KR20240153521A - Let7 miRNA 억제제의 중간엽기질세포 기능 강화 용도 - Google Patents
Let7 miRNA 억제제의 중간엽기질세포 기능 강화 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 Let7 miRNA 억제제의 중간엽기질세포 기능 강화 용도에 관한 것으로, 본 발명에 따르면, 중간엽기질세포에서 miRNA인 let-7의 억제로 인해 세포 이동 증가, 골분화능 증가, 증식 촉진 및 노화 억제 효과가 나타났으며, 측분비 효과 및 상처 치유 효과가 향상되었고, 산화적 인산화에서 혐기적 해당경로로 글루코스 대사가 재프로그래밍되어 줄기세포 상태의 세포의 대사 특성을 나타냈으며, 이와 같은 MSC의 기능성 변화가 세포 운명(cell fate)의 변화가 아닌 세포 기능의 향상/강화임을 확인하였으므로, 이를 중간엽기질세포의 기능 강화용으로 활용할 수 있고, let-7가 억제된 중간엽기질세포를 골재생 또는 혈관 재생 용도의 세포 치료제로 이용할 수 있는 효과가 있다.
Description
본 발명은 Let7 miRNA 억제제의 중간엽기질세포 기능 강화 용도에 관한 것이다.
MSCs(Mesenchymal stromal cells 또는 mesenchymal stem cells)는 골수, 지방 조직 또는 태반 조직에서 유래된 비-조혈 부착성 세포 집단(non-hematopoietic adherent cell population)으로, 골, 연골, 지방 조직을 포함하는 다양한 유형의 조직으로 분화될 수 있는 다계통(multi-lineage) 분화 잠재력을 가진다 (Curr Opin Hematol 2006, 13, 419-425, Science 1999, 284, 143-147). 종래의 연구에 따르면 MSC의 주요 작용 방식은 세포 사멸 및 섬유증을 억제하고, HSCs(hematopoietic stem cells), 신경 줄기세포(neuronal stem cells) 및 다른 조직-특이적 내인성 줄기세포와 같은 내인성 줄기세포의 재생을 촉진함으로써 조직의 재생을 지원하는 측분비 효과임이 밝혀졌다. 그러나, 실제 MSC 기반 임상 시험에서는 MSC-기반 세포 치료의 효과가 부족한 것으로 나타났다 (International journal of stem cells 2014, 7, 63-69). 특히, 일차 조직으로부터 수득한 MSC는 시험관 내 배양 증식 후 제한된 증식능과 복제 노화(replicative senescence)를 나타냈으며, 이는 증식율(proliferation rate) 감소, 미토콘드리아 ROS 생성 증가, 텔로미어 단축 (또는 DNA 손상), 및 기능적 특성의 손실로 특징지어진다 (BMC Cell Biol 2006, 7, 14). 따라서, MSC를 세포성 치료에 적용하기 위해 이의 증식능과 재생능을 증가시키는 전략이 큰 관심을 끌고 있다.
세포성 치료법은 예를 들면 재생 의료, 장기이식 및 심지어 암과 같은 임의의 상태의 진단 또는 예방 목적을 포함하는 임의의 목적을 위해서 살아있는 세포를 투여하는 것을 포함한다. 줄기세포는 세포치료법에 있어서 매우 훌륭한 잠재성을 갖는 것으로 평가되고 있다. 줄기세포는 생물 조직을 구성하는 다양한 세포들로 분화(differentiation)할 수 있는 세포로서, 배아, 태아 및 성체의 각 조직에서 얻을 수 있는 분화되기 전 단계의 미분화 세포들을 총칭한다. 줄기세포는 분화 자극 (환경)에 의하여 특정 세포로의 분화가 진행되며, 분화가 완료되어 세포분열이 정지된 세포와는 달리 세포분열에 의해 자신과 동일한 세포를 생산(self-renewal)할 수 있어 증식(proliferation; expansion)하는 특성이 있으며, 다른 환경 또는 다른 분화 자극에 의해 다른 세포로도 분화될 수 있어 분화에 유연성(plasticity)을 가지고 있는 것이 특징이다. 줄기세포는 크게 배아(embryo)에서 얻어지고 모든 세포로 분화될 수 있는 잠재력(totipotent)을 지닌 전분화능(pluripotency)의 배아 줄기세포(embryonic stem cell, ES cell)와 각 조직에서 얻어지는 다분화능(multipotency)의 성체 줄기세포(adult stem cell)로 구분된다. 성체 줄기세포는 조혈모 줄기세포(Hematopoietic stem cell), 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cells, MSC), 신경 줄기세포(Neural stem cell, NSC), 장 줄기세포, 근육 줄기세포, 모낭 줄기세포 및 내피 줄기세포 등이 있다. 이 중 중간엽 줄기세포는 많은 성숙한 조직에 존재하며, 자가 재생 능력 및 다양한 계통으로 분화할 수 있는 가능성을 갖는 것으로 잘 알려져 있고, 골수, 지방 조직, 태반, 제대혈, 와튼 제대교질(Wharton's jelly) 등의 성체 조직에서 쉽게 얻을 수 있다. 줄기세포 치료제를 포함한 세포치료제(Cell therapy product)란 세포와 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가(autologous), 동종(allogeneic) 또는 이종(xenogeneic) 세포를 체외에서 증식 또는 선별하거나 여타한 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용하는 의약품으로 정의된다. 세포치료제를 이용한 세포치료 이식술에서는 신체 내 정상적 혹은 건강한 상태와 유사한 조직으로서 형질 발현된 신체를 구성하는 각종의 조직을 대신 할 수 있는 다수의 세포들로 구성되는 각 세포 재료를 분리, 준비하고, 체외 환경에서 배양과정을 통해, 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 일련의 행위를 가하여, 이식물을 수령할 개체에게 주입하거나, 이들 세포로 인체조직을 만듦으로써 치료용으로 쓰이게 된다. 줄기세포 치료제는 세포치료제 중 특히 줄기세포를 사용하는 경우를 의미하며, 현재 대표적인 응용 분야는 신경질환, 심장질환, 폐질환, 간질환, 암과 같이 손실된 세포의 회복과 재생이 필수적이나 잘 재생되지 않는 분야에서 활발하게 연구가 진행되고 있다. 줄기세포는 다분화 잠재능을 가지고 있어서 손상된 조직에서 필요한 세포로의 분화를 유도할 수 있다는 점에서 세포치료에서 잠재력이 크지만, 현재 개발수준에서는 체내 이식 후 생존율이 높지 않아서 실제로 임상 적용에서 광범위하고 안정적으로 성공한 예를 찾기 어렵다.
한편, let-7 miRNA는 동물에서 고도로 보존된 패밀리 유전자이며, 세포 증식 (HMGA1, c-Myc, RAS, HMGA2), 세포 주기 진행 (CyclinD1, CDC34), 혈관 신생 (VEGF, TGFBR) 및 글루코스 대사 (IGF1R, INSR, IRS2)를 포함하는 다양한 스펙트럼의 mRNA들을 표적화함으로써 다면 발현성(pleiotropic) 기능을 한다. 특히, let-7 miRNA는 세포 운명(cell fate), 줄기세포성(stemness) 또는 종양발생(oncogenesis)을 조절하는 세포 과정에 참여하는 것으로 알려졌다.
