku kolagenowego, zawierającego 0,5 pg/cm² do 0,3 ml PBS (płyn fizjologiczny o pH 7,4) użytego jako płyn ekstrakcyjny, w temperaturze 37°C. Po 24, 48 i 72 godzinach uwalniania cytokiny z opatrunków oznaczano w ekstraktach jej zawartość immunoenzymatyczną metodą ELISA.1. Kinetics of rhGM-CSF cytokine release from 1 cm2 of collagen dressing containing 0.5 µg / cm ² to 0.3 ml of PBS (pH 7.4 saline) used as extraction fluid at 37 ° C. After 24, 48 and 72 hours of cytokine release from the dressings, its content in the extracts was determined by enzyme immunoassay by ELISA.

Tabela 1Table 1

Wydajność ekstrakcji cytokiny rhGM-CSF z opatrunku cytokinowegoEfficiency of extraction of rhGM-CSF cytokine from cytokine dressing

Dzień Day 1 1 2 2 3 3 Stężenie rhGM-CSF (μ g/ml) Concentration of rhGM-CSF (μg / ml) 0,15 0.15 0,05 0.05 0,01 0.01 Wydajność ekstrakcji (dane skumulowane) Extraction efficiency (cumulative data) 30% thirty% 40% 40% 42% 42%

2. Kinetyka uwalniania cytokiny EGF z 1 cm opatrunku kolagenowego, zawierającego 0,5 pg/cm2 do 0,3 ml PBS (płyn fizjologiczny o pH 7,4) użytego jako płyn ekstrakcyjny, w temperaturze 37°C. Po 24, 48 i 72 godzinach uwalniania cytokiny z opatrunków oznaczano w ekstraktach jej zawartość immunoenzymatyczną metodą ELISA.2. Kinetics of EGF cytokine release from 1 cm of collagen dressing containing 0.5 µg / cm2 to 0.3 ml of PBS (pH 7.4 saline) used as extraction fluid at 37 ° C. After 24, 48 and 72 hours of cytokine release from the dressings, its content in the extracts was determined by enzyme immunoassay using the ELISA method.

Tabela 2Table 2

Wydajność ekstrakcji cytokiny EGF z opatrunku cytokinowegoEfficiency of EGF cytokine extraction from cytokine dressing

Dzień Day 1 1 2 2 3 3 Stężenie EGF (pg/ml) EGF concentration (pg / ml) 0,125 0.125 0,010 0.010 0,015 0.015 Wydajność ekstrakcji (dane skumulowane) Extraction efficiency (cumulative data) 2,5% 2.5% 4,5% 4.5% 7,5% 7.5%

Przykład VIII. Wyniki badania skuteczności przeciwbakteryjnej opatrunków cytokinowychExample VIII. Results of the study of the antimicrobial efficacy of cytokine dressings

1. Badania in vitro1. In vitro research

Aktywność biologiczna ekstraktów z opatrunków cytokinowych, zawierających cytokiny rhGM-CSF lub rhG-CSF. Badania wykonane przy użyciu zestawów diagnostycznych „Bursttest” produkcji firmy ORPEGEN Pharma (Heidelberg, RFN). Zawierające wymienione cytokiny ekstrakty opatrunków cytokinowych posiadały aktywność biologiczną manifestującą się pobudzaniem ludzkich leukocytów do znacznego wzmożenia procesu zwanego „wybuchem tlenowym”; proces ten posiada zasadnicze znaczenie w wewnątrzkomórkowym zabijaniu sfagocytowanych mikroorganizmów.Biological activity of extracts from cytokine dressings containing rhGM-CSF or rhG-CSF cytokines. The tests were performed with the use of diagnostic kits "Bursttest" by ORPEGEN Pharma (Heidelberg, Germany). Extracts of cytokine dressings containing these cytokines had biological activity manifested by stimulating human leukocytes to significantly intensify a process called "oxygen burst"; this process is essential in the intracellular killing of phagocytic microorganisms.

189 044189 044

2. Badania in vivo2. In vivo studies

Redukcja liczby żywych komórek bakterii Pseudomonas aeruginosa (ATCC 2785) w doświadczalnie zakażonych ranach u myszy. Po nacięciu płata skórnego (1,5 x 1,5 cm) na grzbiecie u 40 myszy, w narkozie eterowej, między mięsień skórny i grzbietowy wstrzykiwano 10⁷ żywych komórek bakteryjnych, po czym u 20 myszy rany pokrywano opatrunkami cytokinowymi sporządzonymi z gąbki poliuretanowej zawierającej 15 pg/cm² ludzkiej rekombinacyjnej cytokiny rhG-CSF (mysie leukocyty reagują na preparat ludzki rhG-CSF). U pozostałych 20 myszy, zakażoną ranę pokrywano identycznym opatrunkiem z gąbki poliuretanowej, zawierającej tylko bufor, będący rozpuszczalnikiem cytokiny; myszy te stanowiły grupę kontrolną. Opatrunki pokrywano odchylonymi wcześniej płatami skóry, które przyszywano kilkoma szwami chirurgicznymi. Po 1, 2, 3 i 8 dniach, myszy poddawano powtórnie narkozie eterowej i pobierano biopsje z zakażonych mięśni. W biopsjach oznaczano liczbę żywych bakterii metodą płytkową.Reduction of Pseudomonas aeruginosa (ATCC 2785) viable cells in experimentally infected wounds in mice. After incision of the skin flap (1.5 x 1.5 cm) on the dorsum of 40 mice, under ether anesthesia, 10 ⁷ viable bacterial cells were injected between the dermal and dorsal muscles, and then in 20 mice the wounds were covered with cytokine dressings made of polyurethane sponge containing 15 µg / cm ^{2 of} human recombinant rhG-CSF cytokine (murine leukocytes react to the human rhG-CSF preparation). In the remaining 20 mice, the infected wound was covered with an identical polyurethane sponge dressing containing only cytokine solvent buffer; these mice constituted the control group. The dressings were covered with previously deflected skin flaps which were sutured with several surgical sutures. After 1, 2, 3 and 8 days, the mice were re-anesthetized with ether anesthesia and biopsies were taken from the infected muscles. The number of live bacteria was determined by the plate method in the biopsies.

