KR20240116540A

KR20240116540A - Masp-2의 세린 프로테아제 도메인에 결합하는 치료 항체 및 이것의 용도

Info

Publication number: KR20240116540A
Application number: KR1020247022585A
Authority: KR
Inventors: 토마스 두들러; 폰 슈페흐트 피터 쿠르트 놀러트; 무네히사 야부키; 사담 야센
Original assignee: 오메로스 코포레이션
Priority date: 2021-12-10
Filing date: 2022-12-07
Publication date: 2024-07-29
Also published as: MX2024007065A; AU2022405100A1; JP2024546109A; EP4444758A2; US12091468B2; WO2023108028A3; TW202334242A; TWI863052B; US20230265215A1; US20240101709A1; IL313331A; CL2024001677A1; CA3240483A1; PE20241620A1; WO2023108028A2; TW202438533A; CO2024007207A2; TW202438532A; CR20240271A

Abstract

인간 MASP-2의 세린 프로테아제 도메인 내의 에피토프에 특이적으로 결합하는 분리된 단클론성 항체 및 그것의 항원 결합 단편이 제공된다. 일부 구체예에서, 항체 또는 그것의 항원 결합 단편은 렉틴 경로 보체 활성화를 억제한다. 또한 개시된 단클론성 항체 또는 그것의 항원 결합 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 및 그러한 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 클로닝 벡터 또는 발현 카세트가 제공된다. 추가로 렉틴 경로 보체 활성화를 억제하는 방법 및 렉틴 경로 질환 및 장애를 치료하는 방법이 제공된다.

Description

MASP-2의 세린 프로테아제 도메인에 결합하는 치료 항체 및 이것의 용도

본 발명은 MASP-2의 세린 프로테아제 도메인에 결합하는 항체, 및 관련 조성물 및 방법에 관한 것이다.

서열 목록에 관한 기재

본 출원과 관련된 서열 목록은 서면 사본 대신 XML 포맷으로 제공되며 명세서에 참조로 본원에 포함된다. 서열 목록을 함유한 XML 파일의 명칭은 MP10329PCT.XML이다; XML 파일은 89 KB이며, 2022년 11월 21일에 생성되었고; 명세서의 출원과 함께 특허 센터를 통해 제출된다.

보체 시스템은 병원체 및 다른 급성 손상에 대한 선천적 숙주 방어를 지지하며(M.K. Liszewski and J.P. Atkinson, 1993, in Fundamental Immunology, Third Edition, edited by W.E. Paul, Raven Press, Ltd., New York), 또한 암에 대한 면역 감시에서도 역할을 한다(P. Macor, et al., Front. Immunol., 9:2203, 2018). 30개를 넘는 유동상 및 막 결합 단백질이 보체 시스템에 관여한다(S. Meyer, et al., mAbs, 6:1133, 2014). 이들 중 대부분은 조절 단백질로, 활성화 사건의 고도로 조절된 캐스케이드를 조율한다. 보체 시스템은 손상된 세포, 생체물질 표면, 또는 미생물 침입자 상의 구별된 구조에 대한 패턴 인식 수용체(PRR)의 결합에 의해 개시된 순차적인 단백질 가수분해 반응의 캐스케이드를 통해 분자 스트레스 신호에 대해 빠르게 반응한다(Reis et al., Nat. Rev. Immunol., 18:5, 2018). 보체 캐스케이드의 활성화는 다양한 면역 이펙터 기능, 예컨대 세포 용해, 식세포작용, 화학주성 및 면역 활성화를 유도한다(S. Meyer, et al., 2014). 나아가, 보체 시스템은 또한 선천적 면역 반응과 후속되는 적응성 면역의 활성화 사이의 가교로서 작용한다. 보체 시스템은 감염 방지 특성 외에, 또한 면역 복합체 및 세포자멸 세포의 정화, 조직 재생, 조혈 전구 세포의 이동, 및 혈관신생에 관여한다(T.M. Pierpont et al., Front. Oncol., 8:163, 2018).

보체 시스템은 3개의 별개의 경로: 고전적 경로, 대체 경로, 및 렉틴 경로를 통해 활성화될 수 있다. 도 1을 참고한다.

고전적 경로(CP)는 주로 항체-항원 복합체에 의해 개시된다. 하위부류 IgM 및 IgG의 항체는 병원체 또는 표적 세포 표면 상의 항원에 결합하여, 다중분자 인식 하위 구성요소 C1q(C1q A 사슬, B 사슬 및 C 사슬의 6개의 이종삼량체로 구성됨) 및 C1q 관련 세린 프로테아제, 즉 C1r 및 C1s로 구성된 C1 복합체를 모집한다. 항원에 결합된 IgM 또는 자신의 항원에 결합된 적어도 2개의 IgG 항체의 Fc 영역에 C1q가 결합할 때, 세린 프로테아제 C1r은 그것의 효소적으로 활성인 형태로 자동 활성화되고 후속해서 그것의 기질인 C1s를 절단하고 활성화한다. 활성화된 후에는, C1s는 C4를 그것의 단편인 C4a 및 C4b로 절단한다. C2는 C4b에 결합하여 C4bC2 복합체를 생성한다. 제2 절단 단계로, C1s는 C4bC2 복합체 내의 C2를 절단하여, C2b를 방출하여 소위 C3 전환효소로 불리는 보체 C3 전환 효소 복합체 C4bC2a를 형성하며, 이것은 풍부한 혈장 보체 구성요소 C3을 C3 및 C3b로 절단한다.

렉틴 경로는 패턴 인식 분자, 예컨대 만노스 결합 렉틴(MBL), 피콜린 또는 콜렉틴-11 및 콜렉틴-10의 병원체 관련 분자 페턴(PAMP) 또는 세포자멸성 또는 변경된 숙주 세포에의 결합에 의해 촉발된다. 인식 분자는 MBL 관련 세린 프로테아제, MASP-1 및 MASP-2과 복합체를 형성하여, 그것들이 동족 리간드에 결합할 때 그것들을 활성화한다. 활성화된 MASP-2는 C4 및 C4b 결합 C2를 절단하여 C3 전환효소(C4bC2a)를 형성한다.

대체 경로는 C3("무부하(tickover)")의 인자 B(fB)에 결합하는 C3(H2O)으로의 자발적인 가수분해에 의해 개시된다. 결과적으로 생성된 C3(H2O)fB 복합체의 효소적 활성 C3 전환효소로의 전환은 보체 인자 D로 불리는 또 다른 고도로 특이적인 세린 프로테아제의 효소적 활성을 필요로 한다. 효소적 활성 인자 D의 이용 가능성은 대체 경로 증폭 루프의 제한 인자인 것으로 여겨지며 인자 D의 이용 가능성은 프로 인자 D(프로CFD)의 활성 형태인 성숙한 인자 D(matCFD, 또는 간단하게 CFD)로의 전환에 필요한 또 다른 효소인 MASP-3의 작용을 필요로 한다(Dobo et al., 2016). CFD는 C3(H2O) 결합 fB를 Ba 및 Bb로 활성화한다. Bb는 또한 세린 프로테아제이며, C3을 C3a 및 C3b로 절단하는 대체 경로 C3 전환효소 C3(H2O)Bb의 형성에 참여한다. 이 메커니즘에 의해, 대체 경로는 낮은 수준에서 구성적으로 활성이다. AP 증폭 루프는, C3(H2O)Bb에 의해 또는 렉틴 및 고전적 경로 C3 전환효소인 C4bC2a에 의해 형성된, 새롭게 생성된 C3b가 표적 표면, 예컨대 박테리아 세포에 결합하여 fB를 격리시켜서, CFD에 의해 절단될 때 대체 경로 C3 전환효소 복합체인 C3bBb를 생성하는 C3bfB 복합체를 형성할 때 형성된다. 이 전환효소는 추가로 인자 I 및 보조 인자에 의한 복합체의 붕괴 및 C3b의 전환을 방지하는 프로퍼딘에 의해 안정화될 수 있다.

3개의 경로는 C3 활성화 단계에서 수렴된다. C3 절단 단편 C3a는 염증을 촉진하는 아나필라톡신이다. C3b는 표적 세포 표면에서 그것의 티오에스테르 결합을 통해 공유적으로 결합하여 순환하는 보체 수용체(CR) 표시 이펙터 세포, 예컨대 각각 보체 의존성 세포의 세포독성(CDCC) 및 보체 의존성 세포의 식세포작용(CDCP)에 기여하는 천연 살해(NK) 세포 및 대식세포를 표시하는 옵소닌으로서 기능한다. C3b는 또한 C3 전환효소(C4bC2a 또는 C3bBb)에 결합하여 C5 전환효소(각각 C4bC2a (C3b)n 또는 C3bBb(C3b)n)를 형성하고, 이것은 MAC 형성 및 후속되는 CDC로 이어진다. 추가적으로, C3b의 세포 결합 분해 단편인 iC3b 및 C3dg는 보체-수용체 매개 세포독성(CDCC 및 CDCP)을 촉진할뿐만 아니라 B 세포 활성화를 통해 적응 면역 반응을 촉진할 수 있다(M.C. Carroll, Nat. Immunol., 5:981, 2004).

C5 전환효소의 형성은 C5의 C5a 및 C5b로의 절단으로 이어진다. C5a는 또 다른 아나필라톡신이다. C5b는 막 공격 복합체(MAC, 또는 C5b-9 복합체)를 형성하기 위해 C6-9를 모집한다. MAC 복합체는 기공 형성을 유발하여 표적 세포의 막 파괴 및 세포 용해를 초래한다(소위 보체 의존성 세포독성, CDC). MAC 형성을 통한 직접 세포 용해는 전통적으로 보체 시스템의 말단 이펙터 메커니즘으로서 인식되었지만, C3b 매개 옵소닌화 및 염증 촉진 신호전달뿐만 아니라 C3a의 아나필라톡신 기능은 보체 의존성 염증 병리의 매개에서 중요한 역할을 하는 것으로 여겨진다.

보체 활성화가 잠재적 병원체에 대해 가치 있는 제1선 방어를 제공하는 한편, 보호 면역 반응을 촉진하는 보체의 활성은 또한 숙주에 대한 잠재적 위협을 나타낼 수 있다(K.R. Kalli, et al., Springer Semin. Immunopathol. 15:417 431, 1994; B.P. Morgan, Eur. J. Clinical Investig. 24:219 228, 1994). 예를 들어, C3 및 C5 단백질 가수분해 생성물은 호중구를 모집하여 활성화한다. 활성화된 호중구는 숙주 방어에 필수적이지만, 파괴적인 효소를 무차별적으로 방출하며 장기 손상을 유발할 수 있다. 더불어, 보체 활성화는 미생물 표적뿐만 아니라 근접한 숙주 세포 상에서 용해성 보체 구성요소의 침착을 유발하여 숙주 세포 용해를 초래할 수 있다.

보체 시스템은 심근 경색(myocardial infarction), 뇌졸중(stroke), 급성 호흡기 장애 증후군(acute respiratory distress syndrome, ARDS), 당뇨병과 관련된 합병증(complications associated with diabetes), 허혈성 재관류 손상(ischemia reperfusion injury), 염증성 위장 장애(inflammatory gastrointestinal disorder), 패혈성 쇼크(septic shock), 열화상 후 모세관 누출(capillary leakage following thermal burn), 이식편대숙주병(graft-versus-host disease), 안과적 장애(ophthalmic disorder), 심폐우회술 후 염증(postcardiopulmonary bypass inflammation), 이식 거부반응(transplant rejection), 혈전성 미세혈관병증(thrombotic microangiopathy, TMA), 신장 질환(renal condition), 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 다발성 경화증(multiple sclerosis), 중증 근무력증(myasthenia gravis), 및 알츠하이머병(Alzheimer's disease)을 포함한 수많은 급성 및 만성 질환 상태의 발병에 연루되어 있다. 보체 활성화는 이들 및 다른 질환의 주요 병리적 메커니즘일 수 있고 많은 이들 질환 상태의 임상 제어를 위한 효과적인 지점을 나타낸다. 다양한 질환 상태에서 보체 매개 조직 손상의 중요성에 대한 인식이 점점 많아져서 효과적인 보체 억제 약물에 대한 필요성이 강조되고 있다. 현재까지, C5에 대한 두 항체인 에쿨리주맙(솔라리스®), 라불리주맙(울토미리스), 및 C3 억제제인 페세타고플란(엠파벨리)이 인간에서 사용하도록 승인된 유일한 3개의 보체 표적화 약물이다. 그러나, C5 및 C3은 보체 시스템의 "하류"에 위치한 이펙터 분자이고, C5의 차단 또는 C3의 억제는 어느 것도 보체 시스템의 활성화를 억제하지 못한다. 그러므로, 보체 활성화의 개시 단계의 억제제는 "하류" 보체 억제제를 능가하는 상당한 장점을 가질 것이다.

본 요약은 아래의 상세한 설명에서 한층 더 설명되는 개념의 선택을 간단한 형태로 도입하기 위해 제공된다. 본 요약은 청구되는 주제의 핵심 특징을 확인하기 위해 의도되거나, 또는 청구된 주제의 범주를 결정하는 데 보조수단으로서 사용되도록 의도된 것이 아니다.

한 측면으로, 본 개시는 MASP-2에 특이적으로 결합하는 분리된 단클론성 항체 또는 그것의 항원 결합 단편을 제공한다. 일부 구체예에서, 분리된 단클론성 항체 또는 그것의 항원 결합 단편은 인간 MASP-2의 세린 프로테아제 도메인 내의 에피토프에 특이적으로 결합한다. 일부 구체예에서, 상기 에피토프는 인간 MASP-2의 아미노산 ₄₉₆DIRMGTLKRLSPHYTQAW₅₁₃(서열 번호:6) 내에 위치한다. 일부 구체예에서, 항체 또는 그것의 항원 결합 단편은 렉틴 경로 보체 활성화를 억제한다. 일부 구체예에서, 항체 또는 그것의 항원 결합 단편은 MASP-2에 대한 C4 결합과 경합한다.

또한 본원에는 개시된 단클론성 항체 또는 그것의 항원 결합 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 및 그러한 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 클로닝 벡터 또는 발현 카세트가 제공된다.

추가로 본원에는 개시된 단클론성 항체 또는 그것의 항원 결합 단편을 발현하는 숙주 세포, 및 항체 또는 그것의 항원 결합 단편의 발현을 허용하는 조건 하에서 숙주 세포를 배양하는 단계 및 항체 또는 그것의 항원 결합 단편을 분리하는 단계를 포함하는 단클론성 항체 또는 그것의 항원 결합 단편의 제조 방법이 제공된다.