본 발명의 목적은 중간엽기질세포(mesenchymal stromal cells, MSCs)의 기능 강화용 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 기능 강화된 중간엽기질세포를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 세포 치료제 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 혈관 질환 또는 혈관 기능 장애의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
아울러, 본 발명의 목적은 상처 치유용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 let-7 miRNA 억제제를 포함하는, 중간엽기질세포의 기능 강화용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 let-7 miRNA가 억제된 중간엽기질세포를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 중간엽기질세포를 유효성분으로 포함하는, 세포 치료제 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 중간엽기질세포 또는 세포 치료제 조성물을 유효성분으로 포함하는 혈관 질환 또는 혈관 기능 장애의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
아울러, 본 발명은 상기 중간엽기질세포 또는 세포 치료제 조성물을 유효성분으로 포함하는 상처 치유용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 따르면, 중간엽기질세포에서 miRNA인 let-7의 억제로 인해 세포 이동 증가, 골분화능 증가, 증식 촉진 및 노화 억제 효과가 나타났으며, 측분비 효과 및 상처 치유 효과가 향상되었고, 산화적 인산화에서 혐기적 해당경로로 글루코스 대사가 재프로그래밍되어 줄기세포 상태의 세포의 대사 특성을 나타냈으며, 이와 같은 MSC의 기능성 변화가 세포 운명(cell fate)의 변화가 아닌 세포 기능의 향상/강화임을 확인하였으므로, 이를 중간엽기질세포의 기능 강화용으로 활용할 수 있고, let-7가 억제된 중간엽기질세포를 골재생 또는 혈관 재생 용도의 세포 치료제로 이용할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 MSCs에서 let-7 miRNAs 서브패밀리의 발현 수준 및 ASO에 의한 각 서브패밀리의 억제 정도를 확인한 도이다:
NC: scrambled RNA 대조군으로 트랜스펙션한 MSCs;
let7 ASO: anti-let7-ASO을 트랜스펙션한 MSCs;
A: 지방 유래 MSC(adipose derived mesenchymal stromal cells, ADMSC)에서 let-7 miRNA 서브패밀리의 발현 수준;
B: 골수 유래 MSCs의 let-7 miRNA 서브패밀리의 발현 수준;
C: let-7 패밀리가 표적화하는 전체 유전자 수, 및 let-7a 또는 let-7b가 표적화하는 유전자의 수;
D: let-7 패밀리 유전자 중 보존된 시드 서열(seed sequence) (붉은색 글씨);
E: let-7a에 대한 ASO 및 let-7b에 대한 ASO의 조합에 의한 let-7 패밀리의 억제;
F: anti-let7-ASO에 의한 let-7가 표적화하는 유전자의 발현 수준; 및
G 및 H: LIN28 단백질의 발현 수준.
도 2는 anti-let7-ASO에 의해 let-7가 억제된 MSCs의 증식 향상 효과를 확인한 도이다:
A: 세포 주기 유전자의 발현 수준;
B: MSCs의 상대적 증식능;
C: 누적된 MSCs 수;
D: SA-b-gal 양성 세포의 이미지;
E: SA-b-gal 양성 세포의 비율; 및
F: 텔로미어 길이.
도 3은 anti-let7-ASO에 의해 let-7가 억제된 MSCs의 기능적 변화를 분석한 도이다:
A: MSC의 골분화 및 지방분화 세포 사진;
B: 상대적 무기질화(mineralization)에 따른 골분화 정량 그래프;
C: 상대적 지방 방울 침적에 따른 지방 분화 정량 그래프;
D: 세포 콜로니 형성을 분석한 사진;
E: 콜로니 수;
F: 혈관주위세포(pericyte) 마커 유전자의 발현 수준; 및
G: 전분화능(pluripotency) 관련 유전자의 발현 수준.
도 4는 anti-let7-ASO에 의해 let-7가 억제된 MSCs의 이동을 분석한 도이다:
A: 세포 이동 이미지;
B: 정량화한 세포 이동 백분율; 및
C: EMT-관련 유전자의 발현 수준.
도 5는 anti-let7-ASO에 의해 let-7가 억제된 MSCs에서의 대사 변화를 분석한 도이다:
A: 글루코스 흡수 관련 유전자의 발현 수준;
B 및 C: ECAR 분석 결과;
D: ROS 생성 분석 이미지;
E: ROS 생성 정량 그래프;
F: TMRE 염색 이미지; 및
G: TMRE의 형광 세기 정량 그래프.
도 6은 MSCs에서 LIN28의 과발현의 효과를 분석한 도이다:
A: let-7 패밀리들의 발현 수준;
B: let-7 표적 유전자 HMGA2의 발현 수준;
C: 세포 이동;
D: 세포 이동 정량 그래프;
E: 골분화 및 지방 분화 이미지;
F: 골분화 정량 그래프;
G: 지방 분화 정량 그래프;
H: 콜로니 수; 및
I: 증식된 세포 수.
도 7은 anti-let7-ASO로 트랜스펙션한 MSCs에서 let7이 표적화하는 단백질들의 발현 변화를 분석한 도이다:
A: let-7 억제에 의해 MSCs에서 발현 증가한 단백질들의 수; 및
B: let-7 억제에 의해 MSCs에서 상향조절된 상위 20가지 단백질 리스트.
도 8은 anti-let7-ASO로 트랜스펙션한 뒤 8시간 후 MSCs에서 프로테오믹스의 변화를 LC-MS/MS로 분석한 도이다:
A: anti-let7-ASO로 트랜스펙션한 MSCs에서 대조군에 비해 현저히 강화된 세포 기능에 대한 GO 분석; 및
B: let-7 억제에 의해 유도된 세포 기능 변화에 대한 IPA 분석.
도 9는 let-7 억제된 MSCs의 측분비 효과를 분석한 도이다:
A: MSC와 CD34+ HPCs의 공배양 실험 개략도;
B: 기질(stroma)-없는 조건 (HSC only), 대조군 MSCs (NC) 또는 let-7 억제된 MSCs (let-7 ASO)와의 공배양 조건하의 조혈 전구세포 (CD34+ CD90+)의 증식;
C: HUVEC 및 MSCs의 공배양 실험 개략도;
D: 공배양한 세포의 사진; 및
E: 혈관 형성 정량 그래프.
도 10은 let-7 억제된 MSCs와 백혈구 세포주 (HL60, MOLM-14 또는 MV-4-11)를 공배양한 뒤 백혈구 세포 (CD90+)의 증식을 정량한 도이다.
도 11은 et-7 억제된 MSCs의 상처 치유 효과를 분석한 도이다:
A: 시간에 따른 상처 이미지; 및
B: 상처 치유 효과를 정량한 그래프.
NC: scrambled RNA 대조군으로 트랜스펙션한 MSCs;
let7 ASO: anti-let7-ASO을 트랜스펙션한 MSCs;
A: 지방 유래 MSC(adipose derived mesenchymal stromal cells, ADMSC)에서 let-7 miRNA 서브패밀리의 발현 수준;
B: 골수 유래 MSCs의 let-7 miRNA 서브패밀리의 발현 수준;
C: let-7 패밀리가 표적화하는 전체 유전자 수, 및 let-7a 또는 let-7b가 표적화하는 유전자의 수;
D: let-7 패밀리 유전자 중 보존된 시드 서열(seed sequence) (붉은색 글씨);
E: let-7a에 대한 ASO 및 let-7b에 대한 ASO의 조합에 의한 let-7 패밀리의 억제;
F: anti-let7-ASO에 의한 let-7가 표적화하는 유전자의 발현 수준; 및
G 및 H: LIN28 단백질의 발현 수준.
도 2는 anti-let7-ASO에 의해 let-7가 억제된 MSCs의 증식 향상 효과를 확인한 도이다:
A: 세포 주기 유전자의 발현 수준;
B: MSCs의 상대적 증식능;
C: 누적된 MSCs 수;
D: SA-b-gal 양성 세포의 이미지;
E: SA-b-gal 양성 세포의 비율; 및
F: 텔로미어 길이.
도 3은 anti-let7-ASO에 의해 let-7가 억제된 MSCs의 기능적 변화를 분석한 도이다:
A: MSC의 골분화 및 지방분화 세포 사진;
B: 상대적 무기질화(mineralization)에 따른 골분화 정량 그래프;
C: 상대적 지방 방울 침적에 따른 지방 분화 정량 그래프;
D: 세포 콜로니 형성을 분석한 사진;
E: 콜로니 수;
F: 혈관주위세포(pericyte) 마커 유전자의 발현 수준; 및
G: 전분화능(pluripotency) 관련 유전자의 발현 수준.
도 4는 anti-let7-ASO에 의해 let-7가 억제된 MSCs의 이동을 분석한 도이다:
A: 세포 이동 이미지;
B: 정량화한 세포 이동 백분율; 및
C: EMT-관련 유전자의 발현 수준.
도 5는 anti-let7-ASO에 의해 let-7가 억제된 MSCs에서의 대사 변화를 분석한 도이다:
A: 글루코스 흡수 관련 유전자의 발현 수준;
B 및 C: ECAR 분석 결과;
D: ROS 생성 분석 이미지;
E: ROS 생성 정량 그래프;
F: TMRE 염색 이미지; 및
G: TMRE의 형광 세기 정량 그래프.
도 6은 MSCs에서 LIN28의 과발현의 효과를 분석한 도이다:
A: let-7 패밀리들의 발현 수준;
B: let-7 표적 유전자 HMGA2의 발현 수준;
C: 세포 이동;
D: 세포 이동 정량 그래프;
E: 골분화 및 지방 분화 이미지;
F: 골분화 정량 그래프;
G: 지방 분화 정량 그래프;
H: 콜로니 수; 및
I: 증식된 세포 수.
