[go: up one dir, main page]
More Web Proxy on the site http://driver.im/

KR20240142290A - Lag-3에 결합하는 펩타이드 및 이의 용도 - Google Patents

Lag-3에 결합하는 펩타이드 및 이의 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR20240142290A
KR20240142290A KR1020240033776A KR20240033776A KR20240142290A KR 20240142290 A KR20240142290 A KR 20240142290A KR 1020240033776 A KR1020240033776 A KR 1020240033776A KR 20240033776 A KR20240033776 A KR 20240033776A KR 20240142290 A KR20240142290 A KR 20240142290A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
cancer
lag
peptide
cells
binding
Prior art date
Application number
KR1020240033776A
Other languages
English (en)
Inventor
이병헌
이석민
Original Assignee
경북대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 경북대학교 산학협력단 filed Critical 경북대학교 산학협력단
Priority to PCT/KR2024/003211 priority Critical patent/WO2024196072A1/ko
Publication of KR20240142290A publication Critical patent/KR20240142290A/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/42—Proteins; Polypeptides; Degradation products thereof; Derivatives thereof, e.g. albumin, gelatin or zein
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/0013—Luminescence
    • A61K49/0017—Fluorescence in vivo
    • A61K49/005—Fluorescence in vivo characterised by the carrier molecule carrying the fluorescent agent
    • A61K49/0056—Peptides, proteins, polyamino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2827—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against B7 molecules, e.g. CD80, CD86
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

본 발명은 LAG-3에 결합하는 펩타이드 및 이를 이용한 암 면역치료 및 항암 용도에 관한 것으로서, 본 발명의 펩타이드는 LAG-3과 특이적 결합하여 이를 억제함으로써 암세포에 대한 면역세포의 기능을 활성화하여 항암 효과를 나타낸다. 본 발명의 펩타이드는 파지 펩타이드 디스플레이 기술을 이용하여 사람의 LAG-3 단백질을 높게 발현시킨 세포를 대상으로 이와 잘 결합하는 두 종의 펩타이드(LAG-3Pep-1 및 LAG-3Pep-2)를 선별한 것으로, 사람 및 마우스의 LAG-3과 결합하여 이의 기능을 억제하는 것을 확인하였다. 본 발명의 펩타이드는 항체와 유사한 수준의 효과를 보였으며, 비교적 혈액 내 안정하여 향후 암 면역치료제로서 높은 가능성을 나타내고 있다.

Description

LAG-3에 결합하는 펩타이드 및 이의 용도{LAG-3-binding peptide and uses thereof}
본 발명은 LAG-3에 결합하는 펩타이드 및 이를 이용한 암 면역치료 및 항암 용도에 관한 것이다.
최근 면역 체크포인트 분자를 표적으로 하는 선택적 단일 클론 항체는 인간에게서 발병하는 암 치료에 있어 전례 없는 성공을 거두었다. 이러한 암 면역치료의 발달은 암 치료의 역사에서 새로운 이정표를 세우고 있다. 면역 체크포인트 분자의 하나인 림프구 활성화 유전자 (Lymphocyte-activation gene-3; LAG-3)은 여러 암에서 매력적인 치료 표적이 되고 있는데, 주로 T 세포가 활성화가 됨에 따라 상향 조절되고, 종양-침윤 림프구에서 일반적으로 나타나는 고갈된 T 세포에도 많이 존재한다. 인간 및 마우스 종양 샘플에 대한 패널 조사에 따르면, LAG-3는 2차 면역 기관 속의 림프구 뿐만 아니라 종양-침윤 림프구에도 높게 발현된다는 것이 밝혀졌다. LAG-3는 다양한 형태의 림프구와 수지상세포에서 발현된다.
LAG-3와 이의 리간드인 MHC class II의 상호작용을 차단하면, 일부 환자에게서는 우수한 항종양 반응 및 임상 효과를 확인할 수 있었다. LAG-3 / MHC class II 상호 작용의 차단은 보조(helper) T 세포의 기능을 유지 및 재활성화 시키고, 사이토카인 생산을 증가시킨다. LAG-3 / MHC class II 경로를 차단하는 항체는 광범위하게 진행되고, 고도의 불응성 암을 가진 환자의 상당수에서 장기간 지속되었고, 좋은 임상 효과를 나타냈다. 따라서, LAG-3 / MHC class II에 대한 고효율, 저비용의 억제제를 개발할 의학적 필요성이 크다.
비록 상당수의 암 환자가 CTLA-4, PD-1, 및 PD-L1과 같은 주요 면역 체크포인트의 차단 치료로 효과를 보지만, 아직도 많은 환자에서 반응성이 나타나지 않는다. 한편, 또 다른 면역 체크포인트인 LAG-3와 그 리간드인 MHC class ll 및 FGL-1 사이의 상호작용에 대한 차단제를 상기 면역 체크포인트 차단제와 함께 병용처리 한다면 더욱 우수한 항암 면역치료가 성취될 수 있을 것으로 여겨진다.
미국공개특허 US 2020-0369766 A1 (2020.05.21 공개)
본 발명은 LAG-3에 결합하는 펩타이드 및 이의 용도에 대한 것으로, 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시된 아미노산 서열로 이루어진 LAG-3에 특이적으로 결합하는 펩타이드, 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 약물전달용 조성물, 암 예방 또는 치료용 약학조성물 및 암 조직 내 침윤된 T 세포 영상화용 조성물; 상기 펩타이드 및 PD-L1 항체를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공하고자 한다.
상기 과제의 해결을 위해, 본 발명은 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시된 아미노산 서열로 이루어진 LAG-3에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합벡터 및 상기 재조합벡터로 형질전환되어 분리된 형질전환체를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 약물 전달용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 펩타이드 및 PD-L1 항체를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 암 조직 내 침윤된 T 세포 영상화용 조성물을 제공한다.
본 발명은 LAG-3에 결합하는 펩타이드 및 이를 이용한 암 면역치료 및 항암 용도에 관한 것으로서, 본 발명의 펩타이드는 LAG-3과 특이적 결합하여 이를 억제함으로써 암세포에 대한 면역세포의 기능을 활성화하여 항암 효과를 나타낸다. 본 발명의 펩타이드는 파지 펩타이드 디스플레이 기술을 이용하여 사람의 LAG-3 단백질을 높게 발현시킨 세포를 대상으로 이와 잘 결합하는 두 종의 펩타이드(LAG3Pep-1 및 LAG3Pep-2)를 선별한 것으로, 사람 및 마우스의 LAG-3와 결합하여 이의 기능을 억제하는 것을 확인하였다. 본 발명의 펩타이드는 항체와 유사한 효과를 보였으며 향후 암 면역치료제로서 높은 가능성을 나타내고 있다.
도 1은 LAG-3를 발현하는 플라스미드 DNA를 형질감염 시킨 HEK-293T 세포에서 LAG-3의 발현을 나타낸다. (a) LAG-3 플라스미드 DNA를 일시적으로 HEK-293T 세포에 형질감염 시키고 48 시간 뒤에 형광 현미경으로 LAG-3와 함께 발현되는 녹색 형광단백질(green fluorescent protein, GFP)의 발현을 DIC 현미경 및 형광 현미경으로 촬영한 것이다(10x 및 4x). (b) LAG-3 발현 양을 확인하기 위해 형질감염 시킨 48 시간 뒤에 세포의 단백질을 추출하여 면역 블랏 분석한 결과를 나타낸 것이다. (c) LAG-3를 발현시키거나 하지 않은 세포에서 48 시간 뒤에 LAG-3 항체를 이용하여 세포를 염색한 후 면역형광 공초점 현미경으로 LAG-3(붉은 색) 및 GFP(녹색)의 발현 정도를 촬영한 것이다(스케일 바: 30 μm).
