PL177831B1 - Enzymatyczny sposób stereoselektywnego wytwarzania enancjomeru heterobicyklicznego alkoholu oraz zasadniczo czysty enancjomer alkoholu - Google Patents

Abstract

1. Enzymatyczny sposób stereoselektywne go wytwarzania enancjomeru heterobicykliczne- go alkoholu, o ogólnym wzorze 1, w którym X oznacza O, NH, N-(C1 -C4)alkil lub CH2, Y1 , Y2 i Y3 oznaczaja kazdy niezaleznie wodór lub podsta- wniki wybrane sposród chlorowca, grupy C 1-C4 alkilowej i nitrowej, grupa NO 2 jest przylaczona do bicyklicznego ukladu pierscieniowego w pozy- cji 5 lub 7, a atom C* ma konfiguracje R lub S, znamienny tym, ze odpowiedni racemat alkoholu poddaje sie obróbce w kolejnych nastepujacych etapach reakcyjnych obejmujacych (i) acylowa- nie racematu srodkiem acylujacym pod wplywem enzymu majacego stereoselektywna aktywnosc estryfikacyjna, (ii) wydzielenie niezestryfikowa nego zwiazku z otrzymanego estru i wydzielenie pozadanego zasadniczo czystego enancjomeru al- koholu o wzorze 1 albo jego estru, (iii) poddanie otrzymanego estru hydrolizie, przeksztalcajac w ten sposób ester w odpowiedni enancjomer alko- holu, i (iv) przeksztalcenie niepozadanego enanjo meru alkoholu w wyjsciowy racemat alkoholu w warunkach zasadowych, w celu jego powtórnego uzycia. W Z ÓR 1 PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotami obecnego wynalazku jest sposób stereoselektywnego wytwarzania enancjomeru heterobicyklicznego alkoholu oraz zasadniczo czysty enancjomer alkoholu.

Różne biologicznie aktywne substancje, które można stosować, na przykład, w mieszankach farmaceutycznych używanych przez ludzi i zwierzęta, posiadają centrum chiralne w swojej strukturze cząsteczkowej i dlatego wywołują izomerię optyczną. Ogólnie wiadomo, że często jedynie jeden z izomerów optycznych wykazują pożądaną optymalną aktywność biologiczną. Obecność innego optycznego antypodu w kompozycji lub preparacie może wywołać lub wzmocnić pewne efekty uboczne i obciążać odbiorcę, to jest ciało człowieka lub zwierzęcia. Ogólnie uważa się, iż coraz bardziej pożądane jest podawanie biologicznie aktywnej substancji w postaci zasadniczo czystego enancjomeru, który wykazuje specjalnie pożądaną aktywność biologiczną. Dlatego, rozdział racematu na enancjomery jest często ważnym etapem procesu wytwarzania farmakologicznie aktywnych substancji.

Zasadniczo dostępne są trzy metody rozdzielania racematów na ich odpowiednie enancjomery. W pierwszej z nich, rozdział oparty jest na różnicy we własnościach fizycznych na przykład, w strukturze krystalicznej i stosuje się ją bardzo okazyjnie. W drugiej i najbardziej dotychczas ogólnie stosowanej metodzie rozdział polega na reakcji z handlowo dostępnym, optycznie aktywnym reagentem, w wyniku czego otrzymuje się diastereoizomery różniące się własnościami fizycznymi. Otrzymane w ten sposób diastereoizomery można rozdzielić, na przykład przez rekrystalizację, po czym odpowiednie enancjomery można regenerować przez dalszą obróbkę chemiczną. Ewidentne jest, iż taki sposób rozdzielania racematów jest zarówno bardzo pracochłonny jak i kosztowny, a to z powodu używania i odzyskiwania kosztownego optycznie czynnego reagenta. Ostatnio, w bardziej ekonomicznej metodzie rozdziału stosuje się enzymy celem selektywnej chemicznej modyfikacji jednego z izomerów racematu. Na przykład, Bianchi i inni (J. Org. Chem., 1988, 53, 5531-5534) donosił, że stosował bezwodniki kwasów karboksylowych jako środki acylujące w selektywnej estryfikacji racemicznych alkoholi katalizowanej lipazą. Pozwoliło to otrzymać z wysoką aktywnością optyczną pierwszo- i drugorzędowe alkohole, mianowicie, z nadmiarem enancjomerycznym ponad 95%. Oczywiście, dla najlepszych zastosowań farmaceutycznych pożądany nadmiar stereoizomeru wynosi przynajmniej 95%. Chociaż liczne rezultaty uzyskane przez Bianchi i współpracowników są zachęcające, to jednak z pewnymi alkoholami nie obserwowano żadnej lub obserwowano niedostateczną stereoselektywną przemianę. W dwóch ostatnich publikacjach Ennis’a i innych (Tetrahedron Letters, 1992, 33, 6283-6286 i 6287-6290), opisano zastosowanie enzymatycznej metodologii rozdziału 2-hydroksymetylo-1,4-benzodioksanów jako substratów. Autorzy zauważyli, że zastosowanie tej metody rozdziału nie pozwala na uzyskanie pożądanych wzorców o optycznej czystości, tak iż konieczny jest powtórny rozdział enzymatyczny.

