KR920002163B1 - TGF-β를 이용한 건선 치료방법 - Google Patents

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TGF-β를 이용한 건선 치료방법

제1도는 원숭이의(시미안) TGF-β cDNA의 뉴클레오티드 베열과 이로부터 연역된 아미노산 배열을 나타내다. pTGF-β의 1600bp 삽입물을 M13mp18과 M13mp19 클로닝 벡터에 서브클론시키고(Yanisch-Perron외, 1985) 디데옥시 체인 종결법(Sanger외, 1977)을 이용하여 양 사슬의 배열을 분석하였다. 인간의 DNA배열과 원숭이의 DNA 배열은 표시된 곳을 제외하고는 동일하며(도트); 인간과 원숭이의 단백질 사이의 아미노산 차이를 윗줄에 나타내었다. 성숙한 TGF-β배열을 박스안에 표시하고 시그날 펩티드는 윗줄을 그어 표시하였다. 5미번역 영역중의 팔린드롬(palindrome) 또한 윗줄을 그어 표시하였다.

제2도는 프란쯔(Franz) 확산 챔버를 나타낸 도면이다.

제3도는 국소 TGF-β를 받은 모든 챔버의 수집된 섭수체 용액으로부터 회수된[³⁵S]HPLC 크로마토그래프를 나타낸다. 용매로 PBS를 사용하여 겔침투컬럼에서 분리시켰다. 미리 주사한 표준물에 기초하여 피크의 대략적인 분자량을 표시하였다.

제4도는 4가지 피부 크림베이스로부터의 TGF-β 회수백분율을 나타내는 도면이다.

본 발명은 비후성(hyperplastic) 피부질환을 치료하기 위한 수단으로서, 표피세포, 특히 케라틴세포의 증식을 억제하는 방법에 관한 것이다.

건선은 표피 증식속도의 증가로 특징지어지는 만성피부병이다. 초고속 증식표피의 주요한 세포유형은 케라틴세포이다. 케라틴세포는 형질전환 성장인자 TGF-α에 의해 증식이 촉진된다. 배양된 케라틴세포를 외인성 TGF-α에 노출시키면 내인성 TGF-α의 메신저 RNA 농도가 증가된다. 그러므로 케라틴세포에 있어 성장인자 사이클은 자기 자극형이다.

건선 피부표본의 하층의 진피는 면역형세포, 주로 임파구와 대식세포의 침윤세포를 함유한다. 이 면역세포들이 생산하는 자극인자들에는 인터류킨-1 및 인터류킨-2와 같은 시토카인(cytokines)이 포함된다.

형질전환 성장인자 타잎 β(TGF-β)로 알려진 펩티드족은 세포성장과 분화를 조절한다. 이 성장조절 폴리펩티드류는 대체로 세포유형에 따라서, 세포증식을 자극하거나 저해할 수 있다. TGF-β1과 TGF-β2는 모두 정상적인 여러 상피세포에 대해 강력한 항 증식효과를 갖는다. 더욱이, TGF-β는 또한 클래스 Ⅱ 항원발현을 변형시키므로 염증반응을 억압할 수 있다. 게다가 TGF-β는 면역기능의 강력한 모듈레이터로서 임파구의 배자발생, B 세포와 인터류킨에 의한 항체분비, 및 기타 관련된 시토카인-유도현상을 억제할 수 있다.

케라틴세포는 상피에 기원을 둔다. 그러므로 표피비후부류의 피부병에서 발견되는 비후성이 이러한 항 증식인자에 의해 억제될 수 있는가 하는 것은 흥미로운 일이다. 더욱이, TGF-β가 면역반응의 억압에 의해 건선증상을 더 완화시킬것인가를 관찰하는 것도 흥미로운 일이다.

