PL167469B1 - Sposób wytwarzania nowych peptydowych pochodnych kwasu borowego - Google Patents

Abstract

Sposóbwytwarzanianowychpeptydowychpochodnych kwasu borowego o wzorze 1, w którym Woznacza 77) atom wodoru lub grupę chroniącą azot, Yoznacza sekwencję naminokwasów taką, że n+1 aminokwasowy peptyd Y-Lys lub Y-Arg ma powinowactwo do aktywnej części proteazy typu trypsyny, przy czym n oznacza liczbę całkowitą 1-10i co najmniejjeden aminokwasjest nienaturalnym aminokwasem o hydrofobowym łańcuchu bocznym, Qi i Q2 są takie same lub różne i oznaczają grupy -OH, -COR1, -CONR1R2, -NR1R2 lub -OR3, albo Qi i Q2 razem oznaczają resztę diolu, Ri, R2 i R3 są takie same lub różne i oznaczają rodnik Ci-io-alkilowy, Cę-ioarylowy, Cę-io-aralkilowy lub fenylowy podstawiony podstawnikami w ilości do trzech, takimijakgrupa C1-4- alkilowa, chlorowiec lub grupa Ci-4-alkoksylowa, R4 oznacza atom wodoru lub rodnik Ci-io-alkilowy, R5 oznacza grupę -A-X, gdzie Aoznacza grupę -(CH2)z, w której z oznacza 2, 3, 4 lub 5, grupę -CH(CH3)-(CH2)2, -CH2-CH(CHa)-CH2-, -(CH2)2-CH(CH3)-, -(CH2>2- C(CH3)2, -CH(CH3H(CH2)3-, -CH2-CH(CH3)-(CH3)- (CH2)2-,-CH2-CH2-CH(CH3)-CH2-,-(CH2)3CH(CH3)-, -(CH2)3-C(CH3)2; grupę Cę-io-arylową, Cę-io-aralkilową, Xoznacza grupę -NH2, a asymetrycznyatom węgla znaczony gwiazdką może oznaczać konfigurację D lub L albo ich mieszaniny, znamienny tym, że związek o wzorze 7, w którym Qi i Q2 mają wyżej podane znaczenie a Ri3 oznacza grupę -A-Br, w której A ma wyżej podane znaczenie, poddaje się reakcji z LiN[Si(CH3)312, po czym prowadzi się kwasową hydrolizę i sprzęganie z chronionym peptydem o wzorze 8, w którym W i Ymają wyżej podane znaczenie, a następnie otrzymany związek o wzorze 6,

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania nowych peptydowych pochodnych kwasu borowego o zastosowaniu farmaceutycznym.

Wynalazek dotyczy inhibitorów proteaz serynowych, takich jak trombina, czynnik Xa, kalikreina i plazmina, jak również innych proteaz serynowych, takich jak prolilo-endopeptydaza i IgAI proteaza. Trombina, ostatni enzym w układzie krzepliwości, rozszczepia rozpuszczalny flbrynogen do fibryny, która następnie ulega usieciowaniu i tworzy nierozpuszczalny żel stanowiący zrąb skrzepliny. Gdy naczynie ulega uszkodzeniu, proces powyższy jest niezbędny do zatrzymania krwawienia. W normalnych okolicznościach ilość trombiny obecnej w plaźmie nie jest mierzalna. Wzrost stężenia trombiny może powodować tworzenie się skrzepów, które mogą prowadzić do choroby zakrzepowej z zatorami, która jest jednym z najbardziej rozpowszechnionych poważnych problemów medycznych naszych czasów.

Trombina przyczynia się do hemostatycznej kontroli za pomocą różnych reakcji biologicznych. Dodatkowo do swej pierwotnej funkcji konwersji fibrynogenu w fibrynę, trombina aktywuje czynnik XIII, który jest odpowiedzialny za sieciowanie fibryny. Trombina działa również za pomocą mechanizmu dodatniego sprzężenia zwrotnego polegającego na aktywowaniu czynnika V i VIII, które to czynniki są niezbędne dla jej z protrombiny. Trombina spełnia jeszcze inną ważną rolę: jej wiązanie z płytkami krwi zapoczątkowuje uwolnienie płytek i agregację, która jest odpowiedzialna za pierwotną hemostazę.

Reakcje trombiny są ponadto hamowane przez naturalne inhibitory w plazmie. Najważniejszymi z nich są antytrombina III i heparyna. Te dwa związki zostały wyodrębnione i stosuje się je leczniczo i profilaktycznie w warunkach, gdy występuje zachwianie równowagi w mechanizmie hemostatycznym z ryzykiem aktywacji protrombiny.

Syntetyczne inhibitory trombiny działające doustnie byłyby cennymi substancjami alternatywnymi w stosunku do podawanych pozajelitowo inhibitorów naturalnych. W wyniku licznych badań w tej dziedzinie uzyskano korzystne inhibitory trombiny in vitro, lecz jak dotychczas brak jest prawdziwie dobrego środka do doustnego stosowania leczniczego. Podczas odtwarzania aminokwasowych sekwencji fibrynogenu, ważnego naturalnego substratu trombiny, uzyskano kilka dobrych krótkich peptydowych substratów trombiny. Te substraty peptydowe przekształcono również w inhibitory enzymu. Tak więc, chromogeniczne substraty D-Phe-Pro-Arg-pNA i D-Phe-Pip-Arg-PNA naśladują sekwencję poprzedzającą rozszczepienie wiązania przez trombinę. Odpowiednie odwracalne i nieodwracalne inhibitory D-Phe-Pro-Arginal i D-Phe-Pro-Arg-CHbCl wykazują hamowanie in vitro rzędu 1(T⁸M.

Chlorometyloketony są na ogól zbyt niespecyficznie reaktywne, aby nadawać się do celów leczniczych, a wymienione wyżej aldehydy peptydowe wykazują zbyt niską wartość LD50.

Czynnik Xa jest enzymem krzepliwości odpowiedzialnym za wytwarzanie trombiny drogą ograniczonej proteolizy jej zymogenu, protrombiny. W przeliczeniu wygowym czynnik Xa jest co najmniej 10-krotnie bardziej trombogeniczny (tworzący skrzepliny) in vivo niż trombina. Wynika to z faktu, że czynnik Xa jest o jeden etap wyżej niż trombina we wzmacniającym układzie kaskadowym tak, że jedna cząsteczka czynnika Xa może wytwarzać wiele cząsteczek trombiny z jej prekursora. Jego siła może również wynikać z raczej powolnego usuwania czynnika Xa z organizmu. Trombina, w przeciwieństwie do czynnika Xa, jest szybko usuwana z obiegu krwi na miejsca o wysokim powinowactwie na ściankach naczyń. Centralna pozycja czynnika Xa w punkcie węzłowym wewnątrz- i zewnątrzpochodnych dróg przemian biologicznych czyni go odpowiednim obiektem do modulowania mechanizmu hemostatycznego.

