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KR20240131324A - 수용체 티로신 키나제 EphA5에 대한 항체-약물 접합체 - Google Patents

수용체 티로신 키나제 EphA5에 대한 항체-약물 접합체 Download PDF

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Publication number
KR20240131324A
KR20240131324A KR1020247018476A KR20247018476A KR20240131324A KR 20240131324 A KR20240131324 A KR 20240131324A KR 1020247018476 A KR1020247018476 A KR 1020247018476A KR 20247018476 A KR20247018476 A KR 20247018476A KR 20240131324 A KR20240131324 A KR 20240131324A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
seq
set forth
variable region
chain variable
antibody
Prior art date
Application number
KR1020247018476A
Other languages
English (en)
Inventor
레나타 파스콸리니
와디 아랍
페르난다 아이. 스타퀴치니
Original Assignee
럿거스, 더 스테이트 유니버시티 오브 뉴 저지
엠브레이스 테라퓨틱스, 인크.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 럿거스, 더 스테이트 유니버시티 오브 뉴 저지, 엠브레이스 테라퓨틱스, 인크. filed Critical 럿거스, 더 스테이트 유니버시티 오브 뉴 저지
Publication of KR20240131324A publication Critical patent/KR20240131324A/ko

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Abstract

본 발명은 특정 측면에서 인간 EPH 수용체 A5 (EphA5)에 특이적인 항체, 결합 폴리펩티드, 및 면역접합체에 관한 것이다.

Description

수용체 티로신 키나제 EphA5에 대한 항체-약물 접합체
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 35 U.S.C. § 119(e) 하에 2021년 11월 3일에 출원된 미국 가특허 출원 번호 63/275,346을 우선권 주장하며, 상기 가출원은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
연방정부가 후원하는 연구 또는 개발에 관한 진술
본 발명은 미국국립보건원(National Institutes of Health)이 부여한 승인 번호 CA218853 하에 정부 지원을 받아 개발되었다. 정부는 발명에 대한 특정 권리를 갖는다.
항체-약물 접합체 (ADC)는 표적 세포에 높은 효율 및 최소화된 오프-타겟(off-target) 효과로 전달될 수 있는 생물제제(biologic)임이 입증되었다. 수용체 티로신 키나제 EphA5는 많은 유형의 인간 폐암 세포주 및 인간 폐암 생검에서 발현되는 표면 분자이다. 폐암이 가장 흔하고 치명적인 인간 암 유형 중 하나가 됨에 따라, 효과적인 요법이 시급히 필요하다. 따라서, EphA5와 같은 종양-특이적 표적을 표적으로 하는 신규한 폐암 요법이 관련 기술분야에 필요하다. 본 발명은 이러한 필요성을 해결한다.
본 발명은 특정 측면에서 인간 EPH 수용체 A5 (EphA5)에 특이적인 항체, 결합 폴리펩티드, 및 면역접합체(immunoconjugate)에 관한 것이다.
특정 측면에서, 본 발명은 인간 EPH 수용체 A5의 에피토프(epitope)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편(antigen-binding fragment)을 제공한다.
본원에 개시된 상기 측면 또는 임의의 다른 측면 또는 실시양태의 특정 실시양태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 서열번호: 1과 적어도 85% 서열 동일성(sequence identity)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄를 포함한다.
본원에 개시된 상기 측면 또는 임의의 다른 측면 또는 실시양태의 특정 실시양태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 서열번호: 8과 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄를 포함한다.
본원에 개시된 상기 측면 또는 임의의 다른 측면 또는 실시양태의 특정 실시양태에서, 중쇄 가변 영역은 3개의 중쇄 상보성-결정 영역(complementarity-determining regions) (HCDR)을 포함하며, 여기서 HCDR1은 서열번호: 16에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, HCDR2는 서열번호: 17-19로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고, HCDR3은 서열번호: 20에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
본원에 개시된 상기 측면 또는 임의의 다른 측면 또는 실시양태의 특정 실시양태에서, 경쇄 가변 영역은 3개의 경쇄 상보성-결정 영역 (LCDR)을 포함하며, 여기서 LCDR1은 서열번호: 21 및 22로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고, LCDR2는 서열번호: 23에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, LCDR3은 서열번호: 24에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
특정 측면에서, 본 발명은 본원에 개시된 상기 측면 또는 임의의 다른 측면 또는 실시양태의 항체 또는 항원-결합 단편을 제공한다.
본원에 개시된 상기 측면 또는 임의의 다른 측면 또는 실시양태의 특정 실시양태에서, 중쇄 가변 영역은 서열번호: 16에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호: 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호: 20에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하고; 경쇄 가변 영역은 서열번호: 21에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호: 23에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호: 24에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함한다.
본원에 개시된 상기 측면 또는 임의의 다른 측면 또는 실시양태의 특정 실시양태에서, 중쇄 가변 영역은 서열번호: 16에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호: 18에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호: 20에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하고; 경쇄 가변 영역은 서열번호: 21에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호: 23에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호: 24에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함한다.
본원에 개시된 상기 측면 또는 임의의 다른 측면 또는 실시양태의 특정 실시양태에서, 중쇄 가변 영역은 서열번호: 16에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호: 19에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호: 20에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하고; 경쇄 가변 영역은 서열번호: 21에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호: 23에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호: 24에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함한다.
본원에 개시된 상기 측면 또는 임의의 다른 측면 또는 실시양태의 특정 실시양태에서, 중쇄 가변 영역은 서열번호: 16에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호: 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호: 20에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하고; 경쇄 가변 영역은 서열번호: 22에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호: 23에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호: 24에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함한다.
본원에 개시된 상기 측면 또는 임의의 다른 측면 또는 실시양태의 특정 실시양태에서, 중쇄 가변 영역은 서열번호: 16에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호: 18에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호: 20에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하고; 경쇄 가변 영역은 서열번호: 22에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호: 23에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호: 24에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함한다.
본원에 개시된 상기 측면 또는 임의의 다른 측면 또는 실시양태의 특정 실시양태에서, 중쇄 가변 영역은 서열번호: 16에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호: 19에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호: 20에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하고; 경쇄 가변 영역은 서열번호: 22에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호: 23에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호: 24에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함한다.
본원에 개시된 상기 측면 또는 임의의 다른 측면 또는 실시양태의 특정 실시양태에서, 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열번호: 2-7로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖고/갖거나, 100% 서열 동일성을 갖는다.
본원에 개시된 상기 측면 또는 임의의 다른 측면 또는 실시양태의 특정 실시양태에서, 중쇄 가변 영역은 서열번호: 2-7로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
본원에 개시된 상기 측면 또는 임의의 다른 측면 또는 실시양태의 특정 실시양태에서, 중쇄 가변 영역은 서열번호: 2-7로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열로 이루어진다.
본원에 개시된 상기 측면 또는 임의의 다른 측면 또는 실시양태의 특정 실시양태에서, 중쇄 가변 영역은 서열번호: 26-31로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열에 의해 코딩된다.
본원에 개시된 상기 측면 또는 임의의 다른 측면 또는 실시양태의 특정 실시양태에서, 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열번호: 9-13으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖고/갖거나, 100% 서열 동일성을 갖는다.
본원에 개시된 상기 측면 또는 임의의 다른 측면 또는 실시양태의 특정 실시양태에서, 경쇄 가변 영역은 서열번호: 9-13으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
본원에 개시된 상기 측면 또는 임의의 다른 측면 또는 실시양태의 특정 실시양태에서, 경쇄 가변 영역은 서열번호: 9-13으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열로 이루어진다.
본원에 개시된 상기 측면 또는 임의의 다른 측면 또는 실시양태의 특정 실시양태에서, 경쇄 가변 영역은 서열번호: 33-37로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열에 의해 코딩된다.
본원에 개시된 상기 측면 또는 임의의 다른 측면 또는 실시양태의 특정 실시양태에서, 중쇄 가변 영역은 서열번호: 2에 제시되고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 9에 제시된다.
본원에 개시된 상기 측면 또는 임의의 다른 측면 또는 실시양태의 특정 실시양태에서, 중쇄 가변 영역은 서열번호: 2에 제시되고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 10에 제시된다.
본원에 개시된 상기 측면 또는 임의의 다른 측면 또는 실시양태의 특정 실시양태에서, 중쇄 가변 영역은 서열번호: 2에 제시되고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 11에 제시된다.
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본원에 개시된 상기 측면 또는 임의의 다른 측면 또는 실시양태의 특정 실시양태에서, 중쇄 가변 영역은 서열번호: 6에 제시된 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 12에 제시된 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
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본원에 개시된 상기 측면 또는 임의의 다른 측면 또는 실시양태의 특정 실시양태에서, 중쇄 가변 영역은 서열번호: 7에 제시된 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 9에 제시된 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
본원에 개시된 상기 측면 또는 임의의 다른 측면 또는 실시양태의 특정 실시양태에서, 중쇄 가변 영역은 서열번호: 7에 제시된 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 10에 제시된 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
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본원에 개시된 상기 측면 또는 임의의 다른 측면 또는 실시양태의 특정 실시양태에서, 중쇄 가변 영역은 서열번호: 7에 제시된 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 12에 제시된 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
본원에 개시된 상기 측면 또는 임의의 다른 측면 또는 실시양태의 특정 실시양태에서, 중쇄 가변 영역은 서열번호: 7에 제시된 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 13에 제시된 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
특정 측면에서, 본 발명은 인간 EPH 수용체 A5의 에피토프(epitope)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
본원에 개시된 상기 측면 또는 임의의 다른 측면 또는 실시양태의 특정 실시양태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 서열번호: 16에 제시된 서열을 포함하는 중쇄 상보성-결정 영역 1 (HCDR1), 서열번호: 18에 제시된 서열을 포함하는 HCDR2, 서열번호: 20에 제시된 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄를 포함한다.
본원에 개시된 상기 측면 또는 임의의 다른 측면 또는 실시양태의 특정 실시양태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 서열번호: 21에 제시된 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 1 (LCDR1), 서열번호: 23에 제시된 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호: 24에 제시된 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄를 포함한다.
특정 측면에서, 본 발명은 인간 EPH 수용체 A5의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
본원에 개시된 상기 측면 또는 임의의 다른 측면 또는 실시양태의 특정 실시양태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 서열번호: 16에 제시된 서열을 포함하는 중쇄 상보성-결정 영역 1 (HCDR1), 서열번호: 19에 제시된 서열을 포함하는 HCDR2, 서열번호: 20에 제시된 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄를 포함한다.
본원에 개시된 상기 측면 또는 임의의 다른 측면 또는 실시양태의 특정 실시양태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 서열번호: 21에 제시된 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 1 (LCDR1), 서열번호: 23에 제시된 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호: 24에 제시된 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄를 포함한다.
특정 측면에서, 본 발명은 인간 EPH 수용체 A5의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
본원에 개시된 상기 측면 또는 임의의 다른 측면 또는 실시양태의 특정 실시양태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 서열번호: 16에 제시된 서열을 포함하는 중쇄 상보성-결정 영역 1 (HCDR1), 서열번호: 17에 제시된 서열을 포함하는 HCDR2, 서열번호: 20에 제시된 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄를 포함한다.
본원에 개시된 상기 측면 또는 임의의 다른 측면 또는 실시양태의 특정 실시양태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 서열번호: 22에 제시된 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 1 (LCDR1), 서열번호: 23에 제시된 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호: 24에 제시된 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄를 포함한다.
특정 측면에서, 본 발명은 인간 EPH 수용체 A5의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
본원에 개시된 상기 측면 또는 임의의 다른 측면 또는 실시양태의 특정 실시양태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 서열번호: 16에 제시된 서열을 포함하는 중쇄 상보성-결정 영역 1 (HCDR1), 서열번호: 18에 제시된 서열을 포함하는 HCDR2, 서열번호: 20에 제시된 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄를 포함한다.
본원에 개시된 상기 측면 또는 임의의 다른 측면 또는 실시양태의 특정 실시양태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 서열번호: 22에 제시된 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 1 (LCDR1), 서열번호: 23에 제시된 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호: 24에 제시된 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄를 포함한다.
특정 측면에서, 본 발명은 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
본원에 개시된 상기 측면 또는 임의의 다른 측면 또는 실시양태의 특정 실시양태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 서열번호: 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄를 포함한다.
본원에 개시된 상기 측면 또는 임의의 다른 측면 또는 실시양태의 특정 실시양태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 서열번호: 11에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄를 포함한다.
특정 측면에서, 본 발명은 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
본원에 개시된 상기 측면 또는 임의의 다른 측면 또는 실시양태의 특정 실시양태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 서열번호: 6에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄를 포함한다.
본원에 개시된 상기 측면 또는 임의의 다른 측면 또는 실시양태의 특정 실시양태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 서열번호: 11에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄를 포함한다.
본원에 개시된 상기 측면 또는 임의의 다른 측면 또는 실시양태의 특정 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 전장 항체(full-length antibody), Fab, 및 단일쇄(single-chain) 가변 단편 (scFv)으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본원에 개시된 상기 측면 또는 임의의 다른 측면 또는 실시양태의 특정 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 전장 항체이다.
본원에 개시된 상기 측면 또는 임의의 다른 측면 또는 실시양태의 특정 실시양태에서, 항체는 인간화된다.
본원에 개시된 상기 측면 또는 임의의 다른 측면 또는 실시양태의 특정 실시양태에서, 중쇄는 인간 면역글로불린 중쇄의 불변 도메인을 추가로 포함하고 경쇄는 인간 경쇄의 불변 도메인을 추가로 포함한다.
본원에 개시된 상기 측면 또는 임의의 다른 측면 또는 실시양태의 특정 실시양태에서, 인간 면역글로불린 중쇄의 불변 도메인은 IgG1 중쇄로부터의 것이다.
본원에 개시된 상기 측면 또는 임의의 다른 측면 또는 실시양태의 특정 실시양태에서, 인간 면역글로불린 중쇄의 불변 도메인은 서열번호: 14에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
본원에 개시된 상기 측면 또는 임의의 다른 측면 또는 실시양태의 특정 실시양태에서, 인간 경쇄의 불변 도메인은 인간 카파 경쇄로부터이다.
본원에 개시된 상기 측면 또는 임의의 다른 측면 또는 실시양태의 특정 실시양태에서, 인간 경쇄의 불변 도메인은 서열번호: 15에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
특정 측면에서, 본 발명은 인간 EPH 수용체 A5의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
본원에 개시된 상기 측면 또는 임의의 다른 측면 또는 실시양태의 특정 실시양태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 서열번호: 38에 제시된 아미노산 서열과 적어도 약 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 포함하고/하거나, 100% 서열 동일성을 가진 중쇄를 포함한다.
본원에 개시된 상기 측면 또는 임의의 다른 측면 또는 실시양태의 특정 실시양태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 서열번호: 40에 제시된 아미노산 서열과 적어도 약 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 포함하고/하거나, 100% 서열 동일성을 가진 경쇄를 포함한다.
본원에 개시된 상기 측면 또는 임의의 다른 측면 또는 실시양태의 항체 또는 항원-결합 단편의 특정 실시양태에서, 중쇄의 가변 영역은 서열번호: 16에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호: 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호: 20에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함한다.
본원에 개시된 상기 측면 또는 임의의 다른 측면 또는 실시양태의 특정 실시양태에서, 경쇄의 가변 영역은 서열번호: 21에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호: 23에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호: 24에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함한다.
본원에 개시된 상기 측면 또는 임의의 다른 측면 또는 실시양태의 특정 실시양태에서, 중쇄는 서열번호: 38에 제시되고 경쇄는 서열번호: 40에 제시된다.
특정 측면에서, 본 발명은 인간 EPH 수용체 A5의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함한다.
본원에 개시된 상기 측면 또는 임의의 다른 측면 또는 실시양태의 특정 실시양태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 서열번호: 39에 제시된 아미노산 서열과 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 포함하고/하거나, 100% 서열 동일성을 가진 중쇄를 포함한다.
본원에 개시된 상기 측면 또는 임의의 다른 측면 또는 실시양태의 특정 실시양태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 서열번호: 40에 제시된 아미노산 서열과 적어도 약 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 포함하고/하거나, 100% 서열 동일성을 가진 경쇄를 포함한다.
본원에 개시된 상기 측면 또는 임의의 다른 측면 또는 실시양태의 항체 또는 항원-결합 단편의 특정 실시양태에서, 중쇄의 가변 영역은 서열번호: 16에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호: 18에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호: 20에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함한다.
본원에 개시된 상기 측면 또는 임의의 다른 측면 또는 실시양태의 특정 실시양태에서, 경쇄의 가변 영역은 서열번호: 21에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호: 23에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호: 24에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함한다.
본원에 개시된 상기 측면 또는 임의의 다른 측면 또는 실시양태의 특정 실시양태에서, 중쇄는 서열번호: 39에 제시되고 경쇄는 서열번호: 40에 제시된다.
본원에 개시된 상기 측면 또는 임의의 다른 측면 또는 실시양태의 특정 실시양태에서, 인간 EpHA5에 결합하기 위한 해리 상수 (KD)는 1.25 x 10-9 M 미만이다.
본원에 개시된 상기 측면 또는 임의의 다른 측면 또는 실시양태의 특정 실시양태에서, 인간 EpHA5에 결합하기 위한 해리 상수 (KD)는 8 x 10-10 M 내지 1.1 x 10-9 M이다.
본원에 개시된 상기 측면 또는 임의의 다른 측면 또는 실시양태의 특정 실시양태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 참조 항체보다 2배 이내로 더 양호한 인간 EpHA5에 결합하기 위한 해리 상수 (KD)를 가지며, 여기서 참조 항체는 11C12이거나 서열번호: 1에 제시된 가변 중쇄 및 서열번호: 8에 제시된 가변 경쇄를 포함하는 항체이고, 임의로 여기서 참조 항체는 동일한 형태이다.
본원에 개시된 상기 측면 또는 임의의 다른 측면 또는 실시양태의 특정 실시양태에서, 인간 EpHA5에 대한 결합에 대한 해리 상수 (KD)가 참조 항체보다 1.2배 초과로 더 양호하고, 여기서 참조 항체는 11C12이거나 서열번호: 1에 제시된 가변 중쇄 및 서열번호: 8에 제시된 가변 경쇄를 포함하는 항체이고, 임의로 여기서 참조 항체는 동일한 형태이다.
본원에 개시된 상기 측면 또는 임의의 다른 측면 또는 실시양태의 특정 실시양태에서, 해리 상수 (KD)는 비아코어(Biacore)에 의해 결정된다.
본원에 개시된 상기 측면 또는 임의의 다른 측면 또는 실시양태의 특정 실시양태에서, 본원에 개시된 상기 측면 또는 임의의 다른 측면 또는 실시양태 중 임의의 것의 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 참조 항체와 비교하여 증가된 열 안정성(thermal stability)을 나타내고, 여기서 참조 항체는 11C12이거나 서열번호: 1에 제시된 가변 중쇄 및 서열번호: 8에 제시된 가변 경쇄를 포함하는 항체이고, 임의로 여기서 참조 항체는 동일한 형태이다.
본원에 개시된 상기 측면 또는 임의의 다른 측면 또는 실시양태의 특정 실시양태에서, 본원에 개시된 상기 측면 또는 임의의 다른 측면 또는 실시양태 중 임의의 것의 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 참조 항체와 비교하여 5℃ 초과 또는 약 5℃ 초과로 증가되는 Tm1의 용융 온도 프로파일(melting temperature profile)을 가지며, 여기서 참조 항체는 11C12이거나 서열번호: 1에 제시된 가변 중쇄 및 서열번호: 8에 제시된 가변 경쇄를 포함하는 항체이고, 임의로 여기서 참조 항체는 동일한 형태이다.
본원에 개시된 상기 측면 또는 임의의 다른 측면 또는 실시양태의 특정 실시양태에서, 본원에 개시된 상기 측면 또는 임의의 다른 측면 또는 실시양태 중 임의의 것의 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 참조 항체와 비교하여 약 10℃ 초과로 증가되는 Tm1의 용융 온도 프로파일을 가지며, 여기서 참조 항체는 11C12이거나 서열번호: 1에 제시된 가변 중쇄 및 서열번호: 8에 제시된 가변 경쇄를 포함하는 항체이고, 임의로 여기서 참조 항체는 동일한 형태이다.
본원에 개시된 상기 측면 또는 임의의 다른 측면 또는 실시양태의 특정 실시양태에서, 항체 또는 항원-결합 단편의 열 풀림 곡선(thermal unfolding curve)의 Tm1은 60℃ 초과이다.
본원에 개시된 상기 측면 또는 임의의 다른 측면 또는 실시양태의 특정 실시양태에서, 항체 또는 항원-결합 단편의 Tm1은 약 60℃ 내지 약 70℃이다.
본원에 개시된 상기 측면 또는 임의의 다른 측면 또는 실시양태의 특정 실시양태에서, 항체 또는 항원-결합 단편의 Tm1은 약 64℃, 약 65℃, 약 66℃, 약 67℃, 약 68℃, 또는 약 69℃이다.
본원에 개시된 상기 측면 또는 임의의 다른 측면 또는 실시양태의 특정 실시양태에서, 용융 온도 프로파일은 단상(monophasic)이다.
본원에 개시된 상기 측면 또는 임의의 다른 측면 또는 실시양태의 특정 실시양태에서, 응집의 개시 온도 (Tagg)는 참조 항체와 비교하여 약 1℃ 초과, 약 2℃ 초과, 약 3℃ 초과, 약 4℃ 초과 또는 약 5℃ 초과로 증가되며, 여기서 참조 항체는 11C12이거나 서열번호: 1에 제시된 가변 중쇄 및 서열번호: 8에 제시된 가변 경쇄를 포함하는 항체이고, 임의로 여기서 참조 항체는 동일한 형태이다.
본원에 개시된 상기 측면 또는 임의의 다른 측면 또는 실시양태의 특정 실시양태에서, 응집의 개시 온도 (Tagg)는 약 67℃ 초과이다.
본원에 개시된 상기 측면 또는 임의의 다른 측면 또는 실시양태의 특정 실시양태에서, 응집의 개시 온도 (Tagg)는 약 67℃ 내지 약 71℃이다.
특정 실시양태에서 항체 또는 항원-결합 단편의 Tagg는 약 67℃, 약 68℃, 약 69℃, 약 70℃, 또는 약 71℃이다.
본원에 개시된 상기 측면 또는 임의의 다른 측면 또는 실시양태의 특정 실시양태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 세포 표면 인간 EphA5에 결합한다.
본원에 개시된 상기 측면 또는 임의의 다른 측면 또는 실시양태의 특정 실시양태에서, 항체 또는 단편은 참조 항체와 비교하여 증가되는 EC50으로, 세포, 임의로 H460 세포주의 표면 상에 발현된 인간 EphA5와 결합하고, 여기서 참조 항체는 11C12이거나 서열번호: 1에 제시된 가변 중쇄 및 서열번호: 8에 제시된 가변 경쇄를 포함하는 항체이고, 임의로 여기서 참조 항체는 동일한 형태이다.
본원에 개시된 상기 측면 또는 임의의 다른 측면 또는 실시양태의 특정 실시양태에서, 항체 또는 단편은 임의로 유세포 분석법(flow cytometry)에 의해 결정되는 0.020 μg/mL 이하의 EC50으로, 세포, 임의로 H460 세포주의 표면 상에 발현된 인간 EphA5와 결합한다.
본원에 개시된 상기 측면 또는 임의의 다른 측면 또는 실시양태의 특정 실시양태에서, 항체 또는 단편은 임의로 유세포 분석법에 의해 결정되는 약 0.010 μg/mL 내지 0.020 μg/mL의 EC50으로, 세포, 임의로 H460 세포주의 표면 상에 발현된 인간 EphA5와 결합한다.
본원에 개시된 상기 측면 또는 임의의 다른 측면 또는 실시양태의 특정 실시양태에서, 항체 또는 단편은 임의로 유세포 분석법에 의해 결정되는 약 0.015 μg/mL, 약 0.016 μg/mL, 약 0.017 μg/mL, 약 0.018 μg/mL, 약 0.019 μg/mL, 또는 약 0.020 μg/mL의 EC50으로, 세포, 임의로 H460 세포주의 표면 상에 발현된 인간 EphA5와 결합한다.
본원에 개시된 상기 측면 또는 임의의 다른 측면 또는 실시양태의 특정 실시양태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 인간 EphA5 발현-세포에 의해 내재화된다.
특정 측면에서, 본 발명은 본원에 개시된 상기 측면 또는 임의의 다른 측면 또는 실시양태 중 어느 하나의 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 중쇄를 코딩하는 핵산을 포함한다.
특정 측면에서, 본 발명은 본원에 개시된 상기 측면 또는 임의의 다른 측면 또는 실시양태 중 어느 하나의 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 경쇄를 코딩하는 핵산을 포함한다.
특정 측면에서, 본 발명은 본원에 개시된 상기 측면 또는 임의의 다른 측면 또는 실시양태 중 어느 하나의 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 핵산을 포함한다.
특정 측면에서, 본 발명은 본원에 개시된 상기 측면 또는 임의의 다른 측면 또는 실시양태 중 어느 하나의 핵산을 포함하는 벡터(vector)를 포함한다.
본원에 개시된 상기 측면 또는 임의의 다른 측면 또는 실시양태의 특정 실시양태에서, 벡터는 발현 벡터이다.
특정 측면에서, 본 발명은 중쇄를 코딩하는 핵산 및 경쇄를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터로서, 여기서 중쇄 및 경쇄가 본원에 개시된 상기 측면 또는 임의의 다른 측면 또는 실시양태 중 어느 하나의 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 것인 벡터를 포함한다.
본원에 개시된 상기 측면 또는 임의의 다른 측면 또는 실시양태의 특정 실시양태에서, 벡터는 비시스트론 벡터(bicistronic vector)이다.
특정 측면에서, 본 발명은 중쇄를 코딩하는 제1 핵산을 포함하는 제1 벡터 및 경쇄를 코딩하는 제2 핵산을 포함하는 제2 벡터를 포함하는 벡터 시스템으로서, 여기서 중쇄 및 경쇄가 본원에 개시된 상기 측면 또는 임의의 다른 측면 또는 실시양태 중 어느 하나의 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 것인 벡터 시스템을 포함한다.
본원에 개시된 상기 측면 또는 임의의 다른 측면 또는 실시양태의 특정 실시양태에서, 제1 벡터 및 제2 벡터는 각각 발현 벡터이다.
특정 측면에서, 본 발명은 본원에 개시된 상기 측면 또는 임의의 다른 측면 또는 실시양태 중 어느 하나의 벡터를 포함하는 숙주 세포를 포함한다.
본원에 개시된 상기 측면 또는 임의의 다른 측면 또는 실시양태의 특정 실시양태에서, 숙주 세포는 포유동물 세포이다.
특정 측면에서, 본 발명은 본원에 개시된 상기 측면 또는 임의의 다른 측면 또는 실시양태 중 어느 하나의 벡터를 숙주 세포에 도입하는 단계, 상기 숙주 세포로부터의 항체 또는 항원 결합 단편의 발현을 위한 조건 하에 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 항체 또는 항원-결합 단편을 단리 또는 정제하는 단계를 포함하는, 항체를 생산하는 방법을 포함한다.
본원에 개시된 상기 측면 또는 임의의 다른 측면 또는 실시양태의 특정 실시양태에서, 숙주 세포는 포유동물 세포이다.
특정 측면에서, 본 발명은 화학식 Ab-(L-D)를 갖는 면역접합체를 포함한다.
본원에 개시된 상기 측면 또는 임의의 다른 측면 또는 실시양태의 특정 실시양태에서, Ab는 실시양태 1 내지 53 중 어느 한 실시양태의 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다.
본원에 개시된 상기 측면 또는 임의의 다른 측면 또는 실시양태의 특정 실시양태에서, L은 링커(linker)이다.
본원에 개시된 상기 측면 또는 임의의 다른 측면 또는 실시양태의 특정 실시양태에서, D는 세포독성 약물이다.
본원에 개시된 상기 측면 또는 임의의 다른 측면 또는 실시양태의 특정 실시양태에서, 링커는 절단가능한 링커이다.
본원에 개시된 상기 측면 또는 임의의 다른 측면 또는 실시양태의 특정 실시양태에서, 링커는 카텝신-절단가능한 링커이다.
본원에 개시된 상기 측면 또는 임의의 다른 측면 또는 실시양태의 특정 실시양태에서, 카텝신-절단가능한 링커는 발린-시트룰린 (Val-Cit)을 포함한다.
본원에 개시된 상기 측면 또는 임의의 다른 측면 또는 실시양태의 특정 실시양태에서, 링커는 하기 구조식을 갖는 MC-VCP이다:
.
본원에 개시된 상기 측면 또는 임의의 다른 측면 또는 실시양태의 특정 실시양태에서, 링커는 하기 구조식을 포함한다:
또는 .
본원에 개시된 상기 측면 또는 임의의 다른 측면 또는 실시양태의 특정 실시양태에서, 링커는 pH 절단가능한 링커이다.
본원에 개시된 상기 측면 또는 임의의 다른 측면 또는 실시양태의 특정 실시양태에서, 링커는 하기 구조식을 갖는 CL2A이다:
.
본원에 개시된 상기 측면 또는 임의의 다른 측면 또는 실시양태의 특정 실시양태에서, 세포독성 약물은 아우리스타틴이다.
본원에 개시된 상기 측면 또는 임의의 다른 측면 또는 실시양태의 특정 실시양태에서, 아우리스타틴은 하기 구조식을 갖는 모노메틸 아우리스타틴 E (MMAE)이다:
.
본원에 개시된 상기 측면 또는 임의의 다른 측면 또는 실시양태의 특정 실시양태에서, L-D는 하기 구조식을 포함한다:
.
본원에 개시된 상기 측면 또는 임의의 다른 측면 또는 실시양태의 특정 실시양태에서, L-D는 하기 구조식을 포함한다:
.
특정 측면에서, 본 발명은 화학식 Ab-(L-D)를 갖는 면역접합체를 포함한다.
본원에 개시된 상기 측면 또는 임의의 다른 측면 또는 실시양태의 특정 실시양태에서, Ab는 서열번호: 38에 제시된 중쇄 및 서열번호: 40에 제시된 경쇄를 포함하는 인간 EPH 수용체 A5 (EphA5)의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체이다.
본원에 개시된 상기 측면 또는 임의의 다른 측면 또는 실시양태의 특정 실시양태에서, L-D는 하기 구조식을 포함한다:
.
특정 측면에서, 본 발명은 화학식 Ab-(L-D)를 갖는 면역접합체를 포함한다.
본원에 개시된 상기 측면 또는 임의의 다른 측면 또는 실시양태의 특정 실시양태에서, Ab는 서열번호: 39에 제시된 중쇄 및 서열번호: 40에 제시된 경쇄를 포함하는 인간 EPH 수용체 A5 (EphA5)의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체이다.
본원에 개시된 상기 측면 또는 임의의 다른 측면 또는 실시양태의 특정 실시양태에서, L-D는 하기 구조식을 포함한다:
.
본원에 개시된 상기 측면 또는 임의의 다른 측면 또는 실시양태의 특정 실시양태에서, 세포독성 약물은 하기 구조식을 갖는 SN38이다:
.
본원에 개시된 상기 측면 또는 임의의 다른 측면 또는 실시양태의 특정 실시양태에서, L-D는 하기 구조식을 포함한다:
.
본원에 개시된 상기 측면 또는 임의의 다른 측면 또는 실시양태의 특정 실시양태에서, L-D는 하기 구조식을 포함한다:
.
본원에 개시된 상기 측면 또는 임의의 다른 측면 또는 실시양태의 특정 실시양태에서, 항체에 대한 약물의 비는 4이거나 약 4이다.
본원에 개시된 상기 측면 또는 임의의 다른 측면 또는 실시양태의 특정 실시양태에서, 항체에 대한 약물의 비는 8이거나 약 8이다.
특정 측면에서, 본 발명은 본원에 개시된 상기 측면 또는 임의의 다른 측면 또는 실시양태 중 어느 하나의 항체 또는 이의 항원-결합 단편 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 포함한다.
특정 측면에서, 본 발명은 본원에 개시된 상기 측면 또는 임의의 다른 측면 또는 실시양태 중 어느 하나의 면역접합체 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 포함한다.
특정 측면에서, 본 발명은 암의 치료, 개선 및/또는 예방을 필요로 하는 대상체에게 유효량의 본원에 개시된 상기 측면 또는 임의의 다른 측면 또는 실시양태의 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 투여하는 단계를 포함하는, 상기 대상체에서 암을 치료, 개선 및/또는 예방하는 방법을 포함한다.
특정 측면에서, 본 발명은 암의 치료, 개선 및/또는 예방을 필요로 하는 대상체에게 유효량의 본원에 개시된 상기 측면 또는 임의의 다른 측면 또는 실시양태 중 어느 하나의 면역접합체를 투여하는 단계를 포함하는, 상기 대상체에서 암을 치료, 개선 및/또는 예방하는 방법을 포함한다.
특정 측면에서, 본 발명은 암의 치료, 개선 및/또는 예방을 필요로 하는 대상체에게 유효량의 본원에 개시된 상기 측면 또는 임의의 다른 측면 또는 실시양태의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 상기 대상체에서 암을 치료, 개선 및/또는 예방하는 방법을 포함한다.
특정 측면에서, 본 발명은 대상체에게 유효량의 본원에 개시된 상기 측면 또는 임의의 다른 측면 또는 실시양태 중 어느 하나의 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 종양 퇴행(tumor regression)을 유도하는 방법을 포함한다.
특정 측면에서, 본 발명은 종양 퇴행의 유도를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 본원에 개시된 상기 측면 또는 임의의 다른 측면 또는 실시양태 중 어느 하나의 면역접합체를 투여하는 단계를 포함하는, 상기 대상체에서 종양 퇴행을 유도하는 방법을 포함한다.
특정 측면에서, 본 발명은 종양 퇴행의 유도를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 본원에 개시된 상기 측면 또는 임의의 다른 측면 또는 실시양태의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 상기 대상체에서 종양 퇴행을 유도하는 방법을 포함한다.
본원에 개시된 상기 측면 또는 임의의 다른 측면 또는 실시양태의 특정 실시양태에서, 암은 EPH 수용체 A5의 발현과 연관이 있다.
본원에 개시된 상기 측면 또는 임의의 다른 측면 또는 실시양태의 특정 실시양태에서, 종양은 EPH 수용체 A5의 발현과 연관이 있다.
본원에 개시된 상기 측면 또는 임의의 다른 측면 또는 실시양태의 특정 실시양태에서, 종양은 암이다.
본원에 개시된 상기 측면 또는 임의의 다른 측면 또는 실시양태의 특정 실시양태에서, EPH 수용체 A5는 암 세포 상에서 발현된다.
본원에 개시된 상기 측면 또는 임의의 다른 측면 또는 실시양태의 특정 실시양태에서, 암은 폐암(lung cancer), 유방암(breast cancer), 식도암(esophageal cancer), 위암(gastric cancer), 및 난소암(ovarian cancer)으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본원에 개시된 상기 측면 또는 임의의 다른 측면 또는 실시양태의 특정 실시양태에서, 암은 폐암이다.
본원에 개시된 상기 측면 또는 임의의 다른 측면 또는 실시양태의 특정 실시양태에서, 암은 유방암이다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 암의 치료, 개선 및/또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 암을 치료, 개선 및/또는 예방하는데 사용하기 위한, 본원에 개시된 상기 측면 또는 임의의 다른 측면 또는 실시양태 중 어느 하나의 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서, 여기서 암은 EPH 수용체 A5의 발현과 연관이 있고, 여기서 EPH 수용체 A5는 암 세포 상에서 발현되고, 여기서 암은 폐암, 유방암, 식도암, 위암, 및 난소암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 암의 치료, 개선 및/또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 암을 치료, 개선 및/또는 예방하는데 사용하기 위한, 본원에 개시된 상기 측면 또는 임의의 다른 측면 또는 실시양태 중 어느 하나의 면역접합체로서, 여기서 암은 EPH 수용체 A5의 발현과 연관이 있고, 여기서 EPH 수용체 A5는 암 세포 상에서 발현되고, 여기서 암은 폐암, 유방암, 식도암, 위암, 및 난소암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 면역접합체를 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 암의 치료, 개선 및/또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 암을 치료, 개선 및/또는 예방하는데 사용하기 위한, 본원에 개시된 상기 측면 또는 임의의 다른 측면 또는 실시양태 중 어느 하나의 약제학적 조성물로서, 여기서 암은 EPH 수용체 A5의 발현과 연관이 있고, 여기서 EPH 수용체 A5는 암 세포 상에서 발현되고, 여기서 암은 폐암, 유방암, 식도암, 위암, 및 난소암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 약제학적 조성물을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 암의 치료, 개선 및/또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 암을 치료, 개선 및/또는 예방하는데 사용하기 위한, 본원에 개시된 상기 측면 또는 임의의 다른 측면 또는 실시양태 중 어느 하나의 약제학적 조성물로서, 여기서 암은 EPH 수용체 A5의 발현과 연관이 있고, 여기서 EPH 수용체 A5는 암 세포 상에서 발현되고, 여기서 암은 폐암, 유방암, 식도암, 위암, 및 난소암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 약제학적 조성물을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 대상체에서 종양 퇴행을 유도하는데 사용하기 위한, 본원에 개시된 상기 측면 또는 임의의 다른 측면 또는 실시양태 중 어느 하나의 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서, 여기서 종양은 암이고, 여기서 종양은 EPH 수용체 A5의 발현과 연관이 있고, 여기서 EPH 수용체 A5는 암 세포 상에서 발현되고, 여기서 암은 폐암, 유방암, 식도암, 위암, 및 난소암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함한다
특정 실시양태에서, 본 발명은 종양 퇴행의 유도를 필요로 하는 대상체에서 종양 퇴행을 유도하는데 사용하기 위한, 본원에 개시된 상기 측면 또는 임의의 다른 측면 또는 실시양태 중 어느 하나의 면역접합체로서, 여기서 종양은 암이고, 여기서 종양은 EPH 수용체 A5의 발현과 연관이 있고, 여기서 EPH 수용체 A5는 암 세포 상에서 발현되고, 여기서 암은 폐암, 유방암, 식도암, 위암, 및 난소암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 면역접합체를 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 종양 퇴행의 유도를 필요로 하는 대상체에서 종양 퇴행을 유도하는데 사용하기 위한, 본원에 개시된 상기 측면 또는 임의의 다른 측면 또는 실시양태 중 어느 하나의 약제학적 조성물로서, 여기서 종양은 암이고, 여기서 종양은 EPH 수용체 A5의 발현과 연관이 있고, 여기서 EPH 수용체 A5는 암 세포 상에서 발현되고, 여기서 암은 폐암, 유방암, 식도암, 위암, 및 난소암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 약제학적 조성물을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 종양 퇴행의 유도를 필요로 하는 대상체에서 종양 퇴행을 유도하는데 사용하기 위한, 본원에 개시된 상기 측면 또는 임의의 다른 측면 또는 실시양태 중 어느 하나의 약제학적 조성물로서, 여기서 종양은 암이고, 여기서 종양은 EPH 수용체 A5의 발현과 연관이 있고, 여기서 EPH 수용체 A5는 암 세포 상에서 발현되고, 여기서 암은 폐암, 유방암, 식도암, 위암, 및 난소암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 약제학적 조성물을 포함한다.
본 발명의 바람직한 실시양태에 대한 다음의 상세한 설명은 첨부된 도면과 함께 읽을 때 더 잘 이해될 것이다. 본 발명을 예시할 목적으로, 현재 바람직한 실시양태를 도면에 나타냈다. 그러나, 본 발명은 도면에 나타낸 실시양태의 정확한 배열 및 수단에 제한되지 않는다는 것을 이해해야 한다.
도 1은 고처리량(high-throughput) 면역형광 유세포 분석법 검정을 사용하여 VH5/VK3 (H5K3) 항체 결합의 검출을 예시한다.
도 2A-2B는 EphA5 항체의 내재화를 예시한다. 도 2A, H460 세포에서 VH5/VK3 항체의 내재화는 용량 의존적이다. 도 2B, H460 인간 폐암 세포에서 VH5/VK3 및 VH0/VK0 항체의 용량 반응 곡선.
도 3은 항체 VH5/VK3에 대한 MMAE의 접합에 사용되는 티오브릿지(ThioBridge)® 링커-페이로드(payload)의 구조식을 예시한다. 박스 표시는 절단가능한 링커이다.
도 4A-4B는 그린 오브젝트 카운트(Green Object Count)에 의해 측정된 바와 같은 세포 사멸에 대한 VH5/VK3-티오브릿지®-VCP-MMAE의 효과에 대한 시간-경과를 예시한다. 도 4A, H460 세포 (EphA5-양성); 도 4B, H226 (EphA5-음성).
도 5A-5B는 면역접합된 EphA5 항체의 생체내 사용을 예시한다. 종양 보유 마우스를 VH5/VK3-티오브릿지®-VCP-MMAE (도 5A) 또는 동일한 페이로드 MMAE에 접합된 뮤린 11C12 항체 (도 5B)로 처리하였다. 최대 종양 퇴행은 녹색으로 나타냈고; 최대 종양 진행은 적색으로 나타냈다.
도 6은 VH5/VK3-티오브릿지®-(VC-PAB-CO-SN-38)2를 이용한 종양 보유 마우스의 처리를 예시한다. 최대 종양 퇴행이 마우스 1-4, 6-7, 및 9의 경우 나타났고; 최대 종양 진행이 마우스 5 및 8의 경우 나타났다.
도 7은 키메라 (VH0/VK0), 2개의 대조군 (VH1/VK0 및 VH0/VK1) 및 30개의 마우스 11C12 Composite Human™ Ab 변이체를 포함하는 일시적 형질감염 (박스)에 의해 생산된 Ab의 요약 표이다. 인간성 백분율(percentage humanness) (가장 가까운 일치하는 인간 생식계열(germline)에 대한 퍼센트 상동성에 의해 결정된 바와 같음)이 표시된다.
도 8은 인간화 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열: 키메라 (VH0 및 VK0) 및 인간화 변이체 (VH1-VH6 및 VK1-VK5)에 대한 요약 iTope™ 점수를 예시한다.
도 9는 인간 중쇄 발현 벡터 pANTVhG1 및 경쇄 발현 벡터 pANTVK에 대한 플라스미드 맵을 예시한다. VH 및 VK 벡터는 인트론 및 polyA 서열을 혼입한, 가변 및 불변 도메인을 코딩하는 게놈 DNA 단편을 함유한다. 두 쇄 모두의 발현은 EF1a 프로모터에 의해 구동된다.
도 10은 키메라 (VH0/VK0), 2개의 대조군 (VH1/VK0 및 VH0/VK1) 및 30개의 Composite Human™ Ab 변이체의 상청액 IgG 발현 수준 (μg/mL)을 예시하는 표이다.
도 11은 단일 주기 동역학 분석(single cycle kinetic analysis)에 의해 rhEphA5에 대한 인간화 IgG의 결합을 평가하는 데 사용된 비아코어 개략도의 예시이다.
도 12는 1:1 상호작용 결합 동역학 (상부); 적합도(fit) 평가의 근접성(closeness) (하부)을 설명하는 방정식을 예시한다.
도 13은 비아코어 T200을 사용하여 결정된 바와 같은 rhEphA5 항원에 결합하는 키메라 (VH0/VK0) 및 인간화 11C12 변이체 (세포 배양 상청액으로서 테스트됨)의 단일 주기 동역학 파라미터를 예시하는 표이다. 상대(relative) KD는 인간화 변이체의 KD를 동일한 실험에서 검정된 VH0/VK0 (상단 행)의 KD로 나누어 계산하였다. '*'로 표시된 변이체는 키메라 항체의 2배 이내이거나 더 양호한 KD 값을 갖는다. '#'으로 표시된 키메라 및 선택된 변이체는 정제를 위한 주요 리드(lead)로서 식별되었다.
도 14는 rhEphA5 항원에 대한 키메라 (VH0/VK0) 및 인간화 11C12 변이체의 결합에 대한 단일 주기 동역학 미가공 센서그램(raw sensorgram) (회색) 및 1:1 모델 (흑색)로 피팅된 곡선(fitted curve)을 예시한다. 비아코어 T200 상에서 동역학 분석을 수행하였다. 각각의 항체는 증가하는 농도의 항원이 주입되고 단일 오프-레이트(single off-rate)가 결정되기 전에 표준 아민 화학을 사용하여 항-인간 IgG와 커플링된 CM5 칩 상에 포획되었다.
도 15는 CHO 세포에서의 발현 후 키메라 (VH0/VK0) 및 6개 리드 Composite Human™ Ab 변이체의 상청액 IgG 발현 수준 (μg/mL)을 예시하는 표이다.
도 16A-16B는 키메라 (VH0/VK0) 및 인간화 11C12 변이체의 SDS-PAGE 겔의 이미지이다. 1 μg의 각각의 샘플을 다음과 같이 로딩하였다: NuPage 4-12% Bis-Tris 겔 (ThermoFisher, Loughborough, UK) 상에서의 (도 16A) 환원, 및; (도 16B) 비환원 조건. 모든 샘플을 95℃에서 5분 동안 가열하고 NuPAGE 샘플 환원제(Sample Reducing Agent) (ThermoFisher, Loughborough, UK)를 첨가하여 환원을 수행하였다. 겔은 InstantBlue(Expedeon, Swavesey, UK)로 염색하였다. Mk: PAGERuler™ Plus 사전 염색된 단백질 래더(ladder) (ThermoFisher, Loughborough, UK). 환원된 샘플의 경우 각각 50 및 25 kDa의 중쇄 및 경쇄에 상응하는 두 개의 밴드가 존재하였다.
도 17은 단백질 A 포획 정제 후 키메라 (VH0/VK0) 및 인간화 11C12 변이체의 SE-HPLC 분석을 예시한다. 10 μg의 정제된 IgG를 이동상으로사 0.2 M 인산칼륨, pH 6.8, 0.2 M 염화칼륨을 사용하여 Acquity UPLC Protein BEH SEC 200Å 분석 컬럼 (Waters, Hertfordshire, UK) 상에 로딩하였다. 개별 SE-HPLC 크로마토그램을 도 31A-31D에 나타냈다.
도 18은 Hitrap MabSelect PrismA 정제 후 SE-HPLC에 의해 결정된 바와 같은 키메라 (VH0/VK0) 및 인간화 변이체 내에서 관찰된 단량체 항체의 백분율을 예시하는 표이다.
도 19는 비아코어 T200을 사용하여 결정된 바와 같은 EphA5 항원에 결합하는 키메라 (VH0/VK0) 및 인간화 변이체 (정제된 단백질로서 테스트됨)의 다중-주기 동역학 파라미터(Multi-cycle kinetic parameter)를 예시하는 표이다. 상대 KD는 인간화 변이체의 KD를 동일한 실험에서 검정된 VH0VK0 (첫 번째 행)의 KD로 나누어 계산하였다.
도 20은 인간 EphA5에 대한 키메라 항체 및 6개의 정제된 리드 인간화 변이체의 결합에 대한 다중-주기 동역학 미가공 센서그램 및 1:1 모델 (흑색)로 피팅된 곡선을 예시한다. 비아코어 T200 상에서 동역학 분석을 수행하였다. 각각의 IgG는 증가하는 농도의 항원이 주입되기 전에 항-인간 IgG 센서 칩에 포획되었다.
도 21은 UNcle 생체안정성 플랫폼(biostability platform)을 사용하여 결정된 바와 같은, 6개의 정제된 리드 인간화 변이체 및 키메라 항체에 대한 열 안정성 값의 요약을 예시하는 표이다. *는 데이터 불량으로 인해 분석에서 샘플이 제거된 경우를 나타낸다.
도 22A-22B는 다음과 같이 키메라 및 6개의 정제된 리드 인간화 변이체 항체의 열 램프(thermal ramp) 실험을 예시한다: (도 22A) 개별 플롯, 또는 (도 22B); UNcle 생체안정성 플랫폼 상에서 수행된 바와 같이 오버레이된 각각의 변이체의 단일 복제. 샘플은 도 21에 나타낸 평균 및 표준 편차를 사용하여 이중으로 테스트하였다.
도 23A-23B는 (도 23A) H460 (EphA5+) 세포 및 (도 23B) H226 (EphA5-) 세포를 사용하여 테스트한 11C12 양성 대조군 및 MolgG1 비결합 대조군에 대한 MFI 값을 나타내는 용량-반응 곡선을 예시한다.
도 24는 H460 세포주를 사용하여 테스트한 6개 변이체에 대한 MFI 값을 나타내는 용량-반응 곡선을 예시한다.
도 25는 H226 세포주를 사용하여 테스트한 6개 변이체에 대한 MFI 값을 나타내는 용량-반응 곡선을 예시한다.
도 26은 H460 양성 세포주와 H226 음성 세포주를 둘 다 사용하여 테스트한 각각의 샘플에 대한 EC50 값 및 최대 MFI를 예시하는 표이다.
도 27A-27B는 11C12 중쇄 (도 27A) 및 경쇄 (도 27B)에 대한 번역 후(post-translational) 서열 책임 요약(sequence liabilities summaries)을 예시하는 다이어그램이다.
도 28은 키메라 및 복합(composite) 인간 항체 서열의 정렬이다. 키메라와 상이한 잔기는 강조표시되고 CDR은 표시된 상자에 포함된다.
도 29는 인간화 중쇄 가변 영역 서열: 키메라 VH0 및 변이체 VH1-VH6의 iTope™ 분석의 요약을 예시한다. 키메라 VH와의 차이점은 "서열" 열에서 적색으로 강조표시된다. 펩티드는 하나의 아미노산 증분으로 9mer 펩티드로서 테스트되었다. 잠재적으로 면역원성 펩티드를 포함하는 영역은 "iTope" 열에 표시되어 있다. '*' (p1)는 잡다한(promiscuous) 고친화도 MHC 클래스 II 결합 펩티드를 나타내고, '#' (p1)은 잡다한 중간 정도의(moderate) 친화도 MHC 클래스 II 결합 펩티드를 나타낸다. 생식계열 서열에 대한 일치는 "서열" 열에 회색으로 표시된다.
도 30은 인간화 경쇄 가변 영역 서열: 키메라 VK0 및 변이체 VK1-VK5의 iTope™ 분석의 요약을 예시한다. 키메라 VK와의 차이점은 "서열" 열에서 적색으로 강조표시된다. 펩티드는 하나의 아미노산 증분으로 9mer 펩티드로서 테스트되었다. 잠재적으로 면역원성 펩티드를 포함하는 영역은 "iTope" 열에 표시되어 있으며; 적색 (p1)은 잡다한 고친화도 MHC 클래스 II 결합 펩티드를 나타내고, 황색 (p1)은 잡다한 중간 정도의 친화도 MHC 클래스 II 결합 펩티드를 나타낸다. 생식계열 서열에 대한 일치는 "서열" 열에 회색으로 표시된다.
도 31A-31D는 Hitrap MabSelect PrismA 정제된 항체의 SE-HPLC 크로마토그램을 예시한다.
도 32는 VH4Vk3에 대한 접합에 사용되는 말레이미드 링커-페이로드의 구조식을 예시한다.
도 33은 항체 항-EphA5-VH4Vk3 및 VH5Vk3에 대한 접합에 사용되는 티오브릿지® 링커-페이로드의 구조식을 예시한다.
도 34는 VH4Vk3 mAb (상단 스펙트럼) 및 VH4Vk3-MC-VCP-MMAE ADC (하단 스펙트럼)에 대한 디콘볼루션된(deconvoluted) LC-MS 스펙트럼을 예시한다. 샘플을 분석 전 22℃에서 20분 동안 10 mM DTT로 환원시켰다.
도 35는 VH4Vk3-MC-VCP-MMAE ADC (상단 트레이스(top trace)) 및 VH4Vk3 mAb (하단 트레이스(bottom trace))에 대한 소수성 상호작용 크로마토그램 (λ = 280 nm)을 예시한다.
도 36은 VH4Vk3-MC-VCP-MMAE ADC (상단 트레이스) 및 PBS 완충제 (하단 트레이스)에 대한 크기 배제 크로마토그램 (λ = 280 nm)을 예시한다.
도 37은 VH4Vk3-MC-VCP-MMAE ADC (상단 트레이스) 및 PBS 완충제 (하단 트레이스)에 대한 크기 배제 크로마토그램 (λ = 248 nm)을 예시한다.
도 38은 VH4Vk3-티오브릿지®-VCP-MMAE ADC (하단 스펙트럼) 및 VH4Vk3 mAb (상단 스펙트럼)에 대한 디콘볼루션된 LC-MS 스펙트럼을 예시한다.
도 39는 VH4Vk3-티오브릿지®-VCP-MMAE ADC (상단 트레이스) 및 VH4Vk3 mAb (하단 트레이스)에 대한 소수성 상호작용 크로마토그램 (λ = 280 nm)을 예시한다.
도 40은 VH4Vk3-티오브릿지®-VCP-MMAE ADC (상단 트레이스) 및 PBS 완충제 (하단 트레이스)에 대한 크기 배제 크로마토그램 (λ = 280 nm)을 예시한다.
도 41은 VH4Vk3-티오브릿지®-VCP-MMAE ADC (상단 트레이스) 및 PBS 완충제 (하단 트레이스)에 대한 크기 배제 크로마토그램 (λ = 248 nm)을 예시한다.
도 42는 VH5Vk3-티오브릿지®-VCP-MMAE ADC (하단 스펙트럼) 및 VH5Vk3 mAb (상단 스펙트럼)에 대한 디콘볼루션된 LC-MS 스펙트럼을 예시한다.
도 43은 VH5Vk3-티오브릿지®-VCP-MMAE ADC (상단 트레이스) 및 VH5Vk3 mAb (하단 트레이스)에 대한 소수성 상호작용 크로마토그램 (λ = 280 nm)을 예시한다.
도 44는 VH5Vk3-티오브릿지®-VCP-MMAE ADC (상단 트레이스) 및 PBS 완충제 (하단 트레이스)에 대한 크기 배제 크로마토그램 (λ = 280 nm)을 예시한다.
도 45는 VH5Vk3-티오브릿지®-VCP-MMAE ADC (상단 트레이스) 및 PBS 완충제 (하단 트레이스)에 대한 크기 배제 크로마토그램 (λ = 248 nm)을 예시한다.
도 46은 VH4Vk3 mAb (상단 스펙트럼) 및 VH4Vk3-CL2A-SN38 ADC (하단 스펙트럼)에 대한 디콘볼루션된 LC-MS 스펙트럼을 예시한다. 샘플을 분석 전 22℃에서 20분 동안 10 mM DTT로 환원시켰다.
도 47은 VH4Vk3-CL2A-SN38 ADC (상단 트레이스) 및 VH4Vk3 mAb (하단 트레이스)에 대한 소수성 상호작용 크로마토그램 (λ = 280 nm)을 예시한다.
도 48은 VH4Vk3-CL2A-SN38 ADC (상단 트레이스) 및 PBS 완충제 (하단 트레이스)에 대한 크기 배제 크로마토그램 (λ = 280 nm)을 예시한다.
도 49는 VH4Vk3-CL2A-SN38 ADC (상단 트레이스) 및 PBS 완충제 (하단 트레이스)에 대한 크기 배제 크로마토그램 (λ = 366 nm)을 예시한다.
도 50은 VH4Vk3-티오브릿지®-(VCP-SN38)2 ADC (½ mAb 접합체 종)에 대한 디콘볼루션된 LC-MS 스펙트럼을 예시한다.
도 51은 VH4Vk3-티오브릿지®-(VCP-SN38)2 ADC (상단 트레이스) 및 VH4Vk3 mAb (하단 트레이스)에 대한 소수성 상호작용 크로마토그램 (λ = 280 nm)을 예시한다.
도 52는 VH4Vk3-티오브릿지®-(VCP-SN38)2 ADC (상단 트레이스) 및 PBS 완충제 (하단 트레이스)에 대한 크기 배제 크로마토그램 (λ = 280 nm)을 예시한다.
도 53은 VH4Vk3-티오브릿지®-(VCP-SN38)2 ADC (상단 트레이스) 및 PBS 완충제 (하단 트레이스)에 대한 크기 배제 크로마토그램 (λ = 366 nm)을 예시한다.
도 54는 VH5Vk3-티오브릿지®-(VCP-SN38)2 ADC (½ mAb 접합체 종)에 대한 디콘볼루션된 LC-MS 스펙트럼을 예시한다.
도 55는 VH5Vk3-티오브릿지®-(VCP-SN38)2 ADC (상단 트레이스) 및 VH5Vk3 mAb (하단 트레이스)에 대한 소수성 상호작용 크로마토그램 (λ = 280 nm)을 예시한다.
도 56은 VH5Vk3-티오브릿지®-(VCP-SN38)2 ADC (상단 트레이스) 및 PBS 완충제 (하단 트레이스)에 대한 크기 배제 크로마토그램 (λ = 280 nm)을 예시한다.
도 57은 VH5Vk3-티오브릿지®-(VCP-SN38)2 ADC (상단 트레이스) 및 PBS 완충제 (하단 트레이스)에 대한 크기 배제 크로마토그램 (λ = 366 nm)을 예시한다.
