KR880001120B1

KR880001120B1 - 엘라스타제의 정제 방법(Elastase의 精製方法)

Info

Publication number: KR880001120B1
Application number: KR8205414A
Authority: KR
Inventors: 쓰네히꼬 가다오까; 요시아끼 나가라; 아끼라 하시모도; 마사유끼 고니시; 고오이찌 오가와
Original assignee: 나이또오 유우지; 에자이 가부시끼가이샤
Priority date: 1981-12-15
Filing date: 1982-12-03
Publication date: 1988-06-30
Also published as: EP0081831A3; JPS6356798B2; DE3270177D1; JPS58101693A; EP0081831A2; US4458018A; EP0081831B1; ATE18777T1; KR840002902A; CA1190495A

Abstract

내용 없음.

Description

엘라스타제의 정제 방법(Elastase의 精製方法)

본 도표는 상이한 전도도를 갖는 4종의 시료용액을 사용하여 결정한, 조엘라스타제 함유 시료용액의 pH와 엘라스타제 활성 잔존율과의 관계를 나타내는 것이다.

본 발명은 엘라스타제의 정제법에 관한 것이다. 더욱 상세히 말하면 본 발명은 엘라스타제 함유 수용액으로부터 엘라스타제를 침전시킴으로써 엘라스타제를 정제하는 방법에 관한 것인바, 이때 엘라스타제 함유 수용액의 전도도(電導度)를3mν/㎝ 또는 그 이하로, 또 pH를 2~5범위의 값으로 조정하는 것이다.

본 발명의 목적은 엘라스타제 함유 수용액의 전도도와 pH를 상기 규정 범위내로 조정하므로써 엘라스타제를 고활성의 엘라스타제분(Elastase 分)으로서 얻는 것이다.

엘라스타제의 제법으로서는, 일반적으로 돼지의 췌장에 함유되어 있는 엘라스타제 전계물(前階物)을 우선 분리하고, 적당한 방법으로 활성화시킨다음 황산암모늄 부분 분리법(염석)이나 유기용제에 의한 처리를 받게 함으로써 조(組)엘라스타제 함유 생성물(生成物)을 얻는 방법이 이용되어 왔다. 이와 같은 조생성물내의 엘라스타제는 다음에 여기에 인산염 완충액이나 이에 상당하는 물질을 가하여 추출하고, 이와 같이 추출된 엘라스타제를 황산암모늄 부분분리 조작을 더욱 받게한 다음 결정화 시킨다.

이와 같은 종래의 방법은 특히 엘라스타제 함유 조생성물에 함유된 엘라스타제를 정제하는 단계에 있어서 여러가지 문제점을 갖고 있다. 예를 들면 이 단게에서 다량의 황산암모늄을 사용하여야 하고, 그렇지 않으면 정제에 소모된 황산암모늄의 양이 적기 때문에 얻어진 황산암모늄 부분분리 생성물의 엘라스타제 활성이 낮게되며, 이점은 불순물로 오염된 다량의 엘라스타제가 침전내에 그대로 잔유하게 된다는 것을 의미한다. 따라서 엘라스타제의 정제기술로는, 간단하고 용이한 조작으로 엘라스타제 함유 조생성물로 부터 고활성의 엘라스타제제분을 얻는 방법이 계속 추구되어 왔다.

본 발명은, 엘라스타제 함유 수용액의 전도도와 pH를 결정화 단계에서 각각 규정된 범위내로 조정함으로써 간단하고 용이한 조작으로 엘라스타제를 정제할 수 있다는 것을 발견함으로써 이루어진 것이다.

본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명에서 출발물로서 사용된 엘라스타제 함유 수용액은 엘라스타제 전계물, 예컨대 포유동물의 췌장에 하유된 엘라스타제 전게물이, 활성화되어 엘라스타제로 전환돈 후 어떠한 단게에서 얻어진 수용액이라도 될 수 있다.

예를 들면 이와 같은 용액은, 엘라스타제를 활성화한 후 조엘라스타제를 추출한 다음 조추출물을 유기용제로 처리하여 얻어진 조엘라스타제 함유생성물을 물이나 인산염 완충액에 용해시키므로써 얻거나, 또는 이와 같은 엘라스타제 함유 수용액을 청등여과하여 얻는 여액으로도 될 수 있다.