Kalikreina tworzy się z prekalikreiny za pomocą czynnika XII w przypadku umiejscowienia na ujemnie naładowanej powierzchni. Kalikreina może z kolei przeprowadzać czynnik XII w czynnikXIIa, przy czym tworzy się układ wzajemnej aktywacji. Czynnik XIIa jest pierwszym enzymem wewnętrznej części układu krzepliwości. Znaczenie układu kontaktowego polega prawdopodobnie na mechanizmie obronnym za pośrednictwem powierzchni, a dużą skalę aktywności tego układu widzi się zazwyczaj w czasie wstrząsu lub rozsianej krzepliwości wewnątrznaczyniowej (DIC). Rolą kalikreiny na tym etapie jest rozszczepianie kininogenu o wysokim ciężarze cząsteczkowym z uwolnieniem rozszerzającej naczynia bradykininy. Bradykinina powoduje również zwiększoną przepuszczalność naczyń, ból i migrację neutrofilowych leukocytów. Stwierdzono, że inhibitory

167 469 tworzenia kininy działają korzystnie w pewnych typach zapaleń, włącznie z zapaleniem stawów i trzustki i mogą być również stosowane do leczenia astmy. Jedyną substancją, która uzyskała znaczenie kliniczne jako inhibitor kalikreiny, jest aprotynina )Trasylol). Aprotynina jest polipeptydem o ciężarze cząsteczkowym 6.500, tworzy ona trwałe związki kompleksowe z proteazami o stałej wiązania rzędu 10¹°- 10¹³M.

Fibrynoliza jest procesem, który powoduje enzymatyczne rozpuszczanie fibrynogenu i skrzeplin fibrynowych. Plazma zawiera białko plazminogen, które pod wpływem różnych aktywatorów przekształca się w plazminę, enzym proteolizyczny, którego aktywność jest zbliżona do aktywności trypsyny. Plazmina rozkłada fibrynogen i fibrynę do produktów degradacji fibryny/fibrynogenu.

W normalnych warunkach układ fibrynolizyjest w równowadze z układem krzepliwości. Małe skrzepliny utworzone w strumieniu krwi można rozpuszczać enzymatycznie, a krążenie w naczyniach można przywrócić do normy drogą aktywacji układu fibrynolitycznego w organizmie. Jeśli aktywność fibrynolityczna jest zbyt wysoka, może to powodować lub przedłużać krwawienie. Aktywność tę można hamować za pomocą naturalnych inhibitorów we krwi.

Prolilo-endopeptydaza rozszczepia wiązania peptydowe w karboksylowej części reszt proliny w łańcuchu peptydowym. Jest to proteaza serynowa, która łatwo degraduje szereg neuropeptydów zawierających substancję P, neurotenysnę, hormon uwalniający tyreotropinę i hormon uwalniający hormon luteinizujący i która wiąże się ze zdolnością komórki do wytwarzania interleukiny 2 (IL-2). Enzym jest hamowany przez benzyloksykarbonylo-prolilo-prolinal ze stałą inhibitora Ki wynoszącą 14 nM. Pomimo faktu, że prawie nic nie wiadomo o fizjologicznej roli proliloendopeptydazy, może ona odgrywać ważną rolę w regulowaniu biologicznej aktywności różnych neuropeptydów.

Katalizowane przez IgA proteinazę rozszczepianie IgA, przeważającą postać przeciwciał stanowiącą pierwszą linię obrony przed infekcją, oddziela Fc z wiążących przeciwciała regionów Fab cząsteczki. Należałoby oczekiwać, że rozszczepianie takie będzie osłabiać lub znosić aktywność przeciw drobnoustrojom. Wszystkie zidentyfikowane IgA proteinazy ulegają rozszczepianiu po reszcie proliny w rejonie osi ludzkich IgA. Peptydowe kwasy prolilo-borowe hamują IgA i proteinazy z Neisseria gonorrhoea i Hemophilus influenzae, wskazując, że enzymy te należą do rodziny serynowych proteaz enzymów proteolitycznych.

Wielorakie role odgrywane przez trombinę w różnych procesach fizjologicznych związanych ze stanami patologicznymi, takimi jak rak, stany zapalne i aktywność neuronowa, sugeruje możliwość stosowania inhibitorów trombiny w przypadku licznych wskazań nie dotyczących ściśle układu sercowo-naczyniowego.

Stwierdzono, że wiele komórek nowotworowych wykazuje aktywność prokoagulacyjną związaną z wytwarzaniem trombiny. W rezultacie- zachodzi miejscowe odkładanie się i krzepnięcie fibryny, co uważa się za ważne dla wzrostu nowotworu. Dodatkowo do swego działania na komórki śródbłonkowe, trombina może ułatwiać wynaczynienie komórek nowotworowych w czasie przerzutu. Tak więc, inhibitory trombiny mogą działać korzystnie nie tylko w trakcie leczenia niektórych raków, lecz mogą także zmniejszać nadkrzepliwość często obserwowaną u pacjentów w czasie terapii za pomocą środków chemoterapeutycznych.

Aktywacja komórek śródbłonkowych za pomocą trombiny wywołuje szereg zmian prozapalnych, takich jak synteza i uwolnienie interleukiny-1, prostaglandyn i czynnika aktywującego płytki. Poza tym trombina wywołuje ekspozycję GMP-140 i CD63, dwóch cząsteczek adhezyjnych odpowiedzialnych za adhezję leukocytów do powierzchni śródbłonka. Trombina wzmaga również naczyniową przepuszczalność białek, działanie, które obejmuje neutrofile, i rozszczepia białko prekursora interleukiny-8, peptyd, który prawdopodobnie bierze udział w zaburzeniach oddychania, reumatoidalnym zapaleniu stawów i wrzodziejącym zapaleniu okrężnicy.

Zaangażowanie trombiny we wszystkie te procesy pro-zapalne czyni ją potencjalnym obiektem terapeutycznego traktowania inhibitorami trombiny w przypadku zaburzeń patologicznych związanych ze stanami zapalnymi.

Aktywność proteazy neksyny-1, stanowiącej modulator wzrostu nerwu i specyficzną naturalną substancję antagonistyczną w stosunku do trombiny, znacznie i specyficznie zmniejsza się u pacjentów z chorobą Alzheimera. To wraz z obserwacją, że aktywność typu trombiny wzrasta w

167 469 5 mózgach z chorobą Alzheimera sugeruje, że inhibitory trombiny mogą ograniczać lub odwracać meuronowe zmiany patologiczne związane z nadczynnością trombiny.

Kwasy borowe badano jako inhibitory różnych serynowych esteraz i proteaz. Pierwszym aminokwasowym analogiem zawierającym kwas borowy, który zastosowano jako inhibitor proteazy, był zawierający kwas borowy analog N-acetylo-L-fenyloalaniny, który zastosowano jako inhibitor chymotrypsyny i subtylizyny. Peptydowe pochodne kwasu borowego były stosowane jako inhibitory chymotrypsyny, subtylizyny i elastaz.

Wzajemne oddziaływanie kwasów borowych z proteazami w układach biologicznych jest znane, przy czym stwierdzono, że różne proste kwasy borowe są wystarczająco nietoksyczne dla ludzi. Peptydowe pochodne kwasu borowego będące inhibitorami elastazy stosowano ostatnio w doświadczeniach na zwierzętach w stosunku do rozedmy płuc. W przeciwieństwie do peptydowych chlorometyloketonów nie ma tu wzmianki o toksyczności przy biologicznie efektywnym poziomie dawkowania.

Europejski opis patentowy nr 293881 opisuje sposób wytwarzania peptydów zawierających przy końcowym atomie C pochodne kwasu borowego lizyny, ornityny i argininy oraz ich zastosowanie jako inhibitorów serynowych proteaz typu trypsyny. Inne aminokwasy w tych peptydach stanowią postacie D lub L 20 aminokwasów występujących w przyrodzie.

Stwierdzono, że można otrzymać związki o doskonałych właściwościach inhibitorów proteaz serynowych typu trypsyny, jeżeli peptyd zawiera co najmniej jeden nienaturalny α-aminokwas posiadający hydrofobowy łańcuch boczny.

