KR20240145092A - 입양 세포 요법을 위해 표적화된 공동자극을 제공하는 수용체 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 입양 세포 요법(ACT)에 유용한 키메라 공동자극 항원 수용체(CoStAR), 및 CoStAR을 포함하는 세포에 관한 것이다. CoStAR은 정의된 항원에 대한 반응을 향상시키는 세포 활성의 조절제로서 작용할 수 있다. 본 발명은 또한 CoStAR 단백질, CoStAR을 인코딩하는 핵산 및 이의 치료적 용도를 제공한다.
Description
관련 출원 및 참조에 의한 포함
[0001] 본 출원은 2022년 6월 15일에 출원되고 발명의 명칭이 "RECEPTORS PROVIDING TARGETED COSTIMULATION FOR ADOPTIVE CELL THERAPY"인 미국 출원 제17/807109호의 일부 계속 출원이고, 본 출원 및 미국 출원 제17/807109호 둘 모두는 2022년 1월 20일에 출원되고 발명의 명칭이 "RECEPTORS PROVIDING TARGETED COSTIMULATION FOR ADOPTIVE CELL THERAPY"인 미국 가출원 제63/301340호를 우선권으로 주장하며, 이러한 문헌 각각은 그 전체가 참조로서 포함된다.
[0002] 2021년 6월 16일에 출원된 미국 가특허 출원 제63/211,042호 및 제63/211,046호가 참조된다.
[0003] 2019년 1월 22일에 출원된 GB 특허 출원 일련 번호 1900858.0호, 2019년 12월 20일에 출원된 미국 특허 출원 일련 번호 62/951,770호, 2020년 1월 20일에 출원된 국제 출원 PCT/GB2020/050120호, 및 2020년 7월 17일에 출원된 미국 가특허 출원 63/053,494호 및 63/053,498호가 참조된다.
[0004] 상기 출원, 및 그 안에 또는 이들의 기소 동안 인용된 모든 문헌("출원 인용된 문헌") 및 출원 인용된 문헌에서 인용되거나 언급된 모든 문헌, 및 본원에서 인용되거나 언급된 모든 문헌("본원에서 인용된 문헌"), 및 본원에 인용된 문헌에 인용되거나 언급된 모든 문헌은, 본원에 또는 본원에 참조로 포함된 임의의 문헌에 언급된 임의의 제품에 대한 임의의 제조사 지침, 설명, 제품 사양, 및 제품 시트와 함께, 본원에 참조로 포함되고, 본 발명의 실시에서 사용될 수 있다. 보다 구체적으로, 모든 언급된 문헌은 각각의 개별 문헌이 참조로서 포함되는 것으로 구체적으로 그리고 개별적으로 명시된 것과 동일한 정도로 참조로서 포함된다.
서열 목록에 대한 참조
[0005] 본 출원은 전자 형식의 서열 목록과 함께 출원된다. 서열 목록은 37,111,282 바이트 크기의 2023년 1월 18일에 생성된 INSTB.008WO.xml이라는 명칭의 파일로 제공된다. 서열 목록의 전자 형식의 정보는 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
발명의 분야
[0006] 본 발명은 TRAF 도메인의 변이체에 관한 것이다.
[0007] 암 퇴행을 매개하기 위해 자가 T-세포를 사용하는 입양 세포 요법(ACT)은 초기 임상 시험에서 많은 가능성을 보여주었다. 생체외에서 확장된 자연 발생 종양 반응성 또는 종양 침윤 림프구(TIL)의 사용과 같은 여러 일반적인 접근법이 취해졌다. 또한, T-세포는 정의된 종양 항원을 향해 이들을 재표적화하도록 유전적으로 변형될 수 있다. 이는 펩티드 (p)-주요 조직적합성 복합체(MHC) 특이적 T-세포 수용체(TCR)의 유전자 전달 또는 종양 특이적 단쇄 항체 단편(scFv)과 T-세포 신호전달 도메인(예를 들어, CD3ζ) 사이의 합성 융합을 통해 수행될 수 있으며, 후자는 키메라 항원 수용체(CAR)로 지칭된다.
[0008] TIL 및 TCR 전달은 흑색종을 표적화할 때 특히 우수한 것으로 입증된 반면(Rosenberg et al. 2011; Morgan 2006), CAR 요법은 특정 B-세포 악성종양의 치료에서 많은 가능성을 보여주었다(Grupp et al. 2013).
[0009] 공동자극 신호는 강력한 CAR T 세포 확장, 기능, 지속성 및 항종양 활성을 달성하는데 유용하다. 백혈병에서 CAR 요법의 성공은 부분적으로 공동자극 도메인(예를 들어, CD28 또는 CD137)을 CAR 작제물로의 혼입에 기인하였고, 이로부터 신호는 항-종양 활성을 향상시키기 위해 CD3ζ에 의해 제공되는 신호와 상승작용한다. 이러한 관찰의 기초는 T-세포 활성화의 고전적인 신호 1/신호 2 패러다임과 관련이 있다. 여기서, TCR 복합체에 의해 제공되는 신호 1은 CD28, CD137 또는 CD134와 같은 공동자극 수용체에 의해 제공되는 신호 2와 상승작용하여 세포가 신호 1 단독과 관련된 활성화 유도된 세포 사멸(AICD) 없이 클론 확장, IL2 생산 및 장기 생존을 겪을 수 있게 한다. 또한, 신호 2의 관여는 신호 1을 통해 생성된 신호를 향상시켜 세포가 항종양 반응 동안 직면하는 것과 같은 낮은 결합력 상호작용에 더 잘 반응하도록 한다.
[0010] 표적화된 공동자극은 비-CAR-기반 T-세포 요법에 대해 유익한 효과를 가질 것이다. 예를 들어, 공동자극 도메인을 키메라 TCR에 혼입시키는 것은 pMHC에 대한 T-세포의 반응을 향상시키는 것으로 나타났다(Govers 2014). 또한, 강장성 신호전달의 기회를 감소시킬 수 있는 신호 1 생성 CD3ζ(또는 다른) 모이어티로부터 신호 2 생성 공동자극 도메인을 별도의 수용체 상으로 분리하는 키메라 공동자극 수용체를 생성하려는 움직임이 있었다(Fisher et al 2019).
[0011] 종양 침윤 림프구(TIL)는 이들의 내인성 TCR을 이용하여 종양 인식을 매개하지만, 내인성 TCR을 조작하는 것은 가능하지 않았다. 따라서, 종양 세포가 매우 적은 공동자극 리간드를 발현하기 때문에 TIL은 실질적인 제한을 받는다. TIL, 또는 실제로 임의의 다른 입양 T-세포 요법 제품의 표적화된 공동자극을 유도하는 능력은 유리할 것이다.
[0012] 본 출원에서 임의의 문서의 인용 또는 확인은 그러한 문서가 본 발명에 대한 종래 기술로서 이용 가능하다는 것을 인정하는 것은 아니다.
[0013] 본 발명은 암종배아 항원(CEA)에 결합하는 신규한 키메라 공동자극 항원 수용체(CoStAR) 및 CAR 및 비-CAR 기반 T-세포 요법 모두에 유익한 CoStAR을 포함하거나 발현하는 세포를 제공한다. 본 발명은 신규한 키메라 공동자극 수용체를 발현하는 세포를 사용하여 정의된 질환-관련, 예를 들어, 종양-관련 항원과 결합시 T-세포에 공동자극 신호를 제공한다.
[0014] 스플릿 신호 1 및 신호 2가 조작된 T-세포에서 항원 특이적 반응을 유도하기 위해 사용되었다는 여러 보고가 있었다(Alvarez-Vallina & Hawkins 1996). 그러나, 어느 것도 전장 CD28 분자를 이용하지 않았다. 말단절단된 형태와 대조적으로 CD28과 같은 전장 수용체를 사용하는 것에 대한 특정 이점이 있다. 전장 수용체는 이량체화될 수 있어, 수용체가 이의 천연 형태로 기능할 수 있게 하며, 실제로 키메라 항원 수용체는 단량체로서 발현될 때 최적으로 기능하지 못한다(Bridgeman et al. 2010).
[0015] 일부 구현예에서, 본 발명의 CoStAR은 정의된 항원, 예컨대, 질병 관련 항원 또는 종양 관련 항원과의 결합시 신호 2를 유도한다. 전장 CD28 분자는 수용체의 B7 패밀리의 결합 구성원에서 이의 천연 기능에 중요한 모티프를 함유하지만; 이는 나란히 CD28 및 CD3ζ 수용체를 운반하는 CAR의 관점에서 잠재적으로 위험하며, 여기서, B7에 의한 CAR의 라이게이션은 T-세포 활성화를 촉발할 수 있으며, 신호 2 수용체만을 보유하는 수용체에 대한 유리한 특성이 있다. 일 양태에서, 본 발명은 막횡단 도메인에 작동적으로 연결된 세포외 결합 도메인, 제1 신호전달 도메인, 및 CD40 신호전달 도메인 또는 이의 신호전달 단편을 포함하는 표적화된 키메라 공동자극 수용체(CoStAR)를 제공한다. 본 발명자들은 CD40 신호전달 도메인을 포함하는 공동자극 수용체가 신규하고 개선된 활성 프로파일을 나타낸다는 것을 발견하였다. 본 발명자들은 CD40 내의 TRAF2, TRAF2/3, 및 TRAF6 결합 도메인의 변이체가 신호전달을 조절한다는 것을 추가로 발견하였다.
[0016] 본 발명의 특정 구현예에서, CD40 신호전달 도메인은 SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, 또는 SEQ ID NO:34를 포함한다. 일부 구현예에서, CD40 신호전달 단편은 SH3 모티프(KPTNKAPH, SEQ ID NO:35), TRAF2 모티프(PKQE, SEQ ID NO:36, PVQE, SEQ ID NO:37, SVQE, SEQ ID NO:38), TRAF6 모티프(QEPQEINFP, SEQ ID NO:39), PKA 모티프(KKPTNKA, SEQ ID NO:40, SRISVQE, SEQ ID NO:41), 또는 이들의 조합을 포함하거나, 전장 CD40 세포내 도메인이다. 일부 구현예에서, CD40 신호전달 도메인의 SH3, TRAF2, TRAF6, 또는 PKA 모티프 중 하나 이상이 돌연변이된다.
[0017] 일부 구현예에서, CoStAR의 제1 신호전달 도메인은, 예를 들어, CD2, CD9, CD26, CD27, CD28, CD29, CD38, CD40, CD43, CD46, CD49d, CD55, CD73, CD81, CD82, CD99, CD100, CD134(OX40), CD137(41BB), CD150(SLAM), CD270(HVEM), CD278(ICOS), DAP10, NTKR, CD357(GITR), 또는 EphB6을 포함하지만 이로 제한되지 않는 종양 괴사 인자 수용체 슈퍼패밀리(TNFRSF) 수용체와 같은 수용체의 신호전달 도메인 또는 신호전달 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, CoStAR은 CD2, CD9, CD26, CD27, CD28, CD29, CD38, CD40, CD43, CD46, CD49d, CD55, CD73, CD81, CD82, CD99, CD100, CD134(OX40), CD137(41BB), CD150(SLAM), CD270(HVEM), CD278(ICOS), DAP10, NTKR, CD357(GITR), 또는 EphB6을 포함한다. 구현예에서, 제1 신호전달 도메인은 CD40 신호전달 도메인을 포함하고, CoStAR은 2개의 CD40 신호전달 도메인의 요소를 포함한다.
[0018] 일부 구현예에서, CoStAR은 CD2, CD9, CD26, CD27, CD28, CD29, CD38, CD40, CD43, CD46, CD49d, CD55, CD73, CD81, CD82, CD99, CD100, CD134(OX40), CD137(41BB), CD150(SLAM), CD270(HVEM), CD278(ICOS), CD357(GITR), 또는 EphB6을 포함하지만 이로 제한되지 않는 예를 들어, 종양 괴사 인자 수용체 슈퍼패밀리(TNFRSF) 수용체와 같은 수용체의 제2 신호전달 도메인 또는 신호전달 단편을 포함한다. 제1 신호전달 도메인 또는 신호전달 단편, CD40 신호전달 도메인 또는 신호전달 단편, 및 제2 신호전달 도메인 또는 신호전달 단편은 임의의 순서일 수 있다. 예시적인 구현예는 CD28, CD137, 및 CD40 신호전달 도메인, CD28, CD134, 및 CD40 신호전달 도메인, CD28, CD2, 및 CD40 신호전달 도메인, CD28, GITR, 및 CD40 신호전달 도메인, 및 CD28, CD29, 및 CD40 신호전달 도메인, 또는 CD28, CD150, 및 CD40 신호전달 도메인을 포함하는 CoStAR을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
[0019] 일부 구현예에서, 본 발명의 CoStAR의 세포외 항원-결합 도메인(예를 들어, 비제한적으로 CEA-결합 도메인, MSLN-결합 도메인 없음)은 링커 및/또는 스페이서에 의해 막횡단 도메인에 작동적으로 연결된다. 일부 구현예에서, 링커는 약 5 내지 약 20개의 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 AAAGSGGSG(SEQ ID NO:18)를 포함한다.
[0020] 일부 구현예에서, 본 발명의 CoStAR은 세포외 결합 도메인을 막횡단 도메인에 작동적으로 연결하고 약 10 내지 약 250개의 아미노산을 포함하는 스페이서를 포함한다. 일부 구현예에서, 스페이서는 CD8 또는 CD28의 세포외 서열 또는 이의 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, CoStAR은 제2 세포외 결합 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 결합 도메인은 CD8 또는 CD28로부터의 세포외 리간드 결합 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 스페이서는 하나 이상의 면역글로불린 도메인 또는 면역글로불린 불변 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 스페이서는 하나 이상의 면역글로불린 도메인 또는 면역글로불린 불변 영역, 예컨대, 비제한적으로 SEQ ID NO:24를 포함한다.
[0021] 일부 구현예에서, 본 발명의 CoStAR의 막횡단 도메인은 TNFRSF 단백질의 막횡단 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 CoStAR의 막횡단 도메인은 CD28 또는 CD8의 막횡단 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 CoStAR의 막횡단 도메인은 CD28 또는 CD8의 막횡단 서열을 포함한다.
[0022] 본 발명의 CoStAR은 종양 관련 항원(TAA), 예를 들어, 비제한적으로, 암종배아 항원(CEA), 메조텔린(MSLN), 또는 다른 것을 발현하는 선택된 표적에 대한 면역 반응을 자극하는데 유용하다. 일부 구현예에서, CoStAR은 SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, 또는 SEQ ID NO:14, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 모두 6개의 상보적 결정 영역(CDR)을 포함하는 단편의 scFv의 항원 결합 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, CoStAR은 SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, 또는 SEQ ID NO:14의 scFv를 포함한다. 일부 구현예에서, CoStAR은 SEQ ID NO:186, SEQ ID NO:187, SEQ ID NO:188, SEQ ID NO:189, SEQ ID NO:190, 또는 SEQ ID NO: 1191, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개 모두의 CDR 모두를 포함하는 단편의 scFv의 항원 결합 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, CoStAR은 SEQ ID NO:186, SEQ ID NO:187, SEQ ID NO:188, SEQ ID NO:189, SEQ ID NO:190, 또는 SEQ ID NO:191의 scFv를 포함한다.
[0023] 본 발명에 따르면, 세포외 결합 도메인은 scFv, 펩티드, 항체의 항원 결합 부분, 항체 중쇄 가변 도메인, 항체 경쇄 가변 도메인, 단일 도메인 항체, CEA 리간드, 또는 MSLN 리간드를 포함할 수 있지만, 이로 제한되지 않는다.
[0024] 일부 구현예에서, 본 발명의 CoStAR은, 예를 들어, C-말단에 위치한 CD3ζ 신호전달 도메인을 포함한다.
[0025] 일부 구현예에서, 본 발명의 CoStAR은 N-말단 신호 펩티드를 포함한다. N-말단 신호 펩티드의 비제한적인 예는 온코스타틴 M(OSM), CD8α, CD2, 인터루킨-2(IL-2), 과립구-대식세포 집락 자극 인자(GM-CSF), 및 인간 IgGκ의 신호 펩티드이다.
[0026] 본 발명의 양태에서, 본 발명의 CoStAR을 인코딩하는 핵산이 제공된다. 핵산은 최적화될 수 있고, 예를 들어, 숙주 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화될 수 있다. 비제한적인 구현예에서, 핵산은 인간 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화된다.
[0027] 일부 구현예에서, 본 개시의 임의의 구현예의 CoStAR을 인코딩하고 발현할 수 있는 벡터가 제공된다.
[0028] 일부 구현예에서, 본 개시의 임의의 구현예의 CoStAR을 발현하는 세포가 제공된다. 일부 구현예에서, 세포는 2개 이상의 CoStAR을 발현하고, 예를 들어, 세포는 CEA 또는 MSLN에 결합하는 CoStAR 및 FOLR1에 결합하는 CoStAR 또는 CA125, 예컨대 비제한적으로 항-CEA.CD28.CD40 및 항-CA125.41BB.CD40 또는 항-MSLN.CD28.CD40 및 항-CA125.41BB.CD40에 결합하는 CoStAR을 발현한다. 일부 구현예에서, 세포는 CEA에 결합하는 CoStAR 및 PDL1, 예컨대, 비제한적으로 항-CEA.CD28.CD40 및 PD1.CD28.CD40에 결합하는 CoStAr을 발현하거나, MSLN에 결합하는 CoStAR 및 PDL1, 예컨대, 비제한적으로 항-MSLN.CD28.CD40 및 PD1.CD28.CD40에 결합하는 CoStAR을 발현한다.
[0029] 일부 구현예에서, 본 개시의 임의의 구현예의 CoStAR을 발현하도록 조작된 세포는 알파-베타 T 세포, 감마-델타 T 세포, T 조절 세포, TIL, NKT 세포 또는 NK 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 개시의 임의의 구현예의 CoStAR을 발현하도록 조작된 세포는 키메라 항원 수용체(CAR) 또는 T 세포 수용체(TCR)를 공동발현한다.
[0030] 일부 구현예는 본 개시의 임의의 구현예의 CoStAR을 인코딩하고 발현할 수 있는 벡터로 세포를 형질도입 또는 형질감염시키는 것을 포함하는 CoStAR을 발현하는 세포를 제조하는 방법을 제공한다.
[0031] 일부 구현예는 세포를 형질도입 또는 형질감염시키고, CoStAR의 발현을 검출하고, CoStAR을 발현하는 세포를 농축, 확장, 및/또는 선택함으로써 본 개시의 임의의 구현예의 CoStAR을 발현하는 세포의 집단을 제조하기 위한 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 도 28, 67, 77a 내지 77c, 83 내지 89d, 및 92의 것들(도 78 및 79의 것들을 제외함)을 포함하고, 표 2, 4 내지 5, 및 7 내지 14의 것들을 포함하고, SEQ ID NO: 42, 475 내지 479, 494 내지 498, 505, 510 내지 519, 및 840 내지 40839, 및 컨센서스 서열 A 내지 C를 포함하는, 본원에 제공된 임의의 CD40, TRAF2, TRAF2/3, 또는 TRAF6 변이체(도 78 및 79의 것들을 제외함)가 본 방법 및/또는 작제물 및/또는 단백질에서 사용될 수 있다.
[0032] 일부 구현예는 본 개시의 임의의 구현예의 CoStAR을 발현하는 세포의 집단을 투여함으로써 대상체에서 질병을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 단백질은 본원에 개시된 바와 같은 변이체 CD40 및/또는 TRAF2, 2/3, 6 도메인을 포함할 것이다. 일부 구현예에서, 도 28, 67, 77a 내지 77c, 83 내지 89d, 및 92의 것들을 포함하고 표 2, 4 내지 5, 및 7 내지 14의 것들을 포함하고(도 78 및 79의 것들을 제외함), SEQ ID NO: 42, 475 내지 479, 494 내지 498, 505, 510 내지 519, 및 840 내지 40839의 것들, 및 컨센서스 서열 A 내지 C를 포함하는 본원에 제공된 임의의 CD40, TRAF2, TRAF2/3, 또는 TRAF6 변이체가 본 방법 및/또는 작제물 및/또는 단백질에 사용될 수 있다.
[0033] 일부 구현예에서, 컨센서스 A, 또는 X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11의 서열을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 단백질이 제공되고, 여기서, X1은 임의의 아미노산이고, X2는 임의의 아미노산이고, X3은 P이고, X4는 임의의 아미노산이고, X5는 Q이고, X6은 X는 C, E, 또는 A이고, X7은 임의의 아미노산이고, X8은 임의의 아미노산이고, X9는 임의의 아미노산이고, X10은 임의의 아미노산이고, X11은 임의의 아미노산이다. 일부 구현예에서, 단백질은 TRAF 도메인의 일부이다. 일부 구현예에서, 단백질은 TRAF2 도메인의 일부이다. 일부 구현예에서, 단백질은 TRAF2/3 도메인의 일부이다. 일부 구현예에서, 서열은 X1이 S 또는 P이고, X2가 V, H, 또는 Y이고, X4가 I, Q, V이고, X7이 T 또는 S이고, X8이 D이고, X9가 K, D, 또는 G이고, X10은 T, S, G, 또는 A이고, X11은 D, S, N, 또는 D이고; 또는 서열이 a)와 적어도 60% 동일하다. 일부 구현예에서, 단백질은 서열 GSNTX1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11, SEQ ID NO: 42299의 것이다. 일부 구현예에서, 단백질은 서열 X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11QPVT, SEQ ID NO: 42377의 것이다. 일부 구현예에서, 단백질은 서열 GSNTX1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11QPVT, SEQ ID NO: 42378의 것이다.
[0034] 일부 구현예에서, 컨센서스 B, 또는 X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11의 서열을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 단백질이 제공되고, 여기서, X1은 임의의 아미노산이고, X2는 임의의 아미노산이고, X3은 P, S, A, 또는 T이고, X4는 임의의 아미노이다. X5는 Q 또는 E이고, X6은 E이고, X7은 임의의 아미노산이고, X8은 임의의 아미노산이고, X9는 임의의 아미노산이고, X10은 임의의 아미노산이고, X11은 임의의 아미노산이다. 일부 구현예에서, 단백질은 TRAF 도메인의 일부이다. 일부 구현예에서, 단백질은 TRAF2 도메인의 일부이다. 일부 구현예에서, 단백질은 TRAF2/3 도메인의 일부이다. 일부 구현예에서, 서열은 다음을 포함한다: X1은 P, A, M, T, S, R, V, H이고, X2는 F, A, L, I, T, V, G, C, A, F, P이고, X4는 K, V, I, H, A, Q, T, E, S이고, X7은 C, T, E, D, S, A이고, X8은 A, L, G, Y, I, Q, D, E이고, X9는 F, H, K, R, P, A, G, Y, E, N이고, X10은 R, G, E, K, A, S, D, C, C, P, V이고, X11이 S, C, D, P, W, T, A, G, E이고; 또는 서열이 a)와 적어도 60% 동일하다. 일부 구현예에서, 서열은 TRAF2/3 서열의 일부이다. 일부 구현예에서, 단백질은 서열 GSNTX1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11, SEQ ID NO: 42300의 것이다. 일부 구현예에서, 단백질은 서열 X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11QPVT, SEQ ID NO: 42379의 것이다. 일부 구현예에서, 단백질은 서열 GSNTX1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11QPVT, SEQ ID NO: 42380의 것이다.
[0035] 일부 구현예에서, 컨센서스 C, 또는 X1X2X3X4X5X6의 서열을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 단백질이 제공되고, 여기서, X1은 P이고, X2는 임의의 아미노산이고, X3은 E이고, X4는 임의의 아미노산이고, X5는 임의의 아미노산이고, X6은 Ac/Ar이다. 일부 구현예에서, 단백질은 TRAF 도메인의 일부이다. 일부 구현예에서, 단백질은 TRAF6 도메인의 일부이다. 일부 구현예에서, 서열은 다음을 포함하고: X2는 Q, P, E, V, T, 또는 S이고, X4는 I, L, M, N, S, T, N, D이고, X5는 N, D, R, S, G, 또는 Y이고; 또는 서열이 a)와 적어도 60% 동일하다. 일부 구현예에서, 단백질은 서열 PKQEX1X2X3X4X5X6, SEQ ID NO: 42301의 것이다. 일부 구현예에서, 단백질은 서열 X1X2X3X4X5X6PDDL, SEQ ID NO: 42381의 것이다. 일부 구현예에서, 단백질은 서열 PKQEX1X2X3X4X5X6PDDL, SEQ ID NO: 42382의 것이다.
[0036] 일부 구현예에서, (a) SEQ ID NO: 475, 476, 477, 478, 479, 494, 495, 496, 498, 505, 510, 511, 512, 513, 514, 515, 516, 517, 518, 또는 519; (b) a)의 서열과 적어도 70% 동일한 서열; 또는 (c) a)와 적어도 80% 유사한 서열 중 하나 이상을 포함하는 아미노산 서열이다.
[0037] 일부 구현예에서, CD40 단백질 내의 TRAF 도메인이 있고, 여기서, TRAF 도메인은 (a) SEQ ID NO: 475, 476, 477, 478, 479, 494, 495, 496, 498, 505, 510, 511, 512, 513, 514, 515, 516, 517, 518, 또는 519; (b) a)의 서열과 적어도 70% 동일한 서열; 또는 (c) a)와 적어도 80% 유사한 서열 중 하나 이상을 포함한다.
[0038] 일부 구현예에서, PQEINF, PEEMSW, PPENYE, 또는 PQENSY를 포함하는 TRAF6 도메인 서열이 있다.
[0039] 일부 구현예에서, PVQET, TQEET, SKEET, AVEET, 또는 PVQET를 포함하는 TRAF2/3 도메인 서열이 있다.
[0040] 일부 구현예에서, SVQE, AVEE 또는 PEEE를 포함하는 TRAF2 도메인 서열이 있다.
[0041] 일부 구현예에서, (a) SEQ ID NO: 475, 476, 477, 478, 479, 494, 495, 496, 498, 505, 510, 511, 512, 513, 514, 515, 516, 517, 518, 또는 519; (b) a)와 적어도 70% 동일한 아미노산 서열 또는 (c) a)와 적어도 80% 유사한 아미노산 서열 중 하나의 아미노산 서열을 포함하는, TRAF6 또는 TRAF2/3 도메인이 있다.
[0042] 일부 구현예에서, 서열은 본 개시의 구현예 중 어느 하나의 단백질, 아미노산 서열, 또는 TRAF 도메인에 대한 CD40 단백질 서열 내에 있다. 일부 구현예에서, 서열은 CD40 단백질 내에 있고, CD40 단백질 내의 상응하는 TRAF2, TRAF2/3, 및/또는 TRAF6 도메인에 위치한다.
[0043] 일부 구현예에서, 컨센서스 A, 또는 X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11의 아미노산 서열을 포함하는 TRAF2/TRAF3 도메인이고, 여기서, X1은 임의의 아미노산이고, X2는 임의의 아미노산이고, X3은 임의의 아미노산이고, X4는 임의의 아미노산이고, X5는 Q이고, X6은 C, E, 또는 A이고, X7은 임의의 아미노산이고, X8은 임의의 아미노산이고, X9는 임의의 아미노산이고, X10은 임의의 아미노산이고, X11은 임의의 아미노산이다. 일부 구현예에서, 단백질은 서열 GSNTX1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11, SEQ ID NO: 42299의 것이다. 일부 구현예에서, 단백질은 서열 X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11QPVT, SEQ ID NO: 42377의 것이다. 일부 구현예에서, 단백질은 서열 GSNTX1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11QPVT, SEQ ID NO: 42378의 것이다.
[0044] 일부 구현예에서, 컨센서스 B, 또는 X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11의 아미노산 서열을 포함하는 TRAF2/TRAF3 도메인이며, 여기서, X1은 임의의 아미노산이고, X2는 임의의 아미노산이고, X3은 P, S, A, 또는 T이고, X4는 임의의 아미노이다. X5는 Q 또는 E이고, X6은 E이고, X7은 임의의 아미노산이고, X8은 임의의 아미노산이고, X9는 임의의 아미노산이고, X10은 임의의 아미노산이고, X11은 임의의 아미노산이다. 일부 구현예에서, 단백질은 서열 GSNTX1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11, SEQ ID NO: 42300의 것이다. 일부 구현예에서, 단백질은 서열 X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11QPVT, SEQ ID NO: 42379의 것이다. 일부 구현예에서, 단백질은 서열 GSNTX1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11QPVT, SEQ ID NO: 42380의 것이다.
[0045] 일부 구현예에서, 컨센서스 C, 또는 X1X2X3X4X5X6의 아미노산 서열을 포함하는 TRAF6 도메인이며, 여기서, X1은 P이고, X2는 임의의 아미노산이고, X3은 E이고, X4는 임의의 아미노산이고, X5는 임의의 아미노산이고, X6은 Ac/Ar이다. 일부 구현예에서, 단백질은 서열 PKQEX1X2X3X4X5X6, SEQ ID NO: 42301의 것이다. 일부 구현예에서, 단백질은 서열 X1X2X3X4X5X6PDDL, SEQ ID NO: 42381의 것이다. 일부 구현예에서, 단백질은 서열 PKQEX1X2X3X4X5X6PDDL, SEQ ID NO: 42382의 것이다.
[0046] 일부 구현예에서, (a) 컨센서스 A, 또는 X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11의 아미노산 서열을 포함하는 TRAF2/TRAF3 도메인(여기서, X1은 임의의 아미노산이고, X2는 임의의 아미노산이고, X3은 P이고, X4는 임의의 아미노산이고, X5는 Q이고, X6은 C, E, 또는 A이고, X7은 임의의 아미노산이고, X8은 임의의 아미노산이고, X9는 임의의 아미노산이고, X10은 임의의 아미노산이고, X11은 임의의 아미노산임); (b) 컨센서스 B, 또는 X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11의 아미노산 서열을 포함하는 TRAF2/TRAF3 도메인(여기서, X1은 임의의 아미노산이고, X2는 임의의 아미노산이고, X3은 P, S, A, 또는 T이고, X4는 임의의 아미노산이고, X5는 Q 또는 E이고, X6은 E이고, X7은 임의의 아미노산이고, X8은 임의의 아미노산이고, X9는 임의의 아미노산이고, X10은 임의의 아미노산이고, X11은 임의의 아미노산임); (c) 컨센서스 C, 또는 X1X2X3X4X5X6의 아미노산 서열을 포함하는 TRAF6 도메인(여기서, X1은 P이고, X2는 임의의 아미노산이고, X3은 E이고, X4는 임의의 아미노산이고, X5는 임의의 아미노산이고, X6은 Ac/Ar임) 중 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 CD40 도메인이 있다.
[0047] 일부 구현예에서, 암종배아 항원(CEA)에 결합하는 세포외 결합 도메인, 또는 메조텔린(MSLN)에 결합하는 세포외 결합 도메인; 세포외 결합 도메인, 제1 신호전달 도메인에 연결된 막횡단 도메인; 및 제2 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 공동자극 항원 수용체(CoStAR)이며, 여기서, 제2 신호전달 도메인은 변이체 CD40 신호전달 도메인 또는 이의 신호전달 단편을 포함하고, 변이체 CD40은 변이체 TRAF2/TRAF3 서열, 또는 변이체 TRAF6 서열, 또는 변이체 TRAF2 서열의 서열을 포함하고, 변이체 CD40은 SEQ ID NO: 42를 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 제1 신호전달 도메인은 CD28 또는 CD278(ICOS)의 신호전달 도메인 또는 신호전달 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 작제물은 도 88a에 도시된 바와 같다. 일부 구현예에서, 작제물은 도 88b에 도시된 바와 같다. 일부 구현예에서, 작제물은 도 88c에 도시된 바와 같다. 일부 구현예에서, 제1 신호전달 도메인은 전장 공동자극 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포외 결합 도메인은 링커 및/또는 스페이서에 의해 막횡단 도메인에 작동적으로 연결된다. 일부 구현예에서, 링커는 약 5 내지 약 20개의 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 약 10 내지 약 250개의 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, 막횡단 도메인은 CD28, CD8, ICOS, DAP10, 또는 NTRK로부터의 막횡단 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 막횡단 도메인은 SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, 또는 SEQ ID NO:22의 막횡단 도메인 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포외 결합 도메인은 scFv, 펩티드, 항체 중쇄 가변 도메인, 항체 경쇄 가변 도메인, 또는 CEA 리간드를 포함한다.
[0048] 일부 구현예에서, 본 개시의 구현예 중 어느 하나의 CoStAR을 인코딩하는 핵산이 있다.
[0049] 일부 구현예에서, 본 개시의 구현예 중 어느 하나의 핵산을 포함하는 벡터가 제공된다.
[0050] 일부 구현예에서, 본 개시의 구현예 중 어느 하나의 CoStAR을 발현하는 세포가 있다. 일부 구현예에서, 세포는 알파-베타 T 세포, 감마-델타 T 세포, T 조절 세포, TIL, NKT 세포 또는 NK 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포는 CAR 또는 TCR을 공동발현한다.
[0051] 일부 구현예에서, 본 개시의 구현예 중 어느 하나의 벡터로 세포를 형질도입 또는 형질감염시키는 단계를 포함하는, 본 개시의 구현예 중 어느 하나의 세포를 제조하는 방법이 제공된다
[0052] 일부 구현예에서, 본 개시의 구현예 중 어느 하나의 CoStAR을 발현하는 세포의 집단을 제조하기 위한 방법으로서, 대안(alternative) 62의 벡터로 형질감염되거나 형질도입된 세포의 표면에서 CoStAR의 발현을 검출하는 단계; 및 CoStAR을 발현하는 것으로 확인된 세포를 선택하는 단계를 포함하는, 방법이다.
[0053] 일부 구현예에서, 본 개시의 구현예 중 어느 하나의 CoStAR이 세포 발현에 대해 농축된 세포 집단이 있다.
[0054] 일부 구현예에서, 대상체에게 본 개시의 구현예 중 어느 하나에 따른 세포, 또는 본 개시의 구현예 중 어느 하나에 따른 세포 집단을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 질환을 치료하는 방법이 제공된다.
[0055] 일부 구현예에서, SEQ ID NO: 510 내지 519 중 하나의 아미노산 서열을 포함하는 단백질이다. 일부 구현예에서, 단백질은 SEQ ID NO: 510의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 단백질은 SEQ ID NO: 511의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 단백질은 SEQ ID NO: 512의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 단백질은 SEQ ID NO: 513의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 단백질은 SEQ ID NO: 514의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 단백질은 SEQ ID NO: 515의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 단백질은 SEQ ID NO: 516의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 단백질은 SEQ ID NO: 517의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 단백질은 SEQ ID NO: 518의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 단백질은 SEQ ID NO: 519의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 단백질은 도 92에 도시된 바와 같은 임의의 작제물(CTP188 내지 CTP202)을 포함한다.
[0056] 따라서, 본 개시의 목적은 출원인이 권리를 보유하고 이로써 임의의 이전에 공지된 제품, 공정, 또는 방법의 면책 조항(disclaimer)을 공개하도록 하는 임의의 이전에 공지된 제품, 제품을 제조하는 공정, 또는 제품을 사용하는 방법을 본 개시 내에 포함하지 않는 것이다. 본 개시는 USPTO(35 USC §112, 첫 번째 단락) 또는 EPO(EPC의 83조)의 기록된 설명 및 실시가능성 요건을 충족하지 않는, 임의의 제품, 공정, 제품을 제조하거나 제품을 사용하는 방법을 본 개시의 범위 내에 포함되는 것으로 의도되지 않으며, 이에 따라, 출원인은 권리를 보유하고 이에 의해 임의의 이전에 기재된 제품, 제품을 제조하는 공정, 또는 제품을 사용하는 방법의 면책 조항을 공개할 수 있다. 이는 본 개시의 실시에서 Art. 53(c) EPC 및 규칙 28(b) 및 (c) EPC에 따르는 것이 유리할 수 있다. 본 출원의 계보 또는 임의의 다른 계보 또는 임의의 제3자의 임의의 이전에 출원된 출원에서 출원인의 임의의 부여된 특허(들)의 대상인 임의의 구현예를 명시적으로 부인하는 모든 권리는 명시적으로 갖는다. 본원의 어떠한 내용도 가능성(promise)으로 해석되어서는 안된다.
[0057] 본 개시 및 특히 청구범위 및/또는 단락에서, "포함하다", "포함하였다", "포함하는" 등과 같은 용어는 미국 특허법에서 이에 부여된 의미를 가질 수 있고; 예를 들어, 이들은 "포함하다", "포함하였다", "포함하는" 등을 의미할 수 있고; "...를 필수적 요소로 하여 구성되는(consisting essentially of)" 및 "...를 필수적 요소로 하여 구성된다(consists essentially of)"와 같은 용어는 미국 특허법에서 그들에게 부여된 의미를 가지며, 예를 들어, 이들은 명시적으로 언급되지 않은 요소를 허용하지만, 선행 기술에서 발견되거나 본 개시의 임의의 구현예의 기본적 또는 신규한 특성에 영향을 미치는 요소를 배제한다.
[0058] 이들 및 다른 구현예는 하기 상세한 설명으로부터 개시되거나 자명하고 이에 포함된다.
[0059] 예로서 주어지지만, 본 발명의 임의의 구현예를 설명된 특정 구현예로만 제한하려는 것은 아닌 하기 상세한 설명은 첨부된 도면과 함께 가장 잘 이해될 수 있다.
[0060] 도 1 - 단일 공동자극 및 융합 공동자극 도메인 수용체의 구조적 구성. 청구범위에 기재된 CoStAR 수용체의 개략도가 도시되어 있다. 첫째로 단일 공동자극 수용체에 기반한 CoStAR, 및 둘째로 제2 공동자극 도메인에 융합된 전장 공동자극 수용체 신호전달 도메인으로 구성된 융합 CoStAR.
[0061] 도 2ai 내지 도 2e - 잠재적인 CoStAR 구성의 게놈 구성 - CoStAR은 도면에 도시되고 청구범위에 기재된 바와 같은 항원 결합 도메인, 선택적 스페이서 도메인 및 공동자극 도메인으로 구성된다. CoStAR은 (도 2ai 내지 도 2aii) 프로모터 단독으로부터 발현될 수 있고, CoStAR은 단일(도 2ai) 또는 융합(도 2aii) 공동자극 수용체로 구성되고; (도 2b) CoStAR의 직접 염색을 가능하게 하기 위해 N 또는 C-말단에서 에피토프 태그(예를 들어, His 태그, DYKDDDDK(SEQ ID NO:499) 등)로 발현될 수 있고; (도 2c) 2A 절단 서열 또는 내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 이용하여 분리된 마커 유전자와 함께; (도 2d) 제2 프로모터로부터 발현된 마커 유전자와 함께; (도 2e) 2A 절단 서열 또는 내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 이용하여 분리된 키메라 항원 수용체 또는 T-세포 수용체와 같은 고려되는 단백질과 함께; (도 2f) 제2 프로모터로부터 발현된 키메라 항원 수용체 또는 T-세포 수용체와 같은 관심 단백질과 함께 발현될 수 있다. CoStAR 및 마커 유전자/키메라 항원 수용체/T-세포 수용체/다른 관심 단백질이 배향 또는 3'(3-프라임) 또는 5'(5- 프라임)에서 서로 발현될 수 있다는 것이 충분한 지식을 갖는 개인에게 명백할 것이다.
[0062] 도 3a 내지 도 3e - LS174T 및 LoVo 종양 제시 항원에 반응한 T-세포에서 CoStAR의 기능적 활성. 공여자 1(도 3a 및 3d), 공여자 2(도 3b) 및 공여자 3(도 3c 및 3e)으로부터의 정상 공여자 T-세포 집단을 암종배야 항원을 표적화하는 CoStAR을 발현하도록 렌티바이러스 조작하고, CD34 자기 선택을 사용하여 이식 유전자가 풍부하도록 자기적으로 분류하였다. T-세포를 야생형 조작되지 않은 CEA+ 종양 세포(비-활성화 종양) 또는 세포 표면 고정된 항-CD3 단쇄 항체 단편(활성화 종양)을 발현하도록 조작된 CEA+ 종양 세포와 명시된 이펙터 대 표적비로 혼합하였고, IL-2를 ELISA에 의해 상청액에서 측정하였다. 데이터를 LS174T 세포(도 3a, 3b 및 3c) 및 LoVo(3d 및 3e)를 사용하여 획득하였다.
[0063] 도 4a 내지 도 4d - T-세포 증식에 대한 CoStAR의 효과. 5 × 105개의 형질도입된 T-세포 및 비-형질도입된 T-세포를 IL-2의 존재(도 4a) 및 부재(도 4b) 하에서 6.25 × 104개의 야생형 LoVo 또는 LoVo-OKT3 세포와 혼합하고, 3일 후에 세포 수를 계수하였다. 동일한 세포 비율 하에서의 또 다른 검정에서, 2명의 공여자로부터의 T-세포(도 4c 및 4d)에 증식 염료를 로딩하고, 세포가 겪은 증식 사이클의 수를 유세포 분석을 사용하여 6일 후에 염료 희석에 의해 결정하였다.
[0064] 도 5 - 일차 인간 T-세포에서 CoStAR 융합 수용체의 IL-2 활성. 7명의 공여자로부터의 정상 공여자 CD8+ T-세포(대조군 CoStAR는 3명의 공여자인 경우 제외)를 명시된 CEA-표적화 CoStAR로 렌티바이러스 형질도입하고, LoVo-OKT3 세포의 존재 하에 밤새 자극한 후 IL-2 생산을 평가하였다. IL-2 양성 세포의 비율을 CD34 음성(CoStAR 비-형질도입) 및 CD34+(CoStAR 형질도입) 집단 둘 모두에서 세포내 유동 염색을 사용하여 결정하였다. 별표는 * p<0.05로 페어드 Wilcoxon 부호 있는 순위 검정을 사용하여 형질도입된 집단과 비-형질도입된 집단 사이에 유의한 차이를 나타낸다.
[0065] 도 6a 내지 도 6d - 일차 인간 T-세포에서 CoStAR 활성의 다중 파라미터 분석. 정상 공여자 CD8+ T-세포를 명시된 CEA-표적화 CoStAR로 렌티바이러스로 형질도입시키고, LoVo-OKT3 세포의 존재 하에 밤새 자극 후 IL-2 생산을 평가하였다. IL-2(7명의 공여자)(도 6a), IFNγ(7명의 공여자)(도 6b), BCL-xL(5명의 공여자)(도 6c) 및 CD107a(6명의 공여자)(도 6d) 양성 세포의 비율을 CD34 음성(CoStAR 비-형질도입) 및 CD34+(CoStAR 형질도입) 집단 둘 모두에서 세포내 유동 염색을 사용하여 결정하였다. 대조군은 CoStAR을 표적화하는 비특이적 CA125이며 모든 경우에 3명의 공여자로부터 유래하였다. 히트 맵은 정의된 조건 하에 특정 판독에 대해 양성인 세포의 백분율과 관련된 칼라 강도를 갖는 모든 공여자의 평균이다.
[0066] 도 7 - CD40은 CD28-기반 CoStAR로부터 IL-2 생산을 향상시킨다. 3명의 건강한 공여자로부터의 일차 인간 T-세포는 비-형질도입된 상태로 유지되거나 세포외 도메인 말단절단된 CD28(Tr CD28), 전장 CD28(FL CD28), 또는 CEA 특이적 scFv를 보유하는 CD28.CD40-기반 CoStAR(MFE23)로 형질도입되었다. 형질도입된 세포를 CD34 마커 유전자를 사용하여 선택하고 분석 전에 확장시켰다. ELISA에 의한 IL-2 생산의 분석 전에 T-세포를 20시간 동안 CEA+ LoVo 세포를 발현하는 OKT3과 8:1 이펙터 대 표적 비율로 혼합하였다.
[0067] 도 8 - CoStAR-매개된 T-세포 확장에 대한 신호전달 도메인 및 표적 항원의 효과. T-세포를 CA125, FolR 또는 CEA 특이적 scFv를 보유하는 DYKDDDDK(SEQ ID NO:449) 에피토프-태깅된 CD28 또는 CD28.CD40 기반 CoStAR, 또는 FolR 특이적 결합 펩티드(C7)로 형질도입하였다. T-세포를 OKT3 발현 CA125+/FolR+/CEA- 세포주 OVCAR3와 혼합하였다. 형질도입된 세포의 수를 최대 21일까지 7일마다 계수하였고, 각 계수 후에 새로운 OVCAR3 세포를 첨가하였다.
[0068] 도 9 - CoStAR-매개된 T-세포 확장에 대한 신호전달 도메인 및 표적 항원의 효과. T-세포를 CA125, FolR 또는 CEA 특이적 scFv를 보유하는 DYKDDDDK(SEQ ID NO:449) 에피토프-태깅된 CD28 또는 CD28.CD40 기반 CoStAR, 또는 FolR 특이적 결합 펩티드(C7)로 형질도입하였다. T-세포를 CA125+/FolR+/CEA- 세포주 OVCAR3을 발현하는 OKT3과 혼합하였다. 형질도입된 세포의 수를 최대 21일까지 7일마다 계수하였고, 각 계수 후에 새로운 OVCAR3 세포를 첨가하였다.
[0069] 도 10a 및 도 10b - (도 10a 및 10b) CD40 기반 CoStAR은 TCR-전달 모델에서 T-세포의 공동자극을 향상시킨다. 3명의 건강한 공여자로부터의 일차 인간 T-세포를 CEA 특이적 TCR과 함께 MFE(열린 또는 닫힌 원) 또는 CA125(열린 사각형) 특이적 scFv를 보유하는 DYKDDDK-태깅된 CD28 또는 CD28.CD40 기반 CoStAR로 형질도입하였다. T-세포를 CEA+/CA125-H508 세포와 1:1 이펙터:표적 비로 혼합하고, TCR+/CoStAR+, TCR+/CoStAR-, TCR-/CoStAR+ 및 TCR-/CoStAR- 집단에서 반응하는 CD4+ 또는 CD8+ T-세포의 수를 결정하기 위해 세포내 사이토카인 염색을 수행하였다. 활성의 유의한 차이를 결정하기 위해 2원 ANOVA(Tukeys 시험)를 수행하였다: *p>0.05, ** p>0.01, *** p>0.001, **** p>0.0001.
[0070] 도 11은 본 발명의 공동자극 분자를 발현하도록 형질도입된 일차 인간 T-세포의 농축 및 확장을 도시한 것이다. MFE23은 암종배아 항원(CEA)에 대해 높은 친화성을 갖는 단쇄 Fv 항체이다. 일차 인간 T-세포를 각각 2A 절단 펩티드에 의해 분리된 CD34 마커 유전자를 보유하는 MFE23.CD28 또는 MFE23.CD28.CD40 CoStAR로 모의 형질도입되거나 형질도입되었다. 시험관내 배양 후, MACS™ 상자성 선택 시약(Miltenyi Biotech)을 사용하여 세포를 CD34에 대해 농축시킨 다음, 조사된 피더 세포를 사용하여 세포 수를 확장시켰다. 3명의 공여자 중 하나로부터의 예시적인 플롯이 제시된다.
[0071] 도 12a 내지 도 12d는 자극 및 외인성 IL-2에 반응하여 본 발명의 공동자극 분자로 형질도입된 T-세포의 확장을 도시한다. 세포를 모의 형질도입하거나 MFE23.CD28 또는 MFE23.CD28.CD40 CoStAR로 형질도입하고 외인성 IL-2의 존재(200 IU/ml) 또는 부재 하에 8:1 이펙터:표적 비로 LoVo-OKT3 세포와 공동배양하였다. 1, 4, 7, 11 및 18일에 세포를 취하고 MACSQuant 유세포 분석기에서 항-CD2 시약을 사용하여 살아있는 T-세포의 수를 열거하였다. (도 12a) 종양 및 IL-2 세포에 의한 자극의 부재 하에, 예상되는 바와 같이 수가 감소하였다. (도 12b) 자극은 없지만 IL-2의 존재 하에서, 세포의 보다 분명한 생존이 있었지만 특이적 성장은 없었다. (도 12c) 종양의 존재 및 IL-2 부재 하에서, 모의 세포는 특이적 생존을 나타내지 않았다. MFE23.CD28 CoStAR은 처음 4일 동안 팽창의 명백한 배가를 매개한 후 감소하였다. MFE23.CD28.CD40은 7일까지 더 큰 팽창을 매개한 후 꾸준히 감소하였다. (도 12d) 동일한 조건 그러나 IL-2의 존재 하에, 모의 및 MFE23.CD28 형질도입된 세포 둘 모두는 18일에 걸쳐 20배 확장을 입증한 반면, MFE23.CD28.CD40 세포는 60배 초과로 확장되었다. 따라서, CD28.CD40 기반 수용체는 외인성 IL-2의 존재 및 부재 둘 모두에서 자극 조건 하에 우수한 확장 및 생존을 입증한다.
[0072] 도 13a 내지 도 13m은 모의, MFE23.CD28 또는 MFE23.CD28.CD40 조작된 T-세포에 의한 사이토카인 생산을 도시한다. T-세포/종양 공동배양물로부터 수득된 상청액에 대해 비드 어레이 분석을 수행하였다. 조작된 T-세포를 LoVo-OKT3 세포와 1:1 이펙터:표적 비로 24시간 동안 인큐베이션하고 상청액을 수집하였다. 컨디셔닝된 상청액을 또한 동일한 수의 T-세포 단독, 또는 LoVo-OKT3 세포 단독으로부터 수집하였다. 사이토카인 생산을 Legendplex™ 인간 TH1/TH2 사이토카인 패널(Biolegend)을 사용하여 분석하였다. (도 13a) IL-2; (도 13g) IFN-γ; (도 13c) TNFα; (도 13d) IL-4; (도 13e) IL-5; (도 13f) IL-13; (도 13g) IL-17A; (도 13h) IL-17F; (도 13i) IL-22; (도 13j) IL-6; (도 13k) IL-10; (도 13l) IL-9; (도 13m) IL-21. 사이토카인은 T-세포 또는 종양 단독으로부터의 배지에서 매우 낮거나 검출불가능하였다. 종양과 공동배양될 때, 사이토카인 생산이 향상되었다. MFE23.CD28은 모의와 비교하여 IL-2, IL-5, IL-17A/17F, IL-10, IL-9 및 IL-21의 생산을 향상시켰다. MFE23.CD28.CD40은 또한 TNFα, IL-13 및 IL-22의 생산을 향상시켰다. MFE23.CD28.CD40 및 MFE23.CD28(IL-2, IL-9 및 IL-17F)에 의해 제공되는 것보다 많은 수의 사이토카인의 생산을 추가로 향상시킬 뿐만 아니라 MFE23.CD28(IL-5 및 IL-10)과 함께 일부 사이토카인의 생산을 관찰된 수준 미만으로 감소시켰다. 이와 함께, 데이터는 CD28-기반 공동자극 수용체에 대한 CD40의 첨가가 케모카인 생산과 관련하여 이들의 특정 활성을 향상 및/또는 조절함을 입증한다.
[0073] 도 14a 내지 도 14m은 Legendplex™ 인간 전염증성 케모카인 패널을 사용한 케모카인의 분석을 도시한다. (도 14a) IL-8(CXCL8); (도 14b) IP-10(CSCL10); (도 14c) 에오탁신(CCL11); (도 14d) TARC(CCL17); (도 14e) MCP-1(CCL2); (도 14f) RANTES(CCL5); (도 14g) MIP-1a(CCL3); (도 14h) MIG(CXCL9); (도 14i) ENA-78 (CXCL5); (도 14j) MIP-3α(CCL20); (도 14k) GROα(CXCL1); (도 14l) I-TAC(CXCL11); (도 14m) MEP-1β(CCL4). 케모카인은 T-세포 단독으로부터의 배지에서 매우 낮거나 검출불가능하였다. 종양과 공동배양될 때, 케모카인 생산이 향상되었다. MFE23.CD28은 모의와 비교하여 CXCL5, CXCL10, CXCL11, CCL17 및 CCL20의 생산을 향상시켰다. MFE23.CD28.CD40은 또한 CCL2, CXCL1 및 CXCL9의 생산을 향상시켰다. MFE23.CD28.CD40은 MFE23.CD28(CXCL1, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CCL17, CCL2, CXCL9, CCL5 및 CCL20)에 의해 제공되는 것보다 많은 수의 사이토카인의 생산을 추가로 향상시킬 뿐만 아니라 MFE23.CD28(CCL4)에서 관찰된 수준 미만으로 일부 사이토카인의 생산을 감소시켰다. 이와 함께, 데이터는 CD28-기반 공동자극 수용체에 대한 CD40의 첨가가 케모카인 생산과 관련하여 이들의 특정 활성을 향상 및/또는 조절함을 입증한다.
[0074] 도 15a 내지 도 15h는 FolR 또는 CA125 반응성 scFv를 보유하는 CoStAR을 사용한 난소 CoStAR 조작된 세포의 기능적 활성을 도시한다(각각 MOV19 & 196-14). 인간 폴레이트 수용체 알파(FolR)는 난소, 두경부, 신장 및 폐를 포함하는 다수의 종양에 대한 적합한 표적을 나타내고, CA125는 난소암에 대한 대안적인 표적을 나타낸다. 6명의 건강한 공여자로부터의 일차 인간 T-세포를 196-14.CD28, 196-14.CD28.CD40, MOV19.CD28 또는 MOV19.CD28.CD40 수용체로 조작하였고, 이러한 수용체 모두는 검출을 위한 DYKDDDDK 에피토프 태그를 보유하였다. 에피토프 태그 양성 및 음성 집단에서 세포내 염색을 사용하여 이펙터 활성의 분석 전에 형질도입된 세포를 FolR+/CA125+ OVCAR-OKT3 세포와 혼합하였다. IL-2(도 15a 및 15b), TNFα(도 15c 및 15d), CD137(도 15e 및 15f), 및 BCL-xL(도 15g 및 15h)의 생산에 의해 결정된 이펙터 활성의 특이적 향상은 MOV19.CD28.CD40과 비교하여 관찰되지 않은 MOV19.CD28에 의한 특이적 BCL-xL 유도를 제외하고, CA125 및 FolR 둘 모두에 반응하여 CD28 및 CD28.CD40 조작된 세포에서 관찰되었다.
[0075] 도 16a 내지 도 16f는 MOV19.CD28.CD40 CoStAR로 모의 형질도입되거나 조작된 후 환자 매칭된 종양 분해물과 혼합된 모의 3개의 TIL 집단을 도시한다. 공여자 종양은 음성(도 16a), 낮은 발현(도 16b)에서 높은 발현(도 16c)까지의 범위로, 분해물에서 다양한 수준의 FolR을 나타내었다. FolR 음성 분해물에 대해 매칭된 CoStAR 조작된 TIL의 모의 및 CoStAR 음성 TIL은 CoStAR의 존재에 의해 향상되지 않은 종양 공동배양 후 유사한 수준의 CD137 상향조절을 입증하였다(도 16d). FolR 저발현 분해물에 노출된 TIL에서, CoStAR-에 비해 CoStAR+ 세포에서 활성의 향상이 있었고, CD137 발현은 <10%에서> 20%로 증가하였다(도 16e). FolR 고 종양 분해물에 노출된 TIL에서, CoStAR- 집단에서 대략 20%로부터, CoStAR+ 집단에서 대략 50%까지의 활성 증가가 있었다(도 16f).
[0076] 도 17a 내지 도 17c는 이펙터 기능의 향상을 도시한다. CoStAR을 표적화하는 FolR은 FolR+ 종양 분해물 반응하여, CD137 발현을 ~20%에서 ~50%로 향상시켰고(도 17a), TNFα 생산을 10%에서 15%로 향상시켰고(도 17b), IL-2 생산을 2%에서 5%로 향상시켰다(도 17c).
[0077] 도 18a 내지 도 18f는 가용성 리간드가 이펙터 기능을 억제하지 않는 것을 도시한다. 3명의 건강한 공여자로부터의 T-세포를 MOV19.CD28 또는 MOV19.CD28.CD40 CoStAR로 조작하고, 고정화된 OKT3으로 활성화시켜 FolR의 부재 하에 자극을 제공하거나, OvCAR-OKT3으로 활성화시켜 TCR 및 CoStAR 활성을 제공하였다. BCL-xL 활성은 OKT3 자극 후 3명의 공여자에 걸쳐 10 내지 20% 증가한 반면(도 18a) IL-2는 0 내지 12% 증가하였고(도 18b), TNFα는 0 내지 20% 증가하였다(도 18c). 외인성 가용성 FolR의 존재는 이러한 특정 이펙터 기능 중 어느 것도 향상시키지 않았다. OvCAR-OKT3의 존재 하에서, BCL-XL 유도는 CD28 CoStAR에서 약 20%만큼 향상되었지만, CD28.CD40 CoStAR에서는 약 35% 향상되었고(도 18d), IL-2 유도는 CD28 CoStAR에서 약 20%만큼 향상되었지만 CD28.CD40 CoStAR에서는 30 내지 50%만큼 향상되었고(도 18e), TNFα 생산은 CD28 CoStAR에서 20 내지 30% 및 CD28.CD40 CoStAR에서 25 내지 50% 향상되었다(도 18f). 외인성 가용성 FolR은 이러한 이펙터 기능 중 어느 것에도 억제 효과를 나타내지 않았다.
[0078] 도 19는 HD T 세포의 표면에서 항-MSLN CoStAR 발현의 표면 발현을 도시한 것이다. 형질도입 및 비-형질도입된(MOCK) 세포는 급속 확장 프로토콜(REP)을 거쳤고, 항-CD34-APC(검정색) 또는 항-MSLN-PE(적색) 항체를 사용하여 마커 유전자 tCD34(말단절단된 CD34) 또는 CoStAR 분자의 표면 검출을 통해 형질도입 효율에 대해 평가되었다. 결과는 3개의 생물학적 복제물을 나타낸다.
[0079] 도 20a 내지 도 20c는 항-MSLN CoStAR로 형질도입되고 OVCAR-3 세포주와 공동배양된 건강한 공여자(HD) T 세포에서의 사이토카인 발현을 도시한다. 6개의 상이한 항-MSLN scFv(SS1, M5, HN1, M912, huYP218, P4) 및 3개의 상이한 스페이서/막횡단 도메인(CD28, N-말단 절단된 CD28, CD8)의 조합을 포함하는 CoStAR을 비교하였다. 구조적 세부사항은 표 8, 표 9, 및 표 10에 제공된다. OVCAR-3 또는 OVCAR3-OKT3 세포주와의 공동배양 후 (도 20a) IL-2, (도 20b) IFNγ, 및 (도 20c) TNFα에 대한 사이토카인 농도를 나타내었다. 처리되지 않은 T 세포를 대조군으로 사용하였다. 결과는 각각 3개의 기술적 복제물을 갖는 1 내지 3개의 생물학적 복제물을 나타낸다.
[0080] 도 21a 내지 도 21c는 항-MSLN CoStAR로 형질도입되고 K562 세포주와 공동배양된 건강한 공여자(HD) T 세포에서의 사이토카인 발현을 도시한다. 6개의 상이한 항-MSLN scFv(SS1, M5, HN1, M912, huYP218, P4) 및 3개의 상이한 스페이서/막횡단 도메인(CD28, N-말단 절단된 CD28, CD8)의 조합을 포함하는 CoStAR을 비교하였다. 구조적 세부사항은 표 8, 표 9 및 표 10에 제공된다. K562-MSNL 또는 K562-MSNL-OKT3 세포주와의 공동배양 후 (도 21a) IL-2, (도 21b) IFNγ 및 (도 21c) TNFα에 대한 사이토카인 농도를 제시하였다. 처리되지 않은 T 세포를 대조군으로 사용하였다. 결과는 각각 3개의 기술적 복제물을 갖는 1 내지 3개의 생물학적 복제물을 나타낸다.
[0081] 도 22는 6개의 상이한 분비 신호 펩티드(OSM1, CD8, CD2, IL2, GMCSF, hIgGκ)로 발현된 MFE23 scFV 항-CEA CoStAR의 표면 발현을 도시한다. 구조적 세부사항은 표 11에 제공된다. 확장 후, 각각 항-CD34-APC(검정색 막대)를 사용하여 마커 유전자 말단절단된 CD34(tCD34) 또는 CoStAR 분자의 표면 검출을 통해 또는 또는 이차 항-IgG-Fc-PE(회색 막대) 항체를 갖는 일차 rhCEACAM5-Fc 항체를 사용하여 세포를 형질도입 효율에 대해 평가하였다.
[0082] 도 23은 6개의 상이한 항-CEA scFv(MFE23, MFE23(Q>K), hMFE23, CEA6, BW431/26, hT84.66)를 포함하는 CoStAR의 표면 발현을 도시한다. 구조적 세부사항은 표 12에 제공된다. 확장 후, 각각 항-CD34-APC(검정색 막대)를 사용하여 마커 유전자 말단절단된 CD34(tCD34) 또는 CoStAR 분자의 표면 검출을 통해 또는 이차 항-IgG-Fc-PE(회색 막대) 항체를 갖는 일차 rhCEACAM5-Fc 항체를 사용하여 세포를 형질도입 효율에 대해 평가하였다.
[0083] 도 24a 내지 도 24c는 항-CEA CoStAR(MFE23, MFE23(Q>K), hMFE23, CEA6, BW431/26, hT84.66)로 형질도입되고 LoVo 세포주와 공동배양된 건강한 공여자(HD) T 세포에 의한 사이토카인 생산을 도시한다. 구조적 세부사항은 표 12에 제공된다. 사이토카인 농도는 Lovo 또는 Lovo-OKT3 세포주와의 공동배양 후 (도 24a) IL-2, (도 24b) IFNγ, 및 (도 24c) TNFα에 대해 나타내었다. 처리되지 않은 T 세포를 음성 대조군으로 사용하였다.
[0084] 도 25a 내지 도 25c는 항-CEA CoStAR(MFE23, MFE23(Q>K), hMFE23, CEA6, BW431/26, hT84.66)로 형질도입되고 K562 세포주와 공동배양된 건강한 공여자(HD) T 세포에서의 사이토카인 생산을 도시한다. 사이토카인 농도는 K562.CEACAM5(신호 2) 또는 K562.CEACAM5.OKT3(신호 1+2) 세포주와의 공동배양 후 (도 25a) IL-2, (도 25b) IFNγ, 및 (도 25c) TNFα에 대해 나타내었다. 처리되지 않은 T 세포를 음성 대조군으로 사용하였다.
[0085] 도 26은 3개의 상이한 스페이서/막횡단 도메인으로 발현된 hMFE23 scFV 항-CEA CoStAR의 표면 발현을 도시한다. 구조적 세부사항은 표 13에 제공된다. 확장 후, 항-CD34-APC(검정색 막대)를 사용하여 마커 유전자 말단절단된 CD34(tCD34)의 표면 검출을 통해 또는 이차 항-IgG-Fc-PE 항체(회색 막대)를 갖는 일차 rhCEACAM5-Fc 항체를 사용하여 CoStAR 분자의 표면 검출을 통해 세포를 형질도입 효율에 대해 평가하였다.
[0086] 도 27a 내지 도 27c는 MFE23 scFV 항-CEA 스페이서 변이체에 의한 사이토카인 생산을 도시한다. Lovo 또는 Lovo.OKT3 세포주와의 공동배양 후 (도 27a) IL-2, (도 27b) IFNγ, 및 (도 27c) TNFα에 대한 사이토카인 농도를 제시하였다. 처리되지 않은 T 세포를 대조군으로 사용하였다.
[0087] 도 28은 CD40, CD134, CD137, CD2, ICOS, DAP10 및 NTRK1 신호전달 요소를 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 갖는 hMFE23 CEA-결합 도메인을 포함하는 항-CEA CoStAR을 도시한다.
[0088] 도 29는 도 28에 도시된 도메인 조합을 포함하는 hMFE23 scFV 항-CEA CoStAR의 표면 발현을 도시하고 도 29에 상세히 도시되어 있다. 확장 후, 항-CD34-APC(검정색 원)를 사용하여 마커 유전자 말단절단된 CD34(tCD34)의 표면 검출을 통해 또는 이차 항-IgG-Fc-PE 항체(적색 원)를 갖는 일차 rhCEACAM5-Fc 항체를 사용하여 CoStAR 분자의 표면 검출을 통해 세포를 형질도입 효율에 대해 평가하였다. 결과는 3개의 생물학적 복제물을 나타낸다.
[0089] 도 30은 3개의 개별 공여자에서 CoStAR 형질감염된 HD T 세포의 T 세포 표현형을 도시한 것이다. 세포를 CD34 마이크로비드를 사용하여 분류하고 14일 동안 급속 확장 프로토콜(REP)을 거쳤다. 파생물 및 REP 후, 1×105 세포를 유세포 분석을 사용하여 분화 하위타입에 대해 평가하였다. Tcm, 중심 기억 T 세포; Tem, 이펙터 메모리 T 세포; Tn, 나이브 T 세포; Tscm; 줄기 세포 기억 T 세포; Tte, 말단 이펙터 T 세포. T 세포 하위타입 정의에 대해서는 표 15가 참조된다.
[0090] 도 31a 내지 도 31c는 K562 세포주와 공동배양된 hMFE23 scFV 항-CEA CoStAR 형질도입된 HD T 세포에 의한 사이토카인 생산을 도시한다. K562.CEACAM5(신호 2) 또는 K562.CEACAM5.OKT3(신호 1+2) 세포주와의 공동배양 후 (도 31a) IL-2, (도 31b) IFNγ, 및 (도 31c) TNFα에 대한 사이토카인 농도를 제시하였다. 처리되지 않은 T 세포를 대조군으로 사용하였다.
[0091] 도 32a 내지 도 32c는 hMFE23 scFV 항-MSLN CoStAR로 형질도입되고 K562 세포주와 공동배양된 HD T 세포에서의 사이토카인 발현을 도시한다. K562.CEACAM5(신호 2) 또는 K562.CEACAM5.OKT3(신호 1+2) 세포주와의 공동배양 후 (도 32a) IL-2, (도 32b) IFNγ, 및 (도 32c) TNFα 발현 세포의 빈도를 제시하였다. 처리되지 않은 T 세포를 대조군으로 사용하였다.
[0092] 도 33은 K562.CEACAM5.OKT3(신호 1+2) 세포주와 공동배양된 hMFE23 scFV 항-MSLN CoStAR로 형질도입된 HD T 세포의 증식을 도시한다. HD T 세포를 2명의 공여자로부터 조달하였다. 숫자는 입력 세포의 배수 확장을 나타낸다.
[0093] 도 34는 K562.CEACAM5.OKT3(신호 1+2) 세포주와 공동배양된 hMFE23 scFV 항-MSLN CoStAR로 형질도입된 HD T 세포의 증식을 도시한다. HD T 세포를 2명의 공여자로부터 조달하였다. 숫자는 자극 후 6일에 입력 세포의 배수 확장을 나타낸다.
[0094] 도 35a 및 도 35b는 TRAF 및 TRAF-유사 결합 부위 및 모티프 및 신호전달 경로를 도시한다. 도 35a는 TRAF 결합 부위 및 신호전달을 나타내는 CoStAR CD40 세포내 도메인을 도시한다. 도 35b는 IProx 도메인을 포함하는 CoStAR을 도시한다.
[0095] 도 36a 및 도 36b는 LoVo.OKT3과 공동배양된 CD28.CD40 CoStAR 형질도입된 T 세포의 사이토카인 분비 및 장기 생존 및 증식에 대한 CoStAR CD40 세포내 신호전달 도메인에서의 돌연변이의 효과를 도시한 것이다. 3명의 공여자의 세포를 Dynabeads로 활성화시키고 WT CD28.CD40(CTP194), TRAF2 결합 부위 돌연변이 SVQE>AVQA(CTP195)를 함유하는 CD28.CD40, TRAF2/TRAF3 결합 부위 돌연변이 PVQET>AVAEA(CTP196), TRAF6 결합 부위 돌연변이 PQEINF>AQAINF(CTP197), Q263A(CTP199)로 형질도입하거나 모의 형질도입하였다. (도 36a) IL-2를 LoVo 또는 LoVo.OKT3.GFP 종양 세포와 IL-2의 부재 하에 공동배양 24시간 후에 수집된 상청액에서 측정하였다. (도 36b) 6 내지 8일 후에 생존력 및 절대 계수를 평가하고, 살아있는 T 세포를 새로운 LoVo.OKT3.GFP 종양 세포로 추가 주 동안 재접종하였다. 장기 공동배양의 말미에, 생존율 및 절대 계수를 측정하고, 배수 확창을 계산하였다. 데이터는 3회 분석된 n3 공여자의 평균 +/- SEM으로 나타낸 것이다.
