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KR20240118798A - 인간 메타뉴모바이러스 백신 - Google Patents

인간 메타뉴모바이러스 백신 Download PDF

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KR20240118798A
KR20240118798A KR1020247021492A KR20247021492A KR20240118798A KR 20240118798 A KR20240118798 A KR 20240118798A KR 1020247021492 A KR1020247021492 A KR 1020247021492A KR 20247021492 A KR20247021492 A KR 20247021492A KR 20240118798 A KR20240118798 A KR 20240118798A
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KR
South Korea
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hmpv
polypeptide
mrna
amino acid
nucleic acid
Prior art date
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Pending
Application number
KR1020247021492A
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English (en)
Inventor
이본 찬
수카니아 사스말
안토니아 스튀블러
마이클 키쉬코
소피아 먼들
리농 장
조쉬 디나폴리
주디스 알라마레스-사푸에이
나탈리 아노소바
수드하 치부쿨라
힐러리 단즈
토드 스트러그넬
레이첼 그로포
Original Assignee
사노피 파스퇴르 인크
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
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Abstract

본 개시내용은 항원성 융합전 hMPV F 폴리펩티드, 융합전 hMPV F 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열(예를 들어, RNA 서열, 예를 들어, mRNA 서열), 항원성 융합전 hMPV F 폴리펩티드를 포함하는 조성물, 융합전 hMPV F 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 조성물, 및 hMPV 백신을 제공한다.

Description

인간 메타뉴모바이러스 백신
관련 출원
본 출원은 2021년 11월 30일에 출원된 미국 가출원 제63/284,405호의 이익을 주장하며, 이는 모든 목적을 위하여 그 전문이 참고로 포함된다.
CRADA 기술서
본 발명은 미국 보건 복지부(Department of Health and Human Services)의 기관인 미국 국립 보건원(National Institutes of Health)과의 공동 연구개발 협정(Cooperative Research and Development Agreement)의 수행으로 생성되었다. 미국 정부는 본 발명에 대해 특정 권리를 갖는다.
인간 메타뉴모바이러스(hMPV)는 특히 어린이, 면역저하 환자, 및 고령자에서 급성 호흡기 감염의 주된 원인이다. 조류 메타뉴모바이러스 아형 C와 가장 밀접하게 관련된 hMPV는 적어도 65년 동안 퍼져 왔고, 거의 모든 어린이가 5세 이내에 hMPV에 감염될 것이다. 그러나, 면역은 불완전하고, 성인기 전반에 걸쳐 재감염이 발생한다. 증상은 경증(예를 들어 기침, 비루 및 열)으로부터 중증(예를 들어 세기관지염 및 폐렴)에 이르기까지, 다른 호흡기 바이러스 감염과 유사하다.
높은 질환 부담(disease burden)에도 불구하고, 현재 hMPV에 대한 허가된 백신 또는 치료제는 없다. 효과적인 hMPV 백신 또는 이용가능한 치료제가 부족하기 때문에, hMPV 감염의 강한 중화를 위한 강한 면역 반응을 유발하는 hMPV 백신에 대한 필요성이 존재한다.
일 양태에서, 항원성 인간 메타뉴모바이러스(hMPV) 융합전 F 폴리펩티드, 또는 이를 인코딩하는 핵산 분자가 제공되며, 상기 융합전 F 폴리펩티드는 막관통 도메인이 결여되어 있고 세포질 꼬리가 결여되어 있으며, 인간 리노바이러스 3C(HRV-3C) 프로테아제 절단 부위를 포함한다.
특정한 예시적인 구현예에서, 상기 융합전 F 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 위치 100에서 글루타민을 아르기닌으로 대체하고, SEQ ID NO: 1의 아미노산 위치 101에서 세린을 아르기닌으로 대체하는, 아미노산 치환 Q100R 및 S101R을 포함하는 F0 절단 부위 돌연변이를 추가로 포함한다.
특정한 예시적인 구현예에서, 상기 융합전 F 폴리펩티드는 신호 펩티드를 포함한다.
특정한 예시적인 구현예에서, 상기 융합전 F 폴리펩티드는 선택적으로 폴리히스티딘-태그(예를 들어 6x His 태그, 8x His 태그 등) 및/또는 Strep II 태그인 적어도 하나의 태그 서열을 포함한다.
특정한 예시적인 구현예에서, 상기 융합전 F 폴리펩티드는 폴돈 도메인을 포함한다.
특정한 예시적인 구현예에서, 상기 융합전 F 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 1의 위치 160에서 야생형 아미노산을 대체하는 아미노산 치환, 및 SEQ ID NO: 1의 위치 46에서 야생형 아미노산을 대체하는 아미노산 치환을 포함한다.
특정한 예시적인 구현예에서, 상기 융합전 F 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 위치 160에서 트레오닌을 대체하는 아미노산 치환, 및 SEQ ID NO: 1의 아미노산 위치 46에서 아스파라긴을 대체하는 아미노산 치환을 포함한다.
특정한 예시적인 구현예에서, 상기 융합전 F 폴리펩티드는 위치 160에서 아미노산을 페닐알라닌, 트립토판, 티로신, 발린, 알라닌, 이소류신 또는 류신으로 대체하는 아미노산 치환을 포함한다. 특정한 예시적인 구현예에서, 상기 융합전 F 폴리펩티드는 위치 160에서 아미노산을 페닐알라닌으로 대체하는 아미노산 치환을 포함한다.
특정한 예시적인 구현예에서, 상기 융합전 F 폴리펩티드는 위치 46에서 아미노산을 발린, 알라닌, 이소류신, 류신, 페닐알라닌, 티로신 또는 프롤린으로 대체하는 아미노산 치환을 포함한다. 특정한 예시적인 구현예에서, 상기 융합전 F 폴리펩티드는 위치 46에서 아미노산을 발린으로 대체하는 아미노산 치환을 포함한다.
특정한 예시적인 구현예에서, hMPV는 A 계통 또는 B 계통이다. 특정한 예시적인 구현예에서, hMPV는 A1 아형, A2 아형, B1 아형, 또는 B2 아형이다.
특정한 예시적인 구현예에서, 상기 융합전 F 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 3과 적어도 95%의 서열 동일성을 포함하거나 SEQ ID NO: 3을 포함한다.
특정한 예시적인 구현예에서, F 폴리펩티드를 인코딩하는 오픈 리딩 프레임(ORF)을 포함하는 메신저 RNA(mRNA)가 제공된다.
특정한 예시적인 구현예에서, 예방적 유효량의 F 폴리펩티드 또는 핵산 분자, 예방적 유효량의 mRNA, 또는 예방적 유효량의 백신을 대상체에 선택적으로 근육내, 비강내, 정맥내, 피하 또는 피내로 투여하는 단계를 포함하는, 면역 반응의 유발을 필요로 하는 대상체에서 면역 반응을 유발하는 방법이 제공된다.
특정한 예시적인 구현예에서, 예방적 유효량의 F 폴리펩티드 또는 핵산 분자, 예방적 유효량의 mRNA, 또는 예방적 유효량의 백신을 대상체에 선택적으로 근육내, 비강내, 정맥내, 피하 또는 피내로 투여하는 단계를 포함하는, hMPV 감염을 예방하거나 hMPV 감염의 하나 이상의 증상을 감소시키는 방법이 제공된다.
특정한 예시적인 구현예에서, F 폴리펩티드 또는 핵산 분자, 예방적 유효량의 mRNA, 또는 백신의 용도는 치료를 필요로 하는 대상체를 치료하는 데 사용하기 위한 의약의 제조를 위해 제공된다.
특정한 예시적인 구현예에서, F 폴리펩티드 또는 핵산 분자, 예방적 유효량의 mRNA, 또는 백신은 치료를 필요로 하는 대상체를 치료하는 데 사용하기 위해 제공된다.
특정한 예시적인 구현예에서, 일회-사용 또는 다회-사용 투여량의 F 폴리펩티드 또는 핵산 분자, 예방적 유효량의 mRNA, 또는 백신을 포함하는 컨테이너를 포함하는 키트가 제공되며, 선택적으로 컨테이너는 바이알 또는 사전 충전형 시린지 또는 주사기이다.
특정한 예시적인 구현예에서, F 폴리펩티드, 핵산 분자 또는 mRNA를 인코딩하는 발현 벡터가 제공된다.
특정한 예시적인 구현예에서, 발현 벡터를 포함하는 세포가 제공된다.
또 다른 양태에서, 항원성 인간 메타뉴모바이러스(hMPV) 융합전 F 폴리펩티드, 또는 이를 인코딩하는 핵산 분자가 제공되며, 상기 융합전 F 폴리펩티드는 막관통 도메인이 결여되어 있고 세포질 꼬리가 결여되어 있으며, SEQ ID NO: 1의 아미노산 위치 100에서 글루타민을 아르기닌으로 대체하고, SEQ ID NO: 1의 아미노산 위치 101에서 세린을 아르기닌으로 대체하는, 아미노산 치환 Q100R 및 S101R을 포함하는 F0 절단 부위 돌연변이; 인간 리노바이러스 3C(HRV-3C) 프로테아제 절단 부위; 이종성 신호 펩티드; 폴리히스티딘-태그(예를 들어 6x His 태그, 8x His 태그 등) 및/또는 Strep II 태그; 및 폴돈 도메인을 포함한다.
또 다른 양태에서, 항원성 인간 융합전 메타뉴모바이러스(hMPV) F 폴리펩티드, 또는 이를 인코딩하는 핵산 분자가 제공되며, 상기 융합전 F 폴리펩티드는 막관통 도메인이 결여되어 있고 세포질 꼬리가 결여되어 있으며, SEQ ID NO: 1의 아미노산 위치 160에서 트레오닌을 대체하는 아미노산 치환, 및 SEQ ID NO: 1의 아미노산 위치 46에서 아스파라긴을 대체하는 아미노산 치환을 포함한다.
특정한 예시적인 구현예에서, 상기 융합전 F 폴리펩티드는 아미노산 위치 160에서 트레오닌을 페닐알라닌, 트립토판, 또는 티로신으로 대체하는 아미노산 치환을 포함한다. 특정한 예시적인 구현예에서, 상기 융합전 F 폴리펩티드는 아미노산 위치 160에서 트레오닌을 페닐알라닌으로 대체하는 아미노산 치환 T160F를 포함한다.
특정한 예시적인 구현예에서, 상기 융합전 F 폴리펩티드는 아미노산 위치 46에서 아스파라긴을 발린, 알라닌, 글리신, 이소류신, 류신, 또는 프롤린으로 대체하는 아미노산 치환을 포함한다. 특정한 예시적인 구현예에서, 상기 융합전 F 폴리펩티드는 아미노산 위치 46에서 아스파라긴을 발린으로 대체하는 아미노산 치환 N46V를 포함한다.
특정한 예시적인 구현예에서, 상기 융합전 F 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 7과 적어도 95%의 서열 동일성을 포함한다.
특정한 예시적인 구현예에서, 상기 융합전 F 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 위치 100에서 글루타민을 아르기닌으로 대체하고, SEQ ID NO: 1의 아미노산 위치 101에서 세린을 아르기닌으로 대체하는, 아미노산 치환 Q100R 및 S101R을 포함하는 F0 절단 부위 돌연변이를 추가로 포함한다.
특정한 예시적인 구현예에서, 상기 융합전 F 폴리펩티드는 신호 펩티드를 포함한다.
특정한 예시적인 구현예에서, 상기 융합전 F 폴리펩티드는 선택적으로 폴리히스티딘-태그(예를 들어 6x His 태그, 8x His 태그 등) 및/또는 Strep II 태그인 적어도 하나의 태그 서열을 포함한다.
특정한 예시적인 구현예에서, 상기 융합전 F 폴리펩티드는 폴돈 도메인을 포함한다.
특정한 예시적인 구현예에서, hMPV는 A 계통 또는 B 계통이다. 특정한 예시적인 구현예에서, hMPV는 A1 아형, A2 아형, B1 아형, 또는 B2 아형이다.
특정한 예시적인 구현예에서, 상기 융합전 F 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 3과 적어도 95%의 서열 동일성을 포함하거나 SEQ ID NO: 3을 포함한다.
특정한 예시적인 구현예에서, F 폴리펩티드를 인코딩하는 오픈 리딩 프레임(ORF)을 포함하는 메신저 RNA(mRNA)가 제공된다.
특정한 예시적인 구현예에서, 예방적 유효량의 F 폴리펩티드 또는 핵산 분자, 예방적 유효량의 mRNA, 또는 예방적 유효량의 백신을 대상체에 선택적으로 근육내, 비강내, 정맥내, 피하 또는 피내로 투여하는 단계를 포함하는, 면역 반응의 유발을 필요로 하는 대상체에서 면역 반응을 유발하는 방법이 제공된다.
특정한 예시적인 구현예에서, 예방적 유효량의 F 폴리펩티드 또는 핵산 분자, 예방적 유효량의 mRNA, 또는 예방적 유효량의 백신을 대상체에 선택적으로 근육내, 비강내, 정맥내, 피하 또는 피내로 투여하는 단계를 포함하는, hMPV 감염을 예방하거나 hMPV 감염의 하나 이상의 증상을 감소시키는 방법이 제공된다.
특정한 예시적인 구현예에서, F 폴리펩티드 또는 핵산 분자, 예방적 유효량의 mRNA, 또는 백신의 용도는 치료를 필요로 하는 대상체를 치료하는 데 사용하기 위한 의약의 제조를 위해 제공된다.
특정한 예시적인 구현예에서, F 폴리펩티드 또는 핵산 분자, 예방적 유효량의 mRNA, 또는 백신은 치료를 필요로 하는 대상체를 치료하는 데 사용하기 위해 제공된다.
특정한 예시적인 구현예에서, 일회-사용 또는 다회-사용 투여량의 F 폴리펩티드 또는 핵산 분자, 예방적 유효량의 mRNA, 또는 백신을 포함하는 컨테이너를 포함하는 키트가 제공되며, 선택적으로 컨테이너는 바이알 또는 사전 충전형 시린지 또는 주사기이다.
특정한 예시적인 구현예에서, F 폴리펩티드, 핵산 분자 또는 mRNA를 인코딩하는 발현 벡터가 제공된다.
특정한 예시적인 구현예에서, 발현 벡터를 포함하는 세포가 제공된다.
또 다른 양태에서, 항원성 인간 메타뉴모바이러스(hMPV) 융합전 F 폴리펩티드, 또는 이를 인코딩하는 핵산 분자가 제공되며, 상기 융합전 F 폴리펩티드는 막관통 도메인이 결여되어 있고 세포질 꼬리가 결여되어 있으며, SEQ ID NO: 1의 아미노산 위치 160에서 트레오닌을 페닐알라닌으로 대체하는 아미노산 치환 T160F, 및 SEQ ID NO: 1의 아미노산 위치 46에서 아스파라긴을 발린으로 대체하는 아미노산 치환 N46V; SEQ ID NO: 1의 아미노산 위치 100에서 글루타민을 아르기닌으로 대체하고, SEQ ID NO: 1의 아미노산 위치 101에서 세린을 아르기닌으로 대체하는, 아미노산 치환 Q100R 및 S101R을 포함하는 F0 절단 부위 돌연변이; 인간 리노바이러스 3C(HRV-3C) 프로테아제 절단 부위; 신호 펩티드; 폴리히스티딘-태그(예를 들어 6x His 태그, 8x His 태그 등) 및/또는 Strep II 태그; 및 폴돈 도메인을 포함한다.
특정한 예시적인 구현예에서, hMPV는 A 계통 또는 B 계통이다. 특정한 예시적인 구현예에서, hMPV는 A1 아형, A2 아형, B1 아형, 또는 B2 아형이다.
특정한 예시적인 구현예에서, 상기 융합전 F 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 3과 적어도 95%의 서열 동일성을 포함하거나 SEQ ID NO: 3을 포함한다.
특정한 예시적인 구현예에서, F 폴리펩티드를 인코딩하는 오픈 리딩 프레임(ORF)을 포함하는 메신저 RNA(mRNA)가 제공된다.
특정한 예시적인 구현예에서, 예방적 유효량의 F 폴리펩티드 또는 핵산 분자, 예방적 유효량의 mRNA, 또는 예방적 유효량의 백신을 대상체에 선택적으로 근육내, 비강내, 정맥내, 피하 또는 피내로 투여하는 단계를 포함하는, 면역 반응의 유발을 필요로 하는 대상체에서 면역 반응을 유발하는 방법이 제공된다.
특정한 예시적인 구현예에서, 예방적 유효량의 F 폴리펩티드 또는 핵산 분자, 예방적 유효량의 mRNA, 또는 예방적 유효량의 백신을 대상체에 선택적으로 근육내, 비강내, 정맥내, 피하 또는 피내로 투여하는 단계를 포함하는, hMPV 감염을 예방하거나 hMPV 감염의 하나 이상의 증상을 감소시키는 방법이 제공된다.
특정한 예시적인 구현예에서, F 폴리펩티드 또는 핵산 분자, 예방적 유효량의 mRNA, 또는 백신의 용도는 치료를 필요로 하는 대상체를 치료하는 데 사용하기 위한 의약의 제조를 위해 제공된다.
특정한 예시적인 구현예에서, F 폴리펩티드 또는 핵산 분자, 예방적 유효량의 mRNA, 또는 백신은 치료를 필요로 하는 대상체를 치료하는 데 사용하기 위해 제공된다.
특정한 예시적인 구현예에서, 일회-사용 또는 다회-사용 투여량의 F 폴리펩티드 또는 핵산 분자, 예방적 유효량의 mRNA, 또는 백신을 포함하는 컨테이너를 포함하는 키트가 제공되며, 선택적으로 컨테이너는 바이알 또는 사전 충전형 시린지 또는 주사기이다.
특정한 예시적인 구현예에서, F 폴리펩티드, 핵산 분자 또는 mRNA를 인코딩하는 발현 벡터가 제공된다.
특정한 예시적인 구현예에서, 발현 벡터를 포함하는 세포가 제공된다.
또 다른 양태에서, 인간 메타뉴모바이러스(hMPV) F 폴리펩티드, 또는 이를 인코딩하는 핵산 분자가 제공되며, 상기 F 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 7과 적어도 95%의 서열 동일성을 포함한다.
특정한 예시적인 구현예에서, F 폴리펩티드는 융합전 F 폴리펩티드이다.
특정한 예시적인 구현예에서, F 폴리펩티드는 항원성이다.
특정한 예시적인 구현예에서, F 폴리펩티드는 아미노산 위치 160에서 트레오닌을 페닐알라닌으로 대체하는 아미노산 치환 T160F, 및 아미노산 위치 46에서 아스파라긴을 발린으로 대체하는 아미노산 치환 N46V를 포함한다.
특정한 예시적인 구현예에서, F 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 7을 포함한다.
특정한 예시적인 구현예에서, 위의 양태 또는 위의 구현예 중 임의의 것의 폴리펩티드 중 임의의 것을 인코딩하는 핵산 분자가 제공된다. 특정한 예시적인 구현예에서, 핵산 분자는 SEQ ID NO: 8과 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는다. 특정한 예시적인 구현예에서, 핵산 분자는 SEQ ID NO: 8을 포함한다. 특정한 예시적인 구현예에서, 핵산 분자는 SEQ ID NO: 18과 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는다. 특정한 예시적인 구현예에서, 핵산 분자는 SEQ ID NO: 18을 포함한다. 특정한 예시적인 구현예에서, 핵산 분자는 SEQ ID NO: 19와 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는다. 특정한 예시적인 구현예에서, 핵산 분자는 SEQ ID NO: 19를 포함한다.
특정한 예시적인 구현예에서, 위의 구현예의 폴리펩티드 중 임의의 것, 또는 이를 인코딩하는 핵산 분자 중 임의의 것을 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다. 특정한 예시적인 구현예에서, 약제학적 조성물은 백신이다.
특정한 예시적인 구현예에서, 백신을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, hMPV에 대한 면역 반응을 유발하거나 hMPV 감염으로부터 대상체를 보호하는 방법이 제공된다.
특정한 예시적인 구현예에서, 대상체는 단백질 hMPV 백신이 투여된 대상체에 비해, 백신의 투여 후 hMPV에 대한 중화 항체의 유사한 혈청 농도를 갖는다. 특정한 예시적인 구현예에서, 단백질 hMPV 백신은 아쥬반트와 공동-투여된다.
특정한 예시적인 구현예에서, 백신은 기존 hMPV 면역성을 갖는 대상체에서 중화 항체의 혈청 농도를 증가시킨다.
특정한 예시적인 구현예에서, 백신을 대상체에 투여하는 것을 포함하는, hMPV에 대한 면역 반응을 유발하거나 hMPV 감염으로부터 대상체를 보호하는데 사용하기 위한 백신이 제공된다.
특정한 예시적인 구현예에서, hMPV에 대한 면역 반응을 유발하거나 hMPV 감염으로부터 대상체를 보호하기 위한 의약의 제조에 있어 백신의 용도가 제공된다.
특정한 예시적인 구현예에서, F 폴리펩티드를 인코딩하는 오픈 리딩 프레임(ORF)을 포함하는 메신저 RNA(mRNA)가 제공된다.
특정한 예시적인 구현예에서, 예방적 유효량의 F 폴리펩티드 또는 핵산 분자, 예방적 유효량의 mRNA, 또는 예방적 유효량의 백신을 대상체에 선택적으로 근육내, 비강내, 정맥내, 피하 또는 피내로 투여하는 단계를 포함하는, 면역 반응의 유발을 필요로 하는 대상체에서 면역 반응을 유발하는 방법이 제공된다.
특정한 예시적인 구현예에서, 예방적 유효량의 F 폴리펩티드 또는 핵산 분자, 예방적 유효량의 mRNA, 또는 예방적 유효량의 백신을 대상체에 선택적으로 근육내, 비강내, 정맥내, 피하 또는 피내로 투여하는 단계를 포함하는, hMPV 감염을 예방하거나 hMPV 감염의 하나 이상의 증상을 감소시키는 방법이 제공된다.
특정한 예시적인 구현예에서, F 폴리펩티드 또는 핵산 분자, 예방적 유효량의 mRNA, 또는 백신의 용도는 치료를 필요로 하는 대상체를 치료하는 데 사용하기 위한 의약의 제조를 위해 제공된다.
특정한 예시적인 구현예에서, F 폴리펩티드 또는 핵산 분자, 예방적 유효량의 mRNA, 또는 백신은 치료를 필요로 하는 대상체를 치료하는 데 사용하기 위해 제공된다.
특정한 예시적인 구현예에서, 일회-사용 또는 다회-사용 투여량의 F 폴리펩티드 또는 핵산 분자, 예방적 유효량의 mRNA, 또는 백신을 포함하는 컨테이너를 포함하는 키트가 제공되며, 선택적으로 컨테이너는 바이알 또는 사전 충전형 시린지 또는 주사기이다.
특정한 예시적인 구현예에서, F 폴리펩티드, 핵산 분자 또는 mRNA를 인코딩하는 발현 벡터가 제공된다.
특정한 예시적인 구현예에서, 발현 벡터를 포함하는 세포가 제공된다.
또 다른 양태에서, 인간 메타뉴모바이러스(hMPV) F 폴리펩티드 항원을 인코딩하는 오픈 리딩 프레임(ORF)을 포함하는 메신저 RNA(mRNA)가 제공되며, hMPV F 폴리펩티드 항원은 SEQ ID NO: 11과 적어도 95%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, SEQ ID NO: 11의 아미노산 서열로 이루어진다.
특정한 예시적인 구현예에서, hMPV F 폴리펩티드 항원은 융합전 F 폴리펩티드이다.
특정한 예시적인 구현예에서, ORF는 코돈 최적화된다.
특정한 예시적인 구현예에서, mRNA 분자는 적어도 하나의 5' 비번역 영역(5' UTR), 적어도 하나의 3' 비번역 영역(3' UTR), 및 적어도 하나의 폴리아데닐화(폴리(A)) 서열을 포함한다.
특정한 예시적인 구현예에서, mRNA는 적어도 하나의 화학적 변형을 포함한다.
특정한 예시적인 구현예에서, mRNA 내의 우라실 뉴클레오티드의 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100%가 화학적으로 변형된다.
특정한 예시적인 구현예에서, ORF 내의 우라실 뉴클레오티드의 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100%가 화학적으로 변형된다.
특정한 예시적인 구현예에서, 화학적 변형은 슈도우리딘, N1-메틸슈도우리딘, 2-티오우리딘, 4'-티오우리딘, 5-메틸시토신, 2-티오-l-메틸-1-데아자-슈도우리딘, 2-티오-l-메틸-슈도우리딘, 2-티오-5-아자-우리딘, 2-티오-디하이드로슈도우리딘, 2-티오-디하이드로우리딘, 2-티오-슈도우리딘, 4-메톡시-2-티오-슈도우리딘, 4-메톡시-슈도우리딘, 4-티오-l-메틸-슈도우리딘, 4-티오-슈도우리딘, 5-아자-우리딘, 디하이드로슈도우리딘, 5-메틸우리딘, 5-메틸우리딘, 5-메톡시우리딘, 및 2'-O-메틸 우리딘으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정한 예시적인 구현예에서, 화학적 변형은 슈도우리딘, N1-메틸슈도우리딘, 5-메틸시토신, 5-메톡시우리딘, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정한 예시적인 구현예에서, 화학적 변형은 N1-메틸슈도우리딘이다.
특정한 예시적인 구현예에서, mRNA는 지질 나노입자(LNP)에 제형화된다.
특정한 예시적인 구현예에서, LNP는 적어도 하나의 양이온성 지질을 포함한다. 특정한 예시적인 구현예에서, 양이온성 지질은 생분해성이다. 특정한 예시적인 구현예에서, 양이온성 지질은 생분해성이 아니다. 특정한 예시적인 구현예에서, 양이온성 지질은 절단 가능하다. 특정한 예시적인 구현예에서, 양이온성 지질은 절단 가능하지 않다.
특정한 예시적인 구현예에서, 양이온성 지질은 OF-02, cKK-E10, GL-HEPES-E3-E10-DS-3-E18-1, GL-HEPES-E3-E12-DS-4-E10, 및 GL-HEPES-E3-E12-DS-3-E14로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정한 예시적인 구현예에서, 양이온성 지질은 cKK-E10이다. 특정한 예시적인 구현예에서, 양이온성 지질은 GL-HEPES-E3-E12-DS-4-E10이다.