Według wynalazku otrzymuje się peptydowe pochodne kwasu borowego o wzorze 1, w którym W oznacza atom wodoru lub grupę chroniącą azot, Y oznacza sekwencję n aminokwasów dobraną tak, że peptyd n+ 1 aminokwasowy Y-Lys lub Y-Arg ma powinowactwo do aktywnej strony proteazy typu trypsyny, przy czym n oznacza liczbę całkowitą 1 -10, korzystnie 1-4 i w której co najmniej jeden aminokwas jest nienaturalnym aminokwasem posiadającym hydrofobowy łańcuch boczny, Q1 i Q2 są jednakowe lub różne i oznaczają grupy -OH, -CORi, -CONR1R2, -NR1R2 i OR3, albo Q1 i Q2 wspólnie tworzą grupę diolową, Ri, R2 i R3 są takie same lub różne i oznaczają rodniki Ci-io-alkilowe, C6-10-aralkilcwe lub fenylowe podstawione podstawnikami w liczbie do trzech takimi, jak grupa Ci-4-alkilowa, chlorowiec i grupa Ci-^^i^J^^koksylowa; R4 oznacza atom wodoru lub rodnik Ci-io-aakilowy, R5 oznacza grupę -A-X, w której A oznacza grupę -(CH2)z-, gdzie z oznacza 2, 3, 4 lub 5; -CH(CH₃)-(CH2)2-, -CH2-CH(CH₃)-CH2-, -(CH₂)2-CH(CH₃)-, -(CH2)2-C(CH3)2-, -CH(CH3H(CH2)3, -CH2-CH(CH3)-(CH2)2, -CH2-CH2-CH(CH3)-CH2, (CH2)3cH(CH3)-(CH2)3-C(CH3)3, grupę C6-io-arylową, Ca-io-aralkilową, X oznacza grupę -NH2, a asymetryczny atom węgla oznaczony gwiazką może wykazywać konfigurację D lub L albo ich mieszaninę.

Przez nienaturalny aminokwas rozumie się aminokwas inny niż D- lub L- Ala, Arg, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyrlub Val.

Korzystnie grupą chroniącą azot W jest grupa o wzorze H(CH2CH2O)p, gdzie p oznacza 3 - 30, grupa RaCO-, R7OCO- lub R8SO2-, w których to grupach R_e oznacza rodnik Ci-a-alkilowy, R7 oznacza rodnik Ci-a-alkilowy, fenylowy, benzylowy lub naftylowy, a Reoznacza rodnik fenylowy, naftylowy lub Ci-^-alkilofenylowy, przy czym grupa R7OCO-jest korzystna. Najkorzystniejszymi grupami ochronnymi są grupy o wzorze R7^,(COC~, gdzie R7' oznacza grupę III-rz. butylową (oznaczoną Boc) i gdzie R7' oznacza grupę benzylową (oznaczoną Z).

Korzystnie R5 oznacza R5', gdzie r5' oznacza grupę -(CH2)_Z'-X', w której X' oznacza grupę -NH2, a z' oznacza 2, 4 lub 4. _

Korzystne są związki o wzorze 1a, w którym W, Y, R4 i R5 mają znaczenie wyżej podane, a R9 i R io oznaczają resztę związku dihydroksylowego.

Jako przykłady wymienia się 2,3-butanodiol, katechol, 2,3-dimetylobutanodiol-2,3, cykloheksanodiol, glikol etylenowy, 1,2-heksanodiol, 2,3-heksanodiol, dietanoloaminę albo związki alifatyczne lub aromatyczne zawierające grupy hydroksylowe, które są podstawione przy sąsiednich atomach węgla albo przy atomach węgla podstawionych przez inne atomy węgla.

Szczególnie korzystne są związki, w których Qi i Q2 razem oznaczają grupę OPin o wzorze 9 lub grupę o wzorze 10.

167 469

Aminokwasy tworzące Y są α-aminokwasami, takimi jak L-aminokwasy występujące w sposób naturalny w proteinach, odpowiadające im enancjomeryczne D-aminokwasy lub chemicznie modyfikowane alfa-aminokwasy, takie jak gamma-piperydyd kwasu glutaminowego o wzorze 11 albo kwas pipekolowy (Pip), z tym, że co najmniej jeden aminokwas jest nienaturalnym aminokwasem posiadającym hydrofobowy łańcuch boczny.

Korzystnymi nienaturalnymi aminokwasami są związki o wzorze 2, w którym R11 oznacza grupę hydrofobową. Korzystną grupą hydrofobowąjest grupa metylenowa związana z ewentualnie podstawioną przez grupę polarną grupą aromatyczną lub grupą alicykliczną posiadającą co najmniej dwa pierścienie i nie posiadającą polarnych podstawników, albo z grupą III-rz. butylową lub grupą trimetylosililową. Korzystnie Rn oznacza R11', gdzie R11' oznacza grupę o wzorze 12, grupę -CH2-Si(CH3)3, grupę o wzorze 13, grupę -CH2-C(CH3)3, grupę o wzorze 14, 15 lub 16.

Nienaturalne aminokwasy o wzorze 2 mogą występować w postaci D lub L, albo w postaci ich mieszanin, lecz korzystnie w postaci D.

Korzystnymi związkami są inhibitory trombiny o wzorze 1, w którym Y oznacza sekwencję dwóch aminokwasów, z których N-końcowy aminokwas stanowi nienaturalny aminokwas, a drugi aminokwas oznacza L-prolinę (pro) o wzorze 17.

Bardziej korzystne związki są przedstawione wzorem 1', w którym N, R4, R5, R11, Q1 i Q2 mają znaczenie wyżej podane.

Szczególnie korzystne są związki o wzorze 1, w którym W, R4, R5' i R11 mają znaczenie wyżej podane.

Najbardziej korzystnymi związkami są związek o wzorze 3, związek o wzorze 4 i związek o wzorze 5.

Peptyd powinien mieć powinowactwo do aktywnej części proteazy typu trypsyny, jeśli stała dysocjacji danego peptydu ma wartość 10“3 M lub niżej.

Sposób według wynalazku wytwarzania związków o wzorze 1, w którym podstawniki mają wyżej podane znaczenie polega na tym, że związek o wzorze 7, w którym Q-i i Q2 mają wyżej podane znaczenie, a R13 oznacza grupę -A-Br, w której A ma wyżej podane znaczenie, poddaje się reakcji z LiN[Si(CH3)3]2, po czym prowadzi się kwasową hydrolizę i sprzęganie z chronionym peptydem o wzorze 8, w którym W i Y mają wyżej podane znaczenie, a następnie otrzymany związek o wzorze 6, w którym R12 oznacza -A-Br, a A, W, Y, Q1 i Qa mają wyżej podane znaczenie, poddaje się reakcji z azydkiem sodu, po czym otrzymany związek o wzorze 1, w którym R5 oznacza grupę A-X, w której A ma wyżej podane znaczenie, a X oznacza N3, a pozostałe podstawniki mają, wyżej podane znaczenie, poddaje się uwodornieniu. Uwodornianie można prowadzić w znany sposób, stosując np. katalizator Pd/C.

Reakcję związku o wzorze 6 z azydkiem sodowym prowadzi się w polarnym rozpuszczalniku aprotycznym, takim jak sulfotlenek dimetylowy.

Reakcję związku o wzorze 7 ze związkiem LiN[Si(CH3)3]2 i następną hydrolizę za pomocą 3 równoważników molowych kwasu i sprzęganie z chronionym peptydem o wzorze 8 prowadzi się korzystnie w suchym aprotycznym rozpuszczalniku polarnym, takim jak tetrahydrofuran, w temperaturze od -78°C do temperatury pokojowej.