도 7은 anti-let7-ASO로 트랜스펙션한 MSCs에서 let7이 표적화하는 단백질들의 발현 변화를 분석한 도이다:
A: let-7 억제에 의해 MSCs에서 발현 증가한 단백질들의 수; 및
B: let-7 억제에 의해 MSCs에서 상향조절된 상위 20가지 단백질 리스트.
도 8은 anti-let7-ASO로 트랜스펙션한 뒤 8시간 후 MSCs에서 프로테오믹스의 변화를 LC-MS/MS로 분석한 도이다:
A: anti-let7-ASO로 트랜스펙션한 MSCs에서 대조군에 비해 현저히 강화된 세포 기능에 대한 GO 분석; 및
B: let-7 억제에 의해 유도된 세포 기능 변화에 대한 IPA 분석.
도 9는 let-7 억제된 MSCs의 측분비 효과를 분석한 도이다:
A: MSC와 CD34+ HPCs의 공배양 실험 개략도;
B: 기질(stroma)-없는 조건 (HSC only), 대조군 MSCs (NC) 또는 let-7 억제된 MSCs (let-7 ASO)와의 공배양 조건하의 조혈 전구세포 (CD34+ CD90+)의 증식;
C: HUVEC 및 MSCs의 공배양 실험 개략도;
D: 공배양한 세포의 사진; 및
E: 혈관 형성 정량 그래프.
도 10은 let-7 억제된 MSCs와 백혈구 세포주 (HL60, MOLM-14 또는 MV-4-11)를 공배양한 뒤 백혈구 세포 (CD90+)의 증식을 정량한 도이다.
도 11은 et-7 억제된 MSCs의 상처 치유 효과를 분석한 도이다:
A: 시간에 따른 상처 이미지; 및
B: 상처 치유 효과를 정량한 그래프.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 구현예로 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 다만, 하기 구현예는 본 발명에 대한 예시로 제시되는 것으로, 통상의 기술자에게 주지 저명한 기술 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있고, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않는다. 본 발명은 후술하는 특허청구범위의 기재 및 그로부터 해석되는 균등 범주 내에서 다양한 변형 및 응용이 가능하다.
또한, 본 명세서에서 사용되는 용어(terminology)들은 본 발명의 바람직한 실시예를 적절히 표현하기 위해 사용된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 본 발명이 속하는 분야의 관례 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 본 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 기술자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 통합된다.
본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 '%'는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (w/w) %, 고체/액체는 (w/v) %, 그리고 액체/액체는 (v/v) %이다.
일 측면에서, 본 발명은 let-7 miRNA 억제제를 포함하는, 중간엽기질세포(mesenchymal stromal cells, MSCs)의 기능 강화용 조성물에 관한 것이다.
일 구현예에서, let-7 miRNA 억제제는 RNA 억제 분자(inhibitoy RNA molecule), 길항제 microRNA, 효소적 RNA 분자 또는 항-miRNA 항체일 수 있다.
일 구현예에서, let-7 miRNA 억제제는 let-7 miRNA에 특이적으로 결합하는 핵산 분자일 수 있고, let-7 miRNA에 특이적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드(antisense oligonucleotides, ASO), 안타고미르(antagomir), 리보자임(ribozyme), 압타머(aptamer), siRNA, miRNA, shRNA(short hairpin RNA), PNA(peptide nucleic acid) 및 LNA(locked nucleic acid)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.
일 구현예에서, let-7 miRNA 억제제는 let-7 miRNA에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드(antisense oligonucleotides, ASO)일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 억제제는 상기 마이크로 RNA에 특이적으로 결합하는 핵산 분자를 코딩 및 발현하는 핵산을 포함할 수 있고, 이를 포함하는 플라스미드일 수 있으며, 통상의 기술 분야에서 이용되는 플라스미드 형태, 벡터 형태, 바이러스 벡터 형태, 안티센스 형태, shRNA 형태 또는 올리고 형태일 수 있다.
일 구현예에서, let-7 miRNA는 let-7a, let-7b, let-7c, let-7d, let-7e, let-7f, let-7g 또는 let-7i일 수 있으며, let-7 miRNA는 let-7a, let-7b, let-7c, let-7d, let-7e, let-7f, let-7g 및 let-7i로 이루어진 군으로부터 선택되는 둘 이상일 수 있다.
일 구현예에서, let-7 miRNA는 let-7a-5p 및 let-7b-5p일 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 조성물은 let-7 miRNA는 let-7a, let-7b, let-7c, let-7d, let-7e, let-7f, let-7g 및 let-7i로 이루어진 군으로부터 선택된 둘 이상의 miRNA 각각에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드들을 혼합한 혼합물을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 조성물은 let-7a에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드(ASO) 및 let-7b에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드 혼합물을 포함할 수 있으며, let-7a에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 let-7b에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드를 1:1의 중량비로 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 let-7a를 표적으로 하는 ASO는 서열번호 1의 염기서열을 포함할 수 있으며, let-7b를 표적으로 하는 ASO는 서열번호 2의 염기서열을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 중간엽기질세포의 기능 강화는 세포 이동(migration) 촉진, 증식(proliferation) 촉진, 분화(differentiation) 촉진 또는 노화(senescence) 억제일 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 조성물은 중간엽기질세포에서 SA(senescence-associated)-β 갈락토시데이즈 활성을 감소시킬 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 조성물은 중간엽기질세포에서 ROS 생성을 감소시킬 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 조성물은 중간엽기질세포에서 미토콘드리아의 막-관통(trans-membrane) 전위를 감소시킬 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 조성물은 중간엽기질세포의 골분화능을 증가시킬 수 있다.
일 구현예에서, 상기 중간엽기질세포는 제대혈 유래(umbilical cord blood-derived), 제대 유래(umbilical cord-derived), 지방 유래(adipose-derived) 또는 골수 유래(bone marrow-derived)일 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 조성물은 중간엽기질세포에서 HMGA2, IGF2BP1, IGF2BP2, c-Myc, CDC34, CCND2, GLUT1, IGF1R, INSR 또는 LIN28의 발현을 증가시킬 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 조성물은 중간엽기질세포의 측분비 효과를 증가시킬 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 조성물은 중간엽기질세포에서 글루코스의 혐기적 사용을 상향 조절하고, 미토콘드리아성 산화적 인산화를 하향-조절할 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 조성물은 중간엽기질세포에서 산화적 인산화로부터 해당(glycolysis)으로 세포 대사 에너지 이동을 유도할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 조성물은 시약 조성물일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 "핵산"이란 폴리뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드, DNA, RNA, 및 그 유사체, 및 그 유도체를 포함하는 것으로 예를 들면 펩타이드 핵산 (PNA) 또는 그 혼합물을 포함한다. 또한 핵산은 단일 또는 이중가닥일 수 있다.
본 발명에서 사용하는 용어 "miR" 또는 "miRNA"는 "micro RNA"를 말하는 것으로, 서로 혼용될 수 있다.
본 발명에서 사용하는 용어 "안타고미르(antagomir)"는 단일-가닥의 화학적으로 변형된 올리고뉴클레오타이드로서, 내인성 miRNA의 차단(silence)에 사용되며, 표적서열에 상보적 서열을 가진다. 본 발명에서 안타고미르는 miRNA에 효과적으로 결합하여 저해할 수 있도록 miRNA의 상보적 RNA 염기서열을 hydroxyprolinol- linked cholesterol solid support 및 2'-OMe phosphoramidites로 변형 (Kru tzfeldt, J., Rajewsky, N., Braich,R., Rajeev, K.G., Tuschl, T., Manoharan, M., and Stoffel, M. (2005). Silencing of microRNAs in vivo with “antagomirs.” Nature 438, 685-689 참조)하여 이용하였으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용하는 용어 "상보적"이란 소정의 혼성화 또는 어닐링 조건, 바람직하게는 생리학적 조건 하에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 miRNA 표적에 선택적으로 혼성화할 정도로 충분히 상보적인 것을 의미하며, 일부 또는 부분적으로 실질적으로 상보적(substantially complementary) 및 완전히 상보적 (perfectly complementary)인 것을 모두 포괄하는 의미를 가진다. 실질적으로 상보적이란, 완전히 상보적인 것은 아니지만, 표적 서열에 결합하여 본 발명에 따른 효과 즉, 상기 miRNA의 발현을 방해하기에 충분한 효과를 낼 정도의 상보성을 의미하는 것이다.