또한 본원에는 포유류에서 렉틴 경로 보체 활성화를 억제하는 방법이 제공되며, 방법은 필요로 하는 포유류 대상체에게 포유류에서 렉틴 경로 보체 활성화를 억제하기에 충분한 양으로 개시된 단클론성 항체 또는 그것의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물의 일정량을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 개시된 단클론성 항체 또는 그것의 항원 결합 단편은 렉틴 경로 관련 질환 또는 장애를 앓고 있거나 발병의 위험이 있는 대상체를 치료하기 위해 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, 렉틴 경로 관련 질환 또는 장애는 혈전성 미세혈관병증(TMA), 신장 질환, 조직 또는 장기 이식으로부터 유발된 염증 반응, 허혈성 재관류 손상, 당뇨병과 관련된 합병증, 심혈관 질환 또는 장애, 염증성 위장 장애, 폐 장애, 안과 질환 또는 장애, 파종성 혈관내 응고(disseminated intravascular coagulation), 이식편대숙주병, 정맥 폐쇄성 질환(veno-occlusive disease) 및 미만성 폐포 출혈(diffuse alveolar hemorrhage)로부터 선택된다.

본 발명의 전술한 측면 및 수반되는 많은 장점은 첨부된 도면과 함께 읽힐 때, 다음의 상세한 설명을 참조로 더 잘 이해됨에 따라 더 쉽게 인식될 것이다:
도 1은 보체 시스템의 개략적인 다이아그램이다.
도 2는 인간 MASP-2 단백질의 도메인 구조를 예시하는 다이아그램이다.
도 3은 실시예 2에서 기술된 것과 같이, 항-MASP-2 억제 항체(마우스 모체) mAb OMS850; mAb OMS860 및 mAb OMS870의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열 정렬이다.
도 4는 실시예 3에서 기술된 것과 같이, mAb OMS850; mAb OMS860; mAb OMS870; 및 mAb OMS858에 의한 인간 MASP-2(CCP1-CCP2-SP 단편)의 결합을 그래프로 도시한다.
도 5A는 실시예 3에서 기술된 것과 같이 mAb OMS850; mAb OMS860 및 mAb OMS870에 의한 인간 혈청에서의 C3b 침착의 농도 의존성 억제를 그래프로 도시한다.
도 5B는 실시예 3에서 기술된 것과 같이 mAb OMS850; mAb OMS860 및 mAb OMS870에 의한 시노몰구스 원숭이 혈청에서의 C3b 침착의 농도 의존성 억제를 그래프로 도시한다.
도 5C는 실시예 3에서 기술된 것과 같이 mAb OMS850; mAb OMS860 및 mAb OMS870에 의한 래트 혈청에서의 C3b 침착의 농도 의존성 억제를 그래프로 도시한다.
도 5D는 실시예 3에서 기술된 것과 같이 mAb OMS850; mAb OMS860 및 mAb OMS870에 의한 마우스 혈청에서의 C3b 침착의 농도 의존성 억제를 그래프로 도시한다.
도 6은 실시예 3에서 기술된 것과 같이 mAb OMS850; mAb OMS860 및 mAb OMS870에 의한 50% 인간 혈청에서의 C4b 침착의 농도 의존성 억제를 그래프로 도시한다.
도 7은 실시예 4에서 기술된 것과 같이 다양한 P53 치환이 있는 mAb OMS852의 인간 혈청에서의 C3b 침착의 농도 의존성 억제를 그래프로 도시한다.
도 8A는 실시예 4에서 기술된 것과 같이 mAb OMS850의 여러 후보 인간화된 버전의 인간 혈청에서의 C3b 침착의 농도 의존성 억제를 그래프로 도시한다.
도 8B는 실시예 4에서 기술된 것과 같이 mAb OMS850의 여러 후보 인간화된 버전의 인간 혈청에서의 C3b 침착의 농도 의존성 억제를 그래프로 도시한다.
도 9A는 실시예 5에서 기술된 것과 같이 고전적 경로 특이적 검정 조건 하에 달라지는 농도의 항-MASP-2 항체 OMS858의 존재 하에 MAC 침착 수준을 그래프로 도시한다.
도 9B는 실시예 5에서 기술된 것과 같이 렉틴 경로 특이적 검정 조건 하에 달라지는 농도의 항-MASP-2 항체 OMS858의 존재 하에 MAC 침착 수준을 그래프로 도시한다.
도 9C는 실시예 5에서 기술된 것과 같이 대체 경로 특이적 검정 조건 하에 달라지는 농도의 항-MASP-2 항체 OMS858의 존재 하에 MAC 침착 수준을 그래프로 도시한다.
도 10은 실시예 6에서 기술된 것과 같이, 비오티닐화된 OMS858 및 다른 MASP-2 항체 패널을 사용하여 Bio Layer Interferometry(BLI) 기기(OCTET) 상에서의 결합 연구 결과를 도시한다.
도 11은 실시예 9에서 기술된 것과 같이, MASP-2 세린 프로테아제 도메인과 Fab mAb OMS858의 배열 및 이들 사이의 접촉을 보여주는 개략도이다.
도 12는 실시예 9에서 기술된 것과 같이, 왼편에 MASP-2의 SP 도메인에 다음 잔기: ASP496; LYS503; SER506; PRO507; HIS508 및 TRP513을 포함하는, mAb OMS858가 결합되는 MASP-2 에피토프; 및 오른편에 중쇄 및 경쇄, 특히 중쇄 잔기 HIS33; ASP50; ASP52; ASP55; GLU57; HIS59 및 경쇄 잔기 TYR31; ARG30 및 TRP90로부터의 기여를 가진 2개의 연결된 상응하는 패치를 포함하는, MASP-2 에피토프에 결합하는 mAb OMS858의 파라토프를 도시한다.
도 13은 실시예 9에서 기술된 것과 같이 LigPlot+ 소프트웨어에 의해 계산된 mAb OMS858 파라토프와 MASP-2 에피토프 사이의 상호작용을 도시한다.
도 14A는 실시예 9에서 기술된 것과 같이, mAb OMS858이 결합하는 ASP496, LYS503, SER506, PRO507, HIS508 및 TRP513을 포함하는 MASP-2 에피토프의 삼차원 구조를 도시한다.
도 14B는 실시예 9에서 기술된 것과 같이 MASP-2가 결합하는 중쇄의 HIS33, ASP50, ASP52, ASP55, GLU57, HIS59 및 경쇄의 ARG30, TYR31 및 TRP90을 포함하는 mAb OMS858 파라토프의 삼차원 구조를 도시한다.
도 15는 실시예 9에서 기술된 것과 같이, MASP-2 에피토프 DIRMGTLKRLSPHYTQAW(서열 번호:6)와 mAb OMS858의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역 사이의 접촉을 도시한다.
도 16은 실시예 10에서 기술된 것과 같이, 인간 MASP-2의 HIS508이 시노몰구스 원숭이, 마우스 및 래트에서는 보존되지만 개에서는 보존되지 않는 것을 보여주는, 인간 MASP-2의 MASP-2 세린 프로테아제(SP) 도메인(서열 번호:1의 aa 445 내지 686); 시노몰구스 원숭이 MASP-2의 MASP-2 세린 프로테아제(SP) 도메인(서열 번호:4의 aa 445 내지 686); 개 MASP-2의 MASP-2 세린 프로테아제(SP) 도메인(서열 번호:5의 aa 445 내지 686); 마우스 MASP-2의 MASP-2 세린 프로테아제(SP) 도메인(서열 번호:2의 aa 444 내지 685): 및 래트 MASP-2의 MASP-2 세린 프로테아제(SP) 도메인(서열 번호:3의 aa 444 내지 685)의 아미노산 정렬이다.
도 17A는 실시예 11에서 기술된 것과 같이 1.5 mg/kg OMS856의 정맥내 투여 후 시노몰구스 원숭이의 렉틴 경로 활성 대비 시간을 그래프로 도시한다.
도 17B는 실시예 11에서 기술된 것과 같이, 1.5 mg/kg OMS858의 정맥내 투여 후 시노몰구스 원숭이의 렉틴 경로 활성 대비 시간을 그래프로 도시한다.
도 18A는 실시예 11에서 기술된 것과 같이, 1.5 mg/kg OMS856의 피하 투여 후 시노몰구스 원숭이의 렉틴 경로 활성 대비 시간을 그래프로 도시한다.
도 18B는 실시예 11에서 기술된 것과 같이, 1.5 mg/kg OMS858의 피하 투여 후 시노몰구스 원숭이의 렉틴 경로 활성 대비 시간을 그래프로 도시한다.
도 19는 실시예 12에서 기술된 것과 같이, OMS858의 용량 범위가 투여된 마우스에서 폐쇄까지의 시간(TOC)을 그래프로 도시한다.
도 20A는 실시예 13에서 기술된 것과 같이 고전적 경로 특이적 검정 조건 하에 달라지는 농도의 항-MASP-2 항체 OMS858의 존재 하에 MAC 침착 수준을 그래프로 도시한다.
도 20B는 실시예 13에서 기술된 것과 같이 렉틴 경로 특이적 검정 조건 하에 달라지는 농도의 항-MASP-2 항체 OMS858의 존재 하에 MAC 침착 수준을 그래프로 도시한다.
도 20C는 실시예 13에서 기술된 것과 같이 대체 경로 특이적 검정 조건 하에 달라지는 농도의 항-MASP-2 항체 OMS858의 존재 하에 MAC 침착 수준을 그래프로 도시한다.
도 21은 실시예 16에서 기술된 것과 같이, 0.1, 0.3, 1, 또는 3 mg/kg 피하 OMS858 또는 1 mg/kg 정맥내 OMS585에 대한 노출 후에 시노몰구스 원숭이에서 렉틴 경로 활성의 OMS858 억제의 약력학을 그래프로 도시한다.
도 22는 실시예 16에서 기술된 것과 같이, 시노몰구스 원숭이에서 OMS858 혈청 농도와 PD 반응 데이터(즉, 렉틴 경로 억제) 사이의 관계를 그래프로 도시한다.
도 23은 실시예 17에서 기술된 것과 같이, 0.1, 0.3, 1, 또는 3 mg/kg 피하 OMS858 또는 1 mg/kg 정맥내 OMS585에 대한 노출 후 마우스 및 시노몰구스 원숭이에서 OMS858의 약력학 매개변수를 그래프로 도시한다. 마우스(왼쪽 패널) 및 원숭이(오른쪽 패널)에 대한 단일 정맥내 또는 피하 투여 후 시간 경과에 따른 평균 OMS858 혈청 농도의 플롯이 도시된다.
도 24는 실시예 16에서 기술된 것과 같이, 0.1, 0.3, 1, 또는 3 mg/kg 피하 OMS858 또는 1 mg/kg 정맥내 OMS585에 대한 노출 후 마우스에서 렉틴 경로 활성의 OMS858 억제의 약력학을 그래프로 도시한다.
도 25는 건강한 인간 대상체에서의 OMS858의 약동학(PK)을 그래프로 도시한다. 대상체는 0.01 mg/kg(코호트 1), 0.03 mg/kg(코호트 2), 0.1 mg/kg(코호트 3), 또는 0.3 mg/ml(코호트 4)의 1 정맥내 용량의 OMS858로 투여되었다. 투여 후 다양한 시점에서 대상체로부터 취한 혈청 샘플에서 검출된 OMS858의 농도가 도시된다. 점선은 사용된 검정에 대한 정량 하한인 70 ng/mL을 나타낸다.
도 26은 건강한 인간 대상체에서의 OMS858의 약력학(PD)을 그래프로 도시한다. 대상체는 0.01 mg/kg(코호트 1), 0.03 mg/kg(코호트 2), 0.1 mg/kg(코호트 3), 또는 0.3 mg/kg(코호트 4)의 1 정맥내 용량의 OMS858로 투여되었다. 투여 후 다양한 시점에서 C4 침착에 의해 측정된 보체의 렉틴 경로의 억제 수준이 도시되다. 위약이 투여된 대상체에 대한 측정이 또한 도시된다.
도 27은 OMS858에 대한 PK 및 PD의 관계를 그래프로 도시한다. 0.01 mg/kg(코호트 1), 0.03 mg/kg(코호트 2), 또는 0.1 mg/kg(코호트 3)의 1 정맥내 용량의 OMS858이 투여된 대상체에 대한 다양한 수준의 OMS858에서의 렉틴 경로 억제 수준이 도시된다. 계산된 EC₅₀은 170 ng/mL이고 계산된 EC₉₀은 400 ng/mL이다.

I. 정의

본원에서 구체적으로 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 용어는 본 발명의 기술분야에서 통상의 지식을 가진 사람들에 의해 이해되는 것과 같은 의미를 가진다. 다음의 정의는 본 발명을 기술하기 위해 명세서 및 청구범위에서 사용되는 용어들과 관련하여 명료성을 제공하기 위해 제공된다. 추가 정의는 본 명세서 전체에서 제시된다.

본 설명에서, 임의의 농도 범위, 백분율 범위, 비율 범위, 또는 정수 범위는, 달리 표시되거나 맥락으로부터 분명하지 않는 한, 인용된 범위 내의 임의의 정수 값 및 적절한 경우 그것의 분수(예컨대 정수의 1/10 및 1/100)를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 임의의 물리적 특징, 예컨대 중합체 하위단위, 크기, 또는 두께와 관련한 본원에서 인용된 임의의 숫자 범위는, 달리 표시되거나 맥락으로부터 분명하지 않는 한, 인용된 범위 내의 임의의 정수 및 적절한 경우 그것의 분수를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본원에서 사용되는 바, 용어 "약"은, 달리 표시되지 않는 한, 제공된 범위 또는 값이 표시된 범위 또는 값의 ±10%만큼 달라질 수 있는 것을 명시하는 것을 의미한다.

본원에서 사용된 단수로 표시된 용어(수식어 "a", "an", 및 "the"로 수식됨)는 언급된 구성요소의 하나 이상을 지칭하는 것으로 이해되어야 한다. 대안(예컨대, "또는")의 사용은 하나, 둘 다, 또는 대안의 임의의 조합을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 본원에서 사용되는 바, 용어 "포함되다", "가지다", 및 "포함하다"는 동의어적으로 사용되며, 이들 용어 및 변용은 비제한적으로 해석되도록 의도된다.

"선택적인" 또는 "선택적으로"는 후속해서 기술된 요소, 구성요소, 사건, 또는 상황이 일어날 수 있거나 또는 일어나지 않을 수 있으며, 이 기술에는 요소, 구성요소, 사건, 또는 상황이 일어난 경우 및 일어나지 않은 경우가 포함되는 것을 의미한다.