도 2는 Jurkat T 세포주에서 LAG-3의 발현 정도를 나타낸다. (a-b) Phorbol 12-Myristate 13-Acetate (PMA) (50 ng/ ml), Ionomycin (1 μg/ml), Chloroquine (CQ) (100 μM)를 이용하여 여러 가지 방법으로 자극시키고, 자극된 Jurkat T 세포에서의 LAG-3 항체를 이용하여 LAG-3 발현 퍼센트와 평균 형광 강도(mean fluorescent intensity, MFI)를 유세포 분석기로 측정한 결과를 나타낸 것이다. *, P< 0.05; **,P< 0.01; ***, P< 0.001. (c) 자극된 Jurkat T 세포에서 LAG-3 발현에 대한 유세포 분석 결과를 히스토그램으로 나타낸 것이다. (d) 자극 및 자극하지 않은 Jurkat T 세포주에서 LAG-3의 발현 정도를 공초점 현미경으로 면역 형광 분석한 결과를 나타낸 것이다. AML 및 EOL 세포는 대조군으로 사용하였다(스케일 바: 30 μm).
도 3은 LAG-3 결합 펩타이드 발굴을 위한 바이오 패닝 결과를 나타낸다. (a) 바이오 패닝 과정의 대략적인 모식도이다. (b) HEK-293T 형질감염된 세포 및 형질감염되지 않은 세포에서 5회의 바이오 패닝을 수행한 결과 각 회에서 회수된 파지 역가(pfu)를 나타낸 것이다. (c) NCBI-protein BLAST 데이터베이스를 검색한 결과, 후보 펩타이드(LAG-3Pep-1로 명명)가 LAG-3의 리간드인 HLA-DR1(인간 MHC class ll의 subtype)과 아미노산 서열이 비슷한 것을 보여준다. (d) HEK-293T 형질감염된 세포에서 13개의 파지 클론을 선택하고 이들의 HEK-293T 세포에 대한 결합을 파지 결합 ELISA로 분석한 결과를 나타낸다. 광학 밀도(Optical Density; OD)는 450 nm 파장에서 측정하였다.
도 4는 LAG-3 결합 펩타이드(LAG3Pep-1, LAG3Pep-2)의 세포 결합 정도를 나타낸다. (a) LAG-3 플라스미드 벡터로 형질감염 시키거나 하지 않은 HEK-293T 세포를 대상으로 펩타이드의 결합을 면역 형광 현미경으로 분석한 결과이다(스케일 바: 30 μm). (b) PMA (50 ng/ ml), Ionomycin (1 μg/ml), CQ (100 μM)를 이용하여 자극시키거나 하지 않은 Jurkat T 세포에서 LAG-3 결합 펩타이드의 결합 퍼센트를 유세포 분석기로 확인한 결과이다. *, P< 0.05; **,P< 0.01; ***, P< 0.001. (c) 펩타이드의 결합에 대한 유세포 분석 결과를 히스토그램으로 나타낸 것이다.
도 5는 LAG-3 결합 펩타이드와 항체 사이의 경쟁적 결합을 분석한 결과를 나타낸다. (a) LAG-3 차단 항체와 LAG-3 결합 펩타이드 사이의 경쟁적 결합에 대한 분석의 모식도이다. (b) 형질감염된 HEK-293T 세포에서 LAG3Pep-1 및 LAG3Pep-2의 결합이 LAG-3 차단 항체로 인해 차단되는 것을 면역 형광 현미경으로 관찰한 것이다 (스케일 바: 30 μm). (c-d) Jurkat T 세포에 자극을 주어 LAG-3를 발현시킨 상태에서, LAG-3 차단 항체의 경쟁적 결합으로 인해 LAG3Pep-1 및 LAG3Pep-2의 결합이 감소하는 것을 유세포 분석기로 측정하고 이를 결합 퍼센트와 평균 형광 강도로 각각 나타낸 것이다. *, P< 0.05; **,P< 0.01; ***, P< 0.001. (e) 펩타이드의 결합에 대한 유세포 분석 결과를 히스토그램으로 나타낸 것이다.
도 6은 LAG-3와 HLA-DR의 상호작용에 대한 LAG3 결합 펩타이드의 차단 효과를 나타낸다. (a) 세포 기반 차단 분석의 개략도이다. (b) 48시간동안 재조합 사람 인터페론-감마에 의해 유도된 THP-1 인간 세포 (급성 단핵구 백혈병 세포주)에 대한 HLA-DR의 발현 정도를 유세포 분석으로 나타낸다. (c-d) HLA-DR이 발현된 THP-1 세포와 LAG-3 단백질의 상호작용에 대해 LAG-3 차단 항체와 LAG3 결합 펩타이드의 차단 정도를 유세포 분석으로 나타낸다. 또한 차단 정도에 대한 계산식을 나타낸다. (e) 유세포 분석 결과 중 대표적인 것을 히스토그램으로 나타낸 것이다.
도 7은 LAG3 결합 펩타이드의 결합 친화도와 특이적 결합을 분석한 결과이다. LAG3Pep-1(a)와 LAG3Pep-2(b)에 대한 SPR 분석을 통해서 확인한 결합 친화도 결과이다. 인간LAG-3 재조합 단백질(c)와 인간 LAG-3를 과발현시킨 세포용해물(d)를 비오틴-펩타이드와 반응한 후 스트렙트아비딘으로 침전시키고 LAG-3 항체로 면역 블랏팅 분석한 결과이다.
도 8은 LAG3Pep을 사용한 T 세포의 회복을 관찰하기 위한 기능 테스트로 IL-2 ELISA 분석을 한 것이다. 차단 항체 (LAG-3, PD-L1)와 펩타이드(Control-pep, LAG3Pep-1, LAG3Pep-2)로 Jurkat T 세포를 PMA(50ng/ml), Ionomycin(1μg/ml) 및 클로로퀸(CQ)(100μM)으로 24시간 동안 자극 하였다. HepG2 세포를 24시간 동안 배양하여 FGL-1 단백질을 방출시켰다. 자극 및 배양 후 T 세포와 암세포를 공동 배양하고, 한편 자극되지 않은 Jurkat T 세포를 대조군으로 사용하였다. 공동 배양 비율은 1:5 이다. (c) Jurkat T 세포 및 HepG2 세포의 배양 배지 혼합 배양을 위해 HepG2 세포를 48시간 동안 배양하여 FGL-1 단백질을 방출시키고 혼합 배양하였다. (d). Jurkat T-세포 및 hFGL-1 단백질(10μg/ml) 또는 Isotype(BSA)(10μg/ml)으로 배양 및 자극 후, hFGL-1 단백질 및 BSA와 세포를 같이 배양하였다. 대조군 펩타이드로는 파지 표면 단백질에서 유래한 NSSSVDK 펩타이드를 대조군으로 사용하였다. *, P< 0.05; **,P< 0.01; ***, P< 0.001.
도 9는 마우스 동일계통 (syngenic) MC38 종양을 이식한 모델에서 LAG-3 결합 펩타이드가 PD-L1 항체와 병용투여시 종양 성장을 억제한다는 결과를 나타낸다. (a) MC38 종양 마우스 모델에서 펩타이드/항체 투여 일정을 나타낸 모식도이다. (c) 총 15일의 실험이 끝나고 종료 시점에서의 각 군의 종양 크기 차이를 보여준다. 15일 동안 2일 마다 마우스의 무게(b)와 종양 크기(d)를 측정한 결과이다. (e) 각각의 마우스의 종양 크기 병환를 보여주는 결과이다. n=6; Mean ±SEM, *, P< 0.05; **,P< 0.01; ***, P< 0.001.
본 발명은 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시된 아미노산 서열로 이루어진 림프구 활성화 유전자(Lymphocyte-activation gene-3; LAG-3)에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 제공한다.
본 발명에서 서열번호 1로 표시된 아미노산 서열은 "CIRNDPAVC"으로, 본 명세서에서는 "LAG3Pep-1"로 약칭하였고, 서열번호 2로 표시된 아미노산 서열은 "CSVLNASGC"으로, 본 명세서에서는 "LAG3Pep-2"로 약칭하였다.