도 58은 다중-주기 동역학 분석에 의해 EphA5 항원에 대한 인간화 IgG의 결합을 평가하는 데 사용된 비아코어 개략도의 카툰(cartoon)을 예시한다.
도 59A-59B는 LC-MS 분석 (도 59A) 및 HIC 분석 (도 59B)에 사용된 방정식의 예시이다
도 60은 H4K3 항체의 결합 검증을 예시하는 일련의 그래프 및 표이다.
도 61은 H5K3 항체의 결합 검증을 예시하는 일련의 그래프 및 표이다.
도 62는 표적 단백질에 대한 MAb의 최적화를 예시한다.
도 63은 표적 단백질에 대한 Fab의 최적화를 예시한다.
도 64는 Ab 결합을 위한 일차 잔기의 시각화를 예시하는 다이아그램이다.
도 65는 표적 단백질에 대한 Ab(들)의 결합을 위한 일차 잔기를 열거한 표이다.
도 66은 시험관내에서 VH4Vk3 mAb의 내재화를 예시한다.
도 67은 시험관내에서 VH5Vk3 mAb의 내재화를 예시한다.
도 68은 VH4Vk3-티오브릿지®-VCP-MMAE의 세포독성을 예시한다.
도 69는 VH4Vk3-티오브릿지®-(VCP-SN-38)2의 세포독성을 예시한다.
도 70은 VH5Vk3-티오브릿지®-VCP-MMAE의 세포독성을 예시한다.
도 71은 VH5Vk3-티오브릿지®-(VCP-SN-38)2의 세포독성을 예시한다.
도 72는 인간 폐암의 H522-유래 이종이식 모델에서 VH4Vk3-티오브릿지®-VCP-MMAE의 생체내 효능을 예시한다.
도 73은 처리 전 및 처리 후 종양-보유 마우스의 체중을 예시한다 (도 72 참조)
도 74는 인간 폐암의 H522-유래 이종이식 모델에서 VH4Vk3-티오브릿지®-VCP-MMAE의 효능을 입증하는 두 번째 실험을 예시한다.
도 75는 처리 전 및 처리 후 종양-보유 마우스의 체중을 도시한다 (도 74 참조)
도 76은 인간 폐암의 H522-유래 이종이식 모델에서 VH4Vk3-티오브릿지®-(VCP-SN-38)2의 효능을 예시한다.
도 77은 처리 전 및 처리 후 종양-보유 마우스의 체중을 도시한다 (도 76 참조)
도 78은 인간 폐암의 A549-유래 이종이식 모델에서 VH4Vk3-티오브릿지®-VCP-MMAE의 효능을 예시한다.
도 79는 처리 전 및 처리 후 종양-보유 마우스의 체중을 예시한다 (도 78 참조).
도 80은 인간 폐암의 A549-유래 이종이식 모델에서 VH4Vk3-티오브릿지®-(VCP-SN-38)2의 효능을 예시한다.
도 81은 처리 전 및 처리 후 종양-보유 마우스의 체중을 예시한다 (도 80 참조)
도 82는 인간 폐암의 H460-유래 이종이식 모델에서 VH4Vk3-티오브릿지®-VCP-MMAE의 효능을 예시한다.
도 83은 처리 전 및 처리 후 종양-보유 마우스의 체중을 예시한다 (도 82 참조).
도 84는 인간 폐암의 H460-유래 이종이식 모델에서 VH4Vk3-티오브릿지®-(VCP-SN-38)2의 효능을 예시한다.
도 85는 처리 전 및 처리 후 종양-보유 마우스의 체중을 예시한다 (도 84 참조).
도 86은 인간 폐암의 H522-유래 이종이식 모델에서 VH5Vk3-티오브릿지®-VCP-MMAE의 효능을 예시한다.
도 87은 처리 전 및 처리 후 종양-보유 마우스의 체중을 예시한다 (도 86 참조).
도 88은 인간 폐암의 H522-유래 이종이식 모델에서 VH5Vk3-티오브릿지®-VCP-MMAE의 효능을 입증하는 두 번째 연구를 예시한다.
도 89는 처리 전 및 처리 후 종양-보유 마우스의 체중을 예시한다 (도 88 참조).
도 90은 인간 폐암의 A549-유래 이종이식 모델에서 VH5Vk3-티오브릿지®-VCP-MMAE의 효능을 예시한다.
도 91은 처리 전 및 처리 후 종양-보유 마우스의 체중을 예시한다 (도 90 참조).
도 92는 인간 폐암의 A549-유래 이종이식 모델에서 VH5Vk3-티오브릿지®-(VCP-SN-38)2의 효능을 예시한다.
도 93은 처리 전 및 처리 후 종양-보유 마우스의 체중을 예시한다 (도 92 참조).
도 94는 인간 폐암의 H460-유래 이종이식 모델에서 VH5Vk3-티오브릿지®-VCP-MMAE의 효능을 예시한다. 막대 그래프 분석을 위해 도 5A 참조.
도 95는 처리 전 및 처리 후 종양-보유 마우스의 체중을 예시한다 (도 94 참조).
도 96은 인간 폐암의 H460-유래 이종이식 모델에서 VH5Vk3-티오브릿지®-(VCP-SN-38)2의 효능을 예시한다. 막대 그래프 분석을 위해 도 6 참조.
도 97은 처리 전 및 처리 후 종양-보유 마우스의 체중을 예시한다 (도 96 참조).
도 98은 이종이식된 환자 조직 (PDX)으로부터 유래된 유방의 ER, PR, 및 HER2 음성 (삼중-음성(triple-negative)) 침윤성 유관암(invasive ductal carcinoma)에서 VH4Vk3-티오브릿지®-VCP-MMAE 및 VH5Vk3-티오브릿지®-VCP-MMAE의 효능을 예시한다. 왼쪽의 히스토그램은 이종이식 조직에서의 EphA5 발현을 예시한다. 오른쪽의 성장 곡선은 표시된 MMAE-접합체 처리 및 대조군 마우스에서 이종이식 종양의 성장을 나타낸다. 화살표는 10 mg/kg MMAE-접합체의 5주간 용량의 투여를 나타낸다. PBS를 비히클 대조군으로서 사용하였다.
도 99A-99B는 대조군 IgG 항체를 사용하여 TM00096 PDX 모델로부터의 삼중 음성 유방암 조직의 IHC 염색 (도 99A) 및 EphA5에 선택적으로 결합하는 시판되는 항체를 사용하여 TM00096 PDX 모델로부터의 삼중 음성 유방암 조직의 IHC 염색 (도 99B)을 예시한다.
도 100은 40일의 테스트 기간에 걸쳐 ADC1 또는 PBS (위약)로 5주 동안 매주 처리된 마우스의 종양 부피를 예시한다.
도 101A-101B는 ADC1 또는 PBS (위약)로 처리한 후 TM00096-보유 마우스에서 제거된 종양의 중량 (도 101A) 및 ADC1로의 처리 전후의 TM00096-보유 마우스의 체중 (도 101B)을 예시한다.
도 102는 40일의 테스트 기간에 걸쳐 ADC2 또는 PBS (위약)로 5주 동안 매주 처리된 마우스의 종양 부피를 예시한다.
도 103A-104B는 ADC2 또는 PBS (위약)로 처리 후 TM00096-보유 마우스에서 제거된 종양의 중량 (도 103A) 및 ADC2로의 처리 전후의 TM00096-보유 마우스의 체중 (도 103B)을 예시한다.
도 104A-104B는 24일의 테스트 기간에 걸쳐 ADC3 또는 PBS (위약)로 4주 동안 매주 처리된 TM00096-보유 마우스의 종양 부피 (도 104A) 및 ADC4 또는 PBS (위약)로 4주 동안 매주 처리된 TM00096-보유 마우스의 종양 부피 (도 104B)를 예시한다.
도 105A-105B는 ADC3 또는 PBS (위약)로 처리 후 TM00096-보유 마우스에서 제거된 종양의 중량 (도 105A) 및 ADC4 또는 PBS (위약)로 처리 후 TM00096-보유 마우스에서 제거된 종양의 중량 (도 105B)을 예시한다.
도 106A-106B는 ADC3으로의 처리 전후의 TM00096-보유 마우스의 체중 (도 106A) 및 ADC4로의 처리 전후의 TM00096-보유 마우스의 체중 (도 106B)을 예시한다.
도 107A-107B는 대조군 IgG 항체를 사용한 TM00098 PDX 모델로부터의 삼중 음성 유방암 조직의 IHC 염색 (도 107A), 및 EphA5에 선택적으로 결합하는 시판되는 항체를 사용한 TM00098 PDX 모델로부터의 삼중 음성 유방암 조직의 IHC 염색 (도 107B)을 예시한다.
도 108A-108C는 50일의 테스트 기간에 걸쳐 ADC1 또는 PBS (위약)로 5주 동안 매주 처리된 마우스의 종양 부피 (도 108A), ADC1 또는 PBS (위약)로 처리 후 TM00098-보유 마우스에서 제거된 종양의 중량 (도 108B), 및 ADC1로의 처리 전후의 TM00098-보유 마우스의 체중 (도 108C)을 예시한다.
도 109A-109C는 50일의 테스트 기간에 걸쳐 ADC2 또는 PBS (위약)로 5주 동안 매주 처리된 마우스의 종양 부피 (도 109A), ADC2 또는 PBS (위약)로 처리 후 TM00098-보유 마우스에서 제거된 종양의 중량 (도 109B), 및 ADC2로의 처리 전후의 TM00098-보유 마우스의 체중 (도 109C)을 예시한다.
도 110A-110B는 대조군 IgG 항체를 사용한 (도 110A) 그리고 EphA5에 선택적으로 결합하는 시판되는 항체를 사용한 (도 110B) TM00188 PDX 모델로부터의 종양 조직의 IHC 염색을 예시한다.
도 111A-111C는 50일의 테스트 기간에 걸쳐 ADC1 또는 PBS (위약)로 5주 동안 매주 처리된 마우스의 종양 부피 (도 111A), ADC1 또는 PBS (위약)로 처리 후 TM0188-보유 마우스에서 제거된 종양의 중량 (도 111B), 및 ADC1로의 처리 전후의 TM0188-보유 마우스의 체중 (도 111C)을 예시한다.
도 112A-112C는 50일의 테스트 기간에 걸쳐 ADC2 또는 PBS (위약)로 5주 동안 매주 처리된 TM0188-보유 마우스의 종양 부피 (도 112A), ADC2로의 처리 후 TM0188-보유 마우스에서 제거된 종양의 중량 (도 112B), 및 ADC2로의 처리 전후의 TM0188-보유 마우스의 체중 (도 112C)을 예시한다.
도 113A-113B는 대조군 IgG 항체 (도 113A), 및 EphA5에 선택적으로 결합하는 시판되는 항체 (도 113B)를 사용한 TM00219 PDX 모델로부터의 종양 조직의 IHC 염색을 예시한다.
도 114A-114C는 50일의 테스트 기간에 걸쳐 ADC1 또는 PBS (위약)로 5주 동안 매주 처리된 마우스의 종양 부피 (도 114A), ADC1 또는 PBS (위약)로 처리 후 TM00219-보유 마우스에서 제거된 종양의 중량 (도 114B), 및 ADC1로의 처리 전후의 TM000219-보유 마우스의 체중 (도 114C)을 예시한다.
도 115A-115C는 50일의 테스트 기간에 걸쳐 ADC2 또는 PBS (위약)로 5주 동안 매주 처리된 TM000219-보유 마우스의 종양 부피 (도 115A), ADC2 또는 PBS (위약)로 처리 후 TM000219-보유 마우스에서 제거된 종양의 중량 (도 115B), 및 ADC2로의 처리 전후의 TM000219-보유 마우스의 체중 (도 115C)을 예시한다.
도 116A-116B는 대조군 IgG 항체 (도 116A) 및 EphA5에 선택적으로 결합하는 시판되는 항체 (도 116B)를 사용한 TM00226 PDX 모델로부터의 종양 조직의 IHC 염색을 예시한다
도 117A-117C는 50일의 테스트 기간에 걸쳐 ADC1 또는 PBS (위약)로 5주 동안 매주 처리된 마우스의 종양 부피 (도 117A), ADC1 또는 PBS (위약)로 처리 후 TM00226-보유 마우스에서 제거된 종양의 중량 (도 117B), 및 ADC1로의 처리 전후의 TM00226-보유 마우스의 체중 (도 117C)을 예시한다.
도 118A-118C는 50일의 테스트 기간에 걸쳐 ADC2 또는 PBS (위약)로 5주 동안 매주 처리된 TM00226-보유 마우스의 종양 부피 (도 118A), ADC2로의 처리 후 TM00226-보유 마우스에서 제거된 종양의 중량 (도 118B), 및 ADC2로의 처리 전후의 TM00226-보유 마우스의 체중 (도 118C)을 예시한다.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것들과 유사하거나 등가인 임의의 방법 및 재료가 본 발명의 테스트를 위한 실시에 사용될 수 있긴 하지만, 바람직한 재료 및 방법이 본원에 기재된다. 본 발명을 기재하고 청구함에 있어서, 다음의 용어가 사용될 것이다.
또한, 본원에 사용된 용어는 단지 특정한 실시양태를 기재하기 위한 것이며 제한하려는 의도가 아니라는 점을 이해해야 한다.
관사 "a" 및 "an"은 관사의 문법적 대상 중 하나 또는 하나 초과 (즉, 적어도 하나)을 지칭하기 위해 본원에 사용된다. 예를 들어, "요소"는 하나의 요소 또는 하나 초과의 요소를 의미한다.
본원에서 양, 시간적 지속시간 등과 같은 측정가능한 값을 언급할 때 사용된 바와 같은 "약"은 명시된 값으로부터 ±20% 또는 ±10%, 더욱 바람직하게는 ±5%, 더욱 더 바람직하게는 ±1%, 그리고 더욱 더 바람직하게는 ±0.1%인데, 그 이유는 이러한 변화가 개시된 방법을 수행하는데 적절하기 때문이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "재조합"은 다수의 공급원으로부터 유전적 서열을 모아, 그렇지 않으면 천연 게놈에서는 발견되지 않을 서열을 생성하는, 유전 공학 (예를 들어, 분자 클로닝(molecular cloning))의 인공 (예를 들어, 실험실-유래) 방법에 의해 형성된 핵산 또는 단백질 분자를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "항체"는 항원과 특이적으로 결합하는 면역글로불린 분자를 지칭한다. 항체는 천연 공급원 또는 재조합 공급원으로부터 유래된 무손상 면역글로불린일 수 있으며 무손상 면역글로불린의 면역반응성 부분일 수 있다. 항체는 전형적으로 두 개의 중쇄와 두 개의 경쇄 폴리펩티드를 포함하는 면역글로불린 분자의 사량체이다. 각각의 폴리펩티드 쇄는 항원에 결합하고 항체의 항원 특이성을 정의하는 3개의 상보성-결정 영역 (CDR)을 함유한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "항체" 및 "항체들"은 또한 전장 항체로부터 유래된 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체를 포함할 수 있다. 이들 폴리펩티드 복합체는 자연적으로 발생하거나 단일쇄 항체 또는 항체 단편으로부터 작제될 수 있으며 항원-특이적 결합 능력을 보유한다. 본 발명의 항체는, 예를 들어, 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, Fv, Fab 및 F(ab')2, 뿐만 아니라 단일쇄 항체 (scFv), 인간화 항체, 및 인간 항체를 포함한 다양한 형태로 존재할 수 있다 (Harlow et al., 1999, In: Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Harlow et al., 1989, In: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York; Houston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; Bird et al., 1988, Science 242:423-426). "항체"는 또한 표적에 대해 충분한 친화도를 나타내는 VL 또는 VH 도메인으로 구성된, 단일-도메인 항체, 예컨대 낙타과(camelid) 항체 (Riechmann, 1999, Journal of Immunological Methods 231:25-38), 및 항체 단편으로 형성된 다중특이적 항체를 포함한다. 항체 단편은 또한 인간 항체 또는 인간화 항체, 또는 인간 항체 또는 인간화 항체의 일부를 포함한다.
용어 "항체 단편"은 무손상 항체의 일부를 포함하거나 이로부터 유래된 폴리펩티드를 지칭하며, 무손상 항체의 항원-결합 단편을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "항체 중쇄"는 모든 항체 분자에 이의 자연 발생 입체형태로 존재하는 두 가지 유형의 폴리펩티드 쇄 중 더 큰 것을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 "항체 경쇄"는 모든 항체 분자에 이의 자연 발생 입체형태로 존재하는 두 가지 유형의 폴리펩티드 쇄 중 더 작은 것을 지칭한다. κ 및 λ는 두 가지 주요 항체 경쇄 이소형을 지칭한다.
항원 또는 에피토프에 "특이적으로 결합한다"는 용어는 관련 기술분야에 널리 이해되는 용어이며, 이러한 특이적 결합을 결정하는 방법도 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 항체 또는 항원-결합 단편과 같은 결합 분자는, 그것이 대안적 표적과 하는 것보다 특정한 표적과 더 빈번히, 더 신속하게, 더 긴 지속시간으로 및/또는 더 큰 친화도로 반응하거나 회합하는 경우 "우선적 결합"과 같은 "특이적 결합"을 나타낸다고 언급된다. 항체는 그것이 다른 물질에 결합하는 것보다 더 큰 친화도, 결합력(avidity), 더 쉽게, 및/또는 더 긴 지속시간으로 결합하는 경우 표적에 특이적으로 결합하거나 우선적으로 결합한다. 예를 들어, EphA8에 특이적으로 또는 우선적으로 결합하는 항체는 그것이 비표적 단백질 에피토프에 결합하는 것보다 더 큰 친화도, 결합력, 더 쉽게, 및/또는 더 긴 지속시간으로 EphA8에 결합하는 항체이다. 또한 이 정의를 읽으면; 예를 들어, 제1 표적에 특이적으로 또는 우선적으로 결합하는 결합 분자는 제2 표적에 특이적으로 또는 우선적으로 결합할 수도 있고 그렇지 않을 수도 있다는 것이 이해된다. 또한, 이 정의를 읽으면 특이적 결합 또는 우선적 결합이 반드시 배타적 결합을 요구하지는 않는다는 것 (포함할 수는 있긴 하지만)이 이해된다. 이러한 특이적 또는 우선적 결합을 결정하는 방법, 예를 들어 면역검정(immunoassay)이 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "합성 항체"란 재조합 DNA 기술을 사용하여 생성된 항체, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 박테리오파지에 의해 발현된 항체를 의미한다. 상기 용어는 또한 항체를 코딩하는 DNA 분자의 합성에 의해 생성되고 DNA 분자가 항체 단백질, 또는 항체를 특정하는 아미노산 서열을 발현하는 항체를 의미하는 것으로 해석되어야 하며, 여기서 DNA 또는 아미노산 서열은 관련 기술분야에 이용가능하고 널리 공지된 합성 DNA 또는 아미노산 서열 기술을 사용하여 수득되었다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "항원" 또는 "Ag"는 면역 반응을 유발하는 분자로 정의된다. 이 면역 반응은 항체 생산이나 특이적 면역학적-적격 세포(specific immunologically-competent cell)의 활성화, 또는 둘 다를 포함할 수 있다. 통상의 기술자는 사실상 모든 단백질 또는 펩티드를 포함하는 임의의 거대분자가 항원으로서 역할할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 더욱이, 항원은 재조합 DNA 또는 게놈 DNA로부터 유래될 수 있다. 통상의 기술자는 따라서 면역 반응을 도출하는 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 또는 부분 뉴클레오티드 서열을 포함하는 임의의 DNA가 본원에서 사용되는 용어로서 "항원"을 코딩한다는 것을 이해할 것이다. 더욱이, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 항원이 유전자의 전장 뉴클레오티드 서열에 의해서만 코딩될 필요가 없다는 것을 이해할 것이다. 본 발명은 하나 초과의 유전자의 부분 뉴클레오티드 서열의 사용을 포함하나 이에 제한되지는 않으며 이들 뉴클레오티드 서열은 원하는 면역 반응을 도출하기 위해 다양한 조합으로 배열된다는 것이 쉽게 명백하다. 게다가, 통상의 기술자는 항원이 "유전자"에 의해 코딩될 필요가 전혀 없다는 것을 이해할 것이다. 항원이 합성되어 생성될 수 있거나 생물학적 샘플로부터 유래될 수 있다는 것은 쉽게 명백하다. 이러한 생물학적 샘플은 조직 샘플, 종양 샘플, 세포 또는 생물학적 체액을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "항체-약물 접합체" 또는 "ADC"는 생물학적 활성 약물 분자에 접합된 항체로부터 유래된 항체 또는 항원-결합 폴리펩티드 단편을 포함하는 항체-기반 분자 복합체를 지칭하며, 종종 "페이로드"로 지칭된다. ADC-연관 약물 분자는 종종 기능상 세포독성이며, 이는 ADC 복합체가 특이적 분자 표적을 발현하는 세포, 특히 종양 세포를 사멸할 수 있게 한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "항종양 효과"는 종양 부피 감소, 종양 세포 수 감소, 전이 수 감소, 기대 수명 증가, 또는 암성 상태(cancerous condition)와 연관된 다양한 생리학적 증상의 개선으로 나타날 수 있는 생물학적 효과를 지칭한다. "항종양 효과"는 또한 우선적으로 종양 발생을 예방하는데 있어서 본 발명의 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 세포 및 항체의 능력에 의해 나타날 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "Kd", "KD" 또는 "평형 해리 상수"는 항체의 이의 에피토프에 대한 친화도의 계산된 정량적 측정을 지칭한다. KD는 항체와 이의 에피토프 사이의 결합 속도 (Kon)와 해리 속도 (Koff)의 비율을 나타낸다. KD와 친화도는 높은 친화도 상호작용이 낮은 KD를 특징으로 한다는 점에서 반비례한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "자가유래(autologous)"는 그것이 나중에 개체에 다시 도입되는 동일한 개체로부터 유래된 임의의 물질을 지칭하는 것을 의미한다.
"동종이계(Allogeneic)"는 동일한 종의 상이한 동물로부터 유래된 이식편을 지칭한다.
"이종발생성(Xenogeneic)"은 상이한 종의 동물로부터 유래된 이식편을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "암"은 이상 세포의 신속하고 제어되지 않는 성장을 특징으로 하는 질환으로서 정의된다. 암 세포는 국소적으로 또는 혈류와 림프계를 통해 신체의 다른 부위로 퍼질 수 있다. 다양한 암의 예는 유방암, 전립선암, 난소암, 자궁경부암, 피부암, 췌장암, 대장암(colorectal cancer), 신장암, 간암, 뇌암, 림프종, 백혈병, 폐암 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 특정 실시양태에서, 암은 갑상선 수질 암종(medullary thyroid carcinoma)이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "보존적 서열 변형"은 아미노산 서열을 함유하는 항체의 결합 특성에 유의한 영향을 미치거나 변경시키지 않는 아미노산 변형을 지칭하는 것으로 의도된다. 이러한 보존적 변형은 아미노산 치환, 부가 및 결실을 포함한다. 부위-지정 돌연변이유발 및 PCR-매개 돌연변이유발과 같은 관련 기술분야에 공지된 표준 기술에 의해 변형이 본 발명의 항체에 도입될 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체되는 치환이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리가 관련 기술분야에 정의되어 있다. 이들 패밀리는 염기성 측쇄 (예를 들어, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄 (예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 전하를 띠지 않은 극성 측쇄 (예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 트립토판), 비극성 측쇄 (예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), 베타-분지 측쇄 (예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄 (예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 가진 아미노산을 포함한다. 따라서, 본 발명의 항체의 CDR 영역 내의 하나 이상의 아미노산 잔기는 동일한 측쇄 패밀리로부터의 다른 아미노산 잔기로 대체될 수 있고 변경된 항체는 본원에 기재된 기능 검정을 사용하여 EPH 수용체 A5와 같은 에피토프에 결합하는 능력에 대해 테스트될 수 있다.
EphA5의 발현 또는 활성 수준과 관련하여 사용될 때 용어 "조절장애(dysregulated)"는 달리 동일한 건강한 동물, 유기체, 조직, 세포 또는 그 구성요소에서 EphA5의 발현 수준 또는 활성과 상이한 발현 또는 활성 수준을 지칭한다. 용어 "조절 장애"는 또한 달리 동일한 건강한 동물, 유기체, 조직, 세포 또는 이의 구성요소에서의 조절과 비교하여 EphA5의 발현 및 활성 수준의 변경된 조절을 지칭한다. 특정 실시양태에서, 발현 또는 활성의 조절장애는 EphA5의 발현 수준 또는 활성이 암 세포 내에서 조절장애가 있는 암을 포함한 질환 상태와 연관이 있다.
"코딩"은 정의된 뉴클레오티드 서열 또는 정의된 아미노산 서열을 갖는 생물학적 과정에서 다른 중합체 및 거대분자의 합성을 위한 주형 역할을 하는 유전자, cDNA, 또는 mRNA (즉, rRNA, tRNA 및 mRNA)와 같은 폴리뉴클레오티드에서의 특정 뉴클레오티드 서열의 고유 특성 및 이로부터 발생하는 생물학적 특성을 지칭한다. 따라서, 해당 유전자에 상응하는 mRNA의 전사 및 번역이 세포 또는 기타 생물학적 시스템에서 단백질을 생산하는 경우 유전자는 단백질을 코딩한다. 이의 뉴클레오티드 서열이 mRNA 서열과 동일하고 대개 서열 목록에 제공되는 코딩 가닥, 및 유전자 또는 cDNA의 전사를 위한 주형으로 사용되는 비코딩 가닥 둘 다는, 단백질 또는 해당 유전자 또는 cDNA의 기타 생성물을 코딩하는 것으로 지칭될 수 있다.
달리 명시하지 않는 한, "아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열"은 서로의 축퇴 버전(degenerate version)이고 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 모든 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 단백질과 RNA를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 인트론을 포함할 수 있다.
"유효량" 또는 "치료학적 유효량"은 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 특정한 생물학적 결과를 달성하는데 효과적인 본원에 기재된 바와 같은, 화합물, 제형, 물질, 또는 조성물의 양을 지칭한다. 이러한 결과는 관련 기술분야에 적합한 임의의 수단에 의해 결정된 바와 같이 바이러스 감염의 억제를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 바와 같이 "내인성"은 유기체, 세포, 조직 또는 시스템으로부터 생성되거나 그 내부에서 생산된 임의의 물질을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "외인성"은 유기체, 세포, 조직 또는 시스템으로부터 도입되나 그 외부에서 생산된 임의의 물질을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "발현"은 이의 프로모터에 의해 구동되는 특정한 뉴클레오티드 서열의 전사 및/또는 번역으로서 정의된다.
"발현 벡터"는 발현될 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 발현 조절 서열을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 지칭한다. 발현 벡터는 발현을 위한 충분한 시스-작용 요소를 포함하며; 발현을 위한 다른 요소는 숙주 세포에 의해 또는 시험관내 발현 시스템에서 공급될 수 있다. 발현 벡터는 재조합 폴리뉴클레오티드를 혼입하는, 코스미드, 플라스미드 (예를 들어, 네이키드(naked) 또는 리포솜에 함유됨) 및 바이러스 (예를 들어, 렌티바이러스, 레트로바이러스, 아데노바이러스(adenovirus), 및 아데노-연관 바이러스(adeno-associated virus))와 같은 관련 기술분야에 공지된 모든 것들을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 "상동성"은 두 개의 중합체 분자 사이, 예를 들어 두 개의 DNA 분자 또는 두개의 RNA 분자와 같은 두 개의 핵산 분자 사이, 또는 두 개의 폴리펩티드 분자 사이의 서브유닛 서열 동일성을 지칭한다. 두 분자 모두의 서브유닛 위치가 동일한 단량체 서브유닛에 의해 점유되는 경우; 예를 들어, 두 DNA 분자 각각의 위치가 아데닌에 의해 점유되어 있다면, 해당 위치에서 이들은 상동성이다. 두 서열 간의 상동성은 일치하는 위치 또는 상동성 위치 수의 직접적인 함수이며; 예를 들어, 두 서열의 위치 중 절반 (예를 들어, 길이가 10개의 서브유닛인 중합체의 5개 위치)이 상동성인 경우, 두 서열은 50% 상동성이고; 위치의 90% (예를 들어, 10개 중 9개)가 일치하거나 상동성인 경우, 두 서열은 90% 상동성이다.
비인간 (예를 들어, 뮤린) 항체의 "인간화" 및 "키메라" 형태는 면역글로불린, 면역글로불린 쇄 또는 이의 단편 (예컨대 Fv, Fab, Fab', F(ab')2 또는 항체의 기타 항원-결합 하위 서열)이며 이들은 비인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유한다. 대부분의 경우, 인간화 및 키메라 항체는 수용자의 상보적-결정 영역 (CDR)의 잔기가 비인간 종 예컨대 원하는 특이성, 친화도, 및 능력을 갖는 마우스, 래트 또는 토끼의 CDR (공여자 항체)로부터의 잔기로 대체된 인간 면역글로불린 (수용자 항체)이다. 일부 경우에, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 영역 (FR) 잔기가 상응하는 비인간 잔기로 대체된다. 더욱이, 인간화 및 키메라 항체는 수용자 항체나 내수송된(imported) CDR 또는 프레임워크 서열 모두에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이들 변형은 항체 성능을 더욱 개선하고 최적화하기 위해 이루어졌다. 일반적으로, 인간화 및 키메라 항체는 적어도 1개, 및 전형적으로 2개의 가변 도메인을 실질적으로 전부 포함할 것이며, 여기서 CDR 영역의 전부 또는 실질적으로 전부는 비인간 면역글로불린의 것들에 상응하고, FR 영역의 전부 또는 실질적으로 전부는 인간 면역글로불린 서열의 것들이다. 인간화 및 키메라 항체는 또한 최적으로 면역글로불린 불변 영역 (Fc)의 적어도 일부, 전형적으로 인간 면역글로불린의 일부를 포함할 것이다. 세계보건기구(World Health Organization) (WHO) 국제일반명(International Nonproprietary Name) (INN) 전문가 그룹은 비인간 유래 항체에 대한 요건을 "인간화"된 것으로 간주하도록 정의하였다. 지침에 따르면, 후보 항체와 인간 서열의 비교는 International Immunogenetics Information System® (IMGT®) DomainGapAlign 툴 (www.imgt.org)을 통해 수행되어야 한다. 이 툴은 정렬 점수가 생식계열 서열 가변 영역 엑손에 대해서만 작성되어, 분석으로부터 CDR3 및 J 영역의 일부를 생략하는 항체 생식계열 가변 영역 유전자의 IMGT® 데이터베이스를 조사한다. 항체가 "인간화"되려면, "다른 종보다 인간에 더 가깝다"는 것 외에도, 최고 "적중(hit)"이 인간이어야 하고 인간 서열과의 동일성이 적어도 85%여야 하며, 그렇지 않으면 항체가 "키메라"로 지정될 것이다. 추가 세부사항에 대해서는, [Jones et al., Nature, 321: 522-525, 1986; Reichmann et al., Nature, 332: 323-329, 1988; Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596, 1992]을 참조한다.
"완전 인간(Fully human)"은 전체 분자가 인간 기원이거나 인간 형태의 항체와 동일한 아미노산 서열로 이루어진 항체와 같은 면역글로불린을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 "동일성"은 두 개의 중합체 분자 사이, 특히 두 개의 아미노산 분자 사이, 예컨대 두 개의 폴리펩티드 분자 사이의 서브유닛 서열 동일성을 지칭한다. 두 개의 아미노산 서열이 동일한 위치에 동일한 잔기를 갖는 경우; 예를 들어 두 개의 폴리펩티드 분자 각각의 위치가 아르기닌에 의해 점유되어 있다면, 해당 위치에서 이들은 동일하다. 두 개의 아미노산 서열이 정렬의 동일한 위치에 동일한 잔기를 갖는 동일성 또는 정도는 종종 백분율로 표시된다. 두 아미노산 서열 간의 동일성은 일치하거나 동일한 위치 수의 직접적인 함수이며; 예를 들어, 두 서열의 위치 중 절반 (예를 들어 길이가 10개 아미노산인 중합체의 5개 위치)이 동일하면, 두 서열은 50% 동일하고; 위치의 90% (예를 들어, 10개 중 9개)가 일치하거나 동일하면, 두 아미노산 서열은 90% 동일하다.
"단리된"이란 자연 상태에서 변경되거나 제거된 것을 의미한다. 예를 들어, 살아있는 동물에 자연적으로 존재하는 핵산 또는 펩티드는 "단리"되지 않지만, 이의 자연 상태의 공존 물질로부터 부분적으로 또는 완전히 분리된 동일한 핵산 또는 펩티드는 "단리"된다. 단리된 핵산 또는 단백질은 실질적으로 정제된 형태로 존재할 수 있거나, 예를 들어 숙주 세포와 같은 비천연 환경에 존재할 수 있다.
본 발명의 맥락에서, 통상적으로 발생하는 핵산 염기에 대해 다음의 약어가 사용된다. "A"는 아데노신을 지칭하고, "C"는 시토신을 지칭하고, "G"는 구아노신을 지칭하고, "T"는 티미딘을 지칭하고, "U"는 우리딘을 지칭한다.
달리 명시하지 않는 한, "아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열"은 서로의 축퇴 버전이고 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 모든 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 단백질 또는 RNA를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이라는 어구는 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 일부 버전에서 인트론(들)을 함유할 수 있는 정도로 인트론을 또한 포함할 수 있다.
용어 "작동가능하게 연결된"은 조절 서열과 이종 핵산 서열 사이의 기능적 연결을 지칭하며, 후자의 발현을 초래한다. 예를 들어, 제1 핵산 서열이 제2 핵산 서열과 기능적 관계에 위치할 때 제1 핵산 서열은 제2 핵산 서열과 작동가능하게 연결된다. 예를 들어, 프로모터가 코딩 서열의 전사 또는 발현에 영향을 미치는 경우 프로모터는 코딩 서열(coding sequence)에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, 작동가능하게 연결된 DNA 서열은 인접하며, 두 개의 단백질 코딩 영역을 연결하는 데 필요한 경우 동일한 판독 프레임에 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "폴리뉴클레오티드"는 뉴클레오티드 쇄로 정의된다. 더욱이, 핵산은 뉴클레오티드의 중합체이다. 따라서, 본원에 사용된 바와 같은 핵산 및 폴리뉴클레오티드는 상호교환가능하다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 핵산이 단량체성 "뉴클레오티드"로 가수분해될 수 있는 폴리뉴클레오티드라는 일반적인 지식을 가지고 있다. 단량체성 뉴클레오티드는 뉴클레오시드로 가수분해될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이 폴리뉴클레오티드는, 일반적인 클로닝 기술과 PCR™ 등을 사용하여, 그리고 합성 수단에 의해, 재조합 수단, 즉 재조합 라이브러리 또는 세포 게놈으로부터의 핵산 서열의 클로닝을, 제한 없이, 포함하는 관련 기술분야에서 이용가능한 임의의 수단에 의해 수득되는 모든 핵산 서열을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "펩티드", "폴리펩티드", 및 "단백질"은 상호교환적으로 사용되며, 펩티드 결합에 의해 공유적으로 연결된 아미노산 잔기로 구성된 화합물을 지칭한다. 단백질 또는 펩티드는 적어도 2개의 아미노산을 포함해야 하며, 단백질 또는 펩티드의 서열을 포함할 수 있는 아미노산의 최대 수에 대한 어떠한 제한도 없다. 폴리펩티드는 펩티드 결합에 의해 서로 연결된 2개 이상의 아미노산을 포함하는 임의의 펩티드 또는 단백질을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 상기 용어는, 예를 들어, 관련 기술분야에서 또한 통상적으로 펩티드, 올리고펩티드 및 올리고머로 지칭되는 단쇄, 및 일반적으로 관련 기술분야에서 단백질로 지칭되는 장쇄 둘 다를 지칭하며, 이의 많은 유형이 있다. "폴리펩티드"는, 그 중에서도, 예를 들어, 생물학적 활성 단편, 실질적으로 상동성인 폴리펩티드, 올리고펩티드, 동종이량체, 이종이량체, 폴리펩티드의 변이체, 변형된 폴리펩티드, 유도체, 유사체, 융합 단백질 등을 포함한다. 폴리펩티드는 천연 펩티드, 재조합 펩티드, 합성 펩티드, 또는 이의 조합을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "프로모터"는 폴리뉴클레오티드 서열의 특정 전사를 개시하는데 필요한, 세포의 합성 기구, 또는 도입된 합성 기구에 의해 인식되는 DNA 서열로 정의된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "프로모터/조절 서열"은 프로모터/조절 서열에 작동가능하게 연결된 유전자 생성물의 발현에 필요한 핵산 서열을 의미한다. 일부 경우에, 이 서열은 핵심 프로모터 서열일 수 있고, 다른 경우에, 이 서열은 또한 유전자 생성물의 발현에 필요한 인핸서 서열 및 기타 조절 요소를 포함할 수 있다. 프로모터/조절 서열은, 예를 들어, 조직 특이적 방식으로 유전자 생성물을 발현하는 서열일 수 있다.
"구성적" 프로모터는 유전자 생성물을 코딩하거나 특정하는 폴리뉴클레오티드와 작동가능하게 연결될 때 세포의 대부분 또는 모든 생리학적 조건 하에 세포에서 유전자 생산물이 생산되도록 하는 뉴클레오티드 서열이다.
"유도성" 프로모터는 유전자 생성물을 코딩하거나 특정하는 폴리뉴클레오티드와 작동가능하게 연결될 때 프로모터에 상응하는 유도인자가 세포에 존재할 때만 실질적으로 세포에서 유전자 생산물이 생산되도록 하는 뉴클레오티드 서열이다.
"조직-특이적" 프로모터는 유전자를 코딩하거나 유전자에 의해 특정되는 폴리뉴클레오티드와 작동가능하게 연결될 때 세포가 프로모터에 상응하는 조직 유형의 세포인 경우에만 실질적으로 세포에서 유전자 생산물이 생산되도록 하는 뉴클레오티드 서열이다.
"단일쇄 항체"는 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 단편이 조작된 아미노산 범위(span)를 사용하여 서로 연결되어 항체의 Fv 영역을 단일 폴리펩티드로 요약하는 재조합 DNA 기술에 의해 형성된 항체를 지칭한다. 단일쇄 항체를 생성하는 다양한 방법이 공지되어 있으며, 상기 방법은 미국 특허 번호 4,694,778; 문헌 [Bird (1988) Science 242:423-442; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; Ward et al. (1989) Nature 334:54454; Skerra et al. (1988) Science 242:1038-1041]에 기재된 것들을 포함한다.
용어 "대상체"는 면역 반응이 도출될 수 있는 살아있는 유기체 (예를 들어, 포유동물)를 포함하도록 의도된다. 본원에 사용된 바와 같은, "대상체" 또는 "환자"는 인간 또는 비인간 포유동물일 수 있다. 비인간 포유동물은, 예를 들어, 가축 및 애완동물, 예컨대 양, 소, 돼지, 개, 고양이 및 뮤린 포유동물을 포함한다. 바람직하게는, 대상체는 인간이다.
본원에 사용된 바와 같이, "실질적으로 정제된" 세포는 본질적으로 다른 세포 유형이 없는 세포이다. 실질적으로 정제된 세포는 또한 자연 발생 상태에서 일반적으로 연관되어 있는 다른 세포 유형으로부터 분리된 세포를 지칭한다. 일부 경우에, 실질적으로 정제된 세포 집단(population)은 균질한 세포 집단을 지칭한다. 다른 경우에, 이 용어는 단순히 이의 자연 상태에서 자연적으로 결합되어 있는 세포로부터 분리된 세포를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 세포는 시험관내에서 배양된다. 다른 실시양태에서, 세포는 시험관내에서 배양되지 않는다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "치료적"은 치료 및/또는 예방을 의미한다. 치료 효과는 질환 상태의 억제, 관해, 또는 근절에 의해 수득된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "치료하는"은 질환 상태를 개선하거나 예방할 목적으로 수행되는 의학적 개입을 지칭할 수 있다. 상기 용어는 질환 또는 병태 또는 장애, 또는 증상, 부작용 또는 결과, 또는 이와 연관이 있는 표현형의 완전한 또는 부분적인 개선 또는 감소를 지칭한다. 치료의 바람직한 효과는 질환의 발생 또는 재발 방지, 증상의 완화, 질환의 임의의 직간접적인 병리학적 결과의 감소, 전이 예방, 질환 진행 속도 감소, 질환 상태의 개선 또는 완화, 및 관해 또는 예후 개선을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 상기 용어는 질환의 완전한 치유 또는 모든 증상이나 결과에 대한 임의의 증상이나 영향(들)의 완전한 제거를 의미하지는 않는다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "형질감염된", "형질전환된" 또는 "형질도입된"은 외인성 핵산이 숙주 세포 내로 전달되거나 도입되는 과정을 지칭한다. "형질감염된" 또는 "형질전환된" 또는 "형질도입된" 세포는 외인성 핵산으로 형질감염된, 형질전환된 또는 형질도입된 세포이다. 세포는 일차 대상 세포 및 이의 자손을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 문구 "전사 제어 하에" 또는 "작동적으로 연결된"은 프로모터가 RNA 폴리머라제에 의한 전사 개시 및 폴리뉴클레오티드의 발현을 제어하기 위해 폴리뉴클레오티드와 관련하여 올바른 위치 및 배향에 있음을 의미한다.
"벡터"는 단리된 핵산을 포함하고 이는 단리된 핵산을 세포 내부로 전달하는 데 사용될 수 있는 물질의 조성물이다. 선형 폴리뉴클레오티드, 이온성 또는 양친매성 화합물과 연관이 있는 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 및 바이러스를 포함하나, 이에 제한되지는 않는 수많은 벡터가 관련 기술분야에 공지되어 있다. 따라서, 용어 "벡터"는 자율적으로 복제되는 플라스미드 또는 바이러스를 포함한다. 상기 용어는 또한 핵산의 세포 내로의 전달을 촉진하는 비플라스미드 및 비바이러스성 화합물, 예컨대, 예를 들어, 폴리리신 화합물, 리포솜 등을 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 바이러스 벡터의 예는 아데노바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "특이적으로 결합한다"는 샘플에 존재하는 동족 결합 파트너(예를 들어, T 세포 상에 존재하는 자극 및/또는 공동자극 분자) 단백질을 인식하여 결합하는 항체, 또는 리간드이나, 이 항체, 또는 리간드가 샘플 내 다른 분자를 실질적으로 인식하거나 결합하지 않는, 항체, 또는 리간드를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"은 항원 특이성 및 결합 친화도를 부여하는 항체 가변 영역 내의 아미노산 서열을 지칭한다. 예를 들어, 일반적으로, 각각의 중쇄 가변 영역 (예를 들어, HCDR1, HCDR2 및 HCDR3)에는 3개의 CDR이 있고 각각의 경쇄 가변 영역 (LCDR1, LCDR2 및 LCDR3)에는 3개의 CDR이 있다. 소정의 CDR의 정확한 아미노산 서열 경계는 문헌 [Kabat et al. (1991), "Sequences of Proteins of Immunological Interest," 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD ("Kabat" numbering scheme), Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273,927-948 ("Chothia" numbering scheme)]에 기재된 것들, 또는 이의 조합을 포함한, 다수의 널리 공지된 체계 중 임의의 것을 사용하여 결정할 수 있다.
Kabat 및 Clothia 넘버링 시스템은 또한 프레임워크 영역 (FR) 등과 같은 항체 또는 항체-유래 단편의 다른 특징의 위치를 결정하는 데 사용될 수 있다.
용어 "열 융점(thermal melting point)" 또는 "열 용융 온도(thermal melting temperature)" (종종 "Tm" 또는 "Tmelt"로 약칭)는, 본원에 사용되는 경우, 단백질이 4차, 3차, 및 이차 구조가 소실되는 풀림 과정인 변성을 겪는 온도를 지칭한다. 단백질의 Tm은 트립토판과 티로신 잔기로 인한 고유 형광의 변화를 관찰하여 직접 측정할 수 있다. 형광을 기반으로 한 이러한 Tm 검정은 단백질 작제물(construct)의 안정성 순위를 매기거나 상이한 제형을 비교하여 다양한 조건을 최적화하는 데 사용할 수 있다. Tm을 측정하는 다른 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 정적 광산란(static light scattering) (SLS), 동적 광산란(dynamic light scattering) (DLS), 시차 주사 열량측정법(differential scanning calorimetry), 원형 이색성(circular dichromism) 등을 포함하나 이에 제한되지는 않으며 본 발명의 항체 및 항체-유래 단편의 Tm을 결정하는 데 사용될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "열 응집(thermal aggregation)" 또는 "열 응집 온도(thermal aggregation temperature)" (종종 "Tagg"로 약칭됨)는 현탁액 중의 단백질 분자가 올리고머화 또는 응집되기 시작하는 온도를 지칭한다. Tagg가 발생하는 온도는 단백질 자체의 물리적 특성과 완충제 용액의 조성에 따라 달라진다.
범위: 본 개시내용에 전체에 걸쳐, 본 발명의 다양한 측면이 범위 형식으로 제시될 수 있다. 범위 형식의 설명은 단지 편의와 간결성을 위한 것이며 본 발명의 범위에 대한 융통성 없는 제한으로 해석되어서는 안 된다는 점을 이해해야 한다. 따라서, 범위에 대한 설명은 가능한 모든 하위 범위뿐만 아니라 그 범위 내의 개별 수치도 구체적으로 개시한 것으로 간주되어야 한다. 예를 들어, 1 내지 6과 같은 범위에 대한 기재는 1 내지 3, 1 내지 4, 1 내지 5, 2 내지 4, 2 내지 6, 3 내지 3 등과 같은 하위 범위, 뿐만 아니라 해당 범위 내의 개별 숫자, 예를 들어, 1, 2, 2.7, 3, 4, 5, 5.3 및 6을 구체적으로 개시한 것으로 간주되어야 한다. 이는 범위의 폭에 상관 없이 적용된다.
설명
본원에는 EphA5에 결합하고 암과 같은 질환 또는 병태를 치료, 개선 및/또는 예방하기 위해 EphA5를 표적화하는 데 사용될 수 있는 항체 (항원-결합 항체 단편 및 면역접합체 (예를 들어, 항체 약물 접합체) 포함)와 같은 결합 분자가 제공된다. 또한, 항체를 코딩하는 핵산 분자가 제공된다. 또한, 항체 및 항원-결합 단편뿐만 아니라 항체 및 항원-결합 단편을 함유하는 면역접합체 (예를 들어, 항체 약물 접합체)를 제조하고 사용하는 방법이 제공된다. 또한, 이러한 항체 또는 항원-결합 단편 또는 상기 항체 또는 항원-결합 단편을 함유하는 면역접합체 (예를 들어, 항체 약물 접합체)를 함유하는 약제학적 조성물을 포함한 조성물이 제공된다. 일부 측면에서, 제공된 조성물, 항체 또는 항원-결합 단편 또는 상기 항체 또는 항원-결합 단편을 함유하는 면역접합체 (예를 들어, 항체 약물 접합체)는 요법 또는 치료, 개선 및/또는 예방 방법과 관련하여 사용될 수 있다.
본 발명은 인간 EPH 수용체 A5에 특이적인 인간화 항체 또는 항체 유래 항원-결합 단편이 EPH 수용체 A5의 발현과 연관이 있는 암 및 질환을 치료, 개선 및/또는 예방하는 데 사용될 수 있다는 관찰을 기반으로 한다. 본 발명의 항체는 또한 이에 유용한 항체 약물 접합체에 사용될 수 있다. 또한, 암의 치료, 개선 및/또는 예방을 위한 본 발명의 인간 EPH 수용체 A5 특이적 항체 또는 항원-결합 단편을 포함하는 방법 및 조성물이 제공된다.
에프린 A형 수용체 5 및 EphA5라고도 불리는 EPH 수용체 A5는 인간의 EPHA5 유전자에 의해 코딩되는(encoded) 단백질이며 단백질-티로신 키나제의 에프린 수용체 패밀리의 구성원이다. 이 패밀리의 수용체는 주로 발달 중에, 특히 신경계에서 신호전달 사건을 중재하는 데 관여하는 것으로 공지되어 있다. EPH 수용체 A5를 포함한 에프린 패밀리 구성원은 전형적으로 단일 키나제 도메인과 시스틴이 풍부한 도메인과 두 개의 피브로넥틴 유형 III 반복부를 포함하는 세포외 도메인을 보유한다. 에프린 수용체는 이의 세포외 도메인이 에프린-A 또는 에프린-B 리간드에 대해 가지는 친화도에 따라 두 가지 주요 그룹으로 조직화된다. EPH 수용체 A5에 대한 리간드를 포함한 에프린 리간드는 막 고정이라는 독특한 특성을 공유한다. 에프린-A 패밀리의 리간드는 GPI 연결을 통해 막에 연결되며, 한편 에프린-B 패밀리의 리간드는 막횡단 단백질이다.
인간 암에서, EPHA5 과발현은, 예를 들어, 유방암, 간암, 뇌암, 및 폐암과 연결되어 있으며, 여기서 EPHA5의 억제는 일반적으로 종양 세포의 성장 감소를 야기한다. 폐암에 대한 최근 연구는 EPH 수용체 A5가 DNA 손상 반응 (DDR)을 활성화시키고 증진시킴으로써 방사선 저항성과 치료의 주요 조절인자임을 확인하였다. 따라서, 특히 특정 항체 (예를 들어, 본 발명의 항체 및 이의 항원-결합 단편)에 의한, EPH 수용체 A5 억제와 관련된 제공된 실시양태는 단독으로 그리고 또한 다른 세포독성 요법 및 치료와 조합하여 감작 치료로서 종양 성장을 늦출 수 있다. 따라서, 특정 측면에서, 본 발명은 암 치료를 위한 EPH 수용체 A5의 억제에 유용한 인간 EPH 수용체 A5 항체 및 이의 항원-단편을 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 EPH 수용체 A5 항체는 EPH 수용체 A5 특이적 항체가 EPH 수용체 A5-발현 세포, 특히 암 세포를 사멸시키는 작용을 하는 세포독성제에 접합된 항체 약물 접합체에 사용될 수 있다.
제공된 항체 (예를 들어, 본 발명의 항체 및 이의 항원-결합 단편), 뿐만 아니라 이를 함유하는 항체 약물 접합체는 EphA5에 대한 기존 항체 및 이와 관련된 면역접합체와 비교하여 유리한 특징을 나타낸다. 특히, 제공된 실시양태는 증가된 입체형태적 안정성, 감소된 면역원성 위험 및 이에 따라 치료제로 사용하기에 적합한 바람직한 제조가능 특성 및 특징과 함께 EphA5에 대한 고친화도 표적 결합을 보유하는 새로운 항체-기반 분자를 생성한다. 특히, 제공된 항체 (예를 들어, 항체 및 이의 항원-결합 단편)는 인간화되어 뮤린 항체와 같은 기존의 다른 EphA5 항체와 비교하여 면역원성이 감소된 인간에게 투여하기에 적합하게 만들어졌다. 게다가, 인간화는 약물 생산 및 전달 동안 표적 결합 친화도, 응집, 화학적 안정성, 및/또는 물리적 안정성을 감소시킬 수 있는 항체의 특정 특성에 영향을 미치는 것으로 공지되어 있지만, 본원에 제공된 항체는 모(parental) 항체 또는 참조 항체 (예를 들어, 11C12)와 비교하여 개선된 하나 이상의 특징을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 예를 들어, 제공된 항체는 참조 항체 (예를 들어, 뮤린 11C12 항체의 가변 중쇄 및 경쇄를 가진 항체)와 비교하여 인간 EphA5에 대한 개선된 결합 친화도를 나타낸다. 또한, 제공된 항체는 개선된 열 안정성 (예를 들어, 참조 11C12 항체와 비교하여 더 높은 Tm 및 Tagg)으로 입증되는 바와 같이 이의 안정성의 개선을 또한 나타낸다. 입체형태적 안정성은 성공적인 항체 안정화를 위한 대리 측정으로서 통상적으로 사용되는 데 그 이유는 열 안정성은 높은 발현, 더 쉬운 정제, 더 긴 보관 수명 및 최적의 약동학적/약력학적 특성과 상관관계가 있기 때문이다 (Goswami et al. (2013) Antibodies 2:452:500; Thiagarajan et al. (2016) MAbs 8:1088-1097). 마지막으로, 제공된 항체 중에는 표적 세포 상의 세포 표면 EphA5에 특이적으로 결합할 수 있고 결합된 세포 내로 내재화될 수 있는 항체가 있다. EphA5는 암 세포 상에서 고도로 발현되므로, 제공된 항체 약물 접합체는 EphA5를 과발현하는 암 세포를 인식하고 결합된 ADC를 쉽게 내재화하여 암 세포에 대한 세포독성 효과를 시작할 수 있다.
따라서, 제공된 항체 중에는 감소된 면역원성, EphA5 표적에 대한 더 높은 결합 친화도, 더 양호한 열 안정성 및 EphA5-발현 세포에 의해 내재화되는 능력의 개선된 특징 중 하나 이상, 또는 일부 경우에 모두를 나타내는 항체가 있다. 예를 들어, 이러한 특징을 나타내는 제공된 항체 중에는 VH5/VK3 및 VH4/VK3으로 지정된 항체가 있다. 일부 실시양태에서, 또한 세포독성 약물에 연결된 제공된 항체 (예를 들어, VH5/VK3 또는 VH4/VK3)를 함유하는 항체 약물 접합체 (ADC) 및 EphA5-발현 암, 예컨대 폐암을 치료, 개선 및/또는 예방하기 위한 이의 용도가 제공된다.
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항체 및 항원-결합 단편
본원에는 에프린 A형 수용체 5 (EphA5)에 결합하는 결합 폴리펩티드가 제공된다. 예를 들어, 결합 폴리펩티드 및 항체는 인간 EPH 수용체 A5에 특이적으로 결합한다. 이러한 결합 폴리펩티드는 인간 EphA5와 같은 EphA5에 특이적으로 결합하는 항체 (이의 항원-결합 단편 포함)를 포함한다. 제공된 실시양태에서, 본원에 제공된 항-EphA5 항체 또는 항원-결합 단편은 인간화 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항-EphA5 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간 EPH 수용체 A5 단백질에 결합한다. 일부 실시양태에서 인간 EPH 수용체 A5 단백질은 서열번호: 41에 제시된 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 결합 폴리펩티드 및 항체는 인간 EPH 수용체 A5에 높은 친화도로 결합한다. 바람직하게는, 본 발명의 결합 폴리펩티드 및 항체는 세포 상에서 자연적으로 발현된 인간 EPH 수용체 A5 단백질을 특이적으로 인식하고 해당 세포 상의 다른 표면 분자와 교차-반응하지 않는다.
특정 측면에서, 본 발명은 인간 EPH 수용체 A5 (EPHA5)의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항원-결합 도메인을 포함하는 항체를 제공한다. 특정 실시양태에서, 항원-결합 도메인은 3개의 중쇄 상보성-결정 영역 (HCDR)을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 3개의 경쇄 상보성-결정 영역 (LCDR)을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, 가변 도메인 서열 및 전장 항체 서열의 아미노산 잔기는 Kabat 넘버링 규칙에 따라 넘버링된다 [Kabat et al. (1991), "Sequences of Proteins of Immunological Interest," 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. Kabatet al. (1991)]. Kabat 넘버링 체계 하에, 일부 실시양태에서, 중쇄 가변 도메인 (VH) 내의 CDR 아미노산 잔기는 31-35/35A/35B (HCDR1), 50-65 (HCDR2), 및 95-102 (HCDR3)으로 넘버링되고; 경쇄 가변 도메인 (VL) 내의 CDR 아미노산 잔기는 24-34 (LCDR1), 50-56 (LCDR2), 및 89-97 (LCDR3)으로 넘버링된다. Kabat 넘버링 시스템을 사용하면, 펩티드의 실제 선형 아미노산 서열은 가변 도메인의 프레임워크 (FR) 또는 CDR의 단축 또는 삽입에 상응하는 더 적거나 추가의 아미노산을 함유할 수 있다. 예를 들어, 중쇄 가변 도메인은 CDR H2의 잔기 52 뒤의 아미노산 삽입 (Kabat에 따른 잔기 52a, 52b 및 52c) 및 중쇄 FR 잔기 82 뒤에 삽입된 잔기 (예를 들어, Kabat에 따른 잔기 82a, 82b 및 82c 등)를 포함할 수 있다. 잔기의 Kabat 넘버링은 항체 서열의 상동성 영역을 "표준" Kabat 넘버링 서열과 정렬함으로써 소정의 항체에 대해 결정될 수 있다.