본원에서 기술된 구조 및 하위단위의 다양한 조합으로부터 유래된 개별 구성물 또는 구성물의 그룹은 각각의 구성물 또는 구성물 그룹이 개별적으로 제시된 것과 같은 정도로 본 출원에 의해 개시되는 것이 이해되어야 한다. 그러므로, 특정 구조 또는 특정 하위단위의 선택은 본 개시의 범주 내에 있다.

용어 "본질적으로 이루어지는"은 "포함하는"과 동등하지 않으며 청구하는 명시된 물질 또는 단계, 또는 청구된 주제의 기본적인 특징에 실질적으로 영향을 미치지 않는 것들을 지칭한다. 예를 들어, 단백질 도메인, 영역, 또는 모듈(예컨대, 결합 도메인) 또는 단백질은 도메인, 영역, 모듈, 또는 단백질의 아미노산 서열에, 함께 도메인, 영역, 모듈, 또는 단백질의 길이의 많으면 20%(예컨대, 많으면 15%, 10%, 8%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1%)에 기여하고 도메인(들), 영역(들), 모듈(들), 또는 단백질의 활성(예컨대, 결합 단백질의 표적 결합 친화성)에 실질적으로 영향을 미치지 않는(즉, 50% 이하, 예컨대 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 또는 1% 이하만큼 활성을 감소시키지 않음) 연장, 결실, 돌연변이, 또는 이것들의 조합(예컨대, 아미노- 또는 카르복시 말단에 또는 도메인 사이의 아미노산)이 포함될 때 특별한 아미노산 서열로 "본질적으로 이루어진다".

본원에서 사용되는 바, 용어 "치료하다", "치료", 또는 "개선하다"는 대상체의 질환, 장애, 또는 병태의 의료적 관리를 지칭한다. 일반적으로, 본 개시의 항체 또는 그것의 항원 결합 단편을 포함하는 적절한 용량 또는 치료 요법이 치료적 또는 예방적 이익을 유도하기에 충분한 양으로 투여된다. 치료적 또는 예방적/방지 이익에는 개선된 임상 결과; 질환과 관련된 증상의 감소 또는 완화; 감소된 증상 발생; 개선된 삶의 질; 더 긴 질환 없는 상태; 질환 정도의 감소; 질환 상태의 안정화; 질환 진행의 지연 또는 방지; 관해; 생존; 연장된 생존; 또는 이것들의 임의의 조합이 포함된다.

본 개시의 항체 또는 그것의 항원 결합 단편, 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 숙주 세포, 또는 조성물의 "치료적 유효량" 또는 "유효량"은 통계학적으로 유의미한 방식으로 개선된 임상 결과; 질환과 관련된 증상의 감소 또는 완화; 감소된 증상 발생; 개선된 삶의 질; 더 긴 질환 없는 상태; 질환 정도의 감소; 질환 상태의 안정화; 질환 진행의 지연 또는 방지; 관해; 생존; 또는 연장된 생존을 포함한 치료적 효과를 초래하기에 충분한 조성물 또는 분자의 양을 지칭한다. 단독으로 투여된 개별 활성 성분을 언급할 때, 치료적 유효량은 그 성분 또는 그 성분을 발현하는 세포 단독의 효과를 지칭한다. 조합을 언급할 때, 치료적 유효량은 활성 성분 또는 일련적으로, 순차적으로, 또는 동시에 투여되는지의 여부에 관계없이 치료적 효과를 초래하는 활성 성분을 발현하는 세포와 조합된 보조 활성 성분의 조합된 양을 지칭한다.

본원에서 사용되는 바, "대상체"에는 제한 없이 인간, 비인간 영장류, 개, 고양이, 말, 양, 염소, 소, 토끼, 돼지, 및 설치류를 포함한 모든 포유류가 포함된다. 대상체는 수컷 또는 암컷일 수 있고, 유아, 어린이, 청소년, 성인, 및 노인 대상체를 포함한 임의의 적합한 연령일 수 있다.

본원에서 사용되는 바, "아미노산"은 자연적으로 발생하는 아미노산 및 합성 아미노산, 뿐만 아니라 자연적으로 발생하는 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 아미노산 유사체 및 아미노산 모방체를 지칭한다. 자연적으로 발생하는 아미노산은 유전자 코드에 의해 암호화된 것들뿐만 아니라, 나중에 변형된 아미노산, 예컨대, 하이드록시프롤린, γ-카르복시글루타메이트, 및 O-포스포세린이다. 아미노산 유사체는 자연적으로 발생하는 아미노산과 동일한 기본 화학 구조, 즉, 수소, 카르복실기, 아미노기, 및 R 기에 결합된 α 탄소를 갖는 화합물, 예컨대, 호모세린, 노르류신, 메티오닌 설폭사이드, 메티오닌 메틸 설포늄을 지칭한다. 그러한 유사체는 변형된 R 기를 갖거나(예컨대, 노르류신) 또는 변형된 펩타이드 백본을 갖지만, 자연적으로 발생하는 아미노산과 동일한 기본적인 화학적 구조를 유지한다. 아미노산 모방체는 아미노산의 일반적인 화학적 구조와 상이한 구조를 갖지만 자연적으로 발생하는 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 화학적 화합물을 지칭한다.

본원에서 사용되는 바, "돌연변이"는 각각 기준 또는 야생형 핵산 분자 또는 폴리펩타이드 분자와 비교할 때 핵산 분자 또는 폴리펩타이드 분자의 서열에서의 변화를 지칭한다. 돌연변이는 뉴클레오타이드(들) 또는 아미노산(들)의 치환, 삽입 또는 결실을 포함한, 서열의 여러 상이한 유형의 변화를 초래할 수 있다.

가장 넓은 의미로, 자연적으로 발생하는 아미노산은 각 아미노산의 측쇄의 화학적 특성을 기반으로 한 그룹들로 나누어질 수 있다. "소수성" 아미노산은 Ile, Leu, Met, Phe, Trp, Tyr, Val, Ala, Cys 또는 Pro를 의미한다. "친수성" 아미노산은 Gly, Asn, Gln, Ser, Thr, Asp, Glu, Lys, Arg 또는 His를 의미한다.

"보존성 치환"은 특정 단백질의 결합 특징에 유의하게 영향을 미치거나 변경시키지 않는 아미노산 치환을 지칭한다. 일반적으로, 보존성 치환은 치환된 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체되는 것이다. 보존성 치환에는 다음 그룹 중 하나에서 찾아볼 수 있는 치환이 포함된다: 그룹 1: 알라닌(Ala 또는 A), 글리신(Gly 또는 G), 세린(Ser 또는 S), 트레오닌(Thr 또는 T); 그룹 2: 아스파르트산(Asp 또는 D), 글루탐산(Glu 또는 Z); 그룹 3: 아스파라긴(Asn 또는 N), 글루타민(Gln 또는 Q); 그룹 4: 아르기닌(Arg 또는 R), 리신(Lys 또는 K), 히스티딘(His 또는 H); 그룹 5: 아이소류신(Ile 또는 I), 류신(Leu 또는 L), 메티오닌(Met 또는 M), 발린(Val 또는 V); 및 그룹 6: 페닐알라닌(Phe 또는 F), 티로신(Tyr 또는 Y), 트립토판(Trp 또는 W). 추가적으로 또는 대안적으로, 아미노산은 유사한 기능, 화학적 구조, 또는 조성에 의해 보존성 치환 기로 그룹화될 수 있다 (예컨대, 산성, 염기성, 지방족, 방향족, 또는 황 함유). 예를 들어, 지방족 그룹에는, 치환 목적으로, Gly, Ala, Val, Leu, 및 Ile가 포함될 수 있다. 다른 보존성 치환 그룹에는: 황 함유: Met 및 시스테인(Cys 또는 C); 산성: Asp, Glu, Asn, 및 Gln; 작은 지방족, 비극성 또는 약한 극성 잔기: Ala, Ser, Thr, Pro, 및 Gly; 극성, 음전하 잔기 및 그것의 아미드: Asp, Asn, Glu, 및 Gln; 극성, 양전하 잔기: His, Arg, 및 Lys; 큰 지방족, 비극성 잔기: Met, Leu, Ile, Val, 및 Cys; 및 큰 방향족 잔기: Phe, Tyr, 및 Trp이 포함된다. 추가 정보는 문헌[Creighton (1984) Proteins, W.H. Freeman and Company]에서 찾아볼 수 있다.

본원에서 사용되는 바, "단백질" 또는 "펩타이드" 또는 "폴리펩타이드"는 아미노산 잔기의 중합체를 지칭한다. 단백질은 자연적으로 발생하는 아미노산 중합체, 뿐만 아니라 하나 이상의 아미노산 잔기가 상응하는 자연적으로 발생하는 아미노산의 인공적인 화학적 모방체인 아미노산 중합체, 및 자연적으로 발생하지 않는 아미노산 중합체에도 적용된다. 본 개시의 단백질, 펩타이드, 및 폴리펩타이드의 변이체가 또한 고려된다. 특정 구체예에서, 변이체 단백질, 펩타이드, 및 폴리펩타이드는 본원에서 기술된 정의된 또는 기준 아미노산 서열의 아미노산 서열에 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.9% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 그것으로 이루어진다.

"핵산 분자" 또는 "올리고뉴클레오타이드" 또는 "폴리뉴클레오타이드" 또는 "폴리핵산"은 천연 하위단위(예컨대, 퓨린 또는 피리미딘 염기) 또는 비천연 하위단위(예컨대, 모르폴린 고리)로 구성될 수 있는, 공유 연결된 뉴클레오타이드를 포함한 올리고머 또는 중합체 화합물을 지칭한다. 퓨린 염기에는 아데닌, 구아닌, 하이포잔틴, 및 잔틴이 포함되며 피리미딘 염기에는 우라실, 티민, 및 시토신이 포함된다. 핵산 분자에는 예를 들어, mRNA, microRNA, siRNA, 바이러스 게놈 RNA, 및 합성 RNA가 포함되는 폴리리보핵산(RNA), 및 예를 들어, cDNA, 게놈 DNA, 및 합성 DNA가 포함되는 폴리데옥시리보핵산(DNA)이 포함된다. 두 RNA 및 DNA는 모두 단일 또는 이중 가닥일 수 있다. 만약 단일 가닥이면, 핵산 분자는 코딩 가닥이거나 비코딩(항-센스) 가닥일 수 있다. 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 분자에는 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 모든 뉴클레오타이드 서열이 포함된다. 뉴클레오타이드 서열의 일부 버전에는 또한 인트론(들)이 동시 전사 또는 전사 후 메커니즘을 통해 제거될 정도로 인트론(들)이 포함된다. 달리 말하면, 상이한 뉴클레오타이드 서열이 유전자 코드의 중복성 또는 축퇴성의 결과로서, 또는 스플라이싱에 의해 동일한 아미노산 서열을 암호화할 수 있다.

본 개시의 핵산 분자의 변이체가 또한 고려된다. 변이체 핵산 분자는 본원에서 기술된 정의된 또는 기준 폴리뉴클레오타이드의 핵산 분자에 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 바람직하게는 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.9% 동일하거나, 또는 약 65-68℃에서 0.015 M 염화 나트륨, 0.0015 M 시트르산 나트륨 또는 약 42℃에서 0.015 M 염화 나트륨, 0.0015 M 시트르산 나트륨, 및 50% 포름아미드의 엄격한 혼성화 조건 하에서 폴리뉴클레오타이드에 혼성화한다. 핵산 분자 변이체는 본원에서 기술된 기능, 예컨대 표적 분자에 결합하는 기능을 가지는 결합 도메인을 암호화하는 능력을 유지한다.

"퍼센트 서열 동일성"은 서열을 비교함으로써 결정된 바, 둘 이상의 서열 사이의 관계를 지칭한다. 바람직한 서열 동일성 결정 방법은 비교되는 서열 사이에 최상의 매치를 제공하도록 설계된다. 예를 들어, 서열은 최적 비교 목적으로 정렬된다(예컨대, 최적 정렬을 위해 갭이 제1 및 제2 아미노산 또는 핵산 서열 중 하나 또는 둘 다에 도입될 수 있다). 추가로, 비상동성 서열이 비교 목적으로 무시될 수 있다. 본원에서 언급된 퍼센트 서열 동일성은, 달리 표시되지 않는 한, 기준 서열의 길이에 걸쳐 계산된다. 서열 동일성 및 유사성을 결정하기 위한 방법은 대중적으로 이용 가능한 컴퓨터 프로그램에서 찾아볼 수 있다. 서열 정렬 및 퍼센트 동일성 계산은 BLAST 프로그램(예컨대, BLAST 2.0, BLASTP, BLASTN, 또는 BLASTX), 또는 Megalign(DNASTAR) 소프트웨어를 사용하여 수행될 수 있다. BLAST 프로그램에 사용된 수학적 알고리즘은 문헌[Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997]에서 찾아볼 수 있다. 비교되는 서열의 전체 길이에 걸쳐 최대 정렬을 달성하기 위해 필요한 임의의 알고리즘을 포함한, 정렬을 측정하기 위한 적절한 매개변수는 알려져 있는 방법에 의해 결정될 수 있다.

용어 "분리된"은 물질이 원래의 환경(예컨대, 자연적으로 발생된 것이라면 자연적인 환경)으로부터 제거된 것을 의미한다. 예를 들어, 살아있는 동물에 존재하는 자연적으로 발생하는 핵산 또는 폴리펩타이드는 분리되지 않은 것이지만, 자연계에 공존하는 물질의 일부 또는 전부로부터 분리된 동일한 핵산 또는 폴리펩타이드는 분리된 것이다. 그러한 핵산은 벡터의 일부일 수 있고/거나 그러한 핵산 또는 폴리펩타이드는 조성물(예컨대, 세포 용해물)의 일부일 수 있으며, 그러한 벡터 또는 조성물이 핵산 또는 폴리펩타이드에 대해 자연적인 환경의 일부가 아니라는 점에서 여전히 분리된 것이다.

"분리된"은 또한, 일부 구체예에서, 인체 외부에 있는 항체, 항원 결합 단편, 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 숙주 세포, 또는 조성물을 기술한다.

용어 "유전자"는 폴리펩타이드 사슬의 생성에 관여하는 DNA 또는 RNA의 분절을 의미한다; 특정 맥락에서, 그것에는 코딩 영역의 선행 및 후행 영역(예컨대, 5' 미번역 영역(UTR) 및 3' UTR) 뿐만 아니라 개별 코딩 분절(엑손) 사이의 개재 서열(인트론)이 포함된다.