본 발명의 펩타이드는 당업계에 공지된 화학적 합성에 의해 쉽게 제조될 수 있다. 대표적인 방법으로서 액체 또는 고체상 합성, 단편 응축, F-MOC 또는 T-BOC 화학법이 포함되지만, 이들로 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 펩타이드는 유전공학적 방법에 의해 제조될 수 있다. 우선, 통상적인 방법에 따라 상기 펩타이드를 코딩하는 DNA 서열을 합성한다. DNA 서열은 적절한 프라이머를 사용하여 PCR 증폭함으로써 합성할 수 있다. 다른 방법으로 당업계에 공지된 표준 방법에 의해, 예컨대, 자동 DNA 합성기(예: Biosearch 또는 AppliedBiosystems사에서 판매하는 것)를 사용하여 DNA 서열을 합성할 수도 있다. 제작된 DNA 서열은 이 DNA 서열에 작동가능하게 연결되어(operatively linked) 그 DNA 서열의 발현을 조절하는 하나 또는 그 이상의 발현 조절 서열(expression control sequence)(예: 프로모터, 인핸서 등)을 포함하는 벡터에 삽입시키고, 이로부터 형성된 재조합 발현 벡터로 숙주세포를 형질전환시킨다. 생성된 형질전환체를 상기 DNA 서열이 발현되도록 적절한 배지 및 조건 하에서 배양하여, 배양물로부터 상기 DNA 서열에 의해 코딩된 실질적으로 순수한 펩타이드를 회수한다. 상기 회수는 이 기술분야에서 공지된 방법(예컨대, 크로마토그래피)을 이용하여 수행할 수 있다. 상기에서 '실질적으로 순수한 펩타이드'라 함은 본 발명에 따른 펩타이드가 숙주로부터 유래된 어떠한 다른 단백질도 실질적으로 포함하지 않는 것을 의미한다.
본 발명에서 상기 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시된 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드는 이의 기능적 변이체를 포함하는 개념이다. “기능적 변이체”란 LAG-3에 특이적으로 결합하는 본 발명의 펩타이드의 성질에는 영향을 미치지 않는 아미노산 위치에서 일부 아미노산의 치환이 발생된 모든 유사한 서열을 의미한다.
또한, 본 발명은 상기 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.
상기 “폴리뉴클레오타이드(polynucleotide)”는 단일가닥 또는 이중가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드의 중합체이다. RNA 게놈 서열, DNA(gDNA 및 cDNA) 및 이로부터 전사되는 RNA 서열을 포괄하며, 특별하게 다른 언급이 없는 한 천연의 폴리뉴클레오타이드의 유사체를 포함한다.
상기 폴리뉴클레오타이드는 상기 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열뿐만 아니라, 그 서열에 상보적인(complementary) 서열도 포함한다. 상기 상보적인 서열은 완벽하게 상보적인 서열뿐만 아니라, 실질적으로 상보적인 서열도 포함한다.
또한, 상기 폴리뉴클레오타이드는 변형될 수 있다. 상기 변형은 뉴클레오타이드의 추가, 결실 또는 비보존적 치환 또는 보존적 치환을 포함한다. 상기 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 상기 뉴클레오타이드 서열에 대하여 실질적인 동일성을 나타내는 뉴클레오타이드 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기 뉴클레오타이드 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 80%의 상동성, 최소 90%의 상동성 또는 최소 95%의 상동성을 나타내는 서열일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합벡터로 형질전환되어 분리된 형질전환체를 제공한다.
본 발명에 있어서,“벡터”는 클론유전자(또는 클론 DNA의 다른 조각)를 운반하는데 사용되는 스스로 복제되는 DNA 분자를 의미한다.
본 발명에서 있어서, “재조합벡터”는 숙주 세포 내에서 삽입된 핵산을 발현할 수 있는 당 분야에 공지된 플라스미드, 바이러스 벡터 또는 기타 매개체를 의미하는 것으로서, 당업계에 공지된 통상의 발현벡터에 본 발명의 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 작동가능하게 연결된 것일 수 있다. 상기 재조합벡터는 일반적으로 숙주세포에서 증식할 수 있는 복제원점, 발현을 조절하는 하나 이상의 발현 조절 서열(예. 프로모터, 인핸서 등), 선별 마커(selective marker) 및 발현 조절 서열과 작동가능하게 연결된 본 발명의 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 형질전환체는 상기 재조합벡터에 의해 형질전환된 것일 수 있다.
바람직하게는 형질전환체는 본 발명의 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합벡터를 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 이에 한정되지는 않으나, 일시적 형질감염(transient transfection), 미세주사, 형질도입(transduction), 세포융합, 칼슘 포스페이트 침전법, 리포좀 매개된 형질감염(liposome-mediated transfection), DEAE 덱스트란-매개된 형질감염(DEAE Dextran- mediated transfection), 폴리브렌-매개된 형질 감염(polybrene-mediated transfection), 전기침공법(electropora tion), 유전자 총(gene gun) 및 세포 내로 핵산을 유입시키기 위한 다른 공지의 방법에 의해 숙주세포에 도입하여 수득할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 약물 전달용 조성물을 제공한다.
바람직하게는, 상기 약물은 펩타이드 약물 또는 항암제일 수 있으며, 보다 바람직하게는, 상기 펩타이드 약물은 세포 사멸 또는 괴사 유도 활성을 갖는 세포 독성 펩타이드일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 펩타이드는 암 조직 내 침윤된 T 세포에 대한 결합을 통해 약물을 주변의 암세포에 선택적으로 전달하는 지능형 약물 전달체로서 사용될 수 있다. 본 발명의 펩타이드를 종래 공지의 약물과 연결하여 암 치료에 이용한다면 본 발명의 펩타이드에 의해 약물이 암조직에 선택적으로 전달되기 때문에 약물의 효력을 증가시킬 수 있고 동시에 정상조직에 미치는 약물의 부작용을 현저히 줄일 수 있다.
상기 약물은 항암제로서, 본 발명의 펩타이드에 연결될 수 있는 항암제로는 종래 암의 치료에 사용되는 것이라면 제한 없이 사용될 수 있다. 예컨대, 젬시타빈(gemcitabine), 크리조티닙(crizotinib), 독소루비신, 파클리탁셀, 빈크리스틴, 다우노루비신(daunorubicin), 빈블라스틴(vinblastine), 액티노마이신-D(actinomycin-D), 도세탁셀, 에토포사이드(etoposide), 테니포사이드(teniposide), 비산트렌 (bisantrene), 호모해링토닌(homoharringtonine), 글리벡(Gleevec; STI-571), 시스플라틴, 5-플로오로우라실, 아드리아마이신, 메토트렉세이트, 부설판(busulfan), 클로람부실(chlorambucil), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 멜팔란 (melphalan), 니트로겐 무스타드(nitrogen mustard) 또는 니트로소우레아 (nitrosourea) 등이 있다. 항암제와 본 발명의 펩타이드 간의 연결은 당업계에 공지된 방법, 예컨대, 공유 결합, 가교 등을 통해 수행될 수 있다. 이를 위해 본 발명의 펩타이드는 필요하다면 그 활성이 소실되지 않는 범위에서 화학적으로 수식(modification)될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 펩타이드 및 PD-L1 항체를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.
바람직하게는 상기 암은 대장암, 유방암, 폐암, 췌장암, 뇌종양, 혈액암, 간암, 식도암, 신장암, 직장암, 위암, 갑상선암, 방광암, 난소암, 담도암, 담관암, 담낭암, 자궁암, 자궁경부암, 전립선암, 두경부암, 후두암 또는 구강암일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 약학 조성물은 유효 성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등의 가용화제를 사용할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 투여를 위해서 유효 성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1 종 이상 포함하여 약학 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 약제 제제 형태는 과립제, 산제, 피복정, 정제, 캡슐제, 좌제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 및 활성 화합물의 서방출형 제제 등이 될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 복강내, 흉골내, 경피, 비측내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물의 유효성분의 유효량은 질환의 예방 또는 치료 요구되는 양을 의미한다. 따라서, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효 성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 이에 제한되는 것은 아니나, 예컨대, 성인의 경우, 1일 1회 내지 수회 투여시, 본 발명의 조성물은 1일 1회 내지 수회 투여시, 화합물일 경우 0.1ng/kg~10g/kg 용량으로 투여할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 암 조직 내 침윤된 T 세포의 영상화용 조성물을 제공한다.