[관련 참고 문헌]

TGF-β로 지칭되는 화합물류에 관한 리뷰가 Sporn 등의 Science(1986) 233 : 532-534에 기재되어 있다. CIF-β(연골-유도인자 β)와 TGF-β와의 기능적 관계 및 구조가 Seyedin 등의 J.Biol.Chem. (1987) 262 : 1946-1949에 의해 설명되었다. Seyedin 등의 Proc.Natl.Acad.Sci USA(1985) 82 : 2267-2271도 참고.

표피증식 속도의 증가로 특징지어지는 피부병의 치료를 위해 적어도 한 가지의 형질전환 성장인자 β나 또는 그의 콘지너(congeners)를 포함하는 조성물 및 신규의 방법이 제공된다. 이 조성물들은 촉진된 표피증식, 시토키닌을 포함한 분열촉진제(미토겐)로부터 기인하는 비후 증상을 억제하는데 사용된다. 이 조성물은 발병된 피부부위에 국소적으로 투여될 수 있으며, 각질층을 통한 흡수가 개선된 조제형태로 제공되는 것이 바람직하다.

본 발명에 따라, 건선 및 관련 피부병 증상의 치료를 위해 표피에 있어서의 분열촉진제에 의해 자극된 케라틴세포의 성장을 저해하기 위한 조성물 및 방법이 제공된다. 이 조성물은 TGF-β의 연속적인 아미노산 배열과 적어도 부분적으로 동일한 아미노산 배열을 실제로 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 반대작용을 할 수 있는 케라틴세포 분열촉진제에는 EGF와 TGF-α가 포함된다.

원숭이의 TGF-β DNA의 뉴클레오티드 배열과 인간과 원숭이의 TGF-β의 아미노산 배열을 제1도에 나타내었다. 성숙한 TGF-β1은 다음의 배열을 가지며 :

성숙한 TGF-β2는 다음의 배열을 갖는다 :

여러 가지 아미노산을 다음과 같이 단일문자로 나타내었다 : A=알라닌; R=아르기닌; N=아스파라긴; D=아스파라트산; C=시스테인; Q=글루타민; E=글루탐산; G=글리신, H=히스티딘; I=이소류신; L=류신; K=라이신, M=메티오닌; F=페닐알라닌, P=프롤린; S=세린; T=트레오닌; W=트립토판, Y=티로신; 및 V=발린.

주제의 조성물의 배열은 대개 TGF-β 전구체 폴리펩티드를 포함하여 TGF-β 분자 단편의 배열과 필적할 것이다. 이 조성물은 표피세포의 증식, 특히 케리틴세포의 증식을 억제하는데 있어서 관찰된 TGF-β의 생물적 효과가 관련된 분자의 일부분과 실제로 상응하는 배열을 포함할 것이다.

본 발명의 조성물은 활성부로서 적어도 약 8개의 아미노산, 대개는 적어도 약 25개의 아미노산, 더욱 흔히는 적어도 약 35개의 아미노산, 완전한 길이까지의 적어도 하나의 TGF-β 또는 TGF-β 전구체 폴리펩티드를 갖는다. 이 조성물은 바람직하게는 TGF-β의 동종이량체로 된다. 동종이량체란 각각 적어도 8개의 아미노산으로된 2개의 동일한 아미노산 사슬로 된 폴리펩티드를 의미한다. 이 두 사슬의 바람직한 연결방법은 사슬간 디술파이드 결합에 의한 것으로, 여기서 각 사슬은 적어도 한 개의 시스테인을 포함한다. 다른 연결법도 가능하다.

아미노산 배열이 상술한 배열에 정확히 상응할 필요는 없고 대개 1개 이하의 아미노산의 결실 및 삽입을 포함하는 1∼4가지의 보존적 혹은 비보존적 치환에 의해 변형될 수 있음과 이때 이 변형은 생성물의 활성에 심각한 영향을 미침이 없이, D-아미노산을 포함할 수 있음을 이해하여야 한다. 그러므로 주제의 폴리펩티드는 사용상 어떠한 잇점을 얻을 수 있다면 보존적이던 비보전적이던 삽입, 결실, 및 치환과 같은 여러변형을 가할 수 있다. 보존적 치환이란 G,A; V,I,L; D,E; N,Q; F,T; K,R; 및 S,Y,W와 같은 조합을 의미한다.