특정한 예시적인 구현예에서, LNP는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 접합된(PEG화된) 지질, 콜레스테롤계 지질 및 헬퍼 지질을 추가로 포함한다.
특정한 예시적인 구현예에서, LNP는 35% 내지 55%의 몰비의 양이온성 지질; 0.25% 내지 2.75%의 몰비의 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 접합된(PEG화된) 지질, 20% 내지 45%의 몰비의 콜레스테롤계 지질, 및 5% 내지 35%의 몰비의 헬퍼 지질을 포함하며, 모든 몰비는 LNP의 총 지질 함량에 상대적이다.
특정한 예시적인 구현예에서, LNP는 40%의 몰비의 양이온성 지질, 1.5%의 몰비의 PEG화된 지질, 28.5%의 몰비의 콜레스테롤계 지질, 및 30%의 몰비의 헬퍼 지질을 포함한다.
특정한 예시적인 구현예에서, PEG화된 지질은 디미리스토일-PEG2000(DMG-PEG2000) 또는 2-[(폴리에틸렌 글리콜)-2000]-N,N-디테트라데실아세트아미드(ALC-0159)이다.
특정한 예시적인 구현예에서, 콜레스테롤계 지질은 콜레스테롤이다.
특정한 예시적인 구현예에서, 헬퍼 지질은 1,2-디올레오일-SN-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE) 또는 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC)이다.
특정한 예시적인 구현예에서, LNP는 40%의 몰비의 GL-HEPES-E3-E12-DS-4-E10, 1.5%의 몰비의 DMG-PEG2000, 28.5%의 몰비의 콜레스테롤, 및 30%의 몰비의 DOPE를 포함한다.
특정한 예시적인 구현예에서, LNP는 40%의 몰비의 cKK-E10, 1.5%의 몰비의 DMG-PEG2000, 28.5%의 몰비의 콜레스테롤, 및 30%의 몰비의 DOPE를 포함한다.
특정한 예시적인 구현예에서, LNP는 30 nm 내지 200 nm의 평균 직경을 갖는다. 특정한 예시적인 구현예에서, LNP는 80 nm 내지 150 nm의 평균 직경을 갖는다.
특정한 예시적인 구현예에서, mRNA를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다. 특정한 예시적인 구현예에서, 약제학적 조성물은 백신을 포함한다.
특정한 예시적인 구현예에서, 백신을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, hMPV에 대한 면역 반응을 유발하거나 hMPV 감염으로부터 대상체를 보호하는 방법이 제공된다.
특정한 예시적인 구현예에서, 대상체는 단백질 hMPV 백신이 투여된 대상체에 비해, 백신의 투여 후 hMPV에 대한 중화 항체의 유사한 혈청 농도를 갖는다. 특정한 예시적인 구현예에서, 단백질 hMPV 백신은 아쥬반트와 공동-투여된다.
특정한 예시적인 구현예에서, 백신은 기존 hMPV 면역성을 갖는 대상체에서 중화 항체의 혈청 농도를 증가시킨다.
특정한 예시적인 구현예에서, 백신을 대상체에 투여하는 것을 포함하는, hMPV에 대한 면역 반응을 유발하거나 hMPV 감염으로부터 대상체를 보호하는데 사용하기 위한 백신이 제공된다.
특정한 예시적인 구현예에서, hMPV에 대한 면역 반응을 유발하거나 hMPV 감염으로부터 대상체를 보호하기 위한 의약의 제조에 있어 백신의 용도가 제공된다.
특정한 예시적인 구현예에서, 예방적 유효량의 F 폴리펩티드 또는 핵산 분자, 예방적 유효량의 mRNA, 또는 예방적 유효량의 백신을 대상체에 선택적으로 근육내, 비강내, 정맥내, 피하 또는 피내로 투여하는 단계를 포함하는, 면역 반응의 유발을 필요로 하는 대상체에서 면역 반응을 유발하는 방법이 제공된다.
특정한 예시적인 구현예에서, 예방적 유효량의 F 폴리펩티드 또는 핵산 분자, 예방적 유효량의 mRNA, 또는 예방적 유효량의 백신을 대상체에 선택적으로 근육내, 비강내, 정맥내, 피하 또는 피내로 투여하는 단계를 포함하는, hMPV 감염을 예방하거나 hMPV 감염의 하나 이상의 증상을 감소시키는 방법이 제공된다.
특정한 예시적인 구현예에서, F 폴리펩티드 또는 핵산 분자, 예방적 유효량의 mRNA, 또는 백신의 용도는 치료를 필요로 하는 대상체를 치료하는 데 사용하기 위한 의약의 제조를 위해 제공된다.
특정한 예시적인 구현예에서, F 폴리펩티드 또는 핵산 분자, 예방적 유효량의 mRNA, 또는 백신은 치료를 필요로 하는 대상체를 치료하는 데 사용하기 위해 제공된다.
특정한 예시적인 구현예에서, 일회-사용 또는 다회-사용 투여량의 F 폴리펩티드 또는 핵산 분자, 예방적 유효량의 mRNA, 또는 백신을 포함하는 컨테이너를 포함하는 키트가 제공되며, 선택적으로 컨테이너는 바이알 또는 사전 충전형 시린지 또는 주사기이다.
특정한 예시적인 구현예에서, F 폴리펩티드, 핵산 분자 또는 mRNA를 인코딩하는 발현 벡터가 제공된다.
특정한 예시적인 구현예에서, 발현 벡터를 포함하는 세포가 제공된다.
또 다른 양태에서, 인간 메타뉴모바이러스(hMPV) F 폴리펩티드 항원, 또는 이를 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 백신이 제공되며, F 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 7과 적어도 95% 동일성을 갖거나 SEQ ID NO: 7의 아미노산 서열로 이루어진 아미노산 서열을 포함한다.
특정한 예시적인 구현예에서, hMPV F 폴리펩티드는 융합전 F 폴리펩티드이다.
특정한 예시적인 구현예에서, 백신을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, hMPV에 대한 면역 반응을 유발하거나 hMPV 감염으로부터 대상체를 보호하는 방법이 제공된다.
특정한 예시적인 구현예에서, 백신은 아쥬반트와 공동-투여된다. 특정한 예시적인 구현예에서, 백신은 추가적인 백신과 조합하여 투여된다. 특정한 예시적인 구현예에서, 추가적인 백신은 호흡기 세포 융합 바이러스(RSV) 백신 또는 인플루엔자 백신이다.
특정한 예시적인 구현예에서, 대상체는 인간이다. 특정한 예시적인 구현예에서, 인간 대상체는 소아(infant), 유아(toddler) 또는 노인(older adult)이다.
특정한 예시적인 구현예에서, 백신은 중화 항체의 혈청 농도를 증가시키고, 대상체는 기존 hMPV 면역을 갖는다.
특정한 예시적인 구현예에서, 백신을 대상체에 투여하는 것을 포함하는, hMPV에 대한 면역 반응을 유발하거나 hMPV 감염으로부터 대상체를 보호하는데 사용하기 위한 백신이 제공된다.
특정한 예시적인 구현예에서, hMPV에 대한 면역 반응을 유발하거나 hMPV 감염으로부터 대상체를 보호하기 위한 의약의 제조에 있어 백신의 용도가 제공된다.
특정한 예시적인 구현예에서, 예방적 유효량의 백신을 대상체에 선택적으로 근육내, 비강내, 정맥내, 피하, 또는 피내로 투여하는 단계를 포함하는, 면역 반응의 유발을 필요로 하는 대상체에서 면역 반응을 유발하는 방법이 제공된다.
특정한 예시적인 구현예에서, 예방적 유효량의 백신을 대상체에 선택적으로 근육내, 비강내, 정맥내, 피하, 또는 피내로 투여하는 단계를 포함하는, hMPV 감염을 예방하거나 hMPV 감염의 하나 이상의 증상을 감소시키는 방법이 제공된다.
특정한 예시적인 구현예에서, 치료를 필요로 하는 대상체를 치료하는데 사용하기 위한 의약의 제조를 위한 백신의 용도가 제공된다.
특정한 예시적인 구현예에서, 백신은 치료를 필요로 하는 대상체를 치료하는데 사용하기 위해 제공된다.
특정한 예시적인 구현예에서, 백신의 일회-사용 또는 다회-사용 투여량을 포함하는 컨테이너를 포함하는 키트가 제공되며, 선택적으로 컨테이너는 바이알 또는 사전 충전형 시린지 또는 주사기이다.
특정한 예시적인 구현예에서, F 폴리펩티드, 핵산 분자 또는 mRNA를 인코딩하는 발현 벡터가 제공된다.
특정한 예시적인 구현예에서, 발현 벡터를 포함하는 세포가 제공된다.
본 개시내용의 전술한 특징 및 이점 그리고 다른 특징 및 이점은 첨부된 도면과 함께 예시적인 구현예의 하기 상세한 설명으로부터 보다 완전히 이해될 것이다. 본 특허 또는 출원 파일에는 컬러로 작성된 적어도 하나의 도면이 포함되어 있다. 컬러 도면(들)이 있는 본 특허 또는 특허 출원 공개의 사본은 요청 및 필요한 요금 납부 시 해당 관청에 의해 제공될 것이다.
도 1은 2개의 예시적인 작제물, D185P 및 T160_N46V로서 나타나 있는 21개의 후보 hMPV 융합전 F 항원의 패널에 대한 설계 고려를 도시한다. 작제물 D185P는 다양한 신규 작제물의 활성을 계측하기 위해 벤치마크 참조로서 사용된다. "(mut)" = 음영처리된 "ENPRRRR" 아미노산 서열 및 음영처리된 "P", 음영처리된 "V" 및 음영처리된 "F" 단일 아미노산; "링커" = 볼드체, 밑줄로 표시된 "GGGGS", "GRS" 및 "G" 아미노산 서열; "폴돈" = 밑줄로 표시된 "GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL" 아미노산 서열; "8xHIS" = 음영처리된 "HHHHHHHH" 아미노산 서열; "StrepII" = 음영처리된 "SAWSHPQFEK" 서열.
도 2는 제0일, 제21일 및 제35일에 측정된 hMPV 융합전 F 항원 단백질 작제물 중 4개에 대한 마우스 IgG 항체 역가를 도시한다(데이터 포인트는 하기와 같이 각각의 시점에서 좌측으로부터 우측으로 순서대로 나열됨): (1) A2-F D185P, (2) A2-F T160F_N46V, (3) A2-F K138F, 및 (4) A2-F G366F_K362F, 뿐만 아니라 대조군: hMPV (5) A1-F pre-F 로트 1, (6) A1-F pre-F 로트 2, (7) A1-F post F, 및 (8) B2 pre-F.
도 3은 hMPV 융합전 F 항원 단백질 작제물 중 4개에 대해 제21일 및 제35일에 측정된 마우스 hMPV 미세중화 항체 역가를 도시한다: (1) A2-F D185P, (2) A2-F T160F_N46V, (3) A2-F K138F, 및 (4) A2-F G366F_K362F뿐만 아니라 대조군: hMPV (5) A1 pre-F 로트 1, (6) A1 pre-F 로트 2, (7) A1 post F, 및 (8) B2 pre-F.
도 4는 참조 A1 단백질인 A1-A185P와 A1-postF 및 A2 단백질 항원 후보인 A2-T160F_N46V와 A2-D185P에 대한 SEC-MALS 결과를 도시한다.
도 5는 nanoDSF에 의해 측정했을 때 A1-pre-F뿐만 아니라 A1-post-F에 대한 대표적인 용융 곡선[형광 방출 330 및 350 nm에서](상단 패널), 평활화된 1차 도함수 곡선(smoothened first derivative curve)(중간 패널) 및 광 산란[mAU](하단 패널)을 도시한다.
도 6은 nanoDSF에 의해 측정했을 때 A2-D185P 및 A2-T160F_N46V 작제물로부터 유래된 단백질 샘플에 대한 대표적인 용융 곡선[형광 방출 330 및 350 nm에서](상단 패널) 및 평활화된 1차 도함수 곡선(중간 패널) 및 광 산란[mAU](하단 패널)을 도시한다.
도 7은 LNP로 제형화된 hMPV 융합전 F mRNA 작제물인 A2-D185P 또는 A2-T160F_N46V의 투여 시, 제0일, 제21일 및 제35일에 측정된 마우스 hMPV F 항원 IgG 항체 역가를 도시한다.
도 8은 LNP로 제형화된 hMPV 융합전 F mRNA 작제물인 A2-D185P 또는 A2-T160F_N46V의 투여 시, 제0일, 제21일 및 제35일에 측정된 마우스 hMPV 미세중화 항체 역가를 도시한다.
도 9는 결합 항원으로서 RSV-pre-F 단백질을 사용하는 엔드-포인트 ELISA에 의해 측정되고 토끼-항-마우스 IgG로 검출된 바와 같은, (1) RSV F mRNA; (2) RSV-F + hMPV-F mRNA; 또는 (3) RSV 단백질로 백신접종된 마우스에서의 항-RSV-F 항체의 역가를 도시한다. 개별 동물(n=8)로부터의 판독값은 D35 시점에 대해 평균 +/- 95% 신뢰 구간을 갖는 log2 변환 역가(transformed titer)로서 나타낸다.
도 10은 결합 항원으로서 hMPV-pre-F 단백질을 사용하는 엔드-포인트 ELISA에 의해 측정되고 염소-항-마우스 IgG로 검출된 바와 같은, (1) hMPV F mRNA; (2) RSV-F + hMPV-F mRNA; 또는 (3) hMPV 단백질로 백신접종된 마우스에서의 항-RSV-F 항체의 역가를 도시한다. 개별 동물(n=8)로부터의 판독값은 D35 시점에 대해 평균 +/- 95% 신뢰 구간을 갖는 log2 변환 역가로서 나타낸다.
도 11은 Vero 세포의 96-웰 플레이트 상에서 백신접종된 마우스의 연속 희석된 혈청과 혼합된 RSV A2-GFP 계통을 사용하는 미세중화 검정에 의해 측정된 바와 같은, (1) RSV F mRNA; (2) RSV-F + hMPV-F mRNA; 또는 (3) RSV 단백질로 백신접종된 마우스에서의 RSV 중화 항체 역가를 도시한다. 24-시간 인큐베이션 후 형광 초점의 역 감소를 계산함으로써 역가를 결정하였다. 개별 동물(n=8)로부터의 판독값은 D35 시점에 대해 평균 +/- 95% 신뢰 구간을 갖는 log2 변환 역가로서 나타낸다.
도 12는 Vero 세포의 96-웰 플레이트 상에서 백신접종된 마우스의 연속 희석된 혈청과 혼합된 hMPV A2-GFP 계통을 사용하는 미세중화 검정에 의해 측정된 바와 같은, (1) hMPV F mRNA; (2) RSV-F + hMPV-F mRNA; 또는 (3) hMPV 단백질로 백신접종된 마우스에서의 hMPV 중화 항체 역가를 도시한다 24-시간 인큐베이션 후 형광 초점의 역 감소를 계산함으로써 역가를 결정하였다. 개별 동물(n=8)로부터의 판독값은 D35 시점에 대해 평균 +/- 95% 신뢰 구간을 갖는 log2 변환 역가로서 나타낸다.
도 13은 1 μg mRNA로 형질감염된 30만 개의 세포/웰을 사용하여 D185P 및 T160_N46V에 대한 hMPV F 단백질 발현 수준의 면역블롯을 보여준다.
도 14는 pre-F 항체(패널 A), post-F 항체(패널 B), 또는 pre-F/post-F 항체(패널 C)를 사용하여 야생형 HMPV F, D185P, 또는 T160F_N46V로 형질감염된 세포에서의 에피토프 발현을 도시한다. 각각의 패널 A, B, C에서 상단 라인은 MNR hMPV T160F_N46V에 상응하고, 중간 라인은 MNR hMPV CAN97-83에 해당하며, 하단 라인은 MNR hMPV D185P에 상응한다.
도 15는 24명의 공여자에서 2명의 hMPV 후보의 면역원성을 평가하기 위한 hMPV MIMIC 설정을 도시한다.
도 16은 3개의 폴리오(Polio) 계통 - 폴리오 1(패널 A), 폴리오 2(패널 B) 및 폴리오 3(패널 C)에 대해 1:50 희석도의 IPOL(폴리오 백신) 또는 비처리 대조군(처리 없음 및 공동배양물에 인간 골격근 세포 없음, "항원 없음(w/o HSK)")으로 처리된 MIMIC 공동배양물의 상층액으로부터 수집된 제14일에 측정된 인간 IgG 항체 역가를 도시한다.
도 17은 RSV pre-F(패널 A) 및 RSV post-F(패널 C)에 대해 50 ng/ml RSV pre-F NP(페리틴 나노입자에 융합된 RSV pre-F 단백질) 처리로 처리된 MIMIC 공동배양물의 상층액으로부터 수집된 제14일에 측정된 인간 IgG 항체 역가를 도시한다. 패널 C는 RSV 중화 검정에서 측정했을 때 항체가 기능적인지 여부를 도시한다.
도 18은 pre-F(패널 A) 및 post-F(패널 B) 항체 반응을 그래프로 도시한다. N = 22; 95% C.I와 함께 기하 평균으로 제시된 데이터.
도 19는 pre-F 및 post-F 중화 항체 역가를 그래프로 도시한다. N = 22; 95% C.I와 함께 기하 평균으로 제시된 데이터.
도 20은 hMPV pre-F(패널 A) 또는 hMPV post-F 항원(패널 B)에 대해 실험군 - (100 ng/ml 또는 500 ng/ml의) hMPV pre-F 단백질 또는 hMPV post F 항원 단백질(100 ng/ml) 또는 대조군 - 항원 없음 w/o HSK, RSV pre-F NP, 또는 IPOL로 처리된 MIMIC 공동배양물의 상층액으로부터 수집된 제14일에 측정된 인간 IgG 항체 역가를 도시한다.
도 21은 (100 ng/ml 또는 500 ng/ml의) hMPV pre-F 단백질, hMPV post F 항원 단백질(100 ng/ml), 또는 항원 없음 w/o HSK로 처리된 MIMIC 공동배양물의 수집된 상층액을 사용하여 제14일에 측정된 hMPV 미세중화 항체 역가를 도시한다.
본 개시내용은 특히 항원성 융합전 hMPV F 폴리펩티드, 항원성 융합전 hMPV F 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열(예를 들어, RNA 서열, 예를 들어, mRNA 서열), 항원성 융합전 hMPV F 폴리펩티드를 포함하는 조성물, 항원성 융합전 hMPV F 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 조성물, 및 hMPV 백신에 관한 것이다.
I. 정의
본원에서 달리 정의되지 않는 한, 본 발명과 관련하여 사용되는 과학적 및 기술적 용어는 당업자가 일반적으로 이해하는 의미를 가질 것이다. 예시적인 방법 및 물질이 하기에 기재되어 있지만, 본원에 기재되어 있는 것들과 유사하거나 동등한 방법 및 물질도 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있다. 상충되는 경우, 정의를 포함하여 본 명세서가 우선할 것이다. 일반적으로, 본원에 기재된 세포 및 조직 배양, 분자 생물학, 바이러스학, 면역학, 미생물학, 유전학, 분석 화학, 합성 유기 화학, 의약 및 약 화학, 단백질 및 핵산 화학, 및 혼성화와 관련하여 사용되는 명명법 및 이들의 기법은 당업계에 잘 알려져 있고 흔히 사용되는 것들이다. 효소 반응 및 정제 기법은 당업계에서 일반적으로 달성되는 바와 같이 또는 본원에 기재된 바와 같이, 제조업체의 사양서에 따라 수행된다. 또한, 문맥상 달리 요구되지 않는 한, 단수형 용어는 복수를 포함할 것이고, 복수형 용어는 단수형을 포함할 것이다. 본 명세서 및 구현예 전반에 걸쳐, 단어 "갖다(have)" 및 "포함하다(comprise)", 또는 "갖는다(has)", "갖는(having)", "포함한다(comprises)", 또는 "포함하는(comprising)"과 같은 변형은 언급된 정수 또는 정수의 그룹을 포함하되, 임의의 다른 정수 또는 정수의 그룹을 배제하지 않음을 암시하는 것으로 이해될 것이다. 본원에 언급된 모든 간행물 및 다른 참고문헌은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다. 다수의 문헌이 본원에 인용되지만, 이러한 인용은 임의의 이들 문헌이 당업계의 통상적인 일반 지식의 일부를 형성함을 인정하는 것으로 간주되지 않는다.
단수형("a" 또는 "an") 엔티티는 그 엔티티 중 하나 이상을 지칭한다는 것에 유의해야 하며, 예를 들어 "뉴클레오티드 서열"은 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 나타내는 것으로 이해된다. 따라서, 단수형 용어("a" (또는 "an")), 용어 "하나 이상" 및 "적어도 하나"는 본원에서 상호교환 가능하게 사용될 수 있다.
추가로, 본원에 사용되는 "및/또는"은 다른 것의 유무와 상관없이 2개의 명시된 특징 또는 구성요소 각각의 특정 개시내용으로서 간주되어야 한다. 그러므로, 본원에서 "A 및/또는 B"와 같은 문구에 사용된 바와 같은 용어 "및/또는"은 "A 및 B", "A 또는 B", "A"(단독) 및 "B"(단독)를 포함하기 위한 것이다. 마찬가지로, "A, B 및/또는 C"와 같은 문구에 사용된 바와 같은 용어 "및/또는"은 하기 양태 각각을 포괄하기 위한 것이다: A, B, 및 C; A, B, 또는 C; A 또는 C; A 또는 B; B 또는 C; A 및 C; A 및 B; B 및 C; A(단독); B(단독); 및 C(단독).
본원의 양태가 "포함하는(comprising)"이라는 말을 사용하여 기재되는 경우, "이루어진(consisting of)" 및/또는 "본질적으로 이루어진(consisting essentially of)"이라는 측면에서 기재된 다른 유사한 양태도 제공되는 것으로 이해된다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 개시내용과 관련된 분야의 당업자가 흔히 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 예를 들어, 문헌[Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2nd ed., 2002, CRC Press]; 문헌[The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3rd ed., 1999, Academic Press]; 및 문헌[Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology, Revised, 2000, Oxford University Press]은 당업자에게 본 개시내용에 사용된 많은 용어의 일반 사전을 제공할 수 있다.
단위, 접두사, 및 기호는 그에 관한 국제 단위계(SI)에서 허용된 형식으로 표시된다. 숫자 범위는 해당 범위를 정의하는 숫자를 포함한다. 달리 명시되지 않는 한, 아미노산 서열은 아미노에서 카복시 배향으로 좌측에서 우측으로 기재된다. 본원에 제공된 표제는 본 개시내용의 다양한 양태를 제한하는 것이 아니다. 따라서, 바로 아래에 정의된 용어는 본 명세서 전체를 참조하여 더욱 완전하게 정의된다.
용어 "대략" 또는 "약"은 본원에서 거의, 가량 또는 ~한 정도를 의미하기 위해 사용된다. 용어 "약"이 수치 범위와 함께 사용되는 경우, 이는 제시된 수치값의 위와 아래로 경계를 확장하여 그 범위를 수식한다. 일반적으로, 용어 "약"은 예를 들어 10 퍼센트 위 또는 아래의(더 높거나 더 낮은) 변량만큼 언급된 값보다 높은 및 낮은 수치값을 수식할 수 있다. 일부 구현예에서, 용어는 표시된 수치값으로부터 ±10%, ±5%, ±4%, ±3%, ±2%, ±1%, ±0.9%, ±0.8%, ±0.7%, ±0.6%, ±0.5%, ±0.4%, ±0.3%, ±0.2%, ±0.1%, ±0.05%, 또는 ±0.01%만큼의 편차를 나타낸다. 일부 구현예에서, "약"은 표시된 수치값으로부터 ±10%만큼의 편차를 나타낸다. 일부 구현예에서, "약"은 표시된 수치값으로부터 ±5%만큼의 편차를 나타낸다. 일부 구현예에서, "약"은 표시된 수치값으로부터 ±4%만큼의 편차를 나타낸다. 일부 구현예에서, "약"은 표시된 수치값으로부터 ±3%만큼의 편차를 나타낸다. 일부 구현예에서, "약"은 표시된 수치값으로부터 ±2%만큼의 편차를 나타낸다. 일부 구현예에서, "약"은 표시된 수치값으로부터 ±1%만큼의 편차를 나타낸다. 일부 구현예에서, "약"은 표시된 수치값으로부터 ±0.9%만큼의 편차를 나타낸다. 일부 구현예에서, "약"은 표시된 수치값으로부터 ±0.8%만큼의 편차를 나타낸다. 일부 구현예에서, "약"은 표시된 수치값으로부터 ±0.7%만큼의 편차를 나타낸다. 일부 구현예에서, "약"은 표시된 수치값으로부터 ±0.6%만큼의 편차를 나타낸다. 일부 구현예에서, "약"은 표시된 수치값으로부터 ±0.5%만큼의 편차를 나타낸다. 일부 구현예에서, "약"은 표시된 수치값으로부터 ±0.4%만큼의 편차를 나타낸다. 일부 구현예에서, "약"은 표시된 수치값으로부터 ±0.3%만큼의 편차를 나타낸다. 일부 구현예에서, "약"은 표시된 수치값으로부터 ±0.1%만큼의 편차를 나타낸다. 일부 구현예에서, "약"은 표시된 수치값으로부터 ±0.05%만큼의 편차를 나타낸다. 일부 구현예에서, "약"은 표시된 수치값으로부터 ±0.01%만큼의 편차를 나타낸다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "메신저 RNA" 또는 "mRNA"는 적어도 하나의 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같은 mRNA는 변형된 RNA 및 변형되지 않은 RNA 둘 모두를 포괄한다. mRNA는 하나 이상의 코딩 및 비코딩 영역을 함유할 수 있다. 코딩 영역은 대안적으로 오픈 리딩 프레임(ORF)으로 지칭된다. mRNA의 비코딩 영역은 5' 캡, 5' 비번역 영역(UTR), 3' UTR 및 폴리(A) 꼬리를 포함한다. mRNA는 자연 공급원으로부터 정제될 수 있으며, 재조합 발현 시스템(예를 들어, 시험관내 전사)을 사용하여 생산되고 선택적으로 정제되거나 화학적으로 합성될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "항원성 부위 Ø" 또는 "부위 Ø 에피토프"는 hMPV F 삼량체의 융합전 형태로 위치하는 부위를 지칭한다. 부위 Ø 에피토프는 융합전 hMPV F에 대해 특이성을 갖는 항체의 결합 부위이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "항원성 부위 V" 또는 "부위 V 에피토프"는 hMPV F 삼량체의 융합전 형태로 위치하는 부위를 지칭한다. 부위 V 에피토프는 융합전 hMPV F에 대해 특이성을 갖는 항체에 대한 결합 부위이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "항원 안정성"은 시간 경과에 따른 또는 용액 내에서의 항원의 안정성을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "캐비티 충전 치환(cavity filling substitution)"은 융합전 hMPV F 삼량체에 존재하는 캐비티를 충전하기 위한 조작된 소수성 치환을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "F 단백질" 또는 "hMPV F 단백질"은 바이러스 진입 동안 바이러스 피막과 숙주 세포막의 융합을 매개하는 데 관여하는 hMPV의 단백질을 지칭한다. F 단백질은 감염된 세포와 비-감염된 세포 사이의 융합을 매개하여 다핵 세포 또는 합포체를 형성할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "hMPV F 폴리펩티드", "F 폴리펩티드", 또는 "F 폴리펩티드 항원"은 hMPV F 단백질의 적어도 하나의 에피토프를 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "막관통 도메인"은 hMPV 비리온의 막을 가로지르는 hMPV F0/F1의 c-말단 부근의 대략 23개 아미노산 서열을 지칭한다. 특정한 구현예에서, 막관통 도메인은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열 GFIIVIILIAVLGSSMILVSIFII를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "세포질 꼬리"는 비리온 내부에 위치하는 hMPV F0/F1의 c-말단에 있는 대략 25개 아미노산 서열을 지칭한다. 특정한 구현예에서, 막관통 도메인은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열 IKKTKKPTGAPPELSGVTNNGFIPHN을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "폴돈 도메인"은 T4 피브리틴의 삼량체화 도메인을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, "신호 펩티드" 또는 "신호 서열"은 폴리펩티드를 소포체 및 골지체에서 분비 경로로 전좌시키는 기능을 하는, 폴리펩티드의 아미노-말단 또는 카복시-말단에 존재하는 대략 16개 내지 30개 아미노산 길이의 펩티드를 지칭한다. 특정한 구현예에서, 신호 서열은 SEQ ID NO: 1, 3, 5 및 7 중 임의의 하나의 아미노산 1 내지 18에 상응한다.