본 발명에서 사용된 용어, "중간엽기질세포(mesenchymal stromal cell; MSC)"는 "중간엽줄기세포(mesenchymal stem cell)" 또는 "기질세포"와 같은 의미로 사용되며, 인간을 포함한 포유동물, 바람직하게는 인간의 성체 세포로부터 유래된 다분화능(multipotency)을 갖는 미분화 세포를 말하고, 지방세포, 골세포, 연골세포, 근육세포, 신경세포, 심근세포로의 분화가 가능한 다분화능(multipotency)을 가진 세포를 의미한다. 본 발명의 중간엽기질세포는 인간(human), 원숭이(monkey), 돼지(pigs), 말(horses), 소(cows), 양(sheep), 개(dogs), 고양이(cats), 마우스(mice), 토끼(rats) 등의 모든 동물 유래의 세포를 포함하나, 바람직하게는 인간 유래의 세포이다. 중간엽기질세포는 예를 들어, 골수, 혈액, 뇌, 피부, 지방(즉, 지방조직 또는 지방세포), 제대혈, 제대의 바르톤 젤리(Wharton's jelly) 등의 다양한 성체 세포로부터 유래될 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 "분화(differentiation)"는 덜 특화된 세포가 특정한 세포로 발달하여 세포의 크기나 모양, 막전위, 대사 활성, 신호에 대한 반응이 특정한 유형의 세포로 변화하는 현상을 말하며, 처음에 거의 동질이었던 어떤 생물계의 부분 사이에 질적인 차이가 생기는 것, 또는 그 결과로서 질적으로 구별할 수 있는 부분계로 나누어져 있는 상태를 분화라고 한다. 특히, 줄기세포의 분화는 줄기세포가 특정 기능을 가지는 세포로 방향성을 가지고 발달하는 현상을 의미하는 것이다.
본 발명에서 사용된 용어, "발현"은 일반적으로 생물학적 활성이 있는 폴리펩티드가 DNA 서열로부터 생성되고 세포에서 생물학적 활성을 나타내는 세포 과정을 의미한다. 그런 의미로, 유전자 발현은 전사 및 해독 과정을 포함할 뿐만 아니라, 유전자 또는 유전자 산물의 생물학적 활성에 영향을 끼칠 수 있는 전사 후 및 해독 후 과정을 포함한다. 상기 과정들은 RNA 합성, 가공 및 수송뿐만 아니라, 폴립펩티드 합성, 수송 및 폴리펩티드의 해독후 변형을 포함하지만, 이들에 국한되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용된 용어, "과발현" 또는 "상향 조절(up-regulation)"은 세포내 전사(gene transcription) 또는 번역(gene translation)에 의해서 특정 유전자의 mRNA로의 발현 또는 단백질로의 발현량이 현저하게 증가된 것을 의미한다.
본 발명에서 사용된 용어, "하향 조절(down-regulation)"은 세포내 전사(gene transcription) 또는 번역(gene translation)에 의해서 특정 유전자의 mRNA로의 발현 또는 단백질로 발현량이 현저하게 되어 감소된 것을 의미한다.
본 발명에서, 상기 발현은 핵산서열, 상기 핵산서열에 상보적인 핵산서열, 상기 핵산서열 및 상보적인 서열의 단편을 특이적으로 인식하는 프라미어 쌍, 프로브, 또는 프라이머 쌍 및 프로브를 이용하여 중합효소연쇄반응, 실시간 RT-PCR (Real-time RT-PCR), 역전사 중합효소연쇄반응, 경쟁적 중합효소연쇄반응(Competitive RT-PCR), Nuclease 보호 분석(RNase, S1 nuclease assay), in situ 교잡법, 핵산 마이크로어레이, 노던블랏 또는 DNA 칩 방법으로 유전자 또는 mRNA의 발현 수준을 측정하여 확인할 수 있으며, 해당 단백질 전장 또는 그 단편을 특이적으로 인식하는 항체, 항체단편, 앱타머(aptamer), 아비머(avidity multimer) 또는 펩티도모방체(peptidomimetics)를 이용하여 웨스턴블랏, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사면역확산법(radioimmunodiffusion), 면역 전기영동, 조직면역염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), FACS, 질량분석 또는 단백질 마이크로어레이 방법으로 단백질의 발현 수준을 측정하여 확인할 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 let-7 miRNA가 억제된 중간엽기질세포에 관한 것이다.
일 구현예에서, 본 발명의 중간엽기질세포는 HMGA2, IGF2BP1, IGF2BP2, c-Myc, CDC34, CCND2, GLUT1, IGF1R, INSR 또는 LIN28의 발현이 증가/상향 조절될 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 중간엽기질세포는 증식, 이동, 골분화능 또는 측분비 효과가 증가/상향 조절될 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 중간엽기질세포는 SA(senescence-associated)-β 갈락토시데이즈 활성이 감소/하향 조절될 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 중간엽기질세포는 산화적 인산화로부터 해당(glycolysis)으로 세포 대사 에너지 이동이 유도된 세포일 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 중간엽기질세포는 글루코스의 혐기적 사용이 상향 조절되고, 미토콘드리아성 산화적 인산화가 하향-조절된 세포일 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 중간엽기질세포는 해당 용량(glycolytic capacity)이 향상된 세포일 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 중간엽기질세포는 상처 치유를 증가시킬 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 중간엽기질세포는 조혈전구세포(HPC)의 증식 또는 자가-재생을 증가시킬 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 중간엽기질세포는 내피세포의 혈관 신생을 증가시킬 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 중간엽기질세포를 유효성분으로 포함하는, 세포 치료제 조성물에 관한 것이다.
일 구현예에서, 상기 세포 치료제 조성물은 골 재생 또는 혈관 재생용일 수 있다.
일 구현예에서, 혈관 재생은 동맥 재생, 소동맥 재생, 정맥 재생, 모세혈관재생, 뇌혈관장벽 (BBB) 재생 또는 망막혈관 재생을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 세포 치료제 조성물은 냉동저장될 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 "세포 치료제"는, 세포의 조직과 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가(autologus), 동종(allogenic), 또는 이종(xenogenic)의 줄기세포를 이용하여 체외에서 증식 및 선별하고 체내에 도입함으로써 조직의 재생 치료에 사용하는 치료제를 의미한다.
상기 세포 치료제는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 인체에 투여될 수 있으며, 비경구 또는 경구투여될 수 있고, 경구투여될 경우 세포를 이식재 등으로 내포하여 투여될 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어, "혈관 재생"은 손상된 혈관의 손상을 복구하는 것으로, 본 발명의 조성물을 이용하여 혈관 신생, 즉 손상된 혈관의 재생을 촉진하고 이미 손상된 혈관이 지속적인 외력 등에 의해 추가로 손상되는 것을 방지하는 것을 의미한다. 상기 "혈관 신생" 또는 "혈관 형성"은 기관 또는 손상을 받은 조직에 혈액을 공급하기 위하여 새로운 혈관을 형성하는 자연치유 과정을 말하며, 혈관 신생은 많은 질환에서 병의 진행과 치료에 중요한 역할을 한다.
일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 중간엽기질세포 또는 본 발명의 세포 치료제 조성물을 유효성분으로 포함하는, 혈관 질환 또는 혈관 기능 장애의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
일 구현예에서, 혈관 질환은 외상성 혈관 손상, 말초혈관 질환, 심혈관 질환, 뇌혈관 질환 또는 허혈성 질환일 수 있으며, 허혈성 질환은 허혈성 심근경색, 허혈성 심장질환, 허혈성 혈관질환, 허혈성 장염, 허혈성 안질환, 허혈성 녹내장, 허혈성 신부전, 허혈성 망막증, 허혈성 뇌졸중 또는 허혈성 하지질환일 수 있다.
일 구현예에서, 혈관 질환 또는 혈관 기능 장애는 중증 사지 허혈, 당뇨성 혈관 신생 장애, 혈관성 치매, 당뇨병 수반 장기 손상, 동맥경화증, 협심증, 말초 심혈관 질환, 고혈압, 뇌경색, 뇌손상 후유증, 심부전증, 말초 순환장애, 심근경색증, 동맥패쇄성 질환, 뇌졸중, 척수손상, 척수신경 후유증, 퇴행성 질환, 뇌경색 후유증, 말초신경 장애, 당뇨성 궤양, 노안, 퇴행성 난청, 뇌수술 후유증, 허혈성 발작 또는 지주막하 출혈일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 조성물은 혈관신생 또는 혈관형성 유도, 혈관 재생 또는 조직재생을 촉진하거나, 혈관 기능 개선, 조직 관류 및 새로운 혈관 형성을 증가시킬 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에서 사용되는 용어, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체의 건강상태, 혈관 질환 또는 혈관 기능 장애의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여, 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 생물학적 제제에 통상적으로 사용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 둘 이상의 이들의 조합을 포함할 수 있다. 본 발명에서 사용되는 용어, "약학적으로 허용가능한"이란 상기 조성물에 노출되는 세포나 인간에게 독성이 없는 특성을 나타내는 것을 의미한다. 상기 담체는 조성물을 생체 내 전달에 적합한 것이면 특별히 제한되지 않으며, 예를 들면, Merck Index, 13th ed., Merck & Co. Inc. 에 기재된 화합물, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 이용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주이용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(Mack Publishing Company, Easton PA, 18th, 1990)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 약학 조성물은 경구형 제형, 외용제, 좌제, 멸균 주사용액 및 분무제를 포함하는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 제형일 수 있다.
