KR870001673B1 - 고구마 β-아밀라제 정제 및 결정화 방법 - Google Patents

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Description

고구마 β-아밀라제 정제 및 결정화 방법

제1도는 본 발명에 의한 정제 및 결정화 방법의 각 공정을 나타내는 순서도.

제2도는 정제 고구마 β-아밀라제의 결정 사진으로서,

제2(a)도는 본 발명에 의한 상온 아세톤 분획으로 정제된 수용액상의 결정을 나타내는 배율 100배의 현미경 사진.

제2(b)도는 종래의 냉아세톤 분획으로 정제된 수용액 중의 결정 사진.

제2(c)도는 종래의 냉아세톤 분획으로 정제된 아세톤 용액중의 결정사진.

제2(d)도는 다른 종래 방법에 의한 황산 암모늄 분획으로 정제된 황산 암모늄중의 결정 사진.

제3도는 결정 고구마 β-아밀라제의 자외 흡광 형태를 나타내는 도면.

제4도는 정제 결정된 고구마 β-아밀라제의 디스크겔 전기 영동상을 나타내는 도면.

제5도는 고속 액체 크로마토 그래피에 의한 정제 효소-기질 반응 산물의 분석 형태를 나타내는 도면이다.

본 발명은 고구마 β-아밀라제 정제 및 결정화 방법에 관한 것으로 특히 상온 유기용매 분획법에 의하여 단시간에 고구마 착즙액에서 β-아밀라제를 수출하여 정제 및 결정화 하는 방법의 개량에 관한 것이다.

β-아밀라제는 다당류의 (α-1.4-1) 결합을 비환원성 말단에서 부터 차례대로 가수분해 하여 β-형의 말토스(maltose)를 생산하는 효소로서 발효공업, 식품공업, 의약품 공업 등 산업적 용도는 물론 탄수화물과 효소학적 실험, 연구에도 필수적인 효소로 날로 그 수요가 늘어나고 있다.

현재까지, β-아밀라제는 맥아, 보리, 밀, 콩, 발아수수, 무우, 미생물, 고구마 등에서 추출 정제된 바 있는데, 고구마 β-아밀라제 정제 및 결정화에 관해서는 발스 (Ball, A.K.)등이 최초로 발표한 바 있다. (J. Biol. Chem., 9, 1948 및 미국 특허 제 2,496,261호). 그후, 여러가지 추출법이 나 정제 및 결정화 방법이 제안 되었는데, 독일 특허공보 제 2,129,705호 및 제 2,418,708호, 미국 특허공보 제 3,801,462호 일본 특허 공보 제75-107182호 및 제82-11636호 등에 개시된 추출법은 결정화 이전의 저순도 효소만을 그 대상으로 하고 있다.

그러나, 종래의 정제 및 결정 방법으로서, 상기한 발스의 방법(J. Biol. Chem., 9, 1948)과 그 변형방법으로서 베른 펠드에 의해 제안된 방법(Methods in Enzymology, Academic Press V.1, 149, 1955)은 일종의 황산 암모늄 분획 방법으로서, 필요조건이 많기 때문에 1주일 이상의 시간을 필요로 하고, 결정화가 까다로워 결정화에 핵이 필요하며, 결정 수율도 낮을 뿐만 아니라 9회에 걸쳐 재결정 시켜도 불순물로서 황색물질, 산성 포스포타제, α-글루코시다제 등을 함유 함으로써 97%의 순도 밖에 얻을 수 없는 문제점이 있었다. 또한 이들 방법에 있어서는 정제에 오랜 시간이 소요되기 때문에 상온에서 변성, 실활되거나 결정화에 실패할 가능성이 높았다.

이에 대하여 1963년도에 발행된 간행물 (J. BiolChem., 54, 375, 1963)을 통하여 나가야마(中山)외 1인은, 고구마 착즙액을 60°에서 10분간 열처리할 경우 고구마 β-아밀라제가 상온의 50%의 아세톤 농도에서 수일간 안정하다는 사실을 발견하고, 전술한 발스의 방법에 상온 아세톤 분획을 1회 실시함으로써 처리 소요시간을 4일로 단축시키는 방법을 제시하였다.

1969년 이르러서는 다께다(竹田)외 1인이 간행물(BioChim. Biophys. Acta, 185, 469, 1969)을 통하여 -20℃의 냉아세톤으로 0℃ 이하의 환경 조건에서 냉아세톤 분획법(황산 암모늄 분획 1회 포함)으로 6시간 만에 결정화 시킬 수 있는 방법을 제시한 바 있다. 그런데 이 방법에 있어서는, 전체 조작을 빙냉실이나 영하의 기온 조건하에서 처리해야 하는 결점이 있고, 사용된 염이 잔류할 경우 결정화가 불가능해지는 단점이 있었다.