Związki wyjściowe o wzorze 7 otrzymuje się metodą Mattesona i innych, Organometallica 3, 1284-8(1984).

Chroniony peptyd o wzorze 8 można wytwarzać metodami znanymi w chemii peptydów, wychodząc z żądanego nienaturalnego aminokwasu. Takie aminokwasy są dostępne w handlu na przykład aminokwas o wzorze 2, w którym R1 oznacza grupę o wzorze 12, albo też można je wytwarzać metodami analogicznymi do opisanych w' literaturze, np. Angew, Chem. 93,793 (1981) i J. Am. Chem. Soc. 109, 6881 (1987).

Związki o wzorze i mogą znaleźć zastosowanie jako inhibitory proteaz typu trypsyny i można je stosować in vitro do badań diagnostycznych i mechanistycznych tych enzymów. Ponadto ze względu na ich działanie hamujące, są one wskazane do stosowania w zapobieganiu lub leczeniu schorzeń powodowanych przez nadmiar enzymu w układzie regulującym, na przykład do kontroli krzepliwości w układzie fibrynolizy.

Związki otrzymywane sposobem według wynalazku będące inhibitorami trombiny lub czynnika Xa wykazują właściwości anty-trombogeniczne i mogą być stosowane, gdy niezbędny jest

167 469 czynnik anty-trombogeniczny. Na ogół związki te można podawać doustnie lub pozajelitowo w celu uzyskania efektu anty-trombogenicznego. W przypadku większych ssaków, takich jak człowiek, związki można podawać same lub w zestawieniu z farmaceutycznymi nośnikami lub rozcieńczalnikami w dawkach 0,02-15 mg/Kg wagi ciała, korzystnie 1-10 mg/Kg w celu uzyskania efektu anty-trombogenicznego i można je podawać w postaci pojedynczej dawki lub w dawkach podzielonych albo w postaci o przedłużonym działaniu. W przypadku stosowania pozaustrojowego obiegu krwi podaje się dożylnie 0,1-1 mg/Kg. W przypadku stosowania dla całej krwi dawki 1-10 mg na litr zapobiega się krzepnięciu. Jako farmaceutyczne rozcieńczalniki stosuje się cukry, skrobie i wodę, które można stosować do wytwarzania tabletek, kapsułek, roztworów do wstrzykiwania itp. Związki otrzymywane sposobem według wynalazku można dodawać do krwi w celu zapobiegania krzepnięciu krwi w pojemnikach do gromadzenia lub rozdzielania krwi, w przewodach lub aparatach implantowanych, które wchodzą w kontakt z krwią.

Zaletą nowych związków jest aktywność doustna, szybkie rozpoczęcie działania i niska toksyczność. Dodatkowo związki te mogą znaleźć specjalne zastosowanie w leczeniu osobników, które wykazują nadwrażliwość w stosunku do związków takich, jak heparyna.

W następujących przykładach symbole mają następujące znaczenie:

Z=benzyloksykarbonyl

Boc = III-rz.butyloksykarbonyl

Ac = acetyl

MeOH = alkohol metylowy

EtOAc = octan etylu

DCC = dicykloheksylokarbodiimid

HONSu = N-hydroksysukcynimid

OPin = pinanodiol

THF = tetrahydrofuran

N-Bu = n-butyl

Np = p-nitrofenyl

TLC = chromatografia cienkowarstwowa

Bzl = benzyl

Baa = -NH-CH-(CH₂CH₂CH₂Br)BTMSal = trimetylosililoalanina

Adal = adamantyloalanina

Naphal = 2-naftyloalanina

BoroOrn = -NH-CH-(CH₂CH₂CH₂NH₂)BBoroArg = -NH-CH-[CH₂CH₂CH₂NHC(NH)NH₂]BAdgly= 1-adamantyloglicyna

Boro-Pro-OPin = analog proliny, w którym grupa -COOH jest zastąpiona przez B-OPin

BoroLys = -NH-CH-(CH₂-CH2-CH₂-CH2-NH₂)BBoroHArg = -NH-CH-(CH₂CH₂CH₂CH₂NHC)NH(NH₂)BBoroMpg = -NH-CH-(CH₂CH₂CH₂-OCH3)Bp-OH-Me-Phal = p-hydroksymetylo-fenyloalanina p-TBDPS-O-Me-Phal = p-III-rz.butylo-difenylo-sililo-oksymetylo-fenyloalanina.

Kinetyczne parametry Ki, Kon i koff określane są przez hamowanie katalizowanej enzymem hydrolizy peptydo-arg-pNA. W wyniku tej hydrolizy otrzymuje się p-nitroanilinę i jej uwalnianie w zależności od czasu, wyliczane ilościowo za pomocą gęstości optycznej mierzonej przy 405 nm, określa stopień hamowanej i niehamowanej reakcji.

Pomiary kinetyczne prowadzi się na płytce o 96 mikrodołkach w kombinacji z jednokomórkowym kinetycznym czytnikiem. Miareczkowaną przy aktywnej części trombinę ludzką rozpuszcza się w 0,1 M buforze fosforanowym, o wartości pH 7,4, zawierającym 0,1 MNaCl i 0,1% albuminy surowicy bydlęcej w roztworze podstawowym zawierającym 400 nM aktywnego enzymu.

167 469

Do próby chromogenicznej roztwór ten rozpuszcza się w tym samym buforze do 0,4 nM. Substrat, 2AcOH-H-D-cykloheksylo-ala-arg-pNA rozpuszcza się w tym samym buforze do stężenia 0,5 mM. Inhibitory rozpuszcza się najpierw w układzie kremofor/ etanol 1:1, a następnie rozcieńcza wodą destylowaną do 1 mM roztworu podstawowego. Dalsze rozcieńczenia prowadzi się za pomocą wyżej opisanego buforu fosforanowego.

Próby rozpoczyna się przez dodanie 100 pl roztworu enzymu do mieszaniny zawierającej 100 pl inhibitora i 50 pl roztworu substrrtu. Uwalnianie p-nitroaniliny z hydrolizy substratu peptydylo-p-nitroanilidowego następuje w ciągu 30 minut do 1 godziny, przy czym mierzy się wzrost gęstości optycznej przy 405 nm. Zebrane dane stosuje się do wyliczenia parametrów kinetycznych w obecności i w nieobecności inhibitora. Choć inne mechanizmy działania nie są wykluczone, charakterystyka tej klasy inhibitorów trombiny jest ograniczona do dwóch głównych zaobserwowanych mechanizmów, a mianowicie szybkiego, odwracalnego i powolnego, szczelnie wiążącego hamowania współzawodniczącego. Stałe kinetyczne tych inhibitorów wykazujących szybki, odwracalny mechanizm wiążący, mianowicie szybkie wiązanie (początkowa ilość Vo hamowania >Vo z inhibitorem (przy It>>Et (całkowite stężenie inhibitora/całkowite stężenie enzymu) wylicza się przez liniową regresję wyprowadzoną z wykresu funkcji 1/vvs. stężenia inhibitora (I). Wartość Ki wylicza się z poziomego wyznacznika Ki, app za pomocą równania (1)

Ki, app = Ki(1 + S/Km) (1)

Jeśli wskaźnik interakcji z enzymem jest powolny (Vo bez działania inhibitora) i zwarty (Ki zbliżone do lub niższe niż Et) tak, że prędkość hamowania w stanie równowagi osiąga się powoli, stopień tworzenia się pNA opisany jest przez równanie (2) (V₀-Vs)

P = Vst+ --- [1-exp(-kobst)] kob3 (2) gdzie: P oznacza ilość pNA utworzoną w czasie t, Vo oznacza ilość początkową, Vs oznacza ilość w stanie równowagi, a kobs oznacza globalną ilość jako funkcję Et, It, Ki, app i obserwowanej drugorzędnej stałej (k'on) dla interakcji pomiędzy inhibitorem i enzymem. Dane z pomiarów powolnego, mocno wiążącego hamowania stosuje się do równania (2) przez analizę nieliniowej regresji, z której uzyskuje się przybliżone wartości kobs. Wartości k'on, koff i Ki, app otrzymuje się następnie z wykresu funkcji kobs vs (I). Wartość koff uzyskuje się z pionowego wyznacznika, natomiast wartości k'on i Ki oblicza się odpowiednio z nachylenia i wyznaczników poziomych, stosując równanie (1).