[0096] 도 37a 및 도 37b는 1일에 해동된 OC 샘플에서 CD2+ 염색을 기초로 한 TIL의 백분율(도 37a) 및 총 TIL 계수(도 37b)를 도시한다.
[0097] 도 38은 비-Td 및 Td TIL의 성장을 도시한다. Novocyte 3005에서 CD2 및 DRAQ7 염색 및 획득을 사용하여 세포를 계수하였다. 25일에 REP 종료시 세포 수를 그래프로 나타내었다. 5개의 난소암 샘플 각각에 상응하는 형상이 도시되어 있다. 채워진 형태는 비-Td이고 개방된 형태는 Td TIL이다. 통계 분석은 페어드 t-테스트를 사용하여 수행되었다.
[0098] 도 39a 내지 도 39d는 CoStAR 변형된 TIL의 세포당 형질도입 효율 및 바이러스 통합을 도시한다. 비-형질도입된(비-Td) 및 항-FOLR1 CoStAR 형질도입된(Td) TIL을 CD3+(도 39a), CD4+(도 39b) 및 CD8+(도 39c) 세포 집단에서 REP 후 25일째에 형질도입 효율에 대해 평가하였다. 바이러스 복사체 수(VCN)를 바이러스 통합을 결정하기 위해 평가하였다(도 39d). 5개의 난소암 샘플 각각에 상응하는 형상이 도시되어 있다. 채워진 형태는 비-Td이고 투명한 형태는 Td TIL이다.
[0099] 도 40은 REP-후 TIL에서 CD4 및 CD8 집단을 도시한 것이다. 비-형질도입된(비-Td) 및 항-FOLR1 CoStAR-형질도입된(Td) 및 항-FOLR1 CoStAR+ Td TIL을 유세포분석을 사용하여 REP 후 D25에 CD4 및 CD8 조성물에 대해 평가하였다. 검정 후 매칭된 Tukey의 다중 비교와 함께 이원 ANOVA를 사용하여 통계적 분석을 수행하였다.
[00100] 도 41a 내지 도 41c는 TIL의 분화 상태에 대한 CoStAR 변형의 효과를 도시한 것이다. 비-형질도입된(비-Td), 항-FOLR1 CoStAR-형질도입된(Td) TIL 및 항-FOLR1 CoStAR+ Td TIL을 총 T 세포(도 41a), CD4+(도 41b) 및 CD8+(도 41c) 세포 집단으로부터 REP 후 D25에 이들의 분화 상태에 대해 평가하였다. 매칭된 Tukey의 다중 비교 시험과 함께 이원 ANOVA를 사용하여 통계 분석을 수행하였다. CD3+(도 41a) 및 CD4+(도 41b) 집단에 대한 항-FORL1 CoStAR-Td TIL과 항-FOLR1 CoStAR+ Td TIL 사이의 Tscm 집단에 대해 통계적 유의성을 관찰하였다. *p<0.05
[00101] 도 42a 및 도 42b는 공동-억제 또는 공동-자극 마커 발현에 대한 TIL의 CoStAR 변형 효과를 도시한다. 비-형질도입된(비-Td), 항-FOLR1 CoStAR-형질도입된(Td) TIL 및 항-FOLR1 CoStAR+ Td TIL을 CD4+(도 42a) 및 CD8+(도 42b) 세포 집단에서 공동-억제 및 공동-자극성 마커의 발현에 대해 평가하였다. 5개의 난소암 샘플 각각에 상응하는 모양은 충전물에 관계없이 도시되어 있다. 흑색, 암회색 및 밝은 회색 막대는 각각 비-Td TIL, 항-FOLR1 CoStAR-Td 및 항-FOLR1 CoStAR+ Td TIL을 나타낸다. 검정 후 매칭된 Tukey의 다중 비교와 함께 이원 ANOVA를 사용하여 통계적 분석을 수행하였다. *p<0.05
[00102] 도 43a 및 도 43b는 TIL에서 TCRαβ, TCRγδ 및 Treg 빈도에 대한 CoStAR 변형의 효과를 도시한다. 비-형질도입된(비-Td), 항-FOLR1 CoStAR-형질도입된(Td) TIL 및 항-FOLR1 CoStAR+ Td TIL을 CD3+ 세포 집단(도 43a)에서 TCRαβ(CD3+TCRαβ+), 및 TCRγδ(CD3+TCRγδ+)의 빈도에 대해 평가하였다. CD4+ 하위집단에서 Treg의 빈도를 또한 평가하였다(도 43b). 5개의 난소암 샘플 각각에 상응하는 모양은 충전물에 관계없이 도시되어 있다. 흑색, 암회색 및 밝은 회색 막대는 각각 비-Td TIL, 항-FOLR1 CoStAR-Td TIL 및 항-FOLR1 CoStAR+ Td TIL을 나타낸다. 통계 분석을 검정 후 일치된 Tukey의 다중 비교와 함께 이원 ANOVA(도 43a) 및 Friedman의 사후 검정을 사용한 일원 ANOVA(도 43b)를 사용하여 수행하였다.
[00103] 도 44a 내지 도 44c는 유사분열 활성화 시 사이토카인 생산에 대한 TIL의 CoStAR 변형 효과를 도시한다. 비-형질도입된(비-Td), 항-FOLR1 CoStAR-형질도입된(Td) TIL 및 항-FOLR1 CoStAR+ Td TIL을 CD3+에서(도 44a), CD4+(도 44b) 및 CD8+(도 44c) 세포 집단에서 PMA(50 ng/mL)/이오노마이신(1 ㎍/mL)으로 4시간 자극시 사이토카인의 생산에 대해 평가하였다. 5개의 OC 샘플 각각에 상응하는 형상은 충전과 무관하게 도시되어 있다. 흑색, 암회색 및 밝은 회색 막대는 각각 비-Td TIL, 항-FOLR1 CoStAR-Td TIL 및 항-FOLR1 CoStAR+ Td TIL을 나타낸다. 매칭된 Tukey의 다중 비교 후-시험과 함께 이원 ANOVA를 사용하여 통계적 분석을 수행하였다. * p≤0.05, *** p≤0.001.
[00104] 도 45는 OC 분해물 세포에서의 FOLR1의 발현을 도시한다. 동결보존된 자가 종양 분해물을 해동하고 유세포분석에 의해 분석하여 각 공여자의 FOLR1의 표면 발현을 결정하였다. 연구에 사용된 5명의 공여자 모두가 제시된다. 약어: OC, 난소암, FOLR1, 폴레이트 수용체 알파; FOLR1 PE, PE에 컨쥬게이션된 항-FOLR1 항체; PE, 피코에리트린.
[00105] 도 46a 내지 도 46d는 자가 종양과의 공동배양시 사이토카인 생산 세포에 대한 CoStAR 변형의 효과를 도시한다. 비-Td 및 항-FOLR1 CoStAR Td TIL을 자가 종양 분해물과 함께 16시간 동안 공동배양하고, 세포내 유세포 분석을 수행하여 사이토카인을 생산하는 세포의 비율을 평가하였다. IL-2 양성(도 46a) CD4 및 (도 46b) CD8 TIL의 빈도 뿐만 아니라 TNFα 양성 (도 46c) CD4 및 (도 46d) CD8 TIL의 빈도를 평가하였다. 결과는 각각 3개의 기술적 복제물을 갖는 5개의 생물학적 복제물을 나타낸다. Tukey의 다중 비교 시험과 함께 이원 ANOVA를 사용하여 통계적 분석을 수행하였다. *P <0.05.
[00106] 도 47a 내지 도 47e는 FOLR1을 발현하는 자가 종양 분해물과의 공동배양시 사이토카인 분비에 대한 CoStAR 변형의 효과를 도시한다. 비-Td 및 항-FOLR1 CoStAR 형질도입된(Td) TIL을 자가 종양 분해물과 24시간 동안 공동배양한 후, 상청액을 수집하고 MSD 면역검정을 사용하여 사이토카인 분비에 대해 분석하였다. 그래프는 공동배양 상청액에서 (도 47a) IL-2, (도 47b) TNFα, (도 47c) IL-13 및 (도 47d) IFNγ의 측정된 농도를 나타낸다. (도 47e) 도 1에서 결정된 바와 같은 자가 분해물에 의한 IFNγ 농도와 FOLR1 발현 사이의 상관관계. 결과는 각각 3개의 기술적 복제물을 갖는 5개의 생물학적 복제물을 나타낸다. Sidak의 다중 비교 시험과 함께 이원 ANOVA를 사용하여 통계 분석을 수행하였다. 상관관계 분석을 단순 선형 회귀를 사용하여 수행하였다. *P <0.05, **P <0.01, ***P<0.001.
[00107] 도 48은 자가 종양 분해물과의 공동배양에서 MHC-의존성 CoStAR 기능성의 평가를 도시한 것이다. 비-Td 및 항-FOLR1 CoStAR 형질도입된(Td) TIL을 MHC 차단 시약 또는 이소타입 대조군의 존재 하에 자가 종양 분해물과 24시간 동안 공동배양하였다. 이어서, 상청액을 MSD 면역검정을 사용하여 IFNγ 사이토카인 생산에 대해 분석하였다. 결과는 각각 3개의 기술적 복제물을 갖는 3개의 생물학적 복제물을 나타낸다. Tukey의 다중 비교 시험과 함께 이원 ANOVA를 사용하여 통계적 분석을 수행하였다.
[00108] 도 49a 및 도 49b는 조작된 세포주와의 공동배양시 사이토카인 생산 세포 빈도에서 CoStAR 변형의 효과를 도시한다. 비-Td 및 항-FORL1 CoStAR 형질도입된(Td) TIL을 조작된 표적 세포주와 16시간 동안 공동배양하고, 사이토카인 생산 세포를 세포내 유세포 분석을 사용하여 측정하였다. K-562(좌) 및 OVCAR-3(우) 유래된 계통과의 공동배양 후 CD4+(상부) 및 CD8+(하부) TIL에서 IL-2 양성 (도 49a)의 빈도. K-562(좌) 및 OVCAR-3(우) 유래된 계통과의 공동배양 후 CD4+(상부) 및 CD8+(하부) TIL에서 TNFα 양성 (도 49b)의 빈도. 결과는 각각 3개의 기술적 복제물을 갖는 5개의 생물학적 복제물을 나타낸다. Tukey의 다중 비교 시험과 함께 이원 ANOVA를 사용하여 통계적 분석을 수행하였다. *P <0.05, **P <0.01, ***P <0.001, ****P <0.0001.
[00109] 도 50a 내지 도 50d는 조작된 세포주와의 공동배양시 사이토카인 분비에서 CoStAR 변형의 효과를 도시한다. 비-Td 및 항-FOLR1 CoStAR 형질도입된(Td) TIL을 조작된 표적 세포주와 24시간 동안 공동배양하고 MSD 면역검정을 수행하여 분비된 사이토카인의 농도를 평가하였다. (좌) K-562, 및 (우) BA/F3 유래된 세포주와의 공동배양 후 (도 50a) IL-2, (도 50b) TNFα, (도 50c) IL-13 및 (도 50d) IFNγ에 대한 사이토카인 농도가 도시되어 있다. 결과는 각각 3개의 기술적 복제물을 갖는 5개의 생물학적 복제물을 나타낸다. Tukey의 다중 비교 시험과 함께 이원 ANOVA를 사용하여 통계적 분석을 수행하였다. *P <0.05, **P <0.01, ***P <0.001, ****P <0.0001.
[00110] 도 51a 내지 도 51c는 OKT3 보유 표적에 대한 TIL의 세포독성 용량에 대한 CoStAR 변형의 영향의 평가를 도시한다. 비-Td 및 항-FOLR1 CoStAR 형질도입된(Td) TIL을 BA/F3 또는 OVCAR-3 조작된 세포주와 공동배양하고, 세포독성을 기반으로 하는 유세포분석 기반(도 51a) 및 xCELLigence-기반 검정(도 51b 및 51c)을 사용하여 평가하였다. (도 51b) 1:5의 E:T 비율 및 (도 51c) 1:30의 E:T 비율. 결과는 각각 3개의 기술적 복제물을 갖는 5개의 생물학적 복제물을 나타낸다. 유세포 분석 데이터에 대한 Tukey의 다중 비교 시험을 이용한 이원 ANOVA 및 xCELLigence 데이터에 대한 Tukey의 다중 비교 시험을 이용한 일원 ANOVA를 사용하여 통계 분석을 수행하였다. *P <0.05, **P <0.01.
[00111] 도 52a 내지 도 52d는 >80%의 생존율(도 52a) 및 약 1억 내지 2억 개의 세포(도 52b), CD3+ T 세포에서 40 내지 55% CoStar 형질도입(도 52c) 및 >90% CD3+ T 세포 순도(도 52d)를 갖는 NSCLC TIL의 확장을 도시한다.
[00112] 도 53은 >80%의 생존력을 갖는 NSCLC TIL의 확장을 도시한다. CoStAR 형질도입된 집단과 비-형질도입된 집단에서는 생존율 및 세포 확장의 관점에서 차이가 없었다.
[00113] 도 54는 수확시 5천만 내지 5억 개의 세포를 갖는 NSCLC TIL의 확장을 도시한 것이다. CoStAR 형질도입된 집단과 비-형질도입된 집단에서는 생존율 및 세포 확장의 관점에서 차이가 없었다.
[00114] 도 55는 7명의 환자 샘플의 T 세포 집단을 도시한 것이다.
[00115] 도 56은 CD3+를 T 세포로, CD3-CD56+를 NK 세포로 표시하는 CD3 대 CD56을 도시한 것이다.
[00116] 도 57은 비-형질도입된 및 CoStAR 형질도입된 T 세포의 정량화를 도시한다.
[00117] 도 58은 T 세포 하위세트에 대한 CoStAR 염색을 도시한다.
[00118] 도 59a 내지 도 59d는 REP 동안 난소암 TIL의 생존율의 유의한 증가 및 제조 공정의 말미에 >90% 생존율을 도시하며, 수확시 1억 내지 3억 개의 세포를 갖는다. 도 59a는 세포 수를 도시하고 도 59b는 10일에 걸친 난소암 TIL의 생존력을 도시한다. 도 59c는 세포 수를 도시하고 도 59d는 제조 공정 후 생존력을 도시한다.
[00119] 도 60a 내지 도 60d는 수확시 1억 내지 3억 5천만 개의 세포로, 성장 동안 >50%의 생존력 및 제조 공정의 마지막에 >90%의 생존력이 일관되게 입증된 신장암 TIL을 도시한다. 도 60a는 세포 수를 도시하고 도 60b는 10일에 걸친 신장암 TIL의 생존력을 도시한다. 도 60c는 세포 수를 도시하고 도 60d는 제조 공정 후 생존력을 도시한다.
[00120] 도 61은 실시예 16에 개략된 바와 같은 실험 설정을 도시하며, 여기서, CD40 신호전달 모티프 돌연변이체 작제물은 전사에 대한 변화에 대해 스크리닝하기 위해 세포에 혼입되었다.
[00121] 도 62a는 실시예 17에 개략적으로 기재된 바와 같이, T 세포에서 TRAF 변이체 CoSTAR를 제조하기 위한 23일 실험 접근법을 도시한다.
[00122] 도 62b는 실시예 17에 개략적으로 기재된 바와 같이, T 세포에서의 증식에 대한 TRAF 변이체 CoSTAR의 효과를 모니터링하기 위한 26일 실험 접근법을 도시한다.
[00123] 도 63a 내지 도 63c는 IL-2 처리에 의한 TRAF 변이체 CoSTAR를 발현하는 CD2+ T 세포의 총 수의 변화를 도시한다. 공여자 HD 702C(도 63a), HD 1004(도 63b), 및 HD 2000(도 63c)으로부터 수집된 세포로부터의 세포 수의 변화에 대한 그래프가 제공된다.
[00124] 도 64a 내지 도 64c는 IL-2 처리에 의한 TRAF 변이체 CoSTAR를 발현하는 CD2+ T 세포의 수에서의 배수-변화를 도시한다. 공여자 HD 702C(도 64a), HD 1004(도 64b), 및 HD 2000(도 64c)으로부터 수집된 세포로부터의 세포 수의 배수 변화에 대한 그래프가 제공된다.
[00125] 도 65a 내지 도 65c는 TRAF 변이체 CoSTAR를 발현하는 CD2+ T 세포의 총 수의 변화를 도시하며, 여기서, T 세포는 임의의 IL-2 치료를 받지 않았다. 공여자 HD 702C(도 65a), HD 1004(도 65b), 및 HD 2000(도 65c)으로부터 수집된 세포로부터의 세포 수의 변화에 대한 그래프가 제공된다.
[00126] 도 66a 내지 도 66c는 TRAF 변이체 CoSTAR를 발현하는 CD2+ T 세포의 수에서의 배수-변화를 도시하며, 여기서, T 세포는 임의의 IL-2 치료를 받지 않았다. 공여자 HD 702C(도 66a), HD 1004(도 66b), 및 HD 2000(도 66c)으로부터 수집된 세포로부터의 세포 수의 배수 변화에 대한 그래프가 제공된다.
[00127] 도 67은 SEQ ID NO: 510 내지 519의 CD40 TRAF 변이체의 일부 구현예를 도시한다. 이 도면에서, 밑줄 친 영역은 CD40이고, 회색으로 강조 표시된 서열은 TRAF6 결합 도메인 영역이고, 밝은 회색으로 강조 표시된 서열은 TRAF2/3 결합 도메인이며, 회색으로 강조 표시되고 이중 괄호로 둘러싸인 서열은 TRAF2 결합 도메인이다.
[00128] 도 68은 공여자 HD 702C, HD 1004, 및 HD 2000으로부터 수집된 일차 T 세포로의 작제물의 형질도입 수준을 도시한다.
[00129] 도 69a 내지 도 69f는 실시예 18에 개략적으로 기재된 바와 같은, TRAF6 변이체를 갖는, 및 IL-2 처리(도 69a 내지 69c)와 함께 IL-2 처리 없이(도 69d 내지 69f) CoStAr 작제물을 발현하는 일차 인간 공여자 702C(도 69a 및 69d) 1004(도 69b 및 69e), 및 2000(도 69c 및 69f) 일차 T 세포에서 기준선과 비교하여 세포 증식의 배수 변화를 도시한다.
[00130] 도 70a 내지 도 70f는 실시예 18에 개략적으로 기재된 바와 같은, TRAF2/3 변이체를 갖는, 및 IL-2 처리(도 70a 내지 70c)와 함께 IL-2 처리 없이(도 70d 내지 70f) CoStAr 작제물을 발현하는 일차 인간 공여자 702C(도 70a 및 70d) 1004(도 70b 및 70e), 및 2000(도 70c 및 70f) 일차 T 세포에서 기준선과 비교하여 세포 증식의 배수 변화를 도시한다.
[00131] 도 71a 내지 도 71f는 실시예 18에 개략적으로 기재된 바와 같은, TRAF2 변이체를 갖는, 및 IL-2 처리(도 71a 내지 71c)와 함께 IL-2 처리 없이(도 71d 내지 71f) CoStAr 작제물을 발현하는 일차 인간 공여자 702C(도 71a 및 71d) 1004(도 71b 및 71e), 및 2000(도 71c 및 71f) 일차 T 세포에서 기준선과 비교하여 세포 증식의 배수 변화를 도시한다.
[00132] 도 72a 내지 도 72f는 실시예 18에 개략적으로 기재된 바와 같은, TRAF 변이체를 갖는, 및 IL-2 처리(도 72a 내지 72c)와 함께 IL-2 처리 없이(도 72d 내지 72f) CoStAr 작제물을 발현하는 일차 인간 공여자 702C(도 72a 및 72d) 1004(도 72b 및 72e), 및 2000(도 72c 및 72f) 일차 T 세포에서 기준선과 비교하여 세포 증식의 배수 변화를 도시한다.
[00133] 도 73a 내지 도 73d는 도 69a 내지 69c, 70a 내지 70c, 71a 내지 71c, 및 72a 내지 72c의 조합된 데이터를 도시하며, 여기서, 3명의 공여자에 걸친 일차 T 세포에서 기준선과 비교한 세포 증식의 배수 변화가 시간 경과에 따라 그래프로 표시된다. 그래프는 IL-2로 처리된 세포를 보여주고, TRAF6(도 73a), TRAF2/3(도 73b), TRAF2(도 73c), 또는 다른 TRAF(도 73d) 변이체를 발현하는 세포에 대한 조합된 데이터를 나타낸다.
[00134] 도 74a 내지 도 74d는 도 69a 내지 69c, 70a 내지 70c, 71a 내지 71c, 및 72a 내지 72c의 조합된 데이터를 도시하며, 여기서, 3명의 공여자에 걸친 일차 T 세포에서 기준선과 비교한 세포 증식의 배수 변화가 시간 경과에 따라 그래프로 표시된다. 그래프는 IL-2 처리가 제공되지 않은 세포를 나타내고, TRAF6(도 74a), TRAF2/3(도 74b), TRAF2(도 74c), 또는 다른 TRAF(도 74d) 변이체를 발현하는 세포에 대한 조합된 데이터를 나타낸다.
[00135] 도 75a 및 도 75b는 IL-2 처리된(도 75a) 및 IL-2 처리가 없는(도 75b) 세포에 대해 21일에 3명의 공여자로부터의 일차 인간 T 세포에서 기준선과 비교하여 세포 증식의 조합된 배수 변화를 도시한다.
[00136] 도 76a 내지 도 76c는 TRAF 변이체를 갖는 보편적인 공동자극 단백질에 대한 도식 모델의 비제한적인 예를 도시한다. (도 76a) TCR 혼입된 항원 불문 수용체(TIAAR)는 TCR 복합체의 변형 성분 및 관련 신호전달 어댑터를 포함한다. (도 76b) 막횡단 도메인(TMD) 및 유도성 또는 구성적 활성화를 가능하게 하는 특징을 포함하는 구성적 공동자극 수용체. (도 76c) 세포외 리간드 결합에 의해 유도 및 활성화될 수 있는 유도성 공동자극 수용체. 이러한 비제한적인 예에서, TRAF 변이체는 CD40 도메인의 일부이다("CD40*"로 표시됨).
[00137] 도 77a 내지 도 77c는 본원의 일부 구현예의 비제한적인 예시적인 단백질 작제물을 도시한다. 도 77a는 선택적 섹션, 결합 도메인, CD28 도메인, 및 TRAF 변이체를 갖는 CD40 도메인을 추가로 포함하는 보편적인 CoStAR 서열을 포함하는 단백질의 일반적인 개략도이다. 도 77b는 본원에 제공된 일부 구현예의 개략도이다. 도 77c는 본원에 제공된 일부 구현예의 서열 세트를 개략적으로 나타낸 것이다.
[00138] 도 78은 본원에 제공된 일부 구현예의 서열 세트를 도시한다(SEQ ID NO: 40839 내지 41074). 일부 구현예에서, 이러한 서열은 본원에 제공된 컨센서스 서열 또는 다른 TRAF 변이체 작제물로부터 제외된다(도 84 및 85에서의 것들이 제외되는 것을 포함함).
[00139] 도 79는 본원에 제공된 일부 구현예의 서열 세트를 도시한다(SEQ ID NO: 41075 내지 43474). 일부 구현예에서, 이러한 서열은 본원에 제공된 컨센서스 서열 또는 다른 TRAF 변이 작제물로부터 제외된다(도 84 및 85에서 제외되는 것을 포함함).
[00140] 도 80은 실시예 13에 기재된 바와 같이, 신호전달 모티프의 기능을 평가하기 위해 작제물 CTP195, CTP196, 및 CTP197을 사용한 CD40의 돌연변이 분석의 비제한적인 예를 도시한다.
[00141] 도 81은 실시예 13에 기재된 바와 같이, 신호전달 모티프의 기능을 평가하기 위해 작제물 CTP195, CTP196, CTP197, CTP198, 및 CTP199를 사용한 CD40의 돌연변이 분석의 비제한적인 예를 도시한다.
[00142] 도 82a는 표 1에 제시된 바와 같은 TRAF2 도메인에서 변이체의 정렬로부터 생성된 소수의 컨센서스 서열을 도시하며, 여기서, 강조 표시된 아미노산은 변이체에 걸쳐 보존된다.
[00143] 도 82b는 표 1에 제시된 바와 같은 TRAF2 도메인에서 변이체의 정렬로부터 생성된 주요 컨센서스 서열을 도시하며, 여기서, 강조 표시된 아미노산은 변이체에 걸쳐 보존된다.
[00144] 도 82c는 표 3에 제시된 바와 같은 TRAF6 도메인에서 변이체의 정렬로부터 생성된 컨센서스 서열을 도시하며, 여기서, 강조 표시된 아미노산은 변이체에 걸쳐 보존된다.
[00145] 도 83은 TRAF2 도메인(SEQ ID NO: 520 내지 679)에서 변이체의 비제한적인 예시적인 서열을 도시한다.
[00146] 도 84는 TRAF2/3 도메인(SEQ ID NO: 680 내지 839)에서 변이체의 비제한적인 예시적인 서열을 도시한다.
[00147] 도 85는 TRAF6 도메인(SEQ ID NO: 840 내지 40839)에서 변이체의 비제한적인 예시적인 서열을 도시한다.
[00148] 도 86a 내지 도 86d는 FOLR1-알파 CoStAR 및/또는 CD40 변이체와의 융합 단백질의 일부 구현예를 보여주는 개략도를 예시한다. 일부 일반적인 구현예가 도 86a에 도시되어 있다. 도 86b는 FOLR1-알파 CoStAR 또는 융합 단백질의 일부 구현예를 도시한다. 도 86c는 CoStAR 또는 융합 단백질의 일부 구현예를 도시한다. 도 86d는 CoStAR 또는 융합 단백질의 일부 구현예를 도시한다. 일부 구현예에서, 서열은 이의 전체로 구조를 기술하고, CoStAR 또는 융합 단백질을 기술하기 위해 추가의 기능적 양태는 요구되지 않는다. 일부 구현예에서, 도 28, 67, 77a 내지 77c, 83 내지 89d, 및 92(도 78 및 79의 것들을 제외함)의 것들을 포함하고, 표 2, 4 내지 5, 및 7 내지 14의 것들을 포함하고, SEQ ID NO: 42, 475 내지 479, 494 내지 498, 505, 510 내지 519, 및 840 내지 40839를 포함하는 것들, 및 컨센서스 서열 A 내지 C를 포함하는 본원에 제공된 임의의 CD40, TRAF2, TRAF2/3, 또는 TRAF6 변이체가 본 방법 및/또는 작제물 및/또는 단백질에서 사용될 수 있다.
[00149] 도 87a 내지 도 87d는 항-펨브롤리주맙 CoStAR 및/또는 CD40 변이체를 갖는 융합 단백질의 일부 구현예를 보여주는 개략도를 예시한다. 일부 일반적인 구현예는 도 87a에 도시되어 있다. 도 87b는 항-펨브롤리주맙 CoStAR 또는 융합 단백질의 일부 구현예를 도시한다. 도 87c는 CoStAR 또는 융합 단백질의 일부 구현예를 도시한다. 도 87d는 CoStAR 또는 융합 단백질의 일부 구현예를 도시한다. 일부 구현예에서, 서열은 그 전체로 구조를 기술하고, CoStAR 또는 융합 단백질을 기술하기 위해 추가의 기능적 양태는 요구되지 않는다. 일부 구현예에서, 도 28, 67, 77a 내지 77c, 83 내지 89d, 및 92의 것들을 포함하고(도 78 및 79의 것들을 제외함), 표 2, 4 내지 5, 및 7 내지 14의 것들을 포함하고, SEQ ID NO: 42, 475 내지 479, 494 내지 498, 505, 510 내지 519, 및 840 내지 40839를 포함하는 것들, 및 컨센서스 서열 A 내지 C를 포함하는 본원에 제공된 임의의 CD40, TRAF2, TRAF2/3, 또는 TRAF6 변이체가 본 방법 및/또는 작제물 및/또는 단백질에서 사용될 수 있다.
[00150] 도 88a 내지 도 88d는 CEA CoStAR 및/또는 CD40 변이체와의 융합 단백질의 일부 구현예를 보여주는 개략도를 예시한다. 일부 일반적인 구현예는 도 88a에 도시되어 있다. 도 88b는 CEA CoStAR 또는 융합 단백질의 일부 구현예를 도시한다. 도 88c는 CoStAR 또는 융합 단백질의 일부 구현예를 도시한다. 도 88d는 CoStAR 또는 융합 단백질의 일부 구현예를 도시한다. 일부 구현예에서, 서열은 그 전체로 구조를 기술하고, CoStAR 또는 융합 단백질을 기술하기 위해 추가의 기능적 양태는 요구되지 않는다. 일부 구현예에서, 도 28, 67, 77a 내지 77c, 83 내지 89d, 및 92의 것들을 포함하고(도 78 및 79의 것들을 제외함), 표 2, 4 내지 5, 및 7 내지 14의 것들을 포함하고, SEQ ID NO: 42, 475 내지 479, 494 내지 498, 505, 510 내지 519, 및 840 내지 40839를 포함하는 것들, 및 컨센서스 서열 A 내지 C를 포함하는 본원에 제공된 임의의 CD40, TRAF2, TRAF2/3, 또는 TRAF6 변이체가 본 방법 및/또는 작제물 및/또는 단백질에서 사용될 수 있다.
[00151] 도 89a 내지 도 89d는 CEA CoStAR 및/또는 CD40 변이체와의 융합 단백질의 일부 구현예를 보여주는 개략도를 예시한다. 일부 일반적인 구현예는 도 89a에 도시되어 있다. 도 89b는 MSLN CoStAR 또는 융합 단백질의 일부 구현예를 도시한다. 도 89c는 CoStAR 또는 융합 단백질의 일부 구현예를 도시한다. 도 89d는 CoStAR 또는 융합 단백질의 일부 구현예를 도시한다. 일부 구현예에서, 서열은 그 전체로 구조를 기술하고, CoStAR 또는 융합 단백질을 기술하기 위해 추가의 기능적 양태는 요구되지 않는다. 일부 구현예에서, 도 28, 67, 77a 내지 77c, 83 내지 89d, 및 92의 것들을 포함하고(도 78 및 79의 것들을 제외함), 표 2, 4 내지 5, 및 7 내지 14의 것들을 포함하고, SEQ ID NO: 42, 475 내지 479, 494 내지 498, 505, 510 내지 519, 및 840 내지 40839를 포함하는 것들, 및 컨센서스 서열 A 내지 C를 포함하는 본원에 제공된 임의의 CD40, TRAF2, TRAF2/3, 또는 TRAF6 변이체가 본 방법 및/또는 작제물 및/또는 단백질에서 사용될 수 있다.
[00152] 도 90a 내지 도 90c는 실시예 19에 개략적으로 기재된 바와 같이, CD40 변이체를 갖는 T 세포의 발현 후에 존재하는 사이토카인 TNF-알파(도 90a), IFN-감마(도 90b), 및 IL-2(도 90c)의 양을 도시한다.
[00153] 도 91a 및 도 91b는 실시예 20에 개략적으로 기재된 바와 같이, 작제물 CTP194-CTP200 중 하나를 발현하는 세포에서 IL-2 생산(도 91a) 및 배수 팽창(도 91b)을 도시한다.
[00154] 도 92는 본원에 기재된 바와 같은 단백질 작제물 CTP188-CTP202의 개략도를 도시한다.
[0060] 도 1 - 단일 공동자극 및 융합 공동자극 도메인 수용체의 구조적 구성. 청구범위에 기재된 CoStAR 수용체의 개략도가 도시되어 있다. 첫째로 단일 공동자극 수용체에 기반한 CoStAR, 및 둘째로 제2 공동자극 도메인에 융합된 전장 공동자극 수용체 신호전달 도메인으로 구성된 융합 CoStAR.
[0061] 도 2ai 내지 도 2e - 잠재적인 CoStAR 구성의 게놈 구성 - CoStAR은 도면에 도시되고 청구범위에 기재된 바와 같은 항원 결합 도메인, 선택적 스페이서 도메인 및 공동자극 도메인으로 구성된다. CoStAR은 (도 2ai 내지 도 2aii) 프로모터 단독으로부터 발현될 수 있고, CoStAR은 단일(도 2ai) 또는 융합(도 2aii) 공동자극 수용체로 구성되고; (도 2b) CoStAR의 직접 염색을 가능하게 하기 위해 N 또는 C-말단에서 에피토프 태그(예를 들어, His 태그, DYKDDDDK(SEQ ID NO:499) 등)로 발현될 수 있고; (도 2c) 2A 절단 서열 또는 내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 이용하여 분리된 마커 유전자와 함께; (도 2d) 제2 프로모터로부터 발현된 마커 유전자와 함께; (도 2e) 2A 절단 서열 또는 내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 이용하여 분리된 키메라 항원 수용체 또는 T-세포 수용체와 같은 고려되는 단백질과 함께; (도 2f) 제2 프로모터로부터 발현된 키메라 항원 수용체 또는 T-세포 수용체와 같은 관심 단백질과 함께 발현될 수 있다. CoStAR 및 마커 유전자/키메라 항원 수용체/T-세포 수용체/다른 관심 단백질이 배향 또는 3'(3-프라임) 또는 5'(5- 프라임)에서 서로 발현될 수 있다는 것이 충분한 지식을 갖는 개인에게 명백할 것이다.
[0062] 도 3a 내지 도 3e - LS174T 및 LoVo 종양 제시 항원에 반응한 T-세포에서 CoStAR의 기능적 활성. 공여자 1(도 3a 및 3d), 공여자 2(도 3b) 및 공여자 3(도 3c 및 3e)으로부터의 정상 공여자 T-세포 집단을 암종배야 항원을 표적화하는 CoStAR을 발현하도록 렌티바이러스 조작하고, CD34 자기 선택을 사용하여 이식 유전자가 풍부하도록 자기적으로 분류하였다. T-세포를 야생형 조작되지 않은 CEA+ 종양 세포(비-활성화 종양) 또는 세포 표면 고정된 항-CD3 단쇄 항체 단편(활성화 종양)을 발현하도록 조작된 CEA+ 종양 세포와 명시된 이펙터 대 표적비로 혼합하였고, IL-2를 ELISA에 의해 상청액에서 측정하였다. 데이터를 LS174T 세포(도 3a, 3b 및 3c) 및 LoVo(3d 및 3e)를 사용하여 획득하였다.
[0063] 도 4a 내지 도 4d - T-세포 증식에 대한 CoStAR의 효과. 5 × 105개의 형질도입된 T-세포 및 비-형질도입된 T-세포를 IL-2의 존재(도 4a) 및 부재(도 4b) 하에서 6.25 × 104개의 야생형 LoVo 또는 LoVo-OKT3 세포와 혼합하고, 3일 후에 세포 수를 계수하였다. 동일한 세포 비율 하에서의 또 다른 검정에서, 2명의 공여자로부터의 T-세포(도 4c 및 4d)에 증식 염료를 로딩하고, 세포가 겪은 증식 사이클의 수를 유세포 분석을 사용하여 6일 후에 염료 희석에 의해 결정하였다.
[0064] 도 5 - 일차 인간 T-세포에서 CoStAR 융합 수용체의 IL-2 활성. 7명의 공여자로부터의 정상 공여자 CD8+ T-세포(대조군 CoStAR는 3명의 공여자인 경우 제외)를 명시된 CEA-표적화 CoStAR로 렌티바이러스 형질도입하고, LoVo-OKT3 세포의 존재 하에 밤새 자극한 후 IL-2 생산을 평가하였다. IL-2 양성 세포의 비율을 CD34 음성(CoStAR 비-형질도입) 및 CD34+(CoStAR 형질도입) 집단 둘 모두에서 세포내 유동 염색을 사용하여 결정하였다. 별표는 * p<0.05로 페어드 Wilcoxon 부호 있는 순위 검정을 사용하여 형질도입된 집단과 비-형질도입된 집단 사이에 유의한 차이를 나타낸다.
[0065] 도 6a 내지 도 6d - 일차 인간 T-세포에서 CoStAR 활성의 다중 파라미터 분석. 정상 공여자 CD8+ T-세포를 명시된 CEA-표적화 CoStAR로 렌티바이러스로 형질도입시키고, LoVo-OKT3 세포의 존재 하에 밤새 자극 후 IL-2 생산을 평가하였다. IL-2(7명의 공여자)(도 6a), IFNγ(7명의 공여자)(도 6b), BCL-xL(5명의 공여자)(도 6c) 및 CD107a(6명의 공여자)(도 6d) 양성 세포의 비율을 CD34 음성(CoStAR 비-형질도입) 및 CD34+(CoStAR 형질도입) 집단 둘 모두에서 세포내 유동 염색을 사용하여 결정하였다. 대조군은 CoStAR을 표적화하는 비특이적 CA125이며 모든 경우에 3명의 공여자로부터 유래하였다. 히트 맵은 정의된 조건 하에 특정 판독에 대해 양성인 세포의 백분율과 관련된 칼라 강도를 갖는 모든 공여자의 평균이다.
[0066] 도 7 - CD40은 CD28-기반 CoStAR로부터 IL-2 생산을 향상시킨다. 3명의 건강한 공여자로부터의 일차 인간 T-세포는 비-형질도입된 상태로 유지되거나 세포외 도메인 말단절단된 CD28(Tr CD28), 전장 CD28(FL CD28), 또는 CEA 특이적 scFv를 보유하는 CD28.CD40-기반 CoStAR(MFE23)로 형질도입되었다. 형질도입된 세포를 CD34 마커 유전자를 사용하여 선택하고 분석 전에 확장시켰다. ELISA에 의한 IL-2 생산의 분석 전에 T-세포를 20시간 동안 CEA+ LoVo 세포를 발현하는 OKT3과 8:1 이펙터 대 표적 비율로 혼합하였다.
[0067] 도 8 - CoStAR-매개된 T-세포 확장에 대한 신호전달 도메인 및 표적 항원의 효과. T-세포를 CA125, FolR 또는 CEA 특이적 scFv를 보유하는 DYKDDDDK(SEQ ID NO:449) 에피토프-태깅된 CD28 또는 CD28.CD40 기반 CoStAR, 또는 FolR 특이적 결합 펩티드(C7)로 형질도입하였다. T-세포를 OKT3 발현 CA125+/FolR+/CEA- 세포주 OVCAR3와 혼합하였다. 형질도입된 세포의 수를 최대 21일까지 7일마다 계수하였고, 각 계수 후에 새로운 OVCAR3 세포를 첨가하였다.
[0068] 도 9 - CoStAR-매개된 T-세포 확장에 대한 신호전달 도메인 및 표적 항원의 효과. T-세포를 CA125, FolR 또는 CEA 특이적 scFv를 보유하는 DYKDDDDK(SEQ ID NO:449) 에피토프-태깅된 CD28 또는 CD28.CD40 기반 CoStAR, 또는 FolR 특이적 결합 펩티드(C7)로 형질도입하였다. T-세포를 CA125+/FolR+/CEA- 세포주 OVCAR3을 발현하는 OKT3과 혼합하였다. 형질도입된 세포의 수를 최대 21일까지 7일마다 계수하였고, 각 계수 후에 새로운 OVCAR3 세포를 첨가하였다.
[0069] 도 10a 및 도 10b - (도 10a 및 10b) CD40 기반 CoStAR은 TCR-전달 모델에서 T-세포의 공동자극을 향상시킨다. 3명의 건강한 공여자로부터의 일차 인간 T-세포를 CEA 특이적 TCR과 함께 MFE(열린 또는 닫힌 원) 또는 CA125(열린 사각형) 특이적 scFv를 보유하는 DYKDDDK-태깅된 CD28 또는 CD28.CD40 기반 CoStAR로 형질도입하였다. T-세포를 CEA+/CA125-H508 세포와 1:1 이펙터:표적 비로 혼합하고, TCR+/CoStAR+, TCR+/CoStAR-, TCR-/CoStAR+ 및 TCR-/CoStAR- 집단에서 반응하는 CD4+ 또는 CD8+ T-세포의 수를 결정하기 위해 세포내 사이토카인 염색을 수행하였다. 활성의 유의한 차이를 결정하기 위해 2원 ANOVA(Tukeys 시험)를 수행하였다: *p>0.05, ** p>0.01, *** p>0.001, **** p>0.0001.
[0070] 도 11은 본 발명의 공동자극 분자를 발현하도록 형질도입된 일차 인간 T-세포의 농축 및 확장을 도시한 것이다. MFE23은 암종배아 항원(CEA)에 대해 높은 친화성을 갖는 단쇄 Fv 항체이다. 일차 인간 T-세포를 각각 2A 절단 펩티드에 의해 분리된 CD34 마커 유전자를 보유하는 MFE23.CD28 또는 MFE23.CD28.CD40 CoStAR로 모의 형질도입되거나 형질도입되었다. 시험관내 배양 후, MACS™ 상자성 선택 시약(Miltenyi Biotech)을 사용하여 세포를 CD34에 대해 농축시킨 다음, 조사된 피더 세포를 사용하여 세포 수를 확장시켰다. 3명의 공여자 중 하나로부터의 예시적인 플롯이 제시된다.
[0071] 도 12a 내지 도 12d는 자극 및 외인성 IL-2에 반응하여 본 발명의 공동자극 분자로 형질도입된 T-세포의 확장을 도시한다. 세포를 모의 형질도입하거나 MFE23.CD28 또는 MFE23.CD28.CD40 CoStAR로 형질도입하고 외인성 IL-2의 존재(200 IU/ml) 또는 부재 하에 8:1 이펙터:표적 비로 LoVo-OKT3 세포와 공동배양하였다. 1, 4, 7, 11 및 18일에 세포를 취하고 MACSQuant 유세포 분석기에서 항-CD2 시약을 사용하여 살아있는 T-세포의 수를 열거하였다. (도 12a) 종양 및 IL-2 세포에 의한 자극의 부재 하에, 예상되는 바와 같이 수가 감소하였다. (도 12b) 자극은 없지만 IL-2의 존재 하에서, 세포의 보다 분명한 생존이 있었지만 특이적 성장은 없었다. (도 12c) 종양의 존재 및 IL-2 부재 하에서, 모의 세포는 특이적 생존을 나타내지 않았다. MFE23.CD28 CoStAR은 처음 4일 동안 팽창의 명백한 배가를 매개한 후 감소하였다. MFE23.CD28.CD40은 7일까지 더 큰 팽창을 매개한 후 꾸준히 감소하였다. (도 12d) 동일한 조건 그러나 IL-2의 존재 하에, 모의 및 MFE23.CD28 형질도입된 세포 둘 모두는 18일에 걸쳐 20배 확장을 입증한 반면, MFE23.CD28.CD40 세포는 60배 초과로 확장되었다. 따라서, CD28.CD40 기반 수용체는 외인성 IL-2의 존재 및 부재 둘 모두에서 자극 조건 하에 우수한 확장 및 생존을 입증한다.
[0072] 도 13a 내지 도 13m은 모의, MFE23.CD28 또는 MFE23.CD28.CD40 조작된 T-세포에 의한 사이토카인 생산을 도시한다. T-세포/종양 공동배양물로부터 수득된 상청액에 대해 비드 어레이 분석을 수행하였다. 조작된 T-세포를 LoVo-OKT3 세포와 1:1 이펙터:표적 비로 24시간 동안 인큐베이션하고 상청액을 수집하였다. 컨디셔닝된 상청액을 또한 동일한 수의 T-세포 단독, 또는 LoVo-OKT3 세포 단독으로부터 수집하였다. 사이토카인 생산을 Legendplex™ 인간 TH1/TH2 사이토카인 패널(Biolegend)을 사용하여 분석하였다. (도 13a) IL-2; (도 13g) IFN-γ; (도 13c) TNFα; (도 13d) IL-4; (도 13e) IL-5; (도 13f) IL-13; (도 13g) IL-17A; (도 13h) IL-17F; (도 13i) IL-22; (도 13j) IL-6; (도 13k) IL-10; (도 13l) IL-9; (도 13m) IL-21. 사이토카인은 T-세포 또는 종양 단독으로부터의 배지에서 매우 낮거나 검출불가능하였다. 종양과 공동배양될 때, 사이토카인 생산이 향상되었다. MFE23.CD28은 모의와 비교하여 IL-2, IL-5, IL-17A/17F, IL-10, IL-9 및 IL-21의 생산을 향상시켰다. MFE23.CD28.CD40은 또한 TNFα, IL-13 및 IL-22의 생산을 향상시켰다. MFE23.CD28.CD40 및 MFE23.CD28(IL-2, IL-9 및 IL-17F)에 의해 제공되는 것보다 많은 수의 사이토카인의 생산을 추가로 향상시킬 뿐만 아니라 MFE23.CD28(IL-5 및 IL-10)과 함께 일부 사이토카인의 생산을 관찰된 수준 미만으로 감소시켰다. 이와 함께, 데이터는 CD28-기반 공동자극 수용체에 대한 CD40의 첨가가 케모카인 생산과 관련하여 이들의 특정 활성을 향상 및/또는 조절함을 입증한다.
[0073] 도 14a 내지 도 14m은 Legendplex™ 인간 전염증성 케모카인 패널을 사용한 케모카인의 분석을 도시한다. (도 14a) IL-8(CXCL8); (도 14b) IP-10(CSCL10); (도 14c) 에오탁신(CCL11); (도 14d) TARC(CCL17); (도 14e) MCP-1(CCL2); (도 14f) RANTES(CCL5); (도 14g) MIP-1a(CCL3); (도 14h) MIG(CXCL9); (도 14i) ENA-78 (CXCL5); (도 14j) MIP-3α(CCL20); (도 14k) GROα(CXCL1); (도 14l) I-TAC(CXCL11); (도 14m) MEP-1β(CCL4). 케모카인은 T-세포 단독으로부터의 배지에서 매우 낮거나 검출불가능하였다. 종양과 공동배양될 때, 케모카인 생산이 향상되었다. MFE23.CD28은 모의와 비교하여 CXCL5, CXCL10, CXCL11, CCL17 및 CCL20의 생산을 향상시켰다. MFE23.CD28.CD40은 또한 CCL2, CXCL1 및 CXCL9의 생산을 향상시켰다. MFE23.CD28.CD40은 MFE23.CD28(CXCL1, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CCL17, CCL2, CXCL9, CCL5 및 CCL20)에 의해 제공되는 것보다 많은 수의 사이토카인의 생산을 추가로 향상시킬 뿐만 아니라 MFE23.CD28(CCL4)에서 관찰된 수준 미만으로 일부 사이토카인의 생산을 감소시켰다. 이와 함께, 데이터는 CD28-기반 공동자극 수용체에 대한 CD40의 첨가가 케모카인 생산과 관련하여 이들의 특정 활성을 향상 및/또는 조절함을 입증한다.
[0074] 도 15a 내지 도 15h는 FolR 또는 CA125 반응성 scFv를 보유하는 CoStAR을 사용한 난소 CoStAR 조작된 세포의 기능적 활성을 도시한다(각각 MOV19 & 196-14). 인간 폴레이트 수용체 알파(FolR)는 난소, 두경부, 신장 및 폐를 포함하는 다수의 종양에 대한 적합한 표적을 나타내고, CA125는 난소암에 대한 대안적인 표적을 나타낸다. 6명의 건강한 공여자로부터의 일차 인간 T-세포를 196-14.CD28, 196-14.CD28.CD40, MOV19.CD28 또는 MOV19.CD28.CD40 수용체로 조작하였고, 이러한 수용체 모두는 검출을 위한 DYKDDDDK 에피토프 태그를 보유하였다. 에피토프 태그 양성 및 음성 집단에서 세포내 염색을 사용하여 이펙터 활성의 분석 전에 형질도입된 세포를 FolR+/CA125+ OVCAR-OKT3 세포와 혼합하였다. IL-2(도 15a 및 15b), TNFα(도 15c 및 15d), CD137(도 15e 및 15f), 및 BCL-xL(도 15g 및 15h)의 생산에 의해 결정된 이펙터 활성의 특이적 향상은 MOV19.CD28.CD40과 비교하여 관찰되지 않은 MOV19.CD28에 의한 특이적 BCL-xL 유도를 제외하고, CA125 및 FolR 둘 모두에 반응하여 CD28 및 CD28.CD40 조작된 세포에서 관찰되었다.
[0075] 도 16a 내지 도 16f는 MOV19.CD28.CD40 CoStAR로 모의 형질도입되거나 조작된 후 환자 매칭된 종양 분해물과 혼합된 모의 3개의 TIL 집단을 도시한다. 공여자 종양은 음성(도 16a), 낮은 발현(도 16b)에서 높은 발현(도 16c)까지의 범위로, 분해물에서 다양한 수준의 FolR을 나타내었다. FolR 음성 분해물에 대해 매칭된 CoStAR 조작된 TIL의 모의 및 CoStAR 음성 TIL은 CoStAR의 존재에 의해 향상되지 않은 종양 공동배양 후 유사한 수준의 CD137 상향조절을 입증하였다(도 16d). FolR 저발현 분해물에 노출된 TIL에서, CoStAR-에 비해 CoStAR+ 세포에서 활성의 향상이 있었고, CD137 발현은 <10%에서> 20%로 증가하였다(도 16e). FolR 고 종양 분해물에 노출된 TIL에서, CoStAR- 집단에서 대략 20%로부터, CoStAR+ 집단에서 대략 50%까지의 활성 증가가 있었다(도 16f).
[0076] 도 17a 내지 도 17c는 이펙터 기능의 향상을 도시한다. CoStAR을 표적화하는 FolR은 FolR+ 종양 분해물 반응하여, CD137 발현을 ~20%에서 ~50%로 향상시켰고(도 17a), TNFα 생산을 10%에서 15%로 향상시켰고(도 17b), IL-2 생산을 2%에서 5%로 향상시켰다(도 17c).
[0077] 도 18a 내지 도 18f는 가용성 리간드가 이펙터 기능을 억제하지 않는 것을 도시한다. 3명의 건강한 공여자로부터의 T-세포를 MOV19.CD28 또는 MOV19.CD28.CD40 CoStAR로 조작하고, 고정화된 OKT3으로 활성화시켜 FolR의 부재 하에 자극을 제공하거나, OvCAR-OKT3으로 활성화시켜 TCR 및 CoStAR 활성을 제공하였다. BCL-xL 활성은 OKT3 자극 후 3명의 공여자에 걸쳐 10 내지 20% 증가한 반면(도 18a) IL-2는 0 내지 12% 증가하였고(도 18b), TNFα는 0 내지 20% 증가하였다(도 18c). 외인성 가용성 FolR의 존재는 이러한 특정 이펙터 기능 중 어느 것도 향상시키지 않았다. OvCAR-OKT3의 존재 하에서, BCL-XL 유도는 CD28 CoStAR에서 약 20%만큼 향상되었지만, CD28.CD40 CoStAR에서는 약 35% 향상되었고(도 18d), IL-2 유도는 CD28 CoStAR에서 약 20%만큼 향상되었지만 CD28.CD40 CoStAR에서는 30 내지 50%만큼 향상되었고(도 18e), TNFα 생산은 CD28 CoStAR에서 20 내지 30% 및 CD28.CD40 CoStAR에서 25 내지 50% 향상되었다(도 18f). 외인성 가용성 FolR은 이러한 이펙터 기능 중 어느 것에도 억제 효과를 나타내지 않았다.
[0078] 도 19는 HD T 세포의 표면에서 항-MSLN CoStAR 발현의 표면 발현을 도시한 것이다. 형질도입 및 비-형질도입된(MOCK) 세포는 급속 확장 프로토콜(REP)을 거쳤고, 항-CD34-APC(검정색) 또는 항-MSLN-PE(적색) 항체를 사용하여 마커 유전자 tCD34(말단절단된 CD34) 또는 CoStAR 분자의 표면 검출을 통해 형질도입 효율에 대해 평가되었다. 결과는 3개의 생물학적 복제물을 나타낸다.
[0079] 도 20a 내지 도 20c는 항-MSLN CoStAR로 형질도입되고 OVCAR-3 세포주와 공동배양된 건강한 공여자(HD) T 세포에서의 사이토카인 발현을 도시한다. 6개의 상이한 항-MSLN scFv(SS1, M5, HN1, M912, huYP218, P4) 및 3개의 상이한 스페이서/막횡단 도메인(CD28, N-말단 절단된 CD28, CD8)의 조합을 포함하는 CoStAR을 비교하였다. 구조적 세부사항은 표 8, 표 9, 및 표 10에 제공된다. OVCAR-3 또는 OVCAR3-OKT3 세포주와의 공동배양 후 (도 20a) IL-2, (도 20b) IFNγ, 및 (도 20c) TNFα에 대한 사이토카인 농도를 나타내었다. 처리되지 않은 T 세포를 대조군으로 사용하였다. 결과는 각각 3개의 기술적 복제물을 갖는 1 내지 3개의 생물학적 복제물을 나타낸다.
[0080] 도 21a 내지 도 21c는 항-MSLN CoStAR로 형질도입되고 K562 세포주와 공동배양된 건강한 공여자(HD) T 세포에서의 사이토카인 발현을 도시한다. 6개의 상이한 항-MSLN scFv(SS1, M5, HN1, M912, huYP218, P4) 및 3개의 상이한 스페이서/막횡단 도메인(CD28, N-말단 절단된 CD28, CD8)의 조합을 포함하는 CoStAR을 비교하였다. 구조적 세부사항은 표 8, 표 9 및 표 10에 제공된다. K562-MSNL 또는 K562-MSNL-OKT3 세포주와의 공동배양 후 (도 21a) IL-2, (도 21b) IFNγ 및 (도 21c) TNFα에 대한 사이토카인 농도를 제시하였다. 처리되지 않은 T 세포를 대조군으로 사용하였다. 결과는 각각 3개의 기술적 복제물을 갖는 1 내지 3개의 생물학적 복제물을 나타낸다.
[0081] 도 22는 6개의 상이한 분비 신호 펩티드(OSM1, CD8, CD2, IL2, GMCSF, hIgGκ)로 발현된 MFE23 scFV 항-CEA CoStAR의 표면 발현을 도시한다. 구조적 세부사항은 표 11에 제공된다. 확장 후, 각각 항-CD34-APC(검정색 막대)를 사용하여 마커 유전자 말단절단된 CD34(tCD34) 또는 CoStAR 분자의 표면 검출을 통해 또는 또는 이차 항-IgG-Fc-PE(회색 막대) 항체를 갖는 일차 rhCEACAM5-Fc 항체를 사용하여 세포를 형질도입 효율에 대해 평가하였다.
[0082] 도 23은 6개의 상이한 항-CEA scFv(MFE23, MFE23(Q>K), hMFE23, CEA6, BW431/26, hT84.66)를 포함하는 CoStAR의 표면 발현을 도시한다. 구조적 세부사항은 표 12에 제공된다. 확장 후, 각각 항-CD34-APC(검정색 막대)를 사용하여 마커 유전자 말단절단된 CD34(tCD34) 또는 CoStAR 분자의 표면 검출을 통해 또는 이차 항-IgG-Fc-PE(회색 막대) 항체를 갖는 일차 rhCEACAM5-Fc 항체를 사용하여 세포를 형질도입 효율에 대해 평가하였다.
[0083] 도 24a 내지 도 24c는 항-CEA CoStAR(MFE23, MFE23(Q>K), hMFE23, CEA6, BW431/26, hT84.66)로 형질도입되고 LoVo 세포주와 공동배양된 건강한 공여자(HD) T 세포에 의한 사이토카인 생산을 도시한다. 구조적 세부사항은 표 12에 제공된다. 사이토카인 농도는 Lovo 또는 Lovo-OKT3 세포주와의 공동배양 후 (도 24a) IL-2, (도 24b) IFNγ, 및 (도 24c) TNFα에 대해 나타내었다. 처리되지 않은 T 세포를 음성 대조군으로 사용하였다.
[0084] 도 25a 내지 도 25c는 항-CEA CoStAR(MFE23, MFE23(Q>K), hMFE23, CEA6, BW431/26, hT84.66)로 형질도입되고 K562 세포주와 공동배양된 건강한 공여자(HD) T 세포에서의 사이토카인 생산을 도시한다. 사이토카인 농도는 K562.CEACAM5(신호 2) 또는 K562.CEACAM5.OKT3(신호 1+2) 세포주와의 공동배양 후 (도 25a) IL-2, (도 25b) IFNγ, 및 (도 25c) TNFα에 대해 나타내었다. 처리되지 않은 T 세포를 음성 대조군으로 사용하였다.
[0085] 도 26은 3개의 상이한 스페이서/막횡단 도메인으로 발현된 hMFE23 scFV 항-CEA CoStAR의 표면 발현을 도시한다. 구조적 세부사항은 표 13에 제공된다. 확장 후, 항-CD34-APC(검정색 막대)를 사용하여 마커 유전자 말단절단된 CD34(tCD34)의 표면 검출을 통해 또는 이차 항-IgG-Fc-PE 항체(회색 막대)를 갖는 일차 rhCEACAM5-Fc 항체를 사용하여 CoStAR 분자의 표면 검출을 통해 세포를 형질도입 효율에 대해 평가하였다.
[0086] 도 27a 내지 도 27c는 MFE23 scFV 항-CEA 스페이서 변이체에 의한 사이토카인 생산을 도시한다. Lovo 또는 Lovo.OKT3 세포주와의 공동배양 후 (도 27a) IL-2, (도 27b) IFNγ, 및 (도 27c) TNFα에 대한 사이토카인 농도를 제시하였다. 처리되지 않은 T 세포를 대조군으로 사용하였다.
[0087] 도 28은 CD40, CD134, CD137, CD2, ICOS, DAP10 및 NTRK1 신호전달 요소를 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 갖는 hMFE23 CEA-결합 도메인을 포함하는 항-CEA CoStAR을 도시한다.
[0088] 도 29는 도 28에 도시된 도메인 조합을 포함하는 hMFE23 scFV 항-CEA CoStAR의 표면 발현을 도시하고 도 29에 상세히 도시되어 있다. 확장 후, 항-CD34-APC(검정색 원)를 사용하여 마커 유전자 말단절단된 CD34(tCD34)의 표면 검출을 통해 또는 이차 항-IgG-Fc-PE 항체(적색 원)를 갖는 일차 rhCEACAM5-Fc 항체를 사용하여 CoStAR 분자의 표면 검출을 통해 세포를 형질도입 효율에 대해 평가하였다. 결과는 3개의 생물학적 복제물을 나타낸다.
[0089] 도 30은 3개의 개별 공여자에서 CoStAR 형질감염된 HD T 세포의 T 세포 표현형을 도시한 것이다. 세포를 CD34 마이크로비드를 사용하여 분류하고 14일 동안 급속 확장 프로토콜(REP)을 거쳤다. 파생물 및 REP 후, 1×105 세포를 유세포 분석을 사용하여 분화 하위타입에 대해 평가하였다. Tcm, 중심 기억 T 세포; Tem, 이펙터 메모리 T 세포; Tn, 나이브 T 세포; Tscm; 줄기 세포 기억 T 세포; Tte, 말단 이펙터 T 세포. T 세포 하위타입 정의에 대해서는 표 15가 참조된다.
[0090] 도 31a 내지 도 31c는 K562 세포주와 공동배양된 hMFE23 scFV 항-CEA CoStAR 형질도입된 HD T 세포에 의한 사이토카인 생산을 도시한다. K562.CEACAM5(신호 2) 또는 K562.CEACAM5.OKT3(신호 1+2) 세포주와의 공동배양 후 (도 31a) IL-2, (도 31b) IFNγ, 및 (도 31c) TNFα에 대한 사이토카인 농도를 제시하였다. 처리되지 않은 T 세포를 대조군으로 사용하였다.
[0091] 도 32a 내지 도 32c는 hMFE23 scFV 항-MSLN CoStAR로 형질도입되고 K562 세포주와 공동배양된 HD T 세포에서의 사이토카인 발현을 도시한다. K562.CEACAM5(신호 2) 또는 K562.CEACAM5.OKT3(신호 1+2) 세포주와의 공동배양 후 (도 32a) IL-2, (도 32b) IFNγ, 및 (도 32c) TNFα 발현 세포의 빈도를 제시하였다. 처리되지 않은 T 세포를 대조군으로 사용하였다.
[0092] 도 33은 K562.CEACAM5.OKT3(신호 1+2) 세포주와 공동배양된 hMFE23 scFV 항-MSLN CoStAR로 형질도입된 HD T 세포의 증식을 도시한다. HD T 세포를 2명의 공여자로부터 조달하였다. 숫자는 입력 세포의 배수 확장을 나타낸다.
[0093] 도 34는 K562.CEACAM5.OKT3(신호 1+2) 세포주와 공동배양된 hMFE23 scFV 항-MSLN CoStAR로 형질도입된 HD T 세포의 증식을 도시한다. HD T 세포를 2명의 공여자로부터 조달하였다. 숫자는 자극 후 6일에 입력 세포의 배수 확장을 나타낸다.
[0094] 도 35a 및 도 35b는 TRAF 및 TRAF-유사 결합 부위 및 모티프 및 신호전달 경로를 도시한다. 도 35a는 TRAF 결합 부위 및 신호전달을 나타내는 CoStAR CD40 세포내 도메인을 도시한다. 도 35b는 IProx 도메인을 포함하는 CoStAR을 도시한다.
[0095] 도 36a 및 도 36b는 LoVo.OKT3과 공동배양된 CD28.CD40 CoStAR 형질도입된 T 세포의 사이토카인 분비 및 장기 생존 및 증식에 대한 CoStAR CD40 세포내 신호전달 도메인에서의 돌연변이의 효과를 도시한 것이다. 3명의 공여자의 세포를 Dynabeads로 활성화시키고 WT CD28.CD40(CTP194), TRAF2 결합 부위 돌연변이 SVQE>AVQA(CTP195)를 함유하는 CD28.CD40, TRAF2/TRAF3 결합 부위 돌연변이 PVQET>AVAEA(CTP196), TRAF6 결합 부위 돌연변이 PQEINF>AQAINF(CTP197), Q263A(CTP199)로 형질도입하거나 모의 형질도입하였다. (도 36a) IL-2를 LoVo 또는 LoVo.OKT3.GFP 종양 세포와 IL-2의 부재 하에 공동배양 24시간 후에 수집된 상청액에서 측정하였다. (도 36b) 6 내지 8일 후에 생존력 및 절대 계수를 평가하고, 살아있는 T 세포를 새로운 LoVo.OKT3.GFP 종양 세포로 추가 주 동안 재접종하였다. 장기 공동배양의 말미에, 생존율 및 절대 계수를 측정하고, 배수 확창을 계산하였다. 데이터는 3회 분석된 n3 공여자의 평균 +/- SEM으로 나타낸 것이다.
[0096] 도 37a 및 도 37b는 1일에 해동된 OC 샘플에서 CD2+ 염색을 기초로 한 TIL의 백분율(도 37a) 및 총 TIL 계수(도 37b)를 도시한다.
[0097] 도 38은 비-Td 및 Td TIL의 성장을 도시한다. Novocyte 3005에서 CD2 및 DRAQ7 염색 및 획득을 사용하여 세포를 계수하였다. 25일에 REP 종료시 세포 수를 그래프로 나타내었다. 5개의 난소암 샘플 각각에 상응하는 형상이 도시되어 있다. 채워진 형태는 비-Td이고 개방된 형태는 Td TIL이다. 통계 분석은 페어드 t-테스트를 사용하여 수행되었다.
[0098] 도 39a 내지 도 39d는 CoStAR 변형된 TIL의 세포당 형질도입 효율 및 바이러스 통합을 도시한다. 비-형질도입된(비-Td) 및 항-FOLR1 CoStAR 형질도입된(Td) TIL을 CD3+(도 39a), CD4+(도 39b) 및 CD8+(도 39c) 세포 집단에서 REP 후 25일째에 형질도입 효율에 대해 평가하였다. 바이러스 복사체 수(VCN)를 바이러스 통합을 결정하기 위해 평가하였다(도 39d). 5개의 난소암 샘플 각각에 상응하는 형상이 도시되어 있다. 채워진 형태는 비-Td이고 투명한 형태는 Td TIL이다.
[0099] 도 40은 REP-후 TIL에서 CD4 및 CD8 집단을 도시한 것이다. 비-형질도입된(비-Td) 및 항-FOLR1 CoStAR-형질도입된(Td) 및 항-FOLR1 CoStAR+ Td TIL을 유세포분석을 사용하여 REP 후 D25에 CD4 및 CD8 조성물에 대해 평가하였다. 검정 후 매칭된 Tukey의 다중 비교와 함께 이원 ANOVA를 사용하여 통계적 분석을 수행하였다.
[00100] 도 41a 내지 도 41c는 TIL의 분화 상태에 대한 CoStAR 변형의 효과를 도시한 것이다. 비-형질도입된(비-Td), 항-FOLR1 CoStAR-형질도입된(Td) TIL 및 항-FOLR1 CoStAR+ Td TIL을 총 T 세포(도 41a), CD4+(도 41b) 및 CD8+(도 41c) 세포 집단으로부터 REP 후 D25에 이들의 분화 상태에 대해 평가하였다. 매칭된 Tukey의 다중 비교 시험과 함께 이원 ANOVA를 사용하여 통계 분석을 수행하였다. CD3+(도 41a) 및 CD4+(도 41b) 집단에 대한 항-FORL1 CoStAR-Td TIL과 항-FOLR1 CoStAR+ Td TIL 사이의 Tscm 집단에 대해 통계적 유의성을 관찰하였다. *p<0.05
[00101] 도 42a 및 도 42b는 공동-억제 또는 공동-자극 마커 발현에 대한 TIL의 CoStAR 변형 효과를 도시한다. 비-형질도입된(비-Td), 항-FOLR1 CoStAR-형질도입된(Td) TIL 및 항-FOLR1 CoStAR+ Td TIL을 CD4+(도 42a) 및 CD8+(도 42b) 세포 집단에서 공동-억제 및 공동-자극성 마커의 발현에 대해 평가하였다. 5개의 난소암 샘플 각각에 상응하는 모양은 충전물에 관계없이 도시되어 있다. 흑색, 암회색 및 밝은 회색 막대는 각각 비-Td TIL, 항-FOLR1 CoStAR-Td 및 항-FOLR1 CoStAR+ Td TIL을 나타낸다. 검정 후 매칭된 Tukey의 다중 비교와 함께 이원 ANOVA를 사용하여 통계적 분석을 수행하였다. *p<0.05
[00102] 도 43a 및 도 43b는 TIL에서 TCRαβ, TCRγδ 및 Treg 빈도에 대한 CoStAR 변형의 효과를 도시한다. 비-형질도입된(비-Td), 항-FOLR1 CoStAR-형질도입된(Td) TIL 및 항-FOLR1 CoStAR+ Td TIL을 CD3+ 세포 집단(도 43a)에서 TCRαβ(CD3+TCRαβ+), 및 TCRγδ(CD3+TCRγδ+)의 빈도에 대해 평가하였다. CD4+ 하위집단에서 Treg의 빈도를 또한 평가하였다(도 43b). 5개의 난소암 샘플 각각에 상응하는 모양은 충전물에 관계없이 도시되어 있다. 흑색, 암회색 및 밝은 회색 막대는 각각 비-Td TIL, 항-FOLR1 CoStAR-Td TIL 및 항-FOLR1 CoStAR+ Td TIL을 나타낸다. 통계 분석을 검정 후 일치된 Tukey의 다중 비교와 함께 이원 ANOVA(도 43a) 및 Friedman의 사후 검정을 사용한 일원 ANOVA(도 43b)를 사용하여 수행하였다.
[00103] 도 44a 내지 도 44c는 유사분열 활성화 시 사이토카인 생산에 대한 TIL의 CoStAR 변형 효과를 도시한다. 비-형질도입된(비-Td), 항-FOLR1 CoStAR-형질도입된(Td) TIL 및 항-FOLR1 CoStAR+ Td TIL을 CD3+에서(도 44a), CD4+(도 44b) 및 CD8+(도 44c) 세포 집단에서 PMA(50 ng/mL)/이오노마이신(1 ㎍/mL)으로 4시간 자극시 사이토카인의 생산에 대해 평가하였다. 5개의 OC 샘플 각각에 상응하는 형상은 충전과 무관하게 도시되어 있다. 흑색, 암회색 및 밝은 회색 막대는 각각 비-Td TIL, 항-FOLR1 CoStAR-Td TIL 및 항-FOLR1 CoStAR+ Td TIL을 나타낸다. 매칭된 Tukey의 다중 비교 후-시험과 함께 이원 ANOVA를 사용하여 통계적 분석을 수행하였다. * p≤0.05, *** p≤0.001.