본원에 사용된 바와 같이, "태그 서열" 또는 "친화성 태그"는 태그 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 단백질을 정제하는 데 사용될 수 있는 폴리펩티드 서열을 지칭한다. 태그 서열은 예를 들어, 폴리히스티딘-태그(예를 들어 헥사히스티딘(6x His 태그), 옥타히스티딘(8x His 태그) 등), 글루타티온 S-트랜스퍼라제(GST), FLAG, 스트렙타비딘-결합 펩티드(SBP), strep II, 말토스-결합 단백질(MBP), 칼모듈린-결합 단백질(CBP), 키틴-결합 도메인(CBD), RNase A의 S 단백질, 헤마글루티닌(HA), c-Myc 등을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "프로토머-내 안정화 치환"은 hMPV F 삼량체의 프로토머 내의 상호작용을 안정화시킴으로써 융합전 입체형태를 안정화시키는 hMPV F에서의 아미노산 치환을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "프로토머-간 안정화 치환"은 hMPV F 삼량체의 프로토머가 서로 상호작용하는 것을 안정화시킴으로써 융합전 입체형태를 안정화시키는 hMPV F에서의 아미노산 치환을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "프로테아제 절단"은 폴리펩티드 서열의 프로테아제 절단 부위에서 취약한 잔기(예를 들어 라이신 또는 아르기닌)의 단백질분해(때때로 "클립핑(clipping)"으로도 지칭됨)를 지칭한다. 프로테아제 절단 부위는 예를 들어, hMPV F0 프로테아제 절단 부위, 호흡기 세포 융합 바이러스(RSV) F0 프로테아제 절단 부위 및 인간 리노바이러스 3C(HRV-3C) 프로테아제 절단 부위와 같은 바이러스 프로테아제 절단 부위를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, hMPV F와 관련하여 용어 "융합후"는 바이러스 및 숙주 세포막의 병합 후에 발생하는 hMPV F의 안정한 입체형태를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, hMPV F와 관련하여 용어 "융합전"은 바이러스-세포 상호작용 전에 채택된 hMPV F의 입체형태를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "프로토머"는 올리고머 단백질의 구조 단위를 지칭한다. hMPV F의 경우, hMPV F 삼량체의 개별 단위는 프로토머이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "면역 반응"은 항원 또는 백신과 같은 자극에 대한 면역계의 세포, 예컨대 B 세포, T 세포, 수지상 세포, 대식세포 또는 폴리모르포뉴클레오사이트(polymorphonucleocyte)의 반응을 지칭한다. 면역 반응은, 예를 들어 인터페론 또는 사이토카인을 분비하는 상피 세포를 포함하여, 숙주 방어 반응과 관련된 신체의 임의의 세포를 포함할 수 있다. 면역 반응은 선천성 및/또는 적응성 면역 반응을 포함하지만 이로 제한되지 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, "보호 면역 반응"은 감염으로부터 대상체를 보호하는(예를 들어 감염을 예방하거나 감염과 연관된 질환의 발생을 예방하는) 면역 반응을 지칭한다. 면역 반응을 측정하는 방법은, 예를 들어 림프구(예컨대 B 또는 T 세포)의 증식 및/또는 활성, 사이토카인 또는 케모카인의 분비, 염증, 항체 생산 등을 측정하는 단계를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "항체 반응"은 항체가 생산되는 면역 반응이다.
본원에 사용된 바와 같이, "항원"은 면역 반응을 유발하는 제제, 및/또는 (예를 들어 MHC 분자에 의해 제시될 때) T 세포 수용체에 의해 결합되거나, 유기체에 노출되거나 투여될 때 (예를 들어 B 세포에 의해 생산되는) 항체에 결합되는 제제를 지칭한다. 일부 구현예에서, 항원은 유기체에서 체액성 반응(예를 들어 항원-특이적 항체의 생산을 포함함)을 유발한다. 대안적으로 또는 추가적으로, 일부 구현예에서, 항원은 유기체에서 (예를 들어 항원과 특이적으로 상호작용하는 수용체를 갖는 T-세포를 수반하는) 세포 반응을 유발한다. 특정 항원은 표적 유기체(예를 들어 마우스, 토끼, 영장류, 인간)의 하나의 또는 몇몇 구성원에서 면역 반응을 유발할 수 있으나, 표적 유기체 종의 모든 구성원에서 그러한 것은 아니다. 일부 구현예에서, 항원은 표적 유기체 종의 구성원 중 적어도 약 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%에서 면역 반응을 유발한다. 일부 구현예에서, 항원은 항체 및/또는 T 세포 수용체에 결합하고, 유기체에서 특정 생리학적 반응을 유도할 수 있거나 유도하지 않을 수 있다. 일부 구현예에서, 예를 들어 항원은 이러한 상호작용이 생체내에서 발생하는지 여부에 관계없이 시험관내에서 항체 및/또는 T 세포 수용체에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 항원은 특정 체액성 또는 세포성 면역의 생성물과 반응한다. 항원은 본원에 기재된 바와 같이 hMPV 폴리펩티드를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "아쥬반트"는 항원에 대한 면역 반응을 강화하는 물질 또는 비히클을 지칭한다. 아쥬반트는 항원이 흡착된 미네랄(예를 들어 알룸, 알루미늄 하이드록사이드 또는 포스페이트)의 현탁액; 항원 용액이 미네랄 오일 또는 물에 유화된 유중수 또는 수중유 에멀션(예를 들어 프로인트 불완전 아쥬반트)을 비제한적으로 포함할 수 있다. 때때로, 항원성을 추가로 강화하기 위해, 살해된 마이코박테리아가 포함된다(예를 들어 프로인트 완전 아쥬반트). 면역-자극성 올리고뉴클레오티드(예를 들어 CpG 모티프) 또한 아쥬반트로서 사용될 수 있다(예를 들어 미국 특허 제6,194,388호; 제6,207,646호; 제6,214,806호; 제6,218,371호; 제6,239,116호; 제6,339,068호; 제6,406,705호; 및 제6,429,199호 참조). 아쥬반트는 또한 톨-유사 수용체(TLR) 작용제 및 공동자극 분자와 같은 생물학적 분자를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "항원성 hMPV 폴리펩티드"는 분자가 hMPV에 대해 항원성인 충분한 길이의 hMPV 아미노산 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, "대상체"는 동물계의 임의의 구성원을 지칭한다. 일부 구현예에서, "대상체"는 인간을 지칭한다. 일부 구현예에서, "대상체"는 비인간 동물을 지칭한다. 일부 구현예에서, 대상체는 포유류, 조류, 파충류, 양서류, 어류, 곤충 및/또는 벌레를 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 특정한 구현예에서, 비인간 대상체는 포유류(예를 들어 설치류, 마우스, 래트, 토끼, 원숭이, 개, 고양이, 양, 소, 영장류 및/또는 돼지)이다. 일부 구현예에서, 대상체는 트랜스제닉 동물, 유전자 조작 동물 및/또는 클론일 수 있다. 일부 구현예에서, 용어 "개체" 또는 "환자"가 사용되고, "대상체"와 상호교환 가능한 것으로 하고자 한다.
일부 구현예에서, "대상체"는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다: 65세 이상의 대상체, 18세 내지 64세(18세 내지 <65세)의 대상체, 12세 이상의 대상체, 12세 내지 17세(12세 내지 <18세)의 대상체, 6세 내지 11세(6세 내지 <12세)의 대상체, 2세 내지 5세(2세 내지 <6세)의 대상체, 1세 내지 4세(1세 내지 <5세)의 대상체, 2개월령 내지 1세(2개월령 내지 <2세)의 대상체, 및 0개월령 내지 2개월령(0개월령 내지 <3개월령)의 대상체.
일부 구현예에서, "대상체"는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다: 노인(예를 들어 시니어 또는 고령의 성인), 성인, 청소년, 어린이, 유아 및 소아. 일부 구현예에서, "대상체"는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다: 60세 이상의 노인, 고령자(예를 들어 65세 이상), 성인(예를 들어 18세 내지 50세 또는 18세 내지 64세), 12세 내지 17세(예를 들어 12세 내지 <18세)의 청소년, 6세 내지 11세(예를 들어 6세 내지 <12세)의 어린이, 2세 내지 5세(예를 들어 2세 내지 <6세)의 어린이, 1세 내지 4세(예를 들어 1세 내지 <5세)의 유아, 2개월령 내지 1세(예를 들어 2개월령 내지 <2세)의 소아, 신생아(예를 들어 0일령 내지 27일령), 및 조기분만아(예를 들어 37주 미만의 재태기간). 일부 구현예에서, 대상체는 미국 FDA에 의해 정의된 바와 같이 소아 나이(pediatric age) 그룹 내에 있다: 신생아(예를 들어 출생 내지 1개월령 미만("NEO"); 소아(예를 들어 1개월령 내지 2세 미만("INF")); 어린이(예를 들어 2세 내지 12세 미만("CHI")); 및 청소년(예를 들어 12세 내지 17세 미만("ADO")). 일부 구현예에서, 대상체는 미국 FDA에 의해 정의된 바와 같은 연령 그룹에서 노인이며, 65세 이상 또는 75세 이상이다. 특히 예시적인 구현예에서, 대상체는 소아(예를 들어 1개월령 내지 2세 미만), 유아(예를 들어 1세 내지 <5세), 또는 노인(예를 들어 60세 이상, 65세 이상 또는 75세 이상)이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "백신접종" 또는 "백신접종하다"는, 예를 들어 질환을 야기하는 물질(disease-causing agent)에 대한 면역 반응을 생성하기 위한 조성물의 투여를 지칭한다. 백신접종은 질환을 야기하는 물질, 및/또는 하나 이상의 증상의 발생에 노출되기 전에, 노출되는 동안 및/또는 노출된 후에, 그리고 일부 구현예에서는 질환을 야기하는 물질에 노출되기 전에, 노출되는 동안 및/또는 노출된 직후에 시행될 수 있다. 일부 구현예에서, 백신접종은 적절하게 또는 적합하게 시간 간격을 두고 백신접종 조성물을 다회 투여하는 것을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "치료제(therapeutic)" 또는 "치료제"는 hMPV 감염의 하나 이상의 증상을 완화하거나 제거하도록 의도된 조성물의 투여를 지칭한다. 치료제는 hMPV에 대한 노출 전, 동안 및/또는 후에, 및/또는 하나 이상의 증상의 발생 전, 동안 및/또는 후에 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 치료제는 백신접종 조성물의 적절하게 또는 적합하게 시간적으로 간격을 두고 다회 투여로서 대상체에 제공된다.
본 개시내용은 각각 주어진 핵산 서열 또는 아미노산 서열(예를 들어 참조 서열)과 특정한 정도의 동일성을 갖는 핵산 서열(예를 들어 DNA 및 RNA 서열) 및 아미노산 서열을 기재한다.
용어 "동일한 %", "동일성 %" 또는 유사한 용어는 특히 비교될 서열들 사이의 최적 정렬에서 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산의 백분율을 지칭하기 위한 것이다. 2개의 핵산 서열 사이의 "서열 동일성"은 이러한 서열들 사이에서 동일한 뉴클레오티드의 백분율을 나타낸다. 2개의 아미노산 서열 사이의 "서열 동일성"은 이러한 서열들 사이에서 동일한 아미노산의 백분율을 나타낸다. 상기 백분율은 순전히 통계적이며, 2개의 서열 간의 차이는 비교될 서열의 전체 길이에 걸쳐 무작위로 분포될 수 있지만 반드시 그런 것은 아니다. 2개의 서열의 비교는 통상 상응하는 서열의 국소 영역을 식별하기 위해, 분절 또는 "비교 창"에 대해 최적 정렬 후에 상기 서열을 비교함으로써 수행된다. 비교를 위한 최적 정렬은 수동으로 수행될 수 있거나, 문헌[Smith and Waterman, 1981, Ads App. Math. 2, 482]의 국소적 상동성 알고리즘의 도움을 받아, 문헌[Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48, 443]의 국소적 상동성 알고리즘의 도움을 받아, 문헌[Pearson and Lipman, 1988, Proc. Natl Acad. Sci. USA 88, 2444]의 유사성 검색 알고리즘의 도움을 받아, 또는 상기 알고리즘을 이용하는 컴퓨터 프로그램(위스콘신 제네틱스 소프트웨어 패키지(Wisconsin Genetics Software Package) 내의 GAP, BESTFIT, FASTA, BLAST P, BLAST N 및 TFASTA, 미국 위스콘신주 매디슨 사이언스 드라이브 575 소재의 Genetics Computer Group)의 도움을 받아 수행될 수 있다.
동일성 백분율은 비교될 서열과 상응하는 동일한 위치의 수를 결정하고, 이 수를 비교된 위치의 수(예를 들어 참조 서열에서의 위치의 수)로 나누고, 이 결과에 100을 곱함으로써 얻어진다.
일부 구현예에서, 동일성 정도는 참조 서열의 전체 길이의 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90% 또는 약 100%인 영역에 대해 주어진다. 예를 들어, 참조 핵산 서열이 200개의 뉴클레오티드로 이루어진 경우, 동일성 정도는 적어도 약 100개, 적어도 약 120개, 적어도 약 140개, 적어도 약 160개, 적어도 약 180개 또는 약 200개의 뉴클레오티드에 대해, 일부 구현예에서는 연속 뉴클레오티드에 주어진다. 일부 구현예에서, 동일성 정도는 참조 서열의 전체 길이에 대해 주어진다.
주어진 핵산 서열 또는 아미노산 서열과 각각 특정한 동일성 정도를 갖는 핵산 서열 또는 아미노산 서열은 상기 주어진 서열의 적어도 하나의 기능적 특성을 가질 수 있으며, 예를 들어 일부 경우에는 상기 주어진 서열과 기능적으로 동등하다. 일부 구현예에서, 주어진 핵산 서열 또는 아미노산 서열과 특정한 동일성 정도를 갖는 핵산 서열 또는 아미노산 서열은 상기 주어진 서열과 기능적으로 동등하다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "키트"는 하나 이상의 화합물 또는 조성물과 같은 관련 구성요소 및 용매, 용액, 완충액, 설명서 또는 건조제와 같은 하나 이상의 관련 물질의 패키지 세트를 지칭한다.
II. hMPV F 폴리펩티드 항원
인간 메타뉴모바이러스(hMPV)는 파라믹소바이러스과 내의 뉴모바이러스 서브패밀리에 속하는 음성-센스, 단일-가닥 RNA 바이러스이다. hMPV는 코 및 폐에서 기도 상피 세포를 감염시키고, 어린 아이들에서 호흡기 세포 융합 바이러스(RSV) 후 하기도 감염(lower respiratory infection)의 두 번째로 가장 통상적인 원인이다. hMPV는 비리온 표면 상에 당단백질(G 단백질), 작은 소수성 단백질(SH 단백질) 및 융합 단백질(F 단백질)이 있는 피막 바이러스이다.
이는 피막 바이러스이므로, 숙주 세포 내로의 hMPV의 진입은 바이러스 및 세포막의 융합을 필요로 한다. 파라믹소바이러스 진입에는 일반적으로 2개의 바이러스 당단백질인 융합(F) 및 부착(G, H 또는 HN) 단백질이 필요하며, 검사된 모든 파라믹소바이러스 당단백질에 의해 촉진되는 막 융합은 한 가지 가능한 예외(즉, SER 바이러스)를 제외하고 중성 pH에서 발생한다. 바이러스-세포막 융합에 더하여, 파라믹소바이러스 당단백질은 또한 세포-세포 융합을 촉진한다. 합포체라고도 하는 다핵 거대 세포는 다양한 파라믹소바이러스에 의해 감염된 조직에서 발견될 수 있다. hMPV에 감염된 배양된 세포는 합포체를 형성하지만, hMPV에 감염된 일차 인간 기도 상피 세포의 검사는 이 바이러스에 의한 합포체 형성이 통상적인 생체내 발생은 아닐 수 있음을 시사한다.
hMPV F는, 융합이 적격하게 되도록 절단될 필요가 있는 불활성 전구체(F0)로서 합성되는 클래스 I 융합 당단백질이다. 단백질 분해 절단은, 동형삼량체로 조립되는 2개의 디설파이드-연결 하위단위(F1에 대해 N-말단의 F2)를 생성한다. 절단은 소수성 융합 펩티드의 바로 업스트림에 있는 일염기성(monobasic) 절단 부위에서 발생한다. 절단은 조직 배양물에서 외인성 트립신을 배지에 추가함으로써 또는 퓨린-발현 플라스미드를 추가함으로써 달성될 수 있다. 그러나, 생체내에서는 다른 세린 프로테아제, 예컨대 TMPRSS2가 절단을 위해 더 적절할 가능성이 있는 것으로 여겨진다. F 삼량체는 준안정 "융합전" 또는 "pre-F" 입체형태에서 바이러스 입자 내로 혼입된다. 막 융합을 개시하기 위해, hMPV F는 활성화되고, 막 융합을 구동하고 고도로 안정한 "융합후" 또는 "post-F" 입체형태를 채택하는 hMPV F를 초래하는, F 단백질에서의 일련의 단계적 입체형태 변화를 거친다.
특정한 예시적인 구현예에서, F0의 단백질 분해 절단은 hMPV F 폴리펩티드를 인코딩하는 플라스미드와 퓨린을 인코딩하는 플라스미드를 4:1 비의 hMPV 플라스미드: 퓨린 플라스미드에서 공동 형질감염시킴으로써 달성된다.
hMPV F 폴리펩티드를 포함하는 항원성 hMPV 폴리펩티드가 본원에 제공된다. hMPV F 폴리펩티드는 hMPV F의 서열 전체 또는 hMPV F의 일부를 포함할 수 있다. 특정한 구현예에서, 일부는 엑토도메인이다.
일부 구현예에서, hMPV F 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 1, 3, 5 및 7 중 임의의 하나와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 99.5%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, hMPV F 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 1, 3, 5 및 7 중 임의의 하나의 폴리펩티드와 적어도 80%의 동일성을 갖는 변형된 hMPV F 폴리펩티드를 포함하며, hMPV F 폴리펩티드는 항원성이다.
일부 구현예에서, hMPV F 폴리펩티드는 F 단백질의 엑토도메인 부분만 포함한다.
A2-CAN97-83에 대한 F0의 아미노산 서열은 하기와 같다:
Figure pct00001
(수탁 AAN52910; 버전 AAN52910.1; DB 공급원 수탁 AY145296.1.) 막관통 도메인은 볼드체 및 밑줄로 표시되어 있고, 세포질 꼬리는 볼드체로 표시되어 있다.
A2-CAN97-83에 대한 F0의 뉴클레오티드 서열은 하기와 같다:
Figure pct00002
Figure pct00003
일부 구현예에서, pre-F와 post-F 사이에서 공유되는 hMPV F 단백질의 에피토프는 차단되어 있다. 에피토프를 차단하는 것은, 항원성 hMPV F 폴리펩티드를 인코딩하는 RNA(예를 들어 mRNA)가 대상체에게 투여될 때 또는 항원성 hMPV F 폴리펩티드가 대상체에게 투여될 때 에피토프에 대한 항체의 생성을 저하시키거나 없앤다. 이는 융합전 입체형태과 같은 F의 특정 입체형태에 특이적인 에피토프를 표적화하는 항체(예를 들어 부위 Ø 및/또는 부위 V를 표적화하는 항체)의 비율을 증가시킬 수 있다. F는 아직 세포에 진입하지 않은 바이러스에서 융합전 입체형태를 갖기 때문에, pre-F를 표적화하는 항체의 증가된 비율은 더 높은 중화도를 제공할 수 있다(예를 들어 본원에 기재된 바와 같이 중화 대 결합 비로 표현됨).
본원에 기재된 hMPV F 폴리펩티드는 야생형 hMPV F 단백질(예를 들어 SEQ ID NO: 1)에 비해 결실 또는 치환을 가질 수 있다.
예를 들어, 특정한 구현예에서, hMPV 폴리펩티드는 (a) 막관통 도메인을 결여하며 세포질 꼬리를 결여하고, 인간 리노바이러스 3C(HRV-3C) 프로테아제 절단 부위를 포함하고/하거나; (b) SEQ ID NO: 1에 비해 아미노산 위치 100에서 글루타민을 아르기닌으로 대체하고, 아미노산 위치 101에서 세린을 아르기닌으로 대체하는, 아미노산 치환 Q100R 및 S101R을 포함하는 F0 절단 부위 돌연변이를 포함하고/하거나; (c) 이종성 신호 펩티드를 포함하고/하거나; (d) 선택적으로 폴리히스티딘-태그(예를 들어 6x His 태그, 8x His 태그 등) 및/또는 Strep II 태그인 적어도 하나의 태그 서열을 포함하고/하거나; (e) 폴돈 도메인을 포함한다.
특정한 구현예에서, hMPV 폴리펩티드는 막관통 도메인을 결여하며 세포질 꼬리를 결여하고, SEQ ID NO: 1에 비해 아미노산 위치 100에서 글루타민을 아르기닌으로 대체하고, 아미노산 위치 101에서 세린을 아르기닌으로 대체하는, 아미노산 치환 Q100R 및 S101R을 포함하는 F0 절단 부위 돌연변이; 인간 리노바이러스 3C(HRV-3C) 프로테아제 절단 부위; 이종성 신호 펩티드; 폴리히스티딘-태그(예를 들어 6x His 태그, 8x His 태그 등) 및/또는 Strep II 태그; 및 폴돈 도메인을 포함한다.
특정한 구현예에서, hMPV 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 1의 위치 185에서 발린, 알라닌, 글리신, 이소류신, 류신 또는 프롤린 치환을 포함한다.
특정한 구현예에서, hMPV 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 1의 위치 160에서 페닐알라닌, 트립토판, 티로신, 발린, 알라닌, 이소류신 또는 류신 치환, 및/또는 SEQ ID NO: 1의 위치 46에서 발린, 알라닌, 이소류신, 류신, 페닐알라닌, 티로신 또는 프롤린 치환을 포함한다.
특정한 구현예에서, hMPV 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 1의 위치 160에서의 치환, 및 SEQ ID NO: 1의 위치 46에서의 치환을 포함하며, 치환은 hMPV 폴리펩티드의 3차 및/또는 4차 구조를 안정화시키는 "안정화 치환"이다. 안정화 치환은 소수성 아미노산(예를 들어 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 프롤린 및 메티오닌); 친수성 아미노산(예를 들어 시스테인, 세린, 트레오닌, 아스파라긴 및 글루타민); 디설파이드 결합을 형성하는 아미노산(예를 들어 시스테인); 수소 결합을 형성하는 아미노산(예를 들어 트립토판, 히스티딘, 티로신 및 페닐알라닌); 하전된 아미노산(예를 들어 아스파르트산, 글루탐산, 아르기닌, 라이신 및 히스티딘) 등의 치환을 포함하지만 이로 제한되지 않는다.
특정한 구현예에서, hMPV 폴리펩티드는 A 계통 hMPV(예를 들어, A1 아형 또는 A2 아형) 또는 B 계통 hMPV(예를 들어, B1 아형 또는 B2 아형)로부터의 것이다.
특정한 구현예에서,
Figure pct00004
로 제시된 "백본" F0 폴리펩티드 서열을 포함하는 아미노산 서열이 제공된다.
특정한 구현예에서,
Figure pct00005
Figure pct00006
로 제시된 "백본" F0 폴리펩티드 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이 제공된다.
특정한 구현예에서, hMPV 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 3으로 제시된 "백본" hMPV 서열을 포함하고, 선택적으로 하나 이상의 아미노산 치환을 함유할 수 있다. 예를 들어, 특정한 구현예에서, hMPV 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 3의 위치 185에서 발린, 알라닌, 글리신, 이소류신, 류신 또는 프롤린 치환을 포함한다. 특정한 구현예에서, hMPV 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 3의 위치 160에서 페닐알라닌, 트립토판 또는 티로신 치환, 및/또는 SEQ ID NO: 3의 위치 46에서 발린, 알라닌, 글리신, 이소류신, 류신 또는 프롤린 치환을 포함한다. 특정한 구현예에서, hMPV 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 3의 위치 100 및 101 중 하나 또는 그 둘 모두에서 아르기닌 치환을 포함한다.
특정한 구현예에서, hMPV 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 3과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는다.