또한, 1979년에는 헥데 외 2인은 간행물(Prep. Biochem,. 9(1), 71-84, 1979)통하여 고구마 β-아밀라제를 티몰 아밀로스에 흡착시켜 정제하는 방법을 발표하였다. 이 방법에 의하면, 정제 배수와 수율이 향상되나, 역시 처리 시간이 오래 걸리고, 또한 결정화에 황산 암모늄 분획법을 사용하기 때문에 전술한 바와 같은 결정화시의 단점을 내포하고 있는 것으로 지적되고 있다.

이들 방법으로 정제 및 결정화된 효고에 미량 함유되어 있는 불순물은 칼럼 크로마토그래피(Columnchromatography)로 제거하는 경우도 있으나 고가, 장시간의처리, 까다로운 처리조건, 처리량의 소규모등의 제약 때문에 제한된 범위에서 일부 실험실에만 사용되고 있는 실정이다.

이에, 본 발명은 상기한 종래의 결점을 제거하여 단시간에 고순도의 고구마 β-아밀라제를 정제 및 결정화할 수 있는 간편한 방법을 제공하는 데 그 주목적을 두고 있다.

본 발명의 다른 목적은 실험 연구용 및 산업적 용도를 동시에 충족시킬 수 있는 고구마 β-아밀라제를 고구마 즙액에서 효율적으로 회수, 정제할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.

다음은 본 발명에 따르는 고구마 β-아밀라제 정제 및 결정화 방법을 설명한 것이다.

본 발명의 방법에 사용되는 기자재중 고구마나 그 착즙액과 접촉하는 부분은 유리, 플라스틱, 스테인레스 스틸 등으로 구성한다.

[실시예]

우선, 고구마를 수세하고 변질 부위를 제거하여 이물질의 혼입을 막고 이를 파쇄하여 착즙한다. 착즙박의 수분 함량은 낮을 수록 좋다. 착즙시 착즙액의 여과효율이 높아야 한다. 건조 고구마 분말을 사용할 경우 에는, 분말 1kg을 50℃의 물 3ι에 현탁시켜 30-40분간 방치한 다음 여과한다. 찌끼 수분에 다시 500mι의 물을 부어 추출한 다음, 압착한다. 본실시예에서는 착즙액 3ι를 기준으로 하여 제1도를 참조 하면서 설명한다.

제1단계 :

착즙액을 자동 가열 장치를 갖춘 이중 솥을 사용하여 간접열로 60℃에서 10분간 처리한다. 이 조작은 함유 고구마 β-아밀라제에 아세톤 등의 유기용매에 대한 내성을 부여하고 함유 불순물중 내열성이 약한 불순물을 변성시켜 제거 효율을 높이는데 있다. 가열 전, 후의 온도는 20℃정도가 적당하며, 가열에 소요되는 시간과 냉각에 소요되는 시간은 2-3분이 이상적이다. 이 범위를 초과하면 고구마 β-아밀라제가 변성될 여지가 있다. 열처리 온도가 높으면 열처리시 변성되고, 열처리 온도가 낮거나 열처리 시간이 짧으면 아세톤 처리시 변성되는 효소의 양이 많아진다. 보통, 열처리에 의해 10정도의 활성이 상실된다.

열처리액에 상온의(이하 동일)유기용매, 바람직 하게는 아세톤을 가해 50%포화시켜 7,000g(이하 동일으로 5분간 원심 분리하면 착즙액에 함유된 고구마 β-아밀라제는 거의 모두 침전된다. 이 때 상등액을 제거해 낸다.

제2단계 :

침전을 증류수로 용해시켜 600mι로 만든다음, 1N 염산으로 pH3.6으로 조절하여 8분 동안 원심분리하여 침전을 제거한다. 이 조작은 착즙액에 존재하는 대부분의 불순물을 침전, 제거시키고, β-아밀라제 보다 산성에 약한 α-아밀라제를 변성, 제거시키는 데 목적이있다.

제3단계 :

제2단계에서 얻어진 상등액에 3%암모니아수를 가해 고구마 β-아밀라제의 안정 영역인 pH 5.0으로 조절 한다. 이어서 아세톤을 가하여 47%포화시켜 6분 동안 원심 분리하여 상등액을 제거한다.

