KR970005898B1 - 뉴클레오티드 프로브에 대한 비-뉴클레오티드 연결시약 - Google Patents
뉴클레오티드 프로브에 대한 비-뉴클레오티드 연결시약 Download PDFInfo
- Publication number
- KR970005898B1 KR970005898B1 KR1019890700894A KR890700894A KR970005898B1 KR 970005898 B1 KR970005898 B1 KR 970005898B1 KR 1019890700894 A KR1019890700894 A KR 1019890700894A KR 890700894 A KR890700894 A KR 890700894A KR 970005898 B1 KR970005898 B1 KR 970005898B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- nucleotide
- reagent
- coupling
- monomer unit
- linked
- Prior art date
Links
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 title claims abstract description 198
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 title claims abstract description 196
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 title claims abstract description 99
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 60
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 claims abstract description 59
- 230000008878 coupling Effects 0.000 claims abstract description 58
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 claims abstract description 58
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims abstract description 33
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims abstract description 18
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 89
- 239000000178 monomer Substances 0.000 claims description 83
- -1 dimethoxy triphenylmethyl Chemical group 0.000 claims description 67
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 23
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 23
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 claims description 22
- RXNXLAHQOVLMIE-UHFFFAOYSA-N phenyl 10-methylacridin-10-ium-9-carboxylate Chemical group C12=CC=CC=C2[N+](C)=C2C=CC=CC2=C1C(=O)OC1=CC=CC=C1 RXNXLAHQOVLMIE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 claims description 13
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 12
- 125000004044 trifluoroacetyl group Chemical group FC(C(=O)*)(F)F 0.000 claims description 10
- 125000003545 alkoxy group Chemical group 0.000 claims description 9
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims description 9
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 claims description 9
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 claims description 9
- 239000011616 biotin Substances 0.000 claims description 9
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 claims description 9
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 9
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 claims description 8
- 150000002367 halogens Chemical class 0.000 claims description 8
- 125000000951 phenoxy group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(O*)C([H])=C1[H] 0.000 claims description 8
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims description 8
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 7
- 125000000467 secondary amino group Chemical group [H]N([*:1])[*:2] 0.000 claims description 7
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 claims description 5
- 125000001301 ethoxy group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])O* 0.000 claims description 5
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 125000000956 methoxy group Chemical group [H]C([H])([H])O* 0.000 claims description 5
- 125000002221 trityl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1C([*])(C1=C(C(=C(C(=C1[H])[H])[H])[H])[H])C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 claims description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 4
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 125000000623 heterocyclic group Chemical group 0.000 claims description 3
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 3
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical group [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 125000002015 acyclic group Chemical group 0.000 claims description 2
- 125000004663 dialkyl amino group Chemical group 0.000 claims description 2
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 claims description 2
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 claims description 2
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 claims description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims 8
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 claims 7
- 125000001183 hydrocarbyl group Chemical group 0.000 claims 6
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- 239000008139 complexing agent Substances 0.000 claims 2
- 229930195733 hydrocarbon Natural products 0.000 claims 2
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 claims 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 claims 2
- WDCYWAQPCXBPJA-UHFFFAOYSA-N 1,3-dinitrobenzene Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC=CC([N+]([O-])=O)=C1 WDCYWAQPCXBPJA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 239000004215 Carbon black (E152) Substances 0.000 claims 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 claims 1
- YCKRFDGAMUMZLT-UHFFFAOYSA-N Fluorine atom Chemical compound [F] YCKRFDGAMUMZLT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 125000003282 alkyl amino group Chemical group 0.000 claims 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 claims 1
- 150000001721 carbon Chemical group 0.000 claims 1
- 229910052731 fluorine Inorganic materials 0.000 claims 1
- 239000011737 fluorine Substances 0.000 claims 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 claims 1
- 125000005740 oxycarbonyl group Chemical group [*:1]OC([*:2])=O 0.000 claims 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 claims 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 claims 1
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N texas red Chemical compound [O-]S(=O)(=O)C1=CC(S(Cl)(=O)=O)=CC=C1C(C1=CC=2CCCN3CCCC(C=23)=C1O1)=C2C1=C(CCC1)C3=[N+]1CCCC3=C2 MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 7
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 3
- 239000000138 intercalating agent Substances 0.000 abstract 1
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 81
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 57
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 57
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 55
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 54
- 239000000463 material Substances 0.000 description 40
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 39
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 38
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 36
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 33
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 32
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 32
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 31
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 28
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 26
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 26
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 26
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 25
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 24
- 239000000047 product Substances 0.000 description 24
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 24
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 22
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 21
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 21
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 19
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 18
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 229940093499 ethyl acetate Drugs 0.000 description 18
- 235000019439 ethyl acetate Nutrition 0.000 description 18
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 17
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) Chemical compound CCN(C(C)C)C(C)C JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 14
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 14
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 14
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 12
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 12
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 11
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N Argon Chemical compound [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 238000003818 flash chromatography Methods 0.000 description 10
- 239000012044 organic layer Substances 0.000 description 10
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 9
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 9
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 9
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 8
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 8
- FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N ninhydrin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(O)(O)C(=O)C2=C1 FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 8
- NJZPMKZAHHFPLJ-UHFFFAOYSA-N 2,2-bis(3-aminopropyl)propane-1,3-diol Chemical compound NCCCC(CO)(CO)CCCN NJZPMKZAHHFPLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 7
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 7
- 150000001412 amines Chemical group 0.000 description 7
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 7
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 7
- VEHZNTVQQZAEIT-UHFFFAOYSA-N n-[4,4-bis(hydroxymethyl)-7-[(2,2,2-trifluoroacetyl)amino]heptyl]-2,2,2-trifluoroacetamide Chemical compound FC(F)(F)C(=O)NCCCC(CO)(CO)CCCNC(=O)C(F)(F)F VEHZNTVQQZAEIT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 7
- YPFDHNVEDLHUCE-UHFFFAOYSA-N propane-1,3-diol Chemical compound OCCCO YPFDHNVEDLHUCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- VGGUKFAVHPGNBF-UHFFFAOYSA-N s-ethyl 2,2,2-trifluoroethanethioate Chemical compound CCSC(=O)C(F)(F)F VGGUKFAVHPGNBF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- KQIGMPWTAHJUMN-UHFFFAOYSA-N 3-aminopropane-1,2-diol Chemical compound NCC(O)CO KQIGMPWTAHJUMN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 6
- NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N Piperidine Chemical compound C1CCNCC1 NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 6
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 6
- LOSXTWDYAWERDB-UHFFFAOYSA-N 1-[chloro(diphenyl)methyl]-2,3-dimethoxybenzene Chemical compound COC1=CC=CC(C(Cl)(C=2C=CC=CC=2)C=2C=CC=CC=2)=C1OC LOSXTWDYAWERDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 0 CC(C)C1C2C1C*C2 Chemical compound CC(C)C1C2C1C*C2 0.000 description 5
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 5
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical group C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 5
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 5
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000012280 lithium aluminium hydride Substances 0.000 description 5
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 5
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 5
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 5
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 5
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 5
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 5
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 5
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 5
- YYROPELSRYBVMQ-UHFFFAOYSA-N 4-toluenesulfonyl chloride Chemical compound CC1=CC=C(S(Cl)(=O)=O)C=C1 YYROPELSRYBVMQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- SLXKOJJOQWFEFD-UHFFFAOYSA-N 6-aminohexanoic acid Chemical compound NCCCCCC(O)=O SLXKOJJOQWFEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J ATP(4-) Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J 0.000 description 4
- ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N Adenosine triphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 102000004861 Phosphoric Diester Hydrolases Human genes 0.000 description 4
- 108090001050 Phosphoric Diester Hydrolases Proteins 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 description 4
- BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N gamma-aminobutyric acid Chemical compound NCCCC(O)=O BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M lithium chloride Chemical compound [Li+].[Cl-] KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 4
- 230000000269 nucleophilic effect Effects 0.000 description 4
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 4
- SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M potassium acetate Chemical compound [K+].CC([O-])=O SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 229960004063 propylene glycol Drugs 0.000 description 4
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- ZWVMLYRJXORSEP-UHFFFAOYSA-N 1,2,6-Hexanetriol Chemical compound OCCCCC(O)CO ZWVMLYRJXORSEP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WZZBNLYBHUDSHF-DHLKQENFSA-N 1-[(3s,4s)-4-[8-(2-chloro-4-pyrimidin-2-yloxyphenyl)-7-fluoro-2-methylimidazo[4,5-c]quinolin-1-yl]-3-fluoropiperidin-1-yl]-2-hydroxyethanone Chemical compound CC1=NC2=CN=C3C=C(F)C(C=4C(=CC(OC=5N=CC=CN=5)=CC=4)Cl)=CC3=C2N1[C@H]1CCN(C(=O)CO)C[C@@H]1F WZZBNLYBHUDSHF-DHLKQENFSA-N 0.000 description 3
- LTMRRSWNXVJMBA-UHFFFAOYSA-L 2,2-diethylpropanedioate Chemical compound CCC(CC)(C([O-])=O)C([O-])=O LTMRRSWNXVJMBA-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- JVSFQJZRHXAUGT-UHFFFAOYSA-N 2,2-dimethylpropanoyl chloride Chemical compound CC(C)(C)C(Cl)=O JVSFQJZRHXAUGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CPFCCWRQVWRUDB-UHFFFAOYSA-N 6-aminohexane-1,2-diol;hydrochloride Chemical compound Cl.NCCCCC(O)CO CPFCCWRQVWRUDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- BQXUPNKLZNSUMC-YUQWMIPFSA-N CCN(CCCCCOCC(=O)N[C@H](C(=O)N1C[C@H](O)C[C@H]1C(=O)N[C@@H](C)c1ccc(cc1)-c1scnc1C)C(C)(C)C)CCOc1ccc(cc1)C(=O)c1c(sc2cc(O)ccc12)-c1ccc(O)cc1 Chemical compound CCN(CCCCCOCC(=O)N[C@H](C(=O)N1C[C@H](O)C[C@H]1C(=O)N[C@@H](C)c1ccc(cc1)-c1scnc1C)C(C)(C)C)CCOc1ccc(cc1)C(=O)c1c(sc2cc(O)ccc12)-c1ccc(O)cc1 BQXUPNKLZNSUMC-YUQWMIPFSA-N 0.000 description 3
- 229920002527 Glycogen Polymers 0.000 description 3
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 3
- 108020004711 Nucleic Acid Probes Proteins 0.000 description 3
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 3
- 239000012300 argon atmosphere Substances 0.000 description 3
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 3
- DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N benzoquinolinylidene Natural products C1=CC=CC2=CC3=CC=CC=C3N=C21 DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 3
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 3
- 230000009849 deactivation Effects 0.000 description 3
- 238000004821 distillation Methods 0.000 description 3
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 3
- 239000012847 fine chemical Substances 0.000 description 3
- 229960003692 gamma aminobutyric acid Drugs 0.000 description 3
- 229940096919 glycogen Drugs 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 3
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 3
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 3
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000005291 magnetic effect Effects 0.000 description 3
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 3
- 239000002853 nucleic acid probe Substances 0.000 description 3
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 description 3
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 3
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 3
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 3
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 3
- 238000010992 reflux Methods 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 3
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 3
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- GYHXXWONJFXEMK-UHFFFAOYSA-N (2,3-dimethoxyphenyl)-diphenylmethanol Chemical compound COC1=CC=CC(C(O)(C=2C=CC=CC=2)C=2C=CC=CC=2)=C1OC GYHXXWONJFXEMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UVGHPGOONBRLCX-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 6-[5-(2-oxo-1,3,3a,4,6,6a-hexahydrothieno[3,4-d]imidazol-4-yl)pentanoylamino]hexanoate Chemical compound S1CC2NC(=O)NC2C1CCCCC(=O)NCCCCCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O UVGHPGOONBRLCX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UHDGCWIWMRVCDJ-UHFFFAOYSA-N 1-beta-D-Xylofuranosyl-NH-Cytosine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005160 1H NMR spectroscopy Methods 0.000 description 2
- ALFVYOCDIWKQRY-UHFFFAOYSA-N 2-(3-aminopropyl)propane-1,3-diol Chemical compound NCCCC(CO)CO ALFVYOCDIWKQRY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZJYJEANZJODQAE-UHFFFAOYSA-N 6-aminohexane-1,2-diol Chemical compound NCCCCC(O)CO ZJYJEANZJODQAE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZVEJRZRAUYJYCO-UHFFFAOYSA-N CC1c2ccccc2-c2ccccc12 Chemical compound CC1c2ccccc2-c2ccccc12 ZVEJRZRAUYJYCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UHDGCWIWMRVCDJ-PSQAKQOGSA-N Cytidine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 2
- 235000000638 D-biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011665 D-biotin Substances 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- BAVYZALUXZFZLV-UHFFFAOYSA-N Methylamine Chemical compound NC BAVYZALUXZFZLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 108050008598 Phosphoesterases Proteins 0.000 description 2
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N Uridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 229960002684 aminocaproic acid Drugs 0.000 description 2
- 239000000908 ammonium hydroxide Substances 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 2
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000010549 co-Evaporation Methods 0.000 description 2
- 239000010779 crude oil Substances 0.000 description 2
- UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N cytidine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- JXTHNDFMNIQAHM-UHFFFAOYSA-N dichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)Cl JXTHNDFMNIQAHM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 2
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 2
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 239000003517 fume Substances 0.000 description 2
- 230000005021 gait Effects 0.000 description 2
- 125000004356 hydroxy functional group Chemical group O* 0.000 description 2
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000011140 membrane chromatography Methods 0.000 description 2
- VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N methane Chemical compound C VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002808 molecular sieve Substances 0.000 description 2
- BCNQROVQMOOXOQ-UHFFFAOYSA-N n-(2,3-dihydroxypropyl)-2,2,2-trifluoroacetamide Chemical compound OCC(O)CNC(=O)C(F)(F)F BCNQROVQMOOXOQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000002972 pentoses Chemical class 0.000 description 2
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 description 2
- 235000011056 potassium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 150000003141 primary amines Chemical class 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- WGYKZJWCGVVSQN-UHFFFAOYSA-N propylamine Chemical compound CCCN WGYKZJWCGVVSQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N sodium aluminosilicate Chemical compound [Na+].[Al+3].[O-][Si]([O-])=O.[O-][Si]([O-])=O URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JHJLBTNAGRQEKS-UHFFFAOYSA-M sodium bromide Chemical compound [Na+].[Br-] JHJLBTNAGRQEKS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ISDBYDBAKGWSCA-UHFFFAOYSA-N trimethoxy phosphate Chemical compound COOP(=O)(OOC)OOC ISDBYDBAKGWSCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WVLBCYQITXONBZ-UHFFFAOYSA-N trimethyl phosphate Chemical compound COP(=O)(OC)OC WVLBCYQITXONBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ONDPHDOFVYQSGI-UHFFFAOYSA-N zinc nitrate Chemical compound [Zn+2].[O-][N+]([O-])=O.[O-][N+]([O-])=O ONDPHDOFVYQSGI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UAOUIVVJBYDFKD-XKCDOFEDSA-N (1R,9R,10S,11R,12R,15S,18S,21R)-10,11,21-trihydroxy-8,8-dimethyl-14-methylidene-4-(prop-2-enylamino)-20-oxa-5-thia-3-azahexacyclo[9.7.2.112,15.01,9.02,6.012,18]henicosa-2(6),3-dien-13-one Chemical compound C([C@@H]1[C@@H](O)[C@@]23C(C1=C)=O)C[C@H]2[C@]12C(N=C(NCC=C)S4)=C4CC(C)(C)[C@H]1[C@H](O)[C@]3(O)OC2 UAOUIVVJBYDFKD-XKCDOFEDSA-N 0.000 description 1
- WMSUFWLPZLCIHP-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 9h-fluoren-9-ylmethyl carbonate Chemical compound C12=CC=CC=C2C2=CC=CC=C2C1COC(=O)ON1C(=O)CCC1=O WMSUFWLPZLCIHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HEWZVZIVELJPQZ-UHFFFAOYSA-N 2,2-dimethoxypropane Chemical compound COC(C)(C)OC HEWZVZIVELJPQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003923 2,5-pyrrolediones Chemical class 0.000 description 1
- TVCIOTDUSXIOPM-UHFFFAOYSA-N 2-(9h-fluoren-1-ylmethoxycarbonylamino)acetic acid;1-hydroxypyrrolidine-2,5-dione Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O.C1C2=CC=CC=C2C2=C1C(COC(=O)NCC(=O)O)=CC=C2 TVCIOTDUSXIOPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VCFCFPNRQDANPN-UHFFFAOYSA-N 2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)hexanoic acid Chemical compound C1=CC=C2C(COC(=O)NC(CCCC)C(O)=O)C3=CC=CC=C3C2=C1 VCFCFPNRQDANPN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ARVQIYGIIOWVCP-UHFFFAOYSA-N 2-cyanoethyl dihydrogen phosphite Chemical compound OP(O)OCCC#N ARVQIYGIIOWVCP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 2-deoxy-D-ribose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)CC=O ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 0.000 description 1
- QBWKPGNFQQJGFY-QLFBSQMISA-N 3-[(1r)-1-[(2r,6s)-2,6-dimethylmorpholin-4-yl]ethyl]-n-[6-methyl-3-(1h-pyrazol-4-yl)imidazo[1,2-a]pyrazin-8-yl]-1,2-thiazol-5-amine Chemical compound N1([C@H](C)C2=NSC(NC=3C4=NC=C(N4C=C(C)N=3)C3=CNN=C3)=C2)C[C@H](C)O[C@H](C)C1 QBWKPGNFQQJGFY-QLFBSQMISA-N 0.000 description 1
- CQZIEDXCLQOOEH-UHFFFAOYSA-N 3-bromopropanenitrile Chemical compound BrCCC#N CQZIEDXCLQOOEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PGSPUKDWUHBDKJ-UHFFFAOYSA-N 6,7-dihydro-3h-purin-2-amine Chemical compound C1NC(N)=NC2=C1NC=N2 PGSPUKDWUHBDKJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M Bisulfite Chemical compound OS([O-])=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- AGRABNLFLZOFMK-UHFFFAOYSA-N C(C)(C)N(P(=O)(Cl)[ClH]C)C(C)C Chemical compound C(C)(C)N(P(=O)(Cl)[ClH]C)C(C)C AGRABNLFLZOFMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940123150 Chelating agent Drugs 0.000 description 1
- 229920002101 Chitin Polymers 0.000 description 1
- 241000606153 Chlamydia trachomatis Species 0.000 description 1
- 241000271538 Crotalus durissus Species 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N D-ribofuranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H]1O HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N 0.000 description 1
- AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N Deoxyuridine 5'-triphosphate Chemical class O1[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 1
- 229910004373 HOAc Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000872931 Myoporum sandwicense Species 0.000 description 1
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NFOMHWALMFWNAQ-UHFFFAOYSA-N N-acetoxy-2-acetamidofluorene Chemical compound C1=CC=C2C3=CC=C(N(C(C)=O)OC(=O)C)C=C3CC2=C1 NFOMHWALMFWNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OPFJDXRVMFKJJO-ZHHKINOHSA-N N-{[3-(2-benzamido-4-methyl-1,3-thiazol-5-yl)-pyrazol-5-yl]carbonyl}-G-dR-G-dD-dD-dD-NH2 Chemical compound S1C(C=2NN=C(C=2)C(=O)NCC(=O)N[C@H](CCCN=C(N)N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(N)=O)=C(C)N=C1NC(=O)C1=CC=CC=C1 OPFJDXRVMFKJJO-ZHHKINOHSA-N 0.000 description 1
- 229920002302 Nylon 6,6 Polymers 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 230000006819 RNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N Ribose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 1
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000004809 Teflon Substances 0.000 description 1
- 229920006362 Teflon® Polymers 0.000 description 1
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 1
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 1
- 241000271897 Viperidae Species 0.000 description 1
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 1
- GKVHYBAWZAYQDO-XVFCMESISA-N [[(2r,3s,4r,5r)-3,4-dihydroxy-5-(2-oxo-4-sulfanylidenepyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] phosphono hydrogen phosphate Chemical compound O1[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1N1C(=O)NC(=S)C=C1 GKVHYBAWZAYQDO-XVFCMESISA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 125000003158 alcohol group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 150000003973 alkyl amines Chemical class 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N alpha-D-Furanose-Ribose Natural products OCC1OC(O)C(O)C1O HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 238000005915 ammonolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 125000004104 aryloxy group Chemical group 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 150000001540 azides Chemical class 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N beta-L-uridine Natural products O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 1
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 1
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 229940038705 chlamydia trachomatis Drugs 0.000 description 1
- 238000004040 coloring Methods 0.000 description 1
- 239000012230 colorless oil Substances 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 229940126086 compound 21 Drugs 0.000 description 1
- 229940125846 compound 25 Drugs 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 239000005289 controlled pore glass Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 239000007822 coupling agent Substances 0.000 description 1
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical group NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 229960005215 dichloroacetic acid Drugs 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 229920001971 elastomer Polymers 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000007306 functionalization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical group O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000005179 haloacetyl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 1
- RLIUKKHIBMHFOK-UHFFFAOYSA-N indium sodium Chemical compound [Na].[In] RLIUKKHIBMHFOK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003317 industrial substance Substances 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000003999 initiator Substances 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 1
- 150000002540 isothiocyanates Chemical class 0.000 description 1
- 230000000155 isotopic effect Effects 0.000 description 1
- 238000007885 magnetic separation Methods 0.000 description 1
- 238000003760 magnetic stirring Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 125000004573 morpholin-4-yl group Chemical group N1(CCOCC1)* 0.000 description 1
- VIJMMQUAJQEELS-UHFFFAOYSA-N n,n-bis(ethenyl)ethenamine Chemical compound C=CN(C=C)C=C VIJMMQUAJQEELS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N nitrogen group Chemical group [N] QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 150000004713 phosphodiesters Chemical group 0.000 description 1
- OJMIONKXNSYLSR-UHFFFAOYSA-N phosphorous acid Chemical compound OP(O)O OJMIONKXNSYLSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 229920001467 poly(styrenesulfonates) Polymers 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 125000001436 propyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 239000013014 purified material Substances 0.000 description 1
- 150000003254 radicals Chemical class 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 108020004418 ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000002390 rotary evaporation Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000003345 scintillation counting Methods 0.000 description 1
- 150000003333 secondary alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 238000010008 shearing Methods 0.000 description 1
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 1
- 239000000779 smoke Substances 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 108010051423 streptavidin-agarose Proteins 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N sulfuric acid Substances OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 1
- JOXIMZWYDAKGHI-UHFFFAOYSA-N toluene-4-sulfonic acid Chemical compound CC1=CC=C(S(O)(=O)=O)C=C1 JOXIMZWYDAKGHI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005891 transamination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000005583 trifluoroacetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013638 trimer Substances 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N uracil arabinoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940045145 uridine Drugs 0.000 description 1
- 238000007794 visualization technique Methods 0.000 description 1
- 229920001221 xylan Polymers 0.000 description 1
- 150000004823 xylans Chemical class 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
- C07H21/02—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with ribosyl as saccharide radical
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
- C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
- C07F9/02—Phosphorus compounds
- C07F9/06—Phosphorus compounds without P—C bonds
- C07F9/22—Amides of acids of phosphorus
- C07F9/24—Esteramides
- C07F9/2404—Esteramides the ester moiety containing a substituent or a structure which is considered as characteristic
- C07F9/2408—Esteramides the ester moiety containing a substituent or a structure which is considered as characteristic of hydroxyalkyl compounds
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Confectionery (AREA)
- Transition And Organic Metals Composition Catalysts For Addition Polymerization (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
내용 없음.