본 발명의 요건 중 하나는 엘라스타제 함유 수용액의 전도도를 3mν/㎝ 또는 그이하에 유지한다는 것이다. 이 요건을 만족시키기 위하여, 한외여과, 이온교환 또는 역침투등과 같은 방법을 이용할 수 있다. 이들 방법중 한외여과가 본 발명 목적으로 가장 적합하다. 다음에 기술한 실험결과로부터 명확한 바와같이, 전도도가 3mν/㎝ 이상이면 엘라스타제의 침전율이 나쁘고, 따라서 높은 엘라스타제 활성을 갖는 엘라스타제분을 얻기 곤란하다.

본 발명 방법의 또 다른 요건은 조엘라스타제 함유 수용액의 pH를 2~5의 범위에 유지시키는 것이다. 이 요건은 적당량의 아세트산, 염산 또는 유사한 산을 엘라스타제 함유 수용액에 가함으로써 만족되며, 특히 아세트산이 본 발명 목적에 특히 바람직하다. 후기하는 실험결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 엘라스타제 침전은 5 또는 그 이하의 pH에서 신속히 진행되고, 가장 바람직한 결과는 pH가 3~4.5일때 얻어진다. 더욱 구체적으로 설명하면, 본 발명의 바람직한 방법은, 엘라스타제 함유 수용액을 한외여과한 다음, 여기에 산, 바람직하게는 아세트산을 가하고 조엘라스타제 함유 수용액의 전도도와 pH를 특정범위내로 조정하고, 이에 의하여 출발수용액에 원래 존재하던 대부분의 엘라스타제, 예컨데 90%나 그 이상의 엘라스타제를 고활성의 엘라스타제 침전으로서 얻게하는 방법이다. 따라서 본 발명 방법을 실시하면 출발수용액내에 존재하는 잔유엘라스타제의 양이 대단히 낮아서, 즉 출발용액의 원래 존재하던 엘라스타제의 양이 10%이하이다. 대체로 용액의 전도도가 높으면 pH가 낮아야 된다. 예를들면, 전도도가 약 1.2mν/㎝이면 용액은 pH 4.8 또는 그 이하로 조정되어야 하고, 전도도가 약 2mν/㎝이면 4.5이하로 pH를 유지하는 것이 바람직하다. 이와 유사하게, 전도도가 약 3mν/㎝이면 pH는 3 또는 그 이하인 것이 바람직하다. 그러나 과하게 낮은 pH는 엘라스타제의 변성을 유발함으로, 용액의 pH는 2이상으로 유지하는 것이 바람직하다.

본 발명 방법에 따라 얻어진 엘라스타제 생성물을 즉시 여과하고 진공건조하면 원하는 엘라스타제 물질을 건조 생성물로서 얻을 수 있다. 더욱 정제된 엘라스타제 결정이 요구되는 일본 특허공보 21557/1975에 기술된 것과 같은 정제방법을 이용할 수 있다. 이 방법에 의하면, 본 발명 방법에 따라 얻어진 것과 같은 엘라스타제 침전을 여과하고 수용액에 재용해 시켜서 예컨대 pH7의 엘라스타제 수용액을 형성하고, 이 용액을 방치하여 이로부터 침전하는 엘라스타제 결정을 원심분리하고 동결 건조시킨다.

이와 같은 정제법은 일반적으로 특히 고순도의 엘라스타제가 요구되는 경우에 이용된다. 본 발명 방법에 의하여 얻어진 엘라스타제 침전이 특수용도를 위한 그 이상의 정제를 하지 않고도 사용할 수 있는 경우, 이와 같은 처리는 불필요하다.

본 발명은 이와 같은 부가적인 정제방법의 사용을 요구하지 않는다.

본 발명을 다음 실험예에서 더욱 설명하고저 한다.

[실험예 1]

시료 및 방법

실시에1에서 기술한 것과 같이 얻어진 조엘라스타제 함유 생성물을 10배 용적의 물에 용해시키고, 이 용액을 청징여과하여 엘라스타제 함유 수용액의 시료를 제조하였다.

이들 시료를 한외여과하여 개개의 시료가 각각 5, 3, 2 및 1.2mν/㎝의 전도도를 갖게 되었다. 다음에 시료에 농아세트산을 가하고 여러시료의 pH를 여러수준으로 조정하였다. 상기한 바와 같이 pH를 조정한 후 상기 시료들과 출발수용액을 1시간동안 방치한다음, 엘라스타제 침전을 제거하고, 잔유용액의 엘라스타제 활성을 측정하여 각 시료에 대한 활성잔존율을 결정하였다.