"기능적 변이체"는 본 개시의 모 또는 기준 화합물에 구조적으로 유사한 또는 실질적으로 구조적으로 유사하지만, 조성이 약간 상이하여(예컨대, 하나 이상의 염기, 원자 또는 작용기가 상이하거나, 첨가되거나, 또는 제거됨) 폴리펩타이드 또는 암호화된 폴리펩타이드가 적어도 50% 효율로, 바람직하게는 모 폴리펩타이드의 활성의 적어도 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.9%, 100% 수준, 또는 모 폴리펩타이드의 활성보다 더 큰 활성 수준으로 모 폴리펩타이드의 적어도 하나의 기능을 수행할 수 있게 되는 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다. 달리 말하면, 본 개시의 폴리펩타이드 또는 암호화된 폴리펩타이드의 기능적 변이체는 모 또는 기준 폴리펩타이드와 비교하여 선택된 검정에서, 예컨대 효소적 활성 또는 결합 친화성을 측정하기 위한 검정에서 기능적 변이체가 성능에서 개선을 보이거나, 또는 성능이 50% 이하로 감소할 때 "유사한 결합", "유사한 친화성" 또는 "유사한 활성"을 가진다.

본원에서 사용되는 바, "기능적 부분" 또는 "기능적 단편"은 모 또는 기준 화합물의 도메인, 일부 또는 단편만을 포함하는 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드를 지칭하며, 폴리펩타이드 또는 암호화된 폴리펩타이드는 모 또는 기준 화합물의 도메인, 부분 또는 단편과 관련하여 적어도 50% 활성, 바람직하게는 모 폴리펩타이드의 활성의 적어도 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.9%, 100% 수준, 또는 모 폴리펩타이드의 활성보다 더 큰 수준의 활성을 유지하거나, 또는 생물학적 이익(예컨대, 이펙터 기능)을 제공한다. 본 개시의 폴리펩타이드 또는 암호화된 폴리펩타이드의 "기능적 부분" 또는 "기능적 단편"은 모 또는 기준 폴리펩타이드와 비교하여 선택된 검정에서 기능적 부분 또는 단편이 성능의 개선을 보이거나, 또는 성능이 50% 이하(바람직하게는 20% 또는 10% 이하, 또는 친화성과 관련하여 모 또는 기준과 비교하여 로그 차이 이하)로 감소할 때 "유사한 결합" 또는 "유사한 활성"을 가진다.

본원에서 사용되는 바, 용어 "조작된", "재조합", 또는 "비천연"은 적어도 하나의 유전자 변경이 포함되거나 외인성 또는 이종성 핵산 분자의 도입에 의해 변형된 유기체, 미생물, 세포, 단백질, 폴리펩타이드, 핵산 분자, 또는 벡터를 지칭하며, 그러한 변경 또는 변형은 유전자 조작(즉, 인간 개입)에 의해 도입된다. 유전자 변경에는, 예를 들어, 기능성 RNA, 단백질, 융합 단백질 또는 효소를 암호화하는 발현 가능한 핵산 분자를 도입하는 변형, 또는 다른 핵산 분자 첨가, 결실, 치환, 또는 세포의 유전 물질의 다른 기능적 파괴가 포함된다. 추가의 변형에는, 예를 들어, 변형이 폴리뉴클레오타이드, 유전자, 또는 오페론의 발현을 변경시키는 비코딩 조절 영역이 포함된다.

본원에서 사용되는 바, "이종성" 또는 "비내인성" 또는 "외인성"은 숙주 세포 또는 대상체 태생이 아닌 임의의 유전자, 단백질, 화합물, 핵산 분자, 또는 활성, 또는 변경된 숙주 세포 또는 대상체 태생인 임의의 유전자, 단백질, 화합물, 핵산 분자, 또는 활성을 지칭한다. 이종성, 비내인성, 또는 외인성에는 구조, 활성, 또는 둘 다가 천연 유전자, 단백질, 화합물, 또는 핵산 분자와 변경된 유전자, 단백질, 화합물, 또는 핵산 분자 사이에서와 같이 상이하도록 돌연변이되었거나 또는 그렇지 않으면 변경된 유전자, 단백질, 화합물, 또는 핵산 분자가 포함된다. 특정 구체예에서, 이종성, 비내인성, 또는 외인성 유전자, 단백질, 또는 핵산 분자(예컨대, 수용체, 리간드, 등)는 숙주 세포 또는 대상체에 내인성일 수 없지만, 대신 그러한 유전자, 단백질, 또는 핵산 분자를 암호화하는 랙산은 콘쥬게이션, 형질전환, 형질감염, 전기천공, 등에 의해 숙주 세포에 첨가될 수 있고, 첨가된 핵산 분자는 숙주 세포 게놈에 통합되거나 염색체외 유전자 물질로서(예컨대, 플라스미드 또는 다른 자가 복제 벡터로서) 존재할 수 있다. 용어 "상동성" 또는 "상동체"는 숙주 세포, 종, 또는 스트레인에서 찾아볼 수 있거나 또는 그로부터 유래된 유전자, 단백질, 화합물, 핵산 분자, 또는 활성을 지칭한다. 예를 들어, 이종성 또는 외인성 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자는 천연 폴리뉴클레오타이드 또는 유전자에 상동성일 수 있고 상동성 폴리펩타이드 또는 활성을 암호화하지만, 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드는 변경된 구조, 서열, 발현 수준, 또는 이것들의 임의의 조합을 가질 수 있다. 비내인성 폴리뉴클레오타이드 또는 유전자, 뿐만 아니라 암호화된 폴리펩타이드 또는 활성은 동일한 종, 상이한 종, 또는 이것들의 조합으로부터 유래될 수 있다.

특정 구체예에서, 숙주 세포에 고유한 핵산 분자 또는 그것의 부분은 만약 변경되었거나 돌연변이되었다면 숙주 세포에 대해 이종성인 것으로 간주될 것이고, 또는 숙주 세포에 고유한 핵산 분자는 만약 이종성 발현 제어 서열로 변경되었거나 숙주 세포에 고유한 핵산 분자와 정상적으로 회합되지 않는 내인성 발현 제어 서열로 변경되었다면 이종성인 것으로 간주될 수 있다. 더불어, 용어 "이종성"은 숙주 세포에 대해 상이하거나, 변경되거나, 또는 내인성이 아닌 생물학적 활성을 지칭할 수 있다. 본원에서 기술되는 것과 같이, 하나 이상의 이종성 핵산 분자는 별도의 핵산 분자로서, 복수의 개별적으로 제어된 유전자로서, 폴리시스트론성 핵산 분자로서, 항체 또는 항원 결합 단편(또는 다른 폴리펩타이드)을 암호화하는 단일 핵산 분자로서, 또는 이것들의 임의의 조합으로서 숙주 세포에 도입될 수 있다.

본원에서 사용되는 바, 용어 "내인성" 또는 "천연"은 숙주 세포 또는 대상체에 정상적으로 존재하는 폴리뉴클레오타이드, 유전자, 단백질, 화합물, 분자, 또는 활성을 지칭한다.

본원에서 사용되는 바, 용어 "발현"은 폴리펩타이드가 핵산 분자의 암호화 서열, 예컨대 유전자를 기반으로 생성되는 과정을 지칭한다. 그 과정에는 전사, 전사 후 제어, 전사 후 변형, 번역, 번역 후 제어, 번역 후 변형, 또는 이것들의 임의의 조합이 포함될 수 있다. 발현된 핵산 분자는 전형적으로 발현 제어 서열(예컨대, 프로모터)에 작동 가능하게 연결된다.

용어 "작동 가능하게 연결된"은 하나의 기능이 다른 것에 의해 영향을 받도록 단일 핵산 단편 상에서 둘 이상의 핵산 분자의 회합을 지칭한다. 예를 들어, 프로모터는 그것이 코딩 서열의 발현에 영향을 미칠 수 있을 때 그 코딩 서열과 작동 가능하게 연결된다(즉, 코딩 서열은 프로모터의 전사 제어 하에 있다). "연결되지 않은"은 회합된 유전자 요소가 서로 밀접하게 회합되어 있지 않고 하나의 기능이 다른 것에 영향을 주지 않는 것을 의미한다.

본원에서 기술되는 것과 같이, 하나 이상의 이종성 핵산 분자는 별도의 핵산 분자로서, 복수의 개별적으로 제어된 유전자로서, 폴리시스트론성 핵산 분자로서, 단백질(예컨대, 항체의 중쇄)을 암호화하는 단일 핵산 분자로서, 또는 이것들의 임의의 조합으로서 숙주 세포에 도입될 수 있다. 2개 이상의 이종성 핵산 분자가 숙주 세포에 도입될 때, 2개 이상의 이종성 핵산 분자는 단일 핵산 분자(예컨대, 단일 벡터 상의)로서, 별도의 벡터 상에 도입될 수 있고, 단일 부위 또는 다중 부위에서 숙주 염색체에 통합될 수 있거나, 또는 이것들의 임의의 조합일 수 있는 것으로 이해된다. 참조된 이종성 핵산 분자 또는 단백질 활성의 수는 숙주 세포에 도입된 별도의 핵산 분자의 수가 아닌 상이한 암호화 핵산 분자의 수 또는 상이한 단백질 활성의 수를 지칭한다.

용어 "구성물"은 재조합 핵산 분자(또는, 맥락이 분명하게 표시하는 경우에는 본 개시의 융합 단백질)를 함유하는 임의의 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다. (폴리뉴클레오타이드) 구성물은 벡터(예컨대, 박테리아 벡터, 바이러스 벡터)에 존재할 수 있거나 또는 게놈에 통합될 수 있다. "벡터"는 또 다른 핵산 분자를 수송할 수 있는 핵산 분자이다. 벡터는, 예를 들어, 염색체, 비염색체, 반합성 또는 합성 핵산 분자를 포함할 수 있는 플라스미드, 코스미드, 바이러스, RNA 벡터 또는 선형 또는 원형 DNA 또는 RNA 분자일 수 있다. 본 개시의 벡터에는 또한 트랜스포존 시스템이 포함된다(예컨대, 슬리핑 뷰티(Sleeping Beauty), 예컨대, Geurts et al., Mol. Ther. 8:108, 2003: Mαtes et al., Nat. Genet. 41:753, 2009 참고). 예시의 벡터는 자율 복제를 할 수 있는 벡터(에피솜성 벡터), 폴리뉴클레오타이드를 세포 게놈에 전달할 수 있는 벡터(예컨대, 바이러스 벡터), 또는 연결된 핵산 분자를 발현할 수 있는 벡터(발현 벡터)이다.

본원에서 사용되는 바, "발현 벡터", "클로닝 벡터", 또는 "벡터"는 적합한 숙주에서 핵산 분자의 발현을 실시할 수 있는 적합한 제어 서열에 작동 가능하게 연결된 핵산 분자를 함유하는 DNA 구성물을 지칭한다. 그러한 제어 서열에는 전형적으로 전사를 실시하기 위한 프로모터, 그러한 전사를 제어하기 위한 선택적인 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보솜 결합 부위를 암호화하는 서열, 및 전사 및 번역의 종결을 제어하는 서열이 포함된다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자, 바이러스, 또는 단순하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적합한 숙주로 형질전환된 후에, 벡터는 숙주 게놈과 독립적으로 복제 및 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에는 게놈 자체로 통합되거나 벡터에 함유된 폴리뉴클레오타이드를 벡터 서열 없이 게놈에 전달할 수 있다. 본 명세서에서 "플라스미드", "발현 플라스미드", "바이러스", 및 "벡터"는 종종 상호교환적으로 사용된다.

핵산 분자를 세포에 삽입하는 맥락에서 용어 "도입된"은 "형질감염", "형질전환", 또는 "형질도입"을 의미하고 핵산 분자의 진핵 또는 원핵 세포로의 통합에 대한 언급을 포함하며 여기서 핵산 분자는 세포의 게놈(예컨대, 염색체, 플라스미드, 플라스티드, 또는 미토콘드리아 DNA)에 통합될 수 있고, 자율적인 레플리콘으로 전환되거나, 또는 일시적으로 발현될 수 있다(예컨대, 형질감염된 mRNA).

특정 구체예에서, 본 개시의 폴리뉴클레오타이드는 벡터의 특정 요소에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오타이드 서열이 결찰되는 코딩 서열의 발현 및 프로세싱을 실시하기 위해 필요한 폴리뉴클레오타이드 서열이 작동 가능하게 연결될 수 있다. 발현 제어 서열에는 적절한 전사 개시, 종결, 프로모터, 및 인핸서 서열; 스플라이싱 및 폴리아데닐화 신호와 같은 효율적인 RNA 프로세싱 신호; 세포질 mRNA를 안정화시키는 서열; 번역 효율을 향상시키는 서열(즉, Kozak 공통 서열); 단백질 안정성을 향상시키는 서열; 및 가능하게는 단백질 분비를 향상시키는 서열이 포함될 수 있다. 발현 제어 서열은 만약 그것이 관심의 유전자와 연속적이라면 작동 가능하게 연결된 것일 수 있고 관심의 유전자를 제어하기 위하여 트랜스로 또는 먼 거리에서 작용하는 발현 제어 서열도 또한 작동 가능하게 연결된 것으로 간주될 수 있다.

특정 구체예에서, 벡터는 플라스미드 벡터 또는 바이러스 벡터(예컨대, 렌티바이러스 벡터 또는 γ-레트로바이러스 벡터)를 포함한다. 바이러스 벡터에는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 파보바이러스(예컨대, 아데노 관련 바이러스), 코로나바이러스, 오르토-믹소바이러스와 같은 음성 가닥 RNA 바이러스(예컨대, 인플루엔자 바이러스), 라브도바이러스(예컨대, 광견병 및 소포성 구내염 바이러스), 파라믹소바이러스(예컨대, 홍역 및 센다이), 피코르나 바이러스 및 알파바이러스와 같은 양성 가닥 RNA 바이러스, 및 아데노바이러스, 헤르페스바이러스(예컨대, 헤르페스 단순 바이러스 유형 1 및 2, 엡스타인 바 바이러스, 사이토메갈로바이러스), 및 폭스바이러스(예컨대, 백시니아 파울폭스, 및 카나리폭스)를 포함한 이중 가닥 DNA 바이러스가 포함된다. 다른 바이러스로는, 예를 들어, 노르워크 바이러스, 토가바이러스, 플라비바이러스, 레오바이러스, 파포바바이러스, 헤파드나바이러스, 및 간염 바이러스를 들 수 있다. 레트로바이러스의 예로는 조류 백혈병-육종, 포유류 C 타입, B 타입 바이러스, D 타입 바이러스, HTLV-BLV 그룹, 렌티바이러스, 스푸마바이러스(Coffin, J. M., Retroviridae: The viruses and their replication, In Fundamental Virology, Third Edition, B. N. Fields et al., Eds., Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, 1996)를 들 수 있다. 레트로바이러스 및 렌티바이러스 바이러스 벡터를 사용하는 방법 및 도입유전자를 함유한 바이러스 입자로 포유류 숙주 세포를 형질도입시키기 위한 포장 세포는 기술 분야에 알려져 있고 예를 들어 문헌에 이전에 기술되었다: 미국 특허 제8,119,772호; 문헌[Walchli et al., PLoS One 6:327930, 2011; Zhao et al., J. Immunol. 174:4415, 2005; Engels et al., Hum. Gene Ther. 14:1155, 2003; Frecha et al., Mol. Ther. 18:1748, 2010; 및 Verhoeyen et al., Methods Mol. Biol. 506:97, 2009]. 레트로바이러스 및 렌티바이러스 벡터 구성물 및 발현 시스템 또한 상업적으로 이용 가능하다. 또한, 예를 들어 아데노바이러스 기반 벡터 및 아데노 관련 바이러스(AAV) 기반 벡터를 포함한 DNA 바이러스 벡터; 암플리콘 벡터, 복제 결핍 HSV 및 감쇠된 HSV(Krisky et al., Gene Ther. 5:1517, 1998)를 포함한 헤르페스 단순 바이러스(HSV)로부터 유래된 벡터를 포함한 다른 바이러스 벡터도 폴리뉴클레오타이드 전달에 사용될 수 있다.