Tabela 3Table 3

Wyniki skuteczności opatrunków cytokinowych zawierających rhG-CSF w badaniach na myszach, którym wstrzyknięto do rany 1θ7 żywych bakterii (CFU).Efficacy results of cytokine dressings containing rhG-CSF in studies on mice injected into the wound with 1–7 live bacteria (CFU).

Dzień Day Liczba żywych bakterii (CFU) w biopsji z mięśni Live bacteria count (CFU) on muscle biopsy 1 1 2 2 3 3 8 8 Grupa kontrolna - opatrunek bez cytokiny Control group - a dressing without a cytokine 5-10⁶ 5-10 ⁶ 1,5-106 1.5-106 1,5-106 1.5-106 2,5-105 2.5-105 Grupa badana - opatrunek cytokinowy zawierający rhG-CSF Study group - cytokine dressing containing rhG-CSF 10⁶ 10 ⁶ 6,3-10⁵ 6.3-10 ⁵ 105 1) 105 1) 5,8-10³ 2)5.8-10 ³ 2)

1) - różnica statystycznie znamienna w stosunku do kontroli dnia trzeciego, p<0,0011) - statistically significant difference in relation to the control on the third day, p <0.001

2) - różnica statystycznie znamienna w stosunku do kontroli dnia ósmego, p<0,00012) - statistically significant difference in relation to the eighth day control, p <0.0001

WniosekProposal

Opatrunek cytokinowy zawierający cytokinę rhG-CSF posiada wysoką aktywność przeciwbakteryjną (leczniczą), powodując pobudzenie fagocytozy i w efekcie redukując liczbę bakterii w zakażonej ranie poniżej wartości 10⁵, jako liczby granicznej różnicującej zakażenie kliniczne od kolonizacji tkanek.The cytokine dressing containing the rhG-CSF cytokine has a high antimicrobial (therapeutic) activity, inducing phagocytosis and, as a result, reducing the number of bacteria in the infected wound below 10 ⁵ , as a cut-off number differentiating clinical infection from tissue colonization.

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 50 egz.Publishing Department of the UP RP. Circulation of 50 copies

Cena 2,00 zł.Price PLN 2.00.

Claims

Patent claims

1. Spongy dressings for superficial wounds, especially those infected with pathogenic microorganisms based on a collagen or polyurethane sponge, characterized in that they consist of a collagen or polyurethane pad with pores below 0.5 mm and at least one cytokine in a protective buffer solution, whereby the concentration of cytokine in the dressing is 0.1-50 pg / cm ² .

2. Spongy dressings according to claim 1, characterized in that the protective buffer solution contains protein substances and other physiologically acceptable additives, in particular glycols, mannitol, methylcellulose.

3. Spongy dressings according to claim 1 The method of claim 1 or 2, characterized in that the pH of the buffer solution is 4-7.8.

4. Spongy dressings according to claim 1 The method of claim 1, additionally containing chemotherapeutic agents that do not interact with cytokines.

Method for the production of spongy dressings for superficial wounds, especially those infected with pathogenic microorganisms, characterized in that a collagen or polyurethane pad with pores of 0.5 mm and a thickness of 1 - 6 mm is soaked in at least one cytokine in a protective buffer solution with a pH of 4 - 7 , 8 containing agents that protect cytokines against denaturation and / or irreversible adsorption, then dried and packed in a sterilized laminated foil package and sealed, optionally subjected to radiation sterilization and stored at 0 - 8 ° C.

6. The method according to p. 6. The process of claim 5, characterized in that the spongy dressing saturated with a cytokine solution is subjected to a quick deep freeze at a temperature of -70 to -180 ° C, dried in a vacuum at low temperatures so that the final drying temperature is below 20 ° C.

7. The method according to p. 5. The method of claim 5, characterized in that the cytokine solution is first introduced into the cream and the mixture obtained in this way is applied to the surface of a collagen or polyurethane sponge, covered with a thin microbiologically sterile plastic film less than 0.1 mm thick, lightly pressed at a temperature of 35 - 45 ° C and quickly cools below 4 ° C.

8. The method according to p. The method of claim 7, characterized in that the cytokine solution is mixed with a eucerin cream.

9. The method according to p. The method of claim 5, wherein after saturating the tampon with the cytokine solution, the wet dressing is wrapped in a radiation-sterilized section of a medical foil-paper sleeve, sealed by heat sealing and freeze-dried.