[결과]

결과는 도표에 나타나 있는바, 이 도표는 각실의 잔유용액에 대한 pH와 활성잔존율(%)과의 관게를 나타내는 것이다. 도표에서 0, 0,

및 △의 표시를 갖는 실측치점의 곡선은 각각 5, 3, 2 및 1. 2mν/㎝ 의 전도도를 갖는 시료를 나타내는 것이다. 도표에서 알수 있는 바와 같이, 엘라스타제 함유 시료수용액내의 엘라스타제 활성잔존율이 그 차이에 있어서 심하게 감소하는바, 이것은 수용액의 전도도가 3mν/㎝ 또는 그 이하이고, pH가 5 또는 그 이하, 바람직하게는 4.5 또는 그 이하인 경우 엘라스타제의 높은수율이 침전으로 얻어진다는 것을 시사하는 것이다.

본 발명을 다음의 실시예에서 더욱 상세히 설명하고저 한다.

[실시예 1]

얇게 썬 돼지췌장 1㎏에 220ml의 물과 1g의 판크레아틴 및 다음에 5ml의 40% 수산화나트륨 수용액을 가하였다. 이 혼합물을 격열히 교반한 다음 17℃에서 2시간 방치하여 혼합물의 엘라스타제를 활성화시켰다.

홀성화된 혼합물에 아세톤을 가하고 70V/V%의 농도를 갖는 용액을 제조하고, 이 용액을 1시간동안 교반하였다. 아세톤을 제거한다음 생성되는 침전에 1.2ℓ의 물을 가하고 용액을 형성케하고, 이 용액을 2시간동안 교반하였다. 10g의 하이플로 수퍼 셀(Hyflo super cel)을 가한다음 이 용액을 조여과하였다. 생성되는 1. 8ℓ 여액을 아세톤으로 희석하여 60V/V% 되게 하고, 이와 같이 형성된 침전을 여과하였다. 이 침전을 1.5ℓ씩의 아세톤으로 3호 세척한 다음 진공건조하여 조엘라스타제 함유 생성물을 얻었다.

상기 조생성물 50g에 500ml의 물을 가하고 용액을 형성시키고, 2시간 후 이 용액을 청정여과하여 500ml의 엘라스타제 함유 수용액을 얻었다. 이 용액을 한외여과하여 10,000이하의 분자량을 갖는 성분을 제거하여, 농축된 엘라스타제를 함유하는 100ml의 용액을 얻고, 다음에 이 용액을 몰토 희석하여 500ml의 용액이 되게 하였다. 이 희석된 용액의 전도도는 1.6mν/㎝이었다. 다음 여기에 1.0ml의 농아세트산을 가하고 pH를 4.5로 조정하였다. 이 용액을 1시간 방치한 후 생성된 침전을 여과해 낸 다음, 이 침전을 물로 용해시켜서 pH가 7인 용액이 되게한 후 3일간 방치하였다. 이 기간말에 형성된 결정을 원심분리한 다음 동결건조시켜 엘라스틴 분해 활성이 150단위/㎎인 엘라스타제 결정 1.2g을 얻었다.

[실시예 2]

얇게 썬 돼지의 췌장 10㎏에 10ℓ의 물과, 70g의 판크제아틴과, 다음에 50ml의 40% 수산화나트륨 수용액을 가하였다. 이 혼합물을 교반한 다음 35℃에 2시간 방치하여 엘라스타제를 활성화시켰다. 다음에 이용액을 30V/V%농도까지 아세톤으로 희석하고, 100g의 하이플로 수퍼 셀 100g을 가한 후 이 용액을 조여과 하였다. 생성되는 조여액을 아세톤으로 희석하여 60V/V% 농도가 되게하고, 이로써 형성된 침전을 여과해 내었다. 다음에 이 침전을 1.5ℓ씩의 아세톤으로 3회 세척하고 진공 건조시켜 조엘라스타제 함유생성물을 얻었다. 이 조생성물 100g에 1ℓ의 물을 가하고 용액을 형성시키고, 2시간후에이 용액을 청징여과하여 1ℓ의 조엘라스타제 함유 수용액을 얻었다. 이 용액을 한외여과하여 10,000이하의 분자량을 갖는 성분을 제거하여 150ml의 농축된 용액을 얻고, 여기에 물을 가하여 1ℓ의 수용액을 형성시켰다. 이 용액의 전도도는 1.2mν/㎝이었다. 여기에 2ml의 농아세트산을 가하여 pH를 4.5로 조정하였다. 이 용액을 1시간동안 방치한 다음 형성된 침전을 여과해내고, 물에 다시 용해시켜 pH7의 수용액을 형성시킨 다음 3일간 방치하였다. 이 기간말에 형성된 결정을 원심분리한 다음 동결건조시켜 엘라스틴분해활성이 150단위/㎎인 엘라스타제 결정 2.5g을 얻었다.