[00104] 도 45는 OC 분해물 세포에서의 FOLR1의 발현을 도시한다. 동결보존된 자가 종양 분해물을 해동하고 유세포분석에 의해 분석하여 각 공여자의 FOLR1의 표면 발현을 결정하였다. 연구에 사용된 5명의 공여자 모두가 제시된다. 약어: OC, 난소암, FOLR1, 폴레이트 수용체 알파; FOLR1 PE, PE에 컨쥬게이션된 항-FOLR1 항체; PE, 피코에리트린.
[00105] 도 46a 내지 도 46d는 자가 종양과의 공동배양시 사이토카인 생산 세포에 대한 CoStAR 변형의 효과를 도시한다. 비-Td 및 항-FOLR1 CoStAR Td TIL을 자가 종양 분해물과 함께 16시간 동안 공동배양하고, 세포내 유세포 분석을 수행하여 사이토카인을 생산하는 세포의 비율을 평가하였다. IL-2 양성(도 46a) CD4 및 (도 46b) CD8 TIL의 빈도 뿐만 아니라 TNFα 양성 (도 46c) CD4 및 (도 46d) CD8 TIL의 빈도를 평가하였다. 결과는 각각 3개의 기술적 복제물을 갖는 5개의 생물학적 복제물을 나타낸다. Tukey의 다중 비교 시험과 함께 이원 ANOVA를 사용하여 통계적 분석을 수행하였다. *P <0.05.
[00106] 도 47a 내지 도 47e는 FOLR1을 발현하는 자가 종양 분해물과의 공동배양시 사이토카인 분비에 대한 CoStAR 변형의 효과를 도시한다. 비-Td 및 항-FOLR1 CoStAR 형질도입된(Td) TIL을 자가 종양 분해물과 24시간 동안 공동배양한 후, 상청액을 수집하고 MSD 면역검정을 사용하여 사이토카인 분비에 대해 분석하였다. 그래프는 공동배양 상청액에서 (도 47a) IL-2, (도 47b) TNFα, (도 47c) IL-13 및 (도 47d) IFNγ의 측정된 농도를 나타낸다. (도 47e) 도 1에서 결정된 바와 같은 자가 분해물에 의한 IFNγ 농도와 FOLR1 발현 사이의 상관관계. 결과는 각각 3개의 기술적 복제물을 갖는 5개의 생물학적 복제물을 나타낸다. Sidak의 다중 비교 시험과 함께 이원 ANOVA를 사용하여 통계 분석을 수행하였다. 상관관계 분석을 단순 선형 회귀를 사용하여 수행하였다. *P <0.05, **P <0.01, ***P<0.001.
[00107] 도 48은 자가 종양 분해물과의 공동배양에서 MHC-의존성 CoStAR 기능성의 평가를 도시한 것이다. 비-Td 및 항-FOLR1 CoStAR 형질도입된(Td) TIL을 MHC 차단 시약 또는 이소타입 대조군의 존재 하에 자가 종양 분해물과 24시간 동안 공동배양하였다. 이어서, 상청액을 MSD 면역검정을 사용하여 IFNγ 사이토카인 생산에 대해 분석하였다. 결과는 각각 3개의 기술적 복제물을 갖는 3개의 생물학적 복제물을 나타낸다. Tukey의 다중 비교 시험과 함께 이원 ANOVA를 사용하여 통계적 분석을 수행하였다.
[00108] 도 49a 및 도 49b는 조작된 세포주와의 공동배양시 사이토카인 생산 세포 빈도에서 CoStAR 변형의 효과를 도시한다. 비-Td 및 항-FORL1 CoStAR 형질도입된(Td) TIL을 조작된 표적 세포주와 16시간 동안 공동배양하고, 사이토카인 생산 세포를 세포내 유세포 분석을 사용하여 측정하였다. K-562(좌) 및 OVCAR-3(우) 유래된 계통과의 공동배양 후 CD4+(상부) 및 CD8+(하부) TIL에서 IL-2 양성 (도 49a)의 빈도. K-562(좌) 및 OVCAR-3(우) 유래된 계통과의 공동배양 후 CD4+(상부) 및 CD8+(하부) TIL에서 TNFα 양성 (도 49b)의 빈도. 결과는 각각 3개의 기술적 복제물을 갖는 5개의 생물학적 복제물을 나타낸다. Tukey의 다중 비교 시험과 함께 이원 ANOVA를 사용하여 통계적 분석을 수행하였다. *P <0.05, **P <0.01, ***P <0.001, ****P <0.0001.
[00109] 도 50a 내지 도 50d는 조작된 세포주와의 공동배양시 사이토카인 분비에서 CoStAR 변형의 효과를 도시한다. 비-Td 및 항-FOLR1 CoStAR 형질도입된(Td) TIL을 조작된 표적 세포주와 24시간 동안 공동배양하고 MSD 면역검정을 수행하여 분비된 사이토카인의 농도를 평가하였다. (좌) K-562, 및 (우) BA/F3 유래된 세포주와의 공동배양 후 (도 50a) IL-2, (도 50b) TNFα, (도 50c) IL-13 및 (도 50d) IFNγ에 대한 사이토카인 농도가 도시되어 있다. 결과는 각각 3개의 기술적 복제물을 갖는 5개의 생물학적 복제물을 나타낸다. Tukey의 다중 비교 시험과 함께 이원 ANOVA를 사용하여 통계적 분석을 수행하였다. *P <0.05, **P <0.01, ***P <0.001, ****P <0.0001.
[00110] 도 51a 내지 도 51c는 OKT3 보유 표적에 대한 TIL의 세포독성 용량에 대한 CoStAR 변형의 영향의 평가를 도시한다. 비-Td 및 항-FOLR1 CoStAR 형질도입된(Td) TIL을 BA/F3 또는 OVCAR-3 조작된 세포주와 공동배양하고, 세포독성을 기반으로 하는 유세포분석 기반(도 51a) 및 xCELLigence-기반 검정(도 51b 및 51c)을 사용하여 평가하였다. (도 51b) 1:5의 E:T 비율 및 (도 51c) 1:30의 E:T 비율. 결과는 각각 3개의 기술적 복제물을 갖는 5개의 생물학적 복제물을 나타낸다. 유세포 분석 데이터에 대한 Tukey의 다중 비교 시험을 이용한 이원 ANOVA 및 xCELLigence 데이터에 대한 Tukey의 다중 비교 시험을 이용한 일원 ANOVA를 사용하여 통계 분석을 수행하였다. *P <0.05, **P <0.01.
[00111] 도 52a 내지 도 52d는 >80%의 생존율(도 52a) 및 약 1억 내지 2억 개의 세포(도 52b), CD3+ T 세포에서 40 내지 55% CoStar 형질도입(도 52c) 및 >90% CD3+ T 세포 순도(도 52d)를 갖는 NSCLC TIL의 확장을 도시한다.
[00112] 도 53은 >80%의 생존력을 갖는 NSCLC TIL의 확장을 도시한다. CoStAR 형질도입된 집단과 비-형질도입된 집단에서는 생존율 및 세포 확장의 관점에서 차이가 없었다.
[00113] 도 54는 수확시 5천만 내지 5억 개의 세포를 갖는 NSCLC TIL의 확장을 도시한 것이다. CoStAR 형질도입된 집단과 비-형질도입된 집단에서는 생존율 및 세포 확장의 관점에서 차이가 없었다.
[00114] 도 55는 7명의 환자 샘플의 T 세포 집단을 도시한 것이다.
[00115] 도 56은 CD3+를 T 세포로, CD3-CD56+를 NK 세포로 표시하는 CD3 대 CD56을 도시한 것이다.
[00116] 도 57은 비-형질도입된 및 CoStAR 형질도입된 T 세포의 정량화를 도시한다.
[00117] 도 58은 T 세포 하위세트에 대한 CoStAR 염색을 도시한다.
[00118] 도 59a 내지 도 59d는 REP 동안 난소암 TIL의 생존율의 유의한 증가 및 제조 공정의 말미에 >90% 생존율을 도시하며, 수확시 1억 내지 3억 개의 세포를 갖는다. 도 59a는 세포 수를 도시하고 도 59b는 10일에 걸친 난소암 TIL의 생존력을 도시한다. 도 59c는 세포 수를 도시하고 도 59d는 제조 공정 후 생존력을 도시한다.
[00119] 도 60a 내지 도 60d는 수확시 1억 내지 3억 5천만 개의 세포로, 성장 동안 >50%의 생존력 및 제조 공정의 마지막에 >90%의 생존력이 일관되게 입증된 신장암 TIL을 도시한다. 도 60a는 세포 수를 도시하고 도 60b는 10일에 걸친 신장암 TIL의 생존력을 도시한다. 도 60c는 세포 수를 도시하고 도 60d는 제조 공정 후 생존력을 도시한다.
[00120] 도 61은 실시예 16에 개략된 바와 같은 실험 설정을 도시하며, 여기서, CD40 신호전달 모티프 돌연변이체 작제물은 전사에 대한 변화에 대해 스크리닝하기 위해 세포에 혼입되었다.
[00121] 도 62a는 실시예 17에 개략적으로 기재된 바와 같이, T 세포에서 TRAF 변이체 CoSTAR를 제조하기 위한 23일 실험 접근법을 도시한다.
[00122] 도 62b는 실시예 17에 개략적으로 기재된 바와 같이, T 세포에서의 증식에 대한 TRAF 변이체 CoSTAR의 효과를 모니터링하기 위한 26일 실험 접근법을 도시한다.
[00123] 도 63a 내지 도 63c는 IL-2 처리에 의한 TRAF 변이체 CoSTAR를 발현하는 CD2+ T 세포의 총 수의 변화를 도시한다. 공여자 HD 702C(도 63a), HD 1004(도 63b), 및 HD 2000(도 63c)으로부터 수집된 세포로부터의 세포 수의 변화에 대한 그래프가 제공된다.
[00124] 도 64a 내지 도 64c는 IL-2 처리에 의한 TRAF 변이체 CoSTAR를 발현하는 CD2+ T 세포의 수에서의 배수-변화를 도시한다. 공여자 HD 702C(도 64a), HD 1004(도 64b), 및 HD 2000(도 64c)으로부터 수집된 세포로부터의 세포 수의 배수 변화에 대한 그래프가 제공된다.
[00125] 도 65a 내지 도 65c는 TRAF 변이체 CoSTAR를 발현하는 CD2+ T 세포의 총 수의 변화를 도시하며, 여기서, T 세포는 임의의 IL-2 치료를 받지 않았다. 공여자 HD 702C(도 65a), HD 1004(도 65b), 및 HD 2000(도 65c)으로부터 수집된 세포로부터의 세포 수의 변화에 대한 그래프가 제공된다.
[00126] 도 66a 내지 도 66c는 TRAF 변이체 CoSTAR를 발현하는 CD2+ T 세포의 수에서의 배수-변화를 도시하며, 여기서, T 세포는 임의의 IL-2 치료를 받지 않았다. 공여자 HD 702C(도 66a), HD 1004(도 66b), 및 HD 2000(도 66c)으로부터 수집된 세포로부터의 세포 수의 배수 변화에 대한 그래프가 제공된다.
[00127] 도 67은 SEQ ID NO: 510 내지 519의 CD40 TRAF 변이체의 일부 구현예를 도시한다. 이 도면에서, 밑줄 친 영역은 CD40이고, 회색으로 강조 표시된 서열은 TRAF6 결합 도메인 영역이고, 밝은 회색으로 강조 표시된 서열은 TRAF2/3 결합 도메인이며, 회색으로 강조 표시되고 이중 괄호로 둘러싸인 서열은 TRAF2 결합 도메인이다.
[00128] 도 68은 공여자 HD 702C, HD 1004, 및 HD 2000으로부터 수집된 일차 T 세포로의 작제물의 형질도입 수준을 도시한다.
[00129] 도 69a 내지 도 69f는 실시예 18에 개략적으로 기재된 바와 같은, TRAF6 변이체를 갖는, 및 IL-2 처리(도 69a 내지 69c)와 함께 IL-2 처리 없이(도 69d 내지 69f) CoStAr 작제물을 발현하는 일차 인간 공여자 702C(도 69a 및 69d) 1004(도 69b 및 69e), 및 2000(도 69c 및 69f) 일차 T 세포에서 기준선과 비교하여 세포 증식의 배수 변화를 도시한다.
[00130] 도 70a 내지 도 70f는 실시예 18에 개략적으로 기재된 바와 같은, TRAF2/3 변이체를 갖는, 및 IL-2 처리(도 70a 내지 70c)와 함께 IL-2 처리 없이(도 70d 내지 70f) CoStAr 작제물을 발현하는 일차 인간 공여자 702C(도 70a 및 70d) 1004(도 70b 및 70e), 및 2000(도 70c 및 70f) 일차 T 세포에서 기준선과 비교하여 세포 증식의 배수 변화를 도시한다.
[00131] 도 71a 내지 도 71f는 실시예 18에 개략적으로 기재된 바와 같은, TRAF2 변이체를 갖는, 및 IL-2 처리(도 71a 내지 71c)와 함께 IL-2 처리 없이(도 71d 내지 71f) CoStAr 작제물을 발현하는 일차 인간 공여자 702C(도 71a 및 71d) 1004(도 71b 및 71e), 및 2000(도 71c 및 71f) 일차 T 세포에서 기준선과 비교하여 세포 증식의 배수 변화를 도시한다.
[00132] 도 72a 내지 도 72f는 실시예 18에 개략적으로 기재된 바와 같은, TRAF 변이체를 갖는, 및 IL-2 처리(도 72a 내지 72c)와 함께 IL-2 처리 없이(도 72d 내지 72f) CoStAr 작제물을 발현하는 일차 인간 공여자 702C(도 72a 및 72d) 1004(도 72b 및 72e), 및 2000(도 72c 및 72f) 일차 T 세포에서 기준선과 비교하여 세포 증식의 배수 변화를 도시한다.
[00133] 도 73a 내지 도 73d는 도 69a 내지 69c, 70a 내지 70c, 71a 내지 71c, 및 72a 내지 72c의 조합된 데이터를 도시하며, 여기서, 3명의 공여자에 걸친 일차 T 세포에서 기준선과 비교한 세포 증식의 배수 변화가 시간 경과에 따라 그래프로 표시된다. 그래프는 IL-2로 처리된 세포를 보여주고, TRAF6(도 73a), TRAF2/3(도 73b), TRAF2(도 73c), 또는 다른 TRAF(도 73d) 변이체를 발현하는 세포에 대한 조합된 데이터를 나타낸다.
[00134] 도 74a 내지 도 74d는 도 69a 내지 69c, 70a 내지 70c, 71a 내지 71c, 및 72a 내지 72c의 조합된 데이터를 도시하며, 여기서, 3명의 공여자에 걸친 일차 T 세포에서 기준선과 비교한 세포 증식의 배수 변화가 시간 경과에 따라 그래프로 표시된다. 그래프는 IL-2 처리가 제공되지 않은 세포를 나타내고, TRAF6(도 74a), TRAF2/3(도 74b), TRAF2(도 74c), 또는 다른 TRAF(도 74d) 변이체를 발현하는 세포에 대한 조합된 데이터를 나타낸다.
[00135] 도 75a 및 도 75b는 IL-2 처리된(도 75a) 및 IL-2 처리가 없는(도 75b) 세포에 대해 21일에 3명의 공여자로부터의 일차 인간 T 세포에서 기준선과 비교하여 세포 증식의 조합된 배수 변화를 도시한다.
[00136] 도 76a 내지 도 76c는 TRAF 변이체를 갖는 보편적인 공동자극 단백질에 대한 도식 모델의 비제한적인 예를 도시한다. (도 76a) TCR 혼입된 항원 불문 수용체(TIAAR)는 TCR 복합체의 변형 성분 및 관련 신호전달 어댑터를 포함한다. (도 76b) 막횡단 도메인(TMD) 및 유도성 또는 구성적 활성화를 가능하게 하는 특징을 포함하는 구성적 공동자극 수용체. (도 76c) 세포외 리간드 결합에 의해 유도 및 활성화될 수 있는 유도성 공동자극 수용체. 이러한 비제한적인 예에서, TRAF 변이체는 CD40 도메인의 일부이다("CD40*"로 표시됨).
[00137] 도 77a 내지 도 77c는 본원의 일부 구현예의 비제한적인 예시적인 단백질 작제물을 도시한다. 도 77a는 선택적 섹션, 결합 도메인, CD28 도메인, 및 TRAF 변이체를 갖는 CD40 도메인을 추가로 포함하는 보편적인 CoStAR 서열을 포함하는 단백질의 일반적인 개략도이다. 도 77b는 본원에 제공된 일부 구현예의 개략도이다. 도 77c는 본원에 제공된 일부 구현예의 서열 세트를 개략적으로 나타낸 것이다.
[00138] 도 78은 본원에 제공된 일부 구현예의 서열 세트를 도시한다(SEQ ID NO: 40839 내지 41074). 일부 구현예에서, 이러한 서열은 본원에 제공된 컨센서스 서열 또는 다른 TRAF 변이체 작제물로부터 제외된다(도 84 및 85에서의 것들이 제외되는 것을 포함함).
[00139] 도 79는 본원에 제공된 일부 구현예의 서열 세트를 도시한다(SEQ ID NO: 41075 내지 43474). 일부 구현예에서, 이러한 서열은 본원에 제공된 컨센서스 서열 또는 다른 TRAF 변이 작제물로부터 제외된다(도 84 및 85에서 제외되는 것을 포함함).
[00140] 도 80은 실시예 13에 기재된 바와 같이, 신호전달 모티프의 기능을 평가하기 위해 작제물 CTP195, CTP196, 및 CTP197을 사용한 CD40의 돌연변이 분석의 비제한적인 예를 도시한다.
[00141] 도 81은 실시예 13에 기재된 바와 같이, 신호전달 모티프의 기능을 평가하기 위해 작제물 CTP195, CTP196, CTP197, CTP198, 및 CTP199를 사용한 CD40의 돌연변이 분석의 비제한적인 예를 도시한다.
[00142] 도 82a는 표 1에 제시된 바와 같은 TRAF2 도메인에서 변이체의 정렬로부터 생성된 소수의 컨센서스 서열을 도시하며, 여기서, 강조 표시된 아미노산은 변이체에 걸쳐 보존된다.
[00143] 도 82b는 표 1에 제시된 바와 같은 TRAF2 도메인에서 변이체의 정렬로부터 생성된 주요 컨센서스 서열을 도시하며, 여기서, 강조 표시된 아미노산은 변이체에 걸쳐 보존된다.
[00144] 도 82c는 표 3에 제시된 바와 같은 TRAF6 도메인에서 변이체의 정렬로부터 생성된 컨센서스 서열을 도시하며, 여기서, 강조 표시된 아미노산은 변이체에 걸쳐 보존된다.
[00145] 도 83은 TRAF2 도메인(SEQ ID NO: 520 내지 679)에서 변이체의 비제한적인 예시적인 서열을 도시한다.
[00146] 도 84는 TRAF2/3 도메인(SEQ ID NO: 680 내지 839)에서 변이체의 비제한적인 예시적인 서열을 도시한다.
[00147] 도 85는 TRAF6 도메인(SEQ ID NO: 840 내지 40839)에서 변이체의 비제한적인 예시적인 서열을 도시한다.
[00148] 도 86a 내지 도 86d는 FOLR1-알파 CoStAR 및/또는 CD40 변이체와의 융합 단백질의 일부 구현예를 보여주는 개략도를 예시한다. 일부 일반적인 구현예가 도 86a에 도시되어 있다. 도 86b는 FOLR1-알파 CoStAR 또는 융합 단백질의 일부 구현예를 도시한다. 도 86c는 CoStAR 또는 융합 단백질의 일부 구현예를 도시한다. 도 86d는 CoStAR 또는 융합 단백질의 일부 구현예를 도시한다. 일부 구현예에서, 서열은 이의 전체로 구조를 기술하고, CoStAR 또는 융합 단백질을 기술하기 위해 추가의 기능적 양태는 요구되지 않는다. 일부 구현예에서, 도 28, 67, 77a 내지 77c, 83 내지 89d, 및 92(도 78 및 79의 것들을 제외함)의 것들을 포함하고, 표 2, 4 내지 5, 및 7 내지 14의 것들을 포함하고, SEQ ID NO: 42, 475 내지 479, 494 내지 498, 505, 510 내지 519, 및 840 내지 40839를 포함하는 것들, 및 컨센서스 서열 A 내지 C를 포함하는 본원에 제공된 임의의 CD40, TRAF2, TRAF2/3, 또는 TRAF6 변이체가 본 방법 및/또는 작제물 및/또는 단백질에서 사용될 수 있다.
[00149] 도 87a 내지 도 87d는 항-펨브롤리주맙 CoStAR 및/또는 CD40 변이체를 갖는 융합 단백질의 일부 구현예를 보여주는 개략도를 예시한다. 일부 일반적인 구현예는 도 87a에 도시되어 있다. 도 87b는 항-펨브롤리주맙 CoStAR 또는 융합 단백질의 일부 구현예를 도시한다. 도 87c는 CoStAR 또는 융합 단백질의 일부 구현예를 도시한다. 도 87d는 CoStAR 또는 융합 단백질의 일부 구현예를 도시한다. 일부 구현예에서, 서열은 그 전체로 구조를 기술하고, CoStAR 또는 융합 단백질을 기술하기 위해 추가의 기능적 양태는 요구되지 않는다. 일부 구현예에서, 도 28, 67, 77a 내지 77c, 83 내지 89d, 및 92의 것들을 포함하고(도 78 및 79의 것들을 제외함), 표 2, 4 내지 5, 및 7 내지 14의 것들을 포함하고, SEQ ID NO: 42, 475 내지 479, 494 내지 498, 505, 510 내지 519, 및 840 내지 40839를 포함하는 것들, 및 컨센서스 서열 A 내지 C를 포함하는 본원에 제공된 임의의 CD40, TRAF2, TRAF2/3, 또는 TRAF6 변이체가 본 방법 및/또는 작제물 및/또는 단백질에서 사용될 수 있다.
[00150] 도 88a 내지 도 88d는 CEA CoStAR 및/또는 CD40 변이체와의 융합 단백질의 일부 구현예를 보여주는 개략도를 예시한다. 일부 일반적인 구현예는 도 88a에 도시되어 있다. 도 88b는 CEA CoStAR 또는 융합 단백질의 일부 구현예를 도시한다. 도 88c는 CoStAR 또는 융합 단백질의 일부 구현예를 도시한다. 도 88d는 CoStAR 또는 융합 단백질의 일부 구현예를 도시한다. 일부 구현예에서, 서열은 그 전체로 구조를 기술하고, CoStAR 또는 융합 단백질을 기술하기 위해 추가의 기능적 양태는 요구되지 않는다. 일부 구현예에서, 도 28, 67, 77a 내지 77c, 83 내지 89d, 및 92의 것들을 포함하고(도 78 및 79의 것들을 제외함), 표 2, 4 내지 5, 및 7 내지 14의 것들을 포함하고, SEQ ID NO: 42, 475 내지 479, 494 내지 498, 505, 510 내지 519, 및 840 내지 40839를 포함하는 것들, 및 컨센서스 서열 A 내지 C를 포함하는 본원에 제공된 임의의 CD40, TRAF2, TRAF2/3, 또는 TRAF6 변이체가 본 방법 및/또는 작제물 및/또는 단백질에서 사용될 수 있다.
[00151] 도 89a 내지 도 89d는 CEA CoStAR 및/또는 CD40 변이체와의 융합 단백질의 일부 구현예를 보여주는 개략도를 예시한다. 일부 일반적인 구현예는 도 89a에 도시되어 있다. 도 89b는 MSLN CoStAR 또는 융합 단백질의 일부 구현예를 도시한다. 도 89c는 CoStAR 또는 융합 단백질의 일부 구현예를 도시한다. 도 89d는 CoStAR 또는 융합 단백질의 일부 구현예를 도시한다. 일부 구현예에서, 서열은 그 전체로 구조를 기술하고, CoStAR 또는 융합 단백질을 기술하기 위해 추가의 기능적 양태는 요구되지 않는다. 일부 구현예에서, 도 28, 67, 77a 내지 77c, 83 내지 89d, 및 92의 것들을 포함하고(도 78 및 79의 것들을 제외함), 표 2, 4 내지 5, 및 7 내지 14의 것들을 포함하고, SEQ ID NO: 42, 475 내지 479, 494 내지 498, 505, 510 내지 519, 및 840 내지 40839를 포함하는 것들, 및 컨센서스 서열 A 내지 C를 포함하는 본원에 제공된 임의의 CD40, TRAF2, TRAF2/3, 또는 TRAF6 변이체가 본 방법 및/또는 작제물 및/또는 단백질에서 사용될 수 있다.
[00152] 도 90a 내지 도 90c는 실시예 19에 개략적으로 기재된 바와 같이, CD40 변이체를 갖는 T 세포의 발현 후에 존재하는 사이토카인 TNF-알파(도 90a), IFN-감마(도 90b), 및 IL-2(도 90c)의 양을 도시한다.
[00153] 도 91a 및 도 91b는 실시예 20에 개략적으로 기재된 바와 같이, 작제물 CTP194-CTP200 중 하나를 발현하는 세포에서 IL-2 생산(도 91a) 및 배수 팽창(도 91b)을 도시한다.
[00154] 도 92는 본원에 기재된 바와 같은 단백질 작제물 CTP188-CTP202의 개략도를 도시한다.
[00155] 본원의 개시는 TRAF 결합 도메인의 변이체를 인코딩하는 서열에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 이러한 변이체는 TRAF2, TRAF2/3, 또는 TRAF6 도메인에 대한 것일 수 있다. 일부 구현예에서, TRAF2 변이체는 본원에 제공된 하나 이상의 변이체 또는 점 돌연변이를 포함할 것이다. 일부 구현예에서, TRAF2/3 변이체는 본원에 제공된 하나 이상의 변이체 또는 점 돌연변이를 포함할 것이다. 일부 구현예에서, TRAF6 변이체는 본원에 제공된 하나 이상의 변이체 또는 점 돌연변이를 포함할 것이다. 일부 구현예에서, TRAF2, TRAF2/3, 또는 TRAF6 변이체는, 예를 들어, SEQ ID NO: 475, 476, 477, 478, 479, 494, 495, 496, 498, 505, 510, 511, 512, 513, 514, 515, 516, 517, 518, 또는 519 중 하나 이상을 포함하는, 본원에 제공된 것들 중 임의의 하나 이상일 것이다. 일부 구현예에서, 변이체는 표 2, 표 4, 표 5, 또는 도 67로부터의 작제물 중 임의의 하나 이상을 포함할 것이다. 일부 구현예에서, 변이체는 도 78(SEQ ID NO: 40839 내지 41074) 또는 도 79(SEQ ID NO: 41075 내지 43474)의 작제물 중 하나가 아니다. 일부 구현예에서, 변이체는 도 83, 도 84, 또는 도 85의 작제물 중 적어도 하나를 포함한다. 일부 구현예에서, TRAF2, TRAF2/3, 또는 TRAF6 변이체는 CD40 단백질의 일부일 것이다. 일부 구현예에서, CD40 단백질은 본원에 제공된 바와 같은 CoSTAR 단백질 또는 다른 융합 작제물의 일부이다. 일부 구현예에서, TRAF 변이체는 본원에 제공된 바와 같은 T 세포에서 발현된다. 일부 구현예에서, TRAF 변이체는 도 76a 내지 76c에 도시된 바와 같이 세포에서 발현된다. 일부 구현예에서, TRAF 변이체는 도 77a 내지 77c, 86a 내지 86d, 87a 내지 87d, 88a 내지 88d, 및/또는 89a 내지 89d에 도시된 바와 같은 펩티드 작제물의 일부이다.
[00156] 일부 구현예에서, 본원에 제공된 임의의 단백질 및/또는 CoSTAR는 야생형 CD40 또는 TRAF 도메인 대신에 CD40 또는 TRAF 변이체를 사용할 수 있다. 도 28, 67, 77a 내지 77c, 83 내지 89d, 및 92(도 78 및 79의 것들은 제외)의 것들을 포함하고, 표 2, 4 내지 5, 및 7 내지 14의 것들을 포함하고, SEQ ID NO: 42, 475 내지 479, 494 내지 498, 505, 510 내지 519, 및 840 내지 40839 포함), 및 컨센서스 서열 A 내지 C를 포함하는, 본원에 제공된 임의의 CD40, TRAF2, TRAF2/3, 또는 TRAF6 변이체가 본 방법 및/또는 작제물 및/또는 단백질에서 사용될 수 있다. 본원에 제공된 CD40, TRAF, TRAF2, TRAF2/3, 및 TRAF6 변이체의 모든 설명에 대해, 일부 구현예에서, 도 78 및 79의 서열은 임의로 본 발명의 변이체의 옵션으로부터 제외된다.
[00157] 일부 구현예에서, 서열은 TRAF2의 변이체이다. 일부 구현예에서, 서열은 SEQ ID NO: 520 내지 679 중 어느 하나로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 서열은 SEQ ID NO: 520 내지 679 중 어느 하나와 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95%, 약 99%, 약 100%, 또는 약 60 내지 약 100%인 임의의 정수의 동일성을 갖는다. 일부 구현예에서, 서열은 TRAF2/3의 변이체이다. 일부 구현예에서, 서열은 SEQ ID NO: 680 내지 839 중 어느 하나로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 서열은 SEQ ID NO: 680 내지 839 중 어느 하나와 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95%, 약 99%, 약 100%, 또는 약 60 내지 약 100%인 임의의 정수의 동일성을 갖는다. 일부 구현예에서, 서열은 TRAF6의 변이체이다. 일부 구현예에서, 서열은 SEQ ID NO: 840 내지 40839 중 어느 하나로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 서열은 SEQ ID NO: 840 내지 40839 중 어느 하나와 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95%, 약 99%, 약 100%, 또는 약 60 내지 약 100%인 임의의 정수의 동일성을 갖는다. 일부 구현예에서, 서열은 TRAF의 적어도 2, 3, 및/또는 4개의 변이체를 포함한다.
[00158] 일부 구현예에서, 서열은 표 2, 4, 또는 5로부터의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 서열은 표 2, 4, 또는 5의 서열과 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95%, 약 99%, 약 100%, 또는 약 60 내지 약 100%인 임의의 정수의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 서열은 SEQ ID NO: 475, 476, 477, 478, 479, 494, 495, 496, 498, 505, 510, 511, 512, 513, 514, 515, 516, 517, 518, 및 519 중 어느 하나로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 서열은 SEQ ID NO: 475, 476, 477, 478, 479, 494, 495, 496, 498, 505, 510, 511, 512, 513, 514, 515, 516, 519, 7, 516, 198 중 어느 하나와 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95%, 약 99%, 약 100%, 또는 약 60 내지 약 100%인 임의의 정수의 동일성을 갖는다.
[00159] 본 개시의 일부 구현예는 컨센서스 A, 또는 X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11의 서열을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 단백질에 관한 것이다. 일부 구현예에서, X1은 임의의 아미노산이고, X2는 임의의 아미노산이고, X3은 P이고, X4는 임의의 아미노산이고, X5는 Q이고, X6은 C, E, 또는 A이고, X7은 임의의 아미노산이고, X8은 임의의 아미노산이고, X9는 임의의 아미노산이고, X10은 임의의 아미노산이고, X11은 임의의 아미노산이다. 일부 구현예에서, X1, 및 X2는 임의의 아미노산이고, X3은 P이고, X4는 임의의 아미노산이고, X5는 Q이고, X6, X7, X8, X9, X10, 및 X11은 임의의 아미노산이다. 일부 구현예에서, X1 내지 X11 중 어느 하나는 자연 발생 아미노산이다. 일부 구현예에서, X1 내지 X11 중 어느 하나는 변형된 아미노산이다. 일부 구현예에서, X3 및/또는 X5는 각각 P 및/또는 Q와 유사한 특성을 갖는 또 다른 아미노산으로 보존적으로 돌연변이된다. 일부 구현예에서, 단백질은 TRAF 도메인의 일부이다. 일부 구현예에서, 단백질은 TRAF2 도메인의 일부이다. 일부 구현예에서, 단백질은 TRAF2/3 도메인의 일부이다. 일부 구현예에서, 서열은 X1이 S 또는 P이고, X2가 V, H, 또는 Y이고, X4가 I, Q, V이고, X7이 T 또는 S이고, X8이 D이고, X9가 K, D, 또는 G이고, X10이 T, S, G, 또는 A이고, X11이 D, S, N, 또는 D인 것을 포함하거나; 서열이 (a)와 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 및/또는 적어도 100% 동일하다. 일부 구현예에서, 단백질은 서열 GSNTX1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11, SEQ ID NO: 42299의 것이다. 일부 구현예에서, 단백질은 서열 X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11QPVT, SEQ ID NO: 42377의 것이다. 일부 구현예에서, 단백질은 서열 GSNTX1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11QPVT, SEQ ID NO: 42378의 것이다.
[00160] 일부 구현예에서, 컨센서스 B, 또는 X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11의 서열을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 단백질이 제공되고, 여기서, X1은 임의의 아미노산이고, X2는 임의의 아미노산이고, X3은 P, S, A, 또는 T이고, X4는 임의의 아미노산, X5는 Q 또는 E이고, X6은 E이고, X7은 임의의 아미노산이고, X8은 임의의 아미노산이고, X9는 임의의 아미노산이고, X10은 임의의 아미노산이고, X11은 임의의 아미노산이다. 일부 구현예에서, X1 내지 X11 중 어느 하나는 자연 발생 아미노산이다. 일부 구현예에서, X1 내지 X11 중 어느 하나는 변형된 아미노산이다. 일부 구현예에서, X3은 P, S, A, 및/또는 T와 유사한 특성을 갖는 또 다른 아미노산으로 보존적으로 돌연변이된다. 일부 구현예에서, X5는 Q 및/또는 E와 유사한 특성을 갖는 또 다른 아미노산으로 보존적으로 돌연변이된다. 일부 구현예에서, X6은 E와 유사한 특성을 갖는 또 다른 아미노산으로 보존적으로 돌연변이된다. 일부 구현예에서, 단백질은 TRAF 도메인의 일부이다. 일부 구현예에서, 단백질은 TRAF2 도메인의 일부이다. 일부 구현예에서, 단백질은 TRAF2/3 도메인의 일부이다. 일부 구현예에서, 서열은 다음을 포함한다: X1은 P, A, M, T, S, R, V, H이고, X2는 F, A, L, I, T, V, G, C, A, F, P이고, X4는 K, V, I, H, A, Q, T, E, S이고, X7은 C, T, E, D, S, A이고, X8은 A, L, G, Y, I, Q, D, E이고, X9는 F, H, K, R, P, A, G, Y, E, N이고, X10은 R, G, E, K, A, S, D, C, C, P, V이고, X11은 S, C, D, P, W, T, A, G, E이고; 또는 서열이 (a)와 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 및/또는 적어도 100% 동일하다. 일부 구현예에서, 서열은 TRAF2/3 서열의 일부이다. 일부 구현예에서, 단백질은 서열 GSNTX1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11, SEQ ID NO: 42300의 것이다. 일부 구현예에서, 단백질은 서열 X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11QPVT, SEQ ID NO: 42379의 것이다. 일부 구현예에서, 단백질은 서열 GSNTX1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11QPVT, SEQ ID NO: 42380의 것이다.
[00161] 일부 구현예에서, 컨센서스 C 또는 X1X2X3X4X5X6의 서열을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 단백질이 제공되고, 여기서, X1은 P이고, X2는 임의의 아미노산이고, X3은 E이고, X4는 임의의 아미노산이고, X5는 임의의 아미노산이다. X6은 Ac/Ar이다. 일부 구현예에서, X1은 P이고, X2, X3, X4, X5 및 X6은 임의의 아미노산이다. 일부 구현예에서, X1 내지 X6 중 어느 하나는 자연 발생 아미노산이다. 일부 구현예에서, X1 내지 X6 중 어느 하나는 변형된 아미노산이다. 일부 구현예에서, X1은 P와 유사한 특성을 갖는 또 다른 아미노산으로 보존적으로 돌연변이된다. 일부 구현예에서, X6은 방향족 아미노산이다. 일부 구현예에서, X6은 산성 아미노산이다. 일부 구현예에서, X6은 산성 및/또는 방향족 아미노산과 유사한 특성을 갖는 또 다른 아미노산으로 보존적으로 돌연변이된다. 일부 구현예에서, X6은 Y, H, W, 또는 F 아미노산으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, X6은 D 또는 E 아미노산으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 단백질은 TRAF 도메인의 일부이다. 일부 구현예에서, 단백질은 TRAF6 도메인의 일부이다. 일부 구현예에서, 서열은 다음을 포함한다: X2는 Q, P, E, V, T, 또는 S이고, X4는 I, L, M, N, S, T, N, D이고, X5는 N, D, R, S, G, 또는 Y이고; 또는 서열이 (a)와 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 및/또는 적어도 100% 동일하다. 일부 구현예에서, 단백질은 서열 PKQEX1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11, SEQ ID NO: 42301의 것이다. 일부 구현예에서, 단백질은 서열 X1X2X3X4X5X6PDDL, SEQ ID NO: 42381의 것이다. 일부 구현예에서, 단백질은 서열 PKQEX1X2X3X4X5X6PDDL, SEQ ID NO: 42382의 것이다.
[00162] 컨센서스 서열 A, B, 및 C는 표 1 및 3 및 도 82a 내지 도 82c에 제시된 바와 같이 결정되었다.
[00163] 일부 구현예에서, 아미노산 서열은 (a) SEQ ID NO: 475, 476, 477, 478, 479, 494, 495, 496, 498, 505, 510, 511, 512, 513, 514, 515, 516, 517, 518, 또는 519 중 하나 이상; 또는 (b) (a)와 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 및/또는 적어도 100% 동일한 서열을 포함한다.
[00164] 일부 구현예에서, TRAF 도메인은 CD40 단백질에 있고, 여기서, TRAF 도메인은 (a) SEQ ID NO: 475, 476, 477, 478, 479, 494, 495, 496, 498, 505, 510, 511, 512, 513, 514, 515, 516, 517, 518, 또는 519 중 하나 이상; 또는 (b) (a)와 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 및/또는 적어도 100% 동일한 서열을 포함한다.
[00165] 일부 구현예에서, TRAF6 도메인 서열은 PQEINF, PEEMSW, PPENYE, 또는 PQENSY를 포함한다. 일부 구현예에서, PVQET, TQEET, SKEET, AVEET, 또는 PVQET를 포함하는 TRAF2/3 도메인 서열이 있다. 일부 구현예에서, SVQE, AVEE 또는 PEEE를 포함하는 TRAF2 도메인 서열이 있다.
[00166] 일부 구현예에서, TRAF6 또는 TRAF2/3 도메인은 (a) SEQ ID NO: 475, 476, 477, 478, 479, 494, 495, 496, 498, 505, 510, 511, 512, 513, 514, 515, 516, 517, 518, 또는 519 중 하나의 아미노산 서열 ; 또는 (b) (a)와 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 및/또는 적어도 100% 동일한 서열을 포함한다.
[00167] 일부 구현예에서, 서열은 본 개시의 구현예 중 어느 하나의 단백질, 아미노산 서열, 또는 TRAF 도메인에 대한 CD40 단백질 서열 내에 있다. 일부 구현예에서, 서열은 CD40 단백질 내에 있고, CD40 단백질 내의 상응하는 TRAF2, TRAF2/3, 및/또는 TRAF6 도메인에 위치한다.
[00168] 일부 구현예에서, TRAF2/TRAF3 도메인은 컨센서스 A, 또는 X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11의 아미노산 서열을 포함하고, 여기서, X1은 임의의 아미노산이고, X2는 임의의 아미노산이고, X3는 P이고, X4는 임의의 아미노산이고, X5는 Q이고, X6은 C, E, 또는 A이고, X7은 임의의 아미노산이고, X8은 임의의 아미노산이고, X9는 임의의 아미노산이고, X10은 임의의 아미노산이고, X11은 임의의 아미노산이다. 일부 구현예에서, 단백질은 서열 GSNTX1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11, SEQ ID NO: 42299의 것이다. 일부 구현예에서, 단백질은 서열 X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11QPVT, SEQ ID NO: 42377의 것이다. 일부 구현예에서, 단백질은 서열 GSNTX1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11QPVT, SEQ ID NO: 42378의 것이다.
[00169] 일부 구현예에서, TRAF2/TRAF3 도메인은 컨센서스 B 또는 X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11의 아미노산 서열을 포함하고, 여기서, X1은 임의의 아미노산이고, X2는 임의의 아미노산이고, X3은 P, S, A, 또는 T이고, X4는 임의의 아미노산이고, X5는 Q 또는 E이고, X6은 E이고, X7은 임의의 아미노산이고, X8은 임의의 아미노산, X9는 임의의 아미노산이고, X10은 임의의 아미노산이고, 및 X11은 임의의 아미노산이다. 일부 구현예에서, 단백질은 서열 GSNTX1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11, SEQ ID NO: 42300의 것이다. 일부 구현예에서, 단백질은 서열 X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11QPVT, SEQ ID NO: 42379의 것이다. 일부 구현예에서, 단백질은 서열 GSNTX1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11QPVT, SEQ ID NO: 42380의 것이다.
[00170] 일부 구현예에서, TRAF6 도메인은 컨센서스 C, 또는 X1X2X3X4X5X6의 아미노산 서열을 포함하고, 여기서, X1은 P이고, X2는 임의의 아미노산이고, X3은 E이고, X4는 임의의 아미노산이고, X5는 임의의 아미노산이고, X6은 Ac/Ar이다. 일부 구현예에서, 단백질은 서열 PKQEX1X2X3X4X5X6, SEQ ID NO: 42301의 것이다. 일부 구현예에서, 단백질은 서열 X1X2X3X4X5X6PDDL, SEQ ID NO: 42381의 것이다. 일부 구현예에서, 단백질은 서열 PKQEX1X2X3X4X5X6PDDL, SEQ ID NO: 42382의 것이다.
[00171] 일부 구현예에서, CD40 도메인은 하기 중 하나 이상의 아미노산 서열을 포함한다: (a) 컨센서스 A, 또는 X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11의 아미노산 서열을 포함하는 TRAF2/TRAF3 도메인(여기서, X1은 임의의 아미노산이고, X2는 임의의 아미노산이고, X3은 P이고, X4는 임의의 아미노산이고, X5는 Q이고, X6은 C, E, 또는 A이고, X7은 임의의 아미노산이고, X8은 임의의 아미노산이고, X9는 임의의 아미노산이고, X10은 임의의 아미노산이고, X11은 임의의 아미노산임), (b) 컨센서스 B, 또는 X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11의 아미노산 서열을 포함하는 TRAF2/TRAF3 도메인(여기서, X1은 임의의 아미노산이고, X2는 임의의 아미노산이고, X3은 P, S, A, 또는 T이고, X4는 임의의 아미노산이고, X5는 Q 또는 E이고, X6은 E이고, X7은 임의의 아미노산이고, X8은 임의의 아미노산이고, X9는 임의의 아미노산이고, X10은 임의의 아미노산이고, X11은 임의의 아미노산임), (c) 컨센서스 C, 또는 X1X2X3X4X5X6의 아미노산 서열을 포함하는 TRAF6 도메인(여기서, X1은 P이고, X2는 임의의 아미노산이고, X3은 E이고, X4는 임의의 아미노산이고, X5는 임의의 아미노산이고, X6은 Ac/Ar임).
[00172] 일부 구현예에서, 종양 관련 항원에 결합하는 세포외 결합 도메인; 세포외 결합 도메인에 연결된 막횡단 도메인; 제1 신호전달 도메인 및 제2 신호전달 도메인을 포함하고, 여기서, 상기 제2 신호전달 도메인은 변이체 CD40 신호전달 도메인 또는 이의 신호전달 단편을 포함하고, 상기 변이체 CD40은 변이체 TRAF2/TRAF3 서열, 또는 변이체 TRAF6 서열, 또는 변이체 TRAF2 서열의 서열을 포함하고, 여기서, 변이체 CD40은 SEQ ID NO: 42를 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 도 28, 67, 77a 내지 77c, 83 내지 89d, 및 92의 것들(도 78 및 79의 것들을 제외함)을 포함하고, 표 2, 4 내지 5, 및 7 내지 14의 것들을 포함하고, SEQ ID NO: 42, 475 내지 479, 494 내지 498, 505, 510 내지 519, 및 840 내지 40839를 포함하는 것들, 및 컨센서스 서열 A 내지 C를 포함하는 본원에 제공된 임의의 CD40, TRAF2, TRAF2/3, 또는 TRAF6 변이체가 본 방법 및/또는 작제물 및/또는 단백질에서 사용될 수 있다. 도 78 및 79의 서열 옵션은 본원에 제공된 모든 구현예로부터 선택적으로 제외될 수 있다.
[00173] 일부 구현예에서, 암종배아 항원(CEA)에 결합하는 세포외 결합 도메인, 또는 메조텔린(MSLN)에 결합하는 세포외 결합 도메인; 세포외 결합 도메인에 연결된 막횡단 도메인; 제1 신호전달 도메인및 제2 신호전달 도메인을 포함하고, 여기서, 상기 제2 신호전달 도메인은 변이체 CD40 신호전달 도메인 또는 이의 신호전달 단편을 포함하고, 상기 변이체 CD40은 변이체 TRAF2/TRAF3 서열, 또는 변이체 TRAF6 서열, 또는 변이체 TRAF2 서열의 서열을 포함하고, 여기서, 변이체 CD40은 SEQ ID NO: 42를 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 제1 신호전달 도메인은 CD28 또는 CD278(ICOS)의 신호전달 도메인 또는 신호전달 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 신호전달 도메인은 전장 공동자극 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 작제물은 도 88a에 도시된 바와 같다. 일부 구현예에서, 작제물은 도 88b에 도시된 바와 같다. 일부 구현예에서, 작제물은 도 88c에 제시된 바와 같다. 일부 구현예에서, 도 28, 67, 77a 내지 77c, 83 내지 89d, 및 92의 것들(도 78 및 79의 것들을 제외함)을 포함하고, 표 2, 4 내지 5, 및 7 내지 14의 것들을 포함하고, SEQ ID NO: 42, 475 내지 479, 494 내지 498, 505, 510 내지 519, 및 840 내지 40839를 포함하는 것들, 및 컨센서스 서열 A 내지 C를 포함하는 본원에 제공된 임의의 CD40, TRAF2, TRAF2/3, 또는 TRAF6 변이체가 본 방법 및/또는 작제물 및/또는 단백질에서 사용될 수 있다. 도 78 및 79의 서열 옵션은 본원에 제공된 모든 구현예에서 선택적으로 제외될 수 있다.
[00174] 일부 구현예에서, 세포외 결합 도메인은 링커 및/또는 스페이서에 의해 막횡단 도메인에 작동적으로 연결된다. 일부 구현예에서, 링커는 약 2, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350개, 또는 2 내지 350개의 임의의 정수의 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 약 5 내지 약 20개의 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 약 10 내지 약 250개의 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 5개의 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 10개의 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 20개의 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 50개의 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 100개의 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 250개의 아미노산을 포함한다.
[00175] 일부 구현예에서, 막횡단 도메인은 CD28, CD8, ICOS, DAP10, 또는 NTRK로부터의 막횡단 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 막횡단 도메인은 CD28로부터의 막횡단 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 막횡단 도메인은 CD8로부터의 막횡단 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 막횡단 도메인은 ICOS로부터의 막횡단 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 막횡단 도메인은 DAP10으로부터의 막횡단 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 막횡단 도메인은 NTRK로부터의 막횡단 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 막횡단 도메인은 SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, 또는 SEQ ID NO:22의 막횡단 도메인 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 막횡단 도메인은 SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, 또는 SEQ ID NO:22 중 어느 하나와 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95%, 약 99%, 약 100%, 또는 약 60 내지 약 100%인 임의의 정수의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포외 결합 도메인은 scFv, 펩티드, 항체 중쇄 가변 도메인, 항체 경쇄 가변 도메인, 또는 CEA 리간드를 포함한다. 일부 구현예에서, 도 28, 67, 77a 내지 77c, 83 내지 89d, 및 92의 것들을 포함하고, 표 2, 4 내지 5, 및 7 내지 14의 것들(도 78 및 79의 것들을 제외함)을 포함하고, SEQ ID NO: 42, 475 내지 479, 494 내지 498, 505, 510 내지 519, 및 840 내지 40839를 포함하는 것들, 및 컨센서스 서열 A 내지 C를 포함하는 본원에 제공된 임의의 CD40, TRAF2, TRAF2/3, 또는 TRAF6 변이체가 본 방법 및/또는 작제물 및/또는 단백질에서 사용될 수 있다. 도 78 및 79의 서열 옵션은 본원에 제공된 모든 구현예로부터 선택적으로 제외될 수 있다.
[00176] 일부 구현예에서, 본 개시의 구현예 중 어느 하나의 CD40 TRAF 변이체 작제물을 인코딩하는 핵산이 있다.
[00177] 일부 구현예에서, 본 개시의 구현예 중 어느 하나의 CoStAR을 인코딩하는 핵산이 있다.
[00178] 일부 구현예에서, 본 개시의 구현예 중 어느 하나의 핵산을 포함하는 벡터가 제공된다.
[00179] 일부 구현예에서, 본 개시의 구현예 중 어느 하나의 CD40 TRAF 변이체 작제물을 발현하는 세포가 있다. 일부 구현예에서, 세포는 알파-베타 T 세포, 감마-델타 T 세포, T 조절 세포, TIL, NKT 세포 또는 NK 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포는 CAR 또는 TCR을 공동-발현한다.
[00180] 일부 구현예에서, 본 개시의 구현예 중 어느 하나의 CoStAR을 발현하는 세포가 있다. 일부 구현예에서, 세포는 알파-베타 T 세포, 감마-델타 T 세포, T 조절 세포, TIL, NKT 세포 또는 NK 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포는 CAR 또는 TCR을 공동-발현한다.
[00181] 일부 구현예에서, 본 개시의 구현예 중 어느 하나의 벡터로 세포를 형질도입 또는 형질감염시키는 단계를 포함하는, 본 개시의 구현예 중 어느 하나의 세포를 제조하는 방법이 제공된다.
[00182] 일부 구현예에서, 본 개시의 구현예 중 어느 하나의 CoStAR을 발현하는 세포의 집단을 제조하기 위한 방법이 제공되며, 이는 대안 62의 벡터로 형질감염되거나 형질도입된 세포의 표면에서 CoStAR의 발현을 검출하는 단계; 및 CoStAR을 발현하는 것으로 확인된 세포를 선택하는 단계를 포함한다.
[00183] 일부 구현예에서, 본 개시의 구현예 중 어느 하나의 CoStAR이 세포 발현에 대해 농축된 세포 집단이 있다.
[00184] 일부 구현예에서, 본 개시의 구현예 중 어느 하나에 따른 세포, 또는 본 개시의 구현예 중 어느 하나에 따른 세포 집단을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 질환을 치료하는 방법이 제공된다.
[00185] 일부 구현예에서, SEQ ID NO: 510 내지 519 중 하나의 아미노산 서열을 포함하는 단백질이 있다. 일부 구현예에서, 단백질은 SEQ ID NO: SEQ ID NO: 510 내지 519 중 어느 하나와 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95%, 약 99%, 약 100%, 또는 약 60 내지 약 100%인 임의의 정수의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 단백질은 SEQ ID NO: 510의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 단백질은 SEQ ID NO: 510과 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95%, 약 99%, 약 100%, 또는 약 60 내지 약 100%인 임의의 정수의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 단백질은 SEQ ID NO: 511의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 단백질은 EQ ID NO: 511과 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95%, 약 99%, 약 100%, 또는 약 60 내지 약 100%인 임의의 정수의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 단백질은 SEQ ID NO: 512의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 단백질은 SEQ ID NO: 512와 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95%, 약 99%, 약 100%, 또는 약 60 내지 약 100%인 임의의 정수의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 단백질은 SEQ ID NO: 513의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 단백질은 SEQ ID NO: 513과 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95%, 약 99%, 약 100%, 또는 약 60 내지 약 100%인 임의의 정수의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 단백질은 SEQ ID NO: 514의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 단백질은 SEQ ID NO: 514와 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95%, 약 99%, 약 100%, 또는 약 60 내지 약 100%인 임의의 정수의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 단백질은 SEQ ID NO: 515의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 단백질은 SEQ ID NO: 515와 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95%, 약 99%, 약 100%, 또는 약 60 내지 약 100%인 임의의 정수의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 단백질은 SEQ ID NO: 516의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 단백질은 SEQ ID NO: 516과 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95%, 약 99%, 약 100%, 또는 약 60 내지 약 100%인 임의의 정수의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 단백질은 SEQ ID NO: 517의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 단백질은 SEQ ID NO: 517과 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95%, 약 99%, 약 100%, 또는 약 60 내지 약 100%인 임의의 정수의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 단백질은 SEQ ID NO: 518의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 단백질은 SEQ ID NO: 518과 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95%, 약 99%, 약 100%, 또는 약 60 내지 약 100%인 임의의 정수의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 단백질은 SEQ ID NO: 519의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 단백질은 SEQ ID NO: 519와 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95%, 약 99%, 약 100%, 또는 약 60 내지 약 100%인 임의의 정수의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 도 28, 67, 77a 내지 77c, 83 내지 89d, 및 92의 것들을 포함하고, 표 2, 4 내지 5, 및 7 내지 14의 것들(도 78 및 79의 것들을 제외함)을 포함하고, SEQ ID NO: 42, 475 내지 479, 494 내지 498, 505, 510 내지 519, 및 840 내지 40839를 포함하는 것들, 및 컨센서스 서열 A 내지 C를 포함하는 본원에 제공된 임의의 CD40, TRAF2, TRAF2/3, 또는 TRAF6 변이체가 본 방법 및/또는 작제물 및/또는 단백질에서 사용될 수 있다. 도 78 및 79의 서열 옵션은 본원에 제공된 모든 구현예로부터 선택적으로 제외될 수 있다.
[00186] 일부 구현예에서, a) CD28 세포내 신호전달 도메인; 및 b) CD40 세포내 신호전달 도메인을 포함하는, 세포외 종양-관련 항원(TAA) 특이적 결합 도메인 및 막횡단 도메인을 포함하고, CD40 세포내 신호전달 도메인은 본 개시의 구현예 중 어느 하나의 TRAF 변이체를 포함하는, 면역 세포가 있다. 일부 구현예에서, 세포외 종양-관련 항원(TAA) 특이적 결합 도메인 및 막횡단 도메인을 포함하는 면역 세포의 키메라 수용체를 인코딩하는 단리된 핵산 분자가 있고, 여기서, 핵산 분자는 본 개시의 구현예 중 어느 하나의 TRAF 변이체를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 도 28, 67, 77a 내지 77c, 83 내지 89d, 및 92의 것들(도 78 및 79의 것들을 제외함)을 포함하고, 표 2, 4 내지 5, 및 7 내지 14의 것들을 포함하고, SEQ ID NO: 42, 475 내지 479, 494 내지 498, 505, 510 내지 519, 및 840 내지 40839를 포함하는 것들, 및 컨센서스 서열 A 내지 C를 포함하는 본원에 제공된 임의의 CD40, TRAF2, TRAF2/3, 또는 TRAF6 변이체가 본 방법 및/또는 작제물 및/또는 단백질에서 사용될 수 있다. 도 78 및 79의 서열 옵션은 본원에 제공된 모든 구현예로부터 선택적으로 제외될 수 있다.
[00187] 일부 구현예에서, 제1 공동자극 수용체의 세포외 리간드 결합 단편, 및 신호전달 도메인에 연결된 종양 관련 항원 특이적 결합 도메인에 융합된 제2 공동자극 수용체의 세포내 신호전달 단편을 포함하는 키메라 공동자극 수용체(CoStAR)가 있으며, 여기서, CoStAR은 본 개시의 구현예 중 어느 하나의 TRAF 변이체를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, (a) 암종배아 항원(CEA), 5T4, 멜라노트랜스페린(CD228), Her2, EGFR, GPC3, 흑색종-관련 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸(MCSP/CSPG4), CD71, 폴레이트 수용체 또는 CA125를 포함하지만 이로 제한되지 않는 종양, 관련 항원에 결합하는 단쇄 항체 단편; 또는 (b) 종양 특이적 펩티드 (p)-주요 조직적합성(MHO) 복합체에 결합하는 단쇄 항체 단편; 또는 (c) 종양 특이적 pMHC 복합체 항원 특이적 단쇄 T-세포 수용체(scTCR); 또는 (d) 천연 항원 결합 폴리펩타이드, 예를 들어, 비제한적으로 트랜스페린; 또는 (e) 항체에 결합하는 도메인(예를 들어, CD16, CD32 또는 CD64와 같은 Fe 결합 도메인), 또는 항원 인식의 다른 간접적인 방법으로부터 선택된, 항원 특이적 결합 도메인을 포함하는 CoStAR이 있다. 일부 구현예에서, CoStAr은 (1) 전장 인간 CD28, 또는 단백질 수준에서 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 100%, 또는 60 내지 100%의 임의의 정수의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하거나 이로 구성된 융합 신호전달 도메인; (2) 예컨대, 인간 CD137, 또는 단백질 수준에서 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 100%, 또는 60 내지 100%의 임의의 정수의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체로부터의 세포내 도메인, (3) 인간 CD134, 또는 단백질 수준에서 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 100%, 또는 60 내지 100%의 임의의 정수의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체로부터의 세포내 도메인, (4) 인간 CD2, 또는 단백질 수준에서 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 100%, 또는 60 내지 100%의 임의의 정수의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체로부터의 세포내 도메인, (5) 인간 CD29, 또는 단백질 수준에서 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 100%, 또는 60 내지 100%의 임의의 정수의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체로부터의 세포내 도메인, (6) 인간 GITR, 또는 단백질 수준에서 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 100%, 또는 60 내지 100%의 임의의 정수의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체로부터의 세포내 도메인, (7) 인간 IL2R-감마, 또는 단백질 수준에서 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 100%, 또는 60 내지 100%의 임의의 정수의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체로부터의 세포내 도메인, (8) 인간 CD40, 또는 단백질 수준에서 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 100%, 또는 60 내지 100%의 임의의 정수의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체로부터의 세포내 도메인, (9) 인간 CD150, 또는 단백질 수준에서 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 100%, 또는 60 내지 100%의 임의의 정수의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체로부터의 세포내 도메인, 및/또는 (10) 인간 CD2 및 인간 CD40, 또는 단백질 수준에서 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 100%, 또는 60 내지 100%의 임의의 정수의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체로부터의 세포내 도메인 중 적어도 하나에 융합된다. 일부 구현예에서, 도 28, 67, 77a 내지 77c, 83 내지 89d, 및 92의 것들(도 78 및 79의 것들을 제외함)을 포함하고, 표 2, 4 내지 5, 및 7 내지 14의 것들을 포함하고, SEQ ID NO: 42, 475 내지 479, 494 내지 498, 505, 510 내지 519, 및 840 내지 40839를 포함하는 것들, 및 컨센서스 서열 A 내지 C를 포함하는 본원에 제공된 임의의 CD40, TRAF2, TRAF2/3, 또는 TRAF6 변이체가 본 방법 및/또는 작제물 및/또는 단백질에서 사용될 수 있다. 도 78 및 79의 서열 옵션은 본원에 제공된 모든 구현예로부터 선택적으로 제외될 수 있다.
[00188] 일부 구현예에서, 막횡단 도메인에 작동적으로 연결된 세포외 결합 도메인, CD28 신호전달 도메인 및 CD40 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 공동자극 항원 수용체(CoStAR)가 있고, 여기서, 적어도 하나의 세포외 결합 도메인은 SEQ ID NO: 42275의 아미노산 서열을 포함하고, CD28 신호전달 도메인은 SEQ ID NO: 42276의 아미노산 서열을 포함하고, CD40 신호전달 도메인은 SEQ ID NO: 42277의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, CoStAR은 본 개시의 구현예 중 어느 하나의 적어도 하나의 TRAF 변이체를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 연결된 SEQ ID NO:42275의 아미노산 서열을 포함하는 제1 부분; 연결된 막횡단 도메인을 포함하는 제2 부분; 연결된 SEQ ID NO: 42276의 아미노산 서열을 포함하는 제3 부분; SEQ ID NO: 42277의 아미노산 서열을 포함하는 제4 부분; 및 연결된 SEQ ID NO: 42279의 아미노산 서열을 포함하는 제5 부분을 포함하는 단백질이 있고, 여기서, 제1 부분은 제5 부분에 의해 제2 부분에 연결되고, 제3 부분은 제2 부분에 연결되고, 제4 부분은 제3 부분에 연결된다. 일부 구현예에서, 단백질은 본 개시의 구현예 중 어느 하나의 적어도 하나의 TRAF 변이체를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 일부 구현예에서, 도 28, 67, 77a 내지 77c, 83 내지 89d, 및 92의 것들(도 78 및 79의 것들을 제외함)을 포함하고, 표 2, 4 내지 5, 및 7 내지 14의 것들을 포함하고, SEQ ID NO: 42, 475 내지 479, 494 내지 498, 505, 510 내지 519, 및 840 내지 40839를 포함하는 것들, 및 컨센서스 서열 A 내지 C를 포함하는 본원에 제공된 임의의 CD40, TRAF2, TRAF2/3, 또는 TRAF6 변이체가 본 방법 및/또는 작제물 및/또는 단백질에서 사용될 수 있다. 도 78 및 79의 서열 옵션은 본원에 제공된 모든 구현예로부터 선택적으로 제외될 수 있다.
[00189] 일부 구현예에서, 막횡단 도메인에 작동적으로 연결된, 항체 196-14의 VH 및 항체 196-14의 VL을 포함하는 세포외 결합 도메인, CD28 신호전달 도메인 및 CD40 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 공동자극 항원 수용체(CoStAR)가 있고, 여기서, CD28 신호전달 도메인은 SEQ ID NO: 42276의 아미노산 서열을 포함하고, CD40 신호전달 도메인은 SEQ ID NO: 42277의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, CoStAR은 본 개시의 구현예 중 어느 하나의 적어도 하나의 TRAF 변이체를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, CoStAR의 세포 발현이 농축된 세포 집단이 있고, CoStAR은 막횡단 도메인에 작동적으로 연결된 항체 196-14의 VH 및 항체 196-14의 VL을 포함하는 세포외 결합 도메인, CD28 신호전달 도메인 및 CD40 신호전달 도메인을 포함하고, 여기서, CD28 신호전달 도메인은 SEQ ID NO: 42276의 아미노산 서열을 포함하고, CD40 신호전달 도메인은 SEQ ID NO: 42277의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, CoStAR은 본 개시의 구현예 중 어느 하나의 적어도 하나의 TRAF 변이체를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 도 28, 67, 77a 내지 77c, 83 내지 89d, 및 92의 것들(도 78 및 79의 것들을 제외함)을 포함하고, 표 2, 4 내지 5, 및 7 내지 14의 것들을 포함하고, SEQ ID NO: 42, 475 내지 479, 494 내지 498, 505, 510 내지 519, 및 840 내지 40839를 포함하는 것들, 및 컨센서스 서열 A 내지 C를 포함하는 본원에 제공된 임의의 CD40, TRAF2, TRAF2/3, 또는 TRAF6 변이체가 본 방법 및/또는 작제물 및/또는 단백질에서 사용될 수 있다. 도 78 및 79의 서열 옵션은 본원에 제공된 모든 구현예로부터 선택적으로 제외될 수 있다.
[00190] 일부 구현예에서 막횡단 도메인에 작동적으로 연결된 세포외 결합 도메인, 제1 신호전달 도메인, CD40 신호전달 도메인 또는 이의 단편, 및 본 개시의 구현예 중 어느 하나의 적어도 하나의 TRAF 변이체를 포함하는 CoStAR이 있다. 일부 구현예에서, CD40 신호전달 단편은 SH3 모티프(KPTNKAPH, SEQ ID NO: 42280), TRAF2 모티프(PKQE, SEQ ID NO: 42281, PVQE, SEQ ID NO: 42282, SVQE, SEQ ID NO: 42283), TRAF6 모티프(QEPQEINFP, SEQ ID NO: 42284), PKA 모티프(KKPTNKA, SEQ ID NO: 42285, SRISVQE, SEQ ID NO: 42286), 또는 이들의 조합을 포함하거나, 전장 CD40 세포내 도메인이다. 일부 구현예에서, 제1 신호전달 도메인은 CD2, CD9, CD26, CD27, CD28, CD29, CD38, CD40, CD43, CD46, CD49d, CD55, CD73, CD81, CD82, CD99, CD100, CD134(OX40), CD137(41BB), CD150(SLAM), CD270(HVEM), CD278(ICOS), CD357(GITR), 또는 EphB6의 신호전달 도메인 또는 신호전달 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포외 결합 도메인은 CD70, CD146, FOLRI, 암종배아 항원(CEA), 5T4, 멜라노트랜스페린(CD228), Her2, EGFR, GPC3, 흑색종-관련 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸(MCSP/CSPG4), CD71, EPCAM, SM5-1, 폴레이트 수용체 또는 CA125, PDL-1, CD155 PD-1, 메조텔린, 또는 종양 특이적 펩티드 (p)-주요 조직적합성(MHC) 복합체, 또는 종양 특이적 pMHC 복합체 항원 특이적 단쇄 T-세포 수용체(scTCR), 또는 트랜스페린, 또는 항체 또는 항원 결합 단백질에 결합한다. 일부 구현예에서, 도 28, 67, 77a 내지 77c, 83 내지 89d, 및 92의 것들(도 78 및 79의 것들을 제외함)을 포함하고, 표 2, 4 내지 5, 및 7 내지 14의 것들을 포함하고, SEQ ID NO: 42, 475 내지 479, 494 내지 498, 505, 510 내지 519, 및 840 내지 40839를 포함하는 것들, 및 컨센서스 서열 A 내지 C를 포함하는 본원에 제공된 임의의 CD40, TRAF2, TRAF2/3, 또는 TRAF6 변이체가 본 방법 및/또는 작제물 및/또는 단백질에서 사용될 수 있다. 도 78 및 79의 서열 옵션은 본원에 제공된 모든 구현예로부터 선택적으로 제외될 수 있다.
[00191] 일부 구현예에서, 막횡단 도메인에 작동적으로 연결된 종양 관련 항원(TAA)에 대해 특이적인 세포외 결합 도메인, CD28 신호전달 도메인, CD40 신호전달 도메인 또는 이의 신호전달 단편, 및 본 개시의 구현예 중 어느 하나의 적어도 하나의 TRAF 변이체를 포함하는 키메라 공동자극 항원 수용체(CoStAR)가 있다. 일부 구현예에서, CoStAR은 FOLR1에 특이적이다. 일부 구현예에서, CoStAR은 PDL1에 특이적이다. 일부 구현예에서, CoStAR은 CEA에 특이적이다. 일부 구현예에서, 세포외 결합 도메인은 MOV19 scFv를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포외 결합 도메인은 CD70, CD146, FOLR1, 암종배아 항원(CEA), 5T4, 멜라노트랜스페린(CD228), Her2, EGFR, GPC3, 흑색종-관련 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸(MCSP/CSPG4), CD71, EPCAM, SM5-1, 폴레이트 수용체 또는 CA125, PDL-1, CD155 PD-1, 메조텔린, 또는 종양 특이적 펩티드 (p)-주요 조직적합성(MHC) 복합체, 또는 종양 특이적 pMHC 복합체 항원 특이적 단쇄 T-세포 수용체(scTCR), 또는 트랜스페린, 또는 항체 또는 항원 결합 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 도 28, 67, 77a 내지 77c, 83 내지 89d, 및 92의 것들(도 78 및 79의 것들을 제외함)을 포함하고, 표 2, 4 내지 5, 및 7 내지 14의 것들을 포함하고, SEQ ID NO: 42, 475 내지 479, 494 내지 498, 505, 510 내지 519, 및 840 내지 40839를 포함하는 것들, 및 컨센서스 서열 A 내지 C를 포함하는 본원에 제공된 임의의 CD40, TRAF2, TRAF2/3, 또는 TRAF6 변이체, 및 가 본 방법 및/또는 작제물 및/또는 단백질에서 사용될 수 있다. 도 78 및 79의 서열 옵션은 본원에 제공된 모든 구현예로부터 선택적으로 제외될 수 있다.
