KR800001610B1 - 항생물질 l-13365의 제조방법 - Google Patents

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항생물질 L-13365의 제조방법

제1도는 항생물질 13365의 자외선 흡수 스펙트럼이다.

제2도는 항생물질 13365의 적외선 스펙트럼이다.

본 발명은 액티노프라내스 사르베파렌시스(Actinoplanes Sarveparensis)라는 액티노프라네스 과에 속하는 균주를 발효시켜 얻어진 신규 항생물질에 관한 것이다. 하기에 항생물질 L 13365라고 언급되는 본 신규 항생물질은 융점, 적외선 및 자외선 흡수 극대점 같은 특성을 지닌 연노랑색 결정성 화합물이다.

상기한 바와 같이 항생물질 L13365는 액티노프라네스 사르베파렌시스 라는 균을 발효시켜 배양하므로써 제조된다. 우리 보존번호 A/13826으로 부여된 상기 균은 사르베파르 빌리쥐(인디아)에서 수집한 샘플 토양으로부터 분리되었다. 상기균을 기탁하여 CBS[센트랄 부로 부어 쉼멜 배양(Central Bureau Uoor Schimmekures)오스터스트라아트(Dosterstraat) 1-바아톤(Baarn)-네덜란드의 균주배양수집물에 속하게 됐으며, 그 기탁번호는 305.76이다.

항생물질 L13365를 제조하는데 있어서, 미생물을 호기성 조건하에 동화성 탄소성분, 동화성 질소성분 및 무기염들을 함유한 수성영양 배지속에서 배양된다.

일반적으로 항생물질을 생성하는 균주를 실질적인 항균력이 나타날때까지 교반 플라스크속에서 예비 배양된 다음 영양발효 배지를 함유한 발효조에 접종하여 배양한다.

배양은 25-35℃, 호기성 조건하에 실질적인 항균력을 생성하기에 충분한 시간동안 실시한다. 배양하는 동안 생성된 항생물질의 농도를 조절하기 위해서 한친 희석법에 의한 미생물분석을 실시한다.

여과하여 균사체를 제거한후 예를들어 항생물질이 용해하고 수성매질과 섞이지 않는 유기용매로 추출하는 것과 같은 종래의 방법에 의해 여과된 발효즙으로부터 항생물질을 회수한다. 추출은 여액의 pH를 약 2-4로 맞춘후 실시한다. 추출에 적당한 유기용매는 탄소원자 1-6개의 알칸올류, 저급 지방족산의(C₁-C₄) 알킬 에스테르 또는 할로겐화 된 저급 탄화수소 중에서 선택된다. 그런 다음 고속 원심분리에 의해 용매를 발효즙으로부터 분리시키고 원부피의 약

정도로 농축시킨 다음 냉각시키고 방치하여 생성된 침전물을 여과하여 회수한다. 이 침전물은 거의 순수한 항생제 L13365로 이루어져 있다. 모액을 모아서 경유 같은 불활성 비극성 용매 과량에 부여 추가량의 조항생제 L13365를 회수한다. 상기와 같이하여 얻어진 조생성물을 메탄올-아세톤 혼합물에 용해시키고 산성 의수를 첨가하여 침전을 생성시킨다. 두 침전물을 한곳에 모아서 용출계로서 클로로포름-메탄올 혼합물을 사용한 컬럼 크로마토그라피에 의해 더욱 정제시킨다.

항생물질 L 13365를 메탄올 : 초산에틸(1:1)에서 최종적으로 결정화시킨다.

항생물질 L 13365는 시험관내 및 생체에서 뛰어난 항균력을 나타낸다. 더구나 특히, 항생물질 L 13365는 하기표에 나타난 바와 같이 시험관내에서 현저한 항균작용 특히 그람 양성균에 대한 뛰어난 저항력을 나타낸다.

[표]

더구나 상기 언급한 바와 같이 항생물질 L 13365는 또한 마우스에서 실험 감염균에 대한 뛰어난 생체 항균력을 나타낸다. 더욱 특히, 스타필로코커스 아우레우스, 스트렙코커스 헤몰리티쿠스 및 디플로코커스 뉴모니아에 의해 야기된 실험감염에 대한 항생물질 L 13365의 ED 50치는 하기와 같다.

본 신규 항생물질은 흔히 사용되는 항생제에 대해 저항력이 있는 미생물균에 대해서도 효과가 있다.

하기표 I에는 대표적인 예로써 몇몇 항생제에 대해 저항력이 있는 스타필로코커스 아우레우스에 대한 항생물질 L 13365의 최소 억제농도들(MIC)이 보고되어 있다.

[표 I]

마우스에게 경구 또는 비경구로 투여한 결과, LD 50치가 1000㎎/㎏ 이상인 바와 같이 항생물질 L 13365의 독성은 매우 적다.