제4단계 :

상기 단계에서 얻어진 침전을 회수하여 증류수 125mι에 용해 시킨 다음, 다시 아세톤으로 43% 포화시켜 7분 동안 원심 분리하여 침전을 회수 한다.

제5단계 :

회수된 침전에 100mι의 증류수를 가해 용해시킨 다음 8분 동안 원심 분리하여 변성물(침전)을 제거한다.

제6단계 :

제5단계에서 얻어진 상등액을 아세톤으로 40%포화시켜 8분 동안 원심분리 시킴으로써 상등액을 제거한다.

제7단계 :

회수된 침전에 35℃의 증류수 7mι를 가하여 포화 용해시킨 후, 냉장고 내에 3℃로 냉각된 물에 담그면 포화도 상승과 함께 고구마 β-아밀라제의 용해도가 저하되어 수분 후 결정이 석출되기 시작한다.

결정의 수량을 높이려면 35-40mg/mι의 효소농도를 유지시켜야 한다. 비스킹 튜브(Visking tube)에 효소용액을 넣고 폴리에틸렌 글리콜 6000(PEG 6000) 50% 용액에 담가 저온을 유지시키면 시간은 오래걸리나 결정의 수량은 높일 수 있다. 그러나 무결정 부분이 결정으로 다량 이행되므로 바람직한 방법은 아니다. 단, 고구마 β-아밀라제의 용해도가 높아 결정이 생성되기 어려운 때 사용할 수 있는 방법이다. 결정화 시간이 길어질 수록 또 효소 농도가 높을수록 상등액의 무결정 불순물이 결정으로 이행되므로 24시간 이상을 넘기지 말아야 한다.

제8단계 :

생성된 결점은 초기에는 녹기 쉬우므로 낮은 온도에서 3분간 원심분리 하여 회수하든가 정치시켜 가라앉은 다음 상등액에 제거하여 회수한다.

제9단계 및 제10단계 :

얻어진 결정의 순도가 높다고 판단되면, 제9단계에서 동결 건조하여 제품화 시킨다. 그러나, 만약 얻어진 결정의 순도가 낮으면, 제9단계에서 그 결정에 물을 가 해 세척한 후 다시 원심 분리하여 상등액을 제거하고 제10단계에서 재결정시켜 순도를 더 높인 후 동결 건조 한다.

하기의 표 1은 본 발명에 의한 고구마 β-아밀라제의 단계별 정제도를 나타낸 것이다.

[표 1]

이상 설명한 공정은 본 발명에 의한 고구마 β-아밀라제 정제 및 결정화 방법으로 정제 및 결정화에 사용되는 고구마 착즙액을 공지의 농축기술, 예컨데 일본 특허공보 제 82-11636호에 개시된 방법을 사용하여 1/10로 농축시킨 다음 본 발명의 방법을 사용하면, 유기용매로서 사용되는 아세톤 소모량을 1/8로 줄일수 있고 회수율도 40-50%로 증가시킬 수 있을 뿐 아니라, 아세톤 처리 조작을 1-2회 생략 하여도 고순도의 제품을 얻을 수 있어 전체적인 조작이 간단해진다. 그러나, 이 경우에 있어서는 건조 이전에 사용된 염화 알루미늄을 투석 제거시켜야 한다.

본 발명의 방법에 사용되는 고구마는 가능한한 신선한 것을 사용해야 한다. 발아등으로 효소작용이 시작된 시료를 사용할 경우, 아세톤 분획시 단백질이 검(gum)상으로 엉겨 분리가 불가능 해진다. 고구마가 변질된 경우는 아세톤 용액에 대한 용해성이 증가하여 4차 아세톤 분획이 불가능해진다. 착즙액과 중간단계의 정제 효소를 아세톤과 오래 접촉시킬 경우 활성 저하는 일어나지 않으나 아세톤 용액에 대한 용해도가 증가되어 3차나 4차 아세톤 분획이 불가능 해지므로 바로 원심 분리해야 한다. 갈변 물질이 지나치게 생성되면 품종은 정제고구마 β-아밀라제의 품질에 갈색 물질이 약간 잔류한다.

다음은 본 발명의 고구마 β-아밀라제 정제 및 결정화 방법과 전술한 종래의 방법을 비교한 것으로서, 표 2에는 각 방법에 대한 정제 배수, 회수율, 소요시간, 정제방법, 온도조건, 생성결정의 순도 등이 나타나 있다. 이 표에서 보는 바와 같이, 본 방법의 소요시간은 3시간으로서, 종래의 방법중 가장 처리 소요시간의 짧은 다께다의 방법에 비해 약 1/2로 줄어 들었으며, 회수율에 있어서는 약간 뒤지지만 정제 배수는 약 2배이상 증가 되고 처리 온도 조건이 상온에서 진행되는 특징을 갖고 있다.