Następujące przykłady bliżej wyjaśniają wynalazek.

Przykład! . Boc-TMSai-Pro-NH-CHKCHz^jBOPin.

A. Boc-D-TMSal-OH.

21,5 g (113,7 mmoli) estru etylowego D-TMSal otrzymanego według Angew. Chem. 93, 793 (1981) rozpuszcza się w CH₂Cl₂ i dodaje roztwór nadmiaru BoczO w CH2G2. Mieszaninę utrzymuje się w ciągu 15 godzin w temperaturze pokojowej, po czym dodaje się 500 ml chłodzonego lodem 0,25 N kwasu solnego. Warstwę organiczną przemywa się 5% NaHCO3 i solanką, po czym suszy nad NazSO₄ i zatęża w próżni. Surowy produkt w postaci bezbarwnego oleju stosuje się bezpośrednio do etapu zmydlania. Produkt rozpuszcza się w metanolu, chłodzi do temperatury 0°C, miesza z 510 ml 1N NaOH i miesza w temperaturze 0°C w ciągu 3 godzin. Po zakwaszeniu do wartości pH 1 za pomocą 1N HCl mieszaninę ekstrahuje się kilkakrotnie eterem. Warstwy organiczne łączy się, przemywa solanką, suszy nad Na₂SO₄ i zatęża w próżni. Produkt w postaci 29,7 g oleju stosuje się w następnym etapie bez dalszego oczyszczania.

B. Boc-D-TMSal-Pro-ONSU 29,7 g Boc-D-TMSal-OH (113,7 mmoli) i 19,0 g (136,3 mmoli) p-nitrofenolu rozpuszcza się w EtOAc. Po ochłodzeniu do temperatury 0°C dodaje się 23,4 g (113,6 mmoli) DCC i mieszaninę miesza w ciągu 1 godziny w temperaturze 0°C, a następnie w ciągu 15 godzin w temperaturze pokojowej. Osad odsącza się i przemywa EtOAc, a przesącz zatęża pod obniżonym ciśnieniem. Otrzymany olej oczyszcza się drogą szybkiej chromatografii (9:1 heksan/EtOAc), uzyskując żądany Boc-D-TMSal-ONp w postaci białych kryształów.

51,6g (113,7 mmoli) Boc-D-TMSal-ONp rozpuszcza się w THF i dodaje wodny roztwór równomolowych ilości proliny i EteN. Mieszaninę utrzymuje się w ciągu 20 godzin w temperaturze pokojowej, po czym usuwa THF pod obniżonym ciśnieniem, a wodną pozostałość rozcieńcza

167 469 wodą, a następnie kilkakrotnie ekstrahuje EtOAc. Wartość pH warstwy wodnej doprowadza się do 3 przez dodanie 10% kwasu cytrynowego. Uzyskany oleisty produkt ekstrahuje się kilkakrotnie EtOAc. Połączone warstwy organiczne przemywa się solanką, suszy nad Na₂SO4 i zatęża pod obniżonym ciśnieniem. Bezbarwny olej przekrystalizowuje się z eteru/heksanu, otrzymując dipeptyd Boc-D-TMSal-Pro-OH w postaci białego krystalicznego związku o temperaturze topnienia 176°C.

26,0 g (72,5 mmoli) otrzymanega dipeptydu rozpuozcza się w E tOAc. Po ochłodzeniu do temperatury 0°C dodaje się 9,8 g (85,5 mmoli) HONSu i 14,9 g (72,3 mmoli) DCC. Mieszaninę miesza się w ciągu 3 godzin w temperaturze 0°C, a następnie przez dalsze 15 godzin w temperaturze pokojowej. Mieszaninę ponownie chłodzi się do temperatury 0°C, dicrkioheksyi^mocznik odsącza się i kilkakrotnie przemywa EtOAc. Przesącz przemywa się wodnym roztworem 0,1 M Na₂CO3, a następnie wodnym 2% roztworem KHSO4.

Po wysuszeniu nad Na₂SO4 i zatężeniu pod obniżonym ciśnieniem otrzymuje się Boc-DTMSal-Pro-ONSu w postaci białej piany.

C. Boc-D-TMSal-Pro-Baa-OPin.

Proces ten stanowi jednoreaktorową ^^iiapową reakcję obejmującą utworzenie in situ chiralnego a-(bistrimetylosililo}-amido-boranu, hydrolizę dwóch grup trimetrlosililooych i sprzęganie tak uzyskanego α-amino-boranu z aktywnym estrem (Boc-D-TMSal-Pro-ONSu) wytworzonym w etapie B. Początkową sekwencję reakcji prowadzi się w atmosferze argonu. 1,75 g (5,0 mmoli) ch^alnego a-chloroboranu (1-boran( + --pinanodiolo-(SZ-1-chloro-4~bromo-butanu rozpuszcza się w 2,5 ml THF i dodaje się do wstępnie ochłodzonego do temperatury -78°C roztworu heksametylodisilazanu litu (5 ml roztworu 1,0 M w heksanie, 5,0 mmoli). Mieszaninę miesza się w ciągu 30 minut w temperaturze -78°C, po czym roztwór doprowadza się przez noc do temperatury pokojowej. Po ponownym ochłodzeniu do temperatury -78°C dodaje się 3 równoważniki molowe HCl w dioksanie. Mieszaninę ogrzewa się do temperatury pokojowej i miesza w ciągu 2 godzin w tej temperaturze. Po ponownym ochłodzeniu do temperatury -20°C dodaje się roztwór 2,28 g (5,0 mmoli) aktywnego estru z etapu B w 6 ml CH₂Cl₂, a następnie 1,39 ml (10,0 mmoli) metyloaminy.

Mieszaninę miesza się w ciągu 1godziny w temperaturze -13°C, ogrzewa do temperatury pokojowej i miesza w ciągu 2 godzin w tej temperaturze. Mieszaninę sączy się, przesącz zatęża się pod obniżonym ciśnieniem, pozostałość rozcieńcza eterem i przemywa 2N HCl, 5% NaHCO3 i solanką. Warstwę organiczną suszy się nad Na₂SO4 i zatęża pod obniżonym ciśnieniem. Pozostałość krystalizuje podczas stania, przy czym uzyskuje się żądany chiralny boran peptydu w postaci białej krystalicznej substancji.

D. Boc-D-TMSal-Pro-NH-CH[(CH2)3N3]BOPin.

804 mg (1,2 mmoli) Boc-D-TMSal-Pro-Baa-OPin, produktu z etapu C rozpuszcza się w 13 ml DMSO i dodaje 156 mg (2,4 mmoli) azydku sodu. Mieszaninę miesza się w ciągu 3 godzin w temperaturze pokojowej. Dodaje się mieszaninę eteru z wodą z lodem, przy czym zaraz wytrącają się białe kryształy. Osad odsącza się i przemywa eterem, otrzymując 0,6 g azydku w postaci białej krystalicznej substancji.