Description
[발명의 명칭]
뉴클레오티드 프로브에 대한 비-뉴클레오티드 연결시약
[도면의 간단한 설명]
발명의 구체예를 이제 도면을 참조하여 기술하기로 한다.
제1도는 본 발명의 시약의 제법을 예시하며,
제2도는 본 발명의 또다른 시약의 제법을 예시하며,
제3도는 본 발명의 또다른 시약의 제법을 예시하며,
제4-8도는 본 말명의 또다른 시약의 제법을 예시한다.
[발명의 상세한 설명]
[발명의 분야]
본 발명의 표지 또는 삽입체 같은 부분의 단일로 또는 다중의 뉴클레오티드 프로브에, 그 위의 어떠한 특이적 예비적-선택위치(들)에서도 편리하게 연결될 수 있게 하는 비-뉴클레오티드 시약에 관한 것이다.
[기술 검토]
임상연구에서 및 진단시에, RNA 또는 DNA의 어느 하나의 특정 뉴클레오티드 서열(표적 뉴클레오티드 서열 또는 간단히 표적서열이라함)의 존재를 측정하기 위해 공지되어 있는 가법은 핵산 혼성체 형성 측정을 수행하는 것이다. 그러한 측정법에서, 적어도 표적서열의 일부에 상보하는 뉴클레오티드 서열을 가지는 뉴클레오티드 다량체 프로브(전형적으로는 올리고뉴클레오티드)가 선택된다. 전형적으로, 프로브는 표지된다. 즉, 프로브는 거기에 연결된 원자 또는 기와 함께 제공되어 그 존재가 쉽게 검출될 수 있다. 표지된 프로브가 혼성체형성 조건하에서, 표적 뉴클레오티드 서열을 함유하고 있을 것으로 측정되는 시험샘플에 노출되면, 표적은 그렇게 표지된 어떠한 프로브와 혼성화할 것이다. 샘플중의 표적서열의 존재는 통상 혼성 및 비-혼성 프로브를 분리한 후, 프로브 혼성체중의 표지의 존재를 측정함에 의하여, 또는 비-혼성 프로브중의 표지의 양을 측정함에 의하여 혼성화된 표지프로브의 양을 측정함으로써 정성적으로 또는 정량적으로 측정될 수 있다.
역사적으로 보면 방사성 표지가 사용되어 왔다. 그러나, 취급상의 어려움으로 인하여, 후에 비-동위원소성 표지가 개발 되었다. 그러한 표지로는 직접 또는 간접적으로 그 존재가 측정되는 것들이 있다. 직접 표지의 실례로는 화학발광, 인관(phosphorescent), 형광, 또는 분광학적으로 검출가능한 표지들이 있다. 간접표지의 실례로는 적합한 검축가능 표지에 포함된 단백질에 의하여 검출될 수 있는 비오틴과 각종 항원같은 화합물이 있다.
표지를 뉴클레오티드 프로브에 연결하기 위한 몇가지 선행 방법은 전형적으로 단일 표지를 뉴클레오티드에 연결한 후, 그런 뉴클레오티드중 하나 또는 그 이상을 프로브안에 통합시키는 것을 기초로 하여 왔다. 예를 들어, 비오틴 부분이, 피라미딘 고려의 C-5위치에 부착되어 있는 dUTP와 UTP의 아날로그가 화학적으로 합성되어 폴리뉴클레오티드 안에 효소적으로 톤합되어 왔다(P.R.Langer et al, Proc. Nat. Acad.sic., U.S.A., Vol. 78, p.6633, 1981). 그러한 비오틴 표지 뉴클레오티드는 효소적 과정에 의해 생물학적 또는 합성기원의 핵산 프로브안에 통합될 수 있다. 또한, 전술한 아날로그 5'-알릴아민 전구체가 유사한 방식으로 사용될 수 있는 것으로 제안되었으며, 그것은 통상의 방법을 사용하여 표지에 연결될 수 있는 친핵성 아민부분이 프로브에 통합되도록 유도한다. 다른 삼인산 데옥시뉴클레오티드 아날로그도 프로브안에 효소적으로 통합되어 왔다. 구체적으로, 브로모-dUTP 와 표오도-dUTP가 통합되었고 면역화학적으로 검출도 되었다(Boultwood, J. et al., J. Pathol., Vol. 148, p61, 1986). 또한, 4-티오-UTP(H. Eshaghpour et al., Nucl. Acids Res., Vol, 7, p.1485, 1979)가 DNA 단편의 3'- 끝에 부착되었으며 계속해서 그의 친핵성 술프히드릴 부분이 표지되었다. 첸에 의한 PCT출원(국제공개번호 WO86/00074; 1986년 1월 3일 공개됨)에서는, 피리미딘 염기 뉴클레오티드가 분명히 랜덤하게 탈피리미드화 될 수 있고, 그 결과 형성되는 당고리가 열리게 되어 아민 함유 부분이 거기에 부착할 수 있는 기법을 개시하고 있다.
화학적 표지방법이 또한 제안되어 왔으며, 그 방법은 본질적으로 표지가 뉴클레오티드 다량체중의 약간의 뉴클레오티드에 랜덤하게 연결되는 것을 허용한다. 예를 들어, N-아세톡시-N-아세틸아미노플루오렌이 핵산의 구아닌 잔기에 커플되었고 계속해서 면역화학적 기법에 의하여 검출된 바있다(P. Chen et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, Vol. 81, p.3466, 1984). 표지가 연결될 수 있는 친핵성 아민기를 제공하는 또다른 그러한 방법은 핵산프로브의 시토신 잔기의 C-6위치에서의 중아황상염 촉매 트란스 아민화를 포함한다(R.P.Viscidi et al., J. Clin.Biol., Vol. 23, p.311, 1986). 상술한 화학적 및 효소적 방법에는 단일 뉴클레오티드가 특이적으로 표지될 수 없다거나 또는 과정이 뉴클레오티드 염기상의 고리외 아민을 변형시킴으로써 혼성체 형성을 간섭한다는 문제점이 따른다.
뉴클레오티드 다량체, 전형적으로는 오리고뉴클레오티드의 5' 또는 3' 끝을 오로지 단일 표지만의 부착을 허용하는 다른 기법도 개시되어 왔다. 예를 들어, 그러한 기법은 시. 에프. 추등에 의해 Nucl. Acids. Res, Vol. 11, p.6513(1983)에, 및 에이. 콜세등에 의해 Nucl. Acids Res., Vol.13, p.1529(1985)에 개시되어 있다. 유사한 말단표지화 접근법도 개시되어 있는 바, 그것은 고상 올리고 뉴클레오티드 합성의 최종 단계로서 보다 더 표지부착이 잘된다.(예를 들어, B.A. Connolly, Nucl. Acids Res., Vol. 13, p.4485, 1985; S, Agrawal et al., Nucl. Acids Res., Vol. 14, p.6227, 1986; 및 B.A. Connolly, Nucl. Acids Res., Vol. 15, P.3131, 1987 참조.) 그러나, 이들 말단 표지화 방법은 단지 뉴클레오티드 다량체에 단일-표지만을 부착시키는 것을 허용하는 한정된 것이다.
표준자동 합성과정중에 합성 올리고뉴클레오티드의 선택위치에 일차 아민-변형 뉴틀레오티드 잔기를 삽입하기 위해 사용될 수 있는 화합물이 제안되어 왔다. 그러한 화합물로는 데옥시티미딘, 데옥시데닌, 데옥시구아닌, 및 데옥시디티딘의 아날로그들이 있다(G. B. Dreyer et al., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., Vol. 82, p.968, 1985; J. L. Ruth, PCT출원 공개번호 WO84/03285, 1984.8.30 공개). 이론적으로, 그러한 화합물들로 인하여, 표지된 뉴클레오티드가 서열을 따라 많은 부위에 놓이게 됨으로써 다중 표지를 사용할 수 있어서 검출의 감도를 증가시킬수 있다. 그러나, 프로브중의 그러한 표지 뉴클레오티드의 사용은, 특히 다중표지가 존재하는 경우, 표지서열과 함께 형성된 혼성체의 안정성을 감소 시킬 수 있음이 증명되었다. 그렇게 감소된 혼성체 안정성은 우리딘, 시티딘 또는 아데닌 염기에 부착된 다중 비오틴 부분을 가지고 있는 생물학적 기원의 핵산 프로브의 경우에 나타났다(R.P.Viscidi et al., J. Clin. Microbiol., Vol. 23, p.311, 1986; G. Gebeyehu et al., Nucl. Acids Res., Vol. 15, p.4513, 1987). 그러나, 이들 말단 표지화 방법은 단지 뉴클레오티드 다량체에 단일-표지만을 부착시키는 것을 허용하는 한정된 것이다.
표준자동 합성과정중에 합성 올리고뉴클레오티드의 선택위치에 일차 아민-변형 뉴클레오티드 잔기를 삽입하기 위해 사용될 수 있는 화합물이 제안되어 왔다. 그러한 불안정성은 또한 비오틴과 플루오레신 표지가 시티딘 염기의 N-4위치에 부착되어 있는 합성 올리고뉴클레오티드에 대해서도 입증 될 수 있다. 더욱이, 합성 올리고뉴클레오티드 내의 어떠한 소정 위치(들)에서 표지 또는 표지들을 대치하기 위해서는 전체의 또는 8개의 상이한 화합물(4개는 데옥시리보뉴클레오티드 다량체에 대한 것이고, 4개는 리보뉴클레오티드 다량체에 대한 것이다.)을 가지는 것이 필요하다.
또한, 뉴클레오티드 연결용 인산기의 유도체가 개시되어 있으며, 그것의 친핵성 부분은 올리고뉴클레오티드의 통합후에 표지될 수 있다(R.L. Letsinger and M.E. Schott, J. Am. Chem. Soc. 1981, Vol. 103, p.7394; N.Sugimoto, Japanese Patent Nos. 61 44,353; 61 57,595; 61 44,352, 모두 1986년 3월 발행). 그러나, 그러한 화합물은 뉴클레오티드 유도체를 토대로 하고 있으며, 뉴클레오티드 기저 유도체에 대해 상기 논의된 결점 중 적어도 몇가지를 나타낸다. 나아가, 전술한 설명에 개시된 링커의 실례들은 현재의 표준 고상합성 기법에는, 이들 기법의 변형없이는 사용될 수 없다.
[정의]
본 명세서에서와 특허청구의 범위에서 사용되는 다음과 같이 정의한다 :
뉴클레오티드 : 인산기, 5탄당 및 질소함유 염기로 이루어지는 핵산의 하위단위. RNA에서 5탄당은 리보오스이며, DNA에서는 2-데옥시리보오스이다. 이 용어는 또한 그런 하윈단위의 아날로그를 포함한다.
뉴클레오티드 다량체 : 포스포디에스테르 결합에 의해 연결된 뉴클레오티드 사슬 또는 그의 아날로그.
올리고뉴클레오티드 : 일반적으로 약 10 내지 약 100뉴클레오티드 길이의 뉴클레오티드 다량체. 그러나, 길이가 100뉴클레오티드 보다 클 수도 있다. 이것들은 통상 뉴클레오티드 단량체로부터 합성되는 것으로 생각되지만 효소적 수단에 의해서도 얻어질 수 있다.
데옥시리보올리고뉴클레오티드 : 데옥시리보뉴클레오티드 단량체로 이루어지는 올리고뉴클레오티드.
폴리뉴클레오티드 : 일반적으로 약 100뉴클레오티드 이상 길이의 뉴클레오티드 다량체. 이들은 통상 생물학적 기원의 것이거나 또는 효소적 수단에 의해서 얻어진다.
뉴클레오티드 다량체 프로브 : 제 2뉴클레오티드 다량체, 통상 폴리뉴클레오디트 내에 함유된 표적 뉴클레오티드 서열과 상보하는 뉴클레오티드 서열을 가지는 뉴클레오티드 다량체. 통상 프로브는 표적서열의 대웅 염기에 완전하게 상보하도록 선택된다. 그러나, 어떤 경우에는, 프로브중의 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드가 표적 서열주의대웅 염기에 상보하지 않는 것이 적당하거나 또는 바람직하기조차 하다. 전형적으로 프로브는 표지된다.
비-뉴클레오티드 단량체 단위 : 이 용어는 중합체의 혼성체형성에 그다지 중요하지 않게 포함되는 단량체 단위를 의미한다. 그러한 단량체 단위는, 예를 들어 뉴클레오티드와의 어떠한 중요한 수소결합에 표함되어서는 안되며, 구성성분으로서 5뉴클레오티드연기 또는 그의 아날로그중 어느것을 포함하는 단량체 단위는 배제되어야 한다.
뉴클레오티드-비-뉴클레오티드 중합체 : 뉴클레오티드와 비-뉴클레오티드 단량체 단위로 구성된 중합체. 프로브로 사용되는 경우, 전형적으로, 표지된다.
올리고뉴클레오티드-비-뉴클레오티드 다량체 : 100개미만의 뉴클레오티드를 가지나, 200개를 넘는 뉴클레오티드를 함유할 수 있고 하나 이상의 비-뉴클레오티드 단량체 단위를 함유하는 다량체.
다량체 단위 : 본 발명의 뉴클레오티드 시약 또는 비-뉴클레오티드 시약의 단위로서, 이 시약은 중합체에 기여한다.
혼성체 : 상보염기들간의 왓슨-크릭(Watson-Crick)염기쌍에 의해 두 뉴클레오티드 다량체간에 형성된 복합체.
[발명의 요약]
본 발명은 뉴클레오티드 시약으로부터의 특이적 뉴클레오티드 단량체 단위와 합성에 의해 커플링되어 뉴클레오티드와 비-뉴클레오티드 단량체 단위로 이루어진 골격을 가진 규정된 서열의 중합체를 제조할 수 있는 비-뉴클레오티드 단량체 단위를 가진 비-뉴클레오티드 시약을 제공한다.
상기 비-뉴클레오티드 시약은 또한 일단 링커-아암이 탈보호되면 콘주게이션 반응에 참여할 수 있는 링커-아암인 리간드를 지니거나 아니면 그것은 중합의 합성을 개시하기에 앞서 유용한, 원하는 화학적 부분이 부착된 측-아암이 될 수도 있다. 일반적으로, 일커 아암에 부분들을 연결시키는 기술은 단백질상의 기들에 표지물을 연결시키는 기술과 유사할 것이다. 그러나, 이러한 기술의 수정이 요구될 것이다.
유용한 화학의 예들은 알킬아민의 활성에스테르, 활성아민, 아릴플로오라이드, 또는 이소티오시아네이트와의 반응과, 티올의 말레이미드, 할로아세틸등과의 반응을 포함한다(더 이상의 가능한 기술은 G. M. Means and R.E. Feeney, Chemical Modification of Protelne, Holden-Day Inc., 1971; R.E. Feeney, Int. J. Peptide Protein Res., Vol. 29. 1987, p. 145-161 참조).
중합체의 형성동안에 링커아암 관능기를 보호하는데 사용될 수 있는 적당한 보호기는 단백질 화학에서 사용된 것들과 또한 유사하다(예를들면, The Peptides Analysis Synthesia, Biology, Vol. 3, ed.E.Gross J. Meienhofer, Academic Press, 1971 참조).
비-뉴클레오티드 시약의 화학적 성질로 인해, 골격서열내에 어떤 원하는 위치에도 놓일 수 있다. 이것은 크게 다양한 특성들을 뉴클레오티드 단량체를 함유하는 중합체에 설계하는 것을 가능하게 한다. 이것들은 다음 특성들을 포함한다 : (1) 중합체내 어떤 원하는 위치에 특정 화학적 부분의 부착, 이러한 부분들은(여기에 제한되지는 않으나) 검출가능한 표지물, 삽입제, 킬레이트제, 약제, 호르몬, 단백질, 팹티드, 합텐, 라디칼 발생물질, 핵분해재, 단백질 분해제, 촉매, 수용체 결합물질, 및 기타 생물학적 흥미있는 결합물질, 그리고 생물학적 장벽(막과 같은 것)을 가로지르는 DNA운반 변형체, 그리고 뉴클레오티드 다량체의 용해도를 변경시키는 물질을 포함할 수 있다. 이것은 어떤 원하는 뉴클레오티드에 인접하여 이러한 표지물 및 삽입제를 위치시키는 것이 가능함을 의미한다; (2) 예를 들면, 뉴클레오티드 어피니티 지지체를 제조하기 위해 고체지지체의 화학적 부분에의 결합을 위한 링커-아암을 사용하여 고체지지체에 규정된 서열을 고정시키는 능력; (3) 중합체에 다수의 비-뉴클레오티드 단량체 단위를 포함시킴으로써 링커-아암을 통해 중합체에 다수의 화학적 부분을 부착시키는 능력; (4) 폴리뉴클레오티드에 작용하는 단백질 및 효소와의 활성을 변경시킨 점에서 천연발생 폴리뉴클레오티드와는 다른 중합체를 제조하는 능력, 예를 들면, 순수한 폴리뉴클레오티드의 3' 말단에 비-뉴클레오티드 단량체 단위를 놓는 것은 독사 포스포디에스테라제에 의한 분해에 저항성을 부여한다.
이러한 비-뉴클레오티드 단량체 단위는 다른 뉴클레아제에 대한 특이적 절단부위를 조장할 수 있다; (5) 혼성체 형성가능 뉴클레오티드 단량체 단위와 비-뉴클레오티드 단량체 단위를 군데군데 배치시킴으로써 혼성체 형성 프로브를 제조하는 능력, 예를 들면, 뉴클레오티드와 비-뉴클레오티드 단량체의 혼합된 블록합성이 생성될 수 있고, 이로써 규정된 서열의 뉴클레오티드 단량체와, 이어서 하나 이상의 비-뉴클레오티드 단량체를 단위 확장과 이어서 제2의 규정된 서열 뉴클레오티드 단량체 블록이 합성된다; (6) 하나 이상의 염기쌍이 다른 표적 뉴클레오티드 다량체를 동시에 검출하는 합성프로브를 제조하는 능력. 이것은 여기 기술된 비-뉴클레오티드 시약을 사용하여 여러 표적 뉴클레오티드 다량체의 뉴클레오티드 서열에서 차이가 일어나는 부위에서 비-뉴클레오티드 단량체 단위로 프로브의 뉴클레오티드를 치환함으로써 달성한다.
발명의 바람직한 형태에서, 뉴클레오티드와 비-뉴클레오티드 단량체로 이루어진 규정된 서열을 가진 표지된 혼성체 형성 프로브가 제조된다. 발명의 또다른 바람직한 형태에서, 비-뉴클레오티드 단량체 단위는 2이상의 규정된 서열 뉴클레오티드 다량체를 연결시키는데 사용되는 비-뉴클레오티드 단량체 단위는 혼성체 형성반응에서 사용하기 위해 화학적으로 표지된다.