바람직하게는, 상기 펩타이드는 발색효소, 방사성동위원소, 크로모포어(chromophore), 발광물질, 형광물질(fluorescer), 자기공명 영상물질, 상자성입자(superparamagnetic particles) 또는 초상자성입자(ultrasuper paramagnetic particles)로 표지될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
예컨대, 검출가능한 표지로 형광물질을 이용하는 경우에는 형광단층촬영(Fluorescence mediated tomography: FMT)으로 암 조직 내 T 세포의 침윤 수준을 진단할 수 있다. 즉, 형광물질로 표지된 본 발명의 펩타이드를 혈액 내로 순환시키고 형광단층촬영으로 펩타이드에 의한 형광을 관찰할 수 있다. 형광이 강하게 관찰된다면, 암 조직 내 T 세포의 침윤이 높은 것으로 진단된다.
암 조직 내 침윤된 T 세포 영상화 및 침윤 수준의 진단은, 이에 한정되지는 않으나, 암 질환의 초진 목적 뿐만 아니라, 진행 경과, 치료에 대한 치료 경과, 치료제(특히, 항암 면역치료제)에 대한 반응 모니터링 등을 포괄하여 사용할 수 있다. 상기 펩타이드는 결합 여부의 확인, 검출 및 정량을 용이하게 하기 위하여, 표지된 상태로 제공될 수 있으며, 이에 대해서는 상기에서 기술한 바와 같다.
이하에서는, 본 발명을 한정하지 않는 실시예에 따라 본 발명을 상세히 설명한다. 본 발명의 하기 실시예는 본 발명을 구체화하기 위한 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는 것이 아님은 물론이다. 따라서, 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 전문가가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다.
<실험예>
하기의 실험예들은 본 발명에 따른 각각의 실시예에 공통적으로 적용되는 실험예를 제공하기 위한 것이다.
1. 세포주 및 시약
HEK-293T (인간 배아 신장 세포), Jurkat T, EOL, AML, 및 THP-1 (인간 백혈병 세포), HepG2 및 Hep3B (인간 간암 세포)는 American type culture collection (ATCC, Manassas, VA, USA)에서 구입하였다. HEK-293T, HepG2, 및 Hep3B 세포는 DMEM low glucose (Gibco, Carslbad, CA, USA) 배양액으로, Jurkat T, EOL, AML, 및 THP-1 세포는 RPMI-1640 (Gibco, Carsl bad, CA, USA) 배양액을 사용하여 배양하였다. 모든 배양액은 10% 우태아혈청(fetal bovine serum; Gibco), 100 U/ml 페니실린(penicillin), 및 100 ug/ml 스트렙토마이신(streptomycin)을 첨가 하였다. 모든 세포는 CO2 배양기를 사용하여 37℃에서 배양하였다.
사람 재조합 LAG-3 및 FGL-1 (Acro Biosystems), 사람 재조합 IFN-γ (R&D), 사람 LAG-3 항체 및 FGL-1 항체 (Santa Cruz Biotechnology), LAG-3 차단 항체 (AdipoGen)를 구입하여 사용하였다. 사람 LAG-3 항체, 사람 HLA-DR 항체, 항-Fc 항체, 사람 HLA-DR 항체, 사람 IL-2 ELISA kit (Bio legend), 사람 PD-L1 항체, 사람 PD-L1 차단 항체, T7-HRP 항체는 ThermoFisher Scientific사에서 구입하였다. Lipofectamine 3000 (Invitrogen), Phorbol 12-Myristate 13-Acetate (PMA), Chloroquine (CQ, Sigma-Aldrich), Ionomycin (Abcam)에서 구입하여 사용하였고, GFP-LAG-3 plasmid vector는 Origene으로부터 구입하였다.
2. 세포의 LAG-3 단백질 발현에 대한 웨스턴 블랏팅 분석
HEK-293T 세포(6.25×105)를 6-웰 플레이트에 접종하고, 사람 LAG-3 플라스미드로 형질감염 시킨 후, 48 시간 동안 배양하였다. 대조군으로 형질감염 되지 않은 세포를 사용하였고. 다음 날, 세포들을 수확하여 포유류 단백질 추출 시약 (M-PER)와 프로테아제 저해 혼합물을 이용하여 세포를 녹여서 단백질을 수확하고 사람 LAG-3 항체와 HRP 2차 항체를 사용하여 웨스턴 블랏팅에 적용하였다.
3. 세포의 LAG-3 단백질 발현에 대한 공초점 현미경 및 유세포 분석기 분석
HEK-293T 세포(1.25×105)를 4-웰 챔버 슬라이드에 접종하고, 사람 LAG-3 플라스미드로 형질감염 시킨 후, 48 시간 동안 배양하였다. 다음 날, 세포들을 인산완충액으로 2번 씻어냈고, 1% BSA로 상온에서 1시간 동안 반응시켜, 항체의 비특이적 결합을 감소시켰다. 그 후, 세포 LAG-3 항체로 실온에서 1시간 동안 반응시켰고. 2차 항체(Alexa594)로 다시 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 고정 후, 세포들을 씻어냈고, 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)로 대비 염색하였으며, 형광 보존을 위한 변색 방지 시약을 처리하고, 공초점 현미경으로 분석하였다. 대조군으로 비 형질감염된 세포를 사용하였다.
같은 방식으로 Phorbol 12-Myristate 13-Acetate (PMA, 50 ng/ml), Ionomycin (1 μg/ml), chloroquine (CQ, 100 μM)를 이용하여 자극 시킨 Jurkat T 세포와 자극시키지 않은 Jurakt T 세포를 이용하여 부유 세포인 것을 고려하여 106개를 수확하여 e-tube에서 염색을 진행하고 마지막 단계에서 슬라이드에 일부를 도말하고 덮개 슬라이드를 덮어 후, 공초점 현미경(NanoScope사, 대전)으로 분석하였다.
Jurkat T 세포의 경우, PMA/Iono/CQ에 처리 방식에 따른 LAG-3의 발현 정도를 확인하기 위해 여러 방식으로 약물이 처리된 Jurkat T세포를 106개를 수확하여 인산완충액으로 2번 씻어냈고, 1% BSA로 상온에서 30 분 동안 반응시켜, 항체의 비특이적 결합을 감소시켰다. 그 후, 플루오레세인 이소티오시아네이트(Fluorescein isothiocyanate; FITC) 녹색 형광이 표지된 LAG-3 항체로 4℃에서 1시간 동안 반응시켰고. 여러 번 씻어낸 후, 인산완충액으로 현탁시킨 300 ul의 세포 현탁액을 Attune NxT 유세포 분석(Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA)으로 분석하였다. 대조군으로 자극 시키지 않은 Jurkat T세포를 이용하였다.
4. T7 파지 펩타이드 라이브러리를 이용한 바이오-패닝(Bio-panning)
T7 파지 펩타이드 라이브러리는 Novagen로부터 파지 벡터를 구입한 뒤 라이브러리를 제작하여 사용하였다. Hek-293T 세포는 35mm 접시에 배양하였고, 70-80%로 가득하게 되면, LAG-3 플라스미드로 형질감염 시켰다. 상기 세포들은 인산완충액으로 5분 동안 각각 2번 씻어냈다. 음성 선별과정(subtraction procedure)을 위해, 1×109 플라크-형성 유닛(plaque-forming unit; pfu)의 파지 라이브러리를 Hek-293T 세포에서 1시간 동안 4℃로 배양하였다. 상기 세포에 비결합한 파지를 회수하였고, LAG-3 형질감염된 Hek-293T 세포와 함께 1시간 동안 4℃로 배양하였다. 그 후, 비결합 파지는 10 mg/ml 소 혈청 알부민(bovine serum albumin; BSA)을 포함한 인산완충액으로 씻어냈다. 세포에 결합한 파지는 BL21 (OD: 1.0) 배양액으로 상온에서 10분 동안 용출시켰다. 용출물은 적정에 사용하였고, 잔여 용출 파지 클론은 10 ml BL21 (OD: 0.5)에 넣어, T7 파지가 용해 사이클을 겪어 투명하게 용해될 때까지 3-4 시간 동안 반응시켰다. 상기 과정은 총 4번 반복하였고, 이후 연속적으로 희석하였다. 용출물은 LB medium Petri plates에 접종하였고, 37℃에서 밤새도록 배양하였다. 파지의 역가는 콜로니의 수를 계수하여 측정하였다.