본 개시의 조성물 및 방법과 함께 사용될 수 있는 다른 벡터에는 배큘로바이러스 및 α-바이러스로부터 유래된 것(Jolly, D J. 1999. Emerging Viral Vectors. pp 209-40 in Friedmann T. ed. The Development of Human Gene Therapy. New York: Cold Spring Harbor Lab), eHSor 플라스미드 벡터(예컨대 슬리핑 뷰티 또는 다른 트랜스포존 벡터)가 포함된다.

바이러스 벡터 게놈이 별도의 전사체로서 숙주 세포에서 발현될 복수의 폴리뉴클레오타이드를 포함할 때, 바이러스 벡터는 또한 2개(또는 그 이상) 전사체 사이에 이중시스트론성 또는 다중시스트론성 발현을 허용하는 추가 서열을 포함할 수 있다. 바이러스 벡터에 사용된 그러한 서열의 예로는 내부 리보솜 진입 부위(IRES), 퓨린 절단 부위, 바이러스 2A 펩타이드, 또는 이것들의 임의의 조합을 들 수 있다.

시험관내에서 하나 이상의 단백질의 발현을 위한 또는 대상체에게 직접 투여하기 위한 DNA 기반 플라스미드 벡터를 포함한 플라스미드 벡터가 또한 기술분야에 알려져 있다. 그러한 벡터는 박테리아 복제 기원, 바이러스 복제 기원, 플라스미드 복제에 필요한 구성요소를 암호화하는 유전자, 및/또는 하나 이상의 선택 마커를 포함할 수 있고, 또한 이중시스트론성 또는 다중시스트론성 발현을 허용하는 추가 서열을 함유할 수 있다.

본원에서 사용되는 바, 용어 "숙주"는 관심의 폴리펩타이드(예컨대, 본 개시의 항체)를 생성하기 위하여 이종성 핵산 분자로 유전자 변형하기 위해 표적화된 세포 또는 미생물을 지칭한다.

숙주 세포에는 벡터 또는 핵산의 통합을 수용하거나 단백질을 발현할 수 있는 임의의 개별 세포 또는 세포 배양물이 포함될 수 있다. 용어는 또한 유전적으로 또는 표현형적으로 동일하거나 상이한지에 관계없이 숙주 세포의 자손을 포함한다. 적합한 숙주 세포는 벡터에 따라 달라질 수 있고 포유류 세포, 동물 세포, 인간 세포, 유인원 세포, 곤충 세포, 효모 세포, 및 박테리아 세포가 포함될 수 있다. 이들 세포는 바이러스 벡터, 칼슘 포스페이트 침전, DEAE-덱스트란, 전기천공을 통한 형질전환, 또는 다른 방법을 사용함으로써 벡터 또는 다른 물질을 통하바도록 유도될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2d ed. (Cold Spring Harbor Laboratory, 1989)]을 참고한다.

본원에서 사용되는 바, "항원"은 면역 반응을 일으키는 면역원성 분자를 지칭한다. 이 면역 반응은 항체 생성, 특이한 면역학적으로 유능한 세포의 활성화, 보체 활성화, 항체 의존적 세포독성, 또는 이것들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 항원(면역원성 분자)은, 예를 들어, 펩타이드, 글리코펩타이드, 폴리펩타이드, 글리코폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 다당, 지질, 등일 수 있다. 항원은 합성되거나, 재조합에 의해 제조되거나, 또는 생물학적 샘플로부터 유래될 수 있는 것이 쉽게 드러난다. 하나 이상의 항원을 함유할 수 있는 예시의 생물학적 샘플에는 조직 샘플, 대변 샘플, 세포, 생물학적 유체, 또는 이것들의 조합이 포함된다. 항원은 항원을 발현하도록 변형되었거나 유전자 조작된 세포에 의해 생성될 수 있다. 항원은 또한 예컨대 비리온에 존재하는 감염원 내에 또는 감염원 상에 존재하거나, 또는 감염원에 의해 감염된 세포의 표면에 발현되거나 제시될 수 있다.

용어 "에피토프" 또는 "항원성 에피토프"에는 동족 결합 분자, 예컨대 면역글로불린, 또는 다른 결합 분자, 도메인, 또는 단백질에 의해 인식되고 특이적으로 결합되는 임의의 분자, 구조, 아미노산 서열, 또는 단백질 결정기가 포함된다. 에피토프 결정기는 일반적으로 분자의 화학적으로 활성인 표면 그룹, 예컨대 아미노산 또는 당 측쇄를 함유하며, 특이적인 삼차원 구조적 특징과, 뿐만 아니라 특이적인 전하 특징을 가질 수 있다. 항원이 펩타이드 또는 단백질이거나 또는 펩타이드 또는 단백질을 포함하는 경우, 에피토프는 연속적인 아미노산으로 구성되거나(예컨대, 선형 에피토프), 또는 단백질 접힘에 의해 근접하게 된 단백질의 상이한 부분 또는 영역으로부터의 아미노산(예컨대, 불연속 또는 형태적 에피토프), 또는 단백질 접힘과 무관하게 매우 근접한 비연속성 아미노산으로 구성될 수 있다.

용어 "항체"는 적어도 하나의 에피토프 인식 부위를 토해 항원에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 폴리펩타이드로 이루어지는 면역글로불린 분자를 지칭한다. 예를 들어, 용어 "항체"는 이황화 결합에 의해 연결된 적어도 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함하는 온전한 항체, 뿐만 아니라 온전한 항체에 의해 인식된 항원 표적 분자에 결합하는 능력을 가지거나 유지하는 온전한 항체의 임의의 항원 결합 부분 또는 단편, 예컨대 scFv, Fab, 또는 Fab'2 단편을 포함한다. 용어는 또한 IgG 및 그것의 하위부류(예컨대 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4), IgM, IgE, IgA, 및 IgD를 포함한 임의의 부류 또는 하위부류의 항체의 전장 또는 단편을 포함한다.

용어 "항체"는 본원에서 임의의 항체 생성 포유류(예컨대, 마우스, 래트, 토기, 및 인간을 포함한 영장류)로부터, 하이브리도마, 파지 선택, 재조합 발현 또는 형질도입 동물(또는 항체 또는 항체 단편을 생성하는 다른 방법)로부터 유래된 항체 및 그것의 항체 단편을 포함하는 가장 넓은 의미로 사용된다. 용어 "항체"는 항체의 공급원 또는 그것이 만들어지는 방식(예컨대, 하이브리도마, 파지 선택, 재조합 발현, 형질도입 동물, 펩타이드 합성, 등에 의한 제조 방식)과 관련하여 제한되는 것으로 의도되지 않는다. 예시의 항체로는 다중클론성, 단클론성 및 재조합 항체; 다중특이적 항체(예컨대, 이중특이적 항체); 인간화된 항체; 전체 인간 항체, 쥐과 항체; 키메릭, 마우스 인간, 마우스 영장류, 영장류 인간 단클론성 항체; 및 항 이디오타입 항체를 들 수 있고, 임의의 온전한 분자 또는 그것의 단편일 수 있다. 본원에서 사용되는 바, 용어 "항체"는 온전한 다중클론성 또는 단클론성 항체뿐만 아니라, 그것의 단편(예컨대 dAb, Fab, Fab', F(ab')2, Fv), 단일 사슬(ScFv), 그것의 합성 변이체, 자연적으로 발생하는 변이체, 항체 부분과 필요한 특이성의 항원 결합 단편을 포함하는 융합 단백질, 인간화된 항체, 키메릭 항체, 및 항원 결합 부위 또는 필요한 특이성의 단편(에피토프 인식 부위)을 포함하는 면역글로불린 분자의 임의의 다른 변형된 형태를 포함한다. 용어는 면역글로불린의 유전자 조작된 및-또는 다르게는 변형된 형태, 예컨대 인트라바디, 펩티바디, 디아바디, 트라이아바디, 테트라바디, 탠덤 다이-scFv, 탠덤 트라이-scFv, 등과 이것들의 항원 결합 단편을 포함한다.

용어 "VH" 및 "VL"은 각각 항체 중쇄 및 항체 경쇄로부터의 가변 결합 영역을 지칭한다. VL은 카파 부류 사슬 또는 람다 부류 사슬일 수 있다. 가변 결합 영역은 상보성 결정 영역(CDR) 및 프레임워크 영역(FR)으로서 알려져 있는 별개의, 잘 정의된 하위영역을 포함한다. CDR은 항체의 초가변 영역(HVR) 내에 위치하며 일반적으로 함께 항체의 항원 특이성 및/또는 결합 친화성을 부여하는 항체 가변 영역 내의 아미노산 서열을 지칭한다. 연속적인 CDR(즉, CDR1 및 CDR2, 및 CDR2 및 CDR3)은 프레임워크 영역에 의해 일차 구조에서 서로로부터 분리된다.

본원에서 사용되는 바, "키메릭 항체"는 비인간 종(예컨대, 설치류) 항체로부터 유래된 가변 도메인 및 상보성 결정 영역을 함유하는 한편, 항체 분자의 나머지는 인간 항체로부터 유래된 재조합 단백질이다. 일부 구체예에서, 키메릭 항체는 상이한 항체의 이종성 Fc 부분에 작동 가능하게 연결된 또는 다르게는 융합된 한 항체의 항원 결합 단편으로 구성된다. 예를 들어, 마우스-인간 키메릭 항체는 인간 항체로부터 유래된 Fc 부분에 융합된 마우스 항체의 항원 결합 단편을 ?l마할 수 있다. 일부 구체예에서, 이종성 Fc 도메인은 IgA(하위부류 IgA1 및 IgA2를 포함함), IgD, IgE, IgG(하위부류 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함함) 및 IgM을 포함한, 모 항체로부터의 상이한 Ig 부류로부터 유래된 것일 수 있다.

본원에서 사용되는 바, "인간화된 항체"는 일반적으로 재조합 기법을 사용하여 제조된, 비인간 종으로부터의 면역글로불린으로부터 유래된 항원 결합 부위 및 인간 면역글로불린의 구조 및/또는 서열을 기반으로 한 분자의 나머지 면역글로불린 구조를 가지는 분자이다. 인간화된 항체는 전형적으로 비인간 종으로부터의 CDR만이 사용되고, 인간 가변 도메인의 적절한 프레임워크 영역으로 그라프팅된다는 점에서 키메릭 항체와 상이하다. 항원 결합 부위는 야생형이거나 또는 하나 이상의 아미노산 치환에 의해 변형될 수 있다. 일부 구체예에서, 인간화된 항체는 모든 CDR 서열(예를 들어, 마우스 항체로부터의 6개 전부의 CDR을 함유하는 인간화된 마우스 항체)을 보존한다. 다른 구체예에서, 인간화된 항체는 원래의 항체와 관련하여 변경된 하나 이상(1, 2, 3, 4, 5, 6개)의 CDR을 가지며, 그것은 또한 원래 항체로부터의 하나 이상의 CDR"로부터 유래된" 하나 이상의 CDR로 명명된다.

본원에서 사용되는 바, 용어 "항체 단편"은 일반적으로 항원 결합 영역 또는 그것의 가변 영역을 포함한 전장 항체로부터 유래된 또는 전장 항체와 관련된 부분을 지칭한다. 항체 단편의 예시적인 예로는 Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2 및 Fv 단편, scFv 단편, 디아바디, 선형 항체, 단일 사슬 항체 분자 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 들 수 있다.

본원에서 사용되는 바, 용어 "항원 결합 단편"은 항체가 발생되는 항원에 특이적으로 결합하는 면역글로불린 중쇄 및/또는 경쇄의 적어도 하나의 CDR을 함유하는 폴리펩타이드 단편을 지칭한다. 항원 결합 단편은 항체로부터의 VH 및 VL 서열의 1, 2, 3, 4, 5개, 또는 전부 6개의 CDR을 포함할 수 있다.

"Fab"(항원 결합 단편)는 항원에 결합하는 항체 부분이며 사슬간 이황화 결합을 통해 경쇄에 연결된 중쇄의 가변 영역 및 CH1을 포함한다. 각각의 Fab 단편은 항원 결합과 관련하여 일가이다, 즉, 단일 항원 결합 부위를 가진다. 항체의 펩신 처리는 이가 항원 결합 활성을 갖는 대략 2개의 이황화 연결된 Fab 단편에 상응하는 단일한 큰 F(ab')2 단편을 초래하며 여전히 항원에 교차 결합할 수 있다. Fab 및 F(ab')2는 모두 "항원 결합 단편"의 예이다. Fab' 단편은 항체 힌지 영역으로부터의 하나 이상의 시스테인을 포함하는 CH1 도메인의 카르복시 말단에 소수의 추가 잔기를 가짐으로써 Fab 단편과 상이하다. Fab'-SH는 본원에서 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)가 유리 티올 기를 함유하는 Fab'에 대한 표시이다. F(ab')2 항체 단편은 종종 그것들 사이에 힌지 시스테인을 가지는 Fab' 단편의 쌍으로서 생성된다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링도 알려져 있다.