또다른 바람직한 구체예에서, 비-뉴클레오티드 시약은 현존하는 DNA 합성법중 한가지를 사용하여, 혼합된 뉴클레오티드-비-뉴클레오티드 중합체를 제조하기 위해 그것이 단계적 방식으로 첨가되도록 하는 방식으로 제조된다.
이러한 뉴클레오티드와 비-뉴클레오티드 시약은 보통 단게적 방식으로 첨가하여 고체지지체에 공유결합 고정화된 성장하는 올리고뉴클레오티드 사슬에 해당 단량체 단위를 부착시킨다. 전형적으로, 제1뉴클레오티드는 합성의 개시에 앞서 절단가능 에스테르 결합을 통해 지지체에 부착된다.
올리고뉴클레오티드 사슬의 단게식 확장은 보통 3'에서 5' 방향으로 수행된다.
표준 DNA 및 RNA 합성법은 예를 들면 Synthesis and Application of DNA and RNA ed. S.A. Narang, Acadmic Press, 1987, 과 M.J. Gait, Oligonucleotide Synthesis, IRL press, Wash. D.C. U.S.A., 1984 참조. 합성이 완전할 때, 중합체는 상기한 에스테르결합을 가수분해함으로써 지지체로부터 절단되고 지지체에 원래 부착된 뉴클레오티드는 얻어지는 올리고머의 3'-말단이 된다.
유추하여, 비-뉴클레오티드 단량체 단위를 도입하기 위한 또다른 방법은 그것을 DNA합성의 개시에 앞서 DNA 합성지지체에 마찬가지로 부착시키는 것이다.
바람직한 구체예에서 비-뉴클레오티드 단량체 단위는 유리알코올 형태의 비-뉴클레오티드 단량체를 사용하여 형성된 에스테르 결합을 통해 DNA합성 지지체에 부착된다.
따라서, 본 발명은 뉴틀레오티드와 비-뉴클레오티드 단량체 단위의 혼합물을 함유하는 중합체의 제조방법을 제공한다. 상기 비뉴클레오티드 단량체는 추가로 하나이상의 보호된 링커-아암 또는 표지물 또는 삽입제와 같은 원하는 화학적 부분에 콘주케이트된 하나이상의 링커-아암을 함유한다.
이러한 비-뉴클레오티드 단량체는 추가로 뉴클레오티드와 비-뉴클레오티드 단량체 단위의 중합체에 그것의 단계적 포함을 허용하도록 두 개의 커플링기를 지닌다.
상키 커플링기의 첫번째 것은 단량체 단위의 성장하는 사슬의 말단에 효율적으로 커플링될 수 있는 특성을 갖는다. 상기 커플링기의 두 번째 것은 혼합된 뉴클레오티드와 비-뉴클레오티드 단량체의 성장하는 사슬을 단계적 방식으로 더 확장시킬 수 있다. 이것은 제1커플링기가 커플링되는 동안 제2커플링기는 실질적으로 동시에 커플링되지 않도록 비활성화되는 것을 요하나, 다음에 비-뉴클레오티드 단량체 단위를 커플링하도록 그후 활성화될 수 있다. 비활성화는 바람직하게는 제2커플링기에 대한 보호기로 달성되는데, 이것은 제2커플링기를 활성화하기 위해 제거될 수 있다. 그러나, 이러한 비활성화 및 활성화는 반응조건(예를 들면, pH, 온도, 반은계의 어떤 다른 성분의 농도변경)을 변화시킴으로써, 이러한 기술에 의해 비활성화 및 활성화에 적합한 적당한 화학구조의 두번째 커플링기로 간단히 달성될 수 있는 것은 본 발명의 범위내이다.
상기 커플링기는 뉴클레오티드 또는 비-뉴클레오티드 단량체 단위중 어느 것의 인접 부착을 허용한다. 바람직한 구체예에서 상기 커플링기는 표준 DNA합성법중 한가지와 양립될 수 있는 커플링과 탈보호 단계를 통해 조작된다.
이러한 방법은 합성이 일방향적으로 일어나고 모든 커플링 절단과 탈보호가 불리하지 않은 조건하에서 일어날 것 즉, 그것들은 중합체 골격과 그것의 당, 염기, 링커-아암 및 표지물 성분이나 단량체 시약에도 실질적으로 불리하게 영향을 미치지 않을 것을 요한다. 당업자는 기능화, 커플링법, 탈보호방법 및 이들 평가기준을 충족하는 절단조건을 쉽게 확일할 수 있다(예를 들면, Gait 참고 문헌, 위와 같음 참조),
비-뉴클레오티드 단량체는 바람직하게는 골격을 가지며, 그의 단부에 커플링기가 결합되어 있다. 골격은 바람직하게는 비환식 1 내지 20원자 사슬이며, 바람직하게는 1내지 20 탄소원자의 비환식 탄환수소 사슬이다.
발명의 한구체예에서, 시약은 다음 화합물 I 또는 II중 한가지로부터 선택된다.
I 또는 II 어느 것이 선택되든지, 표지된 기들은 다음과 같다.
(ⅰ) R2=비-뉴클레오티드 골격;
는 제1커플링기로서 X2=할로겐 또는 치환된 아미노, X4=할로겐; 아미노; 또는 O, R3=알킬; 알콕시; 또는 페녹시. R5=알킬; 알콕시 또는 아릴옥시 또는 X4=O 라면 H도 될 수 있다.
(ⅲ) R1-X1-은 보호된 제2커플링기로서, 여기서 X1=O;S;NH; 또는 HN=N- R1=제2커플링기 H-X1-을 회수 하기 위해 커플링기 탈보호 조건하에 절단가능한 보호기;
(ⅳ) n은 정수이고;
(ⅴ) R4-X3-는 리간드이며; 이것은 바람직하게는 관능성 부분으로부터 선택되거나 또는 다음에 관능성 부분과(또한 불리하지 않은 조건하에서) 결합할 수 있도록 불리하지 않은 조건하에서 탈보호 될 수 있는 보호된 연결 아암으로부터 선택된다.
더 바람직하게는 표시된 몇가지 기는 다음과 같다.
X2=C1; 또는 2차 아미노(바람직하게는 디알킬아미노 및 해테로고리 N-아민으로부터 선택된 것)
R3=메톡시; 에톡시; 클로로페녹시; 또는 베타-시아노에톡시
X3-는 O; S;NH; 또는 HN=N-말단이며, 바람직하게는 R2로부터 확장하는 1 내지 25 원자사슬을 가지며, X2는 또한 바람직하게는 디이소프로필아미노, 디메틸아미노, 또는 모르폴리노이다.
R1은 더 바람직하게는 트리페닐메틸(이것은 그의 유도체, 전형적으로 디메톡시트리페닐메틸을 포함하며)이며, X1은 O이다.
R2는 바람직하게는 -O- 에 부착된 2차 탄소를 갖는다. 이것은 합성의 동안에 2차 알코올의 사용을 허용하는데 이것은 알코올로부터 더 높은 수율의 보호된 시약을 제조하는 이점을 갖는다.
뉴클레오티드-비-뉴클레오티드 중합체의 제조방법도 또한 기술된다. 이러한 방법은 비-뉴클레오티드 단량체 단위를 단위를 가진 시약과 거기에 결합된 액체(상기와 같음)을 사용하고 불리하지 않은 조건하에서 제1단량체 단위에, 그리고 제2추가의 단량체 단위 또는 고체지지체중 한가지에 비-뉴클레오티드 단량체 단위를 커플링시키는 것으로 이루어진다.
전술한 추가의 단량체 단위중 적어도 한가지는 뉴클레오티드 단량체 단위이다.
비-뉴클레오티드 시약으로부터 또다른 단량체 단위가 선택된다면 물론 그 단량체 단위를 여전히 또다른 비-뉴클레오티드 단량체 단위에 커플링시키는 것 등등이 가능하다.
전형적으로, 전술한 커플링은 둘다 비-뉴클레오티드 단량체 단위에 결합된 제1커플링기와 보호된 커프링기를 통해 달성된다. 따라서, 비-뉴클레오티드 단량체 단위는 제1커플링기를 통해 제1뉴클레오티드 단량체 단위에 먼저 커플링되고 그 다음 제2커플링기가 탈보호되어 제2뉴클레오티드 또는 또다른 시약의 비-뉴클레오티드 단량체 단위중 한가지에 비-뉴클레오티드 단량체 단위를 커플링시키도록 한다. 이러한 벙법에 사용될 수 있는 시약의 바람직한 화확적 조성은 위에 기재되어 있다.
상기 시약과 방법으로부터 나오는 생성물을 또한 기재한다.
복수의 뉴클레오티드 및 비-뉴클레오티드 단량체 단위와, 전형적으로 표지물로서 제공될, 프로브의 해당 단량체 단위로 연결된 적어도 하나의 아크리디늄 에스테르 표지물 부분으로 이루어지는 중합체 프로브도 또한 개시되어 있다.
바람직하게는 아크리디늄 에스테르 부분은 화학 발광성 아크리디늄 에스테르 표지물이다. 적어도 하나의 이러한 아크리디늄 에스테르 부분은 복수의 뉴클레오티드 단량체 단위를 갖는 중합체의 해당 단량체 단위에 결합시키는 것으로 이루어지는 이러한 프로브의 제조방법도 또한 개시되어 있다.
[발명의 바람직한 구체예의 설명]
본 발명의 세가지 다른 링커시약의 합성을 이하 실시예 1-3에 상세히 기술하기로 한다.
아래의 실시예 4는 올리고뉴클레오티드상에, 여러 가지 특정한 사전지정된 위치에서 커플링된 시약의 골격을 갖는 치환된 뉴클레오티드(특히 올리고뉴클레오티드)를 제조하기 위한 본 발명방법을 예시한다.
실시예 5는 본 발명의 치환된 뉴클레오티드의 연결기에 표지물의 결합을 예시하는 한편, 실시예 6은 본 발명의 치환도니 뉴클레오티드에 의해 제공될 수 있는 더 이상의 이점, 즉 포스포디에스테라제에 의해 촉매 작용되는 가수분해에의 저항성을 예시한다.
실시예1
2-(3-아미노프로필)-1,3-디히드록시프로판 링커시약의 합성.
이 합성의 합성개략도는 제1도에 나타내었으며 아래에 설명한다.
(a) 2-(니트릴로프로필)-디에틸말로네이트(1)의 합성 : 사용된 과정은 알. 아담스와 알. 엠. 카암의 Orga-nic Synthesis 제1권 pp.250-251(Gilman Blatt,eds.)의 방법을 응용하였다.
재료 : 디에틸 말로네이트, 3-브로모프로피오니트릴과 에톡시화 나트륨(에탄올중의 21%용액)은 알드리히케미칼 컴파니(밀워키, WI)에서 구입하였다.
무수에탄올(200proof)은 U.S. 인더스트리얼 케미칼즈에서 구입하였다.
과정 : 에톡시화 나트륨(0.1몰)을 무수에탄올로 최종 부피가 100ml가 되도록 희석시켰다.
무수에탄올 50ml중의 디에틸 말로네이트(0.1몰) 용액을 교반하면서 적가하고, CaCl2건조관으로 반응장치를 수분으로부터 보호하였다. 실온에서 1시간동안 교반시켰다. 그런후에 무수에탄올 50ml중의 3-브로모프로포니트릴 용액을 교반하면서 적가하고, 그 혼합물을 실온에서 하룻밤동안 교반하였다. 결과의 용액을 여과하여 침전된 브롬화나트륨을 제거하고 농축한 후 디에틸에테르(50ml) 속으로 추출하였다. 그런후에, 이용액을 물(50ml)로 추출하고, 무수황산마그네슘으로 건조 시키고, 오일이 될 때까지 농축시켰다.
클로로포름을 이동상으로 하는 실리카판상의 박충 크로마토그래피로써 요오드 증기로 가시화 한후에 3개의 점을 얻었다. : Rf는 0.58, 0.51, 0.38 이고 각각 차례로 디에틸 말로네이트, 2-(니트릴로프로필-디에틸말로네이트, 2,2-디-(니트릴로프로필) 말로네이트로 확인되었다.
냉장고 속에 수일동안 둔후에 조야한 오일로부터 여과하여 결정을 분리해내고 톨루엔(10ml)에 용해시키고 핵산을 카해 재침전시켜 3.28g의 백색결정을 얻었다. (12%의 수득률); 박층 크로마토그래피(상기한 것처럼)에서 Rf는 0.38이었다.
이 화합물의 구조는1HNMR(CDCl3)로 2,2-디-(니트릴로프로필) 말로네이트(6) 임을 확인하였다 : δD 1.30(t, 6H), 2.26(t, 4H), 2.47(p, 4H), 4.27(p, 4H).
여과된 오일을 진공하에서 증류하여 (b.p.99-103℃, 0.3mmHg) 20%의 수득률로 목적 화합물(1)을 얻었다; CDCL3중의1HNMR분석; 1δ 1.24(t, 6H), 2.19(q, 2H), 2.47(t, 2H), 3.46(t, 1H), 4.18(q, 4H).
(b) 2- (3-아미노프로필)-1,3- 디히드록시프로판(20)의 합성.
재료 : 파트(1)에 나열된 것외에 수소화 리튬 알루미늄(디에틸에테르 중의 1.0M 용액)을 알드리히 화인케미칼즈(밀워티, 위스콘신)에서 구입하였다.
과정 : 무수디에틸테르(50ml) 중의 2- (3-니트릴로프로필)-디에틸 말로네이트(1, 3.21g, 15.1mmol)를 질소하에서 수소화 리튬 알루미늄(100ml 디에틸에테르중의 0.1몰)의 교반되는 용액에 적가하였다. 결과의 혼합물을 두시간동안 환류하고 나서 실온에서 하룻밤동안 교반하였다. 그런후에 물(100ml)중의 수산화나트륨 2.5mM 용액을 서서히 가하여 반응하지 않은 수소화 물을 급냉시켰다.
이 혼합물을 두시간동안 교반하고 에테르층을 따라내어 버렸다.(생성물은 수층에 남아 있다) 백색의 젤라탄상 고형물을 원심분리하여 수층으로 제거하여 물로 씻어내고 수성상층액과 씻은 물을 합하여 진공하에서 시럽이 될 때까지 휘발시켰다.
박층 크로마토그래피(아날테크 리버어스-상 판이고 물이 이동상이고 닌히드린 시약으로 가시화됨)로 목적 화합물(2)로 확인된 주점인 Rf 0.48과 부산물의 농축에 기인한 부점인 Rf 0.29를 얻었다. 제목의 화합물(2)을 양이온 교환 크로마토크래피(Dowex 50X8, 0.5M HCL 이동상)로써 50%의 총 수득률로 정제하였다.1HNMR분석(D2o) : δ 1.36(외견상 4중선, 2H), 1.68(m, 3H), 2.97(t, 2H), 3.57(d, 4H).
(c) 2-(3-N-트리플루오로아세틸아미노프로필)-1,3-디히드록시프로판(3)의 합성 : 과정은 여기에 참고로 한 Methods in Enzymology 11권 p.317의 R.F. Goldfinger의 방법을 응용하였다.
재료 : (상기한 것외에도) S-에틸트리플루오로티오아세테이트를 알드리히화인 케미칼즈(밀워키, 위스콘신)에서 구입하였다.
과정 : 2-(3-N-아미노프로필)-2,3-디히록시프로판(2)(3mmol)을 물(25ml)에 용해시켰다.
6N HCI을 적가하여 용액의 pH를 9.5까지 낮추었다. 다음의 반응은 후드속에서 수행하였다 : S-에틸트리플루오로티오아세테이트(2ml)를 격렬하게 교반시키는 용액에 적가하였다 : 6N KOH를 적가하여 pH를 935와 10.1사이로 유지하였다. 30분후에 S-에틸트리플루오로티오아세테이트를 몇 밀리리터 더 가하고 pH를 상기한 것처럼 유지하였다. 다음에 6N KOH를 사용하여 pH를 7로 조정하고 혼합물을 진공하에서 회전증발시켜 건조할 때까지 농축하였다. 잔류물을 아세톤(20ml)으로 스월링(swirling)하고 여과하여 아세트산 칼륨 침전물을 제거하였다. 여과물을 시럽이 될 때까지 농축시키고 아세톤(2ml)에 재용해시킨 후 실리카겔(평균입자 직경이 40㎛ 이고, J.T. Baker Cheminal Cl.(필립스 버그, 뉴어저어지, 미국)에서 구입함) 40g을 합유한 플래쉬 크로마토그래피 컬럼에 가하였다. 컬럼을 염화메틸렌/아세톤의 50 : 50용액(v/v)(500ml)으로 25ml분획씩 취하면서 용출하였다.
실리카겔 판에 2㎕의 분취량을 떨어뜨리고 물중의 10% 피레리딘을 분무한 후 15분동안 방치하고나서 히트 전(heat gun)으로 건조시키고 닌히드린 시약으로 처리하여 분획을 생성물 함량에 대해 분석하였다. 피페리딘 분무처리를 하지 않으면 일차 아민의 트리플루오로아세틸화를 확인할 수 있는, 닌히드린과의 착색반응이 일어나지 못한다. 이 과정을 사용하여 분획 13과 18사이에서 생성물을 찾아내었다; 이 분획을 모아 회전증발시켜 농측하여 Rf가 0.4(상기한 것과 같은 용매 시스템과 가시화방법을 사용한 실리카겔 박층 크로마토그래피)인 무색의 오일을 얻었다.
(d) 1-0-(디메톡시트리틸)-2-(3-N-트리플루오로아세틸아미노프로필-1,3-디히드록시프로판(4)의 합성 :
재료 : (상기한 것외에도) 염화 디메톡시트리틸을 알드리히 화인 케미칼즈(밀워키, WI, USA)에서 구입하였다. 염화메틸렌을 CaH2에 대해 환류하고 증류시켜 4옹스트롬(4A) 분자체에 저장하였다. 피리딘을 수산화 칼륨 펠릿과 p-술폰산톨루엔으로 증류하여 건조한 질소하에서 저장하였다.
과정 : 2-(3-N-트리플루오로아세틸아미노프로필)-1.3-디히드록시프로판(3)(362mg, 1.58mmol)을 감압하에서 건조한 피리딘으로 수회 증발하여 건조시킨 후 완전 진공하에서 수시간동안 더 건조시켰다. 잔류물을 건조한 질소하에서 건조한 피리딘 10㎖에 용해시켰다. 건조한 염화메틸렌(1.5㎖)중의 염화 디메톡시트리틸(401mg, 1.18mmol)을 교반하면서 가하고, 결과의 용액을 실온에서 한시간동안 교반하였다. 용매를 감압하에서 제거하고 잔류물을 클로로프름(50ml)에 용해시켰다. 이 용액을 물중의 5% 중탄산 나트륨으로 3회 추출하고 나서 무수 황산 마그네슘으로 건조시켰다. 결과의 용액을 오일이 될때까지 농축시키고 2ml의 클로로포름에 재용해 시킨후 클로로포름/아세트산에틸/피리딘(95:5:0.2 v/v/v)를 이동상으로 사용하는 것을 제외하고는 상기한 것과 같은 플래시 크로마토그래피로 분류하였다. 분획을 같은 용매시스템을 사용하여 실리카판상의 박충 크로마토그래피로 분석하였다.
HCI 발연(fume)으로 가시화한 Rf값이 0.27, 0.87, 0.93인 점들은 각각 1-(디메톡시트리틸) 생성물(4), 디메톡시트리탄올과 1,3-디-(디메톡시트리틸)부산물로 확인되었다. 후자의 물질은 물로 포화된 염화메틸렌중의 4% 디클로로아세트산 혼합물과 흔들어 섞어 목적 화합물(4)로 가수분해될 수 있었다. 용매를 적당한 분획으로부터 휘발시켜 생성물(40을 분리해내고 완전 진공하에서 건조시켜 포옴(370mg, 44%)을 얻었다.
(e) 1-0-(디메톡시트리틸)-2-(3-N-트리플루오로아세틸아미노프로필)-3-0-(메틸-N,N-디이소프로필-포스포아미도)-1,3-디히드록시프로판(5)의 합성 :
재료 : (상기한 것외에)N,N : 디이소프로필에틸아민과 N,N-디이소프로필메틸포스포아미딕 클로라이드를 알드리히 케미칼 컴파니(밀워키, WI USA)에서 구입하였다. 디메틸포름아미드를 CaH로 환류하고 증류한후 4A 분자체에 저장하였다.
과정 : 1-0-(디메톡시트리틸)-2-(3-N-트리플루오로아세틸아미노프로필)-3-0-디히드록시프로판(4,300mg, 0.56mmol)을 건조한 피리딘으로 수회 증발하여 건조시키고 10ml의 건조한 디메틸포름아미드에 용해시켰다. 다음의 반응은 건조한 질소하에서 수행하였다. N,N-디이소프로필에틸아민(245㎕;l, 0.7mmol)을 가하였다. 반응혼합물을 두시간동안 교반하였다. 그런후에 혼합물을 감압하에서 농축시키고 염화메틸렌(50ml)에 용해 시켰다. 이 용액을 5%의 중탄산나트륨 수용액으로 3회 추출한 후 무수 황산 마그네슘으로 건조시키고, 감압하에서 오일이 될 때까지 농축시켰다. 개시물질(4)이 해당하는 포스포아미다이트(5)로 변한 것은31P NMR(CDCl3, 트리메틸 포스페이트, 외부표준)로 확인하였다 : δ; 147.9 순도는 70%이상이었다.