그러나, CDR 서열이 Kabat 넘버링 규칙에 따라 예시되긴 하지만, 가변 도메인 서열 및 전장 항체 서열의 아미노산 잔기에 대한 대안적인 넘버링 규칙이 있다는 것이 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 예를 들어, 대안적인 넘버링 규칙은 예를 들어 문헌 [Chothia et al. (1989) Nature 342:877-883]에 제시된 바와 같은 Chothia 넘버링 체계이다. Chothia 넘버링 체계 하에, 일부 실시양태에서, VH 내의 CDR 아미노산은 26-32/33/34 (HCDR1), 52-56 (HCDR2), 및 95-102 (HCDR3)로 넘버링되며; 경쇄 가변 도메인 (VL) 내의 CDR 아미노산 잔기는 24-34 (LCDR1), 50-56 (LCDR2), 및 89-97 (LCDR3)로 넘버링된다. 일부 예에서, 가변 도메인 서열 및 전장 항체 서열의 아미노산 잔기는 Chothia 및 Kabat CDR 정의 둘 다의 조합에 따라 넘버링된다. 조합된 Kabat 및 Chothia 넘버링 체계에서, 일부 실시양태에서, CDR은 Kabat CDR, Chothia CDR, 또는 둘 다의 일부인 아미노산 잔기에 상응한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, CDR은 VH, 예를 들어 포유동물 VH, 예를 들어 인간화 VH 내의 아미노산 잔기 26-35/35A/35B (HCDR1), 50-65 (HCDR2), 및 95-102 (HCDR3); 및 VL, 예를 들어 포유동물 VL, 예를 들어 인간화 VL 내의 아미노산 잔기 24-34 (LCDR1), 50-56 (LCDR2), 및 89-97 (LCDR3)에 상응한다.
통상의 기술자가 이용가능한 CDR 서열에 대한 다른 넘버링 규칙은, 예를 들어, "AbM" (university of Bath) 및 "contact" (University College London) 방법을 포함한다. 데이터베이스는 Kabat 넘버링, Chechia 또는 기타 넘버링 체계를 기반으로 CDR을 식별하는 것과 같은 CDR 식별에 사용될 수 있다. 또한, 일부 경우에, 다른 잔기는 사용된 특정한 규칙 및 항체의 구조 및 단백질 폴딩과 같은 인자에 따라 CDR 서열의 일부이며 통상의 기술자라면 그렇게 이해할 것으로 이해된다.
특정 측면에서, 본 발명은 아미노산 서열 TFGIH (서열번호: 16) 또는 GFTFSTFGIH (서열번호: 42)을 포함하는 HCDR1을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다. 또한, 아미노산 서열 YISGASTTIYYADTVKG (서열번호: 17), YISGASTTIYYADSVKG (서열번호: 18), 또는 SISGASTTIYYADSVKG (서열번호: 19)을 포함하는 HCDR2를 포함하는 단리된 결합 폴리펩티드가 제공된다. 또한, 아미노산 서열 YGTSFPYGLDY (서열번호: 20)을 포함하는 HCDR3을 포함하는 단리된 결합 폴리펩티드가 제공된다. 또한, 아미노산 서열 KASQSVDYDGDSYMN (서열번호: 21) 또는 KSSQSVDYDGDSYMN (서열번호: 22)을 포함하는 LCDR1을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 단리된 결합 폴리펩티드가 제공된다. 또한, 아미노산 서열 GASNLES (서열번호: 23)을 포함하는 LCDR2를 포함하는 단리된 결합 폴리펩티드가 제공된다. 또한, 아미노산 서열 QQSNEDPFT (서열번호: 24)을 포함하는 LCDR3을 포함하는 단리된 결합 폴리펩티드가 제공된다.
특정 측면에서, 본 발명은 아미노산 서열 TFGIH (서열번호: 16)을 포함하는 HCDR1, 아미노산 서열 YISGASTTIYYADTVKG (서열번호: 17)을 포함하는 HCDR2, 아미노산 서열 YGTSFPYGLDY (서열번호: 20)을 포함하는 HCDR3, 아미노산 서열 KASQSVDYDGDSYMN (서열번호: 21)을 포함하는 LCDR1, 아미노산 서열 GASNLES (서열번호: 23)을 포함하는 LCDR2, 및 아미노산 서열 QQSNEDPFT (서열번호: 24)을 포함하는 LCDR3을 포함하는 항체를 제공한다.
특정 측면에서, 본 발명은 아미노산 서열 GFTFSTFGIH (서열번호: 42)을 포함하는 HCDR1, 아미노산 서열 YISGASTTIYYADTVKG (서열번호: 17)을 포함하는 HCDR2, 아미노산 서열 YGTSFPYGLDY (서열번호: 20)을 포함하는 HCDR3, 아미노산 서열 KASQSVDYDGDSYMN (서열번호: 21)을 포함하는 LCDR1, 아미노산 서열 GASNLES (서열번호: 23)을 포함하는 LCDR2, 및 아미노산 서열 QQSNEDPFT (서열번호: 24)을 포함하는 LCDR3을 포함하는 항체를 제공한다.
특정 측면에서, 본 발명은 아미노산 서열 TFGIH (서열번호: 16)을 포함하는 HCDR1, 아미노산 서열 YISGASTTIYYADSVKG (서열번호: 18)을 포함하는 HCDR2, 아미노산 서열 YGTSFPYGLDY (서열번호: 20)을 포함하는 HCDR3, 아미노산 서열 KASQSVDYDGDSYMN (서열번호: 21)을 포함하는 LCDR1, 아미노산 서열 GASNLES (서열번호: 23)을 포함하는 LCDR2, 및 아미노산 서열 QQSNEDPFT (서열번호: 24)을 포함하는 LCDR3을 포함하는 항체를 제공한다.
특정 측면에서, 본 발명은 아미노산 서열 GFTFSTFGIH (서열번호: 42)을 포함하는 HCDR1, 아미노산 서열 YISGASTTIYYADSVKG (서열번호: 18)을 포함하는 HCDR2, 아미노산 서열 YGTSFPYGLDY (서열번호: 20)을 포함하는 HCDR3, 아미노산 서열 KASQSVDYDGDSYMN (서열번호: 21)을 포함하는 LCDR1, 아미노산 서열 GASNLES (서열번호: 23)을 포함하는 LCDR2, 및 아미노산 서열 QQSNEDPFT (서열번호: 24)을 포함하는 LCDR3을 포함하는 항체를 제공한다.
특정 측면에서, 본 발명은 아미노산 서열 TFGIH (서열번호: 16)을 포함하는 HCDR1, 아미노산 서열 SISGASTTIYYADSVKG (서열번호: 19)을 포함하는 HCDR2, 아미노산 서열 YGTSFPYGLDY (서열번호: 20)을 포함하는 HCDR3, 아미노산 서열 KASQSVDYDGDSYMN (서열번호: 21)을 포함하는 LCDR1, 아미노산 서열 GASNLES (서열번호: 23)을 포함하는 LCDR2, 및 아미노산 서열 QQSNEDPFT (서열번호: 24)을 포함하는 LCDR3을 포함하는 항체를 제공한다.
특정 측면에서, 본 발명은 아미노산 서열 GFTFSTFGIH (서열번호: 42)을 포함하는 HCDR1, 아미노산 서열 SISGASTTIYYADSVKG (서열번호: 19)을 포함하는 HCDR2, 아미노산 서열 YGTSFPYGLDY (서열번호: 20)을 포함하는 HCDR3, 아미노산 서열 KASQSVDYDGDSYMN (서열번호: 21)을 포함하는 LCDR1, 아미노산 서열 GASNLES (서열번호: 23)을 포함하는 LCDR2, 및 아미노산 서열 QQSNEDPFT (서열번호: 24)을 포함하는 LCDR3을 포함하는 항체를 제공한다.
특정 측면에서, 본 발명은 아미노산 서열 TFGIH (서열번호: 16)을 포함하는 HCDR1, 아미노산 서열 YISGASTTIYYADTVKG (서열번호: 17)을 포함하는 HCDR2, 아미노산 서열 YGTSFPYGLDY (서열번호: 20)을 포함하는 HCDR3, 아미노산 서열 KSSQSVDYDGDSYMN (서열번호: 22)을 포함하는 LCDR1, 아미노산 서열 GASNLES (서열번호: 23)을 포함하는 LCDR2, 및 아미노산 서열 QQSNEDPFT (서열번호: 24)을 포함하는 LCDR3을 포함하는 항체를 제공한다.
특정 측면에서, 본 발명은 아미노산 서열 GFTFSTFGIH (서열번호: 42)을 포함하는 HCDR1, 아미노산 서열 YISGASTTIYYADTVKG (서열번호: 17)을 포함하는 HCDR2, 아미노산 서열 YGTSFPYGLDY (서열번호: 20)을 포함하는 HCDR3, 아미노산 서열 KSSQSVDYDGDSYMN (서열번호: 22)을 포함하는 LCDR1, 아미노산 서열 GASNLES (서열번호: 23)을 포함하는 LCDR2, 및 아미노산 서열 QQSNEDPFT (서열번호: 24)을 포함하는 LCDR3을 포함하는 항체를 제공한다.
특정 측면에서, 본 발명은 아미노산 서열 TFGIH (서열번호: 16)을 포함하는 HCDR1, 아미노산 서열 YISGASTTIYYADSVKG (서열번호: 18)을 포함하는 HCDR2, 아미노산 서열 YGTSFPYGLDY (서열번호: 20)을 포함하는 HCDR3, 아미노산 서열 KSSQSVDYDGDSYMN (서열번호: 22)을 포함하는 LCDR1, 아미노산 서열 GASNLES (서열번호: 23)을 포함하는 LCDR2, 및 아미노산 서열 QQSNEDPFT (서열번호: 24)을 포함하는 LCDR3을 포함하는 항체를 제공한다.
특정 측면에서, 본 발명은 아미노산 서열 GFTFSTFGIH (서열번호: 42)을 포함하는 HCDR1, 아미노산 서열 YISGASTTIYYADSVKG (서열번호: 18)을 포함하는 HCDR2, 아미노산 서열 YGTSFPYGLDY (서열번호: 20)을 포함하는 HCDR3, 아미노산 서열 KSSQSVDYDGDSYMN (서열번호: 22)을 포함하는 LCDR1, 아미노산 서열 GASNLES (서열번호: 23)을 포함하는 LCDR2, 및 아미노산 서열 QQSNEDPFT (서열번호: 24)을 포함하는 LCDR3을 포함하는 항체를 제공한다.
특정 측면에서, 본 발명은 아미노산 서열 TFGIH (서열번호: 16)을 포함하는 HCDR1, 아미노산 서열 SISGASTTIYYADSVKG (서열번호: 19)을 포함하는 HCDR2, 아미노산 서열 YGTSFPYGLDY (서열번호: 20)을 포함하는 HCDR3, 아미노산 서열 KSSQSVDYDGDSYMN (서열번호: 22)을 포함하는 LCDR1, 아미노산 서열 GASNLES (서열번호: 23)을 포함하는 LCDR2, 및 아미노산 서열 QQSNEDPFT (서열번호: 24)을 포함하는 LCDR3을 포함하는 항체를 제공한다.
특정 측면에서, 본 발명은 아미노산 서열 GFTFSTFGIH (서열번호: 42)을 포함하는 HCDR1, 아미노산 서열 SISGASTTIYYADSVKG (서열번호: 19)을 포함하는 HCDR2, 아미노산 서열 YGTSFPYGLDY (서열번호: 20)을 포함하는 HCDR3, 아미노산 서열 KSSQSVDYDGDSYMN (서열번호: 22)을 포함하는 LCDR1, 아미노산 서열 GASNLES (서열번호: 23)을 포함하는 LCDR2, 및 아미노산 서열 QQSNEDPFT (서열번호: 24)을 포함하는 LCDR3을 포함하는 항체를 제공한다.
상보성 결정 영역 (CDR) 서열의 허용가능한 변형은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있을 것이다. 예를 들어, 일부 실시양태에서 폴리펩티드는 서열번호: 16 또는 42, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 또는 24에 제시된 아미노산 서열 중 임의의 것과 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 (HCDR 또는 LCDR)을 포함한다.
특정 실시양태에서, 결합 폴리펩티드, 예컨대 제공된 항체 또는 항원-결합 단편은, 서열번호: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7에 제시된 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖고/갖거나, 100% 동일성을 갖는, 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, 결합 폴리펩티드, 예컨대 제공된 항체 또는 항원-결합 단편은, 서열번호: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, 결합 폴리펩티드, 예컨대 제공된 항체 또는 항원-결합 단편은, 서열번호: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변 영역을 갖는다.
특정 실시양태에서, 결합 폴리펩티드, 예컨대 제공된 항체 또는 항원-결합 단편은, 서열번호: 8, 9, 10, 11, 12, 또는 13에 제시된 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖고/갖거나, 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, 결합 폴리펩티드, 예컨대 제공된 항체 또는 항원-결합 단편은, 서열번호: 8, 9, 10, 11, 12, 또는 13 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, 결합 폴리펩티드, 예컨대 항체 또는 항원-결합 단편은, 서열번호: 8, 9, 10, 11, 12, 또는 13 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변 영역을 갖는다.
제공된 결합 폴리펩티드 중에는 인간화 항체가 있다. 일부 실시양태에서, 결합 폴리펩티드, 예컨대 항체 또는 이의 항원-결합 단편은, 상기 HCDR 중 임의의 것을 포함하고 아미노산이 서열번호: 1과 100% 이하의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역, 및 상기 LCDR 중 임의의 것을 포함하고 아미노산 서열이 서열번호: 8과 100% 이하의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중쇄 가변 영역은 서열번호: 1과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중쇄 가변 영역은 서열번호: 1과 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 중쇄 가변 영역은 서열번호: 1과 적어도 86%, 87%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93% 94%, 또는 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 경쇄 가변 영역은 서열번호: 8과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 경쇄 가변 영역은 서열번호: 8과 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 경쇄 가변 영역은 서열번호: 8과 적어도 86%, 87%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93% 94%, 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, 결합 폴리펩티드, 예컨대 제공된 항체 또는 항원-결합 단편은, 서열번호: 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7에 제시된 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖고/갖거나, 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, 결합 폴리펩티드, 예컨대 제공된 항체 또는 항원-결합 단편은, 서열번호: 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, 결합 폴리펩티드, 예컨대 제공된 항체 또는 항원-결합 단편은, 서열번호: 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변 영역을 갖는다.
특정 실시양태에서, 결합 폴리펩티드, 예컨대 제공된 항체 또는 항원-결합 단편은, 서열번호: 9, 10, 11, 12, 또는 13에 제시된 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖고/갖거나, 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, 결합 폴리펩티드, 예컨대 제공된 항체 또는 항원-결합 단편은, 서열번호: 9, 10, 11, 12, 또는 13 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, 결합 폴리펩티드, 예컨대 항체 또는 항원-결합 단편은, 서열번호: 9, 10, 11, 12, 또는 13 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변 영역을 갖는다.
일부 실시양태에서, 결합 폴리펩티드, 예컨대 항-EphA5 항체 또는 항원-결합 단편은, 서열번호: 2에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖고/갖거나, 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가진 중쇄 가변 영역 및 서열번호: 9에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중쇄 가변 영역은 서열번호: 2에 제시되고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 9에 제시된다. 일부 실시양태에서, 항체는 항체 H1K1. 예컨대 전장 인간화 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다.
일부 실시양태에서, 결합 폴리펩티드, 예컨대 항-EphA5 항체 또는 항원-결합 단편은, 서열번호: 2에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖고/갖거나, 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가진 중쇄 가변 영역 및 서열번호: 10에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖고/갖거나, 100% 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중쇄 가변 영역은 서열번호: 2에 제시되고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 10에 제시된다. 일부 실시양태에서, 항체는 항체 H1K2, 예컨대 전장 인간화 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다.
일부 실시양태에서, 결합 폴리펩티드, 예컨대 항-EphA5 항체 또는 항원-결합 단편은, 서열번호: 2에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖고/갖거나, 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가진 중쇄 가변 영역 및 서열번호: 11에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖고/갖거나, 100% 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중쇄 가변 영역은 서열번호: 2에 제시되고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 11에 제시된다. 일부 실시양태에서, 항체는 항체 H1K3, 예컨대 전장 인간화 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다.
일부 실시양태에서, 결합 폴리펩티드, 예컨대 항-EphA5 항체 또는 항원-결합 단편은, 서열번호: 2에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖고/갖거나, 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가진 중쇄 가변 영역 및 서열번호: 12에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖고/갖거나, 100% 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중쇄 가변 영역은 서열번호: 2에 제시되고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 12에 제시된다. 일부 실시양태에서, 항체는 항체 H1K4, 예컨대 전장 인간화 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다.
일부 실시양태에서, 결합 폴리펩티드, 예컨대 항-EphA5 항체 또는 항원-결합 단편은, 서열번호: 2에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖고/갖거나, 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가진 중쇄 가변 영역 및 서열번호: 13에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖고/갖거나, 100% 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중쇄 가변 영역은 서열번호: 2에 제시되고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 13에 제시된다. 일부 실시양태에서, 항체는 항체 H1K5, 예컨대 전장 인간화 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다.
일부 실시양태에서, 결합 폴리펩티드, 예컨대 항-EphA5 항체 또는 항원-결합 단편은, 서열번호: 3에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖고/갖거나, 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가진 중쇄 가변 영역 및 서열번호: 9에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖고/갖거나, 100% 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역을 갖는다. 일부 실시양태에서, 중쇄 가변 영역은 서열번호: 3에 제시되고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 9에 제시된다. 일부 실시양태에서, 항체는 항체 H2K1, 예컨대 전장 인간화 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다.
일부 실시양태에서, 결합 폴리펩티드, 예컨대 항-EphA5 항체 또는 항원-결합 단편은, 서열번호: 3에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖고/갖거나, 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가진 중쇄 가변 영역 및 서열번호: 10에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖고/갖거나, 100% 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중쇄 가변 영역은 서열번호: 3에 제시되고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 10에 제시된다. 일부 실시양태에서, 항체는 항체 H2K2, 예컨대 전장 인간화 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다.
일부 실시양태에서, 결합 폴리펩티드, 예컨대 항-EphA5 항체 또는 항원-결합 단편은, 서열번호: 3에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖고/갖거나, 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가진 중쇄 가변 영역 및 서열번호: 11에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖고/갖거나, 100% 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중쇄 가변 영역은 서열번호: 3에 제시되고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 11에 제시된다. 일부 실시양태에서, 항체는 항체 H2K3, 예컨대 전장 인간화 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다.
일부 실시양태에서, 결합 폴리펩티드, 예컨대 항-EphA5 항체 또는 항원-결합 단편은, 서열번호: 3에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖고/갖거나, 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가진 중쇄 가변 영역 및 서열번호: 12에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖고/갖거나, 100% 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중쇄 가변 영역은 서열번호: 3에 제시되고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 12에 제시된다. 일부 실시양태에서, 항체는 항체 H2K4, 예컨대 전장 인간화 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다.
일부 실시양태에서, 결합 폴리펩티드, 예컨대 항-EphA5 항체 또는 항원-결합 단편은, 서열번호: 3에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖고/갖거나, 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가진 중쇄 가변 영역 및 서열번호: 13에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖고/갖거나, 100% 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중쇄 가변 영역은 서열번호: 3에 제시되고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 13에 제시된다. 일부 실시양태에서, 항체는 항체 H2K5, 예컨대 전장 인간화 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다.
일부 실시양태에서, 결합 폴리펩티드, 예컨대 항-EphA5 항체 또는 항원-결합 단편은, 서열번호: 4에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖고/갖거나, 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가진 중쇄 가변 영역 및 서열번호: 9에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖고/갖거나, 100% 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중쇄 가변 영역은 서열번호: 4에 제시되고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 9에 제시된다. 일부 실시양태에서, 항체는 항체 H3K1, 예컨대 전장 인간화 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다.
일부 실시양태에서, 결합 폴리펩티드, 예컨대 항-EphA5 항체 또는 항원-결합 단편은, 서열번호: 4에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖고/갖거나, 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가진 중쇄 가변 영역 및 서열번호: 10에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖고/갖거나, 100% 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중쇄 가변 영역은 서열번호: 4에 제시되고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 10에 제시된다. 일부 실시양태에서, 항체는 항체 H3K2, 예컨대 전장 인간화 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다.
일부 실시양태에서, 결합 폴리펩티드, 예컨대 항-EphA5 항체 또는 항원-결합 단편은, 서열번호: 4에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖고/갖거나, 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가진 중쇄 가변 영역 및 서열번호: 11에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖고/갖거나, 100% 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중쇄 가변 영역은 서열번호: 4에 제시되고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 11에 제시된다. 일부 실시양태에서, 항체는 항체 H3K3, 예컨대 전장 인간화 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다.
일부 실시양태에서, 결합 폴리펩티드, 예컨대 항-EphA5 항체 또는 항원-결합 단편은, 서열번호: 4에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖고/갖거나, 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가진 중쇄 가변 영역 및 서열번호: 12에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖고/갖거나, 100% 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중쇄 가변 영역은 서열번호: 4에 제시되고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 12에 제시된다. 일부 실시양태에서, 항체는 항체 H3K4, 예컨대 전장 인간화 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다.
일부 실시양태에서, 결합 폴리펩티드, 예컨대 항-EphA5 항체 또는 항원-결합 단편은, 서열번호: 4에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖고/갖거나, 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가진 중쇄 가변 영역 및 서열번호: 13에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중쇄 가변 영역은 서열번호: 4에 제시되고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 13에 제시된다. 일부 실시양태에서, 항체는 항체 H3K5, 예컨대 전장 인간화 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다.
일부 실시양태에서, 결합 폴리펩티드, 예컨대 항-EphA5 항체 또는 항원-결합 단편은, 서열번호: 5에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖고/갖거나, 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가진 중쇄 가변 영역 및 서열번호: 9에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖고/갖거나, 100% 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중쇄 가변 영역은 서열번호: 5에 제시되고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 9에 제시된다. 일부 실시양태에서, 항체는 항체 H4K1, 예컨대 전장 인간화 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다.
일부 실시양태에서, 결합 폴리펩티드, 예컨대 항-EphA5 항체 또는 항원-결합 단편은, 서열번호: 5에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖고/갖거나, 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가진 중쇄 가변 영역 및 서열번호: 10에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖고/갖거나, 100% 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중쇄 가변 영역은 서열번호: 5에 제시되고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 10에 제시된다. 일부 실시양태에서, 항체는 항체 H4K2, 예컨대 전장 인간화 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다.
일부 실시양태에서, 결합 폴리펩티드, 예컨대 항-EphA5 항체 또는 항원-결합 단편은, 서열번호: 5에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖고/갖거나, 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가진 중쇄 가변 영역 및 서열번호: 11에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖고/갖거나, 100% 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중쇄 가변 영역은 서열번호: 5에 제시되고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 11에 제시된다. 일부 실시양태에서, 항체는 항체 H4K3, 예컨대 전장 인간화 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다.
일부 실시양태에서, 결합 폴리펩티드, 예컨대 항-EphA5 항체 또는 항원-결합 단편은, 서열번호: 5에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖고/갖거나, 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가진 중쇄 가변 영역 및 서열번호: 12에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖고/갖거나, 100% 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중쇄 가변 영역은 서열번호: 5에 제시되고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 12에 제시된다. 일부 실시양태에서, 항체는 항체 H4K4, 예컨대 전장 인간화 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다.
일부 실시양태에서, 결합 폴리펩티드, 예컨대 항-EphA5 항체 또는 항원-결합 단편은, 서열번호: 5에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖고/갖거나, 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가진 중쇄 가변 영역 및 서열번호: 13에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖고/갖거나, 100% 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중쇄 가변 영역은 서열번호: 5에 제시되고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 13에 제시된다. 일부 실시양태에서, 항체는 항체 H4K5, 예컨대 전장 인간화 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다.
일부 실시양태에서, 결합 폴리펩티드, 예컨대 항-EphA5 항체 또는 항원-결합 단편은, 서열번호: 6에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖고/갖거나, 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가진 중쇄 가변 영역 및 서열번호: 9에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖고/갖거나, 100% 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중쇄 가변 영역은 서열번호: 6에 제시되고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 9에 제시된다. 일부 실시양태에서, 항체는 항체 H5K1, 예컨대 전장 인간화 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다.
일부 실시양태에서, 결합 폴리펩티드, 예컨대 항-EphA5 항체 또는 항원-결합 단편은, 서열번호: 6에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖고/갖거나, 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가진 중쇄 가변 영역 및 서열번호: 10에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖고/갖거나, 100% 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중쇄 가변 영역은 서열번호: 6에 제시되고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 10에 제시된다. 일부 실시양태에서, 항체는 항체 H5K2, 예컨대 전장 인간화 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다.
일부 실시양태에서, 결합 폴리펩티드, 예컨대 항-EphA5 항체 또는 항원-결합 단편은, 서열번호: 6에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖고/갖거나, 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가진 중쇄 가변 영역 및 서열번호: 11에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖고/갖거나, 100% 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중쇄 가변 영역은 서열번호: 6에 제시되고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 11에 제시된다. 일부 실시양태에서, 항체는 항체 H5K3, 예컨대 전장 인간화 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다.
일부 실시양태에서, 결합 폴리펩티드, 예컨대 항-EphA5 항체 또는 항원-결합 단편은, 서열번호: 6에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖고/갖거나, 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가진 중쇄 가변 영역 및 서열번호: 12에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖고/갖거나, 100% 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중쇄 가변 영역은 서열번호: 6에 제시되고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 12에 제시된다. 일부 실시양태에서, 항체는 항체 H5K4, 예컨대 전장 인간화 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다.
일부 실시양태에서, 결합 폴리펩티드, 예컨대 항-EphA5 항체 또는 항원-결합 단편은, 서열번호: 6에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖고/갖거나, 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가진 중쇄 가변 영역 및 서열번호: 13에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖고/갖거나, 100% 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중쇄 가변 영역은 서열번호: 6에 제시되고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 13에 제시된다. 일부 실시양태에서, 항체는 항체 H5K5, 예컨대 전장 인간화 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다.
일부 실시양태에서, 결합 폴리펩티드, 예컨대 항-EphA5 항체 또는 항원-결합 단편은, 서열번호: 7에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖고/갖거나, 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가진 중쇄 가변 영역, 및 서열번호: 9에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖고/갖거나, 100% 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중쇄 가변 영역은 서열번호: 7에 제시되고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 9에 제시된다. 일부 실시양태에서, 항체는 항체 H6K1, 예컨대 전장 인간화 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다.
일부 실시양태에서, 결합 폴리펩티드, 예컨대 항-EphA5 항체 또는 항원-결합 단편은, 서열번호: 7에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖고/갖거나, 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가진 중쇄 가변 영역 및 서열번호: 10에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖고/갖거나, 100% 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중쇄 가변 영역은 서열번호: 7에 제시되고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 10에 제시된다. 일부 실시양태에서, 항체는 항체 H6K2, 예컨대 전장 인간화 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다.
일부 실시양태에서, 결합 폴리펩티드, 예컨대 항-EphA5 항체 또는 항원-결합 단편은, 서열번호: 7에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖고/갖거나, 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가진 중쇄 가변 영역 및 서열번호: 11에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖고/갖거나, 100% 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중쇄 가변 영역은 서열번호: 7에 제시되고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 11에 제시된다. 일부 실시양태에서, 항체는 항체 H6K3, 예컨대 전장 인간화 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다.
일부 실시양태에서, 결합 폴리펩티드, 예컨대 항-EphA5 항체 또는 항원-결합 단편은, 서열번호: 7에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖고/갖거나, 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가진 중쇄 가변 영역 및 서열번호: 12에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖고/갖거나, 100% 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중쇄 가변 영역은 서열번호: 7에 제시되고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 12에 제시된다. 일부 실시양태에서, 항체는 항체 H6K4, 예컨대 전장 인간화 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다.
일부 실시양태에서, 결합 폴리펩티드, 예컨대 항-EphA5 항체 또는 항원-결합 단편은, 서열번호: 7에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖고/갖거나, 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가진 중쇄 가변 영역 및 서열번호: 13에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖고/갖거나, 100% 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중쇄 가변 영역은 서열번호: 7에 제시되고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 13에 제시된다. 일부 실시양태에서, 항체는 항체 H6K5, 예컨대 전장 인간화 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다.
서열번호: 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호: 11에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 (즉, H4K3)가 제공된다.
서열번호: 6에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호: 11에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 (즉, H5K3)가 제공된다.
본 발명의 항체는 변형된 항체를 조작하기 위한 출발 물질로서 본원에 개시된 VH 및/또는 VL 서열 중 하나 이상을 갖는 항체를 사용하여 제조될 수 있으며, 이 변형된 항체는 출발 항체와 비교하여 변경된 특성을 가질 수 있다. 항체는 하나 또는 둘 다의 가변 영역 (즉, VH 및/또는 VL) 내에서, 예를 들어 하나 이상의 CDR 영역 내에서 및/또는 하나 이상의 프레임워크 영역 내에서 하나 이상의 아미노산을 변형함으로써 조작될 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 항체는 예를 들어 항체의 이펙터 기능(들)을 변경하기 위해 불변 영역(들) 내의 잔기를 변형함으로써 조작될 수 있다.
일부 실시양태에서, 결합 폴리펩티드는 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다.
제공된 항체 중에는 항체 단편이 있다. 항체 단편의 예는 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; 디아바디; 선형 항체; 중쇄 가변 (VH) 영역, 단일쇄 항체 분자 예컨대 scFv 및 VH 영역만을 포함하는 단일-도메인 항체를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 항원-결합 단편은 Fab, 단일쇄 가변 단편 (scFv), 단일-도메인 항체, 및 나노바디로 이루어진 군으로부터 선택된다. 추가 실시양태에서, 항체는 전장 항체이다. 제공된 실시양태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 인간화 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다.
일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 면역글로불린 불변 영역의 적어도 일부, 예컨대 하나 이상의 불변 영역 도메인을 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 중쇄의 불변 영역은 적어도 중쇄 불변 영역 1 (CH1)을 포함하고 경쇄의 불변 영역은 경쇄 불변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중쇄의 불변 영역은 힌지 도메인, CH2 및/또는 CH3 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 중쇄 불변 도메인은 인간 IgG의 CH1, 힌지, CH2 및/또는 CH3, 예컨대 인간 IgG1 또는 IgG4를 함유하는 불변 쇄 또는 이의 일부로부터의 것이다. 일부 실시양태에서, 경쇄 불변 도메인은 인간 카파 경쇄 또는 람다 경쇄의 불변 쇄로부터의 것이다.
제공된 항체 중에는 인간 중쇄 불변 영역과 조합된 본원에 제공된 중쇄 가변 영역 중 어느 하나를 가진 중쇄; 및 인간 경쇄 불변 영역과 조합된 본원에 제공된 경쇄 가변 영역 중 어느 하나를 갖는 경쇄를 함유하는 전장 항체가 있다. 일부 실시양태에서, 중쇄의 불변 영역은 인간 IgG1 중쇄 불변 영역이다. 일부 실시양태에서, 중쇄 불변 영역은 서열번호: 14 또는 서열번호: 14와 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열에 제시되어 있다. 일부 실시양태에서, 중쇄 불변 영역은 서열번호: 14에 제시된다. 일부 실시양태에서, 경쇄의 불변 영역은 인간 카파 경쇄 불변 영역이다. 일부 실시양태에서, 경쇄 불변 영역은 서열번호: 15 또는 서열번호: 15와 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열에 제시되어 있다. 일부 실시양태에서, 중쇄 불변 영역은 서열번호: 15에 제시된다. 본원에 제공된 중쇄 가변 영역의 임의의 것은 적합한 인간 불변 영역과 조합될 수 있다. 경쇄 가변 영역의 임의의 것은 적합한 인간 경쇄 불변 영역과 조합될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에는 서열번호: 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 서열번호: 14에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 도메인을 포함하는 중쇄, 및 서열번호: 8에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 서열번호: 15에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 불변 도메인을 포함하는 경쇄를 포함하는 전장 항체 (예를 들어, 키메라 항체)가 제공된다. 일부 실시양태에서, 전장 항체는 서열번호: 1에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변 도메인 및 서열번호: 14에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 불변 도메인을 포함하는 중쇄, 및 서열번호: 8 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변 도메인 및 서열번호: 15로 이루어진 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 불변 도메인을 포함하는 경쇄로 이루어진다.
일부 실시양태에서, 본원에는 서열번호: 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 서열번호: 14에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 도메인을 포함하는 중쇄, 및 서열번호: 9, 10, 11, 12, 또는 13에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 서열번호: 15에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 불변 도메인을 포함하는 경쇄를 포함하는 전장 항체 (예를 들어, 인간화 항체)가 제공된다.
일부 실시양태에서, 전장 항체는 서열번호: 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변 도메인 및 서열번호: 14에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 불변 도메인을 포함하는 중쇄, 및 서열번호: 9, 10, 11, 12, 또는 13중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변 도메인 및 서열번호: 15에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 불변 도메인을 포함하는 경쇄로 이루어진다.
일부 실시양태에서, 본원에는 서열번호: 38 또는 39에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호: 40에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 전장 항체가 제공된다.
일부 실시양태에서, 본원에는 서열번호: 38 또는 39에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 전장 중쇄 및 서열번호: 40에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 전장 경쇄를 포함하는 전장 항체가 제공된다.
전장 항체 서열의 허용가능한 변형은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있을 것이다. 예를 들어, 일부 실시양태에서 항체는 서열번호: 38, 39, 및 40에 제시된 아미노산 서열 중 임의의 것과 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 제공된 항-EpHA5 항체는 (i) 서열번호: 38에 제시된 아미노산 서열과 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성, 및/또는 100% 동일성을 포함하는 중쇄; 및 (ii) 서열번호: 40에 제시된 아미노산 서열과 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 또는 적어도 약 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성, 및/또는 100% 동일성을 포함하는 경쇄로 구성된 전장 항체이다. 일부 실시양태에서, 중쇄의 가변 영역은 서열번호: 16에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호: 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호: 20에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하고; 경쇄의 가변 영역은 서열번호: 21에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호: 23에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호: 24에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함한다.
서열번호: 38에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 전장 중쇄 및 서열번호: 40에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 전장 경쇄를 포함하는 항-EphA5 항체 (즉, H4K3)가 제공된다.
일부 실시양태에서, 제공된 항-EphA5 항체는 (i) 서열번호: 39에 제시된 아미노산 서열과 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성, 및/또는 100% 동일성을 포함하는 중쇄; 및 (ii) 서열번호: 40에 제시된 아미노산 서열과 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성, 및/또는 100% 동일성을 포함하는 경쇄로 구성된 전장 항체이다. 일부 실시양태에서, 중쇄의 가변 영역은 서열번호: 16에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호: 18에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호: 20에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하고; 경쇄의 가변 영역은 서열번호: 21에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호: 23에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호: 24에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함한다.
또한, 서열번호: 39에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 전장 중쇄 및 서열번호: 40에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 전장 경괘를 포함하는 항-EpHA5 항체 (즉, H5K3)가 제공된다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 항체로서 인간 EPH 수용체 A5에 대한 동일한 에피토프에 결합하는 항체 (즉, 본 발명의 항체 중 임의의 것과 인간 EPH 수용체 A5에 결합하기 위한 교차-경쟁하는 능력을 갖는 항체)를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 교차-경쟁 연구를 위한 참조 항체 또는 항체 단편은 본원에 기재된 항체 또는 항체 단편 중 하나일 수 있으며, 비교는 등가 분자 (예를 들어 Fab 대 Fab, 전장 항체 대 전장 항체)를 사용하여 이루어진다. 예를 들어, 비아코어 분석, ELISA 검정 또는 유세포 분석법을 사용하여 본 발명의 항체와의 교차-경쟁을 입증할 수 있다. 인간 EPH 수용체 A5에 대한, 예를 들어 H4K3 또는 H5K3의 결합을 억제하는 테스트 항체의 능력은 테스트 항체가 인간 EPH 수용체 A5에 결합하기 위해 H4K3 또는 H5K3과 경쟁할 수 있고 따라서 H4K3 또는 H5K3으로서 인간 EPH 수용체 A5의 에피토프에 결합하는 것으로 간주된다는 것을 입증한다.
일부 실시양태에서, 제공된 항-EphA5 항체 중 어느 하나는 이들이 원하는 적용에서 특이성을 보유하도록 단리, 정제 또는 반정제된다. 단백질은 시험관내에서 합성될 수 있거나 재조합일 수 있지만, 대부분의 실시양태에서, 단백질은 재조합이다. 대안적으로, 비재조합 또는 재조합 단백질은 박테리아로부터 단리될 수 있다.
표 1: 본 발명에서 사용된 서열
예시적인 특징
항체 및 이의 항원-결합 단편을 포함하는 본 발명의 결합 폴리펩티드는 항체의 특정한 기능적 특징 또는 특성을 특징으로 한다.
일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 EphA5 단백질에 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간 EphA5에 특이적으로 결합한다. 항체 또는 기타 결합 분자가 EphA5 단백질에 결합하거나 EphA5 단백질에 특이적으로 결합한다는 관찰이 반드시 그것이 모든 종의 EphA5 단백질에 결합한다는 의미는 아니다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, EphA5 단백질에 대한 결합의 특징, 예컨대 이에 특이적으로 결합하는 능력 및/또는 특정한 친화도로 특정한 정도로 결합하는 능력은 일부 실시양태에서 인간 EphA5 단백질에 대한 능력을 지칭하고 항체는 마우스와 같은 또 다른 종의 EphA5 단백질과 관련하여 이러한 특징을 갖지 않을 수 있다.
일부 실시양태에서, 항체는 서열번호: 41 (NCBI No. NP_004430.4)의 아미노산 서열 또는 이의 대립유전자 변이체 또는 스플라이스 변이체를 포함하는 인간 BCMA 단백질과 같은 인간 EphA5 단백질의 에피토프 또는 영역과 같은 인간 EphA5 단백질에 특이적으로 결합한다.
일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 EphA5, 예를 들어 인간 EphA5 내의 하나 이상의 에피토프에 결합, 예를 들어 특이적으로 결합 및/또는 인식한다. 일부 실시양태에서, 에피토프는 EphA5, 예를 들어 인간 EphA5의 세포외 도메인 상에 존재하는 에피토프이다. 일부 실시양태에서, 에피토프는 펩티드 에피토프를 포함한다. 일부 실시양태에서, 에피토프는 선형 에피토프, 입체형태적 에피토프 또는 이의 조합을 포함한다.
일부 실시양태에서, 제공된 항체에 의해 인식되는 에피토프는 서열번호: 41의 넘버링을 참조하여 아미노산 잔기 R306, F309, K321, T328, 및 H329를 함유하는 에피토프를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제공된 항체에 의해 인식되는 에피토프는 서열번호: 41의 넘버링을 참조하여 아미노산 잔기 R306, G308, F309, K321, T328, 및 H329를 함유하는 에피토프를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제공된 항체에 의해 인식되는 에피토프는 서열번호: 41의 넘버링을 참조하여 아미노산 잔기 R306, G308, F309, K321, Y327, T328, H329 및 E330을 함유하는 에피토프를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제공된 항체에 의해 인식되는 에피토프는 서열번호: 41의 넘버링을 참조하여 아미노산 잔기 R306, G308, F309, K321, Y327, T328, H329 및 E330을 함유하는 에피토프를 포함한다. 일부 실시양태에서, 에피토프는 상기 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산의 인접한 서열이다. 일부 실시양태에서, 제공된 항체 또는 항원-결합 단편은 아미노산 잔기 R413, R417 및/또는 D430을 포함하는 에피토프에 결합하지 않는다.
제공된 실시양태에서, 비인간 EphA5 단백질 또는 다른 비-EphA5 단백질과 같은 관련되지 않은 비-EphA5 단백질에 대한 항-EphA5 항체의 결합 정도는, 예를 들어 방사면역검정(radioimmunoassay) (RIA)에 의해 측정된 바와 같은 인간 EphA5 단백질에 대한 항체의 결합의 약 10% 이하이다.
일부 실시양태에서, 제공된 항체는 인간 EphA5 단백질 또는 제공된 항체에 의해 인식되는 에피토프를 함유하는 다른 EphA5 단백질과 같은 EphA5 단백질과 결합할 수 있으며, 다수의 공지된 방법 중 임의의 방법에 의해 측정된 바와 같이 적어도 특정 친화도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 친화도는 평형 해리 상수 (KD)로 표시되며; 일부 실시양태에서, 친화도는 EC50으로 표시된다.
결합 친화도를 평가하고/하거나 결합 분자 (예를 들어, 항체 또는 이의 단편)가 특정한 리간드 (예를 들어, EphA5 단백질과 같은 항원)에 특이적으로 결합하는지 여부를 결정하기 위한 다양한 검정이 공지되어 있다. 예를 들어, 인간 EphA5와 같은 EphA5와 같은 항원에 대한 결합 분자, 예를 들어, 항체의 결합 친화도를 결정하는 것은 예컨대 관련 기술분야에 널리 공지되어 있는 다수의 결합 검정 중 임의의 것을 사용함으로써 결정하는 것은 통상의 기술자의 수준 내에 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, BIAcore® 기기는 표면 플라스몬 공명 (SPR) 분석을 사용하여, 두 단백질 (예를 들어, 항체 또는 이의 단편, 및 EphA5 단백질과 같은 항원) 사이의 복합체의 결합 동역학 및 상수를 결정하는 데 사용될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Scatchard et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 51:660, 1949; Wilson, Science 295:2103, 2002; Wolff et al., Cancer Res. 53:2560, 1993]; 및 미국 특허 번호 5,283,173, 5,468,614 또는 등가물 참조).
SPR은 분자가 표면에 결합하거나 표면에서 해리될 때 센서 표면의 분자 농도 변화를 측정한다. SPR 신호의 변화는 표면에 가까운 질량 농도의 변화에 정비례하므로, 두 분자 사이의 결합 동역학을 측정할 수 있다. 복합체의 해리 상수는 완충제가 칩을 통과할 때 시간에 따른 굴절률의 변화를 모니터링하여 결정할 수 있다. 한 단백질과 또 다른 단백질의 결합을 측정하기 위한 다른 적합한 검정은, 예를 들어, 효소 결합 면역흡착 검정(enzyme linked immunosorbent assay) (ELISA) 및 방사면역검정 (RIA)과 같은 면역검정, 또는 형광, UV 흡수, 원형 이색성 또는 핵자기공명(NMR)을 통해 단백질의 분광학적 또는 광학적 특성의 변화를 모니터링하여 결합을 결정하는 것을 포함한다. 다른 예시적인 검정은 웨스턴 블롯(Western blot), ELISA, 분석용 초원심분리, 분광학, 유세포 분석법, 서열분석 및 발현된 핵산 또는 단백질 결합의 검출을 위한 기타 방법을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 결합 분자, 예를 들어 항체 또는 이의 단편은 105 M-1 이상의 KA (즉, 1/M 단위의 특정한 결합 상호작용의 평형 회합 상수; 이 회합 반응에 대한 온-레이트(on-rate) [kon 또는 ka] 대 오프-레이트 [koff 또는 kd]의 비율과 동등, 이분자 상호작용을 가정)와의 결합 친화도로 항원, 예를 들어 EphA5 단백질 또는 그 안의 에피토프에 결합한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 단편은 10-5 M 이하의 KD (즉, M 단위의 특정한 결합 상호작용의 평형 해리 상수; 이 회합 반응에 대한 오프-레이트 [koff 또는 kd] 대 온-레이트 [kon 또는 ka]의 비율과 동등, 이분자 상호작용을 가정)와의 결합 친화도로 항원, 예를 들어 EphA5 단백질 또는 그 안의 에피토프에 결합한다. 예를 들어, 평형 해리 상수 KD 는 10-5 M 내지 10-13 M, 예컨대 10-7 M 내지 10-11 M, 10-8 M 내지 10-10 M, 또는 10-9 M 내지 10-10 M의 범위이다. 온-레이트 (회합 속도 상수; kon 또는 ka; 1/Ms 단위) 및 오프-레이트 (해리 속도 상수; koff 또는 kd; 1/s 단위)는 관련 기술분야에 공지된 검정 중 임의의 것, 예를 들어 표면 플라스몬 공명 (SPR)을 사용하여 결정할 수 있다.
일부 실시양태에서, 결합 분자, 예를 들어 항체 또는 이의 단편은 1.3 x 10-9 M 이하의 KD로, 항원, 예를 들어 EphA5 단백질 또는 그 안의 에피토프에 결합한다. 일부 실시양태에서, 인간 EpHA5에 결합하기 위한 해리 상수 (KD)는 1.25 x 10-9 M 미만이다. 일부 실시양태에서, KD는 1.2 x 10-9 M, 1.1 x 10-9 M, 1.0 x 10-9 M, 9.5 x 10-10 M, 9.0 x 10-10 M 또는 8.5 x 10-10 M이거나 약 1.2 x 10-9 M, 1.1 x 10-9 M, 1.0 x 10-9 M, 9.5 x 10-10 M, 9.0 x 10-10 M 또는 8.5 x 10-10 M이며, 전술한 내용 중 임의의 것 사이의 임의의 값을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간 EpHA5에 결합하기 위한 해리 상수 (KD)는 8 x 10-10 M 내지 1.1 x 10-9 M이다. 일부 실시양태에서, KD는 1.0 nM ± 0.1 nM 또는 약 1.0 nM ± 0.1 nM이다. 특정한 실시양태에서, 결합 친화도는 BIAcore® 기기를 사용하여 결정된다.
일부 실시양태에서, 제공된 항체 (예를 들어, 항원-결합 단편)의 특성 또는 특징은 또 다른 항체 (예를 들어, 참조 항체)에 대해 관찰된 특성과 관련하여 기재된다. 일부 측면에서, 참조 항체는 비인간 항-EphA5 항체, 예컨대 뮤린 항-EphA5 항체이다. 일부 측면에서, 참조 항체는 11C12로 지정된 뮤린 항체, 및/또는 이의 scFv 단편과 같은 이로부터 유래된 단편, 및/또는 이러한 항체의 VH 및 VL 영역 및/또는 이러한 항체의 중쇄 및 경쇄 CDR을 함유하는 항체이다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 참조 항체는 서열번호: 1에 제시된 아미노산 서열을 함유하는 VH 영역 및 서열번호: 8에 제시된 아미노산 서열을 함유하는 VL 영역을 갖는다. 일부 실시양태에서, 참조 항체는 뮤린 불변 도메인을 추가로 함유하는 완전한 뮤린 항-EphA5 항체일 수 있다. 일부 실시양태에서, 참조 항체는 서열번호: 1에 제시된 아미노산 서열을 함유하는 뮤린 VH 영역 및 서열번호: 14에 제시된 중쇄 불변 도메인을 포함하는 중쇄, 및 서열번호: 8에 기재된 아미노산 서열을 함유하는 경쇄 가변 도메인 및 서열번호: 15에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 불변 도메인을 포함하는 경쇄를 함유하는 키메라 항체일 수 있다. 전형적으로, 참조 항체에 대한 제공된 항체의 결합 또는 기타 특징 또는 특성의 비교는 참조 항체의 상응하는 형태 또는 동일한 형태에 대한 것으로 이해된다. 항체의 "상응하는 형태"는 두 항체의 특성 또는 활성을 비교할 때, 항체의 동일한 형태 (예를 들어, 전장 또는 Fab 또는 다른 항원-결합 단편 형태)를 사용하여 특성을 비교하는 것을 의미한다. 따라서, 본원에서 "상응하는 형태" 및 "동일 형태"는 상호교환적으로 사용된다. 예를 들어, 항체가 상응하는 형태의 첫 번째 항체 (예를 들어, 참조 항체)의 활성과 비교하여 더 큰 활성을 갖는다고 서술되는 경우, 이는 해당 항체의 Fab와 같은 특정한 형태가 첫 번째 항체의 Fab 형태와 비교하여 더 큰 활성을 갖는다는 것을 의미한다.
일부 실시양태에서, 제공된 항체, 예컨대 전장 항체 또는 이의 항원-결합 단편 중에는, 인간 EphA5에 결합하기 위한 해리 상수 (KD)가 참조 항체 (예를 들어, 11C12, 예컨대 서열번호: 1 및 8에 각각 제시된 VH 및 VL을 함유하는 항체)보다 1.2배 더 양호하다 (예를 들어, 더 낮은 KD). 일부 실시양태에서, 인간 EphA5에 결합하기 위한 KD는 참조 항체보다 1.2배, 1.3배, 1.4배, 1.5배, 1.6배, 1.7배, 1.8배, 1.9배, 2.0배 또는 그보다 양호하거나 약 1.2배, 1.3배, 1.4배, 1.5배, 1.6배, 1.7배, 1.8배, 1.9배, 2.0배 또는 그보다 양호하다 (예를 들어, 더 낮은 KD).
제공된 항체 (예를 들어, 항원-결합 단편) 중에는 본원에 기재된 참조 항체에 의해 결합된 것들과 결합에 대해 경쟁하고/하거나 EphA5 단백질의 동일하거나 중첩되는 에피토프에 결합하지만 별개의 VH 및 VL 영역을 함유하는 것들이 있다. 일부 실시양태에서, 제공된 항체 중에는 별개의 CDR 세트, 예를 들어 별개의 중쇄 및 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3을 함유하는 항체가 있다.
일부 실시양태에서, 제공된 결합 분자, 예컨대 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 세포의 외막 상에서 발현되는 막횡단 단백질인 EphA5와 같은 세포 표면 EphA5에 결합한다. 일부 실시양태에서, 제공된 결합 분자, 예컨대 항체 또는 이의 항원-결합 단편은, EphA5-음성 세포, 예컨대 EphA5를 발현하는 것으로 본원에 공지되고/되거나 기재되고 EphA5를 발현하지 않는 것으로 공지된 특정한 세포와 비교하여 EphA5-발현 세포에 대한 결합 선호도를 나타낸다. EphA5 발현 세포는 일차 세포 또는 세포주일 수 있다. 예시적인 EphA5 (예를 들어, 인간 EphA5) 발현 세포는 H460 세포주이다. 일부 실시양태에서, 비발현 세포와 비교하여 EphA5-발현 세포에 대해 상당히 더 큰 결합 정도가 측정되는 경우 결합 선호도가 관찰된다. 일부 실시양태에서, 예를 들어, 비-EphA5-발현 세포와 비교하여 EphA5-발현 세포에 대해, 유세포 분석법-기반 검정에서 평균 형광 강도 및/또는 해리 상수 또는 EC50에 의해 측정된 바와 같이, 검출된 결합 정도 (예를 들어, EC50)의 배수 변화도는 적어도 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 그 초과이고/이거나 참조 항체의 상응하는 형태에 대해 관찰된 배수 변화보다, 대략 그만큼 크거나, 대략 동일하거나, 적어도 그 만큼 크거나 대략 그 만큼 크거나, 또는 그보다 크다. 일부 경우에, EphA5 또는 EphA5-발현 세포에 대해 관찰된 총 결합 정도는 참조 항체의 상응하는 형태에 대해 관찰된 것과 대략 동일하거나, 적어도 그 만큼 크거나, 그보다 크다.
일부 실시양태에서, 제공된 결합 분자, 예컨대 항체 또는 항원-결합 단편은 이것이 결합하는 세포, 예컨대 EphA5-발현 세포에 의해 내재화될 수 있다. 따라서, 제공된 결합 분자, 예컨대 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 세포에 결합시 세포의 지질 이중층 막을 통해 내부 구획으로 이동 (즉, "내재화")될 수 있다. 예를 들어, 내재화 항-EphA5 항체는 세포막의 EphA5에 결합한 후 세포 내로 흡수될 수 있는 항체이다.
일부 실시양태에서, 결합 분자, 예컨대 제공된 항체 또는 이의 항원-결합 단편은, 대상체에게 투여될 때 (예를 들어, 단독으로 또는 접합체로서) 요법에 대한 대상체에 의한 면역 반응을 유도하지 않고/않거나 질환 또는 병태의 효과적인 치료를 방해할 정도로 이러한 반응을 유도하지 않는 치료를 초래한다. 일부 측면에서, 면역원성 및/또는 이식편 대 숙주 반응의 정도는 참조 항체 (예를 들어, 11C12, 예컨대 서열번호 :1 및 8 각각에 제시된 VH 및 VL를 함유하는 항체)를 함유하는 결합 분자와 같은 상이하나 비슷한 치료법으로 관찰된 것보다 덜하다. 예를 들어, 제공된 항-EphA5 항체를 포함하는 항체 약물 접합체 (ADC)의 경우에, 유사한, 예를 들어, 중첩 에피토프에 결합하고/하거나 EphA5에 대한 결합을 위해 제공된 항체, 예컨대 마우스 항체와 경쟁하는 상이한 항체를 포함한 유사한 ADC와 비교하여 면역원성 정도가 감소된다. 예를 들어, 제공된 실시양태에서, 제공된 항-EphA5 항체를 함유하는 ADC의 면역원성 정도는 유사한 ADC와 비교하여 감소되나 참조 항체 (예를 들어, 11C12, 예컨대 서열번호 :1 및 8 각각에 제시된 VH 및 VL을 함유하는 항체)를 함유한다.
일부 실시양태에서, 제공된 결합 분자, 예컨대 항체 또는 항원-결합 단편은, 상기 항체 또는 이의 결합 단편의 안정성에 유리한는 특징을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 제공된 결합 분자, 예를 들어 항체 또는 항원-결합 단편의 안정성은 이의 열 안정성에 의해 입증된다. 단백질의 열 안정성의 검출은 변성을 효과적으로 결정하는 데 사용될 수 있으므로 치료용 단백질 개발 중 단백질의 안정성 시험으로서 사용된다. 통상의 기술자는 단백질의 열 안정성을 평가하는 검정에 익숙하다. 일부 실시양태에서, 제공된 결합 분자, 예컨대 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 높은 열 안정성을 가지므로 단백질 응집이 덜 발생하여 단백질의 활성 및/또는 순도가 개선된다.
일부 실시양태에서, 결합 분자, 예컨대 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 67℃ 초과 또는 약 67℃ 초과, 68℃ 초과 또는 약 68℃ 초과, 69℃ 초과 또는 약 69℃ 초과, 70℃ 초과 또는 약 70℃ 초과, 71℃ 초과 또는 약 71℃ 초과, 또는 72℃ 초과 또는 약 72℃ 초과이거나, 전술한 내용 중 임의의 것 사이의 임의의 값인 응집의 개시 온도 (Tagg)를 갖는다. 일부 실시양태에서, Tagg는 67℃ 또는 약 67℃와 71℃ 또는 약 71℃ 사이에 있다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 항원 결합 단편의 Tagg는 67℃ 또는 약 67℃, 68℃ 또는 약 68℃, 69℃ 또는 약 69℃, 70℃ 또는 약 70℃, 또는 71℃ 또는 약 71℃이다.
일부 실시양태에서, 결합 분자, 예컨대 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호: 1 및 8에 각각 제시된 VH 및 VL을 함유하는 항체와 같은 항체 11C12와 같은 참조 항체와 비교하여 증가되거나 개선된 Tagg를 갖는다. 일부 실시양태에서, Tagg는 참조 항체 (예를 들어, 서열번호 :1 및 8 각각에 제시된 VH 및 VL을 함유하는 항체와 같은 항체 11C12)와 비교하여 1℃ 초과 또는 약 1℃ 초과, 2℃ 초과 또는 약 2℃ 초과, 3℃ 초과 또는 약 3℃ 초과, 4℃ 초과 또는 약 4℃ 초과 또는 5℃ 초과 또는 약 5℃ 초과로 증가된다.
일부 실시양태에서, 결합 분자, 예컨대 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 60℃ 초과인 풀림에 대한 용융 온도 (Tm)를 갖는다. 일부 실시양태에서, Tm은 61℃ 초과 또는 약 61℃ 초과, 62℃ 초과 또는 약 62℃ 초과, 63℃ 초과 또는 약 63℃ 초과, 64℃ 초과 또는 약 64℃ 초과, 65℃ 초과 또는 약 65℃ 초과, 66℃ 초과 또는 약 66℃ 초과, 67℃ 초과 또는 약 67℃ 초과, 68℃ 초과 또는 약 68℃ 초과, 69℃ 초과 또는 약 69℃ 초과 또는 70℃ 초과 또는 약 70℃ 초과이거나, 전술한 내용 중 임의의 것 사이의 임의의 값이다. 일부 실시양태에서, Tm은 60℃ 또는 약 60℃와 70℃ 또는 약 70℃ 사이에 있다. 일부 실시양태에서, Tm은 64℃ 또는 약 64℃, 65℃ 또는 약 65℃, 66℃ 또는 약 66℃, 67℃ 또는 약 67℃, 68℃ 또는 약 68℃, 또는 69℃ 또는 약 69℃이다.
제공된 결합 분자, 예컨대 항체 또는 항원-결합 단편 중에는, 변성과 관련된 개선된 특징을 나타내는 것들이 있다. 변성은 본래의 입체형태에서 풀린 상태(unfolded state)로의 단백질의 전이이며 일반적으로 단백질 기능의 주요 손실을 동반한다. 통상의 기술자가 이해하는 바와 같이, IgG는 다중-도메인 단백질로 기재될 수 있으므로, 용융 곡선은 때때로 2회의 전이, 또는 3회의 전이를 나타내며, 일차 변성 온도 Tm1 및 이차 변성 온도 Tm2, 및 임의로 삼차 변성 온도 Tm3를 가진다. 예를 들어, 문헌 [Akazawa-Ogawa et al. Biophys. Rev. 2018, 10:255-258]을 참조한다.