TGF-β와 그의 콘지너들은 여러방법으로 얻을 수 있다. 이들은 소뼈 및 인간의 혈소판과 같은 자연원으로부터 입수할 수 있다. 이들의 제조방법은 다음을 포함한다 : 펩티드는 공지의 프로토콜에 따라 시판하는 여러 자동합성기를 이용하여 고체 지지체에서 합성할 수 있다. 예컨대, Stewart 및 Young의 Solid Phase Peptide Synthesis, 2판, Pierce Chemical Company(1984) : 및 Tam외, J.Am.Chem.Soc. (1983) 105 : 6422참고. 또한, 이들은 재조합 DNA 기술을 이용하여 제조할 수도 있다. 그러므로, 디히드로폴레이트 환원효소(dhfr)유전자 증폭에 의해 고도로 발현된 TGF-β에 대한 원숭이의 유전자가 함유된 중국산 햄스터난소세포(CHO)에 의해 조건화시킨 생육배지로부터 이들을 얻을 수 있다. 형질전환된 CHO 세포로부터 TGF-β 전구체 폴리펩티드와 동종이량체를 얻는 방법이 Gentry 등의 Molecular and Celluar Biology(1987) 7 : 3417-3427 및 1988년 1월 25일자 미합중국 특허출원 제147,842호에 기재되어 있으며 이들을 본 명세서에 참고 삽입하였다. TGF-β나 그의 단편도 공동계류중인 1988년 1월 25일자 미합중국 특허출원 제148,267호 기재된 재조합 기술에 의해 제조할 수 있다. 이 문헌은 본 명세서에 참고삽입하였다.

TGF-β는 여러 가지 정제기술에 의해 실제로 세포성분이 없도록 정제시킬 수 있다. 이러한 기술은 용매추출, 겔침투 크로마토그래피, 역상 HPLC, 전기영동, 이온교환 또는 흡착 크로마토그래피등을 포함한다.

배양용도에서, 형질전환 성장인자는 어떠한 척추동물로부터도 유래될 수 있으며 세포와 그 유래를 꼭 같이할 필요는 없다. 그러나, 포유류를 치료하는데에는, 잠재적인 면역반응을 최소화하기 위해 자연발생 성분과 실제로 동종의 성분을 사용하는 것이 바람직하다. 대체로 성분은 숙주로부터의 자연발생 배열의 아미노산 배열과 5몰 퍼센트 미만, 더욱 흔하게는 2몰 퍼센트 미만의 차이가 날 것이다.

TGF-β나 그의 콘지너는 감염된 피부에 도포하기 위해 일반적으로 크림이나 연고 베이스로 조제된다. TGF-β나 그의 콘지너는 하나의 화합물로 사용될 수 있다. 이 화합물은 대개 최소한 약 50%의 순도로부터 완전한 순도로 제공된다. 이 폴리펩티드는 치료조성물중 표피 세포증식 억제량만큼 존재하게 되며; 일반적으로 성숙한 TGF-β를 약 20 내지 약 40ng/ml 사용함으로써 배양된 케라틴세포를 50% 이상 억제할 수 있다. 케라틴세포의 증식을 억제하는데 있어 가장 효과적인 TGF-β의 농도는 배양된 케라틴세포에 여러농도의 TGF-β를 첨가하여 각 농도에 따른 세포 증식 억제효과를 모니터함으로써 결정할 수 있다. 억제에 요구되는 양은 사용된 TGF-β의 상대적인 강도에 따라 변할 수 있다. 예컨대, 성숙한 TGF-β보다 상대 생물활성이 낮은 TGF-β 콘지너를 사용할 경우에는 농도를 높여야 한다. 성숙한 TGF-β의 경우, 사용농도는 일반적으로 약 20ng/ml를 넘는다.