Przykład II. Boc-D-TMSal-Pro-BoroOrn-OPin.

569 mg (0,9 mmoli) azydku z przykładu I rozpuszcza się w 25 ml EtOAc i uwodornia w obecności 0,5 g 10% Pd na węglu. Po upływie 2,5 godzin katalizator usuwa się, a roztwór zatęża pod obniżonym ciśnieniem, otrzymując białą pianę, którą pręekrystalięoouje się z EtOAc/eteru, uzyskując żądany produkt w postaci białego krystalicznego związku o temperaturze topnienia 200 - 202°Cł (aD> = 11,6° (c == 0,5 w MeOH).

Przykład III. Boc-D-TMSal-Pro-NH-CH ((CH 2)3N3)B-OPin.

A) 1-boran (4---pmanodiolo-(S)~1-cZloro-5-bromo-pentanu.

20,8 ml (203,3 mmoli) 4-bromo-1-butenu poddaje się reakcji z 24,4 g (203,3 mmoli) katecholoborowodoru w temperaturze 100°C w ciągu 16 godzin. Surowy produkt destyluje się pod obniżonym ciśnieniem, otrzymując 1-boran 4-bromo-butanu w postaci białej krystalicznej substancji. 27,7 g (163 mmoli) ( + )-pinanodiolu rozpuszcza się w THF i dodaje otrzymany wyżej 1-boran Abromobutanu wilości41,6g(163 mmoli). Mieszaninę utrzymuje się w ciągu 1 godziny w tempera10

167 469 turze pokojowej, po czym usuwa THF pod obniżonym ciśnieniem, a pozostałość oczyszcza drogą szybkiej chromatografii (90:10 heksan/EtOAc), otrzymując 1-boran ( + )-pinanodiolo-4-bromobutanu w postaci bezbarwnego oleju.

Żądany 1-boran ( + )-pinanodiolo-(S)-l-chloro-5-bromo-pentanu otrzymuje się według Organometałlics 3,1284 (1984). 9,8 ml chlorku metylenu w THF chłodzi się do temperatury -100°C i dodaje 71,6 M roztworu n-butylolitu (114,5 mmoli) w ciągu 20 minut. Mieszaninę utrzymuje się w ciągu 15 minut w temperaturze -100°C, po czym dodaje zimny (-78°C) roztwór 32,8 g (104,1 mmoli) 1-boranu (+ )-pinanodiolo-5-bromo-pentanu w THF. Po dodatkowym utrzymywaniu mieszaniny w ciągu 1 godziny w temperaturze -100°C dodaje się 7,1 g (52,0 mmoli) bezwodnego ZnCfe. Mieszaninę utrzymuje się w ciągu dodatkowych 15 minut w temperaturze -100°C, po czym ogrzewa do temperatury pokojowej i miesza przez 2 godziny w tej temperaturze. Rozpuszczalnik usuwa się pod obniżonym ciśnieniem, pozostałość rozcieńcza heksanem/wodą i ekstrahuje kilkakrotnie heksanem. Po osuszeniu nad Na₂SO4 i usunięciu rozpuszczalnika pod obniżonym ciśnieniem otrzymuje się 1-boran ( + )-pinanodiolo-(S)-l-chloro-5-bromo-pentanu w postaci żółtego oleju, który stosuje się bezpośrednio w następnym etapie bez dalszego oczyszczania.

B) Boc-D-TMSal-Pro-NH-CH((CH₂)4Br)B-OPin.

65.2 ml 1,0 M roztworu LiN(SiMe3)2 (65,2 mmoli) w THF chłodzi się do temperatury -78°C. Dodaje się 23,7 g (65,2 mmoli) σ-chloro-boranu z etapu A w THF. Mieszaninę miesza się w ciągu 1 godziny w temperaturze -78°C, a następnie w ciągu 15 godzin w temperaturze pokojowej. Następnie mieszaninę chłodzi się ponownie do temperatury -78°C, dodaje 29,8 ml 6,56 N roztworu HCl (196 mmoli), roztwór miesza w ciągu 45 minut w temperaturze -78°C i następnie 2 godziny w temperaturze pokojowej. Mieszaninę chłodzi się do temperatury -15°C, dodaje 29,7 g (65,2 mmoli) Boc-TMSal-Pro-ONSu z przykładu I w CH2CI2, a następnie 18,1 ml (130,4 mmoli) trietyloaminy w celu zapoczątkowania reakcji. Mieszaninę miesza się w temperaturze -15°C w ciągu 1 godziny, a następnie w ciągu 2 godzin w temperaturze pokojowej. Mieszaninę sączy się przez Hyflo i zatęża pod obniżonym ciśnieniem. Pozostałość rozcieńcza się eterem/wodą i ekstrahuje kilkakrotnie eterem. Mieszaninę suszy się nad NazSCL i zatęża w próżni, otrzymując żądany Boc-D-TMSal-ProNH-CH ((CH2)4-br)B-ÓPin, który po krystalizacji z eteru/heksanu daje białą krystaliczną substancję o temperaturze topnienia 74°C.

C) Boc-D-TMSal-Pro-NH-CH((CH₂)4N₃)B-OPin.

33.3 g (48,6 mmoli) produktu z etapu B rozpuszcza się w DMSO i dodaje 6,3 g (97,2 mmoli) azydku sodu. Mieszaninę miesza się w ciągu 6 godzin w temperaturze pokojowej. Dodaje się eter/wodę z lodem i mieszaninę kilkakrotnie ekstrahuje eterem. Po wysuszeniu nad Na₂SO4 i zatężeniu pod obniżonym ciśnieniem otrzymany olej krystalizuje się, uzyskując Boc-D-TMSałPro-NH-CH((CH2)4N3)B-Pin w postaci białej krystalicznej substancji o temperaturze topnienia 69 - 70°C, ff_D = -74,4° (c = 1,0 w MeOH).

Przykład IV. Boc-D-TMSal-Pro-BoroLys-OPin.

22,0 g (34,0 mmoli) azydku z przykładu IV rozpuszcza się w EtOAc i uwodornia w obecności 4,0 g 10% Pd osadzonego na węglu. Po upływie 9 godzin katalizator usuwa się, a roztwór zatęża pod obniżonym ciśnieniem. Uzyskaną pianę rozpuszcza się w EtOAc i krystalizuje, otrzymując żądany Boc-D-TMSal-Pro-BoroLys-OPin w postaci białych kryształów o temperaturze topnienia 128 129°C, σο = -59,6° (c = 1,0 w MeOH).

Przykłady V-XV. Metodami analogicznymi do opisanych w przykładachI-IV można otrzymywać związki o wzorze lb, w którym R4, Rs', R11, Qi + Q₂ i AA mają znaczenia podane w następującej tabeli.