일부 실시양태에서, Tm (예를 들어, Tm1)은 서열번호: 1 및 8에 각각 제시된 VH 및 VL을 함유하는 항체와 같은 항체 11C12와 같은 참조 항체와 비교하여 증가되거나 개선된다. 일부 실시양태에서, Tm (예를 들어, Tm1)은 참조 항체 (예를 들어, 서열번호 :1 및 8 각각에 제시된 VH 및 VL을 함유하는 항체와 같은 항체 11C12)와 비교하여 2℃ 초과 또는 약 2℃ 초과, 3℃ 초과 또는 약 3℃ 초과, 4℃ 초과 또는 약 4℃ 초과, 5℃ 초과 또는 약 5℃ 초과, 6℃ 초과 또는 약 6℃ 초과, 7℃ 초과 또는 약 7℃ 초과, 8℃ 초과 또는 약 8℃ 초과, 9℃ 초과 또는 약 9℃, 또는 10℃ 초과 또는 약 10℃ 초과로 증가된다. 일부 실시양태에서, Tm (예를 들어, Tm1)은 참조 항체 (예를 들어, 서열번호 :1 및 8 각각에 제시된 VH 및 VL을 함유하는 항체와 같은 항체 11C12)와 비교하여 5℃ 초과 또는 약 5℃ 초과로 증가된다. 일부 실시양태에서, Tm (예를 들어, Tm1)은 참조 항체 (예를 들어, 서열번호 :1 및 8 각각에 제시된 VH 및 VL을 함유하는 항체와 같은 항체 11C12)와 비교하여 10℃ 초과 또는 약 10℃ 초과로 증가된다.
일부 실시양태에서, 결합 분자, 예컨대 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 60℃ 초과인 풀림에 대한 Tm1을 갖는다. 일부 실시양태에서, Tm1은 61℃ 초과 또는 약 61℃ 초과, 62℃ 초과 또는 약 62℃ 초과, 63℃ 초과 또는 약 63℃ 초과, 64℃ 초과 또는 약 64℃ 초과, 65℃ 초과 또는 약 65℃ 초과, 또는 66℃ 초과 또는 약 66℃ 초과, 67℃ 초과 또는 약 67℃ 초과, 68℃ 초과 또는 약 68℃ 초과, 69℃ 초과 또는 약 69℃ 초과 또는 70℃ 초과 또는 약 70℃ 초과이거나, 전술한 내용 중 임의의 것 사이의 임의의 값이다. 일부 실시양태에서, Tm1은 60℃ 또는 약 60℃와 70℃ 또는 약 70℃ 사이에 있다. 일부 실시양태에서, Tm1은 64℃ 또는 약 64℃, 65℃ 또는 약 65℃, 66℃ 또는 약 66℃, 67℃ 또는 약 67℃, 68℃ 또는 약 68℃, 또는 69℃ 또는 약 69℃이다.
일부 실시양태에서, 제공된 결합 분자, 예컨대 항체 또는 항원-결합 단편 중에는, 풀림에 대한 변성 곡선이 단일 Tm, 즉 TM1만 관찰되는 단상인 것들이 있다. 일부 실시양태에서, 이론에 얽매이는 것을 바라지 않으면서, 이러한 항체의 이러한 특성은 응집 가능성을 감소시켜 이러한 항체 제제의 순도 및/또는 활성을 개선시킬 수 있는 것으로 여겨진다. 예를 들어, 전형적으로 항체의 상이한 도메인으로 인해 접힌 도메인과 풀린 도메인이 상이한 변성 온도에서 존재할 수 있으며, 이는 내열성을 감소시켜 응집 경향을 증가시키거나 활성을 감소시킬 수 있다. 단일 전이 (예를 들어, 단상 열 변성)를 가진 항체 제제는 개선된 열 안정성 및 개발성(developability)을 나타낼 것으로 예상될 것이다.
핵산 및 발현 벡터
본 개시내용은 또한 제공된 항-EpHA5 항체 또는 이의 항원-결합 단편 중 어느 하나, 또는 이의 쇄를 포함한, 제공된 결합 분자 중 어느 하나를 코딩하는, 핵산, 예를 들어 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 본 개시내용의 제공된 핵산은 본원에 개시된 항체 또는 이의 항원-결합 단편 중 어느 하나의 중쇄 및/또는 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 핵산은 단리된 핵산이다. 일부 실시양태에서, 핵산은 재조합 또는 합성 핵산이다. 일부 실시양태에서, 핵산은 상보성 DNA (cDNA)이다.
일부 실시양태에서, 핵산은 상기에 기재된 임의의 것과 같은 본원에 제공된 항체 또는 항원-결합 단편의 중쇄를 코딩한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 상기에 기재된 임의의 것과 같은 본원에 제공된 항체 또는 항원-결합 단편의 경쇄를 코딩한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 상기에 기재된 임의의 것과 같은 본원에 제공된 항체 또는 항원-결합 단편의 중쇄 및 경쇄를 코딩한다.
일부 실시양태에서, 중쇄 가변 영역은 서열번호: 25와 적어도 80% 서열 동일성을 갖지만 서열번호: 25와 100% 미만의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 중쇄 가변 영역은 서열번호: 25와 적어도 85% 서열 동일성을 갖지만 서열번호: 25와 100% 미만의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산에 의해 코딩된다. 예를 들어, 중쇄 가변 영역은 서열번호: 25와 적어도 86%, 87%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93% 94%, 95% 서열 동일성을 갖지만 서열번호: 25와 100% 미만의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 경쇄 가변 영역은 서열번호: 32와 적어도 80% 서열 동일성을 갖지만 서열번호: 32와 100% 미만의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 경쇄 가변 영역은 서열번호: 32와 적어도 85% 서열 동일성을 갖지만 서열번호: 32와 100% 미만의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산에 의해 코딩된다. 예를 들어, 경쇄 가변 영역은 서열번호: 32와 적어도 86%, 87%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93% 94%, 95% 서열 동일성을 갖지만 서열번호: 32와 100% 미만의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산에 의해 코딩된다.
특정 실시양태에서, 중쇄 가변 영역은 서열번호: 26, 27, 28, 29, 30, 또는 31과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산에 의해 코딩된다. 특정 실시양태에서, 중쇄 가변 영역은 서열번호: 26, 27, 28, 29, 30, 또는 31에 제시된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산에 의해 코딩된다. 특정 실시양태에서, 중쇄 가변 영역은 서열번호: 26, 27, 28, 29, 30, 또는 31에 제시된 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어진 핵산에 의해 코딩된다.
특정 실시양태에서, 경쇄 가변 영역은 서열번호: 33, 34, 35, 36, 또는 37에 제시된 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산에 의해 코딩된다. 특정 실시양태에서, 경쇄 가변 영역은 서열번호: 33, 34, 35, 36, 또는 37에 제시된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산에 의해 코딩된다. 특정 실시양태에서, 경쇄 가변 영역은 서열번호: 33, 34, 35, 36, 또는 37에 제시된 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어진 핵산에 의해 코딩된다 .
핵산 서열의 허용가능한 변형은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있을 것이다. 예를 들어, 일부 실시양태에서 핵산은 서열번호: 26, 27, 28, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 36, 및 37에 제시된 뉴클레오티드 서열 중 어느 하나와 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 결합 폴리펩티드를 코딩하는 제공된 핵산(들), 예컨대 항-EphA5 항체 또는 항원-결합 단편은, 서열번호: 26에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열번호: 33에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호: 26에 제시되고 경쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호: 33에 제시된다. 일부 실시양태에서, 핵산(들)은 항체 H1K1, 예컨대 전장 인간화 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 코딩한다.
일부 실시양태에서, 결합 폴리펩티드를 코딩하는 제공된 핵산(들), 예컨대 항-EphA5 항체 또는 항원-결합 단편은, 서열번호: 27에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성 갖는 중쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열번호: 33에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호: 27에 제시되고 경쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호: 33에 제시된다. 일부 실시양태에서, 핵산(들)은 항체 H2K1, 예컨대 전장 인간화 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 코딩한다.
일부 실시양태에서, 결합 폴리펩티드를 코딩하는 제공된 핵산(들), 예컨대 항-EphA5 항체 또는 항원-결합 단편은, 서열번호: 28에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열번호: 33에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호: 28에 제시되고 경쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호: 33에 제시된다. 일부 실시양태에서, 핵산(들)은 항체 H3K1, 예컨대 전장 인간화 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 코딩한다.
일부 실시양태에서, 결합 폴리펩티드를 코딩하는 제공된 핵산(들), 예컨대 항-EphA5 항체 또는 항원-결합 단편은, 서열번호: 29에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열번호: 33에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호: 29에 제시되고 경쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호: 33에 제시된다. 일부 실시양태에서, 핵산(들)은 항체 H4K1, 예컨대 전장 인간화 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 코딩한다.
일부 실시양태에서, 결합 폴리펩티드를 코딩하는 제공된 핵산(들), 예컨대 항-EphA5 항체 또는 항원-결합 단편은, 서열번호: 30에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열번호: 33에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호: 30에 제시되고 경쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호: 33에 제시된다. 일부 실시양태에서, 핵산(들)은 항체 H5K1, 예컨대 전장 인간화 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 코딩한다.
일부 실시양태에서, 결합 폴리펩티드를 코딩하는 제공된 핵산(들), 예컨대 항-EphA5 항체 또는 항원-결합 단편은, 서열번호: 31에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열번호: 33에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호: 31에 제시되고 경쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호: 33에 제시된다. 일부 실시양태에서, 핵산(들)은 항체 H6K1, 예컨대 전장 인간화 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 코딩한다.
일부 실시양태에서, 결합 폴리펩티드를 코딩하는 제공된 핵산(들), 예컨대 항-EphA5 항체 또는 항원-결합 단편은, 서열번호: 26에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열번호: 34에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호: 26에 제시되고 경쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호: 34에 제시된다. 일부 실시양태에서, 핵산(들)은 항체 H1K2, 예컨대 전장 인간화 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 코딩한다.
일부 실시양태에서, 결합 폴리펩티드를 코딩하는 제공된 핵산(들), 예컨대 항-EphA5 항체 또는 항원-결합 단편은, 서열번호: 27에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열번호: 34에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호: 27에 제시되고 경쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호: 34에 제시된다. 일부 실시양태에서, 핵산(들)은 항체 H2K2, 예컨대 전장 인간화 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 코딩한다.
일부 실시양태에서, 결합 폴리펩티드를 코딩하는 제공된 핵산(들), 예컨대 항-EphA5 항체 또는 항원-결합 단편은, 서열번호: 28에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열번호: 34에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호: 28에 제시되고 경쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호: 34에 제시된다. 일부 실시양태에서, 핵산(들)은 항체 H3K2, 예컨대 전장 인간화 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 코딩한다.
일부 실시양태에서, 결합 폴리펩티드를 코딩하는 제공된 핵산(들), 예컨대 항-EphA5 항체 또는 항원-결합 단편은, 서열번호: 29에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열번호: 34에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호: 29에 제시되고 경쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호: 34에 제시된다. 일부 실시양태에서, 핵산(들)은 항체 H4K2, 예컨대 전장 인간화 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 코딩한다.
일부 실시양태에서, 결합 폴리펩티드를 코딩하는 제공된 핵산(들), 예컨대 항-EphA5 항체 또는 항원-결합 단편은, 서열번호: 30에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열번호: 34에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성 갖는 경쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호: 30에 제시되고 경쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호: 34에 제시된다. 일부 실시양태에서, 핵산(들)은 항체 H5K2, 예컨대 전장 인간화 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 코딩한다.
일부 실시양태에서, 결합 폴리펩티드를 코딩하는 제공된 핵산(들), 예컨대 항-EphA5 항체 또는 항원-결합 단편은, 서열번호: 31에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열번호: 34에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호: 31에 제시되고 경쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호: 34에 제시된다. 일부 실시양태에서, 핵산(들)은 항체 H6K2, 예컨대 전장 인간화 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 코딩한다.
일부 실시양태에서, 결합 폴리펩티드를 코딩하는 제공된 핵산(들), 예컨대 항-EphA5 항체 또는 항원-결합 단편은, 서열번호: 26에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열번호: 35에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호: 26에 제시되고 경쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호: 35에 제시된다. 일부 실시양태에서, 핵산(들)은 항체 H1K3, 예컨대 전장 인간화 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 코딩한다.
일부 실시양태에서, 결합 폴리펩티드를 코딩하는 제공된 핵산(들), 예컨대 항-EphA5 항체 또는 항원-결합 단편은, 서열번호: 27에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열번호: 35에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호: 27에 제시되고 경쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호: 35에 제시된다. 일부 실시양태에서, 핵산(들)은 항체 H2K3, 예컨대 전장 인간화 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 코딩한다.
일부 실시양태에서, 결합 폴리펩티드를 코딩하는 제공된 핵산(들), 예컨대 항-EphA5 항체 또는 항원-결합 단편은, 서열번호: 28에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열번호: 35에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호: 28에 제시되고 경쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호: 35에 제시된다. 일부 실시양태에서, 핵산(들)은 항체 H3K3, 예컨대 전장 인간화 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 코딩한다.
일부 실시양태에서, 결합 폴리펩티드를 코딩하는 제공된 핵산(들), 예컨대 항-EphA5 항체 또는 항원-결합 단편은, 서열번호: 29에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열번호: 35에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호: 29에 제시되고 경쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호: 35에 제시된다. 일부 실시양태에서, 핵산(들)은 항체 H4K3, 예컨대 전장 인간화 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 코딩한다.
일부 실시양태에서, 결합 폴리펩티드를 코딩하는 제공된 핵산(들), 예컨대 항-EphA5 항체 또는 항원-결합 단편은, 서열번호: 30에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열번호: 35에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호: 30에 제시되고 경쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호: 35에 제시된다. 일부 실시양태에서, 핵산(들)은 항체 H5K3, 예컨대 전장 인간화 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 코딩한다.
일부 실시양태에서, 결합 폴리펩티드를 코딩하는 제공된 핵산(들), 예컨대 항-EphA5 항체 또는 항원-결합 단편은, 서열번호: 31에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열번호: 35에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호: 31에 제시되고 경쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호: 35에 제시된다. 일부 실시양태에서, 핵산(들)은 항체 H6K3, 예컨대 전장 인간화 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 코딩한다.
일부 실시양태에서, 결합 폴리펩티드를 코딩하는 제공된 핵산(들), 예컨대 항-EphA5 항체 또는 항원-결합 단편은, 서열번호: 26에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열번호: 36에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호: 26에 제시되고 경쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호: 36에 제시된다. 일부 실시양태에서, 핵산(들)은 항체 H1K4, 예컨대 전장 인간화 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 코딩한다.
일부 실시양태에서, 결합 폴리펩티드를 코딩하는 제공된 핵산(들), 예컨대 항-EphA5 항체 또는 항원-결합 단편은, 서열번호: 27에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열번호: 36에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호: 27에 제시되고 경쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호: 36에 제시된다. 일부 실시양태에서, 핵산(들)은 항체 H2K4, 예컨대 전장 인간화 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 코딩한다.
일부 실시양태에서, 결합 폴리펩티드를 코딩하는 제공된 핵산(들), 예컨대 항-EphA5 항체 또는 항원-결합 단편은, 서열번호: 28에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열번호: 36에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호: 28에 제시되고 경쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호: 36에 제시된다. 일부 실시양태에서, 핵산(들)은 항체 H3K4, 예컨대 전장 인간화 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 코딩한다.
일부 실시양태에서, 결합 폴리펩티드를 코딩하는 제공된 핵산(들), 예컨대 항-EphA5 항체 또는 항원-결합 단편은, 서열번호: 29에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열번호: 36에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호: 29에 제시되고 경쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호: 36에 제시된다. 일부 실시양태에서, 핵산(들)은 항체 H4K4, 예컨대 전장 인간화 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 코딩한다.
일부 실시양태에서, 결합 폴리펩티드를 코딩하는 제공된 핵산(들), 예컨대 항-EphA5 항체 또는 항원-결합 단편은, 서열번호: 30에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열번호: 36에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호: 30에 제시되고 경쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호: 36에 제시된다. 일부 실시양태에서, 핵산(들)은 항체 H5K4, 예컨대 전장 인간화 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 코딩한다.
일부 실시양태에서, 결합 폴리펩티드를 코딩하는 제공된 핵산(들), 예컨대 항-EphA5 항체 또는 항원-결합 단편은, 서열번호: 31에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열번호: 36에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호: 31에 제시되고 경쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호: 36에 제시된다. 일부 실시양태에서, 핵산(들)은 항체 H6K4, 예컨대 전장 인간화 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 코딩한다.
일부 실시양태에서, 결합 폴리펩티드를 코딩하는 제공된 핵산(들), 예컨대 항-EphA5 항체 또는 항원-결합 단편은, 서열번호: 26에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열번호: 37에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호: 26에 제시되고 경쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호: 37에 제시된다. 일부 실시양태에서, 핵산(들)은 항체 H1K5, 예컨대 전장 인간화 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 코딩한다.
일부 실시양태에서, 결합 폴리펩티드를 코딩하는 제공된 핵산(들), 예컨대 항-EphA5 항체 또는 항원-결합 단편은, 서열번호: 27에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열번호: 37에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호: 27에 제시되고 경쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호: 37에 제시된다. 일부 실시양태에서, 핵산(들)은 항체 H2K5, 예컨대 전장 인간화 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 코딩한다.
일부 실시양태에서, 결합 폴리펩티드를 코딩하는 제공된 핵산(들), 예컨대 항-EphA5 항체 또는 항원-결합 단편은, 서열번호: 28에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열번호: 37에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호: 28에 제시되고 경쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호: 37에 제시된다. 일부 실시양태에서, 핵산(들)은 항체 H3K5, 예컨대 전장 인간화 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 코딩한다.
일부 실시양태에서, 결합 폴리펩티드를 코딩하는 제공된 핵산(들), 예컨대 항-EphA5 항체 또는 항원-결합 단편은, 서열번호: 29에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열번호: 37에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호: 29에 제시되고 경쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호: 37에 제시된다. 일부 실시양태에서, 핵산(들)은 항체 H4K5, 예컨대 전장 인간화 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 코딩한다.
일부 실시양태에서, 결합 폴리펩티드를 코딩하는 제공된 핵산(들), 예컨대 항-EphA5 항체 또는 항원-결합 단편은, 서열번호: 30에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열번호: 37에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호: 30에 제시되고 경쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호: 37에 제시된다. 일부 실시양태에서, 핵산(들)은 항체 H5K5, 예컨대 전장 인간화 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 코딩한다.
일부 실시양태에서, 결합 폴리펩티드를 코딩하는 제공된 핵산(들), 예컨대 항-EphA5 항체 또는 항원-결합 단편은, 서열번호: 31에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열번호: 37에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호: 31에 제시되고 경쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호: 37에 제시된다. 일부 실시양태에서, 핵산(들)은 항체 H6K5, 예컨대 전장 인간화 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 코딩한다.
또한, 서열번호: 29에 제시된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩된 중쇄 가변 영역 및 서열번호: 35에 제시된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩된 경쇄 가변 영역을 포함하는, 결합 폴리펩티드, 예컨대 항체 또는 항원-결합 단편을 코딩하는 핵산(들)이 제공된다.
또한, 서열번호: 30에 제시된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩된 중쇄 가변 영역 및 서열번호: 35에 제시된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩된 경쇄 가변 영역을 포함하는, 결합 폴리펩티드, 예컨대 항체 또는 항원-결합 단편을 코딩하는 핵산(들)이 제공된다.
본 발명의 또 다른 측면은 본원에 개시된 핵산 중 어느 하나를 포함하는 벡터를 제공한다. 특정 실시양태에서, 벡터는 DNA 벡터, RNA 벡터, 플라스미드, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터, 및 레트로바이러스 벡터로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, 벡터는 발현 벡터이다.
또한, 본원에 개시된 벡터 또는 핵산 중 임의의 것을 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 숙주 세포는 진핵 세포, 원핵 세포, 포유동물, 또는 박테리아 기원일 수 있다. 폴리펩티드를 발현하는데 사용될 수 있는 예시적인 진핵 세포는 COS 7 세포를 포함한 COS 세포; 293-6E 세포를 포함한 293 세포; CHO-S, DG44. Lec13 CHO 세포, 및 FUT8 CHO 세포를 포함한 CHO 세포; PER.C6® 세포; 및 NSO 세포를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 항체 중쇄 및/또는 경쇄 (예를 들어, VH 영역 및/또는 VL 영역)는 효모에서 발현될 수 있다. 예를 들어, 미국 공개 번호 US 2006/0270045 A1을 참조한다. 일부 실시양태에서, 특정한 진핵 숙주 세포는 중쇄 및/또는 경쇄 (예를 들어, VH 영역 및/또는 VL 영역)에 원하는 번역 후 변형을 만드는 이의 능력을 기반으로 선택된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, CHO 세포는 293 세포에서 생성된 동일한 폴리펩티드보다 더 높은 수준의 시알릴화를 갖는 폴리펩티드를 생성한다.
인간 EPH 수용체 A5에 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 생산하는 방법이 또한 본원에 제공되며, 여기서 상기 방법은 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 항-EphA5 항체의 재조합 생산을 위해, 예를 들어 상기에 기재된 바와 같은 항체를 코딩하는 핵산 서열(들)을 단리하고 숙주 세포에서의 추가 클로닝 및/또는 발현을 위해 하나 이상의 벡터에 삽입할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 통상적인 절차를 사용하여 (예를 들어, 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여) 쉽게 단리되고 서열분석될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항-EphA5 항체를 제조하는 방법이 제공되며, 여기서 상기 방법은 상기에 제공된 바와 같은 항체를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 숙주 세포를 항체의 발현에 적합한 조건 하에 배양하고, 임의로 숙주 세포 (또는 숙주 세포 배양 배지)로부터 항체를 회수하거나 정제하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 핵산은 전사 제어 요소, 예를 들어 프로모터, 및 인핸서 등에 작동가능하게 연결될 수 있다. 적합한 프로모터 및 인핸서 요소는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다.
특정 실시양태에서, 핵산은 프로모터와 작동가능하게 연결되어 있다. 박테리아 세포에서의 발현을 위해, 적합한 프로모터는 lacI, lacZ, T3, T7, gpt, 람다 P 및 trc를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 진핵 세포에서의 발현을 위해, 적합한 프로모터는 경쇄 및/또는 중쇄 면역글로불린 유전자 프로모터 및 인핸서 요소; 거대세포바이러스 즉시 초기 프로모터; 포스포글리세레이트 키나제-1 (PGK) 프로모터; 단순 포진 바이러스(herpes simplex virus) 티미딘 키나제 프로모터; 초기 및 후기 SV40 프로모터; 레트로바이러스로부터의 긴 말단 반복부에 존재하는 프로모터; 마우스 메탈로티오네인-I 프로모터; 및 다양한 관련 기술분야에 공지된 조직 특이적 프로모터를 를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 가역적 유도성 프로모터를 포함한 적합한 가역적 프로모터는 관련 기술분야에 공지되어 있다. 이러한 가역적 프로모터는 많은 유기체, 예를 들어 진핵생물 및 원핵생물로부터 단리되고 유래될 수 있다. 제2 유기체, 예를 들어 제1 원핵생물 및 제2 진핵생물, 제1 진핵생물 및 제2 원핵생물 등에서 사용하기 위한 제1 유기체로부터 유래된 가역적 프로모터의 변형은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 이러한 가역적 프로모터, 및 이러한 가역적 프로모터를 기반으로 하지만 추가 제어 단백질도 포함하는 시스템은 알코올 조절 프로모터(alcohol regulated promoter) (예를 들어, 알코올 탈수소효소 I (alcA) 유전자 프로모터, 알코올 트랜스활성화제 단백질(alcohol transactivator protein) (A1cR)에 반응하는 프로모터 등), 테트라사이클린 조절 프로모터 (예를 들어, TetActivator, TetON, TetOFF 등을 포함하는 프로모터 시스템), 스테로이드 조절 프로모터 (예를 들어, 래트 글루코코르티코이드 수용체 프로모터 시스템, 인간 에스트로겐 수용체 프로모터 시스템, 레티노이드 프로모터 시스템, 갑상선 프로모터 시스템, 엑디손 프로모터 시스템, 미페프리스톤 프로모터 시스템 등), 금속 조절 프로모터 (예를 들어, 메탈로티오네인 프로모터 시스템 등), 발병기전-관련 조절 프로모터 (예를 들어, 살리실산 조절 프로모터, 에틸렌 조절 프로모터, 벤조티아디아졸 조절 프로모터 등), 온도 조절 프로모터 (예를 들어, 열 충격 유도성 프로모터(heat shock inducible promoter) (예를 들어, HSP-70, HSP-90, 대두 열 충격 프로모터 등), 광 조절 프로모터, 합성 유도성 프로모터 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
효모 세포에서의 발현을 위해, 적합한 프로모터는 구성적 프로모터(constitutive promoter) 예컨대 ADH1 프로모터, PGK1 프로모터, ENO 프로모터, PYK1 프로모터 등; 또는 조절성 프로모터(regulatable promote) 예컨대 GAL1 프로모터, GAL10 프로모터, ADH2 프로모터, PHOS 프로모터, CUP1 프로모터, GALT 프로모터, MET25 프로모터, aMET3 프로모터, CYC1 프로모터, HIS3 프로모터, ADH1 프로모터, PGK 프로모터, aGAPDH 프로모터, ADC1 프로모터, TRP1 프로모터, URA3 프로모터, LEU2 프로모터, ENO 프로모터, TP1 프로모터, 및 AOX1 (예를 들어, 피치아(Pichia)에서 사용하기 위한 것)이다. 적절한 벡터 및 프로모터의 선택은 관련 기술분야의 통상의 기술자의 수준 내에 있다. 원핵 숙주 세포에 사용하기에 적합한 프로모터는 박테리오파지 T7 RNA 폴리머라제 프로모터; trp 프로모터; lac 오페론 프로모터; 하이브리드 프로모터, 예를 들어 lac/tac 하이브리드 프로모터, tac/trc 하이브리드 프로모터, trp/lac 프로모터, T7/lac 프로모터; trc 프로모터; tac 프로모터 등; araBAD 프로모터; 생체내 조절 프로모터, 예컨대 ssaG 프로모터 또는 관련 프로모터 (예를 들어, 미국 특허 공개 번호 20040131637을 참조한다), pagC 프로모터 (Pulkkinen and Miller, J. Bacteriol. (1991) 173(1): 86-93; Alpuche-Aranda et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89(21): 10079-83), nirB 프로모터 (Harborne et al. Mol. Micro. (1992) 6:2805-2813) 등 (예를 들어, 문헌 [Dunstan et al., Infect. Immun. (1999) 67:5133-5141; McKelvie et al., Vaccine (2004) 22:3243-3255]; 및 [Chatfield et al., Biotechnol. (1992) 10:888-892]을 참조한다); sigma70 프로모터, 예를 들어 컨센서스 sigma70 프로모터 (예를 들어, GenBank 수탁 번호 AX798980, AX798961, 및 AX798183 참조); 고정상 프로모터(stationary phase promoter), 예를 들어 dps 프로모터, spv 프로모터 등; 병원성 섬(pathogenicity islan) SPI-2로부터 유래된 프로모터 (예를 들어 WO96/17951 참조); actA 프로모터 (예를 들어, 문헌 [Shetron-Rama et al., Infect. Immun. (2002) 70:1087-1096]을 참조한다); rpsM 프로모터 (예를 들어, 문헌 [Valdivia and Falkow Mol. Microbiol. (1996). 22:367]을 참조한다); tet 프로모터 (예를 들어, 문헌 [Hillen, W. and Wissmann, A. (1989) In Saenger, W. and Heinemann, U. (eds), Topics in Molecular and Structural Biology, Protein--Nucleic Acid Interaction. Macmillan, London, UK, Vol. 10, pp. 143-162]을 참조한다); SP6 프로모터 (예를 들어, 문헌 [Melton et al., Nucl. Acids Res. (1984) 12:7035]을 참조한다) 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)와 같은 원핵생물에 사용하기에 적합한 강력한 프로모터는 Trc, Tac, T5, T7 및 P람다를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 박테리아 숙주 세포에 사용하기 위한 오퍼레이터의 비제한적 예는 락토스 프로모터 오퍼레이터 (락토스와 접촉할 때 LacI 리프레서 단백질이 입체형태를 변화시켜, Lad 리프레서 단백질이 오퍼레이터에 결합하지 못하도록 함), 트립토판 프로모터 오퍼레이터 (트립토판과 복합체화되는 경우, TrpR 리프레서 단백질은 오퍼레이터와 결합하는 입체형태를 가지며; 트립토판의 부재 하에, TrpR 리프레서 단백질은 오퍼레이터와 결합하지 않는 입체형태를 가짐), 및 tac 프로모터는 오퍼레이터 (예를 들어, 문헌 [deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1983) 80:21-25]을 참조한다)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
적합한 프로모터의 다른 예는 즉시 초기 거대세포바이러스 (CMV) 프로모터 서열을 포함한다. 이 프로모터 서열은 이에 작동가능하게 연결된 임의의 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 높은 수준으로 유도할 수 있는 강력한 구성적 프로모터 서열이다. 유인원 바이러스 40 (SV40) 초기 프로모터(simian virus 40 (SV40) early promoter), 마우스 유방 종양 바이러스(mouse mammary tumor virus) (MMTV) 또는 인간 면역결핍 바이러스(human immunodeficiency virus) (HIV) 긴 말단 반복부(long terminal repeat) (LTR) 프로모터, MoMuLV 프로모터, 조류 백혈병 바이러스 프로모터(avian leukemia virus promoter), 엡스타인-바 바이러스 즉시 초기 프로모터(Epstein-Barr virus immediate early promoter), 로우스 육종 바이러스 프로모터(Rous sarcoma virus promoter), EF-1 알파 프로모터, 뿐만 아니라 인간 유전자 프로모터 예컨대, 그러나 이에 제한되지 않는, 액틴 프로모터, 미오신 프로모터, 헤모글로빈 프로모터, 및 크레아틴 키나제 프로모터를 포함하나, 이에 제한되지는 않는 다른 구성적 프로모터 서열이 또한 사용될 수 있다. 추가로, 본 발명은 구성적 프로모터의 사용으로 제한되어서는 안 된다. 유도성 프로모터도 본 발명의 일부로 고려된다. 유도성 프로모터의 사용은 발현이 요망될 때 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 켜거나 발현이 요망되지 않을 때 발현을 끌 수 있는 분자 스위치를 제공한다. 유도성 프로모터의 예는 메탈로티오닌 프로모터, 글루코코르티코이드 프로모터, 프로게스테론 프로모터, 및 테트라사이클린 프로모터를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 적합한 프로모터를 함유하는 유전자좌 또는 작제물 또는 이식유전자(transgene)는 유도성 시스템의 유도를 통해 비가역적으로 스위칭된다. 비가역적 스위치의 유도에 적합한 시스템은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있으며, 예를 들어 비가역적 스위치의 유도는 Cre-lox-매개 재조합(mediated recombination )을 이용할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Fuhrmann-Benzakein, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2000) 28:e99]을 참조하며, 이 문헌의 내용은 본원에 참조로 포함됨). 관련 기술분야에 공지된 리콤비나제(recombinase), 엔도뉴클레아제(endonuclease), 리가제(ligase), 재조합 부위 등의 임의의 적합한 조합이 비가역적으로 스위칭가능한 프로모터를 생성하는데 사용될 수 있다. 본원의 다른 곳에 기재된 부위-특이적 재조합을 수행하기 위한 방법, 메커니즘, 및 요건은 비가역적으로 스위칭된 프로모터를 생성하는 데 사용되며 관련 기술분야에 널리 공지되어 있으며, 예를 들어, 문헌 [Grindley et al. Annual Review of Biochemistry (2006) 567-605]; 및 [Tropp, Molecular Biology (2012) (Jones & Bartlett Publishers, Sudbury, Mass.)]을 참조하며, 이 문헌들의 개시내용은 본 문서에 참조로 포함된다.
본 개시내용의 핵산은 발현 벡터 및/또는 클로닝 벡터 내에 존재할 수 있다. 발현 벡터는 선별 마커(selectable marker), 복제 기점, 및 벡터의 복제 및/또는 유지를 제공하는 기타 특징을 포함할 수 있다. 적합한 발현 벡터는, 예를 들어, 플라스미드, 바이러스 벡터 등을 포함한다. 다수의 적합한 벡터 및 프로모터가 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있으며; 대상 재조합 작제물을 생성하기 위해 많은 것들이 시판되고 있다. 다음의 벡터는 예로서 제공되며 어쨌든 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다: 박테리아: pBs, phagescript, PsiX174, pBluescript SK, pBs KS, pNH8a, pNH16a, pNH18a, pNH46a (Stratagene, La Jolla, Calif., USA); pTrc99A, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, 및 pRIT5 (Pharmacia, Uppsala, Sweden). 진핵생물: pWLneo, pSV2cat, pOG44, PXR1, pSG (Stratagene) pSVK3, pBPV, pMSG 및 pSVL (Pharmacia).
발현 벡터는 일반적으로 이종 단백질(heterologous proteins)을 코딩하는 핵산 서열의 삽입을 제공하기 위해 프로모터 서열 근처에 위치한 편리한 제한 부위를 갖는다. 발현 숙주에서 작동하는 선별 마커가 존재할 수 있다. 적합한 발현 벡터는 바이러스 벡터 (예를 들어, 백시니아 바이러스(vaccinia virus); 폴리오바이러스(polioviru); 아데노바이러스 (예를 들어, 문헌 [Li et al., Invest. Opthalmol. Vis. Sci. (1994) 35: 2543-2549; Borras et al., Gene Ther. (1999) 6: 515-524; Li and Davidson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92: 7700-7704; Sakamoto et al., H. Gene Ther. (1999) 5: 1088-1097]; WO 94/12649, WO 93/03769; WO 93/19191; WO 94/28938; WO 95/11984 및 WO 95/00655을 참조한다); 아데노-연관 바이러스 (예를 들어, 문헌 [Ali et al., Hum. Gene Ther. (1998) 9: 81-86, Flannery et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1997) 94: 6916-6921; Bennett et al., Invest. Opthalmol. Vis. Sci. (1997) 38: 2857-2863; Jomary et al., Gene Ther. (1997) 4:683 690, Rolling et al., Hum. Gene Ther. (1999) 10: 641-648; Ali et al., Hum. Mol. Genet. (1996) 5: 591-594; Srivastava in WO 93/09239, Samulski et al., J. Vir. (1989) 63: 3822-3828; Mendelson et al., Virol. (1988) 166: 154-165]; 및 [Flotte et al., Proc. Natl. Acad. USA (1993) 90: 10613-10617]을 참조한다); 단순 포진 바이러스; 인간 면역결핍 바이러스 (예를 들어, 문헌 [Miyoshi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1997) 94: 10319-23; Takahashi et al., J. Virol. (1999) 73: 7812-7816]을 참조한다)를 기반으로 한 바이러스 벡터; 레트로바이러스 벡터 (예를 들어, 뮤린 백혈병 바이러스(Murine Leukemia Virus), 비장 괴사 바이러스(spleen necrosis virus), 및 레트로바이러스 예컨대 로우스 육종 바이러스(Rous Sarcoma Virus), 하비 육종 바이러스(Harvey Sarcoma Virus), 조류 백혈병 바이러스(avian leukosis virus), 인간 면역결핍 바이러스, 골수증식성 육종 바이러스(myeloproliferative sarcoma virus), 및 유방 종양 바이러스로부터 유래된 벡터) 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
사용하기에 적합한 추가 발현 벡터는, 예를 들어, 제한 없이 렌티바이러스 벡터, 감마 레트로바이러스 벡터, 거품성(foamy) 바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 폭스 바이러스 벡터, 헤르페스 바이러스 벡터, 조작된 하이브리드 바이러스 벡터, 트랜스포존 매개 벡터(transposon mediated vector) 등이다. 바이러스 벡터 기술은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌 [Sambrook et al., 2012, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, volumes 1-4, Cold Spring Harbor Press, NY)], 및 기타 바이러스학 및 분자 생물학 매뉴얼에 기재되어 있다. 벡터로서 유용한 바이러스는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스, 헤르페스 바이러스, 및 렌티바이러스를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
일반적으로, 적합한 벡터는 적어도 하나의 유기체에서 기능적인 복제 기점, 프로모터 서열, 편리한 제한 엔도뉴클레아제 부위, 및 하나 이상의 선별 마커를 함유한다 (예를 들어, WO 01/96584; WO 01/29058; 및 미국 특허 번호 6,326,193).
일부 실시양태에서, 발현 벡터 (예를 들어, 렌티바이러스 벡터)는 핵산을 숙주 세포 내로 도입하는데 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 발현 벡터 (예를 들어, 렌티바이러스 벡터)는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 발현 벡터 (예를 들어, 렌티바이러스 벡터)는 그 안에 코딩된 폴리펩티드의 기능적 발현을 보조할 추가 요소를 포함할 것이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터는 포유동물 프로모터를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 벡터는 신장 인자-1-알파 프로모터(elongation-factor-1-alpha promoter) (EF-1α 프로모터)를 추가로 포함한다. EF-1α 프로모터를 사용하면 하류 이식유전자(downstream transgene)의 발현 효율이 증가할 수 있다. 생리학적 프로모터 (예를 들어, EF-1α 프로모터)는 통합 매개 유전독성(integration mediated genotoxicity)을 유도할 가능성이 낮을 수 있으며 레트로바이러스 벡터가 줄기 세포를 형질전환시키는 능력을 저지할 수 있다. 벡터 (예를 들어, 렌티바이러스 벡터)에 사용하기에 적합한 다른 생리학적 프로모터는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있으며 본 발명의 벡터에 혼입될 수 있다. 일부 실시양태에서, 벡터 (예를 들어, 렌티바이러스 벡터)는 역가 및 유전자 발현을 개선할 수 있는 비필수적 시스 작용 서열(non-requisite cis acting sequence)을 추가로 포함한다. 비필수적 시스 작용 서열의 한 가지 비제한적 예는 효율적인 역전사 및 핵 내수송(nuclear import)에 중요한 중앙 폴리퓨린 관(central polypurine tract) 및 중앙 종결 서열(central termination sequence) (cPPT/CTS)이다. 다른 비필수적 시스 작용 서열은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있으며 본 발명의 벡터 (예를 들어, 렌티바이러스 벡터)에 혼입될 수 있다. 일부 실시양태에서, 벡터는 전사후 조절 요소(posttranscriptional regulatory element)를 추가로 포함한다. 전사후 조절 요소는 RNA 번역을 개선하고 이식유전자 발현을 개선하며 RNA 전사체를 안정화시킬 수 있다. 전사후 조절 요소의 한 예는 우드척 간염 바이러스 전사후 조절 요소(woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element) (WPRE)이다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본 발명을 위한 벡터는 WPRE 서열을 추가로 포함한다. 다양한 전사후 조절인자 요소가 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있으며 본 발명의 벡터 (예를 들어, 렌티바이러스 벡터)에 혼입될 수 있다. 본 발명의 벡터는 RNA 수송을 위한 rev 반응 요소(rev response element) (RRE), 패키징 서열, 및 5' 및 3' 긴 말단 반복부 (LTR)와 같은 추가 요소를 추가로 포함할 수 있다. 용어 "긴 말단 반복부" 또는 "LTR"은 U3, R 및 U5 영역을 포함하는 레트로바이러스 DNA의 말단에 위치한 염기 쌍의 도메인을 지칭한다. LTR은 일반적으로 레트로바이러스 유전자의 발현 (예를 들어, 유전자 전사체의 촉진, 개시 및 폴리아데닐화) 및 바이러스 복제에 필요한 기능을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 벡터 (예를 들어, 렌티바이러스 벡터)는 3' U3 결실된 LTR을 포함한다. 따라서, 본 발명의 벡터 (예를 들어, 렌티바이러스 벡터)는 이식유전자의 기능적 발현 효율을 증진시키기 위해 본원에 기재된 요소의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 벡터 (예를 들어, 렌티바이러스 벡터)는 CAR을 코딩하는 핵산 외에 WPRE 서열, cPPT 서열, RRE 서열, 5'LTR, 3' U3 결실 LTR'을 포함할 수 있다.
본 발명의 벡터는 자가-불활성화 벡터(self-inactivating vector)일 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "자가 불활성화 벡터"는 3' LTR 인핸서 프로모터 영역 (U3 영역)이 변형된 (예를 들어, 결실 또는 치환에 의해) 벡터를 지칭한다. 자가-불활성화 벡터는 바이러스 복제의 첫 번째 라운드 이후에 바이러스 전사를 방지할 수 있다. 결과적으로, 자가-불활성화 벡터는 한 번만 숙주 게놈 (예를 들어, 포유동물 게놈)을 감염시킨 다음에 그에 통합될 수 있으며, 더 이상 통과할 수 없다. 따라서, 자가-불활성화 벡터는 복제-적격 바이러스(replication-competent virus)의 생성 위험을 크게 줄일 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 핵산은 RNA, 예를 들어 시험관내 합성 RNA일 수 있다. RNA의 시험관내 합성 방법은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있으며; 임의의 공지된 방법을 사용하여 본 개시내용의 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 포함하는 RNA를 합성할 수 있다. RNA를 숙주 세포 내로 도입하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Zhao et al. Cancer Res. (2010) 15: 9053]을 참조한다. 본 개시내용의 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 RNA를 숙주 세포 내로 도입하는 것은 시험관내, 생체외 또는 생체내에서 수행될 수 있다. 예를 들어, 숙주 세포 (예를 들어, NK 세포, 세포독성 T 림프구 등)는 본 개시내용의 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 RNA를 사용하여 시험관내 또는 생체 외에서 전기천공될 수 있다.
폴리펩티드 (예를 들어, 항체) 또는 이의 일부의 발현을 평가하기 위해, 세포 내로 도입될 발현 벡터는 또한 선별 마커 유전자 또는 리포터 유전자, 또는 둘 다를 함유하여, 바이러스 벡터를 통해 형질감염 또는 감염시키려는 세포 집단으로부터의 세포 발현의 식별 및 선택을 용이하게 할 수 있다. 일부 실시양태에서, 선별 마커는 별도의 DNA 조각 상에 운반될 수 있고 공동-형질감염 절차에 사용될 수 있다. 선별 마커와 리포터 유전자 둘 다는 숙주 세포에서 발현을 가능하게 하는 적절한 조절 서열과 플랭크(flank)될 수 있다. 유용한 선별 마커는, 제한 없이, 항생제-내성 유전자를 포함한다.
리포터 유전자는 잠재적으로 형질감염된 세포를 식별하고 조절 서열(regulatory sequence)의 기능성을 평가하는 데 사용된다. 일반적으로, 리포터 유전자는 수용자 유기체 또는 조직에 존재하지 않거나 이에 의해 발현되지 않으며 효소 활성과 같은 일부 쉽게 감지할 수 있는 특성에 의해 발현이 나타나는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자이다. 리포터 유전자의 발현은 DNA가 수용자 세포에 도입된 후 적절한 시기에 평가된다. 적합한 리포터 유전자는, 제한 없이, 루시퍼라제, 베타-갈락토시다제, 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제, 분비된 알칼리성 포스파타제, 또는 녹색 형광 단백질 유전자를 코딩하는 유전자를 포함할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Ui-Tei et al., 2000 FEBS Letters 479: 79-82]).
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 핵산은 예를 들어 숙주 세포에서 본원에 기재된 바와 같은 항체 또는 항원-결합 단편의 생산을 위해 제공된다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 핵산은 폴리펩티드-코딩 핵산의 증폭을 제공한다.
항체 약물 접합체 (ADC)
또한, 본 발명에는 약물 (예를 들어, 세포독성 약물), 또는 독소, 또는 방사성 동위원소 분자에 연결되거나 접합된 본원에 개시된 항체 또는 이의 항원-결합 단편 중 임의의 것을 포함하는, 항체 약물 접합체 (ADC)와 같은 면역접합체가 제공된다. 특정한 실시양태에서, ADC는 본원에 개시된 항체 또는 항원-결합 단편 및 세포독성 약물, 예컨대 MMAE 또는 SN38로 구성된다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 ADC는 인간 EPH 수용체 A5 발현 세포를 효과적으로 근절하기 위해 상기 세포를 특이적으로 표적으로 할 수 있다. 제공된 실시양태에서, ADC는 인간 EphA5와 같은 EphA5에 대한 항체 또는 항원-결합 단편의 결합 시 세포에 의해 내재화될 수 있다.
제공된 ADC에서의 예시적인 항체 또는 항원-결합 단편은 "항체 및 항원-결합 단편" 섹션에서와 같이, 본원에 기재된 바와 같은 임의의 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, ADC와 같은 면역접합체는 화학식 Ab-(L-D)를 가지며, 여기서 Ab는 본원에 기재된 임의의 것과 같은, 항체 또는 이의 항원-결합 단편이고; L은 링커이고; D는 세포독성 약물이다.
특정 실시양태에서, ADC는 서열번호: 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호: 11에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, ADC는 중쇄가 중쇄 인간 불변 도메인 (예를 들어, 서열번호: 14)을 추가로 포함하고 경쇄가 경쇄 인간 불변 도메인 (예를 들어, 서열번호: 15)을 추가로 포함하는 전장 항체이다. 일부 실시양태에서, ADC는 서열번호: 38에 제시된 중쇄 및 서열번호: 40에 제시된 경쇄를 포함하는 항체를 포함한다.
특정 실시양태에서, ADC는 서열번호: 6에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호: 11에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, ADC는 중쇄가 중쇄 인간 불변 도메인 (예를 들어, 서열번호: 14)을 추가로 포함하고 경쇄가 경쇄 인간 불변 도메인 (예를 들어, 서열번호: 15)을 추가로 포함하는 전장 항체이다. 일부 실시양태에서, ADC는 서열번호: 39에 제시된 중쇄 및 서열번호: 40에 제시된 경쇄를 포함하는 항체를 포함한다.
통상의 기술자에게 공지된 바와 같이 다양한 세포독성 약물 중 임의의 것이 이용될 수 있다. 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 메이탄시노이드 (DM1), 또는 SSTR2-결합 옥트레오타이드를 포함하나, 이에 제한되지는 않는, 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 임의의 약물 또는 세포독성제, 또는 파클리탁셀, 다우노루비신, 두오카르마이신 A, 5-플루루라실, 메토트렉세이트, 튜불린 중합 억제제, 라브탄신 (DM4), 및 리신 A를 포함하나 이에 제한되지는 않는 독소에 연결되거나 접합될 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 ADC는 모노메틸 아우리스타틴 E (MMAE) 또는 모노메틸 아우리스타틴 F (MMAF)을 포함하나 이에 제한되지는 않는 아우리스타틴에 연결되거나 접합될 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 ADC는 약물의 활성 대사산물에 연결되거나 접합될 수 있다. 이러한 약물의 비제한적인 예는 이리노테칸의 활성 대사산물인 SN-38이다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 약물 또는 세포독성제의 원하는 특성 및 ADC에 의해 표적화되는 세포의 특성을 기반으로 하여 본 발명의 항체에 접합시킬 약물 또는 세포독성제를 선택할 수 있을 것이다. 예시적인 세포독성 약물은 하기에 추가로 기재된다. 일부 실시양태에서, 세포독성 약물은 모노메틸 아우리스타틴 E (MMAE)이다. 일부 실시양태에서, 세포독성 약물은 SN-38이다.
통상의 기술자에게 공지된 바와 같이 다양한 링커 중 임의의 것이 이용될 수 있다. 예시적인 링커는 하기에 기재된다. 일부 실시양태에서, 링커는 절단가능한 링커이다. 일부 실시양태에서, 링커는 카텝신-절단가능한 링커이다. 일부 실시양태에서, 링커는 pH 절단가능한 링커이다.
일부 실시양태에서, 제공된 접합체 내 약물 항체 비율 (DAR)은 4 또는 약 4 내지 8 또는 약 8이다. 일부 실시양태에서, DAR은 4 또는 약 4이다. 일부 실시양태에서, DAR은 8 또는 약 8이다.
특정 실시양태에서, 제공된 ADC 중에는 항체 또는 항원-결합 단편이 결합 시 표적 세포 내로, 예를 들어 세포 내 분해 구획(degradative compartment) 내로 내재화되는 것들이 있다. 일부 실시양태에서, 제공된 ADC는 따라서 표적 세포에 결합 시 내재화되고, 분해를 겪고, 약물 모이어티를 방출하여 암 세포를 사멸하는 것들이다. 약물 모이어티는 효소 작용, 가수분해, 산화, 또는 임의의 다른 메커니즘에 의해 항체 및/또는 ADC의 링커 모이어티로부터 방출될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, ADC의 항체는 세포 (예를 들어, 암 세포)의 표면 상에 발현된 EphA5에 결합하고 결합 시 세포에 진입한다. 일부 실시양태에서, ADC의 약물 모이어티는 ADC가 진입한 후 ADC의 항체 모이어티로부터 방출되고 EphA5 항원을 발현하는 세포에 존재한다 (즉, ADC가 내재화된 후).
세포독성 약물
특정 실시양태에서, 세포독성 약물은 (S)-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-히드록시-1-페닐프로판-2-일)아미노)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)-N,3-디메틸-2-((S)-3-메틸-2-(메틸아미노)부탄아미도)부탄아미드, (모노메틸 아우리스타틴 E (MMAE))이다. 특정 실시양태에서, 세포독성 약물은 (S)-4,11-디에틸-4,9-디히드록시-1,12-디히드로-14H-피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-3,14(4H)-디온, (SN38)이다.
링커
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 항체 또는 항원-결합 단편 (Ab)은 링커 (L)를 통해 세포독성 약물 (D)에 접합된다. 특정 실시양태에서, 링커는 항체 접합 말단 및 카르복시 말단을 포함한다.
특정 실시양태에서, 항체 접합 말단은 티올-접합 말단을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항체 접합 말단은 이황화물-접합 말단을 포함한다. 특정 실시양태에서, 티올-접합 말단은 마이클 수용체(Michael acceptor)를 포함한다. 특정 실시양태에서, 티올-접합 말단은 링커의 마이클 수용체와 항체의 시스테인 사이의 마이클 첨가를 통해 항체에 접합된다. 특정 실시양태에서, 마이클 수용체는 말레이미드이다. 특정 실시양태에서, 이황화물-접합 말단은 비스술폰, 3,4-이치환 말레이미드, 브로모말레이미드, 및/또는 알릴 술폰으로 이루어진 군으로부터 선택된 모이어티를 포함한다. 이황화물-접합 모이어티의 추가 예는 문헌 [Kuan et al. (Chem. Eur. J. 2016, 22(48):17112-17129)]에서 찾아진다. 특정 실시양태에서, 비스술폰은 3-(아릴술포닐)-2-((아릴술포닐)메틸)프로파노일 모이어티를 포함한다. 특정 실시양태에서, 이황화물-접합 말단은 링커의 3-(아릴술포닐)-2-((아릴술포닐)메틸)프로파노일 모이어티와 항체의 이황화물과의 반응을 통해 항체에 접합된다.
특정 실시양태에서, 링커는 카르바메이트를 통해 세포독성 약물에 접합된다. 특정 실시양태에서, 카르바메이트는 세포독성 약물의 아민 및 링커의 카르복시 모이어티로부터 유래된다. 특정 실시양태에서, 링커는 탄산 에스테르를 통해 세포독성 약물에 접합된다. 특정 실시양태에서, 탄산 에스테르는 세포독성 약물의 알코올 모이어티 및 링커의 카르복시 모이어티로부터 유래된다. 특정 실시양태에서, 링커는 하나 초과의 세포독성 약물에 접합된다.
링커는 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜 모이어티를 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서 제1 연결 성분과 제2 연결 성분 (및 이에 따른 전체 링커) 둘 다는 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜 반복부를 함유한다. 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜-기반 링커는 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜을 함유하지 않는 링커에 비해 뚜렷한 이점을 제공할 수 있다. 예를 들어, 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜-기반 링커는 더 큰 유연성(flexibility)을 제공할 수 있으므로, 예를 들어, 링커가 항원-결합 도메인에 매우 근접한 아미노산 잔기에 접합된 경우 (예를 들어, 초가변 영역), 링커/치료제가 항원/수용체의 표면 요소에 결합하거나 이와 상호작용하여 전체 면역접합체를 더욱 치료적으로 효과적으로 만들 것이다. 게다가, 링커가 클릭 화학 (예를 들어, DBCO 및 N3 사용)을 통해 생성되는 이러한 실시양태에서, 이론에 얽매이기를 바라지 않지만, 연결 성분에서 에틸렌 글리콜 및/또는 프로필렌 글리콜의 사용은 스페이서로서 작용하여 트리아졸 모이어티에서 발견되는 테트라사이클릭 고리 구조와 노출된 방향족 측쇄, 특히 트립토판 측쇄 사이의 비특이적 상호작용 (파이-파이 상호작용)을 방지할 수 있다. 본 개시내용의 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜-기반 링커는 총 1-30개의 에틸렌 글리콜 및/또는 프로필렌 글리콜 단위 사이의 어딘가에 반복부, 예를 들어 제1 연결 성분과 제2 연결 성분을 활용하는 이러한 실시양태에서는 제1 연결 성분과 제2 연결 성분 각각당 1-10개의 에틸렌 글리콜 및/또는 프로필렌 글리콜 단위의 반복부를 포함할 수 있다.
이러한 면역접합체의 공유 연결은 절단가능한 연결 모이어티, 예를 들어 리소좀 내부의 카텝신 B에 의해 절단가능한 Val-Cit 링커 또는 Val-Cit-PAB와 같은 카텝신 절단가능한 링커를 포함할 수 있다. 시판되는 Val-Cit 링커가 본원에 기재된 바와 같이 사용되었다. 다른 절단가능한 연결 모이어티는 카텝신 B에 의해서도 절단가능한 Phe-Lys 링커를 포함할 수 있다. 가장 간단한 절단가능한 연결 모이어티 중 일부는 환원성 (즉, 세포내) 환경에서 절단가능한 이황화물 (S-S) 브릿지를 포함한다. 그러나, Val-Cit 링커와 같은 절단가능한 연결 모이어티는 예를 들어 무분별한 절단을 겪을 수 있는 이황화물 브릿지보다 더 많은 특이성을 제공하므로 우수한 옵션을 제시하지만, 임의의 이러한 절단가능한 연결 모이어티는 본 개시내용의 범위 내에서 고려되어야 한다. 본 개시내용의 맥락에서 적합할 수 있는 절단가능한 연결 모이어티의 개요는 문헌 [Leriche et al. (Bioorg. Med. Chem. 2012, 20(2):571-582)]에 제공되어 있으며, 이 문헌은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
대안적으로, 링커는 절단불가능할 수 있다. 절단불가능한 링커는 세포내 환경에서 절단에 저항성인 임의의 연결 모이어티를 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, 링커는 (MC-VCP)을 포함한다. 특정 실시양태에서, 링커는 (CL2A)을 포함한다. 특정 실시양태에서, 링커는 을 포함한다. 특정 실시양태에서, 링커는 을 포함한다.
특정 실시양태에서, L-D는 (MC-VCP-MMAE)을 포함한다.
특정 실시양태에서, L-D는 (CL2A-SN38)을 포함한다.
특정 실시양태에서, L-D는 (티오브릿지®-VCP-MMAE)을 포함한다.
특정 실시양태에서, L-D는 (티오브릿지®-(VCP-SN38)2)을 포함한다.
일부 실시양태에서, 화학식 Ab-(L-D)를 갖는 ADC와 같은 면역접합체가 제공되며, 여기서 Ab는 서열번호: 38에 제시된 중쇄 및 서열번호: 40에 기재된 경쇄를 포함하는 인간 EPH 수용체 A5 (EPHA5)의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체이고; L-D는 하기 구조식을 포함한다:
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일부 실시양태에서, 화학식 Ab-(L-D)를 갖는 ADC와 같은 면역접합체가 제공되며, 여기서 Ab는 서열번호: 39에 제시된 중쇄 및 서열번호: 40에 제시된 경쇄를 포함하는 인간 EPH 수용체 A5 (EPHA5)의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체이고; L-D는 하기 구조식을 포함한다:
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약제학적 조성물 및 제형
또한, 본원에 개시된 항체, 항원-결합 단편 및 면역접합체 (예를 들어, 항체 약물 접합체) 중 어느 하나를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다. 조성물 중에는 질환 또는 장애의 치료, 개선 및/또는 예방과 같은 투여용 약제학적 조성물 및 제형이 있다. 또한, 대상체, 예를 들어 환자에게 약제학적 조성물을 투여하기 위한 치료 방법이 제공된다.
약제학적 조성물 및 제형은 일반적으로 하나 이상의 임의적 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 적어도 하나의 추가 치료제를 포함한다.
용어 "제약 제형"은 그 안에 함유된 활성 성분의 생물학적 활성이 효과적이도록 하는 형태로 되어 있고, 제제가 투여될 대상체에게 허용될 수 없을 정도로 독성이 있는 어떤 추가 성분도 함유하지 않는 제형을 지칭한다.