요구된다면, TGF-β 함유조성물은 감염부위가 이 펩티드에 지속적으로 노출되도록 하기위해 붕대나 기타 치료용 드레싱에 포입시킬 수 있다. 담체의 성격은 크게 다를 수 있으며 목적부위와 적용형식에 의존할 것이다. 다른 적용예로서 주사 및 에어로졸방식 및 피부분사에 의해 제공되는 가압투여를 들 수 있다.

TGF-β의 생물활성을 보존하기 위해, 예컨대, 약 0.5-15%농도의 글리세롤 스테아레이트, PEG-40 스테아레이트, 소르비탄 스테아레이트와 같은 비이온계 유화제; 약 1-20%의 지방산 에스테르와 같은 연화제; 약 1-15%의 소르비톨과 같은 보습제; 및 약 0.1-2%의 벤질알코올 또는 카톤 C.G.와 같은 보존제를 함유하는 오일앤드워터(o/w) 타잎의 크림성 백색 유제와 같은 크림담체로 TGF-β를 조제할 수 있다. 바람직한 조제에는 또한 TGF-β의 안정성을 돕기 위해 인체혈청 알부민, 콜라겐 및 그의 유도체와 같은 단백질 담체를 크림베이스 1g당 0.01 내지 0.1g만큼 첨가시킨다. 이러한 조제로부터의 생물활성적 TGF-β의 회수백분율은 연화제가 디메티콘, 퍼트롤륨 또는 그 유사물, 또는 글리세린과 같은 보습제를 함유하는 조제의 경우보다 높다.

본 발명의 펩티드는 단독으로 사용할 수도 있고 예컨대 종양 괴사인자-β, 종양 괴사인자-α, TGF-β, 또는 혈소판인자 4등과 같은 1종 이상의 기타 항증식 화합물과 함께 사용할 수도 있다.

[TGF-β 및 그의 콘지너의 용도]

주제의 조성물은 극세포증계통의 피부병과 관련한 피부 비후의 치료 및 시토카인-유도증상과 관련한 건선증상을 완화시키는데서 그 용도를 찾을 수 있다.

이들의 증식억제특성 용도외에도, TGF-β 및 그의 단편은 진단에 이용될 수 있다. 그러므로 TGF-β나 그의 단편은 방사능동위체, 효소, 플루오레서, 화학발광체, 효소단편, 입자등과 같은 표식자와 결합시킬 수 있다. TGF-β의 진단 용도의 예로 세포상의 TGF-β에 대한 섭수체의 수를 측정하는 것을 들 수 있다. TGF-β의 섭수체의 동정은 곧 TGF-β의 증식억제효과에 대한 세포의 잠재적 반응성을 나타내는 것이다. 그러므로 부거표본은 TGF-β의 섭수체 존재여부에 대해 분석할 수 있다. 이러한 섭수체를 갖지않는 환자는 본 발명의 조성물을 이용한 치료에 반응할 가능성이 적다고 할 수 있다. 또한, 상이한 치료방식에 따른 섭수체 수의 정량에 의해, 예컨대, 시간과 치료, 배열 및/또는 사용된 특성치료 조성물의 조성물의 조제사이의 치료프로토콜을 최적화시킬 수 있다. 예컨대, TGF-β의 섭수체의 수를 증가시키는 치료방식이 TGF-β를 함유하는 조성물에 대한 반응성을 증가시키리라는 것을 기대할 수 있다.

다음의 실시예는 설명목적을 위한 것으로서 본 발명의 범위를 한정하고자 함이 아니다.

[실험]

TGF-β : 달리 명시되지 않는한, 모든 실험에 사용된 TGF-β는 Seyedin 등이 기재한 바와 같이 소뼈로부터 수득한 겉보기 분자량이 약 24,000인 TGF-β1(동종이량체)이다.