W celu ułatwienia rozdziału estru wytworzonego z pozostałego alkoholu, Terao i inni, (Chem. Pharm. Bull., 1989, 37, 1653-1656) zastosował bezwodnik bursztynowy dla otrzymania enancjomeru monoestru bursztynowego, który mógł być łatwo oddzielony od innego, nie przereagowanego enancjomeru alkoholu, przez przemycie roztworem alkalicznym. W ten sposób pożądany aktywny enancjomer można było oddzielić bez problemu od niepożądanego nieaktywnego enancjomeru, chociaż rezultaty, jeśli chodzi o czystość optyczną, to jest nadmiar enancjomeryczny, były generalnie nie zadowalające. Jedynie z jedną substancją, mianowicie (1-hydroksyetylo)benzenem, drugorzędowym alkoholem, enzymatyczny rozdział racematu przez enancjoselektywną estryfikacją bezwodnikiem bursztynowym był zadowalający.

Ponadto, do często nie dających się przewidzieć wyników enzymatycznego rozdziału racematu alkoholu, jak można wnioskować z powyższych publikacji, dochodzi jeszcze inny problem związany z wydzieleniem pożądanego enancjomeru alkoholu z jego odpowiedniego racematu. W rzeczywistości, rozdział każdego racematu daje poza pożądanym enancjomerem niepożądany antypod optyczny, który jest zwykle bezużyteczny. Znaczy to, iż przynajmniej 50%, zwykle kosztownego, substratu należy chemicznie uważać za odpad, lub innymi słowy,

177 831 że wydajność rozdziału racematu, jeśli chodzi o aktywny materiał, wynosi co najmniej 50%.

Jest to wyraźnie pokazane w tabelach w powyższej publikacji Erniis’a i innych, którzy wykazują, że początkowy racemat może dać co najmniej 50% pożądanego enancjomeru albo w postaci nieskonwertowanego alkoholu lub estru uzyskanego po konwersji.

Celem obecnego wynalazku jest dostarczenie ekonomicznie skutecznego sposobu stereoselektywnego wytwarzania enancjomeru heterobicyklicznego alkoholu o wzorze 1.

Cel ten można osiągnąć w określonym wyżej procesie enzymatycznym. Według wynalazku, sposób wytwarzania zasadniczo czystego enancjomeru o wzorze ogólnym 1, w którym X oznacza O, NH, N-(C_rC₄)alkil lub CH₂, Y_l5 Y₂ i Y3 oznaczają każdy niezależnie wodór lub podstawniki wybrane spośród chlorowca, grupy C1-C4 alkilowej i nitrowej, podstawnik NO2 jest przyłączony do bicyklicznego układu pierścieniowego w pozycji 5, a atom węgla C* ma konfigurację R albo S, polega na tym, że odpowiedni racemat alkoholu poddaje się obróbce w kolejnych następujących etapach reakcyjnych obejmujących (i) acylowanie racematu środkiem acylującym pod wpływem enzymu mającego stereoselektywną aktywność estryfikującą, (ii) wydzielenie niezestyfikowanego związku z otrzymanego estru i wydzielenie pożądanego, zasadniczo czystego enancjomeru alkoholu o wzorze 1 albo jego estru, (iii) poddanie otrzymanego estru hydrolizie, przekształcając w ten sposób ester w odpowiedni enancjomer alkoholu, i (iv) przekształcenie niepożądanego enancjomeru alkoholu w wyjściowy racemat alkoholu w warunkach zasadowych, w celu jego powtórnego użycia.

Całkowicie przeciwnie do oczekiwań, powyższa obróbka zasadowa (etap iv) daje racemizację niepożądanego enancjomeru alkoholu. Zjawiska tego nie można wytłumaczyć, ponieważ proton przyłączony do centrum chiralnego (C*) jest zupełnie niekwaśny. Tak otrzymany racemat alkoholu można z powrotem używać jako materiał wyjściowy w następującej reakcji rozdziału. Ewidentną sprawą będzie to, iż wynalazek ten czyni stereoselektywne wytwarzanie enancjomeru alkoholu katalizowane enzymem, procesem wykonalnym zarówno z punktu widzenia ekonomicznego jak i z punktu widzenia ochrony środowiska.

Odpowiednimi środkami acylującymi w powyższej reakcji acylacji są bezwodniki karboksylowe, co będzie dalej zilustrowane przykładami, i estry winylowe, takie jak octan winylu, propionian winylu, maślan winylu, izomaślan winylu i tym podobne.

Reakcję acylacji prowadzi się korzystnie w układach rozpuszczalnika organicznego zawierających małą ilość wody lub wodnego bufora. Enzym najczęściej stosuje się w postaci surowego stałego preparatu, który jest handlowo dostępny, co ułatwia jego odzyskiwanie. Enzym można także stosować w postaci unieruchomionej jak, na przykład, kowalencyjnie związany z lub zaadsorbowany na odpowiednim nośniku. Związek niezestryfikowany można wydzielić z wytworzonego estru stosując różne techniki znane przy wydzielaniu związków, takie jak ekstrakcja, rekrystalizacja, preparatywna chromatografia kolumnowa i tym podobne.

Po wyżej wspomnianym, zasadniczo czystym enancjomerem alkoholu, należy rozumieć produkt zawierający związki alkoholu o czystości enancjomerycznej (ee) ponad w przybliżeniu 95%. Jeśli w sposobie enzymatycznym według wynalazku, nie osiąga się czystości enancjomerycznej, to czystość enancjomeryczną można generalnie polepszyć aż do pożądanego poziomu, stosując prostą metodę rekrystalizacji. Tym samym, wyodrębnianie pożądanego enancjomeru czystego alkoholu, jak opisano wyżej, może obejmować także rekrystalizację mającą na celu polepszenie czystości enancjomerycznej i usunięcie mniejszych zanieczyszczeń.