[액티노 프라네스 사르베파렌시스 A/13826에 대한 설명 집락의 육안적 실험]

상기균은 여러가지 영양 한친상에서 잘 발육한다. 오트밀 한천에서 집락들은 직경이 3-4㎜이고 불규칙한 윤곽 및 거친 표면을 나타낸다. 공기중 균사체는 대체로 없었다.

[현미경 실험]

몇몇 한전 배지에서 포자낭들이 생성된다. 그 포자낭들은 직경이 13-20μ인 규칙적인 구형이다. 매우 활동적인 유주자들은 구형이지만 경우에 따라서는 직경이 1.5-2μ 늘어난것도 있다. 상기 특징때문에 균주 A/13826을 액티노플라네스 속에 포함시키며 액티노플라네스 사르베파렌시스 C.B.S. 305.76이라고 명명된다. 쉬트링 및 고트리브가 제시한 여러가지 표준배지(Intern.J.Syst.Bact., 16, 313-340,1966) 및 왁스만이 제시한 다른 배지(더 액티노마이세레스, II권, 더 윌리암즈 앤드 윌킨스 컴페니, 1961)상에서 배양된 액티노프라네스 사르베파렌시스 C.B.S.305.76의 배양특징들이 표 II에 기재되어 있다. 배양특징들은 30℃에서 배양한지 6-14일후에 관찰되었다. 프리담 및 고트리브의 방법(Intern.J.Syst.Bact, 56,107,1948)에 의해 시험한 탄소원의 이용에 대해 표 III에 기재되어 있다.

표 IV에는 균주의 생리학적 특성에 대해서 기재되어 있다.

액티노플라네스 사르베파렌시스 C.B.S. 305.76

[표 II]

색도측정은 마르에쯔 및 폴(Haerz, A 및 M Reg.Paul 1950색도의 사전, 제2판 M.Grow-힐북 컴페니, Inc., 뉴욕)의 방법에 의해서 실시했다.

배양배지의 숫자는 쉬링 및 코트리브에 의해서 주어진 것들을 참고한다. (Intern,J.Syst.Bact., 16, 313-340, 1966)

[표 III]

[표 IV]

[항생물질의 생성 및 분리]

항생물질을 생성하기 위해서 균주 액티노플라네스사르베파렌시스 C.B.S. 305.76을 pH 약 6-약 10에서 주항균력이 나타날때까지 배지에서 호기적으로 예비 배양시킨다. 예를들어 교반 플라스크 배양물은 g/1당 하기 조성물로 되어 있다.

플라스크들을 약 28-30℃에서 약 24시간동안 교반하고 예비배양액(1ℓ)을 각각 하기 배양매질을 10ℓ함유하는 발효단지에 접종시킨다.

배양물 1회분씩을 호기적으로 28-30℃에서 교반하에 배양시킨다. 시간간격을 정해서 시험군으로 스타필로코커스 아우레우스를 사용하여 한천 희석법으로 항균력에 대해 미생물학적인 분석을 한다. 최고 항균력은 72-96시간동안 발효한후에 나타난다.

[항생물질 L13365의 분리 및 정제]

여과기 보조물로 1% 크라셀(Clarcel)(W/V)을 사용하여 배양액(80리터)을 여과한다. 균사체를 제거하고 여과된 용액을 10% Hcl로 pH2.5로 산성화하고 그 부피의 약 50% 해당하는 양의 초산에틸로 2번 추출한다.

고속 원심분리에 의해 유기상을 수층으로부터 분리하고 Na₂SO상에서 건조시킨 다음 40-50℃에서 원부피의 약 1/300이 될때까지 진공 농축시키고 마지막으로 약 0-10℃로 냉각시킨다.

여과기에 수집한 조 침전물을 소량의 초산에틸로 세척하고 45℃에서 진공 건조시킨다. 항생물질 L13365 1.140g를 70%의 순도로 획득하는데 순도는 분광 측정법으로 측정된다.

상기 여과할때 나온 모액들은 20배량의 경유에 부어서 순도 20-25%(분광측정법으로 측정된)의 항생물질 2.550g을 더 획득한다. 이 물질을 소량의 메탄올:아세톤(9:1) 혼합물에 현탁시키고 모든 불용성분을 여과한 다음 물로 희석시킨다. 그 용액에 10%HCl을 교반 첨가하여 pH 약 2.5로 만든 다음 원심분리에 의해 수집된 침전물을 약 45-50℃에서 최소량의 부탄올에 더욱 용해시킨다. 그 용액을 진공 농축시켜 원부피의 약 1/5로 만든 다음 약 4℃로 냉각시켰다. 수집하여 진공건조시켜 얻어진 침전물이 80%의 순도(분광 측정법으로 측정된)를 갖는 항생물질 L13365(0.450g)이다. 그런 다음 얻어진 생성물에 대해 통상의 정제과정을 실시한다.