167 469

Tabela

Nr

przykładu	w	R11	R4	Re'	Qi + Q2	AA	(Oo”	C	Rozpuszczalnik
1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
V	Boc	wzór 12	H	-(CH2)3-NH2	wzór 9	Pro	-27,8°	0,5	EtOH
VI	Boc	wzór 13	H	^CH2)4-No	wzór 9	Pro	-64,7°	0,51	CC2CI2
VII	Boc	wzór 13	H	-(CHj),-NH2	wzór 9	Pro	-52,4°	0,54	CH2CI2
VIII	Boc	wzór 13	H	-{CH2)3-NH2	wzór 9	Pro	-10,6°	0,5	CH2CI2
IX	Ac	wzór 12	H	-<CH2)3-NH2	wzór 9	Pro	-78,6°	0,75	CH2CI2
X	Boc	wzór 13	H	-(CH2)3-NH2	wzór 10	Gly	-4,4°	0,5	CH2CI2
XI	Boc	-CH2-C(CH3)3	H	-{CH2)-N3	wzór 9	Pro	-76,0°	0,5	CH2CI2
XII	Boc	-CHi-C(CH3)3	H	CCH2)nHH2	wzór 9	Pro	-25,4°	0,5	CH2CI2
XIII	Boc	CHz-SKCHa)!	H	-(CK2)4-NH2	wzór 9	Gly	-30,6°	0,5	EtOH
XIV	Boc	CH2-Si(CH3)3	H	-<CH2)4NH2	wzór 9	Asp	-18,4°	0,5	MeOH
XV	H	CH2-Si(CH3)3	H	-<CH2)3NH2	wzór 9	Pro	-53,6°	0,32	MeOH

Przykład XVI. Boc-D-(p-)TBDPS-O(-metylo)Phal-Pro-BoroOrn-OPin.

A) Boc-D-(p-)( 1,1 -dimeiyloetylo/diifenylo-sililo(-oksy)-metylo-fenyloalani.na.

W celu selektywnej redukcji grupy azydowej w substracie 7,27 g (66,0 mmoli) tiofenolu dodaje się do zawiesiny 3,12 g (16,5 mmoli) SnCk w CH2 Cl2. Dodaje się 6,8 ml (49,5 mmoli) trietyloaminy i otrzymuje żółty roztwór. Następnie dodaje się 4,8 g (22,0 mmoli) bezwodnika Boc, a następnie 6,8 g (11,0 mmoli, %de>95) (3-(2S), 4S-3-(2-azydo-3-(p-) (1,1-dimetylo)-difenylo-siliIo(-oksy-metylo)fenylo-1-okso-propylo-(-4-)fenylometylo)-2-oksazolidynonu, otrzymanego według J. Am. Chem.Soc. 109,6881 (1987) w postaci roztworu w CH2 Cl2. Mieszaninę miesza się w ciągu 2,5 godzin w temperaturze pokojowej, a następnie rozcieńcza EtOAc/2N NaOH i sączy przez Hyflo. Warstwę organiczną przemywa się 2% wodnym roztworem NaHSO4, 5% wodnym roztworem NaHCOa i wreszcie solanką. Otrzymany po wysuszeniu nad NasSO^ i zatężeniu pod obniżonym ciśnieniem żółty olej oczyszcza się za pomocą szybkiej chromatografii, uzyskując (3(2S), 4S(-3^)2^)((IIIrz.butyloksy)-karbonylo)-ammo(-3-(p-X(1,1-dimetyloetylo)-difenylolo-sililo(-oksy}-metylo)--fenylo-1-oksopropylo)-4-(fenylometylo)-2-oksazolidynon w postaci białej piany. 2,0 g (2,88 mmoli) tego związku rozpuszcza się w THF/wodzie i hydrolizuje za pomocą 5,76 mmoli wytworzonego in situ LiOOH w temperaturze 0°C. Po upływie 1,75 godziny w temperaturze 0°C dodaje się 1,25 g (9,9 mmoli) Na2SO3 w wodzie. THF usuwa się pod obniżonym ciśnieniem, wartość pH pozostałości doprowadza się do 1-2 i mieszaninę ekstrahuje trzykrotnie EtOAc. Połączone warstwy organiczne przemywa się wodą, suszy nad Na2SO4 i zatęża pod obniżonym ciśnieniem. Po krystalizacji z heksanu/eteru otrzymuje się oksazolidynon w postaci białych kryształów. Przesącz zatęża się pod obniżonym ciśnieniem, otrzymując żądany związek tytułowy w postaci białej piany.

B) Boc-D-(p-)(1,1-dimetyloetylo)-difenylo-sililo-(oksy)-metylo-fenyloalamno-Pro-ONSu.

0,59 g (2,88 mmoli) DCC dodaje się do mieszaniny 1,6 g (2,88 mmoli) związku tytułowego z etapu A) i 0,43 g (3,12 mmoli) p-nitrofenolu w EtOAc w temperaturze 0°C. Mieszaninę miesza się w ciągu 16 godzin w temperaturze pokojowej. Po ochłodzeniu do temperatury 0°C osad odsącza się i przemywa zimnym EtOAc. Przesącz zatęża się pod zmniejszonym ciśnieniem. Otrzymany olej Boc-D-(p-TBDPS-O-Me)-Phal-ONp stosuje się w następnym etapie bez dalszego oczyszczania.

2.2 g (2,88 mmoli) Boc-D-(p-TBDPS-O-Me)-Phal-ONp rozpuszcza się w THF i dodaje wodny roztwór 365 mg (3,17 mmoli) L-proliny i 0,88 ml (6,33 mmoli) Et3N. Mieszaninę miesza się w ciągu 15 godzin w temperaturze pokojowej, po czym usuwa THF pod obniżonym ciśnieniem. Wartość pH doprowadza się do 3 przez dodatek 10% kwasu cytrynowego. Uzyskany oleisty produkt ekstrahuje się kilkakrotnie EtOAc. Połączone warstwy organiczne przemywa się solanką, suszy nad Na2SO4 i zatęża pod obniżonym ciśnieniem. Bezbarwny olej oczyszcza się za pomocą szybkiej chromatografii (9:1 CH2Cl2)EtOH do eluowania p-nitrofenolu, po czym 80:20 CH2Cb(EtOH), otrzymując Boc-D-(p-TBDPS-O-Me)-Phal-Pro-Oh w postaci białej piany.

1.3 g (2,06 mmoli) tego dipeptydu rozpuszcza się w EtOAc. Po ochłodzeniu do temperatury 0°C dodaje się 220 mg (2,47 mmoli) HONSu i 330 mg (2,06 mmoli) DDC. Mieszaninę ponownie chłodzi się do temperatury 0°C, odsącza dicykloheksylomocznik i kilkakrotnie przemywa zimnym EtOAc. Przesącz przemywa się wodnym 0,1 M roztworem NaaCOg, 8% roztworem NaHSO4 i następnie solanką. Po wysuszeniu nad NaaSOz i zatężeniu pod obniżonym ciśnieniem otrzymuje się związek tytułowy Boc-D-(p-TBDPS-O-Me)-Phal-Pro-ONSu w postaci białej piany.

167 469

C) Boc-D-(p-TBDPS-0-Me)-Phal-Pro-Baa-OPin.

Związek tytułowy otrzymuje się stosując analogiczny 3-etapowy proces jednoreaktorowy, jak opisano dla syntezy Boc-D-TMSal-Pro-Baa-OPin w przykładzie IC. Tak więc pośredni α-aminoboran, który otrzymuje się przez reakcję 659 mg (2,0 mmole) chiralnego α-chloro-boranu (1boranu( + --pinanodiolO((S--l-chloro44-bromo-butanu) z 2,0 mmolami Lin(SiMe3)2 i ^^<rn^^ięę za pomocą HCl, poddaje się reakcji z aktywnym estrem z etapu B) w ilości 1,45 g (2,0 mmole) w obecności 4,0 mmoli EteN, otrzymując związek tytułowy, który oczyszcza się za pomocą szybkiej chromatografu (1:1 heksan/EtOAc).

D) Boc-D-(plTBDPS-O-Me)-Phal-PrOlBoroOrn-OPm.