Decydujący etap reakcyjny, mianowicie, racemizacja niepożądanego enancjomeru alkoholu w warunkach zasadowych, można łatwo przeprowadzić zarówno w warunkach aprotycznych jak w warunkach protycznych. Jako zasady stosuje się wodorotlenek sodowy, wodorotlenek potasowy, wodorotlenek litowy, wodorotlenek amonowy, i tak dalej, rozpuszczone w wodzie lub w mieszaninach rozpuszczalnika wodnego i zawierających mieszalne z wodą rozpuszczalniki organiczne, takie jak alkohole. Przykładami zasad stosowanych w układach aprotycznych są (a) wodorki, na przykład wodorek sodowy, w rozpuszczalnikach aprotycznych, takich jak DMSO, (b) alkoholany potasowe, takie jak tert-butanolan potasowy i metylo-2-butanolan potasowy, w aprotycznych rozpuszczalnikach, takich jak etery

177 831 (na przykład THF), i (c) alkilolity i amidy alkilolitowe takie jak metylolit, różne butylolity i amid litowodiizopropylowy, także w rozpuszczalnikach aprotycznych, na przykład THF. Racemat alkoholu można odzyskiwać z dobrymi wydajnościami po neutralizacji kwasem na przykład przez ekstrakcję odpowiednim rozpuszczalnikiem organicznym z fazy wodnej i następnie, jeśli to pożądane, po odparowaniu rozpuszczalnika uzyskuje się produkt gotowy do powtórnego użycia.

Hydrolizę wytworzonego estru, jak wspomniano wyżej w punkcie (iii) można dogodnie prowadzić w warunkach kwaśnych lub słabo alkalicznych celem uniknięcia racemizacji wytworzonego enancjomeru alkoholu. Szczególne wykorzystanie wynalazku polega jednakże na tym, że można połączyć powyższą hydrolizę estru z racemizacją enancjomeru alkoholu. W tym przypadku powyższe etapy reakcyjnej (iii) i (iv) można połączyć w jeden, redukując przez to jeden etap reakcyjny. Aby przeprowadzić obie reakcje w tym samym czasie, mianowicie równocześnie hydrolizę i racemizację, pożądane są dostatecznie silne warunki zasadowe, jak to określono wyżej dla reakcji racemizacji.

Sposób według wynalazku jest korzystnie przeznaczony do stereoselektywnego otrzymywania odpowiednio czystego enancjomeru alkoholu o strukturze benzodioksanu, takiej jak dla związku o wzorze ogólnym 2, w którym Y' oznacza wodór lub podstawnik wybrany spośród chloru, fluoru i grupy metylowej, grupa NO₂ przyłączona jest do pierścienia benzodioksanu w pozycji 5 lub 7 a atom węgla C* ma konfigurację R lub S, prowadząc kolejne etapy reakcyjne, jak opisano wyżej.

Enzym stosuje się korzystnie w postaci ciała stałego i dlatego można go łatwo odzyskać w celu powtórnego użycia. Odzyskiwanie enzymu dogodnie jest prowadzić po etapie reakcyjnym (i), to znaczy po zakończeniu acylacji, stosując w tym celu odpowiedni sposób postępowania, taki jak prosta filtracja. Jeśli stosuje się enzym, który związany jest z odpowiednim nośnikiem, takim jak Celite (patrz powyższa publikacja autorów Bianchi i inni) lub szklane kulki, to enzym można łatwo odzyskać przez proste odsączenie i jeśli to pożądane następne odmycie przesączu od zanieczyszczeń.

Użycie bezwodników karboksylowych korzystne jest przy stosowaniu estrów winylowych jako środków acylujących, ponieważ bezwodniki karboksylowe, takie jak bezwodnik octowy, bezwodnik propionowy, bezwodnik masłowy, bezwodnik izomasłowy lub bezwodnik heksanowy, generalnie mają lepsze działanie w obecności odpowiedniego enzymu. Aby ułatwić oddzielenie niezestryfikowanego związku od wytworzonego estru, preferowane jest użycie cyklicznych bezwodników karboksylowych, w szczególności bezwodnika bursztynowego lub bezwodnika glutarowego. Otrzymany w ten sposób wytworzony monoester można łatwo oddzielić od niezestryfikowanego związku stosując ekstrakcję słabo alkalicznym roztworem w takich warunkach, w których ester pozostaje nienaruszony.

Odpowiednimi enzymami do przeprowadzenia stereoselektywnej estryfikacji są hydrolizy, takie jak występujące naturalnie i generowane lipazy i esterazy. Przykładami odpowiednich lipaz są: Aspergillus niger, Candida cylindracea (na przykład Meito® MY 30 lub Amano® AY), Candida lipolytica, Chromobacterium Ciscosum, Geotrichum candidum, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Mucor javanicus (na przykład Amano® M), Pig pancreatic lipase, Penicillium cyclopium, Penicillium roqueforti, Pseudomonas cepacia (Am^n^® PS), Pseudomonas fluoroscence (na przykład Amano® P), Phizopus niveus (na przykład Amano® N), Rhizopus javanicus (na przykład Amanci® F), Rhizopus arrhizus i Rhizopus delemar. W przeciwieństwie do tego co sugerowanie jest w publikacji Bianchi i innych, stwierdzono obecnie, że niektóre lipazy, w szczególności lipaza Candida cylindracea, wykazują preferencję do enancjomeru. S. Dlatego też takie lipazy są zdolne stereoselektywnie estryfikować enancjomer S, co w rezultacie pozwala otrzymać pozostały enancjomer R z wysoką wydajnością, i o stereochemicznej czystości. Inne lipazy, na przykład Pseudomonas fluoroscence i wiele innych lipaz, preferuje konwersję enancjomeru R i dlatego są one dobre do wyodrębniania enancjomeru S, również z wysoką wydajnością i o stereochemicznej czystości.