특정한 구현예에서,
Figure pct00007
Figure pct00008
로 제시된 hMPV 폴리펩티드 서열을 포함하는 아미노산 서열이 제공된다. (소문자 아미노산은 링커, 폴돈 모티프, 링커, HRV-3C 절단 부위, 링커, 8X-His-태그 및 strep-태그 II 영역을 의미함.)
특정한 구현예에서,
Figure pct00009
로 제시된 hMPV 폴리펩티드 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이 제공된다.
특정한 구현예에서,
Figure pct00010
로 제시된 hMPV 폴리펩티드 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이 제공된다.
특정한 구현예에서, hMPV 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 5와 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는다. 특정한 구현예에서, hMPV 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 5를 포함한다. 특정한 구현예에서, hMPV 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 6과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는다. 특정한 구현예에서, hMPV 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 6을 포함한다. 특정한 구현예에서, hMPV 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 17과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는다. 특정한 구현예에서, hMPV 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 17을 포함한다.
특정한 구현예에서,
Figure pct00011
로 제시된 hMPV 폴리펩티드 서열을 포함하는 아미노산 서열이 제공된다. (소문자 아미노산은 링커, 폴돈 모티프, 링커, HRV-3C 절단 부위, 링커, 8X-His-태그 및 strep-태그 II 영역을 의미함.)
특정한 구현예에서,
Figure pct00012
Figure pct00013
로 제시된 hMPV 폴리펩티드 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이 제공된다.
특정한 구현예에서,
Figure pct00014
Figure pct00015
로 제시된 hMPV 폴리펩티드 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이 제공된다.
특정한 구현예에서,
Figure pct00016
로 제시된 hMPV 폴리펩티드 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이 제공된다.
특정한 구현예에서, hMPV 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 7과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는다. 특정한 구현예에서, hMPV 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 7을 포함한다. 특정한 구현예에서, hMPV 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 8과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는다. 특정한 구현예에서, hMPV 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 8을 포함한다. 특정한 구현예에서, hMPV 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 18과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는다. 특정한 구현예에서, hMPV 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 18을 포함한다. 특정한 구현예에서, hMPV 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 8과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는다. 특정한 구현예에서, hMPV 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 8을 포함한다. 특정한 구현예에서, hMPV 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 19와 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는다. 특정한 구현예에서, hMPV 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 19를 포함한다.
일반적으로, 본원에 기재된 작제물에서의 위치는, 예를 들어 표준 매개변수(EBLOSUM62 매트릭스, 갭 페널티 10, 갭 확장 페널티 0.5)와 함께 Needleman-Wunsch 알고리즘을 사용하여, 쌍 정렬에 의해 참조 서열, 예를 들어 SEQ ID NO: 1의 야생형 서열 또는 SEQ ID NO: 3의 백본 서열 상으로 맵핑될 수 있다.
III. 재조합 hMPV F 폴리펩티드 항원
특정한 구현예에서, 본 개시내용의 hMPV 백신은 적어도 하나의 hMPV F 폴리펩티드 항원을 포함할 수 있다. 본 개시내용의 hMPV F 폴리펩티드 항원은 다양한 방법에 의해 제조될 수 있다. 일 구현예에서, 진핵생물 또는 원핵생물 기원일 수 있는 숙주 세포주는 hMPV F 폴리펩티드의 발현을 위해 사용된다. 일 구현예에서, hMPV F 폴리펩티드의 발현을 위해 사용되는 숙주 세포주는 박테리아 기원이다. 일 구현예에서, hMPV F 폴리펩티드의 발현을 위해 사용되는 숙주 세포주는 포유동물 기원이다. 그 안에 발현될 원하는 유전자 산물에 가장 적합한 특정 숙주 세포주가 결정될 수 있다. 예시적인 숙주 세포주는 DG44 및 DUXB11(중국 햄스터 난소주, DHFR-), HELA(인간 경부암종), CVI(원숭이 신장주), COS(SV40 T 항원을 갖는 CVI의 유도체), CHO(중국 햄스터 난소), R1610(중국 햄스터 섬유모세포) BALBC/3T3(마우스 섬유모세포), HAK(햄스터 신장주), SP2/O(마우스 골수종), BFA-1c1BPT(소 내피 세포), RAJI(인간 림프구), 및 293(인간 신장)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 숙주 세포주는 전형적으로 상업용 서비스, 미국 조직 배양 컬렉션(ATCC), 또는 공개 문헌으로부터 이용가능하다.
특정한 구현예에서, 바큘로바이러스 세포는 본원에 기재된 hMPV F 폴리펩티드 항원을 발현하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 바큘로바이러스 오토그라파 캘리포르니카 핵다각체병 바이러스(Autographa californica Nuclear Polyhedrosis Virus; AcNPV)는 hMPV F 폴리펩티드를 발현하기 위해 사용될 수 있다.
재조합 바큘로바이러스는 바큘로바이러스 DNA와 관심 hMPV F 서열을 함유하는 키메라 플라스미드 사이의 상동성 재조합에 의해 hMPV F 폴리펩티드를 발현하도록 작제될 수 있다. 재조합 바이러스는 이의 뚜렷한 플라크 형태에 의해 검출될 수 있으며 동종까지 플라크 정제될 수 있다.
재조합 hMPV F 폴리펩티드는 인시목(Lepidopteran) 종 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda)로부터 유래된 세포를 포함하나 이에 제한되지 않는 세포에서 생산될 수 있다. 봄빅스 모리(Bombyx mori), 갤러리아 멜라노마(Galleria mellanoma), 트리크플루시아 니(Trichplusia ni) 또는 라만스리아 디스파르(Lamanthria dispar) 종으로부터의 곤충 세포와 같은 바큘로바이러스에 의해 감염될 수 있는 다른 적합한 곤충 세포도 재조합 hMPV F 폴리펩티드를 생산하기 위한 적합한 기질로서 사용될 수 있다.
재조합 hMPV F 폴리펩티드는 또한 엔토모폭스 바이러스(곤충의 폭스바이러스), 세포질 다각체병 바이러스(CPV) 및 재조합 hMPV F 유전자 구성적 발현을 이용한 곤충 세포의 형질전환과 같은 다른 발현 벡터에서 발현될 수 있다.
재조합 단백질의 바큘로바이러스 발현은 미국 특허 번호 US 5,762,919에 추가로 기재되어 있으며, 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
특정한 구현예에서, 조류 세포, 예를 들어, 미세조류 세포는 본원에 기재된 바와 같은 재조합 hMPV F 폴리펩티드 항원을 발현하기 위해 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 미세조류 숙주 세포는 헤테로콘트 또는 스트라메노파일이다. 일부 구현예에서, 미세조류 숙주 세포는 라비린툴로마이코타 문의 구성원이다. 일부 구현예에서, 라비린툴로마이코타 숙주 세포는 트라우스토키트리알레스 목 또는 라비린툴라레스 목의 구성원이다.
미세조류 숙주 세포에서 hMPV 폴리펩티드 항원의 발현에 사용되는 발현 시스템은 미세조류 세포에서 활성인 조절 제어 요소를 포함한다. 일부 구현예에서, 발현 시스템은 라비린툴로마이코타 세포에서 활성인 조절 제어 요소를 포함한다. 일부 구현예에서, 발현 시스템은 트라우스토키트리드에서 활성인 조절 제어 요소를 포함한다. 일부 구현예에서, 발현 시스템은 스키조키트리움 또는 트라우스토키트리움에서 활성인 조절 제어 요소를 포함한다. 다양한 프로모터를 포함하는 많은 조절 제어 요소가 다수의 다양한 종에서 활성이다. 따라서, 조절 서열은 이들이 단리된 세포와 동일한 세포 유형에서 활용될 수 있거나, 이들이 단리된 세포와 상이한 세포 유형에서 활용될 수 있다.
일부 구현예에서, 미세조류 세포에서 hMPV F 폴리펩티드 생산에 사용되는 발현 시스템은 라비린툴로마이코타 서열로부터 유래되는 조절 요소를 포함한다. 일부 구현예에서, 미세조류 세포에서 hMPV F 폴리펩티드를 생산하는데 사용되는 발현 시스템은 비-라비린툴로마이코타 조류 서열로부터 유래된 서열을 포함하는 비-라비린툴로마이코타 서열로부터 유래된 조절 요소를 포함한다. 일부 구현예에서, 발현 시스템은 hMPV F 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 폴리뉴클레오티드 서열은 미세조류 숙주 세포에서 기능적인 임의의 프로모터 서열, 임의의 종결자 서열, 및/또는 임의의 다른 조절 서열과 회합된다. 유도성 또는 구성적으로 활성인 서열이 사용될 수 있다. 특정한 구현예에서, 미세조류 숙주 세포에서의 hMPV F 폴리펩티드의 발현을 위한 발현 카세트뿐만 아니라 이를 포함하는 조류 세포가 제공된다.
재조합 단백질의 미세조류 발현은 국제 공개 번호 WO 2011/082189 및 WO 2011/090731에 추가로 기재되며, 모든 목적을 위해 그 전문이 참조로 본원에 포함된다.
특정한 구현예에서, CHO 세포는 본원에 기재된 hMPV F 폴리펩티드를 발현하기 위해 사용될 수 있다. 특정한 구현예에서, hMPV F를 발현하는 벡터를 포함하는 CHO 세포주가 제공된다. 특정한 구현예에서, 상기 CHO 세포주는 상기 벡터로 형질감염(안정적으로 또는 일시적으로 형질감염)된다. 특정한 구현예에서, 상기 CHO 세포주는 그의 게놈에 통합된 상기 벡터를 포함한다. CHO 세포주는 산업용 단백질 생산에 일반적으로 사용되며, 많은 CHO 세포주는 알려져 있으며, 예를 들어, ATCC로부터 상업적으로 이용 가능하다. 예를 들어, 이러한 CHO 세포주에는 예를 들어, CHO-K1 세포주(ATCC 번호: CCL-61), CHO DP-12 세포주(ATCC 번호 CRL-12444 및 12445) 및 CHO 1-15세포주(ATCC 번호 CRL-9606)를 포함한다.
시험관내 생산은 스케일 업이 가능하여 많은 양의 목적하는 폴리펩티드를 제공할 수 있다. 조직 배양 조건 하에서의 세포 배양에 대한 기법은 당업계에 알려져 있으며, 예를 들어, 에어리프트 반응기 또는 연속 교반기 반응기에서의 균질한 현탁 배양, 또는 예를 들어, 중공 섬유, 마이크로캡슐, 아가로스 마이크로비드, 또는 세라믹 카트리지에서의 고정화 또는 포획 세포 배양을 포함한다. 필요한 경우 및/또는 원하는 경우, 폴리펩티드의 용액은 통상적인 크로마토그래피 방법, 예를 들어, 겔 여과, 이온-교환 크로마토그래피, DEAE-셀룰로스 상의 크로마토그래피, 및/또는 (면역-) 친화성 크로마토그래피를 사용하여 정제될 수 있다.
IV. RNA
특정한 구현예에서, 본 개시내용의 hMPV 백신은 hMPV F 폴리펩티드 항원을 인코딩하는 ORF를 포함하는 적어도 하나의 리보핵산(RNA)을 포함할 수 있다. 특정한 구현예에서, RNA는 hMPV F 단백질 항원을 인코딩하는 ORF를 포함하는 메신저 RNA(mRNA)이다. 특정한 구현예에서, RNA(예를 들어, mRNA)는 적어도 하나의 5' UTR, 3' UTR, 폴리(A) 꼬리, 및/또는 5' 캡을 추가로 포함한다.
특정한 구현예에서, hMPV F 단백질 항원은 다음과 같이 제시된다:
Figure pct00017
특정한 구현예에서, hMPV F 단백질 항원은 (SEQ ID NO: 6)(A2-D185P mRNA ORF)로서 제시된 mRNA ORF에 의해 인코딩된다.
특정한 구현예에서, hMPV F 단백질 항원은 (SEQ ID NO: 17)(AD185P mRNA ORF)로서 제시된 코돈-최적화된 mRNA ORF에 의해 인코딩된다.
특정한 구현예에서, hMPV F 단백질 항원은 다음과 같이 제시된다:
Figure pct00018
특정한 구현예에서, hMPV F 단백질 항원은 (SEQ ID NO: 8)(A2-T160F_N46V mRNA ORF)로 제시된 mRNA ORF에 의해 인코딩된다.
특정한 구현예에서, hMPV F 단백질 항원은 (SEQ ID NO: 18)(T160F_N46V mRNA ORF)로 제시된 코돈-최적화된 mRNA ORF에 의해 인코딩된다.
특정한 구현예에서, hMPV F 단백질 항원은 (SEQ ID NO: 19)(T160F_N46V mRNA ORF)로 제시된 코돈-최적화된 mRNA ORF에 의해 인코딩된다.
II. A. 5' 캡
mRNA 5' 캡은 대부분의 진핵 세포에서 발견되는 뉴클레아제에 대한 저항성을 제공하고, 번역 효율을 촉진할 수 있다. 몇몇 유형의 5' 캡이 알려져 있다. 7-메틸구아노신 캡("m7G" 또는 "캡-0"로도 지칭됨)은 5' - 5' - 트리포스페이트 결합을 통해 제1 전사된 뉴클레오티드에 연결된 구아노신을 포함한다.
5' 캡은 전형적으로 다음과 같이 부가된다: 먼저, RNA 말단 포스파타아제는 5' 뉴클레오티드로부터의 말단 포스페이트 기들 중 하나를 제거하여, 2개의 말단 포스페이트를 남기고; 이어서 구아노신 트리포스페이트(GTP)가 구아닐릴 트랜스퍼라제를 통해 말단 포스페이트에 부가되어, 5 '5 '5 트리포스페이트 연결을 생산하고; 이어서, 구아닌의 7-질소는 메틸트랜스퍼라제에 의해 메틸화된다. 캡 구조의 예는 m7G(5')ppp, (5'(A,G(5')ppp(5')A, 및 G(5')ppp(5')G을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 추가적인 캡 구조는 미국 공개 번호 US 2016/0032356 및 미국 공개 번호 US 2018/0125989에 기재되어 있으며, 이는 본원에 참조로 포함된다.
폴리뉴클레오티드의 5'-캡핑은 다음의 화학적 RNA 캡 유사체를 사용하여 시험관내-전사 반응 동안 부수적으로 완료되어, 제조업체 프로토콜에 따라 5'-구아노신 캡 구조를 생성할 수 있다: 3'-O-Me-m7G(5')ppp(5')G(ARCA 캡); G(5')ppp(5')A; G(5')ppp(5')G; m7G(5')ppp(5')A; m7G(5')ppp(5')G; m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pG; m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pU; 및 m7G(5')ppp(5')(2'OMeG)pG(New England BioLabs, 입스위치, 메사추세스; TriLink Biotechnologies). 변형된 RNA의 5'-캡핑은 백시니아 바이러스 캡핑 효소를 사용하여 전사-후 완료되어, 캡 0 구조: m7G(5')ppp(5')G를 생성할 수 있다. 캡 1 구조는 백시니아 바이러스 캡핑 효소 및 2'-O 메틸-트랜스퍼라제 둘 모두를 사용하여, m7G(5')ppp(5')G-2'-O-메틸을 생성할 수 있다. 캡 2 구조는 2'-O 메틸-트랜스퍼라제를 사용하는 5'-끝에서 세번째 뉴클레오티드의 2'-O-메틸화가 뒤따르는 캡 1 구조로부터 생성될 수 있다. 캡 3 구조는 2'-O 메틸-트랜스퍼라제를 사용하는 5'-끝에서 네번째 뉴클레오티드의 2'-O-메틸화가 뒤따르는 캡 2 구조로부터 생성될 수 있다.
특정한 구현예에서, 본 개시내용의 mRNA는 3'-O-Me-m7G(5')ppp(5')G(ARCA 캡), G(5')ppp(5')A, G(5')ppp(5')G, m7G(5')ppp(5')A, m7G(5')ppp(5')G, m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pG, m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pU, 및 m7G(5')ppp(5')(2'OMeG)pG로 이루어진 군으로부터 선택되는 5' 캡을 포함한다.
특정한 구현예에서, 본 개시내용의 mRNA는 하기의 5' 캡을 포함한다:
Figure pct00019
.
II. B. 비번역 영역(UTR)
일부 구현예에서, 본 개시내용의 mRNA는 5' 및/또는 3' 비번역 영역(UTR)을 포함한다. mRNA에서, 5' UTR은 전사 시작 부위에서 시작하여 시작 코돈까지 계속되지만, 시작 코돈을 포함하지 않는다. 3' UTR은 정지 코돈 바로 다음에서 시작하여 전사 종결 신호까지 계속된다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 mRNA는 mRNA의 안정성 또는 번역에 영향을 미치는 하나 이상의 요소를 포함하는 5' UTR을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 5' UTR은 약 10 내지 5,000개의 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 일부 구현예에서, 5' UTR은 약 50 내지 500개의 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 일부 구현예에서, 5' UTR은 적어도 약 10개의 뉴클레오티드 길이, 약 20개의 뉴클레오티드 길이, 약 30개의 뉴클레오티드 길이, 약 40개의 뉴클레오티드 길이, 약 50개의 뉴클레오티드 길이, 약 100개의 뉴클레오티드 길이, 약 150개의 뉴클레오티드 길이, 약 200개의 뉴클레오티드 길이, 약 250개의 뉴클레오티드 길이, 약 300개의 뉴클레오티드 길이, 약 350개의 뉴클레오티드 길이, 약 400개의 뉴클레오티드 길이, 약 450개의 뉴클레오티드 길이, 약 500개의 뉴클레오티드 길이, 약 550개의 뉴클레오티드 길이, 약 600개의 뉴클레오티드 길이, 약 650개의 뉴클레오티드 길이, 약 700개의 뉴클레오티드 길이, 약 750개의 뉴클레오티드 길이, 약 800개의 뉴클레오티드 길이, 약 850개의 뉴클레오티드 길이, 약 900개의 뉴클레오티드 길이, 약 950개의 뉴클레오티드 길이, 약 1,000개의 뉴클레오티드 길이, 약 1,500개의 뉴클레오티드 길이, 약 2,000개의 뉴클레오티드 길이, 약 2,500개의 뉴클레오티드 길이, 약 3,000개의 뉴클레오티드 길이, 약 3,500개의 뉴클레오티드 길이, 약 4,000개의 뉴클레오티드 길이, 약 4,500개의 뉴클레오티드 길이 또는 약 5,000개의 뉴클레오티드 길이이다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 mRNA는 폴리아데닐화 신호 중 하나 이상을 포함하는 3' UTR, mRNA의 세포 내의 위치의 안정성에 영향을 미치는 단백질에 대한 결합 부위, 또는 miRNA에 대한 하나 이상의 결합 부위를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 3' UTR은 50 내지 5,000개의 뉴클레오티드 길이 또는 그 초과일 수 있다. 일부 구현예에서, 3' UTR은 50 내지 1,000개의 뉴클레오티드 길이 또는 그 초과일 수 있다. 일부 구현예에서, 3' UTR은 적어도 약 50개의 뉴클레오티드 길이, 약 100개의 뉴클레오티드 길이, 약 150개의 뉴클레오티드 길이, 약 200개의 뉴클레오티드 길이, 약 250개의 뉴클레오티드 길이, 약 300개의 뉴클레오티드 길이, 약 350개의 뉴클레오티드 길이, 약 400개의 뉴클레오티드 길이, 약 450개의 뉴클레오티드 길이, 약 500개의 뉴클레오티드 길이, 약 550개의 뉴클레오티드 길이, 약 600개의 뉴클레오티드 길이, 약 650개의 뉴클레오티드 길이, 약 700개의 뉴클레오티드 길이, 약 750개의 뉴클레오티드 길이, 약 800개의 뉴클레오티드 길이, 약 850개의 뉴클레오티드 길이, 약 900개의 뉴클레오티드 길이, 약 950개의 뉴클레오티드 길이, 약 1,000개의 뉴클레오티드 길이, 약 1,500개의 뉴클레오티드 길이, 약 2,000개의 뉴클레오티드 길이, 약 2,500개의 뉴클레오티드 길이, 약 3,000개의 뉴클레오티드 길이, 약 3,500개의 뉴클레오티드 길이, 약 4,000개의 뉴클레오티드 길이, 약 4,500개의 뉴클레오티드 길이 또는 약 5,000개의 뉴클레오티드 길이이다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 mRNA는 mRNA 전사물에 의해 인코딩된 유전자와 구별되는 유전자로부터 유래된 5' 또는 3' UTR을 포함할 수 있다(즉, UTR은 이종성 UTR임).
특정한 구현예에서, 5' 및/또는 3' UTR 서열은 안정한 mRNA(예를 들어, 글로빈, 액틴, GAPDH, 튜불린, 히스톤 또는 시트르산 사이클 효소)로부터 유래되어 mRNA의 안정성을 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 5' UTR 서열은 CMV 즉각적-초기 1(IE1) 유전자의 부분 서열, 또는 이의 단편을 포함하여, 뉴클레아제 저항성을 개선하고/하거나 mRNA의 반감기를 개선시킬 수 있다. 인간 성장 호르몬(hGH)을 인코딩하는 서열, 또는 이의 단편을 mRNA의 3' 말단 또는 비번역 영역에 포함시키는 것도 고려된다. 일반적으로, 이러한 변형은 비변형 대응물에 비해 mRNA의 안정성 및/또는 약동학적 특성(예를 들어, 반감기)을 개선하고, 예를 들어, 생체내 뉴클레아제 소화에 대한 이러한 mRNA 저항성을 개선하기 위해 이루어진 변형을 포함한다.
예시적인 5' UTR은 CMV 즉각적-초기 1(IE1) 유전자로부터 유래된 서열(미국 공개 번호 2014/0206753 및 2015/0157565, 이들 각각은 본원에 참조로 포함됨), 또는 서열 GGGAUCCUACC(SEQ ID NO: 16)(미국 공개 번호 2016/0151409, 이는 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)을 포함한다.
다양한 구현예에서, 5' UTR은 TOP 유전자의 5' UTR로부터 유래될 수 있다. TOP 유전자는 전형적으로 5'-말단 올리고피리미딘(TOP) 트랙트의 존재를 특징으로 한다. 또한, 대부분의 TOP 유전자는 성장-관련 번역 조절을 특징으로 한다. 그러나, 조직 특이적 번역 조절을 갖는 TOP 유전자도 알려져 있다. 특정한 구현예에서, TOP 유전자의 5' UTR로부터 유래된 5' UTR은 5' TOP 모티프(올리고피리미딘 트랙트)가 결여되어 있다(예를 들어, 미국 공개 번호 2017/0029847, 2016/0304883, 2016/0235864, 및 2016/0166710, 이들 각각은 본원에 참조로 포함됨).
특정한 구현예에서, 5' UTR은 리보솜 단백질 Large 32 (L32) 유전자로부터 유래된다(미국 공개 번호 2017/0029847, 위와 같음).
특정한 구현예에서, 5' UTR은 하이드록시스테로이드(17-b) 데하이드로게나제 4 유전자(HSD17B4)의 5' UTR로부터 유래된다(미국 공개 번호 2016/0166710, 위와 같음).
특정한 구현예에서, 5' UTR은 ATP5A1 유전자의 5' UTR로부터 유래된다(미국 공개 번호 2016/0166710, 위와 같음).
일부 구현예에서, 내부 리보솜 진입 부위(IRES)는 5' UTR 대신에 사용된다.
일부 구현예에서, 5'UTR은 하기 SEQ ID NO: 13에 제시된 핵산 서열을 포함한다:
Figure pct00020
일부 구현예에서, 3'UTR은 하기 SEQ ID NO: 14에 제시된 핵산 서열을 포함한다:
Figure pct00021
5' UTR 및 3'UTR은 국제 공개 번호 WO 2012/075040에 추가로 상세히 기재되어 있으며, 이는 본원에 참조로 포함된다.
II. C. 폴리아데닐화 꼬리
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "폴리(A) 서열," "폴리(A) 꼬리," 및 "폴리(A) 영역"은 mRNA 분자의 3' 말단에서의 아데노신 뉴클레오티드의 서열을 지칭한다. 폴리(A) 꼬리는 mRNA에 안정성을 부여하고 이를 엑소뉴클레아제 분해로부터 보호할 수 있다. 폴리(A) 꼬리는 번역을 향상시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리(A) 꼬리는 본질적으로 호모폴리머이다. 예를 들어, 100개의 아데노신 뉴클레오티드의 폴리(A) 꼬리는 본질적으로 100개의 뉴클레오티드 길이를 가질 수 있다. 특정한 구현예에서, 폴리(A) 꼬리는 아데노신 뉴클레오티드와 상이한 적어도 하나의 뉴클레오티드(예를 들어, 아데노신 뉴클레오티드가 아닌 뉴클레오티드)에 의해 중단될 수 있다. 예를 들어, 100개의 아데노신 뉴클레오티드의 폴리(A) 꼬리는 100개 초과의 뉴클레오티드 길이를 가질 수 있다(100개의 아데노신 뉴클레오티드 및 적어도 하나의 뉴클레오티드, 또는 아데노신 뉴클레오티드와 상이한 뉴클레오티드의 스트레치 포함). 특정한 구현예에서, 폴리(A) 꼬리는 서열
Figure pct00022
를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "폴리(A) 꼬리"는 전형적으로 RNA에 관한 것이다. 그러나, 본 개시내용의 맥락에서, 용어는 마찬가지로 DNA 분자 내의 상응하는 서열(예를 들어, "폴리(T) 서열")에 관한 것이다.
폴리(A) 꼬리는 약 10 내지 약 500개 아데노신 뉴클레오티드, 약 10 내지 약 200개 아데노신 뉴클레오티드, 약 40 내지 약 200개 아데노신 뉴클레오티드, 또는 약 40 내지 약 150개 아데노신 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 폴리(A) 꼬리의 길이는 적어도 약 10, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 또는 500개 아데노신 뉴클레오티드일 수 있다.
핵산이 RNA인 일부 구현예에서, 핵산의 폴리(A) 꼬리는 RNA 시험관내 전사 동안 DNA 주형으로부터 얻어진다. 특정한 구현예에서, 폴리(A) 꼬리는 DNA 주형으로부터 전사되지 않으면서 일반적인 화학 합성 방법에 의해 시험관내에서 얻어진다. 다양한 구현예에서, 폴리(A) 꼬리는 상업적으로 이용 가능한 폴리아데닐화 키트 및 상응하는 프로토콜을 사용하여 RNA의 효소적 폴리아데닐화(RNA 시험관내 전사 후)에 의해, 또는 대안적으로, 고정화된 폴리(A)폴리머라제를 사용하여, 예를 들어, 국제 공개 번호 WO 2016/174271에 기재된 바와 같은 방법을 사용하여, 생성된다.