5. 서열분석 및 펩타이드 합성
5회의 바이오-패닝 후, 삽입된 클론은 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction; PCR)으로 확인하였다. DNA 삽입된 80개 각각의 클론들을 서열 분석하였다(Macrogen , Seoul, South korea). 서열 유사성은 Clustal W 프로그램을 사용하여 분석하였다. LAG-3 결합 펩타이드로서, LAG3Pep-1 (CIRNDPAVC; 서열번호 1) 및 LAG3Pep-2 (CSVLNASGC; 서열번호 2)를 합성하였다(Peptron Inc. Daejeon, Korea). 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC), 비오틴(biotin)를 각 펩타이드의 N-말단에 접합시켰다. 동결건조된 펩타이드들은 50 mM 또는 10 mM 농도까지 증류수 또는 디메틸 설폭사이드(dimethyl sulfoxide; DMSO)로 재구성되었다. 그 후, 인산완충액으로 10 μM 농도까지 추가적으로 희석하였다. 파지 코팅 단백질에 존재하는 펩타이드 서열인 NSSSVDK를 대조군 펩타이드로 사용하였다.
6. 파지 결합 ELISA 분석
Hek-293T 세포(2.5×104)를 96 웰 플레이트에 접종하였고, LAG-3 플라스미드로 형질감염 시켰다. 48 시간동안 배양하였다. 대조군으로 형질감염 되지 않은 Hek-293T 세포를 이용하였다. 플레이트는 10 mg/ml BSA로 상온에서 1시간 동안 차단시켰다. Tris-buffered saline-Tween 20 (0.1%)로 웰을 6번 씻어낸 후, 100 μl 파지 클론(1×109 pfu/well)을 첨가하였고, 4℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 씻어낸 후, horse-radish peroxidase (HRP)가 접합된 T7 tail fiber 항체 (블롯킹 완충액으로 1:10,000 비율로 희석)을 첨가하였고, 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 플레이트를 다시 6번 씻어낸 후, 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine로 구성된 기질을 첨가하였고, 상온에서 10-15분 동안 반응시켰다. 반응은 100 μl의 2 M 농도의 H2S04 (정지 용액)을 첨가함으로써 최종적으로 중단시켰고, 플레이트들은 마이크로플레이트 리더로 450 nm에서 분석하였다.
7. LAG-3 펩타이드 결합의 면역형광분석 및 유세포 분석
Hek-293T 세포(1.25×105)를 4-웰 챔버 슬라이드에 접종하고, 사람 LAG-3 플라스미드로 형질감염 시킨 후, 48 시간동안 배양하였다. 대조군으로 형질감염 되지 않은 세포를 사용하였고. 다음 날, 세포들을 인산완충액으로 2번 씻어냈고, 1% BSA로 상온에서 1시간 동안 반응시켜, 펩타이드의 비특이적 결합을 감소시켰다. 그 후, 세포는 농도(25 μM)의 TAMRA 접합 펩타이드로 4℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 고정 후, 세포들을 씻어냈고, DAPI로 대비염색하였으며, 형광 보존을 위한 변색 방지 시약을 처리하고, 공초점 현미경(Nanoscope System)으로 분석하였다.
유세포 분석을 위해, PMA (50 ng/ ml), Ionomycin (1 μg/ml), CQ (100 μM)를 이용하여 자극시킨 Jurkat T 세포(1×106)을 수확한 후, 차단을 위해 1% BSA가 포함된 배양 배지에 상온에서 1시간 동안 현탁 시켰다. 그 후, 플루오레세인 이소티오시아네이트-표지된 LAG-3 결합 펩타이드(10 μM)로 4℃에서 1시간 동안 추가적으로 반응시켰다. 여러 번 씻어낸 후, 인산완충액으로 현탁시킨 300 ul의 세포 현탁액을 Attune NxT 유세포 분석(Thermo Fisher Scientific)에 적용하였다.
8. LAG-3 결합 펩타이드의 경쟁적 결합 강도
Hek-293T 세포(1.25×105)를 4-웰 챔버 슬라이드에 접종하고, 사람 LAG-3 플라스미드로 형질감염 시킨 후, 다음 날, 세포들을 인산완충액으로 2번 씻어냈고, 1% BSA로 상온에서 1시간 동안 반응시켜, 비특이적 결합을 감소시켰다. 그 후, 세포는 사람 LAG-3 차단 항체(10 μg/ml)를 이용하여 4℃에서 30분 동안 차단 시킨 후, 농도(25 μM)의 TAMRA 접합 펩타이드로 4℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 고정 후, 세포들을 씻어냈고, DAPI로 대비 염색하였으며, 형광 보존을 위한 변색 방지 시약을 처리하고, 공초점 현미경(Nanoscope System)으로 분석하였다.
마찬가지로 유세포 분석을 위해, PMA (50 ng/ ml), Ionomycin (1 μg/ml), CQ (100 μM)를 이용하여 자극시킨 Jurkat T 세포(1×106)을 수확한 후, 비특이적 결합 차단을 위해 1% BSA가 포함된 배양 배지에 상온에서 1시간 동안 현탁시켰다. 그 후, 세포는 사람 LAG-3 차단 항체(10 μg/ml)를 이용하여 4℃에서 30분 동안 차단 시킨 후, 농도(10 μM)의 플루오레세인 이소티오시아네이트 접합 펩타이드로 4℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 여러 번 씻어낸 후, 인산완충액으로 현탁시킨 300ul의 세포 현탁액을 Attune NxT 유세포 분석(Thermo Fisher Scientific)에 적용하였다. 대조군으로는 LAG-3 차단 항체를 이용하지 않은 군을 사용하였다.
9. LAG-3 결합 펩타이드의 LAG-3/HLA-DR 상호작용 방해 강도
혈액암 세포의 THP-1 세포에 HLA-DR(MHC class ll)의 발현을 높이기 위해 사람 재조합 IFN-γ를 처리하고, 48시간 동안 배양하여 세포 막의 HLA-DR을 발현 시킨 후, 세포를 수확하고 사람 재조합 LAG-3 단백질을 처리하기 전에 LAG-3 결합 펩타이드와 LAG-3 차단 항체를 농도별로 처리하고 4℃에서 30분 동안 반응시켜서 LAG-3 단백질을 도장시킨다. 코팅된 LAG-3 단백질을 세포에 처리 첨가하여 4℃에서 30분 동안 반응시킨 후, 붙지 않은 단백질은 씻어 낸 후, Fc에 대한 항체를 이용하여 단백질을 염색시켰다 여러 번 씻어낸 후, 인산완충액으로 현탁시킨 300 ul의 세포 현탁액을 Attune NxT 유세포 분석(Thermo Fisher Scientific)에 적용하였다. 대조군으로는 BSA를 이용하였다.
10. LAG-3 결합 펩타이드의 결합 특이성 분석
LAG-3 결합 펩타이드의 결합 특이성은 풀다운 분석을 통해 측정하였다. 인간 재조합 LAG-3 단백질을 이용하여 LAG-3 결합 펩타이드와 풀다운 후, LAG-3 항체를 사용하여 면역-블랏팅에 적용하였다. 같은 방식으로 인간 LAG-3 plasmid DNA를 이용하여 LAG-3를 과발현시킨 세포 용해물을 이용하여 녹다운 후, LAG-3 항체를 이용하여 면역-블랏팅에 적용하였다.