실시예 2
2,2-디-(3-아미노프로필)-1,3-디히드록시프로판 연결시약의 합성.
이 실시예는 다중표지 부착용의 2개의 아미노프로필 링커를 가진 합성 올리고뉴클레오티드의 포스포디에스테르 골격에 통합시키기 위한 단량체로 이루어진다. 합성원리는 제2도에 나타내었다.
제료 : 특별히 표시할 때만 제외하고는 실시예 1에 나타낸 것과 같은 재료이다.
(a) 2,2-디-(3-아미노프로필)-1,3-디히드록시프로판(7)의 합성:
다음의 과정은 상기한 실시예 1(b)의 방법을 응용한 것에 대한 간단한 설명이다.
실시예 1(a)에서 설명한 합성인 2,2-디-(니트릴로프로필)-디에틸 말로네이트(6)(2.00g, 7.51mmol)을 무수 디에틸에테르(80ml)에 용해시켰다. 결과의 용액을 디에틸에테르(100ml)중의 수소화 리튬알루미늄(0.1mmol)의 교반되는 용액에 적가하였다. 15분후에 혼합물을 2시간동안 환류가열하고 나서 실온에서 하룻밤동안 교반하였다. 조야한 생성물의 생성과 회수는 상기한 실시예 1(b)에서 처럼 수행하였다. 실시예1(b)에서 설명한 것과 같은 박층 크로마토그래피로 주점(Rf 약 0.2)을 얻었다.
(b) 2,2-디-(3-트리플루오로아세틸아미노프로필)-1,3-디히드록시프로판(8)의 합성
2,2-디-(3-아미노프로필)-1,3-디히드록시프로판(7)(3.7mmol)을 물(25ml)에 용해시키고 6N HCL로 pH를 약 10으로 조정하였다. S-에틸트리플루오로티오아세테이트(1.0ml)를 격렬하게 교반하면서 가하고 6N KOH를 적가하여 pH를 9.5와 10사이로 유지하였다. 마찬가지로 두번더 1.0ml의 S-에틸트리플루오로티오아세테이트를 30분 간격으로 가하였다. 혼합물을 진공하에서 오일이 될 때까지 농축시키고 아세톤(30ml)에 용해시켰다. 침전된 아세트산 칼륨을 여과하여 제거하였다. 생성물(8)을 염화메틸렌/아세톤(50 : 50 v/v) 이동상을 사용하여 실시예 1(c)에서 설명한 것처럼 실리카겔 플래쉬 크로마토그래피로 정제하였다. 정제된 물질은 같은 용매시스템을 사용하여 실리카겔 박층 크로마토그래피로 단일한 점(Rf 0.7)을 나타내었다 : 실시예1(c)에서 처럼 피페리딘으로 처리한후 닌히드린으로 처리하여 가시화하였다. 수득률은 510mg(1.48mmol)이었다.
(c) 1-0-(디메톡시트리틸)-2,2-디-(3-트리플루오로아세틸아미노프로필)-1,3-디히드록시프로판(9)의 합성:
2,2-디-(3-트리플루오로아세틸아미노프로필)-1,3-디히드록시프로판(8)(510mg, 1.48mmol)을 진공하에서 건조한 피리딘으로 수회 증발시켜 건조한 후 질소하에서 건조한 피리딘 5ml에 용해시켰다. 건조한 염화메틸렌중의 디메톡시트리틸 클로라이드(376mg, 1.11mmol)를 질소하에서 교반하면서 가하고, 그 혼합물을 한시간동안 교반하였다. 혼합물을 농축하고 클로로포름(50ml)에 용해시켰다. 이 용액을 표화된 중탄산나트륨 수용액으로 3회 추출하고 진공하에서 오일이 될 때까지 농축하였다. 그런후에 오일을 2ml의 클로로포름에 용해시키고 클로로포름/아세트산에틸/피리딘(80:20:0.2 v/v/v)를 사용하여 상기한 것처럼 실리카겔 플래시 크로마토그래피로 분류하였다. 생성물(9)을 같은 용매시스템을 사용하고 HCI발연으로 가시화하여 실리카겔 박층 크로마토그래피로 확인하였다.(Rf 0.3) : 감압하에서 농축하고 완전 전공하에서 건조시켜 담황색 포옴(517mg, 52%)을 얻었다.
(d)1-0-(디메톡시트리틸)-2,2-디-(3-트리플루오로아세틸아미노프로필) -3,0-(메틸-N,N-디이소프로필포스포아미도)-1,3-디히드록시프로판(10)의 합성:
과정 : 1-0-(디메톡시트리틸)-2,2-디-(3-트리플루오로아세틸아미노프로필)-1,3-디히드록시프로판(0)(136mg, 0.2mmol)을 건조한 피리딘(3ml)으로 3회 증발하여 건조시켰다. 결과의 잔류물을 아르곤하에서 건조한 염화메틸렌(1.5ml)에 용해시키고 N,N-디이소프로필에틸아민(175㎕ 1.0mmol)을 교반하면서 가하였다. 그런후에 N,N-디이소프로필메틸포스포아미딕 클로라이드(80㎕, 0.4mmol)를 가하고 반응물을 1시간동안 교반하였다. 결과의 혼합물을 아세트산 에틸/트리에틸아민(98.2)(50ml)으로 회석시키고 포화된 중탄산나트륨 수용액(25ml)으로 두 번 추출하였다. 유기층을 무수 MgSO4로 건조시키고 오일이 될 때까지 농축시켰다.(240ml) 포스포아미다이트(10)로 바뀐 것은31p NMR(cdcl3 트리메톡시 포스페페이트, 외부표준)로 확인하였다 : δ145.5. 순도는 60%이상이었다.
실시예3
3-아미노-1,2-프로판에디올 기저 링커시약의 합성.
합성은 제3도에 그려져 있으며 아래에서 설명하였다.
(a) 3-(트리플루오로아세틸아미노)-1,2-프로판디올(11)의 합성.
재표 : 3-아미노-1,2-프로판에디올과 S-에틸트리플루오로티오아세테이트를 알드리히 케미칼 컴파티(밀워키, WI USA)에서 구입하였다.
과정 : S-에틸트리플루오로티오아세테이트(5.13ml, 45mmol)를 3-아미노-1,2-프로판에디올(2.32ml, 30mmol)과 아세트산에틸(5.0ml)의 혼합물에 신속히 교반하면서 가하였다. 몇분후, 혼합물은 균질화되었다. 한시간후에 반응용액을 석유에테르(100ml)와 흔들어 섞어 오일을 얻고, 그것을 분리하여 진공하에서 농축하였다.
이 물질을 아세트산에틸/염화메틸렌(2.1)을 이동상으로 사용하여 실리카판상의 박층 크로마토그래피로 분석하였다. 판을 먼저 닌히드린 시약으로 가시화하는데 그것은 원점에서 반응하지 않은 미량의 아민 출발물질을 나타내었다. 다음에 10%의 피페리딘 수용액을 분무하여 가시화하고 히트 건(heat gun)으로 건조하고 나서 닌히드린 시약으로 처리하였다. 후자의 경우에 95%이상의 물질로 이루어지는 것으로 평가되는 주점이 나타났다.(Rf 0.28) 주점(11)과 관련된 물질의 정제는 예비 스케일의 박층 크로마토그래피로 행해졌다.
(b) 3-(트리플루오로아세틸아미노)-1-0-(디메톡시트리틸)-1,2-프로판디올(12)의 합성.
재료와 일반적인 과정은 앞의 실시예 1(d)에 기술되어 있다.
3-(트리플루오로아세틸아미노)-1,2-디히드록시프로판(11)(1.87ml,10mmol)을 감압하에서 건조 피리미딘(10ml)으로 3회 공증발시킴으로써 건조시켰다. 그리고나서 이 물질을 건조 피리미딘(10ml)에 용해시켰다. 그 다음에 건조 피리미딘(10ml)중의 염화 디메톡시트리틸(3.73g, 11mmol). 용액을 질소하에서 교반하면서 적가하였다. 약 1시간후에 메탄올(0.2ml)을 첨가하였다. 결과용액을 에틸아세테이트(80ml)로 희석하고 포화수성탄산수소나트륨(30ml)으로 2번, 물(29ml)로 2번 추출하였다.
유기층을 무수 황산마그네슘상에서 건조시키고 감압하에서 농축시켜 6g의 원유를 산출해 내었다. 1.1g의 원물질을 위해 기술한 바와 같이 염화메틸렌/에틸아세테이트/피리딘(10:1:0.01 v/v/v)을 사용하는 실리카겔 플래시 크로마토그래피에 의해 분별하였다. 실리카겔 플레이트 위에서 동일한 용매시스템을 사용하여 얇은 막 크로마토그래피함으로써 분획을 분석하였다. HCI 증기로 반점이 보이게 되는데 2개의 적은 성분이 Rf 값 0.94 와 0.87로 나타나고 주성분은 Rf 0.53의 값으로 나타나며 이것들은 각각 1,2-디=(디메톡시트리틸)쪽 생성물, 디메톡시트리탄올, 그리고 예상했던 생성물(12)로 확인되었다. 위에 기술한 대로의 얇은 막 크로마토그래피에 의해 Rf 값 0.53을 가지는 분획을 모아 증류시켜서 0.72g 의 (12)를 얻었고1H NMR에 의해 그 구조를 확인하였다. (12)의 전반적 수율은 플래시컬럼의 수율을 기초로 하여 80%였다.
(c) 3-(트리플루오로아세틸아미노)-1-0-(디메톡시트리틸)-2-0-(메틸-N,N-디이소프로필포스포르아미도)-1,2-프로판디올(13)의 합성.
본 합성을 위한 시료들은 위의 실시예 1에 주어져 있다.
디이소프로필에틸아민(348㎕ 2mmol)을 함유하는 건조한 염화메틸렌(1.5ml)에 3-(트리플루오로아세틸아미노)-1-0-(디메톡시트리틸-1,2-프로판디올(12)(196mg, 0.4mmol)을 용해시켰다. 아르곤(argon) 하에서 N,N-디이소프로필메틸포스포르아미딕 클로라이드(200;l, 1mmol)를 교반하면서 적가하였다. 한시한 후 트리에틸아민을 1% 함유하는 에틸아세테이트를 가하고(50ml), 그 결과용액을 포화수성 탄산수소나트륨으로 세번 추출하였다. 유기층을 무수 황산마그네슘 위에서 건조시키고 감압하에서 농축시켜 오일(oil)이 되도록했다. 이 물질의 순도는31P NMR(CD3CD, 트리메톡시 인산, 외적표준) : δ147.5에서 의해 95%보다 높게 평가되었다.
톨루엔/핵산 혼합물 안에서 이 물질을 결정화시키려는 시도는 성공적이지 못했다; 그러므로 미정제샘플을 직접 링커 첨가에 대해 사용하였다.
실시예3(a)
결합시약에 근거한 6-아미노-1,2-헥산디올의 합성.
본 합성을 제4도에 도시하고 아래에 기술하였다.
(a) 1,2-(이소프로필리딘)-1,2,6-트리히드록시헥산(14)의 합성.
재료 : 1,2,6-트리히드록시헥산과 1,2,6-디메톡시프로판을 Aldrich Chemical Co. (milwaukee, WI, USA..)로 부터 구입하였다.
과정 : 1,2,6-트리히드록시헥산(1.00g, 7.45mmol)과 건조 아세톤(10ml), 농축황산(300;l)을 자기교반막대를 따라서 50ml 둥근바닥 플라스크에 가했다. 습기를 제거하기 위해 플라스크를 질소로 세척하고 고무격막을 부착하였다.
그 다음에 30분에 걸쳐서 2,2-디메콕시프로판(3.00ml, 24.2mmol)을 교반용에 주사하여 서서히 첨가하였다. 2시간동안 교반을 계속하였다.
반응을 소멸시키기 위하여 무수탄산나트륨(150mg)을 가하고 내용물들을 하룻밤동안 교반하였다. 마지막으로 용액을 여과하고 진공하에서 농축시켜서 담황색의 시럽(1.6g)을 산출하였다. 이 물질을 정제시키지 않고 다음 단계에서 사용하였다.
(b) 1,2-(이소프로필리딘)-6-(p-톨루엔술포닐)-1,2,6-트리히드록시헥산(15)의 합성.
재료 : p-톨루엔술포닐 클로라이드를 Aldrich Chemical Co.(Milwaukee. WI USA)로부터 구입하였다.
과정 : 앞단계(14)에서의 이소프로필리딘화된 미정제물질(대략 7.45mmol)을 건조 아세톤(15ml)에 용해시켰다. 그다음에 p-톨루엔술포닐 클로라이드(2.8g, 14.9mmol)와 건조 피리딘(5ml)을 가하고 습기를 제거한 상태에서 그 내용을 실온에서 3시간 동안 교반하였다.
그리고나서 진공하에서 용매를 제거하고 그 잔류물을 메틸렌 클로라이드(25ml)사이에 분배하고 무수 황산나트륨 위에서 건조시키고 여과시키고 나서 진공하에서 농축시켜서 결정형 고체(15,2.8g)을 얻었다.
위에서 설명한 바와 같이 이동상으로서 클로로포름을 사용하는 실리카겔 플래쉬 크로마토그래피로 미정제 생성물을 정제하였다. 동일한 용매를 사용하여 형광 실리카겔 플래이트상에서의 얇은 박 크로마토그래피에 의해 분획을 분석하였다. 스포트를 자외선 램프하에서 육안으로 보았고 생성물(R, 0.50) 함유분획을 모아서 진공농축하여 전체수율 9639%로 오일(15, 2.37g)을 얻었다.
(c) 1,2-(이소프로필리딘)-6-아지도-1,2-디히드록시헥산(16) 합성.
과정 : 전단게로부터의 토실레이트(15, 2.37g, 7.22mmol)를 건조 디메틸 포름아미드(30ml)에 녹였다. 아지화나트륨(1.64g, 25.2mmol)을 자기 교반 막대를 따라 첨가하고 환류 콘덴서와 CaCl2건조튜브를 부착하였다. 그런 다음 혼합물을 60-65℃의 수조에서 3시간동안 교반하였다. 교반을 밤새 실온에서 계속하였다. 그런 다음 원심분리로 침전을 제거하고 그 결과의 용액을 대략 5ml의 최종 부피로 진공 농축하였다. 농축된 용액을 클로로포름(50ml)과 물(15ml) 사이에 분배하였다. 유기층을 물(15ml)로 추가로 세척하고 무수 MgSO4상에서 건조시켰으며 여과하고 암버오일(16)로 진공농축하였다. 그런 다음 미정제 생성물을 더 이상 정제하지 않고 다음 단계에서 사용하였다.
(d) 6-아미노-1,2-디히드록시헥산(17) 합성.
재료 : 디에틸에테르중의 리튬 알루미늄 하이드라이드(1.0M)용액을 알드리히 케미칼 컴패니(Milwaukee. WI, USA)로부터 구입하였다.
과정 : 무수 디에틸에테르(10ml)와 디에틸에테르(15ml)중의 리튬 알루미늄 하이드라이드(1.0M)용액을 아르곤 대기하에 250ml 둥근바닥 플라스크에 첨가하였다. 전단계에서 얻어진 무수 디에틸에테르(25ml) 중에 미정제 아지드(16, 약 7mmol)를 적하 깔때기를 통해 교반하면서 아르곤하에 첨가하였다. 첨가가 완료된 후 혼합액을 아르곤하에 교반하였다. 첨가가 완료된 후, 혼합액을 환류하에 90분동안 교반하였다. 그 결과 형성된 슬러리를 디에틸에테르(25ml)로 희석하고, 다음의 용액을 교반하면서, 기재된 순서대로 첨가하였다 : 물(1ml), 5N NaOH(1ml) 그리고 물(1ml) 그런 다음 혼합액을 배지 글래스 필터를 통해 여과하였다. 여과액을 실온에서 증류에 의해, 그리고 그 다음에 고진공에서의 증류에 의해 농축하여 담황색 오일을 얻었다. 다음에, 물(10.8ml)과 88% 포름산(14.2ml)을 첨가하였다. 결과의 혼합물을 실온에서 하룻밤 방치한 후 70-75℃에서 2시간 동안 가열하였다. 용액을 시럽이 될 때까지 진공하에서 농축시키고 그것을 물(50ml)에 용해시킨후 AG 50W-X8수지(H형태, 50ml 베드부피, Bio-Rad Labs, Richmond, CA, USA)를 함유한 양이온 교환 칼럼에 가했다. 컬럼을 1N HCI 용출하였다. 아민생성물을 함유한 분획은 실리카겔 TLC 판에 점을 찍고 닌히드린 시약으로 분무하고 상기한 것처럼 가열하여 가시화하였다. 생성물을 함유한 분획을 모아 진공하에서 시럽이 될 때까지 농축하고 그것을 메탄올로 공증발시켜 담황색 침상 결정을 얻었다.(17, 염산염으로서)
(e) 6-N-(9-플루오레닐메톡시카르보닐)-아미노-1,2-디히드록시프로판(18)의 합성.
재료 : 9-플루오레닐메틸숙신이미딜 카르보네이트(Fmoc-NHS)를 Bachem, Inc (Torrance, CA USA)에서 구입하였다.
과정 : 6-아미노-1,2-디히드록시헥산 히드로클로라이드(17)을 전단계에서 얻은 수득률에 따른 양으로 물(10ml)에 용해시키고 5N NaOH로 최종 pH가 8.7이 되도록 조정하였다. 중탄산나트륨(588mg, 7mmol), Fmoc-NHS(2.76g 7mmol)과 아세톤(10ml)을 가하였다. 현탁액을 실온에서 하룻밤동안 교반하였고 그후에 모든 Fmoc-NHS가 용액이 되었다. 반응혼합물을 진공하에서 농축하여 아세톤을 제거하였다. 1N HCl(50ml)와 아세트산 에틸(150ml)을 가하고 그 혼합물을 분액 깔대기에 뎄겼다. 유기층을 분리해내고 0.1N HCl(50ml)로 씻고 물(2×50ml)로 씻었다. 그런후에 유기층을 무수 MgSO4로 건조시킨 후 여과하고 오일이 될 때까지 농축하였다. 생성물을 클로로프름/아세톤(50 : 50)을 이동상으로 하여 상기한 것처럼 실리카겔 플래쉬 크로마토그래리로 정제하였다. 분획은 같은 용매시스템을 사용하여 형광 실리카겔 판상을 박층 크로마토그래피로 분석하였다. 점은 자외선 램프아래에서 가시화하였다. 생성물을 함유한 분획(R,0.25)을 모아 휘발시켜 백색결정성 고체를 얻었다.(18, 1.20g)총수득률은 1,2,6-트리히드록시헥산 개시제의 양을 기준으로할 때 45%였다.
(f) 1-0-(디메톡시트리틸)-6-N-(플루오레닐메톡시카르보닐)-6-아미노-1,2-디히드록헥산의 합성.
과정 : 전단계의 생성물(18, 0.5g, 1.41mmols)을 건조한 피리딘으로 곤등발시키고(3×3ml)아르곤하에서 건조한 피리딘(8ml)에 용해시켰다. 건조한 염화메틸렌(2ml)중의 디메톡시트리틸 클로라이드(0.5736g, 1.69mmols)의 용액을 수분간격으로 교반하면서 주사기로 가하였다.
실온에서 2시간동안 교반을 계속하고나서 메탄올(100㎕)을 가하여 반응을 중지시켰다. 용매를 진공하에서 제거하고 잔류물을 클로로포름(100ml)에 용해시켰다. 얻어진 용액을 분리 깔때기로 옮겨서 포화된 수성중탄산나트륨(3×20ml)에 이어 3M NaCl(20ml)로 세척하였다. 무수 MgSO4위에서 유기층을 건조하고 여과한 후 진공하에서 오일로 농축하였다. 생성물을 염화메틸렌/아세트산에틸/트리에틸아민(95 : 5 : 0.5)용매계를 사용하여 상기와 같이 실리카겔 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 분획물을 같은 용매를 사용하여 실리카겔 플레이트상에 박층 크로마토그래피에 의해 분석하고 플레이트를 HCℓ증기에 쐬여 스포트를 가시화하였다. 생성물(19, R, 0.35)을 함유한 분획물을 모아서 진공에서 증발시킴으로써 기포를 형성하였다(910mg, 이론수율100%).
(g) 1-0-(디메톡시트리틸)-6-N-(플루오레닐메톡시카르보닐)-2-0-(메틸-N,N-디이소프로필포스포르아미도)-6-아미노-1,2-디히드록시헥산(20).
재료 : 재료는 상기 실시예에 기재되어 있다.