"약제학적으로 허용되는 담체"는 활성 성분 이외의, 대상체에게 독성이 없는 제약 제형 중의 성분을 지칭한다. 약제학적으로 허용되는 담체는 완충제, 부형제, 안정화제, 또는 방부제를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
일부 측면에서 담체의 선택은 부분적으로 특정한 조성물 및/또는 투여 방법에 의해 결정된다. 따라서, 다양한 적합한 제형이 있다. 예를 들어, 약제학적 조성물은 방부제를 함유할 수 있다. 적합한 방부제는, 예를 들어, 메틸파라벤, 프로필파라벤, 벤조산나트륨, 및 벤잘코늄 클로라이드를 포함할 수 있다. 일부 측면에서는 2개 이상의 방부제의 혼합물이 사용된다. 방부제 또는 이의 혼합물은 전형적으로 전체 조성물의 중량을 기준으로 약 0.0001 중량% 내지 약 2 중량%의 양으로 존재한다. 담체는 예를 들어 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 기재되어 있다. 약제학적으로 허용되는 담체는 일반적으로 이용된 투여량 및 농도에서 수용자에게 무독성이며, 다음을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다: 완충제 예컨대 포스페이트, 시트레이트, 및 기타 유기 산; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 방부제 (예컨대 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤잘코늄 클로라이드; 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 사이클로헥사놀; 3-펜탄올; 및 m-크레졸 등); 저분자량 (약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 중합체 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 리신; 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함한, 단당류, 이당류, 및 기타 탄수화물; 킬레이트제 예컨대 EDTA; 당류 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 반대-이온 예컨대 나트륨; 금속 복합체 (예를 들어, Zn-단백질 복합체); 및/또는 비이온성 계면활성제 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 (PEG).
일부 측면에서 완충제가 조성물에 포함된다. 적합한 완충제는 예를 들어 시트르산, 시트르산나트륨, 인산, 인산칼륨, 및 다양한 기타 산 및 염을 포함한다. 일부 측면에서는 2개 이상의 완충제의 혼합물이 사용된다. 완충제 또는 이의 혼합물은 전형적으로 전체 조성물의 중량을 기준으로 약 0.001 중량% 내지 약 4 중량%의 양으로 존재한다. 투여가능한 약제학적 조성물을 제조하는 방법은 공지되어 있다. 예시적인 방법은, 예를 들어, 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins; 21st ed. (May 1, 2005)]에 더 상세히 기재되어 있다.
일부 실시양태에서, 제형은 수용액을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 제형은 동결건조 제형을 포함할 수 있다.
제형 또는 조성물은 또한 조성물, 바람직하게는 각각의 활성이 서로에게 부정적인 영향을 미치는 경우, 조성물에 상보적인 활성을 가진 것들로 치료, 개선 및/또는 예방되는 특정한 적응증, 질환, 또는 병태에 유용한 하나 초과의 활성 성분을 함유할 수 있다. 이러한 활성 성분은 의도된 목적에 효과적인 양으로 적합하게 조합되어 존재한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 약제학적 조성물은 항암제와 같은 다른 제약상 활성제 또는 약물을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 항암 약물은 화학요법제, 예를 들어 아스파라기나제, 부술판, 카르보플라틴, 시스플라틴, 다우노루비신, 독소루비신, 플루오로우라실, 젬시타빈, 히드록시우레아, 메토트렉세이트, 파클리탁셀, 리툭시맙, 빈블라스틴, 및/또는 빈크리스틴이다.
일부 실시양태에서 약제학적 조성물은 질환 또는 병태를 치료, 개선 및/또는 예방하는데 효과적인 양, 예컨대 치료학적 유효량 또는 예방 유효량으로 조성물을 함유한다. 일부 실시양태에서 치료 또는 예방 효능은 치료 대상체의 주기적인 평가에 의해 모니터링된다. 며칠 이상 반복 투여하는 경우, 상태에 따라 원하는 질환 증상 억제가 나타날 때까지 치료를 반복한다. 그러나, 다른 투여 요법이 유용할 수 있으며 결정될 수 있다. 원하는 투여량은 조성물의 단일 볼루스 투여, 조성물의 다중 볼루스 투여, 또는 조성물의 연속 주입 투여에 의해 전달될 수 있다.
제형은 경구, 정맥내, 복강내, 피하, 폐, 경피, 근육내, 비강내, 협측, 설하, 또는 좌약 투여를 위한 것들을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 비경구로 투여된다. 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "비경구"는 정맥내, 근육내, 피하, 직장, 질, 및 복강내 투여를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 정맥내, 복강내 또는 피하 주사에 의한 말초 전신 전달을 사용하여 대상체에게 투여된다. 제공된 조성물은 표준 투여 기술, 제형 및/또는 장치를 사용하여 투여될 수 있다. 조성물의 보관 및 투여를 위한 제형 및 주사기 및 바이알과 같은 장치가 제공된다.
일부 실시양태에서 조성물은 멸균 액체 제제, 예를 들어 등장성 수용액, 현탁액, 에멀젼, 분산액, 또는 점성 조성물로서 제공되며, 이는 일부 측면에서 선택된 pH로 완충될 수 있다. 액체 제제는 일반적으로 겔, 기타 점성 조성물 및 고체 조성물보다 제조하기가 더 쉽다. 게다가, 액체 조성물은 특히 주사를 통해 투여하기가 다소 더 편리하다. 다른 한편으로는, 점성 조성물은 특정 조직과의 더 긴 접촉 기간을 제공하기 위해 적절한 점도 범위 내에서 제제화될 수 있다. 액체 또는 점성 조성물은, 예를 들어, 물, 식염수, 인산염 완충 식염수, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜) 및 이의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있는 담체를 포함할 수 있다.
멸균 주사용 용액은 적합한 담체, 희석제, 또는 부형제 예컨대 멸균수, 생리 식염수, 글루코스, 덱스트로스 등과 혼합하여 용매에 조성물을 혼입시켜 제조할 수 있다. 조성물은 원하는 투여 경로 및 제제에 따라 보조 물질 예컨대 습윤제, 분산제, 또는 유화제 (예를 들어, 메틸셀룰로오스), pH 완충제, 겔화제 또는 점도 증진 첨가제, 방부제, 향미제, 및/또는 색소를 함유할 수 있다. 적합한 제제를 제조하기 위해 일부 측면에서 표준 텍스트를 참조할 수 있다.
항미생물 방부제, 항산화제, 킬레이트제 및 완충제를 포함한, 조성물의 안정성 및 멸균성을 향상시키는 다양한 첨가제가 첨가될 수 있다. 다양한 항균제 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르빈산에 의해 미생물의 작용 예방이 보장될 수 있다. 주사용 제약 형태의 장기간 흡수는 흡수 지연제, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 사용하여 초래될 수 있다.
생체내 투여에 사용되는 제형은 일반적으로 멸균되어 있다. 무균은 예를 들어 무균 여과막을 통한 여과를 통해 쉽게 완수될 수 있다.
치료, 개선 및/또는 예방 방법
또한, 본원에 기재된 제공된 항체 (전장 항체 또는 이의 항원-결합 단편 포함) 및 면역접합체 (예를 들어, 항체 약물 접합체) 중 어느 하나로 암과 같은 질환 또는 병태를 치료, 개선 및/또는 예방하기 위한 치료 방법 및 용도와 같은 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 제공된 항체 및 면역접합체 (예를 들어, 항체 약물 접합체) 중 어느 하나는 질환 또는 병태의 치료, 개선 및/또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 질환 또는 병태를 치료, 개선 및/또는 예방하기 위한 조성물에 포함될 수 있다. 상기 조성물은 약제학적 조성물을 포함할 수 있으며, 약제학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 치료학적 유효량의 약제학적 조성물이 대상체에게 투여될 수 있다.
일부 실시양태에서, 방법은 본원에 기재된 항체 및 면역접합체 (예를 들어, 항체 약물 접합체) 또는 이를 함유하는 조성물 중 어느 하나의 투여 방법 및 용도, 예컨대 치료 및 예방 용도를 포함한다. 이러한 방법 및 용도는 예를 들어, 제공된 항체 및 면역접합체 (예를 들어, 항체 약물 접합체) 또는 이를 함유하는 조성물 중 어느 하나를 EphA5와 연관된 질환, 병태 또는 장애를 갖는는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 치료 방법 및 용도를 포함한다. 또한, 본원에는 이러한 방법 및 치료, 그리고 이러한 치료 방법을 수행하기 위한 의약의 제조에서의 제공된 항체 및 면역접합체 (예를 들어, 항체 약물 접합체), 또는 이를 함유하는 조성물 중 어느 하나의 용도가 제공된다. 일부 실시양태에서, 질환, 병태 또는 장애는 EphA5 발현과 연관되고/되거나, 이 질환, 병태 또는 장애에서는 세포 또는 조직이 예를 들어 EphA5를 특이적으로 발현한다.
일부 실시양태에서, 제공된 항체 또는 면역접합체 (예를 들어, 항체 약물 접합체)를 함유하는 조성물은 질환 또는 장애의 치료, 개선 및/또는 예방을 달성하기 위한 유효량으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 방법은 제공된 항체 및 면역접합체 (예를 들어, 항체 약물 접합체), 또는 이를 함유하는 조성물 중 어느 하나를 질환 또는 병태를 갖고 있거나, 가졌거나, 가질 것으로 의심되는 대상체에게 투여함으로써 수행된다. 일부 실시양태에서, 이에 의한 방법은 대상체의 질환, 병태 또는 장애를 치료, 개선 및/또는 예방한다. 또한, 본원에는 EphA5와 연관된 질환 또는 장애, 예를 들어 암의 치료, 개선 및/또는 예방을 위한 조성물 중 어느 하나, 예컨대 본원에 제공된 약제학적 조성물의 용도가 제공된다.
치료, 개선 및/또는 예방될 질환 중에는 EphA5와 연관된 임의의 질환 또는 장애, 예컨대 BCMA가 특이적으로 발현되고/되거나 EphA5가 치료 표적이 된 임의의 질환 또는 장애가 있다 ("EphA5-연관 질환 또는 장애"로 상호교환적으로 본원에서도 언급됨). 일부 실시양태에서, 질환 또는 장애는 암이다. 특정 실시양태에서, 암은 인간 EPH 수용체 A5 (인간 EphA5)-발현 세포와 연관이 있다. 특정 실시양태에서, EPH 수용체 A5-발현 세포는 암 세포이다.
특정 측면에서, 암은 유방암, 폐암, 두경부암, 전립선암, 식도암, 기관암(tracheal cancer), 뇌암, 간암, 방광암, 위암, 췌장암, 난소암, 자궁암, 자궁경부암, 고환암, 결장암, 직장암 또는 피부암일 수 있다. 특정 측면에서, 암은 상피암이다. 다른 측면에서, 암은 결장직장 선암종(colorectal adenocarcinoma), 폐 선암종(lung adenocarcinoma), 폐 편평 세포 암종(lung squamous cell carcinoma), 유방암, 간세포 암종(hepatocellular carcinoma), 난소암, 신장 신장 투명 세포 암종(kidney renal clear cell carcinoma), 폐암 또는 신장암일 수 있다.
일부 실시양태에서, 제공된 항체 및 면역접합체 (예를 들어, 항체 약물 접합체), 및 이를 함유하는 조성물은 종양 세포가 표면 상에 EphA5를 발현하는 암을 치료, 개선 및/또는 예방하는 데 사용될 수 있다. EphA5를 발현하는 예시적인 종양 유형은 폐암 (Staquicini, F. I., et al. (2015). Receptor tyrosine kinase EphA5 is a functional molecular target in human lung cancer. The Journal of Biological Chemistry, 290(12), 7345-7359), 유방암, 자궁경부암, 두경부암, 식도암 (Zhang R, et al. EphA5 knockdown enhances the invasion and migration ability of esophageal squamous cell carcinoma via epithelial-mesenchymal transition through activating Wnt/beta-catenin pathway. Cancer Cell Int. 2020;Jan 13,20:20), 위암 (Zhang, W., et al. (2019). Differential expression of EphA5 protein in gastric carcinoma and its clinical significance. Oncology letters, 17(6), 5147-5153.), 췌장관 선암종(pancreatic ductal adenocarcinoma) (Giaginis C, et al. Clinical significance of ephrin (eph)-A1, -A2, -a4, -a5 and -a7 receptors in pancreatic ductal adenocarcinoma. Pathol Oncol Res. 2010;16(2):267-276.), 및 난소암 (Chen X, et al. EphA5 protein, a potential marker for distinguishing histological grade and prognosis in ovarian serous carcinoma. J Ovarian Res. 2016;9:83)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 제공된 항체 및 면역접합체 (예를 들어, 항체 약물 접합체), 및 이를 함유하는 조성물은 폐암, 유방암, 자궁경부암, 췌장관 선암종, 또는 난소암을 치료, 개선 및/또는 예방하는 데 사용될 수 있다. 특정한 실시양태에서, 암은 폐암이다. 일부 실시양태에서, 암은 비소세포폐암(non-small cell lung cancer) (NSCLC)이다.
일부 실시양태에서, 방법은 EphA5-연관 질환 또는 장애를 앓고 있거나, 가질 것으로 의심되거나, 발병할 위험이 있는 대상체를 식별할 수 있다. 따라서, 상승된 EphA5 발현과 연관된 질환 또는 장애를 가진 대상체를 식별하고 제공된 항체 및 면역접합체 (예를 들어 항체 약물 접합체) 또는 이를 함유하는 조성물 중 어느 하나로 치료하기 위해 이들을 선택하는 방법이 제공된다. 예를 들어, 대상체는 EphA5-발현 암과 같은 상승된 EphA5 발현과 연관된 질환 또는 장애의 존재에 대해 스크리닝될 수 있다. 일부 측면에서, 샘플은 상승된 EphA5 발현과 연관된 질환 또는 장애를 갖는 것으로 의심되는 환자로부터 수득되고 EphA5의 발현 수준에 대해 검정될 수 있다. 일부 측면에서, EphA5-연관 질환 또는 장애에 대해 양성 반응을 보인 대상체는 본 방법에 의한 치료를 위해 선택될 수 있으며, 제공된 항체 및 면역접합체 (예를 들어, 항체 약물 접합체) 또는 본원에 기재된 것과 동일한 것을 함유하는 조성물 중 어느 하나의 치료학적 유효량을 투여받을 수 있다. 일부 실시양태에서, 방법은 시간 경과에 따라, 예를 들어, 방법에 의한 치료 전, 치료 동안, 또는 치료 후에 EphA5-발현 조직, 예를 들어 종양의 크기 또는 밀도를 모니터링하는 데 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 투여량 및 경로로 투여될 수 있으며, 시기는 적절한 전임상 및 임상 실험 및 시험에서 결정될 수 있다. 조성물은 이들 범위 내의 투여량으로 다수회 투여될 수 있다. 조성물의 투여는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 결정되는 바와 같이 원하는 질환 또는 병태를 치료, 개선 및/또는 예방하는 데 유용한 다른 방법과 조합될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원의 조성물은 0.001 mg 내지 1000 mg, 예컨대 0.001 mg 내지 100 mg, 0.001 mg 내지 10 mg, 0.001 mg 내지 1 mg, 0.001 mg 내지 0.1 mg 또는 0.001 mg 내지 0.01 mg일 수 있는 제공된 항체 또는 면역접합체 (예를 들어, 항체 약물 접합체)의 유효량을 함유할 수 있다. 질환의 유형 및 중증도에 따라, 항체 또는 면역접합체 (예를 들어, 항체 약물 접합체)의 투여량은 약 1 μg/kg 내지 약 15 mg/kg (예를 들어, 0.1 mg/kg-10 mg/kg), 약 1 μg/kg 내지 약 100 mg/kg, 약 0.05 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 약 0.5 mg/kg, 약 2.0 mg/kg, 약 4.0 mg/kg 또는 약 10 mg/kg을 포함할 수 있다. 다중 용량은 간헐적으로, 예를 들어 매주 또는 3주마다 투여될 수 있다. 처음에는 더 높은 로딩 용량(loading dose)을 투여한 후, 1회 이상의 더 낮은 용량을 투여할 수 있다.
일부 실시양태에서, 항체는 전신 투여될 수 있다. 추가 측면에서, 항체는 정맥내, 피내, 종양내, 근육내, 복강내, 피하 또는 국소적으로 투여될 수 있다. 방법은 대상체에게 적어도 이차 항암 요법을 투여하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 이차 항암 요법의 예는 수술 요법, 화학요법, 방사선 요법, 냉동요법, 호르몬 요법, 면역요법, 또는 시토카인 요법 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 치료는 치료에 대한 대상체의 면역 반응을 유도하지 않고/하거나 질환 또는 병태의 효과적인 치료를 방해할 정도로 이러한 반응을 유도하지 않는다. 일부 측면에서, 면역원성 및/또는 이식편 대 숙주 반응의 정도는 상이하지만 유사한 치료법으로 관찰된 것보다 덜 하다. 예를 들어, 일부 실시양태에서 면역원성의 정도는 유사한, 예를 들어, 중첩 에피토프에 결합하고/하거나 기재된 바와 같이 참조 항체와 같은, EphA5에 대한 결합을 위해 제공된 항체와 경쟁하는 상이한 항체를 포함한 유사한 항체 약물 접합체와 비교하여 면역원성 정도가 감소된다.
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본 발명은 이의 구체적인 실시양태를 참조하여 기재되었긴 하지만, 본 발명의 진정한 사상과 범위를 벗어나지 않으면서 다양한 변화가 이루어질 수 있고 등가물이 대체될 수 있다는 것이 관련 기술분야의 통상의 기술자라면 이해할 수 있을 것이다. 본원에 개시된 실시양태의 범위를 벗어나지 않고 적합한 등가물을 사용하여 본원에 기재된 방법의 다른 적합한 수정 및 적합화(adaptation)가 이루어질 수 있는 것이 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 쉽게 명백할 것이다. 또한, 특정한 상황, 물질, 물질의 조성, 공정, 공정 단계 또는 단계들을 본 발명의 목적, 사상 및 범위에 적합화하기 위해 많은 수정이 이루어질 수 있다. 이러한 모든 수정은 여기에 첨부된 청구범위의 범위 내에 있도록 의도되었다. 이제 특정 실시양태들을 상세히 설명했지만, 단지 예시의 목적으로 포함되고 제한하려는 의도가 아닌, 다음의 실시예를 참조하여 상기 특정 실시양태들은 더욱 명확하게 이해될 것이다.
실험적 실시예
본 발명은 다음의 실험적 실시예를 참조하여 더욱 상세히 설명된다. 이들 실시예는 예시의 목적으로만 제공되며 달리 명시하지 않는 한 제한하려는 의도가 없다. 따라서, 본 발명은 결코 다음의 실시예에 제한되는 것으로 해석되어서는 안 되며, 오히려 본원에 제공된 교시내용의 결과로서 명백해지는 임의의 그리고 모든 변형을 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
추가 설명 없이도, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 전술한 설명 및 다음의 예시적인 실시예를 사용하여 본 발명의 화합물을 제조하고 활용하고 청구된 방법을 실시할 수 있다고 여겨진다. 따라서, 다음의 작업 실시예는 본 발명의 바람직한 실시예를 구체적으로 지적하며, 어떤 식으로든 본 개시내용의 나머지 부분을 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
실시예 1: 복합 인간 항체 기술을 사용한 인간화 11C12 항체의 생성 및 특성화
본 개시내용은 항-인간 EphA5 모노클로날 뮤린 11C12 항체를 코딩하는 V 영역 서열을 사용하여 뮤린 가변 영역 및 인간 불변 영역 (VH0/VK0)을 함유하는 키메라 항체 및 Composite Human Antibody™ 기술을 사용한 인간화 불변 영역 및 인간화 가변 영역을 함유하는 일련의 인간화 항체를 작제하는 작업을 상세히 설명한다. 키메라 및 설계된 인간화 변이체를 인간 IgG1 중쇄 불변 영역 (서열번호: 14) 및 인간 카파 경쇄 불변 영역 (서열번호: 15)을 코딩하는 벡터에 클로닝하였다.
키메라 및 30개의 인간화 항체 변이체 (표 E1)는 HEK293 EBNA 부착 세포에서 소규모로 일시적으로 발현되었고 상청액은 비아코어 (단일-주기 동역학 분석)를 사용하여 rhEphA5 항원에 대한 결합에 대해 테스트되었다. 6개의 리드 인간화 항체 변이체 (VH3/VK4, VH4/VK3, VH4/VK4, VH5/VK2, VH5/VK3 및 VH5/VK4)가 CHO 현탁액 세포에서 대규모로 일시적으로 발현되었다. 1 mL Hitrap™ MabSelect™ PrismA 컬럼을 사용하여 CHO 상청액으로부터 항체를 정제하고 완충제를 DPBS pH 7.4로 교환하였다. 키메라 및 인간화 항체 변이체를 SDS-PAGE에 의해 분석하고, 분석용 SE-HPLC를 다중-주기 동역학 분석 및 UNcle 생체안정성 플랫폼을 사용하여 평가하였다.
표 E1은 상응하는 중쇄 (VH) 또는 경쇄 (VL) 가변 영역 및 CDR의 아미노산 서열의 아미노산 (aa) 및 뉴클레오티드 (nt) 서열에 상응하는 서열 식별자 (서열번호)를 열거한다. CDR은 Kabat 넘버링 규칙을 기반으로 예시된다. 통상의 기술자는 가변 도메인 서열 및 전장 항체 서열의 CDR의 아미노산 잔기에 대한 대체 넘버링 규칙에 익숙하다. 예를 들어, 서열번호: 16으로 지정된 CDRH1에 대한 대안은 서열번호: 42로 지정된 CDRH1이다. 표 E1은 또한 후속 실시예에 기재된 바와 같이 대조군으로서 그리고 비교 연구를 위해 사용된 예시적인 키메라 마우스 가변/인간 불변 항-EphA5 참조 항체의 서열을 제시한다.
표 E1. 예시적인 클론 및 참조 항체에 대한 서열 식별자 (서열번호)
Composite Human Antibody™ 가변 영역의 설계
뮤린 항체 V 영역의 구조 모델은 Swiss PDB Viewer를 사용하여 생산되었으며 항체의 결합 특성에 필수적일 가능성이 있는 V 영역의 중요한 "제한" 아미노산을 확인하기 위해 분석되었다. 다수의 프레임워크 잔기와 함께 CDR (Kabat 및 Chothia 정의 둘 다 사용) 내에 포함된 대부분의 잔기가 중요한 것으로 간주되었다.
이 분석으로부터, 뮤린 항체의 복합 인간 서열은 CDR 외부의 대안적 잔기에 대해 넓은 지역(latitude)으로 생성될 수 있지만 CDR 서열 내의 가능한 잔기의 좁은 메뉴만을 사용하여 생성될 수 있는 것으로 간주되었다. 예비 분석은 몇몇 인간 항체로부터의 상응하는 서열 세그먼트를 조합하여 뮤린 서열의 CDR과 유사하거나 동일한 CDR을 생성할 수 있음을 나타냈다. CDR 외부 및 플랭킹 영역의 경우, 넓은 인간 서열 세그먼트 선택이 신규 인간화 V 영역의 가능한 구성요소로서 확인되었다. VH 및 VK에서 일부 중간 정도의-위험 잠재적 아스파르테이트 이성질체화 및 탈아미드화 위험이 확인되었으며 (도 27A-27B 참조) 하나의 더 높은 위험 이성질체화 부위 (VK CDR1)와 하나의 산 불안정 부위 (VK CDR3)도 확인되었다. 이들 중 일부는 인간화를 통해 해결될 수 있지만, 몇몇 책임은 CDR 영역 내에서 발견되며 그대로 유지될 가능성이 높다.
CD4+ T 세포 에피토프 회피
구조 분석을 기반으로 하여, 인간화 변이체를 생성하는 데 사용할 수 있는 대규모 예비 서열 세그먼트 세트를 선택하고 인간 MHC 클래스 II 대립유전자에 대한 펩티드 결합의 인실리코(in silico) 분석을 위한 iTope™ 기술을 사용하여 분석하였다 (Perry et al 2008). 가능한 경우, 인간 MHC 클래스 II에 대한 중요한 비인간 생식계열 결합제로 확인된 서열 세그먼트는 폐기되었다. 이로 인해 세그먼트 세트가 감소되었으며, 이들의 조합을 상기와 같이 다시 분석하여, 세그먼트 간의 접합이 잠재적인 T 세포 에피토프를 함유하지 않았는지 확인하였다. 중요한 T 세포 에피토프가 없거나 감소된 완전한 V 영역 서열을 생성할 목적으로 선택된 서열 세그먼트를 어셈블리하였다(assembled). 총 6개의 중쇄 (VH1 내지 VH6) 및 5개의 경쇄 (VK1 내지 VK5) 서열을 설계하였다. 도 7과 표 E1 참조.
iTope™에 의한 분석
독점적인 인실리코 기술인 iTope™ (Perry et al. 2008)을 적용하여 결정된 바와 같은 잠재적인 T 세포 에피토프의 발생에 대해 변이체 서열을 분석하였다.
iTope™ 소프트웨어는 34개 인간 MHC 클래스 II 대립유전자의 개방형 결합 그루브(groove) 내에서 펩티드의 아미노산 측쇄와 특정 결합 포켓 (특히 포켓 위치; p1, p4, p6, p7 및 p9) 사이의 유리한 상호작용을 예측한다. 이들 대립유전자는 임의의 특정한 인종 집단에서 가장 널리 발견되는 대립유전자에 가중치를 두지 않고 전 세계적으로 발견되는 가장 일반적인 HLA-DR 대립유전자를 나타낸다. 20개의 대립유전자는 '개방형' p1 구성(configuration)을 함유하고 14개는 위치 83의 글리신이 발린으로 대체된 '폐쇄형' 구성을 함유한다. 주요 결합 잔기의 위치는 테스트 단백질 서열에 걸쳐 8개의 아미노산이 겹치는 9mer 펩티드의 인실리코 생성에 의해 달성된다. 그러나, MHC 클래스 II 결합에 대한 모든 예측 방법은 본질적으로 T 세포 에피토프의 수를 과대 예측한다는 사실을 고려하여 결과를 평가해야 하는데, 그 이유는 이들이 단백질/펩티드 처리, T 세포 수용체에 의한 인식 또는 펩티드에 대한 T 세포 내성과 같은 항원 제시 동안 다른 중요한 과정을 허용하지 않기 때문이다.
iTope™ 분석은 중첩되는 9mer 펩티드 (각각 마지막 펩티드와 8개 잔기가 중첩됨)를 사용하여 수행되었다. 각각의 9mer는 잠재적인 '적합도'와 34개 MHC 클래스 II 동종이형 각각에 대한 상호작용을 기준으로 점수가 매겨졌으며 결과적으로 펩티드 점수는 0 내지 1의 범위었다. 그 다음에, MHC 클래스 II 에피토프는 iTope™에 의해 다음과 같이 정의된다:
· 잡다한 고친화도 MHC 클래스 II 결합 펩티드는 결합 점수 > 0.6를 갖는 대다수 (34개 대립유전자 중 17개)의 >50%의 대립유전자와 결합한다.
· 잡다한 중간 정도의 친화도 MHC 클래스 II 결합 펩티드는 결합 점수 >0.55 (그러나 다수는 >0.6이 아님)로 >50%의 대립유전자에 결합한다.
· 이들 기준은 34개 대립유전자 중 20개의 개방형 p1 포켓이 큰 방향족 잔기의 결합을 허용하는 p1 앵커 위치에서 발생하는 큰 방향족 아미노산 (예를 들어, F, W, Y)의 경우에 변경된다. 이것이 발생하는 경우, 잡다한 펩티드는 20개의 대립유전자 서브세트 중 10개 이상에 결합하는 것으로 정의된다.
다수의 생식계열 잡다한 높은 그리고 중간 정도의 친화도 MHC 클래스 II 결합 리간드가 모 항체 및 설계된 변이체에서 확인되었지만 이들 에피토프가 T 세포 내성으로 인해 면역원성 잠재력을 가질 가능성은 낮으므로 임의의 추가 분석에서 제외되었다. 몇몇 비-생식계열 잡다한 높은 그리고 중간 정도의 친화도 MHC 클래스 II 결합 리간드가 중쇄 및 경쇄 서열 둘 다에서 확인되었지만, 인간화 설계 과정 동안 이러한 에피토프의 대부분이 제거되거나 MHC 클래스 II에 대한 친화도 감소를 나타낸 것으로 관찰되었다. 그러나, VH 서열 및 VK 서열 둘 다에서 확인된 에피토프의 서브세트는 CDR 영역과 연관되어 있는 것으로 밝혀졌으며, 이의 항원에 결합하는 항체의 능력에 영향을 미칠 가능성 없이는 이들 에피토프가 쉽게 제거될 수 없을 것 같다.
인간화 변이체의 iTope™ 인실리코 분석이 도 29 및 30에 도시되어 있으며 각각의 인간화 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인과 연관된 잡다한 중간 정도의 그리고 높은 에피토프의 수가 도 8에 요약되어 있다.
키메라 IgG1 및 인간화 변이체의 작제
인간화 변이체와 함께 마우스 11C12의 VH 및 VK 서열 (VH0 및 VK0)은 인간 IgG1 VH 및 카파 경쇄에 대한 pANT 발현 벡터 시스템으로 클로닝하기 위해 플랭킹 제한 효소 부위와 함께 합성되었다 (도 9). VH 영역은 Mlu I과 Hind III 제한 부위 사이에 클로닝되었고, VK 영역은 Pte I과 BamH I 제한 부위 사이에 클로닝되었다. 모든 작제물은 서열분석에 의해 확인되었다.
11C12 키메라 및 인간화 항체의 소규모 일시적 발현
6웰 플레이트에 PEI 형질감염 방법을 사용하여 키메라 VH0/VK0 및 인간화 중쇄 및 경쇄 DNA 작제물의 조합 (총 30개의 인간화 쌍형성(pairing), 도 7 및 표 E1)을 HEK293 EBNA 부착 세포 (LGC Standards, Teddington, UK)에 일시적으로 형질감염시키고, 다음날 신선한 배지를 채우고 형질감염 후 5일 동안 인큐베이션하였다.
HEK 상청액을 형질감염 5일 후에 수확하고 0.2 μM 필터 시스템 (Corning, New York, US)을 사용하여 여과하였다. 항체 농도는 IgG1 항체를 표준으로 사용하여 단백질 A 바이오센서(Protein A biosensor) (Molecular Devices, Wokingham, Berkshire, UK)를 사용하여 Octet QK 384 상에서 측정되었다 (도 10).
키메라 및 인간화 변이체의 단일 주기 동역학 분석
모든 변이체의 재조합 인간 EphA5 (rhEphA5) 항원에 대한 결합을 평가하고 키메라 (VH0/VK0) 항체에 가장 가까운 친화도를 가진 리드 인간화 IgG를 선택하기 위해, 단일 주기 동역학 분석 (도 11)을 형질감염된 세포 배양물로부터의 상청액 상에서 수행하였다. 비아코어 T200 제어 소프트웨어(Control sofware) V2.0.1 및 평가 소프트웨어(Evaluation software) V3.0 (Cytiva, Uppsala, 스웨덴)을 시행하는 비아코어 T200에서 25℃에서 동역학 실험을 수행하였다.
1% BSA (Sigma, Dorset, UK)가 보충된 HBS-P+ (Cytiva, Uppsala, Sweden)를 러닝(running) 완충제뿐만 아니라 리간드 및 분석물 희석용으로 사용하였다. IgG를 함유한 상청액을 러닝 완충제에서 1 μg/mL로 희석하였다. 각각의 주기 시작 시, 항-인간 IgG CM5 센서 칩 (Cytiva, Little Chalfont, UK)의 Fc2, Fc3 및 Fc4에 항체를 로딩하였다. Ig는 10 μl/min의 유속으로 포획되어 ~ 60 RU의 고정화 수준(immobilizaion level) (RL)을 제공하였다. 그 다음에 표면을 안정화시켰다.
임의의 잠재적인 물질 전달 효과를 최소화하기 위해 40 μl/분의 유속으로 주입된 분석물로서 인간 EphA5 (R 및 D 시스템, 카탈로그 번호 3036-A5)를 사용하여 단일 주기 동역학 데이터를 수득하였다. 러닝 완충제 중 항원의 1.0 nM 내지 9.0 nM의 3점, 3배 희석 범위를 각각의 농도 간 재생 없이 사용하였다. 증가하는 농도의 항원을 3회 주입할 때마다 회합 단계(association phase)를 150초 동안 모니터링하고 단일 해리 단계(dissociation phase)를 마지막 항원 주입 후 400초 동안 측정하였다. 3 M MgCl2 용액을 1회 주입하여 센서 칩 표면의 재생을 수행하였다.
동역학 주기에 걸쳐 표면과 분석물의 안정성을 점검하기 위해 참조 키메라 IgG를 사용한 다중 반복을 수행하였다. 참조 채널 Fc1 (포획된 IgG 없음)로부터의 신호를 Fc2, Fc3 및 Fc4의 신호에서 차감하여 참조 표면에 대한 비특이적 결합의 차이와 벌크 효과를 보정하였다. 표면 안정성의 차이를 보정하기 위해 각각의 IgG 블랭크 시행 (IgG는 포획되었으나 항원은 없음)의 신호를 차감하였다. 이중 참조 센서그램은 Langmuir (1:1) 결합 모델 (도 12, 상단)에 피팅하였으며, 여기서 모델에 대한 데이터의 적합도의 근접성은 실험값과 적합값 (관측치 및 예상치) 곡선 간의 편차를 설명하는 Chi 제곱 값을 사용하여 평가된다 (도 12, 하단). 피팅 알고리즘은 Chi 제곱 값의 최소화를 모색한다. 피팅이 반드시 가장 적합한 모델은 아니지만 변이체의 비교 순위를 지정할 수 있다.
도 13 및 도 14에 나타낸 바와 같이, 대부분의 인간화 변이체 항체는 키메라 항체의 2배 이내에서 EphA5에 결합하는 것으로 나타났다. 유일한 예외는 역시 결합되지 않은 VH6 조합이었다. 주황색 및 청색으로 각각 강조표시된 키메라 및 리드 항체는 CHO 세포에서 대규모로 일시적으로 발현되었다.
11C12 키메라 및 리드 인간화 항체의 대규모 일시적 발현 및 정제
키메라 VH0/VK0 및 선택된 인간화 중쇄 및 경쇄 DNA 작제물의 조합 (도 13에 강조표시된 총 6개의 리드 항체)을 OC-400 처리 어셈블리를 가진 MaxCyte STX® 전기천공 시스템 (MaxCyte Inc., Gaithersburg, USA)을 사용하여 CHO 세포로 일시적으로 형질감염시켰다. 세포 회수 후, 세포를 8 mM L-글루타민 (ThermoFisher, Loughborough, UK) 및 1x 하이포크산틴-티미딘 (ThermoFisher, Loughborough, UK)을 함유하는 CD Opti-CHO 배지 (ThermoFisher, Loughborough, UK)에 3 x106개 세포/mL로 희석하였다. 재현탁 후 2시간에 0.5x 페니실린 스트렙토마이신 용액 (ThermoFisher, Loughborough, UK)을 배양물 (5 mL/L)에 첨가하였다. 형질감염 후 24시간 동안 배양 온도를 37℃에서 32℃로 낮추고 1 mM 소듐 부티레이트 (Sigma, Dorset, UK)를 첨가하였다. 배양물은 각각 30% 및 15% (배양물 부피의) CHO CD 효율적 공급물(Efficient Feed) B (ThermoFisher, Loughborough, UK), 및 3.3% 및 1.65% 기능 최대 역가 인핸서(Function Max Titre Enhancer) (ThermoFisher, Loughborough, UK)를 첨가함으로써 형질감염 후 24시간 및 7일에 공급하였다. CHO 상청액을 형질감염후 11일에 수확하였다. IgG1 항체를 표준으로 사용하여 단백질 A 바이오센서 (Molecular Devices, Wokingham, Berkshire, UK)를 사용하여 Octet QK 384에서 항체 농도를 측정하였다 (도 15).
배양 수확 후, 항체 상청액을 0.2 μM 필터 시스템 (Corning, New York, US)을 사용하여 여과하고 남은 세포 파편을 제거하고 10x PBS를 보충하여 pH를 중화하였다. 그 다음에, 1x DPBS, pH 7.2-7.4의 10 CV (컬럼 부피)로 미리 평형화된 1 mL Hitrap MabSelect PrismA 컬럼 (Cytiva, Little Chalfont, UK)을 사용하여 상청액으로부터 항체를 정제하였다. 샘플 로딩 후, 컬럼을 10 CV의 1x DPBS로 세척하고 단백질을 0.1 M 시트르산나트륨, pH 3.0으로 용리하였다. 분획을 수집하고, 1 M Tris-HCl, pH 9.0으로 pH를 조정한 후 OD280 nm 정량화하였다. 각각의 변이체에 대한 항체-함유 분획을 모으고 완충제를 1xDPBS, pH 7.2-7.4로 교환하고 0.2 μM 주사기 필터 (Sartorius, Epsom, UK)로 필터 멸균한 후 예측된 아미노산 서열을 기반으로 하여 흡광 계수 (Ec(0.1%))를 사용하여 OD280 nm로 정량화하였다.
그 다음에 PrismA 정제된 물질을 도 16A-16B 및 분석용 SE-HPLC (오버레이에 대해서는 도 17 및 개별 트레이스에 대해서는 도 31 참조)에 도시된 바와 같이 SDS-PAGE에 의해 분석하였다. 도 18은 분석용 SE-HPLC에 의해 결정된 바와 같은 각각의 변이체에 대해 관찰된 단량체의 백분율을 나타낸다.
키메라 및 인간화 11C12 변이체의 다중주기 동역학 비아코어
rhEphA5 항원에 대한 6개의 리드 인간화 변이체의 결합을 평가하기 위해, 정제된 물질에 대해 다중-주기 동역학 분석 (도 68)을 수행하였다. 비아코어 T200 제어 소프트웨어 V2.0.1 및 평가 소프트웨어 V3.0 (GE Healthcare, Uppsala, Sweden)을 시행하는 비아코어 T200 상에서 25℃에서 동역학 실험을 수행하였다.
1% BSA w/v (Sigma, Dorset, UK)가 보충된 HBS-P+ (GE Healthcare, Uppsala, Sweden)를 러닝 완충제뿐만 아니라 리간드 및 분석물 희석용으로 사용하였다. 정제된 리드 항체를 러닝 완충제에서 0.5 μg/mL로 희석하고 각각의 주기 시작 시 항-인간 IgG CM5 센서 칩 (GE Healthcare, Little Chalfont, UK)의 Fc2, Fc3 및 Fc4에 로딩하였다. 항체는 10 μl/min의 유속으로 포획되어 ~ 50 RU의 고정화 수준 (RL)을 제공하였다. 그 다음에 표면을 안정화시켰다.
임의의 잠재적인 물질 전달 효과를 최소화하기 위해 30 μl/min의 유속으로 주입된 분석물로서 재조합 EphA5를 사용하여 다중-주기 동역학 데이터를 수득하였다. 1.11 nM 내지 270 nM의 EphA5의 5점, 3배 희석 범위가 러닝 완충제에서 제조되었다. 각각의 농도에 대해, 회합 단계를 210초 동안 모니터링하고 해리 단계를 900초 동안 측정하였다. 센서 칩 표면의 재생은 3 M MgCl2의 2회 주입을 사용하여 주기 사이에 수행되었다. 동역학 주기에 걸쳐 표면과 분석물 둘 다의 안정성을 점검하기 위해 블랭크 및 EphA5의 다중 반복이 동역학 시행에 프로그래밍되었다.
참조 채널 Fc1 (포획된 IgG 없음)로부터의 신호를 Fc2, Fc3 및 Fc4의 신호에서 차감하여 참조 표면에 대한 비특이적 결합의 차이와 벌크 효과를 보정하였다. 표면 안정성의 차이를 보정하기 위해 각각의 IgG 블랭크 시행 (IgG는 포획되었으나 항원은 없음)의 신호를 차감하였다. 이중 참조 센서그램은 Langmuir (1:1) 결합 모델에 피팅하였으며, 여기서 모델에 대한 데이터의 적합도의 근접성은 실험값과 적합값 (관측치 및 예상치) 곡선 간의 편차를 설명하는 Chi 제곱 값을 사용하여 평가된다. 피팅 알고리즘은 Chi 제곱 값의 최소화를 모색한다.
1:1 모델 적합 곡선으로부터 결정된 동역학 상수의 요약이 도 20에 나타낸 피팅된 곡선과 함께 도 19에 도시되어 있다. 비아코어 분석은 모든 변이체가 키메라의 2배 내에서 결합한다는 것을 나타냈다.
키메라 및 인간화 11C12 변이체의 열 안정성 분석.
열 램프 안정성 실험 (Tm 및 Tagg)은 안정성을 위해 단백질 및 제형의 순위를 매기는 널리 확립된 방법이다. 단백질의 변성 프로파일은 이의 열 안정성에 대한 정보를 제공하고 구조 및 제형 완충제 변형을 평가하기 위한 구조적 '지문'을 나타낸다. 단백질의 열적 구조 안정성의 널리 사용되는 측정은 단백질이 원래 상태(native state)에서 변성 상태로 풀리는 온도이다. 많은 단백질의 경우, 이러한 풀림 과정은 좁은 온도 범위에 걸쳐 발생하며 이러한 전이의 중간점을 '용융 온도' 또는 'Tm'이라고 한다. 단백질의 용융 온도를 결정하기 위해, UNcle은 단백질이 입체형태적 변화를 겪음에 따라 Sypro Orange (이는 단백질의 노출된 소수성 영역에 결합)의 형광을 측정한다.
각각의 변이체에 대한 샘플은 PBS 및 Sypro Orange에서 최종 농도 1 mg/mL로 제제화되었다. 각각의 샘플 혼합물의 9 μL를 UNi 마이크로큐벳에 이중으로 로딩하였다. 샘플에 0.3℃/분의 램프 속도와 473 nm의 여기로 25-95℃의 열 램프를 적용하였다. 전체 방출 스펙트럼은 250 - 720 nm에서 수집되었으며, 510 - 680 nm 사이의 곡선 아래 영역을 사용하여 전이 곡선 (Tonset 및 Tm)의 변곡점을 계산하였다. 473 nm에서 정적 광산란 (SLS)을 모니터링하면 단백질 응집이 검출되고, 생성된 SLS 프로파일로부터 Tagg (응집 시작)이 계산되었다. 데이터 분석은 UNcle™ 소프트웨어 버전 4.0을 사용하여 수행되었으며 도 21 및 도 22A-22B에 도시되어 있다. 결정된 열 안정성 값은 57.9 내지 69.6℃ (Tm1), 55.1 내지 65.2℃ (Tonset) 및 65.6 내지 70.2℃ (Tagg)의 넓은 범위에 있으며, 여기서 인간화 리드는 일반적으로 키메라 항체와 비교할 때 향상된 프로파일을 나타낸다. 테스트된 모든 인간화 항체에 대해 하나의 전이 (Tm1)가 검출되었으며, 한편 키메라 VH0/VK0 항체에 대해서는 2개의 전이 (Tm1 및 Tm2)가 검출되었다. 모든 인간화 항체는 키메라 항체와 비교하여 더 높은 Tm1, Tonset 및 Tagg를 갖는 것으로 보인다. SLS 프로파일을 기반으로 하여, 제안된 상위 3개 리드는 가장 높은 Tagg 값을 가진 변이체 VH5/VK3, VH4/VK3 및 VH5/VK4일 것이다.
EphA5에 대한 세포 결합의 유세포 분석법 분석
EphA5 (Rutgers에 의해 제공)를 안정적으로 발현하는 H460 세포주를 H226 세포와 함께 음성 대조군으로 사용하여, 유세포 분석법 검정에서 항체 결합을 테스트하였다. (Rutgers에 의해 제공된 10 μg/ml의 뮤린 동물 11C12 및 MolgG1 비결합 대조군 (Biolegend, California, US)을 사용하여 표적 발현에 대해 세포주를 먼저 평가하였다. 염소 항-마우스 Alexa Fluor 647 (Thermo Fisher, Loughborough, UK)을 항체 검출에 사용하였다. 11C12 양성 대조군은 농도 의존적 방식으로 양성 세포주에 결합하였다 (도 23). 예상한 바와 같이, H226 세포주에서는 양성 대조군의 어떤 결합도 관찰되지 않았다.
세포 결합 검정을 위해, 두 세포주를 모두 FACS 완충제 (PBS + 1% BSA + 0.1% 아지드화 나트륨)에 재현탁하고 웰당 1 x105 (100 μl)개 세포로 96웰 U 바닥 플레이트에 시딩하였다. 키메라 및 6개의 정제된 인간화 변이체를 11C12 뮤린 양성 대조군, MolgG1 및 HulgG1 비결합 대조군과 함께 검정에서 테스트하였다. 샘플은 FACS 완충제에서 10 μg/ml의 시작 농도로 제조되었으며 H460 세포를 테스트하기 위해 4배 7점 연속 희석을 수행하고 H226 세포에 대해 3배 3점 연속 희석을 거쳤다. 세포 펠릿을 연속적으로 희석된 샘플 100 μl에 재현탁하고 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 세포를 펠릿화하고, 100 μl의 FACS 완충제로 2회 세척하고, FACS 완충제 중 5 μg/ml로 희석된 Alexa Fluor 647 항-마우스 또는 항-인간 (Thermo Fisher)에 재현탁시켰다. 4℃에서 30분 동안 인큐베이션 후, 세포를 펠릿화하고, 100 μl의 FACS 완충제로 2회 세척하고, 웰당 200 μl의 1X BD CellFix 용액 (BD Pharmingen, Berkshire, UK)에 재현탁시켰다. 중위 형광 강도(Median fluorescence intensity) (MFI)는 Attune NxT Flow Cytometer (Thermo Fisher, Loughborough, UK)를 사용하여 측정되었으며 샘플당 10,000개의 게이트된 사건(event)이 획득되었다. 데이터 분석을 위해, 살아있는 세포 집단은 Alexa Fluor 647 MFI 값이 RL1 채널에서 측정될 수 있도록 전방 및 측면 산점도(scatter dot plot)를 기반으로 하여 게이트되었다.
테스트된 모든 인간화 변이체에 대해 전체 용량 반응 곡선 및 특이적 결합이 관찰되었으며 항체는 VH0/VK0과 비슷하게 수행되었다. 표적에 대해 음성인 H226 세포주에서는 어떤 결합도 관찰되지 않았다. 결합 곡선은 도 24, 25, 및 26)에 도시되어 있다.
선택된 결론 및 논의
항-인간 EphA5 모노클로날 뮤린 항체인 11C12를 코딩하는 V-영역 서열을 사용하여 키메라 항체 (VH0/VK0) 및 30개의 인간화 항체 변이체를 작제하였다. HEK 세포에서 발현시킨 후, 단일 주기 동역학 (SCK) 비아코어를 사용하여 EphA5 항원에 대한 결합에 대해 항체 상청액을 테스트하였다. 6개의 항원-결합 인간화 항체 변이체 및 키메라 항체를 MabSelect PrismA 크로마토그래피를 사용하여 CHO 상청액으로부터 정제하였다. 정제된 항체를 SE-HPLC 및 환원 및 비환원 SDS-PAGE에서 특성화하였다. SE-HPLC는 키메라 항체에 대한 단량체의 백분율이 모든 인간화 변이체에 대해 >90%임을 나타냈다.
다중-주기 동역학 분석 및 UNcle 생체안정성 플랫폼 평가는 키메라 항체 및 6개의 주요 인간화 변이체 (VH3/VK4, VH4/VK3, VH4/VK4, VH5/VK2, VH5/VK3 및 VH5/VK4)에 대해 수행되었다. 비아코어 분석은 모든 인간화 변이체는 키메라 항체의 2배 이내에서 결합하는 것으로 나타났다. Sypro Orange와 UNcle 생체안정성 플랫폼을 사용한 열 안정성 분석은 인간화 변이체 VH5/VK3, VH4/VK3 및 VH5/VK4가 가장 높은 Tagg 값을 갖는 것으로 나타났다.
모든 인간화 변이체에 대해 전체 용량 반응 곡선 및 특이적 결합이 관찰되었다. EphA5 음성 H226 세포주에서는 어떤 결합도 관찰되지 않았다.
표 E2 및 E3은 참조 키메라 항체 VH0/VK0과 비교하여 예시적인 항체 VH5/VK3에 대한 결합 친화도 및 온도 안정성의 개선에 대한 결과를 요약한다.
표 E2: VH5/VK3 항체는 더 낮은 KD를 가지며, 이는 표적에 대한 더 높은 친화도를 시사한다.
표 E3: VH5/VK3은 VH0/VK0과 비교하여 더 높은 Tm1, Tonset 및 Tagg를 갖는다.
실시예 2: H4K3 및 H5K3 항체의 특이성 프로파일링
테스트 항체 검출을 위한 조건을 최적화하기 위해, HEK-293T 세포 및 QT6 세포를 384웰 세포-배양 플레이트에서 알려진 테스트 항체 표적, 단백질 A (항체 Fc에 결합; 양성 대조군), 또는 벡터 단독 (pUC; 음성 대조군)을 코딩하는 플라스미드로 형질감염시켰다. 인큐베이션 후, 각각의 테스트 항체의 20 μg/ml에서 시작하여 4개의 4배 희석액을 형질감염된 세포에 사중으로 첨가하고 고처리량 면역형광 유세포 분석법 검정에서 이차 항체의 단일 희석액을 사용하여 검출하였다. 검정 설정 실험으로부터의 데이터를 사용하여 고처리량 면역검출을 위한 최적의 스크리닝 조건을 결정하였다 (표 E4). 최적의 스크리닝 농도는 배경 신호 (평균 형광 강도(MFI)), 및 벡터 제어의 위양성률에 의해 결정되었다.
재료 및 방법:
막 프로테옴 배열(Membrane Proteome Array): 막 프로테옴 배열 (MPA) 스크리닝은 Integral Molecular에서 수행되었다. MPA는 6,000개의 인간 막 단백질 클론으로 구성된 단백질 라이브러리이며, 각각은 발현 플라스미드로부터의 살아있는 세포에서 과발현된다. 각각의 클론을 384웰 플레이트의 별도의 웰에 개별적으로 형질감염시킨 후 36시간 동안 인큐베이션하였다 (Tucker et al., 2018). 각각의 개별 MPA 단백질 클론을 발현하는 세포는 고처리량 스크리닝을 위해 매트릭스 형식으로 이중으로 배열되었다. MPA 상에서 스크리닝하기 전에, 양성 (막-결합 단백질 A(membrane-tethered Protein A)) 및 음성 (모의(mock)-형질감염) 결합 대조군을 발현하는 세포에서 스크리닝을 위한 테스트 항체 농도를 결정한 후, 형광-표지된 이차 항체를 사용하여 유세포 분석법으로 검출하였다. 각각의 테스트 항체를 미리 결정된 농도로 MPA에 첨가하고, 단백질 라이브러리 전반에 걸친 결합을 형광-표지된 이차 항체를 사용하여 Intellicyt iQue에서 측정하였다. 각각의 어레이 플레이트(array plate)는 플레이트 간(plate-to-plate) 재현성을 보장하기 위해 양성 (Fc-결합) 및 음성 (빈 벡터) 대조군을 둘 다 함유한다. MPA 스크리닝에 의해 확인된 임의의 오프 타겟과의 테스트 항체 상호작용은 테스트 항체의 연속 희석을 사용한 두 번째 유세포 분석법 실험에서 확인되었으며, 표적 동일성은 서열분석에 의해 재확인되었다.
표 E4: 고처리량 면역검출을 위해 최적화된 실험 파라미터.
막 프로테옴 배열 스크린
항체 결합 표적을 확인하기 위해, ~6,000개의 상이한 막 단백질이 384웰 플레이트에 배열된 HEK-293T 또는 QT6 세포의 개별 웰에서 각각 발현되었다. 그 다음에 각각의 384웰 플레이트의 개별 열과 행을 모아서 세포를 매트릭스화하여 각각의 단백질이 매트릭스 플레이트의 상이한 두 웰의 고유한 조합으로 표시되도록 하였다. 그 다음에, 중첩하는 열 및 행 풀(pool)에 대한 MAb 결합 (이전에 최적화된 조건; 표 E4 사용)을 검출하여 표적을 식별하여, 특정 디콘볼루션을 허용하였다 (표 E5; 도 70 및 71). 각각의 개별 막 단백질 표적에는 이의 고유한 행 및 열 풀의 결합 값에 상응하는 값이 할당되었으며, 두 웰 모두에서 배경보다 3 표준 편차 초과의 결합을 나타내는 표적은 하류 검증 실험을 위해 선택되었다. 생성된 쌍형성(paired) 결합 값은 후속적으로 정규화되고 변환되어 각각의 표적 단백질에 대한 MAb의 결합 (표적 결합)에 대한 단일 수치 값을 제공하였다. 비특이적 형광은 평균 배경 값의 3 표준 편차 미만의 임의의 값인 것으로 결정되었다.
표 E5: 확인된 막 단백질 표적
항체 표적의 검증
확인된 오프-타겟 상호작용을 검증하기 위해, 확인된 표적, 단백질 A, 또는 벡터 단독을 코딩하는 플라스미드로 세포를 384웰 형식으로 형질감염시켰다. 인큐베이션 후, 20 μg/ml에서 시작하여 각각의 테스트 항체의 4개의 4배 희석액을 형질감염된 세포에 첨가한 후 고처리량 면역형광 유세포 분석법 검정 (표 E4에 기재된 바와 동일한 조건)을 사용하여 항체 결합을 검출하였다. 분자의 알려진 표적이 MPA 스크린에서 식별된 유일한 단백질인 경우 어떤 검증도 수행되지 않았으며, 그 이유는 검정 설정 결과는 이미 검증 스크린과 동일한 스크린에서 특정 반응성을 나타내기 때문이다.
다양한 농도로 표적 세포 상에 발현된 세포 표면 EPHA5에 결합한 후 VH5/VK3 항체의 거동을 관찰한 유사한 연구는 결합된 항체가 EphA5+ 세포에 내재화되었지만 EphA5- 세포에는 내재화되지 않았으며 세포 표면 표적에 결합한 후 리소좀으로 트래피팅되었음(trafficked)을 밝혀냈다 (도 2A 및 2B).
항체 결합 및 스크리닝 조건의 최적화
고처리량 유세포 분석법을 사용하여 MAb 및 Fab의 결합 및 스크리닝을 위한 조건은 독점 벡터에 클로닝되고 HE-293T 세포에서 발현된 야생형 표적 단백질을 사용하여 최적화되었다. MAb와 Fab의 에피토프를 매핑하기 위해, 표적 단백질의 알라닌-스캔 라이브러리를 작제하였다. 그 다음에 테스트 항체를 각각의 개별 표적 단백질 변이체에 대한 결합에 대해 스크리닝하여, 테스트 MAb 결합에 관여하는 표적 단백질 잔기를 식별할 수 있었다.
샷건 돌연변이유발(Shotgun Mutagenesis) 에피토프 매핑 서비스는 문헌 [Davidson and Doranz, 2014]에 기재된 바와 같이 Integral Molecular (Philadelphia, PA)에서 제공되었다. 간단히 말하면, 표적 단백질의 돌연변이 라이브러리는 고처리량의 부위-지정 돌연변이유발에 의해 생성되었다. 각각의 잔기는 개별적으로 알라닌으로 돌연변이되었으며, 알라닌 코돈은 세린으로 돌연변이되었다. 돌연변이 라이브러리를 384웰 마이크로플레이트에 배열하고 HEK-293T 세포에 일시적으로 형질감염시켰다. 형질감염 후, 세포를 야생형 단백질에 대한 독립적인 면역형광 적정 곡선을 사용하여 미리 결정된 농도로 지시된 항체와 함께 인큐베이션하였다. MAb는 Alexa Fluor 488-접합 이차 항체를 사용하여 검출되었으며 Intellicyt iQue 유세포 분석법 플랫폼을 사용하여 평균 세포 형광을 측정하였다. 돌연변이된 잔기는 이들이 테스트 MAb의 반응성을 뒷받침하지 않지만 참조 MAb의 반응성을 뒷받침하는 경우 MAb 에피토프에 중대한 것으로 확인되었다. 이 카운터 스크린 전략은 국소적으로 잘못 접혀 있거나(misfolded) 발현 결함을 갖는 돌연변이의 배제를 쉽게 한다.
초기 연구에서는 표적 단백질에 대한 MAb의 결합 및 스크리닝을 최적화를 모색하였다. 세포를 표적 단백질의 야생형 (WT) 작제물 또는 384웰 형식의 벡터 단독으로 형질감염시킨 후, 고처리량 유세포 분석법을 통해 세포 발현을 검출하였다 (도 72). 각각의 MAb의 연속 희석액을 표적 단백질 (WT)을 발현하는 세포 또는 벡터 단독에 대한 면역반응성에 대해 테스트하였다. 각각의 포인트는 4회 반복실험의 평균을 나타낸다. 각각의 MAb에 대한 최적의 스크리닝 농도는 미가공 신호(raw signal) 값과 신호 대 배경 계산을 기반으로 하여 결정되었다. 표 E6 참조.