11. LAG-3 결합 펩타이드의 K D 수치 측정
표면 플라즈몬 공명(Surface Plasmon Resonance; SPR)을 사용하여, 친화도 상수(affinity constant; KD), 동역학(Kinetics; Ka 및 Kd)을 측정하였다. LAG-3 결합 펩타이드 (15μM)를 스트렙트아비딘(SA) 칩의 표면상에 고정시켰고, 1x 인산완충액으 (PH 7.4)을 25 μl/min으로 10분 동안 흘려보냈다. 그 후, 잔여 미결합 단백질은 2 M NaCl을 50 μl/min으로 5분 동안 흘려보내 제거하였다. LAG-3 단백질은 작용 완충액에 용해 시켰고, 6가지 다른 농도 (31.25nM, 62.5nM, 125nM, 250nM, 500nM, 1000nM)를 흘려보냈다. 각각의 농도로 주입하였고, 50 μl/min으로 2분 30초 동안 흘려보냈다. 각각의 RU를 기록하였다. 계산은 Scrubber and clamp software를 사용하여 수행하였다.
12. T-세포 활성화 분석
Jurkat T 세포(1×106)를 T25 플라스크에 접종하고, PMA (50 ng/ ml), Ionomycin (1 μg/ml), CQ (100 μM)를 이용하여 24시간 동안 자극시킨다. HepG2 세포(5×103)를 96-웰 플레이트에 접종하고, 48시간 동안 FGL-1을 분비시킨다. 두 가지 세포를 공동 배양 하기 위해 1:5 비율로 자극시킨 Jurkat T세포(2.5×104)를 HepG2와 혼합시킨다. 마찬가지로 간접적 공동 배양을 위해, 자극시킨 Jurkat T 세포(2.5×104)를 HepG2 세포 배양액과 혼합시킨다. 마지막으로, 직접적인 영향을 보기위해 자극시킨 Jurkat T세포(2.5×104)에 재조합 FGL-1(10 μg/ml) 단백질을 처리한다. 이 과정에서 LAG-3 결합 펩타이드(50 μM), 사람 LAG-3 항체(10 μg/ml), 사람 PD-L1 항체(10 μg/ml), PD-L1/LAG-3 항체, LAG-3결합 펩타이드+사람 PD-L1 항체를 첨가한다. 그 후, 반응을 위해 24시간 동안 추가로 배양한다. 대조군 펩타이드도 비교를 위해 사용하였다. 각각의 배양시간 후, 상층액을 수확하였고, 사람 IL-2 측정용 ELISA kit를 사용하여 IL-2 분비를 측정하였다.
13. 생체 내( in vivo ) 항종양 치료
6-8 주령 C57BL/6 마우스를 구입하였다. 경북대학교 동물실험윤리위원회(Institutional Animal Care and Use Committee; IACUC)의 가이드라인 하에서(2023-0184), 마우스는 사육되고 유지시켰다. 종양은 마우스의 오른쪽 하부 옆구리에 주입하였다. 생체 내(in vivo) 항 종양 치료를 위해, 마우스를 무작위로 선별하였고, 종양 크기가 약 100-150 mm3에 달하면 그룹화하였다. 그 후, 펩타이드를 10 mg/kg의 용량으로 2주 동안 주당 3번씩 정맥으로 주입하였고, 마찬가지로 항체도 같은 용량으로 총 3번을 복강 내로 주입하였다. 종양 크기는 디지털 칼리퍼를 사용하여 측정하였고, 종양 부피는 식(V = length × width2 × 0.52)을 사용하여 계산하였다(단, 길이(L)는 최장 치수, 너비(W)는 짧은 치수, 마우스 몸과 평행). 모든 마우스는 치료 후 궤양 정도를 확인하였고, 종양 크기가 3000 mm3 정도에 이르면 치료를 종료하고 마우스를 희생시켰다.
14. 통계 분석
통계적 유의성은 2 그룹을 비교시에는 unpaired Student t test로 측정하였고, 다중 그룹 간 비교시에는 one or two-way ANOVA를 사용하였다. 수치는 3번의 독립적인 샘플에 대해 평균 ± SD로 나타냈다. P 수치가 <0.05이면, 통계적으로 유의성이 있는 것으로 판단하였다.
<실시예 1> LAG-3 단백질을 과발현하는 세포주 구축 및 분석
LAG-3 발현 세포와 선택적으로 결합할 수 있거나, LAG-3을 차단할 수 있는 펩타이드를 찾아내기 위해서, LAG-3-과발현 세포에 대한 무작위 펩타이드들의 T7 파지 라이브러리를 스크리닝하였다. LAG-3-과발현 세포를 제조하기 위해서, 녹색 형광단백질(green fluorescent protein, GFP)가 함께 발현되도록 연결된 LAG-3 플라스미드 DNA를 일시적으로 Hek-293T 세포에 형질 감염시켰고, 48 시간 동안 배양하였다.
그 결과, 형질 감염 후, GFP와 LAG-3의 발현은 48 시간에서 높게 나타났는데, 이는 현미경 분석(도 1a) 및 웨스턴 블랏팅(도 1b)으로 확인하였다. 이후 실험에서는 형질 감염 48 시간 후의 세포들을 사용하였다. LAG-3 발현을 더욱 더 확인하기 위해 LAG-3 형질 감염시킨 Hek-293T 세포를 LAG-3 항체로 염색하여 면역형광 현미경으로 확인하였다. 대조군으로 형질 감염되지 않은 세포를 사용하였고, LAG-3 형질 감염된 세포에서 더 많은 LAG-3 항체가 염색된 것을 확인하였다(도 1c). 또한, LAG-3 및 GFP의 발현이 세포막에 주로 존재하는 것을 관찰하였다(도 1c).
<실시예 2> Jurkat T 세포의 LAG-3 발현 분석
Jurkat T 세포를 PMA (50 ng/ ml), Ionomycin (1 μg/ml), CQ (100 μM)를 이용하여 여러 혼합 처리법과 시간을 달리하여 자극한 후, 유세포 분석을 이용하여 세포막의 LAG-3 발현 수준을 확인하였다. 대조군으로 자극되지 않은 Jurkat T세포를 사용하였다.
그 결과, PMA (50 ng/ ml), Ionomycin (1 μg/ml), CQ (100 μM)를 함께 처리하고 48 시간 동안 배양했을 때, 가장 높은 수준의 LAG-3를 발현하는 세포의 퍼센트(도 2a 및 2c) 및 평균 형광세기(mean fluorescence intensity, MFI)를 보였다(도 2b). 이후 연구에서는 자극하고 48 시간 후의 Jurkat T 세포들을 사용하였다. 다른 혈액암 세포주인 EOL, AML에 대해서도 PMA (50 ng/ ml), Ionomycin (1 μg/ml), CQ (100 μM)를 처리하여 면역형광 현미경을 이용하여 LAG-3 세포막의 발현 수준을 확인하였을 때, 다른 혈액암 세포주에 비해 Jurkat T세포에서 더 높은 수준의 LAG-3 발현을 보였다(도 2d).
<실시예 3> T7 파지 라이브러리를 이용한 LAG-3 결합 펩타이드의 바이오 패닝
무작위 서열의 펩타이드를 가진 T7 파지 라이브러리를 이용하여 LAG-3-과발현 세포에 대한 바이오 패닝을 5회 실행한 결과, 3회에서 첫 회에 비해 파지 역가는 약 40배 높아졌고, 이후 4회에서는 오히려 역가가 감소했다가 5회에서 다시 증가하는 양상을 보였다(도 3a). 3회에서 나온 파지 클론 중 총 80개의 파지 클론을 무작위로 선별하였다. 삽입된 클론의 서열을 확인하기 위해서, 선별된 클론 각각에 대해 중합효소연쇄반응 및 DNA 서열 분석을 수행하였다. 분석한 서열을 바탕으로 단백질 BLAST 데이터베이스를 이용하여 확인한 결과, LAG-3와 상호작용하는 MHC class ll의 세포 표면 수용체인 HLA-DR 서열과 비슷한 서열을 가진 펩타이드(CIRNDPAVC: 서열번호 1, LAG3Pep-1으로 명명)를 선택하여 합성하였다(도 3c). 또한, 형질 전환된 세포 중 형질 감염되지 않은 세포에서 나타나는 서열은 제외한 다음 7개 이상의 아미노산 길이를 가진 13개의 파지 클론을 추가로 선택하였다(도 3c). 형질 감염되거나 형질 감염되지 않은 Hek-293T 세포를 대상으로 파지 결합 ELISA를 통해 선택된 13개 파지 클론들의 세포 결합을 조사하여 가장 높은 수준의 결합을 보인 3번 클론의 펩타이드(CSVLNASGC: 서열번호 2, LAG3Pep-2로 명명)를 선택하여 합성하였다(도 3b 및 3d).