상기 목적을 위해서 최소량의 클로로포름:메탄올(85:15) 혼합물에 용해시키고 실리카-셀리트컬럼(1:1 v/v) 상에서 크로마토그라피한 다음 100℃에서 미리 활성화시키고 상기 클로로포름/메탄올 혼합물로 세척한다.

각 부분들의 용출 및 박층 크로마토그라피 조절을 동일한 혼합물로 실시한다. 박층 크로마토그라피 분석표에 따라 수집된 부분들을 진공 농축시켜 소량으로 만든다. 디에틸 에테르를 가한후 95%의 순도(분광측정법으로 측정된)를 갖는 항생물질 L13365로 이루어진 침전물이 형성된다.

상기 침전물을 메탄올:초산에틸(1:1) 혼합물에 용해시키고 45℃로 가열한 다음 모든 불용성분을 여과해낸다. 4℃에서 냉각시키고 동일한 온도에서 일야동안 방치하면 순수한 항생물질 L13365가 밝은 황색 침상물질로 얻어진다.

[항생물질 L13365의 물리화학적 성질]

항생물질 L13365는 산의 성격을 띤 밝은 황색 결정성 분말이다. 110℃의 봉밀된 튜브내에서 6N염산에 있는 항생물질 L13365의 산 가수 분해산물을 분석해보니 4개의 아미노산으로 밝혀졌고, 그들중 3개는 아미노산 자동 분석기에 의해서 아스파르틴산, 트레오닌 및 글라이신으로 확인되었다. 더구나 항생물질 L13365는 하기 성질과 같은 특징이 있다.

1) 융점 : 210℃

2) 원소분석 : C=51.35 H=5.05 N=10.50 S=11.05 C(별도로)=22.05

3) 자외선 및 가시광선 흡수 스펙트럼

자외선 흡수 스펙트럼은 여러가지 pH의 메틸 셀로솔브(MCS)-완충액들에 L13365를 녹인 용액들을 하나하나 사용하여 유니켐(UNICAM)SP800자외선 분광기로 측정되었다.

스펙트럼의 전면이 도면 1에 나와 있다.

4) 형광 스펙트럼 :

본 항생물질은 강한 형광 발색단을 가지고 있으며 240㎚에서 야기된 0.1N 수산화나트륨에 본 생성물을 녹인 용액은 355 및 490㎚에서 최대 방출 스펙트럼을 나타낸다.

형광 스펙트럼은 퍼어킨 엘머 모델 MPF-44형광 분광기로 측정되었다.

5) 적외선 스펙트럼

뉴졸에서 특징적인 흡수대가 하기 파수(㎝-1)에서 관찰되었다.

3400(만곡), 3350(첨예(Sharp)), 3200(만곡), 3100(첨예), 2930 및 2870(뉴졸)

2800-2400, 2380(대기 이산화탄소) 1750(첨예), 1670(첨예), 1620(첨예), 1540(첨예), 1480(첨예), 1460 및 1380(뉴졸), 1420(첨예), 1340(첨예), 1320(첨예), 1280(첨예), 1240(첨예), 1195(첨예), 1170(첨예), 1145(첨예), 1120(첨예), 1075(브로드), 1015(첨예), 990(첨예), 935(첨예), 920(브로드), 900(첨예), 865(첨예), 640(첨예), 800(첨예), 770(첨예), 770(첨예), 755(첨예), 740(첨예), 720(뉴졸).

적외선 스펙트럼은 퍼어킨-엘머 모델 157분광기로 측정된 것이다.

스펙트럼의 전면이 도면 2에 나와 있다.

6) 비선광도

+125° (농도는 메탄올:클로로포름 1:1중에서 0.8%)

7) 용해도

본 화합물은 디메틸설폭사이드, 디메틸포름아마이드 및 클로로포름/메탄올 혼합물에 용해하고, 클로로포름, 메탄올, 메탄올/초산에틸 혼합물 중탄산나트륨 용액 및 빙초산에 약간 용해하며 물 및 기타 통상 유기용매는 불용이다.

8) 특징적인 반응들

9) 산도

이온화함수 pka 7.8은 메틸 셀로솔브:물 4:1용액중에서 항생물질 L13365의 0.1N 수산화나트륨을 전위차 적정하여 확인된 것이다. 함께 측정된 당량은 1400이다.

10) 크로마토그라피실시

Claims (1)

1. 동화성탄소원, 동화성질소원 및 무기염류를 포함한 배지에서 심부 호기성 조건하이 항생물질 L13365의 실질적량이 생성될때까지 액티노프라네스 사르베파렌시스(균기탁번호 : CBS NO.305.76)을 배양하고 이 배양액으로부터 항생물질을 분리함을 특징으로 하는 항생물질 L13365의 제조방법.

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