[실시예 1]

TGF-β1 단독 또는 EGF나 TGF-α와의 배합사용에 의한 케라틴세포에서의 DNA 합성저해

트립신화에 의해 신생 전피부(neonatal foreskin)로부터 사람의 케라틴세포를 수확하였다. 이 피부를 0.9% 염수중에서 페니실린 및 스트렙토마이신으로 세척하고 실온에서 0.2% 트립신 용액중에 12시간동안 놓아두었다. 표피의 상층을 제거하고 전피부를 McCoy' 5A배지에 옮겼다. 전피부의 표면을 곡선집게로 브러싱하여 기초 케라틴세포를 수확하였다. 배지중에서 세포를 세척하고, 40,000세포/m²으로 계수하여 플레이팅시켰다.

[표 1]

* 대조군과 큰 차이를 보임(N=S)

37℃, 5% CO₂/95% 공기에서 12 내지 18시간동안 배양시켜 세포가 부착되도록 배양하고, 배지를 TGF-β가 단독으로 함유된 배지나 혹은 TGF-β와 함께 TGF-α 또는 EGF가 배합된 것 10ng/ml을 함유하는 배지로 대체하였다. 대조군 배양체에는 배지만을 사용하였다. 6일 후, 1μCi/ml 3중수소화 티미딘으로 6시간동안 세포를 펄스시켰다. 다음 배양체를 수확하고, 총 DNA를 측정한 다음 DNA로 취입된 3중수소화티미딘을 측정하였다. 시험배양체의 DNA의 비활성을 대조군 배양체의 그것과 비교하였다. 표 1에 나타난 바와 같이, TGF-β는 단독이던(0.4 내지 40ng/ml) 또는 EGF(10ng/ml)나 TGF-α(10ng/ml)와 배합되서 든 배양중의 인체 케라틴세포의 성장을 억제하였다. 따라서, TGF-β는 투여량-의존형식으로 케라틴세포의 증식을 억제하였다. 이것은 또한 케라틴세포의 증식에 미치는 EGF나 TGF-α의 촉직효과도 방지하였다.

[실시예 2]

케라틴세포에 있어서 DNA 합성에 대한 인터류킨-1 자극의 전도

트립신 부양법을 이용하여 마우스 케라틴세포를 제조하였다. 세포를 Dulbecco' 변형 Eagles 배지(DMEM)에서 10% 열-실활 송아지 혈청과 함께 배양시켰다. 이튿날 배지를 0.6mM Ca²⁺가 함유된 신선한 무혈청 배지(DMEM/변형 F-12 배지, 3:2)로 대체하여 케라틴세포를 G₁(G₀)에 잡아두고 분화를 방지하였다.

시험할 세포를 10% 송아지 태아혈청이 함유된 DMEM/변형 F-12배지 50μl당 3×10³세포의 항상비율로 96-웰 조직배양판(Falcon 302)에서 배양하였다. 시험할 조성물을 0.2M 초산에 두고 멸균 12×75mm 튜브(Falcon 2063)에서 동결건조시켰다. 재조합 IL-1을 Collaborative Biochemicals사(매사츄세츠, 랙싱턴)로부터 구입하고 표 2에 나타낸 농도로 사용하였다. 사람의 혈소판으로부터 TGF-β를 수득하였다.

[표 2]

동결건조시킨 시료를 DMEM 중에서 10% 송아지 태아혈청과 함께 재현탁시키고 플레이팅을 수행한지 5시간 후에 삼중으로 시험 웰에 50μl 만큼 첨가하였다. 5% CO₂-95% 공기분위기 37℃에서 72시간 배양시킨 후, [¹²⁵I]IdUdr(Amersham IM355), 티미딘 동족체를 50μl 배지에 첨가하였다(lμCi/ml). 세포를 추가로 24시간 배양하고 인산완충염 용액(PBS)으로 1회 세척한 다음, 200μl 메탄올로 10분간 고정시켰다. 다음 세포를 15분간 공기-건조시킨 후 65℃에서 200μl의 1M NaOH 중에 20분간 용해시켰다. 표식물질을 Titertech Supernatant Collection System (Flow Laboratories, 78-210-05)을 이용하여 수집하였다. 중식저해를 미처리세포로의 취입에 비교했을 때 처리세포로 취입된 [¹²⁵I]IdUr의 백분율 감소로서 표현하였다. 표 2에 나타낸 바와 같이, IL-1(30 내지 120units/ml)은 케라틴세포에 있어서 DNA 합성을 자극하였으며; TGF-β(5 내지 20ng/ml)는 DNA 합성의 IL-1 유도 촉진을 방해하였을 뿐만 아니라, 나아가 DNA 합성을 억제하기도 하였다.