[00192] 일부 구현예에서, 본 개시의 구현예 중 어느 하나의 적어도 하나의 TRAF 변이체, (a) 결합 도메인으로서, ID NO: 42287의 아미노산 서열을 포함하는 L-CDR1, SEQ ID NO: 42288의 아미노산 서열을 포함하는 L-CDR2 서열, SEQ ID NO: 42289의 아미노산 서열을 포함하는 L-CDR3 서열, SEQ ID NO: 42290의 아미노산 서열을 포함하는 H-CDR1 서열, SEQ ID NO: 42291의 아미노산 서열을 포함하는 H-CDR2 서열, 및 SEQ ID NO: 173의 아미노산 서열을 포함하는 H-CDR3 서열을 포함하는 결합 도메인; (b) 결합 도메인에 연결된 SEQ ID NO: 42293의 아미노산 서열; (c) (b)에 연결된 SEQ ID NO: 42294의 아미노산 서열; (d) (c)에 연결된 SEQ ID NO: 42295의 아미노산 서열; 및 (e) (d)에 연결된 SEQ ID NO: 42296의 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질이 있다. 일부 구현예에서, SEQ ID NO: 42297 또는 42298의 아미노산 서열, 및 본 개시의 구현예 중 어느 하나의 적어도 하나의 TRAF 변이체를 포함하는 융합 단백질이 제공된다. 일부 구현예에서, 도 28, 67, 77a 내지 77c, 83 내지 89d, 및 92의 것들(도 78 및 79의 것들을 제외함)을 포함하고, 표 2, 4 내지 5, 및 7 내지 14의 것들을 포함하고, SEQ ID NO: 42, 475 내지 479, 494 내지 498, 505, 510 내지 519, 및 840 내지 40839를 포함하는 것들, 및 컨센서스 서열 A 내지 C를 포함하는 본원에 제공된 임의의 CD40, TRAF2, TRAF2/3, 또는 TRAF6 변이체가 본 방법 및/또는 작제물 및/또는 단백질에서 사용될 수 있다. 도 78 및 79의 서열 옵션은 본원에 제공된 모든 구현예로부터 선택적으로 제외될 수 있다.
[00193] 일부 구현예에서, 클러스터링 도메인 및 CD40 신호전달 도메인 및 이의 신호전달 단편을 포함하는 신호전달 도메인 및 본 개시의 구현예 중 어느 하나의 적어도 하나의 TRAF 변이체를 포함하는 조작된 단백질이 있고, 여기서, 클러스터링 도메인은 올리고머화되어, 신호전달 도메인이 활성화될 수 있다. 일부 구현예에서, 단백질은 구성적으로 자극하는 항원 불가 수용체(C-SAAR)를 포함한다. 일부 구현예에서, 단백질은 LZ(cFos)-EGFRTM/JMD-CD28-CD40, LZ(cFos)-CD28TM-CD28-CD40, LZ(cJun)-EGFRTM/JMDCD28-CD40, LZ(cJun)-CD28TM-CD28-CD40, LZ(c/EBP)-EGFRTM/JMD-CD28-CD40, 또는 LZ(c/EBP)-CD28TM-CD28-CD40 중 적어도 하나를 포함한다. 일부 구현예에서, 단백질은 유도성 공동자극 수용체를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 단백질은 항-ID1-VHVL(A3 0514-펨브로)-CD28TMD-CD28-CD40, 또는 항-ID 1-VL-VH(A3 0514-펨브로)CD28TMD-CD28-CD40, 또는 항-ID2-VH-VL(A3 0523-펨브로)-CD28TMD-CD28-CD40, 또는 항-ID2-VL-Vh(A3 0523-펨브로)-CD28TMD-CD28-CD40, 또는 항-ID3-Vh-VL(A3063 3-펨브로)-CD28TMD-CD28-CD40, 또는 항-ID3-VL-VH(A 3063 3-펨브로)-CD28TMD-CD28-CD40 중 적어도 하나를 포함한다. 일부 구현예에서, 조작된 단백질은 막횡단 도메인을 포함하고, 클러스터링 도메인은 조작된 단백질이 리간드에 의해 결합될 때 올리고머화된다. 일부 구현예에서, 도 28, 67, 77a 내지 77c, 83 내지 89d, 및 92의 것들(도 78 및 79의 것들을 제외함)을 포함하고, 표 2, 4 내지 5, 및 7 내지 14의 것들을 포함하고, SEQ ID NO: 42, 475 내지 479, 494 내지 498, 505, 510 내지 519, 및 840 내지 40839를 포함하는 것들, 및 컨센서스 서열 A 내지 C를 포함하는 본원에 제공된 임의의 CD40, TRAF2, TRAF2/3, 또는 TRAF6 변이체가 본 방법 및/또는 작제물 및/또는 단백질에서 사용될 수 있다. 도 78 및 79의 서열 옵션은 본원에 제공된 모든 구현예로부터 선택적으로 제외될 수 있다.
[00194] 일부 구현예에서, 암종배아 항원(CEA)에 결합하는 세포외 결합 도메인, 및 본 개시의 구현예 중 어느 하나의 적어도 하나의 TRAF 변이체를 포함하는 CoStAR이 있다. 일부 구현예에서, 세포외 결합 도메인은 ICOS에 작동적으로 연결되고, ICOS는 SEQ ID NO: 515의 아미노산 서열을 포함하고, ICOS는 CD40 신호전달 도메인에 연결되고,세포외 결합 도메인은 SEQ ID NO: 12의 HCDR1; SEQ ID NO: 12의 HCDR2인 HCDR2; SEQ ID NO: 12의 HCDR3인 HCDR3; SEQ ID NO: 12의 LCDR1인 LCDR1; SEQ ID NO: 12의 LCDR2인 LCDR2; 및 SEQ ID NO: 12의 HCDR3인 LCDR3을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 개시의 구현예 중 어느 하나의 적어도 하나의 TRAF 변이체를 포함하는 융합 단백질이 있고, 여기서, 융합 단백질은 SEQ ID NO: 12의 HCDR1인 HCDR1; SEQ ID NO: 12의 HCDR2인 HCDR2; SEQ ID NO: 12의 HCDR3인 HCDR3; SEQ ID NO: 12의 LCDR1인 LCDR1; SEQ ID NO: 12의 LCDR2인 LCDR2; 및 SEQ ID NO: 12의 HCDR3인 LCDR3을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 작제물은 도 88a에 도시된 바와 같다. 일부 구현예에서, 작제물은 도 88b에 도시된 바와 같다. 일부 구현예에서, 작제물은 도 88c에 제시된 바와 같다. 일부 구현예에서, 도 28, 67, 77a 내지 77c, 83 내지 89d, 및 92의 것들(도 78 및 79의 것들을 제외함)을 포함하고, 표 2, 4 내지 5, 및 7 내지 14의 것들을 포함하고, SEQ ID NO: 42, 475 내지 479, 494 내지 498, 505, 510 내지 519, 및 840 내지 40839를 포함하는 것들, 및 컨센서스 서열 A 내지 C를 포함하는 본원에 제공된 임의의 CD40, TRAF2, TRAF2/3, 또는 TRAF6 변이체가 본 방법 및/또는 작제물 및/또는 단백질에서 사용될 수 있다. 도 78 및 79의 서열 옵션은 본원에 제공된 모든 구현예로부터 선택적으로 제외될 수 있다.
[00195] 일부 구현예에서, 메조텔린(MSLN)에 결합하는 세포외 결합 도메인 및 본 개시의 구현예 중 어느 하나의 적어도 하나의 TRAF 변이체를 포함하는 CoStAR이 있다. 일부 구현예에서, CoStAR은 막횡단 도메인; CD28 신호전달 도메인으로서, SEQ ID NO: 25의 아미노산 서열을 포함하는 CD28 신호전달 도메인; 및 CD40 신호전달 도메인을 추가로 포함하고, 여기서, 세포외 결합 도메인은 SEQ ID NO: 186의 HCDR1인 HCDR1, SEQ ID NO: 186의 HCDR2인 HCDR2, SEQ ID NO: 186의 HCDR3인 HCDR3, SEQ ID NO: 186의 LCDR1인 LCDR1, SEQ ID NO: 186의 LCDR2인 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 186의 LCDR3인 LCDR3; SEQ ID NO: 187의 HCDR1인 HCDR1, SEQ ID NO: 187의 HCDR2인 HCDR2, SEQ ID NO: 187의 HCDR3인 HCDR3, SEQ ID NO: 187의 LCDR1인 LCDR1, SEQ ID NO: 187의 LCDR2인 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 187의 LCDR3인 LCDR3; SEQ ID NO: 188의 HCDR1인 HCDR1, SEQ ID NO: 188의 HCDR2인 HCDR2, SEQ ID NO: 188의 HCDR3인 HCDR3, SEQ ID NO: 188의 LCDR1인 LCDR1, SEQ ID NO: 188의 LCDR2인 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 188의 LCDR3인 LCDR3; SEQ ID NO: 189의 HCDR1인 HCDR1, SEQ ID NO: 189의 HCDR2인 HCDR2, SEQ ID NO: 189의 HCDR3인 HCDR3, SEQ ID NO: 189의 LCDR1인 LCDR1 189, SEQ ID NO: 189의 LCDR2인 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 189의 LCDR3인 LCDR3; SEQ ID NO: 190의 HCDR1인 HCDR1, SEQ ID NO: 190의 HCDR2인 HCDR2, SEQ ID NO: 190의 HCDR3인 HCDR3, SEQ ID NO: 190의 LCDR1인 LCDR1, SEQ ID NO: 190의 LCDR2인 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 190의 LCDR3인 LCDR3; SEQ ID NO: 191의 HCDR1인 HCDR1, SEQ ID NO: 191의 HCDR2인 HCDR2, SEQ ID NO: 191의 HCDR3인 HCDR3, SEQ ID NO: 191의 LCDR1인 LCDR1, SEQ ID NO: 191의 LCDR2인 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 191의 LCDR3인 LCDR3; SEQ ID NO: 186에서 VH인 VH, 및 SEQ ID NO: 186에서 VL인 VL; SEQ ID NO: 187에서 VH인 VH, 및 SEQ ID NO: 187에서 VL인 VL; SEQ ID NO: 188에서 VH인 VH, 및 SEQ ID NO: 188에서 VL인 VL; SEQ ID NO: 189에서 VH인 VH, 및 SEQ ID NO: 189에서 VL인 VL; SEQ ID NO: 190에서 VH인 VH, 및 SEQ ID NO: 190에서 VL인 VL; 또는 SEQ ID NO: 191에서 VH인 VH, 및 SEQ ID NO: 191에서 VL인 VL 중 어느 하나를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 개시의 구현예 중 어느 하나의 적어도 하나의 TRAF 변이체를 포함하는 융합 단백질이 제공된다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 SEQ ID NO: 186의 HCDR1인 HCDR1, SEQ ID NO: 186의 HCDR2인 HCDR2, SEQ ID NO: 186의 HCDR3, SEQ ID NO: 186의 LCDR1인 LCDR1, SEQ ID NO: 186의 LCDR2인 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 186의 LCDR3인 LCDR3; SEQ ID NO: 187의 HCDR1인 HCDR1, SEQ ID NO: 187의 HCDR2인 HCDR2, SEQ ID NO: 187의 HCDR3인 HCDR3, SEQ ID NO: 187의 LCDR1인 LCDR1, SEQ ID NO: 187의 LCDR2인 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 187의 LCDR3인 LCDR3; SEQ ID NO: 188의 HCDR1인 HCDR1, SEQ ID NO: 188의 HCDR2인 HCDR2, SEQ ID NO: 188의 HCDR3인 HCDR3, SEQ ID NO: 188의 LCDR1인 LCDR1, SEQ ID NO: 188의 LCDR2인 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 188의 LCDR3인 LCDR3; SEQ ID NO: 189의 HCDR1인 HCDR1, SEQ ID NO: 189의 HCDR2인 HCDR2, SEQ ID NO: 189의 HCDR3인 HCDR3, SEQ ID NO: 189의 LCDR1인 LCDR1, SEQ ID NO: 189의 LCDR2인 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 189의 LCDR3인 LCDR3; SEQ ID NO: 190의 HCDR1인 HCDR1, SEQ ID NO: 190의 HCDR2인 HCDR2, SEQ ID NO: 190의 HCDR3인 HCDR3, SEQ ID NO: 190의 LCDR1인 LCDR1 190, SEQ ID NO: 190의 LCDR2인 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 190의 LCDR3인 LCDR3; SEQ ID NO: 191의 HCDR1인 HCDR1, SEQ ID NO: 191의 HCDR2인 HCDR2, SEQ ID NO: 191의 HCDR3인 HCDR3, SEQ ID NO: 191의 LCDR1인 LCDR1, SEQ ID NO: 191의 LCDR2인 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 191의 LCDR3인 LCDR3; SEQ ID NO: 186에서 VH인 VH, 및 SEQ ID NO: 186에서 VL인 VL; SEQ ID NO: 187에서 VH인 VH, 및 SEQ ID NO: 187에서 VL인 VL; SEQ ID NO: 188에서 VH인 VH, 및 SEQ ID NO: 188에서 VL인 VL; SEQ ID NO: 189에서 VH인 VH, 및 SEQ ID NO: 189에서 VL인 VL; SEQ ID NO: 190에서 VH인 VH, 및 SEQ ID NO: 190에서 VL인 VL; 또는 SEQ ID NO: 191에서 VH인 VH, 및 SEQ ID NO: 191에서 VL인 VL 중 임의의 하나 이상을 포함하는, 제1 서열을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 막횡단 도메인인 제2 서열, SEQ ID NO: 25의 아미노산 서열을 포함하는 제3 서열; 및 SEQ ID NO: 32의 아미노산 서열을 포함하는 제4 서열을 포함하고, 여기서, 제1 서열은 제2 서열에 연결되고, 제2 서열은 제3 서열에 연결되고, 제3 서열은 제4 서열에 연결된다. 일부 구현예에서, 도 28, 67, 77a 내지 77c, 83 내지 89d, 및 92의 것들(도 78 및 79의 것들을 제외함)을 포함하고, 표 2, 4 내지 5, 및 7 내지 14의 것들을 포함하고, SEQ ID NO: 42, 475 내지 479, 494 내지 498, 505, 510 내지 519, 및 840 내지 40839를 포함하는 것들, 및 컨센서스 서열 A 내지 C를 포함하는 본원에 제공된 임의의 CD40, TRAF2, TRAF2/3, 또는 TRAF6 변이체가 본 방법 및/또는 작제물 및/또는 단백질에서 사용될 수 있다. 도 78 및 79의 서열 옵션은 본원에 제공된 모든 구현예로부터 선택적으로 제외될 수 있다.
[00196] 일부 구현예에서, 본 개시의 구현예 중 어느 하나의 적어도 하나의 TRAF 변이체를 포함하는 CoStAR이며, 여기서, CoStAR은 TCR이 TCR의 표적에 의해 결합될 때 ㅆ 세포 수용체(TCR)를 보유하는 면역 세포의 CoStAR-리간드-유도성 활성화를 가능하게 하고, 이는 유도 리간드에 특이적인 세포외 리간드 결합 도메인, 막횡단 도메인, 및 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 개시의 구현예 중 어느 하나의 CoStAR, 항체, 또는 단백질을 발현하는 세포가 있다. 일부 구현예에서, 세포는 알파-베타 T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 알파-베타 T 세포는 종양 침윤 림프구(TIL)를 포함한다. 일부 구현예에서, CoStAR은 전장 CD28 세포외 도메인을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, CoStAR은 리간드 결합 도메인과 막횡단 도메인 사이에 위치한 말단절단된 CD28 세포외 도메인 또는 CD8 세포외 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포내 신호전달 도메인은 CD28, CD40, CD137, OX40, ICOS, CD2, 또는 DAP10 또는 이의 신호전달 단편 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 리간드-결합 도메인은 타파시타맙, 세툭시맙, 트라스투주맙, 및/또는 펨브롤리주맙에 결합한다. 일부 구현예에서, 도 28, 67, 77a 내지 77c, 83 내지 89d, 및 92의 것들(도 78 및 79의 것들을 제외함)을 포함하고, 표 2, 4 내지 5, 및 7 내지 14의 것들을 포함하고, SEQ ID NO: 42, 475 내지 479, 494 내지 498, 505, 510 내지 519, 및 840 내지 40839를 포함하는 것들, 및 컨센서스 서열 A 내지 C를 포함하는 본원에 제공된 임의의 CD40, TRAF2, TRAF2/3, 또는 TRAF6 변이체가 본 방법 및/또는 작제물 및/또는 단백질에서 사용될 수 있다. 도 78 및 79의 서열 옵션은 본원에 제공된 모든 구현예로부터 선택적으로 제외될 수 있다.
[00197] 일부 구현예에서, 방법은 세포 요법의 방법으로서, 방법은 이를 필요로 하는 대상체를 확인하는 단계, 및 본 개시의 구현예 중 어느 하나의 CoStAR, 융합 단백질, 핵산, 벡터, 또는 세포를 투여하는 단계를 포함한다.
[00198] 일부 구현예에서, TRAF 변이체를 발현하는 단백질 또는 CoStAR이 농축된 세포의 집단을 제조하기 위한 방법으로서, 방법은 본 개시의 구현예 중 임의의 하나의 벡터로 형질도입되거나 형질감염된 세포의 표면에 CoStAR 또는 단백질의 발현을 검출하는 단계, 및 CoStAR 또는 단백질을 발현하는 것으로서 확인된 세포를 선택하는 단계를 포함한다.
[00199] 일부 구현예에서, 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에서 질환을 치료하기 위한 방법으로서, 방법은 본 개시의 구현예 중 어느 하나의 세포 또는 세포 집단을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
CD40 및 TRAF
[00200] CD40은 B 세포, 대식세포, 및 수지상 세포와 같은 항원-제시 세포에서 활성화 신호를 제공하는 TNF 수용체 슈퍼패밀리 구성원이다. 이의 리간드에 의한 CD40의 다량체화는 TNF 수용체-관련 인자(TRAF)를 CD40 세포질 도메인으로 동원함으로써 신호전달을 개시한다. TRAF 결합 부위는 CD40의 세포내 신호전달을 담당한다.
[00201] TRAF 도메인은 TRAF 단백질의 올리고머화 뿐만 아니라 업스트림 수용체 또는 어댑터 및 다운스트림 이펙터 단백질과의 이들의 회합을 매개한다. RING 도메인은 E3 유비퀴티나제 리가제의 큰 패밀리에서 단백질 유비퀴틴화를 매개하는 기능으로 가장 잘 알려져 있다. TRAF에 의해 조절되는 주요 다운스트림 경로 중에는 핵 인자 카파 베타(NF-κB) 및 미토겐-활성화된 단백질 키나제(MAPK)의 활성화로 이어지는 것들이 있으며, 이는 또한 선천성 면역, 염증, 및 세포 생존과 관련된 유전자의 유도를 위해 중요하다. TRAF2 및 TRAF3은 B 세포의 생존 및 선천 면역 세포의 염증 반응에 관여하는 일부 신호전달 경로에서 음성 조절자로서 기능한다.
[00202] NF-κB의 정규 경로는 TNFα, IL-1, 또는 LPS에 의해 유도되고, IKK 활성에 관여하기 위해 매우 다양한 신호전달 어댑터를 사용한다. IKKβ에 의한 고전적인 IκB의 신호 반응성 영역(SRR)에서 세린 잔기의 인산화는 IκB 유비퀴틴화 및 후속 프로테오솜 분해를 초래한다. 이는 NF-κB 이량체의 방출을 초래하고, 이는 이후 핵으로 전위되고, 표적 유전자의 전사를 유도할 수 있다. 비정규 경로는 IKKα의 NIK(NF-κB-유도 키나제) 유도된 활성화에 의존한다. IKKα는 p100 NF-κB 서브유닛을 인산화시켜, p100에서 p52로의 프로테오솜 프로세싱을 유도한다. 이는 특정 κB 요소를 표적화하는 p52-RelB 이량체의 활성화를 초래한다.
[00203] CD40 신호전달 도메인을 포함하는 공동자극 수용체는 신규하고 개선된 활성 프로파일을 나타내는 것으로 밝혀졌다. CD40 내의 TRAF2, TRAF2/3, 및 TRAF6 결합 도메인의 변이체가 신호전달을 조절한다는 것이 추가로 발견되었다. 활성 프로파일은 CD40 신호전달 도메인에 연결하기 위한 수용체 단백질의 세포내 도메인을 선택함으로써 및/또는 수용체 단백질의 세포내 도메인에 연결하기 위한 CD40 신호전달 도메인의 요소를 선택함으로써 조절될 수 있다. 본원에는 (i) 질환- 또는 종양-관련 항원 결합 도메인, (ii) 수용체 단백질의 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 제1 세포내 세그먼트, 및 (iii) CD40 수용체 단백질의 제2 세포내 신호전달 도메인 또는 이의 신호 전달 단편을 포함하는 재조합 공동자극 항원 수용체(CoStAR)가 제공된다. 선택적으로, CoStAR은 자극 수용체 단백질의 세포외 세그먼트를 포함한다. 일부 구현예에서, 자극 수용체 단백질의 세포외 세그먼트는 리간드에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 자극 수용체 단백질의 세포외 세그먼트는 절단되고 리간드에 결합하지 않는다. 일부 구현예에서, 자극 수용체 단백질의 세포외 세그먼트는 조절 가능한 길이 스페이서로서 작동하여 질환- 또는 종양-관련 항원 결합 도메인이, 예를 들어, 보다 최적의 면역 시냅스를 형성하기 위해 발현되는 세포의 표면으로부터 떨어져 위치하게 한다. 일부 구현예에서, 자극 수용체 단백질의 세포외 세그먼트 및 제1 세포내 세그먼트는 동일한 수용체 단백질의 세그먼트를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포외 세그먼트 및 제1 세포내 세그먼트는 상이한 수용체 단백질의 세그먼트를 포함한다. CoStAR은 질환 또는 종양 항원 결합 도메인과 제1 세포내 도메인 사이에 개재 막횡단 도메인을 포함한다. 자극 수용체 단백질의 세포외 세그먼트가 존재할 때, 막횡단 도메인은 세포외 세그먼트와 제1 세포내 신호전달 도메인 사이에 개재된다. 일부 구현예에서, 도 28, 67, 77a 내지 77c, 83 내지 89d, 및 92의 것들(도 78 및 79의 것들을 제외함)을 포함하고, 표 2, 4 내지 5, 및 7 내지 14의 것들을 포함하고, SEQ ID NO: 42, 475 내지 479, 494 내지 498, 505, 510 내지 519, 및 840 내지 40839를 포함하는 것들, 및 컨센서스 서열 A 내지 C를 포함하는 본원에 제공된 임의의 CD40, TRAF2, TRAF2/3, 또는 TRAF6 변이체가 본 방법 및/또는 작제물 및/또는 단백질에서 사용될 수 있다. 도 78 및 79의 서열 옵션은 본원에 제공된 모든 구현예로부터 선택적으로 제외될 수 있다.
[00204] 본원에서 사용되는 "전장 단백질" 또는 "전장 수용체"는 예를 들어, CD28 수용체 단백질과 같은 수용체 단백질을 지칭한다. 용어 "전장"은 신호 펩티드가 절단되면 성숙 수용체 단백질의 말단에서 N-에 약 5개 이하 또는 10개 이하의 아미노산, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 아미노산이 결핍된 수용체 단백질을 포함한다. 예를 들어, 수용체 N-말단 신호 펩티드의 특정 절단 부위가 정의될 수 있지만, 정확한 절단 지점의 가변성이 관찰되었다. 용어 "전장"은 수용체 N-말단 신호 펩티드의 아미노산의 존재 또는 부재를 의미하지 않는다. 일 구현예에서, 용어 "전장"(예를 들어, 본 발명의 특정 양태에 따른 전장 CD28 또는 전장 CD40 세포내 도메인)은 신호 펩티드가 절단되면 성숙 수용체 단백질의 N-말단에 약 5개 이하, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5개, 또는 10개 이하의 아미노산이 결여된 N-말단 신호 펩티드가 결핍된 성숙 수용체 단백질(예를 들어, 본 발명의 특정 양태에 따른 CD28)을 포함한다. 상기 언급된 바와 같이, 본 발명의 다양한 양태에 따른 "전장" CD28 수용체 또는 다른 수용체 또는 종양 항원 결합 도메인은 신호 펩티드를 포함하지 않고, 성숙 수용체 단백질의 N-말단에서 약 5개 이하, 예를 들어, 1, 2, 3, 4개, 5개, 또는 10개 이하의 아미노산(예를 들어, N 말단 잔기 N, K, I, L 및/또는 V)이 결여될 수 있다. 이는 예시적인 융합, 예를 들어, SEQ ID No. 4 내지 12(이들은 박스 영역에 도시된 바와 같이 성숙 수용체 단백질의 N-말단에 약 5개 이하, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5개, 또는 10개 이하의 아미노산이 결여될 수 있음에 유의)에 나타난다.
[00205] CoStAR은 모듈 형태를 가지고, 질환-관련 항원, 예를 들어, 종양 관련 항원에 결합하는 항체로부터 수득된 scFv와 함께, 하나 이상의 단백질로부터 수득된 세포외, 막횡단 및 세포내 도메인을 포함하도록 작제될 수 있다.
[00206] 본 발명에 따르면, 일 구현예에서, CoStAR은 질환-관련, 예를 들어, 종양-관련, 항원 수용체, 예컨대, 비제한적으로 종양-관련 항원 특이적 scFv, 및 이의 동족 리간드에 결합하고 세포내 신호를 제공할 수 있는 일차 공동자극 수용체 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 일차 공동자극 수용체는 전장 단백질보다 작을 수 있지만, 동족 리간드에 결합하고 신호를 전달하기에 충분하다. 일부 구현예에서, 일차 공동자극 수용체 도메인은 전장 CD28과 같은 전장이지만, 이로 제한되지 않는다. 따라서, 항원 특이적 결합 도메인 및 리간드 특이적 수용체 둘 모두는 동족 항원 및 리간드에 각각 결합할 수 있다. 본원에 제공된 아미노산 서열은 여러 CoStAR 작제물의 구현예를 제공한다. 이들은 항원 결합 도메인, 선택적 스페이서, 세포외 리간드 결합 세그먼트 또는 이의 단편을 포함하는 선택적 공동자극 수용체 단백질 및 세포내 CD40 신호전달 도메인을 포함하는 CoStAR 작제물을 포함한다. 또 다른 구현예에서, CoStAR은 항원 결합 도메인, 선택적 스페이서, 공동자극 수용체 단백질의 세포외 리간드-결합 부분, 막횡단 도메인, 및 선택된 공동자극 수용체 단백질의 세포내 신호전달 도메인 및 세포내 CD40 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포외 리간드-결합 부분은 CD28 절단, 예를 들어, 아미노산 IEV 이후의 C-말단 CD28 절단을 포함하고, 세포내 신호전달 도메인이 뒤따른다. 일부 구현예에서, 세포내 신호전달 도메인은 CD40으로부터의 것이다. 세포외 리간드-결합 및 세포내 신호전달 도메인을 분리하는 막횡단 도메인은 CD28, CD40으로부터의 것일 수 있지만, 이로 제한되지 않는다. 추가 구현예에서, CoStAR은 추가적인 공동자극 도메인, 예를 들어, 제3의 세포내 공동자극 신호전달 도메인을 포함할 수 있고, 이와 관련하여 특정 키메라 항원 수용체(CAR)와 유사할 수 있고, 이는 제1(CD3ζ 단독), 제2(하나의 공동자극 도메인 + CD3ζ), 또는 제3 세대(하나 초과의 공동자극 도메인 + CD3ζ)로 분류된다.
[00207] 본 발명의 CoStAR에 유용한 공동자극 수용체 단백질은 CD2, CD9, CD26, CD27, CD28, CD29, CD38, CD40, CD43, CD46, CD49d, CD55, CD73, CD81, CD82, CD99, CD100, CD134 (OX40), CD137 (41BB), CD150 (SLAM), CD270 (HVEM), CD278 (ICOS), CD357 (GITR), 또는 EphB6을 포함하지만 이로 제한되지 않고, 이는 이들의 천연 형태로 세포외 리간드 결합 도메인 및 세포내 신호 전달 도메인을 포함한다. 예를 들어, CD2는 T 세포의 표면에서 발견되는 세포 부착 분자를 특징으로 하고, T 세포 활성화에 필요한 세포내 신호를 개시할 수 있다. CD27은 B 세포에서의 발현이 B 세포에서 항원-수용체 활성화에 의해 유도되는 TNFR 슈퍼패밀리(TNFRSF)에 속하는 유형 II 막횡단 당단백질을 특징으로 한다. CD28은 T 세포 상의 단백질 중 하나이고, 항원-제시 세포 상의 CD80(B7.1) 및 CD86(B7.2) 리간드에 대한 수용체이다. CD137(4-1BB) 리간드는 대부분의 백혈구 및 일부 비-면역 세포에서 발견된다. OX40 리간드는 DC2(수지상 세포), 대식세포, 및 B 림프구와 같은 많은 항원-제시 세포에서 발현된다. 일 구현예에서, 공동자극 수용체 단백질은 본원에 정의된 전장 CD28이다.
[00208] CD40은 종양 괴사 인자 수용체(TNFR) 슈퍼패밀리의 구성원이며, 대안적인 스플라이싱에 의해 여러 이소형이 생성된다. 이의 리간드인 CD154(CD40L로도 불림)는 주로 활성화된 T 세포에서 발현되는 단백질이다. 참고로, 인간 CD40 이소형 1 단백질 서열은 신호 펩티드(아미노산 1 내지 20), 막횡단 도메인(아미노산 194 내지 215), 및 세포질 도메인(아미노산 216 내지 277)(SEQ ID NO:32)을 포함하는 GenBank 수탁 번호 NP_001241.1에 제시되어 있다. CD40 수용체 신호전달은 TNF 수용체-관련 인자(TRAF)를 포함하지만 이로 제한되지 않는 어댑터 단백질을 포함하고, CD40 세포질 도메인은 SH3 모티프(KPTNKAPH)(SEQ ID NO:35), TRAF2 모티프(PKQE) (SEQ ID NO:36), PVQE(SEQ ID NO:37), SVQE(SEQ ID NO:38)), TRAF6 모티프(QEPQEINFP)(SEQ ID NO:39) 및 PKA 모티프(KKPTNKA)(SEQ ID NO:40), SRISVQE(SEQ ID NO:41))에 맞는 아미노산 서열을 포함하는 신호전달 성분을 포함한다. 본 발명은 TRAF-결합 아미노산 서열을 포함하는 조작된 신호전달 도메인, 예컨대, 조작된 CD40 신호전달 도메인을 추가로 포함한다. TRAF1, TRAF2, TRAF3, 및 TRAF5에 결합하는 조작된 신호전달 도메인은 주요 컨센서스 서열 (P/S/A/T)X(Q/E)E 또는 소수 컨센서스 서열 PXQXXD를 포함할 수 있고, 비제한적으로, CD30, OX40, 41BB, 및 EBV 종양단백질 LMP1과 같은 TNFR 패밀리 구성원을 포함한다(예를 들어, 문헌[Ye, H et al., The Structural Basis for the Recognition of Diverse Receptor Sequences by TRAF2. Molecular Cell, 1999; 4(3):321-30. doi: 10.1016/S1097-2765(00)80334-2; Park HH, Structure of TRAF Family: Current Understanding of Receptor Recognition. Front. Immunol. 2018; 9:1999. doi: 10.3389/fimmu.2018.01999; Chung, J.Y. et al., All TRAFs are not created equal: common and distinct molecular mechanisms of TRAF-mediated signal transduction. Journal of Cell Science 2002; 115:679-688] 참조).
[00209] 본원에 개시된 예는 CoStAR에서 공동자극 신호전달 도메인으로서 CD40의 작동을 입증하고, 추가로 사이토카인 및 케모카인 발현 프로파일이 신호전달 도메인 선택에 의해 변경된다는 것을 입증한다. 일부 구현예]에서, CoStAR의 공동자극 CD40 신호전달 도메인은 전염증성 사이토카인(예를 들어, IL-2, TNFα)을 촉진한다. 일부 구현예에서, CoStAR의 공동자극 CD40 신호전달 도메인은 면역억제성 사이토카인(예를 들어, IL-5, IL-10)을 감소시킨다. CD40 신호전달 도메인 또는 단편의 공동자극 활성은 제1 수용체 신호전달 도메인, 예컨대, 비제한적으로 CD40 신호전달 도메인 또는 단편 없이 제1 수용체 신호전달 도메인의 활성을 비교하여 CD2, CD9, CD26, CD27, CD28, CD29, CD38, CD40, CD43, CD46, CD49d, CD55, CD73, CD81, CD82, CD99, CD100, CD134 (OX40), CD137 (41BB), CD150 (SLAM), CD270 (HVEM), CD278 (ICOS), CD357 (GITR), 또는 EphB6와 같은(그러나 비제한적임) 제1 수용체 신호전달 도메인과 조합하여 관찰될 수 있다. 이와 관련하여, 특정 인자 결합 부위를 포함하는 신호전달 단편을 포함하고 공동자극 제1 신호전달 도메인과 조합하여, 특정 인자 결합 부위가 돌연변이된, 본 발명의 CD40 신호전달 도메인은 공동자극 신호전달 도메인의 제1 신호전달 도메인 단독 활성과 비교한 특정 사이토카인 및/또는 케모카인의 상대적 발현을 증진 또는 억제할 수 있다(예를 들어, 문헌[Ahonen, CL et al., The CD40-TRAF6 axis controls affinity maturation and the generation of long-lived plasma cells. Nat Immunol. 2002; 3: 451-456; Mackey MF et al., Distinct contributions of different CD40 TRAF binding sites to CD154-induced dendritic cell maturation and IL-12 secretion. Eur J Immunol. 2003; 33: 779-789; Mukundan Let al., TNF receptor-associated factor 6 is an essential mediator of CD40-activated proinflammatory pathways in monocytes and macrophages. J Immunol. 2005; 174: 1081-1090] 참조).
[00210] 일부 구현예에서, 본 발명의 CoStAR은 실질적으로 모든 CD40 공동자극 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 CoStAR은 2개 이상의 CD40 공동자극 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 CoStAR은 CD40 공동자극 도메인 신호전달 성분 또는 단편 또는 모티프를 포함한다. 일부 구현예에서, CD40 신호전달 단편 또는 모티프는 SH3 결합 서열(예를 들어, 비제한적으로, KPTNKAPH(SEQ ID NO:35), PTNKAPHP(SEQ ID NO:443) 또는 PTNKAPH(SEQ ID NO:444)), TRAF2/TRAF3 결합 서열(예를 들어, 비제한적으로, PKQE(SEQ ID NO:506), PKQET(SEQ ID NO:445), PVQE(SEQ ID NO:507), PVQET(SEQ ID NO:446), SVQE(SEQ ID NO:508), SVQET(SEQ ID NO:447)), TRAF6 결합 서열(예를 들어, 비제한적으로, PQEINF(SEQ ID NO:509), QEPQEINF(SEQ ID NO:448) 또는 QEPQEINFP(SEQ ID NO:39)) 또는 PKA 서열(예를 들어, 비제한적으로, KKPTNKA(SEQ ID NO:40), 또는 SRISVQE(SEQ ID NO:41)) 뿐만 아니라 다수의 복사체이고 임의의 순서로 배열될 수 있는 2개 이상, 또는 3개 이상, 또는 4개 이상의 이러한 성분 또는 모티프, 또는 이들의 조합을 포함하거나, 이로 구성되거나 이를 필수적 요로소 하여 구성된다. 일부 구현예에서, 본 발명의 CoStAR은 CD40 공동자극 도메인 및 CD40 공동자극 도메인 신호전달 성분 또는 모티프를 포함한다. 일부 구현예에서, CD40 신호전달 도메인의 SH3, TRAF2/TRAF3, TRAF6, 또는 PKA 모티프 중 하나 이상이 돌연변이된다. 일부 구현예에서, SH3 모티프, TRAF2/TRAF3 모티프, 및 TRAF6 모티프는 전염증성 및/또는 면역억제성 사이토카인을 조절하기에 충분하다. 일부 구현예에서, 이러한 모티프의 탠덤 복사체를 첨가하고/거나 특정 모티프를 돌연변이시키면 이러한 효과가 증폭된다.
[00211] 표 1은 TRAF2/TRAF3 결합 도메인의 비제한적인 예를 제공한다. 소수 및 주요 컨센서스 서열을 갖는 표 1의 정렬은 각각 도 82a 및 도 82b에 도시된 바와 같다.
[00212] 따라서, 본 발명의 TRAF2/TRAF3 결합 서열은 P1V2Q3E4와 같은 서열 및 변이체를 추가로 포함하며, 여기서, P1은 S, A, 또는 T로 치환되고, V2는 Q, K 또는 E로 치환되고, Q3은 E로 치환되고/거나 E4는 A로 치환된다. 이러한 변이체에서, P1V2Q3E4 중 임의의 1개, 2개, 3개, 또는 4개 모두는 치환될 수 있다. 비제한적인 예는 표 1의 위치 P-2, P-1, P0, P1에 제시되어 있다.
[00213] CD40 TRAF2/TRAF3 서열 변이체의 예시적인 비제한적인 예는 하기의, 대시 기호로 둘러싸인 P-2, P-1, P0, 및 P1의 아미노산, 및 확인된 TRAF2/TRAF3 공급원 단백질을 포함한다.
[00214] 표 3은 TRAF6 결합 서열의 비제한적인 예를 제공한다. 주요 TRAF6 공통 서열을 갖는 표 3의 정렬은 도 82c에 제시된 바와 같다.
[00215] CD40 TRAF6 서열 변이체의 예시적인 비제한적인 예는 하기의, 대시 기호로 둘러싸인 P-2, P-1, P0, P1, P2, 및 P3의 아미노산, 및 확인된 TRAF6 서열 기원을 포함한다.
[00216] 일부 구현예에서, 하나 이상의 공동자극 도메인 신호전달 성분 또는 모티프의 선택은 CoStAR이 발현될 세포 및/또는 신호전달 성분 또는 모티프로 더욱 밀접하게 확인된 원하는 공동자극 활성, 또는 신호전달 성분 또는 모티프로 더욱 밀접하게 확인된 공동자극 활성의 회피에 의해 가이딩된다.
[00217] 일부 구현예에서, CoStAR 신호전달 도메인은 CD40 공동자극 도메인 또는 이의 신호전달 성분 또는 모티프, 또는 2개 이상의 이러한 도메인 또는 성분 또는 모티프 또는 이들의 조합 이외에, 비제한적으로, CD2, CD9, CD26, CD27, CD28, CD29, CD38, CD40, CD43, CD46, CD49d, CD55, CD73, CD81, CD82, CD99, CD100, CD134 (OX40), CD137 (41BB), CD150 (SLAM), CD270 (HVEM), CD278 (ICOS), CD357 (GITR), 또는 EphB6으로부터의 추가적인 전장 공동자극 도메인 또는 이의 신호전달 성분을 포함한다.
[00218] 참고로, 인간 CD28 단백질 서열은 신호 펩티드(아미노산 1 내지 18), 세포외 도메인(아미노산 19 내지 152), 막횡단 도메인(아미노산 153 내지 179) 및 세포질 도메인(아미노산 180 내지 200)을 포함하는 GenBank 수탁 번호 NP_006130.1에 제시되어 있다. 세포외 도메인은 항원 결합 부위를 구성하는 아미노산 및 동종이량체 계면을 형성하는 아미노산을 함유하는 면역글로불린 유형 도메인(아미노산 21 내지 136)을 포함한다. 세포외 도메인은 글리코실화될 수 있는 여러 아스파라긴 잔기를 포함하고, 세포내 도메인은 인산화될 수 있는 세린 및 티로신 잔기를 포함한다.
[00219] 참고로, 인간 CD8 알파 사슬 단백질 서열은 신호 펩티드(아미노산 1 내지 21), 세포외 도메인(아미노산 22 내지 182), 막횡단 도메인(아미노산 183 내지 203), 및 세포질 도메인(아미노산 204 내지 235)을 포함한다. 세포외 도메인은 항원 결합 부위를 구성하는 아미노산 및 동종이량체 계면을 형성하는 아미노산을 함유하는 면역글로불린 유형 도메인(아미노산 28 내지 128)을 포함한다. 세포외 도메인은 글리코실화될 수 있는 여러 아스파라긴 잔기를 포함하고, 세포내 도메인은 인산화될 수 있는 세린 및 티로신 잔기를 포함한다.
[00220] 참고로, 인간 IgG4 불변 영역 서열은 CH1(아미노산 1 내지 98), 힌지(아미노산 99 내지 110), CH2(아미노산 111 내지 220), CH3(아미노산 221 내지 327)를 포함하는, UniProtKB/Swiss-Prot: 수탁 번호 P01861.1에 제시되어 있다. CH2 영역은 아미노산 177에 아스파라긴을 포함하며, 이는 글리코실화되고 Fc 수용체 및 항체-의존성 세포-매개 세포독성(ADCC)과 회합된다.
[00221] 참고로, 또 다른 TNFR 슈퍼패밀리 구성원인 인간 CD137(4-1BB)의 단백질 서열은 신호 펩티드(아미노산 1 내지 23), 세포외 도메인(아미노산 24 내지 186), 막횡단 도메인(아미노산 187 내지 213), 및 세포질 도메인(아미노산 214 내지 255)을 포함한다. 항원 제시 세포 상에서 발현된 CD137L 리간드 삼량체의 CD137에 대한 결합은 T 세포 반응성 및 생존에 관여하는 신호전달 캐스케이드의 수용체 삼량체화 및 활성화를 초래한다(Li et al., Limited Cross-Linking of 4-1BB by 4-1BB Ligand and the Agonist Monoclonal Antibody Utomilumab. Cell Reports 2018; 25:909-920). 신호전달 어댑터 TRAF-2 및 TRAF-1과의 CD137의 공동면역침전 및 상호작용에 대한 구조적 기초가 보고되었다(Ye, H et al., Molecular Cell, 1999; 4(3):321-30).
[00222] 참고로, 인간 CD134(OX40) 단백질 서열은 신호 펩티드(아미노산 1 내지 28), 세포외 도메인(아미노산 29 내지 214), 막횡단 도메인(아미노산 215 내지 235), 및 세포질 도메인(아미노산 236 내지 277)을 포함하는, GenBank 수탁 번호 NP_003318.1에 의해 제시된다. 이 수용체는 어댑터 단백질 TRAF2 및 TRAF5와의 상호작용을 통해 NF-카파B를 활성화시키는 것으로 나타났으며, 연구는 이 수용체가 아폽토시스 억제제 BCL2 및 BCL2lL1/BCL2-XL의 발현을 촉진한다고 제안한다.
[00223] 인간 T-세포 표면 항원 CD2는 적어도 2개의 이소형을 갖는다. 참고로, 인간 CD2 이소형1 단백질 서열은 신호 펩티드(아미노산 1 내지 24), 세포외 도메인(아미노산 25 내지 235), 막횡단 도메인(아미노산 236 내지 261), 및 세포질 도메인(아미노산 262 내지 377)을 포함하는, NP_001315538.1에 의해 제시된다. 인간 CD2 이소형2 단백질 서열은 NP_001758.2에 제시되어 있다.
[00224] 참고로, 인간 CD357(GITR) 이소형-1 단백질 서열은 신호 펩티드(아미노산 1 내지 25), 세포외 도메인(아미노산 26 내지 162), 막횡단 도메인(아미노산 163 내지 183), 및 세포질 도메인(아미노산 184 내지 241)을 포함하는 GenBank 수탁 번호 NP_004186.1에 의해 제시된다.
[00225] 참고로, 인간 CD29(베타1 인테그린) 단백질 서열은 신호 펩티드(아미노산 1 내지 20), 세포외 도메인(아미노산 21 내지 728), 막횡단 도메인(아미노산 729 내지 751), 및 세포질 도메인(아미노산 752 내지 798)을 포함하는 GenBank 수탁 번호 NP_596867에 의해 제시된다.
[00226] 인간 CD150(SLAM) 단백질 서열은 여러 이소형을 갖는다. 막횡단 형태의 CD150(mCD150)에 추가하여, 조혈 계통의 세포는 30개 아미노산의 전체 막횡단 영역이 없는 분비된 형태의 CD150(sCD150)을 인코딩하는 mRNA를 발현한다. 참고로, 인간 SLAM 이소형 b는 신호 펩티드(아미노산 1 내지 20), 세포외 도메인(아미노산 21 내지 237), 막횡단 도메인(아미노산 238 내지 258), 및 세포질 도메인(아미노산 259 내지 335)을 포함한다. 인간 SLAM 이소형 a는 GenBank 수탁 번호 NP_001317683.1호에 제시되어 있다.
[00227] CD278 또는 ICOS(유도성 T 세포 COStimulator)는 활성화된 T 세포 상에서 발현되는 CD28-슈퍼패밀리 공동자극 분자이다. 인간 ICOS 전구체(신호 펩티드를 갖는 199 aa)는 신호 펩티드(아미노산 1 내지 20), Ig-V-유사 도메인(아미노산 21 내지 140), 막횡단 도메인(아미노산 141 내지 161) 및 세포내 도메인 (아미노산 162 내지 199)을 포함하는, GenBank 수탁 번호 NP_036224.1에 제시되어 있다. ICOS는 IProx 모티프 서열 SSSVHDPNGE(SEQ ID NO:466)를 함유한다. IProx 모티프 서열 SSSXXXPXGE(SEQ ID NO:467)는 TRAF1(SASFQRPQSE(SEQ ID NO:468)), TRAF2(SSSFQRPVND(SEQ ID NO:469)), TRAF3(SSFKKPTGE(SEQ ID NO:470)), 및 TRAF5(SSSFKRPDGE(SEQ ID NO:471))의 특정 결합 부위와 유사하다.
[00228] DAP10, KAP10, PIK3AP로도 알려져 있는 조혈 세포 신호 전환인자(HCST), 및 조혈 세포 신호 전환인자(GenBank 수탁 번호 NP_055081.1)는 C-유형 렉틴-유사 수용체 NKG2D와의 수용체 복합체의 일부를 형성하는 것으로 생각되는 막횡단 신호전달 어댑터를 인코딩한다. 세포내 도메인은 포스파티딜이노시톨 3-키나제 결합 부위의 YxxM 모티프를 함유한다.
[00229] 본 발명의 구현예에서, CoStAR은 치료 활성을 갖는 세포, 예를 들어, 종양 침윤 림프구(TIL)의 치료 집단에서 프로모터의 제어 하에 단독으로 발현될 수 있다. 대안적으로, CoStAR은 키메라 항원 수용체(CAR) 및/또는 T-세포 수용체(TCR)와 같은 치료적 이식 유전자과 함께 발현될 수 있다(성숙 수용체 단백질의 N-말단에서 최대 약 5, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5 또는 최대 10개의 아미노산이 결여될 수 있음에 유의함). 따라서, 일 양태에서, 본 발명은 또한 성숙 수용체 단백질의 N-말단에서 약 5, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 최대 10개의 아미노산이 결여된 이러한 서열 중 하나를 포함하는, SEQ ID NO: 42 내지 185, 192 내지 335, 344 내지 430 중 어느 하나에 제시된 서열을 갖는 것들로 제한되지 않는 CoStAR 작제물에 관한 것이다. 적합한 TCR 및 CAR, 예를 들어, HLA-A*02-NYESO-1 특이적 TCR(Rapoport et al. Nat Med 2015) 또는 항-CD19scFv.CD3ζ 융합 CAR(Kochenderfer et al. J Clin Oncol 2015)은 문헌에 잘 알려져 있고, 이는 각각 골수종 또는 B-세포 악성종양을 치료하는 데 성공적으로 사용되었다. 본원에 기재된 CoStAR은 임의의 공지된 CAR 또는 TCR로 발현될 수 있으므로, 시험관내 또는 생체내 세포 확장을 가능하게 하는 조절 가능한 성장 스위치, 및 항암 활성에 대한 TCR 또는 CAR 형태의 통상적인 활성화 메커니즘을 세포에 제공할 수 있다. 따라서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 CoStAR 및 종양 관련 항원에 특이적으로 결합하는 TCR 및/또는 CAR을 포함하는 입양 세포 요법에서 사용하기 위한 세포를 제공한다. CD28을 포함하는 예시적인 CoStAR은 세포외 항원 결합 도메인 및 세포외, 막횡단 및 세포내 신호전달 도메인을 포함한다.
[00230] 본원에서 사용되는 용어 "항원 결합 도메인"은 디아바디, Fab, Fab', F(ab')2, Fv 단편, 디설파이드 안정화된 Fv 단편( dsFv), (dsFv)2, 이중특이적 dsFv(dsFv-dsFv'), 디설파이드 안정화된 디아바디(ds 디아바디), 단쇄 항체 분자(scFv), scFv 이량체(2가 디아바디), 하나 이상의 CDR을 포함하는 항체의 일부로부터 형성된 다중특이적 항체, 낙타화된 단일 도메인 항체, 나노바디, 도메인 항체, 2가 도메인 항체, 또는 항원에 결합하지만 완전한 항체 구조를 포함하지 않는 임의의 다른 항체 단편을 포함하지만, 이로 제한되지 않는 항체 단편을 지칭한다. 항원 결합 도메인은 모 항체 또는 모 항체 단편(예를 들어, 모 scFv)이 결합하는 동일한 항원에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 항원-결합 단편은 하나 이상의 상이한 인간 항체로부터의 프레임워크(FR)에 그래프팅된 특정 인간 항체로부터의 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함할 수 있다. "항원 결합 도메인"은 "리간드 결합 도메인"으로 지칭될 수 있다.
[00231] 항원 결합 도메인은 종양-관련 항원(TAA) 및 감염성 질환-관련 항원을 포함하지만 이로 제한되지 않는 임의의 질환-관련 항원에 특이적으로 만들어질 수 있다. 일부 구현예에서, 리간드 결합 도메인은 이중특이적이다. 항원은 버킷 림프종, 신경모세포종, 흑색종, 골육종, 신장 세포 암종, 유방암, 전립선암, 폐암, 및 결장암을 포함하는 대부분의 인간 암에서 확인되었다. TAA는 CD19, CD20, CD22, CD24, CD33, CD38, CD123, CD228, CD138, BCMA, GPC3, CEA, 폴레이트 수용체(FRα), 메조텔린, CD276, gp100, 5T4, GD2, EGFR, MUC-1, PSMA, EpCAM, MCSP, SM5-1, MICA, MICB, ULBP 및 HER-2를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. TAA는 신생항원, 펩티드/MHC 복합체, 및 HSP/펩티드 복합체를 추가로 포함한다.
[00232] 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 정의된 종양 특이적 펩티드-MHC 복합체에 결합하는 T-세포 수용체 또는 이의 결합 단편을 포함한다. 용어 "T 세포 수용체" 또는 "TCR"은 T 세포의 표면에서 쌍을 이루는 αβ 또는 γδ 사슬로 구성된 이종이량체 수용체를 지칭한다. 각각의 α, β, γ, 및 δ 사슬은 2개의 Ig-유사 도메인으로 구성된다: 상보성 결정 영역(CDR)을 통해 항원 인식을 부여하는 가변 도메인(V), 이어서 연결 펩티드 및 막횡단(TM) 영역에 의해 세포막에 고정된 불변 도메인(C). TM 영역은 CD3 신호전달 장치의 불변 서브유닛과 회합한다. 각각의 V 도메인은 3개의 CDR을 갖는다. 이러한 CDR은 주요 조직적합성 복합체(pMHC)에 의해 인코딩된 단백질에 결합된 항원성 펩티드 사이의 복합체와 상호작용한다(Davis and Bjorkman (1988) Nature, 334, 395-402; Davis et al. (1998) Annu Rev Immunol, 16, 523-544; Murphy (2012), xix, 868 p.).
[00233] 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 종양 발현 단백질 또는 이의 종양-결합 단편의 천연 리간드를 포함한다. 비제한적인 예는 PDL1에 결합하는 PD1이다. 또 다른 예는 세포 철 항상성 및 증식의 주요 조절자인 동종이량체성 단백질인 CD71로도 알려진 트랜스페린 수용체 1(TfR1)이다. TfR1은 광범위한 세포에서 낮은 수준으로 발현되지만, 과발현이 불량한 예후와 관련된 악성 세포를 포함하여 빠르게 증식하는 세포에서 더 높은 수준으로 발현된다. 본 발명의 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 트랜스페린 또는 이의 트랜스페린 수용체-결합 단편을 포함한다.
[00234] 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 정의된 종양 관련 항원, 예컨대, 비제한적으로 FRα, CEA, 5T4, CA125, SM5-1 또는 CD71에 특이적이다. 일부 구현예에서, 종양 관련 항원은 종양-특이적 펩티드-MHC 복합체일 수 있다. 이러한 특정 구현예에서, 펩티드는 신생항원이다. 다른 구현예에서, 종양 관련 항원은 펩티드-열 충격 단백질 복합체이다.
[00235] 다양한 구현예에서, 본 발명은 하기를 포함하는 CoStAR을 제공한다:
[00236] i. 암종배아 항원(CEA)에 결합하는 scFv, CD28의 스페이서 및 막횡단 서열, CD28 신호전달 도메인, 및 CD40 신호전달 도메인.
[00237] ii. CEA에 결합하는 scFv, CD28의 스페이서 및 막횡단 서열, 및 CD40 신호전달 도메인.
[00238] iii. CEA에 결합하는 scFv, CD28의 스페이서 및 막횡단 서열, CD137 신호전달 도메인, 및 CD40 신호전달 도메인.
[00239] iv. CEA에 결합하는 scFv, CD28의 스페이서 및 막횡단 서열, CD134 신호전달 도메인, 및 CD40 신호전달 도메인.
[00240] v. CEA에 결합하는 scFv, CD28의 스페이서 및 막횡단 서열, CD2 신호전달 도메인, 및 CD40 신호전달 도메인.
[00241] vi. CEA에 결합하는 scFv, CD28의 스페이서 및 막횡단 서열, GITR 신호전달 도메인, 및 CD40 신호전달 도메인.
[00242] vii. CEA에 결합하는 scFv, CD28의 스페이서 및 막횡단 서열, CD29 신호전달 도메인, 및 CD40 신호전달 도메인.
[00243] viii. CEA에 결합하는 scFv, CD28의 스페이서 및 막횡단 서열, CD150 신호전달 도메인, 및 CD40 신호전달 도메인.
[00244] ix. CEA에 결합하는 scFv, CD8의 스페이서 및 막횡단 서열, CD28 신호전달 도메인, 및 CD40 신호전달 도메인.
[00245] x. CEA에 결합하는 scFv, CD8의 스페이서 및 막횡단 서열, 및 CD40 신호전달 도메인.
[00246] xi. CEA에 결합하는 scFv, CD8의 스페이서 및 막횡단 서열, CD137 신호전달 도메인, 및 CD40 신호전달 도메인.
[00247] xii. CEA에 결합하는 scFv, CD8의 스페이서 및 막횡단 서열, CD134 신호전달 도메인, 및 CD40 신호전달 도메인.
[00248] xiii. CEA에 결합하는 scFv, CD8의 스페이서 및 막횡단 서열, CD2 신호전달 도메인, 및 CD40 신호전달 도메인.
[00249] xiv. CEA에 결합하는 scFv, CD8의 스페이서 및 막횡단 서열, GITR 신호전달 도메인, 및 CD40 신호전달 도메인.
[00250] xv. CEA에 결합하는 scFv, CD8의 스페이서 및 막횡단 서열, CD29 신호전달 도메인, 및 CD40 신호전달 도메인.
[00251] xvi. CEA에 결합하는 scFv, CD8의 스페이서 및 막횡단 서열, CD150 신호전달 도메인, 및 CD40 신호전달 도메인.
[00252] xvii. CEA에 결합하는 scFv, IgG4 불변 영역 및 CD28 막횡단 서열을 포함하는 스페이서, CD28 신호전달 도메인, 및 CD40 신호전달 도메인.
[00253] xviii. CEA에 결합하는 scFv, IgG4 불변 영역 및 CD28 막횡단 서열을 포함하는 스페이서, 및 CD40 신호전달 도메인.
[00254] xix. CEA에 결합하는 scFv, IgG4 불변 영역 및 CD28 막횡단 서열을 포함하는 스페이서, CD137 신호전달 도메인, 및 CD40 신호전달 도메인.
[00255] xx. CEA에 결합하는 scFv, IgG4 불변 영역 및 CD28 막횡단 서열을 포함하는 스페이서, CD134 신호전달 도메인, 및 CD40 신호전달 도메인.
[00256] xxi. CEA에 결합하는 scFv, IgG4 불변 영역 및 CD28 막횡단 서열을 포함하는 스페이서, CD2 신호전달 도메인, 및 CD40 신호전달 도메인.
[00257] xxii. CEA에 결합하는 scFv, IgG4 불변 영역 및 CD28 막횡단 서열을 포함하는 스페이서, GITR 신호전달 도메인, 및 CD40 신호전달 도메인.
[00258] xxiii. CEA에 결합하는 scFv, IgG4 불변 영역 및 CD28 막횡단 서열을 포함하는 스페이서, CD29 신호전달 도메인, 및 CD40 신호전달 도메인.
[00259] xxiv. CEA에 결합하는 scFv, IgG4 불변 영역 및 CD28 막횡단 서열을 포함하는 스페이서, CD150 신호전달 도메인, 및 CD40 신호전달 도메인.
[00260] xxv. CEA에 결합하는 scFv, IgG4 불변 영역 및 CD28 막횡단 서열을 포함하는 스페이서, 제1 CD40 신호전달 도메인 및 제2 CD40 신호전달 도메인.
[00261] xxvi. CEA에 결합하는 scFv, IgG4 불변 영역 및 CD28 막횡단 서열을 포함하는 스페이서, 제1 CD40 신호전달 도메인 및 제2 돌연변이된 CD40 신호전달 도메인.
[00262] xxvii. PDL1에 결합하는 결합 도메인, CD28의 짧은 스페이서 및 막횡단 서열, CD28 신호전달 도메인, 및 CD40 신호전달 도메인.
[00263] xxviii. PDL1에 결합하는 결합 도메인, CD28의 짧은 스페이서 및 막횡단 서열, 및 CD40 신호전달 도메인.
[00264] xxix. CD155, CD112, 또는 CD113에 결합하는 결합 도메인, CD28 막횡단 도메인, CD28 신호전달 도메인, 및 CD40 신호전달 도메인.
[00265] xxx. CD155, CD112, 또는 CD113에 결합하는 결합 도메인, CD28 막횡단 도메인, 및 CD40 신호전달 도메인.
[00266] xxxi. CEA에 결합하는 scFv, PDL1에 결합하는 결합 도메인, CD28의 짧은 스페이서 및 막횡단 서열, CD28 신호전달 도메인, 및 CD40 신호전달 도메인.
[00267] xxxii. CEA에 결합하는 scFv, PDL1에 결합하는 결합 도메인, CD28의 짧은 스페이서 및 막횡단 서열, 및 CD40 신호전달 도메인.
[00268] xxxiii. CEA에 결합하는 scFv, CD155, CD112, 또는 CD113에 결합하는 결합 도메인, CD28의 짧은 스페이서 및 막횡단 서열, CD28 신호전달 도메인, 및 CD40 신호전달 도메인.
[00269] xxxiv. CEA에 결합하는 scFv, CD155, CD112, 또는 CD113에 결합하는 결합 도메인, CD28의 짧은 스페이서 및 막횡단 서열, 및 CD40 신호전달 도메인.
[00270] xxxv. CEA에 결합하는 scFv, CD28 세포외 도메인, 및 CD28의 막횡단 서열을 포함하는 스페이서, 및 NTRK1 신호전달 도메인.
[00271] xxxvi. CEA에 결합하는 scFv, CD28 세포외 도메인 및 CD28의 막횡단 서열을 포함하는 스페이서, NTRK1 신호전달 도메인, 및 CD40 신호전달 도메인.
[00272] xxxvii. CEA에 결합하는 scFv, CD28 세포외 도메인 및 CD28의 막횡단 서열을 포함하는 스페이서, CD28 신호전달 도메인, 및 NTRK1 신호전달 도메인.
[00273] xxxviii. CEA에 결합하는 scFv, CD28 세포외 도메인 및 CD28의 막횡단 서열을 포함하는 스페이서, CD28 신호전달 도메인, NTRK1 신호전달 도메인, 및 CD40 신호전달 도메인.
[00274] xxxix. CEA에 결합하는 scFv, ICOS 세포외 도메인 및 ICOS의 막횡단 서열을 포함하는 스페이서, ICOS 신호전달 도메인, 및 CD40 신호전달 도메인
[00275] xl. CEA에 결합하는 scFv, CD28 세포외 도메인 및 CD28의 막횡단 서열을 포함하는 스페이서, CD28 신호전달 도메인, 및 ICOS 신호전달 도메인.
[00276] xli. CEA에 결합하는 scFv, CD28 세포외 도메인 및 CD28의 막횡단 서열을 포함하는 스페이서, CD28 신호전달 도메인, ICOS 신호전달 도메인, 및 CD40 신호전달 도메인.
[00277] xlii. CEA에 결합하는 scFv, CD2 세포외 도메인 및 CD2의 막횡단 서열을 포함하는 스페이서, CD2 신호전달 도메인, 및 CD40 신호전달 도메인.
[00278] xiii. CEA에 결합하는 scFv, CD28 세포외 도메인 및 CD28의 막횡단 서열을 포함하는 스페이서, CD28 신호전달 도메인, 및 CD2 신호전달 도메인.
[00279] xliv. CEA에 결합하는 scFv, CD28 세포외 도메인 및 CD28의 막횡단 서열을 포함하는 스페이서, CD28 신호전달 도메인, CD40 신호전달 도메인, 및 CD2 신호전달 도메인.
[00280] xlv. CEA에 결합하는 scFv, CD28 세포외 도메인 및 CD28의 막횡단 서열을 포함하는 스페이서, CD28 신호전달 도메인, 및 aCD137 신호전달 도메인.
[00281] xlvi. CEA에 결합하는 scFv, CD28 세포외 도메인 및 CD28의 막횡단 서열을 포함하는 스페이서, CD28 신호전달 도메인, CD40 신호전달 도메인, 및 CD137 신호전달 도메인.
[00282] xlvii. CEA에 결합하는 scFv, CD28 세포외 도메인 및 CD28의 막횡단 서열을 포함하는 스페이서, CD28 신호전달 도메인, 및 DAP10 신호전달 도메인.
[00283] xlviii. CEA에 결합하는 scFv, CD28 세포외 도메인 및 CD28의 막횡단 서열을 포함하는 스페이서, CD28 신호전달 도메인, CD40 신호전달 도메인, 및 DAP10 신호전달 도메인.
[00284] xlix. CEA에 결합하는 scFv, CD28 세포외 도메인 및 CD28의 막횡단 서열을 포함하는 스페이서, CD28 신호전달 도메인, 및 CD134 신호전달 도메인.
[00285] xlx. CEA에 결합하는 scFv, CD28 세포외 도메인 및 CD28의 막횡단 서열을 포함하는 스페이서, CD40 신호전달 도메인, 및 CD134 신호전달 도메인.
[00286] 일부 구현예에서, 본 발명은 단락 i 내지 xlx 중 어느 하나의 스페이서, 막횡단, 및 신호전달 도메인 구조에 연결된 MSLN에 결합하는 scFv를 포함하는 CoStAR을 제공한다.
[00287] 일부 구현예에서, 본 발명은 단락 i 내지 xlx 중 어느 하나의 스페이서, 막횡단, 및 신호전달 도메인 구조에 연결된 FolR1에 결합하는 scFv를 포함하는 CoStAR을 제공한다.
[00288] 일부 구현예에서, 본 발명은 i 내지 xxxiv 중 어느 하나의 스페이서, 막횡단, 및 신호전달 도메인 구조를 포함하고 scFv MOV19(SEQ ID NO: 9)의 항원-결합 단편을 포함하는 결합 도메인에 의해 FolR1에 결합하는 CoStAR을 제공한다.
[00289] 일부 구현예에서, 본 발명은 i 내지 xxxiv 중 어느 하나의 스페이서, 막횡단, 및 신호전달 도메인 구조를 포함하고 scFv MFE23(SEQ ID NO: 10)의 항원-결합 단편을 포함하는 결합 도메인에 의해 CEA에 결합하는 CoStAR을 제공한다.
[00290] 일부 구현예에서, 본 발명은 i 내지 xxvi 및 xxxi 내지 xxxiv 중 어느 하나의 스페이서, 막횡단, 및 신호전달 도메인 구조를 포함하고 scFv MFE23( K>Q)(SEQ ID NO:11)의 항원-결합 단편을 포함하는 결합 도메인에 의해 CEA에 결합하는 CoStAR을 제공한다.
[00291] 일부 구현예에서, 본 발명은 i 내지 xxvi 및 xxxi 내지 xxxiv 중 어느 하나의 스페이서, 막횡단, 및 신호전달 도메인 구조를 포함하고 인간화 scFv MFE23(hMFE23)(SEQ ID NO: 12)의 항원-결합 단편을 포함하는 결합 도메인에 의해 CEA에 결합하는 CoStAR을 제공한다.
[00292] 일부 구현예에서, 본 발명은 i 내지 xxvi 및 xxxi 내지 xxxiv 중 어느 하나의 스페이서, 막횡단, 및 신호전달 도메인 구조를 포함하고 scFv CEA6(SEQ ID NO:13)의 항원-결합 단편을 포함하는 결합 도메인에 의해 CEA에 결합하는 CoStAR을 제공한다.
[00293] 일부 구현예에서, 본 발명은 i 내지 xxvi 및 xxxi 내지 xxxiv 중 어느 하나의 스페이서, 막횡단, 및 신호전달 도메인 구조를 포함하고 scFv BW431/26(SEQ ID NO: 14)의 항원-결합 단편을 포함하는 결합 도메인에 의해 CEA에 결합하는 CoStAR을 제공한다.
[00294] 일부 구현예에서, 본 발명은 i 내지 xxvi 및 xxxi 내지 xxxiv 중 어느 하나의 스페이서, 막횡단, 및 신호전달 도메인 구조를 포함하고 scFv HuT84.66(M5A)(SEQ ID NO: 15)의 항원-결합 단편을 포함하는 결합 도메인에 의해 CEA에 결합하는 CoStAR을 제공한다.
[00295] 일부 구현예에서, 본 발명은 i 내지 xxxiv 중 어느 하나의 스페이서, 막횡단, 및 신호전달 도메인 구조를 포함하고 scFv MOV19(SEQ ID NO: 9)의 항원-결합 단편을 포함하는 결합 도메인에 의해 FolR1에 결합하는 CoStAR을 제공한다.
[00296] 일부 구현예에서, 본 발명은 i 내지 xxxiv 및 xxxi 내지 xxxiv 중 어느 하나의 스페이서, 막횡단, 및 신호전달 도메인 구조를 포함하고 scFv SS1(SEQ ID NO: 186)의 항원-결합 단편을 포함하는 결합 도메인에 의해 MSLN에 결합하는 CoStAR을 제공한다.
[00297] 일부 구현예에서, 본 발명은 i 내지 xxvi 및 xxxi 내지 xxxiv 중 어느 하나의 스페이서, 막횡단, 및 신호전달 도메인 구조를 포함하고 scFv M5(인간화 SS1)(SEQ ID NO:187)의 항원-결합 단편을 포함하는 결합 도메인에 의해 MSLN에 결합하는 CoStAR을 제공한다.
[00298] 일부 구현예에서, 본 발명은 i 내지 xxvi 및 xxxi 내지 xxxiv 중 어느 하나의 스페이서, 막횡단, 및 신호전달 도메인 구조를 포함하고 인간화 scFv HN1(SEQ ID NO: 188)의 항원-결합 단편을 포함하는 결합 도메인에 의해 MSLN에 결합하는 CoStAR을 제공한다.
[00299] 일부 구현예에서, 본 발명은 i 내지 xxvi 및 xxxi 내지 xxxiv 중 어느 하나의 스페이서, 막횡단, 및 신호전달 도메인 구조를 포함하고 scFv M912(SEQ ID NO: 189)의 항원-결합 단편을 포함하는 결합 도메인에 의해 MSLN에 결합하는 CoStAR을 제공한다.