177 831

Wynalazek obecny dotyczy także zasadniczo czystego enancjomeru alkoholu o wzorze 1, przedstawionego poprzednio, w którym X i podstawniki Y mają wyżej podane znaczenia, grupa NO2 jest przyłączona do bicyklicznego układu pierścieniowego w pozycji 5 lub 7, a atom C* ma konfigurację R.

Ten enancjomer można otrzymać dogodnie w procesie enzymatycznym według wynalazku. Enancjomer ten można stosować jako kluczowy produkt pośredni w procesie wytwarzania pewnych farmakologicznie aktywnych pochodnych piperazyny.

W czasopiśmie Drugs of the Future 1988, 13, 31-33 opisano chlorowodorek flesinoksanu, silny aktywny doustnie agonista 5-HT_1A. Racemiczny benzodioksan, odpowiadający powyższemu wzorowi 2, w którym Y' oznacza podstawnik 7-chloro, poddaje się najpierw reakcji z chlorkiem benzoilu, aby zabezpieczyć jego funkcję alkoholową. Następnie, po katalitycznym uwodornieniu poddaje się go reakcji z bis(chloroetylo)aminą i otrzymuje racemiczny związek piperazynowy. W tej fazie rozdział racematu piperazynowego przeprowadza się używając do tego celu kwasu (+)-kamforosulfonowego. Po kilku krystalizacjach otrzymuje się optycznie czysty enancjomer R-(+). Reakcja tego enancjomeru z N-(4-fluorobenzoilo)azyrydyną, usunięcie zabezpieczenia grupy hydroksylowej w procesie zmydlania estru benzoesowego i wreszcie działanie kwasem chlorowcowodorowym daje pożądany, zasadniczo czysty (+)-enancjomer, mianowicie chlorowodorek flesinoksanu. We wspomnianej wyżej ostatniej publikacji, Ennis’a i innych (Tetrahedron Letters, 1992, 33, 6287-6290) opisano enzymatyczny rozdział flesinoksanu i jego optycznego antypodu jako finalny etap rozdziału. W pracochłonnym procesie enzymatycznym z podwójnym przejściem, pożądany flesinoksan można było wyodrębnić z zadawalającą czystością enancjomerycrną.

Z powyższych informacji jest oczywiste, że opisane wytwarzanie flesinoksanu jest pracochłonne i kosztowne, w szczególności ze względu na pracochłonny rozdział racematu w tak zaawansowanym etapie wieloetapowego procesu syntetycznego. Oczywiste też będzie, że nieuniknione straty materiału aktywnego podczas rozdzielania są bardzo szkodliwe w zaawansowanym etapie procesu syntetycznego.

Obecnie stwierdzono, że zasadniczo czysty enancjomer alkoholu o wzorze ogólnym 1 można dogodnie stosować jako kluczowy półprodukt w syntezie farmakologicznie aktywnych pochodnych piperazyny, co pozwala uniknąć pracochłonnego rozdzielania racematu w zaawansowanym etapie wieloetapowej syntezy.

Niżej podane przykłady ilustr^j^ wynalazek.

Przykład I. Roztwór 125 mM (±)-2,3-dihydro-5-nitro-7-chloro-1,4-benzodioksano-2-metanolu (BDA), 250 mM bezwodnika propionowego i 0,2% (w/v) lipazy Pseudomonas fluorescens (Amano® P) w TBME (eter tert-butylometylowy)/heksan woda (50/50/0,1 v/v/v) poddaje się inkubacji w 37°C stosując mieszanie. Po 80% przemiany (estryfikacja alkoholu) reakcję zatrzymuje się przez odsączenie enzymu. Wytworzony ester i pozostały alkohol rozdziela się na kolumnie Zorbax® C-8. Nadmiar enancjomeryczny pozostałego alkoholu analizuje się stosując kolumnę a chiralną alfaglikoproteiną (AGP). Nadmiar enancjomeryczny pozostałego alkoholu i wytworzonego estru określa się także za pomocą ’H NMR bez rozdzielania, używając (+)- lub (-)-trifluorometylo-9-antracenometanol jako rozdzielający odczynnik chiralny. Pozostały alkohol zawiera S-(-)alkohol z nadmiarem enancjomerycznym 97,5%.

Przykład II. W podobny sposób jak opisano w przykładzie I przeprowadza się estryfikację 0,2 % (w/v) lipazą Candida cylindracea (Meito® MY). Pozostały alkohol zawiera R-(+)-alkohol z nadmiarem enancjomerycznym 97,5%. R-(+)-alkohol ma charakterystyczne widmo H NMR jak opisano w przykładzie I. Skręcalność właściwa R-(+)-BDA w acetonitrylu wynosi: [α]2⁵ο = +181,1°.