[실시예 3]

표피 세포증식에 대한 TGF-β1과 TGF-β2의 저해능력비교

신생 전피부로부터의 케라틴세포를 실시예 1에서와 같이 배양하였다. 세포를 플레이트 아웃시킨 후, 배지를 EGF(10ng/ml) 또는 TGF-α(10mg/ml)가 함유되고 세가지 농도중 한가지 농도의 TGF-β2(표 3 참고)가 함유된 배지로 대체시켰다. 성장인자와 배합시켜 6일간 배양한 뒤, 배양체로 3H-티미딘으로 6시간동안 펄스시키고, 세포 DNA의 비활성을 측정하였다. 표 3에 나타낸 바와 같이, 증식을 촉진하는 EGF나 TGF-α가 존재하여도 TGF-β1이나 TGF-β2는 모두 세포의 증식에 반작용 할 수 있었다. TGF-β인자들을 케라틴세포증식을 억제함에 있어 그 강도가 유사하였다.

[표 3]

* 대조군과 큰 차이를 보임.

[실시예 4]

TGF-β의 경피흡수

겉보기 분자량이 약 2000kDA를 초과하는 화합물은 피부에 잘 침투하지 못한다. 그러므로 증진제(Azone)의 효과를 평가하였다. 죽은 사람의 피부를 통한 TGF-β의 경피흡수를 한정 투여량 프란쯔 확산모델을 이용하여 프란쯔 확산챔버(제2도)에서 측정하였다. 사용시, 피부를 셀 캡(공여기)과 셀 보디(수용기)사이에 고정시킨다. 세척목적으로 설치된 포트로부터 등상염수용액을 분사시켜 피부를 하부로부터 세척하였다. 식염용액 챔버를 둘러싼 워터 재킷의 하부로 들어가서 상부까지 순환하는 온도조절 보더에 의해 온도를 37℃로 유지한다. 물을 공급하고 항온조에 연결된 2개의(상부 및 하부)스테인레스강 다기관에 의해 제거한다. 염용액중에 균일한 온도분포는 타이밍 모터에 설치된 외부자석에 의해 추진되는 테프론 피복자력교반막대의 교반작용에 의해 달성한다. 셀 캡을 대기를 향해 열고, 표피를 실험실 환경의 주변조건에 노출시킨다. 마이크로피펫이나 교반막대를 이용하여 열린 캡에 의해 시험화합물의 한정투여량이 표피에 도포되게 한다.

TGF-β 흡수분석 방법은 다음과 같다. 부검시 등에서 얻은 사람의 표피를 -70℃에서 저장한 다음, 실온에서 급속히 해동한다. 60℃로 가열한 2개의 알루미늄 블록사이에 피부를 2분간 샌드위칭시킴으로써, 피부로부터 각질층이 붙어있는 표피를 제거한다. 표피스트립을 1cm²가용표면적의 프란쯔 확산 챔버(제2도)에 고정시킨다.