본 발명의 조성물은 또한 생물학적 제제에 통상적으로 사용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 둘 이상의 이들의 조합을 포함할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 조성물을 생체 내 전달에 적합한 것이면 특별히 제한되지 않으며, 예를 들면, Merck Index, 13th ed., Merck & Co. Inc. 에 기재된 화합물, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 이용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주이용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(Mack Publishing Company, Easton PA, 18th, 1990)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
본 발명의 조성물에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 첨가제를 더 포함할 수 있으며, 이때 약제학적으로 허용 가능한 첨가제로는 전분, 젤라틴화 전분, 미결정셀룰로오스, 유당, 포비돈, 콜로이달실리콘디옥사이드, 인산수소칼슘, 락토스, 만니톨, 엿, 아라비아고무, 전호화전분, 옥수수전분, 분말셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 오파드라이, 전분글리콜산나트륨, 카르나우바 납, 합성규산알루미늄, 스테아린산, 스테아린산마그네슘, 스테아린산알루미늄, 스테아린산칼슘, 백당, 덱스트로스, 소르비톨 및 탈크 등이 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 약제학적으로 허용 가능한 첨가제는 상기 조성물에 대해 0.1 중량부 내지 90 중량부 포함되는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 비 경구 투여(예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 본 발명에 따른 조성물의 일일 투여량은 0.0001 ~ 10 ㎎/㎖이며, 바람직하게는 0.0001 ~ 5 ㎎/㎖이며, 하루 일 회 내지 수회에 나누어 투여하는 것이 더욱 바람직하다.
일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 중간엽기질세포 또는 본 발명의 세포 치료제 조성물을 유효성분으로 포함하는, 상처 치유용 약학적 조성물에 관한 것이다.
하기의 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 내용을 구체화하기 위한 것일 뿐 이에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. MSCs에서 let-7 miRNA의 억제
1-1. let-7 miRNA의 서브패밀리 분석
MSCs(mesenchymal stromal cells) 집단에서 우선적으로 발현되는 주요 서브패밀리(subfamily) 유전자를 식별하기 위해, RNA-seq를 수행하고 RPKMs (read per kilobases million mapped reads) 분석을 수행하여, let-7 miRNAs 서브타입(subtype)들의 상대적 존재비(relative abundance)를 확인하였다. 구체적으로, 인간 지방 조직 유래 MSC(ADMSC)에서 추출한 총 RNA를 변성된 15% 폴리아크릴아마이드 젤에서 분리하고, 18-26개의 뉴클레오타이드의 젤 단편을 절제한 뒤, 작은 RNA(small RNAs)를 0.5 M NaCl로 4℃에서 하룻밤동안 용출하고 에탄올로 침전시켰다. 1 μg의 RNA를 사용하여 TruSeq Small RNA Sample Prep Kit version 2 (Illumina, San Diego, CA, USA)로 작은 RNA 시퀀싱 라이브러리를 생성하고, Illumina HCS (version 1.4.8), RTA (version 1.12.4.2) 및 CASAVA (version 1.8.2) 소프트웨어를 사용하여 base-calling하고 FASTQ 형식의 de-multiplexed 시퀀싱 로(raw) 데이터를 생성하였다. 또한, 인간 골수 유래 MSC(bone marrow-derived MSCs, BM-MSCs)에서 let-7 miRNA 서브패밀리의 발현을 qRT-PCR(quantitative real-time PCR)로 분석하기 위해, 독립적으로 기증된 3개의 골수 유래 MSCs(BM-MSCs)에서 총 RNA를 Trizol (Invitrogen, San Diego, CA, USA)로 분리한 뒤, l-2 μg의 총 RNA를 이용하여 cDNA를 superiorScript III mastermix (Enzynomics, Daejeon, Korea)로 합성하였다. let-7 miRNA 서브패밀리의 각 miRNA의 발현 수준을 miScript II RT Kit (QIAGEN, Hilden, Germany) 및 miScript SYBR® Green PCR Kit (QIAGEN)를 사용하여 분석하였으며, miRNA의 수준의 정규화를 위해, 세포 내 U6 snRNA의 발현 수준을 내부 대조군으로 이용하였다.
그 결과, ADMSC에서 let-7a-5p에 이어 let-7b-5p (1.6×105 및 2.3×104 RPKMs)가 가장 많이 발현되었고, 다른 let-7 miRNA 서브패밀리들 (let-7c, let-7d, let-7e, let-7f, let-7g 및 let-7i)은 상기 두 종류에 비해 발현이 현저히 적은 것으로 나타났다 (< 5×103 RPKMs) (도 1A). 또한, BM-MSCs에서 let-7 miRNA의 서브타입 발현 분석 결과, 다른 서프타입에 비해 let-7a-5p miRNA가 주로 높은 발현 수준을 나타냈다 (도 1B). 이를 통해, let-7a-5p 및/또는 let-7b-5p가 MSCs에서 주로 발현되는 let-7 miRNA의 주요 서브타입임을 확인하였다.
1-2. 안티센스 올리고뉴클레오타이드 혼합물의 let-7 miRNA 억제 확인
let-7 패밀리 표적 유전자의 miR Walk DB-기반 생물정보학 분석 결과, let-7a 및 let-7b에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드(antisense oligonucleotide, ASO)가 총 표적 유전자의 대부분 (전체 let-7 패밀리 표적 유전자의 91%)을 억제할 수 있는 것으로 나타났고 (도 1C), 이는 let-7 패밀리의 보존된 시딩 영역 서열(seeding region sequence) 때문이다 (도 1D). 따라서, MSCs에서 let-7 miRNA의 억제에 따른 효과를 확인하기 위해, Anti-Anti (Gibco)가 없는 배지에서 배양한 BM-MSCs에 let-7a를 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드(antisense oligonucleotide, ASO) (Bionics Corp. Daejeon, Korea) 및 let-7b를 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드 (Bionics Corp. Daejeon, Korea)를 1:1의 중량비로 혼합한 혼합물과 대조군 ASO를 각각 10 nM씩 Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent (Thermofisher, MA, USA)를 이용하여 트랜스펙션한 뒤, let-7 패밀리 (let-7a, b, d, e, f 및 i)의 발현 수준을 qRT-PCR로 분석하였다.
그 결과, let-7a 및 let-7b를 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드 혼합물(anti-let7-ASO)에 의해 대부분의 let-7 패밀리 (let-7a, b, d, e, f 및 i)의 수준이 현저하게 억제된 것으로 나타났다 (도 1E). 이를 통해, 두 let-7 서브패밀리에 대한 ASO가 대부분의 let-7 miRNA의 패밀리를 억제할 수 있음을 확인하였다.
1-3. anti-let7-ASO의 let-7 기능적 억제 확인
MSCs에서 let-7의 억제의 기능적 영향을 확인하기 위해, anti-let7-ASO를 MSCs에 트랜스펙션하고 let-7 miRNA의 대표적인 표적 유전자인 HMGA2, IGF2BP1 및 IGF2BP2의 mRNA 발현 수준을 SYBR Premix Ex Taq II (Takara, Japan)를 이용해 qRT-PCR로 분석하고, HPRT를 내부 대조군으로 이용한 2-ΔΔCt 방법으로 정규화하고 발현 수준을 정량하였다. 또한, 성숙한 let-7 자체가 Lin28 mRNA의 3' 비번역 부위(untranslated region, UTR)에 결합하여 LIN28의 전사 후 억제를 야기할 수 있으므로, LIN28의 발현 수준을 웨스턴 블롯 분석으로 확인하였다. 구체적으로, 트랜스펙션한 MSCs를 Np40 버퍼 (Pierce, Washington, USA)로 파쇄하고, SDS-PAGE 젤에서 단백질을 분리하고 나이트로셀룰로오스 멤브레인 (GE Healthcare, Chicago, USA)으로 트랜스퍼하였다. 멤브레인을 5% 밀크를 함유하는 PBST에서 한시간 동안 블로킹하고 LIN28에 대한 일차 항체 (Abcam, ab124765)와 4℃에서 하룻밤 동안 반응시킨 뒤, donkey-anti-rabbit HRP-conjugated 이차 항체 (GE Healthcare)와 한시간 동안 반응시키고, SuperSignal West Femto Luminol reagents (Invitrogen)를 이용하여 단백질 수준을 검출하였다.
qRT-PCR 결과, anti-let7-ASO 처리에 의해, let-7의 표적 유전자인 HMGA2, IGF2BP1 및 IGF2BP2의 mRNA 발현 수준이 현저히 증가한 것으로 나타났다 (도 1F). 또한, let-7의 억제에 의해 LIN28 단백질 발현 수준이 현저히 증가한 것으로 나타났다 (도 1G 및 H). 이를 통해, anti-let7-ASO가 MSCs에서 let-7의 기능적 억제제로 효과가 있는 것을 확인하였다.