[00300] 일부 구현예에서, 본 발명은 i 내지 xxvi 및 xxxi 내지 xxxiv 중 어느 하나의 스페이서, 막횡단, 및 신호전달 도메인 구조를 포함하고 scFv HuYP218(SEQ ID NO:190)의 항원-결합 단편을 포함하는 결합 도메인에 의해 MSLN에 결합하는 CoStAR을 제공한다.
[00301] 일부 구현예에서, 본 발명은 i 내지 xxvi 및 xxxi 내지 xxxiv 중 어느 하나의 스페이서, 막횡단, 및 신호전달 도메인 구조를 포함하고 scFv P4(SEQ ID NO: 191)의 항원-결합 단편을 포함하는 결합 도메인에 의해 MSLN에 결합하는 CoStAR을 제공한다.
[00302] 일부 구현예에서, 임의의 상기(I 내지 x1x 포함)는 도 28, 67, 77a 내지 77c, 83 내지 89d, 및 92(도 78 및 79의 것들은 제외), 및 표 2, 4 내지 5, 및 7 내지 14의 것들을 포함하고, SEQ ID NO: 42, 475 내지 479, 494 내지 498, 505, 510 내지 519, 840 내지 40839, 및 컨센서스 서열 A 내지 C를 포함하는, 본원에 제공된 CD40, TRAF2, TRAF2/3, 또는 TRAF6 변이체와 함께 사용될 수 있다.
[00303] 본원에서 사용되는 용어 "특이적으로 결합한다" 또는 "~에 특이적이다"는 측정 가능하고 재현 가능한 상호작용, 예컨대, 표적과, 생물학적 분자를 포함하는 분자의 이종 딥단의 존재 하에 표적의 존재를 결정하는 항체 또는 항체 모이어티 사이의 결합을 지칭한다. 예를 들어, 표적(에피토프일 수 있음)에 특이적으로 결합하는 항체 모이어티는 다른 표적에 대한 이의 결합보다 더 큰 친화성, 결합력으로 더 용이하게 및/또는 더 큰 지속기간으로 표적에 결합하는 항체 모이어티이다. 일부 구현예에서, 항원에 특이적으로 결합하는 항체 모이어티는 다른 표적에 대한 결합 친화성의 적어도 약 10배인 결합 친화도로 항원의 하나 이상의 항원 결정기(예를 들어, 세포 표면 항원 또는 펩티드/MHC 단백질 복합체)와 반응한다.
스페이서
[00304] 본 발명의 CoStAR은 선택적으로 항원 결합 도메인과 공동자극 수용체 사이에 스페이서 영역을 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 "스페이서"는 공동자극 단백질의 외부 리간드 결합 도메인으로부터 항원 결합 도메인을 분리하는 CoStAR의 세포외 구조 영역을 지칭한다. 스페이서는 표적화된 항원 및 수용체 리간드에 접근하기 위한 유연성을 제공한다. 일부 구현예에서, 예를 들어, 막-근위 에피토프 또는 글리코실화된 항원을 표적화하기 위해 긴 스페이서가 사용된다(문헌[Guest R.D. et al. The role of extracellular spacer regions in the optimal design of chimeric immune receptors: evaluation of four different scFvs and antigens. J. Immunother. 2005;28:203-211; Wilkie S. et al., Retargeting of human T cells to tumor-associated MUC1: the evolution of a chimeric antigen receptor. J. Immunol. 2008;180:4901-4909] 참조). 다른 구현예에서, CoStAR은, 예를 들어, 막 원위 에피토프를 표적화하기 위해 짧은 스페이서를 보유한다(문헌[Hudecek M. et al., Receptor affinity and extracellular domain modifications affect tumor recognition by ROR1-specific chimeric antigen receptor T cells. Clin. Cancer Res. 2013;19:3153-3164; Hudecek M. et al., The nonsignaling extracellular spacer domain of chimeric antigen receptors is decisive for in vivo antitumor activity. Cancer Immunol. Res. 2015;3:125-135] 참조). 일부 구현예에서, 스페이서는 IgG1, IgG2, 또는 IgG4를 포함하지만 이로 제한되지 않는 IgG 힌지의 전부 또는 일부를 포함하거나 이로부터 유래된다. "Ig 힌지로부터 유래된"은 IgG 힌지에서 삽입, 결실, 또는 돌연변이를 포함하는 스페이서를 의미한다. 일부 구현예에서, 스페이서는 비제한적으로 CH2 및/또는 CH3 도메인과 같은 하나 이상의 항체 불변 도메인의 전부 또는 일부를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, CH2 도메인의 전부 또는 일부를 포함하는 스페이서에서, CH2 도메인은 Fc 수용체에 결합하지 않도록 변형된다. 예를 들어, 골수 세포에서 Fc 수용체 결합은 CAR T 세포 기능을 손상시키는 것으로 밝혀졌다. 일부 구현예에서, 스페이서는 CD28, CD8, 또는 힌지 영역을 포함하는 다른 단백질로부터의 Ig-유사 힌지의 전부 또는 일부를 포함한다. 스페이서를 포함하는 본 발명의 일부 구현예에서, 스페이서는 1 내지 50개의 아미노산 길이이다.
[00305] 비제한적인 구현예에서, 스페이서는 본질적으로 모든 세포외 도메인, 예를 들어, CD28 세포외 도메인(즉, 약 아미노산 19, 20, 21, 또는 22 내지 약 아미노산 152) 또는 다른 TNFR 슈퍼패밀리 구성원을 포함하지만 이로 제한되지 않는 또 다른 단백질의 세포외 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 스페이서는 세포외 도메인의 일부, 예를 들어, CD28 세포외 도메인의 일부를 포함하고, Ig 도메인의 전부 또는 대부분이 결여될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 스페이서는 약 141 내지 약 152개의 CD28의 아미노산을 포함하지만 CD28 세포외 도메인의 다른 부분은 포함하지 않는다. 또 다른 구현예에서, 스페이서는 약 128 내지 약 182개의 CD8의 아미노산을 포함하지만 CD8 세포외 도메인의 다른 부분은 포함하지 않는다.
링커
[00306] 일부 구현예에서, CoStAR 세포외 도메인은 링커를 포함한다. 링커는 도메인, 예를 들어, 결합 도메인을 스페이서 또는 막횡단 도메인과 연결하는 데 사용되는 짧은 실행의 아미노산을 포함한다. 리간드에 결합하는 가요성이 있기 위해, 리간드 결합 도메인은 일반적으로 약 5 내지 25개의 아미노산을 포함하는 가요성 링커, 예를 들어, AAAGSGGSG(SEQ ID NO: 18), GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO: 431)에 의해 스페이서 또는 막횡단 도메인에 결합될 것이다. 일부 구현예에서, CoStAR은 스페이서 없이 링커에 의해 막횡단 도메인에 직접 연결된 결합 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, CoStAR은 링커 없이 스페이서에 의해 막횡단에 직접 연결된 결합 도메인을 포함한다.
신호전달 도메인
[00307] 상기 논의된 바와 같이, 일부 구현예에서, CoStAR은 CD2, CD9, CD26, CD27, CD28, CD29, CD38, CD40, CD43, CD46, CD49d, CD55, CD73, CD81, CD82, CD99, CD100, CD134(OX40), CD137(41BB), CD150(SLAM), CD270(HVEM), CD278(ICOS), CD357(GITR6.), 또는 EphB의 세포외 리간드 결합 및 세포내 신호전달 부분을 비제한적으로 포함할 수 있는 전장 일차 공동자극 수용체를 포함한다. 다른 구현예에서, 공동자극 수용체는, 예를 들어, 상기 언급된 단백질 중 하나의 세포외 리간드 결합 도메인 및 상기 언급된 단백질 중 다른 하나의 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, CoStAR의 신호전달 부분은 단일 신호전달 도메인을 포함한다. 다른 구현예에서, CoStAR의 신호전달 부분은 제2 세포내 신호전달 도메인, 예컨대, 비제한적으로, CD2, CD27, CD28, CD40, CD134(OX40), CD137(4-1BB), CD150(SLAM)을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 세포내 신호전달 도메인은 동일하다. 다른 구현예에서, 제1 및 제2 세포내 신호전달 도메인은 상이하다. 일부 구현예에서, 공동자극 수용체는 이량체화할 수 있다. 이론에 구속됨이 없이, CoStAR은 신호 개시를 위해 이량체화하거나 다른 부속 분자와 회합하는 것으로 생각된다. 일부 구현예에서, CoStAR은 막횡단 도메인 상호작용을 통해 보조 분자를 이량체화하거나 이와 회합한다. 일부 구현예에서, 이량체화 또는 부속 분자와의 회합은 공동자극 수용체의 세포내 부분, 및/또는 세포외 부분에서 공동자극 수용체 상호작용에 의해 보조된다.
막횡단 도메인
[00308] 막횡단의 주요 기능은 CoStAR을 T 세포 막에 고정시키는 것이지만, 일부 구현예에서, 막횡단 도메인은 CoStAR 기능에 영향을 미친다. 일부 구현예에서, 막횡단 도메인은 전장 일차 공동자극 수용체 도메인에 포함된다. CoStAR 작제물이 한 수용체의 세포외 도메인 및 제2 수용체의 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 본 발명의 구현예에서, 막횡단 도메인은 세포외 도메인 또는 세포내 도메인의 것일 수 있다. 일부 구현예에서, 막횡단 도메인은 CD4, CD8α, CD28, 또는 ICOS로부터의 것이다. Guedenet 등은,. 증가된 CAR T 세포 지속성 및 전반적인 항종양 효능을 갖는 ICOS 막횡단 도메인의 관련 사용을 개시하였다(Guedan S. et al., Enhancing CAR T cell persistence through ICOS and 4-1BB costimulation. JCI Insight. 2018;3:96976). 일부 구현예에서, 막횡단 도메인은 세포막에 걸쳐 있는 소수성 α 나선을 포함한다.
[00309] 일부 구현예에서, 막횡단 도메인은 약 아미노산 153 내지 약 179의 CD28 막횡단 도메인의 아미노산을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 막횡단 도메인은 약 아미노산 183 내지 약 아미노산 203의 CD8 막횡단 도메인의 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 CoStAR은 막횡단 도메인과 신호전달 도메인 사이에 여러 아미노산을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 한 작제물에서, CD8 막횡단 도메인으로부터 신호전달 도메인으로의 연결은 CD8 세포질 도메인의 여러 아미노산(예를 들어, CD8의 아미노산 204 내지 210)을 포함한다.
변이체
[00310] 일부 구현예에서, 본원에 제공된 항체 모이어티 또는 다른 모이어티의 아미노산 서열 변이체가 고려된다. 예를 들어, 항체 모이어티의 결합 친화성 및/또는 다른 생물학적 특성을 개선시키는 것이 바람직할 수 있다. 항체 모이어티의 아미노산 서열 변이체는 항체 모이어티를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 적절한 변형을 도입함으로써, 또는 펩티드 합성에 의해 제조될 수 있다. 이러한 변형은, 예를 들어, 항체 모이어티의 아미노산 서열 내의 잔기로부터의 결실, 및/또는 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 최종 작제물이 요망되는 특성, 예를 들어, 항원-결합을 보유한다면, 결실, 삽입, 및 치환의 임의의 조합이 최종 작제물에 도달하도록 이루어질 수 있다.
[00311] 일부 구현예에서, 하나 이상의 아미노산 치환, 결실, 또는 삽입을 포함하는 항체 결합 도메인 모이어티가 제공된다. 돌연변이 변화에 대한 관심 부위는 항체 결합 도메인 중쇄 및 경쇄 가변 영역(VR) 및 프레임워크(FR)를 포함한다. 아미노산 치환은 관심 결합 도메인으로 도입될 수 있고, 생성물은 요망되는 활성, 예를 들어, 보유/개선된 항원 결합 또는 감소된 면역원성에 대해 스크리닝될 수 있다. 일부 구현예에서, 아미노산 치환은 일차 공동-자극 수용체 도메인(세포외 또는 세포내), 이차 공동자극 수용체 도메인, 또는 세포외 공동-수용체 도메인 중 하나 이상으로 도입될 수 있다. 따라서, 본 발명은 본원에 특히 개시된 CoStAR 단백질 및 성분 부분 뿐만 아니라 이의 변이체, 즉, 본원에 특히 개시된 아미노산 서열과 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 87%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 CoStAR 단백질 및 성분 부분을 포함한다. 특정 서열을 언급할 때 용어 "퍼센트 유사성", "퍼센트 동일성", 및 "퍼센트 상동성"은 위스콘신 대학교 GCG 소프트웨어 프로그램 BestFit에 기재된 바와 같이 사용된다. 다른 알고리즘, 예를 들어, BLAST, psiBLAST 또는 TBLASTN(이는 문헌[Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 405-410]의 방법을 사용함), FASTA(이는 훔헌[Pearson and Lipman (1988) PNAS USA 85: 2444-2448]의 방법을 사용함)이 사용될 수 있다.
[00312] 특정 아미노산 서열 변이체는 1개의 아미노산, 2, 3, 4, 5 내지 10, 10 내지 20 또는 20 내지 30개의 아미노산의 삽입, 첨가, 치환 또는 결실에 의해 참조 서열과 상이할 수 있다. 일부 구현예에서, 변이체 서열은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 잔기가 삽입, 결실 또는 치환된 참조 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 5, 10, 15, 최대 20, 최대 30 또는 최대 40개의 잔기가 삽입, 결실 또는 치환될 수 있다.
[00313] 일부 바람직한 구현예에서, 변이체는 참조 서열과 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 보존적 치환만큼 상이할 수 있다. 보존적 치환은 아미노산을 유사한 특성을 갖는 상이한 아미노산으로 대체하는 것을 포함한다. 예를 들어, 지방족 잔기는 또 다른 지방족 잔기로 대체될 수 있고, 비극성 잔기는 또 다른 비극성 잔기로 대체될 수 있고, 산성 잔기는 또 다른 산성 잔기로 대체될 수 있고, 염기성 잔기는 또 다른 염기성 잔기로 대체될 수 있고, 극성 잔기는 또 다른 극성 잔기로 대체될 수 있거나, 방향족 잔기는 또 다른 방향족 잔기로 대체될 수 있다. 보존적 치환은, 예를 들어, 하기 그룹 내의 아미노산 사이에 있을 수 있다:
[00314] 보존적 치환은 하기 표 6에 제시되어 있다.
[00315] 아미노산은 공통 측쇄 특성에 따라 상이한 부류로 그룹화될 수 있다: a. 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile; b. 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; c. 산성: Asp, Glu; d. 염기성: His, Lys, Arg; e. 사슬 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro; 방향족: Trp, Tyr, Phe. 비보존적 치환은 이러한 부류 중 하나의 구성원을 다른 부류로 교환하는 것을 수반할 것이다.
세포
[00316] 본 발명에서 사용되는 세포는 입양 세포 요법에 유용한 임의의 림프구, 예를 들어, T-세포 또는 자연 살해(NK) 세포, NKT 세포, 감마/델타 T-세포 또는 T 조절 세포일 수 있다. 세포는 환자에 대해 동종이계 또는 자가일 수 있다.
[00317] T 세포 또는 T 림프구는 세포-매개 면역에서 중심적인 역할을 하는 림프구의 유형이다. 이들은 세포 표면에 T-세포 수용체(TCR)의 존재에 의해 B 세포 및 자연 살해 세포(NK 세포)와 같은 다른 림프구와 구별될 수 있다. 하기에 요약된 바와 같이, 다양한 유형의 T 세포가 존재한다. 세포독성 T 세포(TC 세포, 또는 CTL)는 바이러스 감염된 세포 및 종양 세포를 파괴하고, 또한 이식 거부와 관련이 있다. CTL은 이들의 표면에서 CD8 분자를 발현한다.
[00318] 이러한 세포는 모든 유핵 세포의 표면에 존재하는 MHC 클래스 I과 관련된 항원에 결합함으로써 이들의 표적을 인식한다. 조절 T 세포에 의해 분비되는 IL-10, 아데노신 및 다른 분자를 통해, CD8+ 세포는 실험적 자가면역 뇌척수염과 같은 자가면역 질환을 예방하는 무력 상태(anergic state)로 불활성화될 수 있다.
[00319] 기억 T 세포는 감염이 해결된 후 장기간 지속되는 항원-특이적 T 세포의 하위세트이다. 이들은 이들의 동족 항원에 재노출시 다수의 이펙터 T 세포로 빠르게 확장하여, 과거 감염에 대한 "기억"을 면역계에 제공한다. 기억 T 세포는 3개의 하위타입: 중심 기억 T 세포(TCM 세포) 및 2가지 유형의 이펙터 기억 T 세포(TEM 세포 및 TEMRA 세포)를 포함한다. 기억 세포는 CD4+ 또는 CD8+일 수 있다. 기억 T 세포는 전형적으로 세포 표면 단백질 CD45RO를 발현한다. 이전에 억제자 T 세포로 공지된 조절 T 세포(Treg 세포)는 면역 관용의 유지에 중요하다. 이들의 주요 역할은 면역 반응의 말미에 T 세포-매개 면역을 차단하고 흉선에서 음성 선택 과정을 탈출한 자가-반응성 T 세포를 억제하는 것이다.
[00320] 2개의 주요 부류의 CD4+ Treg 세포 - 자연 발생 Treg 세포 및 적응 Treg 세포가 기술되었다. 자연 발생 Treg 세포(CD4+CD25+FoxP3+ Treg 세포로도 알려짐)는 흉선에서 발생하고, TSLP로 활성화된 골수(CD11c+) 및 형질세포양(CD123+) 수지상 세포 둘 모두와 발달 중인 T 세포 사이의 상호작용과 관련이 있다. 자연 발생 Treg 세포는 FoxP3로 불리는 세포내 분자의 존재에 의해 다른 T 세포와 구별될 수 있다. 적응 Treg 세포(Tr1 세포 또는 Th3 세포로도 알려짐)는 정상 면역 반응 동안 기원할 수 있다.
[00321] 자연 살해 세포(또는 NK 세포)는 선천 면역 시스템의 일부를 형성하는 일종의 세포용해 세포이다. NK 세포는 MHC 독립적인 방식으로 바이러스 감염된 세포로부터의 선천 신호에 대한 신속한 반응을 제공한다. NK 세포(선천 림프구 세포의 그룹에 속함)는 큰 과립 림프구(LGL)로 정의되고, B 및 T 림프구를 생성하는 공통 림프 전구체로부터 분화된 제3 부류의 세포를 구성한다.
[00322] 일부 구현예에서, 본 발명의 치료 세포는 CoStAR을 발현하도록 조작된 자가 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 치료 세포는 CoStAR을 발현하도록 조작된 동종이계 세포를 포함한다. CoStAR을 발현하는 자가 세포는 수용자 동종항원의 TCR-매개 인식으로 인해 이식편-대-숙주 질환(GVHD)을 피하는데 유리할 수 있다. 또한, CoStAR 수용자의 면역 시스템은 주입된 CoStAR 세포를 공격하여 거부 반응을 일으킬 수 있다. 특정 구현예에서, GVHD를 예방하고 거부를 감소시키기 위해, 내인성 TcR은 게놈 편집에 의해 동종이계 CoStAR 세포로부터 제거된다.
핵산
[00323] 본 발명의 양태는 본원에 기재된 임의의 CoStAR, 폴리펩티드, 또는 단백질(이의 기능적 부분 및 기능적 변이체 포함)을 인코딩하는 본 발명의 핵산 서열을 제공한다. 본원에서 사용되는 용어 "폴리뉴클레오티드", "뉴클레오티드", 및 "핵산"은 서로 동의어로 의도된다. 당업자는 유전자 코드의 축퇴의 결과로서 다수의 상이한 폴리뉴클레오티드 및 핵산이 동일한 폴리펩티드를 인코딩할 수 있음을 이해할 것이다. 또한, 당업자는 통상적인 기술을 사용하여 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드 서열에 영향을 미치지 않는 뉴클레오티드 치환을 수행하여 폴리펩티드가 발현, 예를 들어, 코돈 최적화될 임의의 특정 숙주 유기체의 코돈 용법을 반영할 수 있음을 이해하여야 한다. 본 발명에 따른 핵산은 DNA 또는 RNA를 포함할 수 있다. 이들은 단일 가닥 또는 이중-가닥일 수 있다. 이들은 또한 이들 내에 합성 또는 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 올리고뉴클레오티드에 대한 다수의 상이한 유형의 변형이 당 분야에 공지되어 있다. 이들은 메틸포스포네이트 및 포스포로티오에이트 백본, 분자의 3' 및/또는 5' 말단에서 아크리딘 또는 폴리리신 사슬의 첨가를 포함한다. 본 발명의 목적을 위해, 폴리뉴클레오티드는 당 분야에서 이용 가능한 임의의 방법에 의해 변형될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 이러한 변형은 관심 폴리뉴클레오티드의 생체내 활성 또는 수명을 향상시키기 위해 수행될 수 있다.
[00324] 뉴클레오티드 서열과 관련하여 용어 "변이체", "상동체" 또는 "유도체"는 서열로부터 또는 서열로의 하나(또는 그 이상의) 핵산의 임의의 치환, 변이, 변형, 대체, 결실 또는 첨가를 포함한다.
[00325] 핵산 서열은 SEQ ID NO: 42 내지 247 중 어느 하나 또는 이의 변이체를 포함하지만 이로 제한되지 않는 CoStAR 단백질을 인코딩할 수 있다. 뉴클레오티드 서열은 인간 세포에서의 발현을 위해 조작된 것으로 나타난 코돈 최적화된 핵산 서열을 포함할 수 있다.
[00326] 본 발명은 또한 CoStAR을 인코딩하는 핵산 서열 및 T-세포 수용체(TCR) 및/또는 키메라 항원 수용체(CAR)를 인코딩하는 추가의 핵산 서열을 포함하는 핵산 서열을 제공한다.
[00327] 핵산 서열은 2개 이상의 핵산 서열의 공동-발현을 허용하는 서열에 의해 연결될 수 있다. 예를 들어, 작제물은 내부 프로모터, 내부 리보솜 진입 서열(IRES) 서열 또는 절단 부위를 인코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 절단 부위는 자가-절단될 수 있어, 폴리펩타이드가 생산될 때, 임의의 외부 절단 활성에 대한 필요 없이 분리된 단백질로 즉시 절단된다. 구제역 바이러스(FMDV) 및 2A 자가-절단 펩티드를 포함하는 다양한 자가-절단 부위가 공지되어 있다. 공동-발현 서열은 내부 리보솜 진입 서열(IRES)일 수 있다. 공동-발현 서열은 내부 프로모터일 수 있다.
벡터
[00328] 일 양태에서, 본 발명은 본 발명의 핵산 서열 또는 핵산 작제물을 포함하는 벡터를 제공한다.
[00329] 이러한 벡터는 핵산 서열(들) 또는 핵산 작제물(들)을 숙주 세포에 도입하여 본 발명의 제1 양태에 따른 하나 이상의 CoStAR(들), 및 선택적으로, 하나 이상의 다른 관심 단백질(POI), 예를 들어, TCR 또는 CAR을 발현시킨다. 벡터는, 예를 들어, 플라스미드 또는 바이러스 벡터, 예컨대, 레트로바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 벡터, 또는 트랜스포존-기반 벡터 또는 합성 mRNA일 수 있다.
[00330] 본 발명의 핵산은 또한 표준 유전자 전달 프로토콜을 사용하여 핵산 면역화 및 유전자 요법에 사용될 수 있다. 유전자 전달 방법은 당 분야에 공지되어 있다(예를 들어, 미국특허 제5,399,346호, 제5,580,859호, 제5,589,466호 참조, 그 전문이 본원에 참조로 포함됨).
[00331] 렌티바이러스와 같은 레트로바이러스로부터 유래된 벡터는 이식 유전자 또는 이식 유전자의 장기, 안정적인 통합 및 딸 세포에서의 이의 증식을 가능하게 하기 때문에 장기 유전자 전달을 달성하기에 적합한 도구이다. 벡터는 T 세포 또는 NK 세포를 포함하는 림프구를 형질감염시키거나 형질도입할 수 있다. 본 발명은 또한 본 발명의 핵산이 삽입된 벡터를 제공한다. CoStAR, 및 선택적으로 TCR 또는 CAR을 인코딩하는 천연 또는 합성 핵산의 발현은 전형적으로 CoStAR 및 TCR/CAR 폴리펩타이드 또는 이의 일부를 인코딩하는 핵산을 하나 이상의 프로모터에 작동 가능하게 연결하고, 작제물을 발현 벡터에 도입함으로써 달성된다.
[00332] 추가적인 프로모터 요소, 예를 들어, 인핸서는 전사 개시의 빈도를 조절한다. 전형적으로, 이들은 개시 부위의 업스트림 30 내지 110 bp 영역에 위치하지만, 최근에 다수의 프로모터가 또한 개시 부위의 다운스트림에 기능성 요소를 함유하는 것으로 밝혀졌다. 프로모터 요소 사이의 간격은 종종 가요성이어서, 요소가 서로에 대해 반전되거나 이동할 때 프로모터 기능이 보존된다. 티미딘 키나제(tk) 프로모터에서, 프로모터 요소 사이의 간격은 활성이 감소하기 시작하기 전에 50 bp 이격되게 증가될 수 있다.
[00333] 적합한 프로모터의 한 가지 예는 즉시 초기 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터 서열이다. 이러한 프로모터 서열은 이에 작동적으로 연결된 임의의 폴리뉴클레오티드 서열의 높은 수준의 발현을 유도할 수 있는 강한 구성적 프로모터 서열이다. 적합한 프로모터의 또 다른 예는 신장 성장 인자-1α(EF-1α)이다. 그러나, 유인원 바이러스 40(SV40) 초기 프로모터, 마우스 유방 종양 바이러스(MMTV), 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 긴 말단 반복부(LTR) 프로모터, MoMuLV 프로모터, MSCV 프로모터, MND 프로모터, 조류 백혈병 바이러스 프로모터, Epstein-Barr 바이러스 즉시 초기 프로모터, Rous 육종 바이러스 프로모터, 뿐만 아니라 인간 유전자 프로모터, 예컨대, 비제한적으로, 액틴 프로모터, 미오신 프로모터, 헤모글로빈 프로모터, 및 크레아틴 키나제 프로모터를 포함하지만, 이로 제한되지 않는, 다른 구성적 프로모터 서열이 또한 사용될 수 있다.
[00334] 벡터는 진핵 세포에서 복제 및 통합에 적합할 수 있다. 전형적인 클로닝 벡터는 원하는 핵산 서열의 발현의 조절에 유용한 전사 및 번역 종결자, 개시 서열, 및 프로모터를 함유한다. 바이러스 벡터 기술은 당 분야에 잘 알려져 있고, 예를 들어, 문헌[Sambrook et al. (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York)], 및 다른 바이러스 및 분자 생물학 매뉴얼(또한, WO 01/96584호; WO 01/29058호; 및 미국특허 제6,326,193호 참조)에 기재되어 있다. 일부 구현예에서, 발현된 작제물은 SEQ ID NO:42 내지 247에 제시된 바와 같다. 일부 구현예에서, 핵산은 단일 프로모터의 제어 하에 다중 이식 유전자(예를 들어, CoStAR 및 TCR 및/또는 CAR 등)의 발현을 허용하는 다중-시스트론 작제물이다. 일부 구현예에서, 이식 유전자(예를 들어, CoStAR 및 TCR 및/또는 CAR 등)은 자가-절단 2A 펩티드에 의해 분리된다. 본 발명의 핵산 작제물에 유용한 2A 펩티드의 예는 F2A, P2A, T2A 및 E2A를 포함한다. 본 발명의 다른 구현예에서, 본 발명의 핵산 작제물은 2개의 프로모터를 포함하는 다중-시스트론 작제물이고; 하나의 프로모터는 CoStAR의 발현을 구동하고 다른 프로모터는 TCR 또는 CAR의 발현을 구동한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 이중 프로모터 작제물은 단방향성이다. 다른 구현예에서, 본 발명의 이중 프로모터 작제물은 양방향성이다. CoStAR 폴리펩티드 또는 이의 일부의 발현을 평가하기 위해, 세포에 도입될 발현 벡터는 또한 바이러스 벡터를 통해 형질감염되거나 형질도입되는 것을 추구하는 세포 집단으로부터 발현 세포의 식별 및 선택을 용이하게 하기 위해 선택 가능한 마커 유전자 또는 리포터 유전자 또는 둘 모두를 함유할 수 있다.
세포의 공급원
[00335] 확장 및 유전적 변형 전에, 세포의 공급원(예를 들어, 면역 이펙터 세포, 예를 들어, T 세포 또는 NK 세포)이 대상체로부터 수득된다. 용어 "대상체"는 면역 반응이 유도될 수 있는 살아있는 유기체(예를 들어, 포유동물)를 포함하는 것으로 의도된다. 대상체의 예는 인간, 개, 고양이, 마우스, 래트, 및 이들의 트랜스제닉 종을 포함한다. T 세포는 말초 혈액 단핵 세포, 골수, 림프절 조직, 제대혈, 흉선 조직, 감염 부위로부터의 조직, 복수, 흉막 삼출, 비장 조직, 및 종양을 포함하는 다수의 공급원으로부터 수득될 수 있다.
[00336] 일 양태에서, T 세포는, 예를 들어, PERCOLL™ 구배를 통한 원심분리 또는 역류 원심 분리에 의해 적혈구를 용해시키고 단핵구를 고갈시킴으로써 말초 혈액 림프구로부터 단리된다. T 세포는 성분채집술 센터 및 T 세포가 수확되고, 유지되고, 쉽게 옮겨질 수 있는 세포 저장 시설에서 수집될 수 있다. T 세포는 동결보존되고 추후 사용을 위해 저장될 수 있다. 허용되는 저장 기간은 결정되고 검증될 수 있고, 최대 6개월, 최대 1년 또는 그 이상일 수 있다.
[00337] 일부 구현예에서, 종양 침윤 세포(TIL)는, 예를 들어, 단편화, 해부, 또는 효소 분해된 종양 생검 또는 덩어리에 의해 종양으로부터 단리 및/또는 확장된다. TIL은 출발 물질로서 종양 생검을 사용하여 2-단계 공정으로 생산될 수 있다: 단계 1(일반적으로 2 내지 3 시간에 걸쳐 수행됨) 후속 제조를 위해 출발 물질을 안정화시키는데 직접 동결보존될 수 있는 단일 세포 현탁액을 생산하기 위해 절개, 효소적 소화 및 균질화를 사용하여 종양 물질의 초기 수집 및 가공, 및 수일 또는 수년 후에 일어날 수 있는 단계 2. 단계 2는 4주에 걸쳐 수행될 수 있으며, 이는 단계 1의 생성물의 해동 및 종양 출발 물질로부터 TIL의 성장(약 2주)으로 시작하여, 세포의 양 및 이에 따른 용량을 증가시키기 위해 TIL 세포의 빠른 확장 과정(약 2주)이 뒤따르는 연속 과정일 수 있다. TIL은 세포의 액체 현탁액으로서 제형화 전에 농축되고 세척될 수 있다.
[00338] TIL 집단은 수집 후 임의의 시점에 형질도입될 수 있다. 일부 구현예에서, 동결보존된 TIL 집단은 해동 후 CoStAR을 발현하도록 형질도입된다. 일부 구현예에서, TIL 집단은 종양 출발 물질로부터의 성장 또는 초기 확장 동안 CoStAR을 발현하도록 형질도입된다. 일부 구현예에서, TIL 집단은 REP 동안, 예를 들어, 비제한적으로 REP의 약 8일 내지 약 10일 동안 CoStAR을 발현하도록 형질도입된다. 예시적인 TIL 제조는 2019년 12월 20일 출원된 출원인의 미국 특허 출원 일련 번호 62/951,559호에 기재되어 있다.
[00339] CD3+, CD28+, CD4+, CD8+, CD45RA+, 및 CD45RO+T 세포와 같은 T 세포의 특정 하위집단은 양성 또는 음성 선택 기술에 의해 추가로 단리될 수 있다. 예를 들어, 일 양태에서, T 세포는 원하는 T 세포의 양성 선택에 충분한 기간 동안 항-CD3/항-CD28-컨쥬게이션된 비드, 예를 들어, DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T와 함께 인큐베이션에 의해 단리된다. 일 양태에서, 기간은 약 30분이다. 추가의 양태에서, 기간은 30분 내지 36시간 이상의 범위이고, 그 사이의 모든 정수 값이다. 추가의 양태에서, 기간은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6시간이다. 또 다른 바람직한 양태에서, 기간은 10 내지 24시간이다. 일 양태에서, 인큐베이션 기간은 24시간이다. 더 긴 인큐베이션 시간은 다른 세포 유형에 비해 T 세포가 거의 없는 임의의 상황에서, 예컨대, 종양 조직 또는 면역손상된 개체로부터 종양 침윤 림프구(TIL)를 단리하는 데 사용될 수 있다. 또한, 더 긴 인큐베이션 시간의 사용은 CD8+ T 세포의 포획 효율을 증가시킬 수 있다. 따라서, T 세포가 CD3/CD28 비드에 결합하도록 허용되는 시간을 단순히 단축 또는 연장함으로써 및/또는 비드 대 T 세포의 비율을 증가 또는 감소시킴으로써(본원에 추가로 기재된 바와 같음), T 세포의 하위집단이 우선적으로 선택될 수 있다 배양 개시 또는 공정 동안의 다른 시점에 우선적으로 선택될 수 있다. 또한, 비드 또는 다른 표면 상의 항-CD3 및/또는 항-CD28 항체의 비율을 증가 또는 감소시킴으로써, T 세포의 하위집단은 배양 개시 또는 다른 요망되는 시점에 우선적으로 선택될 수 있다. 당업자는 본 발명의 맥락에서 다중 라운드의 선택이 또한 사용될 수 있음을 인지할 것이다. 특정 양태에서, 선택 절차를 수행하고 활성화 및 확장 과정에서 "비선택된" 세포를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. "비선택된" 세포는 또한 추가 라운드를 거칠 수 있다.
[00340] 음성 선택에 의한 T 세포 집단의 농축은 음성 선택된 세포에 고유한 표면 마커에 대한 항체의 조합으로 달성될 수 있다. 한 가지 방법은 음성으로 선택된 세포 상에 존재하는 세포 표면 마커에 대한 모노클로날 항체의 칵테일을 사용하는 음성 자기 면역부착 또는 유세포 분석을 통한 세포 분류 및/또는 선택이다. 예를 들어, 음성 선택에 의해 CD4+ 세포를 풍부하게 하기 위해, 모노클로날 항체 칵테일은 전형적으로 CD14, CD20, CD16, HLA-DR, 및 CD8에 대한 항체를 포함한다. 특정 양태에서, 전형적으로 CD4+, CD25+, CD62Lhi, GITR+, CD137, PD1, TIM3, LAG-3, CD150 및 FoxP3+를 발현하는 조절 T 세포를 풍부하게 하거나 양성으로 선택하는 것이 바람직할 수 있다. 대안적으로, 특정 양태에서, T 조절 세포는 항-CD25 컨쥬게이션된 비드 또는 다른 유사한 선택 방법에 의해 고갈된다.
[00341] 본원에 기재된 방법은, 예를 들어, 음성 선택 기술, 예를 들어, 하기 기재된 음성 선택 기술을 사용하여, 이펙터 세포, 예를 들어, T 조절 세포-고갈된 집단인 T 세포, CD25+ 고갈된 세포의 특정 하위집단의 선택을 포함할 수 있다. 바람직하게는, T 조절 고갈된 세포의 집단은 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 미만의 CD25+ 세포를 함유한다.
[00342] 표적 항원에 특이적으로 결합하는 CoStAR 이펙터 세포의 특정 하위집단은 양성 선택 기술에 의해 농축될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 이펙터 세포는 요망되는 abTCR 이펙터 세포의 양성 선택에 충분한 기간 동안 표적 항원-컨쥬게이션된 비드와의 인큐베이션에 의해 농축된다. 일부 구현예에서, 기간은 약 30분이다. 일부 구현예에서, 기간은 30분 내지 36시간 또는 그 초과의 범위이다(이러한 값 사이의 모든 범위 포함). 일부 구현예에서, 기간은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6시간이다. 일부 구현예에서, 기간은 10 내지 24시간이다. 일부 구현예에서, 인큐베이션 시간은 24시간이다. 이종 세포 집단에서 낮은 수준으로 존재하는 이펙터 세포의 단리를 위해, 24시간과 같은 더 긴 인큐베이션 시간의 사용은 세포 수율을 증가시킬 수 있다. 다른 세포 유형과 비교하여 이펙터 세포가 거의 없는 임의의 상황에서 이펙터 세포를 단리하기 위해 더 긴 인큐베이션 시간이 사용될 수 있다. 당업자는 본 발명의 맥락에서 다중 라운드의 선택이 또한 사용될 수 있음을 인지할 것이다.
[00343] 자극을 위한 T 세포는 또한 세척 단계 후에 동결될 수 있다. 혈장 및 혈소판을 제거하는 세척 단계 후, 세포는 동결 용액에 현탁될 수 있다. 많은 동결 용액 및 파라미터가 당 분야에 공지되어 있고 이러한 맥락에서 유용할 것이지만, 한 방법은 20% DMSO 및 8% 인간 혈청 알부민을 함유하는 PBS, 또는 10% 덱스트란 40 및 5% 덱스트로스, 20% 인간 혈청 알부민 및 7.5% DMSO, 또는 31.25% 플라스말라이트-A, 31.25% 덱스트로스 5%, 0.45% NaCl, 10% 덱스트란 40 및 5% 덱스트로스, 20% 인간 혈청 알부민, 및 7.5% DMSO를 함유하는 배양 배지, 또는 예를 들어, Hespan 및 PlasmaLyte A를 함유하는 다른 적합한 세포 냉동 배지를 사용하는 것을 포함하고, 이후에, 세포는 분당 1°의 속도로 -80℃로 냉동되고 액체 질소 저장 탱크의 기상 상에 저장된다. 다른 제어된 동결의 방법 뿐만 아니라 -20℃에서 또는 액체 질소에서 즉시 제어되지 않은 동결이 사용될 수 있다.
동종이계 CoStAR
[00344] 본원에 기재된 구현예에서, 면역 이펙터 세포는 동종이계 면역 이펙터 세포, 예를 들어, T 세포 또는 NK 세포일 수 있다. 예를 들어, 세포는 동종이계 T 세포, 예를 들어, 내인성 T 세포 수용체(TCR) 및/또는 인간 백혈구 항원(HLA), 예를 들어, HLA 클래스 I 및/또는 HLA 클래스 II의 발현이 없는 동종이계 T 세포일 수 있다.
[00345] 기능적 내인성 TCR이 결여된 T 세포는, 예를 들어, 이의 표면에서 임의의 기능적 TCR을 발현하지 않도록 조작될 수 있거나, 기능적 TCR을 포함하는 하나 이상의 서브유닛을 발현하지 않도록 조작될 수 있거나(예를 들어, TCR 알파, TCR 베타, TCR 감마, TCR 델타, TCR 입실론, 및/또는 TCR 제타를 발현하지 않도록(또는 감소된 발현을 나타내도록) 조작되거나), 이의 표면에 매우 적은 기능성 TCR을 생산하도록 조작될 수 있다. 대안적으로, T 세포는, 예를 들어, TCR의 하나 이상의 서브유닛의 돌연변이된 또는 말단절단된 형태의 발현에 의해 실질적으로 손상된 TCR을 발현할 수 있다. 용어 "실질적으로 손상된 TCR"은 이러한 TCR이 숙주에서 불리한 면역 반응을 일으키지 않을 것임을 의미한다.
[00346] 본원에 기재된 T 세포는, 예를 들어, 이의 표면에서 기능성 HLA를 발현하지 않도록 조작될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 T 세포는 세포 표면 발현 HLA, 예를 들어, HLA 클래스 1 및/또는 HLA 클래스 II가 하향조절되도록 조작될 수 있다. 일부 양태에서, HLA의 하향조절은 베타-2 마이크로글로불린(B2M)의 발현을 감소시키거나 제거함으로써 달성될 수 있다.
[00347] 일부 구현예에서, T 세포는 기능성 TCR 및 기능성 HLA, 예를 들어, HLA 클래스 I 및/또는 HLA 클래스 II가 결핍될 수 있다. 기능성 TCR 및/또는 HLA의 발현이 없는 변형된 T 세포는 TCR 또는 HLA의 하나 이상의 서브유닛의 녹아웃 또는 녹다운을 포함하는 임의의 적합한 수단에 의해 수득될 수 있다. 예를 들어, T 세포는 siRNA, shRNA, 클러스터링된 규칙적으로 이격된 짧은 회문 반복부(CRISPR) 전사-활성제 유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN), 또는 징크 핑거 엔도뉴클레아제(ZFN)를 사용한 TCR 및/또는 HLA의 녹다운을 포함할 수 있다.
[00348] 일부 구현예에서, 동종이계 세포는 억제 분자를 발현하지 않거나 낮은 수준으로 발현하는 세포, 예를 들어, 본원에 기재된 임의의 방법에 의해 조작된 세포일 수 있다. 예를 들어, 세포는, 예를 들어, 면역 이펙터 반응을 탑재하는 CoStAR-발현 세포의 능력을 감소시킬 수 있는 억제 분자를 발현하지 않거나 낮은 수준으로 발현하는 세포일 수 있다. 억제 분자의 예는 PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEACAM(예를 들어, CEACAM-1, CEACAM-3 및/또는 CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3(CD276), B7-H4(VTCN1), HVEM(TNFRSF14 또는 CD270), KIR, A2aR, MHC 클래스 I, MHC 클래스 II, Gal9, 아데노신, 및 TGFR 베타를 포함한다. 예를 들어, DNA, RNA 또는 단백질 수준에서의 억제에 의한 억제 분자의 억제는 CAR-발현 세포 성능을 최적화할 수 있다. 구현예에서, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 억제 핵산, 예를 들어, 억제 핵산, 예를 들어, dsRNA, 예를 들어, siRNA 또는 shRNA, 클러스터링된 규칙적으로 이격된 짧은 회문 반복부(CRISPR), 전사-활성화제 유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN), 또는 징크 핑거 엔도뉴클레아제(ZFN)가 사용될 수 있다.
[00349] 내인성 TCR 또는 HLA를 억제하기 위한 siRNA 또는 shRNA의 용도
[00350] 일부 구현예에서, TCR 발현 및/또는 HLA 발현은 T 세포에서 TCR 및/또는 HLA를 인코딩하는 핵산, 및/또는 본원에 기재된 억제 분자(예를 들어, PD1, PD-L1, PD-L1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEACAM(예를 들어, CEACAM-1, CEACAM-3 및/또는 CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3(CD276), T 세포에서 B7-H4(VTCN1), HVEM(TNFRSF14 또는 CD270), KIR, A2aR, MHC 클래스 I, MHC 클래스 II, Gal9, 아데노신, 및 TGFR 베타)를 인코딩하는 핵산을 표적화하는 siRNA 또는 shRNA를 사용하여 억제될 수 있다.
[00351] T 세포에서 siRNA 및 shRNA의 발현은 예를 들어, 렌티바이러스 발현 시스템과 같은 임의의 통상적인 발현 시스템을 사용하여 달성될 수 있다. TCR의 성분의 발현을 하향조절하는 예시적인 shRNA는, 예를 들어, 미국 공개 제2012/0321667호에 기재되어 있다. HLA 클래스 I 및/또는 HLA 클래스 II 유전자의 발현을 하향조절하는 예시적인 siRNA 및 shRNA는, 예를 들어, 미국 공개 US 2007/0036773호에 기재되어 있다.
[00352] TCR 또는 HLA를 억제하는 CRISPR
[00353] 본원에서 사용되는 "CRISPR" 또는 "TCR 및/또는 HLA를 억제하기 위한 CRISPR"는 클러스터링된 규칙적으로 이격된 짧은 회문 반복부의 세트, 또는 이러한 반복부 세트를 포함하는 시스템을 지칭한다. 본원에서 사용되는 "Cas"는 CRISPR-관련 단백질을 지칭한다. "CRISPR/Cas" 시스템은 TCR 및/또는 HLA 유전자, 및/또는 본원에 기재된 억제 분자(예를 들어, PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEACAM(예를 들어, CEACAM-1, CEACAM-3 및/또는 CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3(CD276), B7-H4(VTCN1), HVEM(TNFRSF14 또는 CD270), KIR, A2aR, MHC 클래스 I, MHC 클래스 II, GAL9, 아데노신, 및 TGFR 베타)를 침묵시키거나 돌연변이시키는 데 사용될 수 있는 CRISPR 및 Cas로부터 유래된 시스템을 지칭한다.
[00354] 자연 발생 CRISPR/Cas 시스템은 시퀀싱된 유박테리아 게놈의 약 40% 및 시퀀싱된 고세균의 90%에서 발견된다(Grissaet al. (2007) BMC Bioinformatics 8: 172). 이 시스템은 플라스미드 및 파지와 같은 외래 유전 요소에 대한 내성을 부여하고 한 형태의 획득 면역을 제공하는 일종의 원핵생물 면역 시스템이다(Barrangouet al. (2007) Science 315: 1709-1712; Marraginiet al. (2008) Science 322: 1843-1845).
[00355] T 세포의 활성화 및 확장
[00356] T 세포는 일반적으로, 예를 들어, 미국 특허 6,352,694호; 6,534,055; 6,905,680; 6,692,964; 5,858,358; 6,887,466; 6,905,681; 7,144,575; 7,067,318; 7,172,869; 7,232,566; 7,175,843; 5,883,223; 6,905,874; 6,797,514; 6,867,041; 및 미국 특허 출원 공개 제20060121005호에 기재된 바와 같은, 방법을 사용하여 활성화되고 확장될 수 있다.
[00357] 일반적으로, 본 발명의 T 세포는 CD3/TCR 복합체 관련 신호를 자극하는 제제 및 T 세포의 표면 상의 공동자극 분자를 자극하는 리간드가 부착된 표면과의 접촉에 의해 확장될 수 있다. 특히, T 세포 집단은, 예컨대, 표면 상에 고정된 항-CD3 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 항-CD2 항체와의 접촉에 의해, 또는 칼슘 이오노포어와 함께 단백질 키나제 C 활성제(예를 들어, 브리오스타틴)와의 접촉에 의해, 본원에 기재된 바와 같이 자극될 수 있다. T 세포의 표면에서 부속 분자의 공동-자극을 위해, 부속 분자에 결합하는 리간드가 사용된다. 예를 들어, T 세포의 집단은 T 세포의 증식을 자극하기에 적절한 조건 하에 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체와 접촉될 수 있다. CD4+ T 세포 또는 CD8+ T 세포의 증식을 자극하기 위해, 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체가 사용될 수 있다. 항-CD28 항체의 예는 9.3, B-T3, XR-CD28(Diaclone, Besancon, France)을 포함하고, 이는 당해 분야에 통상적으로 공지된 다른 방법과 같이 사용될 수 있다(Berg et al., Transplant Proc. 30(8):3975-3977, 1998; Haanen et al., J. Exp. Med. 190(9):13191328, 1999; Garland et al., J. Immunol Meth. 227(1-2):53-63, 1999).
[00358] 일부 구현예에서, 확창은 당업자에게 공지된 플라스크 또는 용기, 또는 가스-투과성 용기를 사용하여 수행될 수 있고, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일 또는 14일, 약 7일 내지 약 14일, 약 8일 내지 약 14일, 약 9일 내지 약 14일, 약 10일 내지 약 14일, 약 11일 내지 약 14일, 약 12일 내지 약 14일, 또는 약 13일 내지 약 14일 동안 진행될 수 있다. 일부 구현예에서, 제2 TIL 확장은 약 14일 동안 진행될 수 있다.
[00359] 일부 구현예에서, 확장은 인터루킨-2(IL-2) 또는 인터루킨-15(IL-15)의 존재 하에 비-특이적 T-세포 수용체 자극을 사용하여 수행될 수 있다. 비-특이적 T-세포 수용체 자극은, 예를 들어, 항-CD3 항체, 예컨대, 약 30 ng/ml의 OKT3, 마우스 모노클로날 항-CD3 항체(Ortho-McNeil, Raritan, NJ 또는 Miltenyi Biotech, Auburn, CA로부터 상업적으로 입수 가능함) 또는 UHCT-1(BioLegend, San Diego, CA, USA로부터 상업적으로 입수 가능함)을 포함할 수 있다. CoStAR 세포는 이의 항원성 부분, 예컨대, 에피토프(들)를 포함하는, 암의 하나 이상의 항원을 포함함으로써 시험관 내에서 확장될 수 있고, 이는 선택적으로 300 IU/mL IL-2 또는 IL-15와 같은 T-세포 성장 인자의 존재 하에 벡터, 예컨대, 인간 백혈구 항원 A2(HLA-A2) 결합 펩티드, 예를 들어, 0.3 uM MART-1:26-35(27L) 또는 gp100:209-217(210M)로부터 선택적으로 발현될 수 있다. 다른 적합한 항원은, 예를 들어, NY-ESO-1, TRP-1, TRP-2, 티로시나제 암 항원, MAGE-A3, SSX-2, 및 VEGFR2, 또는 이들의 항원성 부분을 포함할 수 있다. CoStAR 세포는 또한 HLA-A2-발현 항원-제시 세포 상으로 펄싱된 암의 동일한 항원(들)으로의 재-자극에 의해 빠르게 확장될 수 있다. 대안적으로, CoStAR 세포는, 예를 들어, 조사된 자가 림프구 또는 조사된 HLA-A2+ 동종이계 림프구 및 IL-2로 추가로 자극될 수 있다. 일부 구현예에서, 자극은 확장의 일부로서 발생한다. 일부 구현예에서, 확장은 조사된 자가 림프구의 존재 하에 또는 조사된 HLA-A2+ 동종이계 림프구 및 IL-2와 함께 발생한다.
[00360] 일부 구현예에서, 세포 배양 배지는 IL-2를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 배양 배지는 약 1000 IU/mL, 약 1500 IU/mL, 약 2000 IU/mL, 약 2500 IU/mL, 약 3000 IU/mL, 약 3500 IU/mL, 약 4000 IU/mL, 약 4500 IU/mL, 약 5000 IU/mL, 약 5500 IU/mL, 약 6000 IU/mL, 약 6500 IU/mL, 약 7000 IU/mL, 약 7500 IU/mL, 또는 약 8000 IU/mL, 또는 1000 내지 2000 IU/mL, 2000 내지 3000 IU/mL, 3000 내지 4000 IU/mL, 4000 내지 5000 IU/mL, 5000 내지 6000 IU/mL, 6000 내지 7000 IU/mL, 7000 내지 8000 IU/mL, 또는 8000 IU/mL의 IL-2를 포함한다.
[00361] 일부 구현예에서, 세포 배양 배지는 OKT3 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 배양 배지는 약 0.1 ng/mL, 약 0.5 ng/mL, 약 1 ng/mL, 약 2.5 ng/mL, 약 5 ng/mL, 약 7.5 ng/mL, 약 10 ng/mL, 약 15 ng/mL, 약 20 ng/mL, 약 25 ng/mL, 약 30 ng/mL, 약 35 ng/mL, 약 40 ng/mL, 약 50 ng/mL, 약 60 ng/mL, 약 70 ng/mL, 약 80 ng/mL, 약 90 ng/mL, 약 100 ng/mL, 약 200 ng/mL, 약 500 ng/mL, 약 1 ㎍/mL 또는 0.1 ng/mL 내지 1 ng/mL mL, 1 ng/mL 내지 5 ng/mL, 5 ng/mL 내지 10 ng/mL, 10 ng/mL 내지 20 ng/mL, 20 ng/mL 내지 30 ng/mL, 30 ng/mL mL 및 40 ng/mL, 40 ng/mL 내지 50 ng/mL, 또는 50 ng/mL 내지 100 ng/mL의 OKT3 항체를 포함한다.
[00362] 일부 구현예에서, IL-2, IL-7, IL-15, 및/또는 IL-21의 조합은 확장 동안 조합으로서 사용된다. 일부 구현예에서, IL-2, IL-7, IL-15, 및/또는 IL-21 뿐만 아니라 이들의 임의의 조합이 확장 동안 포함될 수 있다. 일부 구현예에서, IL-2, IL-15, 및 IL-21의 조합은 확장 동안 조합으로 사용된다. 일부 구현예에서, IL-2, IL-15, 및 IL-21 뿐만 아니라 이들의 임의의 조합이 포함될 수 있다.
[00363] 일부 구현예에서, 확장은 IL-2, OKT-3, 및 항원-제시 피더 세포를 포함하는 보충된 세포 배양 배지에서 수행될 수 있다.
[00364] 일부 구현예에서, 확장 배양 배지는 약 500 IU/mL의 IL-15, 약 400 IU/mL의 IL-15, 약 300 IU/mL의 IL-15, 약 200 IU/mL의 IL-15, 약 180 IU/mL의 IL-15, 약 160 IU/mL의 IL-15, 약 140 IU/mL의 IL-15, 약 120 IU/mL의 IL-15, 또는 약 100 IU/mL의 IL-15, 또는 약 500 IU/mL의 IL-15 내지 약 100 IU/mL의 IL-15, 또는 약 400 IU/mL의 IL-15 내지 약 100 IU/mL의 IL-15 또는 약 300 IU/mL의 IL-15 내지 약 100 IU/mL의 IL-15 또는 약 200 IU/mL의 IL-15, 또는 약 180 IU/mL의 IL-15를 포함한다.
[00365] 일부 구현예에서, 확장 배양 배지는 약 20 IU/mL의 IL-21, 약 15 IU/mL의 IL-21, 약 12 IU/mL의 IL-21, 약 10 IU/mL의 IL-21, 약 5 IU/mL의 IL-21, 약 4 IU/mL의 IL-21, 약 3 IU/mL의 IL-21, 약 2 IU/mL의 IL-21, 약 1 IU/mL의 IL-21, 또는 약 0.5 IU/mL의 IL-21, 또는 약 20 IU/mL의 IL-21 내지 약 0.5 IU/mL의 IL-21, 또는 약 15 IU/mL의 IL-21 내지 약 0.5 IU/mL의 IL- 21, 또는 약 12 IU/mL의 IL-21 내지 약 0.5 IU/mL의 IL-21, 또는 약 10 IU/mL의 IL-21 내지 약 0.5 IU/mL의 IL-21, 또는 약 5 IU/mL IL-21 내지 약 1 IU/mL의 IL-21, 또는 약 2 IU/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 배양 배지는 약 1 IU/mL의 IL-21, 또는 약 0.5 IU/mL의 IL-21을 포함한다.
[00366] 일부 구현예에서, 항원-제시 피더 세포(APC)는 PBMC이다. 일부 구현예에서, 확장에서 CoStAR 세포 대 PBMC 및/또는 항원-제시 세포의 비는 약 1 내지 25, 약 1 내지 50, 약 1 내지 100, 약 1 내지 125, 약 1 내지 150, 약 1 내지 175, 약 1 내지 200, 약 1 내지 225, 약 1 내지 250, 약 1 내지 275, 약 1 내지 300, 약 1 내지 325, 약 1 내지 350, 약 1 내지 375, 약 1 내지 400, 또는 약 1 내지 500, 또는 1 내지 50 내지 1 내지 300, 또는 1 내지 100 내지 1 내지 200이다.
[00367] 특정 양태에서, T 세포에 대한 일차 자극 신호 및 공동자극 신호는 상이한 프로토콜에 의해 제공될 수 있다. 예를 들어, 각각의 신호를 제공하는 제제는 용액에 있거나 표면에 커플링될 수 있다. 표면에 커플링될 때, 제제는 동일한 표면에(즉, "시스" 포메이션으로) 또는 분리된 표면에(즉, "트랜스" 포메이션으로) 커플링될 수 있다. 대안적으로, 하나의 제제는 표면에 커플링될 수 있고, 다른 제제는 용액 중에 있을 수 있다. 일 양태에서, 공동자극 신호를 제공하는 제제는 세포 표면에 결합되고, 일차 활성화 신호를 제공하는 제제는 용액에 있거나 표면에 커플링된다. 특정 양태에서, 둘 모두의 제제는 용액 상태일 수 있다. 일 양태에서, 제제는 가용성 형태일 수 있고, 이후 Fc 수용체 또는 제제에 결합할 항체 또는 다른 결합제를 발현하는 세포와 같은 표면에 가교될 수 있다. 이와 관련하여, 예를 들어, 본 발명에서 T 세포를 활성화 및 확장시키는 데 사용하기 위해 고려되는 인공 항원 제시 세포(aAPC)에 대해서는 미국 특허 출원 공개 제20040101519호 및 제20060034810호가 참조된다.
[00368] 일 양태에서, 2개의 제제는 동일한 비드, 즉, "시스" 또는 분리된 비드에, 즉, "트랜스"로 비드 상에 고정된다. 일 예로서, 일차 활성화 신호를 제공하는 제제는 항-CD3 항체 또는 이의 항원-결합 단편이고, 공동자극 신호를 제공하는 제제는 항-CD28 항체 또는 이의 항원-결합 단편이고; 둘 모두의 제제는 동일한 분자 양으로 동일한 비드에 공동-고정화된다. 일 양태에서, CD4+ T 세포 확장 및 T 세포 성장을 위해 비드에 결합된 각 항체의 1:1 비율이 사용된다. 본 발명의 특정 양태에서, 비드에 결합된 항 CD3:CD28 항체의 비율은 1:1의 비를 사용하여 관찰된 확장과 비교하여 T 세포 확장의 증가가 관찰되도록 사용된다. 한 특정 양태에서, 1:1의 비를 사용하여 관찰된 확장과 비교하여 약 1 내지 약 3배의 증가가 관찰된다. 일 양태에서, 비드에 결합된 CD3:CD28 항체의 비율은 100:1 내지 1:100의 범위이고, 이들 사이의 모든 정수 값이다. 본 발명의 일 양태에서, 항-CD3 항체보다 더 많은 항-CD28 항체가 입자에 결합되며, 즉, CD3:CD28의 비는 1 미만이다. 본 발명의 특정 양태에서, 비드에 결합된 항 CD28 항체 대 항 CD3 항체의 비는 2:1 초과이다. 한 특정 양태에서, 비드에 결합된 항체의 1:100 CD3:CD28 비율이 사용된다. 일 양태에서, 비드에 결합된 항체의 1:75 비율의 CD3:CD28이 사용된다. 추가의 양태에서, 비드에 결합된 항체의 1:50 비의 CD3:CD28이 사용된다. 일 양태에서, 비드에 결합된 항체의 1:30 비의 CD3:CD28이 사용된다. 한 가지 바람직한 양태에서, 비드에 결합된 항체의 1:10 비의 CD3:CD28이 사용된다. 일 양태에서, 비드에 결합된 항체의 1:3 비의 CD3:CD28이 사용된다. 또 하나의 양태에서, 비드에 결합된 항체의 3:1 비의 CD3:CD28이 사용된다.
[00369] 1:500 내지 500:1의 입자 대 세포의 비율 및 그 사이의 임의의 정수 값은 T 세포 또는 다른 표적 세포를 자극하는 데 사용될 수 있다. 당업자가 용이하게 이해할 수 있는 바와 같이, 입자 대 세포의 비율은 표적 세포에 대한 입자 크기에 의존할 수 있다. 예를 들어, 작은 크기의 비드는 소수의 세포에만 결합할 수 있는 반면, 더 큰 비드는 많은 세포에 결합할 수 있다. 특정 양태에서, 세포 대 입자의 비는 1:100 내지 100:1의 범위, 및 이들 사이의 임의의 정수 값이고, 추가의 양태에서, 비는 1:9 내지 9:1, 및 그 사이의 임의의 정수 값을 포함하고 이러한 것이 또한 T 세포를 자극하는 데 사용될 수 있다. T 세포 자극을 초래하는 항-CD3- 및 항-CD28-커플링된 입자 대 T 세포의 비율은 상기 언급된 바와 같이 다양할 수 있지만, 특정 바람직한 값은 1:100, 1:50, 1:40, 1:30, 1:20, 1:10, 1:9, 1:8, 1:7, 1:6, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2, 1:1, 2:1, 3: 1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 및 15:1이고, 하나의 바람직한 비율은 T 세포 당 적어도 1:1 입자이다. 일 양태에서, 1:1 이하의 입자 대 세포의 비가 사용된다. 한 특정 양태에서, 바람직한 입자:세포 비는 1:5이다. 추가 양태에서, 입자 대 세포의 비율은 자극일에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 일 양태에서, 입자 대 세포의 비율은 첫날에 1:1 내지 10:1이고, 추가 입자가 1:1 내지 1:10(첨가 당일의 세포 수를 기준으로 함)의 최종 비율로 최대 10일 동안 매일 또는 격일로 세포에 첨가된다. 한 특정 양태에서, 입자 대 세포의 비는 자극 첫째 날에 1:1이고, 자극 3일 및 5일째에 1:5로 조정된다. 일 양태에서, 입자는 자극 제1일에 1:1, 및 자극 3일 및 5일에 1:5의 최종 비율로 매일 또는 격일로 첨가된다. 일 양태에서, 입자 대 세포의 비는 자극 제1일에 2:1이고 자극 제3일 및 제5일에 1:10으로 조정된다. 일 양태에서, 입자는 자극 제1일에 1:1, 및 자극 3일 및 5일에 1:10의 최종 비율로 매일 또는 격일로 첨가된다. 당업자는 다양한 다른 비율이 본 발명에 사용하기에 적합할 수 있음을 이해할 것이다. 특히, 비율은 입자 크기 및 세포 크기 및 유형에 따라 달라질 것이다. 일 양태에서, 사용을 위한 가장 전형적인 비율은 첫날에 1:1, 2:1 및 3:1 부근이다.
[00370] 본 발명의 추가 양태에서, T 세포와 같은 세포는 제제-코팅된 비드와 조합하고, 비드 및 세포를 후속적으로 분리한 다음, 세포를 배양한다. 대안적인 양태에서, 배양 전에, 제제-코팅된 비드 및 세포는 분리되지 않고 함께 배양된다. 추가의 양태에서, 비드 및 세포는 먼저 자력과 같은 힘의 적용에 의해 농축되어, 세포 표면 마커의 라이게이션을 증가시켜 세포 자극을 유도한다.
CoStar 세포의 제조
[00371] 바이러스- 및 비-바이러스-기반 유전 공학 도구는 치료 유전자의 영구적 또는 일시적 발현을 초래하는 T 세포, NK 세포를 비제한적으로 포함하는 CoStAR 세포를 생성하는 데 사용될 수 있다. 레트로바이러스-기반 유전자 전달은 CAR을 숙주 세포 게놈에 영구적으로 통합하는 데 사용된 성숙하고 잘 특성화된 기술이다(Scholler J., e.g. Decade-long safety and function of retroviral-modified chimeric antigen receptor T cells. Sci. Transl. Med. 2012;4:132ra53; Rosenberg S.A. et al., Gene transfer into humans―immunotherapy of patients with advanced melanoma, using tumor-infiltrating lymphocytes modified by retroviral gene transduction. N. Engl. J. Med. 1990;323:570-578)
[00372] 비-바이러스 DNA 형질감염 방법이 또한 사용될 수 있다. 예를 들어, Singh 등은 CAR T 세포를 조작하기 위해 개발된 슬리핑 뷰티(Sleeping Beauty; SB) 트랜스포존 시스템의 사용을 기술하고(Singh H., et al., Redirecting specificity of T-cell populations for CD19 using the Sleeping Beauty system. Cancer Res. 2008;68:2961-2971), 임상 시험에서 사용되고 있다(예를 들어, ClinicalTrials.gov: NCT00968760 및 NCT01653717 참조). 동일한 기술이 CoStAR 세포를 조작하는데 적용 가능하다.
[00373] 이식 유전자를 전달하기 위해 다수의 SB 효소가 사용되었다. Mates는 1세대 트랜스포사제와 비교할 때 효율이 대략 100배 향상된 과활성 트랜스포사제(SB100X)를 기술한다. SB100X는 조혈 줄기 또는 전구 세포가 풍부한 인간 CD34(+) 세포에서 35 내지 50%의 안정한 유전자 전달을 지원하였고(Mates L. et al., Molecular evolution of a novel hyperactive Sleeping Beauty transposase enables robust stable gene transfer in vertebrates. Nat. Genet. 2009;41:753-761), 다중 이식 유전자는 다중시스트론 단일 플라스미드(Thokala R. et al., Redirecting specificity of T cells using the Sleeping Beauty system to express chimeric antigen receptors by mix-and-matching of VL and VH domains targeting CD123+ tumors. PLoS ONE. 2016;11:e0159477) 또는 다중 플라스미드(예를 들어, Hurton L.V. et al., Tethered IL-15 augments antitumor activity and promotes a stem-cell memory subset in tumor-specific T cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2016;113:E7788-E7797)로부터 전달될 수 있다. 이러한 시스템은 본 발명의 CoStAR과 함께 사용된다.
[00374] Morita 등은 더 큰 이식 유전자를 통합하기 위한 piggyBac 트랜스포존 시스템을 기술한다(Morita D. et al., Enhanced expression of anti-CD19 chimeric antigen receptor in piggyBac transposon-engineered T cells. Mol. Ther. Methods Clin. Dev. 2017;8:131-140). Nakazawa 등은 HER2-특이적 키메라 항원 수용체를 발현하는 EBV-특이적 세포독성 T-세포를 생성하기 위한 시스템의 사용을 기술한다(Nakazawa Y et al, PiggyBac-mediated cancer immunotherapy using EBV-specific cytotoxic T-cells expressing HER2-specific chimeric antigen receptor. Mol. Ther. 2011;19:2133-2143). Manuri 등은 CD-19 특이적 T 세포를 생성하기 위해 시스템을 사용하였다(Manuri P.V.R. et al., piggyBac transposon/transposase system to generate CD19-specific T cells for the treatment of B-lineage malignancies. Hum. Gene Ther. 2010;21:427-437).
[00375] 트랜스포존 기술은 쉽고 경제적이다. 한 가지 잠재적인 단점은 현재 사용되는 더 긴 확장 프로토콜이 T 세포 분화, 손상된 활성 및 주입된 세포의 불량한 지속성을 초래할 수 있다는 것이다. Monjezi 등은 더 높은 효율 통합을 통해 이러한 어려움을 최소화하는 개발 미니서클 벡터를 기술한다(Monjezi R. et al., Enhanced CAR T-cell engineering using non-viral Sleeping Beauty transposition from minicircle vectors. Leukemia. 2017;31:186-194). 이러한 트랜스포존 기술은 본 발명의 CoStAR에 사용될 수 있다.
약학적 조성물
[00376] 본 발명은 또한 약학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제, 및 선택적으로 하나 이상의 추가의 약학적으로 활성인 폴리펩티드 및/또는 화합물과 함께 본 발명의 벡터 또는 CoStAR 발현 세포를 함유하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
[00377] 일부 구현예에서, 상기 기재된 CoStAR 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학적 조성물이 제공된다. 일부 구현예에서, 상기 기재된 임의의 구현예에 따른 CoStAR을 인코딩하는 핵산 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학적 조성물이 제공된다. 일부 구현예에서, 상기 기재된 CoStAR을 발현하는 이펙터 세포 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학적 조성물이 제공된다. 이러한 제형은, 예를 들어, 정맥내 주입에 적합한 형태일 수 있다.
[00378] 본원에서 사용되는 "약학적으로 허용되는" 또는 "약리학적으로 적합한"은 생물학적으로 또는 달리 바람직하지 않은 물질이 아닌 물질을 의미하며, 예를 들어, 물질은 임의의 유의한 바람직하지 않은 생물학적 효과를 야기하지 않거나 또는 함유된 조성물의 임의의 다른 성분과 유해한 방식으로 상호작용하지 않으면서 환자에게 투여되는 약학적 조성물에 혼입될 수 있다. 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제는 바람직하게는 독성학 및 제조 시험의 요구되는 표준을 충족하고/거나 미국 식품의약국(US Food and Drug Administration)에 의해 제조된 비활성 성분 지침(Inactive Ingredient Guide)에 포함된다.
[00379] 본 발명의 양태는 재조합 CoStAR을 발현하는 변형된 T 세포의 집단을 제공한다. 적합한 집단은 상기 기재된 방법에 의해 생산될 수 있다.