[표 2]

본 발명의 방법과 종래 방법의 비교

* 결정화 이전의 기준 수치임.

제2도는 정제된 고구마 β-아밀라제의 결정사진으로서, 본 발명의 상온 유기용매 분획 방법에 의해 수용액에서 결정시킨 고구마 β-아밀라제의 결정 사진은 제2(a)도와 같이 판상 4각형으로 형성 되었다. 이 결과는, 전술한 다께다의 냉아세톤 분획 방법으로 형성시킨 결정(제2(b)도 참조)과 마찬가지의 결과를 보이는 것이다. 제2(c)도는 종래의 다께다 방법에 의한 냉아세톤 분획으로 정제된 아세톤 용액중의 침상 결정 사진이며, 제2(d)도는 종래의 발스(balls)방법에 의한 황산 암모늄 분획으로 정제된 황산암모늄중의 결정 사진이다.

다음은 본 발명의 방법에 의해 정제, 결정된 고구마 β-아밀라제의 순도를 확인하기 위해 각종 실험을 행한 결과를 설명한 것이다.

제3도는 본 발명으로 정제 결정된 고구마 β-아밀라제의 자외 흡광 형태를 나타내는 도면으로 파장 260mm에 대한 파장 280mm의 흡광도의 비율은 1.55로서 핵산계 물질의 영향에서 벗어나고 있다. 종래의 발스 등의 방법으로 정제된 고구마 B-아밀라제는 350mm에서 흡광도를 나타내는 불순 황색물질이 존재하는 것으로 알려졌으나, 본 결과에서는 나타나지 않았다.

또한 본 발명으로 정제 결정된 고구마 β-아밀라제를 pH 8.3, 7%의 아크릴 아미드 디스크 겔(disk gel)전기 영동을 통해 순도를 확인한 결과, 제4도와 같이 단일 밴드로 나타나 균일한 것으로 판명되었다.

아울러, 본 발명으로 정제 결정된 효소 고구마 β-아밀라제 0.5mg/mι와 가용성 전분기질 20mg/mι를 pH 4.8, 37℃의 조건하에서 4시간 반응시켜 고속 액체크로마토그래피로 분석한 결과가 제5도에 도시되어 있다.

동도에서, A는 용매를, B는 크실로스를, C는 글루코스를, D는 말토스를 나타낸다. 효소 기질의 반응 산물을 살펴 보면, 거의 말토스(maltose)만 생성되어 효소가 순수한 것으로 확인되었다. 극미량의 글루코스는 홀수의 직쇄상 아밀로스에 의한 것으로 보이고, 오른쪽 말토트리오스(maltotriose)는 한계 텍스트린으로 보인다.

이상 설명한 바와같이 본 발명에, 고구마 착즙액을 열처리하여 함유 β-아밀라제에 유기용매내성을 부여한 다음 상온에서 유기용매로 복수 회분획하여 얻어진 효소를 수용액으로 포화, 냉각하여 결정화 하는 간편한 고구마 β-아밀라제정제, 결정화 방법이 제공되므로, 현재 전분공업에서 사용되고 있는 연간 수십만톤의 고구마에서 폐기되고 있는 고구마 즙액에서 고구마 β-아밀라제를 효율적으로 회수할 수 있을 것으로 기대되며, 이에 따라 전분공업 분야에 다대한 부가가치를 가져올 것으로 전망된다.

Claims (2)

1. 고구마 착즙액 속에 함유된 고구마 β-아밀라제를 정제 및 결정화하는 방법에 있어서, 고구마 착즙액을 60℃에서 10분간 열처리한 후 상온에서 50% 유기용매로 1차 분획하는 단계와, pH를 3.6으로 조절하여 원심분리하는 단계와, PH 5.0으로 조절하고 47% 유기용매로 2차 분획하는 단계와, 43% 유기용매로 3차 분획하는 단계와, -40% 유기용매로 4차 분획하는 단계와, 증류수에서 냉각 결정화 하는 단계 등을 최소한 포함하는 것을 특징으로 하는 고구마 β-아밀라제 정제 및 결정화 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기한 유기용매가 아세톤으로 구성되어 있는 것을 특징으로 하는 고구마 β-아밀라제 정제 및 결정화 방법.

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