과정 : N,N-디이소프로필-메톡시포스피닐 클로라이드(102㎕, 0.513mmol)를 고반용액 19(225mg, 0.34mmol) 및 건조 염화메틸렌(3ml)중의 N,N-디이소프로필에틸아민(236㎕, 1.36mmol)에 아르곤 분위기하에서 적가하였다. 90분후, 반응혼합물을 2% 트리에틸렌아민 (50ml)을 함유하는 아세트산에틸로 희석하고 포화된 수성 중탄산나트륨(2×25ml)으로 세척하였다. 유기층을 무수 MgSO4위에서 건조하고 여과한 후 진공에서 건조 될 때까지 증발시켰다. 잔류물을 톨루엔(2ml)에 용해시키고 -20℃에서 페트롤리움 에테르에 신속히 교반하면서 적가하였다. 얻어진 혼합물을 -20℃에서 16시간동안 저장하였다.이어서 실온으로 가온한 후 상징액을 기울여 따랐다. 침점물(20)을 진공에서 건조하였다. : 수율=160mg(58%수율).이 물질의 순도는 염화메틸렌/아세트산 에틸/트리에틸아민(10 : 1 : 0.1)용매계를 사용해서 실리카겔 플레이트상에서 박층 크로마토그래피를 하고 자외선 하에서 가시화하여 증명하였다.(R, 0.9, 출발물질 0.25의 R과 비교).
실시예 3(a)에 기재된 링커시약의 연장된 유사물이 발생하였다. 이들 유사물의 구조는 제5도에 표시된다(21-24). 이들 유사물의 제조는 다음 실시예에 기재된다.
실시예3(b)
3-N-(글리시딜)-아미노-1,2-프로판디올 기저 링커 시약(21)의 제조.
이 합성의 스킴은 제6도에 요약되어 있다.
(a)3-N [B-(플루오레닐메톡시카르보닐- 글리시딜] -아미노-1,2-프로판디올(25)의 합성.
재료 : N-(플루오레닐메톡시카르보닐)-글리신-N-히드록시숙신이미드(Fmoc-글리신-NHS)를 바켐, 인코오퍼레이티드(Torrance,CA,USA)로부터 구입하였다. 다른 시약은 상기와 동일하였다.
과정 : 3-아미노-1,2-프로판디올(91mg, 1mmol)을 아세톤 7(ml)중의 Fmoc-글리신-NHS(394mg, 1mmol)의 용액에 첨가하였다. 이 용액에 물(5ml)중의 중탄산나트륨(84mg, 1mmol) 용액을 첨가하였다. 반응혼압액을 실온에서 16시간동안 교반하였다. 실리카겔 플레이트를 사용하여 얇은 층 크로마토그래피를 하였고 염화메틸렌/ 메탄올/아세트산(20:2-0.1)용매시스템으로 반응이 완료되었음을 알았다. 생성물(25)가 침전으로서 플라스크에 나타났으며 그것을 여과제거하여 진공하에 P2O5상에서 2일 동안 건조시켰다. 수율은 310mg이었다(84%)
(b) 1-0-(디메톡시트리털)-3'-N-[N-(풀루오레닐메톡시카르보닐)-글리시딜]-아미노-1,2-프로판디올(26)의 합성.
재료 : 재료는 앞의 실시예에 기재된 것과 같다.
과정 : 화합물 25(185mg, 0.5mmol)를 건조 피리딘(3×3ml)과의 공증발에 의해 건조시켰다. 그런다음 그것을 건조 피리딘(3ml)에 녹이고 염화메틸렌/피리딘(4ml)의 1:1 혼합물중의 염화 디메톡시트리틱(222mg, 0.57mmol)용액에 고반하면서 적가하였다. 교반을 1.5시간동안 계속하고, 반응을 염화메틸렌/메탄올(8:1)용매 시스템을 사용하여 실리카겔 얇은 층 크로마토그래피에 의해 모니터하였다. 반응액을 메탄올(0.2ml)의 첨가에 의해 순간 냉가시키고; 교반을 10분 동안 계속 하였다. 피리딘을 진공증발시켰다. 그 잔류물을 염화메틸렌(150ml)에 녹이고 포화 중탄산 나트륨 수용액으로 세척한 후(2×50ml), 물(50ml)로 세척하였다. 무수MgSO4상에 건조시킨 후, 염화메틸렌 용액을 진공하에서 건조상태까지 증발시켰다. 그 잔류물을 상술한바와 같은 방법에 따라 0.1% 피리딘 함유 염화메틸렌/에틸 아세테이트(11:5)용매 시스템을 사용하여 실리카겔 플래쉬 크로마토그래피로 정제하였다. 생성물 함유 분획을 상술한 바와 같이, 실리카겔 얇은 충 크로마토그래피로 확인하였다. 이들 분획을 모아서 건조상태까지 증발시켜 250mg의 26을 얻었다(75% 수율).
(c) 1-0-(디메톡시트리털)-2-0-[N,N-디이소프로필아미노-메톡시포스핀아미도]-3-N-[N-(풀루오레닐메톡시카르보닐)-글리시딜]-아미노-1,2-프로판디올(21)의 합성.
재료 : 재료는 앞의 실시예와 동일하다.
과정 : 합성물 21(235mg, 0.35mmol)을 건조 피리딘으로 공증발에 의하여 건조시켰다(2×3ml, 그런 다음 그 화합물을 건조 염화메틸렌(2ml)에 녹이고 N,N-디이소프로필에틸아민(244;l, 0.53mmol)을 아르곤 대기하에 교반하면서 적가하였다. 염화메틸렌/에틸아세테이트/트리에틸아민(10:5:0.5)용매 시스템을 사용하여 실리카겔 얇은 층 크로마토그래피에 의해 반응이 20분후에 완료되었음을 알았다. 그런 다음 반응 혼합액을 표화 수성 중탄산 나트륨이 있는 에틸로 희석하였다(2×25ml), 무수 MgSO4상에서 건조시킨 후에 아세테이트 층을 진공발시켰다. 그 잔류물을 에틸아세테이트(3ml)에 녹이고 -25℃에서 헥산(150ml)에 부었다. 침전을 여과하여 진공 건조시켜서 210mg의 21을 얻었다(72%).31P-NMR(CDCl3, 트리메틸포스페이트에 비례한 ppm으로): 147.5(d), 또한 1H-NMR 분석으로 구조를 확인하였다.
실시예 3(c)
3-N-(4-아미노부티릴)-아미노-1,2-프로판디올과 3-N-(6-아미노카프로일)-아미노-1,2-프로판 디올 기저 링커 시약(22,23)의 합성.
이 실시예에 독특한 합성의 단계를 제7도에 도시하고 아래에 기술한다.
(a) 4-아미노부티르산과 6-아미노카프로산의 N-플루오레니메콕시카르보닐 보호된 형태(N-Fomc-6-아미노 카프로산, (28)의 합성.
재료 : 4-아미노부티르산과 6-아미노카프로산을 알드리히 케미칼 컴패니(Milwaukee, MI, USA)로부터 구입하였다. Fmoc-NHS는 실시예 3(a)에서 설명한 것과 동일하다.
과정 : 이들 합성을 에이.피켓(A, Paquae) 방법 (Can.J.Chem, 1982. 60. 976)에 기재된 바와 같이 실행하였다.
(b) N-Fomc-4-아미노부티르산과 N-Fomc-6-아미노카프로산중 어느하나와 3-아미노-1,2-프로판디올의 커플링.
재료 : 트리메틸아세틸 클로라이드를 알디리히 케미컬사(Milwaukee, WI, USA)로부터 구입하였으며, 다른 재료들은 상기 전술 실시예에 기재되어 있다.
과정 : 혼합물 27과 28중 어느하나 (1mmol)와 건조 테트라히드로푸란(3ml)와 공증발하여 건조시켰다. 그다음 잔류물을 건조디메틸 포름아미드(3ml)와 건조 테트라히드로푸란(3ml)의 혼합물에 용해시켰다. 결과 생성용액을 얼음욕에서 냉각시켰으며 N,N-디이소프로필에틸아민(1mmol)을 첨가한 다음 교반하면서 트리메틸아세틸 클로라이드(1mmol)을 천천히 첨가하였다. 교반을 45분 동안 얼음욕에서 계속하였다. 그다음 건조 디메틀포름아미드 내의 3-아미노-1,2-프로판디올(1.2mmol)용액을 첨가하였으며 결과 생성혼합물을 실온으로 따뜻하게 한다음 1시간동안 교반하였다. 반응을 메틸렌 클로라이드/메탄올/아세트산(10:1:0.1)용제 시스템을 사용하는 실리카겔 얇은 층 크로마토그래피로 모니터하였다. 이 분석을 기초로하여 반응을 약 90%완결까지 진행하도록 측정하였다. 그다음 반응혼합물 진공하에서 농축시켰으며 에틸 아세테이트(100ml)로 희석하여 분리깔때기로 옮겼다. 유기용액을 포화 수성 아탄산나트륨(2×50ml)와 물로 수세하였다. 무수 MgSO4상에서 건조한 후 유기층을 건조 증발시켰다. 보통 결과생성물은 95%이상의 순도를 지니도록 측정하여 더 이상의 정제없이 후속단계에 사용한다. 그러나, 정체가 필요한 경우에 메틸렌 클로라이드/메탄을(40:1)용제 시스템을 사용하는 상술한 과정에서 기술한 바와 같이 실리카겔 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 화합물 28 및 29의 순도를1H-NMR분석에 의해 확인하였다.
(c) 28 및 29의 1-O-디메톡시트리틸레이션.
이 분석을 위한 재료 및 과정은 실시예 3(b), 파트(b)에 기재한 바와 같았으며 이들 재료의 순도는 H-NMR에 의해 확인하였다.
(d) 상기 파트(c)에 언급된 화합물을 대응하는 2-O-(N,N-디이소-프로필메틸)-포스포 라미다이트(22) 및 (23)로 전환.
이 합성을 위한 재료 및 과정은 실시예 3(b), 파트(c)에 기재한 바와 같았으며 생성물 22 및 23의 순도는31P-NMR에 의해 확인하였다.
실시예 3(d)
3-N-(6-아미노카프로일)-아미노-1,2-프로판디올 기저 링커시약의 더 연장된 아날로그의 합성.
이 분석의 유일한 단계를 제8도에 도식적으로 도시하며 아래에 기재한다.
(a) 1-O-(디아모톡시트리틸)-3-N-(6-아미노카프로일)-아미노-1,2-디히드록시프로판(31)의 합성.
재료 : 화합물 30을 실시예 3(c)에 기재된 바와 같이 준비하였다.
과정 : 화합물 30(0.89g, 1.1mmol)을 밤새 실온에서 농축된 수산화 암모늄(10ml) 및 피리딘(10ml)과 함께 가암모니아 분해하였다. 반응액의 분취량을 실리카겔 TLC판상에 스포트하고 닌히드린 시약으로 처리하여 1차 아민의 보호기 탈락을 조사하였다. 그다음 반응 혼합물을 진공하에 건조시켰으며 결과 생성한 반응 잔류물(30)을 정제하기 않고 후속단계에서 사용하였다.
(b) 화합물(31)과 화합물(28)의 커플링.
재료 : 화합물 28을 실시예 3(c), 파트(a)에 기재된 과정에 따라 합성하였다.
과정 : N-Fmoc-아미노카프로산(28, 1.1mmol)을 상술한 실시예 3(c), 파트(b)에 기재된 과정에 따라 트리메틸아세틸 클로라이드(1.1mmol)과 반응시켰다. 그다음 건조 디메틸포름아미드내의 화합물 30(1.1mmol)용액을, 다시 실시예 3(c), 파트(b)의 과정에 따라 첨가하였다. 결과 생성부 가물 32을 클로로포름/메탄올(30:1) 용제 시스템을 사용하여 상술 실시예에 기술된 바와 같이 실리카겔 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 생성물 수율은 250mg(23%)이었다.
(c) 화합물 32의 대응 2-O-(N,N-디이소프로필아미노)-메톡시포스포라미다이트(24)로의 전환.
과정 : 방법을 실시예 3(b), 파트(c)에 상술한 것과 본질적으로 동일하게 하였다. 그래서, 화합물 32(240mg, 0.285mmol)을 N,N-디이소프로필에킬아민(198㎕ 1.14mmol)을 함유하는 건조 메틸렌클로라이드(3ml) 내의 N,N-디이소프로필아미노-클로로메톡시포스틴(73㎕ 0.371mmol)과 반응시켰다. 반응을 에틸아세테이트(50ml)내의 2%트리에틸아민과 그것을 희석하고 포화수성 중탄산나트륨(25ml) 과 물(25ml)로 추출하여 진행시켰다. 결과생성 유기층을 무수 황산나트륨상에 건조시키고 여과시킨 다음 증발시켰다. 잔류물을 에틸 아세테이트의 수㎕에 용해시켜서 상술한 실시예에 기재된 바와 같이 헥산(150ml)으로 침전시켰다.
화합물 32의 수율은 200mg이었으며, 그 순도를1H- 및32P-NMR 분광기로 확인하였다.
실시예 4
2-(3-아미노프로필)-1,3-디히드록시프로판 기저 링커의 합성 올리고뉴클레오티드로의 자동부착.
실시예 1에 기재된 링커시약(이후 L1으로 표시됨)의 여러 합성 올리고뉴클레오티드로의 부착을 지금부터 기술한다.
(a) L1 시약을 데옥시올리고뉴클레오티드의 5'-말단에 커플링시켰다. 서열 5'-GCTCGTTGCGGGACTAACCCAACAT-3'을 갖는 데옥시올리고뉴클레오티드를 표준 포스포라미다이트 화학을 사용하는 어플라이드 바이오 시스템사 모델 380A DNA 합성기로 조절된 기공 유리지지체 상에서 합성하였다.
5'-디메톡시 트리틸기를 제거하고 건조 아세토니트릴내의 L1(0.1M)용액을 표준 커플링 사이틀을 이용하여 2회 커플링시켰다. L1의 제1 및 제2부가의 커플링 백분율을 각 커플링 사이클의 끝에 해체된 디메톡시트리틸의 498nm에서의 흡광도를 측정함으로써 전길이 데옥시 올리고뉴클레오티드의 양에 비례하여 정하였다; 이들 값을 각각 29% 및 42%가 되도록 결정하였다.
5'-(L1)- 및 5'-(L1)-(L1)-올리고뉴클레오티드를 7M 우레아를 함유하는 20% 폴리아크릴 아미드겔상의 겔 전기영동에 의해 정제하였다. 대응때를 UV 투영에 의해 눈에 보이게 하였으며 대응 부가 뉴트레오티드 간격의 것보다 약 1.5배의 간격을 가진 겔상에 보다 천천히 이동하는 것으로 평가되었다. 이들 띠를 잘라서 링커 변성된 데옥시 올리고뉴클레오티드를 회수하여 표준 방법론으로 정제시켰다.
(b) L1 시약을 데옥시올리고뉴클레오티드의 3'-말단에 커플링시켰다. 이 분석을 위해 테플론 산화성 고형지지체를 사용하였다.(분자 바이오 시스템스사, 샌디에고, CA, USA, 카타로그 #OSS-01) 데옥시올리고뉴클레오티드가 이 지지체로부터 쪼개져서 제1커플링 사이클동안 사용된 화합물은 3'-말단 포스페이트기와 함께 3'-말단에 남아 있다.
건조 아세토니트릴 내의 L1(0.2M)용액을 어플라이드 바이오시스템스사, 모델 380A DNA 합성기 상의 표준 포스포라미다이트 화학의 3커플링 사이클을 사용하여 이 지지체에 커플링시켰다.
다음에 바로 위의 파트(a)에 기제된 것과 동일한 데옥시 올리고뉴클레오티드 서열을 동일한 커플링화학을 사용하여 첨가하였다. L1 시약과의 초기 커플링 백분율 각각 제1, 제2, 제3 커플링에 대해 40%,63%,63%가 되도록 상술한 바와 같이 결정하였다. 결과생성 삼합체로부터 말단 디메톡시트리틸기의 제거에 뒤이어, 4(a)에서와 동일한 서열을 갖는 데옥시 올리고뉴클레오티드를 표준 포스포라미다이트 화학을 사용하여 부착시켰다. 그다음 지지물질을 합성기로부터 제거하여서 16시간동안 55℃에서 농축수산화 암모늄으로 처리하였다. 다음에 지지체를 물로 3회 수세하여 실온에서 2.5시간동안 20mM 인산나트륨 완충제(pH7.4) 내의 50mM NaIO4로 처리하였다. 마지막으로 지지체를 물로 수회 수세하여 3시간동안 55℃에서 n-프로필아민의 10% 수용액으로 처리하였다. 결과 생성용액을 7M 우레아를 함유하는 20% 폴리아크릴아미드겔에 가하여 전기영동시켰다.
대응 3'-(L1)-(L1)-(L1) 데옥시올리고뉴클레오티드를 상술한 바와 같이 회수하였다.
(c)L1을 서열 5'-AAATAACGAACCCTTGCAGGTCCTTTCAACTTTGAT-3을 갖는 데옥시올리고뉴클레오티드의 3'-말단에 커플링시켰다.
합성의 방법은 파트(b)에 기재된 것과 동일하였고, 단, 바이오서취모델 8750 DNA 합성기를 사용하였다.
(d) L1을 서열 5'-CAGTCAAACTCTAGCCATTACCTGCTAAAGTCATTT-3'을 가지는 데옥시올리고뉴클레오티드의 3'-끝에 커플시켰다.
다시, 파트(b) 기재의 방법을 사용하였다. 단, 합성의 자동부분을 바이오서취 모델 8750 DNA 합성기상에서 수행하였다.
(e) 뉴클레오티드 염기 사이에 삽입된 2-(3-아미노프로필-1,3-디히드록시프로판 링커(L1)를 함유하는 합성 데옥시올리고뉴클레오티드 프로브의 혼성체형상 및 용융온도(Tm).
재료 : 33-량체 데옥시올리고뉴클레오티드 프로브의 2개의 L1-유도체를 상술한 것과 유사한 방법으로 합성하였다 : L1-삽입은 뉴클레오티드 잔기 21과 22(번호는 5'-끝에서부터 시작함) 사이에 삽입된 L1을 가지고 있다: L1-삽입 은 뉴클레오티드 잔기 21과 22(번호는 5'-끝에서부터 시작함) 사이에 삽입된 L1을 가지고 있다; L1-대치는 잔기 21에 대한 대치로서 뉴클레오티드 잔기 20과 22 사이에 L1을 가지고 있다. 두가지 프로브는 클라미디아 트라코마티스로부터의 리보좀 RNA(표적 tRNA)에 상보하는 서열을 가진다. 프로브를 젠-프로우브 인코오페레이티드에서 개발한 표준 프로토콜에 의해125I로 표지하였다.
히드록시 아페타이트(HAP)는 베링 다이아스노스틱, 칼바이오켐 디비젼(La Jolla,CA)으로부터의 것을; 도데실 황산 나트륨(SDS), 인사나트륨(단일 및 2염기성 염) 및 염산은 피셔 사이언티픽 코오퍼레이션으로 부터 구입한 시약급을 ; 베타겔(액체 신틸레이션 칵테일)은 웨스트컴(San Diego, CA)으로부터의 것을 사용하였다. 모든 다른 재료도 시약급이었다. 조작은 다른 언급이 없는 한 1.5ml 스크류-캡 폴리프로필렌 에펜도르프 튜브에서 행하였다.
혼성체 형성을 다음과 같이 수행하였다 : 48㎕ 의 1N 인산나트륨(pH 6.8), 10㎕의125I 표지 프로브(약200,000 CPM), 29.5㎕의 물, 및 2.5㎕의 무르 및 2.5㎕의 rRNA 용액(0.5㎍, VYWJR) 또는 2.5㎕의 물(대조표준)을 혼합하여 60℃에서 1시간동안 배양하였다. 다음에 10㎕의 액을 1ml의 0.12M 인산나트륨(pH 6.8)/0.02% SDS/0.02% 아지화나트륨 1ml로 희석하여 5초동안 와류시켰다. 희석된 액을 실온에서 80℃로 가열한 수조에서 배양한 후 특정온도에서 액은 버리고 얼음상에 보관하였다. 그런다음 샘플을 0.12M 인산나트륨(pH6.8)/0.02% SDS/0.02% 아지화나트륨 평형화하여 놓은 히드록시 아페타이트의 작은 컬럼을 통과시키고, 용출액을 표준과정을 사용한 신틸레이션에 의해 카운트하였다.(컬럼에 결합된 채로 남아있는 카운트의 퍼센트는 혼성된 프로브에 해당된다.)
Tm값을 그 온도에서 처음 형성된 혼성체의 50%가 열변성되어 단일 스트란드 종으로 되는 온도로서 곗간하였다.
이 결과는 두가지 프로브가 기대했던 바와 같이 표적 rRNA에 혼성 되었음을 의미하고, 삽임 프로브의 Tm이 대치프로브에 대한 것보다 약 3℃높은 것보다 약 3℃높은 것으로 나타났다.
실시예 5
비오틴과 플루오레신으로 표지될 수 있는 L1 변형 데옥시올리고뉴클레오티드의 능력을 측정하였다.
(a) 상기 실시예 4(a)에서 기재된 5'-(L1)- 및 5'-(L1)-(11)-변형 데옥시올리고뉴클레오티드들(5'-L1-GCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACAT-3' 및 5'-L1-GCTCGTTGCCCCACTTAACCCAACAT-3')을 P-32로 표지하였다.