실시예 2. let-7 억제에 따른 MSCs의 기능적 변화 분석
2-1. MSCs의 세포 자율기능 변화 분석
MSC에서 let-7의 억제가 세포 자율 기능(cell autonomous functions)에 미치는 영향을 확인하기 위해, let-7 miRNAs의 표적 유전자인 세포 주기 조절 유전자 c-Myc, CDC34 및 CCND2의 발현을 qRT-PCR로 분석하여 세포 증식에 대한 let-7의 억제의 효과를 확인하였다. 또한, anti-let7-ASO를 트랜스펙션한 MSC와 대조군 MSC의 세포 증식(proliferation)을 세포수를 계수하여 분석하였으며, 11계대의 MSC를 anti-let7-ASO 또는 scrambled 대조군을 사용하여 연속 트랜스팩션하여 장기 증식 배양을 수행한 뒤 누적된 세포수를 분석하였다. 또한, let-7의 억제에 의한 MSC의 노화 변화를 확인하기 위해, ASO로 let-7를 억제한 MSC의 후기 계대배양 세포 (12 계대)에 대해 Senescence βstaining kit (Cell Signaling Technology, MA, USA)를 이용하여 노화 관련된 SA(senescence-associated)-β 갈락토시데이즈 분석을 수행하였다. 아울러, anti-let7-ASO를 트랜스펙션한 MSCs의 텔로미어의 길이를 분석하기 위해, 텔로미어 특이적 프라이머 세트 (forward: 5'-GGTTTGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTT-3', reverse: 5'-GGCTTGCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCT-3' 및 36 B4 프라이머 세트 (forward: 5'-CAGCAAGTGGGAAGGTGTAATCC-3', reverse: 5'-CCCATTCTATCATCAACGGGTACAA-3')를 이용하여 Rotor-Gene Q real-time instrument (QIAGEN)로 qPCR을 수행하였다. 상대적 텔로미어 길이는 각 시료에서 36B4 유전자에 대한 T (telomere) 및 S (single copy; b-globin) 양의 카피수로 결정하여 상대적 T/S 비율을 계산하여 도출하였다. 이 때, 대조군은 neonatal cord blood cells를 사용하였다.
그 결과, let-7 miRNA의 표적 세포 주기 조절 유전자인 c-Myc, CDC34 및 CCND2가 ASO에 의해 let-7가 억제된 MSC에서 현저하게 유도되는 것으로 나타났다 (도 2A). 또한, anti let7-ASO에 의해 MSC의 증식이 대조군 MSC에 비해 현저히 증가하였으며 (도 2B 및 C), 대조군 MSC에 비해 SA- β-갈락토시데이즈 활성이 현저히 낮아 노화가 억제된 것으로 나타났다 (도 2D 및 E). 그러나, 이와 같은 증식 증가 및 노화 억제에도 불구하고 텔로미어의 길이는 대조군과 유의적으로 다르지 않아 (도 2F), anti-let7-ASO에 의한 let-7의 억제가 텔로미어의 길이 변화 없이 증식 활성 및 노화를 제어함으로써 생체외 증식 가능성을 향상시킬 수 있음을 확인하였다.
2-2. MSCs의 분화능 변화 분석
let-7 억제에 의한 MSC의 다계통 분화능(multi-lineage differentiation potential) 및 표현형 변화를 분석하기 위해, 골분화(Osteogenic differentiation) 분석 및 지방분화(Adipogenic differentiation) 분석을 수행하였으며, 줄기세포 특성 분석을 위해, 콜로니 형성(colony formation) 분석, 혈관주위세포 마커 및 줄기세포 특성(stemness) 관련 유전자의 발현 분석을 수행하였다. 구체적으로, STEMPRO®Osteogenesis Differentiation Kit (Gibco)로 골분화를 유도하고, 12일 후 Alizarin Red S 염색으로 세포외기질의 무기질화를 분석하고, 10% 세틸피리디늄클로라이드(cetylpyridinium)로 추출하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 또한, STEMPRO®Adipogenesis Differentiation Kit (Gibco)로 지방분화를 유도하고, 12일 후 세포를 프로필렌 글라이콜로 고정한 뒤, Oil Red O로 염색하여 지방 방울(lipid droplets)을 시각화하였다. 지방 방울의 수를 계수하고, 아이소프로필 알코올에 용해된 4% Nonidet P40를 이용하여 염료를 추출하여 510 nm 에서 분광광도계로 측정하였다. 또한, MSCs의 콜로니 형성 (CFU-F)을 위해, MSC를 100 mm 디쉬 당 1000 cells 또는 2000 cells로 분주하고, 14일 동안 배양한 뒤 크리스탈 바이올렛 (Sigma-Aldrich, Carlsbad, CA, USA)으로 염색하여 50개 이상의 세포를 포함하는 콜로니의 수를 계수하였다. 아울러, 혈관주위세포 마커 NG2, Nestin 및 PDGFR-B의 발현, 및 줄기세포 특성 관련 마커 유전자 Oct-4, Sox2, Nanog 및 Klf-4의 발현은 RT-PCR로 분석하였다.
그 결과, let-7 억제된 MSC는 대조군 MSC에 비해 더 높은 골분화능을 나타냈으며, 유사한 수준의 지방분화능을 나타냈다 (도 3A 내지 C). 이와 같은 기능성 변화가 줄기세포 특성의 획득에 의한 것인지 확인하기 위해, 콜로니 형성(CFU-F) 빈도를 분석하고 (도 3D 및 E), 혈관주위세포(pericyte) 마커 NG2, Nestin 및 PDGFR-B의 발현, 및 줄기세포 특성 관련 마커 유전자 Oct-4, Sox2, Nanog 및 Klf-4의 발현을 분석한 결과, 대조군과 유의한 차이가 나타나지 않았다 (도 3F 및 G). 이를 통해, anti-let7-ASO에 의해 유도된 MSC의 기능적 변화가 세포 운명(cell fate)의 변화가 아닌 세포 기능 상태(cellular functional state)의 차이에 의한 것임을 확인하였다.
2-3. MSCs의 이동 변화 분석
let-7 억제된 MSC의 이동능 변화를 확인하기 위해, 스크레치 분석(scratch assay)을 수행하였다. 구체적으로, 6웰 플레이트에 MSCs를 6 × 104개 분주하고, 2일 후에 anti-let7-ASO를 트랜스펙션하였다. 200 μl 멸균 피펫팁을 사용하여 단층의 세포층을 가로질러 직선으로 스크레치를 생성한 뒤 디쉬를 세척하여 떨어진 세포를 제거하고 새 배양 배지를 추가하였다. 세포를 배양하면서 0시간 및 18시간차에 현미경으로 촬영하고, ImageJ로 세포가 차지하지 않은 스크레치 영역을 측정한 뒤, 하기 수학식 1을 이용하여 계산하였다. 또한, EMT(epithelial-mesenchymal transition) 조절 인자인 snail, slug, zeb1, zeb2 및 twist의 유전자 발현 수준을 qRT-PCR로 분석하였다.
그 결과, let-7가 억제된 MSCs는 상기 실시예 1-3에서 세포 이동을 조절하는 유전자인 HMGA2 및 IGF2BP2의 상향 조절 결과와 일치하게 세포의 이동이 증가한 것으로 나타났다 (도 4A 및 B). 반면, EMT 조절 인자인 snail, slug, zeb1, zeb2 및 twist의 유전자 발현 수준은 let-7 억제에 의해 유의적으로 변화하지 않은 것으로 나타나 (도 4C), MSCs의 세포 운명 변화 없이 기능적인 변화만 일어난 것을 확인하였다.