Fab 단편은, 예컨대, 펩타이드 링커에 의해 연결되어, 본원에서 또한 "scFab"로서 언급되는 단일 사슬 Fab를 형성할 수 있다. 이들 구체예에서, 천연 Fab에 존재하는 사슬간 이황화 결합은 존재할 수 없고, 링커는 전체적으로 또는 부분적으로 단일 폴리펩타이드 사슬 내 Fab 단편을 결합시키거나 연결하는 작용을 한다. 중쇄 유래 Fab 단편(예컨대, VH + CH1, 또는 "Fd"를 포함하거나, 이것들로 이루어지거나, 또는 본질적으로 이루어짐) 및 경쇄 유래 Fab 단편(예컨대, VL + CL을 포함하거나, 이것들로 이루어지거나, 또는 본질적으로 이루어짐)은 임의의 배열로 연결되어 scFab를 형성할 수 있다. 예를 들어, scFab는 N 말단에서 C 말단 방향으로, (중쇄 Fab 단편 - 링커 - 경쇄 Fab 단편) 또는 (경쇄 Fab 단편 - 링커 - 중쇄 Fab 단편)에 따라 배열될 수 있다.

"Fv"는 완전한 항원 인식 및 항원 결합 부위를 함유하는 작은 항체 단편이다. 이 단편은 일반적으로 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 가변 영역 도메인의 이량체로 긴밀한 비공유 회합으로 이루어진다. 그러나, 단일 가변 도메인(또는 항원에 특이적인 3개의 CDR만을 포함하는 Fv의 절반)이라도, 비록 전형적으로 전체 결합 부위보다는 낮은 친화도이지만 항원을 인식하고 결합하는 능력을 가진다.

"단일 사슬 Fv"는 또한 "sFv" 또는 "scFv"로 약칭되며, 단일 폴리펩타이드 사슬에 연결된 VH 및 VL 항체 도메인을 포함하는 항체 단편이다. scFv 폴리펩타이드는 VH 도메인과 VL 도메인 사이에 배치되어 이들을 연결시켜서 scFv가 항원 결합을 위해 바람직한 구조를 유지하거나 형성하는 것을 가능하게 하는 폴리펩타이드 링커를 포함할 수 있지만, 링커가 언제나 필요하지는 않다. 그러한 펩타이드 링커는 기술분야에 잘 알려져 있는 표준 기법을 사용하여 융합 폴리펩타이드로 통합될 수 있다. 추가적으로, 또는 대안적으로, Fv는 VH와 VL 사이에서 형성되고 이들을 안정화시키는 이황화 결합을 가질 수 있다. scFv의 검토를 위해서는, 문헌[Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)]을 참고한다. 특정 구체예에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 VH 도메인, VL 도메인, 및 VH 도메인을 VL 도메인에 연결시키는 펩타이드 링커를 포함하는 scFv를 포함한다. 특정 구체예에서, scFv는 펩타이드 링커에 의해 VL 도메인에 연결된 VH 도메인을 포함하며, 그것은 VH-링커-VL 방향 또는 VL-링커-VH 방향일 수 있다. 본 개시의 임의의 scFv는 VL 도메인의 C 말단 단부가 짧은 펩타이드 서열에 의해 VH 도메인의 N 말단 단부에 연결되도록, 또는 그 반대가 되도록(즉, (N)VL(C)-링커-(N)VH(C) 또는 (N)VH(C)-링커-(N)VL(C)) 조작될 수 있다. 대안적으로, 일부 구체예에서, 링커는 VH 도메인, VL 도메인, 또는 둘 다의 N 말단 부분 또는 단부에 연결될 수 있다.

scFv 또는 다른 융합 단백질, 예컨대 본원에서 기술된 표적화된 보체 활성화 분자에 사용하기 위한 펩타이드 링커 서열은, 예를 들어: (1) 유연한 확장된 형태를 채택하는 능력; (2) 제1 및 제2 폴리펩타이드 상에서 및/또는 표적 분자 상에서 기능적 에피토프와 상호작용할 수 있는 이차 구조를 채택하지 못하는 무능력 또는 그러한 능력의 결핍; 및/또는 (3) 폴리펩타이드 및/또는 표적 분자와 반응할 소수성 또는 대전된 잔기의 결핍 또는 상대적 결핍을 기반으로 선택될 수 있다. 링커 설계(예컨대, 길이)와 관련된 다른 고려사항에는 VH 및 VL이 기능적 항원 결합 부위를 형성할 수 있는 형태 또는 형태 범위가 포함될 수 있다. 특정 구체예에서, 펩타이드 링커 서열은, 예를 들어, Gly, Asn 및 Ser 잔기를 함유한다. 다른 거의 중성인 아미노산, 예컨대 Thr 및 Ala가 또한 링커 서열에 포함될 수 있다. 링커로서 유용하게 사용될 수 있는 다른 아미노산 서열로는 문헌[Maratea et al., Gene 40:39 46(1985); Murphy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:8258 8262(1986); 미국 특허 제4,935,233호, 및 미국 특허 제4,751,180호]에서 개시된 것들을 들 수 있다. 임의의 적합한 링커가 사용될 수 있고, 일반적으로 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100개 아미노산 길이, 또는 약 200개 미만 아미노산 길이일 수 있고, 바람직하게 유연한 구조를 포함할 것이며(링커에 의해 연결된 두 영역, 도메인, 모티프, 단편, 또는 모듈 사이에서 형태의 이동을 위한 유연성 및 공간을 제공할 수 있음), 바람직하게 인간에서 생물학적으로 비활성이고/이거나 낮은 면역원성 위험을 가질 것이다.

항체는 단일 특이적(예컨대, 단일 에피토프에 결합함) 또는 다중특이적(예컨대, 다수의 에피토프 및/또는 표적 분자에 결합함)일 수 있다. 이중특이적 또는 다중특이적 항체 또는 항원 결합 단편은, 일부 구체예에서, 1, 2개, 또는 그 이상의 항원 결합 도메인(예컨대, VH 및 VL)을 포함할 수 있다. 동일하거나 상이한 에피토프에 결합하는 2개 이상의 결합 도메인이 존재할 수 있고, 본원에 제공된 이중특이적 또는 다중특이적 항체 또는 항원 결합 단편, 일부 구체예에서, 둘 이상의 결합 도메인은 상이한 항원 또는 병원체에 다같이 결합할 수 있다.

항체 및 항원 결합 단편은 다양한 형식으로 구성될 수 있다. 예시의 항체 형식은 문헌[Spiess et al., Mol. Immunol. 67(2):95 (2015), 및 Brinkmann and Kontermann, mAbs 9(2):182-212 (2017)]에서 개시되며, 이 형식 및 그것의 제조 방법은 본원에 참조로 포함되고, 예를 들어, 이중특이적 T 세포 참여자(BiTE), DART, 놉스-인투-홀(Knobs-Into-Holes)(KIH) 조립체, scFv-CH3-KIH 조립체, KIH 공통 경쇄 항체, TandAb, 삼중 바디, TriBi 미니바디, Fab-scFv, scFv-CH-CL-scFv, F(ab')2-scFv2, 사가 HCab, 인트라바디, 크로스Mab, 이중 작용 Fab(DAF)(투인원 또는 포인원), DutaMab, DT-IgG, 전하 쌍, Fab-아암(arm) 교환, 시드바디(SEEDbodies), 트라이오맙(Triomab), LUZ-Y 조립체, Fcab, κλ-바디, 직교 Fab, DVD-Ig(예컨대, 미국 특허 제8,258,268로, 이 형식은 본원에 전체가 참조로 포함됨), IgG(H)-scFv, scFv-(H)IgG, IgG(L)-scFv, scFv-(L)IgG, IgG(L,H)-Fv, IgG(H)-V, V(H)-IgG, IgG(L)-V, V(L)-IgG, KIH IgG-scFab, 2scFv-IgG, IgG-2scFv, scFv4-Ig, 자이바디(Zybody), 및 DVI-IgG(포인원), 뿐만 아니라 소위 FIT-Ig(예컨대, PCT 5 공보 WO 2015/103072, 이 형식은 본원에 전체 내용이 참조로 포함됨), 소위 우시바디(WuxiBody) 형식(예컨대, PCT 공보 WO 2019/057122, 이 형식은 본원에 전체 내용이 참조로 포함됨), 및 소위 엘보우내 삽입(In-Elbow-Insert) Ig 형식(IEI-Ig; 예컨대, PCT 공보 WO 2019/024979 및 WO 2019/025391, 이들 형식은 본원에 전체 내용이 참조로 포함됨)을 들 수 있다.

항체 또는 항원 결합 단편은 2개 이상의 VH 도메인, 2개 이상의 VL 도메인, 또는 둘 다(즉, 2개 이상의 VH 도메인 및 2개 이상의 VL 도메인)을 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, 항원 결합 단편은 (N 말단에서 C 말단 방향으로) VH-링커-VL-링커-VH-링커-VL 형식을 포함하며, 여기서 2개의 VH 서열은 동일하거나 상이할 수 있고 2개의 VL 서열은 동일하거나 상이할 수 있다. 그렇게 연결된 scFv는 주어진 표적에 결합하기 위해 배열된 VH 및 VL 도메인의 임의의 조합을 포함할 수 있고, 2개 이상의 VH 및/또는 2개 이상의 VL을 포함하는 형식에서 1, 2개, 또는 그 이상의 상이한 에피토프 또는 항원이 결합될 수 있다. 다수의 항원 결합 도메인을 통합하는 형식에는 VH 및/또는 VL 서열이 임의의 조합 또는 방향으로 포함될 수 있는 것이 인지될 것이다. 예를 들어, 항원 결합 단편은 VL-링커-VH-링커-VL-링커-VH, VH-링커-VL-링커-VL-링커-VH, 또는 VL-링커-VH-링커-VH-링커-VL 형식을 포함할 수 있다.

본원에서 사용되는 바, 수식어 "단클론성"은 항체의 실질적으로 균일한 집단으로부터 얻어지는 것으로서 항체의 특징을 나타내며, 항체의 공급원 또는 그것이 제조되는 방식(예컨대, 하이브리도마, 파지 선택, 재조합 발현, 형질도입 동물, 등에 의한 제조 방식)과 관련하여 제한되는 것을 의도하지 않는다. 용어 "단클론성 항체"는 온전한 단클론성 항체 및 전장 단클론성 항체뿐만 아니라, 그것의 단편(예컨대 Fab, Fab', F(ab')2, Fv), 단일 사슬(ScFv), 그것의 변이체, 항원 결합 부분을 포함하는 융합 단백질, 인간화된 단클론성 항체, 키메릭 단클론성 항체, 및 필요한 특이성의 항원 결합 단편(에피토프 인식 부위) 및 에피토프에 결합하는 능력을 포함하는 면역글로불린 분자의 임의의 다른 변형된 형태를 포함한다. 단클론성 항체는 배양 중의 연속적인 세포주에 의해 항체 분자의 생성을 제공하는 임의의 기법, 예컨대 문헌[Kohler, G., et al., Nature 256:495, 1975]에서 기술된 하이브리도마 방법에 의해 얻어질 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법(예컨대, Cabilly의 미국 특허 제4,816,567호 참고)에 의해 제조될 수 있다. 단클론성 항체는 또한 파지 항체 라이브러리로부터 문헌[Clackson, T., et al., Nature 352:624 628, 1991, 및 Marks, J.D., et al., J. Mol. Biol. 222:581 597, 1991]에 기술된 기법을 사용하여 분리될 수 있다. 그러한 항체는 IgG, IgM, IgE, IgA, IgD 및 이것들의 임의의 하위부류를 포함한 임의의 면역글로불린 부류의 것일 수 있다.

인지된 면역글로불린 폴리펩타이드에는 카파 및 람다 경쇄 및 알파, 감마(IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), 델타, 엡실론 및 뮤 중쇄, 또는 다른 종에서의 등가물이 포함된다. 전장 면역글로불린 "경쇄"(약 25 kDa 또는 약 214개 아미노산임)는 NH2 말단에 약 110개 아미노산의 가변 영역 및 COOH 말단에 카파 또는 람다 불변 영역을 포함한다. 전장 면역글로불린 "중쇄"(약 50 kDa 또는 약 446개 아미노산임)는 유사하게 가변 영역(약 116개 아미노산임) 및 앞에서 언급된 중쇄 불변 영역 중 하나, 예컨대, 감마(약 330개 아미노산임) 영역을 포함한다.

기본적인 4-사슬 항체 단위는 2개의 동일한 가벼운(L) 사슬 및 2개의 동일한 무거운(H) 사슬로 구성된 이종사량체 당단백질이다. IgM 항체는 J 사슬로 불리는 추가 폴리펩타이드와 함께 5개의 기본적인 이종사량체 단위로 이루어지고, 따라서 10개의 항원 결합 부위를 함유한다는 점에서 이 계획과 다르다. 분비된 IgA 항체 또한 그것이 중합되어 J 사슬과 함께 5개의 기본적인 4-사슬 단위 중 2개를 포함하는 다가 조립체를 형성할 수 있다는 점에서 기본 구조와 다르다. 각각의 L 사슬은 하나의 공유 이황화 결합에 의해 H 사슬에 연결된 한편, 2개의 H 사슬은 H 사슬 아이소타입에 따라, 하나 이상의 이황화 결합에 의해 하나 이상에 의해 서로 연결된다. 각각의 H 및 L 사슬은 또한 규칙적인 간격의 사슬내 이환화 가교를 가진다. VH 및 VL의 쌍은 함께 단일 항원 결합 부위를 형성한다.

각각의 H 사슬은 N 말단에서, 가변 도메인(VH)과 이어서, 알파, 감마, 및 델타 사슬의 경우 3개의 불변 도메인(CH1, CH2, CH3), 또는 뮤 및 엡실론 사슬의 경우 4개의 CH 도메인(CH1, CH2, CH3, CH4)을 가진다.

각각의 L 사슬은 N 말단에서, 가변 도메인(VL)과 이어서 다른 단부에 불변 도메인(CL)을 가진다. L 사슬과 H 사슬이 쌍을 이룰 때, VL은 VH와 정렬되고 CL은 중쇄(CH1)의 제1 불변 도메인과 정렬된다. 임의의 척추동물 종으로부터의 L 사슬은 그것의 불변 도메인(CL)의 아미노산 서열을 기반으로 카파(κ) 및 람다(λ)로 불리는 두 유형 중 하나에 배정될 수 있다.

중쇄(CH)의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 면역글로불린은 상이한 부류 또는 아이소타입으로 배정될 수 있다. 면역글로불린의 5가지 부류가 있다: 각각 알파(α), 델타(δ), 엡실론(ε), 감마(γ) 및 뮤(μ)로 표시된 중쇄를 갖는 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM. γ 및 α 부류는 다시 CH 서열 및 기능의 미미한 차이를 기반으로 하위부류로 나누어지며, 예를 들어, 인간은 다음 하위부류: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2를 발현한다.

항체의 상이한 부류의 구조 및 특성에 대해서는, 예컨대, 문헌[Basic and Clinical Immunology, 8th Edition, Daniel P. Stites, Abba I. Terr and Tristram G. Parslow (eds); Appleton and Lange, Norwalk, Conn., 1994, page 71 and Chapter 6]을 참고한다.