표 E6: 고처리량 유세포 분석법에 최적화된 실험 파라미터.
그 다음에, 표적 단백질에 대한 H4K3 및 H5K3 항체로부터 유래된 Fab의 스크리닝을 최적화하기 위한 일련의 연구가 수행되었다. 세포를 표적 단백질의 WT 작제물 또는 384웰 형식의 벡터 단독으로 형질감염시킨 후, 고처리량 유세포 분석법을 통해 세포 발현을 검출하였다 (도 73 참조). 각각의 FAb의 연속 희석액을 표적 단백질 (WT)을 발현하는 세포 또는 벡터 단독에 대한 면역반응성에 대해 테스트하였다. 각각의 포인트는 4회 반복실험의 평균을 나타낸다. 각각의 Fab에 대한 최적의 스크리닝 농도는 미가공 신호 값과 신호 대 배경 계산을 기반으로 하여 결정되었다. 표 E7 참조.
표 E7: 고처리량 유세포 분석법에 최적화된 실험 파라미터
그 다음에 일련의 연구는 항체 (Ab) 결합에 대한 돌연변이 항원 클론의 확인에 초점을 맞추었다 (도 74). 알라닌 스캐닝 라이브러리의 각각의 돌연변이 클론에 대한 각각의 테스트 Ab의 결합은 고처리량 유세포 분석법에 의해 이중으로 결정되었다. 각각의 지점에 대해, 미가공 데이터에서 배경 형광을 차감한 다음에, 이를 WT 표적 단백질과의 Ab 반응성에 대해 정규화하였다. 각각의 돌연변이 클론에 대해, 평균 결합 값을 발현 함수로 프롯팅하였다 (대조군 반응성으로 나타냄). 예비 일차 돌연변이 클론 (적색 원)을 확인하기 위해, 대조군 Ab에 대한 >70% WT 결합 및 테스트 Ab에 대한 <20% WT 결합의 임계값 (파선)이 적용되었다. 이차 클론 (청색 원)은 설정된 임계값을 충족하지 못하였으나 중대한 잔기에 대한 감소된 결합 활성 및 근접성을 가진 클론에 대해 강조표시되어 있으며 이는 돌연변이된 잔기가 항체 에피토프의 일부일 수 있음을 시사하였다.
추가 연구를 통해 Ab 결합에 대한 잔기가 확인되었다 (도 75). 확인된 모든 일차 잔기에 대한 평균 결합 반응성 (및 범위)이 열거되어 있다. Ab 결합에 대해 확인된 일차 잔기 (적색으로 강조표시됨)는 돌연변이가 테스트 Ab에 대한 결합에 대해서는 음성이지만 대조군 항체에 대한 결합에 대해서는 양성인 잔기였다. 임계값 지침을 충족하지 못하였으나 일차 잔기에 대한 감소된 결합 활성 및 근접성을 가진 추가 이차 잔기 (청색으로 강조표시됨)가 확인되었으며, 이는 이들이 항체 에피토프의 일부일 수 있음을 시사하였다. 예비 일차 잔기로 확인된 돌연변이 시스테인 잔기는 중대한 것으로 간주되지 않는다. 관찰된 낮은 결합은 단백질의 잘못된 접힘을 유발하는 이황화물 결합의 파괴로 인한 가능성이 있다. 두 돌연변이 모두에 대한 결합 손실은 단백질의 잘못된 접힘으로 인한 가능성이 있다.
결합-일차 잔기를 확인한 후, Ab 결합에 대한 일차 잔기의 시각화를 결정하였다 (도 76). 일차 잔기 (적색 구체)는 EPHA4의 구조를 기반으로 하는 표적 단백질의 결정 구조 모델에서 시각화되었다 (PDB ID# 4BK4, Seirdake et al., 2013). 결합에 기여할 수 있는 이차 잔기 (청색 구체)도 표시된다.
도 76은 돌연변이가 특정 항체와 가장 낮은 반응성을 제공한 일차 잔기를 볼드체로 강조표시하고 밑줄을 그은 것을 예시한다. 검증된 일차 잔기는 측쇄가 항체-에피토프 상호작용에 가장 높은 에너지 기여를 하는 아미노산을 나타내며 (Bogan and Thorn, 1998; Lo Conte et al., 1999); 따라서, 강조표시된 잔기는 결합에 대한 주요 에너지 기여자일 가능성이 있다.
실시예 3: 티오브릿지® 및 말레이미드 항-EphA5 항체-약물 접합체의 생산
항체-약물 접합체 (ADC)는 표적 세포에 높은 효율로 약물을 전달하고 오프-타겟 효과를 최소화할 수 있는 생물제제임이 입증되었다. 수용체 티로신 키나제 EphA5는 많은 유형의 인간 폐암 세포주 및 인간 폐암 생검에서 발현되는 표면 분자이다. 폐암이 가장 흔하고 치명적인 인간 암 유형 중 하나가 됨에 따라, 효과적인 요법이 시급히 필요하다.
감소된 면역원성, EphA5 표적에 대한 더 높은 결합 친화도 및/또는 더 양호한 열 안정성을 가진 개선된 항체를 포함하여, 상기 연구에서 기재된 개선된 항-EphA5 모노클로날 항체를, ADC 생성을 위해 선택하였다. 바람직한 개선된 특징을 나타낸, 후보 항체 VH5/VK3 및 VH4/VK3을 세포 표면 표적 결합 및 항체 내재화에 대한 추가 조사를 위해 선택하였다. ADC VH5/VK3-티오브릿지®-VCP-MMAE 및 ADC VH5/VK3-티오브릿지®-(VC-PAB-CO-SN-38)2 (및 동일한 페이로드를 갖는 VH4/VK3 ADC)는 페이로드 모노메틸 아우리스타틴 E (MMAE) 또는 토포이소머라제 I 억제제인 SN-38을 전달하기 위한 티오브릿지® 부위-지정 접합 기술을 사용하여 생성되었다. 이다. (도 3 참조) ADC의 효능 및 특이성은 인간 폐암 세포주 또는 인간 폐암 이종이식 모델을 사용하여 시험관내 및 생체내에서 평가되었다.
선택된 요약
항-EphA5 ADC는 인간화 항체 VH4Vk3 (서열번호: 38 및 서열번호: 40) 및 VH5Vk3 (서열번호: 39 및 서열번호: 40)로부터 제조되었다. 세포독성 페이로드 MMAE 및 SN38이 이들 ADC에 이용되었다. 말레이미드 접합 또는 이황화물 재브릿징 접합 기술(disulfide rebridging conjugation technology)인 티오브릿지®를 사용하여 ADC를 제조하였다. VH4Vk3 mAb는 MC-VCP-MMAE 및 CL2A-SN38에도 접합되었다. ADC는 티오브릿지® 접합 기술과 두 가지 세포독성 페이로드인 아우리스타틴 억제 미세소관(microtubule) 중합 약물인 모노메틸 아우리스타틴 E (MMAE)와 DNA 토포이소머라제 I 억제제인 캄프토테신의 유사체인 SN38을 활용하여 제조되었다. MC-VCP-MMAE 또는 CL2A-SN38 링커-페이로드와의 말레이미드 접합을 활용하여 두 개의 ADC를 제조하였다 (구조식에 대해서는 도 32 참조). 두 개의 링커-페이로드는 상용 공급업체 - MC-VCP-MMAE (Levena) 및 CL2A-SN38 (Levena)로부터 구입하였으며 - 두 개의 추가-링커 페이로드인 티오브릿지®-VCP-MMAE 및 티오브릿지®-(VCP-SN38)2를 합성하였다.
이 프로젝트에서 접합에 사용된 티오브릿지® 시약은 단일 로딩된 티오브릿지®-VCP-MMAE 및 이중-로딩된 티오브릿지®-VCP-SN38 시약이었다 (도 33 참조). 티오브릿지®-SN38 링커-페이로드의 경우, 세포독성 페이로드 SN38을 항체에 커플링하기 위해 가수분해에 의해 절단가능한 모이어티 (탄산 염)를 가진 이중-로딩된 구조를 사용하였다 (구조식에 대해서는 도 33 참조). 이 링커 형식은 또한 응집 성향을 줄이고 수용성을 개선시키기 위해 이중 분지형 24-단위 PEG 중합체로 설계되었다. 티오브릿지®-MMAE 링커-페이로드의 경우, 리소좀 카텝신에 의해 절단가능한 모이어티 ('Val-Cit-PAB')를 사용하여 세포독성 페이로드 MMAE를 항체에 커플링하였다 (구조식에 대해서는 도 3 참조). 이 링커 형식은 또한 응집 성향을 줄이고 수용성을 개선시키기 위해 분지형 24-단위 PEG 중합체로 설계되었다.
MC-VCP-MMAE 및 CL2A-SN38은 둘 다 VH4VK3 mAb에 접합되었으며, 한편 티오브릿지® 링커-페이로드는 둘 다 mAb VH4Vk3 및 VH5Vk3에 접합되었다. 생성된 ADC는 MMAE 페이로드의 경우 평균 약물-대-항체 비율 (DAR)이 4, 또는 SN38 페이로드의 경우 8인 고도로 단량체성 (>95%)이었다. 후속 생물학적 테스트를 허용하기 위해, ADC는 50-75 mg 목표량을 초과하여 준비되었다.
LC-MS 분석
LC-MS 분석은 Waters XEVO G2S TOF 질량 분석기 및 Waters Acquity H Class UPLC 시스템에 연결된 POROSHELL 300SB C3 컬럼 (2.1 x 12.5 mm, 5 μm)을 사용하여 수행되었다. 이동상은 완충제 A (물 중 0.1% 포름산)였다. 완충제 B (아세토니트릴, 0.1% 포름산)를 사용하여 0.4 mL/분의 유속으로 구배 (2.5분 10% B, 3.5분 내 10-80% B 구배)를 적용하였다. 분석 내내 컬럼을 60℃로 유지하였다. ADC는 0.05 mg/mL로 희석한 후 직접 분석되었다. 분석을 위해 10 μL의 ADC 용액을 주입하였다. 평균 DAR은 비환원 샘플에 대한 디콘볼루션된 m/z 스펙트럼의 주요 글리코폼(glycoform) 신호 강도 (SI)를 기반으로 한 관찰된 DAR 종의 가중 평균으로 계산되었고, 환원된 샘플에 대해 경 (LSI) 및 중 (HSI)쇄 종 둘 다에 대한 신호 강도에 대해서는 도 69A의 식에 따랐다.
SEC 분석
분석 SEC (크기 배제 크로마토그래피)는 Dionex Ultimate 3000 UPLC 시스템에 연결된, ACQUITY UPLC BEH 200 SEC 컬럼 (4.6 mm x 15 cm, 200 Å, 1.7 μm) 및 가드 컬럼 (4.6 mm x 3 cm)을 사용하여 수행되었다. 이동상은 0.2 M 인산칼륨 완충제, pH 6.8, 0.2 M 염화칼륨, 15% (v/v) 이소프로판올이었다. 유속은 0.35 mL/분으로 일정하게 유지되었다. 분석 내내 컬럼을 30℃로 유지하였다. 분석은 280 nm 및 495 nm에서 UV 검출을 사용하여 10분 등용매 용리로 수행되었다. 분석을 위해 10 μg의 ADC를 주입하였다. 280 nm에서 HMW 종에 상응하는 피크 면적을 280 nm에서 HMW 및 단량체 종에 상응하는 총 피크 면적과 비교하여 고분자량 (HMW) 종의 백분율을 계산하였다.
HIC 분석
분석적 HIC는 Dionex Ultimate 3000 UPLC 시스템에 연결된, TOSOH Bioscience TSKgel Butyl-NPR 컬럼 (4.6 mm x 3.5 cm, 2.5 μm)을 사용하여 수행하였다. 이동상은 완충제 A: 1.5 M 황산암모늄, 50 mM 인산나트륨, pH 7.0이었다. 완충제 B (20% 이소프로판올, 50 mM 인산나트륨, pH 7.0)를 사용하여 1.35 mL/분의 유속으로 선형 구배 (10.5분 내에 0-100% B)를 적용하여 결합된 종을 용리시켰다. 분석 내내 컬럼을 30℃로 유지하였다. 분석은 280 nm에서 UV 검출로 수행되었다. 분석당 10 μg의 ADC를 주입하였다. 각각의 DAR 종(i)의 백분율은 할당된 각각의 피크의 피크 면적을 전체 피크 면적과 비교하여 계산되었다. 평균 DAR은 곡선 아래 피크 면적 (AUCi)을 기반으로 관찰된 DAR 종의 가중 평균으로 계산되었으며 ADC의 평균 분자량은 도 69B의 식에 따라, DAR 및 링커-페이로드 질량 기여를 기반으로 계산되었다.
SDS-PAGE 분석
SDS-PAGE 분석은 MES 완충제를 사용하는 비환원 조건 하에 NuPAGE® 4-12% Bis-Tris 겔 (Invitrogen)을 사용하여 수행되었다. 분석 전에, 각각의 샘플을 10% SDS 용액에서 40℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 분석을 위해, 레인(lane)당 1 μg의 ADC 샘플 (단백질 기준)을 겔에 로딩하였다. 전기영동은 200 V에서 35분 동안 수행하였다. 단백질 검출을 위해 겔을 InstantBlue™ (Abcam)로 염색하고 ChemiDoc™ 이미징 시스템 (Bio-Rad)을 사용하여 분석하였다.
UV 흡광도에 의한 농도 및 평균 DAR 결정
접합체의 농도 및 평균 DAR은 Nanodrop 2000 분광 광도계를 사용하여 280 nm (A280)에서의 UV 흡광도에 의해 그리고 링커-페이로드 (Aλ)에 대한 최대 흡광도에 상응하는 파장 λ에서 결정되었다. 측정은 삼중으로 수행되었으며 평균값이 계산에 사용되었다. 항체 및 링커-페이로드에 사용된 몰 흡광 계수는 실험적으로 결정되었다 (표 E8 및 표 E9).
표 E8: 상이한 파장에서 mAb에 대한 몰 흡광 계수.
표 E9:
엔도톡신 수준 결정 방법
EndoSafe®-PTS™ 플랫폼 (Charles River)을 사용하여 엔도톡신 수준을 결정하였다. EndoSafe®-PTS™는 리물러스 아메보사이트 용해물(Limulus Amebocyte Lysate) (LAL) 정량 결과를 제공하는 USP <85> 및 Pharm Eur 2.6.14에 부합하는 발색 동역학 테스트 시스템(chromogenic kinetic test system)이다. EndoSafe®-PTS™는 LAL 테스트를 수행하는 데 필요한 모든 시약이 미리 로딩되어 있는 FDA-허가 일회용 테스트 카트리지의 LAL 시약을 활용한다. EndoSafe®-PTS™는 샘플 내 엔도톡신 농도와 직접 관련된 색상 강도를 측정하여 허가된 LAL 동역학 발색 방법론을 모방하며; 농도는 카트리지 로트 번호와 연관된 내부 표준 곡선 (0.01-1.00 EU/mL)에 대해 계산된다.
분석 결과:
생성된 접합체의 분석 결과는 표 E10.A-E10.F에 요약되어 있다.
표 E10.A: VH4Vk3-MC-VCP-MMAE
스펙트럼, 크로마토그래피, 및 소수성 상호작용 분석에 대해서는 도 34-37 참조.
표 E10.B: H4Vk3-티오브릿지®-VCP-MMAE
스펙트럼, 크로마토그래피, 및 소수성 상호작용 분석에 대해서는 도 34-37 참조.
표 E10.C: VH5Vk3-티오브릿지®-VCP-MMAE
스펙트럼, 크로마토그래피, 및 소수성 상호작용 분석에 대해서는 도 42-45 참조.
표 E10.D: VH4Vk3-CL2A-SN38
스펙트럼, 크로마토그래피, 및 소수성 상호작용 분석에 대해서는 도 42-49 참조.
표 E10.E: H4Vk3-티오브릿지®-(VCP-SN38)2
스펙트럼, 크로마토그래피, 및 소수성 상호작용 분석에 대해서는 도 50-53 참조.
표 E10.F: H5Vk3-티오브릿지®-(VCP-SN38)2
스펙트럼, 크로마토그래피, 및 소수성 상호작용 분석에 대해서는 도 54-57 참조.
논의
VH4Vk3 항체에 대한 링커-페이로드에 MC-VCP-MMAE 또는 CL2A-SN38을 접합시켜 2개의 ADC를 성공적으로 생산하였다. HIC-HPLC에 의해 결정한 바와 같이, 평균 DAR은 MC-VCP-MMAE의 경우 3.9이거나 CL2A-SN38의 경우 8.0이었다. LC-MS에 의해 결정한 바와 같은 접합체의 평균 DAR은 각각 3.6 및 8.0이었다. 티오브릿지®-VCP-MMAE 링커-페이로드를 항-EphA5 VH4Vk3 및 VH5Vk3 항체에 접합시켜 ADC를 성공적으로 생산하였다. LC-MS에 의해 결정한 바와 같이 모든 접합체에 대한 평균 DAR은 4.0이었다. HIC-HPLC에 의해 결정한 바와 같이 평균 DAR은 4.0 내지 4.1이었다.
티오브릿지®-(VCP-SN38)2 링커-페이로드를 항-EphA5 VH4Vk3 및 VH5Vk3 항체에 접합시켜 ADC를 성공적으로 생산하였다. LC-MS에 의해 측정된 바와 같이, 평균 DAR은 모든 접합체에 대해 8.0 내지 8.6의 범위였다. 모든 ADC는 분석 SEC에 의해 결정된 바와 같이 높은 단량체 순도를 가지며, 단량체 순도는 98.7% 내지 99.9%의 범위였다.
상이한 파장에서 샘플의 SEC 트레이스를 저분자량 종 영역의 제형 완충제의 SEC 트레이스와 비교하면 ADC에서 시약 관련 종의 어떠한 유의한 존재도 검출되지 않았다.
LAL 검정은 또한 모든 ADC 샘플에서 낮은 수준의 엔도톡신 (<0.1 EU/mg)을 확인하였다. 말레이미드 접합체에 대한 사전 환원 또는 티오브릿지® 접합체에 대한 환원 없이 수행된 LC-MS 무결성(intact) 질량 분석은 접합된 종의 동일성을 확인하였다. 무결성 접합체, 단편 종 HHL 및 HH 및 '절반-항체' 단편 종 HL을 포함하는 쇄간 이황화물 브릿지된 접합 종의 존재와 함께, SDS-PAGE에 의해 ADC에 대해 예상된 프로파일이 관찰되었다. 티오브릿지®-MMAE 및 -SN38 ADC에 대해 높은 수준 (64-73%)의 중쇄간 브릿징이 관찰되었다.
모든 티오브릿지® ADC는 분취용 HIC로 정제한 후 중간 정도의 수율 (33-54% 회수율)로 단리되었다. MC-VCP-MMAE 접합체는 분취용 SEC 정제 후 78% 수율로 단리되었다. CL2A-SN38 접합체는 탈염 및 분취용 SEC 정제 후 75% 수율로 단리되었다.
실시예 4: 인간화 항체 및 ADE 기능의 시험관내 및 생체내 검증
그 다음에, 본 개시내용의 실시예 1-3으로부터 유래된 인간화 항체 및 항체 약물 접합체를 사용하여 기능적 세포독성 연구를 수행하였다.
3개의 상이한 Eph5A-발현 표적 세포주를 다양한 농도의 VH5Vk3 또는 VH4Vk3 항체와 함께 인큐베이션한 후 결합된 항체의 내재화를 계산하는 시험관내 연구를 수행하였다. 다음의 세포주에서 Incucyte® Human Fabflur-pH 적색 항체 표지화 염료(Red Antibody Labeling Dye)와 네이키드 VH4Vk3 (도 66) 및 VH5Vk3 (도 67) 인간 모노클로날 항체를 사용하여 항체 내재화를 수행하였다: H460 인간 폐암종, A549 인간 폐암종 및 H1299 인간 폐암종. 이들 세포주는 세포 표면에 다양한 수준의 EphA5를 발현한다: H460 (+++) > A549 (++) = H1299 (++). 실시간 살아있는 세포 이미징 분석을 사용하여 내재화를 시각화하고 정량화하였다. Fabflur-pH 적색 항체 표지 염료는 pH에 민감하며 낮은 pH 조건에서 리소좀 내부에서만 형광을 방출한다. 이들 결과는 항체-약물 접합체의 중요한 특징인, 리소좀 구획을 통한 두 인간 모노클로날 항체 모두의 수용체-매개 내재화 및 트래피킹을 확인해 주었다.
그 다음에, 본 발명의 다양한 항체 약물 접합체의 세포독성을 평가하기 위해 일련의 생체내 연구를 수행하였다. ADC의 세포 독성은 Incucyte®와 컨플루언스(confluence) 세포 이미지 마스크의 실시간 분석 및 정량화를 사용하여 테스트되었다. 간단히 말하면, 시간이 지남에 따라 이미지화된 세포의 점유 면적 (% 컨플루언스)을 분석하여 세포 컨플루언스를 모니터링한다. ADC에 노출된 세포가 증식을 멈추고 사멸함에 따라 세포의 컨플루언스가 감소할 것으로 예상된다. VH4Vk3-티오브릿지®-VCP-MMAE (도 68), VH4Vk3-티오브릿지®-(VCP-SN-38)2 (도 69), VH5Vk3-티오브릿지®-VCP-MMAE (도 70), 및 VH5Vk3-티오브릿지®-(VCP-SN-38)2 (도 71)로부터의 데이터는 표적 EphA5: H522 (++++) > H460 (+++) > A549 (++) = H1299 (++)의 발현 수준에 의존하는 ADC 유도 세포 사멸의 증가하는 양을 입증한다. 추가 연구에서는 VH5Vk3-TB-MMAE ADC가 용량- 및 시간-의존 방식으로 EPHA5+ 세포를 사멸할 수 있지만 EPHA5- 세포는 사멸할 수 없음을 추가로 입증하였다 (도 4A 및 4B).
생체내 ADC 효능의 관찰은 다수의 이종이식 종양 모델을 사용하여 완수되었다. 대체로, 100 mm3 부피의 종양을 지닌 마우스를 연구에 등록하고, 3개의 실험 그룹으로 무작위화하였다:
비히클 (PBS) - PBS의 정맥 주사를 받은 마우스
세포독성제 (MMAE 또는 SN-38, 등몰) - 등몰량의 비접합 MMAE 또는 SN-38의 정맥 주사를 받은 마우스
VH4Vk3 또는 VH5Vk3 ADC - 10 mg/kg의 ADC의 정맥 주사를 받은 마우스.
인간 폐암의 H522-유래 이종이식 모델에서 VH4Vk3-티오브릿지®-VCP-MMAE 및 VH4Vk3-티오브릿지®-(VCP-SN-38)2를 사용한 연구의 경우, 치료는 총 3주 동안 매주 투여한 (총 3회 용량) 후, 대조군 (그룹 1 및 2)이 연구에서 허용된 최대 부피 (2500 mm3)에 도달할 때까지 관찰 및 종양 측정을 수행하였다. 디지털 캘리퍼를 사용하여 48시간마다 종양 측정을 수행하였다. 종양 성장 곡선 및 진행의 폭포형 차트가 도 72, 74, 및 76에 예시되어 있다. 모든 ADC-처리 종양에 대해 완전한 퇴행이 관찰되었다. 퇴행은 실험 종료를 나타낸, 총 50-60일 동안 지속되었다. 동시에, 연구에 등록된 마우스의 체중은 첫 번째 처리 투여 전과 종료 시 측정되었다 (도 73, 75, 및 77). 각각의 연구에서, 체중의 어떤 유의한 변화도 관찰되지 않았다.
A549 세포주-유래 인간 폐암 이종이식 모델을 사용하여 유사한 연구를 수행하였다. VH4Vk3-티오브릿지®-VCP-MMAE 및 VH4Vk3-티오브릿지®-(VCP-SN-38)2에 대한 성장 곡선 및 폭포형 플롯이 도 80 및 82에 예시되어 있다. 이전 연구와 유사하게, ADC-처리된 종양 중 4개 종양에 대해 완전한 퇴행이 관찰되었다 (n=5). 한 종양은 연구 전체 (총 32일) 내내 지속된 부분적인 퇴행 (마우스 4)을 나타냈다. 폭포형 차트는 ADC VH4Vk3-티오브릿지®-VCP-MMAE로 처리된 종양의 부분 및 완전한 지속 퇴행을 둘 다 확인해 주었다 (도 82). VH4Vk3-티오브릿지®-(VCP-SN-38)2를 사용한 연구의 경우, 처음 3주 동안 (1-20일차) 치료를 매주 투여하였다. 20일차에, 그룹 3의 마우스는 VH4Vk3-티오브릿지®-VCP-MMAE (10 mg/kg)의 첫 번째 용량을 받았다. 두 번째 및 세 번째 용량은 각각 26일과 32일치에 투여되었다 (처리는 화살표로 표시됨). 대조군 1과 2는 종양 궤양으로 인해 32일차에 종료되었다. 그룹 3은 38일차까지 관찰되었다 (도 80). 디지털 캘리퍼를 사용하여 48시간마다 종양 측정을 수행하였다. 두 연구 모두에서, 첫 번째 처리 투여 전과 종료 시 연구에 등록된 마우스의 체중은 모든 그룹에서 어떤 유의한 체중 변화도 관찰되지 않은 것으로 나타났다 (도 79, 81).
유사한 연구에 사용된 또 다른 이종이식 모델은 인간 폐암의 H460-유래 이종이식 모델이었다. VH4Vk3-티오브릿지®-VCP-MMAE를 사용한 실험의 경우, 대조군(비히클 및 작용제 단독 그룹)이 연구에서 허용된 최대 부피 (2000 mm3)에 도달할 때까지 치료를 5일마다 총 3회 용량으로 투여한 후 관찰 및 종양 측정을 수행하였다. 종양 측정은 디지털 캘리퍼를 사용하여 매일 수행되었다. 결과는 그룹 3 (n=9)의 2개 종양 (마우스 2 및 마우스 8)에 대해 완전한 퇴행이 관찰되었으며 (도 82), 한편 첫 번째 처리 이전부터 그리고 종료시 어떤 그룹에서도 체중 변화가 관찰되지 않은 것으로 밝혀졌다 (도 83). VH4Vk3-티오브릿지®-(VCP-SN-38)2에 대한 연구는 5일마다 총 3회 투여한 후 대조군 (비히클 및 비접합 세포독성제)이 연구 (2000 mm3)에서 허용된 최대 부피에 도달할 때까지 관찰 및 종양 측정을 수행하였고 어떤 체중 변화도 없이 그룹 3 (n=8) (도 84)의 1개 종양 (마우스 6)에 대해 완전한 퇴행이 관찰된 것으로 밝혀졌다 (도 85).
인간 폐암의 H522 세포주-기반 이종이식 모델에서 VH5Vk3-티오브릿지®-VCP-MMAE ADC를 사용한 두 세트의 연구도 본 개시내용의 이전 연구와 유사한 설정 및 일정을 사용하여 수행되었다. 여기서 치료를 3주 동안 매주 투여한 (총 3회 용량) 후, 대조군이 연구에서 허용된 최대 부피 (2500 mm3)에 도달할 때까지 관찰 및 종양 측정을 수행하였다. 도 86은 그룹 3 (n=10)의 모든 종양에 대해 완전한 퇴행이 관찰되었음을 나타낸다. 퇴행은 총 60일 동안 지속되었다. 폭포형 차트는 ADC로 처리된 모든 종양의 완전하고 지속적인 퇴행을 나타낸다. 유사하게, 도 88은 실험군 (n=5)의 모든 종양에서 완전한 퇴행을 나타낸다. 퇴행은 총 50일 동안 지속되었다. 폭포형 차트에 의한 분석은 ADC로 처리된 모든 종양의 완전하고 지속적인 퇴행을 나타낸다. 두 연구 모두에서 체중은 어떤 유의한 변화도 나타내지 않았다 (도 87 및 89).
그 다음에 VH5Vk3-티오브릿지®-VCP-MMAE 및 VH5Vk3-티오브릿지®-(VCP-SN-38)2 ADC를 사용한 일련의 연구를 본 개시내용의 이전 연구와 유사한 설정 및 일정을 사용하여 A549 인간 폐암 세포주를 사용하는 이종이식 모델을 사용하여 수행하였다. MMAE-접합 ADC의 경우, 치료를 3주 동안 매주 투여 (총 3회 용량)한 후 대조군이 연구에서 허용된 최대 부피 (1200 mm3)에 도달하거나 궤양의 징후를 보일 때까지 관찰 및 종양 측정을 수행하였다 (도 90). 결과는 실험군 (n=5)에서 모든 종양의 완전한 퇴행을 발견하였다. 폭포형 차트에 의한 분석은 ADC로 처리된 5개 종양의 완전하고 지속적인 퇴행을 나타냈다. SN-38 접합 ADC로 처리된 동물의 경우, 처음 3주 동안 (1-20일차) 치료를 매주 투여하였다. 20일차에, 그룹 3의 마우스에게 VH5Vk3-티오브릿지®-VCP-MMAE(10 mg/kg)의 첫 번째 용량을 투여하였다 (도 92). 두 번째 및 세 번째 용량은 각각 26일과 32일차에 투여되었다 (처리는 화살표로 표시됨). 대조군은 종양 궤양으로 인해 32일차에 종료되었다. 그룹 3은 38일차까지 관찰되었다. ADC VH5Vk3-티오브릿지®-(VCP-SN-38)2 (10 mg/kg)으로 처리한 종양의 부분 퇴행은 14일차까지 관찰되었으며, 그 후 종양은 20일차까지 꾸준히 진행되었다. ADC VH5Vk3-티오브릿지®-VCP-MMAE를 사용하여 진행성 종양의 결과는 20 - 38일차까지 종양 성장 억제가 지속되었다. 폭포형 분석 차트는 VH5Vk3-티오브릿지®-(VCP-SN-38)2로 처리한 종양의 부분적인 퇴행을 나타낸다. 이들 연구에 참여한 모든 동물의 체중에 어떤 유의한 차이도 관찰되지 않았다 (도 91 및 93).
그 다음에 H460 세포주를 기반으로 한 인간 폐암 이종이식 마우스 모델을 사용하여 두 가지 연구가 수행되었다. 여기서 ADC VH5Vk3-티오브릿지®-VCP-MMAE를 사용한 종양-보유 동물 치료는 5일마다 총 3회 투여한 후 대조군이 연구에서 허용된 최대 부피 (2000 mm3)에 도달할 때까지 관찰 및 종양 측정을 수행하였다. 도 94 및 5A는 부분적인 퇴행이 그룹 3의 8개 종양 (n=9)에 대해 관찰되었음을 입증한다. VH5Vk3-티오브릿지®-(VCP-SN-38)2를 활용한 연구의 경우, 치료는 5일마다 총 3회 용량으로 투여한 후, 대조군이 연구에서 허용된 최대 부피 (2000 mm3)에 도달할 때까지 관찰 및 종양 측정을 수행하였다. 도 96 및 도 6에 도시된 바와 같이, 실험군 (n=9)의 7개 종양에 대해 부분적인 퇴행이 관찰되었다. 이전 연구와 마찬가지로. 모든 그룹에서 체중의 어떤 유의한 변화도 관찰되지 않았다 (도 95 및 97). 비교를 위해, MMAE에 접합된 항-인간 EphA5 수용체 마우스 항체 11C12를 사용하여 연구를 수행하였으며, 이는 종양 성장에 어떤 영향도 미치지 않는 것으로 밝혀졌다 (도 5B).
마지막으로, 유방암의 환자-유래 이종이식 모델 (PDX)을 사용하여 연구가 수행되었다. 간단히 말하면, ER, PR 및 HER2 음성 (삼중-음성) 침윤성 관암종 유방 종양의 조직을 마우스에 이종이식하였다. 그 다음에 종양-보유 동물을 VH4Vk3-티오브릿지®-VCP-MMAE 또는 VH5Vk3-티오브릿지®-VCP-MMAE 또는 비히클 대조군 (PBS)으로 처리하였다. 생착(engraftment) 후 그러나 치료 전에, 이종이식 조직을 EphA5의 발현에 대해 평가하였다 (도 98, 왼쪽). 치료는 7일마다 투여되는 10 mg/kg의 5회 용량의 MMAE-접합 ADC로 이루어졌다. 두 ADC를 모두 사용한 치료는 측정가능한 종양 성장이 거의 발생하지 않았으며, 한편 대조군 동물의 종양은 16일 이내에 실험 종점까지 빠르게 성장하였다 (도 98, 오른쪽).
함께, 그리고 이론에 얽매이기를 바라지 않으면서, 이들 연구는 본 발명의 항-EPHA5 기반 ADC의 시험관내 및 시험관내 기능을 입증하고 폐암을 포함한 EPHA5-발현 암을 치료하기 위한 이들의 임상적 유용성을 나타낸다
실시예 5: 삼중 음성 유방암의 환자-유래 이종이식 모델에서 EphA5에 대한 ADC의 생체내 항종양 활성
종양 단편을 암 환자로부터 외과적으로 절개하고 면역결핍 마우스에 직접 이식하는 환자-유래 종양 이종이식 (PDX)은 번역 연구에서 예측 모델로 확립되었다. 항암제에 대한 PDX 감수성은 PDX 모델이 유래된 환자의 임상 데이터와 밀접한 상관관계가 있으며, PDX 모델은 종종 원래 종양의 세포 및 조직병리학적 구조를 유지한다. 이식 후 PDX 모델의 종양 세포에 대한 유전적 분석을 통해 PDX와 모 환자 종양 사이의 게놈 및 유전자 발현 프로파일이 보존되는 것으로 나타났으며, PDX의 표준 화학요법제에 대한 민감도는 PDX가 유래된 환자의 임상 데이터와 밀접한 상관관계가 있다. 500개가 넘는 상이한 PDX 모델이 다기관(multi-center) 노력을 통해 25가지의 상이한 종양 유형에 대해 특성화되었으며, 이는 이들 모델과 다양한 종양 유형 간의 상관관계에 대한 포괄적인 정보를 제공하였다. 따라서 PDX 모델은 특히 고형 종양에 대한 항암 치료제의 효능을 예측하는 데 매우 효과적인 생체내 모델이다.
본 연구에서는 삼중 음성 유방암에 대한 PDX 모델을 사용하여 새로운 세포-표면 수용체 표적 EphA5를 표적으로 하는 두 가지 항체-약물 접합체 (ADC)의 생체내 항종양 활성을 테스트하였다. EphA5는 막-결합 수용체 티로신 키나제 그룹에 속하는 에프린 수용체이다. EphA 패밀리는 종양 진행, 즉 세포 증식, 침습성 및 전이에 관여하는 것으로 나타났으며, 특히 EphA5는 이전에 폐암을 포함한 다양한 암에서 확인된 세포-표면 표적으로 확인되었다. EphA5는 이전에 면역조직화학을 통해 유방암 세포의 세포 표면 상에서 발현되는 것으로 나타났으며, IHC를 사용한 본 연구에 사용된 PDX 모델의 세포 표면 상에서 고도로 발현되는 것으로 확인되었다.
테스트된 4개의 ADC는 인간 EphA5에 선택적으로 결합하는 2개의 모노클로날 항체 (VH5Vk3 및 VH4Vk3), 독점적인 부위-특이적 접합 기술, 잘 검증된 링커 분자, 그리고 본원에 더 상세히 기재된 바와 같은 2개의 페이로드 독소 중 하나로 이루어진다. 이들 ADC는 이식된 종양 조직의 종양 세포를 표적으로 하여, 처리된 동물에서 암 세포의 특정 세포 사멸 및 종양의 퇴행을 야기하였다.
테스트 동물. 본 연구는 Jackson Laboratories에서 구입한 PDX 모델 TM00096 (BR085F)이 이식된 암컷 NSG™ 마우스를 사용하여 수행되었다. 이들 마우스는 극도로 면역결핍이 있으며 두 가지 돌연변이: 중증 복합 면역결핍(severe combined immune deficiency) (scid)과 IL2 수용체 공통 감마 쇄의 완전한 null 대립유전자(complete null allele of the IL2 receptor common gamma chain) (IL2rgnull)를 가지고 있다. scid 돌연변이는 DNA 복구 복합체 단백질 Prkdc의 돌연변이이며 마우스의 B 세포와 T 세포가 결핍되게 만든다. IL2rgnull 돌연변이는 다중 수용체를 통한 시토카인 신호전달을 방지하여, 기능성 NK 세포의 결핍을 야기한다. 이러한 중증 면역결핍으로 인해 환자 유래 이종이식편 (PDX)이 이식되고 마우스에서 인간 조직-기반 종양이 성장할 수 있다. 이들 종양은 이들이 유래된 인간 종양과 유사한 특성 (예를 들어, 유전자 발현)을 가지며 치료제에 대한 인간 반응을 예측한다.
모델이 유래된 환자의 최초 및 최종 진단은 침윤성 관암종 AJCC IIA/등급 3이었다. 종양의 원발 부위는 유방이었고 이식용 샘플은 전이 부위 (폐)로부터 수득하였다. 종양은 치료 경험이 없는(nave) 종양이 아니었다. 샘플이 유래된 환자는 52세의 백인 히스패닉계 여성이었다. 수술적 절제를 통해 샘플을 수득하였다. 생착을 위한 샘플의 숙주 균주는 NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (일명 NSG 또는 NOD Scid 감마)였다.
마우스는 온도 (20 ± 2℃), 습도 (50 ± 10%), 명암 주기 (명, 7:00 - 19:00; 암, 19:00 내지 7:00)가 제어된 특정 병원균- 및 기회주의자가 없는(specific pathogen- and opportunist-free) (SOPF) 방에 하우징되었으며, New Jersey의 Rutgers Cancer Institute의 연구 동물 시설에서 음식과 물을 자유롭게 이용할 수 있다. 미국 보건 복지부(U.S. Department of Health and Human Services), 공중 보건 서비스(Public Health Service), 및 국제 실험 동물 관리 평가 및 인증(Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care, International) (AAALAC)을 위한 실험 동물 복지국(Office of Laboratory Animal Welfare).
PDX TM00096을 이식한 총 40마리의 암컷 마우스가 연구에 사용되었다. 마우스는 10-12주령에 연구 장소에 수용되었으며 평균 18-12주령까지 연구에 남아있었다. 체중은 연구 시작 시 20 g 내지 24 g의 범위였고 연구 종료 시 20 g 내지 26 g의 범위였다.
재료. 본 연구에 사용된 ADC는 접합을 위해 두 가지 항체: VH4Vk3 및 VH5Vk3 중 하나를 사용하는 4개의 ADC를 포함한다. 둘 다 선택적으로 EphA5에 결합하지만 VH5Vk3은 가변 중쇄의 CDR2 영역에서 하나의 아미노산 변화를 가져, 위치 190의 트레오닌에서 세린으로 변화한다.
I. MMAE-접합 ADC
A. ADC1ADC1: VH5Vk3-티오브릿지-VCP-MMAE
B. ADC2 (ADC2): VH4Vk3-티오브릿지-VCP-MMAE
ADC1 및 ADC2는 VH5Vk3 또는 VH4Vk3 항체와 세포독성 페이로드 MMAE에 커플링된 리소좀 카텝신 ('Val-Cit-PAB')에 의해 절단가능한 링커 모이어티를 활용하는 티오브릿지® 부위-특이적 접합 기술을 사용하여 제조된 ADC이다. 이 링커 형식은 응집 성향을 줄이고 수용해도를 개선시키기 위해 분지형 24-단위 PEG 중합체로 설계되었다 (도 33). 평균 DAR 4가 목표였다.
ADC1 및 ADC2의 모든 연구 뱃치는 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)에 의해 결정된 바와 같은 평균 DAR이 4이고 단량체 종의 순도가 95% 이상인 투명한 무색 용액의 외관을 가졌다. 엔도톡신 수준은 리물러스 아메보사이트 용해물 (LAL) 정량 결과를 제공하는 USP <85> 및 Pharm Eur 2.6.14에 맞춰 정렬된 EndoSafe®-PTSTM 플랫폼 (Charles River, Wilmington, MA)에 의해 결정되었다. LC-MS에 의해 결정된 바와 같은 ADC1과 ADC2의 평균 분자량은 158,000 Da였다. ADC1 및 ADC2는 무균 조건 하에 취급되었으며 사용 전까지 -80℃에서 보관되었다.
(SN-38) 2 -접합 ADC.
A. ADC3ADC3: VH5Vk3-티오브릿지®-VCP-(SN-38)2
B. ADC4ADC4: VH4Vk3-티오브릿지®-VCP-(SN-38)2.
ADC3 및 ADC4는 VH5Vk3 또는 VH4Vk3 항체와 티오브릿지® 부위-특이적 접합 기술을 사용하여 제조된 ADC이다. 세포독성 페이로드 SN-38을 항체에 커플링하기 위해 가수분해에 의해 절단가능한 모이어티 (탄산 염)를 가진 이중-로딩된 구조를 사용하였다 (도 33). 이 링커 형식은 또한 응집 성향을 줄이고 수용성을 개선시키기 위해 이중 분지형 24-단위 PEG 중합체로 설계되었다. 평균 DAR 8이 목표였다.
모든 연구 뱃치 (ADC3 및 ADC4)는 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)에 의해 결정된 바와 같은 평균 DAR이 8이고 단량체 종의 순도가 95% 이상인 투명한 무색 용액의 외관을 가졌다. 엔도톡신 수준은 리물러스 아메보사이트 용해물 (LAL) 정량 결과를 제공하는 USP <85> 및 Pharm Eur 2.6.14에 맞춰 정렬된 EndoSafe®-PTSTM 플랫폼 (Charles River)에 의해 결정되었다. LC-MS에 의해 결정된 바와 같은 ADC3과 ADC4의 평균 분자량은 165,000 Da였다. ADC3 및 ADC4는 무균 조건 하에 취급되었으며 사용 전까지 -80℃에서 보관되었다.
방법
모든 연구 뱃치 (ADC3 및 ADC4)는 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)에 의해 결정된 바와 같은 평균 DAR이 8이고 단량체 종의 순도가 95% 이상인 투명한 무색 용액의 외관을 가졌다. 엔도톡신 수준은 리물러스 아메보사이트 용해물 (LAL) 정량 결과를 제공하는 USP <85> 및 Pharm Eur 2.6.14에 맞춰 정렬된 EndoSafe®-PTSTM 플랫폼 (Charles River)에 의해 결정되었다. LC-MS에 의해 결정된 바와 같은 ADC3과 ADC4의 평균 분자량은 165,000 Da였다. ADC3 및 ADC4는 무균 조건 하에 취급되었으며 사용 전까지 -80℃에서 보관되었다.
마우스는 꼬리 정맥 주사를 통해 10 mg/kg 또는 PBS로 ADC1 또는 ADC2를 매주 5회 용량, 또는 ADC3 또는 ADC4를 매주 4회 용량으로 받았다. 동물에게 0, 7, 14, 21 및 28일차에 투여한 후 처리 없이 (또는 연구가 중단될 때까지) 2주 동안 관찰하였다 (28-40일차). 그룹당 사용된 마우스의 수는 평균 n=7-10이었으며 일부 마우스는 피하 이식된 1개 초과의 종양을 나타냈다. 그러한 경우, 각각의 종양 크기를 독립적으로 측정하고 기록하였다. 측정은 디지털 캘리퍼 (Fisherbrand™ Traceable™ Digital Carbon Fiber Calipers)를 사용하여 매주 2-3회 수행하였다. 연구는 평균 40일 동안 또는 최대 허용 종양 부피에 도달하고/하거나 피부 궤양이 나타날 때까지 지속되었다. 모든 연구는 처리군의 마우스와 동일한 수의 마우스로 구성된 대조군을 포함하였다. 대조군은 PBS 꼬리 정맥 주사를 받았고 TA 처리된 마우스와 동일한 취급 절차를 거쳤다. 첫 번째 처리는 종양의 부피가 100 - 150 mm3에 도달했을 때 투여되었다.
첫 번째 처리 전 (사전) 및 각각의 연구 종료 시 TA 또는 PBS로 매주 처리된 TM00096-보유 마우스의 체중을 결정하고 플롯팅하였다. 연구 종료 후, 임의의 남아있는 종양을 절제하고 실험실 저울에서 중량을 측정하였다. 남아 있는 종양에서 DNA를 추출하고 서열분석을 통해 치료 요법에 의해 잠재적으로 유발되는 EphA5 에피토프의 임의의 돌연변이의 존재를 결정하였다.
데이터 분석
종양 크기 및 체중의 통계 분석 및 그래픽 플롯팅은 GraphPad Prism 9 및 Microsoft Excel (버전 16.63.1)을 사용하여 수행되었다. 테스트 그룹과 대조군 그룹 간의 측정된 차이의 통계적 유의성은 GraphPad Prism 9를 사용하여 스튜던트 t-검정(Student's t-test) 또는 분산 분석 (일원 또는 이원 ANOVA)을 통해 테스트되었다.
선택된 결과
5주 기간에 걸쳐 TM00096 종양을 보유하는 마우스에 ADC1을 매주 투여한 결과 종양이 완전하고 지속적으로 퇴행되었다 (도 100). 총 12개의 종양 중, ADC1 처리군에서 4개 종양은 완전히 퇴행되었으며 종료 시 종양 중량을 결정할 수 없었다. 연구 종료 시 중량이 0.003 g 내지 0.019 g의 범위인 8개의 종양이 남았다 (도 101A). 도 101B에 나타난 바와 같이, ADC1 둘 다로의 처리 전후에 마우스의 체중에는 어떤 유의한 변화도 없었다.
유사하게, 5주 기간에 걸쳐 TM00096 종양을 보유하는 마우스에 ADC2를 매주 투여하면 종양이 완전하고 지속적으로 퇴행되었다 (도 102). 총 10개의 종양 중, ADC2 처리군에서 4개의 종양이 완전히 퇴행되었으며 종료 시 종양 중량을 결정할 수 없었다. 0.014 g 내지 0.025 g 범위의 중량을 갖는 6개의 종양이 연구 종료 시에 남아 있었다 (도 103A). 도 103B에 나타난 바와 같이, ADC2 처리 전후에 마우스의 체중에는 어떤 유의한 변화도 없었다.
4주 기간에 걸쳐 TM00096 PDX 마우스에 ADC3 (도 104A) 및 ADC4 (도 104B) 둘 다를 투여하면 종양 성장이 지연된 후 종양 부담으로 인해 빠른 재성장 및 조기 종료가 초래되었다. ADC3 처리된 마우스의 종양은 PBS 대조군과 비교하여 중량이 약간 감소되었고 (도 105A), ADC4 처리된 마우스의 종양은 위약과 비교하여 어떤 유의한 중량 감소도 나타내지 않았다 (도 105B). 도 106A 및 106B에 나타난 바와 같이, 처리된 마우스는 처리 전후에 체중에 어떤 유의한 변화도 나타내지 않았다.
삼중-음성 유방암은 공격적인 생물학과 복잡한 종양 진화를 보이는 이질적인 질환으로 공지되어 있다. ADC3 및 ADC4에 대한 반응의 차이에 대한 한 가지 가능성은 ADC에 대한 노출로 인해 ADC의 항체 결합 부분에 의해 인식되는 에피토프의 변화일 수 있으며, 이는 감소된 항종양 활성을 야기할 수 있다. TA 처리에 반응하여 EphA5 돌연변이의 가능성을 확인하기 위해, VH5Vk3 또는 VH4Vk3에 의해 인식되는 EphA5 에피토프를 함유하는 영역을 연구 기간 이후 나머지 종양에서 서열분석하였다. PBS나 TA 투여 모두 VH5Vk3 또는 VH4Vk3에 의해 인식되는 EphA5 에피토프를 구성하는 아미노산의 돌연변이를 초래하지 않았다 (표 1 - 5).
VH5Vk3과 인간 EphA5의 결합에 중대한 아미노산 (볼드체로 강조표시)은 게놈 서열에 상응하는 영역 306_RPGFFKASPHIQSCGKCPPHSYTHE_330 (서열번호: 43) 내에 함유되어 있다:
AGACCTGGGTTCTTCAAAGCCTCACCTCACATCCAGAGCTGCGGCAAATGTCCACCTCACAGTTATACCCATGAG (서열번호: 44)
인간 EphA5에 대한 VH4Vk3의 결합을 위한 중대한 아미노산 (볼드체로 강조표시됨)은 상기와 동일한 게놈 서열에 상응하는 영역 306_RPGFFKASPHIQSCGKCPPHSYTHE_330 (서식별번호: 43) 내에 함유되어 있다.
표 1: PBS 처리된 PDX TM00096 마우스로부터의 종양 서열분석
표 2: ADC1 처리된 PDX TM00096 마우스로부터의 종양 서열분석
표 3: ADC2 처리된 PDX TM00096 마우스로부터의 종양 서열분석
표 4: ADC3 처리된 PDX TM00096 마우스로부터의 종양 서열분석
표 5: ADC4 처리된 PDX TM00096 마우스로부터의 종양 서열분석
선택된 결론
삼중 음성 유방암의 TM00096 PDX 모델에 ADC1 및 ADC2를 5주의 기간에 걸쳐 투여한 결과 종양이 완전하고 지속적으로 퇴행되었다. 또한, 처리된 동물은 연구 기간 동안 체중에 어떤 유의한 차이도 나타내지 않았는데, 이는 ADC1 및 ADC2 투여가 동물의 번성(thrive) 능력에 부정적인 영향을 미치지 않았음을 시사한다. 이론에 얽매이기를 바라지 않으면서, 이는 ADC1 또는 ADC2가 삼중 음성 유방암 치료를 위한 추가 개발을 위한 유망한 약물 후보가 될 수 있음을 시사한다.
ADC3 및 ADC4는 삼중 음성 유방암의 TM00096 PDX 모델에서 적당한 생체내 항종양 활성을 나타냈으며, 종양 성장이 약간 지연된 후 재성장이 뒤따랐다. ADC3 및 ADC4 처리된 동물은 또한 체중에 있어 어떤 유의한 변화도 나타내지 않았는데, 이는 ADC3 및 ADC4 투여가 동물의 번성 능력에 부정적인 영향을 미치지 않았음을 시사한다.
TA와 위약의 투여는 VH5Vk3 또는 VH4Vk3에 의해 인식되는 EphA5 에피토프의 변형을 일으키지 않았으며, 이는 ADC3 및 ADC4의 항종양 활성 차이가 표적 에피토프 표시의 변경으로 인한 것이 아님을 나타낸다.
실시예 6: 삼중 음성 유방암의 환자-유래 이종이식 모델에서 EphA5에 대한 ADC의 생체내 항종양 활성
이 연구의 목적은 삼중 음성 유방암의 PDX 모델을 사용하여 새로운 표적인 EphA5에 대한 두 가지 ADC의 치료적 항종양 활성을 평가하는 것이었다. 구체적으로, 본 연구의 목적은 종양 세포의 세포 표면 상에 높은 수준으로의 EphA5를 발현하는 것으로 나타난 삼중 음성 유방암의 PDX 마우스 모델에서, 2개의 ADC, H5Vk3-MMAE 및 H5Vk3-(SN-38)2의 생체내 항종양 활성을 테스트하는 것이었다.
테스트 동물. 본 연구는 Jackson Laboratories에서 구입한 PDX 모델 TM00098 (BR1126F)이 이식된 암컷 NSG™ 마우스를 사용하여 수행되었다. 이들 마우스는 극도로 면역결핍이 있으며 두 가지 돌연변이: 중증 복합 면역결핍 (scid)과 IL2 수용체 공통 감마 쇄의 완전한 null 대립유전자 (IL2rgnull)를 가지고 있다. scid 돌연변이는 DNA 복구 복합체 단백질 Prkdc의 돌연변이이며 마우스의 B 세포와 T 세포가 결핍되게 만든다. IL2rgnull 돌연변이는 다중 수용체를 통한 시토카인 신호 전달을 방지하여, 기능성 NK 세포의 결핍을 야기한다. 이러한 중증 면역결핍으로 인해 PDX가 이식되고 마우스에서 인간 조직-기반 종양이 성장할 수 있다. 이들 종양은 이들이 유래된 인간 종양과 유사한 특성 (예를 들어, 유전자 발현)을 가지며 치료제에 대한 인간 반응을 예측한다.
TM00098 PDX 모델이 유래된 종양의 최초 및 최종 진단은 침윤성 관암종 AJCC IA/등급 3이었다. 인간 종양의 원발성 부위는 유방이었고, PDX 모델의 종양의 샘플 부위는 종양의 원발성 부위였다. TM00098 PDX 모델에 사용된 종양은 치료 경험이 없었다. 샘플이 유래된 환자는 64세의 백인 비-히스패닉계 여성이었다. 수술적 절제를 통해 샘플을 수득하였다. 생착을 위한 샘플의 숙주 균주는 NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (일명 NSG 또는 NOD Scid 감마)였다.
테스트 동물 하우징 및 관리
본 연구에 사용된 마우스는 미국 보건 복지부, 공중 보건 서비스, 및 실험 동물 복지국을 포함하여 모든 적용가능한 법률 및 지침을 준수하여 관리되었다. New Jersey의 Rutgers Cancer Institute의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(The Institutional Animal Care and Use Committee)는 모든 동물 실험을 승인하였고, 루트거스 동물 시설(Rutgers Animal Facility)은 국제 실험 동물 관리 평가 및 인증 협회(Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care, International) (AAALAC)에서 정한 지침을 따랐다.
마우스는 온도 (20±2℃), 습도 (50±10%), 명암 주기 (명, 7:00 내지 19:00; 암, 19:00 내지 7:00)가 제어된 특정 병원균- 및 기회주의자가 없는 (SOPF) 방에 하우징되었으며, New Jersey의 Rutgers Cancer Institute (Newark, NJ)의 연구 동물 시설에서 음식과 물을 자유롭게 이용할 수 있다. 한배 새끼는 실험 그룹에 무작위로 할당되었다.
PDX TM00098을 이식한 총 40마리의 암컷 마우스가 연구에 사용되었다. 마우스는 10-12주령에 연구 장소에 수용되었으며 평균 18-12주령까지 연구에 남아있었다. 체중은 연구 시작 시 18 g 내지 25 g의 범위였고 연구 종료 시 22 g 내지 27 g의 범위였다.
재료
ADC1: VH5Vk3-티오브릿지-VCP-MMAE
ADC1은 세포독성 페이로드 MMAE에 커플링된 리소좀 카텝신 ('Val-Cit-PAB')에 의해 절단가능한 링커 모이어티를 활용하는 티오브릿지® 부위-특이적 접합 기술과 접합된 VH5Vk3 항체를 사용하여 제조된 ADC이다. 이 링커 형식은 응집 성향을 줄이고 수용해도를 개선시키기 위해 분지형 24-단위 PEG 중합체로 설계되었다 (도 33). 평균 DAR 4가 목표였다.
ADC1의 모든 연구 뱃치는 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)에 의해 결정된 바와 같은 평균 DAR이 4이고 단량체 종의 순도가 95% 이상인 투명한 무색 용액의 외관을 가졌다. 엔도톡신 수준은 리물러스 아메보사이트 용해물 (LAL) 정량 결과를 제공하는 USP <85> 및 Pharm Eur 2.6.14에 맞춰 정렬된 EndoSafe®-PTSTM 플랫폼 (Charles River, Wilmington, MA)에 의해 결정되었다. LC-MS에 의해 결정된 바와 같은 ADC1의 평균 분자량은 158,000 Da였다. ADC1은 무균 조건 하에 취급되었으며 사용 전까지 -80℃에서 보관되었다.
ADC2 VH5Vk3-티오브릿지®-VCP-(SN-38)2
ADC2는 티오브릿지® 부위-특이적 접합 기술과 접합된 VH5Vk3 항체와 세포독성 페이로드 SN-38을 항체에 커플링하기 위해 가수분해에 의해 절단가능한 모이어티 (탄산 염)를 가진 이중-로딩된 구조를 사용하였다 (도 33). 이 링커 형식은 또한 응집 성향을 줄이고 수용성을 개선시키기 위해 이중 분지형 24-단위 PEG 중합체로 설계되었다. 평균 DAR 8이 목표였다.
모든 연구 뱃치는 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)에 의해 결정된 바와 같은 평균 DAR이 8이고 단량체 종의 순도가 95% 이상인 투명한 무색 용액의 외관을 가졌다. 엔도톡신 수준은 리물러스 아메보사이트 용해물 (LAL) 정량 결과를 제공하는 USP <85> 및 Pharm Eur 2.6.14에 맞춰 정렬된 EndoSafe®-PTSTM 플랫폼 (Charles River)에 의해 결정되었다. LC-MS에 의해 결정된 바와 같은 ADC2의 평균 분자량은 165,000 Da였다. ADC2는 무균 조건 하에 취급되었으며 사용 전까지 -80℃에서 보관되었다.