2-4. MSC의 대사 조절 변화 분석
MSCs가 유전적 또는 세포 운명의 변화 없이 기능적 변화를 겪으므로, MSCs가 let-7의 억제에 의해 대사 조절 변화가 있는지 확인하기 위해 글루코스 흡수 단백질들(GLUT1, IGF1R 및 INSR)의 유전자 발현을 RQ-PCR로 분석하고, ECAR로 해당작용을 분석하였으며, ROS 수준과 미토콘드리아 막전위를 분석하였다. 구체적으로, miRNA 억제제를 처리한 MSCs를 XF 24웰 배양 마이크로플레이트 (Seahorse Bioscience, MA, USA)에 2 × 104 cells/well의 밀도로 분주하여 밤새 배양한 뒤, 10 mM 글루코스(glucose), 2 μM 올리고마이신(oligomycin) 및 50 mM 2-DG(2-deoxy-Dglucose)를 순차적으로 처리하고, ECAR(extracellular acidification rate)를 XF24 Extracellular Flux Analyzer (Seahorse Bioscience)로 측정하였다. 측정된 ECAR를 Pierce BCA assay (Thermo Fisher)로 측정한 단백질 농도로 정규화하였다. 또한, ROS를 측정하기 해, miRNA 억제제를 처리한 MSCs를 6웰 세포 배양 플레이트에 분주한 뒤, 세포를 PBS로 세척하고 20 nM DCF-DA 및 2% FBS를 포함하는 HBSS 배지에서 45분 동안 인큐베이션하고, Lionheart FX 로 촬영하여 GEN5 프로그램으로 분석하였다. 또한, 미토콘드리아 막 전위를 TMRE-Mitochondrial Membrane Potential Assay Kit (Abcam, CAM, England)로 측정하고, Lionheart FX로 촬영하여 GEN5 프로그램으로 분석하였다.
글루코스 대사를 분석한 결과, let-7 억제 MSC는 GLUT1, IGF1R 및 INSR를 포함하는 글루코스 흡수를 위한 단백질의 발현이 상향조절되었으며 (도 5A), ECAR 분석 결과 해당 용량(glycolytic capacity)이 향상된 것으로 나타났다 (도 5B 및 C). 또한, let-7 억제된 MSCs는 대조군에 비해 낮은 ROS 수준을 나타내 (도 5D 및 E), MSC의 글루코스 대사가 산화적 인산화(oxidative phosphorylation)에서 혐기적 해당경로(anaerobic glycolytic pathways)로 재프로그래밍된 것을 알 수 있었다. 또한, let-7 억제된 MSCs에서 미토콘드리아의 막-관통(trans-membrane) 전위가 현저히 낮아진 것으로 나타나 (도 5E 및 F), 산화적 인산화의 감소를 한 번 더 뒷받침하였다.
2-5. Lin28 과발현과 상이한 독특한 기능적 영향 확인
let-7이 LIN28의 독점적인 하류(down-stream) 표적이 아니므로, MSCs에서 let-7의 억제 효과가 LIN28의 과발현 효과와 유사한지 분석하였다. MSCs에서 LIN28를 과발혀시키기 위해, LIN28 cDNA를 pMIRNA1 렌티바이러스 벡터 (System Biosciences, CA, USA)에 클로닝하고 Lipofectamine LTX (ThermoFisher)를 이용하여 293T 세포에 감염시켰다. 2일 후 세포 숲(soup)을 수득하고 Retro concentinTM (System Biosciences)로 농축하여 MSCs를 감염시켰다. 그 뒤, LIN28가 과발현된 MSCs에서 let-7 패밀리의 발현 정도, HMGA2의 발현 정도, 세포 이동, 골분화 및 지방분화, 및 세포 증식을 상기 실시예에서와 같이 분석하여 세포의 기능적 변화를 분석하였다.
그 결과, LIN28 단백질의 과발현이 let-7 패밀리 miRNAs를 하향 조절하고 이의 표적 유전자인 HMGA2의 발현을 상향 조절하는 것으로 나타났다 (도 6A 및 B). 또한, LIN28 단백질이 과발현된 MSCs는 let-7 억제된 MSCs와 유사하게 지방분화의 변화없이 세포 이동 및 골분화의 증가를 나타냈다 (도 6C 내지 H). 그러나, LIN28 과발현은 let-7 억제와 달리 세포 증식이 증가하지 않는 것으로 나타나 (도 6I), LIN28 과발현과 let-7의 억제가 유사하지만 서로 다른 별개의 생물학적 결과임을 확인할 수 있었다. 이를 통해, LIN28 과발현이 let-7 억제에 의한 기능적 변화를 모방하지만 부분적인 차이가 있으므로 let-7 억제가 MSCs에 독특한 기능적 영향을 미치는 것을 알 수 있다.
상기 결과들을 통해, MSCs에서 let-7 억제가 ROS 감소 및 미토콘드리아 활성 감소로 특징지어지는 대사 리프로그래밍을 유도하여 줄기세포 상태의 세포의 대사 특성을 모방하는 것을 확인하였다.
실시예 3. let-7 억제된 MSCs의 단백질 발현 수준 변화 분석
let-7 억제에 의해 유도된 MSCs의 기능적 변화를 miRNA의 전사 후 조절 효과에 의한 단백질 수준 변화로 특성화하기 위해, anti-let7-ASO 트랜스펙션한 MSC 및 대조군 MSC의 전체 단백질 발현 패턴을 LC-MS/MS 분석을 통해 확인하였다. 구체적으로, anti-let7-ASO 트랜스펙션한 MSC 및 대조군 MSC로부터 단백질 시료를 분리하고, 이를 0.4% 아세트산에서 환원하고 37℃에서 10분 동안 초음파처리하였다. 단백질 시료 (100 μg 단백질)를 트립신 분해 후 LTQ-Orbitrap XL mass spectrometer (Thermo Fisher)로 nano-flow LC-MS/MS(liquid chromatography tandem mass spectrometry) 분석하고, 데이터를 Proteome Discoverer (ver2.2.0.388) 소프트웨어에 로딩하였으며, LFQ(label-free quantification)를 수행하여 각 개별 단백질의 발현 수준을 비교 분석하였다. 이 때, FBS에 의해 영향받은 단백질을 제외하기 위해 MS 데이터 검색에 FBS 단백질 리스트가 추가된 인간 UniProtKB 데이터베이스 (released in June 2020)를 사용하였다. 그 후, either SignalP, SecretomeP (score ≥ 0.5) 또는 TMHMM에 의해 실제 분비 단백질로 확인된 단백질만 GO(gene ontology) 분석에 사용하였다. GO 용어는 DAVID(Database for Annotation, Visualization, and Integrated Discovery) tools (https://david.ncifcrf.gov/, accessed on 19 March 2021)의 알고리즘을 이용하여 분석하였다.
let-7 억제된 MSCs와 대조군 MSCs의 프로테오믹스 비교를 통해 anti-let7-ASO 트랜스펙션에 의해 유도된 262개의 단백질을 확인하였으며, let-7의 표적 유전자인 HMGA2 및 IGF2BP2가 가장 단백질 발현이 가장 상향조절된 것으로 나타났다 (도 7). 또한, let-7 억제 MSC에서 유의하게 유도된(>1.3배) 단백질의 GO 분석 결과, 상처 치유, 혈관 신생, 세포 이동 및 에너지 대사를 포함한 많은 세포 기능에 관련된 단백질들이 강화된(enriched) 것으로 나타났다 (도 8A). 이와 유사하게, IPA 분석(ingenuity pathway analysis)은 세포 이동의 활성화, 세포 생존 및 세포사멸의 억제를 나타냈다 (도 8B). 따라서, MSCs에서 let-7 miRNAs의 억제에 의해 유도된 프로테오믹스의 변화는 let-7에 의해 세포 이동 및 증식능이 증가된 MSC의 기능적 변화를 뒷받침하는 것을 확인하였다.