30% 아세토니트릴, 0.05% TFA중의 [³⁵S]-TGF-β (3×10⁶cpm/μg)를 소외 혈청알부민 50μg이 첨가된 후 Speed-Vac 시스템에서 건조시켰다. 일단 건조시킨 다음, [³⁵S]-TGF-β를 2부분으로 나누어, 하나는 Vehicle-N(물중 4% 프로필렌 글리콜, 47.5%에탄올 및 4% 이소프로필 알코올로 구성됨)에, 다른부분은 물중 5% Azone(도데실아자시클로헵탄), 침투촉진제를 함유하는 Vehicle-N에 용해시켰다. Azone은 Nelston Laboratories사 제품을 이용하였다. 각 담체혼합물 20마이크로리터를 별개의 2가지 피부시료에 피펫으로 부하시켰다. 각 담체 10μl를 스탠다드로서 분석하였다. 챔버 용액을 분석을 위해 제거하고 TGF-β투여후 4, 8, 12, 24, 36 및 48시간째에 신선한 용액으로 대체시켰다. 챔버용액 3ml를 섬광용액 10ml와 혼합하고 섬광계수기에서 계수하였다. 각 시료로부터의 잔여 챔버용액(약 2ml)을 다른 챔버용액과 함께 수집하여 -30℃에서 저장하였다.

[표 4]

48시간 후 표피를 챔버로부터 제거하고 1ml의 Soluene-350에 용해시켰다. 섬광액 10ml첨가하고 시료를 계수하였다. 2회 계수하여 이를 평균내고 외부 스탠다드 H계수법에 의해 급냉에 대해 보정하였다. 결과를 표 4에 나타내었다. 이 결과는 TGF-β의 침투가 Azone(5%)에 의해 증진되었음을 시사한다.

[실시예 5]

인체피부로의 침투

건선피부의 각질층이 컴프로마이즈화(compromised)된 것으로 알려졌다. 정상피부와 건선피부로의 TGF-β의 상대적 침투성을 다음과 같이 평가하였다. 건선피부를 각막절개도를 사용하여 지원자로부터 0.4mm간격으로 얻었다. 관련 표피시료를 프란쯔 셀(제2도)에 넣고 식염수와 함께 하부로부터 천천히 살포하였다. 정상인의 피부시료를 대조군으로 사용하였다. [³⁵S]-TGF-β 3×10⁶cpm/μg을 인산완충용액중 4μg/ml 냉 TGF-β와 혼합하였다. 0.75×10⁶cpm을 함유하는 이 용액 50μl를 피부단면 상부에 놓고 챔버 하부로의 표식의 확산을 모니터하였다. 최초의 12시간 이내에³⁵S-표식단백질 34%가 건선 병소부위 아래로 확산하였다. 그러나, 정상피부에서는 표식단백질의 0.4%만이 정상피부 아래로 확산하였는데, 이는 건선피부에서 TGF-β가 더욱 효율적으로 침투함을 나타내는 것이다.

[표 5]

[실시예 6]

피부용 크림으로부터의 TGF-β 회수

여러가지 비이온계 유화제 크림베이스가 TGF-β의 활성을 보지하는 능력을 평가하기 위해, 유사한 TGF-β1을 크림담체 A, B, C 및 D중 어느 하나로 조제하였다. 조제 A, B 및 D는 비이온계 유화성 크림베이스중 퍼트롤륨, 글리세린 및 디메티콘을 함유하였다. 세가지 조제중 이들 성분의 백분율을 표 6에 나타내었다.

[표 6]

조제 C는 오일앤드 워터(o/w) 타입으로서, 표 7에 나타낸 조성으로된 크림빛 백색의 유화제 베이스이다.

[표 7]

¹Kathon으로서 시판됨 ; Rohm and Haas, Pa로부터 구입

각각의 크림 0.2g을 TGF-β 1μg 또는 10μg을 함유하는 PBS 20ml와 혼합함으로써 조제들을 제조하였다. 사용시 인체 혈청 알부민(10μg/0.2g)을 조제에 첨가하였다. 크림의 pH는 H.S.였다. 실온에서 크림을 정치시킨 다음, 증류수 1ml/0.2g 크림으로 추출하였다. 크림을 원심분리시킨 다음 Bourne 등의 Science(1986) : 531-534에 기재된 바와 같이 방사능 섭수체 분석을 이용하여 TGF-β 활성에 대해 상청액을 분석하였다. 디메티콘, 퍼트롤륨 또는 글리세린을 함유하지 않은 조제 C가 이들 성분들을 함유한 다른 조제들보다 TGF-β 활성을 더 잘 유지하였다. 그러나, 인체 혈청 알부민(10μg/0.2g)이 존재하자, TGF-β 회수는 조제 A 및 C의 경우 유사하였다.