핵산은 효소적 폴리아데닐화에 의해 수득된 폴리(A) 꼬리를 포함할 수 있으며, 대부분의 핵산 분자는 약 100개(+/-20) 내지 약 500개(+/-50) 또는 약 250개(+/-20) 아데노신 뉴클레오티드를 포함한다.
일부 구현예에서, 핵산은 주형 DNA로부터 유래된 폴리(A) 꼬리를 포함할 수 있고, 예를 들어, 국제 공개 번호 WO 2016/091391에 기재된 바와 같은, 효소적 폴리아데닐화에 의해 생성된 적어도 하나의 추가적인 폴리(A) 꼬리를 추가적으로 포함할 수 있다.
특정한 구현예에서, 핵산은 적어도 하나의 폴리아데닐화 신호를 포함한다.
다양한 구현예에서, 핵산은 적어도 하나의 폴리(C) 서열을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "폴리(C) 서열"은 최대 약 200개의 시토신 뉴클레오티드의 시토신 뉴클레오티드의 서열인 것으로 의도된다. 일부 구현예에서, 폴리(C) 서열은 약 10 내지 약 200개 시토신 뉴클레오티드, 약 10 내지 약 100개 시토신 뉴클레오티드, 약 20 내지 약 70개 시토신 뉴클레오티드, 약 20 내지 약 60개 시토신 뉴클레오티드, 또는 약 10 내지 약 40개 시토신 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리(C) 서열은 약 30개의 시토신 뉴클레오티드를 포함한다.
II. D. 화학적 변형
본원에 개시된 mRNA는 변형되거나 변형되지 않을 수 있다. 일부 구현예에서, mRNA는 적어도 하나의 화학적 변형을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 mRNA는 전형적으로 RNA 안정성을 향상시키는 하나 이상의 변형을 포함할 수 있다. 예시적인 변형은 백본 변형, 당 변형, 또는 염기 변형을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 개시된 mRNA는 자연 발생 뉴클레오티드 및/또는 퓨린(아데닌(A) 및 구아닌(G)) 또는 피리미딘(티민(T), 시토신(C), 및 우라실(U))을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 뉴클레오티드 유사체(변형된 뉴클레오티드)로부터 합성될 수 있다. 특정한 구현예에서, 개시된 mRNA는 퓨린 및 피리미딘의 변형된 뉴클레오티드 유사체 또는 유도체, 예컨대, 예를 들어, 1-메틸-아데닌, 2-메틸-아데닌, 2-메틸티오-N-6-이소펜테닐-아데닌, N6-메틸-아데닌, N6-이소펜테닐-아데닌, 2-티오-시토신, 3-메틸-시토신, 4-아세틸-시토신, 5-메틸-시토신, 2,6-디아미노퓨린, 1-메틸-구아닌, 2-메틸-구아닌, 2,2-디메틸-구아닌, 7-메틸-구아닌, 이노신, 1-메틸-이노신, 슈도우라실(5-우라실), 디하이드로-우라실, 2-티오-우라실, 4-티오-우라실, 5-카복시메틸아미노메틸-2-티오-우라실, 5-(카복시하이드록시메틸)-우라실, 5-플루오로-우라실, 5-브로모-우라실, 5-카복시메틸아미노메틸-우라실, 5-메틸-2-티오-우라실, 5-메틸-우라실, N-우라실-5-옥시 아세트산 메틸 에스테르, 5-메틸아미노메틸-우라실, 5-메톡시아미노메틸-2-티오-우라실, 5'-메톡시카보닐메틸-우라실, 5-메톡시-우라실, 우라실-5-옥시아세트산 메틸 에스테르, 우라실-5-옥시아세트산(v), 1-메틸-슈도우라실, 퀘오신, β-D-만노실-퀘오신, 포스포라미데이트, 포스포로티오에이트, 펩티드 뉴클레오티드, 메틸포스포네이트, 7-데아자구아노신, 5-메틸시토신, 및 이노신으로부터 합성될 수 있다.
일부 구현예에서, 개시된 mRNA는 슈도우리딘, N1-메틸슈도우리딘, 2-티오우리딘, 4'-티오우리딘, 5-메틸시토신, 2-티오-l-메틸-1-데아자-슈도우리딘, 2-티오-l-메틸-슈도우리딘, 2-티오-5-아자-우리딘, 2-티오-디하이드로슈도우리딘, 2-티오-디하이드로우리딘, 2-티오-슈도우리딘, 4-메톡시-2-티오-슈도우리딘, 4-메톡시-슈도우리딘, 4-티오-l-메틸-슈도우리딘, 4-티오-슈도우리딘, 5-아자-우리딘, 디하이드로슈도우리딘, 5-메틸우리딘, 5-메틸우리딘, 5-메톡시우리딘, 및 2'-O-메틸 우리딘을 포함하나, 이에 제한되지 않는 적어도 하나의 화학적 변형을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 화학적 변형은 슈도우리딘, N1-메틸슈도우리딘, 5-메틸시토신, 5-메톡시우리딘, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 화학적 변형은 N1-메틸슈도우리딘을 포함한다.
일부 구현예에서, mRNA 내의 우라실 뉴클레오티드의 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100%가 화학적으로 변형된다.
일부 구현예에서, ORF 내의 우라실 뉴클레오티드의 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100%가 화학적으로 변형된다.
이러한 유사체의 제조는 예를 들어, 미국 특허 제4,373,071호, 미국 특허 제4,401,796호, 미국 특허 제4,415,732호, 미국 특허 제4,458,066호, 미국 특허 제4,500,707호, 미국 특허 제4,668,777호, 미국 특허 제4,973,679호, 미국 특허 제5,047,524호, 미국 특허 제5,132,418호, 미국 특허 제5,153,319호, 미국 특허 제5,262,530호, 및 미국 특허 제5,700,642호에 기재되어 있다.
II. E. mRNA 합성
본원에 개시된 mRNA는 임의의 다양한 방법에 따라 합성될 수 있다. 예를 들어, 본 개시내용에 따른 mRNA는 시험관내 전사(IVT)를 통해 합성될 수 있다. 시험관내 전사를 위한 일부 방법은, 예를 들어, 문헌[Geall et al. (2013) Semin. Immunol. 25(2): 152-159]; 문헌[Brunelle et al. (2013) Methods Enzymol. 530:101-14]에 기재되어 있다. 간단히 말해서, IVT는 전형적으로 프로모터, 리보뉴클레오티드 트리포스페이트의 풀, DTT 및 마그네슘 이온을 포함할 수 있는 완충 시스템, 적절한 RNA 폴리머라제(예를 들어, T3, T7, 또는 SP6 RNA 폴리머라제), DNase I, 피로포스파타제 및/또는 RNase 저해제를 함유하는 선형 또는 원형 DNA 주형으로 수행된다. 정확한 조건은 특정 적용에 따라 다를 수 있다. 이들 시약의 존재는 일반적으로 최종 mRNA 생성물에서 바람직하지 않으며, 이들 시약은 치료 용도에 적합한 깨끗하고/하거나 균질한 mRNA를 제공하기 위해 정제 또는 제거될 수 있는 불순물 또는 오염물로 간주될 수 있다. 일부 구현예에서 시험관내 전사 반응으로부터 제공된 mRNA가 바람직할 수 있지만, 박테리아, 진균, 식물 및/또는 동물로부터 생성된 야생형 mRNA를 포함하는 mRNA의 다른 공급원이 본 개시내용에 따라 사용될 수 있다.
V. 지질 나노입자(LNP)
본 개시내용의 LNP는 4가지 카테고리의 지질을 포함할 수 있다: (i) 이온화 가능한 지질(예를 들어, 양이온성 지질); (ii) PEG화된 지질; (iii) 콜레스테롤계 지질(예를 들어, 콜레스테롤), 및 (iv) 헬퍼 지질.
A. 양이온성 지질
이온화 가능한 지질은 mRNA 캡슐화를 촉진하고, 양이온성 지질일 수 있다. 양이온성 지질은 낮은 pH에서 양전하 환경을 제공하여 음전하 mRNA 약물 물질의 효율적인 캡슐화를 용이하게 한다. 예시적인 양이온성 지질은 하기 표 1에 나타나 있다.
표 1 - 이온화 가능한 지질
Figure pct00023
Figure pct00024
Figure pct00025
Figure pct00026
Figure pct00027
양이온성 지질은 [ckkE10] / [OF-02], [(6Z,9Z,28Z,31Z)-헵타트리아콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-일] 4-(디메틸아미노)부타노에이트(D-Lin-MC3-DMA); 2,2-디리놀레일-4-디메틸아미노에틸-[1,3]-디옥솔란(DLin-KC2-DMA); 1,2-디리놀레일옥시-N,N-디메틸-3-아미노프로판(DLin-DMA); 디((Z)-논-2-엔-1-일) 9-((4-(디메틸아미노)부타노일)옥시)헵타데칸디오에이트(L319); 9-헵타데카닐 8-{(2-하이드록시에틸)[6-옥소-6-(운데실옥시)헥실]아미노}옥타노에이트(SM-102); [(4-하이드록시부틸)아잔디일]디(헥산-6,1-디일) 비스(2-헥실데카노에이트)(ALC-0315); [3-(디메틸아미노)-2-[(Z)-옥타데크-9-에노일]옥시프로필](Z)-옥타데크-9-에노에이트(DODAP); 2,5-비스(3-아미노프로필아미노)-N-[2-[디(헵타데실)아미노]-2-옥소에틸]펜탄아미드(DOGS); [(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-디메틸-17-[(2R)-6-메틸헵탄-2-일]-2,3,4,7,8,9,11,12,14,15,16,17-도데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일] N-[2-(디메틸아미노)에틸]카바메이트(DC-Chol); 테트라키스(8-메틸노닐) 3,3',3",3'''-(((메틸아잔디일) 비스(프로판-3,1 디일))비스(아잔트리일))테트라프로피오네이트(306Oi10); 데실(2-(디옥틸암모니오)에틸)포스페이트(9A1P9); 에틸 5,5-디((Z)-헵타데크-8-엔-1-일)-1-(3-(피롤리딘-1-일)프로필)-2,5-디하이드로-1H-이미다졸-2-카복실레이트(A2-Iso5-2DC18); 비스(2-(도데실디설파닐)에틸) 3,3'-((3-메틸-9-옥소-10-옥사-13,14-디티아-3,6-디아자헥사코실)아잔디일)디프로피오네이트(BAME-O16B); 1,1'-((2-(4-(2-((2-(비스(2-하이드록시도데실)아미노)에틸)(2-하이드록시도데실)아미노)에틸) 피페라진-1-일)에틸)아잔디일)비스(도데칸-2-올)(C12-200); 3,6-비스(4-(비스(2-하이드록시도데실)아미노)부틸)피페라진-2,5-디온(cKK-E12); 헥사(옥탄-3-일) 9,9',9'',9''',9'''',9'''''-((((벤젠-1,3,5-트리카보닐)이리스(아잔디일))트리스(프로판-3,1-디일))트리스(아잔트리일))헥사노나노에이트(FTT5); (((3,6-디옥소피페라진-2,5-디일)비스(부탄-4,1-디일))비스(아잔트리일))테트라키스(에탄-2,1-디일)(9Z,9'Z,9''Z,9'''Z,12Z,12'Z,12''Z,12'''Z)-테트라키스(옥타데카-9,12-디에노에이트)(OF-Deg-Lin); TT3; N1,N3,N5-트리스(3-(디도데실아미노)프로필)벤젠-1,3,5-트리카복사미드; N1-[2-((1S)-1-[(3-아미노프로필)아미노]-4-[디(3-아미노프로필)아미노]부틸카복사미도)에틸]-3,4-디[올레일옥시]-벤즈아미드(MVL5); 헵타데칸-9-일 8-((2-하이드록시에틸)(8-(노닐옥시)-8-옥소옥틸)아미노)옥타노에이트(지질 5); 및 이들의 조합을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다.
특정한 구현예에서, 양이온성 지질은 생분해성이다.
다양한 구현예에서, 양이온성 지질은 생분해성이 아니다.
일부 구현예에서, 양이온성 지질은 절단 가능하다.
특정한 구현예에서, 양이온성 지질은 절단 가능하지 않다.
양이온성 지질은 문헌[Dong et al. (PNAS. 111(11):3955-60. 2014)]; 문헌[Fenton et al. (Adv Mater. 28:2939. 2016)]; 미국 특허 제9,512,073호; 및 미국 특허 제10,201,618호에 더 상세하게 기재되어 있으며, 이들 각각은 본원에 참조로 포함된다.
B. PEG화된 지질
PEG화된 지질 구성요소는 나노입자의 입자 크기 및 안정성에 대한 제어를 제공한다. 이러한 구성요소의 첨가는 복합체 응집을 예방할 수 있고, 순환 수명을 증가시키고 지질-핵산 약제학적 조성물의 표적 조직으로의 전달을 증가시키는 수단을 제공할 수 있다(문헌[Klibanov et al. FEBS Letters 268(1):235-7. 1990)]. 이들 구성요소는 생체내에서 약제학적 조성물로부터 빠르게 교환되도록 선택될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제5,885,613호 참조).
고려되는 PEG화된 지질은 C6-C20(예를 들어, C8, C10, C12, C14, C16, 또는 C18) 길이의 알킬 사슬(들)을 갖는 지질에 공유 부착된 최대 5 kDa 길이의 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 사슬, 예컨대 유도체화된 세라마이드(예를 들어, N-옥탄오일-스핑고신-1-[숙시닐(메톡시폴리에틸렌 글리콜)] (C8 PEG 세라마이드))를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, PEG화된 지질은 1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌 글리콜(DMG-PEG); 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-폴리에틸렌 글리콜(DSPE-PEG); 1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-폴리에틸렌 글리콜(DLPE-PEG); 또는 1,2-디스테아로일-rac-글리세로-폴리에틸렌 글리콜(DSG-PEG), PEG-DAG; PEG-PE; PEG-S-DAG; PEG-S-DMG; PEG-cer; PEG-디알콕시프로필카바메이트; 2-[(폴리에틸렌 글리콜)-2000]-N,N-디테트라데실아세트아미드(ALC-0159); 및 이들의 조합이다.
특정한 구현예에서, PEG는 고분자량, 예를 들어, 2000 내지 2400 g/mol을 갖는다. 특정한 구현예에서, PEG는 PEG2000(또는 PEG-2K)이다. 특정한 구현예에서, 본원의 PEG화된 지질은 DMG-PEG2000, DSPE-PEG2000, DLPE-PEG2000, DSG-PEG2000, C8 PEG2000, 또는 ALC-0159(2-[(폴리에틸렌 글리콜)-2000]-N,N-디테트라데실아세트아미드)이다. 특정한 구현예에서, 본원의 PEG화된 지질은 DMG-PEG2000이다.
C. 콜레스테롤계 지질
콜레스테롤 구성요소는 나노입자 내의 지질 이중층 구조에 안정성을 제공한다. 일부 구현예에서, LNP는 하나 이상의 콜레스테롤계 지질을 포함한다. 적합한 콜레스테롤계 지질은 예를 들어 DC-Choi(N,N-디메틸-N-에틸카복사미도콜레스테롤), l,4-비스(3-N-올레일아미노-프로필)피페라진(문헌[Gao et al., Biochem Biophys Res Comm. (1991) 179:280]; [Wolf et al., BioTechniques(1997) 23:139]; 미국 특허 5,744,335), 이미다졸 콜레스테롤 에스테르 ("ICE"; 국제 공개 번호 WO 2011/068810), 시토스테롤(22,23-디하이드로스티그마스테롤), β-시토스테롤, 시토스타놀, 푸코스테롤, 스티그마스타롤(스티그마스타-5,22-디엔-3-올), 에르고스테롤; 데스모스테롤(3β-하이드록시-5,24-콜레스타디엔); 라노스테롤(8,24-라노스타디엔-3b-올); 7-데하이드로콜레스테롤(Δ5,7-콜레스테롤); 디하이드로라노스테롤(24,25-디하이드로라노스테롤); 자이모스테롤(5α-콜레스타-8,24-디엔-3ß-올); 라토스테롤(5α-콜레스트-7-엔-3ß-올); 디오스게닌((3β,25R)-스피로스트-5-엔-3-올); 캄페스테롤(캄페스트-5-엔-3ß-올); 캄페스탄올(5a-캄페스탄-3b-올); 24-메틸렌 콜레스테롤(5,24(28)-콜레스타디엔-24-메틸렌-3ß-올); 콜레스테릴 마가레이트(콜레스트-5-엔-3ß-일 헵타데카노에이트); 콜레스테릴 올레에이트; 콜레스테릴 스테아레이트 및 기타 변형된 형태의 콜레스테롤을 포함한다. 일부 구현예에서, LNP에 사용되는 콜레스테롤계 지질은 콜레스테롤이다.
D. 헬퍼 지질
헬퍼 지질은 LNP의 구조적 안정성을 향상시키고, 엔도솜 탈출에서 LNP를 돕는다. 그것은 mRNA 약물 페이로드의 흡수 및 방출을 개선시킨다. 일부 구현예에서, 헬퍼 지질은 약물 페이로드의 흡수 및 방출을 향상시키기 위한 융해성(fusogenic) 특성을 갖는 쯔비터이온성 지질이다. 헬퍼 지질의 예는 1,2-디올레오일-SN-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE); 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC); 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포-L-세린(DOPS); 1,2-디엘라이도일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DEPE); 및 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DPOC), 디팔미토일포스파티딜콜린(DPPC), DMPC, 1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DLPC), 1,2-디스테아로일포스파티딜에탄올아민(DSPE), 및 1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DLPE)이다.
다른 예시적인 헬퍼 지질은 디올레오일포스파티딜콜린(DOPC), 디올레오일포스파티딜글리세롤(DOPG), 디팔미토일포스파티딜글리세롤(DPPG), 팔미토일올레오일포스파티딜콜린(POPC), 팔미토일올레오일-포스파티딜에탄올아민(POPE), 디올레오일-포스파티딜에탄올아민 4-(N-말레이미도메틸)-사이클로헥산-l-카복실레이트(DOPE-mal), 디팔미토일 포스파티딜 에탄올아민(DPPE), 디미리스토일포스포에탄올아민(DMPE), 포스파티딜세린, 스핑고지질, 스핑고미엘린, 세라마이드, 세레브로시드, 강글리오시드, 16-O-모노메틸 PE, 16-O-디메틸 PE, 18-1-트랜스 PE, l-스테아로일-2-올레오일-포스파티디에탄올아민(SOPE), 또는 이들의 조합이다. 특정한 구현예에서, 헬퍼 지질은 DOPE이다. 특정한 구현예에서, 헬퍼 지질은 DSPC이다.
다양한 구현예에서, 본 LNP는 (i) OF-02, cKK-E10, GL-HEPES-E3-E10-DS-3-E18-1, GL-HEPES-E3-E12-DS-4-E10, 또는 GL-HEPES-E3-E12-DS-3-E14로부터 선택된 양이온성 지질; (ii) DMG-PEG2000; (iii) 콜레스테롤; 및 (iv) DOPE를 포함한다.
E. 지질 구성요소의 몰비
위의 구성요소의 몰비는 mRNA 전달에서 LNP의 유효성에 중요하다. 양이온성 지질, PEG화된 지질, 콜레스테롤계 지질, 및 헬퍼 지질의 몰비는 A: B: C: D이며, A + B + C + D = 100%이다. 일부 구현예에서, 총 지질에 대한 LNP 내 양이온성 지질(즉, A)의 몰비는 35 내지 55%, 예컨대 35 내지 50%(예를 들어, 38 내지 42%, 예컨대 40%, 또는 45 내지 50%)이다. 일부 구현예에서, 총 지질에 대한 PEG화된 지질 구성요소(즉, B)의 몰비는 0.25 내지 2.75%(예를 들어, 1 내지 2% 예컨대 1.5%)이다. 일부 구현예에서, 총 지질에 대한 콜레스테롤계 지질(즉, C)의 몰비는 20 내지 50%(예를 들어, 27 내지 30% 예컨대 28.5%, 또는 38 내지 43%)이다. 일부 구현예에서, 총 지질에 대한 헬퍼 지질(즉, D)의 몰비는 5 내지 35%(예를 들어, 28 내지 32%, 예컨대 30%, 또는 8 내지 12%, 예컨대 10%)이다. 일부 구현예에서, (PEG화된 지질 + 콜레스테롤) 구성요소는 헬퍼 지질과 동일한 몰량을 갖는다. 일부 구현예에서, LNP는 1보다 큰 헬퍼 지질에 대한 양이온성 지질의 몰비를 포함한다.
특정한 구현예에서, 본 개시내용의 LNP는
35% 내지 55% 또는 40% 내지 50%의 몰비의 양이온성 지질(예를 들어, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41% 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 또는 55%의 몰비의 양이온성 지질);
0.25% 내지 2.75% 또는 1.00% 내지 2.00%의 몰비의 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 접합된(PEG화된) 지질(예를 들어, 0.25%, 0.50%, 0.75%, 1.00%, 1.25%, 1.50%, 1.75%, 2.00%, 2.25%, 2.50%, 또는 2.75%의 몰비의 PEG화된 지질);
20% 내지 50%, 25% 내지 45%, 또는 28.5% 내지 43%의 몰비의 콜레스테롤계 지질(예를 들어, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41% 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 또는 50%의 몰비의 콜레스테롤계 지질); 및
5% 내지 35%, 8% 내지 30%, 또는 10% 내지 30%의 몰비의 헬퍼 지질(예를 들어, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 또는 35%의 몰비의 헬퍼 지질)을 포함하고,
모든 몰비는 LNP의 총 지질 함량에 상대적이다.
특정한 구현예에서, LNP는 40%의 몰비의 양이온성 지질; 1.5%의 몰비의 PEG화된 지질; 28.5%의 몰비의 콜레스테롤계 지질; 및 30%의 몰비의 헬퍼 지질을 포함한다.
특정한 구현예에서, PEG화된 지질은 디미리스토일-PEG2000(DMG-PEG2000)이다.
다양한 구현예에서, 콜레스테롤계 지질은 콜레스테롤이다.
일부 구현예에서, 헬퍼 지질은 1,2-디올레오일-SN-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE)이다.
특정한 구현예에서, LNP는 35% 내지 55%의 몰비의 OF-02; 0.25% 내지 2.75%의 몰비의 DMG-PEG2000; 20% 내지 50%의 몰비의 콜레스테롤; 및 5% 내지 35%의 몰비의 DOPE를 포함한다.
특정한 구현예에서, LNP는 35% 내지 55%의 몰비의 cKK-E10; 0.25% 내지 2.75%의 몰비의 DMG-PEG2000; 20% 내지 50%의 몰비의 콜레스테롤; 및 5% 내지 35%의 몰비의 DOPE를 포함한다.
특정한 구현예에서, LNP는 35% 내지 55%의 몰비의 GL-HEPES-E3-E10-DS-3-E18-1; 0.25% 내지 2.75%의 몰비의 DMG-PEG2000; 20% 내지 50%의 몰비의 콜레스테롤; 및 5% 내지 35%의 몰비의 DOPE를 포함한다.
특정한 구현예에서, LNP는 35% 내지 55%의 몰비의 GL-HEPES-E3-E12-DS-4-E10; 0.25% 내지 2.75%의 몰비의 DMG-PEG2000; 20% 내지 50%의 몰비의 콜레스테롤; 및 5% 내지 35%의 몰비의 DOPE를 포함한다.
특정한 구현예에서, LNP는 35% 내지 55%의 몰비의 GL-HEPES-E3-E12-DS-3-E14; 0.25% 내지 2.75%의 몰비의 DMG-PEG2000; 20% 내지 50%의 몰비의 콜레스테롤; 및 5% 내지 35%의 몰비의 DOPE를 포함한다.
특정한 구현예에서, LNP는 35% 내지 55%의 몰비의 SM-102; 0.25% 내지 2.75%의 몰비의 DMG-PEG2000; 20% 내지 50%의 몰비의 콜레스테롤; 및 5% 내지 35%의 몰비의 DSPC를 포함한다.
특정한 구현예에서, LNP는 35% 내지 55%의 몰비의 ALC-0315; 0.25% 내지 2.75%의 몰비의 ALC-0159; 20% 내지 50%의 몰비의 콜레스테롤; 및 5% 내지 35%의 몰비의 DSPC를 포함한다.
특정한 구현예에서, LNP는 40%의 몰비의 OF-02; 1.5%의 몰비의 DMG-PEG2000; 28.5%의 몰비의 콜레스테롤; 및 30%의 몰비의 DOPE를 포함한다.
특정한 구현예에서, LNP는 40%의 몰비의 cKK-E10; 1.5%의 몰비의 DMG-PEG2000; 28.5%의 몰비의 콜레스테롤; 및 30%의 몰비의 DOPE를 포함한다.
특정한 구현예에서, LNP는 40%의 몰비의 GL-HEPES-E3-E10-DS-3-E18-1; 1.5%의 몰비의 DMG-PEG2000; 28.5%의 몰비의 콜레스테롤; 및 30%의 몰비의 DOPE를 포함한다.
특정한 구현예에서, LNP는 (40%의 몰비의 GL-HEPES-E3-E12-DS-4-E10; 1.5%의 몰비의 DMG-PEG2000; 28.5%의 몰비의 콜레스테롤; 및 30%의 몰비의 DOPE를 포함한다.
특정한 구현예에서, LNP는 40%의 몰비의 GL-HEPES-E3-E12-DS-3-E14; 1.5%의 몰비의 DMG-PEG2000; 28.5%의 몰비의 콜레스테롤; 및 30%의 몰비의 DOPE를 포함한다.
특정한 구현예에서, LNP는 50%의 몰비의 9-헵타데카닐 8-{(2-하이드록시에틸)[6-옥소-6-(운데실옥시)헥실]아미노}옥타노에이트(SM-102); 10%의 몰비의 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC); 38.5%의 몰비의 콜레스테롤; 및 1.5%의 몰비의 1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌 글리콜-2000(DMG-PEG2000)을 포함한다.