W podobny sposób otrzymuje się R-(+)-2,3-dihydro-5-nitro-7-metylo-1,4-benzodioksano-2-metanol i R-(+)-2,3-dihydro-5-nitro-1,4-benzodioksano-2-metanol, również z wysokimi nadmiarami enancjomerycznymi.

177 831

Przykład III. Roztwór 250 mM (±)-BDA, 500 mM bezwodnika masłowego i 0,5% (w/v) lipazy Candida cylindracea (Meito® MY) w heksanie/octanie etylu/wodzie (50/50/0,2 v/v/v) inkubuje się w 25°C stosując mieszanie. Po przemianie 65% alkoholu, reakcję zatrzymuje się. Pozostały alkohol zawiera R-(+)-alkohol z nadmiarem enancjomerycznym 97,5%.

Przykład IV. W podobny sposób jak opisano w przykładzie III, 250 mM (±) BDA inkubuje się z 500 mM bezwodnika izomasłowego względnie heksanowego. Po 63 względnie 60% przemianie alkoholu reakcję zatrzymuje się. Pozostały alkohol zawiera R - (+) alkohol, w obu przypadkach z nadmiarem enancjomerycznym 97,5%.

Przykład V. Roztwór 350 mM (±)-BDA, 600 mM bezwodnika bursztynowego i 2,4% (w/v) lipazy Candida cylindracea (Meito® MY) w TBME/acetonitryl/woda (90/10/0,6 v/v/v) inkubuje się w temperaturze pokojowej stosując mieszanie. Po 70% przemianie alkoholu reakcję zatrzymuje się przez odsączenie. Pozostały alkohol zawiera R-(+)-enancjomer z nadmiarem enancjomerycznym 98%.

Przykład VI. Enancjoselektywna estryfikacja (schemat 1).

Roztwór 15,2 kg (±)-BDa, 7,6 kg bezwodnika bursztynowego i 3,7 kg lipazy Candida cylindracea (Mei^to® MY) w mieszaninie 200 l eteru tert-butylometylowego (MTBE), 17,5 l acetonitrylu i 925 ml wody inkubuje się w reaktorze pod azotem w temperaturze pokojowej. Po przemianie dochodzącej do 60-63% (HPLC, w przybliżeniu 20 godzin), reakcję zatrzymuje się przez odsączenie enzymu. Enzym przemywa się dwukrotnie 10 l MTBE, warstwę organiczną przemywa kolejno 90 l i 30 l wodnego węglanu (150 g Na₂CO3 w 1 i wody). Roztwór węglanowy ekstrahuje się dwukrotnie 10 l MTBE. Następnie połączone warstwy organiczne kolejno przemywa się 30 l wody, rozcieńczonym kwasem chlorowodorowym otrzymanym przez rozpuszczenie 40 ml 36% HCl w 15 l wody, i 10 l wody. MTBE oddestylowuje się pod próżnią w 60°C. Krystaliczną pozostałość (4,6 kg) rozpuszcza się w 15 l 96% etanolu w 60°C; do tego roztworu dodaje się Di n-heksanu stosując mieszanie. Mieszaninę oziębia się do około 10°C i po 2 do 10 godzinnym mieszaniu krystaliczny materiał odsysa się, przemywa kolejno 10 l etanolu/heksanu (15/35 v/v) i 5 l n-heksanu, i suszy. Krystaliczny materiał jest czystym (ee 98%) (+)-enancjomerem, mianowicie, R-(+)-2,3-dihydro-5-nitro-7-chloro-1,4-benzodioksano-2-metanolem /R-(+)-BDA/, wydajność około 4 kg.

Temperatura topnienia 116,0°C, [α ]²⁵D = +194,8° (c = 4,5, CH3OH).

Przykład VII. Zmydlanie wytworzonego estru S-(-)-BDA (schemat 2).

Do połączonych warstw wodnych z eksperymentu w przykładzie VI dodaje się 15 i 50% NaOH w temperaturze około 23°C. Mieszaninę reakcyjna miesza się przez około 15 godzin w temperaturze 23°C i następnie oziębia do 5°C. Po zaszczepieniu, mieszaninę miesza się przez 3 godziny w temperaturze 5°C. Krystaliczny materiał odsysa się, przemywa 60 l wody i suszy. Otrzymany alkohol, w ilości około 10 kg, zawiera nadmiar S-(-)-BDA enancjomeru.

Przykład VIII. Racemizacja enancjomeru S-(-)-BDA (schemat 3).

Otrzymany S-(-)-BDA sposobem według przykładu VII, w ilości 1 kg, rozpuszcza się 6 l n-propanolu w atmosferze azotu i ogrzewa do wrzenia pod chłodnicą zwrotną. Do tego roztworu dodaje się 235 ml 2N wodnego NaOH w czasie około 15 minut. Roztwór pozostawia się w stanie wrzenia przez 1,5 godziny. Po oziębieniu do około 40°C, dodaje się 47 ml roztworu stężonego HCl (do pH=3). Propanol oddestylowuje się pod próżnią w temperaturze około 60°C. Do pozostałości dodaje się 4 l n-heksanu, i roztwór zaszczepia się podczas ochładzania do 20°C i powolnego mieszania. Po 2 godzinnym mieszaniu w temperaturze 20°C oraz przez noc w temperaturze 0°C, krystaliczny materiał odsysa się i przemywa dwukrotnie 0,5 l n-heksanu. Następnie krystaliczny materiał miesza się z 7,5 l wody w około 70°C przez 1 godzinę. Po ochłodzeniu do 20°C dodaje się 350 ml n-heksanu miesza się przez następną godzinę, krystaliczny materiał odsącza i przemywa dwukrotnie 0,5 l n-heksanu. Po wysuszeniu otrzymuje się pożądany racemiczny BDA z wydajnością 850 g zawartość 95%, ee=0. Temperatura topnienia wynosi 108,2°C.