용어 "가변"은 V 도메인의 특정 분절이 항체 사이에서 서열이 광범위하게 다르다는 사실을 나타낸다. V 도메인은 항원 결합을 매개하며 특정 항체의 그것의 특별한 항원에 대한 특이성을 정의한다. 그러나, 가변성은 가변 도메인의 110개 아미노산 범위에 걸쳐 고르게 분포되지 않는다. 오히려, V 영역은 각각 9-12개 아미노산 길이의 "초가변 영역"으로 불리는 극한 가변성의 짧은 영역에 의해 분리된 프레임워크 영역(FR)으로 불리는 15-30개 아미노산의 상대적으로 불변하는 구간으로 이루어진다. 천연 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 각각은 대부분 베타 시트 구성을 채택하고, n 시트 구조를 연결하는, 일부 경우에는 n 시트 구조의 일부를 형성하는 루프를 형성하는 3개의 초가변 영역에 의해 연결된 4개의 FR을 포함한다. 각 사슬에서 초가변 영역은 FR에 의해 매우 근접하게, 다른 사슬로부터의 초가변 영역과 함께 유지되어 항체의 항원 결합 부위 형성에 기여한다(Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md (1991) 참고). 불변 도메인은 항원에 대한 항체 결합에 직접적으로 관여하지는 않지만, 다양한 이펙터 기능을 나타낸다.

본원에서 사용되는 바, "이펙터 기능"은 항체의 Fc 영역에 기여할 수 있는 그런 생물학적 활성을 지칭한다. 항체 이펙터 기능의 예로는 항체 의존성 세포의 세포독성(ADCC), C1q 결합 및 보체 의존성 세포독성, Fc 수용체 결합, 식세포작용, 세포 표면 수용체의 하향 조절, 및 B 세포 활성화에의 참여를 들 수 있다. 아미노산 치환과 같은 변형은 Fc 함유 폴리펩타이드의 하나 이상의 기능을 변형(예컨대, 향상 또는 감소)시키기 위해 Fc 도메인에 대해 이루어질 수 있다. 그러한 기능으로는, 예를 들어, Fc 수용체 결합, 항체 반감기 조절, ADCC 기능, 단백질 A 결합, 단백질 G 결합, 및 보체 결합을 들 수 있다. Fc 기능을 변형시키는 아미노산 변형으로는, 예를 들어, T250Q/M428L, M252Y/S254T/T256E, H433K/N434F, M428L/N434S, E233P/L234V/L235A/G236△/A327G/A330S/P331S, E333A, S239D/A330L/I332E, P257I/Q311, K326W/E333S, S239D/I332E/G236A, N297Q, K322A, S228P, L235E/E318A/K320A/K322A, L234A/L235A, 및 L234A/L235A/P329G 돌연변이를 들 수 있다. 다른 Fc 변형 및 Fc 기능에 미치는 그것의 효과는 기술분야에 알려져 있다.

본원에서 사용되는 바, 용어 "초가변 영역"은 항원 결합을 담당하는 항체의 아미노산 잔기를 지칭한다. 초가변 영역은 여러 개의 "상보성 결정 영역"(CDR)을 함유한다. 중쇄는 3개의 CDR 서열(CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3)을 포함하고 경쇄는 3개의 CDR 서열(CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3)을 포함한다. CDR을 구성하는 아미노산을 확인하고 넘버링하기 위한 다양한 시스템이 존재한다. 예를 들어, 초가변 영역은 일반적으로 문헌[Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md (1991)]에서 기술된 Kabat 넘버링 시스템에 따라 넘버링될 때 경쇄 가변 도메인의 약 잔기 24-34(L1), 50-56(L2) 및 89-97(L3) 정도에서 CDR을 포함하고, 중쇄 가변 도메인의 약 31-35(H1), 50-65(H2) 및 95-102(H3) 정도에서; 및/또는 문헌[Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)]에서 기술된 Chothia 넘버링 시스템에 따라 넘버링될 때 경쇄 가변 도메인의 약 잔기 24-34(L1), 50-56(L2) 및 89-97(L3)에서, 및 중쇄 가변 도메인의 26-32(H1), 52-56(H2) 및 95-102(H3)에서; 및/또는 문헌[Lefranc, J.P., et al., Nucleic Acids Res 27:209-212; Ruiz, M., et al., Nucleic Acids Res 28:219-221 (2000)]에서 기술된 IMGT 넘버링 시스템에 따라 넘버링될 때 VL의 약 잔기 27-38(L1), 56-65(L2) 및 105-117(L3)에서, 및 VH의 27-38(H1), 56-65(H2), 및 105-117(H3)에서 CDR을 포함한다. 동등한 잔기 위치에 주석이 달리고 항원 수용체 넘버링 및 수용체 분류(ANARCI) 소프트웨어 도구(2016, Bioinformatics 15:298-300)를 사용하여 상이한 분자에 대해 비교될 수 있다. 따라서, 한 가지 넘버링 체계에 따라 본원에 제공된 예시의 가변 도메인(VH 또는 VL) 서열의 CDR의 확인은 상이한 넘버링 치계를 사용하여 결정된 바 동일한 가변 도메인의 CDR을 포함하는 항체를 배제하지 않는다.

본원에서 사용되는 바, "특이적으로 결합한다"는 특정 친화성으로 항원에 결합하지만, 샘플 중의 임의의 다른 분자 또는 구성요소와 유의하게 회합되거나 연관되지 않는 항체 또는 항원 결합 단편을 지칭한다. 친화성은 kon/koff의 비율로서 계산되고 1/M의 단위의 평형 결합 상수(Ka)로서 또는 koff/kon의 비율로서 계산되고 M의 단위의 평형 해리 상수(Kd)로서 정의될 수 있다.

일부 맥락에서, 항체 및 항원 결합 단편은 항원에 대한 친화도 및/또는 결합력을 참조하여 기술될 수 있다. 달리 표시되지 않는 한, 결합력은 항체 또는 그것의 항원 결합 단편의 항원에 대한 총 결합 강도를 지칭하며, 결합 친화도, 항체 또는 항원 결합 단편의 결합가(예컨대, 항체 또는 항원 결합 단편이 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개, 또는 그 이상의 결합 부위를 포함하는지의 여부), 및, 예를 들어, 결합에 영향을 줄 수 있는 또 다른 작용제(예컨대, 항체 또는 항원 결합 단편의 비경합성 억제제)가 존재하는지의 여부를 반영한다.

본 명세서의 각 구체예는 분명하게 달리 명시되지 않는 한 모든 다른 구체예에 준용되어 적용될 것이다. 본 명세서에서 논의된 임의의 구체예는 발명의 임의의 방법, 키트, 시약, 또는 조성물과 관련하여 실행될 수 있고, 그 반대도 마찬가지인 것으로 고려된다. 나아가, 발명의 조성물은 발명의 방법을 달성하기 위해 사용될 수 있다.

II. 개요

본 개시는 보체 시스템의 렉틴 경로의 활성자인 인간 MASP-2에 결합하는 항체 및 그것의 항체 결합 단편을 제공한다. 렉틴, 예컨대 MBL, M-피콜린, H-피콜린, L-피콜린, 콜렉틴-10, 및 콜렉틴-11은 선천적 보체 시스템을 촉발시키는 특이적 인식 분자이다. 보체 시스템에는 또한 더 많은 양의 말단 보체 이펙터 분자의 방출을 초래하는 렉틴 개시된 보체 활성화를 증폭시키는 말단 경로 증폭 루프가 포함된다.

면역 방어에서의 필수적인 역할 외에, 보체 시스템은 많은 임상 상태에서 조직 손상에 기여한다. 그러므로, 이들 부작용을 방지하기 위하여 치료적으로 효과적인 보체 억제제를 개발할 시급한 필요성이 있다. 고전적 및 대체 경로를 온전하게 남기면서 보체 렉틴 경로를 억제하는 것이 가능하다는 인식과 함께 보체의 면역 방어 능력을 완전하게 정지시키지 않으면서 특정 병리학을 유발하는 보체 활성화 시스템만을 특이적으로 억제하는 것이 고도로 바람직할 것이라는 인식이 이어진다. 예를 들어, 보체 활성화가 지배적으로 렉틴 경로에 의해 매개되는 질환 상태에서, 이 경로만을 특이적으로 억제하는 것이 유리할 것이다. 이것은 면역 복합체 프로세싱을 관리하고 감염에 대해 숙주 방어를 보조하기 위하여 보체 고전적 경로는 온전하게 남겨둘 것이다.

렉틴 경로를 특이적으로 억제하기 위한 치료제의 개발에서 가능한 표적인 보체 시스템의 한 구성요소는 MASP-2이다. 렉틴 의존적 보체 시스템의 알려져 있는 모든 단백질 구성요소(예컨대 MBL, H 피콜린, M 피콜린, L 피콜린, 콜렉틴, MASP-1, MASP-2, C4 및 C2) 중에서, MASP-1 및 MASP-2 둘만이 렉틴 경로에 고유하고 시스템이 기능하기 위해 필요하다. 렉틴(예컨대 MBL, H 피콜린, M 피콜린, L 피콜린, 콜렉틴-10, 및 콜렉틴-11)도 또한 렉틴 경로의 고유한 구성요소이다. 그러나, 렉틴 구성요소 중 어느 하나의 손실도 렉틴 중복성으로 인해 시스템의 활성화를 반드시 억제하지는 못할 것이다. 렉틴 의존성 보체 활성화 시스템의 억제를 보장하기 위해 모든 렉틴을 억제하는 것이 필요할 것이다. 나아가, MBL 및 피콜린은 또한 보체와 무관한 옵소닌성 활성을 가지는 것으로 알려져 있기 때문에, 렉틴 경로 기능의 억제는 감염에 대한 이런 유익한 숙주 방어 메커니즘의 손실을 초래할 것이다. 대조적으로, 보체와 무관한 옵소닌성 활성은 MASP-2가 억제 표적일 때 온전하게 유지된다. 렉틴 경로를 억제하기 위한 치료제로서 MASP-2의 추가 이익은 MASP-2의 혈장 농도가 임의의 보체 단백질 중 가장 낮은 것이라는 것이다(약 500 ng/ml); 그러므로, MASP-2의 고친화성 억제제의 그에 따라 낮은 농도가 완전한 억제를 얻기에 충분할 수 있다(Moller Kristensen, M., et al., J. Immunol Methods 282:159 167, 2003). 이것은 혈장 농도가 약 10,000 ng/mL인 MASP-1과는 매우 대조적이고, 그러므로 완전한 억제를 얻기 위해 MASP-1의 고친화성 억제제의 실질적으로 더 높은 농도가 필요할 것으로 예상된다.

III. 항체 및 항원 결합 단편

본원에는 MASP-2에 특이적으로 결합하는 항체 및 그것의 항원 결합 단편이 제공된다. 일부 구체예에서, 항체 및 그것의 항원 결합 단편은 분리된 단클론성 항체 또는 그것의 항원 결합 단편이다. 일부 구체예에서, 항체 및 그것의 항원 결합 단편은 렉틴 경로 보체 활성화를 억제한다. 본원에서 기술된 항체 및 항원 결합 단편은 인간 항체, 인간화된 항체, 키메릭 항체, 또는 쥐과 항체, 또는 전술한 것 중 임의의 것의 항원 결합 단편일 수 있다. 추가적으로, 항체 및 그것의 항원 결합 단편은 단일 사슬 항체, ScFv, Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, 힌지 영역이 없는 일가 항체, 또는 전체 항체일 수 있다. 추가로, 항체 및 그것의 항원 결합 단편은 일가, 이가, 또는 다가일 수 있다.

일부 구체예에서, 본원에서 기술된 항체 및 항원 결합 단편은 면역글로불린 불변 영역을 포함한다. 항체 및 그것의 항원 결합 단편은 IgG 면역글로불린 또는 그것의 단편일 수 있다. 일부 구체예에서, IgG 면역글로불린은 IgG1, IgG2, 또는 IgG4 면역글로불린이다.

일부 구체예에서, 본원에서 기술된 항체 및 그것의 항원 결합 단편은 인간 MASP-2의 세린 프로테아제 도메인 내에 위치한 에피토프에 특이적으로 결합한다. 일부 구체예에서, 에피토프는 인간 MASP-2의 아미노산 ₄₉₆DIRMGTLKRLSPHYTQAW₅₁₃₍서열 번호:6) 내에 위치한다. 일부 구체예에서, 항체 및 그것의 항원 결합 단편은 MASP-2에의 결합에 대해 C4 결합과 경합한다.

한 측면으로, 발명은: (a) 서열 NXXMH를 가지며, 여기서 위치 2의 X는 H 또는 Y이고 위치 3의 X는 H 또는 W인 HC-CDR1; 서열 번호:63(DIDXSDSEXXYXXKFKD)으로서 제시되고 여기서 위치 4의 X는 P 또는 A이며; 위치 9의 X는 T 또는 I이고, 위치 10의 X는 H 또는 Y이며, 위치 12의 X는 I 또는 N이고; 위치 13의 X는 E 또는 Q인 HC-CDR2; 및 서열 번호:18(GDITTTLRYFDV)로서 제시된 HC-CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 (b) 서열 번호:64(SASSSVXYMY)로서 제시되고 여기서 위치 7의 X는 R 또는 S인 LC-CDR1; 서열 번호:34(DTSNLAS)로서 제시된 LC-CDR2 및 서열 번호:36(QQWSSYPLT)으로서 제시된 LC-CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, MASP-2에 결합하는 분리된 항체, 또는 그것의 항원 결합 단편을 제공한다. 한 구체예에서, (a)에 따르는 중쇄 가변 영역의 HC-CDR1은 서열 번호:14(NYWMH)를 포함한다.

일부 구체예에서, 중쇄 가변 영역의 HC-CDR1은 서열 번호: 14(NYWMH)를 포함한다. 일부 구체예에서, 중쇄 가변 영역의 HC-CDR1은 서열 번호: 56(NYHMH)을 포함한다. 일부 구체예에서, 중쇄 가변 영역의 HC-CDR1은 서열 번호: 57(NHHMH)을 포함한다.

일부 구체예에서, 중쇄 가변 영역의 HC-CDR2는 서열 번호:16(DIDPSDSETHYIEKFKD)을 포함한다. 일부 구체예에서, 중쇄 가변 영역의 HC-CDR2는 서열 번호:22(DIDPSDSEIYYNQKFKD)를 포함한다. 일부 구체예에서, 중쇄 가변 영역의 HC-CDR2는 서열 번호:53(DIDASDSETHYIEKFKD)을 포함한다.