특정한 구현예에서, LNP는 46.3%의 몰비의 (4-하이드록시부틸)아잔디일]디(헥산-6,1-디일) 비스(2-헥실데카노에이트)(ALC-0315); 9.4%의 몰비의 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC); 42.7%의 몰비의 콜레스테롤; 및 1.6%의 몰비의 2-[(폴리에틸렌 글리콜)-2000]-N,N-디테트라데실아세트아미드(ALC-0159)를 포함한다.
특정한 구현예에서, LNP는 47.4%의 몰비의 (4-하이드록시부틸)아잔디일]디(헥산-6,1-디일) 비스(2-헥실데카노에이트)(ALC-0315); 10%의 몰비의 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC); 40.9%의 몰비의 콜레스테롤; 및 1.7%의 몰비의 2-[(폴리에틸렌 글리콜)-2000]-N,N-디테트라데실아세트아미드(ALC-0159)를 포함한다.
LNP 제형에 투입될 각각의 지질의 실제 양을 계산하기 위해, 양이온성 지질의 몰량은 먼저 원하는 N/P 비에 기초하여 결정되며, N은 양이온성 지질 내의 질소 원자의 수이며, P는 LNP에 의해 수송되는 mRNA 내의 포스페이트 기의 수이다. 다음으로, 각각의 다른 지질의 몰량은 선택된 몰비 및 양이온성 지질의 몰량에 기초하여 계산된다. 그 후, 이러한 몰량은 각각의 지질의 분자량을 사용하여 중량으로 변환된다.
F. 완충액 및 다른 구성요소
핵산 및/또는 LNP를 안정화하기 위해(예를 들어, 백신 제품(vaccine product)의 유통기한을 연장하기 위해), LNP 약제학적 조성물의 투여를 용이하게 하기 위해, 및/또는 핵산의 생체내 발현을 향상시키기 위해, 핵산 및/또는 LNP는 하나 이상의 담체, 표적화 리간드, 안정화 시약(예를 들어, 보존제 및 산화방지제), 및/또는 기타 약제학적으로 허용되는 부형제와 조합되어 제형화될 수 있다. 이러한 부형제의 예는 파라벤, 티메로살, 티오메르살, 클로로부탄올, 벤즈알코늄 클로라이드 및 킬레이트제(예를 들어, EDTA)이다.
본 개시내용의 LNP 조성물은 냉동 액체 형태 또는 동결건조 형태로 제공될 수 있다. 수크로스, 트레할로스, 글루코스, 만니톨, 만노스, 및 덱스트로스 등을 제한 없이 포함하는 다양한 동결방지제가 사용될 수 있다. 동결방지제는 LNP 조성물의 5 내지 30% (w/v)를 구성할 수 있다. 일부 구현예에서, LNP 조성물은 예를 들어, 5 내지 30%(예를 들어, 10%)(w/v)의 트레할로스를 포함한다. 일단 동결방지제를 이용하여 제형화되면, LNP 조성물은 -20℃ 내지 -80℃에서 동결(또는 동결건조 및 동결보존)될 수 있다.
LNP 조성물은 수성 완충 용액으로 환자에게 제공될 수 있다 - 이전에 동결된 경우 해동되거나, 이전에 동결건조된 경우 침상에서 수성 완충 용액으로 재구성된다. 완충 용액은 등장성이고, 예를 들어, 근육내 또는 피내 주사에 적합할 수 있다. 일부 구현예에서, 완충 용액은 포스페이트 완충 식염수(PBS)이다.
VI. LNP 백신 제조 프로세스
본 LNP는 다양한 기법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 다층 소포(multilamellar vesicles, MLV)는 적절한 용매에 지질을 용해시킴으로써 적절한 컨테이너 또는 용기의 내벽에 선택된 지질을 침착시킨 다음, 용매를 증발시켜 용기 내부에 박막을 남기거나, 분무 건조하는 것과 같은 통상적인 기법에 따라 제조될 수 있다. 그런 다음 MLV의 형성을 초래하는 볼텍싱 운동으로 수성상이 용기에 첨가될 수 있다. 그런 다음, 단층 소포(ULV)는 다층 소포의 균질화, 초음파처리 또는 압출에 의해 형성될 수 있다. 또한, 단층 소포는 세제 제거 기법에 의해 형성될 수 있다.
다양한 방법이 미국 공개 번호 US 2011/0244026, US 2016/0038432, US 2018/0153822, US 2018/0125989, 및 US 2021/0046192에 기재되어 있으며, LNP 백신을 제조하는 데 사용될 수 있다. 하나의 예시적인 프로세스는 미국 공개 번호 US 2016/0038432에 기재된 바와 같이, 지질을 먼저 지질 나노입자로 미리 형성하지 않으면서 mRNA를 지질의 혼합물과 혼합함으로써 mRNA를 캡슐화하는 것을 수반한다. 또 다른 예시적인 프로세스는 미국 공개 번호 US 2018/0153822에 기재된 바와 같이, 미리 형성된 LNP를 mRNA와 혼합함으로써 mRNA를 캡슐화하는 것을 수반한다.
일부 구현예에서, mRNA-로딩된 LNP를 제조하는 프로세스는 용액 중 하나 이상을 주변 온도보다 높은 온도까지 가열하는 단계를 포함하며, 하나 이상의 용액은 미리 형성된 지질 나노입자를 포함하는 용액, mRNA를 포함하는 용액 및 LNP-캡슐화된 mRNA를 포함하는 혼합 용액이다. 일부 구현예에서, 프로세스는 혼합 단계 이전에, mRNA 용액 및 미리 형성된 LNP 용액 중 하나 또는 둘 모두를 가열하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 프로세스는 미리 형성된 LNP를 포함하는 용액, mRNA를 포함하는 용액 및 LNP-캡슐화된 mRNA를 포함하는 용액 중 하나 이상을 혼합 단계 동안 가열하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 프로세스는 혼합 단계 후에 LNP-캡슐화된 mRNA를 가열하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 용액 중 하나 이상이 가열되는 온도는 약 30℃, 37℃, 40℃, 45℃, 50℃, 55℃, 60℃, 65℃, 또는 70℃이거나, 이보다 높다. 일부 구현예에서, 용액 중 하나 이상이 가열되는 온도는 약 25 내지 70℃, 약 30 내지 70℃, 약 35 내지 70℃, 약 40 내지 70℃, 약 45 내지 70℃, 약 50 내지 70℃, 또는 약 60 내지 70℃의 범위이다. 일부 구현예에서, 온도는 약 65℃이다.
본 개시내용에 적합한 mRNA 용액을 제조하기 위해 다양한 방법이 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, mRNA는 본원에 기재된 완충 용액에 직접 용해될 수 있다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은 캡슐화를 위해 지질 용액과 혼합하기 전에 mRNA 스톡 용액을 완충 용액과 혼합함으로써 생성될 수 있다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은 캡슐화를 위해 지질 용액과 혼합하기 직전에 mRNA 스톡 용액을 완충 용액과 혼합함으로써 생성될 수 있다. 일부 구현예에서, 적합한 mRNA 스톡 용액은 약 0.2 mg/ml, 0.4 mg/ml, 0.5 mg/ml, 0.6 mg/ml, 0.8 mg/ml, 1.0 mg/ml, 1.2 mg/ml, 1.4 mg/ml, 1.5 mg/ml, 또는 1.6 mg/ml, 2.0 mg/ml, 2.5 mg/ml, 3.0 mg/ml, 3.5 mg/ml, 4.0 mg/ml, 4.5 mg/ml, 또는 5.0 mg/ml 이상의 농도로 물 또는 완충액에 mRNA를 함유할 수 있다.
일부 구현예에서, mRNA 스톡 용액은 펌프를 사용하여 완충 용액과 혼합된다. 예시적인 펌프는 기어 펌프, 연동 펌프 및 원심 펌프를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 전형적으로, 완충 용액은 mRNA 스톡 용액보다 더 큰 속도로 혼합된다. 예를 들어, 완충 용액은 mRNA 스톡 용액의 속도보다 적어도 1x, 2x, 3x, 4x, 5x, 6x, 7x, 8x, 9x, 10x, 15x, 또는 20x 더 큰 속도로 혼합될 수 있다. 일부 구현예에서, 완충 용액은 약 100 내지 6000 ml/분(예를 들어, 약 100 내지 300 ml/분, 300 내지 600 ml/분, 600 내지 1200 ml/분, 1200 내지 2400 ml/분, 2400 내지 3600 ml/분, 3600 내지 4800 ml/분, 4800 내지 6000 ml/분, 또는 60 내지 420 ml/분) 범위의 유량으로 혼합된다. 일부 구현예에서, 완충 용액은 약 60 ml/분, 100 ml/분, 140 ml/분, 180 ml/분, 220 ml/분, 260 ml/분, 300 ml/분, 340 ml/분, 380 ml/분, 420 ml/분, 480 ml/분, 540 ml/분, 600 ml/분, 1200 ml/분, 2400 ml/분, 3600 ml/분, 4800 ml/분, 또는 6000 ml/분 이상의 유량으로 혼합된다.
일부 구현예에서, mRNA 스톡 용액은 약 10 내지 600 ml/분(예를 들어, 약 5 내지 50 ml/분, 약 10 내지 30 ml/분, 약 30 내지 60 ml/분, 약 60 내지 120 ml/분, 약 120 내지 240 ml/분, 약 240 내지 360 ml/분, 약 360 내지 480 ml/분, 또는 약 480 내지 600 ml/분) 범위의 유량으로 혼합된다. 일부 구현예에서, mRNA 스톡 용액은 약 5 ml/분, 10 ml/분, 15 ml/분, 20 ml/분, 25 ml/분, 30 ml/분, 35 ml/분, 40 ml/분, 45 ml/분, 50 ml/분, 60 ml/분, 80 ml/분, 100 ml/분, 200 ml/분, 300 ml/분, 400 ml/분, 500 ml/분, 또는 600 ml/분 이상의 유량으로 혼합된다.
원하는 mRNA의 지질 나노입자로의 혼입의 프로세스는 "로딩"으로 지칭된다. 예시적인 방법은 문헌[Lasic et al., FEBS Lett. (1992) 312:255-8]에 기재되어 있다. LNP-혼입된 핵산은 지질 나노입자의 이중층 막 내에서 지질 나노입자의 내부 공간에 완전히 또는 부분적으로 위치되거나, 지질 나노입자 막의 외부 표면과 회합될 수 있다. 지질 나노입자로의 mRNA의 혼입은 본원에서 "캡슐화"라고도 지칭되며, 핵산은 지질 나노입자의 내부 공간 내에 완전히 또는 실질적으로 포함된다.
적합한 LNP는 다양한 크기로 제조될 수 있다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자의 감소된 크기는 mRNA의 보다 효율적인 전달과 관련이 있다. 적절한 LNP 크기의 선택은 표적 세포 또는 조직의 부위 및 어느 정도 지질 나노입자가 제조되는 적용을 고려할 수 있다.
다양한 방법이 지질 나노입자의 집단의 크기결정에 이용 가능하다. 다양한 구현예에서, 본원의 방법은 LNP 입자 크기를 측정하기 위해 Zetasizer Nano ZS(Malvern Panalytical)를 활용한다. 한 프로토콜에서, 10 μl의 LNP 샘플이 990 μl의 10% 트레할로스와 혼합된다. 이러한 용액을 큐벳 내에 로딩한 다음, Zetasizer 기계에 넣는다. z-평균 직경(nm), 또는 누적 평균은 샘플의 LNP에 대한 평균 크기로 간주된다. Zetasizer 기계는 동적 광 산란(DLS) 및 자기상관 함수의 누적 분석을 사용하여 다분산 지수(PDI)를 측정하는 데에도 사용될 수 있다. 평균 LNP 직경은 형성된 LNP의 초음파처리에 의해 감소될 수 있다. 간헐적인 초음파처리 주기는 준탄성 광 산란(QELS) 평가와 교번하며 효율적인 지질 나노입자 합성을 가이드할 수 있다.
일부 구현예에서, 대부분의 정제된 LNP, 즉, LNP의 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 초과가 약 70 내지 150 nm (예를 들어, 약 145 nm, 약 140 nm, 약 135 nm, 약 130 nm, 약 125 nm, 약 120 nm, 약 115 nm, 약 110 nm, 약 105 nm, 약 100 nm, 약 95 nm, 약 90 nm, 약 85 nm, 또는 약 80 nm)의 크기를 갖는다. 일부 구현예에서, 실질적으로 모든(예를 들어, 80% 또는 90% 초과)의 정제된 지질 나노입자가 약 70 내지 150 nm(예를 들어, 약 145 nm, 약 140 nm, 약 135 nm, 약 130 nm, 약 125 nm, 약 120 nm, 약 115 nm, 약 110 nm, 약 105 nm, 약 100 nm, 약 95 nm, 약 90 nm, 약 85 nm, 또는 약 80 nm)의 크기를 갖는다.
특정한 구현예에서, LNP는 30 내지 200 nm의 평균 직경을 갖는다.
다양한 구현예에서, LNP는 80 내지 150 nm의 평균 직경을 갖는다.
일부 구현예에서, 본 조성물 중 LNP는 150 nm 미만, 120 nm 미만, 100 nm 미만, 90 nm 미만, 80 nm 미만, 70 nm 미만, 60 nm 미만, 50 nm 미만, 30 nm 미만, 또는 20 nm 미만의 평균 크기를 갖는다.
일부 구현예에서, 본 조성물 내의 LNP의 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 초과가 약 40 내지 90 nm (예를 들어, 약 45 내지 85 nm, 약 50 내지 80 nm, 약 55 내지 75 nm, 또는 약 60 내지 70 nm) 또는 약 50 내지 70 nm (예를 들어, 55 내지 65 nm) 범위의 크기를 가지며, 분무를 통한 폐 전달용으로 적합하다.
일부 구현예에서, 본 개시내용에 의해 제공되는 약제학적 조성물 내의 LNP의 분산도 또는 분자의 크기의 이질성(PDI)의 측정치는 약 0.5 미만이다. 일부 구현예에서, LNP는 약 0.5 미만, 약 0.4 미만, 약 0.3 미만, 약 0.28 미만, 약 0.25 미만, 약 0.23 미만, 약 0.20 미만, 약 0.18 미만, 약 0.16 미만, 약 0.14 미만, 약 0.12 미만, 약 0.10 미만, 또는 약 0.08 미만의 PDI를 갖는다. PDI는 전술한 바와 같이 Zetasizer 기계에 의해 측정될 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 약제학적 조성물 중 정제된 LNP의 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 초과는 각각의 개별 입자 내에서 mRNA를 캡슐화한다. 일부 구현예에서, 실질적으로 모든 (예를 들어, 80% 또는 90% 초과의) 약제학적 조성물 중 정제된 지질 나노입자는 각각의 개별 입자 내에서 mRNA를 캡슐화한다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자는 50% 내지 99%; 또는 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 98%, 또는 99% 초과의 캡슐화 효율을 갖는다. 전형적으로, 본원에서 사용하기 위한 지질 나노입자는 적어도 90%(예를 들어, 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 또는 95%)의 캡슐화 효율을 갖는다.
일부 구현예에서, LNP는 1 내지 10의 N/P 비를 갖는다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자는 1 초과, 약 1, 약 2, 약 3, 약 4, 약 5, 약 6, 약 7, 또는 약 8의 N/P 비를 갖는다. 특정한 구현예에서, 본원의 전형적인 LNP는 4의 N/P 비를 갖는다.
일부 구현예에서, 본 개시내용에 따른 약제학적 조성물은 적어도 약 0.5 μg, 1 μg, 5 μg, 10 μg, 100 μg, 500 μg, 또는 1000 μg의 캡슐화된 mRNA를 함유한다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 약 0.1 μg 내지 1000 μg, 적어도 약 0.5 μg, 적어도 약 0.8 μg, 적어도 약 1 μg, 적어도 약 5 μg, 적어도 약 8 μg, 적어도 약 10 μg, 적어도 약 50 μg, 적어도 약 100 μg, 적어도 약 500 μg, 또는 적어도 약 1000 μg의 캡슐화된 mRNA를 함유한다.
일부 구현예에서, mRNA는 화학 합성 또는 DNA 주형의 시험관내 전사(IVT)에 의해 제조될 수 있다. 이러한 프로세스인, IVT 프로세스에서, cDNA 주형은 mRNA 전사물을 생산하기 위해 사용되고, DNA 주형은 DNase에 의해 분해된다. 전사물은 심층 여과 및 접선류 여과(TFF)에 의해 정제된다. 정제된 전사물은 캡과 꼬리를 첨가하여 추가로 변형되며, 변형된 RNA는 심층 여과 및 TFF에 의해 다시 정제된다.
그런 다음 mRNA는 수성 완충액에서 제조되고, LNP의 지질 구성요소를 함유하는 양친매성 용액과 혼합된다. LNP의 4가지 지질 구성요소를 용해시키기 위한 양친매성 용액은 알코올 용액일 수 있다. 일부 구현예에서, 알코올은 에탄올이다. 수성 완충액은 예를 들어 시트레이트, 포스페이트, 아세테이트 또는 숙시네이트 완충액일 수 있고, 약 3.0 내지 7.0, 예를 들어, 약 3.5, 약 4.0, 약 4.5, 약 5.0, 약 5.5, 약 6.0, 또는 약 6.5의 pH를 가질 수 있다. 완충액은 염(예를 들어, 나트륨, 칼륨 및/또는 칼슘 염)과 같은 다른 구성요소를 함유할 수 있다. 특정 구현예에서, 수성 완충액은 1 mM 시트레이트, 150 mM NaCl, pH 4.5를 갖는다.
mRNA-LNP 조성물을 제조하기 위한 예시적이고 비제한적인 프로세스는 완충된 mRNA 용액을 에탄올 내의 지질의 용액과 제어된 균질한 방식으로 혼합하는 단계를 포함하며, 지질:mRNA의 비는 혼합 프로세스 전체에 걸쳐 유지된다. 이러한 예시적인 예에서, mRNA는 시트르산 일수화물, 삼나트륨 시트레이트 이수화물 및 염화나트륨을 함유하는 수성 완충액 내에 제시된다. mRNA 용액이 용액(1 mM 시트레이트 완충액, 150 mM NaCl, pH 4.5)에 첨가된다. 네 가지 지질(예를 들어, 양이온성 지질, PEG화된 지질, 콜레스테롤계 지질, 및 헬퍼 지질)의 지질 혼합물이 에탄올에 용해된다. mRNA 수용액과 에탄올 지질 용액은 거의 "무펄스" 펌프 시스템을 갖는 "T" 혼합기에서 4:1의 부피 비로 혼합된다. 생성된 혼합물은 이후 다운스트림 정제 및 완충액 교환을 거친다. 완충액 교환은 투석 카세트 또는 TFF 시스템을 사용하여 달성될 수 있다. TFF는 T-mix 프로세스를 통한 형성 직후 생성된 초기 LNP를 농축 및 완충액-교환하는 데 사용될 수 있다. 다이아필트레이션 프로세스는 투과물 흐름과 동일한 속도로 적절한 완충액을 첨가하여 부피를 일정하게 유지하는 연속 작업이다.
VII. hMPV 백신의 패키징 및 용도
본원에 기재된 하나 이상의 hMPV F 폴리펩티드 항원은 백신으로서 대상체에 투여될 수 있다. 본원에 기재된 hMPV 백신은 비경구(예를 들어, 근육내, 피내 또는 피하) 투여 또는 비인두(예를 들어, 비강내) 투여를 위해 제형화되거나 패키징될 수 있다. 다양한 구현예에서, hMPV 백신은 폐 투여를 위해 제형화되거나 패키징될 수 있다. 다양한 구현예에서, hMPV 백신은 정맥내 투여를 위해 제형화되거나 패키징될 수 있다. 백신 조성물은 즉석 제형의 형태일 수 있으며, 조성물은 동결건조되고 사용 직전에 생리학적 완충액(예를 들어 PBS)으로 재구성된다. 백신 조성물은 또한 수용액 또는 냉동 수용액의 형태로 운송 및 제공될 수 있고, 재구성 없이 대상체에게 직접 투여될 수 있다(이전에 냉동된 경우, 해동 후).
따라서, 본 개시내용은 단일 컨테이너에 hMPV 백신을 제공하거나 하나의 컨테이너(예를 들어 제1 컨테이너)에 hMPV 백신 그리고 또 다른 컨테이너(예를 들어 제2 컨테이너)에 재구성을 위한 생리학적 완충액을 제공하는 키트와 같은 제조 물품을 제공한다. 컨테이너(들)는 일회-사용 투여량 또는 다회-사용 투여량을 함유할 수 있다. 컨테이너(들)는 전처리된 유리 바이알 또는 앰플일 수 있다. 제조 물품은 사용 설명서도 포함할 수 있다.
hMPV 백신의 투여 방법은 피내, 근육내, 복강내, 정맥내, 피하, 비강내, 기관내, 경막외 및 경구 경로를 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 조성물은 임의의 편리한 경로에 의해, 예를 들어 주입 또는 볼루스 주사에 의해, 상피 또는 점막피부 내벽(예를 들어 경구 점막, 직장 및 내장 점막 등)을 통한 흡수에 의해 투여될 수 있으며, 다른 생물학적 활성제와 함께 투여될 수 있다.
특히 예시적인 구현예에서, 백신은 주사에 의해 근육내(IM) 투여된다. hMPV 백신은 예를 들어, 상완의 삼각근에서 대상체 내로 주사될 수 있다. 이러한 구현예에서, 주사 가능 물질(injectable)은 통상적인 형태로, 즉 액체 용액 또는 현탁액 또는, 주사 전에 액체 내의 용액 또는 현탁액에 적합한 고체 형태로, 또는 에멀션으로 제조될 수 있다. 일부 구현예에서, 주사 용액 및 현탁액은 멸균 분말, 동결건조 분말 또는 과립으로부터 제조된다.
본원에 기재된 약제학적 조성물은 선택적으로 사전 충전된 표준 바늘 및 시린지를 이용하여 예를 들어 근육내로, 피하로 또는 정맥내로 전달될 수 있다. 추가로, 펜 전달 디바이스(예를 들어 주사기(예를 들어 단일-챔버형 또는 다중-챔버형) 또는 자동주사기 펜)는 본원에 기재된 약제학적 조성물을 전달하는 데 적용된다. 이러한 펜 전달 디바이스는 재사용 가능하거나 일회용일 수 있다. 일부 구현예에서, 백신은 흡입에 사용하기 위해 제공되고, 사전 충전된 펌프, 에어로졸화기 또는 흡입기에 제공된다. 특정한 구현예에서, 사전 충전형 시린지는 비강내 전달을 위한 점적 투여에 활용될 수 있다.
hMPV 백신은 예방적 유효량, 즉, 충분한 시간의 양(예를 들어, 1년, 2년, 5년, 10년, 또는 평생) 동안 표적 병원체에 대해 충분한 면역 보호를 제공하는 양으로 이를 필요로 하는 대상체에 투여될 수 있다. 예를 들어, 충분한 면역 보호는 병원체에 의한 감염과 관련된 증상의 예방 또는 완화일 수 있다. 일부 구현예에서, 백신의 다회 용량(예를 들어, 2회 용량)은 원하는 예방적 효과를 달성하기 위해 이를 필요로 하는 대상체에 투여된다(예를 들어, 주사된다). 용량(예를 들어, 프라임 및 부스터 용량)은 적어도, 예를 들어, 2주, 3주, 4주, 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 1년, 2년, 5년, 또는 10년의 간격만큼 분리될 수 있다.
VIII. 약제학적 조성물
본 개시내용에 따라 정제된 hMPV 폴리펩티드 항원은 예를 들어, 백신으로서 사용하기 위한 약제학적 조성물의 구성요소로서 유용할 수 있다. 이들 조성물은 전형적으로 RNA 또는 결합 폴리펩티드 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 것이다. 본 개시내용의 약제학적 조성물은 또한 소분자 면역강화제(예를 들어, TLR 작용제)와 같은 하나 이상의 추가 구성요소를 포함할 수 있다. 본 개시내용의 약제학적 조성물은 또한 리포좀, 수중유 에멀션 또는 마이크로입자와 같은 RNA용 전달 시스템을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 지질 나노입자(LNP)를 포함한다. 특정한 구현예에서, 조성물은 LNP 내에 캡슐화된 항원 인코딩 핵산 분자를 포함한다.
hMPV 결합 폴리펩티드를 환자에 투여하는 단계를 포함하는 방법으로서, hMPV 결합 폴리펩티드 길항제는 약제학적 조성물 내에 함유되어 있는, 방법이 제공된다. 본원에 기재된 약제학적 조성물은 적절한 담체, 부형제, 및 적절한 운반, 전달, 내약성 등을 제공하는 기타 작용제(agent)와 함께 제형화된다. 다수의 적절한 제형은 모든 약제사에게 공지된 처방서인 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA]에서 찾아볼 수 있다. 이들 제형은, 예를 들어 분말, 페이스트, 연고, 젤리, 왁스, 오일, 지질, 지질(양이온성 또는 음이온성) 함유 소포(예컨대 LIPOFECTIN™), DNA 접합체, 무수 흡수 페이스트, 수중유 및 유중수 에멀션, 에멀션 카보왁스(다양한 분자량의 폴리에틸렌 글리콜), 반고체 겔, 및 카보왁스를 포함하는 반고체 혼합물을 포함한다. 또한 문헌[Powell et al. "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA (1998) J Pharm Sci Technol. 52:238-311]을 참조한다.
다양한 전달 시스템이 알려져 있고, 본원에 기재된 약제학적 조성물, 예를 들어, 리포좀, 마이크로입자, 마이크로캡슐 내의 캡슐화, 돌연변이 바이러스를 발현시킬 수 있는 재조합 세포, 수용체 매개된 세포내이입을 투여하기 위해 사용될 수 있다 (예를 들어, 문헌[Wu et al., 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432] 참조). 투여 방법은 피내, 근육내, 복강내, 정맥내, 피하, 비강내, 기관내, 경막외 및 경구 경로를 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 조성물은 임의의 편리한 경로에 의해, 예를 들어 주입 또는 볼루스 주사에 의해, 상피 또는 점막피부 내벽(예를 들어 경구 점막, 직장 및 내장 점막 등)을 통한 흡수에 의해 투여될 수 있으며, 다른 생물학적 활성제와 함께 투여될 수 있다.
본원에 기재된 약제학적 조성물은 표준 바늘 및 시린지(예를 들어, 사전 충전형 시린지)를 이용하여 피하 또는 정맥내 전달될 수 있다. 또한, 피하 전달과 관련하여, 펜 전달 디바이스(예를 들어, 자동주사기 펜)는 본원에 기재된 약제학적 조성물을 전달하는 데 용이하게 적용된다.