재료 : 알파-32P 아데노신 트리포스페이트를 뉴 잉글랜드 뉴클리어(DuPont, Boston, NA, USA)로부터 구입하였다. 말단 데옥시뉴클레오티드 트란스퍼라제(TdT)와 5X 테일링 완충액은 베데스다 리서취 래보레이토리스(Gaithersburg, MD, USA)의 제품이었다.
20pmol의 5'-(L1)-(L1)-변형 데옥시올리고뉴클레오티드를 20㎕의 1X 테일링 완충액중의 16.5pmol의 알파-P-32 아데노신 트리포스페이트(비중 3000 Ci/mmol)와 40유니트의 TdT와 37℃에서 1시간동안 반응시켰다. 그 결과 형성된 P-32 표지 올리고뉴클레오티드를 넨소오브-20(TM) 컬럼(New England Nuclear, Dupont Corp., Boston MA, USA)의 제품이었다.
20pmol의 5'-(L1)-(L1)-변형 데옥시올리고뉴클레오티드를 2-㎕의 1X 테일링 완충약중 16.5pmol의 알파-P-32 아데노신 트리포스페이트(비중 3000 Ci/mmol)와 40유니트의 TdT와 37℃에서 1시간동안 반응 시켰다. 그 결과 형성된 P-32 표지 올리고뉴클레오티드를 넨소오브-20(TM) 컬럼(New England Nuclear, Dupont Corp., Boston MA, USA)상에서 제작자의 과정을 따라 정제하였다(본원에 참고로 삽입됨).
(b) P-32 표지'-(L1)-(L1)-올리고뉴클레오티드를 비오티-E-아미노카프로산 N-히드록신숙시이미드(Bio-X-NHS, 칼바이오켐-베링 코오퍼레이션, San Diego, CA, USA)와 반응시켰다.
스트렙트아비딘-아가로스는 베데스다 리서취 래보레이토리스(Gaithersburg, MD, USA)로부터, 그리고 D(+) 비오틴은 칼바이오켐-베링 코오퍼레이션(San Diego, CA, USA)으로부터 구입하였다.
상술한 각 변형 올리고뉴클레오티드를 1pmol씩 12.5% 디메틸술폭시드함유 125mM 붕산염 완충액(pH9)중의 2.5mM Bio-X-NHS와 1.5시간동안 반응시켰다. 결과반응 혼합액의 소량 액을 취하여 0.2mg/ml D(+) 비오틴의 존해하에 (비특이적 결합)또는 부재하에 (특이적 결합) 50mM 인산나트륨(pH7.4)/2mM EDTA/0.5NaCl 중에서 스트랩트아비딘-아가로스에의 결합에 대하여 시험하였다. 결합된 물질을 신틸레이션 카운팅으로 정량하였다 :
이들 L1-변형 올리고머에 대한 비오틴의 부착을 또한 상기 반응 혼합액의 액을 20% 폴리아크릴아미드/7M 우레아 겔상에서 전기영동함으로써 확인하였다. 대표적인 밴드를 자동방사선사진으로 확인하였고, 그것은 거의 비오티닐화 형태로 정량 전환되었음을 의미하며, 그것은 비-비오티닐화 대조표준보다 더 느리게 이동하였다.
(c) 실시예 4(d,d)에 기재된 3'-L1-수정 데옥시올리고뉴클레오티드.
(%-AAATAACGAACCCTTGCAGGTCCTTTCAACTTTGAT-L1-3' 및 5'-CAGTCAAACTCTAGCCATTACCTGCTAAAGTCATTT-L1-3')를 각각 플루오레신 아소티오시아네이트 및 비오틴 -X- NHS로 표지하였다. 올리고뉴클레오티드를 먼저 막삼 및 길버트(Maxam and Gilbert; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1977, Vol. 74, p.560)의 방법에 따라 T4-폴리뉴클레오티드 카나제(Kinase)를 사용하여 [gamma-32P]아데노신 삼인산으로 활성화(Kinased) 시켰다. 상기 문헌을 참고로 제출한다.
제1수정 올리고뉴클레오티드를 플루오레신 이소티오시네이트와 반응시켰다(FITC, Sigma Chemical co., St. Louis, Mo, USA). 이 올리고머 40pmol을 90% DMSO를 함유하는 0.1M 붕산염 완충액에서 90mM FITC로 12시간 동안 처리하였다. 반응 혼합물을 20% 폴리아크릴아미드/7M 우레아 겔상에서 전기영동 하였다. 오토라디오그래피에 의해 밴드(띠)가 나타났다. 각 줄의 최상 밴드를 잘라내어 올리고머로 표지된 FITC를 겔로부터 회수·정제하였다.
고형물 지지체로 유도된 항-FITC 항체에 대한 결합분석을 사용하여 플루오레신이 상기 올리고뉴클레오티드에 부착된 것을 확인하였다. 항-FITC 자기성 미세구를 어드밴스트 마그네틱스 인코포레이트드(Adbanced Magnetics, Inc.;Cambridge, Ma. USA), Cat #4310으로부터 구입하였다. 정제된32P 표지된, FITC 수정 올리고뉴클레오티드의 알리큇(aliquot)을 가수분해된 FITC 20mM의 존재(비특이적 결합)하에 또한 부존재(특이적 결합)하에 항-FITC 미세구 20㎕를 함유하는 완충액(50mM 인산나트륨, pH7.4/2mM EDTA/0.5M NaCl)0.5ml와 혼합하였다. 1시간후 자성분리에 의해 미세구를 제거하고 상징액을 체렌코프(Ceren kov)라디에이션에 의해 계수하여 결합물질의 양을 측정하였다.
비특이적 결합 퍼센트 : 0.1%
특이적 결합 퍼센트 : 80.2%
제2변형 올리고뉴클레오티드를 비오틴-X-NHS와 반응시켰다. 이 올리고머의 40pmol을 20%DMSO를 함유하는 0.1M 붕산염 완충액(pH9)에서 1시간 동안 10mM 비오틴-X-NHA로 처리하였다. 얻어진 비오틴화된 소량체를 상기 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 정제하였다. 이 올리고뉴클레오티드에 부착된 비오틴의 존재는 이 실시예에서 상기 문헌에 기재된 스트랩트아비딘-아가로스상에서 결합분석에 의해 확인되었다.
비특이적 결합 퍼센트 : 0.3%
특이적 결합 퍼센트 : 87.4%
실시예 6
포스포리에스테라제의 의해 촉매되는 가수분해에 대한 3'-L1-수정 데옥시뉴클레오티드 저항성.
재료 : Crotalusdurissus로 부터의 포스포디에스테라제를 Boehringer Mannheim Biochemicals(인디아나 폴리스 안디아나, 미합중국)로부터 구입하였다. 이 효소는 올리고뉴클레오티드의 3'-말단으로부터 액소뉴 클레올리틱 분해를 촉매한다.
5'-AAATAACGAACCCTTGCAGGTCCTTTCAACTTTGAT-3 서열을 가지는 합성 데옥시뉴클레오티드를 표준 포스포르아미다이트 화학을 이용하여 Applied Biosystem Model 380A DNA Synthesizer상에서 합성하였다. 같은 서열을 가지며 3'-L1링커가 부착된 프로브를 실시예 4에 주어진 방법에 따라 합성하였다.
두 올리고뉴클레오티드를 실시예 5에 언급된 방법에 따라32p로 활성화시켰다. 각각의 표지된 올리고뉴클레오티드 약 350,000 CPM을, 포스포디에스테라제 각각 3×10-5, 또는 3×10-6단위를 포함하는 10μl의 완충액(0.1M Tris-Hcl, pH8.0/20mM Mgcl2)에서 반응시켰다. 5분, 10분, 15분 및 30분 시간 간격으로 1.5μl 알리큇을 제거하였다. 0.1N NaOH 3μl를 첨가하여 반응물을 퀸치하였다. 이어서 브로모테닐 블루 및 크실란을 XCFF다이를 함유하는 90%포름아미드 5μl를 각 알리큇에 첨가하고 얻어진 샘플을 20% 폴리아크릴아미드/7M 우레아 겔상에서 전기영동 하였다. 오토라디오그래피로 겔을 분석하였다.
3'-L1 수정 뉴클레오티드는 시험효소의 양쪽 농도로써 30분 후의 포스포리에스테라제 촉매 가수분해에 대한 저향성이 95%이상인 것으로 나타났다. 길이 전체가 수정되지 않은 올리고뉴클레오티드는 겔 상에서 사실상 발견되지 않았으나 효소는 정상적으로 3'-L1기 없이 올리고머를 분할 한 것을 지시하였다.
실시예7
합성 올리고뉴클레오티드 내로의 2,2-디-(3-아미노프로필)-1,3-디히드록기프로판 기저 링커시약의 자동배합.
실시예 2에 기재된 링커시약(이하 L2로 약칭함)의 배합은 서열 5'-CGTT
ACTCGGATGCCCAAAT(L2)ATCGCCACATTCG-3'을 발생하는 합성 올리고뉴클레오티드의 염기 사이에 삽입되었다.
실시예 4(a)에 기재된 마지막 커플링 사이클과는 달리 L2 용액(아세토니트릴중의 0.1M)을 13번째 커플링 사이클에서 반응시킨 것을 제외하고는 실시예 1(a)에 기재된 방법과 유사한 방법을 사용하었다. L2와의 커플링 효율은 방출된 디메톡시트리틸의 양으로부터 측정한 것과 같은 약 30%였다(실시예 4(a)참조).
실시예8
합성 올리고뉴클레오티드 내로 링커시약의 자동배합.
5'-CCCGCACGTCCCTATT(L3)AATCATTACGATGG-3' 서열을 가지는 합성 올리고뉴클레오티드내로 이 링커 (이하 L3로 약칭함)를 배합하는 것은 실시예 4(a)에 제시된 방법에 따라 시행하였다. 이 실시예에서 L3 용액(건조 아세토니트릴중의 0.3M)을 14번째 커플링 사이클에서 반응시켰다. 이 단계에서 커플링 효율은 디메톡시트리틸 방출로부터 약 60%로 측정되었다.
실시예8(a)
합성 올리고뉴클레오티드 내로 링커시약 20,21,22,23 및 24의 자동배합.
링커시약 20-24(그 합성은 상기 실시예 3(a)에 기재되어 있다.)의 배합은 실시예 4, 파트(a)에 기재된 것과 같이 시행되었다. 이들 시약과 관련된 대웅 링커를 이하에서 각각 L4, L5, L6, L7 및 L8으로 지칭한다. 상기 시약의 하나를 사용하는 것에 대응하는 특정예로써, 건조 아세토니트릴중의 0.12-0.2M시약 용액을 Applied Bio Systems Model 380A DNA Synthesizer(포스터 시티, 캘리포니아, 미합중국)의 위치 #6에 가하였다. 올리고뉴클레오티드 중합체 내로의 시약의 배합은 표준 포스포르아미다이트 커플링 프로트콜을 이용하여 이루어졌다. 염기 길이 17내지 35범위에서 서열내의 여러위치에 삽입된 각 링커 L4-L8로 일련의 올리고뉴클레오티드를 제조하였다. 커플링 사이클의 끝에서 트리틸 방출에 의해 측정된 대로, 이들 시약과 관련된 커플링 효율은 75% 내지 98%였다.
실시예 9
아크리디늄 에스테르로 아민 링커-아암프로브의 표지 및 후속 정제.
아크리딘 에스테르의 25mM 원액(그 조성에 대해서는 I.Weeks et al., Clin. Chem., Vol.29, p.147, 1983)을 증류 DMSO에서 제조하였다. 실시예 4,7 또는 8(a)에서 제조된 중합체의 소망량을 1.5ml 원추형 폴리프로필렌 튜브에서 건도될 때까지 증발시켰다. 순서대로 수록된 다음 성분을 가하여 다음 칵테일을 구성하였다.
3㎕ H20
1㎕ 1M HEPES(8.0)
4㎕ DMSO(증류)
DMSO(증류) 중에서 25mM 아크리딘 에스테르 2㎕
혼합물을 와류시키고 마이크로 원심분리기에서 2초간 회전(내용물을 튜브의 바닥으로 가게 하기 위함)시킨 후 37℃에서 20분간 배양하였다. 그 시점에서 다음 성분을 순서대로 수록된 반응 칵테일에 첨가하였다.
DMSO(증류) 중의 25mM 아크리딘 에스테르3.0㎕
1.5㎕ H2O
0.5㎕ 1M HEPES(8.0)
칵테일을 다시 와류, 회전시키고 37℃에서 추가적으로 20분간 배양하였다. 0.1M HEPES(8.0), 50% DMSO에서 0.125M리신(lysine) 5㎕를 첨가하여 5배과량의 리신을 이용하여 미반응 표지를 퀀치하고 실온에서 5분간 배양하였다.
이 시점에서 아크리디늄 에스테르-표지 올리고머를 다음 방법을 이용하여 정제하였다. 퀀치된 반응혼합물 20μl에 3M NaOAc(5.0) 30μl, H2O 245μl 및 글리코겐 5μl를 캐리어로서 첨가하였다(글리코겐은 전처리하여 모든 뉴클레아제 활성을 제거하였다). 샘플을 짧게 와류시키고 무수에탄올을 가하였다. 샘플을 짧게 와류시키고 얼음에서 5-10분동안 배양한 후 마이크로 원심분리기에서 15,000rpm으로 5분동안 원심분리하였다. 상징액을 조심스럽게 제거하고 펠렛을 0.1M NaOAc(5.0), 0.1% SDS 20μl에 재용해시켰다. 샘플을 다음과 같이 이온교환 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의해 더 정제하였다. 재용해된 펠렛 20㎕를 IBM 9533 HPLC시스템에 장착된 Nucleogen-DEAE 60-7 ion-exchange HPLC columm:에 주입하였다.이과정에서 사용된 모든 완충액은 HPLC 등급물, 아세토니트릴(CH3CN) 및 아세트산나트륨(NaOAc)과 시약등급 아세트산(HOAc) 및 LiCl로 만들었다. 또한 모든 완충액은 사용전에 0.45㎕ 기공크기 Nylon-66 필터를 통해여과하였다. 26단량체 단위 전체를 가지는 뉴클레오티드/비-뉴클레오티드 멀티머로서 그중 하나만이 비-뉴클레오티드 단량체 단위인 특별한 경우에 다음의 용리 프로토콜을 채용하였다. 완충액 A는 20mM NaOAc, (pH5.5) 20% CH3CN; 완충액 B는 20mM NaOAc, (pH5.5) 20% CH3CN 및 1M LiCl이였다. 용리액은 유속 1ml/분에서 25분동안 완충액 A 55%, 완충액 B 45% 내지 완충액 A 30%, 완충액 B 70%의 선형 구배로써 이루어졌다. 작동하는 동안 260nm에서의 흡수를 감시하였고 0.5ml의 분획을 1.5ml 원추형폴리프로필렌 튜브에서 수집하였다. 작동직후 10% SDS 5μl를 각 튜브에 첨가하고 각 튜브를 와류시켰다.(이것은 아크리디늄 에스테르-표지 프로브가 튜브의 벽에 달라붙는 것을 확실히 방지하기 위해 행하였다) 0.5㎕ 알리큇을 분획 21-42로부터 제거하고 12×75mm 튜브에서 물 200㎕에 첨가하였다(옮기는 문제점을 피하기 위해 각 알리큇에 대해 별도의 피펫 끝을 사용하였다). 각각 알리큇의 화확발광은 Berthoid Clinilumat에서 0.25N HNO3, 0.1% H2O 200㎕ 자동 주입후에 1초후 1N NaOH 200㎕를 자동 주입하고 10초간 발광을 읽어서 측정하였다.
29-33분획을 각각 5μl 글리코겐에 가하고 와류시킨 후 각 와류에 1ml에탄올을 가하고 얼음에서 5-10분간 배양한 후 마이크로 원심 분리기에서 15,000rpm으로 5분간 원심분리함으로써 에탄올 침전시켰다. 각 상징액을 조심스럽게 제거하고 각 펠렛을 0.1M NaOH, pH5, 0.1% SDS 20μl에 재 용해시킨 후 이들 별도의 분획을 모았다.
본 발명의 시약이 제조될 수 있고 그들 각각이 비-뉴클레오티드 골격, 제1 및 제2커플링기 및 리간드를 가진다는 것이 상기 실시예에 의해 예증되었으며 이들 모두는 상기 본발명의 요약에 기재되어 있다. 특히 시약(5)은 비-뉴클레오티드 프로필 골격을 가지며 거기에 메틸- N,N-디이소프로필포스포르아미도의 제1커플링기가 결합되고 디메톡시트리틸(DMT)에 의해 보호된 1-히드록시 제2커플링 기가 결합되고 트리플루오로아세틸에 의해 보호된 아미노프로필 연결 팔형태의 리간드가 결합된다. 시약(10)은 시약(5)과 동일한데 다만 전자는 2개의 동일한 리간드(2개의 보호된 연결 팔 트리플루오로아세틸 아미노프로필 형태의)가 제공된다. 시약(13)도 또한 시약(5)과 유사한 데, 다만 비-뉴클레오티드 골격이 프로필이 아니라 에틸이고, 연결 팔이 길이가 짧고, 유사하게 보호된 아미노프로필이 아니라 단지 트리플루오로아세틸 보호 메틸 아민이다.
상기와 같이 본 발명의 단일 시약을 사용하여 원하지 않는 뉴클레오티드를 도입함이 없이 뉴클레오티드 멀티머 상에서 어떤 미리 선택된 위치(들)에서 특이적으로 연결 팔을 제공할 수 있다. 또한 상기와 같이 골격을 뉴클레오티드 및 다른 골격에 커플링 시킴으로써, (이것은 사슬을 제조하기 위하여 차례로 다른 골격에 커플링 된다.) 본 발명의 시약은 인접 리간드(예컨데, 라벨이 부착되는 연결 팔 또는 라벨)에 뉴클레오티드 멀티머로서 제공되는 것을 가능 하게 한다. 따라서 다수의 인접 라벨이 프로브에 연결되기 때문에 그러한 프로브를 사용한 혼성분석의 감수성을 향상시킨다.
더욱이 하나 또는 본 발명의 일련의 후속 연결된 비-뉴클레오티드 골격의 사용은 부가적으로 표적 뉴클레오티드 멀티머 상의 대응 서열에 상보적인 프로브 상에서 두 뉴클레오티드 서열 사이의 고량 역할을 할수 있고, 단일의 서로 다른 뉴클레오티드 또는 피검 샘플의 다른 서열에 의해 연결될 수 있다. 따라서 표적 뉴클레오티드 멀티머는 실제로 관심있는 공통 뉴클레오티드 서열로 구성된 그 또는 그 이상의 뉴클레오티드 멀티머의 기가 될 수 있고 관심없는 단일의 다른 뉴클레오티드 또는 다른 뉴클레오티드 서열에 의해 연결된다. 단일 표적 서열이 관심인 때라도 어떠한 두 뉴클레오티드 사이에 커플링된, 표지기를 포함하는 비-뉴클레오티드 단량체 단위를 가지는 상보적 서열을 구비한 프로브를 제조하는 것이 가능하다. 그러한 경우에 프로브는, 표지기를 함유하는 단량체 단위가 혼성을 발생하지 않는 것과 같은 방법으로 자신을 순웅시키는 경향을 나타내는 경우 (즉 혼성구조의 loop out을 일으키려는 것)를 제외한 정상적인 방법으로 표적 뉴클레오티드 서열을 혼성시킨다. 그러한 배열을 프로브 특이성을 향상 시키 것과 같이 삽입효과를 이용하는 것이 소망스러운 경우(U.Aaaeline et al, Proc. Natl. Acad. Sci.USA, V.81.pp 3297-3301)에 특히 유리할 수 있다. 물론 본 발명이 비-뉴클레오티드 단량체 단위를 사용하다는 사실은 뉴클레오티드 단량체 단위를 사용하는 종래의 프로브와 관련해서 상기 유형의 방해를 상당히 감소시킨다.
본 발명의 요약에서 논의된 바와 같이, 화합물(4),(9) 및 (12)은 그들의 주 히드록실기를 통한 고상 합성지지체에 부착될 수 있다(그러한 목적에 적합한 기술에 관한,Gait 및 Sarang의 텍스트, 상기 참조) 부가적인 중합체 합성을 위해 사용되었을 때 얻어진 유도된 지지체는 얻어진 뉴클레오티드/비-뉴클레오티드 중합체의 3'-말단에서 비-뉴클레오티드 단량체 단위가 부착되는 결과가 된다.
상기한 본 발명에 대하여 여러 가지 변형이 가능한 것으로 이해되어야 한다. 예컨대 리간드는 실제로, 그들이 뉴클레오티드 멀티머의 뉴클레오티드에 커플되기 전에 본 발명의 시약에 제공된 표지자 또는 삽입자가 된다. 또한 상기 요약에 기재된 대로 상기한 특정 실시예와는 다른 여러 가지 보호기가 사용될 수 있다. 그러나 환외 뉴클레오티드 아민의 보호기를 탈락시키기 위해 공지의 표준 올리고뉴클레오티드 합성에서 사용된 것과 같은 알칼리 조건 (일반적으로는 50℃에서 1내지 12시간 동안 농축 NH4OH)하에서 아민을 잘라 보호기를 탈락시키기 때문에, 트리플루오로아세틸 및 9-플루오레닐 메톡시카보닐 아미노 보호기의 어느 하나를 사용하는 것이 바람직하다. 유사하게, 커플링하는 동안 아인산염 이탈기로서 디메톡시트리틸 5' 히드록시 보호, 메틸 또는 베타-시아노에틸 포스파이트 보호 및 N,N-디이소프로필의 사용은 모두 시약을 현재의 표준 올리고뉴클레오티드 고상 합성기술에 완전히 적당하게 하기 때문에 다른 특별적 부가적인 단계의 필요를 최소화시킨다.