Claims

본문에 상술한 바와 같이, 조엘라스타제의 출발수용액을 처리하여 3mν/㎝이하의 전도도가 2~5pH를 갖는 수정된 수용액을 얻는 단계와, 다음에 상기 수정된 수용액으로부터 엘라스타제를 침전시키는 단계로 구성되는 것을 특징으로 하는 , 엘라스타제의 정제방법.
청구범위 1항에 있어서, 상기 출발용액을 한외여과함으로써, 출발용액의 전도도를 3mν/㎝ 또는 그 이하로 조정하는 것을 특징으로하는, 엘라스타제의 정제방법.
청구범위 1항에 있어서, 상기 수정된 수용액의 pH가 3~4.5범위인 것을 특징으로 하는, 엘라스타제의 정제방법.
청구범위 1항에 있어서, 포유동물의 췌장으로부터 엘라스 타제 전계물을 추출한 다음, 상기 전계물을 활성화시켜 조엘라스타제 생성물을 형성케 하기에 유효한 조건하에 상기 엘라스타제 전계물과 활성화제를 혼합하고, 다음에 상기 조엘라스타제 전생물을 회수하여 이로부터 출발수용액이 되게 함으로써, 상기 출발수용액이 제조되는 것을 특징으로 하는, 엘라스타제의 정제방법.
청구범위 1항에 있어서, 상기 수정된 수용액의 전도도가 약 1.2mν/㎝이고, 그의 pH는 4.8 또는 그 이하인 것을 특징으로 하는, 엘라스타제의 정제방법.
청구범위 1항에 있어서, 상기 수정된 수용액의 전도도가 약 2mν/㎝이고, 그의 pH는 4.5 또는 그 이하인 것을 특징으로 하는, 엘라스타제의 정제방법.
청구범위 1항에 있어서, 상기 수정된 수용액의 전도도가 약 3mν/㎝이고, 그의 pH는 3 도는 그 이하인 것을 특징으로 하는, 엘라스타제의 정제방법.
청구범위 4항에 있어서, 포유동물의 췌장이 돼지의 췌장인 것을 특징으로 하는, 엘라스타제의 정제방법.
다음(a)~(h)의단계로 구성되는 것을 특징으로 하는, 엘라스타제의 제조방법. (a) 포유동물의 췌장으로부터 엘라스타제의 전계물을 추출하는 단계 ; (b) 다음에 상기 전계물을 활성화시켜 엘라스타제를 형성케 하기에 유효한 조건하에, 상기 엘라스타제 전계물과 활성화제를 혼합하는 방법 ; (c) 다음에 상기 엘라스타제를 불순한 고체의 알레스타제 함유생성물의 형태로 회수하는 단계 ; (d) 다음에 상기 고체 엘라스타제 함유생성 물에 물을 가하여 조엘라스타제 함유 수용액을 형성시키는 단계 ; (e) 당므에 상기 조엘라스타제 함유 수용액을 한회여과함으로써 이로부터 10,000 또는 그 이하의 분자량을 갖는 불순물을 제거하여 3m/ν/㎝ 또는 그 이하의 전도도를 갖는 수정된 엘라스타제 함유 수용액을 얻는 단계 ; (f) 다음에 상기 수정된 용액에 사에트산을 가하여 그의 pH를 2~5로 조정하는 단계 ; (g) 다음에 상기용액을 엘라스타제 침전이 형성되기에 충분한 시간동인 방치하는 단계 ; (h) 상기 침전을 회수하는 단계.
청구범위 9하에 있어서, 상기 아세트산 부가후의 상기 용액의 pH가 3~4.6인 것을 특징으로 하는, 엘라스타제의 제조방법.