방법
PDX 모델의 선택은 EPHA5 유전자 발현 수준 (Jackson Laboratory 데이터베이스) 및 면역조직화학 (IHC)에 의한 단백질 발현 (사내; 하기에 표시된 IHC 염색)을 기반으로 하였다. 중간 정도 내지 높은 EphA5 발현을 나타내고 유리한 성장 곡선을 가진 PDX 모델이 항종양 활성 연구를 위해 고려되었다. 우리는 또한 시스플라틴, 도세탁셀 및 독소루비신과 같은 일반적인 약물에 대한 반응/저항성을 분석하였다. 여러 약물에 내성이 있는 모델은 선택에서 제외되었으며, 치료 경험이 없는 모델이 우선 순위에 놓였다. 이들 기준을 기반으로 하여, 본 연구에서는 TM00098 PDX 모델이 선택되었다.
마우스는 꼬리 정맥 주사를 통해 10 mg/kg 또는 PBS로 ADC1 또는 ADC2를 매주 5회 용량으로 받았다. 동물에게 0, 7, 14, 21 및 28일차에 투여하고 처리 없이 28-50일차에 종양을 관찰하여 지속된 퇴행 및/또는 종양 재성장의 지연을 관찰하였다. 그룹당 사용된 마우스의 수는 평균 n=7-10이었으며 일부 마우스는 피하 이식된 1개 초과의 종양을 나타냈다. 그러한 경우, 각각의 종양 크기를 독립적으로 측정하고 기록하였다. 측정은 디지털 캘리퍼 (Fisherbrand™ Traceable™ Digital Carbon Fiber Calipers)를 사용하여 매주 2-3회 수행하였다. 연구는 평균 50일 동안 또는 최대 허용 종양 부피 (2,000 mm3)에 도달하고/하거나 피부 궤양이 나타날 때까지 지속되었다. 모든 연구는 처리군의 마우스와 동일한 수의 마우스로 구성된 대조군을 포함하였다. 대조군은 PBS 꼬리 정맥 주사를 받았고 ADC1 및 ADC2 처리된 마우스와 동일한 처리 절차를 거쳤다. 화살표는 처리 일수를 나타낸다. 첫 번째 처리는 종양의 부피가 100 - 150 mm3에 도달했을 때 투여되었다.
첫 번째 처리 전 (사전) 및 종료 시 (처리 후 50일) ADC1, ADC2 또는 PBS로 매주 5주 동안 처리된 TM00098-보유 마우스의 체중을 결정하고 플롯팅하였다. 연구 종료 후 (50일), 임의의 남아있는 종양을 절제하고 실험실 저울에서 중량을 측정하였다. 남아 있는 종양에서 DNA를 추출하고 서열분석을 통해 치료 요법에 의해 유발되는 EphA5 에피토프의 임의의 돌연변이 존재를 결정하였다.
데이터 분석
종양 크기 및 체중의 통계 분석 및 그래픽 플롯팅은 GraphPad Prism 9 및 Microsoft Excel (버전 16.63.1)을 사용하여 수행되었다. 테스트 그룹과 대조군 그룹 간의 측정된 차이의 통계적 유의성은 GraphPad Prism 9를 사용하여 스튜던트 t-검정 또는 분산 분석 (일원 또는 이원 ANOVA)을 통해 s에 대해 테스트되었다.
선택된 결과
5주 기간에 걸쳐 TM00098 종양을 보유하는 마우스에 ADC1을 매주 투여한 결과 종양이 완전하고 지속적으로 퇴행되었다 (도 108A). ADC1 처리 마우스에서의 종양은 완전히 퇴행되었으며 연구 종료 시 종양 중량을 결정할 수 없었다 (도 108B). 종양으로부터 DNA 추출은 연구 종료 시 종양의 부재로 인해 가능하지 않았다. 도 108C에 나타난 바와 같이, ADC1 및 위약 둘 다로 처리하기 전후에 마우스의 체중에는 어떤 유의한 변화도 없었다.
5주 기간에 걸쳐 TM00098 종양을 보유하는 마우스에 ADC2를 투여한 결과 통계적으로 유의한 반응이 나타났고, 일부 종양에서는 초기 퇴행이 관찰된 후 정체 또는 종양 성장 지연이 관찰되었다 (도 109A). ADC2 처리된 마우스의 종양은 PBS 대조군과 비교하여 중량이 상당히 감소하였다 (도 109B). 도 109C에 도시된 바와 같이, ADC1 및 위약 모두 처리 전후에 마우스의 체중에는 어떤 유의한 변화도 없었다.
삼중-음성 유방암은 공격적인 생물학과 복잡한 종양 진화를 보이는 이질적인 질환으로 공지되어 있다. TA1 및 ADC2에 대한 반응의 차이에 대한 한 가지 가능성은 ADC에 대한 노출로 인해 ADC의 항체 결합 부분에 의해 인식되는 에피토프의 변화일 수 있으며, 이는 ADC2의 감소된 항종양 활성을 야기할 수 있을 것이다. TA 처리에 반응하여 EphA5 돌연변이의 가능성을 확인하기 위해, VH5Vk3에 의해 인식되는 EphA5 에피토프를 포함하는 영역을 연구 기간 이후 나머지 종양에서 서열분석하였다. PBS나 ADC2 투여 모두 VH5Vk3에 의해 인식되는 EphA5 에피토프를 구성하는 아미노산의 돌연변이를 일으키지 않았으며 (표 1 및 2); ADC1 투여 후 에피토프 돌연변이를 결정하기에는 종양이 불충분하게 남아 있었다.
하기 게놈 서열: AGACCTGGGTTCTTCAAAGCCTCACCTCACATCCAGAGCTGCGGCAAATGTCCACCTCACAGTTATACCCATGAG (서열번호: 44)에 상응하는, VH5Vk3의 결합을 위한 EphA5 에피토프 (볼드체는 결합에 중대한 아미노산): ephA5_RPGFFKASPHIQSCGKCPPHSYTHE (서열번호: 43)
표 1: PBS로 처리된 TM00098-보유 마우스의 종양에 대한 에피토프 서열분석(서열번호: 44)
표 2: ADC2로 처리된 TM00098-보유 마우스의 종양에 대한 에피토프 서열 분석
선택된 결론
5주의 기간에 걸쳐 삼중 음성 유방암의 TM00098 PDX 모델을 보유한 마우스에 ADC1을 투여한 결과, 50일의 연구 기간 이후에 절제하거나 추가로 평가할 어떤 종양도 남아 있지 않을 정도로 종양이 완전하고 지속적으로 퇴행되었다. ADC1 또는 위약으로 처리된 동물은 연구 동안 체중에 유의한 변화를 나타내지 않았는데, 이는 ADC1 투여가 동물의 번성 능력에 부정적인 영향을 미치지 않았음을 시사한다. 이론에 얽매이기를 바라지 않으면서, 이는 ADC1이 삼중 음성 유방암 치료를 위한 추가 개발을 위한 유망한 약물 후보임을 시사한다.
삼중 음성 유방암의 TM00098 PDX 모델을 보유한 마우스를 ADC2로 처리하면 종양 크기가 통계적으로 유의하게 감소하고 시간이 지나면서 지속되는 종양 성장이 지연되었다. 유사하게, ADC2 또는 위약으로 처리된 동물은 연구 기간 동안 체중에 유의한 변화를 나타내지 않았는데, 이는 ADC2 투여가 동물의 번성 능력에 부정적인 영향을 미치지 않았음을 시사한다. 따라서, ADC2는 ADC1보다 덜 효과적이긴 하지만, 삼중 음성 유방암 치료를 위한 추가 개발을 위한 유망한 약물 후보일 수도 있다.
5회 용량에 대해 매주 10 mg/Kg의 치료는 ADC1 및 ADC2 둘 다에 대해 내약성이 양호하며, 처리되지 않은 동물 또는 PBS (위약)를 투여받은 동물과 비교하여 처리된 동물에서 어떤 독성이나 체중 감소도 관찰되지 않았다.
ADC2와 위약의 투여는 VH5Vk3에 의해 인식되는 EphA5 에피토프의 변형을 일으키지 않았으며, 이는 ADC1과 ADC2의 항종양 활성 차이가 표적 에피토프 표시의 변경으로 인한 것이 아니었음을 나타낸다.
실시예 7: 폐 편평 세포 암종의 환자-유래 이종이식 모델에서 EphA5에 대한 ADC의 생체내 항종양 활성 (연구 RS-003)
이 연구의 목적은 폐 편평 세포 암종의 PDX 모델을 사용하여 새로운 표적인 EphA5에 대한 두 가지 ADC의 치료적 항종양 활성을 평가하는 것이었다. 구체적으로, 본 연구의 목적은 종양 세포의 세포 표면 상에 높은 수준으로의 EphA5를 발현하는 것으로 나타난 폐 편평 세포 암종의 PDX 마우스 모델에서, 2개의 ADC, VH5Vk3-MMAE 및 VH5Vk3-(SN-38)2의 생체내 항종양 활성을 테스트하는 것이었다.
테스트 동물
본 연구는 Jackson Laboratories에서 구입한 PDX 모델 TM00188 (LG0520F)이 이식된 암컷 NSG™ 마우스를 사용하여 수행되었다. 이들 마우스는 극도로 면역결핍이 있으며 두 가지 돌연변이: 중증 복합 면역결핍 (scid)과 IL2 수용체 공통 감마 쇄의 완전한 null 대립유전자 (IL2rg null )를 가지고 있다. scid 돌연변이는 DNA 복구 복합체 단백질 Prkdc의 돌연변이이며 마우스의 B 세포와 T 세포가 결핍되게 만든다. IL2rg null 돌연변이는 다중 수용체를 통한 시토카인 신호 전달을 방지하여, 기능성 NK 세포의 결핍을 야기한다. 이러한 중증 면역결핍으로 인해 PDX가 이식되고 마우스에서 인간 조직-기반 종양이 성장할 수 있다. 이들 종양은 이들이 유래된 인간 종양과 유사한 특성 (예를 들어, 유전자 발현)을 가지며 치료제에 대한 인간 반응을 예측한다.
모델이 유래된 환자의 최초 및 최종 진단은 폐 편평 세포 암종 AJCC IA/등급 3이었다. 인간 종양의 원발성 부위는 폐였고, PDX 모델의 종양의 샘플 부위는 종양의 원발성 부위였다. TM00188 PDX 모델에 사용된 종양은 치료 경험이 없었다. 샘플이 유래된 환자는 67세의 백인 비-히스패닉계 남성 이전의 흡연자였다. 수술적 절제를 통해 샘플을 수득하였다. 생착을 위한 샘플의 숙주 균주는 NOD.Cg-Prkdc scid 　Il2rg tm1Wjl /SzJ (일명 NSG 또는 NOD Scid 감마)였다.
테스트 동물 하우징 및 관리
마우스는 온도 (20 ± 2℃), 습도 (50 ± 10%), 명암 주기 (명, 7:00 내지 19:00; 암, 19:00 내지 7:00)가 제어된 특정 병원균- 및 기회주의자가 없는 (SOPF) 방에 하우징되었으며, New Jersey의 Rutgers Cancer Institute의 연구 동물 시설에서 음식과 물을 자유롭게 이용할 수 있다. 본 연구에 사용된 마우스는 미국 보건 복지부, 공중 보건 서비스, 및 실험 동물 복지국을 포함하여 모든 적용가능한 법률 및 지침을 준수하여 관리되었다. New Jersey의 Rutgers Cancer Institute의 기관 동물 관리 및 사용 위원회는 모든 동물 실험을 승인하였고, 루트거스 동물 시설은 국제 실험 동물 관리 평가 및 인증 협회 (AAALAC)에서 정한 지침을 따랐다.
마우스는 온도 (20±2℃), 습도 (50±10%), 명암 주기 (명, 7:00 내지 19:00; 암, 19:00 내지 7:00)가 제어된 특정 병원균- 및 기회주의자가 없는 (SOPF) 방에 하우징되었으며, New Jersey의 Rutgers Cancer Institute (Newark, NJ)의 연구 동물 시설에서 음식과 물을 자유롭게 이용할 수 있다. 한배 새끼는 실험 그룹에 무작위로 할당되었다.
PDX TM00098을 이식한 총 40마리의 암컷 마우스가 연구에 사용되었다. 마우스는 10-12주령에 연구 장소에 수용되었으며 평균 18-12주령까지 연구에 남아있었다. 체중은 연구 시작 시 19 g 내지 24 g의 범위였고 연구 종료 시 19 g 내지 25 g의 범위였다.
재료
ADC1: VH5Vk3-티오브릿지-VCP-MMAE
ADC1은 VH5Vk3 항체와 세포독성 페이로드 MMAE에 커플링된 리소좀 카텝신 ('Val-Cit-PAB')에 의해 절단가능한 링커 모이어티를 활용하는 티오브릿지® 부위-특이적 접합 기술을 사용하여 제조된 ADC이다. 이 링커 형식은 응집 성향을 줄이고 수용해도를 개선시키기 위해 분지형 24-단위 PEG 중합체로 설계되었다 (도 33). 평균 DAR 4가 목표였다. ADC1의 모든 연구 뱃치는 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)에 의해 결정된 바와 같은 평균 DAR이 4이고 단량체 종의 순도가 95% 이상인 투명한 무색 용액의 외관을 가졌다. 엔도톡신 수준은 리물러스 아메보사이트 용해물 (LAL) 정량 결과를 제공하는 USP <85> 및 Pharm Eur 2.6.14에 맞춰 정렬된 EndoSafe®-PTS™ 플랫폼 (Charles River, Wilmington, MA)에 의해 결정되었다. LC-MS에 의해 결정된 바와 같은 ADC1의 평균 분자량은 158,000 Da였다. ADC1은 무균 조건 하에 취급되었으며 사용 전까지 -80℃에서 보관되었다.
ADC2 VH5Vk3-티오브릿지®-VCP-(SN-38)2
ADC2는 VH5Vk3 항체와 티오브릿지® 부위-특이적 접합 기술을 사용하여 제조된 ADC이다. 세포독성 페이로드 SN-38을 항체에 커플링하기 위해 가수분해에 의해 절단가능한 모이어티 (탄산 염)를 가진 이중-로딩된 구조를 사용하였다 (도 33). 이 링커 형식은 또한 응집 성향을 줄이고 수용성을 개선시키기 위해 이중 분지형 24-단위 PEG 중합체로 설계되었다. 평균 DAR 8이 목표였다.
모든 연구 뱃치는 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)에 의해 결정된 바와 같은 평균 DAR이 8이고 단량체 종의 순도가 95% 이상인 투명한 무색 용액의 외관을 가졌다. 엔도톡신 수준은 리물러스 아메보사이트 용해물 (LAL) 정량 결과를 제공하는 USP <85> 및 Pharm Eur 2.6.14에 맞춰 정렬된 EndoSafe®-PTS™ 플랫폼 (Charles River)에 의해 결정되었다. LC-MS에 의해 결정된 바와 같은 ADC2의 평균 분자량은 165,000 Da였다. ADC2는 무균 조건 하에 취급되었으며 사용 전까지 -80℃에서 보관되었다.
방법
PDX 모델의 선택은 EPHA5 유전자 발현 수준 (Jackson Laboratory 데이터베이스) 및 면역조직화학 (IHC)에 의한 단백질 발현 (사내; 하기에 표시된 IHC 염색)을 기반으로 하였다. 중간 정도 내지 높은 EphA5 발현을 나타내고 유리한 성장 곡선을 가지고, 시스플라틴, 도세탁셀 및 독소루비신과 같은 일반적인 약물에 대한 반응성이 간주되는 PDX 모델이 항종양 활성 연구를 위해 고려되었다. 여러 약물에 내성이 있는 모델은 선택에서 제외되었으며, 치료 경험이 없는 모델이 우선 순위에 놓였다. 이들 기준을 기반으로 하여, 본 연구에서는 TM000188 PDX 모델이 선택되었다.
마우스는 꼬리 정맥 주사를 통해 10 mg/kg 또는 PBS로 ADC1 또는 ADC2를 매주 5회 용량으로 받았다. 동물에게 0, 7, 14, 21 및 28일차에 투여한 후 처리 없이 3주 관찰 (28-50일차)하였다. 그룹당 사용된 마우스의 수는 평균 n=10이었으며 일부 마우스는 피하 이식된 1개 초과의 종양을 나타냈다. 그러한 경우, 각각의 종양 크기를 독립적으로 측정하고 기록하였다. 측정은 디지털 캘리퍼 (Fisherbrand™ Traceable™ Digital Carbon Fiber Calipers)를 사용하여 매주 2-3회 수행하였다. 연구는 평균 50일 동안 또는 최대 허용 종양 부피에 도달하고/하거나 피부 궤양이 나타날 때까지 지속되었다. 모든 연구는 처리군의 마우스와 동일한 수의 마우스로 구성된 대조군을 포함하였다. 대조군은 PBS 꼬리 정맥 주사를 받았고 ADC1 및 ADC2 처리된 마우스와 동일한 취급 절차를 거쳤다. 첫 번째 처리는 종양의 부피가 100 - 150 mm3에 도달했을 때 투여되었다.
첫 번째 처리 전 (사전) 및 종료 시 (첫 번째 처리 후 50일) 연구에 등록된TM00188-보유 마우스의 체중을 측정하였다. 연구 종료 후, 임의의 남아있는 종양을 절제하고 실험실 저울에서 중량을 측정하였다. 남아 있는 종양에서 DNA를 추출하고 서열분석을 통해 치료 요법에 의해 잠재적으로 유발되는 EphA5 에피토프의 임의의 돌연변이 존재를 결정하였다.
데이터 분석
종양 크기 및 체중의 통계 분석 및 그래픽 플롯팅은 GraphPad Prism 9 및 Microsoft Excel (버전 16.63.1)을 사용하여 수행되었다. 테스트 그룹과 대조군 그룹 간의 측정된 차이의 통계적 유의성은 GraphPad Prism 9를 사용하여 스튜던트 t-검정 또는 분산 분석 (일원 또는 이원 ANOVA)을 통해 테스트되었다.
선택된 결과
5주 기간에 걸쳐 TM00188 종양을 보유하는 마우스에 ADC1을 매주 투여한 결과 모든 종양 (n=16)이 완전하고 지속적으로 퇴행되었고 (도 111A), 연구 종료 시 종양 중량을 결정할 수 없었다 (도 111B). DNA 추출은 연구 종료 시 종양 조직의 부재로 인해 가능하지 않았다. 도 111C에 나타난 바와 같이, ADC1 둘 다로 처리하기 전후에 마우스의 체중에는 어떤 유의한 변화도 없었다.
5주 기간에 걸쳐 TM00188 종양을 보유하는 마우스에 ADC2를 투여한 결과 어떠한 반응도 나타나지 않았고, 모든 처리된 종양이 시간이 지남에 따라 진행되었다. 대조군 및 ADC2 처리군 둘 다에서 종양 부담으로 인해 연구를 조기에 종료하였다 (도 112A). 대조군과 ADC2 그룹 사이의 종양 중량에 어떤 차이도 없었다 (도 112B). 112C에 도시된 바와 같이, ADC2 처리 전후에 마우스의 체중에는 어떤 변화도 관찰되지 않았다.
폐 편평 세포 암종은 공격적인 생물학과 복잡한 종양 진화를 보이는 이질적인 질환으로 공지되어 있다. ADC1 및 ADC2에 대한 반응의 차이에 대한 한 가지 가능성은 ADC에 대한 노출로 인해 ADC의 항체 결합 부분에 의해 인식되는 에피토프의 변화일 수 있으며, 이는 ADC2의 감소된 항종양 활성을 야기할 수 있을 것이다. TA 처리에 반응하여 EphA5 돌연변이의 가능성을 확인하기 위해, VH5Vk3에 의해 인식되는 EphA5 에피토프를 포함하는 영역을 연구 기간 이후 나머지 종양에서 서열분석하였다. PBS나 ADC2 투여 모두 VH5Vk3에 의해 인식되는 EphA5 에피토프를 구성하는 아미노산의 돌연변이를 일으키지 않았으며 (표 1 및 2); ADC1 투여 후 에피토프 돌연변이를 결정하기에는 종양이 불충분하게 남아 있었다.
VH5Vk3과 인간 EphA5의 결합에 중대한 아미노산 (볼드체로 강조표시)은 하기 게놈 서열에 상응하는, 영역 306_RPGFFKASPHIQSCGKCPPHSYTHE_330 (서열번호:43) 내에 함유되어 있다:
AGACCTGGGTTCTTCAAAGCCTCACCTCACATCCAGAGCTGCGGCAAATGTCCACCTCACAGTTATACCCATGAG (서열번호:44)
표 1: PBS로 처리된 TM00188-보유 마우스로부터의 종양에 대한 에피토프 서열분석
표 2: ADC2로 처리된 TM00188-보유 마우스의 종양에 대한 에피토프 서열분석
선택된 결론
5주의 기간에 걸쳐 폐 편평 세포 암종의 TM00188 PDX 모델을 보유한 마우스에 ADC1을 투여한 결과, 50일의 연구 기간 이후에 절제하거나 추가로 평가할 종양 조직이 남아 있지 않을 정도로 종양이 완전하고 지속적으로 퇴행되었다. ADC1 또는 위약으로 처리된 동물은 연구 동안 체중에 유의한 변화를 나타내지 않았는데, 이는 ADC1 투여가 동물의 번성 능력에 부정적인 영향을 미치지 않았음을 시사한다. 이는 ADC1이 폐 편평 세포 암종 치료를 위한 추가 개발을 위한 유망한 약물 후보임을 시사한다.
폐 편평 세포 암종의 TM00188 PDX 모델을 보유한 마우스를 ADC2로 처리하면 처리에 대한 어떤 반응도 없으며 시간이 지나면서 모든 처리된 종양이 진행된다. 종양 부담으로 인해 조기 종료가 필요하였다. ADC2로 처리된 동물은 연구 기간 동안 체중에 유의한 변화를 나타내지 않았는데, 이는 ADC2 투여가 동물의 번성 능력에 부정적인 영향을 미치지 않았음을 시사한다.
실시예 8: 폐 선암종의 환자-유래 이종이식 모델에서 EphA5에 대한 ADC의 생체내 항종양 활성
이 연구의 목적은 폐 선암종의 PDX 모델을 사용하여 새로운 표적인 EphA5에 대한 두 가지 ADC의 치료적 항종양 활성을 평가하는 것이었다. 구체적으로, 본 연구의 목적은 종양 세포의 세포 표면 상에 중간 내지 높은 수준으로의 EphA5를 발현하는 것으로 나타난 폐 선암종의 PDX 마우스 모델에서, 2개의 ADC, VH5Vk3-MMAE 및 VH5Vk3-(SN-38)2의 생체내 항종양 활성을 테스트하는 것이었다.
테스트 동물
본 연구는 참조 번호 TM00219 (LG1049F)로, Jackson Laboratories에서 구입한 암컷 NSG™ 마우스를 사용하여 수행되었다. 이들 마우스는 극도로 면역결핍이 있으며 두 가지 돌연변이: 중증 복합 면역결핍 (scid)과 IL2 수용체 공통 감마 쇄의 완전한 null 대립유전자 (IL2rgnull)를 가지고 있다. scid 돌연변이는 DNA 복구 복합체 단백질 Prkdc의 돌연변이이며 마우스의 B 세포와 T 세포가 결핍되게 만든다. IL2rgnull 돌연변이는 다중 수용체를 통한 시토카인 신호 전달을 방지하여, 기능성 NK 세포의 결핍을 야기한다. 이러한 중증 면역결핍으로 인해 환자 유래 이종이식편 (PDX)이 이식되고 마우스에서 인간 조직-기반 종양이 성장할 수 있다. 이들 종양은 이들이 유래된 인간 종양과 유사한 특성 (예를 들어, 유전자 발현)을 가지며 치료제에 대한 인간 반응을 예측한다.
모델이 유래된 환자의 최초 및 최종 진단은 폐 선암종 AJCC IV/등급: 1이었다. 인간 종양의 원발성 부위는 폐였고, 샘플 수집은 전이 부위 (림프절)로부터 수행하였다. 종양은 치료 경험이 없진 않았다. 샘플이 유래된 환자는 59세의 백인 비-히스패닉계 여성 이전의 흡연자였다. 미세 바늘 흡인을 통해 샘플을 수득하였다. 생착을 위한 샘플의 숙주 균주는 NOD.Cg-Prkdcscid　Il2rgtm1Wjl/SzJ (일명 NSG 또는 NOD Scid 감마)였다.
테스트 동물 하우징 및 관리
마우스는 온도 (20 ± 2℃), 습도 (50 ± 10%), 명암 주기 (명, 7:00 내지 19:00; 암, 19:00 내지 7:00)가 제어된 특정 병원균- 및 기회주의자가 없는 (SOPF) 방에 하우징되었으며, New Jersey의 Rutgers Cancer Institute의 연구 동물 시설에서 음식과 물을 자유롭게 이용할 수 있다. 본 연구에 사용된 마우스는 미국 보건 복지부, 공중 보건 서비스, 및 실험 동물 복지국을 포함하여 모든 적용가능한 법률 및 지침을 준수하여 관리되었다. New Jersey의 Rutgers Cancer Institute의 기관 동물 관리 및 사용 위원회는 모든 동물 실험을 승인하였고, 루트거스 동물 시설은 국제 실험 동물 관리 평가 및 인증 협회 (AAALAC)에서 정한 지침을 따랐다.
마우스는 온도 (20±2℃), 습도 (50±10%), 명암 주기 (명, 7:00 내지 19:00; 암, 19:00 내지 7:00)가 제어된 특정 병원균- 및 기회주의자가 없는 (SOPF) 방에 하우징되었으며, New Jersey의 Rutgers Cancer Institute (Newark, NJ)의 연구 동물 시설에서 음식과 물을 자유롭게 이용할 수 있다. 한배 새끼는 실험 그룹에 무작위로 할당되었다.
PDX TM00219를 이식한 총 40마리의 암컷 마우스가 연구에 사용되었다. 마우스는 10-12주령에 연구 장소에 수용되었으며 평균 18-12주령까지 연구에 남아있었다. 체중은 연구 시작 시 17 g 내지 24 g의 범위였고 연구 종료 시 18 g 내지 24 g의 범위였다.
재료
ADC1: VH5Vk3-티오브릿지-VCP-MMAE
ADC1은 VH5Vk3 항체와 세포독성 페이로드 MMAE에 커플링된 리소좀 카텝신 ('Val-Cit-PAB')에 의해 절단가능한 링커 모이어티를 활용하는 티오브릿지® 부위-특이적 접합 기술을 사용하여 제조된 ADC이다. 이 링커 형식은 응집 성향을 줄이고 수용해도를 개선시키기 위해 분지형 24-단위 PEG 중합체로 설계되었다 (도 33). 평균 DAR 4가 목표였다.
ADC1의 모든 연구 뱃치는 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)에 의해 결정된 바와 같은 평균 DAR이 4이고 단량체 종의 순도가 95% 이상인 투명한 무색 용액의 외관을 가졌다. 엔도톡신 수준은 리물러스 아메보사이트 용해물 (LAL) 정량 결과를 제공하는 USP <85> 및 Pharm Eur 2.6.14에 맞춰 정렬된 EndoSafe®-PTS™ 플랫폼 (Charles River, Wilmington, MA)에 의해 결정되었다. LC-MS에 의해 결정된 바와 같은 ADC1의 평균 분자량은 158,000 Da였다. ADC1은 무균 조건 하에 취급되었으며 사용 전까지 -80℃에서 보관되었다.
ADC2 VH5Vk3-티오브릿지®-VCP-(SN-38) 2
ADC2는 VH5Vk3 항체와 티오브릿지® 부위-특이적 접합 기술을 사용하여 제조된 ADC이다. 세포독성 페이로드 SN-38을 항체에 커플링하기 위해 가수분해에 의해 절단가능한 모이어티 (탄산 염)를 가진 이중-로딩된 구조를 사용하였다 (도 33). 이 링커 형식은 또한 응집 성향을 줄이고 수용성을 개선시키기 위해 이중 분지형 24-단위 PEG 중합체로 설계되었다. 평균 DAR 8이 목표였다.
모든 연구 뱃치는 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)에 의해 결정된 바와 같은 평균 DAR이 8이고 단량체 종의 순도가 95% 이상인 투명한 무색 용액의 외관을 가졌다. 엔도톡신 수준은 리물러스 아메보사이트 용해물 (LAL) 정량 결과를 제공하는 USP <85> 및 Pharm Eur 2.6.14에 맞춰 정렬된 EndoSafe®-PTS™ 플랫폼 (Charles River)에 의해 결정되었다. LC-MS에 의해 결정된 바와 같은 ADC2의 평균 분자량은 165,000 Da였다. ADC2는 무균 조건 하에 취급되었으며 사용 전까지 -80℃에서 보관되었다.
방법
PDX 모델의 선택은 EPHA5 유전자 발현 수준 (Jackson Laboratory 데이터베이스) 및 면역조직화학 (IHC)에 의한 단백질 발현 (사내; 하기에 표시된 IHC 염색)을 기반으로 하였다. 중간 정도 내지 높은 EphA5 발현을 나타내고 유리한 성장 곡선을 가지고, 시스플라틴, 도세탁셀 및 독소루비신과 같은 일반적인 약물에 대한 반응성이 간주되는 PDX 모델이 항종양 활성 연구를 위해 고려되었다. 여러 약물에 내성이 있는 모델은 선택에서 제외되었으며, 치료 경험이 없는 모델이 우선 순위에 놓였다. 이들 기준을 기반으로 하여, 본 연구에서는 TM00188 PDX 모델이 선택되었다.
마우스는 꼬리 정맥 주사를 통해 10 mg/kg 또는 PBS로 ADC1 또는 ADC2를 매주 5회 용량으로 받았다. 동물에게 0, 7, 14, 21 및 28일차에 투여한 후 처리 없이 3주 관찰 (28-50일차)하였다. 그룹당 사용된 마우스의 수는 평균 n=8이었으며 일부 마우스는 피하 이식된 1개 초과의 종양을 나타냈다. 그러한 경우, 각각의 종양 크기를 독립적으로 측정하고 기록하였다. 측정은 디지털 캘리퍼 (Fisherbrand™ Traceable™ Digital Carbon Fiber Calipers)를 사용하여 매주 2-3회 수행하였다. 연구는 평균 50일 동안 또는 최대 허용 종양 부피에 도달하고/하거나 피부 궤양이 나타날 때까지 지속되었다. 모든 연구는 처리군의 마우스와 동일한 수의 마우스로 구성된 대조군을 포함하였다. 대조군은 PBS 꼬리 정맥 주사를 받았고 ADC1 및 ADC2 처리된 마우스와 동일한 취급 절차를 거쳤다. 첫 번째 처리는 종양의 부피가 100 - 150 mm3에 도달했을 때 투여되었다.
첫 번째 처리 전 (사전) 및 종료 시 (첫 번째 처리 후 50일) 연구에 등록된 TM00219-보유 마우스의 체중을 측정하였다. 연구 종료 후, 임의의 남아있는 종양을 절제하고 실험실 저울에서 중량을 측정하였다. 남아 있는 종양에서 DNA를 추출하고 서열분석을 통해 치료 요법에 의해 잠재적으로 유발되는 EphA5 에피토프의 임의의 돌연변이 존재를 결정하였다.
데이터 분석
종양 크기 및 체중의 통계 분석 및 그래픽 플롯팅은 GraphPad Prism 9 및 Microsoft Excel (버전 16.63.1)을 사용하여 수행되었다. 테스트 그룹과 대조군 그룹 간의 측정된 차이의 통계적 유의성은 GraphPad Prism 9를 사용하여 스튜던트 t-검정 또는 분산 분석 (일원 또는 이원 ANOVA)을 통해 테스트되었다.
선택된 결과
5주 기간에 걸쳐 TM00219 종양을 보유하는 마우스에 ADC1을 매주 투여하면 종양이 완전하고 지속적으로 퇴행되었다 (도 114A). 총 11개 종양 중, ADC1 치료군에서 6개 종양이 완전히 퇴행되었으며 연구 종료 시 종양 부피를 결정할 수 없었다. 연구 종료시까지 5개의 종양이 남아 있었다 (도 114B). 도 114C에 도시된 바와 같이, ADC1 처리 전후에 마우스의 체중에는 어떤 유의한 변화도 없었다.
5주 기간에 걸쳐 TM00219 PDX 마우스에 ADC2를 투여하면 양호한 반응이 나타났고, 일부 종양에서는 초기 퇴행이 관찰된 후 정체 또는 종양 성장 지연이 관찰되었다 (도 115A). ADC2 처리된 마우스의 종양은 PBS 대조군과 비교하여 중량이 감소되었다 (도 115B). 도 115C에 나타난 바와 같이, 처리된 마우스는 처리 전후에 체중에 어떤 변화도 없는 것으로 나타났다.
폐 선암종은 공격적인 생물학과 복잡한 종양 진화를 보이는 이질적인 질환으로 공지되어 있다. ADC1 및 ADC2에 대한 반응의 차이에 대한 한 가지 가능성은 ADC에 대한 노출로 인해 ADC의 항체 결합 부분에 의해 인식되는 에피토프의 변화일 수 있으며, 이는 ADC2의 감소된 항종양 활성을 야기할 수 있을 것이다. TA 처리에 반응하여 EphA5 돌연변이의 가능성을 확인하기 위해, VH5Vk3에 의해 인식되는 EphA5 에피토프를 포함하는 영역을 연구 기간 이후 나머지 종양에서 서열분석하였다. PBS나 ADC1 또는 ADC2 투여 모두 VH5Vk3에 의해 인식되는 EphA5 에피토프를 구성하는 아미노산의 돌연변이를 일으키지 않았다 (표 1 - 3).
VH5Vk3과 인간 EphA5의 결합에 중대한 아미노산 (볼드체로 강조표시)은 하기 게놈 서열에 상응하는, 영역 306_RPGFFKASPHIQSCGKCPPHSYTHE_330 (서열번호:43) 내에 함유되어 있다:
AGACCTGGGTTCTTCAAAGCCTCACCTCACATCCAGAGCTGCGGCAAATGTCCACCTCACAGTTATACCCATGAG (서열번호:44)
표 1: PBS 처리된 PDX TM00219 마우스로부터의 종양 서열분석
표 2: ADC1 처리된 PDX TM00219 마우스로부터의 종양 서열분석
표 3: ADC2 처리된 PDX TM00219 마우스로부터의 종양 서열분석
선택된 논평
ADC는 폐 선암종의 TM00219 PDX 모델의 종양 치료에서 생체내 효능을 나타내며, ADC1 투여는 5주 투여 요법 이후 종양의 완전하고 지속적인 퇴행을 초래하였으며, ADC2는 시간이 지남에 따라 지속된 종양 크기의 초기 퇴행을 나타내거나, 종양 성장이 지연된다. 이는 ADC2가 ADC1만큼 효과적이지는 않지만, ADC1 또는 ADC2가 폐 선암종 치료를 위한 추가 개발을 위한 유망한 약물 후보일 수 있음을 시사한다. TM00219를 보유한 마우스에 ADC1 또는 ADC2 또는 위약을 처리한 결과 연구 기간 동안 체중에 유의한 변화가 나타나지 않았는데, 이는 이들 중 어느 것도 투여해도 동물의 번성 능력에 부정적인 영향을 미치지 않았음을 시사한다.
ADC1, ADC2 및 위약의 투여는 치료 후 EphA5의 VH5Vk3 에피토프에 어떤 변형도 초래하지 않았는데, 이는 ADC1과 ADC2의 반응 차이가 EphA5 에피토프의 어떤 변경으로 인한 것이 아니라는 것을 나타낸다.
실시예 9: 폐 선암종의 환자-유래 이종이식 모델에서 EphA5에 대한 ADC의 생체내 항종양 활성
이 연구의 목적은 폐 선암종의 PDX 모델을 사용하여 새로운 표적인 EphA5에 대한 두 가지 ADC의 치료적 항종양 활성을 평가하는 것이었다. 구체적으로, 본 연구의 목적은 종양 세포의 세포 표면 상에 EphA5를 발현하는 것으로 나타난 폐 선암종의 PDX 마우스 모델에서, 2개의 ADC, VH5Vk3-MMAE 및 VH5Vk3-(SN-38)2의 생체내 항종양 활성을 테스트하는 것이었다.
테스트 동물
본 연구는 Jackson Laboratories에서 구입한 PDX 모델 TM00226 (LG1179F)가 이식된 암컷 NSG™ 마우스를 사용하여 수행되었다. 이들 마우스는 극도로 면역결핍이 있으며 두 가지 돌연변이: 중증 복합 면역결핍 (scid)과 IL2 수용체 공통 감마 쇄의 완전한 null 대립유전자 (IL2rg null )를 가지고 있다. scid 돌연변이는 DNA 복구 복합체 단백질 Prkdc의 돌연변이이며 마우스의 B 세포와 T 세포가 결핍되게 만든다. IL2rg null 돌연변이는 다중 수용체를 통한 시토카인 신호 전달을 방지하여, 기능성 NK 세포의 결핍을 야기한다. 이러한 중증 면역결핍으로 인해 PDX가 이식되고 마우스에서 인간 조직-기반 종양이 성장할 수 있다. 이들 종양은 이들이 유래된 인간 종양과 유사한 특성 (예를 들어, 유전자 발현)을 가지며 치료제에 대한 인간 반응을 예측한다.
모델이 유래된 환자의 최초 및 최종 진단은 폐 선암종 AJCC IB/등급 3이었다. 인간 종양의 원발성 부위는 폐였고, PDX 모델에 대한 종양의 샘플 부위는 종양의 원발성 부위이다. TM00226 PDX 모델에 사용된 종양은 치료 경험이 없었다. 샘플이 유래된 환자는 49세의 백인 비-히스패닉계 여성 흡연자였다. 외과적 절제를 통해 샘플을 수득하였다. 생착을 위한 샘플의 숙주 균주는 NOD.Cg-Prkdc scid 　Il2rg tm1Wjl /SzJ (일명 NSG 또는 NOD Scid 감마)였다.
테스트 동물 하우징 및 관리
마우스는 온도 (20 ± 2℃), 습도 (50 ± 10%), 명암 주기 (명, 7:00 내지 19:00; 암, 19:00 내지 7:00)가 제어된 특정 병원균- 및 기회주의자가 없는 (SOPF) 방에 하우징되었으며, New Jersey의 Rutgers Cancer Institute의 연구 동물 시설에서 음식과 물을 자유롭게 이용할 수 있다. 본 연구에 사용된 마우스는 미국 보건 복지부, 공중 보건 서비스, 및 실험 동물 복지국을 포함하여 모든 적용가능한 법률 및 지침을 준수하여 관리되었다. New Jersey의 Rutgers Cancer Institute의 기관 동물 관리 및 사용 위원회는 모든 동물 실험을 승인하였고, 루트거스 동물 시설은 국제 실험 동물 관리 평가 및 인증 협회 (AAALAC)에서 정한 지침을 따랐다.
마우스는 온도 (20±2℃), 습도 (50±10%), 명암 주기 (명, 7:00 내지 19:00; 암, 19:00 내지 7:00)가 제어된 특정 병원균- 및 기회주의자가 없는 (SOPF) 방에 하우징되었으며, New Jersey의 Rutgers Cancer Institute (Newark, NJ)의 연구 동물 시설에서 음식과 물을 자유롭게 이용할 수 있다. 한배 새끼는 실험 그룹에 무작위로 할당되었다.
PDX TM00226을 이식한 총 40마리의 암컷 마우스가 연구에 사용되었다. 마우스는 10-12주령에 연구 장소에 수용되었으며 평균 18-12주령까지 연구에 남아있었다. 체중은 연구 시작 시 22 g 내지 28 g의 범위였고 연구 종료 시 22 g 내지 28 g의 범위였다.
재료
ADC1: VH5Vk3-티오브릿지-VCP-MMAE
ADC1은 VH5Vk3 항체와 세포독성 페이로드 MMAE에 커플링된 리소좀 카텝신 ('Val-Cit-PAB')에 의해 절단가능한 링커 모이어티를 활용하는 티오브릿지® 부위-특이적 접합 기술을 사용하여 제조된 ADC이다. 이 링커 형식은 응집 성향을 줄이고 수용해도를 개선시키기 위해 분지형 24-단위 PEG 중합체로 설계되었다 (도 33). 평균 DAR 4가 목표였다.
ADC1의 모든 연구 뱃치는 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)에 의해 결정된 바와 같은 평균 DAR이 4이고 단량체 종의 순도가 95% 이상인 투명한 무색 용액의 외관을 가졌다. 엔도톡신 수준은 리물러스 아메보사이트 용해물 (LAL) 정량 결과를 제공하는 USP <85> 및 Pharm Eur 2.6.14에 맞춰 정렬된 EndoSafe®-PTS™ 플랫폼 (Charles River, Wilmington, MA)에 의해 결정되었다. LC-MS에 의해 결정된 바와 같은 ADC1의 평균 분자량은 158,000 Da였다. ADC1은 무균 조건 하에 취급되었으며 사용 전까지 -80℃에서 보관되었다.
ADC2 VH5Vk3-티오브릿지®-VCP-(SN-38) 2
ADC2는 VH5Vk3 항체와 티오브릿지® 부위-특이적 접합 기술을 사용하여 제조된 ADC이다. 세포독성 페이로드 SN-38을 항체에 커플링하기 위해 가수분해에 의해 절단가능한 모이어티 (탄산 염)를 가진 이중-로딩된 구조를 사용하였다 (도 33). 이 링커 형식은 또한 응집 성향을 줄이고 수용성을 개선시키기 위해 이중 분지형 24-단위 PEG 중합체로 설계되었다. 평균 DAR 8이 목표였다.
모든 연구 뱃치는 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)에 의해 결정된 바와 같은 평균 DAR이 8이고 단량체 종의 순도가 95% 이상인 투명한 무색 용액의 외관을 가졌다. 엔도톡신 수준은 리물러스 아메보사이트 용해물 (LAL) 정량 결과를 제공하는 USP <85> 및 Pharm Eur 2.6.14에 맞춰 정렬된 EndoSafe®-PTS™ 플랫폼 (Charles River)에 의해 결정되었다. LC-MS에 의해 결정된 바와 같은 ADC2의 평균 분자량은 165,000 Da였다. ADC2는 무균 조건 하에 취급되었으며 사용 전까지 -80℃에서 보관되었다.
방법
PDX 모델의 선택은 EPHA5 유전자 발현 수준 (Jackson Laboratory 데이터베이스) 및 면역조직화학 (IHC)에 의한 단백질 발현 (사내; 하기에 표시된 IHC 염색)을 기반으로 하였다. 중간 정도 내지 높은 EphA5 발현을 나타내고 유리한 성장 곡선을 가지고, 시스플라틴, 도세탁셀 및 독소루비신과 같은 일반적인 약물에 대한 반응성이 간주되는 PDX 모델이 항종양 활성 연구를 위해 고려되었다. 여러 약물에 내성이 있는 모델은 선택에서 제외되었으며, 치료 경험이 없는 모델이 우선 순위에 놓였다. 이들 기준을 기반으로 하여, 본 연구에서는 TM00226 PDX 모델이 선택되었다.
마우스는 꼬리 정맥 주사를 통해 10 mg/kg 또는 PBS로 ADC1 또는 ADC2를 매주 5회 용량으로 받았다. 동물에게 0, 7, 14, 21 및 28일차에 투여한 후 처리 없이 3주 관찰 (28-50일차)하였다. 그룹당 사용된 마우스의 수는 평균 n=7이었으며 일부 마우스는 피하 이식된 1개 초과의 종양을 나타냈다. 그러한 경우, 각각의 종양 크기를 독립적으로 측정하고 기록하였다. 측정은 디지털 캘리퍼 (Fisherbrand™ Traceable™ Digital Carbon Fiber Calipers)를 사용하여 매주 2-3회 수행하였다. 연구는 평균 50일 동안 또는 최대 허용 종양 부피에 도달하고/하거나 피부 궤양이 나타날 때까지 지속되었다. 모든 연구는 처리군의 마우스와 동일한 수의 마우스로 구성된 대조군을 포함하였다. 대조군은 PBS 꼬리 정맥 주사를 받았고 ADC1 및 ADC2 처리된 마우스와 동일한 취급 절차를 거쳤다. 첫 번째 처리는 종양의 부피가 100 - 150 mm3에 도달했을 때 투여되었다.
첫 번째 처리 전 (사전) 및 종료 시 연구에 등록된 TM00226-보유 마우스의 체중을 측정하였다. 연구 종료 후, 임의의 남아있는 종양을 절제하고 실험실 저울에서 중량을 측정하였다.
데이터 분석
종양 크기 및 체중의 통계 분석 및 그래픽 플롯팅은 GraphPad Prism 9 및 Microsoft Excel (버전 16.63.1)을 사용하여 수행되었다. 테스트 그룹과 대조군 그룹 간의 측정된 차이의 통계적 유의성은 GraphPad Prism 9를 사용하여 스튜던트 t-검정 또는 분산 분석 (일원 또는 이원 ANOVA)을 통해 테스트되었다.
선택된 결과
5주 기간에 걸쳐 TM00226 종양을 보유하는 마우스에 ADC1을 매주 투여하면 종양 (n=8)이 지속적으로 퇴행되었다 (도 117A). 총 8개 종양 중, ADC1 처리군에서 1개 종양이 완전히 퇴행되었으며 연구 종료 시 종양 부피를 결정할 수 없었다. 연구 종료 시 0.001 g 내지 0.019 g 범위의 중량을 가진 7개의 종양이 남아 있었다 (도 117B). 연구 종료 시 종양 조직의 부재로 인해 DNA 추출이 가능하지 않았다.도 117C에 도시된 바와 같이, 두 ADC1 처리 전후에 마우스의 체중에는 어떤 유의한 변화도 없었다.
5주 기간에 걸쳐 TM00226 종양을 보유하는 마우스에 ADC2를 투여하면 초기 종양 퇴행에 이어서 4주 후에 재성장을 초래하였다 (도 118A). 연구 종료 시, ADC2 처리된 종양은 위약 처리 종양과 비교하여 크기가 더 작았다 (도 118B). 도 118C에 나타난 바와 같이, ADC2 처리 전후에 마우스 체중에 어떤 변화도 관찰되지 않았다.
선택적 결론
폐 선암종의 TM00226 PDX 모델을 보유한 마우스에 5주의 기간에 걸쳐 ADC1을 투여한 결과 50일 연구 기간 동안 종양이 지속적으로 퇴행되었다. ADC1 또는 위약으로 처리된 동물은 연구 기간 동안 체중에 유의한 변화를 나타내지 않았는데, 이는 ADC1 투여가 동물의 번성 능력에 부정적인 영향을 미치지 않았음을 시사한다. 이는 ADC1이 폐 선암종 치료를 위한 추가 개발을 위한 유망한 약물 후보임을 시사한다.
폐 선암종의 TM00266 PDX 모델을 보유한 마우스를 ADC2로 치료하면 종양이 초기 퇴화에 이어서 4주 후에 재성장을 초래하였다. ADC2로 처리된 동물은 연구 기간 동안 체중에 유의한 변화를 나타내지 않았는데, 이는 ADC2 투여가 동물의 성장 능력에 부정적인 영향을 미치지 않았음을 시사한다.
열거된 실시양태
다음의 열거된 실시양태가 제공되며, 그 넘버링은 중요성 수준을 지정하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
실시양태 1은 인간 EPH 수용체 A5의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서,
a. 3개의 중쇄 상보성-결정 영역 (HCDR)을 포함하는 중쇄 가변 영역으로서, 여기서
HCDR1은 서열번호: 16에 제시된 아미노산 서열을 포함하고,
HCDR2는 서열번호: 17-19로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고,
HCDR3은 서열번호: 20에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것인 중쇄 가변 영역 및
b. 3개의 경쇄 상보성-결정 영역 (LCDR)을 포함하는 경쇄 가변 영역으로서, 여기서
LCDR1은 서열번호: 21 및 22로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고,
LCDR2는 서열번호: 23에 제시된 아미노산 서열을 포함하고,
LCDR3은 서열번호: 24에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것인 경쇄 가변 영역
을 포함하는, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
실시양태 2는 실시양태 1에 있어서,
a. 서열번호: 1과 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄; 및
b. 서열번호: 8과 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄
를 추가로 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
실시양태 3은 실시양태 1 또는 2에 있어서,
a. 중쇄 가변 영역은 서열번호: 16에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호: 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호: 20에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하고; 경쇄 가변 영역은 서열번호: 21에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호: 23에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호: 24에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하거나;
b. 중쇄 가변 영역은 서열번호: 16에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호: 18에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호: 20에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하고; 경쇄 가변 영역은 서열번호: 21에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호: 23에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호: 24에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하거나;
c. 중쇄 가변 영역은 서열번호: 16에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호: 19에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호: 20에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하고; 경쇄 가변 영역은 서열번호: 21에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호: 23에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호: 24에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하거나;
d. 중쇄 가변 영역은 서열번호: 16에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호: 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호: 20에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하고; 경쇄 가변 영역은 서열번호: 22에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호: 23에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호: 24에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하거나;
e. 중쇄 가변 영역은 서열번호: 16에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호: 18에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호: 20에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하고; 경쇄 가변 영역은 서열번호: 22에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호: 23에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호: 24에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하거나;
f. 중쇄 가변 영역은 서열번호: 16에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호: 19에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호: 20에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하고; 경쇄 가변 영역은 서열번호: 22에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호: 23에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호: 24에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 것인,
항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
실시양태 4는 실시양태 1 내지 3 중 어느 한 실시양태에 있어서, 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열번호: 2-7로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 것인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
실시양태 5는 실시양태 1 내지 4 중 어느 한 실시양태에 있어서, 중쇄 가변 영역이 서열번호: 2-7로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
실시양태 6은 실시양태 1 내지 5 중 어느 한 실시양태에 있어서, 중쇄 가변 영역이 서열번호: 2-7로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열로 이루어진 것인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
실시양태 7은 실시양태 1 내지 6 중 어느 한 실시양태에 있어서, 중쇄 가변 영역이 서열번호: 26-31로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열에 의해 코딩되는 것인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
실시양태 8은 실시양태 1 내지 7 중 어느 한 실시양태에 있어서, 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열이 서열번호: 9-13으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 것인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
실시양태 9는 실시양태 1 내지 3 및 8 중 어느 한 실시양태에 있어서, 경쇄 가변 영역이 서열번호: 9-13으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
실시양태 10은 실시양태 1 내지 3 및 9 중 어느 한 실시양태에 있어서, 경쇄 가변 영역이 서열번호: 9-13으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열로 이루어진 것인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
실시양태 11은 실시양태 1 내지 3 및 8 내지 9 중 어느 한 실시양태에 있어서, 경쇄 가변 영역이 서열번호: 33-37로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열에 의해 코딩되는 것인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
실시양태 12는 실시양태 1 내지 11 중 어느 한 실시양태에 있어서,
a. 중쇄 가변 영역은 서열번호: 2에 제시되고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 9에 제시되어 있거나;
b. 중쇄 가변 영역은 서열번호: 2에 제시되고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 10에 제시되어 있거나;
c. 중쇄 가변 영역은 서열번호: 2에 제시되고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 11에 제시되어 있거나;
d. 중쇄 가변 영역은 서열번호: 2에 제시되고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 12에 제시되어 있거나;
e. 중쇄 가변 영역은 서열번호: 2에 제시되고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 13에 제시되어 있거나;
f. 중쇄 가변 영역은 서열번호: 3에 제시되고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 9에 제시되어 있거나;
g. 중쇄 가변 영역은 서열번호: 3에 제시되고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 10에 제시되어 있거나;
h. 중쇄 가변 영역은 서열번호: 3에 제시되고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 11에 제시되어 있거나;
i. 중쇄 가변 영역은 서열번호: 3에 제시되고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 12에 제시되어 있거나;
j. 중쇄 가변 영역은 서열번호: 3에 제시되고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 13에 제시되어 있거나;
k. 중쇄 가변 영역은 서열번호: 4에 제시되고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 9에 제시되어 있거나;
l. 중쇄 가변 영역은 서열번호: 4에 제시되고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 10에 제시되어 있거나;
m. 중쇄 가변 영역은 서열번호: 4에 제시되고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 11에 제시되어 있거나;
n. 중쇄 가변 영역은 서열번호: 4에 제시되고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 12에 제시되어 있거나;
o. 중쇄 가변 영역은 서열번호: 4에 제시되고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 13에 제시되어 있거나;
p. 중쇄 가변 영역은 서열번호: 5에 제시되고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 9에 제시되어 있거나;
q. 중쇄 가변 영역은 서열번호: 5에 제시되고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 10에 제시되어 있거나;
r. 중쇄 가변 영역은 서열번호: 5에 제시되고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 11에 제시되어 있거나;
s. 중쇄 가변 영역은 서열번호: 5에 제시되고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 12에 제시되어 있거나;
t. 중쇄 가변 영역은 서열번호: 5에 제시되고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 13에 제시되어 있거나;
u. 중쇄 가변 영역은 서열번호: 6에 제시되고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 9에 제시되어 있거나;
v. 중쇄 가변 영역은 서열번호: 6에 제시되고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 10에 제시되어 있거나;
w. 중쇄 가변 영역은 서열번호: 6에 제시되고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 11에 제시되어 있거나;
x. 중쇄 가변 영역은 서열번호: 6에 제시되고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 12에 제시되어 있거나;
y. 중쇄 가변 영역은 서열번호: 6에 제시되고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 13에 제시되어 있거나;
z. 중쇄 가변 영역은 서열번호: 7에 제시되고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 9에 제시되어 있거나;
aa. 중쇄 가변 영역은 서열번호: 7에 제시되고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 10에 제시되어 있거나;
bb. 중쇄 가변 영역은 서열번호: 7에 제시되고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 11에 제시되어 있거나;
cc. 중쇄 가변 영역은 서열번호: 7에 제시되고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 12에 제시되어 있거나;
dd. 중쇄 가변 영역은 서열번호: 7에 제시되고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 13에 제시되는 것인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
실시양태 13은 실시양태 1 내지 11 중 어느 한 실시양태에 있어서,
a. 중쇄 가변 영역은 서열번호: 2에 제시된 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 9에 제시된 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나;
b. 중쇄 가변 영역은 서열번호: 2에 제시된 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 10에 제시된 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나;
c. 중쇄 가변 영역은 서열번호: 2에 제시된 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 11에 제시된 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나;
d. 중쇄 가변 영역은 서열번호: 2에 제시된 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 12에 제시된 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나;
e. 중쇄 가변 영역은 서열번호: 2에 제시된 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 13에 제시된 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나;
f. 중쇄 가변 영역은 서열번호: 3에 제시된 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 9에 제시된 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나;
g. 중쇄 가변 영역은 서열번호: 3에 제시된 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 10에 제시된 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나;
h. 중쇄 가변 영역은 서열번호: 3에 제시된 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 11에 제시된 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나;
i. 중쇄 가변 영역은 서열번호: 3에 제시된 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 12에 제시된 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나;
j. 중쇄 가변 영역은 서열번호: 3에 제시된 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 13에 제시된 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나;
k. 중쇄 가변 영역은 서열번호: 4에 제시된 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 9에 제시된 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나;
l. 중쇄 가변 영역은 서열번호: 4에 제시된 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 10에 제시된 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나;
m. 중쇄 가변 영역은 서열번호: 4에 제시된 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 11에 제시된 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나;
n. 중쇄 가변 영역은 서열번호: 4에 제시된 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 12에 제시된 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나;
o. 중쇄 가변 영역은 서열번호: 4에 제시된 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 13에 제시된 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나;
p. 중쇄 가변 영역은 서열번호: 5에 제시된 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 9에 제시된 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나;
q. 중쇄 가변 영역은 서열번호: 5에 제시된 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 10에 제시된 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나;
r. 중쇄 가변 영역은 서열번호: 5에 제시된 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 11에 제시된 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나;
s. 중쇄 가변 영역은 서열번호: 5에 제시된 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 12에 제시된 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나;
t. 중쇄 가변 영역은 서열번호: 5에 제시된 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 13에 제시된 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나;
u. 중쇄 가변 영역은 서열번호: 6에 제시된 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 9에 제시된 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나;
v. 중쇄 가변 영역은 서열번호: 6에 제시된 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 10에 제시된 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나;
w. 중쇄 가변 영역은 서열번호: 6에 제시된 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 11에 제시된 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나;
x. 중쇄 가변 영역은 서열번호: 6에 제시된 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 12에 제시된 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나;
y. 중쇄 가변 영역은 서열번호: 6에 제시된 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 13에 제시된 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나;
z. 중쇄 가변 영역은 서열번호: 7에 제시된 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 9에 제시된 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나;
aa. 중쇄 가변 영역은 서열번호: 7에 제시된 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 10에 제시된 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나;
bb. 중쇄 가변 영역은 서열번호: 7에 제시된 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 11에 제시된 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나;
cc. 중쇄 가변 영역은 서열번호: 7에 제시된 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 12에 제시된 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나;
dd. 중쇄 가변 영역은 서열번호: 7에 제시된 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 13에 제시된 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
실시양태 14는 인간 EPH 수용체 A5의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서,
a. 서열번호: 16에 제시된 서열을 포함하는 중쇄 상보성-결정 영역 1 (HCDR1), 서열번호: 18에 제시된 서열을 포함하는 HCDR2, 서열번호: 20에 제시된 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄; 및
b. 서열번호: 21에 제시된 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 1 (LCDR1), 서열번호: 23에 제시된 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호: 24에 제시된 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄
를 포함하는, 항체 또는 항원-결합 단편을 제공한다.