177 831

Racemizacja przebiega równie pomyślnie stosując amid litowo diizopropylowy jako zasadę i używając THF jako rozpuszczalnik. Temperatura reakcji wynosi 40°C, racemizacja jest całkowita po 5,5 godzinach.

Przykład IX. Zmydlanie i jednoczesna racemizacja estru S-(-)-BDA.

Do części, którą otrzymano z 43,5 g (126 mmol) estru S-(-)-BDA, 620 ml wodnego węglanu (150 g Na₂CO₃ w 1 l wody), 150 ml wody i 59 ml acetonitrylu, zasadowej warstwy wodnej otrzymanej jak w przykładzie VI dodaje się 250 ml etanolu i 50 ml 50% w/v wodnego roztworu wodorotlenku sodowego. Mieszaninę reakcyjną miesza się ogrzewając ją do wrzenia pod chłodnicą zwrotną przez 16 godzin. Po ochłodzeniu do 40°C dodaje się ostrożnie (pH jest w przybliżeniu 5) 160 ml 12N wodnego roztworu kwasu chlorowodorowego. Mieszaninę reakcyjną ochładza się do temperatury pokojowej, po czym stały produkt odsysa się, przemywa wodą i suszy. Otrzymuje się 23,8 (±)-BDA o barwie jasno brązowej z nadmiarem enancjomerycznym 0.

Przykład X. Roztwór 0,2 M 5-chloro-2,3-dihydro-7-nitro-1,4-benzodioksyn-2-metanolu, 0,34 M bezwodnika bursztynowego i 2% (w/v) lipazy Candida cylindracea (Meito® MY) wTBME/acetonitryl/woda (90/10/0,3 v/v/v) inkubuje się w temperaturze pokojowej stosując mieszanie. Po przemianie 41% alkoholu (określono używając kolumny Zorbax C-8), reakcję zatrzymuje się przez odsączenie. Pozostały alkohol zawiera (+)-enancjomer z nadmiarem enancjomerycznym 38% (oznaczono używając kolumnę Chiracel® - OD).

Przykład XI. Wytwarzanie 6-chloro-2,3-dihydro-8-nitro-1,4-benzoksazyno-3-metanolu (schemat 4).

(a) Do zawiesiny 18,5 g (91 mmoli) związku (1) w 50 ml toluenu dodaje się 30 ml (314 mmoli) bezwodnika octowego stosując mieszanie. Po 4 godzinach ogrzewania w temperaturze 100°C dodaje się następnie 10 ml bezwodnika octowego. Ogrzewanie kontynuuje się przez dalsze 2 godziny. Po usunięciu łaźni grzewczej ostrożnie dodaje się 25 ml etanolu. Po oziębieniu do temperatury pokojowej mieszaninę reakcyjną traktuje się octanem etylu i wodą. Warstwę organiczną przemywa się dwukrotnie wodą i suszy siarczanem magnezu. Po filtracji rozpuszczalnik odparowuje się pod próżną Do 18,23 g jasno brązowego ciała stałego dodaje się 75 ml etanolu i 80 ml 2N wodnego roztworu wodorotlenku sodowego. Zawiesinę o ciemno czerwonej barwie miesza się przez noc w temperaturze pokojowej. Po oziębieniu do 0°C dodaje się 90 ml 2N wodnego roztworu kwasu solnego. Stały materiał odsysa się i przemywa dwukrotnie wodą. Po wysuszeniu w temperaturze pokojowej i pod normalnym ciśnieniem otrzymuje się 16,5 g proszku (2) o barwie pomarańczowej.

TLC (eluenty: octan etylu/eter naftowy 40-65°C 50/50): Rf = 0,3. Temperatura topnienia: 156-160°C.

(b) Do roztworu 8 g (34,5 mmoli) związku (2) w mieszaninie 80 ml toluenu i 80 ml 1-metylo-2-pirolidonu dodaje się 5,6 g (40 mmoli) sproszkowanego węglanu potasowego. Mieszaninę reakcyjną miesza się w temperaturze wrzenia przez jedną godzinę i usuwa wodę przy pomocy nasadki Dean-Starka. Toluen oddestylowuje się pod ciśnieniem atmosferycznym. Po ochłodzeniu do temperatury 100°C dodaje się 9,3 g (41 mmola) tosylanu glicydylu. Po mieszaniu w temperaturze 120°C przez 4,5 godziny zawiesinę oziębiono do temperatury pokojowej. Mieszaninę reakcyjną rozcieńcza się wodą i octanem etylu i ustala pH 5 za pomocą 2n wodnego roztworu kwasu chlorowodorowego. Warstwę wodną ekstrahuje się dwukrotnie octanem etylu. Połączone warstwy organiczne przemywa się solanką i suszy nad siarczanem magnezu. Po odsączeniu siarczanu magnezu i odparowaniu rozpuszczalnika pod próżnią otrzymuje się 10,86 g ciemno brązowego oleju. Oczyszczenie metodą średnio ciśnieniowej chromatografii (eluenty: octan etylu/eter naftowy 40-65°C = 25/75) daje 4,18 g związku (3) jako czerwone płytki. Temperatura topnienia: 76-84°C. TLC (patrz wyżej): Rf = 0,ł5.