[00380] 변형된 T 세포의 집단은 의약으로서 사용하기 위한 것일 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 변형된 T 세포의 집단은 암 면역요법 요법, 예를 들어, 입양 T 세포 요법에 사용될 수 있다.
[00381] 본 발명의 다른 양태는 암 치료를 위한 의약의 제조를 위한 본원에 기재된 바와 같은 변형된 T 세포의 집단, 암의 치료를 위한 본원에 기재된 바와 같은 변형된 T 세포의 집단의 용도를 제공하며, 암 치료 방법은 이를 필요로 하는 개체에게 본원에 기재된 바와 같은 변형된 T 세포의 집단을 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
[00382] 변형된 T 세포의 집단은 자가 유래일 수 있고, 즉, 변형된 T 세포는 이들이 후속하여 투여되는 동일한 개체로부터 원래 수득되었다(즉, 공여자 및 수용자 개체가 동일하다). 개체에 투여하기 위한 적합한 변형된 T 세포 집단은 개체로부터 수득된 T 세포의 초기 집단을 제공하는 단계, cAMP PDE 또는 이의 단편 및 개체에서의 암 세포에 특이적으로 결합하는 항원 수용체를 발현하도록 T 세포를 변형시키는 단계, 및 변형된 T 세포를 배양하는 단계를 포함하는 방법에 의해 생산될 수 있다.
[00383] 변형된 T 세포의 집단은 동종이계일 수 있고, 즉, 변형된 T 세포는 원래 이들이 후속 투여되는 개체와 상이한 개체로부터 수득되었다(즉, 공여자 및 수용자 개체는 상이하다). 공여자 및 수용자 개체는 GVHD 및 다른 바람직하지 않은 면역 효과를 피하기 위해 HLA 매칭될 수 있다. 수용자 개체에게 투여하기에 적합한 변형된 T 세포 집단은 공여자 개체로부터 수득된 T 세포의 초기 집단을 제공하는 단계, 수용자 개체에서의 암 세포에 특이적으로 결합하는 CoStAR을 발현하도록 T 세포를 변형시키는 단계 및 변형된 T 세포를 배양하는 단계를 포함하는 방법에 의해 생산될 수 있다.
[00384] 변형된 T 세포의 투여 후, 수용자 개체는 수용자 개체에서 암 세포에 대한 T 세포 매개 면역 반응을 나타낼 수 있다. 이는 개체의 암 상태에 유익한 효과를 가질 수 있다.
[00385] 암 상태는 악성 암 세포의 비정상적인 증식을 특징으로 할 수 있고, 백혈병, 예컨대, AML, CML, ALL 및 CLL, 림프종, 예컨대, 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종 및 다발성 골수종, 및 고형암, 예컨대, 육종, 피부암, 흑색종, 방광암, 뇌암, 유방암, 자궁암, 난소암, 전립선암, 폐암, 결장직장암, 자궁경부암, 간암, 두경부암, 식도암, 췌장암, 신장암, 부신 암, 위암, 고환암, 담낭암 및 담도암, 갑상선암, 흉선암, 골암, 및 뇌암 뿐만 아니라 원발성 미상암(CUP)을 포함할 수 있다.
[00386] 개체 내의 암 세포는 개체의 정상 체세포와 면역학적으로 구별될 수 있다(즉, 암성 종양은 면역원성일 수 있다). 예를 들어, 암 세포는 암 세포에 의해 발현된 하나 이상의 항원에 대해 개체에서 전신 면역 반응을 유발할 수 있다. 면역 반응을 유발하는 종양 항원은 암 세포에 특이적일 수 있거나 개체에서 하나 이상의 정상 세포에 의해 공유될 수 있다.
[00387] 상기 기재된 바와 같은 치료에 적합한 개체는 포유동물, 예컨대, 설치류(예를 들어, 기니피그, 햄스터, 래트, 마우스), 뮤린(예를 들어, 마우스), 개과(예를 들어, 개), 고양이과(예를 들어, 고양이), 말(예를 들어, 말), 영장류, 유인원(예를 들어, 원숭이 또는 유인원), 원숭이(예를 들어, 마모셋, 비비), 원숭이(예를 들어, 고릴라, 침팬지, 오랑우탄, 긴팔원숭이), 또는 인간일 수 있다.
[00388] 바람직한 구현예에서, 개체는 인간이다. 다른 바람직한 구현예에서, 비-인간 포유동물, 특히 인간(예를 들어, 뮤린, 영장류, 돼지, 개, 또는 토끼 동물)에서 치료 효능을 입증하기 위한 모델로서 통상적으로 사용되는 포유동물이 사용될 수 있다.
치료 방법
[00389] 용어 "치료적 유효량"은 개체에서 질환 또는 장애를 "치료"하는데 효과적인, 본원에 개시된 바와 같은 CoStAR 또는 CoStAR을 포함하는 조성물의 양을 지칭한다. 암의 경우, 치료적 유효량의 본원에 개시된 바와 같은 CoStAR 또는 CoStAR을 포함하는 조성물은 암 세포의 수를 감소시킬 수 있고; 종양 크기 또는 중량을 감소시킬 수 있고; 말초 기관으로의 암 세포 침윤을 억제(즉, 어느 정도 늦추고 바람직하게는 중지)시킬 수 있고; 종양 전이를 억제(즉, 어느 정도 늦추고 바람직하게는 중지)시킬 수 있고; 종양 성장을 어느 정도 억제할 수 있고; 및/또는 암과 관련된 하나 이상의 증상을 어느 정도 경감시킬 수 있다. 본원에 개시된 바와 같은 CoStAR 또는 CoStAR을 포함하는 조성물이 성장을 예방하고/거나 기존의 암 세포를 사멸시킬 수 있는 정도까지, 이는 세포증식억제성 및/또는 세포독성일 수 있다. 일부 구현예에서, 치료적 유효량은 성장 억제량이다. 일부 구현예에서, 치료적 유효량은 환자의 무진행 생존을 개선시키는 양이다. 바이러스 감염과 같은 감염성 질환의 경우, 치료적 유효량의 본원에 개시된 바와 같은 CoStAR 또는 CoStAR을 포함하는 조성물은 병원체에 의해 감염된 세포의 수를 감소시킬 수 있고; 병원체-유래 항원의 생산 또는 방출을 감소시킬 수 있고; 감염되지 않은 세포로의 병원체의 확산을 억제(즉, 어느 정도 늦추고 바람직하게는 중지)시킬 수 있고; 및/또는 감염과 관련된 하나 이상의 증상을 어느 정도 경감시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 치료적 유효량은 환자의 생존을 연장하는 양이다.
[00390] 본 발명의 방법에 사용하기 위한 CoStAR을 발현하는 T 및 NK 세포를 포함하는 세포는 환자 자신의 말초 혈액(자가)으로부터 생체외에서, 또는 공여자 말초 혈액으로부터 조혈 줄기 세포 이식(동종이계), 또는 연결되지 않은 공여자로부터의 말초 혈액(동종이계)의 환경에서 생성될 수 있다. 대안적으로, T-세포 또는 NK 세포는 T-세포 또는 NK 세포로의 유도성 전구 세포 또는 배아 전구 세포의 생체외 분화로부터 유래될 수 있다. 이러한 경우에, CoStAR 및, 선택적으로 CAR 및/또는 TCR을 발현하는 T-세포는 바이러스 벡터와의 형질도입, DNA 또는 RNA와의 형질감염을 포함하는 여러 수단 중 하나에 의해 CoStAR을 코딩하는 DNA 또는 RNA, 및 선택적으로 CAR 및/또는 TCR을 도입함으로써 생성된다.
[00391] 본 발명의 CoStAR을 발현하고, 선택적으로 TCR 및/또는 CAR을 발현하는 T 또는 NK 세포는 혈액암 또는 고형 종양의 치료에 사용될 수 있다.
[00392] 질환의 치료 방법은 본 발명의 T 또는 NK 세포를 포함하는 벡터 또는 세포의 치료적 용도에 관한 것이다. 이와 관련하여, 벡터, 또는 T 또는 NK 세포는 질환과 관련된 적어도 하나의 증상을 경감, 감소 또는 개선시키기 위해 및/또는 질환의 진행을 감속, 감소 또는 차단하기 위해 기존 질환 또는 병태를 갖는 대상체에게 투여될 수 있다. 본 발명의 방법은 암 세포의 T-세포 매개된 사멸을 유발하거나 촉진할 수 있다. 본 발명에 따른 벡터, 또는 T 또는 NK 세포는 하나 이상의 추가 치료제와 함께 환자에게 투여될 수 있다. 하나 이상의 추가 치료제는 환자에게 공동 투여될 수 있다. "공동-투여"는 하나 이상의 추가 치료제 및 본 발명의 벡터, 또는 T 또는 NK 세포를 시간상 충분히 근접하여 벡터, 또는 T 또는 NK 세포가 하나 이상 추가 치료제의 효과를 향상시킬 수 있도록 투여하거나 그 반대로 투여하는 것을 의미한다. 이와 관련하여, 벡터 또는 세포가 먼저 투여될 수 있고, 하나 이상의 추가 치료제가 두 번째로 투여될 수 있거나, 그 반대의 경우도 마찬가지이다. 대안적으로, 벡터 또는 세포 및 하나 이상의 추가 치료제는 동시에 투여될 수 있다. 유용할 수 있는 한 가지 공동-투여되는 치료제는 IL-2인데, 이는 현재 투여된 세포의 활성을 부스트하기 위해 기존의 세포 요법에서 사용되기 때문이다. 그러나, IL-2 치료는 독성 및 내약성 문제와 관련이 있다.
[00393] 언급된 바와 같이, 환자에게 투여하기 위해, CoStAR 이펙터 세포는 환자에 대해 동종이계 또는 자가일 수 있다. 일부 구현예에서, 동종이계 세포는, 예를 들어, 유전자 편집에 의해 추가로 유전적으로 변형되어, CoStAR 세포에 대한 GVHD 및/또는 환자의 면역 반응을 최소화하거나 예방한다.
[00394] CoStAR 이펙터 세포는 표적 항원과 관련된 암 및 신생물 질환을 치료하는 데 사용된다. 본원에 기재된 임의의 방법을 사용하여 치료될 수 있는 암 및 신생물 질환은 혈관화되지 않거나, 또는 아직 실질적으로 혈관화되지 않은 종양 뿐만 아니라 혈관화된 종양을 포함한다. 암은 비-고형 종양(예를 들어, 혈액 종양, 예를 들어, 백혈병 및 림프종)을 포함할 수 있거나 고형 종양을 포함할 수 있다. 본 발명의 CoStAR 이펙터 세포로 치료될 암의 유형은 암종, 모세포종, 및 육종, 및 특정 백혈병 또는 림프성 악성종양, 양성 및 악성 종양, 및 악성종양, 예를 들어, 육종, 암종, 및 흑색종을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 성인 종양/암 및 소아 종양/암이 또한 포함된다.
[00395] 혈액암은 혈액 또는 골수의 암이다. 혈액암(또는 혈액암)의 예는 급성 백혈병(예컨대, 급성 림프구성 백혈병, 급성 골수구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병 및 골수모세포, 전골수구성, 골수단핵구, 단핵구 및 적혈구백혈병), 만성 백혈병(예컨대, 만성 골수구성(과립구성) 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 및 만성 림프구성 백혈병), 진성적혈구증가증, 림프종, 호지킨병, 비호지킨 림프종(나태 및 고급 형태), 다발성 골수종, 형질세포종, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 중쇄 질환, 골수이형성 증후군, 모발 세포 백혈병 및 골수이형성증을 포함하는, 백혈병을 포함한다.
[00396] 고형 종양은 일반적으로 낭종 또는 액체 영역을 포함하지 않는 비정상적인 조직 덩어리이다. 고형 종양은 양성 또는 악성일 수 있다. 상이한 유형의 고형 종양은 이들을 형성하는 세포의 유형(예컨대, 육종, 암종, 및 림프종)에 따라 명명된다. 육종 및 암종과 같은 고형 종양의 예는 부신피질 암종, 담관암종, 섬유육종, 근육종, 지방육종, 연골육종, 골육종, 및 다른 육종, 활액종, 중피종, 유잉 종양, 평활근육종, 횡문근육종, 결장 암종, 위암, 악성 림프종, 췌장암, 유방암, 폐암, 난소암, 전립선암, 간세포 암종, 편평 세포 암종, 기저 세포 암종, 선암종, 땀샘 암종, 갑상선암(예를 들어, 수질 갑상선 암종 및 유두 갑상선 암종), 갈색세포종 피지선 암종, 유두암종, 유두 선암종, 수질암종, 기관지암종, 신장 세포 암종, 간암, 담관 암종, 융모막암종, 윌름스 종양, 자궁경부암(예를 들어, 자궁경부 암종 및 전-침습성 자궁경부 이형성증), 결장직장암, 항문, 항문관, 또는 항문직장의 암, 질암, 외음부암(예를 들어, 편평 세포 암종, 상피내 암종, 선암종, 및 섬유육종), 음경암, 구강인두암, 식도암, 두부암(예를 들어, 편평 세포 암종), 경부암(예를 들어, 편평 세포 암종), 고환암(예를 들어, 정액종, 기형종, 배아 암종, 기형암종, 융모막암종, 육종, 라이디히 세포 종양, 섬유종, 섬유선종, 선종양 종양, 및 지방종), 방광 암종, 신장암, 흑색종, 자궁암(예를 들어, 자궁내막 암종), 요로상피암(예를 들어, 편평 세포 암종, 이행 세포 암종, 선암종, 요관암, 및 방광암), 및 CNS 종양(예컨대, 신경아교종(예컨대, 뇌간 신경교종 및 혼합 신경교종), 교모세포종(다형성 교모세포종으로도 공지됨) 성상세포종, CNS 림프종, 생식세포종, 수모세포종, 신경초종 두개인두신경종, 뇌실막종, 송과종, 혈관모세포종, 청각 신경종, 희소돌기아교종, 수막종, 신경모세포종, 망막모세포종 및 브래지어 전이를 포함한다.
[00397] "면역학적 유효량", "항종양 유효량", "종양-억제 유효량" 또는 "치료량"이 지시될 때, 투여되는 본 발명의 조성물의 정확한 양은 연령, 체중, 종양 크기, 감염 또는 전이의 정도, 및 환자(대상체)의 상태의 개인차를 고려하여 의사에 의해 결정될 수 있다. 일반적으로 본원에 기재된 T 세포를 포함하는 약학적 조성물은 104 내지 109개 세포/kg 체중, 일부 경우에 105 내지 106개 세포/kg 체중(이러한 범위 내의 모든 정수 값을 포함함)의 투여량으로 투여될 수 있다고 언급될 수 있다. T 세포 조성물은 또한 이러한 투여량으로 여러 번 투여될 수 있다. 세포는 면역요법에서 일반적으로 알려진 주입 기술을 사용하여 투여될 수 있다(예를 들어, 문헌[Rosenberg et al., New Eng. J. of Med. 319:1676, 1988] 참조).
조합 요법
[00398] 본원에 기재된 CoStAR-발현 세포는 다른 공지된 제제 및 요법과 함께 사용될 수 있다. 본원에서 사용되는 "조합하여" 투여되는 것은 2개(또는 그 초과)의 상이한 치료가 대상체의 장애로 고통받는 과정 동안 대상체에게 전달되는 것을 의미하며, 예를 들어, 2개 이상의 치료는 대상체가 장애를 갖는 것으로 진단된 후 및 장애가 치료 또는 제거되거나 치료가 다른 이유로 중단되기 전에 전달된다. 일부 구현예에서, 하나의 치료의 전달은 두 번째의 전달이 시작될 때 여전히 발생하므로, 투여의 측면에서 중복된다. 이는 때때로 본원에서 "동시" 또는 "동시 전달"로 지칭된다. 다른 구현예에서, 한 치료의 전달은 다른 치료의 전달이 시작되기 전에 종료된다. 어느 하나의 경우의 일부 구현예에서, 치료는 조합 투여로 인해 더 효과적이다. 예를 들어, 제2 치료는 더 효과적이며, 예를 들어, 제2 치료의 부재 하에 제2 치료가 투여된 경우에 보여질 것보다 더 적은 양의 제2 치료로 동등한 효과가 나타나거나, 제2 치료가 제1 치료의 부재 하에 제2 치료가 투여되거나 유사한 상황이 제1 치료와 함께 보여지는 경우 보여지는 것보다 더 크게 증상을 감소시킨다. 일부 구현예에서, 전달은 장애와 관련된 증상 또는 다른 파라미터의 감소가 다른 치료 없이 전달되는 한 치료로 관찰되는 것보다 크도록 하는 것이다. 2개의 처리의 효과는 부분적으로 상가적이거나, 전체적으로 상가적이거나, 상가보다 클 수 있다. 전달은 전달된 제1 치료의 효과가 제2 치료가 전달될 때 여전히 검출가능하도록 이루어질 수 있다.
[00399] 본원에 기재된 CoStAR-발현 세포 및 적어도 하나의 추가 치료제는 동시에, 동일하거나 별도의 조성물로, 또는 순차적으로 투여될 수 있다. 순차적 투여의 경우, 본원에 기재된 CAR-발현 세포가 먼저 투여될 수 있고, 추가의 작용제가 두 번째로 투여될 수 있거나, 투여 순서가 역전될 수 있다.
[00400] CoStAR 요법 및/또는 다른 치료제, 절차 또는 양식은 활성 장애 기간 동안, 또는 관해 또는 덜 활동적인 질환 기간 동안 투여될 수 있다. CoStAR 요법은 다른 치료 전에, 치료와 동시에, 치료 후, 또는 장애의 관해 동안 투여될 수 있다.
[00401] 조합하여 투여될 때, 요법 및 추가 제제(예를 들어, 제2 또는 제3 제제), 또는 모두는 개별적으로, 예를 들어, 단일요법으로서 사용되는 각 제제의 양 또는 투여량보다 더 높거나, 더 낮거나 또는 동일한 양 또는 용량으로 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, CoStAR 요법, 추가적인 제제(예를 들어, 제2 또는 제3 제제), 또는 모두의 투여되는 양 또는 투여량은 개별적으로, 예를 들어, 단일요법으로서 사용되는 각 제제의 양 또는 투여량보다 더 낮다(예를 들어, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 또는 적어도 50%). 다른 구현예에서, 요망되는 효과(예를 들어, 암의 치료)를 초래하는 CoStAR 요법, 추가 제제(예를 들어, 제2 또는 제3 제제)의 양 또는 투여량은 동일한 치료 효과를 달성하기 위해, 예를 들어, 단일요법으로서 개별적으로 사용되는 각 제제의 양 또는 투여량보다 더 낮다(예를 들어, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 또는 적어도 50% 낮음).
[00402] 추가 양태에서, 본원에 기재된 CoStAR-발현 세포는 수술, 화학요법, 방사선, 면역억제제, 예컨대, 사이클로스포린, 아자티오프린, 메토트렉세이트, 미코페놀레이트, 및 FK506, 항체, 또는 다른 면역절제제, 예컨대, CAMPATH, 항-CD3 항체 또는 다른 항체 요법, 사이톡신, 플루다라빈, 사이클로스포린, FK506, 라파마이신, 마이코페놀산, 스테로이드, FR901228, 사이토카인, 및 방사선 조사, 펩티드 백신, 예컨대, 문헌[Izumoto et al. 2008 J Neurosurg 108:963-971]에 기재된 것과 조합하여 치료 요법에서 사용될 수 있다.
[00403] 특정 예에서, 본 발명의 화합물은 다른 치료제, 예컨대, 다른 항암제, 항알레르기제, 항-메스꺼움제(또는 항-구토제), 통증 완화제, 세포보호제, 및 이들의 조합물과 조합된다.
[00404] 일 구현예에서, 본원에 기재된 CoStAR-발현 세포는 화학치료제와 조합하여 사용될 수 있다. 예시적인 화학치료제는 안트라사이클린(예를 들어, 독소루비신(예를 들어, 리포솜 독소루비신)), 빈카 알칼로이드(예를 들어, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 빈데신, 비노렐빈), 알킬화제(예를 들어, 사이클로포스파미드, 데카르바진, 멜팔란, 이포스파미드, 테모즈폴로멜란), 면역 세포 항체(예를 들어, 알렘투자맙, 젬투주맙, 리툭시맙, 오파투무맙, 토시투모맙, 브렌툭시맙), 항대사물(예를 들어, 엽산 길항제, 피리미딘 유사체, 퓨린 유사체 및 아데노신 데아미나제 억제제(예를 들어, 플루다라빈) 포함), mTOR, TNFR 글루코코르티코이드 유도된 TNFR 관련 단백질(GITR) 작용제, 프로테아좀 억제제(예를 들어, 아클라시노마이신 A, 글리오톡신 또는 보르테조밉), 면역조절제, 예컨대, 탈리도마이드 또는 탈리도마이드 유도체(예를 들어, 레날리도마이드)를 포함한다.
[00405] 조합 요법에서 사용하기 위해 고려되는 일반적인 화학치료제는 부설판(Myleran®), 부설판 주사(Busulfex®), 클라드리빈(Leustatin®), 사이클로포스파미드(Cytoxan® 또는 Neosar®), 시타라빈, 시토신 아라비노시드(Cytosar-U®), 시타라빈 리포솜 주사(DepoCyt®), 다우노루비신 하이드로클로라이드(Cerubidine®), 다우노루비신 시트레이트 리포솜 주사(DaunoXome®), 덱사메타손, 독소루비신 하이드로클로라이드(Adriamycin®, Rubex®), 에토포시드(Vepesid®), 플루다라빈 포스페이트(Fludara®), 하이드록시우레아(Hydrea®), 이다루비신(Idamycin®), 미톡산트론(Novantrone®), 젬투주맙 오조가마이신(mylotarg®)을 포함한다.
[00406] 구현예에서, 조합 요법에서 사용하기 위해 고려되는 일반적인 화학치료제는 아나스트로졸(Arimidex®), 비칼루타미드(Casodex®), 블레오마이신 설페이트(Blenoxane®), 부설판(Myleran®), 부설판 주사(Busulfex®), 카페시타빈(Xeloda®), N4-펜톡시카보닐-5-데옥시-5-플루오로시티딘, 카보플라틴(Paraplatin®), 카르무스틴(BiCNU®), 클로람부실(Leukeran®), 시스플라틴(Platinol®), 클라드리빈(Leustatin®), 사이클로포스파미드(Cytoxan® 또는 Neosar®), 시타라빈, 시토신 아라비노시드(Cytosar-U®), 시타라빈 리포솜 주사(DepoCyt®), 다카르바진(DTIC-Dome®), 닥티노마이신(악티노마이신 D, Cosmegan), 다우노루비신 하이드로클로라이드(Cerubidine®), 다우노루비신 시트레이트 리포솜 주사(DanunoXome®), 덱사메타손, 도세탁셀(Taxotere®), 독소루비신 하이드로클로라이드(Adriamycin®, Rubex®), 에토포시드(Vepesid®), 플루다라빈 포스페이트(Fludara®), 5-플루오로우라실(Adrucil®, Efudex®), 플루타미드(Eulexin®), 테자시티빈, 젬시타빈(디플루오로데옥시시티딘), 하이드록시우레아(Hydrea®), 이다루비신(Idamycin®), 이포스파미드(IFEX®), 이리노테칸(Camptosar®), L-아스파라기나제(ELSPAR®), 류코보린 칼슘, 멜팔란(Alkeran®), 6-머캅토푸린(Purinethol®), 메토트렉세이트(Folex®), 미톡산트론 (Novantrone®), 밀로타르그(mylotarg), 파클리탁셀(Taxol®), 피닉스(phoenix)(이트륨90/MX-DTPA), 펜토스타틴, 카르무스틴 임플란트를 갖는 폴리페프로산 20(Gliadel®), 타목시펜 시트레이트(Nolvadex®), 테니포시드(Vumon®), 6-티오구아닌, 티오테파, 티라파자민(Tirazone®), 주사용 토포테칸 하이드로클로라이드(Hycamptin®), 빈블라스틴(Velban®), 빈크리스틴(Oncovin®), 및 비노렐빈(Navelbine®)을 포함한다.
[00407] 치료는, 예를 들어, 종양 퇴행, 종양 중량 또는 크기 수축, 진행까지의 시간, 생존 기간, 무진행 생존, 전체 반응률, 반응 지속기간, 삶의 질, 단백질 발현 및/또는 활성에 의해 평가될 수 있다. 예를 들어, 방사선 영상화를 통한 반응의 측정을 포함하는 요법의 효능을 결정하기 위한 접근법이 사용될 수 있다.
서열
[00408] 하기 서열은 완전 CoStAR 및 CoStAR 성분을 포함하고, 비제한적이다. 성분은 신호 펩티드(SP), 결합 도메인(BD), 링커, 스페이서 및 막횡단 도메인(STM), 세포외 또는 세포내 서열이 없는 CD28 막횡단 단편(STM-CD28TM), 세포내 신호 도메인(SD) 및 CD40 도메인 및 모티프를 포함한다. SEQ ID NO:42 내지 247이 N-말단 신호 펩티드를 갖는 CoStAR을 포함하는 반면, N-말단 신호 펩티드는 성숙 CoStAR로부터 제거되는 것으로 이해될 것이다. 또한, 성숙 CoStAR은 N-말단에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 이상의 아미노산이 결여될 수 있는 것으로 이해될 것이다(즉, C-말단 신호 펩티드의 말단으로부터 카운팅됨). 전체 단백질 내의 성분 위치는 GenBank 및 다른 출처로부터 확인할 수 있다. 작제물 및 성분은 정확한 크기 및 범위에 대해 예시적이며 성분은 하나 초과의 공급원으로부터 유래될 수 있다. 하나 초과의 세포내 신호전달 도메인 또는 신호전달 단편이 있는 경우, 다중 도메인은 임의의 순서일 수 있다. 특정 단백질은 발현될 때 N-말단 신호 펩티드를 포함할 수 있지만, 이러한 신호 펩티드는 절단되고 단백질이 발현될 때 부정확하게 절단될 수 있으며, 신호 펩티드가 제거된 생성된 단백질은 N-말단 아미노산의 위치에 최대 5개의 아미노산의 변이를 갖는 결합 도메인을 포함하는 것으로 이해될 것이다.
[00409] 본 발명 및 이의 이점이 상세히 설명되었지만, 첨부된 청구범위에 정의된 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않으면서 다양한 변경, 대체 및 변경이 본원에서 이루어질 수 있다는 것으로 이해되어야 한다.
[00410] 본 발명은 단지 예시 목적으로 제공되고 어떠한 방식으로도 본 발명을 제한하려는 것이 아닌 하기 실시예에서 추가로 예시될 것이다.
[00411] 본원에 제공된 본 개시의 구현예는 하기 예시적인 넘버링된 배열(arrangement)에 의해 설명된다:
1. 키메라 공동자극 항원 수용체(CoStAR)로서,
막횡단 도메인에 작동적으로 연결된, 암종배아 항원(CEA)에 결합하는 세포외 결합 도메인, 또는 메조텔린(MSLN)에 결합하는 세포외 결합 도메인, 및
ICOS의 제1 신호전달 도메인 및 세포내 도메인 또는 이의 신호전달 단편, 또는
NTRK1의 제1 신호전달 도메인 및 세포내 도메인 또는 이의 신호전달 단편, 또는
DAP10의 제1 신호전달 도메인 및 세포내 도메인 또는 이의 신호전달 단편, 또는
제1 신호전달 도메인 및 CD40 신호전달 도메인 또는 이의 신호전달 단편, 또는
제1 신호전달 도메인 및 TRAF2/TRAF3 서열, TRAF6 서열, TRAF2 서열, 또는 IProx 서열 중 하나 이상을 포함하는, CoStAR.
2. 배열 1에 있어서, 제1 신호전달 도메인이 CD2, CD9, CD26, CD27, CD28, CD29, CD38, CD40, CD43, CD46, CD49d, CD55, CD73, CD81, CD82, CD99, CD100, CD134 (OX40), CD137 (41BB), CD150 (SLAM), CD270 (HVEM), CD278 (ICOS), CD357 (GITR), 또는 EphB6의 신호전달 도메인 또는 신호전달 단편을 포함하는, CoStAR.
3. 배열 1에 있어서, CoStAR이 제2 신호전달 도메인을 포함하는, CoStAR.
4. 배열 3에 있어서, 제2 신호전달 도메인이 CD2, CD9, CD26, CD27, CD28, CD29, CD38, CD40, CD43, CD46, CD49d, CD55, CD73, CD81, CD82, CD99, CD100, CD134 (OX40), CD137 (41BB), CD150 (SLAM), CD270 (HVEM), CD278 (ICOS), CD357 (GITR), 또는 EphB6의 신호전달 도메인 또는 신호전달 단편을 포함하는, CoStAR.
5. 배열 1에 있어서, CD40 신호전달 단편이 SH3 모티프(KPTNKAPH, SEQ ID NO:35), TRAF2 모티프(PKQE, SEQ ID NO:36, PVQE, SEQ ID NO:37, SVQE, SEQ ID NO:38), TRAF6 모티프(QEPQEINFP, SEQ ID NO:39), PKA 모티프(KKPTNKA, SEQ ID NO:40, SRISVQE, SEQ ID NO:41), 또는 이들의 조합을 포함하거나, 전장 CD40 세포내 도메인인, CoStAR.
6. 배열 2에 있어서, 제1 신호전달 도메인이 전장 공동자극 도메인을 포함하는, CoStAR.
7. 배열 1에 있어서, 세포외 결합 도메인이 링커 및/또는 스페이서에 의해 막횡단 도메인에 작동적으로 연결되는, CoStAR.
8. 배열 7에 있어서, 링커가 약 5 내지 약 20개의 아미노산을 포함하는, CoStAR.
9. 배열 7에 있어서, 링커가 약 10 내지 약 250개의 아미노산을 포함하는, CoStAR.
10. 배열 1에 있어서, CoStAR이 제2 세포외 결합 도메인을 포함하는, CoStAR.
11. 배열 10에 있어서, 제2 세포외 결합 도메인이 CD8, CD28, 또는 ICOS로부터의 리간드 결합 도메인을 포함하는, CoStAR.
12. 배열 1에 있어서, 막횡단 도메인이 CD28, CD8, ICOS, DAP10, 또는 NTRK로부터의 막횡단 도메인을 포함하는, CoStAR.
13. 배열 1에 있어서, 막횡단 도메인이 SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, 또는 SEQ ID NO:22의 막횡단 도메인 서열을 포함하는, CoStAR.
14. 배열 1에 있어서, 세포외 결합 도메인이 scFv, 펩티드, 항체 중쇄 가변 도메인, 항체 경쇄 가변 도메인, 또는 CEA 리간드를 포함하는, CoStAR.
15. 배열 1 내지 배열 14 중 어느 하나에 있어서, C-말단에 CD3ζ 신호전달 도메인을 추가로 포함하는, CoStAR.
16. 배열 1 내지 배열 14 중 어느 하나에 있어서, N-말단 신호 펩티드를 추가로 포함하는, CoStAR.
17. 배열 16에 있어서, N-말단 신호 펩티드가 온코스타틴 M(OSM), CD8α, CD2, 인터루킨-2(IL-2), 과립구-대식세포 집락 자극 인자(GM-CSF), 또는 인간 IgGκ의 신호 펩티드를 포함하는, CoStAR.
18. 배열 1 내지 배열 17 중 어느 하나의 CoStAR을 인코딩하는, 핵산.
19. 배열 18의 핵산을 포함하는, 벡터.
20. 배열 1 내지 배열 16 중 어느 하나의 CoStAR을 발현하는, 세포.
21. 배열 20에 있어서, 세포가 알파-베타 T 세포, 감마-델타 T 세포, T 조절 세포, TIL, NKT 세포 또는 NK 세포를 포함하는, 세포.
22. 배열 20에 있어서, 세포가 CAR 또는 TCR을 공동발현하는, 세포.
23. 배열 20의 세포를 제조하는 방법으로서, 세포를 배열 19의 벡터로 형질도입시키거나 형질감염시키는 단계를 포함하는, 방법.
24. 배열 1 내지 배열 16 중 어느 하나의 CoStAR을 발현하는 세포의 집단을 제조하기 위한 방법으로서,
i) 배열 19의 벡터로 형질감염되거나 형질도입된 세포의 표면 상에서 상기 CoStAR의 발현을 검출하는 단계; 및
ii) 상기 CoStAR을 발현하는 것으로 동정된 세포를 선택하는 단계를 포함하는, 방법.
25. 세포 발현을 위해 배열 1 내지 배열 16 중 어느 하나의 CoStAR이 농축된 세포 집단.
26. 임의의 배열에 따른 세포 또는 배열에 따른 세포 집단을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 대상체에서 질병을 치료하는 방법.
27. 컨센서스 A, 또는 X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11의 서열을 포함하는 아미노산 서열을 포함하고, 여기서:
a. X1은 임의의 아미노산이고,
b. X2는 임의의 아미노산이고,
c. X3은 P이고, X4는 임의의 아미노산이고,
d. X5는 Q이고,
e. X6은 C 또는 A이고,
f. X7은 임의의 아미노산이고,
g. X8은 임의의 아미노산이고,
h. X9는 임의의 아미노산이고,
i. X10은 임의의 아미노산이고,
j. X11은 임의의 아미노산인, 단백질.
28. 배열 27에 있어서, 단백질이 TRAF 도메인의 일부인, 단백질.
29. 전술한 배열 중 어느 하나에 있어서, 단백질이 TRAF2 도메인의 일부인, 단백질.
30. 전술한 배열 중 어느 하나에 있어서,
a. 서열은,
i. X1은 S 또는 P이고,
ii. X2는 V, H, 또는 Y이고,
iii. X4는 I, Q, V이고,
iv. X7은 T 또는 S이고,
v. X8은 D이고,
vi. X9는 K, D, 또는 G이고,
vii. X10은 T, S, G, 또는 A이고,
viii. X11은 D, S, N, 또는 D인 것을 포함하거나,
b. 서열은 a)와 적어도 60% 동일한, 단백질.
31. 컨센서스 B, 또는 X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11의 서열을 포함하는 아미노산 서열을 포함하고, 여기서,
a. X1은 임의의 아미노산이고,
b. X2는 임의의 아미노산이고,
c. X3은 P, S, A, 또는 T이고,
d. X4는 임의의 아미노산이고,
e. X5는 Q 또는 E이고,
f. X6은 E이고,
g. X7은 임의의 아미노산이고,
h. X8은 임의의 아미노산이고,
i. X9는 임의의 아미노산이고,
j. X10은 임의의 아미노산이고,
k. X11은 임의의 아미노산인, 단백질.
32. 배열 31에 있어서, 단백질이 TRAF 도메인의 일부인, 단백질.
33. 전술한 배열 중 어느 하나에 있어서, 단백질이 TRAF2 도메인의 일부인, 단백질.
34. 전술한 배열 중 어느 하나에 있어서,
a. 서열이
i. X1은 P, A, M, T, S, R, V, H이고,
ii. X2는 F, A, L, I, T, V, G, C, A, F, P이고,
iii. X4는 K, V, I, H, A, Q, T, E, S이고,
iv. X7은 C, T, E, D, S, A이고,
v. X8은 A, L, G, Y, I, Q, D, E이고,
vi. X9는 F, H, K, R, P, A, G, Y, E, N이고,
vii. X10은 R, G, E, K, A, S, D, C, C, P, V이고,
viii. X11은 S, C, D, P, W, T, A, G, E인 것을 포함하거나;
b. 서열이 a)와 적어도 60% 동일한, 단백질.
35. 전술한 배열 중 어느 하나에 있어서, 서열이 TRAF2/3 서열의 일부인, 단백질.
36. 컨센서스 C, 또는 X1X2X3X4X5X6의 서열을 포함하는 아미노산 서열을 포함하고, 여기서,
a. X1은 P이고,
b. X2는 임의의 아미노산이고,
c. X3은 E이고,
d. X4는 임의의 아미노산이고,
e. X5는 임의의 아미노산이고,
f. X6은 Ac/Ar인, 단백질.
37. 배열 36에 있어서, 단백질이 TRAF 도메인의 일부인, 단백질.
38. 전술한 배열 중 어느 하나에 있어서, 단백질이 TRAF6 도메인의 일부인, 단백질.
39. 전술한 배열 중 어느 하나에 있어서,
a. 서열이
i. X2는 Q, P, E, V, T, 또는 S이고,
ii. X4는 I, L, M, N, S, T, N, D이고,
iii. X5는 N, D, R, S, G, 또는 Y인 것을 포함하거나,
b. 서열이 a)와 적어도 60% 동일한, 단백질.
40. 아미노산 서열로서,
a) SEQ ID NO: 475, 476, 477, 478, 479, 494, 495, 496, 498, 505, 510, 511, 512, 513, 514, 515, 516, 517, 518, 또는 519 중 하나 이상;
b) a)의 서열과 적어도 70% 동일한 서열; 또는
c) a)와 적어도 80% 유사한 서열을 포함하는, 아미노산 서열.
41. CD40 단백질에서의 TRAF 도메인으로서, TRAF 도메인은
a) SEQ ID NO: 475, 476, 477, 478, 479, 494, 495, 496, 498, 505, 510, 511, 512, 513, 514, 515, 516, 517, 518, 또는 519;
b) a)의 서열과 적어도 70% 동일한 서열; 또는
c) a)와 적어도 80% 유사한 서열
중 하나 이상을 포함하는, TRAF 도메인.
42. PQEINF, PEEMSW, PPENYE, 또는 PQENSY를 포함하는, TRAF6 도메인 서열.
43. PVQET, TQEET, SKEET, AVEET, 또는 PVQET를 포함하는, TRAF2/3 도메인 서열.
44. SVQE, AVEE 또는 PEEE를 포함하는, TRAF2 도메인 서열.
45. TRAF6 또는 TRAF2/3 도메인으로서,
a) SEQ ID NO: 475, 476, 477, 478, 479, 494, 495, 496, 498, 505, 510, 511, 512, 513, 514, 515, 516, 517, 518, 또는 519 중 하나의 아미노산 서열;
b) a)와 적어도 70% 동일한 아미노산 서열 또는
c) a)와 적어도 80% 유사한 아미노산 서열을 포함하는, TRAF6 또는 TRAF2/3 도메인.
46. 전술한 배열 중 어느 하나에 있어서, 서열이 CD40 단백질 서열 내에 있는, 단백질, 아미노산 서열, 또는 TRAF 도메인.
47. 전술한 배열 중 어느 하나에 있어서, 서열이 CD40 단백질 내에 있고, CD40 단백질 내의 상응하는 TRAF2, TRAF2/3, 및/또는 TRAF6 도메인에 위치하는, 단백질, 아미노산 서열, 또는 TRAF 도메인.
48. 컨센서스 A, 또는 X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11의 아미노산 서열을 포함하고, 여기서,
a. X1은 임의의 아미노산이고,
b. X2는 임의의 아미노산이고,
c. X3은 P이고, X4는 임의의 아미노산이고,
d. X5는 Q이고,
e. X6은 C 또는 A이고,
f. X7은 임의의 아미노산이고,
g. X8은 임의의 아미노산이고,
h. X9는 임의의 아미노산이고,
i. X10은 임의의 아미노산이고,
j. X11은 임의의 아미노산인, TRAF2/TRAF3 도메인.
49. 컨센서스 B, 또는 X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11의 아미노산 서열을 포함하고, 여기서,
a. X1은 임의의 아미노산이고,
b. X2는 임의의 아미노산이고,
c. X3은 P, S, A, 또는 T이고,
d. X4는 임의의 아미노산이고,
e. X5는 Q 또는 E이고,
f. X6은 E이고,
g. X7은 임의의 아미노산이고,
h. X8은 임의의 아미노산이고,
i. X9는 임의의 아미노산이고,
j. X10은 임의의 아미노산이고,
k. X11은 임의의 아미노산인, TRAF2/TRAF3 도메인.
50. 컨센서스 C, 또는 X1X2X3X4X5X6의 아미노산 서열을 포함하고, 여기서,
a. X1은 P이고,
b. X2는 임의의 아미노산이고,
c. X3은 E이고,
d. X4는 임의의 아미노산이고,
e. X5는 임의의 아미노산이고,
f. X6은 Ac/Ar인, TRAF6 도메인.
51. 하기 중 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 CD40 도메인:
a. 컨센서스 A, 또는 X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11의 아미노산 서열을 포함하는 TRAF2/TRAF3 도메인으로서, 여기서,
i. X1은 임의의 아미노산이고,
ii. X2는 임의의 아미노산이고,
iii. X3은 P이고, X4는 임의의 아미노산이고,
iv. X5는 Q이고,
v. X6은 C 또는 A이고,
vi. X7은 임의의 아미노산이고,
vii. X8은 임의의 아미노산이고,
viii. X9는 임의의 아미노산이고,
ix. X10은 임의의 아미노산이고,
x. X11은 임의의 아미노산인, TRAF2/TRAF3 도메인,
b. 컨센서스 B, 또는 X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11의 아미노산 서열을 포함하는 TRAF2/TRAF3 도메인으로서, 여기서,
i. X1은 임의의 아미노산이고,
ii. X2는 임의의 아미노산이고,
iii. X3은 P, S, A, 또는 T이고,
iv. X4는 임의의 아미노산이고,
v. X5는 Q 또는 E이고,
vi. X6은 E이고,
vii. X7은 임의의 아미노산이고,
viii. X8은 임의의 아미노산이고,
ix. X9는 임의의 아미노산이고,
x. X10은 임의의 아미노산이고,
xi. X11은 임의의 아미노산인, TRAF2/TRAF3 도메인,
c. 컨센서스 C, 또는 X1X2X3X4X5X6의 아미노산 서열을 포함하는 TRAF6 도메인으로서, 여기서,
i. X1은 P이고,
ii. X2는 임의의 아미노산이고,
iii. X3은 E이고,
iv. X4는 임의의 아미노산이고,
v. X5는 임의의 아미노산이고,
vi. X6은 Ac/Ar인, TRAF6 도메인.
52. 키메라 공동자극 항원 수용체(CoStAR)로서,
암종배아 항원(CEA)에 결합하는 세포외 결합 도메인, 또는 메조텔린(MSLN)에 결합하는 세포외 결합 도메인;
세포외 결합 도메인에 연결된 막횡단 도메인,
제1 신호전달 도메인; 및
제2 신호전달 도메인으로서, 제2 신호전달 도메인은 변이체 CD40 신호전달 도메인 또는 이의 신호전달 단편을 포함하고, 변이체 CD40은 변이체 TRAF2/TRAF3 서열, 또는 변이체 TRAF6 서열, 또는 변이체 TRAF2 서열의 서열을 포함하고, 변이체 CD40은 SEQ ID NO: 42를 포함하지 않는, 제2 신호전달 도메인을 포함하는, CoStAR.
53. 배열 52에 있어서, 제1 신호전달 도메인이 CD28 또는 CD278(ICOS)의 신호전달 도메인 또는 신호전달 단편을 포함하는, CoStAR.
54. 배열 52에 있어서, 제1 신호전달 도메인이 전장 공동자극 도메인을 포함하는, CoStAR.
55. 배열 52에 있어서, 세포외 결합 도메인이 링커 및/또는 스페이서에 의해 막횡단 도메인에 작동적으로 연결되는, CoStAR.
56. 배열 55에 있어서, 링커가 약 5 내지 약 20개의 아미노산을 포함하는, CoStAR.
57. 배열 55에 있어서, 링커가 약 10 내지 약 250개의 아미노산을 포함하는, CoStAR.
58. 배열 55에 있어서, 막횡단 도메인이 CD28, CD8, ICOS, DAP10, 또는 NTRK로부터의 막횡단 도메인을 포함하는, CoStAR.
59. 배열 55에 있어서, 막횡단 도메인이 SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, 또는 SEQ ID NO:22의 막횡단 도메인 서열을 포함하는, CoStAR.
60. 배열 55에 있어서, 세포외 결합 도메인이 scFv, 펩티드, 항체 중쇄 가변 도메인, 항체 경쇄 가변 도메인, 또는 CEA 리간드를 포함하는, CoStAR.
61. 배열 27 내지 60 중 어느 하나의 CoStAR을 인코딩하는, 핵산.
62. 배열 61의 핵산을 포함하는, 벡터.
63. 배열 27 내지 62 중 어느 하나의 CoStAR을 발현하는, 세포.
64. 배열 63에 있어서, 세포가 알파-베타 T 세포, 감마-델타 T 세포, T 조절 세포, TIL, NKT 세포 또는 NK 세포를 포함하는, 세포.
65. 배열 64에 있어서, 세포가 CAR 또는 TCR을 공동발현하는 세포.
66. 배열 63 내지 65 중 어느 하나의 세포를 제조하는 방법으로서, 배열 62의 벡터로 세포를 형질도입 또는 형질감염시키는 단계를 포함하는, 방법.
67. 배열 52 내지 60 중 어느 하나의 CoStAR을 발현하는 세포의 집단을 제조하기 위한 방법으로서,
a. 배열 62의 벡터로 형질감염되거나 형질도입된 세포의 표면 상에서 CoStAR의 발현을 검출하는 단계; 및
b. CoStAR을 발현하는 것으로 확인된 세포를 선택하는 단계를 포함하는, 방법.
68. 배열 52 내지 60 중 어느 하나의 CoStAR이 세포 발현에 대해 농축된, 세포 집단.
69. 대상체에서 질환을 치료하는 방법으로서, 배열 63 내지 65 중 어느 하나에 따른 세포, 또는 배열 68에 따른 세포 집단을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
70. SEQ ID NO: 510 내지 519 중 하나의 아미노산 서열을 포함하는, 단백질.
71. 배열 70에 있어서, 단백질이 SEQ ID NO: 510의 서열을 포함하는, 단백질.
72. 배열 70에 있어서, 단백질이 SEQ ID NO: 511의 서열을 포함하는, 단백질.
73. 배열 70에 있어서, 단백질이 SEQ ID NO: 512의 서열을 포함하는, 단백질.
74. 배열 70에 있어서, 단백질이 SEQ ID NO: 513의 서열을 포함하는, 단백질.
75. 배열 70에 있어서, 단백질이 SEQ ID NO: 514의 서열을 포함하는, 단백질.
76. 배열 70에 있어서, 단백질이 SEQ ID NO: 515의 서열을 포함하는, 단백질.
77. 배열 70에 있어서, 단백질이 SEQ ID NO: 516의 서열을 포함하는, 단백질.
78. 배열 70에 있어서, 단백질이 SEQ ID NO: 517의 서열을 포함하는, 단백질.
79. 배열 70에 있어서, 단백질이 SEQ ID NO: 518의 서열을 포함하는, 단백질.
80. 배열 70에 있어서, 단백질이 SEQ ID NO: 519의 서열을 포함하는, 단백질.
실시예
실시예 1 - CoStAR을 발현하는 T-세포의 생산
[00412] 물질 및 방법
[00413] 작제물 설계 - MFE23 CoStAR은 온코스타틴 M1, CD8α, CD2, IL-2, GM-CSF 또는 hIgGκ VIII 리더 서열을 갖는 CEA-특이적 MFE23, 인간화된(hu) MFE23, CEA6, BW431/26 또는 huT84.66 유래된 단쇄 항체 단편 뉴클레오티드 서열로 구성된다. 각각의 CoStAR은 CD8 또는 CD28 또는 말단절단된 CD28로부터 유래된 세포외 스페이서 도메인 및 CD28 및 CD40으로부터 유래된 신호전달 도메인을 갖는다. 작제물을 MND 프로모터를 함유하는 pSF.Lenti(Oxford Genetics)에 클로닝하고, P2A 절단 서열을 통해 말단절단된 CD34 마커 유전자로부터 분리하였다.
[00414] 렌티바이러스 생산 - 50 mM CaCl2를 함유한 무혈청 RPMI 중에서 함께, 10 ㎍의 각 플라스미드와 10 ㎍의 이식 유전자를 함유한 pSF.Lenti 렌티바이러스 플라스미드를 혼합함으로써 3-플라스미드 패키징 시스템(Cell Biolabs, San Diego, USA)을 사용하여 렌티바이러스 생산을 수행하였다. 혼합물을 75 ㎠ 플라스크에서 293T 세포의 50% 컨플루언트(confluent) 단층에 적가하였다. 바이러스 상청액을 트랜스펙션 후 48 및 72h에 수집하고, 풀링하고, 제조사의 지침에 따라 LentiPac 렌티바이러스 상청액 농도(GeneCopoeia, Rockville, Maryland, USA) 용액을 사용하여 농축하였다. 렌티바이러스 상청액을 10배 농축하고, 4 ㎍/ml 폴리브렌(Sigma-Aldrich, Dorset, UK)의 존재 하에 일차 인간 T-세포를 직접 감염시키는 데 사용하였다. 렌티바이러스 상청액을 첨가하기 전에 제조사의 지침에 따라 T-세포 활성화 및 확장 비드(Invitrogen)로 24시간 동안 활성화시키기 전에 말초 혈액 단핵 세포를 정상의 건강한 공여자로부터 단리하였다.
[00415] 세포 형질도입을 감염 96시간 후에 CEA.hFc 단백질 및 항-hFc-PE 이차, + 항-CD34-APC를 사용하여 또는 항-CD34-PE 항체 단독에 의해 평가하였다. 이후, 1 ㎍/ml PHA 및 200 IU/ml IL-2를 첨가하면서 RPMI + 10% FCS에서 1:20 내지 1:200 비율의 x10 공여자 미스매칭된 조사된 PBMC 피더를 사용하여 세포를 추가로 확장시켰다. 14일 후, 세포를 이전과 같이 염색하고 검정을 위해 준비하여 보관하였다.
[00416] CoStAR 양성 또는 음성 세포를 야생형 또는 OKT3 조작된 CEA-양성 LoVo 또는 LS174T 세포와 혼합함으로써 기능성 검정을 수행하였다. 간략하게, T-세포를 96-웰 플레이트에서 다양한 비율로 LoVo 세포와 혼합하고, IFNγ 또는 IL-2를 ELISA에 의해 측정하였다. 나머지 세포를 450 nm에서의 흡광도 판독 전에 30분 동안 WST-1 시약(Sigma, UK)의 1:10 희석액과 함께 인큐베이션하였다. % 세포독성을 하기 방정식 = 100 - ((실험 판독 - T-세포 단독)/(종양 단독)) × 100을 사용하여 결정하였다.
[00417] 얼음 상에서 5 부피의 차가운 T-세포 배지에서 세포를 5분 동안 인큐베이션시키기 전에 먼저 T-세포를 10 μM eFluor450 증식 염료(eBioscience, UK)와 함께 1 × 107개 세포/ml의 농도로 37℃에서 10분 동안 로딩함으로써 증식 검정을 수행하였다. 이후, 세포를 과도하게 세척하여 결합되지 않은 염료를 제거하고, 종양 세포를 함유하는 공동배양물에 첨가하였다. 2, 6 및 10일에 세포를 제거하고, DRAQ7의 1:200 희석액을 첨가하고, MACSQuant 세포계산기 및 MACSQuantify 소프트웨어를 사용하여 세포를 분석하였다.
[00418] 웰로부터 세포를 취하고 암소에서 항-CD2 PerCP eFluor710 항체(eBioscience, UK)로 20분 동안 염색한 후, DRAQ7 염색 및 MACSQuant 분석기를 사용한 계수를 수행함으로써 증식 검정을 위한 세포 계수를 수행하였다.
[00419] 결과
[00420] 일차 인간 T-세포를 NHSBT로부터 수득된 버피 코트(Buffy coat)로부터 단리하였다. T-세포를 Ficoll-매개 단리 및 T-세포 음성 분리 키트(StemCell Technologies)에 의해 단리하였다. 단리된 T-세포를 인간 T-세포 활성화 및 확장 비드(Invitrogen, UK)로 활성화시켰다. 세포를 농축된 렌티바이러스 입자와 함께 인큐베이션하고 수 일에 걸쳐 확창시켰다. 렌티바이러스는 MFE.CoStAR.2A.tCD34 작제물의 DNA 서열을 함유하였다(2A 절단 서열을 통해 말단절단된 인간 CD34와 공동-발현된 전장 인간 CD28에 융합된 MFE23.scFv). 성공적으로 형질도입된 세포를 물질 및 방법에서 약술된 바와 같이 조사된 피더를 사용하여 추가로 확장시켰다. 공여자 1 형질도입은 22.69%(17.15 CD34+/CoStAR+ + 5.53% CD34-/CoStAR+)로 측정되었고, 공여자 2는 20.73%로, 공여자 3은 13.34%로 측정되었다. 항-CD34 항체를 사용하여 CoStAR 발현에 대해 세포를 농축시켜 90% 초과의 CoStAR 양성인 T-세포 집단을 수득하였다.
[00421] T-세포 활성에 대한 CoStAR의 영향을 시험하기 위한 생리학적으로 관련된 시험관내 모델을 생성하기 위해, 비-형질도입된 세포 및 형질도입된 세포를 CEA+ 종양 세포주 LoVo 및 LS174T에 대해 시험하였다. 일치하지 않는 종양주에 반응하여 T-세포의 활성화를 가능하게 하기 위해, 본 발명자들은 유세포 분석을 사용하여 형질도입된 세포를 시각화하기 위해 합성 막횡단 도메인을 통해 세포막에 고정되고 IRES 요소를 사용하여 GFP 마커 유전자로부터 분할된 항-CD3 단쇄 항체 단편을 발현하도록 종양 세포를 조작하였다.
[00422] LoVo 및 LS174T의 단일 세포 클론을 벌크 형질감염체로부터 생성하였다. 비-형질도입된 및 CoStAR 형질도입된 T-세포를 야생형 비-형질도입된 또는 OKT3-조작된 LS174T 또는 LoVo 세포와 다양한 이펙터:표적 비로 혼합하였다. 24시간 후, IL-2 ELISA 측정을 위해 공동배양물 배지를 취하였다. 활성화 의존성 IL-2 분비를 OKT3 조작된 LS174T 세포에 반응하여 3명의 공여자로부터의 CoStAR+ 및 CoStAR- T-세포 집단 둘 모두로부터 관찰하였고, 백그라운드 IL-2 분비만이 조작되지 않은 종양 세포에 반응하여 형질도입된 및 비-형질도입된 T-세포로부터 관찰되었다(도 3a 내지 도 3c). OKT3 조작된 종양 세포에 대한 CoStAR 증진된 IL-2 분비는 시험된 3명의 공여자 모두에서 발견되었다. 효과는 8:1 및 16:1의 E:T 비에서 가장 명백하였고, 더 높은 E:T 비에서 IL-2 분비는 너무 낮아서 정확하게 측정하지 못했다. 더 낮은 이펙터 대 표적 비율에서, IL-2 분비는 비-형질도입된 세포로부터 포화되는 것으로 나타났다. 이러한 관찰은 유사한 결과로 LS174T에 대해 시험된 3명의 공여자 중 2명을 사용하여 LoVo 세포에서 반복되었다(도 3d 및 도 3e).
[00423] T-세포 확장에 대한 CoStAR의 영향을 결정하기 위해, 형질도입되거나 비-형질도입된 T-세포를 야생형 또는 OKT3-GFP 조작된 LoVo 세포와 혼합하고, 3일 후 총 세포의 수를 계수하였다. CoStAR은 IL-2의 존재(도 4a) 및 IL-2의 부재(도 4b) 하에 야생형 LoVo 세포가 아닌 LoVo-OKT3에 반응하여 조작된 T-세포의 생존 및/또는 증식을 향상시켰다. 이 현상을 추가로 조사하기 위해, 증식 염료를 사용하여 2명의 공여자로부터의 T-세포에서 세포 증식 분석을 수행하여 각 집단이 6일에 걸쳐 거친 세포 주기의 수를 계수하였다(도 4c 및 도 4d). CoStAR 조작된 세포의 더 큰 비율은 LoVo-OKT3에 반응하여 조작되지 않은 세포와 비교하여 6일에 걸쳐 5, 6 또는 7 증식 주기를 거친 반면, CoStAR 형질도입된 세포 및 비-형질도입된 세포는 야생형 LoVo에 반응하여 동일한 기간에 걸쳐 평균 대략 2 주기를 거쳤다.
[00424] N-말단 추가 공동자극 도메인에 융합된 CD28로 구성된 다양한 융합 수용체를 생성하였다. CD137, CD2, CD29, CD134, CD150, CD40, GITR로부터 수득된 공동자극 도메인 및 IL-2 수용체 γ-사슬(IL2Rγ)로부터의 신호전달 도메인을 선택하였다. 유도성 공동자극의 이전 연구에서 사용된 것과 유사한 수용체를 포함하였다. CD28(IEV)로 명명된 이 수용체는 CD28의 C-말단 모티프가 아미노산 트리어드(triad) 'IEV'가 되도록 절단된다. 서열을 Genewiz에 의해 데노보(de novo) 생성하고, 2A 자가-절단 펩티드에 의해 융합 CoStAR로부터 분리된 CD34 마커 유전자와 함께 EF1α 프로모터 하에 렌티바이러스 벡터에 클로닝하였다. 일차 CD8+ T-세포를 EasySep 비드(StemCell Technologies)를 사용하여 단리하고, 렌티바이러스 입자의 첨가 전에 항-CD3/항-CD28 활성화/확창 Dynabeads로 활성화시켰다. 짧은 확장 기간 후, 세포를 항-CD107a 항체 및 브레펠딘 및 모넨신을 포함하는, LoVo 또는 LoVo-OKT3 세포와 혼합하고, 16시간 인큐베이션 후 고정시키고, 마커 유전자(CD34)에 대한 항체로 염색하였을 뿐만 아니라 IL-2, IFNγ 및 bcl-xL에 대한 항체로 염색하였다. MACSQuant 분석기 및 MACSQuantify 소프트웨어를 사용하여 분석을 수행하였다. 도 5는 CD34-(CoStAR 형질도입되지 않음) 및 CD34+(CoStAR 형질도입됨)로부터의 IL-2 반응을 보여준다. 통계적 분석은 시험된 모든 수용체가 변이체 CoStAR 수용체를 보유할 때 IL-2를 생산하는 세포의 비율에서 유의한 증가를 유도함을 입증하였다. 하기 3개의 다른 판독을 동시에 측정하였다: 정상 신호 1 조건 하에 방출되지만 공동자극에 의해 강화된 사이토카인인 IFNγ; 탈과립화의 마커인 CD107a; 및 공동자극에 의해 상향조절되는 항아폽토시스 단백질인 bcl-xL. CoStAR의 참여는 다양한 정도로 분석된 모든 이펙터 기능을 향상시켰다. CD28.CD2 및 CD28.CD40 융합 수용체는 시험된 모든 수용체의 가장 강력한 반응을 유도하는 것으로 나타났다(도 6 참조)
실시예 2
[00425] 집단 기반 사이토카인 분비에 대한 CD28 및 CD28.CD40 기반 CoStAR의 효과를 비교하였다. 3명의 공여자로부터의 일차 T-세포를 CD28(IEV) 말단절단된 CoStAR, 전장 CD28 CoStAR 또는 CD28.CD40 CoStAR(SEQ ID NO:439에 제시된 바와 같은 전장 CD28을 갖지만, N 말단 N 및 K 잔기가 존재하지 않음)로 형질도입하거나, 비-형질도입된 채로 남았다. T-세포를 CD34 마커 유전자를 사용하여 CoStAR 발현에 대해 농축하고, 확장 후 세포를 LoVo-OKT3 세포와 혼합하고 IL-2 분비를 ELISA에 의해 분석하였다(도 7 참조). 비-형질도입된 세포는 평균 0.80 ng/ml의 IL-2를 생산하였고, CD28(IEV) 및 전장 CD28 CoStAR은 각각 4.6 및 5.0 ng/ml의 IL-2를 생산하였다. 그러나, CD28.CD40은 3명의 공여자에 걸쳐 평균 29.0 ng/ml의 IL-2를 유도하였고, CD40을 염기성 CD28-기반 CoStAR에 혼입시키는 것에 대한 분명한 이점을 입증하였다.
[00426] 다음으로, T-세포 확장에 대한 CoStAR의 효과를 분석하였다. 7명의 공여자로부터의 T-세포를 CD28 또는 CD28.CD40 CoStAR으로, 항-CA125(196-14) 또는 항-폴레이트 수용체(MOV-19) scFv, 또는 항-폴레이트 수용체 펩티드(C7) 항원 결합 도메인으로 형질도입하였다. 추가의 세포를 불일치 대조군으로서 항-CEA scFv를 보유하는 CD28 CoStAR로 형질도입하였다. 이후에, 세포를 막 결합된 OKT3을 발현하도록 조작된 CA125+/폴레이트 수용체+/CEA- 세포주 OvCAR3(OvCAR-OKT3)와 혼합하였다. 7, 14 및 21일 후에 T-세포 계수를 수행하고, 7일 및 14일에 새로운 OvCAR-OKT3을 첨가하였다. 항-CA125 scFv를 보유하는 세포의 제한된 확장이 관찰되었지만(평균 배수 확장: CD28: 15.1; CD28.CD40: 69.1), scFv를 갖는 폴레이트 수용체를 표적화하는 세포는 CD28 및 CD28.CD40 코호트 둘 모두에서 확장되었다(평균 배수 확장: CD28: 186.7; CD28.CD40: 1295.0). C7 펩티드가 폴레이트 수용체를 표적화하기 위해 사용되었을 때 더 제한된 확장이 나타났다(평균 배수 확장: CD28: 71.5; CD28.CD40: 28.0). 대조군 CEA 표적화 수용체는 제한된 확장을 나타내었다(평균 배수 확장: 28.0).
[00427] 신호 1 및 신호 2의 상승작용을 더 잘 이해하기 위해, HLA-A*02 뿐만 아니라 세포 표면 CEA 단백질을 향해 표적화된 CD28 또는 CD28.CD40 CoStAR과 관련하여 CEA 펩티드(691 내지 699)를 인식하는 뮤린 불변 도메인 변형된 TCR로 T-세포를 조작하였다. 대조군으로서 세포를 또한 CA125 특이적 CD28 CoStAR로 형질도입하였다. T-세포를 HLA-A*02+/CEA+ H508 세포와 혼합하고 사이토카인 생산을 세포내 유세포 분석 염색에 의해 분석하였다. 뮤린 TCRβ 불변 도메인(TCR 조작된 세포를 표시함) 뿐만 아니라 DYKDDDDK(SEQ ID NO:449) 에피토프 태그(CoStAR 조작된 세포를 표시함)에 대한 항체를 사용하여 유동 세포측정 게이팅을 수행하였다. 따라서, 각 공동배양 웰에서 TCR-/CoStAR-, TCR+/CoStAR-, TCR-/CoStAR+ 및 TCR+/CoStAR+ 세포를 분석하는 것이 가능하였다. 이후 사이토카인 생산을 CD4+ 또는 CD8+ T-세포의 각 하위집단에서 플롯팅하였다(도 9). CD4+ 세포에서 CD28.CD40 CoStAR은 TCR 자극 단독보다 CD137 및 TNFα 생산을 향상시켰지만, CD4+ 세포에서의 TCR 반응은 CD8에 대한 TCR의 의존성으로 인해 불량하였다. CD8+ 세포에서, 특히 CD28.CD40 CoStAR 그룹에서 더 강한 유도를 나타내는 IL-2 및 CD107a로 더 강력한 이펙터 활성이 있었다. 수용체를 더 잘 비교하기 위해, 단지 TCR+/CoStAR+ 그룹에서의 이펙터 활성을 CD4+ 및 CD8+ 세포에 플롯팅하였다(도 10). CD4+ 세포에서 CD137의 유도는 CEA 또는 불일치된 표적화 CD28 CoStAR과 비교하여 CD28.CD40에 의해 유의하게 향상되었다. CD8+ 세포에서 CD137 유도는 CEA 또는 불일치된 표적화 CD28 CoStAR에 비해 유의하게 증가된 반면, CD107a 유도는 대조군 CoStAR에 비해 증가하였다. 따라서, CD28.CD40은 광범위한 모델 및 이펙터 활성에 걸쳐 향상된 이펙터 활성을 나타낸다.
실시예 3
[00428] CoStAR을 갖는 CD40에 의한 공동자극을 평가하기 위해, 일차 인간 T-세포를 MFE23.CD28 또는 MFE23.CD28.CD40 CoStAR로 모의 형질도입하거나 형질도입하였고, 각각은 2A 절단 펩티드에 의해 분리된 CD34 마커 유전자를 함유하였다. MFE23은 암종배아 항원(CEA)에 대해 높은 친화성을 갖는 단쇄 Fv 항체이다. 시험관내 배양 후, MACS™ 상자성 선택 시약(Miltenyi Biotech)을 사용하여 세포를 CD34에 대해 농축시킨 다음, 조사된 피더 세포를 사용하여 세포 수를 확장시켰다. MFE23.CD28 CoStAR은 CD34+ T 세포의 확장을 강력하게 매개하고, MFE23.CD28.CD40 CoStAR은 확장을 추가로 향상시켰다(도 11).
[00429] 공동자극 활성 및 지속성을 평가하기 위해, MFE23.CD28 또는 MFE23.CD28.CD40으로 모의 형질도입되거나 형질감염된 T 세포를 외인성 IL-2의 존재(200 IU/ml) 또는 부재 하에 8:1 이펙터:표적 비로 LoVo-OKT3 세포와 공동배양하였다. 1, 4, 7, 11 및 18일에 세포를 취하고 MACSQuant 유세포 분석기에서 항-CD2 시약을 사용하여 생존 T-세포의 수를 열거하였다. 종양 및 IL-2에 의한 자극의 부재 하에서, 세포는 예상대로 수적으로 감소하였다(도 12a). 자극은 없지만 IL-2가 존재하는 경우, 세포의 보다 분명한 생존이 있었지만, 특이적 성장은 없었다(도 12b). 종양이 존재하지 않지만, IL-2가 존재하지 않는 경우, 모의 세포는 특이적 생존을 나타내지 않았다. MFE23.CD28 CoStAR은 처음 4일 동안 확창의 명백한 배가를 매개하였고, 이후 감소하였다. MFE23.CD28.CD40은 7일까지 더 큰 확창 후 꾸준한 감소를 매개하였다(도 12c). 동일한 조건 하에, 그러나 IL-2의 존재 하에, 모의 및 MFE23.CD28 형질도입된 세포 둘 모두는 18일에 걸쳐 20배 확장을 나타낸 반면, MFE23.CD28.CD40 세포는 60배 초과로 확장되었다(도 12d). 따라서, CD28.CD40 기반 수용체는 외인성 IL-2의 존재 및 부재 둘 모두에서 자극 조건 하에 우수한 확장 및 생존을 입증하였다.
[00430] MFE23.CD28 또는 MFE23.CD28.CD40 CoStAR로 형질도입된 모의 및 T 세포를 이후 사이토카인 생산에 대해 시험하였다. T-세포/종양 공동배양물로부터 수득된 상청액에 대해 비드 어레이 분석을 수행하였다. 조작된 T-세포를 LoVo-OKT3 세포와 1:1 이펙터:표적 비로 24시간 동안 인큐베이션하고, 상청액을 수집하였다. 컨디셔닝된 상청액을 또한 동일한 수의 T-세포 단독, 또는 LoVo-OKT3 세포 단독으로부터 수집하였다. IL-2, IFN-γ, TNFα, IL-4, IL-5, IL-13, IL-17A, IL-17F, IL-22, IL-6, IL-10, IL-9, 및 IL-21의 생산을 Legendplex™ 인간 TH1/TH2 사이토카인 패널(Biolegend)을 사용하여 분석하였다(도 13a 내지 도 13m). 사이토카인은 T-세포 또는 종양 단독으로부터의 배지에서 매우 낮거나 검출 가능하지 않았다. 그러나, 종양 사이토카인 생산과 공동배양될 때 향상되었다. MFE23.CD28은 모의와 비교하여 IL-2, IL-5, IL-17A/17F, IL-10, IL-9 및 IL-21의 생산을 향상시켰다. 그러나, MFE23.CD28.CD40은 또한 TNFα, IL-13 및 IL-22의 생산을 향상시켰다. MFE23.CD28.CD40은 또한 MFE23.CD28(IL-2, IL-9 및 IL-17F)에 의해 유발된 것보다 더 많은 사이토카인의 생산을 향상시켰지만, 또한 MFE23.CD28(IL-5 및 IL-10)에서 관찰된 수준 미만으로 일부 사이토카인의 생산을 감소시켰다. 함께, 이 데이터는 CD28-기반 공동자극 수용체에 대한 CD40의 첨가가 케모카인 생산과 관련하여 이들의 특정 활성을 향상 및/또는 조절함을 입증한다.