본 발명의 상기 규정된 구체예의 다른 변형 및 변경은 이 분야의 전문가에게 자명한 것이다. 따라서 본 발명은 상기 상세히 기재한 이들 실시예에만 한정되지 않는다.
Claims (40)
- (a) 비-뉴클레오티드 단량체 단위; 와 (b) 비-뉴클레오티드 단량체 단위에 연결되고, 화학적 부분이 부착된 측아암으로부터, 및 불리하지 않은 조건하에 화학적 부분이 연결될수 있는 연결 아암으로부터 선택되는 리간드를 가지는 시약으로부터 치환된 뉴클레오티드를 제조하는 방법으로서, 비-뉴클레오티드 단량체 단위를 불리하지 않은 조건하에 뉴클레오티드 단량체 단위와 제2단량체 단위 및 고체 지지체중 하나에 커플시키는 것으로 이루어지는 방법
- (ⅰ) 화학적부분이 부착된 측아암으로부터 및 화학적부분이 연결될수 있는 보호된 연결 아암으로부터 선택된 리간드를 가지고 있는 비-뉴클레오티드 단량체 단위; 와 (ⅱ) 제 1커플링기 및 비-뉴클레오티드 단량체 단위에 연결된 보호된 제2커플링기를 가지고 있는 시약으로부터 치환된 뉴클레오티드의 제조방법으로서, 불리하지 않은 조건하에서, (a) 비-뉴클레오티드 단량체 단위를 제1커플링기를 통하여 제1추가의 단량체 단위에 첫번째 커플시키는 단계; (b) 그런다음 제2커플링기를 탈보호하는 단계; 그리고 (c) 비-뉴클레오티드 단량체 단위를 제2커플링기를 통하여 제2추가의 단량체 단위에 커플시키는 단계로 이루어지며, 제1 및 제2단량체 단위중 적어도 하나는 뉴클레오티드 단량체 단위이고 나머지 하나는 단량체 단위와 고체지지체로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 제1 및 제2추가의 단량체 단위 두가지가 모두 뉴클레오티드 단량체 단위인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 이어서, 제1 및 제2커플링기는 비-뉴클레오티드 단량체 단위를 각각 뉴클레오티드 단량체 단위 5' 히드록실과 3'인산에 커플시킬수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제2항에 있어서, 비-뉴클레오티드 단량체 단위가 그 각각의 끝에 제1 및 제2커플링기가 연결되어 있는 비고리형 골격을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제2항에 있어서, 시약이 다음식을 가지는 화합물중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.상기식에 (a) R2는 탄화수소 사슬을 포함하는, 1 내지 20 원자길이의 사슬; (b) Z는 뉴클레오티드의 OH에 결합하거나 또는 커플링을 위해 활성화 될 수 있는그 중에서 X2=할로겐 또는 치환된 아미노, X4=할로겐; 아미노; 또는 O-, R3=알킬;알콕시; 또는 페녹시, R5=알킬;알콕시; 또는 페녹시, R5=알킬; 알콕시; 또는 페녹시; 부가적으로 X4가 O-인 경우에만 H일수 있다.(c) R1-X1-은 보호된 제2커플링기이고, 그중에서 X1은 O;S;NH; 또는 HN=N-이고, R1은 H, 또는 디메톡시 트리페닐메틸 또는 등가의 보호기; (d) n은 양의 정수; (e) X3-R4-는 리간드로서 X3은 NH, O,S, 또는 O,S, NH-NH 또는 NH로 종결되는 길이 1 내기 25원자 길이의 탄화수소 사슬이고, R4는 플루오레닐메톡시카르보닐 또는 트리플루오로아세틸 또는 등가의 보호기이다.
- 제6항에 있어서, 상기 리간드가 표지, 삽입제, 금속착화제로부터, 및 표지, 삽입제, 또는 금속착화제중 하나에 연결될 수 있는 연결기능기로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제7항에 있어서, X2=Cl; 또는 2차 아미노, R3X4=클로로페녹시; 메톡시; 에톡시; 또는 베타-시아노에톡시, X4=Cl; 2차 아미노; 또는 R5=H 인 경우 O-R5=메톡시; 에톡시; 모노클로로페녹시; 베타-시아노에톡시; 부가적으로 X4가 O-인 경우에만 H일수 있는 것을 특징으로 하는 시약.
- 제7항에 있어서, 시약의 2차 아미노기가 디알킬아미노와 헤테로시클릭 N-아민으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제6항 또는 제9항에 있어서, 시약의 R1이 트리페닐메틸 또는 그의 알콕시 유도체인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제6항 또는 제9항에 있어서, 시약의 R1이 디메톡시트리페닐메틸인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제6항 또는 제9항중 어느하나에 있어서서, 시약의 R1이 O이고 R1디메톡시트리페닐메틸인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제5항 또는 9항중 어느하나에 있어서, 추가의 단량체 단위를 커플된 뉴클레오티드-비-뉴클레오티드 중합체에 커플시켜서 표적 뉴클레오티드 서열의 적어도 일부와 상보하고, 그 상보하는 뉴클레오티드 서열은 그안에 배열된 비-뉴클레오티드 단량체 단위를 적어도 하나를 가지는 뉴클레오티드 서열을 가지는 중합체를 제조하는 단계와, 그런다음 뉴클레오티드-비-뉴클레오티드 중합체 서열을 표적서열과 혼성화시키는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 중합체 프로브로서, 다수의 뉴클레오티드 단량체 단위와, 프로브의 해당하는 단량체 단위에 연결된 적어도 하나의 아크리디늄 에스테르 부분을 포함하는 것을 특징으로 하는 프로브.
- 제14항에서 있어서 아크라디늄 에스테르 표지가 화학발광 아크리디늄 에스테르 표지인 것을 특징으로 하는 프로브.
- 프로브의 제조방법으로, 적어도 하나의 아크리디늄 에스테르 부분을 다수의 뉴클레오티드 단량체 단위를 가지는 중합체의 해당하는 단량체 단위에 연결시키는 것으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제16항에 있어서, 아크리디늄 에스테르 표지가 화학발광 아크리디늄 에스테르 표지인 것을 특징으로 하는 방법.
- 뉴클레오티드-비-뉴클레오티드 중합체 제조에 적합한 하기식의 비-뉴클레오티드 시약.상기식에서 (a) R2는 탄화수소 사슬을 포함하는, 1 내지 20내 원자길이의 사슬; (b) Z는 뉴클레오티드의 OH에 결합하거나 또는 커플링을 위해 활성화 될 수 있는그 중에서 X2=할로겐 또는 치환된 아미노, X4=할로겐; 아미노; 또는 O-, R3=알킬; 알콜시; 또는 페녹시, R5=알킬; 알콕시; 또는 페녹시; 부가적으로 X4가 O-인 경우에만 H일수 있다.(c) R1-X1-은 보호된 제2커플링기이고, 그중에서 X1은 O;S;NH; 또는 NH=N-이고, R1은 H, 또는 디메톡시 트리페닐메틸 또는 등가의 보호기; (d) n은 양의 정수; (e) X3-R4는 리간드로서 X3은 NH, O,S, 또는 O,S, NH-NH 또는 NH로 종결되는 길이 1 내지 25 원자 길이의 탄화수소 사슬이고, R4는 플루오레닐메톡시카르보닐 또는 트리플루오로아세틸 또는 등가의 보호기이다.
- 제18항에 있어서, X2=Cl; 또는 2차 아미노, R3X4=클로로페녹시; 메톡시; 에톡시; 또는 베타-시아노에톡시, X4=Cl; 2차 아미노; 또는 R5=H 인 경우 O-R|5=메톡시; 에톡시; 모노클로로페녹시; 또는 베타-시아노에톡시; 또는 X4=O-인 경우에만 H일수 있는 것을 특징으로 하는 시약.
- 제19항에 있어서, 리간드는 보호된 연결아암이고, 그중 X3는 C- 에 의해 R2에 연결되고 N-에 의해 R4에 연결된 알킬아미노이며, R4는 트리플루오로아세틸과 9-플루오레닐메톡시카르보닐로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 시약.
- 제18항에 있어서, R1이 디메톡시트리페닐메틸인 것을 특징으로 하는 시약.
- 제20항에 있어서, R2가 X1에 연결된 2차 탄소를 지니는 것을 특징으로 하는 시약 .
- 제18항에 있어서, 2차 아미노기가 디알틸아미노, 및 헤테로시클릭 N-아민으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 시약.
- 제18항에 있어서, R1이 하나 또는 그 이상의 단량체 단위인 것을 특징으로 하는 시약.
- 제18항에 있어서, X1은 O이고 R1이 트리페닐메틸인 것을 특징으로 하는 시약
- 제18항에 있어서, X1은 O이고 R1이 디메톡시트리페닐메틸인 것을 특징으로 하는 시약.
- 제18항에 있어서, 비환식 탄환수소를 포함하는 것을 특징으로 하는 시약.
- 제18항에 있어서, 1 내지 20 탄소원자 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 시약.
- 제18항에 있어서, 에스테르는 1 내지 10 탄소원자 비환식 탄화수소를 포함하는 것을 특징으로 하는 시약.
- 제18항에 있어서, R1은 비-뉴클레오티드 단량체 단위인 것을 특징으로 하는 시약.
- 하기식으로 이루어지는 인함유 시약상기식에서 DMT 는 디메톡시트리페닐메틸이고, q는 독립적으로 0,1,2 또는 3이며, X5는 H 또는 (CH2)t-NH-CO-(CH2)sNH-M2또는 (CH2)t-NH-M1인바, 각 M1은 독립적으로 플루오레닐메톡시카르보닐 또는 트리플루오로아세틸이며, r은 1내지 5의 정수이고, m은 0,1 또는 2이며, 각각의 t는 독립적으로 0,1,2 또는 3이고, s는 1 내지 5의 정수이며, Me는 메틸기이고, 및 iPr은 이소프로필이다.
- 제30항에 있어서, M1은 표지인 것을 특징으로 하는 시약.
- 존재하는 모든 뉴클레오티드 -비-뉴클레오티드 중합체의 대부분이 단일 서열 뉴클레오티드-비-뉴클레오티드 중합체를 포함하는 제18항의 시약.
- 다수의 뉴클레오티드 단량체단위, 및 대응하는 프로브의 단량체 단위에 연결된 적어도 하나의 아크리디늄 에스테르부분을 지니는 제18항의 시약.
- 제33항에 있어서, 아크리디늄 에스테르 표지가 화학발광 아크리디늄 에스테르인 것을 특징으로 하는 시약.
- 제33항에 있어서, 단량체 단위는 뉴클레오티드 단량체 단위인 것을 특징으로 하는 시약.
- 제33항에 있어서, 단랑체 단위는 다른 하나의 비-뉴클레오티드 단량체 단위에 결합된 비-뉴클레오티드 단량체 단위인 것을 특징으로 하는 시약.
- 제33항에 있어서, 표지는 비오틴, 플루오레신, 디니트로벤젠, 로다민, 또는 텍사스 레드로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 시약.
- 하기식을 갖는 시약.상기식에서 R1은 디메톡시트리페닐메틸 또는 등가의 보호기이고, X1는 O,S,NH 또는 NH-NH이며, R2는 탄화수소 사슬을 포함하는 1 내지 20 원자길이의 사슬이고, R3은 NH,O,S, 또는 O,S,NH-NH 또는 NH로 종결된 탄화수소 사슬을 포함하는 1 내지 25 원자길이의 사슬이며, R4는 플루오레닐메톡시카르보닐 또는 트리플루오로아세틸 또는 등가의 보호기 이고, n은 양의 정수이며, A는 뉴클레오티드 단량체 단위이다.
- 하기식을 갖는 시약상기식에서 R1은 H, 또는 디AP톡시트리페닐메틸 또는 등가의 보호기, 또는 하나 또는 그 이상의 단량체 단위이고, 각각의 q는 독립적이고 0 내지 3이고, X5는 H 또는 (CH2)5NH-M2이고 각각의 M1은 독립적으로 H, 플루오레닐메톡시카르보닐, 트리플루오로아세틸 또는 표지적이고, M2는 H, 플루오레닐메톡시카르보닐 또는 트리플루오로아세틸이고, r은 1 내지 5의 정수이고, m은 0,1 또는 2이고, 각각의 t는 독립적으로 o 내지 3이고, s는 1 내지 5의 정수이고, 및그 중에서 X2=할로겐 또는 치환된 아미노, X4=할로겐; 아미노; 또는 O-,R|3=알킬; 알콕시; 또는 페녹시, R5=알킬;알콕시;또는 페녹시; 부가적으로 X4가 O-인 경우에만 H일수 있다.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US9905087A | 1987-09-21 | 1987-09-21 | |
| US099,050 | 1987-09-21 | ||
| PCT/US1988/003173 WO1989002439A1 (en) | 1987-09-21 | 1988-09-20 | Non-nucleotide linking reagents for nucleotide probes |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR890701610A KR890701610A (ko) | 1989-12-21 |
| KR970005898B1 true KR970005898B1 (ko) | 1997-04-21 |
Family
ID=22272324
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1019890700894A KR970005898B1 (ko) | 1987-09-21 | 1988-09-20 | 뉴클레오티드 프로브에 대한 비-뉴클레오티드 연결시약 |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0313219B1 (ko) |
| JP (1) | JP3012244B2 (ko) |
| KR (1) | KR970005898B1 (ko) |
| AT (1) | ATE137755T1 (ko) |
| AU (1) | AU630076B2 (ko) |
| CA (1) | CA1339303C (ko) |
| DE (2) | DE3855275T4 (ko) |
| DK (1) | DK244789A (ko) |
| ES (1) | ES2086300T3 (ko) |
| FI (1) | FI892434A (ko) |
| PT (1) | PT88550A (ko) |
| WO (1) | WO1989002439A1 (ko) |
Families Citing this family (126)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4948882A (en) * | 1983-02-22 | 1990-08-14 | Syngene, Inc. | Single-stranded labelled oligonucleotides, reactive monomers and methods of synthesis |
| KR960002561B1 (ko) * | 1987-09-21 | 1996-02-22 | 젠-프로우브 인코퍼레이티드 | 균질보호분석법 |
| US5141813A (en) * | 1989-08-28 | 1992-08-25 | Clontech Laboratories, Inc. | Multifunctional controlled pore glass reagent for solid phase oligonucleotide synthesis |
| US5451463A (en) * | 1989-08-28 | 1995-09-19 | Clontech Laboratories, Inc. | Non-nucleoside 1,3-diol reagents for labeling synthetic oligonucleotides |
| IL99068A (en) * | 1990-08-09 | 1998-01-04 | Genta Inc | Non-nucleotide binding reagents for oligomers |
| IL99069A (en) * | 1990-08-09 | 1998-08-16 | Genta Inc | Methyphosphonate oligonucleotides associated with psoralen |
| US5512667A (en) * | 1990-08-28 | 1996-04-30 | Reed; Michael W. | Trifunctional intermediates for preparing 3'-tailed oligonucleotides |
| GB9021625D0 (en) * | 1990-10-04 | 1990-11-21 | Ici Plc | Synthesis of oligonucleotides |
| CA2135073C (en) * | 1992-05-06 | 2002-11-19 | Daniel L. Kacian | Nucleic acid sequence amplification method, composition and kit |
| US6093538A (en) * | 1992-05-06 | 2000-07-25 | Gen-Probe Incorporated | Nucleic acid probes to ureaplasma |
| EP1602725A3 (en) | 1993-09-02 | 2006-03-29 | Sirna Therpeutics, Inc. | Abasic-nucleotide containing enzymatic nucleic acid |
| US6448373B1 (en) * | 1994-01-11 | 2002-09-10 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Phosphate linked oligomers formed of monomeric diols and processes for preparing same |
| US5886177A (en) * | 1994-01-11 | 1999-03-23 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Phosphate linked oligomers |
| US5514551A (en) * | 1994-10-14 | 1996-05-07 | Gen-Probe Incorporated | Compositions for the detection of Chlamydia trachomatis |
| EP0709466B1 (en) * | 1994-10-28 | 2006-09-27 | Gen-Probe Incorporated | Compositions and methods for the simultaneous detection and quantification of multiple specific nucleic acid sequences |
| US5622827A (en) * | 1995-02-07 | 1997-04-22 | Gen-Probe Incorporated | Amplification primers and nucleic acid probes targeted to coccidioides immitis nucleic acid |
| US5739311A (en) * | 1995-06-07 | 1998-04-14 | Gen-Probe Incorporated | Enzymatic synthesis of phosphorothioate oligonucleotides using restriction endonucleases |
| US5652126A (en) * | 1995-06-07 | 1997-07-29 | Gen-Probe Incorporated | Use of restriction endonuclease sequences for cleaving phosphorothioate oligonucleotides |
| US5916777A (en) * | 1995-06-07 | 1999-06-29 | Gen-Probe Incorporated | Enzymatic synthesis of oligonucleotides using 3'-ribonucleotide primers |
| US5756352A (en) * | 1995-06-07 | 1998-05-26 | Gen-Probe Incorporated | Thiocationic lipid-nucleic acid conjugates |
| US5711964A (en) * | 1995-06-07 | 1998-01-27 | United States Of America | Method for the intracellular delivery of biomolecules using liposomes containing cationic lipids and vitamin D |
| US5879885A (en) * | 1995-06-07 | 1999-03-09 | Gen-Probe Incorporated | Compositions for detecting and quantifying biological samples |
| US5731148A (en) * | 1995-06-07 | 1998-03-24 | Gen-Probe Incorporated | Adduct protection assay |
| US5739271A (en) * | 1995-06-07 | 1998-04-14 | Gen-Probe Incorporated | Thiocationic lipids |
| US5932450A (en) * | 1995-06-07 | 1999-08-03 | Gen-Probe Incorporated | Enzymatic synthesis of oligonucleotides using digestible templates |
| US5747252A (en) * | 1995-06-07 | 1998-05-05 | Gen-Probe Incorporated | Nucleic acid probes and amplification oligonucleotides for Neisseria species |
| US5759519A (en) * | 1995-06-07 | 1998-06-02 | Gen-Probe Incorporated | Method for the intracellular delivery of biomolecules using thiocationic lipids |
| US5851548A (en) * | 1995-06-07 | 1998-12-22 | Gen-Probe Incorporated | Liposomes containing cationic lipids and vitamin D |
| DE19534122A1 (de) * | 1995-09-14 | 1997-03-20 | Behringwerke Ag | Homogener Gensondentest mit einem gegen das Label gerichteten Rezeptor |
| US7034009B2 (en) | 1995-10-26 | 2006-04-25 | Sirna Therapeutics, Inc. | Enzymatic nucleic acid-mediated treatment of ocular diseases or conditions related to levels of vascular endothelial growth factor receptor (VEGF-R) |
| CA2237891C (en) | 1995-11-15 | 2013-07-30 | Gen-Probe Incorporated | Nucleic acid probes complementary to human papillomavirus nucleic acid and related methods and kits |
| US6218107B1 (en) | 1996-05-22 | 2001-04-17 | Gen-Probe Incorporated | Compositions and methods for detecting the presence of Mycobacterium kansassii |
| US6025133A (en) * | 1996-12-30 | 2000-02-15 | Gen-Probe Incorporated | Promoter-sequestered oligonucleoside and method of use |
| US6251666B1 (en) | 1997-03-31 | 2001-06-26 | Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. | Nucleic acid catalysts comprising L-nucleotide analogs |
| US6280936B1 (en) | 1997-06-09 | 2001-08-28 | Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. | Method for screening nucleic acid catalysts |
| US6548657B1 (en) | 1997-06-09 | 2003-04-15 | Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. | Method for screening nucleic acid catalysts |
| DE19741738A1 (de) | 1997-09-22 | 1999-03-25 | Hoechst Ag | Linker-Nucleosid, seine Herstellung und Verwendung |
| US6127173A (en) * | 1997-09-22 | 2000-10-03 | Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. | Nucleic acid catalysts with endonuclease activity |
| DE19741715A1 (de) * | 1997-09-22 | 1999-03-25 | Hoechst Ag | Pentopyranosyl-Nucleosid, seine Herstellung und Verwendung |
| US6656731B1 (en) | 1997-09-22 | 2003-12-02 | Max Planck Gesellschaft Zur Forderung Der Wissenschaften E.V. | Nucleic acid catalysts with endonuclease activity |
| DE19815901A1 (de) | 1998-04-08 | 1999-10-14 | Aventis Res & Tech Gmbh & Co | Verfahren zur Herstellung von Pentopyranosyl-Nucleosiden |
| AU3751299A (en) | 1998-04-20 | 1999-11-08 | Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. | Nucleic acid molecules with novel chemical compositions capable of modulating gene expression |
| US6831171B2 (en) | 2000-02-08 | 2004-12-14 | Yale University | Nucleic acid catalysts with endonuclease activity |
| US8273866B2 (en) | 2002-02-20 | 2012-09-25 | Merck Sharp & Dohme Corp. | RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (SINA) |
| WO2005041859A2 (en) | 2003-04-30 | 2005-05-12 | Sirna Therapeutics, Inc. | Conjugates and compositions for cellular delivery. |
| US8202979B2 (en) | 2002-02-20 | 2012-06-19 | Sirna Therapeutics, Inc. | RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid |
| US7833992B2 (en) | 2001-05-18 | 2010-11-16 | Merck Sharpe & Dohme | Conjugates and compositions for cellular delivery |
| US7491805B2 (en) | 2001-05-18 | 2009-02-17 | Sirna Therapeutics, Inc. | Conjugates and compositions for cellular delivery |
| WO2002081628A2 (en) | 2001-04-05 | 2002-10-17 | Ribozyme Pharmaceuticals, Incorporated | Modulation of gene expression associated with inflammation proliferation and neurite outgrowth, using nucleic acid based technologies |
| EP3231445A1 (en) | 2001-05-18 | 2017-10-18 | Sirna Therapeutics, Inc. | Conjugates and compositions for cellular delivery |
| US7109165B2 (en) | 2001-05-18 | 2006-09-19 | Sirna Therapeutics, Inc. | Conjugates and compositions for cellular delivery |
| US9994853B2 (en) | 2001-05-18 | 2018-06-12 | Sirna Therapeutics, Inc. | Chemically modified multifunctional short interfering nucleic acid molecules that mediate RNA interference |
| US20050148530A1 (en) | 2002-02-20 | 2005-07-07 | Sirna Therapeutics, Inc. | RNA interference mediated inhibition of vascular endothelial growth factor and vascular endothelial growth factor receptor gene expression using short interfering nucleic acid (siNA) |
| DK2423335T3 (da) | 2001-06-21 | 2014-08-18 | Dynavax Tech Corp | Kimæriske immunmodulatoriske forbindelser og fremgangsmåder til anvendelse deraf |
| US7785610B2 (en) | 2001-06-21 | 2010-08-31 | Dynavax Technologies Corporation | Chimeric immunomodulatory compounds and methods of using the same—III |
| US9181551B2 (en) | 2002-02-20 | 2015-11-10 | Sirna Therapeutics, Inc. | RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (siNA) |