(c) Do zawiesiny 3 g (10 mmoli) związku (9) w mieszaninie 100 ml metanolu i 30 ml wody dodaje się 1,44 g sproszkowanego węglanu potasu. Po mieszaniu w temperaturze pokojowej przez 1,5 godziny mieszaninę reakcyjną rozcieńcza się wodą i dwa razy ekstrahuje

ΠΊ 831 octanem etylu. Połączone warstwy organiczne przemywa się trzy razy rozcieńczoną solanką i suszy nad siarczanem magnezu. Po odsączeniu siarczanu magnezu i odparowaniu rozpuszczalnika pod próżnią otrzymuje się 2,53 g związku (4) (NMR) jako ciało stałe o barwie oranżowej.

TLC (octan etylu/eter naftowy 40-65°C = 75/25): Rf = 0,3.

fH-NMR: δ (ppm) 6,99 (d, 1H, arom), 6,90 (s, 1H, NH), 6,88 (d, 1H, arom), 5,02 (t, 1H, CH₂OH), 4,19 (dd, 1H, OCH₂CH), 4,11 (dd, 1H, OCH₂CH), 3,40/3,50 (klaster, 3H, CHCH₂OH).

Przykład XII. Roztwór 0,35 M 6-chloro-2,3-dihydro-8-nitro-1,4-benzoksazyno-3-metanolu, 0,6 M bezwodnika bursztynowego i 3,3% (w/v) lipazy Candida cylindracea (Meito® MY) w TBME/acetonitryl/woda (90/10/0,6 v/v/v) inkubuje się w temperaturze pokojowej stosując mieszanie. Po 47% przemianie alkoholu (określono stosując kolumnę Zorbax C-8), reakcję zatrzymuje się przez sączenie. Pozostały alkohol zawiera (+)-enancjomer z nadmiarem enancjomerycznym 39% (określono stosując kolumnę Chiracel® - OD).

Przykład XIII. Roztwór 0,13 M 2,3-dihydro-7-nitro-1,4-benzodioksin-2-metanolu, 0,24 M bezwodnika masłowego i 25% (w/v) lipazy w mieszaninie diizopropyloeter/acetonitryl/woda (50/50/0,5 v/v/v) inkubuje się w temperaturze pokojowej stosując mieszanie. Po 64% przemianie alkoholu, reakcję zatrzymuje się przez sączenie. Pozostały alkohol zawiera (+)-enancjomer z nadmiarem enancjomerycznym 42,4%.

Przykład XIV. Racemizacja (+)-2,3-dihydro-7-nitro-1,4-benzodioksin-2-metanolu.

Do roztworu 0,1 g (47 mmoli) (+)-2,3-dihydro-7-nitro-1,4-benzodioksin-2-metanolu [α ]²⁰d = +65,5 (c=0,58, 96% etanol) w 15 ml etanolu dodaje się 0,2 ml (40 mmoli) 2N wodnego roztworu wodorotlenku sodowego. Po 125 godzinnym ogrzewaniu do wrzenia mieszaninę reakcyjną chłodzi się do temperatury pokojowej. Mieszaninę reakcyjną rozcieńcza się wodą i ekstrahuje dwukrotnie octanem etylu. Warstwę organiczną suszy się nad siarczanem magnezu. Po odsączeniu siarczanu magnezu i odparowaniu rozpuszczalnika pod próżnią otrzymuje się 0,1 g jasno brązowej stałej substancji. Skręcalność właściwa (patrz wyżej) wynosi 0. Analiza nadmiaru enancjomerycznego przy stosowaniu chiralnej kolumny alfa-glikoproteinowej (AGP) dała rezultat ee=0.

Przykład XV. Racemizacja (+)-5-chloro-2,3-dihydro-7-nitro-1,4-benzodioksino-2-metanolu.

Do roztworu 0,85 g (3,46 mmola) (+)-5-chloro-2.3-dihydro-7-nitro-1,4-benzodioksino-2-metanolu [α ]2°_d = +55,5 (c=0,4, etanol) w 80 ml etanolu, dodano 15 ml 2N wodnego roztworu wodorotlenku sodowego.

Po ogrzaniu przez 16 godzin pod chłodnicą zwrotną mieszaninę ochładza się do temperatury pokojowej i obrabia jak w przykładzie XIV. Skręcalność właściwa (patrz wyżej) otrzymanego stałego produktu wynosi 0. Analiza chiralna na kolumnie chiralnej-OD wykazuje ee=0.

Przykład XVI. Racemizacja (+)-6-chloro-2,3-dihydro-8-mtro-1,4-benzoksazino-3-metanolu.