[00431] MFE23.CD28 또는 MFE23.CD28.CD40 CoStAR로 형질도입된 모의 및 T 세포를 케모카인 생산에 대해 추가로 시험하였다. IL-8(CXCL8), IP-10(CSCL10), 에오탁신(CCL11), TARC(CCL17), MCP-1(CCL2), RANTES(CCL5), MIP-1a(CCL3), MIG(CXCL9), ENA-78(CXCL5), MIP-3α(CCL20), GROα(CXCL1), I-TAC(CXCL11), 및 MEP-1β(CCL4)를 Legendplex™ 인간 전염증성 케모카인 패널을 사용하여 분석하였다(도 14a 내지 도 14m). 케모카인은 T-세포 단독으로부터의 배지에서 매우 낮거나 검출 불가능하였다. 그러나, 종양과 공동배양될 때, 케모카인 생산이 향상되었다. MFE23.CD28은 모의와 비교하여 CXCL5, CXCL10, CXCL11, CCL17 및 CCL20의 생산을 향상시켰다. 그러나, MFE23.CD28.CD40은 또한 CCL2, CXCL1 및 CXCL9의 생산을 향상시켰다. MFE23.CD28.CD40은 또한 일부 사이토카인의 생산을 MFE23.CD28(CCL4)에서 관찰된 수준 미만으로 감소시키면서 MFE23.CD28(CXCL1, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CCL17, CCL2, CXCL9, CCL5 및 CCL20)에 의해 유발된 것보다 더 많은 양으로 특정 사이토카인의 생산을 추가로 향상시켰다. 함께, 이 데이터는 CD28-기반 공동자극 수용체에 대한 CD40의 첨가가 케모카인 생산과 관련하여 이들의 특정 활성을 향상 및/또는 조절함을 입증한다.
[00432] CoStAR을 암 표적에 대한 기능적 활성에 대해 시험하였다. 세포를 FolR 또는 CA125(각각 scFv MOV19 및 scFv 196-14)에 특이적인 scFv 결합 도메인으로 조작된 CD28 또는 CD28.CD40 CoStAR로 형질도입하였다. 인간 폴레이트 수용체 알파(FolR)는 난소, 두경부, 신장 및 폐를 포함하는 다수의 종양에 대한 적합한 표적을 나타내고, CA125는 난소암에 대한 대안적인 표적을 나타낸다. 6명의 건강한 공여자로부터의 일차 인간 T-세포를 196-14.CD28, 196-14.CD28.CD40, MOV19.CD28 또는 MOV19.CD28.CD40 수용체로 조작하였고, 모두는 검출을 위한 DYKDDDDK 에피토프 태그를 함유하였다. 에피토프 태그 양성 및 음성 집단에서 세포내 염색을 사용하여 이펙터 활성의 분석 전에 형질도입된 세포를 FolR+/CA125+ OvCAR-OKT3 세포와 혼합하였다. IL-2(도 15a 및 도 15b), TNFα(도 15c 및 도 15d), CD137(도 15e 및 도 15f), 및 BCL-xL(도 15g 및 도 15h)의 생산에 의해 결정된 이펙터 활성의 특이적 향상은 CA125 및 FolR 둘 모두에 반응하여 모의 형질도입 세포와 비교하여 CD28 및 CD28.CD40 조작된 세포에서 관찰되었지만, MOV19.CD28에 의한 특이적 BCL-xL 유도는 MOV19.CD28.CD40에 비해 실질적이지 않았다.
[00433] MOV19.CD28.CD40 CoStAR로 조작된 TIL 또는 모의 형질도입된 TIL을 환자 매칭된 종양 분해에 의해 자극된 확장 및 CD137 생산에 대해 평가하였다(도 16). 음성(6A), 저발현(6B) 내지 고발현(6C) 범위의 분해물 상에서 다양한 수준의 FolR을 나타내는 3개의 공여자 종양을 시험하였다. FolR 음성 분해물에 대해 매칭된 TIL의 CoStAR 조작된 집단의 모의 및 CoStAR 음성 TIL은 CoStAR의 존재에 의해 향상되지 않은 종양 공동배양 후 유사한 수준의 CD137 상향조절을 입증하였다(도 16d). FolR 저발현 분해물에 노출된 TIL에서, CoStAR-에 비해 CoStAR+ 세포에서 활성의 향상이 있었고, CD137 발현은 <10%에서 >20%로 증가하였다(도 16e). FolR 고발현 종양 분해물에 노출된 TIL에서, CoStAR- 집단에서 대략 20%로부터, CoStAR+ 집단에서 대략 50%까지의 활성 증가가 있었다(도 16f).
[00434] 이펙터 기능의 향상에 대해 FolR 표적화 CoStAR을 조사하였다. MOV19.CD28.CD40은 CD137 발현을 약 20%에서 약 50%로 향상시켰고(도 17a), FolR+ 종양 소화에 대한 반응에서 TNFα 생산을 10%에서 15%로 향상시켰고(도 17b), IL2 생산을 2%에서 5%로 향상시켰다(도 17c).
[00435] 가용성 리간드에 의한 CoStAR 매개 자극을 또한 조사하였다. 3명의 건강한 공여자로부터의 T-세포를 MOV19.CD28 또는 MOV19.CD28.CD40 CoStAR로 조작하고, 고정화된 OKT3으로 활성화시켜 FolR의 부재 하에 자극을 제공하거나, OvCAR-OKT3으로 활성화시켜 TCR 및 CoStAR 활성을 제공하였다. Bcl-XL 활성은 OKT3 자극 후 3명의 공여자에 걸쳐 10 내지 20%에서 증가한 반면(도 18a), IL2는 0 내지 12%로 증가되었고(도 18b), TNFα는 0 내지 20%로 증가하였다(도 18c). 외인성 가용성 FolR의 존재는 이러한 특정 이펙터 기능 중 어느 것도 향상시키지 않았다. OvCAR-OKT3의 존재 하에서, Bcl-XL 유도는 CD28 CoStAR에서 약 20%만큼 및 CD28.CD40 CoStAR에서 약 35%만큼 향상되었고(도 18d), IL-2 유도는 CD28 CoStAR에서 약 20%만큼 및 CD28.CD40 CoStAR에서 30 내지 50%만큼 향상되었고(도 18e), TNFα 생산은 CD28 CoStAR에서 20 내지 30%만큼 및 CD28.CD40 CoStAR에서 25 내지 50%만큼 향상되었다(도 18f). 외인성 가용성 FolR은 이러한 이펙터 기능 중 어느 것에도 억제 효과를 나타내지 않았다.
실시예 4
[00436] 물질 및 방법
[00437] 작제물 설계 - MFE23, MOV19 및 196-14 CoStAR 작제물은 공동자극 도메인에 융합된 온코스타틴 M1 리더 서열을 갖는 MFE23(CEA 특이적), MOV19(폴레이트 수용체 α 특이적) 또는 196-14(CA125 특이적) 유래된 단쇄 항체 단편 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 공동자극 도메인은 인간 CD8 또는 CD28로부터 유래된 세포외 스페이서 영역 및 막횡단 도메인 및 CD28, CD2 또는 CD137 및/또는 야생형 또는 돌연변이체 CD40 변이체의 신호전달 도메인을 함유한다. 본원에 기재된 일부 CoStAR은 CD28 및 CD40에 융합된 인간 PD1 세포외 도메인을 포함한다. 수용체를 P2A 절단 서열 및 말단절단된 형태의 인간 CD34로 클로닝하여 형질도입된 세포의 검출을 가능하게 하였다. CoStAR 뉴클레오티드 서열을 Genewiz Inc.에 의해 코돈 최적화시키고 유전자 합성하였다. 작제물을 3세대 렌티바이러스 벡터에 클로닝하였다.
[00438] 렌티바이러스 상청액을 첨가하기 전에 제조사의 지침에 따라 T-세포 활성화 및 확장 비드(Invitrogen)로 24시간 동안 활성화시키기 전에 말초 혈액 단핵 세포를 정상의 건강한 공여자로부터 단리하였다.
[00439] 세포 형질도입을 감염 96시간 후에 CEA.hFc 단백질(R&D Systems) 및 항-hFc-PE 이차, 플러스 항-CD34-APC를 사용하여 또는 항-CD34-PE 항체 단독에 의해 평가하였다. 이후, 30 ng/ml OKT3 및 200 IU/ml IL-2를 첨가하여 RPMI + 10% FCS에서 1:20 내지 1:200 비율로 x10 공여자 미스매칭된 조사된 PBMC 피더를 사용하여 세포를 추가로 확장시켰다. 14일 후, 세포를 이전과 같이 염색하고 검정을 위해 저장하였다.
[00440] CoStAR 양성 또는 음성 세포를 야생형 또는 OKT3 조작된 CEA-양성 LoVo 세포와 혼합함으로써 기능성 검정을 수행하였다. 간략하게, T-세포를 96-웰 플레이트에서 다양한 비율로 LoVo 세포와 혼합하였다. 흐름 분석을 위해 공동배양물을 브레펠딘(Brefeldin) 및 모넨신 및 항-CD107a 항체와 함께 16시간 동안 인큐베이션하고,이후에 세포를 Fixable Viability Dye ef450(eBiosciences)으로 염색하고, 4% 파라포름알데히드로 고정한 다음 Fix/Perm 세척 완충액(BD Biosciences)을 사용하여 투과시켰다. 이후, 세포를 항-CD34 또는 항 DYKDDDDK 항체로 염색하여 CoStAR+ 및 CoStAR- 집단, 항-IL-2, 항-TNFα 및 항-IFNγ 항체(Biolegend)를 구별하였다. 가용성 분석물 분석을 위해, ELISA, 사이토카인 비드 어레이(LEGENDPLEX™ 인간 Th 사이토카인 패널(12-플렉스)) 또는 케모카인 비드 어레이(LEGENDPLEX™ 인간 전염증성 케모카인 패널(13-플렉스))에 의한 분석을 위해 상청액을 수집하였다.
[00441] 완전한 T-세포 배지(TCM: 10% FCS, 0.01 M HEPES 및 1% 페니실린/스트렙토마이신, 50 mM β-머캅토에탄올이 보충된 RPMI) 중에 IL-2의 존재 또는 부재 하에, 8:1 이펙터:표적 비율로 T-세포 및 종양 세포를 혼합함으로써 증식 검정을 수행하였다. 지시된 시점에 세포 계수를 수행하고, 재자극 검정에서 8:1의 최종 E:T로 신선한 종양 세포를 첨가하였다. 웰로부터 세포를 취하고 암소에서 항-CD2 PerCP eFluor710 항체(eBioscience, UK)로 20분 동안 염색한 후, DRAQ7 염색하고 MACSQuant 분석기를 사용하여 계수함으로써 증식 검정을 위한 세포 계수를 수행하였다.
실시예 5
[00442] 어떤 수용체 신호전달 모티프가 CoStAR 활성의 CD40 향상에 기여하는지 결정하기 위해, TRAF6 결합 모티프(MFE23.CD28.CD40(AQAINF로 돌연변이된 PQEINF)), TRAF2 결합 모티프(MFE23.CD28.CD40), SVQE(AVQA로 돌연변이됨)) 또는 TRAF1/2/3/5 결합 모티프(MFE23.CD28.CD40(AVAEA로 돌연변이된 PVQET))에 돌연변이를 보유하는 변이체 수용체를 생성하였다. 3개의 별도의 건강한 공여자로부터 단리된 일차 인간 T-세포에 지시된 CoStAR 및 CD34를 통한 CoStAR 발현이 강화된 세포로 형질도입하였다. 공동 배양물을 LoVo-OKT3 세포로 설정하고 상청액을 사이토카인 분석을 위해 수집하였다.
[00443] 비-형질도입된 세포에 의한 IL2 생산은 매우 낮았지만, 야생형 MFE23.CD28.CD40 CoStAR을 발현하는 세포에서 상승하였다. IL2 생산은 SVQE, PQEINF 또는 Q263A 돌연변이에 대한 돌연변이에 의해 크게 영향을 받지 않았다. 그러나, PVQET 모티프에 대한 돌연변이는 T-세포에 의한 IL2 생산에 극적인 영향을 미쳤다.
[00444] 조작된 T-세포의 동시 증식을 LoVo-OKT3 세포로의 2 라운드의 자극에 걸쳐 LoVo-OKT3 세포에 반응하여 평가하였다. 비-형질도입된 세포는 1 라운드의 자극에도 생존하지 못한 반면, 야생형 수용체를 발현하는 세포는 14일에 걸쳐 2 라운드의 자극에 걸쳐 10배 확장을 겪었다. SVQE-AVQA 돌연변이 또는 PQEINF-AQAINF 돌연변이를 보유하는 세포는 증식하는 능력 감소를 나타내었고, 이는 Q263A 돌연변이를 보유하는 세포에서 추가로 악화되었다. 그러나, TRAF2/3 결합 영역에서 PVQET-AVAEA 돌연변이를 보유하는 세포는 2 라운드의 자극에 걸쳐 심각한 증식 불능을 나타내었다.
실시예 6
[00445] CEA에 결합하는 CoStAR의 설계 - CoStAR은 온코스타틴 M1, CD8α, CD2, IL-2, GM-CSF 또는 hIgGκ VIII 리더 서열을 갖는 CEA 특이적 MFE23, 인간화된(hu) MFE23, CEA6, BW431/26 또는 huT84.66 유래된 단쇄 항체 단편 뉴클레오티드 서열로 구성된다. 각각의 CoStAR은 CD8 또는 CD28 또는 말단절단된 CD28로부터 유래된 세포외 스페이서 도메인 및 CD28 및 CD40으로부터 유래된 신호전달 도메인을 갖는다. 작제물을 MND 프로모터를 함유하는 pSF.Lenti(Oxford Genetics)에 클로닝하고, P2A 절단 서열을 통해 말단절단된 CD34 마커 유전자로부터 분리하였다.
[00446] 렌티바이러스 생산 - 50 mM CaCl2를 함유한 무혈청 RPMI에서 함께, 10 ㎍의 각 플라스미드와 10 ㎍의 이식 유전자를 함유하는 pSF.렌티바이러스 플라스미드를 혼합함으로써 3-플라스미드 패키징 시스템(Cell Biolabs, San Diego, USA)을 사용하여 렌티바이러스 생산을 수행하였다. 혼합물을 75 ㎠ 플라스크에서 293T 세포의 50% 컨플루언트 단층에 적가하였다. 바이러스 상청액을 형질감염 48시간 및 72시간 후에 수집하고, 풀링하고, 제조업체의 지침에 따라 Lenti-X 렌티바이러스 상청액 농도(Takara Bio Inc. Japan) 용액을 사용하여 농축하였다. 렌티바이러스 상청액을 10배 농축하고, 4 ㎍/ml 폴리브렌(Sigma-Aldrich, Dorset, UK)의 존재 하에 3 내지 5의 MOI로 일차 인간 T-세포를 직접 감염시키는 데 사용하였다. 말초 혈액 단핵 세포를, 렌티바이러스 상청액을 첨가하기 전 제조자의 지침에 따라 T-세포 활성화 및 확장 비드(Invitrogen)로 24시간 동안 활성화되기 전에 정상의 건강한 공여자로부터 단리하였다.
[00447] 세포 형질도입을 감염 96시간 후에 CEA.hFc 단백질 및 항-hFc-PE 이차, 및 항-CD34-APC를 사용하여 또는 항-CD34-PE 항체 단독에 의해 평가하였다. 이후, 세포를 T-세포 배지(RPMI 1640, 10% FBS, 10mM HEPES, 50 μM β-머캅토에탄올 및 50 u/ml 페니실린/스트렙토마이신), IU/ml IL-2 및 최종 농도의 30 ng/ml 항-CD3(OKT3)에서 1:200 비율로 x10 공여자 미스매칭된 조사된 PBMC 피더를 사용하여 추가로 확장하였다. 12 내지 14일 후, 세포를 이전과 같이 염색하고 검정을 위해 저장하였다.
[00448] CoStAR 양성 또는 음성 세포를 야생형 또는 OKT3 조작된 CEA 양성 세포주(LoVo, HT29, SW480, H508)와 혼합함으로써 기능성 검정을 수행하였다. 간략하게, T-세포를 96-웰 플레이트에서 다양한 비율로 표적 세포와 혼합하고, 사이토카인 방출을 ELISA 및 MSD 분석에 의해 측정하였다.
[00449] 세포독성 검정을 xCELLigence RTCA SP 실시간 세포 분석기 시스템(Acea)을 사용하여 수행하였다. 실험 기간(최대 250시간) 동안 15분마다 96-웰 PET E-플레이트의 웰 전도도(세포 지수)를 시험하기 위한 프로그램을 생성하였다. 50 ㎕ T 세포 배지를 세포 지수를 시험할 웰에 첨가하고 실온(RT)에서 30분 동안 인큐베이션하였다. E-플레이트를 RTCA SP 디바이스에 첨가하고 백그라운드 전도도 판독값을 측정하였다.
[00450] 시드에 대한 표적 세포의 최적 밀도는 검정 시작 후 24시간 내지 36시간 사이에 안정한 세포 지수에 도달하고 검정 종료 전 개입(즉, Triton-x-100 또는 이펙터 세포 집단의 첨가) 없이 감소하지 않는 것으로 정의된다. 사멸 검정을 위한 최적 밀도의 표적 세포(세포주 의존성)를 사세포(dead-cell) 구별이 가능한 정량적 방법을 사용하여 계수하였다. E-플레이트를 디바이스로부터 제거하고, RT에서 30분 동안 인큐베이션하기 전에 100 ㎕의 최종 부피로 T 세포 배지를 함유하는 웰에 최적 밀도의 생세포(live cell)를 첨가하였다.
[00451] 이후, E-플레이트를 분석기에 다시 배치하고, 안정한 세포 지수가 관찰될 때까지 세포 지수 값을 획득하였고, 이 시점에서 프로그램이 일시 중지되고 E-플레이트가 RTCA SP 디바이스로부터 제거되었다. 처리물을 적절한 웰에 첨가하였다. 처리는 100 ㎕ T 세포 배지(처리 대조군 없음), 또는 이펙터 세포 또는 0.5% Triton-x-100을 함유하는 동일한 부피(완전 용해 대조군)으로 구성된다. 이펙터 세포 계수는 사멸- 및 아폽토시스-세포 구별이 가능한 정량적 방법을 사용한다. 표적 세포에 대한 이펙터의 수는 실험에 따라 다양하였다.
[00452] 데이터 분석 동안, 세포 지수는 RTCA 소프트웨어 패키지에서 하기 방정식을 사용하여 정규화된다:
[수학식]
정규화된 CIti = CIti/CInml_time
[00453] [상기 식에서, CIti = 특정 시점에서의 세포 지수(CI), 및 CInml_time = T 세포의 첨가 전 시점에서의 CI].
[00454] 이후, 데이터는 % 세포용해를 제공하기 위해 전체 용해 대조군에 비해 추가로 조작된다:
[수학식]
% 세포용해 = [1-(NCIst)/(AvgNCIRt)]×100
[00455] [상기 식에서, NCIst는 샘플에 대한 정규화된 세포 지수이고 NCIRt는 매칭 기준 웰에 대한 정규화 세포 지수의 평균임].
[00456] 96-웰 U-바닥 플레이트의 3중 웰에서 외인성 IL-2의 부재 하에 5×104 CoStAR 형질도입 또는 모의-형질도입된 세포를 LoVo-OKT3 세포와 8:1 E:T 비율로 혼합함으로써 반복 자극 검정을 수행하였다. αCD2 게이팅에 기반한 수의 유세포 분석 평가를 통해 D1, 4 및 7에 T-세포 계수를 수행하고, 7일 간격으로 새로운 종양 세포를 첨가하였다. 계수를 위해 제거된 세포의 비율도 고려하여 원래의 시딩 밀도에 기반하여 웰의 분할 및 배수 변화의 열거에 의해 상대 확장을 평가하였다.
[00457] 결과
[00458] CEA 지시된 CoStAR 수용체의 다양한 구조적 성분의 영향을 평가하기 위한 모델 시스템을 개발하였다. 이를 위해, 신호 펩티드(SP), 단쇄 항체 단편(scFv) 및 세포외 스페이서(ES)를 발현 및 기능에 미치는 영향에 대해 평가하였다.
[00459] 상이한 신호 펩티드가 다양한 재조합 단백질(REF)의 발현에 영향을 미칠 수 있는 것으로 알려져 있기 때문에 CoStAR의 발현에 대한 신호 펩티드의 영향을 시험하였다. MFE23.CD28.CD40 CoStAR 수용체를 다양한 상이한 리더 서열(원하는 신호 펩티드를 인코딩함) 서열로 생성하였다. 이들은 온코스타틴 M1(OSM), IL2, CD2, CD8α, GMCSF 및 hIgGκ VIII로부터 유래된 신호 펩티드를 포함한다. 각각의 리더 서열을 MFE23 scFv 서열과 프레임으로 클로닝하여 SP.MFE23.CD28.CD40.P2A.tCD34를 생성하였다. Jurkat 세포주 모델을 tCD34 마커 유전자에 대한 각각의 SP 변형된 CoStAR의 상대적 발현을 조사하기 위해 선택하였다. 이를 위해 Jurkat JRT3-T3.5 T-세포를 5의 MOI에서 렌티바이러스 입자와 함께 인큐베이션하였다. 형질도입 7일 후에 세포를 형질도입된 세포를 염색하기 위해 항-CD34 항체로 염색하고, CEA.hFc 단백질에 이어 항-hFc 이차 항체로 염색하여 CEA CoStAR에 대해 확인하였다. 시험된 모든 SP 변형된 CoStAR 변이체는 JRT3-T3.5 세포의 CD34+ 부분에서 발현되는 것으로 밝혀졌다.
[00460] 다음으로, CoStAR과 관련하여 상이한 CEA 특이적 scFv의 영향을 평가할 뿐만 아니라 상이한 스페이서 도메인을 조사하였다. 6개의 상이한 scFv를 비교하고; 뿐만 아니라 MFE23 K>Q 돌연변이체를 포함하는 상기 기재된 MFE23 서열(Chester et al. 1994), 인간화(Hu) MFE23(Begent et al. 2003), CEA6(Jackson et al. 1998), BW431/26(Seenmann et al. 1991) 및 HuT84.66(Yazaki et al. 2005)를 비교하였다.
[00461] 일차 인간 T-세포를 NHSBT로부터 수득된 버피 코트로부터 단리하였다. T-세포를 Ficoll-매개 단리 및 T-세포 음성 단리 키트(StemCell Technologies)에 의해 단리하였다. 단리된 T-세포를 인간 T-세포 활성화 및 확장 비드(Invitrogen, UK)로 활성화하였다. 세포를 OSM SP를 함유하는 CEA CoStAR을 인코딩하는 농축된 렌티바이러스 입자와 함께 인큐베이션하고, 수일에 걸쳐 확창시켰다. 물질 및 방법에서 약술된 바와 같이 조사된 버피 코트 유래된 PBMC와 함께, 급속 확장 프로토콜(REP)에 배치되기 전에 항-CD34 항체를 사용하여 CoStAR 발현에 대해 세포를 농축하여 90% 초과의 CoStAR 양성의 T-세포 집단을 수득하였다.
[00462] 생리학적으로 관련된 시험관내 모델을 사용하여 T-세포 활성에 대한 CoStAR의 영향을 시험하였다. 형질도입된 세포 및 비-형질도입된 세포를 CEA+ 세포주 LoVo, H508, SW480 또는 HT29에 대해 시험하였다. 뮤린 CEA-세포주 Ba/F3을 대조군으로서 CEA를 발현하도록 조작하였다. 비매칭된 종양주에 반응하여 T-세포의 활성화를 가능하게 하기 위해, 종양 세포를 합성 막횡단 도메인에 의해 세포막에 고정된 항-CD3 단쇄 항체 단편을 발현하도록 조작하고 유세포 분석을 사용하여 형질도입된 세포를 시각화하기 위한 IRES 요소를 사용하여 GFP 마커 유전자로부터 분할하였다. 세포주를 또한 표적 세포 용해의 분석을 허용하기 위해 퓨로마이신 선택 하에 반딧불이-루시페라제(ffLuc)를 발현하도록 조작하였다.
[00463] 비-형질도입된 및 CoStAR 형질도입된 T-세포를 야생형 또는 OKT3-조작된 종양 세포주와 다양한 이펙터:표적 비로 혼합하였다. 24시간 후, IL-2 ELISA 측정을 위해 공동배양 배지를 취하였다. 활성화 의존성 IL-2 분비는 OKT3 조작된 세포에 반응하여 모든 공여자로부터의 CoStAR+ 및 CoStAR- T-세포 집단 둘 모두로부터 관찰되고, 단지 백그라운드 IL-2 분비는 조작되지 않은 종양 세포에 반응하여 형질도입된 및 비-형질도입된 T-세포로부터 나타났다. 시험된 모든 공여자에서, CEA CoStAR의 존재는 OKT3 조작된 CEA+ 종양주에 대한 이펙터 활성(IL2, IL3, CXCL10)을 향상시킨다.
[00464] Ba/F3 세포와의 공동배양은 CEA CoStAR의 표적화된 접근법을 입증한다. Ba/F3 또는 Ba/F3-CEA와 CEA CoStAR 조작된 세포의 공동배양은 특정 IL2 방출을 초래하지 않는 반면, Ba/F3-OKT3과의 인큐베이션은 IL-2 분비를 향상시킨다. 그러나, Ba/F3-OKT3/CEA와 T-세포의 인큐베이션은 Ba/F3-OKT3 단독과 비교하여 IL2 분비를 유의하게 향상시킨다.
[00465] 종양 세포 사멸에 대한 CoStAR의 영향을 결정하였다. 형질도입된 또는 비-형질도입된 T-세포를 야생형 또는 OKT3-GFP 조작된 종양 세포와 혼합하고 정의된 시점에서 잔류 종양 세포 유래된 루시페라제 활성을 정량화하였다. CoStAR의 존재는 표적 세포 용해를 매개하는 T-세포의 능력을 향상시킨다. 항종양 활성을 매개하는 CoStAR+ 세포의 이러한 향상된 능력은 또한 물질 및 방법에 약술된 바와 같이 xCELLigence 디바이스를 사용하여 입증된다.
[00466] 반복 자극 검정을 물질 및 방법에 따라 수행하였다. 간단히 말해서, 모의 또는 CoStAR 조작된 세포를 OKT3 조작된 표적주와 8:1의 E:T 비율로 혼합하고, 7일 간격으로 새로운 종양을 첨가하면서 지시된 시점에 T-세포의 상대적 확장을 나열하였다. 시험된 모든 CoStAR은 여러 라운드의 자극에 걸쳐 T-세포의 연장된 생존 및 확장을 매개하는 반면, 모의 형질도입된 세포의 수는 반복 자극 후 감소한다.
[00467] TIL 시편에서 CoStAR 활성을 평가하기 위해, TIL을 CEA 특이적 CoStAR 작제물로 조작하였다. 이를 위해, 종양을 분해시키고 유세포분석을 사용하여 CEA 발현에 대해 분석하였다. 양성으로 시험된 종양 분해물을 CEA CoStAR로 조작하였다. 파생물(outgrowth) 및 급속 확장 프로토콜에 따라, 조작된 TIL 및 매칭된 비-조작된 TIL을 종양 분해제, 또는 이용 가능한 경우, 매칭된 자가 종양주와 혼합하였다. 시험된 모든 공여자에서, CEA CoStAR의 존재는 모의 형질도입된 세포와 비교하여 IFNγ 및 IL-2에 의해 측정된 바와 같이 특이적 이펙터 활성을 향상시켰다.
실시예 7
[00468] 항-MSLN CoStAR 발현
[00469] 상이한 scFv 항원-결합 도메인(표 8)을 포함하는 항-MSLN CoStAR을 건강한 공여자로부터의 T 세포 상의 표면 발현에 대해 비교하였다.
[00470] 건강한 공여자(HD) PBMC로부터의 T 세포를 CD28.CD40 신호전달 도메인을 보유하는 메조텔린(MSNL)에 대한 6개의 가변 scFV 작제물로 감염 다중도(MOI) 5로 렌티바이러스 형질도입하였다. 비-형질도입된(MOCK) 세포를 대조군으로 사용하였다. 세포를 CD34 마이크로비드를 사용하여 분류하고 14일 동안 급속 확장 프로토콜(REP)을 거쳤다. 확장 후, 각각 항-CD34-APC(검정색) 또는 항-MSLN-PE(적색) 항체를 사용하여 마커 유전자 tCD34 또는 CoStAR 분자의 표면 검출을 통해 1×105 세포를 형질도입 효율에 대해 평가하였다(도 19). 결과는 3개의 생물학적 복제물을 나타낸다.
실시예 8
[00471] 항-MSLN CoStAR 활성
[00472] 표적 세포주와 공동배양된 CoStAR 형질도입된 HD T 세포에서 사이토카인 생산을 평가하였다. 상이한 항-MSLN 결합 도메인, 스페이서, 또는 막횡단 도메인(표 8, 표 9, 표 10)을 포함하는 다양한 CoStAR을 시험하였다.
[00473] 비-형질도입된(MOCK) 및 항-MSNL CoStAR 형질도입된 HD T 세포를 24시간 동안 8:1(1×105: 1.25×104)의 이펙터 대 표적(E:T) 비율로 조작된 OVCAR3 표적 세포주와 공동배양하고 MSD 면역검정을 수행하여 분비된 사이토카인의 농도를 평가하였다. OVCAR-3 또는 OVCAR3-OKT3 세포주와의 공동배양 후 IL-2(도 20a), IFNγ(도 20b) 및 TNFα(도 20c)에 대한 사이토카인 농도를 결정하였다. 처리되지 않은 T 세포를 대조군으로 사용하였다. 결과는 각각 3개의 기술적 복제물과 함께 1 내지 3개의 생물학적 복제물을 나타낸다.
[00474] 비-형질도입된(MOCK) 및 항-MSNL CoStAR 형질도입된 HD T 세포를 24시간 동안 8:1(1×105: 1.25×104)의 이펙터 대 표적(E:T) 비율로 조작된 K562 표적 세포주와 공동배양하고 MSD 면역검정을 수행하여 분비된 사이토카인의 농도를 평가하였다. K562-MSNL 또는 K562-MSNL-OKT3 세포주와의 공동배양 후 IL-2(도 21a), IFNγ(도 21b) 및 TNFα(도 21c)에 대한 사이토카인 농도를 결정하였다. 처리되지 않은 T 세포를 대조군으로 사용하였다. 결과는 각각 3개의 기술적 복제물을 갖는 1 내지 3개의 생물학적 복제물을 나타낸다.
[00475] 항-CEA CoStAR 발현
[00476] 항-CEA CoStAR 발현을 상이한 신호 펩티드(표 11) 또는 scFv 항원 결합 도메인(표 12)을 포함하는 항-CEA CoStAR에 대해 평가하였다.
[00477] 신호 펩티드 변이체를 조사하기 위해, 건강한 공여자 PBMC로부터의 T 세포를 CD28.CD40 도메인을 보유하는 암종배아 항원 5(CEA)에 대한 MFE23 scFV 작제물로 감염 다중도(MOI) 5로 렌티바이러스 형질도입하였다. 작제물은 신호 펩티드에서 변이를 갖고, 비-형질도입된(MOCK) 세포를 대조군으로 사용하였다. 세포를 CD34 마이크로비드를 사용하여 분류하고 14일 동안 급속 확장 프로토콜(REP)을 거쳤다. 확장 후, 1×105개 세포를 각각 항-CD34-APC(검정색 막대)를 사용하거나 이차 항-IgG-Fc-PE(회색 막대)와 함께 일차 rhCEACAM5-Fc 항체를 사용하여 마커 유전자 tCD34 또는 CoStAR 분자의 표면 검출을 통해 형질도입 효율에 대해 평가하였다(도 22).
[00478] 건강한 공여자 PBMC로부터의 T 세포를 또한 CD28.CD40 도메인을 보유하는 암종배아 항원 5(CEA)에 대한 가변 scFV 작제물로 감염 다중도(MOI) 5로 렌티바이러스 형질도입하였다. 상기와 같이, 비-형질도입된(MOCK) 세포를 대조군으로 사용하였다. 세포를 CD34 마이크로비드를 사용하여 분류하고 14일 동안 급속 확장 프로토콜(REP)을 거쳤다. 확장 후, 1×105개 세포를 각각 항-CD34-APC(검정색 막대)를 사용하거나 이차 항-IgG-Fc-PE(회색 막대)와 함께 일차 rhCEACAM5-Fc 항체를 사용하여 마커 유전자 tCD34 또는 CoStAR 분자의 표면 검출을 통해 형질도입 효율에 대해 평가하였다(도 23).
실시예 9
[00479] 항-CEA CoStAR 활성
[00480] 사이토카인 생산을 Lovo 표적 세포주와 공동배양된 CoStAR 형질도입된 HD T 세포에서 평가하였다. 상이한 항-CEA 결합 도메인(표 12)을 포함하는 CoStAR을 시험하였다. 비-형질도입된(MOCK) 및 항-CEA CoStAR 형질도입된 HD T 세포를 24시간 동안 8:1(1×105: 1.25×104)의 이펙터 대 표적(E:T) 비율로 조작된 표적 세포주와 공동배양하고, MSD 면역검정을 수행하여 분비된 사이토카인의 농도를 평가하였다. Lovo 또는 Lovo-OKT3 세포주와의 공동배양 후 IL-2(도 24a) IFNγ(도 24b) 및 TNFα(도 24c)에 대한 사이토카인 농도를 결정하였다. 처리되지 않은 T 세포를 대조군으로 사용하였다. 결과는 3개의 기술적 복제물을 갖는 1개의 생물학적 복제물을 나타낸다.
[00481] 사이토카인 생산을 또한 K562 표적 세포주와 공동배양된 CoStAR 형질도입된 HD T 세포에서 평가하였다. 상기와 같이, 세포를 24시간 동안 8:1(1×105: 1.25×104)의 이펙터 대 표적(E:T) 비율로 조작된 표적 세포주와 공동배양하고, MSD 면역검정을 수행하여 분비된 사이토카인의 농도 및 사이토카인 농도를 평가하였다. K562.CEACAM5 또는 K562.CEACAM5.OKT3 세포주와의 공동배양 후 IL-2(도 25a), IFNγ(도 25b) 및 TNFα(도 25c)에 대해 결정되었다. 처리되지 않은 T 세포를 대조군으로 사용하였다.
[00482] 스페이서-막횡단 변이체를 또한 조사하였다. 한 실험에서, hMFE23 CEA-결합 도메인 및 상이한 스페이서/막횡단 도메인을 포함하는 항-CEA CoStAR을 비교하였다.
[00483] 건강한 공여자 PBMC로부터의 T 세포를 CD28.CD40 도메인을 보유하는 암종배아 항원 5(CEA)에 대한 hMF23 scFV 작제물로 감염 다중도(MOI) 5에서 렌티바이러스 형질도입하였다. 세포를 CD34 마이크로비드를 사용하여 분류하고 14일 동안 급속 확장 프로토콜(REP)을 거쳤다. 확장 후, 항-CD34-APC(검정색 막대)를 사용하여 마커 유전자 tCD34의 표면 검출 또는 CoStAR 분자의 검출을 통해 또는 이차 항-IgG-Fc-PE(회색 막대) 항체와 함께 일차 rhCEACAM5-Fc 항체를 사용하여 1×105개 세포를 형질도입 효율에 대해 평가하였다(도 26). 모든 변이체를 효율적으로 발현시켰다.
[00484] 사이토카인 생산을 Lovo 표적 세포주와 공동배양된 CoStAR 형질도입된 HD T 세포에서 평가하였다. 상기와 같이, 세포를 24시간 동안 8:1(1×105: 1.25×104)의 이펙터 대 표적(E:T) 비율로 조작된 표적 세포주와 공동배양하고, MSD 면역검정을 수행하여 분비된 사이토카인의 농도를 평가하고, Lovo 또는 Lovo-OKT3 세포주와의 공동배양 후 사이토카인 농도를 IL-2(도 27a), IFNγ(도 27b) 및 TNFα(도 27c)에 대해 결정하였다. 처리되지 않은 T 세포를 대조군으로 사용하였다.
실시예 10
[00485] CoStAR을 세포내 신호전달 도메인을 시험하기 위해 작제하였다. 도 28은 CD40, CD134, CD137, CD2, ICOS, DAP10, 및 NTRK1 신호전달 요소를 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 갖는 hMFE23 CEA-결합 도메인을 포함하는 항-CEA CoStAR을 도시한다.
[00486] 건강한 공여자 PBMC로부터의 T 세포를 암종배아 항원 5(CEA)에 대한 hMF23 scFV 작제물로 감염 다중도(MOI) 5로 렌티바이러스 형질도입하였다. 비-형질도입된(MOCK) 세포를 대조군으로 사용하였다. 세포를 CD34 마이크로비드를 사용하여 분류하고 14일 동안 급속 확장 프로토콜(REP)을 거쳤다. 확장 후, 각각 항-CD34-APC(검정색)를 사용하거나 이차 항-IgG-Fc-PE(적색) 항체와 함께 일차 rhCEACAM5-Fc 항체를 사용하여 마커 유전자 tCD34 또는 CoStAR 분자의 표면 검출을 통해 1×105개 세포를 형질도입 효율에 대해 평가하였다(도 29). 결과는 3개의 생물학적 복제물을 나타낸다.
[00487] CoStAR 형질도입된 세포를 표현형으로 특성규명하였다. 파생물 및 REP 후, 1×105 세포를 유세포 분석을 사용하여 분화 하위타입에 대해 평가하였다.
3명의 공여자의 HD PBMC로부터의 T 세포를 도 28의 hMF23 scFV 작제물로 렌티바이러스 형질도입하였다. 세포를 CD34 마이크로비드를 사용하여 분류하고 14일 동안 급속 확장 프로토콜(REP)을 거쳤다. 파생물 및 REP 후, 1×105 세포를 유세포 분석을 사용하여 비-형질도입된 세포와 비교하여 분화 하위타입에 대해 평가하였다. T 세포 표현형은 CD3 세포의 비율로서 도 30에 도시되어 있다.
실시예 11
[00488] 사이토카인 분비 항-CEA hFME23 CoStAR 형질도입된 T 세포를 K562 표적 세포와의 공동배양에 의해 평가하였다. 비-형질도입된(MOCK) 및 항-CEA CoStAR 형질도입된 HD T 세포를 24시간 동안 8:1(1×105: 1.25×104)의 이펙터 대 표적(E:T) 비율로 조작된 표적 세포주와 공동배양하고, MSD 면역검정을 수행하여 분비된 사이토카인의 농도를 평가하였다. K562.CEACAM5(신호 2) 또는 K562.CEACAM5.OKT3(신호 1+2) 세포주와의 공동배양 후 IL-2(도 31a), IFNγ(도 31b) 및 TNFα(도 31c)에 대한 사이토카인 농도를 나타낸다. 처리되지 않은 T 세포를 대조군으로 사용하였다.
[00489] 사이토카인 발현을 또한 평가하였다. 비-형질도입된(MOCK) 및 항-CEA CoStAR 형질도입된 HD T 세포를 브레펠딘 A의 존재 하에 16시간 동안 1:1(1×105: 1×105)의 이펙터 대 표적(E:T) 비율로 조작된 표적 세포주와 공동배양하고, 사이토카인 생산 세포를 세포내 유세포 분석을 사용하여 측정하였다. K562.CEACAM5(신호 2) 또는 K562.CEACAM5.OKT3(신호 1+2) 세포주와의 공동배양 후 IL-2(도 32a), IFNγ(도 32b) 및 TNFα(도 32c) 발현 세포의 빈도를 나타내었다. 처리되지 않은 T 세포를 대조군으로 사용하였다.
실시예 12
[00490] 항-CEA CoStAR 형질도입된 세포의 증식.
[00491] HD T 세포를 hMFE23 항-CEA CoStAR로 형질도입하고 조작된 표적 세포와 공동배양하였다. 비-형질도입된(MOCK) 및 항-CEA CoStAR 형질도입된 HD T 세포를 0일에 8:1(1×105: 1.25×104)의 이펙터 대 표적(E:T) 비율로 K562.CEACAM5.OKT3 조작된 표적 세포주와 공동배양하였다. 비-형질도입된(MOCK) 세포를 대조군으로 사용하였다. 7일에, 최대 50000개의 세포를 8:1의 E:T에서 K562.CEACAM5.OKT3 조작된 표적 세포주로 재자극하였다. 자극 후 5일, 7일 및 9일에 유세포 분석에 의한 계수를 위해 공동 배양물의 일부를 수집하였다. 모든 계수에 대해, DRAQ7을 생세포 구별에 사용하고 CD2를 사용하여 T 세포를 열거하였다(도 33). 도면은 투입 세포의 배수 확장을 나타낸다. N= 2
[00492] 배수 확장을 평가하기 위해 상기와 같이 hMFE23 항-CEA CoStAR로 형질도입되고 K562.CEACAM5.OKT3 조작된 표적 세포주와 공동배양된 HD T 세포를 6일에 계수하기 위해 샘플링하였다(도 34). 생세포 구별을 위해 DRAQ7을 사용하고 T 세포를 열거하기 위해 CD2를 사용하여 유세포 분석에 의해 세포를 계수하였다.
실시예 13
[00493] 신호 전달 및 세포내 도메인 결합 부위 및 모티프.
[00494] 사이토카인 분비에 대한 CD40의 TRAF2/TRAF3 및 TRAF6 결합 부위에서 돌연변이 효과(도 35) 및 CD28.CD40 CoStAR 형질도입된 T 세포의 장기 생존 및 증식의 효과를 조사하였다. 3명의 공여자의 세포를 Dynabeads로 활성화시키고 WT CD28.CD40(CTP194), TRAF2 결합 부위 돌연변이 SVQE>AVQA(CTP195), TRAF2/TRAF3 결합 부위 돌연변이 PVQET>AVAEA(CTP196), TRAF6 결합 부위 돌연변이 PQEINF>AQAINF(CTP197), Q263A(CTP199)를 함유하는 CD28.CD40로 형질도입하거나, 모의 형질도입하였다. 세포를 CD34 마커 발현에 대해 농축하고, 급속 확장 프로토콜(REP)에 따라 확장하고, 후속 실험을 위해 동결시켰다. 해동 후, 세포를 IL-2가 보충된 완전한 RPMI에서 3 내지 4일 동안 휴지시키고 이들의 형질도입 속도를 CD34 마커 유전자 발현을 관찰하여 결정하였다. 생존율 및 절대 계수를 유세포 분석(Novocyte)에 의해 DRAQ-7(1:200)을 사용하여 밤새 IL-2 기아 후 평가하였고, 데이터를 NovoExpress 1.5.0 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 형질도입된 T 세포를 IL-2의 부재 하에 LoVo(ATCC로부터의 CCL-229TM) 또는 LoVo.OKT3.GFP 종양 세포와 8:1 이펙터 대 표적 비율로 공동배양하였다. 24시간 후, 상청액을 수집하고 동결시켰다. LoVo 및 LoVo.OKT3.GFP는 이들의 표면에서 자연적으로 CEA 및 PD-L1을 발현하여, CoStAR 단독(LoVo)을 통해 또는 신호 1(LoVo.OKT3.GFP)과 회합된 신호 2를 형질도입된 T 세포에 부여한다. 공동배양을 3회 수행하고, 상응하는 음성(T 세포 단독, 종양 세포 단독) 및 양성(PMA + 이오노마이신) 대조군을 실험에 포함시켰다. 해동 후, 분비된 IL-2를 ELISA에 의해 검출하고, FLUOstar Omega 마이크로플레이트 리더를 사용하여 흡광도를 측정한 다음, Omega MARS 3.42 R5 소프트웨어로 분석하였다(도 36a). 각 점은 1명의 공여자에 대한 3회의 평균을 나타낸다. 음성 대조군(T 세포 단독, 종양 세포 단독)은 모두 검출 범위 미만이었다.
[00495] 6 내지 8일 후, 생존력 및 절대 계수를 평가하고, 살아있는 T 세포를 상기 기재된 바와 같이 새로운 LoVo.OKT3.GFP 종양 세포로 추가 주 동안 재접종하였다. 장기 공동배양의 말미에, 생존력 및 절대 계수를 측정하고, 배수 확장을 계산하였다(도 36b). 데이터는 3회 분석된 n≤3 공여자의 평균 +/- SEM으로 나타내었다.
[00496] TRAF2 결합 부위의 돌연변이(SVQE>AVQA; CTP195)는 IL-2 분비의 감소를 거의 나타내지 않고, 팽창의 중간 정도의 감소를 초래하였다(도 80). TRAF2/TRAF3 결합 부위의 돌연변이(PVQET>AVAEA; CTP196)는 IL-2 분비 및 확장을 실질적으로 감소시켰다. TRAF6 결합 부위의 돌연변이(PQEINF>AQAINF; CTP197)는 IL-2 분비의 중간 정도의 감소 및 팽창의 중간 정도의 감소를 초래하였다.
실시예 14
[00497] 24일 프로토콜을 사용하여 비-형질도입된(Non-Td) 및 항-FOLR1 CoStAR 형질도입된(Td) TIL을 생성하였다. 간략하게, 분취량의 OC 분해물을 해동하고 48h 및 72h에 5의 감염 다중도(MOI)로 항-FOLR1 CoStAR 렌티바이러스로 형질도입하였다. 이후, 세포를 8일 동안 확장시키고(파생물), 이어서 동종이계 조사된 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 사용하여 12일 동안 급속 확장 프로토콜(REP)에 적용하였다.
[00498] 생산 후, TIL CD4/CD8 비율 및 항-FOLR1 CoStAR 형질도입 효율을 측정하였다. TIL을, 유세포 분석 패널을 사용하여 이들의 분화 상태, 공동-억제 및 공동-자극 마커의 발현, T 세포 하위세트 및 사이토카인 생산 가능성에 대해 표현형으로 특성규명하였다.
[00499] 파생물을 위한 완전한 TIL T 세포 배지(TCM)는 50 mL의 열 불활성화된 우태아 혈청, 젠타마이신(10 ㎍/mL)/암포테리신(0.25 ㎍/mL) 및 반코마이신(50 ㎍/mL)을 갖는 450 mL의 GIBCO 맞춤형 P158718 배지로 구성된다. 완전 급속 확장 프로토콜(REP) 배지는 40 mL 인간 AB 혈청, 젠타마이신(10 ㎍/mL)/암포테리신(0.25 ㎍/mL) 및 반코마이신(50 ㎍/mL)을 갖는 460 mL의 GIBCO 맞춤형 P158718로 구성된다.
[00500] 항-FOLR1 CoStar OC TIL의 생성
[00501] 5개의 OC 샘플을 사용하여 항-FOLR1 CoStAR 변형된 TIL을 생성하였다. TIL의 성장 기간은 12일이었다. 1일(D1)에, 각 공여자로부터의 샘플을 완전 TIL TCM에서 해동시키고, 세포를 400 ×g에서 5분 동안 원심분리함으로써 1회 세척하고, 새로운 TIL TCM에 재현탁시키고, 계수하였다. Novocyte 3005 Flow Cytometer System을 사용하여 DRAQ7 염료 및 항-CD2 항체 염색을 사용하여 모든 세포 계수를 수행하였다. 이어서, TIL을 400 ×g에서 5분 동안 원심분리하고, 1×106개 세포/mL의 농도로 재현탁시키고, 3000 IU/mL IL-2를 갖는 적절한 용기에 넣고, 37℃로 설정된 5% CO2 인큐베이터에서 2일 동안 휴지시켰다.
[00502] 3일의 휴지 기간 후, 세포를 수집하고, 세척하고, 400 ×g에서 5분 동안 원심분리하고, 새로운 완전 TCM에 재현탁시켰다. 각 샘플에서 생존 세포의 수를 상기 기재된 바와 같이 Novocyte 3005를 사용하여 결정하였고, 세포를 400 ×g에서 5분 동안 원심분리하고 1×106개 세포/mL의 농도로 재현탁시켰다. 각 샘플을 2개의 동일한 부분으로 분할하였고, 하나는 비-Td의 생산을 위한 것이고 다른 하나는 항-FOLR1 CoStAR을 발현하도록 변형된 형질도입된(Td) TIL을 위한 것이다. 항-FOLR1 CoStAR 렌티바이러스를 사용한 형질도입을 생세포의 총 수를 기준으로 5의 MOI로 수행하였다. IL-2를 3000 IU/mL의 농도로 첨가하고, 세포를 37℃로 설정된 5% CO2 인큐베이터에 넣었다.
[00503] 4일에, 세포를 수집하고, 완전 TIL TCM으로 1회 세척하고, 형질도입 2일 동안 3일에와 동일한 부피의 새로운 완전 TIL TCM에 재현탁시켰다. 5의 MOI에서 항-FOLR1 CoStAR 렌티바이러스를 사용하여 형질도입을 수행하고, 세포를 37℃로 설정된 5% CO2 인큐베이터에 8일 동안 배치하기 전에 3000 IU/mL의 IL-2를 세포에 첨가하였다. IL-2(3000 IU/mL)를 D13까지 2 내지 3일마다 세포에 첨가하였다.
[00504] 13일에 세포를 수집하고, 세척하고, 완전 TIL TCM에 재현탁시키고, Novocyte 3005를 사용하여 계수하였다. 13일에 TIL 수를 결정한 후, 세포를 200:1 비의 피더:TIL로 피더로서 10명의 건강한 공여자 가치의 조사된 동종이계 PBMC를 사용하여 REP에 대해 적절한 스케일의 G-REX 플레이트에 시딩하였다. REP에 사용된 배지는 활성화를 위해 30 ng/mL의 농도로 첨가된 항-CD3(OKT3) 항체를 갖는 완전한 REP TIL TCM이었다. IL-2를 3000 IU/mL의 농도로 첨가하고, 세포를 37℃로 설정된 5% CO2 인큐베이터에 넣었다. REP 기간은 12일이었고, 그 동안 2 내지 3일마다 IL-2(3000 IU/mL)가 보충되었다.
[00505] 19일(즉, REP의 6일)에, 24 웰 G-REX 플레이트로부터의 5 mL의 배지 또는 6 웰 G-REX 플레이트로부터의 25 mL의 배지를 세포를 방해하지 않고 제거하고 새로운 완전 REP TIL TCM 및 IL-2(3000 IU/mL)로 대체하였다. D25에, REP의 말미에, 400 ×g에서 5분 동안 원심분리에 의해 TIL을 수확하고, Novocyte 3005를 사용하여 계수하기 위해 새로운 배지에 재현탁시켰다. TIL을 1×106개 세포/mL의 농도로 재현탁시켰다. 이후에, CD3, CD4, CD8, CoStAR에 대한 항체 및 생존성 염색으로 각 샘플의 1×105개 세포를 염색함으로써 TIL을 형질도입 효율에 대해 평가하였다. 제조사의 지침에 따라 DNeasy Blood & Tissue Kit를 사용하여 각 샘플로부터 1×106개 세포로부터 DNA를 추출하였다. 단리된 DNA를 사용하여 소적 디지털 PCR(ddPCR) 및 항-FOLR1 CoStAR 및 참조 유전자 폴리(rC) 결합 단백질 2(PCBP2)에 특이적인 프라이머를 사용하여 벡터 복사체 수(VCN)를 분석하였다. 후속 실험을 위해 2 내지 5×107개 세포를 IL-2(3000 IU/mL)와 함께 새로운 완전 REP TIL TCM에서 3일 동안 휴지시켰다. 나머지 TIL을 동결보호제에 재현탁시키고 동결바이알에 분취하고, -80℃로 밤새 냉각시킨 다음, 단기 저장을 위해 -150℃로 옮겼다. 동결보존된 TIL을 37℃ 수조에서 해동시키고, 400 ×g에서 5분 동안 원심분리에 의해 PBS로 1회 세척한 다음, 실험 전에 상기 기재된 바와 동일한 휴지 기간을 거쳤다.
[00506] 4명의 공여자로부터의 항-FOLR1 CoStAR OC TIL의 표현형 특성규명.
[00507] 4명의 공여자로부터의 비-Td 및 Td 세포를 IL-2(3000 IU/mL)를 갖는 REP TCM 배지에서 3일 동안 휴지시켰다. 후속하여, 세포를 수확하고, 400 ×g에서 5분 동안 원심분리에 의해 배지로 1회 세척하고, 새로운 완전 REP TIL TCM에 재현탁시키고, Novocyte 3005를 사용하여 계수하고, 1×106개 세포/mL의 농도로 재현탁시켰다. TIL의 세포측정 평가를, 4개의 유세포측정 패널을 사용하여 웰 당 1×105개 세포에 대해 3회 수행하였다. 분화 상태의 평가를 CD3, CD4, CD8, CD27, CD95, CCR7, CD45RA, CD45RO, CoStAR, 및 생존성 염색에 대한 항체를 갖는 패널을 사용하여 수행하였다. CD4, CD8, CD137, 프로그램된 세포 사멸 단백질 1(PD-1), 세포독성 T-림프구-관련 단백질 4(CTLA-4), 림프구-활성화 유전자 3(LAG-3), T 세포 면역글로불린 및 뮤신 도메인 단백질 3(TIM-3), 신호전달 림프구 활성화 분자(SLAM), CoStAR에 대한 항체 및 생존력 염색를 사용하여 공동저해 및 공동자극 마커 발현을 평가하였다. Treg를 포함하는 세포 하위집단을, CD3, CD4, CD25, 포크헤드 박스 단백질 3(FOXP3), T 세포 수용체 알파 베타(TCRαβ), T 세포 수용체 감마 델타(TCRγδ), CD56, CD127, CoStAR에 대한 항체, 및 생존성 염색을 사용하여 평가하였다. 유사분열 자극시 사이토카인 생산을 CD3, CD4, CD8, IL-22, TNFα, IL-17A, IFNγ, CoStAR에 대한 항체, 및 생존력 염색을 사용하여 평가하였다. 이 패널의 경우, TIL을 PMA(50 ng/mL)/이오노마이신(1 ㎍/mL), 및 브레펠딘 A(1000 x)의 첨가에 의해 활성화시키고, 37℃로 설정된 5% CO2 인큐베이터에 4시간 동안 두었다. 활성화 후, TIL을 수집하고, 400 ×g에서 5분 동안 원심분리하고, 계수하고, 세포계산 분석을 위해 1×105개 세포를 삼중으로 시딩하였다. 모든 유세포 분석 패널에 대해, 제조사의 지침에 따라 BD Cytofix/Cytoperm을 사용하여 고정 및 투과성을 수행하였다. 염색 후, 세포를 세척하고 Novocyte 3005 유세포 분석기 시스템을 사용한 분석을 위해 PEF(500 mL DPBS, 2 mL EDTA 및 2.5 mL의 열 불활성화 FBS)에 재현탁시켰다.
비-Td 및 Td 세포의 분석
[00508] 4개의 표현형 특성화 패널의 경우, Fc 태그를 갖는 재조합 인간 FOLR1(rhFOLR1-FC)을 항-FOLR1 CoStAR 세포의 검출에 사용하고, 관심 집단을 비-Td TIL에 대한 CoStAR-하위세트로부터 보고하였고, Td TIL로부터의 CoStAR- 및 CoStAR+ 분획 둘 모두(항-FOLR1 CoStAR- Td TIL 및 항-FOLR1 CoStAR+ Td TIL)으로부터 보고하였다. 이러한 집단에 대해 추가 하위세트 특성화를 수행하였다.
[00509] 분화 상태
[00510] T 세포 분화 상태를 특성화하기 위해 사용된 게이팅 전략은 다음과 같았다: 림프구 게이트, 이어서 이중선 및 사세포 배제, CD3+, CD4+ 및 CD8+ 게이트. 모든 3개의 집단(CD3+, CD4+, 및 CD8+)으로부터, 관심 T 세포 분획에 대해 추가 분석을 수행하였다. 상이한 T 세포 기억 하위세트를 특성화하기 위해, CD45RA+CD45RO- 및 CD45RA-CD45RO+ 세포를 CD3+ 세포로부터 게이팅하였다. 이어서, CD45RO+CCR7+ 및 CD45RO+CCR7- 집단을 CD45RA-CD45RO+ 세포로부터 게이팅하였다. 이러한 게이트를 사용하여, 중심 기억 T 세포(Tcm; CD45RO+CCR7+CD95+CD27+) 세포 및 이펙터 기억 T 세포(Tem; CD45RO+CCR7-CD95+CD27+/-) 세포를 추가로 게이팅하였다. 또한, CD45RA+CCR7+ 및 CD45RA+CCR7- 집단을 CD45RA+CD45RO- 세포로부터 게이팅하였다. 이러한 게이트를 사용하여, 줄기 세포 기억 T 세포(Tscm; CD45RA+CCR7+CD95+CD27+) 및 나이브 T 세포(Tn; CD45RA+CCR7+CD95-CD27+)를 CD45RA+CCR7+ 세포로부터 게이팅한 반면, 말단 이펙터 T 세포(Tte (CD45RA+CCR7-CD27-CD95+) 세포를 CD45RA+CCR7- 세포로부터 게이팅하였다.
[00511] 공동억제 및 공동자극 마커
[00512] 공동억제 및 공동자극 분자를 특성화하기 위해 사용된 게이팅 전략은 이중선 및 사세포 배제를 포함하였다. CD4+ 및 CD8+ 및 CoStAR+/- 세포의 게이팅을 수행하고, 집단을 CD137, PD-1, CTLA-4, LAG-3, TIM-3 및 SLAM 발현에 대해 추가로 분석하였다.
[00513] T 세포 하위타입
[00514] T 세포 하위타입을 특성화하기 위해 사용된 게이팅 전략은 이중선 및 사세포 배제 및 CD3+ 게이트를 포함하였다. 이러한 집단을 사용하여, TCRαβ, TCRγδ, 및 CD56의 발현을 평가하였다. 후속하여, CD3+CD4+ 세포를 TCRαβ 및 CD56의 발현에 대해 게이팅하고, CD25 및 CD127 발현에 대한 CD3+CD4+TCRαβ+ 집단의 추가 분석을 수행하였다. CD25+CD127-게이트를 사용하여 FOXP3+ 세포를 게이팅하여 Treg의 집단을 결정하였다. 따라서, Treg는 평가된 집단에 따라 CD3+TCRab+CD4+ CD25+CD127-FOXP3+ 및 CoStAR+/-로 정의된다.
[00515] 유사분열 자극 시 사이토카인 생산
[00516] 세포내 사이토카인 생산을 특성화하기 위해 사용된 게이팅 전략은 이중선 및 사세포 배제, CD3+, CD4+, 및 CD8+ 게이트를 포함하였다. 상이한 집단에 대한 CoStAR 발현 분석을 수행한 후 IL-22, IL-17A, TNFα, 및 IFNγ를 발현하는 세포의 빈도를 추가로 분석하였다.
[00517] 임상적 특성
[00518] 5명의 난소암 환자로부터의 TIL의 임상 특징은 표 16에 제시되어 있다. 환자는 모두 치료 경험이 없었고, 특정 조직학은 3개의 장액 낭선암종, 1개의 자궁내막양 및 1개의 투명 세포 선암종을 나타내었다. 샘플 중량은 0.55 내지 2.62 그램의 범위였으며, 평균 중량은 2.39 ± 1.31 그램이었다. 프로세싱 후, 샘플을 바이알 당 1 mL에서 6×106 내지 2.5×107개의 세포로 동결보존하였다. 1일에, 샘플을 해동하고, CD2+ TIL의 유세포분석을 사용하여 계수하였고, 여기서, 평균 백분율은 19.5±9.43이었다. 해동된 샘플에서 수확된 총 TIL은 4.4×105 내지 3.3×106개 세포의 범위였다.
[00519] TIL 생산 후, TIL 성장에 대한 항-FOLR1 CoStAR 변형의 임의의 효과를 평가하기 위해 비-Td 및 Td TIL의 세포 수를 비교하였다. 결과는 TIL의 세포 수에 유의한 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다(도 38). 형질도입된 CD3+, CD4+ 및 CD8+ 세포의 비율을 TIL 생산 후 평가하였다(도 39a 내지 도 39c). CD4 세포는 CD8 세포(32.7±20.6%)보다 더 높은 형질도입 백분율(50.8±15.2%)을 나타내었고, 이는 통계적으로 유의하였다(p=0.384). 또한, ddPCR을 사용하여 VCN을 평가하여 PCBP2 기준 유전자에 비해 CoStAR 이식 유전자를 검출하고, 세포 당 < 4 적분값(integration)을 측정하였다(도 39). 생성물에서 CD4 및 CD8 집단 조성의 비교는 대부분의 세포가 53.0 내지 58.7% 범위의 수준을 갖는 CD4+ 및 더 적은 수의 CD8+ 세포(30.8 내지 38.2%)임을 나타내었다. CD4+CD8+ 및 CD4-CD8- 세포는 또한 각각 3.47 내지 4.43% 및 3.19 내지 6.97% 범위의 낮은 수준으로 검출되었다. CD4/CD8 세포 조성과 관련하여 비-Td, 항-FOLR1 CoStAR-Td, 및 항-FOLR1 CoStAR+ Td TIL 사이에는 유의한 차이가 없었다(도 40).
[00520] TIL을 추가로 특성규명하여 항-FOLR1 CoStAR 변형이 TIL 기능에 영향을 미치는지 여부를 결정하였다. Tn, Tscm, Tcm, Tem 및 Tte의 조성을 비-Td, 항-FOLR1 CoStAR-Td 및 항-FOLR1 CoStAR+ Td TIL의 CD3+, CD4+ 및 CD8+ T 세포 구획으로부터 평가하였다(도 41a 내지 도 41c). 결과는 대부분의 TIL이 CD3+(63.2 내지 78.6%), CD4+(76.9 내지 88.8%) 및 CD8+(48.3 내지 66.9%) 집단에 걸쳐 Tem이었다는 것을 보여준다. Tcm 세포 빈도는 CD3+, CD4+ 및 CD8+ TIL에 대해 각각 6.28 내지 15.7%, 6.72 내지 17.5% 및 5.18 내지 11.7%였다. Tte 세포는 벌크 CD3+ TIL의 14.8 내지 15.9%를 구성하였다. 이들은 주로 CD4+ 하위집단에서 2.68 내지 3.79%의 빈도로 CD8+ 하위집단에서 22.1 내지 25.1%의 빈도이었다. CD3+, CD4+ 및 CD8+ TIL에 대해 각각 0.15 내지 1.38%, 0.05 내지 0.50% 및 0.53 내지 3.24%의 빈도로 Tscm 세포가 거의 검출되지 않았다. 가장 낮은 빈도의 기억 하위타입은 Tn 세포였고, 이들은 3개 집단 모두에 걸쳐 0.002 내지 0.019% 범위였다. Tn, Tem, Tcm 또는 Tte 빈도와 관련하여 비-Td, 항-FOLR1 CoStAR-Td 및 항-FOLR1 CoStAR+ Td TIL 사이에 유의한 차이는 없었다. 낮은 Tscm TIL에도 불구하고, 항-FOLR1- Td TIL과 비교하여 항-FOLR1+ Td TIL에서 CD3+(0.15±0.05% 대 1.38±0.69%) 및 CD4+(0.05±0.02% 대 0.51±0.27%) 집단에서 유의하게 더 낮은 Tscm TIL이 검출되었지만, 비-Td TIL과 비교하여서는 그러하지 않았다. 전반적으로, 데이터는 항-FOLR1 CoStAR 변형이 TIL의 분화 상태에 유의하게 영향을 미치지 않았음을 보여준다.
[00521] CD8+ 및 CD4+ TIL을 CD137, PD-1, CTLA-4, LAG-3, TIM-3 및 SLAM의 발현에 대해 평가하였다(도 42). CD4+ TIL에서, 모두 3개의 관심 집단에 대한 발현은 LAG-3, PD-1, SLAM, 및 TIM-3에 대해 각각 39.8 내지 47.7%, 61.0 내지 64.4%, 52.7 내지 57.6%, 및 65.6 내지 72.1%의 범위였다. CD8+ TIL에서, 발현은 LAG-3, PD-1, SLAM, 및 TIM-3에 대해 각각 86.7 내지 88.2%, 38.2 내지 46.5%, 61.5 내지 67.2%, 및 90.0 내지 94.3%의 범위였다. CTLA-4는 CD4+ 및 CD8+ 세포에 대해 각각 8.92 내지 15.2% 및 4.10 내지 7.29%의 범위였고, CD137은 2.80 내지 8.30% 및 7.70 내지 17.1%였다.
[00522] 3개의 TIL 집단, 즉, 비-Td, 항-FOLR1 CoStAR-Td 및 항-FOLR1 CoStAR+ Td TIL의 비교는 CD4+ TIL에서 공동억제 및 공동자극 마커 발현에 대한 항-FOLR1 CoStAR의 효과가 없음을 나타내었다. CD8+ TIL에서, CD137+(17.1±8.79% 대 7.70±3.92% 대 7.77±4.01%) 및 CTLA-4+(7.29±2.41% 대 4.66±1.51% 대 4.10±1.07%) 세포는 비-Td 및 항-FOLR1 CoStAR-Td TIL 둘 모두와 비교할 때 항-FOLR1+ Td에서 더 높은 빈도를 보였다. PD-1+ TIL 빈도는 항-FOLR1-Td TIL과 비교하여 단지 더 높았지만 비-Td TIL와 비교하여 그러하지 않았다(각각 46.5±21.1% 대 38.2±19.6% 대 40.6±26.8%). 전반적으로, CD8+ CD137+, CTLA4+, 및 PD-1+ TIL의 빈도의 약간이지만 유의한 증가를 제외하고는 공동억제 또는 공동자극 마커 발현에 대한 TIL의 CoStAR 변형 효과는 거의 관찰되지 않았다.
[00523] T 세포 하위세트 빈도를 TCRαβ 및 TCRγδ의 발현에 추가하여 Treg 검출을 위한 마커를 사용하여 TIL 샘플에서 평가하였다. 대부분의 CD3+ 세포는 TCRαβ(90.0 내지 93.5%)를 발현하였고, 상대적으로 적은 TCRγδ 세포(1.35 내지 3.08%)가 검출되었고(도 43a), 3개 집단 간에 차이는 관찰되지 않았다. CoStAR- 또는 CoStAR+ TIL에서 Treg(CD3+TCRαβ+CD4+CD25+CD127-FOXP3+)의 백분율은 매우 낮았다. 구체적으로, 검출 빈도는 비-Td, 항-FOLR1 CoStAR- 및 항-FOLR1 CoStAR+ Td TIL에 대해 각각 0.63±0.48%, 0.66±0.36% 및 0.93±0.63%였다(도 43b). 전반적으로, 비-Td, 항-FOLR1 CoStAR-Td 및 항-FOLR1 CoStAR+ Td TIL을 비교할 때 TCRαβ, TCRγδ, 및 Treg 빈도에 대한 항-FOLR1 CoStAR의 효과는 없었다.
[00524] TIL을 PMA/이오노마이신을 사용하여 유사분열 활성화시 사이토카인을 생산하는 세포의 능력을 평가하였다. 비-Td 및 Td TIL을 PMA/이오노마이신을 사용하여 4시간 동안 활성화시킨 다음, CD3+, CD4+, 및 CD8+ 세포로부터의 IFNγ, IL-22, IL-17A, 및 TNFα에 대해 염색하였다. 자극시, 높은 빈도의 TNFα(61.8 내지 73.6%) 및 IFNγ(32.5 내지 42.0%)를 발현하는 CD3+ TIL, 및 낮은 빈도의 IL-22(4.74 내지 8.07%) 및 IL-17A(5.74 내지 11.0%) 발현 세포가 검출되었다(도 44a). TNFα+ 세포의 빈도는 항-FOLR1 CoStAR-Td TIL과 비교하여 항-FOLR1 CoStAR+ Td에서 더 높았지만(73.6±14% 대 61.8±18.3%), 비-Td TIL은 그렇지 않았다(72.1±9.20%).