상술한 결과로부터, IL-1, EGF 및 TGF-α에 의해 유도되는 케라틴세포의 증식에 대항할 수 있는 TGF-β 함유조성물이 제공됨을 분명히 알 수 있다. 그러므로, 이 조성물은 건선과 같은 비후성 피부질환의 치료수단을 제공한다.

본 명세서에서 언급된 모든 공개문헌 및 특허출원들은 본 발명이 속하는 기술분야의 숙련가들에게 기술수준을 가늠케할 것이다. 모든 공개문헌과 특허출원들은 특정적으로 그리고 개별적으로 참고로 삽입된 만큼 본 명세서에 참고삽입하였다.

이제까지 본 발명을 충실히 기재하였는바, 본 발명이 속하는 기술분야의 숙련가라면 첨부된 특허청구범위의 정신이나 범위로부터 이탈함이 없이 본 발명에 여러변화와 변형을 가할 수 있음을 분명히 알 수 있다.

Claims (10)

1. TGF-β의 완전한 배열의 최소한 8개의 연속적인 아미노산으로 이루어진 형질전환 성장인자-베타(TGF-β) 또는 그의 단편을 하나이상 필수적으로 포함하면서, 표피세포의 증식을 억제할 수 있는 조성물을 상기의 표피세포와 접촉시키는 것을 특징으로 하는 인간을 제외한 포유동물의 표피 세포의 증식억제방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 표피세포가 케라킨세포인 것이 특징인 인간을 제외한 포유동물의 표피세포의 증식억제방법.
3. 제1항에 있어서, 상기 형질전환 성장인자 베타가 TGF-β1이나 TGF-β2로 되는 것이 특징인 인간을 제외한 포유동물의 표피세포의 증식억제방법.
4. 형질전환 성장인자-베타의 완전한 배열중에 포함되는 최소한 8개의 연속적인 아미노산으로 이루어지면서 케라틴세포의 증식을 억제할 수 있는 폴리펩티드를 필수적으로 함유하는 시토카인 유도성 증식의 억제자를 상기 케라틴세포와 접촉시키는 것을 특징으로 하는 인간을 제외한 포유동물의 케라틴세포의 시토카인 유도성 증식억제방법.
5. 제4항에 있어서, 상기 시토카인이 TGF-α, 인터류킨 1, 및 EGF 중 적어도 하나인 것이 특징인 인간을 제외한 포유동물의 케라틴세포의 시토카인 유도성 증식억제방법.
6. 복수의 초고속 증식표피세포들을 TGF-β1이나, TGF-β2 또는 이들의 콘지너(congener)로 된 폴리펩티드의 증식억제량과 접촉시킴을 특징으로 하는 인간을 제외한 포유동물의 복수의 초고속 증식표피세포의 증식억제방법.
7. 생리적으로 허용되는 담체중에 최소한 하나이상의 형질전환 성장인자-베타 1이나 형질전환 성장인자-베타 2 또는 그의 콘지너의 세포증식억제량이 포함된 케라틴세포 증식억제조성물.
8. 제7항에 있어서, 상기의 생리적으로 허용되는 담체에 표피 침투촉진제가 추가로 포함됨을 특징으로 하는 케라틴세포 증식억제조성물.
9. 제8항에 있어서, 상기 촉진제가 약 5 내지 약 50%의 디메틸술폭시드로 된 것이 특징인 케라틴세포 증식억제조성물.
10. 제9항에 있어서, 상기 농도가 약 25%인 것이 특징인 케라틴세포 증식억제조성물.

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