<실시예 4> LAG-3 결합 펩타이드의 LAG-3 발현 세포에 대한 결합 분석
펩타이드의 LAG-3와의 결합 정도를 확인하기 위해 LAG-3를 형질 감염시킨 Hek-293T 세포에 붉은색 형광시약을 표지한 펩타이드를 합성하여 처리한 다음, 면역형광 현미경으로 관찰하였다. 대조군으로는 형질 감염되지 않은 세포를 사용하였다. 한편, PMA, Ionomycin, CQ를 이용하여 자극시켜 LAG-3의 발현을 증가시킨 Jurkat T 세포에 대해서는 상기 펩타이드를 처리하여 결합 여부를 유세포 분석기로 확인하였다. 대조군으로 자극시키지 않은 Jurakt T 세포를 이용하였다.
그 결과, 대조군 세포에 비해 LAG-3의 발현(녹색 형광)이 더 높은 Hek-293 세포에서 LAG-3Pep-1 및 LAG-3Pep-2 펩타이드(붉은색 형광)가 더 강하게 결합하는 것으로 나타났다 (도 4a). 또한, 대조군 세포에 비해 자극시킨 Jurkat T 세포에서 LAG-3Pep-1 및 LAG-3Pep-2 펩타이드가 더 많이 결합하였다(도 4b 및 4c).
다음으로, LAG-3 차단 항체를 이용하여 LAG-3를 차단하게 되면 LAG-3 결합 펩타이드의 결합이 감소되는지 확인하였다(도 5a). 먼저, LAG-3를 형질 감염시킨 Hek-293T 세포를 이용하여 LAG-3 차단 항체를 먼저 처리하고 LAG-3Pep-1 및 LAG-3Pep-2 펩타이드(붉은색 형광)를 처리하여 면역형광 현미경으로 확인한 결과, LAG-3 차단 항체를 처리한 군에서 처리하지 않은 군에 비해 LAG-3 결합 펩타이드의 결합 강도가 감소하는 것을 확인하였다(도 5b). 마찬가지로, PMA, Ionomycin, CQ를 이용하여 자극시킨 Jurakt T 세포를 이용하여 LAG-3 차단 항체를 먼저 처리하고 LAG-3 결합 펩타이드를 처리한 후 유세포 분석기로 확인한 결과, LAG-3 차단 항체를 처리한 군에서 처리하지 않은 대조군에 비해 LAG-3Pep-1 및 LAG-3Pep-2 펩타이드의 결합이 감소하는 것을 확인하였다(도 5c-e).
<실시예 5> HLA-DR과 LAG-3 사이의 상호작용에 대한 LAG-3 결합 펩타이드의 억제 효과
LAG-3의 리간드인 HLA-DR을 발현하는 THP-1 세포에 재조합 LAG-3-Fc 단백질을 반응시키고, 이때 LAG-3 차단 항체 또는 LAG-3 결합 펩타이드를 처리하게 되면 LAG-3-Fc와 HLA-DR 사이의 결합 또는 상호작용이 영향을 받는지 확인하고자 하였다(도 6a).
먼저, THP-1 세포의 HLA-DR 발현 수준을 증가시키기 위해 인간 재조합 IFN-γ를 처리하고 48 시간 동안 배양한 후, HLA-DR 항체를 이용하여 유세포 분석으로 HLA-DR 발현 수준을 확인하였다. 대조군으로 인간 재조합 IFN-γ을 처리하지 않은 세포와 BSA를 처리한 세포를 사용하였다. 그 결과, 인간 재조합 IFN-γ를 처리한 세포에서 가장 높은 HLA-DR 발현을 보였다(도 6b). 재조합 LAG-3-Fc 단백질을 세포에 처리할 때 LAG-3 결합 펩타이드를 농도별로 처리하여 THP-1 세포막의 HLA-DR에 결합한 LAG-3-Fc 단백질의 양을 Fc에 대한 항체를 이용하여 염색하고 유세포 분석기로 측정하였다. 양성 대조군으로 LAG-3 차단 항체를 사용하였고, 음성 대조군으로는 NSSSVDK 서열의 대조군 펩타이드를 사용하였다. 그 결과, LAG-3 차단 항체는 농도가 증가함에 따라 LAG-3 / HLA-DR의 상호작용의 차단 비율이 증가하는 것이 나타났고(도 6c), LAG-3 결합 펩타이드는 LAG3Pep-2에서만 농도가 증가함에 따라 LAG-3 / HLA-DR의 상호작용의 차단 비율이 증가하는 것으로 나타났다(도 6d 및 6e). 차단 비율 공식은 유세포 분석의 평균 형광 강도 값을 이용하여 계산하였다.
<실시예 6> 재조합 LAG-3 단백질에 대한 LAG-3 결합 펩타이드의 친화도 분석
펩타이드의 결합 친화도(KD) 값을 측정하기 위해서, 스트렙트아비딘(streptavidin) 칩에 비오틴-펩타이드를 코팅하고 재조합 LAG-3 단백질을 흘려보내는 방식으로 SPR 분석을 수행하였다.
그 결과, LAG-3 단백질에 대한 LAG3Pep-1의 친화도는 약 20.49 ± 16.79 μM 이였고(도 7a), LAG3Pep-2의 친화도는 약 0.203 ± 0.01 μM 이였다(도 7b). 또한, 재조합 LAG-3 단백질과 비오틴 표지된 펩타이드를 반응시킨 후, 스트렙트아비딘 비드로 풀다운 및 LAG-3 항체로 면역-블랏팅 한 결과, 대조군 대비 LAG3 결합 펩타이드, 특히 LAG3Pep-2에 의해 LAG-3 단백질이 더 많이 검출되었다(도 7c). LAG-3를 과발현시킨 세포용해물과 비오틴 표지된 펩타이드를 반응시킨 후, 상기와 같이 풀다운 및 면역-블랏팅 한 결과, 대조군 대비 LAG3 결합 펩타이드, 특히 LAG3Pep-2에 의해 LAG-3 단백질이 더 많이 검출되었다(도 7d).
<실시예 7> HepG2 간암세포 공동배양 및 재조합 FGL-1 처리에 따른 T 세포의 IL-2 생성 및 이에 대한 LAG-3 결합 펩타이드의 영향
간암 세포인 HepG2에서 분비된 FGL-1과 T 세포의 LAG-3 사이의 상호작용으로 T 세포 활성이 억제되는지와, 만약 억제된다면 LAG-3 결합 펩타이드에 의해 차단되는지를 조사하였다. 이를 위해 첫 번째 실험으로, PMA, Ionomycin, CQ를 이용하여 Jurkat T 세포를 24 시간 동안 자극시키면서 배양하였다. HepG2 세포는 FGL-1 분비를 위해 96-웰에서 48 시간 동안 배양하였다. 이후, Jutakt T 세포와 HepG2 세포를 5:1 비율로 24 시간 동안 공동배양하면서, LAG-3 차단 항체 및 PD-L1 차단 항체/LAG-3 결합 펩타이드 병용을 처리하였다(도 8a). 두 번째 실험은, HepG2 세포의 세포배양액만을 수집한 다음, 자극시킨 Jurkat T 세포에 처리하였다. 이때는 PD-L1 차단 항체는 사용하지 않고 LAG-3 차단 항체 및 LAG-3 결합 펩타이드만을 처리하고 24시간 동안 배양하였다(도 8b). 세 번째 실험은, 재조합 FGL-1 단백질을 자극시킨 Jurkat T 세포에 직접 처리하면서, 이때 LAG-3 차단 항체 및 LAG-3 결합 펩타이드를 처리하고 24시간 동안 배양하였다(도 8c-d). 대조군으로 BSA 처리한 군 및 NSSSVDK 펩타이드를 이용하였다. 공동배양이 끝나면 세포 배양액을 수확하여 사람 IL-2 ELISA kit을 이용하여 배양액 속의 IL-2 분비 수준을 확인하였다.