680 mg (0,72 mmoli) produktu z etapu C) rozpuszcza się w DMSO i dodaje 94 mg (1,44 mmoli) azydku sodu. Mieszaninę miesza się w ciągu 4 godzin w temperaturze pokojowej. Następnie dodaje się eter/wodę z lodem i niezwłocznie wytrącają się białe kryształy. Biały osad odsącza się i przemywa wodą, otrzymując Boc-D-(p-TBDPS-O-Me)-Phal-Pro-NH-CH((CH2)3N3)B-OPm w postaci białej krystalicznej substancji.

272 mg (0,3 mmoli) azydku rozpuszcza się w EtOAc i uwodornia w obecności katalizatora Lindlara. Po upływie 8 godzin katalizator usuwa się, a roztwór zatęża pod obniżonym ciśnieniem. Surowy produkt oczyszcza się za pomocą szybkiej chromatografii (EtOAc potem EtOH), otrzymując żądany związek tytułowy w postaci białej piany, Ud = -32,4° (c = 0,25 w MeOH).

Przykład XVII. Bo--D-(p-OH-Me)-Phal-Pro-BoroOra-OPin.

132 mg (0,15 mmoli) boro-ornityny z przykładu XVI rozpuszcza się w THF i poddaje reakcji z 0,3 ml 1,1 M roztworu n-Bu4NF (0,3 mmoli). Mieszaninę utrzymuje się w ciągu 45 minut w temperaturze pokojowej, po czym dodaje wodę z lodem i otrzymaną mieszaninę kilkakrotnie ekstrahuje EtOAc. Połączone warstwy organiczne suszy się nad Na_aSO4 i zatęża pod obniżonym ciśnieniem. Otrzymany olej oczyszcza się za pomocą krótkiej chromatografii (EtOAc potem EtOH), otrzymując żądany związek tytułowy w postaci białej piany, Ud = -34,0° (c = 01 w MeOH).

,Q1

W-Y-N-CH - Β I I r₄ r₅ “Q₂

WZÓR 1 z^0R9

W-Y-N-CH - B

Ra R5 'OR

WZÓR 1 a

W-NH-CH-CO-AA-N-CH-B ^R11

R/ R5*

WZÓR 1 b

W-NH-CHtR^J-CO-Pro-N-CHR₅- Β *1

Q₂

WZÓR 1’

W - NH - CH (R^) -CO- Pro -N- CHR₅ Ra °

WZÓR 1”

R11

I

-NH-CH-CII O

WZÓR 2

WZÓR 3

l-)^xO

WZÓR 4

16*7469

WZÓR 5

W-Y-NH - CH - Β I ^r12

WZÓR 6

Ol ^Q2

Cl - CH - B I ^r13

Ol o₂

O

W-Y-O-N

O

WZÓR 8

WZÓR 7

WZÓR 9

WZÓR 10

Glu

WZÓR 12

WZÓR

WZÓR 4

WZÓR 15

WZÓR 16 x^0H H· <₀

WZÓR 17

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz. Cena 1,50 zł

Claims (7)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób wytwarzania nowych peptydowych pochodnych kwasu borowego o wzorze I, w którym W oznacza atom wodoru lub grupę chroniącą azot, Y oznacza sekwencję n aminokwasów taką, że n +1 aminokwasowy peptyd Y-Lys lub Y-Arg ma powinowactwo do aktywnej części proteazy typu trypsyny, przy czym n oznacza liczbę całkowitą 1-10 i co najmniej jeden aminokwas jest nienaturalnym aminokwasem o hydrofobowym łańcuchu bocznym, Q-i i Q2 są takie same lub różne i oznaczają grupy -OH, -COR1, -CONR1R2, -NR1R 2 lub -OR3, albo Q1 i Q2 razem oznaczają resztę diolu, R1, R2 i R3 są takie same lub różne i oznaczają rodnik C1- 10-alkilowy, Ce-10-arylowy, Ce-w-aralkilowy lub fenylowy podstawiony podstawnikami w ilości do trzech, takimi jak grupa C1-4-alkilowa, chlorowiec lub grupa C1-4-alkoksylowa, R4 oznacza atom wodoru lub rodnik C1- 10-alkilowy, R5 oznacza grupę -A-X, gdzie A oznacza grupę -(CH2)z, w której z oznacza 2,3,4 lub 5, grupę -CH(CH3)-(CH2)2, -CH2-CH(CH3)-CH2-, -(CH2)₂-CH(CH3)-, -(CH2)2-C(CH3)2, CH(CH3)-(CH2)3-, -CH2-CH(CH3)-(CH3)-(CH2)2-, -CH2-CH2-CH(CH3)-CH2-, -(CH2)3CH(CH3)-, -(CH2)3-C(CH3)2; grupę Ce-10-arylową, Ce-10-aralkilową, X oznacza grupę -NH2, a asymetryczny atom węgla znaczony gwiazdką może oznaczać konfigurację D lub L albo ich mieszaniny, znamienny tym, że związek o wzorze 7, w którym Q1 i Q2 mają wyżej podane znaczenie a R13 oznacza grupę -A-Br, w której A ma wyżej podane znaczenie, poddaje się reakcji z LiN[Si(CH3)3]2, po czym prowadzi się kwasową hydrolizę i sprzęganie z chronionym peptydem o wzorze 8, w którym W i Y mają wyżej podane znaczenie, a następnie otrzymany związek o wzorze 6, w którym R12 oznacza -A-Br, a A, W, Y, Q1 i Q2 mają wyżej podane znaczenie, poddaje się reakcji z azydkiem sodu, po czym otrzymany związek o wzorze 1, w którym R5 oznacza grupę -A-X, w której A ma wyżej podane znaczenie, a X oznacza N3, a pozostałe podstawniki mają wyżej podane znaczenie, poddaje się uwodornieniu.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się związki wyjściowe o wzorze 8, w którym W oznacza grupę H(CH2CH2O)-, ReCO-, R7OCO- lub R8SO2-, w których to grupach p oznacza liczbę 3 - 30, Re oznacza grupę G-e-alkilową, R7oznacza grupę C1-e-alkilową, fenylową, benzylową lub naftylową, a R8 oznacza grupę fenylową, naftylową lub C1-4-alkilofenylową, a Yma znaczenie podane w zastrz. 1.
3. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w przypadku wytwarzania związku o wzorze 1a, w którym W, Y, R4 i R5 mają znaczenie podane w zastrz. 1 albo 2, a R9 i R10 oznaczają resztę związku dihydroksylowego, stosuje się związek wyjściowy o wzorze 7, w którym Q1 i Q2 oznaczają grupy o wzorach -OR9 i -OR 10, gdzie R9 i R10 mają wyżej podane znaczenie, a R13 we wzorze 7 ma znaczenie podane w zastrz. 1.
4. 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się związki wyjściowe o wzorze 7, w którym Q1 i Q2 razem oznaczają grupę o wzorze 9 lub 10, a R13 ma znaczenie podane w zastrz. 1.
5. 5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się związki wyjściowe o wzorze 8, w którym W i Y mają znaczenie podane w zastrz. 1, przy czym nienaturalny aminokwas w podstawniku Yjest związkiem o wzorze 2, w którym R11 oznacza grupę hydrofobową.
6. 6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że R11 oznacza grupę o wzorze 12, grupę -CH2Si(CH3)3, grupę o wzorze 13, grupę -CH2-C(CH3)3, grupę o wzorze 14, 15 lub 16.
7. 7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się związki wyjściowe o wzorze 8, w którym Y oznacza sekwencję dwóch aminokwasów, z których N-końcowy aminokwas jest nienaturalnym aminokwasem, a drugi aminokwas jest L-proliną, a W ma znaczenie podane w zastrz. 1 albo 2.

   167 469 3