Do roztworu 2 g (8,18 mmoli) (+)-6-chloro-2,3-dihydro-8-nitro-1,4-benzoksazino-3-metanolu [α ]2’d = +14 (c=0,71, 96% etanol) w 50 ml etanolu dodaje się 2N wodny roztwór wodorotlenku sodowego. Po 3 godzinnym ogrzewaniu do wrzenia dodaje się inną porcję 1 ml 2N wodnego roztworu wodorotlenku sodwego. Po 32 godzinnym ogrzewaniu do wrzenia mieszaninę reakcyjną oziębia się do temperatury pokojowej i rozcieńcza solanką. Warstwę wodną ekstrahuje się dwukrotnie octanem etylu. Połączone warstwy organiczne przemywa się dwukrotnie rozcieńczoną solanką i suszy nad siarczanem magnezu. Po odsączeniu siarczanu magnezu i odparowaniu rozpuszczalnika pod próżnią otrzymuje się 1,83 g pomarańczowo-brązowego stałego materiału. Skręcalność właściwa wynosi 0 a analiza chiralna na kolumnie chiralnej-OD wykazuje ee=0.

177 831

Przykład XVII. Racemizacja za pomocą wodorku sodowego.

Do mieszaniny 0,2 g (0,8 mmola) R-(+)-BDA i 0,01 g (0,5 równoważnika) 60% zawiesiny wodorku sodowego w oleju mineralnym dodaje się 5 ml DMF. Po zakończeniu wydzielania się gazu oranżowy roztwór miesza się w temperaturze pokojowej. Całkowitą racemizację uzyskuje się po 0,75 godzinach co wykazała analiza za pomocą kolumny Chiracel-OD.

Claims (4)

1. Enzymatynzny sposób sSpreoselsktywnego wytwarzania enzacjamnru heterobicyklicznego alkoholu, o ogólnym wzorze 1, w którym X oznacza O, NH, N-(Ci-Cb)alkil lub CH₂, Yi, Y₂ i Y₃ oznaczają każdy niezależnie wodór lub podstawniki wybrane spośród chlorowca, grupy C_rC₄ alkilowej i nitrowej, grupa NO2 jest przyłączona do bicyklicznego układu pierścieniowego w pozycji 5 lub 7, a atom C* ma konfigurację R lub S, znamienny tym, że odpowiedni racemat alkoholu poddaje się obróbce w kolejnych następujących etapach reakcyjnych obejmujących (i) acylowanie racematu środkiem acylującym pod wpływem enzymu mającego stereoselektywną aktywność estryfikacyjną, (ii) wydzielenie ni-zestryfikowan-go związku z otrzymanego estru i wydzielenie pożądanego zasadniczo czystego -nsncjemeru alkoholu o wzorze 1 albo jego estru, (iii) poddanie otrzymanego estru hydrolizie, przekształcając w ten sposób ester w odpowiedni enancjomer alkoholu, i (iv) przekształcenie niepożądanego enanhomgru alkoholu w wyjściowy racemat alkoholu w warunkach zasadowych, w celu jego powtórnego użycia.

2. Sposób według zwe^r^. g , anamienny 0^ ny łycmy się etapy re ^tapjne Ο'Ο i niz) ^sto_ sując dostatecznie silne warunki zasadowe, aby przeprowadzić jednocześnie hydrolizę estru i rstemizschę enancjomeru alkoholu.

1. Sposób spoSób wasta. 1 albo 2i znamię nny tym, że w przynadee nytw;bzania zasadniczo czystego ensnchomerb o ogólnym wzorze b, w którym Y' oznacza wodór lub podstawnik wybrany spośród chloru, fluoru i grupy metylowej, grupa NOi jest przyłączona do bicyklicznego układu pierścieniowego w pozycji 5 lub 7, a atom węgla C* ma konfigurację R lub S, odpowiedni racgmst alkoholu poddaje się obróbce w kolejnych etapach reakcyjnych obejmujących (i) acylowanig racematu środkiem acylującym pod wpływem enzymu mającego stereoselektywną aktywność -stryfikacyjne, (ii) wydzielenie niezestryfSkowangao związku z otrzymanego estru i wydzielenie pożądanego zasadniczo czystego enancjomgrb alkoholu o wzorze 1 albo jego estru, (iii) poddanie otrzymanego estru hydrolizie, przekształcając w ten sposób ester w odpowiedni enancjomer alkoholu, i (iv) przekształcenie niepożądanego gnancjomgru alkoholu w wyjściowy racemat alkoholu w warunkach zasadowych, w celu jego powtórnego użycia.

4. Sposób wpoług zwedz. 1 aUro 2, znbmiezny tym, ny ym etżgie reekcyjnym (ćy oyzv 1 skuj- się enzym w znany sposób.

1. Sposób wpdług zu-trz. g ais^<ri2, znam ibnny tymn ny jakm Zż-dak acyodjący stosie sit bezwodnik kwasu karboksylowego.

6. Sposób wpobóg wsteu 5,anamienny tym, ny jy^m śsgdsk acyoujący stosuje s^ buzwodnik kwasu bursztynowego lub bezwodnik kwasu glutarowego.

1. Sposób) wpos^ w-U^:^. 1 albo Z, znemienIttl tym, ia ty^o eezym ζ-08ΐ^ się: lipgzb albo esterazę mające st-reoselektywną aktywność estryfikacji.

Z. Zasadni cza arnity enzybtymnr ntkoyolu o o/zoue owconym g, w któiym X ó^x O, NH, N-(Ci-Cb)alkil lub CHi, Yz Y2 i Y3 oznaczają każdy niezależnie wodór lub podstawniki wybrane spośród chlorowca, grupy C,-Cbalkilowej i nitrowej, grupa NOi j-st przyłączona do bScyklSezneao układu pi-rściemowego w pozycji 5 lub 7, a atom węgla oznaczony C* ma konfigurację R.