그 결과, 상기 세 가지 실험조건, 즉 HepG2 세포의 공동배양, HepG2 세포배양액 처리, 및 재조합 FGL-1 처리를 하는 경우 T 세포가 활성화되면서 생성하는 사이토카인인 IL-2가 줄어들었다(도 8a-c). 반면, LAG-3 차단 항체 또는 LAG3Pep-2를 상기 조건에서 함께 처리하면 IL-2 분비가 의미 있게 다시 증가하였다(도 8a-c).
<실시예 8> 마우스 종양 모델 대상 LAG-3 결합 펩타이드의 항암치료 효과
마우스 동일 계통(syngeneic) 종양 모델에서 항암효과를 확인하고자 MC38 마우스 대장암세포를 이용해 종양을 유발시킨 마우스에 LAG-3 결합 펩타이드를 단독 및 PD-L1항체와의 병용투여를 실시하였다(도 9a). 이때, LAG-3 결합 펩타이드는 마우스에 격일로 총 6회 정맥으로 투여하였고 PD-L1 항체는 마우스에 5일 주기로 총 3회 복강내로 투여 하였다.
그 결과, 대조군 및 인산완충액 군에 비해 LAG3Pep-2 및 PD-L1 항체 단독 투여에 의해 암 성장을 일부 억제하였고, LAG3Pep-2와 PD-L1 항체의 병용투여에 의해서는 단독군에 비해 종양의 성장을 억제하였다(도 9b-d). 실험 기간 동안 동물의 체중은 모든 실험군에서 모두 큰 변동 없이 유사하였다(도 9e).
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시예일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (13)

  1. 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시된 아미노산 서열로 이루어진 림프구 활성화 유전자(Lymphocyte-activation gene-3; LAG-3)에 특이적으로 결합하는 펩타이드.
  2. 제1항의 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드.
  3. 제2항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합벡터.
  4. 제3항의 재조합벡터로 형질전환되어 분리된 형질전환체.
  5. 제1항의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 약물 전달용 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 약물은 펩타이드 약물 또는 항암제인 것을 특징으로 하는 약물 전달용 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 펩타이드 약물은 세포 사멸 또는 괴사 유도 활성을 갖는 세포 독성 펩타이드인 것을 특징으로 하는 약물 전달용 조성물.
  8. 제6항에 있어서, 상기 항암제는 젬시타빈(gemcitabine), 크리조티닙(crizotinib), 독소루비신, 파클리탁셀, 빈크리스틴, 다우노루비신(daunorubicin), 빈블라스틴(vinblastine), 액티노마이신-D(actinomycin-D), 도세탁셀, 에토포사이드(etoposide), 테니포사이드(teniposide), 비산트렌 (bisantrene), 호모해링토닌(homoharringtonine), 글리벡(Gleevec; STI-571), 시스플라틴, 5-플로오로우라실, 아드리아마이신, 메토트렉세이트, 부설판(busulfan), 클로람부실(chlorambucil), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 멜팔란 (melphalan), 니트로겐 무스타드(nitrogen mustard) 및 니트로소우레아 (nitrosourea)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 약물 전달용 조성물.
  9. 제1항의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학조성물.
  10. 제1항의 펩타이드 및 PD-L1 항체를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학조성물.
  11. 제9항 또는 제10항에 있어서, 상기 암은 대장암, 유방암, 폐암, 췌장암, 뇌종양, 혈액암, 간암, 식도암, 신장암, 직장암, 위암, 갑상선암, 방광암, 난소암, 담도암, 담관암, 담낭암, 자궁암, 자궁경부암, 전립선암, 두경부암, 후두암 및 구강암으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 암 예방 또는 치료용 약학조성물.
  12. 제1항의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 암 조직 내 침윤된 T 세포 영상화용 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 상기 펩타이드는 발색효소, 방사성동위원소, 크로모포어(chromophore), 발광물질, 형광물질(fluorescer), 자기공명 영상물질, 상자성입자(superparamagnetic particles) 및 초상자성입자(ultrasuper paramagnetic particles)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나로 표지된 것을 특징으로 하는 암 조직 내 침윤된 T 세포 영상화용 조성물.
KR1020240033776A 2023-03-20 2024-03-11 Lag-3에 결합하는 펩타이드 및 이의 용도 KR20240142290A (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/KR2024/003211 WO2024196072A1 (ko) 2023-03-20 2024-03-13 Lag-3에 결합하는 펩타이드 및 이의 용도

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR20230035632 2023-03-20
KR1020230035632 2023-03-20

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20240142290A true KR20240142290A (ko) 2024-09-30

Family

ID=92927879

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020240033776A KR20240142290A (ko) 2023-03-20 2024-03-11 Lag-3에 결합하는 펩타이드 및 이의 용도

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR20240142290A (ko)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20200369766A1 (en) 2019-05-22 2020-11-26 Leidos, Inc. LAG3 Binding Peptides

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20200369766A1 (en) 2019-05-22 2020-11-26 Leidos, Inc. LAG3 Binding Peptides

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US8258256B2 (en) Compositions and methods for the treatment of cancer
US20190209715A1 (en) Plectin-1 Targeted Agents for Detection and Treatment of Pancreatic Ductal Adenocarcinoma
AU2006208068A1 (en) EphB receptor-binding peptides
JP7101118B2 (ja) 異常ｗｎｔシグナル伝達の処置のための安定化ｂｃｌ９ペプチド
KR102150419B1 (ko) Pd-l1에 결합하는 펩타이드 및 이의 용도
US11306119B2 (en) Peptide bound to PD-L1 and use thereof
JP2009502983A (ja) タンパク質キナーゼｃイソフォームの抑制剤およびその使用
KR20210056959A (ko) 간암의 예방 또는 치료용 조성물
US11192920B2 (en) Peptides for binding to CD44v6 and use thereof
KR20240142290A (ko) Lag-3에 결합하는 펩타이드 및 이의 용도
JP2022509258A (ja) Ｄｐｅｐ－１結合剤および使用の方法
WO2024196072A1 (ko) Lag-3에 결합하는 펩타이드 및 이의 용도
US9581598B2 (en) Diagnosis and treatment of brain tumor
KR102194026B1 (ko) Trail 수용체에 결합하는 펩타이드 및 이의 용도
KR102659285B1 (ko) 암세포 유래 엑소좀에 선택적으로 결합하는 펩타이드 및 이의 용도
WO2021011799A1 (en) Inflammatory bowel diseases therapy involving disrupting ccr9:drd5 heteromer assembly
US20230295229A1 (en) Peptide selectively binding to cancer cell-derived exosome, and uses thereof
CN111378039A (zh) 治疗恶性肿瘤的抗体及其应用
KR20240032207A (ko) Trop2에 결합하는 펩타이드 및 이의 용도
CA3083242A1 (en) Human cancer cell metastasis inhibitory agent and human cancer cell determination agent
KR20230121560A (ko) 메소세린에 결합하는 펩타이드 및 이의 용도
KR102027248B1 (ko) 유방암 줄기세포 검출용 바이오마커 및 이의 용도
CA3227830A1 (en) Vimentin targeted peptoids for early diagnosis and treatment of cancer
US9233121B2 (en) Compositions and methods for the treatment of cancer
KR101254243B1 (ko) ｃｈｋ１ 단백질 및 ＨＪＵＲＰ 단백질 간의 상호작용을 억제하는 펩티드, 이를 포함하는 항암제 및 항암제를 스크리닝하는 방법