| AU2003207708A1 (en) | 2002-02-20 | 2003-09-09 | Sirna Therapeutics, Inc. | Rna interference mediated inhibition of map kinase genes |
| US9657294B2 (en) | 2002-02-20 | 2017-05-23 | Sirna Therapeutics, Inc. | RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (siNA) |
| WO2004003233A1 (en) | 2002-06-28 | 2004-01-08 | Rosetta Inpharmatics Llc | Methods to assess quality of microarrays |
| KR20050052467A (ko) | 2002-08-12 | 2005-06-02 | 다이나박스 테크놀로지 코퍼레이션 | 면역조절 조성물, 이의 제조방법 및 이의 이용방법 |
| US7956176B2 (en) | 2002-09-05 | 2011-06-07 | Sirna Therapeutics, Inc. | RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (siNA) |
| US7560231B2 (en) | 2002-12-20 | 2009-07-14 | Roche Molecular Systems, Inc. | Mannitol and glucitol derivatives |
| WO2004058159A2 (en) | 2002-12-23 | 2004-07-15 | Dynavax Technologies Corporation | Branched immunomodulatory compounds and methods of using the same |
| CA2463719A1 (en) | 2003-04-05 | 2004-10-05 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Nucleotide analogs with six membered rings |
| WO2005105157A2 (en) | 2004-04-23 | 2005-11-10 | The Trustees Of Columbia University In The City Ofnew York | INHIBITION OF HAIRLESS PROTEIN mRNA |
| US20060040882A1 (en) | 2004-05-04 | 2006-02-23 | Lishan Chen | Compostions and methods for enhancing delivery of nucleic acids into cells and for modifying expression of target genes in cells |
| US10508277B2 (en) | 2004-05-24 | 2019-12-17 | Sirna Therapeutics, Inc. | Chemically modified multifunctional short interfering nucleic acid molecules that mediate RNA interference |
| EP2305693B1 (en) | 2004-09-01 | 2015-07-15 | Dynavax Technologies Corporation | Methods and compositions for inhibition of innate immune responses and autoimmunity |
| EP1700922B1 (en) | 2005-03-10 | 2016-08-24 | Roche Diagnostics GmbH | 3-Substituted 5-Nitroindole derivatives and labeled oligonucleotide probes containing them |
| WO2006138145A1 (en) | 2005-06-14 | 2006-12-28 | Northwestern University | Nucleic acid functionalized nanoparticles for therapeutic applications |
| JP4713514B2 (ja) * | 2006-02-20 | 2011-06-29 | エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー | 改善された標識試薬 |
| CN101583346B (zh) | 2006-04-28 | 2015-08-19 | 儿童医院医疗中心 | 用于穿膜药物递送系统的皂化蛋白c和相关蛋白及肽的促融合性质 |
| EP2121987B1 (en) | 2007-02-09 | 2012-06-13 | Northwestern University | Particles for detecting intracellular targets |
| AU2008247488B2 (en) | 2007-05-04 | 2014-02-27 | Marina Biotech, Inc. | Amino acid lipids and uses thereof |
| EP2160464B1 (en) | 2007-05-30 | 2014-05-21 | Northwestern University | Nucleic acid functionalized nanoparticles for therapeutic applications |
| EP2361980B1 (en) | 2007-10-26 | 2016-12-07 | Dynavax Technologies Corporation | Methods and compositions for inhibition of immune responses and autoimmunity |
| JP2011521649A (ja) | 2008-05-30 | 2011-07-28 | イェール ユニバーシティー | 遺伝子発現を改変するための標的化オリゴヌクレオチド組成物 |
| CN102231979B (zh) | 2008-10-16 | 2014-10-29 | 玛瑞纳生物技术有限公司 | 基因沉默治疗剂的脂质体有效递送方法和组合物 |
| CN102281872A (zh) | 2008-11-24 | 2011-12-14 | 西北大学 | 多价rna纳米颗粒组合物 |
| US20100233270A1 (en) | 2009-01-08 | 2010-09-16 | Northwestern University | Delivery of Oligonucleotide-Functionalized Nanoparticles |
| WO2010090762A1 (en) | 2009-02-04 | 2010-08-12 | Rxi Pharmaceuticals Corporation | Rna duplexes with single stranded phosphorothioate nucleotide regions for additional functionality |
| CN102482714B (zh) | 2009-07-30 | 2018-04-06 | 霍夫曼-拉罗奇有限公司 | 寡核苷酸探针组以及与其相关的方法和用途 |
| US20110038871A1 (en) | 2009-08-11 | 2011-02-17 | Veena Viswanth | Ccr2 inhibitors for treating conditions of the eye |
| WO2011034605A2 (en) | 2009-09-16 | 2011-03-24 | Genentech, Inc. | Coiled coil and/or tether containing protein complexes and uses thereof |
| US8350038B2 (en) | 2009-10-20 | 2013-01-08 | Roche Diagnostics Operations, Inc. | Fluorescence quencher molecules |
| AU2010313154B2 (en) | 2009-10-30 | 2016-05-12 | Northwestern University | Templated nanoconjugates |
| TWI611021B (zh) | 2009-12-09 | 2018-01-11 | 日東電工股份有限公司 | Ｈｓｐ４７表現之調節 |
| EP2516681B1 (en) | 2010-02-11 | 2017-10-18 | Nanostring Technologies, Inc | Compositions and methods for the detection of preferably small rnas by bridge hybridisation and ligation |
| WO2011120023A1 (en) | 2010-03-26 | 2011-09-29 | Marina Biotech, Inc. | Nucleic acid compounds for inhibiting survivin gene expression uses thereof |
| TW201138821A (en) | 2010-03-26 | 2011-11-16 | Roche Glycart Ag | Bispecific antibodies |
| WO2011133584A2 (en) | 2010-04-19 | 2011-10-27 | Marina Biotech, Inc. | Nucleic acid compounds for inhibiting hras gene expression and uses thereof |
| EP2563922A1 (en) | 2010-04-26 | 2013-03-06 | Marina Biotech, Inc. | Nucleic acid compounds with conformationally restricted monomers and uses thereof |
| WO2011139842A2 (en) | 2010-04-28 | 2011-11-10 | Marina Biotech, Inc. | Nucleic acid compounds for inhibiting fgfr3 gene expression and uses thereof |
| CA2802873C (en) | 2010-06-16 | 2018-09-18 | Dynavax Technologies Corporation | Methods of treatment using tlr7 and/or tlr9 inhibitors |
| US9260471B2 (en) | 2010-10-29 | 2016-02-16 | Sirna Therapeutics, Inc. | RNA interference mediated inhibition of gene expression using short interfering nucleic acids (siNA) |
| CN103384681B (zh) | 2010-12-23 | 2018-05-18 | 霍夫曼-拉罗奇有限公司 | 结合剂 |
| JP6046049B2 (ja) | 2010-12-23 | 2016-12-14 | エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ | 二価結合剤による翻訳後修飾されたポリペプチドの検出 |
| SG191153A1 (en) | 2010-12-23 | 2013-07-31 | Hoffmann La Roche | Polypeptide-polynucleotide-complex and its use in targeted effector moiety delivery |
| CN103492572A (zh) | 2011-03-03 | 2014-01-01 | 夸克医药公司 | 用于治疗肺疾病和损伤的组合物和方法 |
| US10196637B2 (en) | 2011-06-08 | 2019-02-05 | Nitto Denko Corporation | Retinoid-lipid drug carrier |
| TWI658830B (zh) | 2011-06-08 | 2019-05-11 | 日東電工股份有限公司 | Ｈｓｐ47表現調控強化用類視色素脂質體 |
| AU2012304358B2 (en) | 2011-09-07 | 2017-07-20 | Marina Biotech Inc. | Synthesis and uses of nucleic acid compounds with conformationally restricted monomers |
| US9889209B2 (en) | 2011-09-14 | 2018-02-13 | Northwestern University | Nanoconjugates able to cross the blood-brain barrier |
| CA2863084C (en) | 2012-02-01 | 2020-07-07 | Gen-Probe Incorporated | Asymmetric hairpin target capture oligomers |
| WO2013119966A2 (en) | 2012-02-10 | 2013-08-15 | Genentech, Inc. | Single-chain antibodies and other heteromultimers |
| BR112014032193A2 (pt) | 2012-06-27 | 2017-06-27 | Hoffmann La Roche | métodos de produção de anticorpos biespecíficos e de determinação de combinação, anticorpo biespecífico, formulação e uso de anticorpo biespecífico |
| EP2867254B1 (en) | 2012-06-27 | 2017-10-25 | F. Hoffmann-La Roche AG | Method for making antibody fc-region conjugates comprising at least one binding entity that specifically binds to a target and uses thereof |
| EP4219549A1 (en) | 2012-06-27 | 2023-08-02 | The Trustees of Princeton University | Split inteins, conjugates and uses thereof |
| WO2014043291A1 (en) | 2012-09-12 | 2014-03-20 | Quark Pharmaceuticals, Inc. | Double-stranded nucleic acid compounds |
| US9228184B2 (en) | 2012-09-29 | 2016-01-05 | Dynavax Technologies Corporation | Human toll-like receptor inhibitors and methods of use thereof |
| EP3164113B1 (en) | 2014-06-04 | 2019-03-27 | Exicure, Inc. | Multivalent delivery of immune modulators by liposomal spherical nucleic acids for prophylactic or therapeutic applications |
| WO2016022866A1 (en) | 2014-08-07 | 2016-02-11 | Agilent Technologies, Inc. | Cis-blocked guide rna |
| CN107106493A (zh) | 2014-11-21 | 2017-08-29 | 西北大学 | 球形核酸纳米颗粒缀合物的序列特异性细胞摄取 |
| EP3227332B1 (en) | 2014-12-03 | 2019-11-06 | F.Hoffmann-La Roche Ag | Multispecific antibodies |
| US10264976B2 (en) | 2014-12-26 | 2019-04-23 | The University Of Akron | Biocompatible flavonoid compounds for organelle and cell imaging |
| PT3386519T (pt) | 2015-12-13 | 2021-04-27 | Nitto Denko Corp | Estruturas de sirna para atividade elevada e redução de alvos extra |
| WO2018039629A2 (en) | 2016-08-25 | 2018-03-01 | Northwestern University | Micellar spherical nucleic acids from thermoresponsive, traceless templates |
| ES2972334T3 (es) | 2018-11-16 | 2024-06-12 | Nitto Denko Corp | Formulación y métodos de administración de interferencia de ARN para tumores malignos |
| US20230159930A1 (en) | 2021-11-19 | 2023-05-25 | Sanegene Bio Usa Inc. | Double stranded rna targeting angiopoietin-like 3 (angptl-3) and methods of use thereof |
| US20240002857A1 (en) | 2022-05-09 | 2024-01-04 | Sanegene Bio Usa Inc. | Double stranded rna targeting 17-beta hydroxysteroiddehydrogenase 13 (hsd17b13) and methods of use thereof |
| US20240052348A1 (en) | 2022-08-05 | 2024-02-15 | Sanegene Bio Usa Inc. | Double stranded rna targeting angiotensinogen (agt) and methods of use thereof |
| WO2024081954A2 (en) | 2022-10-14 | 2024-04-18 | Sanegene Bio Usa Inc. | Small interfering rna targeting c3 and uses thereof |
| WO2024137590A2 (en) | 2022-12-19 | 2024-06-27 | Sanegene Bio Usa Inc. | Small interfering rna targeting cfb and uses thereof |
| WO2024137545A1 (en) * | 2022-12-19 | 2024-06-27 | Arnatar Therapeutics, Inc | Arnatar compounds and methods for enhanced cellular uptake |
| US20240309383A1 (en) | 2023-02-24 | 2024-09-19 | Suzhou Sanegene Bio Inc. | Small interfering rna targeting hbv and uses thereof |
| WO2024186673A2 (en) | 2023-03-03 | 2024-09-12 | Sanegene Bio Usa Inc. | Small interfering rna targeting apoc3 and uses thereof |
Family Cites Families (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4500707A (en) * | 1980-02-29 | 1985-02-19 | University Patents, Inc. | Nucleosides useful in the preparation of polynucleotides |
| US4469863A (en) * | 1980-11-12 | 1984-09-04 | Ts O Paul O P | Nonionic nucleic acid alkyl and aryl phosphonates and processes for manufacture and use thereof |
| US4401796A (en) * | 1981-04-30 | 1983-08-30 | City Of Hope Research Institute | Solid-phase synthesis of polynucleotides |
| GB2112779B (en) * | 1981-12-11 | 1986-10-15 | Welsh Nat School Med | Aryl acridinium esters as luminescent labelling materials |
| AU596068B2 (en) | 1983-02-22 | 1990-04-26 | Syngene, Inc. | Defined sequence single strand oligonucleotides incorporating reporter groups, process for the chemical synthesis thereof, and nucleosides useful in such synthesis |
| FR2565996B1 (fr) | 1984-06-15 | 1988-01-22 | Inst Nat Sante Rech Med | Acides nucleiques marques chimiquement, leur utilisation et necessaire pour sa mise en oeuvre |
| JPS6144353A (ja) | 1984-08-07 | 1986-03-04 | Yuki Gosei Yakuhin Kogyo Kk | 蛍光標識化されたポリヌクレオチドとその製法 |
| JPS6144352A (ja) | 1984-08-07 | 1986-03-04 | Yuki Gosei Yakuhin Kogyo Kk | ポリデオキシリボヌクレオチドまたはポリリボヌクレオチドの螢光標識化法 |
| JPS6157595A (ja) | 1984-08-28 | 1986-03-24 | Yuki Gosei Yakuhin Kogyo Kk | ポリデオキシリボヌクレオチドまたはポリリボヌクレオチドの酵素標識化法 |
| JP2509574B2 (ja) * | 1985-08-15 | 1996-06-19 | アモコ・コーポレーション | 標識付けした核酸 |
| US4757141A (en) * | 1985-08-26 | 1988-07-12 | Applied Biosystems, Incorporated | Amino-derivatized phosphite and phosphate linking agents, phosphoramidite precursors, and useful conjugates thereof |
| US4707834A (en) * | 1985-09-17 | 1987-11-17 | Tektronix, Inc. | Computer-based instrument system |
-
1988
- 1988-09-20 KR KR1019890700894A patent/KR970005898B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1988-09-20 PT PT88550A patent/PT88550A/pt not_active Application Discontinuation
- 1988-09-20 CA CA000577911A patent/CA1339303C/en not_active Expired - Lifetime
- 1988-09-20 JP JP63507941A patent/JP3012244B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1988-09-20 AU AU24856/88A patent/AU630076B2/en not_active Expired
- 1988-09-20 WO PCT/US1988/003173 patent/WO1989002439A1/en active Application Filing
- 1988-09-21 DE DE3855275T patent/DE3855275T4/de not_active Expired - Lifetime
- 1988-09-21 AT AT88308766T patent/ATE137755T1/de not_active IP Right Cessation
- 1988-09-21 ES ES88308766T patent/ES2086300T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1988-09-21 EP EP88308766A patent/EP0313219B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1988-09-21 DE DE3855275A patent/DE3855275D1/de not_active Expired - Lifetime
-
1989
- 1989-05-19 FI FI892434A patent/FI892434A/fi not_active Application Discontinuation
- 1989-05-19 DK DK244789A patent/DK244789A/da not_active Application Discontinuation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DK244789D0 (da) | 1989-05-19 |
| DK244789A (da) | 1989-06-30 |
| WO1989002439A1 (en) | 1989-03-23 |
| PT88550A (pt) | 1989-07-31 |
| JP3012244B2 (ja) | 2000-02-21 |
| FI892434A0 (fi) | 1989-05-19 |
| AU2485688A (en) | 1989-04-17 |
| KR890701610A (ko) | 1989-12-21 |
| ES2086300T3 (es) | 1996-07-01 |
| EP0313219A2 (en) | 1989-04-26 |
| EP0313219B1 (en) | 1996-05-08 |
| DE3855275T4 (de) | 1997-03-20 |
| EP0313219A3 (en) | 1990-05-30 |
| DE3855275T2 (de) | 1996-11-14 |
| JPH02503146A (ja) | 1990-10-04 |
| AU630076B2 (en) | 1992-10-22 |
| DE3855275D1 (de) | 1996-06-13 |
| FI892434A (fi) | 1989-05-19 |
| ATE137755T1 (de) | 1996-05-15 |
| CA1339303C (en) | 1997-08-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR970005898B1 (ko) | 뉴클레오티드 프로브에 대한 비-뉴클레오티드 연결시약 | |
| US6031091A (en) | Non-nucleotide linking reagents for nucleotide probes | |
| US5585481A (en) | Linking reagents for nucleotide probes | |
| EP0543913B1 (en) | Oligo(alpha-arabinofuranosyl nucleotides) and alpha-arabinofuranosyl precursors thereof | |
| JP2710756B2 (ja) | 新規ヌクレオシドホスホルアミダイトおよびその製造方法 | |
| KR101032008B1 (ko) | 폴리뉴클레오티드 표지 시약 | |
| JP2511005B2 (ja) | インビトロにおけるオリゴヌクレオチド合成法並びにそれに用いる試薬 | |
| FI115214B (fi) | Menetelmä oligonukleotidianalogien valmistamiseksi ja niiden käyttö | |
| US5185439A (en) | Acridinium ester labelling and purification of nucleotide probes | |
| EP0954606B1 (en) | Non-nucleotide linking reagents | |
| JPS58180500A (ja) | Ｄｎａの化学的合成方法 | |
| JP2004325457A (ja) | 試料中の検体の存在又は量を検出する方法 | |
| WO1995024413A1 (en) | Compositions and methods for use in the synthesis of oligonucleotides | |
| Matsuzaki et al. | A new class of condensing reagents for rapid internucleotide bond formation in the phosphotriester approach and preparation of n3-benzoylthymidine as a key intermediate in oligodeoxyribonucleotide synthesis | |
| KR100541842B1 (ko) | 붕산을 함유하는 시약과 올리고누클레오티드 | |
| JPH01317400A (ja) | 非放射活性標識の目的で５’（ｏｈ）位置で化学的に修飾された末端ヌクレオチドを含む核酸プローブ | |
| JP2000119199A (ja) | ヌクレオチドプローブ用非ヌクレオチド連結試薬 | |
| NO892042L (no) | Ikke-nukleotide bindingsreagenser for nukleotidprober. | |
| EP0562014A1 (en) | Methods for labelling oligonucleotides | |
| US20220073546A1 (en) | Diastereomeric linking reagents for nucleotide probes | |
| DE69128628T2 (de) | Oligo(alpha-arabinofuranosyl nukleotide) und entsprechende alpha-arabinofuranosyl vorläufer | |
| JPS63222187A (ja) | リン酸エステル形成用縮合剤及びその使用方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| N231 | Notification of change of applicant | ||
| G160 | Decision to publish patent application | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| GRNT | Written decision to grant | ||
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20080930 Year of fee payment: 12 |
|
| LAPS | Lapse due to unpaid annual fee |