부비동에 직접 투여하기 위해, 본원에 기재된 약제학적 조성물은 예를 들어, 마이크로카테터(예를 들어, 내시경 및 마이크로카테터), 에어로졸화기, 분말 디스펜서, 분무기, 또는 흡입기를 사용하여 투여될 수 있다. 방법은 에어로졸화 제형으로 hMPV 결합 폴리펩티드를 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 것을 포함한다. 에어로졸화 항체는 예를 들어, 본원에 그 전문이 참조로 포함되는 미국 특허 번호 US 8,178,098에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다.
주사용 제제는 정맥내, 피하, 피내 및 근육내 주사, 점적 주입 등을 위한 투여형을 포함할 수 있다. 이들 주사 가능한 제제는 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 주사용 제제는 예를 들어, 주사용으로 통상적으로 사용되는 멸균 수성 매질(medium) 또는 유성 매질 내에 전술한 항체 또는 이의 염을 용해, 현탁, 또는 유화시킴으로써 제조될 수 있다. 주사용 수성 매질로서, 예를 들어, 생리 식염수, 글루코스 및 다른 보조제를 함유하는 등장성 용액 등이 있으며, 이는 알코올(예를 들어, 에탄올), 폴리알코올(예를 들어, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜), 비이온성 계면활성제(예를 들어, 폴리소르베이트 80, HCO-50(수소화된 피마자유의 폴리옥시에틸렌(50 mol) 부가물)) 등과 같은 적절한 가용화제와 조합하여 사용될 수 있다. 유성 매질로서, 예를 들어, 참기름, 대두유 등이 사용되며, 이들은 벤질 벤조에이트, 벤질 알코올 등과 같은 가용화제와 조합하여 사용될 수 있다. 이와 같이 제조된 주사제(injection)는 전형적으로 적절한 앰플 내에 채워진다.
유리하게는, 전술한 경구 또는 비경구 사용을 위한 약제학적 조성물은 활성 성분의 용량에 맞추기에 적합한 단위 용량의 투여형으로 제조된다. 단위 용량의 이러한 투여형은 예를 들어 정제, 환제, 캡슐제, 주사제(앰플), 좌제 등을 포함한다.
IX. 백신접종 방법
본원에 개시된 hMPV 백신은 hMPV F 단백질에 대한 면역 반응을 유도하기 위해 대상체에게 투여될 수 있으며, 대상체에서 항-항원 항체 역가는 본원에 개시된 hMPV 백신으로 백신접종되지 않은 대상체에서의 항-항원 항체 역가에 비해 또는 hMPV에 대한 대안적 백신에 비해 백신접종 후 증가된다. "항-항원 항체"는 항원에 특이적으로 결합하는 혈청 항체이다.
일 양태에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 hMPV 백신을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, hMPV에 대한 면역 반응을 유발하거나 hMPV 감염으로부터 대상체를 보호하는 방법을 제공한다. 본 개시내용은 또한 hMPV에 대한 면역 반응을 유발하거나 hMPV 감염으로부터 대상체를 보호하는데 사용하기 위한 본원에 기재된 hMPV 백신을 제공한다. 본 개시내용은 또한 hMPV에 대한 면역 반응을 유발하거나 hMPV 감염으로부터 대상체를 보호하기 위한 백신의 제조에 사용하기 위한 본원에 기재된 hMPV mRNA를 제공한다.
특정한 구현예에서, 대상체는 아쥬반트와 공동-투여되는 hMPV 단백질 백신이 투여된 대상체에 비해 hMPV 백신의 투여 후 hMPV에 대한 중화 항체의 유사한 혈청 농도를 갖는다.
특정한 구현예에서, hMPV 백신은 hMPV F 단백질의 부위 Ø에 대한 결합 특이성을 갖는 항체의 혈청 농도를 증가시킨다.
특정한 구현예에서, hMPV 백신은 hMPV F 단백질의 부위 V에 대한 결합 특이성을 갖는 항체의 혈청 농도를 증가시킨다.
특정한 구현예에서, hMPV 백신은 기존 hMPV 면역성을 갖는 대상체에서 중화 항체의 혈청 농도를 증가시킨다.
본 발명이 보다 잘 이해될 수 있도록, 하기 실시예가 제시된다. 이들 실시예는 단지 예시를 위한 것이며, 임의의 방식으로 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
실시예
특정 구현예에 대한 전술한 설명은 본 개시내용의 일반적인 속성을 완전히 밝힐 것이며, 그에 따라 다른 사람은 당업계 내의 지식을 적용함으로써, 본 개시내용의 일반 개념으로부터 벗어나지 않으면서 과도한 실험 없이 이러한 특정 구현예를 다양한 적용에 맞도록 용이하게 변형하고/하거나 조정시킬 수 있을 것이다. 따라서, 본원에 제시된 교시 및 지침에 기초하여 이러한 조정 및 변형은 개시된 구현예의 균등물의 의미 및 범위 내에 있는 것으로 하고자 한다. 본원에서의 표현 및 용어는 제한을 위한 것이 아니라 설명을 위한 것이므로, 본 명세서의 용어 또는 표현은 교시 및 지침에 비추어 당업자에 의해 해석되어야 하는 것으로 이해되어야 한다.
실시예 1: 융합전 안정화된 hMPV F 당단백질 항원 작제물의 생성
융합전 입체형태의 안정성을 개선시키고 정제를 강화하고 더 높은 중화 항체 역가를 유도하기 위해, 캐나다 지정 A2-CAN97-83(SEQ ID NO: 1)으로부터의 A2 아형에 기초하여 야생형 hMPV-F 항원에서 돌연변이를 갖는 후보 hMPV 융합전 F 항원 작제물의 패널을 설계하였다.
후보 hMPV 융합전 F 항원 작제물의 패널에 대한 설계 고려의 그래픽 표현을 2개의 예시적인 작제물, D185P(SEQ ID NO: 5) 및 T160F/N46V(SEQ ID NO: 7)에 대해 도 1에 도시한다. 각각의 작제물은 하기 특징을 함유하였다: (1) 신호 펩티드; (2) 아미노산 100 내지 101에서의 pre-F 절단 부위 돌연변이(QS로부터 RR로); (3) 막관통 도메인 및 세포질 꼬리의 제거; (4) 피브리틴 모티프(즉, 폴돈 도메인)의 추가; (5) HRV-3C 절단 부위; (6) 8x His 태그 및 Strep II 태그; 및 (7) 항목 (4) 내지 (6)에 적절한 링커(SEQ ID NO: 3).
이러한 백본으로부터, 인 실리코(in silico) 분석을 수행하여, 충전 캐비티 돌연변이 또는 계면 안정성 돌연변이를 추가함으로써 pre-F 입체형태 안정성을 증가시킬 단일- 또는 이중-점 돌연변이를 결정하였다. 전체적으로, 후보 hMPV 융합전 F 항원의 패널은 표 1의 1열에 나타나 있는 바와 같은 21개의 상이한 작제물로 이루어졌다.
실시예 2: 융합전 안정화된 hMPV F 항원 작제물에 대한 단백질 발현의 평가
후보 hMPV 융합전 F 항원 작제물 각각에 대한 핵산 분자를 단리하고, 발현 벡터 내로 클로닝하였다. 각각의 작제물에 대한 단백질 발현의 생성을 Expi293F 인간 세포를 사용하여 포유동물 일시적 형질감염 시 평가하였다. 작제물의 형질감염 후 24시간째에, 웨스턴 블롯에 의한 분석을 위해 세포 용해물 또는 상층액을 회수하였다.
21개의 후보 설계 중에서, 9개의 단백질 항원을 생산하였다. 그러나, 단지 4개의 단백질 항원만 1 L 배양물로부터 SDS-PAGE에 의해 결정된 바와 같이 90% 이상의 순도를 가졌다. 모든 21개의 작제물에 대한 단백질 발현 특징을 표 1에 나타낸다. 높은 단백질 생산 및 순도를 갖는 작제물은 하기 돌연변이를 가졌다: D185P, T160F_N46V, K138F 및 G366F_K362F.
표 1 - 21개-후보 hMPV 융합전 F 항원 작제물의 단백질 발현 특징
Figure pct00028
Figure pct00029
실시예 3: 마우스에서 융합전 안정화된 hMPV F 항원 단백질 작제물의 면역원성
표 1에 기재된 90% 이상의 순도를 갖는 4개의 후보 hMPV F 항원 작제물을 후속적으로 A1 계통으로부터의 참조 hMPV-F 단백질과 비교하여 마우스에서 면역원성에 대해 평가하였다.
표 2에 나타낸 바와 같이 8마리의 BALB/c 마우스(N=8)의 그룹에 0.5 μg 용량의, 알루미늄 하이드록사이드(Al(OH)3)와 아쥬반트화된 단백질 항원을 제0일(D) 및 D21에 근육내(IM) 주사에 의해 투여하였다. 모든 마우스에서 채혈을 행하고, 혈청을 각각의 백신 투여 전에, 뿐만 아니라 마지막 백신접종 후 2주(D35)째에 추출하였다. 그 후에, 혈청을 사용하여 효소-결합 면역흡착 검정(ELISA)(도 2)에 의해 그리고 hMPV 미세중화 검정(도 3)에 의해 측정된 바와 같은 순환형 항-hMPV-F IgG 역가를 결정하여 항체 반응의 중화 활성을 결정하였다. post-F 그룹 내 모든 단백질이 실제로 post-F 입체형태로 있도록 보장하기 위해, 단백질을 70℃까지 10분 동안 가열한 후 투여용으로 제조하였다.
표 2 - 마우스에서 hMPV F 항원 백신 연구 설계
Figure pct00030
데이터는, A2-K138F 돌연변이를 갖는 작제물이 hMPV-F ELISA에 의해 가장 높은 결합 항체 역가를 유도하였고, A2-T160F_N46V, A2-G366F_K362F 및 마지막으로 A2-D185P가 그 뒤를 이었음을 보여준다(도 2). hMPV A2-GFP 바이러스를 사용한 미세중화에 의해 평가되었을 때, A2-T160F_N46V가 가장 높은 중화 역가를 가졌고, A2-K138F, A2-D185P 및 A2-G366F_K362F가 그 뒤를 이었다(도 3).
A2-K138F는 가장 높은 결합 항체 역가 및 두 번째로 가장 높은 중화 항체 역가를 가졌지만, 이 작제물은 용액에서 응집물을 형성하는 것으로 발견되었으며, 이는 잠재적인 부적절한 단백질 접힘을 나타내고, 따라서 추가 평가로부터 탈락시켰다. 또한 A2-G366F_K362F는 두 번째로 가장 낮은 결합 항체 역가 및 가장 낮은 중화 항체 역가를 가졌기 때문에 추가 평가로부터 탈락시켰다. 따라서, A2-D185P 및 A2-T160F_N46V는 가장 높은 품질의 항체를 유도하는 것으로 발견되었으며, 실시예 4에 기재된 바와 같이 순도, 크기 및 열 안정성을 평가하기 위한 고급 해석적 분석(advanced analytic analysis)을 위해 선택되었다.
실시예 4: 융합전 안정화된 hMPV F 항원 작제물의 물리화학적 특징규명
A2-D185P 및 A2-T160F_N46V 작제물로부터 생산된 단백질의 순도, 크기 및 열 안정성을 추가로 특징규명하기 위해, HP-SEC, SEC-HPLC, SEC-MALS 및 nanoDSF 분석을 수행하였다.
순도 및 크기
HP-SEC, SEC-HPLC 및 SEC-MALS 분석에 대한 결과를 하기 표 3에 요약한다.
표 3 - 융합전 안정화된 hMPV F 항원 작제물 및 대조군에 대한 SEC 평가의 요약.
Figure pct00031
MALS로부터 분자량(MW)을 삼량체 피크에 대해 결정하였다. SEC-HPLC에 대한 조건은 하기와 같았다: TSK 3000SWxl SEC 컬럼, 포스페이트 완충액(0.2 M NaH2PO4, 0.1 M 아르기닌, 1% IPA, pH 6.5), 유량 0.5 ml/분. SEC-MALS에 대한 조건은 하기와 같았다: 1.7 μM, 200 Å BEH 단백질 컬럼, 및 pH 7.5에서 50 mM 트리스 완충액, 유량 0.3 ml/분.
도 4는 참조 A1 단백질인 A1-A185P와 A1-post-F, 및 그 아래에 A2 단백질 항원 후보인 A2-T160F_N46V와 A2-D185P에 대한 SEC-MALS 결과를 나타낸다. 모든 4개의 단백질에 대한 데이터를 또한 표 3에 요약한다. 두 A1 참조 단백질 모두는 98.8% 이상의 삼량체 형성 및 A1-A185P 및 A1-post-F 각각에 대해 224 kDa 및 283 kDa의 MW를 보여준다. A2-T160F_N46V 및 A2-D185P 작제물로부터의 단백질은 267 kDa 및 224 kDa의 MW를 각각 갖는 97.4% 및 97.1% 삼량체로 구성되었다.
열 안정성
A1-pre-F 및 A1-post-F 단백질뿐만 아니라 A2 후보 단백질 항원, A2-T160F_N46V 및 A2-D185P의 대형 및 소형 배치(batch) 로트 둘 모두에서 나노스케일 시차 주사 형광측정법(nanoDSF: nanoscale differential scanning fluorimetry)을 사용하여 단백질 변성의 개시 온도(Tonset) 및 융점(Tm)을 결정하였다. 샘플을 제형 완충액에서 0.5 mg/ml의 최종 농도로 희석시키고, 2회 반복으로 nanoDSF 모세관 내에 로딩하였다. nanoDSF 디바이스를 사용하여 모든 측정을 수행하였다. 가열 속도는 20℃로부터 95℃까지 분당 1.5℃였다. 데이터를 기록하고, PR.Stability Analysis v1.01을 사용하여 분석하였다.
도 5는 60.12℃ 및 86.7℃의 Tm 값을 각각 산출하는 A1-preF(A185P) 및 A2-postF(n=3)에 대한 용융 곡선을 도시한다. 이 데이터는, nanoDSF가 용융 온도에서 대략 27℃ 차이로 A1 융합전 항원과 A1 융합후 항원을 구별할 수 있었음을 보여준다.
흥미롭게도, 도 6에 도시된 바와 같이 A2 hMPV-F 후보 단백질 항원의 열안정성 특성을 비교할 때, A2-T160F_N46V 작제물로부터 유래된 단백질은 A2-D185P 작제물로부터 생산된 더 최소한으로 조작된 단백질보다 열안정성이 있는 것으로 발견되었으며, 이때 융점은 거의 9℃ 증가하였다(각각 Tm 70.4℃ 및 79.3℃).
실시예 5: 융합전 안정화된 hMPV F 항원 작제물을 인코딩하는 mRNA
hMPV F 항원 작제물의 면역원성을 추가로 개선시킬 수 있는지 결정하기 위해, A2-D185P 및 A2-T160F_N46V 작제물을 mRNA-기반 백신에서 테스트하기 위해 선택하였다. A2-D185P 및 A2-T160F_N46V 작제물에 대한 아미노산 서열은 각각 SEQ ID NO: 9 및 SEQ ID NO: 11에 제시되어 있다. A2-D185P 및 A2-T160F_N46V 작제물에 대한 mRNA ORF는 각각 SEQ ID NO: 6 및 SEQ ID NO: 8에 제시되어 있다. A2-D185P 및 A2-T160F_N46V 작제물에 대한 코돈-최적화된 mRNA ORF는 각각 SEQ ID NO: 17 및 SEQ ID NO: 18에 제시되어 있다.
본원에 기재된 mRNA는 hMPV F 단백질 항원을 인코딩하는 오픈 리딩 프레임(ORF), 적어도 하나의 5' 비번역 영역(5' UTR), 적어도 하나의 3' 비번역 영역(3' UTR), 및 적어도 하나의 폴리아데닐화(폴리(A)) 서열을 포함하였다. mRNA는 다음의 구조를 갖는 5' 캡을 추가로 포함하였다:
Figure pct00032
5'UTR 및 3'UTR에 대한 핵산 서열은 각각 SEQ ID NO: 13 및 14에 열거되었다.
실시예 6: 마우스에서 융합전 안정화된 hMPV F 항원 mRNA 작제물의 면역원성
mRNA를 발현하는 A2-D185P 및 A2-T160F_N46V 작제물의 상대적 면역원성을 지질 나노입자(LNP)로 제형화된 mRNA를 IM 주사하기 전과 후에 순환 항-hMPV-F 역가를 측정함으로써 마우스에서 테스트하였다. 각각의 mRNA는 40% 양이온성 지질 OF-02, 30% 인지질 DOPE, 1.5% PEG화된 지질 DMGPEG2000 및 28.5% 콜레스테롤로 구성된 LNP 내로 캡슐화되었다. 대안적으로, LNP 지질은 양이온성 지질: PEG화된 지질: 콜레스테롤: 인지질이 40: 1.5: 28.5: 30인 비로 열거될 수 있다.
8마리의 BALB/c 마우스(N=8)의 그룹에, D0 및 D21에 IM 주사를 통해 1 μg 용량을 투여하였다. 모든 마우스에서 채혈을 행하고, 혈청을 각각의 백신 투여 전에, 뿐만 아니라 마지막 백신접종 후 2주(D35)째에 추출하였다. 그 후에, 혈청을 사용하여 ELISA(도 7)에 의해 그리고 hMPV 미세중화 검정(도 8)에 의해 측정된 바와 같은 순환형 항-hMPV-F IgG 역가를 결정하여 항체 반응의 중화 활성을 결정하였다.
mRNA를 발현하는 A2-D185P 및 A2-T160F_N46V 작제물 둘 모두는 hMPV-F ELISA에 의해 모든 시점에서 유사하게 높은 역가의 결합 항체를 유도하였다(도 7). A2-GFP 바이러스를 사용하는 미세중화에 의해 평가하였을 때, 두 작제물 모두에 의해 유사하게 강력한 중화 역가가 유도되었다(도 8). 따라서, 두 항원 모두 mRNA-LNP를 통해 발현되었을 때 유사하게 면역원성이었다.
실시예 7: hMPV 및 RSV에 대한 mRNA 다중-병원체 백신의 합리적 설계
RSV 및 hMPV는 인플루엔자 바이러스에 버금가는 인간 집단 내에서 광범위한 이환을 유발하는 호흡기 바이러스이다(문헌[Collins et al. 2013, Fields Virology. 6 ed: Lippincott Williams and Wilkins]). 질환 부담에도 불구하고, 두 바이러스 모두에 대한 백신 및 치료 전략은 여전히 제한적이다. hMPV와 RSV 표면 당단백질 간의 상당한 상동성뿐만 아니라 두 바이러스 모두에 대한 보호가 더 적은 주사를 초래하고 백신 일정을 단순화할 것이라는 실질적인 고려 사항(문헌[Lauer et al. 2017, Clin Vaccine Immunol. 24(1):e00298-16])을 고려하여, RSV와 hMPV 항원 작제물을 포함하는 조합 mRNA 백신을 설계하였다.
따라서, 두 mRNA를 포함하는 조합 백신: (1) RSV F 항원 작제물, FD3; 및 (2) hMPV F 항원 작제물, A2-CAN97-83이 공동-제형화되었다.
mRNA hMPV 작제물뿐만 아니라 사용된 5' 및 3' UTR은 실시예 6에 기재되어 있다.
사용된 mRNA RSV 작제물은 미국 가특허 출원 일련 번호 63/276,233에 기재되어 있으며, 이는 모든 목적을 위해 그 전문이 참조로 본원에 포함된다.
실시예 8: 마우스에서의 hMPV 및 RSV에 대한 mRNA 다중-병원체 백신의 면역원성
실시예 7에 기재된 바와 같이 hMPV 및 RSV에 대한 mRNA 다중-병원체 백신의 상대적 면역원성을 지질 나노입자(LNP)로 제형화된 mRNA를 IM 주사하기 전과 후에 순환 항-RSV FD3 및 항-hMPV-F 역가를 측정함으로써 마우스에서 평가하였다. 각각의 mRNA는 40% 양이온성 지질 OF-02, 30% 인지질 DOPE, 1.5% PEG화된 지질 DMGPEG2000 및 28.5% 콜레스테롤로 구성된 LNP 내로 캡슐화되었다. 대안적으로, LNP 지질은 양이온성 지질: PEG화된 지질: 콜레스테롤: 인지질이 40: 1.5: 28.5: 30인 비로 열거될 수 있다.
BALB/c 마우스의 5개의 그룹(N=8)은 다음의 양생법에 따라 D0 및 D21에 IM 주사를 통해 면역화되었다: (1) 그룹 1 - 오른쪽 뒷다리에 투여된 50 μL 총 부피에서 cOrn-EE1 LNP로 제형화된 RSV mRNA 1μg을 투여받았으며; (2) 그룹 2 - 오른쪽 뒷다리에 투여된 50 μL 총 부피에서 cOrn-EE1 LNP로 제형화된 hMPV mRNA 1μg을 투여받았으며; (3) 그룹 3 - 단일 cOrn-EE1 LNP 내에 1 μg의 RSV와 1 μg의 hMPV mRNA를 함유하는 공동-제형을 100 μL의 총 부피로 투여하였으며, 50 μL를 각각의 뒷다리에 전달하였고; (4) 그룹 4 - RSV 면역원성 대조군으로서 오른쪽 뒷다리에 투여된 50 μL의 총 부피에서 알룸과 아쥬반트화된 1 μg의 RSV pre-F 단백질 나노입자를 투여받았으며; (5) 그룹 5 - hMPV 면역원성 대조군으로서 오른쪽 뒷다리에 투여된 50 μL의 총 부피에서 알룸과 아쥬반트화된 1 μg의 hMPV pre-F 단백질 나노입자를 투여받았다.
각각의 백신 투여 전뿐만 아니라 마지막 백신접종-후 2주(D35)째에 모든 마우스를 채혈하고, D35 혈청을 ELISA에 의해 테스트하여 순환 항-RSV 및 항-hMPV-F 역가를 결정하였고, 미세중화 검정에 의해 테스트하여, RSV 및 hMPV 항체 반응의 중화 활성을 결정하였다.
RSV mRNA는 단독으로 제공되거나 hMPV와 공동-제형화될 때 RSV-F ELISA에 의해 유사한 역가를 유도하였다(도 9). 유사하게, hMPV mRNA는 단독으로 제공되거나 RSV와 공동-제형화될 때 hMPV-F ELISA에 의해 유사한 역가를 유도하였다(도 10). RSV A2-GFP 바이러스를 사용하는 미세중화로 평가하였을 때, 단독으로 또는 hMPV와 조합하여 전달된 RSV mRNA에 의해 유사하게 강력한 중화 역가가 유도되었다(도 11). hMPV A2-GFP 바이러스를 사용한 미세중화로 평가하였을 때, 단독으로 또는 RSV와 조합하여 전달된 hMPV mRNA에 의해 유사하게 강력한 중화 역가가 유도되었다(도 12). 따라서, 단일 LNP로서 전달된 RSV와 hMPV mRNA의 공동-제형을 이용한 면역화는 단독으로 전달된 항원에 대해서도 유사하게 면역원성이다.
실시예 9: hMPV F 폴리펩티드 항원-항체 결합의 분석
hMPV F 작제물에 대한 항체의 결합을 옥텟으로 테스트하였다. 모든 샘플 및 항체를 운동 완충액(ForteBio 운동 완충액 1X 희석 + PBS)에 희석하여, 각각 최종 농도 5 μg/mL 및 1 μg/mL로 만들었다. 항체를 단백질 A 바이오센서에 로딩하고, 모든 항원의 결합을 다음의 조건으로 테스트하였다: 초기 기준선(120초), 항체의 로딩(180초), 제2 기준선(120초), 항원의 회합(180초), 항원의 해리(120초). 결합 결과를 ForteBio Data Analysis 12.0 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.
표 4는 A2-T160F_N46V 및 A2-D185P가 mAb MPE8, 101F, 338 및 DS7에 대해 예상 결합 패턴을 가졌다는 것을 보여준다.
표 4 - hMPV F 항원성 작제물의 결합 특성
Figure pct00033
실시예 10: hMPV F 항원 발현
HEK293 세포 - 30 만 개의 세포/웰
다음으로, HELA 세포를 2 mL DMEM +10%FBS에서 30 만 개의 세포/웰로 6-웰 플레이트에 플레이팅하였다. 세포를 다음날 리포펙타민 2000을 이용하여 1 μg/웰 hMPV mRNA 작제물로 형질감염시켰다. 세포를 다음날 수확하고, 웰당 500 μL의 RIPA +1x HALT +0.2% Omnicleave에서 용해시켰다. 용해물을 얼음 위에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 15 μL의 용해물을 5 μL NuPAGE LDS 샘플 완충액과 조합하였다.
샘플을 8 내지 16% 구배 SDS-PAGE에서 185 V에서 75분 동안 실행시켰다. 단백질을 니트로셀룰로스 막으로 운반하였다. 블롯은 Intercept 단백질이 없는 차단 완충액으로 실온에서 1시간 동안 차단되었다. 블롯을 Intercept 단백질이 없는 차단 완충액에서 일차 항체인 NBP2-50505 마우스 항-hMPV-F(hMPV24)(Novus)로 4℃에서 밤새 염색하였다. 블롯을 TBST로 3x5분 동안 세척하였다. 블롯을 Intercept 차단 완충액 내의 당나귀 항-마우스 800 이차 항체로 실온에서 1시간 동안 염색하였다. 블롯을 TBST로 4x5분 세척한 다음, Licor Odyssey에서 스캔하였다.
결과를 도 13에 나타내었다. D185P는 예상 분자량 60 kDa 근처에서 강력한 발현을 보였다. T160F_N46V는 단백질 발현을 보였지만, 신호는 D185P보다 유의하게 낮았다.
HSKM 세포
mRNA를 24-웰 플레이트 내의 인간 골격근(HSKM) 세포에 형질감염시켰다. 24시간 후, 유세포 측정을 사용하여 에피토프 발현을 측정하였다. 세포의 수/웰 = 100k. 형질감염 24시간 후에, 웰을 PBS로 세척하고, 트립신(0.25%)을 첨가하여, 세포를 분리하였다. 세포를 유세포 측정을 위해 96-웰 플레이트에 분배하고, 항체를 첨가하기 전에 세포내 염색(Cytoperm)으로 처리하였다. 이차 항체는 염소 항-인간 IgG였다(Jackson Immuno Research - Cat. #109-115-098).