실시양태 15는 인간 EPH 수용체 A5의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서,
a. 서열번호: 16에 제시된 서열을 포함하는 중쇄 상보성-결정 영역 1 (HCDR1), 서열번호: 19에 제시된 서열을 포함하는 HCDR2, 서열번호: 20에 제시된 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄; 및
b. 서열번호: 21에 제시된 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 1 (LCDR1), 서열번호: 23에 제시된 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호: 24에 제시된 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄
를 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
실시양태 16은 인간 EPH 수용체 A5의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서,
a. 서열번호: 16에 제시된 서열을 포함하는 중쇄 상보성-결정 영역 1 (HCDR1), 서열번호: 17에 제시된 서열을 포함하는 HCDR2, 서열번호: 20에 제시된 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄; 및
b. 서열번호: 22에 제시된 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 1 (LCDR1), 서열번호: 23에 제시된 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호: 24에 제시된 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄
를 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
실시양태 17은 인간 EPH 수용체 A5의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서,
a. 서열번호: 16에 제시된 서열을 포함하는 중쇄 상보성-결정 영역 1 (HCDR1), 서열번호: 18에 제시된 서열을 포함하는 HCDR2, 서열번호: 20에 제시된 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄; 및
b. 서열번호: 22에 제시된 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 1 (LCDR1), 서열번호: 23에 제시된 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호: 24에 제시된 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄
를 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
실시양태 18은
a. 서열번호: 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄; 및
b. 서열번호: 11에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄
를 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
실시양태 19는
a. 서열번호: 6에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄; 및
b. 서열번호: 11에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄
를 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
실시양태 20은 실시양태 1 내지 19 중 어느 한 실시양태에 있어서, 전장 항체, Fab, 및 단일쇄 가변 단편 (scFv)으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
실시양태 21은 실시양태 1 내지 20 중 어느 한 실시양태에 있어서, 전장 항체인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
실시양태 22는 실시양태 1 내지 21 중 어느 한 실시양태에 있어서, 항체가 인간화되는 것인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
실시양태 23은 실시양태 1 내지 22 중 어느 한 실시양태에 있어서, 중쇄가 인간 면역글로불린 중쇄의 불변 도메인을 추가로 포함하고 경쇄가 인간 경쇄의 불변 도메인을 추가로 포함하는 것인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
실시양태 24는 실시양태 23에 있어서, 인간 면역글로불린 중쇄의 불변 도메인이 IgG1 중쇄로부터의 것인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
실시양태 25은 실시양태 23 또는 24에 있어서, 인간 면역글로불린 중쇄의 불변 도메인이 서열번호: 14에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
실시양태 26은 실시양태 23에 있어서, 인간 경쇄의 불변 도메인이 인간 카파 경쇄로부터의 것인 항체를 제공한다.
실시양태 27은 실시양태 23 또는 실시양태 26에 있어서, 인간 경쇄의 불변 도메인이 서열번호: 15에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
실시양태 28은 인간 EPH 수용체 A5의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서,
a. 서열번호: 38에 제시된 아미노산 서열과 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 포함하는 중쇄; 및
b. 서열번호: 40에 제시된 아미노산 서열과 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 포함하는 경쇄
를 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
실시양태 29는 실시양태 28에 있어서,
a. 중쇄의 가변 영역이 서열번호: 16에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호: 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호: 20에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하고;
b. 경쇄의 가변 영역이 서열번호: 21에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호: 23에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호: 24에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 것인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
실시양태 30은 실시양태 1 내지 29 중 어느 한 실시양태에 있어서, 중쇄가 서열번호: 38에 제시되고 경쇄가 서열번호: 40에 제시되는 것인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
실시양태 31은 인간 EPH 수용체 A5의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서,
a. 서열번호: 39에 제시된 아미노산 서열과 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 포함하는 중쇄; 및
b. 서열번호: 40에 제시된 아미노산 서열과 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 포함하는 경쇄
를 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
실시양태 32는 실시양태 31에 있어서,
a. 중쇄의 가변 영역이 서열번호: 16에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호: 18에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호: 20에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하고;
b. 경쇄의 가변 영역이 서열번호: 21에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호: 23에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호: 24에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 것인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
실시양태 33은 실시양태 1 내지 27, 31 및 32 중 어느 한 실시양태에 있어서, 중쇄가 서열번호: 39에 제시되고 경쇄가 서열번호: 40에 제시되는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
실시양태 34는 실시양태 1 내지 33 중 어느 한 실시양태에 있어서, 인간 EpHA5에 결합하기 위한 해리 상수 (KD)가 1.25 x 10-9 M 미만인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
실시양태 35는 실시양태 1 내지 34 중 어느 한 실시양태에 있어서, 인간 EpHA5에 결합하기 위한 해리 상수 (KD)가 8 x 10-10 M 내지 1.1 x 10-9 M인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
실시양태 36은 실시양태 1 내지 35 중 어느 한 실시양태에 있어서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 참조 항체보다 2배 이내로 더 양호한 인간 EpHA5에 결합하기 위한 해리 상수 (KD)를 가지며, 여기서 참조 항체는 11C12이거나 서열번호: 1에 제시된 가변 중쇄 및 서열번호: 8에 제시된 가변 경쇄를 포함하는 항체이고, 임의로 여기서 참조 항체는 동일한 형태인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
실시양태 37은 실시양태 1 내지 36 중 어느 한 실시양태에 있어서, 인간 EpHA5에 대한 결합에 대한 해리 상수 (KD)가 참조 항체보다 1.2배 초과로 더 양호하고, 여기서 참조 항체는 11C12이거나 서열번호: 1에 제시된 가변 중쇄 및 서열번호: 8에 제시된 가변 경쇄를 포함하는 항체이고, 임의로 여기서 참조 항체는 동일한 형태인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
실시양태 38은 해리 상수 (KD)가 비아코어(Biacore)에 의해 결정되는 것인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
실시양태 39는 실시양태 1 내지 38 중 어느 한 실시양태에 있어서, 참조 항체와 비교하여 증가된 열 안정성을 나타내고, 여기서 참조 항체는 11C12이거나 서열번호: 1에 제시된 가변 중쇄 및 서열번호: 8에 제시된 가변 경쇄를 포함하는 항체이고, 임의로 여기서 참조 항체는 동일한 형태인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
실시양태 40은 실시양태 1 내지 39 중 어느 한 실시양태에 있어서, 참조 항체와 비교하여 약 5℃ 이상 증가되는 Tm1의 용융 온도 프로파일을 가지며, 여기서 참조 항체는 11C12이거나 서열번호: 1에 제시된 가변 중쇄 및 서열번호: 8에 제시된 가변 경쇄를 포함하는 항체이고, 임의로 여기서 참조 항체는 동일한 형태인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
실시양태 41은 실시양태 1 내지 40 중 어느 한 실시양태에 있어서, 참조 항체와 비교하여 약 10℃ 이상 증가되는 Tm1의 용융 온도 프로파일을 가지며, 여기서 참조 항체는 11C12이거나 서열번호: 1에 제시된 가변 중쇄 및 서열번호: 8에 제시된 가변 경쇄를 포함하는 항체이고, 임의로 여기서 참조 항체는 동일한 형태인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
실시양태 42는 실시양태 40 또는 41에 있어서, 항체 또는 항원-결합 단편의 열 풀림 곡선(thermal unfolding curve)의 Tm1이 60℃ 초과인 항체 또는 항원-결합 단편을 제공한다.
실시양태 43은 실시양태 40 내지 42 중 어느 한 실시양태에 있어서, 항체 또는 항원-결합 단편의 Tm1이 약 60℃ 내지 약 70℃인 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
실시양태 44은 실시양태 40 내지 43 중 어느 한 실시양태에 있어서, 항체 또는 항원-결합 단편의 Tm1이 약 64℃, 약 65℃, 약 66℃, 약 67℃, 약 68℃, 또는 약 69℃인 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
실시양태 45는 실시양태 40 내지 44 중 어느 한 실시양태에 있어서, 용융 온도 프로파일이 단상(monophasic)인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
실시양태 46은 실시양태 1 내지 45 중 어느 한 실시양태에 있어서, 응집의 개시 온도 (Tagg)는 참조 항체와 비교하여 약 1℃ 초과, 약 2℃ 초과, 약 3℃ 초과, 약 4℃ 초과 또는 약 5℃ 초과 증가되며, 여기서 참조 항체는 11C12이거나 서열번호: 1에 제시된 가변 중쇄 및 서열번호: 8에 제시된 가변 경쇄를 포함하는 항체인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
실시양태 47은 실시양태 1 내지 46 중 어느 한 실시양태에 있어서, 항체 또는 항원-결합 단편의 응집의 개시 온도 (Tagg)가 약 67℃ 초과인 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
실시양태 48은 실시양태 1 내지 47 중 어느 한 실시양태에 있어서, 항체 또는 항원-결합 단편의 응집의 개시 온도 (Tagg)가 67℃ 내지 약 71℃인 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
실시양태 49은 실시양태 1 내지 48 중 어느 한 실시양태에 있어서, 항체 또는 항원-결합 단편의 Tagg가 약 67℃, 약 68℃, 약 69℃, 약 70℃, 또는 약 71℃인 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
실시양태 50 실시양태 1 내지 49 중 어느 한 실시양태에 있어서, 세포 표면 인간 EphA5에 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
실시양태 51은 실시양태 1 내지 50 중 어느 한 실시양태에 있어서, 항체 또는 단편이 참조 항체와 비교하여 증가되는 EC50으로, 세포, 임의로 H460 세포주의 표면 상에 발현된 인간 EphA5와 결합하고, 여기서 참조 항체는 11C12이거나 서열번호: 1에 제시된 가변 중쇄 및 서열번호: 8에 제시된 가변 경쇄를 포함하는 항체이고, 임의로 여기서 참조 항체는 동일한 형태인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
실시양태 52는 실시양태 1 내지 51 중 어느 한 실시양태에 있어서, 항체 또는 단편이 임의로 유세포 분석법에 의해 결정되는 0.020 mg/mL 이하의 EC50으로, 세포, 임의로 H460 세포주의 표면 상에 발현된 인간 EphA5와 결합하는 것인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함한다.
실시양태 53은 실시양태 1 내지 52 중 어느 한 실시양태에 있어서, 항체 또는 단편이 임의로 유세포 분석법에 의해 결정되는 약 0.010 mg/mL 내지 0.020 mg/mL의 EC50으로, 세포, 임의로 H460 세포주의 표면 상에 발현된 인간 EphA5와 결합하는 것인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
실시양태 54는 실시양태 1 내지 53 중 어느 한 실시양태에 있어서, 항체 또는 단편이 임의로 유세포 분석법에 의해 결정되는 약 0.015 μg/mL, 약 0.016 μg/mL, 약 0.017 μg/mL, 약 0.018 μg/mL, 약 0.019 μg/mL, 또는 약 0.020 μg/mL의 EC50으로, 세포, 임의로 H460 세포주의 표면 상에 발현된 인간 EphA5와 결합하는 것인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
실시양태 55는 실시양태 1 내지 54 중 어느 한 실시양태에 있어서, 인간 EphA5 발현-세포에 의해 내재화되는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
실시양태 56은 실시양태 1 내지 55 중 어느 한 실시양태의 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 중쇄를 코딩하는 핵산을 제공한다.
실시양태 57은 실시양태 1 내지 55 중 어느 한 실시양태의 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 경쇄를 코딩하는 핵산을 제공한다.
실시양태 58은 실시양태 1 내지 55 중 어느 한 실시양태의 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 핵산을 제공한다.
실시양태 59는 실시양태 56 내지 58 중 어느 한 실시양태의 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다.
실시양태 60은 실시양태 59에 있어서, 발현 벡터인 벡터를 제공한다.
실시양태 61은 중쇄를 코딩하는 핵산 및 경쇄를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터로서, 여기서 중쇄 및 경쇄가 실시양태 1 내지 58 중 어느 한 실시양태의 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 것인 벡터를 제공한다.
실시양태 62는 실시양태 61에 있어서, 비시스트론 벡터(bicistronic vector)인 벡터를 제공한다.
실시양태 63은 중쇄를 코딩하는 제1 핵산을 포함하는 제1 벡터 및 경쇄를 코딩하는 제2 핵산을 포함하는 제2 벡터를 포함하는 벡터 시스템으로서, 여기서 중쇄 및 경쇄가 실시양태 1 내지 58 중 어느 한 실시양태의 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 것인 벡터 시스템을 제공한다.
실시양태 64는 실시양태 63에 있어서, 제1 벡터 및 제2 벡터가 각각 발현 벡터인 벡터 시스템을 제공한다.
실시양태 65는 실시양태 61 또는 62의 벡터 또는 실시양태 63 또는 64의 벡터 시스템을 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
실시양태 66은 실시양태 65에 있어서, 포유동물인 숙주 세포를 제공한다.
실시양태 67은 실시양태 61 또는 62의 벡터 및 실시양태 63 또는 64의 벡터 시스템을 숙주 세포에 도입하는 단계, 상기 숙주 세포로부터의 항체 또는 항원 결합 단편의 발현을 위한 조건 하에 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 항체 또는 항원-결합 단편을 단리 또는 정제하는 단계를 포함하는, 항체를 생산하는 방법을 제공한다.
실시양태 68은 실시양태 67에 있어서, 숙주 세포가 포유동물 세포인 방법을 제공한다.
실시양태 69는 화학식 Ab-(L-D)를 갖는 면역접합체로서, 여기서
Ab는 실시양태 1 내지 55 중 어느 한 실시양태의 항체 또는 이의 항원-결합 단편이고;
L은 링커이고;
D는 세포독성 약물인 면역접합체를 제공한다.
실시양태 70은 실시양태 69에 있어서, 링커가 절단가능한 링커인 면역접합체를 제공한다.
실시양태 71은 실시양태 69 또는 실시양태 70에 있어서, 링커가 카텝신-절단가능한 링커인 면역접합체를 제공한다.
실시양태 72는 실시양태 71에 있어서, 카텝신-절단가능한 링커가 발린-시트룰린 (Val-Cit)을 포함하는 것인 면역접합체를 제공한다.
실시양태 73은 실시양태 68 내지 72 중 어느 한 실시양태에 있어서, 링커는 하기 구조식을 갖는 MC-VCP인 면역접합체를 제공한다:
.
실시양태 74는 실시양태 68 내지 72 중 어느 한 실시양태에 있어서, 링커가 하기 구조식을 포함하는 것인 면역접합체를 제공한다:
또는 .
실시양태 75는 실시양태 68 내지 74 중 어느 한 실시양태에 있어서, 링커가 pH 절단가능한 링커인 면역접합체를 제공한다.
실시양태 76은 실시양태 69 내지 79 및 75 중 어느 한 실시양태에 있어서, 링커가 하기 구조식을 갖는 CL2A인 면역접합체를 제공한다:
.
실시양태 77은 실시양태 69 내지 76 중 어느 한 실시양태에 있어서, 세포독성 약물이 아우리스타틴인 면역접합체를 제공한다.
실시양태 78은 실시양태 77에 있어서, 아우리스타틴이 하기 구조식을 갖는 모노메틸 아우리스타틴 E (MMAE)인 면역접합체를 제공한다:
.
실시양태 79는 실시양태 69 내지 73, 77, 및 78 중 어느 한 실시양태에 있어서, L-D가 하기 구조식을 포함하는 것인 면역접합체를 제공한다:
.
실시양태 80은 실시양태 69 내지 72, 74, 77, 및 78 중 어느 한 실시양태에 있어서, L-D가 하기 구조식을 포함하는 것인 면역접합체를 제공한다:
.
실시양태 81은 화학식 Ab-(L-D)를 갖는 면역접합체로서, 여기서,
Ab가 서열번호: 38에 제시된 중쇄 및 서열번호: 40에 제시된 경쇄를 포함하는 인간 EPH 수용체 A5 (EphA5)의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체이고;
L-D가 하기 구조식을 포함하는 것인 면역접합체를 제공한다:
.
실시양태 82는 화학식 Ab-(L-D)를 갖는 면역접합체로서, 여기서,
Ab가 서열번호: 39에 제시된 중쇄 및 서열번호: 40에 제시된 경쇄를 포함하는 인간 EPH 수용체 A5 (EphA5)의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체이고;
L-D가 하기 구조식을 포함하는 것인 면역접합체를 제공한다:
실시양태 83은 실시양태 69 내지 76 중 어느 한 실시양태에 있어서, 세포독성 약물이 하기 구조식을 갖는 SN38인 면역접합체를 제공한다:
.
실시양태 84는 실시양태 69, 70, 75, 76, 및 83 중 어느 한 실시양태에 있어서, L-D가 하기 구조식을 포함하는 것인 면역접합체를 제공한다:
.
실시양태 85는 실시양태 69 내지 72, 74 및 83 중 어느 한 실시양태에 있어서, L-D가 하기 구조식을 포함하는 것인 면역접합체를 제공한다:
.
실시양태 86은 실시양태 69-85 중 어느 한 실시양태에 있어서, 항체에 대한 약물의 비가 약 4인 면역접합체를 제공한다.
실시양태 87은 실시양태 69-85 중 어느 한 실시양태에 있어서, 항체에 대한 약물의 비가 약 8인 면역접합체를 제공한다.
실시양태 88은 실시양태 1 내지 55 중 어느 한 실시양태의 항체 또는 이의 항원-결합 단편 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
실시양태 89는 실시양태 69 내지 87 중 어느 한 실시양태의 면역접합체 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
실시양태 90은 실시양태 1 내지 55 중 어느 한 실시양태에 있어서, 암의 치료, 개선 및/또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 암을 치료, 개선 및/또는 예방하는데 사용하기 위한, 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서, 여기서 암은 EPH 수용체 A5의 발현과 연관이 있고, 여기서 EPH 수용체 A5는 암 세포 상에서 발현되고, 여기서 암은 폐암, 유방암, 식도암, 위암, 및 난소암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
실시양태 91은 실시양태 69 내지 78 중 어느 한 실시양태에 있어서, 암의 치료, 개선 및/또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 암을 치료, 개선 및/또는 예방하는데 사용하기 위한 면역접합체로서, 여기서 암은 EPH 수용체 A5의 발현과 연관이 있고, 여기서 EPH 수용체 A5는 암 세포 상에서 발현되고, 여기서 암은 폐암, 유방암, 식도암, 위암, 및 난소암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 면역접합체를 제공한다.
실시양태 92는 실시양태 88에 있어서, 암의 치료, 개선 및/또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 암을 치료, 개선 및/또는 예방하는데 사용하기 위한 약제학적 조성물로서, 여기서 암은 EPH 수용체 A5의 발현과 연관이 있고, 여기서 EPH 수용체 A5는 암 세포 상에서 발현되고, 여기서 암은 폐암, 유방암, 식도암, 위암, 및 난소암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 약제학적 조성물을 제공한다.
실시양태 93은 실시양태 89에 있어서, 암의 치료, 개선 및/또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 암을 치료, 개선 및/또는 예방하는데 사용하기 위한 약제학적 조성물로서, 여기서 암은 EPH 수용체 A5의 발현과 연관이 있고, 여기서 EPH 수용체 A5는 암 세포 상에서 발현되고, 여기서 암은 폐암, 유방암, 식도암, 위암, 및 난소암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 약제학적 조성물을 제공한다.
실시양태 94는 실시양태 1 내지 55 중 어느 한 실시양태에 있어서, 대상체에서 종양 퇴행을 유도하는데 사용하기 위한, 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서, 여기서 종양은 암이고, 여기서 종양은 EPH 수용체 A5의 발현과 연관이 있고, 여기서 EPH 수용체 A5는 암 세포 상에서 발현되고, 여기서 암은 폐암, 유방암, 식도암, 위암, 및 난소암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
실시양태 95는 실시양태 67 내지 85 중 어느 한 실시양태에 있어서, 종양 퇴행의 유도를 필요로 하는 대상체에서 종양 퇴행을 유도하는데 사용하기 위한 면역접합체로서, 여기서 종양은 암이고, 여기서 종양은 EPH 수용체 A5의 발현과 연관이 있고, 여기서 EPH 수용체 A5는 암 세포 상에서 발현되고, 여기서 암은 폐암, 유방암, 식도암, 위암, 및 난소암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 면역접합체를 제공한다.
실시양태 96은 실시양태 86에 있어서, 종양 퇴행의 유도를 필요로 하는 대상체에서 종양 퇴행을 유도하는데 사용하기 위한 약제학적 조성물로서, 여기서 종양은 암이고, 여기서 종양은 EPH 수용체 A5의 발현과 연관이 있고, 여기서 EPH 수용체 A5는 암 세포 상에서 발현되고, 여기서 암은 폐암, 유방암, 식도암, 위암, 및 난소암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 약제학적 조성물을 제공한다.
실시양태 97은 실시양태 87에 있어서, 종양 퇴행의 유도를 필요로 하는 대상체에서 종양 퇴행을 유도하는데 사용하기 위한 약제학적 조성물로서, 여기서 종양은 암이고, 여기서 종양은 EPH 수용체 A5의 발현과 연관이 있고, 여기서 EPH 수용체 A5는 암 세포 상에서 발현되고, 여기서 암은 폐암, 유방암, 식도암, 위암, 및 난소암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 약제학적 조성물을 제공한다.
실시양태 98은 암의 치료, 개선 및/또는 예방을 필요로 하는 대상체에게 치료학적 유효량의 실시양태 1 내지 55 중 어느 한 실시양태의 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 투여하는 단계를 포함하는, 상기 대상체에서 암을 치료, 개선 및/또는 예방하는 방법으로서, 여기서 암은 EPH 수용체 A5의 발현과 연관이 있고, 여기서 EPH 수용체 A5는 암 세포 상에서 발현되고, 여기서 암은 폐암, 유방암, 식도암, 위암, 및 난소암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법을 제공한다.
실시양태 99는 암의 치료, 개선 및/또는 예방을 필요로 하는 대상체에게 치료학적 유효량의 실시양태 69 내지 87 중 어느 한 실시양태의 면역접합체를 투여하는 단계를 포함하는, 상기 대상체에서 암을 치료, 개선 및/또는 예방하는 방법으로서, 여기서 암은 EPH 수용체 A5의 발현과 연관이 있고, 여기서 EPH 수용체 A5는 암 세포 상에서 발현되고, 여기서 암은 폐암, 유방암, 식도암, 위암, 및 난소암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법을 제공한다.
실시양태 100은 암의 치료, 개선 및/또는 예방을 필요로 하는 대상체에게 치료학적 유효량의 실시양태 88의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 상기 대상체에서 암을 치료, 개선 및/또는 예방하는 방법으로서, 여기서 암은 EPH 수용체 A5의 발현과 연관이 있고, 여기서 EPH 수용체 A5는 암 세포 상에서 발현되고, 여기서 암은 폐암, 유방암, 식도암, 위암, 및 난소암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법을 제공한다.
실시양태 101은 암의 치료, 개선 및/또는 예방을 필요로 하는 대상체에게 치료학적 유효량의 실시양태 89의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 상기 대상체에서 암을 치료, 개선 및/또는 예방하는 방법으로서, 여기서 암은 EPH 수용체 A5의 발현과 연관이 있고, 여기서 EPH 수용체 A5는 암 세포 상에서 발현되고, 여기서 암은 폐암, 유방암, 식도암, 위암, 및 난소암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법을 제공한다.
실시양태 102는 종양 퇴행의 유도를 필요로 하는 대상체에게 치료학적 유효량의 실시양태 1 내지 53 중 어느 한 실시양태의 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 투여하는 단계를 포함하는, 상기 대상체에서 종양 퇴행을 유도하는 방법으로서, 여기서 종양은 암이고, 여기서 종양은 EPH 수용체 A5의 발현과 연관이 있고, 여기서 EPH 수용체 A5는 암 세포 상에서 발현되고, 여기서 암은 폐암, 유방암, 식도암, 위암, 및 난소암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법을 제공한다.
실시양태 103은 종양 퇴행의 유도를 필요로 하는 대상체에게 치료학적 유효량의 실시양태 67 내지 85 중 어느 한 실시양태의 면역접합체를 투여하는 단계를 포함하는, 상기 대상체에서 종양 퇴행을 유도하는 방법으로서, 여기서 종양은 암이고, 여기서 종양은 EPH 수용체 A5의 발현과 연관이 있고, 여기서 EPH 수용체 A5는 암 세포 상에서 발현되고, 여기서 암은 폐암, 유방암, 식도암, 위암, 및 난소암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법을 제공한다.
실시양태 104는 종양 퇴행의 유도를 필요로 하는 대상체에게 치료학적 유효량의 실시양태 86의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 상기 대상체에서 종양 퇴행을 유도하는 방법으로서, 여기서 종양은 암이고, 여기서 종양은 EPH 수용체 A5의 발현과 연관이 있고, 여기서 EPH 수용체 A5는 암 세포 상에서 발현되고, 여기서 암은 폐암, 유방암, 식도암, 위암, 및 난소암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법을 제공한다.
실시양태 105는 종양 퇴행의 유도를 필요로 하는 대상체에게 치료학적 유효량의 실시양태 87의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 상기 대상체에서 종양 퇴행을 유도하는 방법으로서, 여기서 종양은 암이고, 여기서 종양은 EPH 수용체 A5의 발현과 연관이 있고, 여기서 EPH 수용체 A5는 암 세포 상에서 발현되고, 여기서 암은 폐암, 유방암, 식도암, 위암, 및 난소암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법을 제공한다.
기타 실시양태
본 명세서에서 변수의 정의에 있는 요소 목록의 언급에는 열거된 요소의 단일 요소 또는 조합(또는 하위 조합)으로서의 해당 변수의 정의가 포함된다. 본 명세서의 실시양태에 대한 언급에는 임의의 단일 실시양태로서 실시양태 또는 임의의 다른 실시양태 또는 이의 부분과의 조합이 포함된다.
본 명세서에 인용된 각각의 모든 특허, 특허 출원 및 간행물의 개시 내용은 그 전체가 참조로 본 명세서에 포함된다. 본 발명이 특정 실시양태를 참조하여 개시되었지만, 본 발명의 진정한 사상 및 범위를 벗어나지 않고 본 발명의 다른 실시양태 및 변형이 통상의 기술자에 의해 고안될 수 있다는 것이 명백하다. 첨부된 청구범위는 이러한 모든 실시양태 및 동등한 변형을 포함하도록 해석되도록 의도되었다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (105)

  1. 인간 EPH 수용체 A5의 에피토프(epitope)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편(antigen-binding fragment)으로서,
    a. 3개의 중쇄 상보성-결정 영역 (HCDR)을 포함하는 중쇄 가변 영역으로서, 여기서
    HCDR1은 서열번호: 16에 제시된 아미노산 서열을 포함하고,
    HCDR2는 서열번호: 17-19로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고,
    HCDR3은 서열번호: 20에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것인 중쇄 가변 영역 및
    b. 3개의 경쇄 상보성-결정 영역 (LCDR)을 포함하는 경쇄 가변 영역으로서, 여기서
    LCDR1은 서열번호: 21 및 22로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고,
    LCDR2는 서열번호: 23에 제시된 아미노산 서열을 포함하고,
    LCDR3은 서열번호: 24에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것인 경쇄 가변 영역
    을 포함하는, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  2. 제1항에 있어서,
    a. 서열번호: 1과 적어도 85% 서열 동일성(sequence identity)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄; 및
    b. 서열번호: 8과 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄
    를 추가로 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    a. 중쇄 가변 영역은 서열번호: 16에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호: 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호: 20에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하고; 경쇄 가변 영역은 서열번호: 21에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호: 23에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호: 24에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하거나;
    b. 중쇄 가변 영역은 서열번호: 16에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호: 18에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호: 20에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하고; 경쇄 가변 영역은 서열번호: 21에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호: 23에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호: 24에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하거나;
    c. 중쇄 가변 영역은 서열번호: 16에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호: 19에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호: 20에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하고; 경쇄 가변 영역은 서열번호: 21에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호: 23에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호: 24에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하거나;
    d. 중쇄 가변 영역은 서열번호: 16에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호: 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호: 20에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하고; 경쇄 가변 영역은 서열번호: 22에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호: 23에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호: 24에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하거나;
    e. 중쇄 가변 영역은 서열번호: 16에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호: 18에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호: 20에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하고; 경쇄 가변 영역은 서열번호: 22에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호: 23에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호: 24에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하거나;
    f. 중쇄 가변 영역은 서열번호: 16에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호: 19에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호: 20에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하고; 경쇄 가변 영역은 서열번호: 22에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호: 23에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호: 24에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 것인, 항체 또는 항원-결합 단편.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열번호: 2-7로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 것인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄 가변 영역이 서열번호: 2-7로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄 가변 영역이 서열번호: 2-7로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열로 이루어진 것인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄 가변 영역이 서열번호: 26-31로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열에 의해 코딩되는(encoded) 것인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열이 서열번호: 9-13으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 것인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  9. 제1항 내지 제3항 및 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 경쇄 가변 영역이 서열번호: 9-13으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  10. 제1항 내지 제3항 및 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 경쇄 가변 영역이 서열번호: 9-13으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열로 이루어진 것인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  11. 제1항 내지 제3항 및 제8항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 경쇄 가변 영역이 서열번호: 33-37로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열에 의해 코딩되는 것인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    a. 중쇄 가변 영역은 서열번호: 2에 제시되고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 9에 제시되어 있거나;
    b. 중쇄 가변 영역은 서열번호: 2에 제시되고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 10에 제시되어 있거나;
    c. 중쇄 가변 영역은 서열번호: 2에 제시되고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 11에 제시되어 있거나;
    d. 중쇄 가변 영역은 서열번호: 2에 제시되고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 12에 제시되어 있거나;
    e. 중쇄 가변 영역은 서열번호: 2에 제시되고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 13에 제시되어 있거나;
    f. 중쇄 가변 영역은 서열번호: 3에 제시되고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 9에 제시되어 있거나;
    g. 중쇄 가변 영역은 서열번호: 3에 제시되고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 10에 제시되어 있거나;
    h. 중쇄 가변 영역은 서열번호: 3에 제시되고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 11에 제시되어 있거나;
    i. 중쇄 가변 영역은 서열번호: 3에 제시되고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 12에 제시되어 있거나;
    j. 중쇄 가변 영역은 서열번호: 3에 제시되고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 13에 제시되어 있거나;
    k. 중쇄 가변 영역은 서열번호: 4에 제시되고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 9에 제시되어 있거나;
    l. 중쇄 가변 영역은 서열번호: 4에 제시되고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 10에 제시되어 있거나;
    m. 중쇄 가변 영역은 서열번호: 4에 제시되고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 11에 제시되어 있거나;
    n. 중쇄 가변 영역은 서열번호: 4에 제시되고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 12에 제시되어 있거나;
    o. 중쇄 가변 영역은 서열번호: 4에 제시되고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 13에 제시되어 있거나;
    p. 중쇄 가변 영역은 서열번호: 5에 제시되고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 9에 제시되어 있거나;
    q. 중쇄 가변 영역은 서열번호: 5에 제시되고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 10에 제시되어 있거나;
    r. 중쇄 가변 영역은 서열번호: 5에 제시되고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 11에 제시되어 있거나;
    s. 중쇄 가변 영역은 서열번호: 5에 제시되고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 12에 제시되어 있거나;
    t. 중쇄 가변 영역은 서열번호: 5에 제시되고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 13에 제시되어 있거나;
    u. 중쇄 가변 영역은 서열번호: 6에 제시되고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 9에 제시되어 있거나;
    v. 중쇄 가변 영역은 서열번호: 6에 제시되고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 10에 제시되어 있거나;
    w. 중쇄 가변 영역은 서열번호: 6에 제시되고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 11에 제시되어 있거나;
    x. 중쇄 가변 영역은 서열번호: 6에 제시되고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 12에 제시되어 있거나;
    y. 중쇄 가변 영역은 서열번호: 6에 제시되고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 13에 제시되어 있거나;
    z. 중쇄 가변 영역은 서열번호: 7에 제시되고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 9에 제시되어 있거나;
    aa. 중쇄 가변 영역은 서열번호: 7에 제시되고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 10에 제시되어 있거나;
    bb. 중쇄 가변 영역은 서열번호: 7에 제시되고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 11에 제시되어 있거나;
    cc. 중쇄 가변 영역은 서열번호: 7에 제시되고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 12에 제시되어 있거나;
    dd. 중쇄 가변 영역은 서열번호: 7에 제시되고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 13에 제시되는 것인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  13. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    a. 중쇄 가변 영역은 서열번호: 2에 제시된 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 9에 제시된 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나;
    b. 중쇄 가변 영역은 서열번호: 2에 제시된 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 10에 제시된 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나;
    c. 중쇄 가변 영역은 서열번호: 2에 제시된 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 11에 제시된 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나;
    d. 중쇄 가변 영역은 서열번호: 2에 제시된 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 12에 제시된 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나;
    e. 중쇄 가변 영역은 서열번호: 2에 제시된 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 13에 제시된 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나;
    f. 중쇄 가변 영역은 서열번호: 3에 제시된 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 9에 제시된 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나;
    g. 중쇄 가변 영역은 서열번호: 3에 제시된 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 10에 제시된 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나;
    h. 중쇄 가변 영역은 서열번호: 3에 제시된 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 11에 제시된 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나;
    i. 중쇄 가변 영역은 서열번호: 3에 제시된 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 12에 제시된 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나;
    j. 중쇄 가변 영역은 서열번호: 3에 제시된 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 13에 제시된 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나;
    k. 중쇄 가변 영역은 서열번호: 4에 제시된 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 9에 제시된 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나;
    l. 중쇄 가변 영역은 서열번호: 4에 제시된 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 10에 제시된 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나;
    m. 중쇄 가변 영역은 서열번호: 4에 제시된 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 11에 제시된 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나;
    n. 중쇄 가변 영역은 서열번호: 4에 제시된 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 12에 제시된 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나;
    o. 중쇄 가변 영역은 서열번호: 4에 제시된 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 13에 제시된 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나;
    p. 중쇄 가변 영역은 서열번호: 5에 제시된 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 9에 제시된 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나;
    q. 중쇄 가변 영역은 서열번호: 5에 제시된 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 10에 제시된 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나;
    r. 중쇄 가변 영역은 서열번호: 5에 제시된 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 11에 제시된 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나;
    s. 중쇄 가변 영역은 서열번호: 5에 제시된 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 12에 제시된 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나;
    t. 중쇄 가변 영역은 서열번호: 5에 제시된 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 13에 제시된 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나;
    u. 중쇄 가변 영역은 서열번호: 6에 제시된 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 9에 제시된 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나;
    v. 중쇄 가변 영역은 서열번호: 6에 제시된 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 10에 제시된 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나;
    w. 중쇄 가변 영역은 서열번호: 6에 제시된 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 11에 제시된 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나;
    x. 중쇄 가변 영역은 서열번호: 6에 제시된 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 12에 제시된 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나;
    y. 중쇄 가변 영역은 서열번호: 6에 제시된 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 13에 제시된 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나;
    z. 중쇄 가변 영역은 서열번호: 7에 제시된 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 9에 제시된 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나;
    aa. 중쇄 가변 영역은 서열번호: 7에 제시된 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 10에 제시된 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나;
    bb. 중쇄 가변 영역은 서열번호: 7에 제시된 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 11에 제시된 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나;
    cc. 중쇄 가변 영역은 서열번호: 7에 제시된 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 12에 제시된 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나;
    dd. 중쇄 가변 영역은 서열번호: 7에 제시된 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고 경쇄 가변 영역은 서열번호: 13에 제시된 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  14. 인간 EPH 수용체 A5의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서,
    a. 서열번호: 16에 제시된 서열을 포함하는 중쇄 상보성-결정 영역 1 (HCDR1), 서열번호: 18에 제시된 서열을 포함하는 HCDR2, 서열번호: 20에 제시된 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄; 및
    b. 서열번호: 21에 제시된 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 1 (LCDR1), 서열번호: 23a에 제시된 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호: 24에 제시된 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄
    를 포함하는, 항체 또는 항원-결합 단편.
  15. 인간 EPH 수용체 A5의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서,
    a. 서열번호: 16에 제시된 서열을 포함하는 중쇄 상보성-결정 영역 1 (HCDR1), 서열번호: 19에 제시된 서열을 포함하는 HCDR2, 서열번호: 20에 제시된 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄; 및
    b. 서열번호: 21에 제시된 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 1 (LCDR1), 서열번호: 23에 제시된 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호: 24에 제시된 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄
    를 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  16. 인간 EPH 수용체 A5의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서,
    a. 서열번호: 16에 제시된 서열을 포함하는 중쇄 상보성-결정 영역 1 (HCDR1), 서열번호: 17에 제시된 서열을 포함하는 HCDR2, 서열번호: 20에 제시된 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄; 및
    b. 서열번호: 22에 제시된 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 1 (LCDR1), 서열번호: 23에 제시된 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호: 24에 제시된 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄
    를 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  17. 인간 EPH 수용체 A5의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서,
    a. 서열번호: 16에 제시된 서열을 포함하는 중쇄 상보성-결정 영역 1 (HCDR1), 서열번호: 18에 제시된 서열을 포함하는 HCDR2, 서열번호: 20에 제시된 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄; 및
    b. 서열번호: 22에 제시된 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 1 (LCDR1), 서열번호: 23에 제시된 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호: 24에 제시된 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄
    를 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  18. a. 서열번호: 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄; 및
    b. 서열번호: 11에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄
    를 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  19. a. 서열번호: 6에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄; 및
    b. 서열번호: 11에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄
    를 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 전장 항체(full-length antibody), Fab, 및 단일쇄(single-chain) 가변 단편 (scFv)으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 전장 항체인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 인간화되는 것인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  23. 제11항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄가 인간 면역글로불린 중쇄의 불변 도메인을 추가로 포함하고 경쇄가 인간 경쇄의 불변 도메인을 추가로 포함하는 것인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  24. 제23항에 있어서, 인간 면역글로불린 중쇄의 불변 도메인이 IgG1 중쇄로부터의 것인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  25. 제23항 또는 제224항에 있어서, 인간 면역글로불린 중쇄의 불변 도메인이 서열번호: 14에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  26. 제23항에 있어서, 인간 경쇄의 불변 도메인이 인간 카파 경쇄로부터 유래되는 것인 항체.
  27. 제23항 또는 제26항에 있어서, 인간 경쇄의 불변 도메인이 서열번호: 15에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  28. 인간 EPH 수용체 A5의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서,
    a. 서열번호: 38에 제시된 아미노산 서열과 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 포함하는 중쇄; 및
    b. 서열번호: 40에 제시된 아미노산 서열과 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 포함하는 경쇄
    를 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  29. 청구항 28에 있어서,
    a. 중쇄의 가변 영역이 서열번호: 16에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호: 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호: 20에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하고;
    b. 경쇄의 가변 영역이 서열번호: 21에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호: 23에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호: 24에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 것인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄가 서열번호: 38에 제시되고 경쇄가 서열번호: 40에 제시되는 것인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  31. 인간 EPH 수용체 A5의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서,
    a. 서열번호: 39에 제시된 아미노산 서열과 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 포함하는 중쇄; 및
    b. 서열번호: 40에 제시된 아미노산 서열과 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 포함하는 경쇄
    를 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  32. 청구항 31에 있어서,
    a. 중쇄의 가변 영역이 서열번호: 16에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호: 18에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호: 20에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하고;
    b. 경쇄의 가변 영역이 서열번호: 21에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호: 23에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호: 24에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 것인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  33. 제1항 내지 제27항, 제31항 및 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄가 서열번호: 39에 제시되고 경쇄가 서열번호: 40에 제시되는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 EpHA5에 결합하기 위한 해리 상수 (KD)가 1.25 x 10-9 M 미만인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  35. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 EpHA5에 결합하기 위한 해리 상수 (KD)가 8 x 10-10 M 내지 1.1 x 10-9 M인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 참조 항체보다 2배 이내로 더 양호한 인간 EpHA5에 결합하기 위한 해리 상수 (KD)를 가지며, 여기서 참조 항체는 11C12이거나 서열번호: 1에 제시된 가변 중쇄 및 서열번호: 8에 제시된 가변 경쇄를 포함하는 항체이고, 임의로 여기서 참조 항체는 동일한 형태인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  37. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 EpHA5에 대한 결합에 대한 해리 상수 (KD)가 참조 항체보다 1.2배 초과로 더 양호하고, 여기서 참조 항체는 11C12이거나 서열번호: 1에 제시된 가변 중쇄 및 서열번호: 8에 제시된 가변 경쇄를 포함하는 항체이고, 임의로 여기서 참조 항체는 동일한 형태인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  38. 해리 상수 (KD)가 비아코어(Biacore)에 의해 결정되는 것인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  39. 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 참조 항체와 비교하여 증가된 열 안정성을 나타내고, 여기서 참조 항체는 11C12이거나 서열번호: 1에 제시된 가변 중쇄 및 서열번호: 8에 제시된 가변 경쇄를 포함하는 항체이고, 임의로 여기서 참조 항체는 동일한 형태인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  40. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 참조 항체와 비교하여 약 5℃ 이상 증가되는 Tm1의 용융 온도 프로파일(melting temperature profile)을 가지며, 여기서 참조 항체는 11C12이거나 서열번호: 1에 제시된 가변 중쇄 및 서열번호: 8에 제시된 가변 경쇄를 포함하는 항체이고, 임의로 여기서 참조 항체는 동일한 형태인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  41. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 참조 항체와 비교하여 약 10℃ 이상 증가되는 Tm1의 용융 온도 프로파일을 가지며, 여기서 참조 항체는 11C12이거나 서열번호: 1에 제시된 가변 중쇄 및 서열번호: 8에 제시된 가변 경쇄를 포함하는 항체이고, 임의로 여기서 참조 항체는 동일한 형태인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  42. 제40항 또는 제41항에 있어서, 항체 또는 항원-결합 단편의 열 풀림 곡선(thermal unfolding curve)의 Tm1이 60℃ 초과인 항체 또는 항원-결합 단편.
  43. 제40항 내지 42항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 항원-결합 단편의 Tm1이 약 60℃ 내지 약 70℃인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  44. 제40항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 항원-결합 단편의 Tm1이 약 64℃, 약 65℃, 약 66℃, 약 67℃, 약 68℃, 또는 약 69℃인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  45. 제40항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 용융 온도 프로파일이 단상(monophasic)인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  46. 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 응집의 개시 온도 (Tagg)는 참조 항체와 비교하여 약 1℃ 초과, 약 2℃ 초과, 약 3℃ 초과, 약 4℃ 초과 또는 약 5℃ 초과 증가되며, 여기서 참조 항체는 11C12이거나 서열번호: 1에 제시된 가변 중쇄 및 서열번호: 8에 제시된 가변 경쇄를 포함하는 항체인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  47. 제1항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 항원-결합 단편의 응집의 개시 온도 (Tagg)가 약 67℃ 초과인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  48. 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 항원-결합 단편의 응집의 개시 온도 (Tagg)가 67℃ 내지 약 71℃인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  49. 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 항원-결합 단편의 Tagg가 약 67℃, 약 68℃, 약 69℃, 약 70℃, 또는 약 71℃인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  50. 제1항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 표면 인간 EphA5에 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  51. 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 단편이 참조 항체와 비교하여 증가되는 EC50으로, 세포, 임의로 H460 세포주의 표면 상에 발현된 인간 EphA5와 결합하고, 여기서 참조 항체는 11C12이거나 서열번호: 1에 제시된 가변 중쇄 및 서열번호: 8에 제시된 가변 경쇄를 포함하는 항체이고, 임의로 여기서 참조 항체는 동일한 형태인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  52. 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 단편이 임의로 유세포 분석법(flow cytometry)에 의해 결정되는 0.020 mg/mL 이하의 EC50으로, 세포, 임의로 H460 세포주의 표면 상에 발현된 인간 EphA5와 결합하는 것인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  53. 제1항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 단편이 임의로 유세포 분석법에 의해 결정되는 약 0.010 mg/mL 내지 0.020 mg/mL의 EC50으로, 세포, 임의로 H460 세포주의 표면 상에 발현된 인간 EphA5와 결합하는 것인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  54. 제1항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 단편이 임의로 유세포 분석법에 의해 결정되는 약 0.015 μg/mL, 약 0.016 μg/mL, 약 0.017 μg/mL, 약 0.018 μg/mL, 약 0.019 μg/mL, 또는 약 0.020 μg/mL의 EC50으로, 세포, 임의로 H460 세포주의 표면 상에 발현된 인간 EphA5와 결합하는 것인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  55. 제1항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 EphA5 발현-세포에 의해 내재화되는 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  56. 제1항 내지 제55항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 중쇄를 코딩하는 핵산.
  57. 제1항 내지 제55항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 경쇄를 코딩하는 핵산.
  58. 제1항 내지 제55항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 핵산.
  59. 제56항 내지 58항 중 어느 한 항의 핵산을 포함하는 벡터(vector).
  60. 제59항에 있어서, 발현 벡터인 벡터.
  61. 중쇄를 코딩하는 핵산 및 경쇄를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터로서, 여기서 중쇄 및 경쇄가 제1항 내지 제58항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 것인 벡터.
  62. 제61항에 있어서, 비시스트론 벡터(bicistronic vector)인 벡터.
  63. 중쇄를 코딩하는 제1 핵산을 포함하는 제1 벡터 및 경쇄를 코딩하는 제2 핵산을 포함하는 제2 벡터를 포함하는 벡터 시스템으로서, 여기서 중쇄 및 경쇄가 제1항 내지 제58항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 것인 벡터 시스템.
  64. 제63항에 있어서, 제1 벡터 및 제2 벡터가 각각 발현 벡터인 벡터 시스템.
  65. 제61항 또는 제62항의 벡터 또는 제63항 또는 제64항의 벡터 시스템을 포함하는 숙주 세포.
  66. 제65항에 있어서, 포유동물인 숙주 세포.
  67. 제61항 또는 제62항의 벡터 및 제63항 또는 제64항의 벡터 시스템을 숙주 세포에 도입하는 단계, 상기 숙주 세포로부터의 항체 또는 항원 결합 단편의 발현을 위한 조건 하에 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 항체 또는 항원-결합 단편을 단리 또는 정제하는 단계를 포함하는, 항체를 생산하는 방법.
  68. 제67항에 있어서, 숙주 세포가 포유동물 세포인 방법.
  69. 화학식 Ab-(L-D)를 갖는 면역접합체(immunoconjugate)로서, 여기서
    Ab는 제1항 내지 제55항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원-결합 단편이고;
    L은 링커(linker)이고;
    D는 세포독성 약물인, 면역접합체.
  70. 제69항에 있어서, 링커가 절단가능한 링커인 면역접합체.
  71. 제69항 또는 제70항에 있어서, 링커가 카텝신-절단가능한 링커인 면역접합체.
  72. 제71항에 있어서, 카텝신-절단가능한 링커가 발린-시트룰린 (Val-Cit)을 포함하는 것인 면역접합체.
  73. 제68항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 링커가 하기 구조식을 갖는 MC-VCP인 면역접합체:
    .
  74. 제68항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 링커가 하기 구조식을 포함하는 것인 면역접합체:
    또는 .
  75. 제68항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 링커가 pH 절단가능한 링커인 면역접합체.
  76. 제69항 내지 제79항 및 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 링커가 하기 구조식을 갖는 CL2A인 면역접합체:
    .
  77. 제69항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 세포독성 약물이 아우리스타틴인 면역접합체.
  78. 제77항에 있어서, 아우리스타틴이 하기 구조식을 갖는 모노메틸 아우리스타틴 E (MMAE)인 면역접합체:
    .
  79. 제69항 내지 제73항, 제77항, 및 제78항 중 어느 한 항에 있어서, L-D가 하기 구조식을 포함하는 것인 면역접합체:
  80. 제69항 내지 제72항, 제74항, 제77항, 및 제78항 중 어느 한 항에 있어서, L-D가 하기 구조식을 포함하는 것인 면역접합체:
    .
  81. 화학식 Ab-(L-D)를 갖는 면역접합체로서, 여기서,
    a. Ab가 서열번호: 38에 제시된 중쇄 및 서열번호: 40에 제시된 경쇄를 포함하는 인간 EPH 수용체 A5 (EphA5)의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체이고;
    b. L-D가 하기 구조식을 포함하는 것인 면역접합체:
    .
  82. 화학식 Ab-(L-D)를 갖는 면역접합체로서, 여기서,
    a. Ab가 서열번호: 39에 제시된 중쇄 및 서열번호: 40에 제시된 경쇄를 포함하는 인간 EPH 수용체 A5 (EphA5)의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체이고;
    b. L-D가 하기 구조식을 포함하는 것인 면역접합체:
    .
  83. 제69항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 세포독성 약물이 하기 구조식을 갖는 SN38인 면역접합체:
    .
  84. 제69항, 제70항, 제75항, 제76항, 및 제83항 중 어느 한 항에 있어서, L-D가 하기 구조식을 포함하는 것인 면역접합체:
    .
  85. 제69항 내지 제72항, 제74항 및 제83항 중 어느 한 항에 있어서, L-D가 하기 구조식을 포함하는 것인 면역접합체:
    .
  86. 제69항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 항체에 대한 약물의 비가 약 4인 면역접합체.
  87. 제69항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 항체에 대한 약물의 비가 약 8인 면역접합체.
  88. 제1항 내지 제55항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원-결합 단편 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  89. 제69항 내지 제87항 중 어느 한 항의 면역접합체 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  90. 제1항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 암의 치료, 개선 및/또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 암을 치료, 개선 및/또는 예방하는데 사용하기 위한, 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서, 여기서 암은 EPH 수용체 A5의 발현과 연관이 있고, 여기서 EPH 수용체 A5는 암 세포 상에서 발현되고, 여기서 암은 폐암(lung cancer), 유방암(breast cancer), 식도암(esophageal cancer), 위암(gastric cancer), 및 난소암(ovarian cancer)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  91. 제69항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 암의 치료, 개선 및/또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 암을 치료, 개선 및/또는 예방하는데 사용하기 위한 면역접합체로서, 여기서 암은 EPH 수용체 A5의 발현과 연관이 있고, 여기서 EPH 수용체 A5는 암 세포 상에서 발현되고, 여기서 암은 폐암, 유방암, 식도암, 위암, 및 난소암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 면역접합체.
  92. 제88항에 있어서, 암의 치료, 개선 및/또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 암을 치료, 개선 및/또는 예방하는데 사용하기 위한 약제학적 조성물로서, 여기서 암은 EPH 수용체 A5의 발현과 연관이 있고, 여기서 EPH 수용체 A5는 암 세포 상에서 발현되고, 여기서 암은 폐암, 유방암, 식도암, 위암, 및 난소암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 약제학적 조성물.
  93. 제89항에 있어서, 암의 치료, 개선 및/또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 암을 치료, 개선 및/또는 예방하는데 사용하기 위한 약제학적 조성물로서, 여기서 암은 EPH 수용체 A5의 발현과 연관이 있고, 여기서 EPH 수용체 A5는 암 세포 상에서 발현되고, 여기서 암은 폐암, 유방암, 식도암, 위암, 및 난소암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 약제학적 조성물.
  94. 제1항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에서 종양 퇴행을 유도하는데 사용하기 위한, 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서, 여기서 종양은 암이고, 여기서 종양은 EPH 수용체 A5의 발현과 연관이 있고, 여기서 EPH 수용체 A5는 암 세포 상에서 발현되고, 여기서 암은 폐암, 유방암, 식도암, 위암, 및 난소암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  95. 제69항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, 종양 퇴행의 유도를 필요로 하는 대상체에서 종양 퇴행을 유도하는데 사용하기 위한 면역접합체로서, 여기서 종양은 암이고, 여기서 종양은 EPH 수용체 A5의 발현과 연관이 있고, 여기서 EPH 수용체 A5는 암 세포 상에서 발현되고, 여기서 암은 폐암, 유방암, 식도암, 위암, 및 난소암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 면역접합체.
  96. 제86항에 있어서, 종양 퇴행의 유도를 필요로 하는 대상체에서 종양 퇴행을 유도하는데 사용하기 위한 약제학적 조성물로서, 여기서 종양은 암이고, 여기서 종양은 EPH 수용체 A5의 발현과 연관이 있고, 여기서 EPH 수용체 A5는 암 세포 상에서 발현되고, 여기서 암은 폐암, 유방암, 식도암, 위암, 및 난소암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 약제학적 조성물.
  97. 제89항에 있어서, 종양 퇴행의 유도를 필요로 하는 대상체에서 종양 퇴행을 유도하는데 사용하기 위한 약제학적 조성물로서, 여기서 종양은 암이고, 여기서 종양은 EPH 수용체 A5의 발현과 연관이 있고, 여기서 EPH 수용체 A5는 암 세포 상에서 발현되고, 여기서 암은 폐암, 유방암, 식도암, 위암, 및 난소암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 약제학적 조성물.
  98. 암의 치료, 개선 및/또는 예방을 필요로 하는 대상체에게 치료학적 유효량의 청제1항 내지 제55항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 투여하는 단계를 포함하는, 상기 대상체에서 암을 치료, 개선 및/또는 예방하는 방법으로서, 여기서 암은 EPH 수용체 A5의 발현과 연관이 있고, 여기서 EPH 수용체 A5는 암 세포 상에서 발현되고, 여기서 암은 폐암, 유방암, 식도암, 위암, 및 난소암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  99. 암의 치료, 개선 및/또는 예방을 필요로 하는 대상체에게 치료학적 유효량의 제69항 내지 제87항 중 어느 한 항의 면역접합체를 투여하는 단계를 포함하는, 상기 대상체에서 암을 치료, 개선 및/또는 예방하는 방법으로서, 여기서 암은 EPH 수용체 A5의 발현과 연관이 있고, 여기서 EPH 수용체 A5는 암 세포 상에서 발현되고, 여기서 암은 폐암, 유방암, 식도암, 위암, 및 난소암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  100. 암의 치료, 개선 및/또는 예방을 필요로 하는 대상체에게 치료학적 유효량의 제88항의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 상기 대상체에서 암을 치료, 개선 및/또는 예방하는 방법으로서, 여기서 암은 EPH 수용체 A5의 발현과 연관이 있고, 여기서 EPH 수용체 A5는 암 세포 상에서 발현되고, 여기서 암은 폐암, 유방암, 식도암, 위암, 및 난소암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  101. 암의 치료, 개선 및/또는 예방을 필요로 하는 대상체에게 치료학적 유효량의 제89항의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 상기 대상체에서 암을 치료, 개선 및/또는 예방하는 방법으로서, 여기서 암은 EPH 수용체 A5의 발현과 연관이 있고, 여기서 EPH 수용체 A5는 암 세포 상에서 발현되고, 여기서 암은 폐암, 유방암, 식도암, 위암, 및 난소암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  102. 종양 퇴행의 유도를 필요로 하는 대상체에게 치료학적 유효량의 제1항 내지 제55항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 투여하는 단계를 포함하는, 상기 대상체에서 종양 퇴행을 유도하는 방법으로서, 여기서 종양은 암이고, 여기서 종양은 EPH 수용체 A5의 발현과 연관이 있고, 여기서 EPH 수용체 A5는 암 세포 상에서 발현되고, 여기서 암은 폐암, 유방암, 식도암, 위암, 및 난소암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  103. 종양 퇴행의 유도를 필요로 하는 대상체에게 치료학적 유효량의 제69항 내지 제87항 중 어느 한 항의 면역접합체를 투여하는 단계를 포함하는, 상기 대상체에서 종양 퇴행을 유도하는 방법으로서, 여기서 종양은 암이고, 여기서 종양은 EPH 수용체 A5의 발현과 연관이 있고, 여기서 EPH 수용체 A5는 암 세포 상에서 발현되고, 여기서 암은 폐암, 유방암, 식도암, 위암, 및 난소암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  104. 종양 퇴행의 유도를 필요로 하는 대상체에게 치료학적 유효량의 제88항의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 상기 대상체에서 종양 퇴행을 유도하는 방법으로서, 여기서 종양은 암이고, 여기서 종양은 EPH 수용체 A5의 발현과 연관이 있고, 여기서 EPH 수용체 A5는 암 세포 상에서 발현되고, 여기서 암은 폐암, 유방암, 식도암, 위암, 및 난소암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  105. 종양 퇴행의 유도를 필요로 하는 대상체에게 치료학적 유효량의 제89항의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 상기 대상체에서 종양 퇴행을 유도하는 방법으로서, 여기서 종양은 암이고, 여기서 종양은 EPH 수용체 A5의 발현과 연관이 있고, 여기서 EPH 수용체 A5는 암 세포 상에서 발현되고, 여기서 암은 폐암, 유방암, 식도암, 위암, 및 난소암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.

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