[00525] CD4+ TIL에서, 높은 빈도의 TNFα를 발현하는 세포(54.3 내지 67.2%), 및 낮은 빈도의 IFNγ(19.3 내지 26.2%), IL-22(7.63 내지 10.5%) 및 IL-17A(12.0 내지 20.2%) 발현 세포가 검출되었다(도 44b). TNFα+(67.2±15.5% 대 54.3±17.2%) 및 IL-17A+ 세포(20.2±11.3 대 12.0±7.06)의 빈도는 항-FOLR1 CoStAR-Td TIL에 비해 항-FOLR1 CoStAR+ Td에서 더 높았다. 항-FOLR1 CoStAR +/- Td TIL을 비-Td TIL과 비교할 때 TNFα 또는 IL-17A를 발현하는 CD4+의 빈도에서 유의한 차이는 관찰되지 않았다.
[00526] CD8+ TIL 집단에 대해 유사한 관찰이 이루어졌으며, 여기서, 높은 TNFα(62.7 내지 86.7%) 및 IFNγ(45.3 내지 63.0%), 및 더 낮은 IL-22(6.80 내지 17.0%) 및 IL-17A(6.93 내지 15.3%) 빈도의 양성 세포가 검출되었다(도 44c). 이 집단에서, TNFα(86.7±8.37% 대 62.7±18.2%), IL-17A(15.3 ±7.24% 대 6.93±2.77%), 및 IL-22(17.0±6.90% 대 6.80±2.48%)와 관련하여 항-FOLR1 CoStAR- TIL과 비교하여 항-FOLR1 CoStAR+ Td TLD에서 더 높은 빈도의 사이토카인 발현 세포가 확인되었다. 다시, 비-Td TILS와 비교하여 항-FOLR1 CoStAR+/- Td TIL 사이에 유의한 차이는 관찰되지 않았다.
[00527] IL-17A+ 항-FOLR1 CoStAR + Td TIL과 항-FOLR1 CoStAR-Td TIL 사이의 CD4+ 및 CD8+ 하위집단 둘 모두에서 관찰된 유의한 차이는 CD3+ 벌크 집단에서 통계적으로 유의하지 않았다(p=0.0527). 종합적으로, Td 세포의 항-FOLR1 CoStAR +/- 집단 사이에 IL-17A, IL-22, 및 TNFα 발현 세포의 비율로 CD3+, CD4+, 또는 CD8+ TIL 집단 내에서 일부 통계적으로 유의한 차이가 관찰되었다. 그러나, Td 집단(즉, 항-FOLR1 CostAR -/+ 분획)을 비-Td TIL과 비교할 때 IFNγ, IL-17A, IL-22, 및 TNFα 생산 세포의 빈도에서 유의한 차이는 관찰되지 않았다.
실시예 15
[00528] CoStAR 양성 TIL의 항종양 반응성
[00529] 완전 급속 확장 프로토콜(REP) 배지는 40 mL 인간 AB 혈청, 젠타마이신(10 ㎍/mL)/암포테리신(0.25 ㎍/mL) 및 반코마이신(50 ㎍/mL)이 보충된 460 mL GIBCO 맞춤형 P158718로 구성되었다. 완전 T 세포 배지(TCM)는 5 mL 페니실린-스트렙토마이신, 500 ㎕ 2-머캅토에탄올(50 mM), 및 50 mL 우태아 혈청(FBS)이 보충된 450 mL RPMI 1640 GlutaMAX™ 보충 HEPES 배지로 구성되었다.
[00530] 기능적 특성화를 위한 CoStAR 변형된 OC TIL의 제조
[00531] 5개의 OC 샘플로부터의 비-Td 및 Td TIL을 ITIL-306-NC-010에 기재된 바와 같이 생산하였고, 형질도입 백분율은 표 17에 제시되어 있다.
[00532] TIL을 REP 직후 또는 장기 동결보존(-150℃; 10% DMSO를 갖는 FBS로 구성된 동결보호제에 저장됨)으로부터 해동시 사용하였다. 난소암 TIL을 37℃ 수조를 사용하여 해동시키고, 10 mL의 완전 REP TCM을 갖는 50 mL 팔콘 튜브로 옮기고, 400 ×g에서 5분 동안 원심분리하고, 완전한 REP TCM에 재현탁시켰다. REP 후 및 해동 후 TIL 둘 모두를 DRAQ7 사세포 배제 및 CD2+ 계수 후 NovoCyte 3005 유세포분석기 시스템을 사용하여 계수하였고, 3000 IU/ml의 인터루킨 2(IL-2)가 보충된 완전 REP TCM에서 1×106개 세포/mL의 밀도로 T75 플라스크에 배치시켰다. 이후, 세포를 37℃로 설정된 5% CO2 인큐베이터에 2 내지 3일 동안 두었다. 검정 전에, TIL을 IL-2 없이 1×106개 세포/mL의 밀도로 완전 REP TCM에 재현탁시키고 밤새 37℃로 설정된 5% CO2 인큐베이터에 두었다.
자가 종양 분해에 의한 FOLR1 발현의 평가.
[00533] 모든 자가 종양 분해물을 37℃ 수조를 사용하여 장기 동결보존(-150℃; 10% DMSO를 갖는 FBS로 구성된 동결보호제에 저장)으로부터 해동시키고, 9 mL의 완전 TCM을 갖는 15 mL 팔콘 튜브로 옮겼다. 400 ×g에서 5분 동안 원심분리하고 5 mL의 완전 TCM에 재현탁시켰다. DRAQ7 사멸 세포 배제 후 NovoCyte 3005 유세포 분석기 시스템을 사용하여 각 샘플에서 생존 세포의 수를 결정하고, 세포를 완료된 TCM에 1×106개 세포/mL의 농도로 재현탁시켰다. 이후, 1×105개의 자가 종양 분해 세포를 유세포 분석 염색 프로토콜에 따라 분석하고 Novocyte 3005 유세포 분석 시스템을 사용하여 획득하였다.
[00534] FOLR1 발현의 정량화는 하기 게이팅 전략에 따라 수행되었다: 세포 게이트(정방향 산란-높이[FSC]-H 대 측면 산란-높이[SSC]-H), 이어서 이중선 배제 게이트(SSC-H 대 측면 산란-영역 [SSC-A]) 이어서 사멸 세포 배제 게이트(SSC-A 대 고정 가능한 생존성 염료 eFluor 450). 이어서, CD2-세포를 게이팅하여 FOLR1+ 세포의 빈도를 정량하였다(SSC-A 대 FOLR1-PE).
세포내 유세포 분석에 의해 평가된 사이토카인 생산
[00535] 사이토카인 생산 T 세포의 빈도를 측정하기 위해, 비-Td 및 항-FOLR1 CoStAR Td TIL을 1:1 이펙터 대 표적 비율(E:T, 1×105 TIL: 1×105 표적 세포)로 표적으로서 자가종양 분해물, K-562, 또는 OVCAR-3 유래된 조작된 세포주로 공동배양하였다. 공동배양을 1x 브레펠딘 A가 보충된 200 ㎕의 완전 TCM을 갖는 96웰 둥근 바닥 플레이트에서 발생하였고, 37℃로 설정된 5% CO2 인큐베이터에서 16시간 동안 인큐베이션하였다. 비-자극된 TIL 또는 표적 세포만을 음성 대조군으로 사용하고, 양성 대조군 TIL을 50 ng/mL 포르볼-미리스테이트-아세테이트(PMA) 및 1 ㎍/mL 이오노마이신으로 활성화시켰다. 모든 조건을 3회 수행하였다.
[00536] 사이토카인 생산의 측정을 CD3, CD4, CD8, CoStAR(항-이디오타입 19.1 일차 및 항-마우스 IgG1 이차 항체), 종양 괴사 인자 알파(TNFα), IL-2, 및 생존력 염색에 대한 항체를 갖는 패널을 사용하여 수행하였다. 16시간 인큐베이션 후, 500 ×g에서 4분 동안 원심분리에 의해 공동배양물을 수확하였다. 상청액을 버리고, 샘플을 유세포 분석에 의해 분석하였다. 간략하게, 세포를 100 ㎕의 고정 가능한 생존성 염료(PBS에 1:1000 희석)를 사용하여 표지하고, 실온에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 후속하여, 세포를 BD 염색 완충액을 사용하여 세척하고, 500 xg에서 4분 동안 원심분리하고, 세포 펠렛을 실온에서 10분 동안 FcR 차단 시약과 함께 100 ㎕의 BD 염색 완충액에 재현탁시켰다. 인큐베이션 단계 후, 세포를 BD 염색 완충제로 1회 세척하고, 실온에서 15분 동안 4% 파라포름알데하이드(PFA)를 사용하여 고정시켰다. BD perm/세척 완충액으로의 세척, 4℃에서 25분 동안 19.1 항-이디오타입을 사용한 염색 및 2회 이상의 BD perm/세척 완충액 세척이 뒤따랐다. 이후, 세포를 CD3, CD4, CD8, 항-마우스 IgG1, TNFα, 및 IL-2를 갖는 100 ㎕의 BD 염색 완충제에 재현탁시키고, 4℃에서 25분 동안 인큐베이션하였다. BD perm/세척 완충제를 사용한 2회 이상의 세척 단계 후, 세포 펠렛을 NovoCyte 3005 유세포 분석기 시스템에서의 획득을 위해 100 ㎕의 BD 염색 완충제에 재현탁시켰다.
[00537] CD4 및 CD8 하위집단에서 TNFα 및 IL-2 생산 세포 빈도의 정량화를 사멸 세포 배제를 포함하는 게이팅 전략에 따라 수행하였다. CD3+ 세포를 라이브 게이트로부터 게이팅하고(SSC-A 대 CD3-A), 이어서 CD4+ 및 CD8+ 세포를 CD3+ 게이트로부터 게이팅하였다(CD4-A 대 CD8-A). TNFα 및 IL-2 생산 세포를 비-Td TIL에 대한 CoStAR 음성(-) 하위세트, 및 Td TIL로부터의 CoStAR- 및 CoStAR 양성(+) 분획 둘 모두(항-FOLR1 CoStAR-Td TIL 및 항- FOLR1 CoStAR+ Td TIL)로부터 보고하였다.
MSD 면역검정에 의해 평가된 사이토카인 생산
[00538] 사이토카인 분비를 측정하기 위해, 비-Td 및 항-FOLR1 CoStAR Td TIL을 자가 종양 분해물과 1:1 비율(E:T, 1×105 TIL: 1×105 표적 세포)로, 및 K-562 또는 BA/F3 유래된 조작된 세포주와 8:1 비율(E:T, 1×105 TIL: 1.25×104 표적 세포)로 공동배양하였다. 공동배양을 200 ㎕ 완전 TCM에서 3회 수행하였다. MHC 차단이 수행된 실험에서, 자가 종양 분해물을 MHC 클래스 I(HLA-ABC; 40 ㎍/mL), MHC 클래스 II(HLA-DRDPDQ; 40 ㎍/mL), MHC 클래스 I + II(둘 모두 40 ㎍/mL), 또는 이소타입 대조군(마우스 IgG2a; 80 ㎍/mL)에 대한 항체와 함께 100 ㎕ 완전 TCM에서 45분 동안 사전-인큐베이션하였다(4℃). 인큐베이션 후, TIL을 적절한 웰에 첨가하였다. 모든 실험에 대해, 비-자극된 TIL 또는 표적 세포만을 음성 대조군으로 사용하고, 50 ng/mL 포르볼-미리스테이트-아세테이트(PMA) 및 1 ㎍/mL 이오노마이신으로 활성화된 TIL을 양성 대조군으로 사용하였다. 이후, 세포를 37℃로 설정된 5% CO2 인큐베이터에 24시간 동안 두었다.
[00539] 24시간 인큐베이션 후, 샘플을 400 ×g에서 5분 동안 원심분리하고, -80℃에서 저장하기 전에 상청액을 수확하였다. 해동시, 샘플을 Meso scale Discovery(MSD)로부터의 V-Plex Plus 전염증성 패널 1 키트로부터 완전 TCM 및 희석제 2로 적절히 희석하였다. 검정을 제조자의 지시에 따라 수행하였다.
유세포 분석에 의해 평가된 표적 세포 세포독성
[00540] TIL의 세포독성 활성을 측정하기 위해, 비-Td 및 항-FOLR1 CoStAR Td TIL을 BA/F3 유래된 조작된 세포주와 1:1 비율(E:T, 1×105 TIL: 1×105 표적 세포)로 공동배양하였다. 공동 배양을 200 ㎕ 완전 TCM을 갖는 96웰 둥근 바닥 플레이트에서 3회 수행하고, 37℃로 설정된 5% CO2 인큐베이터에서 20시간 동안 인큐베이션하였다. TIL 및 표적 세포를 음성 대조군으로서 단독으로 배양하였다.
[00541] 20시간 공동배양 후, 샘플을 400 ×g에서 5분 동안 원심분리하고, 상청액을 버리고, 샘플을 유세포 분석에 의해 분석하였다. 간략하게, 세포를 100 ㎕의 고정 가능한 생존성 염료(PBS에 1:1000 희석)를 사용하여 표지하고 실온에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 모든 세척을 BD 염색 완충제를 사용하여 수행하였다. 인큐베이션 후, 세포를 세척하고, 500 ×g에서 4분 동안 원심분리하고, 세포 펠렛을 실온에서 10분 동안 FcR 차단 시약을 갖는 100 ㎕의 BD 염색 완충액에 재현탁시켰다. 인큐베이션 단계 후, 세포를 CD2를 갖는 100 ㎕의 BD 염색 완충액에 재현탁시키고, 4℃에서 25분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 2회 세척하고, 세포 펠렛을 NovoCyte 3005 유세포 분석기 시스템에서의 획득을 위해 100 ㎕의 BD 염색 완충제에 재현탁시켰다.
[00542] 표적 세포 수를 이중선 및 사멸 세포 배제 후 유세포 분석에 의해 열거하였다. CD2-세포를 라이브 게이트로부터 게이팅하고(SSC-A 대 CD2-A), NovoCyte 3005 유세포 분석기 시스템의 절대 계수 함수에 의해 정량화하였다.
[00543] xCELLigence에 의해 평가된 표적 세포 세포독성
[00544] xCELLigence에 의한 표적 세포 세포독성의 평가를 제조사의 지침에 따라 수행하였다. 간략하게, E-플레이트를 웰 당 50 ㎕ TCM을 첨가하여 평형화시키고, 실온에서 30분 동안 인큐베이션하고, RTCA 분석기(37℃, 5% CO2)에서 배경 전기 임피던스를 획득하였다. 이어서, 50 ㎕ TCM에서 3×104개의 OVCAR-3 유래된 조작된 세포주를 각 E-플레이트의 웰 당 첨가하고 실온에서 30분 동안 인큐베이션하기 전에 세포 성장을 RTCA 분석기(37 oC, 5% CO2)에서 전기 임피던스에 의해 평가하였다. 세포 지수를 검정 기간 동안 15분마다 측정하였다. 컨플루언시(24 내지 31시간 사이)에 도달하면, 100 ㎕ TCM에서 6×103 또는 1×103 비-Td 또는 Td TIL을 OVCAR-3 유래된 조작된 세포주에 첨가하였다(각각 1:5 및 1:30의 E:T 비). 이들을 RTCA 분석기(37℃, 5% CO2)에서 169시간의 추가 세포 지수 판독 전에 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 대조군 조건은 표적 세포주 단독, OC TIL 로딩 시점에 첨가된 0.5% Triton X-100을 갖는 표적 세포주(완전 용해 대조군), 및 TIL 단독을 함유하는 웰을 포함하였다. 표준화된 세포 지수(NCI)를 RTCA 소프트웨어 pro를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 결정하였다. OVCAR-3 유래된 조작된 세포주와 OC TIL 공동배양의 169시간 기간 동안 RTCA 소프트웨어 프로로부터 추출된 NCI 곡선하 면적은 정량적 판독값으로 보고된다. RTCA SP 및 DP 둘 모두를 사용하였다. 9831 및 9260 종양 분해물로부터의 비-Td 및 Td TIL의 1:30 비율의 경우, 공동배양을 이중으로 수행하였다.
분석
[00545] 동결보존된 종양 샘플로부터 TIL의 생산 및 특성규명 후, 보유된 입력 종양 소화 샘플을 해동하고 FOLR1; 항-FOLR1 CoStAR의 리간드의 발현에 대해 평가하였다. FOLR1은 5.44-22.1% 범위의 FOLR1 양성 세포의 비율로 5개 종양 모두에서 CD2-세포의 표면에서 검출될 수 있었다(도 45).
[00546] 자가 종양을 인식하고, 이에 반응하는 T 세포의 빈도를 평가하기 위해 세포내 유세포분석을 사용하였다. PMA/I 자극을 IL-2 및 TNFα를 용이하게 생산할 수 있는 TIL의 빈도에 대한 양성 대조군으로 사용하였다. 브레펠딘 A와 함께 밤새(16시간) 배양된 종양 분해물에서 IL-2+ 또는 TNFα+ TIL이 검출되지 않았다. 대조적으로, IL-2+ 및 TNFα+ TIL은 자가 종양 분해와 확장된 TIL의 16-시간 공동배양시 검출되었다(도 46). CD4+ 항-FOLR1 CoStAR+ Td TIL은 현저한 6.56배 증가(12.0±12.9% 대 1.83±0.55%)로 비-Td TIL과 비교하여 유의하게 더 높은 빈도의 IL-2 생산 세포를 특징으로 하였다(도 46a). 유의하지는 않지만, CD4+ 항-FOLR1 CoStAR+ Td TIL은 또한 항-FOLR1 CoStAR-Td TIL에 비해 IL-2 생산 세포 빈도에서 3.33배 증가를 가졌다(12.0±12.9% 대 3.61±3.10%). 항-FOLR1 CoStAR-Td TIL(2.58 ±1.60%)에 비해 단독으로 배양될 때 TNFα를 생산하는 항-FOLR1 CoStAR+ CD4 T 세포의 수(6.96 ±3.56%)의 약간이지만 유의한 증가(비-Td TIL은 아님)(3.31±3.62%)가 또한 검출되었다(도 46c). 자가 소화와 공동배양시, TNFα+ 세포는 항-FOLR1 CoStAR+ Td TIL 집단에서 빈도가 증가하는 것으로 보였지만, 항-FOLR1 CoStAR-Td 및 비-Td TIL과 비교하여 통계적으로 유의한 차이는 관찰되지 않았다(32.3% 대 17.8% 대 11.6%).
[00547] 자가 분해와 함께 공동배양시 CD8+ 집단에 대해 유사한 관찰이 이루어졌다(도 46). 항-FOLR1 CoStAR-Td TIL(1.42±1.00%; 2.9배 증가)에 비해 항-FOLR1 CoStAR+ Td TIL(4.13±2.26%)에 의해 유의하게 더 높은 빈도의 CD8+ IL-2+ 세포가 검출되었지만, 비-Td TIL(1.11±0.55%; 4.13배 증가, p=0.1097)(도 46b)은 그러하지 않았다. CD8+ TNFα 생산 세포 빈도는 항-FOLR1 CoStAR-Td 및 비-Td TIL에 비해 항-FOLR1 CoStAR+ Td TIL에서 증가했지만, 이러한 차이는 통계적 유의성에 도달하지 않았다(22.6% 대 12.5% 대 10.5%)(도 46d).
[00548] 전반적으로, CoStAR 변형은 자가 분해물로 자극시 IL-2를 생산하는 CD4+ 및 CD8+ 세포의 빈도를 유의하게 증가시켰다. 동일한 설정에서, 비록 통계적 유의성에 도달하지는 않았지만, TNFα+를 생산하는 CD4+ 및 CD8+ 세포 빈도는 유사하게 경향이 있다.
[00549] 자가 소화와 TIL 공동배양시 방출된 사이토카인의 양을 평가하기 위해 MSD 면역검정을 수행하였다(도 47). PMA/I 자극을 사이토카인 생산에 대한 양성 대조군으로 사용하였고, 이는 CoStAR 변형된 TIL과 비-Td TIL 사이에서 유사하였다. TIL의 CoStAR 변형은 비-Td TIL과 비교하여 자가 종양에 반응하여 IL-2, TNFα, IL-13 및 IFNγ 분비의 통계적으로 유의한 증가를 야기하였다(도 47a 내지 47d). 단독으로 배양될 때 Td 대 비-Td TIL로부터의 증가된 배경 사이토카인 수준의 경향(도 47a 내지 47d)는 관찰되었고 IL-2에 대해서만 유의하였다(70.6 pg/mL 대 31.8 pg/mL)(도 47a). 자가 분해와 공동배양시, IL-2 분비가 비-Td TIL에 비해 Td TIL에서 유의하게 더 높았지만(74.1 pg/mL 대 32.1 pg/mL), 이는 단독으로 배양된 TIL의 배경 수준과 다르지 않았다. Td TIL은 8287 pg/mL 대 1970 pg/mL의 생산 수준으로 비-Td TIL과 비교하여 자가 소화에 반응하여 더 높은 수준의 IFNγ를 분비하였다(도 11d). 유사하게, Td TIL이 상대적인 자가 분해물과 공동배양될 때 비-Td TIL에 비해 더 높은 수준의 TNFα(55.0 pg/mL 대 18.2 pg/mL, 도 47b) 및 IL-13(152 pg/mL 대 48.4 pg/mL, 도 47c)이 검출되었다. 이들은 각각 CoStAR 변형된 Td TIL에 의한 TNFα, IFNγ 및 IL-13 생산의 3배, 4.2배 및 3.1배 증가를 나타낸다.
[00550] 자가 종양과의 공동배양시 CoStAR 변형된 TIL에 의해 방출된 IFNγ와 FOLR1을 발현하는 종양 분해물의 비율 사이에 통계적으로 유의한 양의 상관관계(r2 = 0.9191)가 관찰되었다(도 47e). 이러한 상관관계는 비-Td TIL에 대해 관찰되지 않았으며, 이는 CoStAR-FOLR1 상호작용이 TIL 향상에 핵심임을 확인시켜준다. 또한, CoStAR 변형된 TIL IFNγ 방출은 5.44%만큼 낮은 FOLR1 양성 세포의 빈도를 보유하는 난소 종양에 대해서도 향상된다(도 11e).
[00551] MHC 차단 항체는 TCR이 이들의 표적에 관여하고 TCR 신호전달을 매개하는 것을 방지한다. CoStAR 변형된 TIL의 MHC-제한된 항원 인식을 평가하기 위해, 비-Td 및 Td TIL을 MHC 차단 또는 관련 없는 이소형 대조군 항체의 존재 하에 자가 종양 분해와 함께 공동배양하고, TIL 항-종양 활성을 IFNγ 방출에 의해 측정하였다(도 48). CoStAR 변형이 자가 종양에 대한 반응으로 사이토카인 생산을 향상시킴에 따라(도 47), 차단제 없이 자가 분해와 공동배양된 TIL에 대한 감소 백분율을 평가하였다. 사이토카인 방출의 백분율은 평가된 임의의 조건에서 비-Td 및 Td TIL 사이에 유의하게 다르지 않았다. MHCI, MHCII, 및 MHCI와 MHCII 둘 모두를 조합하여 차단하는 항체는 항체가 존재하지 않는 자가 분해를 갖는 TIL 공동배양에 비해 비-Td(각각 32.7%, 43.1%, 및 43.1%) 및 Td TIL(각각 35.0%, 27.0%, 및 27.3%)의 IFNγ 방출을 유의하게 감소시켰다. 또한, 차단 시약에 의한 사이토카인 방출의 억제는 임의의 차단 조건과 TIL 단독 사이에 유의하게 다르지 않은 감소를 초래하였다. 이소형 대조군 항체는 항체가 존재하지 않는 자가 분해를 갖는 TIL 공동배양에 비해 Td(79.1%) 또는 비-Td TIL(92.7%)로부터의 IFNγ 방출에 거의 영향을 미치지 않았다. MHC 차단 항체에 의한 TIL로부터의 IFNγ 방출의 감소는 이소형 대조군과 비교하여 통계적으로 유의하였고, 억제 수준은 MHC-제한된 항원 인식에 대한 동등한 의존성을 나타내는 Td 및 비-Td TIL 사이에 통계적으로 유의하게 다르지 않았다.
[00552] 강력한 TIL 이펙터 기능의 평가 및 이러한 기능을 향상시키는 CoStAR의 완전한 잠재력은 다양한 조작된 세포주를 사용하여 입증되었다. K-562 및 BA/F3 세포주를 표면 결합된 OKT3(CD3 매개 신호 1을 유도하기 위해) 또는 FOLR1(CoStAR 매개 신호 2) 또는 OKT3 및 FOLR1 둘 모두(신호 1 및 2에 대해)를 발현하도록 조작하였다. 또한, FOLR1(63.68% FOLR1+)을 내인성으로 발현하는 난소 암종 세포주 OVCAR-3을 표면 결합된 OKT3을 발현하도록 조작하였다. 이들 세포주를 사용하여, 비-Td 및 Td TIL을 공동배양하여 각각 세포내 유세포 분석 및 MSD 면역검정에 의해 사이토카인 생산 및 분비를 평가함으로써 CoStAR-매개 이펙터 기능의 영향을 평가하였다.
[00553] 조작된 K-562 및 OVCAR-3 세포주와 16-시간 공동배양 후 사이토카인 생산 세포를 계수하기 위해 세포내 유세포 분석을 사용하였다(도 49). K-562 및 K-562-FOLR1에 반응하여 IL-2 생산 세포 빈도는 모든 관심 집단에 걸쳐 CD4+(1.47-4.17%) 및 CD8+(0.23-3.73%) 세포에 대해 최소였다(도 49a). K-562-OKT3과의 배양은 CD4+ 및 CD8+ 세포 집단에 대해 각각 23.0-34.0% 및 20.0-39.7%의 IL-2+ 세포 빈도를 초래하였다. 항-FOLR1 CoStAR-Td TIL보다(그러나 비-Td TIL은 아님(각각 39.7±21.7% 대 20.0±15.1% 대 24.8±13.4%)) 높은 CD8+ 항-FOLR1 CoStAR+ Td TIL을 제외하고, 대조군 세포주와 공동배양시 비-Td 및 항-FOLR1 CoStAR+/- 집단 사이에서 IL-2 생산 세포 빈도에서 통계적으로 유의한 차이는 관찰되지 않았다. K-562-OKT3-FOLR1 세포주와의 공동배양은 항-FOLR1 CoStAR+ Td 및 비-Td TIL, 각각(각각 54.9±20.5% 대 29.9±19.4% 대 23.1±13.4%)에 비해 1.84배 및 2.38배의 현저한 증가로 항-FOLR1 CoStAR+ Td TIL을 생산하는 CD4+ IL-2의 유의하게 더 높은 빈도를 초래하였다. 항-FOLR1 CoStAR-Td 및 비-Td TIL에 비해 항-FOLR1 CoStAR+ Td TIL이 각각 2.53배 및 2.29배 증가하여 CD8+ IL-2+ 세포 빈도에 대해 동일한 관찰이 사실이었다(53.0±23.9 대 각각 21.0±15.5% 대 23.2±12.2%).
[00554] 단독으로 배양되거나 OVCAR-3과 공동배양된 TIL은 CD4+(0.78 내지 1.38%) 및 CD8+(0.22 내지 0.80%) 집단 둘 모두에 대해 IL-2 생산 세포의 최소 빈도를 특징으로 하였다(도 49a). OVCAR-3-OKT3 세포주에 의해 제공되는 두 신호 모두로 자극시, IL-2 생산 세포의 빈도의 유의한 증가가 항-FOLR1 CoStAR+ Td TIL에 의해 관찰되었다(39.1±14.5%). 항-FOLR1 CoStAR-Td TIL(22.4±14.0%) 및 비-Td TIL(15.9±9.47%)과 비교하여 각각 1.74배 및 2.46배 증가하였다. 유사하게, CD8+ 집단에서, 항-FOLR1 CoStAR+ Td TIL(34.1±13.2%)은 항-FOLR1 CoStAR-Td TIL(12.9±10.2%)과 비교하여 IL-2 생산 세포 빈도에서 2.65배 및 2.36배 증가를 나타내었다. 및 비-Td TIL(14.5±9.58%)을 각각 나타낸다.
[00555] CD4+ TNFα 양성 세포 빈도는 항-FOLR1 CoStAR-Td TIL(75.9±8.35% 대 66.2±5.04%)과 비교하여 K-562-OKT3와, 및 비-Td TIL과 비교하여 K-562-FOLR1(12.6±7.08% 대 0.73±0.34%)과 함께 공동배양된 항-FOLR1 CoStAR+ Td TIL에서 유의하게 더 높았다(도 49b). CD8+ TNFα 양성 세포 집단에 대해 동일한 조건에서 유의성이 관찰되지 않았다. 둘 모두의 신호를 발현하는 K-562-OKT3-FOLR1로의 자극은 1.31배 증가의 항-FOLR1 CoStAR-Td 및 1.39배 증가의 비-Td TIL 둘 모두에 비해 더 높은 빈도의 TNFα 생산 CD4+ 세포를 초래하였다(89.3±6.15% 대 68.1±4.99% 대 64.2±14.0%). CD8+ 집단에서 동일한 경향이 관찰되었지만, 항-FOLR1 CoStAR+ Td TIL을 항-FOLR1 CoStAR-Td TIL과 비교할 때(1.25배 증가) 통계적 유의성에 도달하였지만, 비-Td TIL(1.14배 증가)은 그러하지 않았다.(각각 90.2±5.35 대 72.2±9.92% 대 79.3±6.30%).
[00556] TIL이 단독으로 배양된 조건에서, CD4+(5.81±3.38% 대 1.85±1.42%) 및 CD8+(4.85±2.46% 대 1.53±0.76%) 세포 집단에서 항-FOLR1 CoStAR-Td TIL과 비교하여 항-FOLR1 CoStAR+ Td TIL 간에 TNFα 백분율의 작지만 유의한 차이가 관찰되었다(도 49b). 어느 한 집단에서 비-Td TIL과 비교하여 유의한 차이는 없었다. 신호 2를 발현하는 OVCAR-3의 존재 하에, 항-FOLR1 CoStAR+ Td TIL에서 항-FOLR1 CoStAR-Td 및 비-Td TIL 둘 모두에 비해 약간 그러나 유의하게 더 높은 CD4+ TNFα+ 세포 빈도가 검출되었다(8.29±4.34 % 대 1.00±0.78% 대 0.40±0.23%). 반대로, CD8+ 세포에서는 이들 집단 사이에 차이가 관찰되지 않았다. 중요하게는, 유의하게 더 높은 빈도의 CD4+ TNFα 생산 세포가 항-FOLR1 CoStAR+ Td TIL에서 OVCAR-3-OKT3 세포주와 TIL의 공동배양시 검출되었고(83.5±6.99%) 항-FOLR1 CoStAR+ Td TIL(67.4±5.35%) 및 비-Td TIL(60.9±10.9%)을 각각 나타내었다. CD8+ 세포 집단에서 유사한 빈도가 검출되었으며, 항-FOLR1 CoStAR+ Td와 항-FOLR1 CoStAR-Td TIL 사이에서 1.31배 증가(88.5±3.72% 대 67.8±10.3%) 및 항- FOLR1 CoStAR+ Td와 비-Td TIL 사이에서 1.21배 증가(88.5±3.72% 대 73.2±4.57%)하였다.
[00557] 종합적으로, 이러한 결과는 둘 모두의 신호를 발현하는 조작된 세포주와 공동배양할 때 CoStAR- 분획 및 비-Td TIL과 비교하여 변형된 TIL의 CoStAR+ 분획에서 IL-2+ 및 TNFα+ 세포의 빈도의 유의한 증가를 입증한다. 최소이지만, 더 높은 빈도의 TNFα+ 세포 집단의 일부 배경이 CD4+ 및 CD8+ 세포 둘 모두에서 관찰되었다. 유사하게, CoStAR 효과의 일부 향상은 K-562-OKT3 세포주와 공동배양물에서 CD8+ IL-2+ 및 CD4+ TNFα+ 세포의 더 높은 빈도에 의해 관찰되었으며, 이는 K-562에서 낮은 수준의 FOLR1 발현에 의해 잠재적으로 설명될 수 있다.
[00558] 유동 세포계수법에 의해 활성화된 T 세포의 빈도를 평가하는 것 외에, MSD 면역검정을 사용하여 K-562 및 BA/F3 조작된 세포주와의 공동배양시 분비된 사이토카인의 수준을 평가하였다(표 18).사이토카인 분비는 야생형 세포주 또는 신호 2를 단독으로 발현하도록 조작된 세포주와의 공동배양에서 최소였다(도 50). K-562-OKT3-FOLR1 세포주에 의해 자극된 IL-2 방출은 비-Td TIL(521.5 pg/mL)과 비교하여 Td TIL(2682 pg/mL)에서 더 높았으며, 이는 5.14배 증가를 입증한다(도 50a). 유사하게, BA/F3-OKT3-FOLR1과 공동배양된 TIL에서, IL-2 분비는 비-Td TIL과 비교하여 Td TIL에서 9.31배 더 높았다(도 50a). K-562-OKT3-FOLR1(2337 pg/ml 대 1211 pg/mL, 1.93배 증가) 및 BA/F3-OKT3-FOLR1(900.3 pg/mL 대 278.0 pg/mL, 3.24배 증가)과 공동배양될 때 비-Td TIL과 비교하여 Td TIL에서 유의하게 더 높은 TNFα 생산이 또한 검출되었다.
[00559] IL-13 IFNγ 생산은 또한 둘 모두의 신호를 발현하는 세포주로의 자극시 유의하게 더 높았다(도 50c 및 50d). 보다 구체적으로, K-562-OKT3-FORL1에 의한 자극에 반응하여, Td TIL은 OKT3-FORL1 Td TIL에 의해 비-Td TIL(587.0 pg/mL)과 비교하여 높은 수준의 IL-13(1590 pg/mL)을 분비하였다. 유사하게, 2.26배 더 많은 양의 IFNγ가 OKT3-FORL1 Td TIL(194559 pg/mL) 대 비-Td TIL(86183 pg/mL)에서 관찰되었다. 유사하게, IL-13 및 IFNγ 농도는 4.35-(983.9 pg/mL 대 226.1 pg/mL) 및 5.13-배수(65594 pg/mL 대 12786 pg/mL) 더 큰 사이토카인 분비와 동일한 조건에서 비-Td TIL에 비해 BA/F3-OKT3-FOLR1과 공동배양된 Td TIL에서 유의하게 상승하였다(도 50c 및 50d). 흥미롭게도, 유의하게 더 높은 IFNγ 분비는 K-562-OKT3과의 공동배양에서 비-Td TIL과 비교하여 Td TIL에 의해 관찰되었으며(1.33배 증가, 98804 pg/mL 대 74917 pg/mL), 이는 K-562 세포에서의 FOLR1 발현의 낮은 수준에 기인할 수 있다.
[00560] TIL의 세포독성 용량에 대한 CoStAR 변형의 영향을 결정하기 위해, 유세포 분석-기반 및 xCELLigence-기반 사멸 검정을 각각 BA/F3 및 OVCAR-3 조작된 세포주에 대해 수행하였다(도 51). 유세포 분석에 의해 평가된 공동배양에서, OKT3은 비-Td 및 Td TIL이 OKT3 또는 OKT3 및 FOLF1 둘 모두를 발현하는 BA/F3 세포를 특이적으로 사멸시켰기 때문에 세포독성을 유도하기에 충분하였다(도 51a). 중요하게는, 사멸을 유도하기 위한 신호 1의 요건을 입증하는 BA/F3 또는 BA/F3-FOLR1에 대해 세포독성이 관찰되지 않았다. RTCA 검정을 사용하여 표적 세포주로서 OVCAR-3 세포를 갖는 공동배양에 대해 유사한 관찰이 사실이었다(도 51b). 둘 모두의 신호를 발현하는 OVCAR-3 OKT3과의 공동배양에서, 시험된 임의의 E:T 비에서 비-Td와 Td-TIL 사이의 AUC(NCI × 시간)에는 유의한 차이가 없었다. OVCAR-3 세포 단독은 초기 시점에 제거되지 않았지만, 나중 시점에 E:T 1:5 비로 비-Td 또는 Td TIL의 첨가 후 5명의 공여자 중 4명에서 OVCAR-3 세포의 NCI의 약간의 감소가 발생하였다.
[00561] 종합적으로, 이러한 데이터는 CoStAR 표적만을 발현하는 표적 세포에 대해 TIL을 갖는 CoStAR에 의해 매개되는 세포독성의 부족을 입증한다. TCR의 참여는 모든 검정에서 비-Td 및 Td TIL 둘 모두에서 세포독성을 매개하는데 충분하였고, OKT3과 같은 강력한 신호 1의 존재 하에 세포독성에 대한 CoStAR의 영향을 나타내지 않았다.
실시예 16
[00562] CD40 신호전달 모티프 돌연변이체 작제물 CTP198, CTP197, CTP196, CTP199, 및 CTP195를 설계하고, 분류를 위한 CD34 마커 유전자를 함유하는 CD40 야생형 신호전달 모티프에 개별적으로 혼입시켰다(도 61). 이어서, 이러한 작제물을 시험관내에서 발현시키고, 야생형 CD40과 비교하여 전사 변화에 대해 스크리닝하였다(데이터는 제시되지 않음). 이로부터, (1) CTP197의 CD40 내의 혼입은 세포 확장의 일부 감소 및 IL-2 분비의 감소를 초래하고, (2) CTP196의 CD40 내의 혼입은 세포 확장의 큰 정도의 감소및 IL-2 분비의 큰 감소를 초래하고, 및 (3) CD40으로의 CTP195의 혼입은 세포 확장의 일부 감소를 초래했지만, IL-2 분비의 감소는 없었다는 것이 입증되었다. 이러한 관찰로부터, 본 발명자들은 CoStAR TRAF2/3 도메인을 변경하는 것이 사이토카인 생산 및 세포 증식에 유해한 영향을 미친다는 결론을 내렸다. 이는 TRAF2/3 도메인이 잠재적으로 대부분의 CoStAR 매개된 활성을 제공한다는 것을 의미한다.
[00563] TRAF 도메인 및 CoStAR 신호전달에 대한 이들의 영향은 TRAF 결합을 억제하거나, TRAF의 발현을 억제하거나, TRAF 결합 모티프를 조절하거나, TRAF 도메인을 교환하기 위한 일련의 돌연변이에 의해 모니터링될 수 있다.
실시예 17
[00564] 표 2, 4, 및 5의 것들과 같은 CD40 TRAF 서열 변이체의 돌연변이 분석을 수행하여 신호전달 모티프의 기능을 추가로 확립하였다. 이 분석은 CD40의 TRAF2, 2/3 및/또는 6 신호전달 모티프를 변형시키는 것이 증식 및 사이토카인 방출을 개선하는지 평가하기 위해 수행되었다.
[00565] CD40의 TRAF 도메인은 표 17 및 도 67에 제시된 바와 같이 작제물에서 스왑되었다. 생성된 총 12개의 돌연변이체 CD40 작제물뿐만 아니라 하나의 야생형 CD40 작제물, 및 CD40이 없는 CoStAR의 하나의 "모의" 작제물이 존재하였다.
[00566] 각 작제물을 3명의 공여자 중 한 명으로부터 STEM 세포(#Cat 70024)로부터 수득된 일차 인간 범 T 세포에 형질도입하였다. 이어서, 각각의 작제물을 발현하는 TRAF 변이체 T 세포의 증식을 8:1의 이펙터 대 표적 비율로 Ba/f3.luc.puro.FOLR1.OKT3과의 공동-배양에서 평가하였다. 증식 실험 파이프라인을 도 62a 및 62b에 도시된 바와 같이 수행하였다. 이러한 실험을 96 웰 플레이트에서 수행하였고, 여기서, 세포는 200 유닛/mL IL-2의 존재 또는 부재 하에 처리되어 다이나비드를 활성화시켰다. TRAF 변이체 CoStAR T 세포의 제조를 위해, 2일 후에 세포를 형질도입하고, 5일에 다이나비드를 제거한 다음, 6일에 CoStAR의 발현을 검출하기 위해 유세포 분석을 사용하였다(도 62a). 9 내지 23일 후, 14일의 REP가 뒤따랐다.
[00567] TRAF 변이체 증식 실험을 위해, 세포에 3일 동안 200 유닛/mL IL-2를 제공한 후, 1일의 IL-2 기아를 제공하였다. 4일에, 유세포 분석을 다시 사용하여 CoStAR의 발현을 검출하였다. 세포를 5일에 8:1의 이펙터 대 표적 비율로 Ba/f3.luc.puro.FOLR1.OKT3과 공동-배양하였다. 12, 19, 및 26일에, 증식을 평가하였다(도면에서 "7, 14, 및 21일"로서). 또한, 사이토카인 MSD 분석을 위해 배지를 교환할 때 상청액을 수집하고, 사이토카인 MSD 분석을 위해 단기 24 공동-배양 실험을 설정하였다.
[00568] IL-2 처리의 유무에 따른 3명의 공여자(HD 702C, HD 1004, 및 HD 2000)로부터의 T 세포에 걸친 총 세포 수의 변화 및 수의 배수-변화는 도 63a 내지 도 66c에 도시된 바와 같다.
[00569] CTP411 및 CTP413(TRAF6 변이체)은 공동-배양 21일까지 CD28-CD40 CoSTAR(CTP205) 및 CD28 CoStAR(CTP343)과 비교하여 HD 공여자 702C에 대해 IL-2의 존재 및 부재 하에 증가된 증식을 가졌다. CTP410(TRAF2 변이체)은 21일까지 CD28-CD40 CoSTAR(CTP205)와 비교하여 단지 IL-2의 존재 하에서 증식이 개선되었다. CTP408(TRAF2/3 변이체), CTP409 & CTP410(TRAF2 변이체), CTP411, CTP412(TRAF6 변이체) 및 CTP421은 IL-로 처리될 때 CD28-CD40 CoSTAR(CTP205) 및 CD28 CoStAR(CTP343)과 비교하여 증가된 증식을 가졌다. 7일까지. CD28-CD40 CoStAR(CTP205)은 IL-2가 없는 공여자 HD 1004에 대해 가장 높은 증식 속도를 가졌다. CD28-CD40 CoStAR(CTP205)은 IL-2를 갖는 공여자 HD 2000에 대해 가장 높은 증식 속도를 가졌다. CTP411(TRAF6 변이체)은 CD28-CD40 CoSTAR(CTP205) 및 CD28 CoStAR(CTP343)과 비교하여 IL-2가 없는 공여자 HD 2000에 대해 가장 높은 증식률을 가졌다.
실시예 18 - CoStAR을 발현하는 T-세포의 생산
[00570] MOV19 CoStAR은 항-폴레이트 수용체 항체 MOV19의 가변 중쇄(VH) 및 가변 경쇄(VL)를 함유한다(Figini et al. 1998 및 CAA68252.1 및 CAA68253.1). 중쇄 및 경쇄를 VH-VL의 배향으로 S(G4S)x3 세린-글리신 링커 영역을 인코딩하는 인간 뉴클레오티드 서열에 최적화된 코돈과 연결하였고, OSM 신호 펩티드에 대한 인간 서열에 최적화된 코돈을 추가하였다. VL 영역 다음에 AAA(GSG)x2 모티프를 인코딩하는 인간 서열에 최적화된 코돈을 포함하였다. 신호전달 도메인은 CD40(NP_001241.1: 잔기 216 내지 277)에 직접 융합된 CD28(NP_006130.1: 잔기 21 내지 220)에 대해 인간 서열에 최적화된 코돈의 융합으로 구성된다. 작제물을 GenScript에 의해 유전자 합성하고 pSF.Lenti(Oxford Genetics)에 클로닝하였다.
[00571] 50 mM CaCl2를 함유하는 무혈청 RPMI에서 10 ㎍의 각 패키징 플라스미드, + 10 ㎍의 이식 유전자를 함유한 pSF.Lenti 렌티바이러스 플라스미드를 함께 혼합함으로써 3-플라스미드 패키징 시스템을 사용하여 렌티바이러스 생산을 수행하였다. 혼합물을 75 ㎠ 플라스크에서 293T 세포의 50% 컨플루언트 단층에 적가하였다. 바이러스 상청액을 형질감염 후 48 및 72h에 수집하고, 풀링하고, 제조사의 지침에 따라 LentiPac 렌티바이러스 상청액 농축(GeneCopoeia, Rockville, Maryland, USA) 용액을 사용하여 농축하였다. 렌티바이러스 상청액을 Jurkat T 세포에서 적정한 다음, 4 ㎍/ml 폴리브렌(Sigma-Aldrich)의 존재 하에 MOI = 5로 일차 인간 T 세포를 직접 감염시키는 데 사용하였다. 인간 말초 혈액 팬 T-세포(StemCell Technologies)를 렌티바이러스 상청액을 첨가하기 전에 제조업체의 지침에 따라 Dynabeads™ 인간 T-활성제 비드(Invitrogen)로 24시간 동안 활성화시켰다.
[00572] 세포 형질도입을 FRα.hFc 단백질(Acro Biosystems) 및 항-IgG-PE 이차(Sigma-Aldrich)를 사용하여 감염 4일 후에 평가되었다. 이어서, 30 ng/mL OKT3 및 200 IU/mL IL-2를 첨가하여 RPMI + 10% FCS에서 1:200 비율의 x10 공여자 미스매칭된 조사된 PBMC 피더를 사용하여 세포를 추가로 확장시켰다. 14일 후, 세포를 검정을 위한 준비로 동결보존하였다. 해동 후, 세포를 3일 동안 휴지시킨 다음, 검정 설정 전에 Il-2의 부재 하에 24 내지 48시간 동안 굶겼다. 세포를 또한 검정 설정 24시간 전에 CoStAR 발현에 대해 염색하였다.
[00573] CoStAR 양성 또는 음성 세포를 막 고정된 OKT3 단쇄 항체 단편을 발현하는 Ba/F3 세포와 혼합함으로써 기능 검정을 수행하였다. 증식 검정을 위해, 0일에 외인성 IL-2(200 IU/mL)의 존재 및 부재 하에 5 × 104개의 T 세포를 6,250개의 표적 세포(E:T 8:1)와 혼합하고 7일 후에 T 세포 수를 계수하였다. 추가의 Ba/F3 표적 세포를 7일에 8:1로 첨가하였고, 21일까지 다중 라운드의 자극을 수행하였다. 사이토카인 분비에 대한 공동배양 검정을 5 × 104개의 T 세포 및 표적(E:T = 1:1)으로 설정하고 20시간 후에 상청액을 수집하였다. 사이토카인 분비(TNFα, IL-2 및 IFNγ)를 제조사의 지침에 따라 MSD 다중화 사이토카인 분석(Mesoscale Discovery)을 사용하여 분석하였다.
[00574] 3명의 공여자로부터의 일차 인간 T 세포를 MOV19.CD28.CD40 CoStAR 또는 이의 변이체로 조작하였다. 이러한 변이체는 CD40 TRAF2, TRAF2/3 또는 TRAF6 도메인이 표 17에 개략된 작제물을 사용하여 인간 단백질을 함유하는 다른 TRAF 도메인으로부터의 TRAF 도메인으로 대체된 도메인 스왑 CoStAR로 구성되었다. TRAF 컨센서스 서열, CD28 이후 단지 5 C- 및 N-말단 아미노산이 측면에 있는 TRAF2/3 결합 도메인, 또는 CD28 단독(여기에서 MOV19.CD28 또는 ΔCD40으로 지정된 CD40 영역을 함유하는 TRAF 도메인의 전체 결여)에 기반하여 무작위로 할당된 TRAF2, 2/3 및 6 영역에 TRAF 도메인을 함유한 추가 수용체를 클로닝하였다. 추가의 모의 형질도입된 세포를 포함하였다.
[00575] 렌티바이러스 첨가 및 세포 제조 후에, 형질도입 수준을 분석하였다. 도 68은 각 수용체 및 각 공여자에 대한 형질도입 수준을 개략적으로 나타낸 것이다. CoStAR 발현을 과량의 모의 형질도입된 세포를 사용하여 각 개별 공여자에서 가장 낮은 형질도입 효율의 발현으로 정규화하였다. 이를 수행함으로써, 발현이 전체 성능에 가질 수 있는 임의의 효과를 완화시키기 위해 동등한 형질도입 수준에서 각 공여자를 시작할 수 있었다. 공여자 702C의 경우 이는 30.4%에서 Δ2-6이었고, 공여자 1004 및 2000의 경우 이는 각각 27.3 및 42.6%에서 2-2/3-6 변이체였다.
[00576] T 세포를 200 IU/mL IL-2의 존재 및 부재 하에 8:1의 E:T로 Ba/F3-OKT3 세포와 공동배양하고, 외인성 IL-2의 존재 및 부재 하에 7, 14 및 21일에 계수하였다. 기준선과 비교한 배수 변화를 각 공여자 및 각 수용체에 대해 그리고 또한 조합된 3명의 공여자 모두에 대해 플롯팅하였다. 본 발명자들은 TRAF6 도메인을 교환하는 것이 야생형 수용체와 비교하여 CoStAR의 기능을 극적으로 손상시키지 않았으며, 일부 경우에, 특히 21일에 증식의 향상이 관찰되었음을 발견하였다(도 69a 내지 도 69f 및 도 73a 내지 도 73d). 이러한 효과는 IL-2의 부재 하에서도 여전히 관찰 가능했지만 덜 두드러졌다. TRAF2/3 도메인 내의 도메인 스왑은, 특히 외인성 IL-2 제공의 부재 하에서, 시험된 3명의 공여자 모두에 걸쳐 관찰된 증식의 일반적인 감소와 함께 덜 잘 용인되었다(도 70a 내지 도 70f 및 도 72a 내지 도 72f). TRAF2/3 도메인 스왑과 유사한 결과가 TRAF2 도메인 스왑으로 관찰되었지만, 일반적으로 증식에 대한 효과는 그다지 극적이지 않았다(도 71a 내지 도 71f 및 도 73a 내지 도 73d). 마지막으로, CD40으로부터 염기성 CD28 CoStAR로의 TRAF2/3 도메인의 첨가는 야생형 수용체와 비교하여 활성의 향상을 매개하기에 충분하지 않았으며, 컨센서스 서열에 기반한 무작위 TRAF 도메인은 야생형 수용체보다 동등하게 덜 효율적이었고, IL-2, 특히 후자의 존재 및 부재 하에 T 세포 증식을 매개하는 것보다 동등하게 덜 효율적이었다(도 73a 내지 도 73d 및 도 74a 내지 도 74d).
[00577] 수용체의 성능을 더 잘 비교하기 위해, 21일차 배수 변화를 플롯팅하였다(도 75a 내지 도 75b). 야생형 MOV19.CD28.CD40 CoStAR 뿐만 아니라 3개의 TRAF6 도메인 변이체 수용체(PQEINF-PEEMSW, PQEINF-PPENYE & PQEINF-PQENSY)는 Il-2의 존재 하에 21일에 모의 형질도입된 세포와 비교하여 증식을 유의하게 향상시켰으며(post-hoc Tukey's test으로의 일원 ANOVA에 의해 각각 P = 0.0443, 0.0045, 0.0053 및 0.0017), TRAF6 변이체 PQENSY는 또한 Δ2-6 변이체와 비교하여 유의하게 향상된 증식을 나타낸다(P = 0.0240). 시험된 모든 다른 변이체는 모의 형질도입된 조건과 비교하여 증식을 유의하게 향상시키지 않았다. Il-2의 부재 하에서, 이러한 경향은 여전히 관찰되었으며, TRAF6 변이체는 야생형 수용체와 함께 최상의 전체 배수 확장을 나타내고, 모든 TRAF2, TRAF2/3 및 다른 TRAF 변이체는 모의 형질도입된 세포와 비교하여 확장이 거의 향상되지 않았다. 일반적으로 시험된 모든 수용체에 대해 IL-2의 부재 하에 더 많은 공여자간 변동성이 존재하였다.
실시예 19 - CoStAR을 발현하는 T-세포를 이용한 사이토카인 생산
[00578] 본 발명자들은 또한 CoStAR 변이체 T-세포로부터 사이토카인 생산을 평가하였다. 이를 위해, T 세포와 BA/F3.OKT3.FRα 세포 사이에 공동배양 실험을 설정하였다(신호 1 및 2 제공). 20시간 후에 상청액을 수확하고 MSD에 의해 TNFα, IL-2 및 IFNγ 분비에 대해 분석하였다(도 90a 내지 도 90c). 일반적으로, 야생형 CD28.CD40 CoStAR+ 세포는 모의 형질도입된 대응물, 및 CD28만을 함유하는 CoStAR(ΔCD40)과 비교하여 더 큰 사이토카인 생산을 유도하였다. TRAF 변이체의 효과는 TRAF2/3 도메인(PVQE-TQEE, PVQE-SKEE 및 PVQE-AVEE)에 대한 변이가 일반적으로 TRAF2 도메인에 대한 변이체(SVQE-AVEE 및 SVQE-PEEE)와 같이, 야생형 수용체와 비교하여 IL-2 생산을 감소시킨 판독값으로서 IL-2에서 더 가변적이었지만 가장 명확하였다. TRAF6 도메인에 대한 변이는 보다 다양한 효과를 나타내었지만, 현저하게는 PQEINF-PPENYE 변이체는 야생형 수용체와 비교하여 분석된 3개 모두의 사이토카인을 증가시키는데 현저한 효과를 가졌다.
실시예 20 - CoStAR을 발현하는 T-세포를 이용한 사이토카인 생산
[00579] 3명의 건강한 공여자(NBC360, NBC362, NBC361)로부터의 세포를 Dynabeads로 활성화시키고 CTP194-CTP200 또는 MOCK로 형질도입하였다(스피접종, MOI 5). 이어서, 세포를 이들의 CD34 발현에 대해 자기적으로 농축하고, 급속 확장 프로토콜(REP)에 따라 확장시키고, 후속 실험을 위해 동결시켰다. 해동 후, 세포를 IL-2가 보충된 완전 RPMI에서 3 내지 4일 동안 휴지시키고 이들의 형질도입 속도를 CD34 마커 유전자 발현을 관찰하여 결정하였다. 생존율 및 절대 계수를 유세포분석(Novocyte)에 의해 DRAQ-7(1:200)을 사용하여 밤새 IL-2 기아 후 평가하였고, 데이터를 NovoExpress 1.5.0 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 형질도입된 T 세포를 IL-2의 부재 하에 8:1 이펙터 대 표적 비율로 LoVo.OKT3.GFP 종양 세포와 함께 3 내지 4일마다 배양 배지의 절반을 교체하면서 공동배양하였다. LoVo.OKT3.GFP는 자연적으로 이들의 표면에서 CEA 및 PD-L1을 발현하여, 형질도입된 T 세포에 신호 2 및 신호 1(OKT3) 둘 모두를 부여하였다. 6 내지 8일 후, 생존력 및 절대 계수를 평가하고, 살아있는 T 세포를 상기 기재된 바와 같이 새로운 LoVo.OKT3.GFP 종양 세포로 추가 주 동안 재접종하였다. 장기 공동배양의 말미에, 생존력 및 절대 계수를 측정하고, 배수 확장을 계산하였고(도 91b), IL-2 수준을 평가하였다(도 91a).
* * *
[00580] 따라서, 본 발명의 바람직한 구현예를 상세히 설명하였지만, 상기 단락에 의해 정의된 본 발명은 본 발명의 사상 또는 범위를 벗어나지 않고 이의 많은 명백한 변형이 가능하기 때문에 상기 설명에 기재된 특정 세부사항으로 제한되지 않는 것으로 이해되어야 한다.
서열목록 전자파일 첨부
Claims (54)
- 컨센서스(consensus) A, 또는 X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11의 서열을 포함하는 아미노산 서열을 포함하고, 여기서,
a. X1은 임의의 아미노산이고,
b. X2는 임의의 아미노산이고,
c. X3은 P이고, X4는 임의의 아미노산이고,
d. X5는 Q이고,
e. X6은 C 또는 A이고,
f. X7은 임의의 아미노산이고,
g. X8은 임의의 아미노산이고,
h. X9는 임의의 아미노산이고,
i. X10은 임의의 아미노산이고,
j. X11은 임의의 아미노산인, 단백질. - 제1항에 있어서, 단백질이 TRAF 도메인의 일부인, 단백질.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 단백질이 TRAF2 도메인의 일부인, 단백질.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
a. 서열이 하기를 포함하고:
i. X1은 S 또는 P이고,
ii. X2는 V, H, 또는 Y이고,
iii. X4는 I, Q, V이고,
iv. X7은 T 또는 S이고,
v. X8은 D이고,
vi. X9는 K, D, 또는 G이고,
vii. X10은 T, S, G, 또는 A이고,
viii. X11은 D, S, N, 또는 D이고; 또는
b. 서열이 a)와 적어도 60% 동일한, 단백질. - 컨센서스 B, 또는 X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11의 서열을 포함하는 아미노산 서열을 포함하고, 여기서,
a. X1은 임의의 아미노산이고,
b. X2는 임의의 아미노산이고,
c. X3은 P, S, A, 또는 T이고,
d. X4는 임의의 아미노산이고,
e. X5는 Q 또는 E이고,
f. X6은 E이고,
g. X7은 임의의 아미노산이고,
h. X8은 임의의 아미노산이고,
i. X9는 임의의 아미노산이고,
j. X10은 임의의 아미노산이고,
k. X11은 임의의 아미노산인, 단백질. - 제5항에 있어서, 단백질이 TRAF 도메인의 일부인, 단백질.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질이 TRAF2 도메인의 일부인, 단백질.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
a. 서열이 하기를 포함하고:
i. X1은 P, A, M, T, S, R, V, H이고,
ii. X2는 F, A, L, I, T, V, G, C, A, F, P이고,
iii. X4는 K, V, I, H, A, Q, T, E, S이고,
iv. X7은 C, T, E, D, S, A이고,
v. X8은 A, L, G, Y, I, Q, D, E이고,
vi. X9는 F, H, K, R, P, A, G, Y, E, N이고,
vii. X10은 R, G, E, K, A, S, D, C, C, P, V이고,
viii. X11은 S, C, D, P, W, T, A, G, E이고; 또는
b. 서열이 a)와 적어도 60% 동일한, 단백질. - 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 서열이 TRAF2/3 서열의 일부인, 단백질.
- 컨센서스 C 또는 X1X2X3X4X5X6의 서열을 포함하는 아미노산 서열을 포함하고, 여기서,
a. X1은 P이고,
b. X2는 임의의 아미노산이고,
c. X3은 E이고,
d. X4는 임의의 아미노산이고,
e. X5는 임의의 아미노산이고,
f. X6은 Ac/Ar인, 단백질. - 제5항에 있어서, 단백질이 TRAF 도메인의 일부인, 단백질.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질이 TRAF6 도메인의 일부인, 단백질.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
a. 서열이 하기를 포함하고:
i. X2는 Q, P, E, V, T, 또는 S이고,
ii. X4는 I, L, M, N, S, T, N, D이고,
iii. X5는 N, D, R, S, G, 또는 Y이고; 또는
b. 서열이 a)와 적어도 60% 동일한, 단백질. - d) SEQ ID NO: 475, 476, 477, 478, 479, 494, 495, 496, 498, 505, 510, 511, 512, 513, 514, 515, 516, 517, 518, 또는 519 중 하나 이상;
e) a)의 서열과 적어도 70% 동일한 서열; 또는
f) a)와 적어도 80% 유사한 서열을 포함하는, 아미노산 서열. - CD40 단백질에서의 TRAF 도메인으로서, 상기 TRAF 도메인은
d) SEQ ID NO: 475, 476, 477, 478, 479, 494, 495, 496, 498, 505, 510, 511, 512, 513, 514, 515, 516, 517, 518, 또는 519;
e) a)의 서열과 적어도 70% 동일한 서열; 또는
f) a)와 적어도 80% 유사한 서열
중 하나 이상을 포함하는, TRAF 도메인. - PQEINF, PEEMSW, PPENYE, 또는 PQENSY를 포함하는, TRAF6 도메인 서열.
- PVQET, TQEET, SKEET, AVEET, 또는 PVQET를 포함하는, TRAF2/3 도메인 서열.
- SVQE, AVEE 또는 PEEE를 포함하는, TRAF2 도메인 서열.
- d) SEQ ID NO: 475, 476, 477, 478, 479, 494, 495, 496, 498, 505, 510, 511, 512, 513, 514, 515, 516, 517, 518, 또는 519 중 하나의 아미노산 서열;
e) a)와 적어도 70% 동일한 아미노산 서열 또는
f) a)와 적어도 80% 유사한 아미노산 서열을 포함하는, TRAF6 또는 TRAF2/3 도메인. - 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 서열이 CD40 단백질 서열 내에 있는, 단백질, 아미노산 서열, 또는 TRAF 도메인.
- 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 서열이 CD40 단백질 내에 있고, CD40 단백질 내의 상응하는 TRAF2, TRAF2/3, 및/또는 TRAF6 도메인에 위치하는, 단백질, 아미노산 서열, 또는 TRAF 도메인.
- 컨센서스 A, 또는 X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11의 아미노산 서열을 포함하고, 여기서,
a. X1은 임의의 아미노산이고,
b. X2는 임의의 아미노산이고,
c. X3은 P이고, X4는 임의의 아미노산이고,
d. X5는 Q이고,
e. X6은 C 또는 A이고,
f. X7은 임의의 아미노산이고,
g. X8은 임의의 아미노산이고,
h. X9는 임의의 아미노산이고,
i. X10은 임의의 아미노산이고,
j. X11은 임의의 아미노산인, TRAF2/TRAF3 도메인. - 컨센서스 B, 또는 X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11의 아미노산 서열을 포함하고, 여기서,
a. X1은 임의의 아미노산이고,
b. X2는 임의의 아미노산이고,
c. X3은 P, S, A, 또는 T이고,
d. X4는 임의의 아미노산이고,
e. X5는 Q 또는 E이고,
f. X6은 E이고,
g. X7은 임의의 아미노산이고,
h. X8은 임의의 아미노산이고,
i. X9는 임의의 아미노산이고,
j. X10은 임의의 아미노산이고,
k. X11은 임의의 아미노산인, TRAF2/TRAF3 도메인. - 컨센서스 C, 또는 X1X2X3X4X5X6의 아미노산 서열을 포함하고, 여기서,
a. X1은 P이고,
b. X2는 임의의 아미노산이고,
c. X3은 E이고,
d. X4는 임의의 아미노산이고,
e. X5는 임의의 아미노산이고,
f. X6은 Ac/Ar인, TRAF6 도메인. - CD40 도메인으로서,
a. 컨센서스 A, 또는 X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11의 아미노산 서열을 포함하고, 여기서,
i. X1은 임의의 아미노산이고,
ii. X2는 임의의 아미노산이고,
iii. X3은 P이고, X4는 임의의 아미노산이고,
iv. X5는 Q이고,
v. X6은 C 또는 A이고,
vi. X7은 임의의 아미노산이고,
vii. X8은 임의의 아미노산이고,
viii. X9는 임의의 아미노산이고,
ix. X10은 임의의 아미노산이고,
x. X11은 임의의 아미노산인, TRAF2/TRAF3 도메인;
b. 컨센서스 B, 또는 X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11의 아미노산 서열을 포함하고, 여기서,
i. X1은 임의의 아미노산이고,
ii. X2는 임의의 아미노산이고,
iii. X3은 P, S, A, 또는 T이고,
iv. X4는 임의의 아미노산이고,
v. X5는 Q 또는 E이고,
vi. X6은 E이고,
vii. X7은 임의의 아미노산이고,
viii. X8은 임의의 아미노산이고,
ix. X9는 임의의 아미노산이고,
x. X10은 임의의 아미노산이고,
xi. X11은 임의의 아미노산인, TRAF2/TRAF3 도메인;
c. 컨센서스 C, 또는 X1X2X3X4X5X6의 아미노산 서열을 포함하고, 여기서,
i. X1은 P이고,
ii. X2는 임의의 아미노산이고,
iii. X3은 E이고,
iv. X4는 임의의 아미노산이고,
v. X5는 임의의 아미노산이고,
vi. X6은 Ac/Ar인, TRAF6 도메인
중 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는, CD40 도메인. - 키메라 공동자극 항원 수용체(CoStAR)로서,
암종배아 항원(CEA)에 결합하는 세포외 결합 도메인, 또는 메조텔린(MSLN)에 결합하는 세포외 결합 도메인;
상기 세포외 결합 도메인에 연결된 막횡단 도메인,
제1 신호전달 도메인; 및
제2 신호전달 도메인으로서, 상기 제2 신호전달 도메인은 변이체 CD40 신호전달 도메인 또는 이의 신호전달 단편을 포함하고, 상기 변이체 CD40은 변이체 TRAF2/TRAF3 서열, 또는 변이체 TRAF6 서열, 또는 변이체 TRAF2 서열의 서열을 포함하고, 상기 변이체 CD40은 SEQ ID NO: 42를 포함하지 않는, 제2 신호전달 도메인
을 포함하는, CoStAR. - 제26항에 있어서, 제1 신호전달 도메인이 CD28 또는 CD278(ICOS)의 신호전달 도메인 또는 신호전달 단편을 포함하는, CoStAR.
- 제26항에 있어서, 제1 신호전달 도메인이 전장 공동자극 도메인을 포함하는, CoStAR.
- 제26항에 있어서, 세포외 결합 도메인이 링커 및/또는 스페이서에 의해 막횡단 도메인에 작동적으로 연결된, CoStAR.
- 제29항에 있어서, 링커가 약 5 내지 약 20개의 아미노산을 포함하는, CoStAR.
- 제29항에 있어서, 링커가 약 10 내지 약 250개의 아미노산을 포함하는, CoStAR.
- 제29항에 있어서, 막횡단 도메인이 CD28, CD8, ICOS, DAP10, 또는 NTRK로부터의 막횡단 도메인을 포함하는, CoStAR.
- 제29항에 있어서, 막횡단 도메인이 SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, 또는 SEQ ID NO:22의 막횡단 도메인 서열을 포함하는, CoStAR.
- 제29항에 있어서, 세포외 결합 도메인이 scFv, 펩티드, 항체 중쇄 가변 도메인, 항체 경쇄 가변 도메인, 또는 CEA 리간드를 포함하는, CoStAR.
- 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항의 CoStAR을 인코딩하는, 핵산.
- 제35항의 핵산을 포함하는, 벡터.
- 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항의 CoStAR을 발현하는, 세포.
- 제37항에 있어서, 세포가 알파-베타 T 세포, 감마-델타 T 세포, T 조절 세포, TIL, NKT 세포 또는 NK 세포를 포함하는, 세포.
- 제37항에 있어서, 세포가 CAR 또는 TCR을 공동발현하는, 세포.
- 제37항 내지 제39항의 세포를 제조하는 방법으로서, 세포를 제36항의 벡터로 형질도입하거나 형질감염시키는 단계를 포함하는, 방법.
- 제26항 내지 제34항 중 어느 한 항의 CoStAR을 발현하는 세포의 집단을 제조하기 위한 방법으로서,
a. 제36항의 벡터로 형질감염되거나 형질도입된 세포의 표면 상에서 상기 CoStAR의 발현을 검출하는 단계; 및
b. 상기 CoStAR을 발현하는 것으로 동정된 세포를 선택하는 단계를 포함하는, 방법. - 제26항 내지 제34항 중 어느 한 항의 CoStAR이 세포 발현에 대해 농축된, 세포 집단.
- 대상체에서 질환을 치료하기 위한 방법으로서, 제37항 내지 제39항 중 어느 한 항에 따른 세포 또는 제42항에 따른 세포 집단을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
- SEQ ID NO: 510 내지 519 중 하나의 아미노산 서열을 포함하는, 단백질.
- 제44항에 있어서, 단백질이 SEQ ID NO: 510의 서열을 포함하는, 단백질.
- 제44항에 있어서, 단백질이 SEQ ID NO: 511의 서열을 포함하는, 단백질.
- 제44항에 있어서, 단백질이 SEQ ID NO: 512의 서열을 포함하는, 단백질.
- 제44항에 있어서, 단백질이 SEQ ID NO: 513의 서열을 포함하는, 단백질.
- 제44항에 있어서, 단백질이 SEQ ID NO: 514의 서열을 포함하는, 단백질.
- 제44항에 있어서, 단백질이 SEQ ID NO: 515의 서열을 포함하는, 단백질.
- 제44항에 있어서, 단백질이 SEQ ID NO: 516의 서열을 포함하는, 단백질.
- 제44항에 있어서, 단백질이 SEQ ID NO: 517의 서열을 포함하는, 단백질.
- 제44항에 있어서, 단백질이 SEQ ID NO: 518의 서열을 포함하는, 단백질.
- 제44항에 있어서, 단백질이 SEQ ID NO: 519의 서열을 포함하는, 단백질.
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