MNR hMPV D185P 발현 수준은 MNR hMPV CAN97-83과 유사하였다. MNR hMPV T160F_N46V는 모든 에피토프에 대해 더 높은 발현 수준을 보였다.
실시예 11: MIMIC 시스템에서 안정화 전 및 후 hMPV F 항원 단백질 작제물의 면역원성
소개:
MIMICⓒ(모듈형 면역 시험관내 작제물(Modular Immune In vitro Construct)) 시스템은 생체내에서 백신접종/내곡(inflection) 부위에서 발생하는 시험관내 선천성 및 적응성 면역 반응을 자극할 수 있다. 문헌[Williams et al. (2015) Sanofi Pasteur poster, "In vitro differentiation of class-switched YF specific antibody secreting cells from
Figure pct00034
B cells"]. MIMIC 시스템을 사용하는 것은 인간 생리학에 고유한 일부 양태, 예를 들어 HLA 하플로타입, 연령, 자가면역 상태 및 성별을 요약함으로써, 동물 모델에서 수행되는 면역원성 연구를 보완할 수 있다. 문헌[Higbee et al. (2009) ATLA 37: 19-27].
이를 위해, pre- 및 post-hMPV F 항원 단백질 작제물을 MIMIC 시스템에서 시험하여 대조군에 비한 면역원성 반응의 품질을 평가하였다. 대조군은 하기를 포함하였다: 비처리 대조군(인간 골격근 세포가 없고 항원 없음(w/o HSK)), 참조 항원 - 페리틴 나노입자에 융합된 RSV pre-F 단백질(pre-F NP) 및 폴리오 백신(IPOL).
물질 및 방법
간략하게는, PBMC를 22명의 상이한 인간 혈액 공여자로부터 자기 비드 분리 키트를 통해 수확하였다. 인간 수지상 세포(DC) 및 이로부터 선택된 B 세포를 인간 골격근 세포(HSKMC)에 추가하고 그와 함께 공동배양하고, (100 ng/ml 또는 500 ng/ml의) hMPV pre-F 항원 단백질 또는 hMPV post F 항원 단백질(100 ng/ml)로 자극하였다. B 세포 반응을 위해, 14일의 공동배양 후, 상층액을 수집하고 항체 특이성 및 기능에 대해 분석하였다.
결과:
도 15는 MIMIC 설정을 도시한다. T160F_N46V와 D185P에 대해 유사한 수준의 발현이 공유된 pre-F/post-F 에피토프에 대해 75 ng/ml 및 375 ng/ml의 용량에서 관찰되었다(도 14, 패널 A 내지 C). 활성화 MIMIC 공동배양물을 확인하기 위해, 이전에 분석된 폴리오 백신(IPOL) 및 항원(RSV pre-F-NP)을 양성 대조군으로서 사용하였다. 도 16, 패널 A 내지 C에 도시된 바와 같이, 1:50 희석도의 IPOL 처리는 비처리 대조군에 비해 3개의 폴리오 계통(폴리오 1, 2 및 3)에 대한 항체 반응을 유발하였다. 유사하게는, 공동배양물의 50 ng/ml RSV pre-F NP 처리는 RSV pre-F(도 17, 패널 A) 및 RSV post-F(도 17, 패널 B) 둘 모두에 대한 IgG 특이적 항체 반응을 유발하였다. 추가로, 이들 항체는 또한 RSV 중화 검정에서 측정된 바와 같이 기능적이었다(도 17, 패널 C).
hMPV pre-F 및 post-F 단백질은 높은 pre-F 및 post-F 항체 반응(도 18, 패널 A 및 B) 및 높은 중화 항체 역가(도 19)를 보였다.
실험군, hMPV pre-F 항원 단백질 또는 hMPV post-F 항원 단백질로 처리된 공동배양물로부터의 상층액은 항원 없음 대조군에 비해 hMPV pre-F(도 20, 패널 A) 및 hMPV post-F 항원(도 20, 패널 B) 둘 모두에 대해 강한 IgG 항체 반응을 유발하였다. 또한, 이들 항체는 hMPV 중화 검정에서 측정된 바와 같이 기능적이었다(도 21). 3개의 처리군 모두의 항체는 hMPV 융합전 및 융합후 F 항원에 결합되었고 융합전 hMPV와 융합후 hMPV가 중화 에피토프를 공유함을 뒷받침하는 중화 바이러스 감염성을 나타냈다.
본 개시내용의 다른 구현예는 본원에 개시된 개시내용의 명세서 및 실시를 고려함으로써 당업자에게 명백할 것이다. 본 명세서 및 실시예는 단지 예시적인 것으로 간주되고, 본 개시내용의 진정한 범주 및 사상은 하기 청구범위에 의해 나타나는 것으로 하고자 한다.
본원에 인용된 모든 특허 및 공개문헌은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (93)

  1. 항원성 인간 메타뉴모바이러스(hMPV) 융합전 F 폴리펩티드, 또는 이를 인코딩하는 핵산 분자로서, 상기 융합전 F 폴리펩티드는 막관통 도메인이 결여되어 있고 세포질 꼬리가 결여되어 있으며, 인간 리노바이러스 3C(HRV-3C) 프로테아제 절단 부위를 포함하는, F 폴리펩티드 또는 핵산 분자.
  2. 제1항에 있어서, 상기 융합전 F 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 위치 100에서 글루타민을 아르기닌으로 대체하고, SEQ ID NO: 1의 아미노산 위치 101에서 세린을 아르기닌으로 대체하는, 아미노산 치환 Q100R 및 S101R을 포함하는 F0 절단 부위 돌연변이를 추가로 포함하는, F 폴리펩티드 또는 핵산 분자.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 융합전 F 폴리펩티드는 신호 펩티드를 포함하는, F 폴리펩티드 또는 핵산 분자.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 융합전 F 폴리펩티드는 선택적으로 8x His 태그 및/또는 Strep II 태그인 적어도 하나의 태그 서열을 포함하는, F 폴리펩티드 또는 핵산 분자.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 융합전 F 폴리펩티드는 폴돈 도메인을 포함하는, F 폴리펩티드 또는 핵산 분자.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 융합전 F 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 위치 160에서 트레오닌을 대체하는 아미노산 치환, 및 SEQ ID NO: 1의 아미노산 위치 46에서 아스파라긴을 대체하는 아미노산 치환을 포함하는, F 폴리펩티드 또는 핵산 분자.
  7. 항원성 인간 메타뉴모바이러스(hMPV) 융합전 F 폴리펩티드, 또는 이를 인코딩하는 핵산 분자로서, 상기 융합전 F 폴리펩티드는 막관통 도메인이 결여되어 있고 세포질 꼬리가 결여되어 있으며, 다음을 포함하는, F 폴리펩티드 또는 핵산 분자:
    SEQ ID NO: 1의 아미노산 위치 100에서 글루타민을 아르기닌으로 대체하고, SEQ ID NO: 1의 아미노산 위치 101에서 세린을 아르기닌으로 대체하는, 아미노산 치환 Q100R 및 S101R을 포함하는 F0 절단 부위 돌연변이;
    인간 리노바이러스 3C(HRV-3C) 프로테아제 절단 부위;
    이종성 신호 펩티드;
    8x His 태그 및/또는 Strep II 태그; 및
    폴돈 도메인.
  8. 항원성 인간 융합전 메타뉴모바이러스(hMPV) F 폴리펩티드 또는 이를 인코딩하는 핵산 분자로서, 상기 융합전 F 폴리펩티드는 막관통 도메인이 결여되어 있고 세포질 꼬리가 결여되어 있으며, SEQ ID NO: 1의 위치 160에서 야생형 아미노산을 대체하는 아미노산 치환, 및 SEQ ID NO: 1의 위치 46에서 야생형 아미노산을 대체하는 아미노산 치환을 포함하는, hMPV F 폴리펩티드 또는 핵산 분자.
  9. 항원성 인간 융합전 메타뉴모바이러스(hMPV) F 폴리펩티드, 또는 이를 인코딩하는 핵산 분자로서, 상기 융합전 F 폴리펩티드는 막관통 도메인이 결여되어 있고 세포질 꼬리가 결여되어 있으며, SEQ ID NO: 1의 아미노산 위치 160에서 트레오닌을 대체하는 아미노산 치환, 및 SEQ ID NO: 1의 아미노산 위치 46에서 아스파라긴을 대체하는 아미노산 치환을 포함하는, hMPV F 폴리펩티드 또는 핵산 분자.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서, 상기 융합전 F 폴리펩티드는 위치 160에서 아미노산을 페닐알라닌, 트립토판, 티로신, 발린, 알라닌, 이소류신 또는 류신으로 대체하는 아미노산 치환을 포함하는, hMPV F 폴리펩티드 또는 핵산 분자.
  11. 제10항에 있어서, 상기 융합전 F 폴리펩티드는 위치 160에서 아미노산을 페닐알라닌으로 대체하는 아미노산 치환을 포함하는, hMPV F 폴리펩티드 또는 핵산 분자.
  12. 제8항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 융합전 F 폴리펩티드는 위치 46에서 아미노산을 발린, 알라닌, 이소류신, 류신, 페닐알라닌, 티로신 또는 프롤린으로 대체하는 아미노산 치환을 포함하는, hMPV F 폴리펩티드 또는 핵산 분자.
  13. 제12항에 있어서, 상기 융합전 F 폴리펩티드는 위치 46에서 아미노산을 발린으로 대체하는 아미노산 치환을 포함하는, hMPV F 폴리펩티드 또는 핵산 분자.
  14. 제8항에 있어서, 상기 융합전 F 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 7과 적어도 95%의 서열 동일성을 포함하는, hMPV F 폴리펩티드 또는 핵산 분자.
  15. 제8항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 융합전 F 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 위치 100에서 글루타민을 아르기닌으로 대체하고, SEQ ID NO: 1의 아미노산 위치 101에서 세린을 아르기닌으로 대체하는, 아미노산 치환 Q100R 및 S101R을 포함하는 F0 절단 부위 돌연변이를 추가로 포함하는, hMPV F 폴리펩티드 또는 핵산 분자.
  16. 제8항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 융합전 F 폴리펩티드는 신호 펩티드를 포함하는, hMPV F 폴리펩티드 또는 핵산 분자.
  17. 제8항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 융합전 F 폴리펩티드는 선택적으로 8x His 태그 및/또는 Strep II 태그인 적어도 하나의 태그 서열을 포함하는, hMPV F 폴리펩티드 또는 핵산 분자.
  18. 제8항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 융합전 F 폴리펩티드는 폴돈 도메인을 포함하는, hMPV F 폴리펩티드 또는 핵산 분자.
  19. 항원성 인간 메타뉴모바이러스(hMPV) 융합전 F 폴리펩티드, 또는 이를 인코딩하는 핵산 분자로서, 상기 융합전 F 폴리펩티드는 막관통 도메인이 결여되어 있고 세포질 꼬리가 결여되어 있으며, 다음을 포함하는, F 폴리펩티드 또는 핵산 분자:
    SEQ ID NO: 1의 아미노산 위치 160에서 트레오닌을 페닐알라닌으로 대체하는 아미노산 치환 T160F, 및 SEQ ID NO: 1의 아미노산 위치 46에서 아스파라긴을 발린으로 대체하는 아미노산 치환 N46V;
    SEQ ID NO: 1의 아미노산 위치 100에서 글루타민을 아르기닌으로 대체하고, SEQ ID NO: 1의 아미노산 위치 101에서 세린을 아르기닌으로 대체하는, 아미노산 치환 Q100R 및 S101R을 포함하는 F0 절단 부위 돌연변이;
    인간 리노바이러스 3C(HRV-3C) 프로테아제 절단 부위;
    신호 펩티드;
    8x His 태그 및/또는 Strep II 태그; 및
    폴돈 도메인.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, hMPV는 A 계통 또는 B 계통인, F 폴리펩티드 또는 핵산 분자.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, hMPV는 A1 아형, A2 아형, B1 아형, 또는 B2 아형인, F 폴리펩티드 또는 핵산 분자.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 융합전 F 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 3과 적어도 95%의 서열 동일성을 포함하거나 SEQ ID NO: 3을 포함하는, F 폴리펩티드 또는 핵산 분자.
  23. 인간 메타뉴모바이러스(hMPV) F 폴리펩티드, 또는 이를 인코딩하는 핵산 분자로서, 상기 F 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 7과 적어도 95%의 서열 동일성을 포함하는, F 폴리펩티드 또는 핵산 분자.
  24. 제23항에 있어서, F 폴리펩티드가 융합전 F 폴리펩티드인, F 폴리펩티드 또는 핵산 분자.
  25. 제23항에 있어서, F 폴리펩티드는 항원성인, F 폴리펩티드 또는 핵산 분자.
  26. 제23항에 있어서, F 폴리펩티드는 아미노산 위치 160에서 트레오닌을 페닐알라닌으로 대체하는 아미노산 치환 T160F, 및 아미노산 위치 46에서 아스파라긴을 발린으로 대체하는 아미노산 치환 N46V를 포함하는, F 폴리펩티드 또는 핵산 분자.
  27. 제23항에 있어서, F 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 7을 포함하는, F 폴리펩티드 또는 핵산 분자.
  28. 제23항 내지 제27항 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 인코딩하는, 핵산 분자.
  29. 제28항에 있어서, SEQ ID NO: 8과 적어도 95%의 서열 동일성을 갖거나, SEQ ID NO: 8을 포함하는, 핵산 분자.
  30. 제28항에 있어서, SEQ ID NO: 18 또는 SEQ ID NO: 19와 적어도 95%의 서열 동일성을 갖거나, SEQ ID NO: 18 또는 SEQ ID NO: 19를 포함하는, 핵산 분자.
  31. 제23항 내지 제27항 중 어느 한 항의 F 폴리펩티드, 또는 이를 인코딩하는 핵산 분자, 또는 제28항 내지 제30항 중 어느 한 항의 핵산 분자를 포함하는, 약제학적 조성물.
  32. 제31항에 있어서, 백신을 포함하는, 약제학적 조성물.
  33. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항의 F 폴리펩티드를 인코딩하는 오픈 리딩 프레임(ORF)을 포함하는, 메신저 RNA(mRNA).
  34. 인간 메타뉴모바이러스(hMPV) F 폴리펩티드 항원을 인코딩하는 오픈 리딩 프레임(ORF)을 포함하는 메신저 RNA(mRNA)로서, hMPV F 폴리펩티드 항원은 SEQ ID NO: 11과 적어도 95%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, SEQ ID NO: 11의 아미노산 서열로 이루어지는, mRNA.
  35. 제33항 또는 제34항에 있어서, hMPV F 폴리펩티드 항원은 융합전 F 폴리펩티드인, mRNA.
  36. 제33항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, ORF는 코돈 최적화되는, mRNA.
  37. 제33항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, mRNA는 적어도 하나의 5' 비번역 영역(5' UTR), 적어도 하나의 3' 비번역 영역(3' UTR), 및 적어도 하나의 폴리아데닐화(폴리(A)) 서열을 포함하는, mRNA.
  38. 제33항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, mRNA는 적어도 하나의 화학적 변형을 포함하는, mRNA.
  39. 제33항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, mRNA 내의 우라실 뉴클레오티드의 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100%가 화학적으로 변형되는, mRNA.
  40. 제33항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, ORF 내의 우라실 뉴클레오티드의 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100%가 화학적으로 변형되는, mRNA.
  41. 제37항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 화학적 변형은 슈도우리딘, N1-메틸슈도우리딘, 2-티오우리딘, 4'-티오우리딘, 5-메틸시토신, 2-티오-l-메틸-1-데아자-슈도우리딘, 2-티오-l-메틸-슈도우리딘, 2-티오-5-아자-우리딘, 2-티오-디하이드로슈도우리딘, 2-티오-디하이드로우리딘, 2-티오-슈도우리딘, 4-메톡시-2-티오-슈도우리딘, 4-메톡시-슈도우리딘, 4-티오-l-메틸-슈도우리딘, 4-티오-슈도우리딘, 5-아자-우리딘, 디하이드로슈도우리딘, 5-메틸우리딘, 5-메틸우리딘, 5-메톡시우리딘, 및 2'-O-메틸 우리딘으로 이루어진 군으로부터 선택되는, mRNA.
  42. 제41항에 있어서, 화학적 변형은 슈도우리딘, N1-메틸슈도우리딘, 5-메틸시토신, 5-메톡시우리딘, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, mRNA.
  43. 제41항에 있어서, 화학적 변형은 N1-메틸슈도우리딘인, mRNA.
  44. 제33항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, mRNA는 지질 나노입자(LNP)에 제형화되는, mRNA.
  45. 제44항에 있어서, LNP는 적어도 하나의 양이온성 지질을 포함하는, mRNA.
  46. 제45항에 있어서, 양이온성 지질은 생분해성인, mRNA.
  47. 제45항에 있어서, 양이온성 지질은 생분해성이 아닌, mRNA.
  48. 제45항에 있어서, 양이온성 지질은 절단 가능한, mRNA.
  49. 제45항에 있어서, 양이온성 지질은 절단 가능하지 않은, mRNA.
  50. 제45항에 있어서, 양이온성 지질은 OF-02, cKK-E10, GL-HEPES-E3-E10-DS-3-E18-1, GL-HEPES-E3-E12-DS-4-E10, 및 GL-HEPES-E3-E12-DS-3-E14로 이루어진 군으로부터 선택되는, mRNA.
  51. 제50[9]항에 있어서, 양이온성 지질은 cKK-E10인, mRNA.
  52. 제50항에 있어서, 양이온성 지질은 GL-HEPES-E3-E12-DS-4-E10인, mRNA.
  53. 제44항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, LNP는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 접합된(PEG화된) 지질, 콜레스테롤계 지질 및 헬퍼 지질을 추가로 포함하는, mRNA.
  54. 제44항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, LNP는,
    35% 내지 55%의 몰비의 양이온성 지질;
    0.25% 내지 2.75%의 몰비의 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 접합된(PEG화된) 지질;
    20% 내지 45%의 몰비의 콜레스테롤계 지질; 및
    5% 내지 35%의 몰비의 헬퍼 지질을 포함하며,
    모든 몰비는 LNP의 총 지질 함량에 상대적인, mRNA.
  55. 제54항에 있어서, LNP는,
    40%의 몰비의 양이온성 지질,
    1.5%의 몰비의 PEG화된 지질,
    28.5%의 몰비의 콜레스테롤계 지질, 및
    30%의 몰비의 헬퍼 지질을 포함하는, mRNA.
  56. 제53항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, PEG화된 지질은 디미리스토일-PEG2000(DMG-PEG2000) 또는 2-[(폴리에틸렌 글리콜)-2000]-N,N-디테트라데실아세트아미드(ALC-0159)인, mRNA.
  57. 제53항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 콜레스테롤계 지질은 콜레스테롤인, mRNA.
  58. 제53항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 헬퍼 지질은 1,2-디올레오일-SN-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE) 또는 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC)인, mRNA.
  59. 제44항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, LNP는
    40%의 몰비의 GL-HEPES-E3-E12-DS-4-E10,
    1.5%의 몰비의 DMG-PEG2000,
    28.5%의 몰비의 콜레스테롤, 및
    30%의 몰비의 DOPE를 포함하는, mRNA.
  60. 제44항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, LNP는
    40%의 몰비의 cKK-E10,
    1.5%의 몰비의 DMG-PEG2000,
    28.5%의 몰비의 콜레스테롤, 및
    30%의 몰비의 DOPE를 포함하는, mRNA.
  61. 제44항 내지 제60[9]항 중 어느 한 항에 있어서, LNP는 30 nm 내지 200 nm의 평균 직경을 갖는, mRNA.
  62. 제61항에 있어서, LNP는 80 nm 내지 150 nm의 평균 직경을 갖는, mRNA.
  63. 제33항 내지 제62항 중 어느 한 항의 mRNA를 포함하는, 약제학적 조성물.
  64. 제63항에 있어서, 백신을 포함하는, 약제학적 조성물.
  65. hMPV에 대한 면역 반응을 유발하거나 hMPV 감염으로부터 대상체를 보호하는 방법으로서, 제32항 또는 제64항의 백신을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  66. 제65항에 있어서, 대상체는 단백질 hMPV 백신이 투여된 대상체에 비해, 백신의 투여 후 hMPV에 대한 중화 항체의 유사한 혈청 농도를 갖는, 방법.
  67. 제66항에 있어서, 단백질 hMPV 백신은 아쥬반트와 공동-투여되는, 방법.
  68. 제65항에 있어서, 백신은 기존 hMPV 면역을 갖는 대상체에서 중화 항체의 혈청 농도를 증가시키는, 방법.
  69. 제32항 또는 제64항의 백신을 대상체에 투여하는 것을 포함하는, hMPV에 대한 면역 반응을 유발하거나 hMPV 감염으로부터 대상체를 보호하는데 사용하기 위한 백신.
  70. hMPV에 대한 면역 반응을 유발하거나 hMPV 감염으로부터 대상체를 보호하기 위한 의약의 제조에 있어, 제32항 또는 제64항의 백신의 용도.
  71. 예방적 유효량의 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항의 F 폴리펩티드 또는 핵산 분자, 예방적 유효량의 제33항 내지 제62항 중 어느 한 항의 mRNA, 또는 예방적 유효량의 제32항, 제64항 및 제69항 중 어느 한 항의 백신을 대상체에 선택적으로 근육내, 비강내, 정맥내, 피하 또는 피내로 투여하는 단계를 포함하는, 면역 반응의 유발을 필요로 하는 대상체에서 면역 반응을 유발하는 방법.
  72. 예방적 유효량의 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항의 F 폴리펩티드 또는 핵산 분자, 예방적 유효량의 제33항 내지 제62항 중 어느 한 항의 mRNA, 또는 예방적 유효량의 제32항, 제64항 및 제69항 중 어느 한 항의 백신을 대상체에 선택적으로 근육내, 비강내, 정맥내, 피하 또는 피내로 투여하는 단계를 포함하는, hMPV 감염을 예방하거나 hMPV 감염의 하나 이상의 증상을 감소시키는 방법.
  73. 선택적으로 제71항 또는 제72항의 방법에서, 치료를 필요로 하는 대상체의 치료에 사용하기 위한 의약의 제조를 위한, 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항의 F 폴리펩티드 또는 핵산 분자, 예방적 유효량의 제33항 내지 제62항 중 어느 한 항의 mRNA, 또는 제32항, 제64항 및 제69항 중 어느 한 항의 백신의 용도.
  74. 선택적으로 제71항 또는 제72항의 방법에서, 치료를 필요로 하는 대상체의 치료에 사용하기 위한, 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항의 F 폴리펩티드 또는 핵산 분자, 예방적 유효량의 제33항 내지 제62항 중 어느 한 항의 mRNA, 또는 제32항, 제64항 및 제69항 중 어느 한 항의 백신.
  75. 일회-사용 또는 다회-사용 투여량의 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항의 F 폴리펩티드 또는 핵산 분자, 예방적 유효량의 제33항 내지 62항 중 어느 한 항의 mRNA, 또는 제32항, 제64항, 또는 제69항 중 어느 한 항의 백신을 포함하는 컨테이너를 포함하는, 키트로서, 선택적으로 컨테이너는 바이알 또는 사전 충전형 시린지 또는 주사기인, 키트.
  76. 인간 메타뉴모바이러스(hMPV) F 폴리펩티드 항원, 또는 이를 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는, 백신으로서, F 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 7과 적어도 95% 동일성을 갖거나 SEQ ID NO: 7의 아미노산 서열로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는, 백신.
  77. 제76항에 있어서, hMPV F 폴리펩티드는 융합전 F 폴리펩티드인, 백신.
  78. hMPV에 대한 면역 반응을 유발하거나 hMPV 감염으로부터 대상체를 보호하는 방법으로서, 제76항 또는 제77항의 백신을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  79. 제77항에 있어서, 백신은 아쥬반트와 공동-투여되는, 방법.
  80. 제78항 또는 제79항에 있어서, 백신은 추가적인 백신과 조합하여 투여되는, 방법.
  81. 제80항에 있어서, 추가적인 백신은 호흡기 세포 융합 바이러스(RSV) 백신 또는 인플루엔자 백신인, 방법.
  82. 제78항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 인간인, 방법.
  83. 제82항에 있어서, 인간 대상체는 소아(infant), 유아(toddler) 또는 노인(older adult)인, 방법.
  84. 제78항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 백신은 중화 항체의 혈청 농도를 증가시키고, 대상체는 기존 hMPV 면역을 갖는, 방법.
  85. 제76항 또는 제77항의 백신을 대상체에 투여하는 것을 포함하는, hMPV에 대한 면역 반응을 유발하거나 hMPV 감염으로부터 대상체를 보호하는데 사용하기 위한 백신.
  86. hMPV에 대한 면역 반응을 유발하거나 hMPV 감염으로부터 대상체를 보호하기 위한 의약의 제조에 있어, 제76항 또는 제77항의 백신의 용도.
  87. 예방적 유효량의 제76항 또는 제77항의 백신을 대상체에 선택적으로 근육내, 비강내, 정맥내, 피하 또는 피내로 투여하는 단계를 포함하는, 면역 반응의 유발을 필요로 하는 대상체에서 면역 반응을 유발하는 방법.
  88. 예방적 유효량의 제76항 또는 제77항의 백신을 대상체에 선택적으로 근육내, 비강내, 정맥내, 피하 또는 피내로 투여하는 단계를 포함하는, hMPV 감염을 예방하거나 hMPV 감염의 하나 이상의 증상을 감소시키는 방법.
  89. 선택적으로 제87항 또는 제88항의 방법에서, 치료를 필요로 하는 대상체를 치료하는 데 사용하기 위한 의약을 제조하기 위한, 제76항 또는 제77항의 백신의 용도.
  90. 제76항 또는 제77항에 있어서, 선택적으로 제87항 또는 제88항의 방법에서, 치료를 필요로 하는 대상체를 치료하는 데 사용하기 위한, 백신.
  91. 일회-사용 또는 다회-사용 투여량의 제76항 또는 제77항의 백신을 포함하는 컨테이너를 포함하는, 키트로서, 선택적으로 컨테이너는 바이알 또는 사전 충전형 시린지 또는 주사기인, 키트.
  92. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항의 F 폴리펩티드 또는 핵산 분자, 또는 제33항 내지 제62항 중 어느 한 항의 mRNA를 인코딩하는, 발현 벡터.
  93. 제92항의 발현 벡터를 포함하는, 세포.
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