실시예 4. let-7 억제된 MSCs의 개선된 세포 치료 효과 분석
4-1. 측분비 효과
let-7 억제된 MSCs의 이웃 세포에 대한 측분비(paracrine) 지원 효과를 확인하기 위해, anti-let7-ASO 트랜스펙션한 MSCs 또는 대조군 MSCs를 인간 재대혈 유래 CD34+ 세포와 공동 배양한 뒤, multilineage reconstitution potential이 있는 HPCs(hematopoietic progenitor cells) (CD34+ CD90+)의 증식을 분석하였다 (도 9A). 구체적으로, 인간 재대혈로부터 CD34+ 세포를 CD34 MicroBead kit (Miltenyi Biotec, NRW, Germany)로 분리 및 정제하고, anti-let7-ASO를 트랜스펙션한 MSCs와 4일 동안 사이토카인 혼합물 (20 ng/mL hSCF, 20 ng/mL hFlt3L, 4 ng/mL hIL-3, 4 ng/mL hIL-6, 4 ng/mL hG-CSF 및 0.2 × 106 M hydrocortisone (ProSpec-Tany TechnoGene Ltd, Ness-Ziona, Israel))의 존재하에 10% FBS (Hyclone)를 포함하는 DMEM으로 공동배양하였다. 생체외 증식된 조혈전구세포의 표현형을 분석하기 위해, 공동배양된 세포를 CD45, CD34 및 CD90 (BD Pharmingen, NJ, USA)에 대한 항체로 염색한 뒤, 조혈 세포 집단 (CD45+)을 게이팅하고 유세포 분석기로 분석하였다. 이 때, 비교를 위해, 백혈병 세포주 MOLM14, HL60 또는 MV-4-11와 24시간 동안 방사선 조사 (15 Gy)하고 세척한 MSCs를 RPMI 성장 배지 (MOLM14) 또는 IMDM 성장 배지 (HL60, MV-4-11)로 공배양하고 CD45 및 CD90에 대한 항체로 염색한 뒤 조혈 세포 집단 (CD45+)을 게이팅하고 유세포 분석기로 분석하였다. 또한, let-7 억제된 MSCs의 내피세포의 혈관 신생에 미치는 영향을 확인하기 위해, HUVEC(human umbilical vein endothelial cells)과 anti-let7-ASO 트랜스펙션한 MSCs 또는 대조군 MSCs를 3일 동안 공동 배양한 뒤, BD FACSAria™Fusion Flow Cytometers를 이용하여 HUVECs (CD90-)를 분류 정제하였다. 정제된 HUVEC을 EBM-2TM 및 감소된 양의 FBS 및 VEGF (각각 1/4 및 1/2) (EGMTM Endothelial Cell Growth Medium SingleQuotsTM Kit, Lonza)를 포함하는 growth factor-reduced Matrigel (Corning, NY, USA)에 로딩하고 혈관 신생을 분석하였다 (도 9C).
그 결과, 대조군 MSCs에 비해 anti-let7-ASO로 트랜스펙션한 MSCs과 공배양한 CD34+ CD90+ 세포의 증식이 현저하게 증가된 것으로 나타났다 (도 9B). 반면, 이와 같은 let7 억제된 MSCs의 효과는 백혈병 세포에서는 관찰되지 않아 (도 10), let7 억제된 MSCs가 선택적으로 정상적인 HPC의 자가-재생을 지원하는 것을 확인하였다. 또한, HUVEC 세포와 공배양한 결과, anti-let7-ASO로 트랜스펙션한 MSCs와 공배양한 경우 대조군 MSC와 공배양한 경우에 비해 HUVEC의 모세관 형성이 현저하게 증가된 것으로 나타났다 (도 9D 및 E).
4-2. 상처 치유 효과 분석
let-7 억제된 MSCs의 상처 치유 효과를 확인하기 위해, 8주령의 C57/BL6 수컷 마우스의 척수 양쪽에 8mm의 상처를 2개 내고, 각 상처에 스프레이 또는 피내 주사를 통해 1 × 106개의 MSCs를 투여하였다. 상처 수축을 방지하기 위해 상처 위에 Tegaderm를 붙이고 0, 3, 5, 7, 9 및 11 일차에 상처를 사진 촬영하였다. 상처 영역을 ImageJ 분석 프로그램으로 측정하고 상처 봉합 비율을 하기 수학식 2로 계산하였다.
그 결과, let-7 억제된 MSCs는 상기 실시예에서의 프로테오믹스 분석과 일치하게 상처 치유가 대조군에 비해 가속화된 것으로 나타났다 (도 11A 및 B).
이를 통해, MSCs에서 let-7의 억제가 HPC의 자가 재생, 내피 세포의 혈관 신생 및 상처 치유 과정에 대한 MSC의 지원 기능을 향상시켜 세포 재생 잠재력을 향상시키는 것을 확인하였다.
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Claims (21)
- let-7 miRNA 억제제를 포함하는, 중간엽기질세포(mesenchymal stromal cells, MSCs)의 기능 강화용 조성물.
- 제 1항에 있어서, let-7 miRNA 억제제는 RNA 억제 분자(inhibitoy RNA molecule), 길항제 microRNA, 효소적 RNA 분자 또는 항-miRNA 항체인, 중간엽기질세포의 기능 강화용 조성물.
- 제 1항에 있어서, let-7 miRNA 억제제는 let-7 miRNA에 특이적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드(antisense oligonucleotides, ASO), 안타고미르(antagomir), 리보자임(ribozyme), 압타머(aptamer), siRNA, miRNA, shRNA(short hairpin RNA), PNA(peptide nucleic acid) 및 LNA(locked nucleic acid)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인, 중간엽기질세포의 기능 강화용 조성물.
- 제 1항에 있어서, let-7 miRNA는 let-7a, let-7b, let-7c, let-7d, let-7e, let-7f, let-7g 또는 let-7i인, 중간엽기질세포의 기능 강화용 조성물.
- 제 1항에 있어서, let-7 miRNA는 let-7a, let-7b, let-7c, let-7d, let-7e, let-7f, let-7g 및 let-7i로 이루어진 군으로부터 선택되는 둘 이상인, 중간엽기질세포의 기능 강화용 조성물.
- 제 1항에 있어서, let-7 miRNA는 let-7a-5p 및 let-7b-5p인, 중간엽기질세포의 기능 강화용 조성물.
- 제 1항에 있어, 중간엽기질세포의 기능 강화는 세포 이동(migration) 촉진, 증식(proliferation) 촉진, 분화(differentiation) 촉진 또는 노화(senescence) 억제인, 중간엽기질세포의 기능 강화용 조성물.
- 제 1항에 있어, 중간엽기질세포는 제대혈 유래(umbilical cord blood-derived), 제대 유래(umbilical cord-derived), 지방 유래(adipose-derived) 또는 골수 유래(bone marrow-derived)인, 중간엽기질세포의 기능 강화용 조성물.
- 제 1항에 있어서, 중간엽기질세포에서 HMGA2, IGF2BP1, IGF2BP2, c-Myc, CDC34, CCND2, GLUT1, IGF1R, INSR 또는 LIN28의 발현을 증가시키는, 중간엽기질세포의 기능 강화용 조성물.
- 제 1항에 있어서, 중간엽기질세포의 측분비 효과를 증가시키는, 중간엽기질세포의 기능 강화용 조성물.
- let-7 miRNA가 억제된 중간엽기질세포.
- 제 11항에 있어서, HMGA2, IGF2BP1, IGF2BP2, c-Myc, CDC34, CCND2, GLUT1, IGF1R, INSR 또는 LIN28의 발현이 증가된, 중간엽기질세포.
- 제 11항에 있어서, 증식, 이동, 골분화능 또는 측분비 효과가 증가된, 중간엽기질세포.
- 제 11항에 있어서, SA(senescence-associated)-β 갈락토시데이즈 활성이 감소된, 중간엽기질세포.
- 제 11항에 있어서, 글루코스의 혐기적 사용이 증가되고, 미토콘드리아성 산화적 인산화가 감소된, 중간엽기질세포.
- 제 11항에 있어서, 상처 치유능이 향상된 중간엽기질세포.
- 제 11항의 중간엽기질세포를 유효성분으로 포함하는, 세포 치료제 조성물.
- 제 17항에 있어서, 골 재생 또는 혈관 재생용인, 세포 치료제 조성물.
- 제 11항의 중간엽기질세포 또는 제 17항의 세포 치료제 조성물을 유효성분으로 포함하는, 혈관 질환 또는 혈관 기능 장애의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제 19항에 있어서, 혈관 질환 또는 혈관 기능 장애가 중증 사지 허혈, 당뇨성 혈관 신생 장애, 혈관성 치매, 당뇨병 수반 장기 손상, 동맥경화증, 협심증, 말초 심혈관 질환, 고혈압, 뇌경색, 뇌손상 후유증, 심부전증, 말초 순환장애, 심근경색증, 동맥패쇄성 질환, 뇌졸중, 척수손상, 척수신경 후유증, 퇴행성 질환, 뇌경색 후유증, 말초신경 장애, 당뇨성 궤양, 노안, 퇴행성 난청, 뇌수술 후유증, 허혈성 발작 또는 지주막하 출혈인, 혈관 질환 또는 혈관 기능 장애의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제 11항의 중간엽기질세포 또는 제 17항의 세포 치료제 조성물을 유효성분으로 포함하는, 상처 치유용 약학적 조성물.
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