일부 구체예에서, 경쇄 가변 영역의 LC-CDR1은 서열 번호:32(SASSSVRYMY)를 포함한다. 일부 구체예에서, 경쇄 가변 영역의 LC-CDR1은 서열 번호:39(SASSSVSYMY)를 포함한다.

일부 구체예에서, HC-CDR1은 서열 번호:14; 서열 번호:56 또는 서열 번호:57을 포함하고, HC-CDR2는 서열 번호: 16 또는 서열 번호:53을 포함하며, HC-CDR3은 서열 번호:18을 포함하고 LC-CDR1은 서열 번호:32를 포함하며 LC-CDR2는 서열 번호:34를 포함하고 LC-CDR3은 서열 번호:36을 포함한다. 일부 구체예에서, HC-CDR1은 서열 번호:14를 포함하고; HC-CDR2는 서열 번호:16 또는 서열 번호:53을 포함하며 HC-CDR3은 서열 번호:18을 포함하고 LC-CDR1은 서열 번호:32를 포함하며 LC-CDR2는 서열 번호:34를 포함하고 LC-CDR3은 서열 번호:36을 포함한다. 일부 구체예에서, HC-CDR1은 서열 번호:56을 포함하고; HC-CDR2는 서열 번호:16 또는 서열 번호:53을 포함하며 HC-CDR3은 서열 번호:18을 포함하고 LC-CDR1은 서열 번호:32를 포함하며 LC-CDR2는 서열 번호:34를 포함하고 LC-CDR3은 서열 번호:36을 포함한다. 일부 구체예에서, HC-CDR1은 서열 번호:57을 포함하고; HC-CDR2는 서열 번호:16 또는 서열 번호:53을 포함하며 HC-CDR3은 서열 번호:18을 포함하고 LC-CDR1은 서열 번호:32를 포함하며 LC-CDR2는 서열 번호:34를 포함하고 LC-CDR3은 서열 번호:36을 포함한다.

일부 구체예에서, HC-CDR1은 서열 번호:14(NYWM)를 포함하고; HC-CDR2는서열 번호:16(DIDPSDSETHYIEKFKD)를 포함하며, HC-CDR3은 서열 번호:18(GDITTTLRYFDV)을 포함하고 LC-CDR1은 서열 번호:32(SASSSVRYMY)를 포함하며, LC-CDR2는 서열 번호:34(DTSNLAS)를 포함하고, LC-CDR3은 서열 번호:36(QQWSSYPLT)을 포함한다. 일부 구체예에서, HC-CDR1은 서열 번호:14(NYWM)를 포함하고; HC-CDR2는 서열 번호:53(DIDASDSETHYIEKFKD)을 포함하며, HC-CDR3은 서열 번호:18(GDITTTLRYFDV)을 포함하고 LC-CDR1은 서열 번호:32(SASSSVRYMY)를 포함하며, LC-CDR2는 서열 번호:34(DTSNLAS)를 포함하고, LC-CDR3은 서열 번호:36(QQWSSYPLT)을 포함한다. 일부 구체예에서, HC-CDR1은 서열 번호:56(NYHMH)을 포함하고; HC-CDR2는 서열 번호:53(DIDASDSETHYIEKFKD)을 포함하며, HC-CDR3은 서열 번호:18(GDITTTLRYFDV)을 포함하고 LC-CDR1은 서열 번호:32(SASSSVRYMY)를 포함하며, LC-CDR2는 서열 번호:34(DTSNLAS)를 포함하고, LC-CDR3은 서열 번호:36(QQWSSYPLT)을 포함한다. 일부 구체예에서, HC-CDR1은 서열 번호:57(NHHMH)을 포함하고; HC-CDR2는 서열 번호:53((DIDASDSETHYIEKFKD)을 포함하며 HC-CDR3은 서열 번호:18(GDITTTLRYFDV)을 포함하고 LC-CDR1은 서열 번호:32(SASSSVRYMY)를 포함하며 LC-CDR2는 서열 번호:34(DTSNLAS)를 포함하고 LC-CDR3은 서열 번호:36(QQWSSYPLT)을 포함한다. 일부 구체예에서, HC-CDR1은 서열 번호:14(NYWM)를 포함하고; HC-CDR2는 서열 번호:22(DIDPSDSEIYYNQKFKD)를 포함하며 HC-CDR3은 서열 번호:18(GDITTTLRYFDV)을 포함하고 LC-CDR1은 서열 번호:39(SASSSVSYMY)를 포함하며 LC-CDR2는 서열 번호:34(DTSNLAS)를 포함하고 LC-CDR3은 서열 번호:36(QQWSSYPLT)을 포함한다.

일부 구체예에서, HC-CDR1은 서열 번호:14를 포함하고; HC-CDR2는 서열 번호:22를 포함하며 HC-CDR3은 서열 번호:18을 포함하고 LC-CDR1은 서열 번호:39를 포함하며 LC-CDR2는 서열 번호:34를 포함하고 LC-CDR3은 서열 번호:36을 포함한다.

일부 구체예에서, HC-CDR1은 서열 번호:25를 포함하고, HC-CDR2는 서열 번호:27을 포함하며 HC-CDR3은 서열 번호:29를 포함하고 LC-CDR1은 서열 번호:41을 포함하며, LC-CDR2는 서열 번호:43을 포함하고 LC-CDR3은 서열 번호:45를 포함한다.

일부 구체예에서, 중쇄 가변 영역은 서열 번호:7, 서열 번호:46, 서열 번호:48, 서열 번호:49 또는 서열 번호:50을 포함한다. 추가의 구체예에서, 중쇄 가변 영역은 서열 번호:7, 서열 번호:46, 서열 번호:48, 서열 번호:49 또는 서열 번호:50에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일하다. 일부 구체예에서, 경쇄 가변 영역은 서열 번호:10 또는 서열 번호:47을 포함한다. 추가의 구체예에서, 경쇄 가변 영역은 서열 번호:10 또는 서열 번호:47에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일하다. 일부 구체예에서, 중쇄 가변 영역은 서열 번호:7, 서열 번호:46, 서열 번호:48, 서열 번호:49 또는 서열 번호:50을 포함하고 경쇄 가변 영역은 서열 번호:10 또는 서열 번호:47을 포함한다.

일부 구체예에서, 중쇄 가변 영역은 서열 번호:46, 서열 번호:48, 서열 번호:49 또는 서열 번호:50을 포함한다. 추가의 구체예에서, 중쇄 가변 영역은 서열 번호:46, 서열 번호:48, 서열 번호:49 또는 서열 번호:50에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일하다. 일부 구체예에서, 경쇄 가변 영역은 서열 번호:47을 포함한다. 추가의 구체예에서, 경쇄 가변 영역은 서열 번호:47에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일하다. 일부 구체예에서, 중쇄 가변 영역은 서열 번호:46, 서열 번호:48, 서열 번호:49 또는 서열 번호:50을 포함하고 경쇄 가변 영역은 서열 번호:47을 포함한다.

일부 구체예에서, 중쇄 가변 영역은 서열 번호:8을 포함한다. 추가의 구체예에서, 중쇄 가변 영역은 서열 번호:8에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일하다. 일부 구체예에서, 경쇄 가변 영역은 서열 번호:11을 포함한다. 추가의 구체예에서, 경쇄 가변 영역은 서열 번호:11에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일하다. 일부 구체예에서, 중쇄 가변 영역은 서열 번호:8을 포함하고 경쇄 가변 영역은 서열 번호:11을 포함한다.

일부 구체예에서, 중쇄 가변 영역은 서열 번호:9를 포함한다. 추가의 구체예에서, 중쇄 가변 영역은 서열 번호:9에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일하다. 일부 구체예에서, 경쇄 가변 영역은 서열 번호:12를 포함한다. 추가의 구체예에서, 경쇄 가변 영역은 서열 번호:12에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일하다. 일부 구체예에서, 중쇄 가변 영역은 서열 번호:9를 포함하고 경쇄 가변 영역은 서열 번호:12를 포함한다.

특정 구체예에서, 항체 또는 그것의 항원 결합 단편은 6개의 CDR 각각에 0, 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환을 포함하며, 이들 치환 중 하나 이상은 선택적으로 보존성 치환이고/이거나 생식선 암호화된 아미노산에 대한 치환이다.

본원에서 기술된 특정 항-MASP-2 항체에 대한 가변 영역 및 CDR의 서열의 요약을 아래의 표 1A, 1B, 및 1C에 제시한다("SIN"은 서열 번호를 나타냄.)

특정 구체예에서, 본원에서 기술된 항체 및 항원 결합 단편은 Fc 영역에 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 예를 들어, Fc 영역은 안정성 또는 이펙터 기능을 향상시키는 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, Fc 영역은 S228P 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구체예에서, Fc 영역은 낮은 pH에서 FcRn 상호작용을 촉진하는 하나 이상의 돌연변이를 포함한다.

일부 구체예에서, 본원에서 기술된 항체 및 항원 결합 단편은 인간 MASP-2의 세린 프로테아제 도메인에 0.2 nM 미만, 0.3 nM 미만, 0.4 nM 미만, 0.5 nM 미만, 0.6 nM 미만, 0.7 nM 미만, 0.8 nM 미만, 0.9 nM 미만, 1.0 nM 미만, 1.2 nM 미만, 1.4 nM 미만, 1.6 nM 미만, 1.8 nM 미만, 2.0 nM 미만, 2.5 nM 미만, 3.0 nM 미만, 3.5 nM 미만, 4.0 nM 미만, 4.5 nM 미만, 5.0 nM 미만, 5.5 nM 미만, 6.0 nM 미만, 6.5 nM 미만, 7.0 nM 미만, 7.5 nM 미만, 8.0 nM 미만, 8.5 nM 미만, 9.0 nM 미만, 9.5 nM 미만, 10.0 nM 미만, 12 nM 미만, 14 nM 미만, 16 nM 미만, 18 nM 미만, 20 nM 미만, 22 nM 미만, 24 nM 미만, 26 nM 미만, 28 nM 미만, 또는 30 nM 미만의 친화도로 결합한다.

일부 구체예에서, 본원에서 기술된 항체 및 항원 결합 단편은 보체 활성화의 렉틴 경로를 억제한다. 일부 구체예에서, 항체 및 항원 결합 단편은 포유류 혈액에서 렉틴 경로를 억제한다. 일부 구체예에서, 렉틴 경로 억제는 표적 세포 상에서 보체 구성요소의 침착의 감소를 포함한다. 일부 구체예에서, 렉틴 경로 억제는 C3b 침착, C4 침착, 또는 MAC 침착의 감소를 포함한다. 일부 구체예에서, 렉틴 경로 억제는 렉틴 경로 특이적 검정 조건 하에서 보체 구성요소의 침착의 감소를 포함한다. 일부 구체예에서, 본원에서 기술된 항체 및 항원 결합 단편은 포유류 혈액에서 보체 활성화의 렉틴 경로를 억제하지만 포유류 혈액에서 보체 활성화의 고전적 경로는 억제하지 않는다.

IV. 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 및 숙주 세포

또 다른 측면으로, 본 개시는 본원에서 개시된 항체 또는 그것의 항원 결합 단편, 또는 그것들의 일부(예컨대, CDR, VH, VL, 중쇄, 또는 경쇄) 중 임의의 것을 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 특정 구체예에서, 폴리뉴클레오타이드는 숙주 세포에서의 발현에 대해 코돈 최적화된다. 코딩 서열이 알려지거나 확인된 후에는, 공지된 기법 또는 도구, 예컨대 GenScript® OptimumGene^TM 도구 또는 ThermoFisher Scientific® GeneArt GeneOptimizer^TM을 사용하여 코돈 최적화가 수행될 수 있다. 코돈 최적화된 서열에는 숙주 세포에서의 발현에 대해 최적화된 하나 이상의 코돈을 갖는 부분적으로 코돈 최적화된 서열, 및 완전히 코돈 최적화된 서열이 포함된다. 또한 항체 및 그것의 항원 결합 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 상이한 뉴클레오타이드 서열을 가질 수 있지만 유전자 코드의 축퇴성, 스플라이싱, 등으로 인해 여전히 동일한 단백질을 암호화하는 것이 인지될 것이다.

일부 구체예에서, 폴리뉴클레오타이드는 서열 번호:69-79 중 임의의 하나 이상에 대해 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.

특정 구체예에서, 항체 또는 그것의 항원 결합 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 다른 서열 및/또는 특징을 포함하는 폴리뉴클레오타이드에 포함될 수 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오타이드에는 암호화 단백질의 제어 또는 발현에 유용한 하나 이상의 서열, 예컨대 프로모터 서열(들), 폴리아데닐화 서열(들), 신호 펩타이드를 암호화하는 서열(들), 등이 포함될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 데옥시리보핵산(DNA) 또는 리보핵산(RNA)을 포함할 수 있다.

또한 본원에 개시된 항체 또는 그것의 항원 결합 단편 중 임의의 것을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하거나 함유하는 벡터가 제공된다. 바이러스 벡터 및 플라스미드 벡터를 포함한 임의의 적절한 벡터가 사용될 수 있다. 특정 구체예에서, 벡터는 함께 완전한 항체 또는 그것의 항원 결합 단편을 구성하는 항체 중쇄 또는 그것의 항원 결합 단편 및 그것의 항체 경쇄 항원 결합 단편 모두를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 그것의 항체 중쇄 항원 결합 단편 및 그것의 항체 경쇄 항원 결합 단편을 암호화하는 서열은 단일 오픈 리딩 프레임 내에 함유될 수 있고, 그 경우에 그것은 프로테아제 절단 부위를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및/또는 자가 절단 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 의해 선택적으로 분리될 수 있다. 대안적으로, 그것의 항체 중쇄 항원 결합 단편 및 그것의 항체 경쇄 항원 결합 단편을 암호화하는 서열은 단일 벡터 상의 별도의 오픈 리딩 프레임 내에 함유될 수 있다. 다른 구체예에서, 그것의 항체 중쇄 항원 결합 단편 및 그것의 항체 경쇄 항원 결합 단편을 암호화하는 서열은 2개의 상이한 벡터 상에 존재하여서, 제1 벡터가 항체 중쇄 또는 그것의 단편을 암호화하고 제2 벡터가 항체 경쇄 또는 그것의 단편을 암호화하게 된다.

추가 측면으로, 본 개시는 또한 본원에서 개시된 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 그러한 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터가 도입될 수 있는 임의의 적절한 세포가 사용될 수 있다. 그러한 세포의 예로는 효모 세포, 동물 세포, 곤충 세포, 포유류 세포, 및 식물 세포를 포함한 진핵 세포; 및 이. 콜라이(E. coli)와 같은 박테리아 세포를 포함한 원핵 세포를 들 수 있다. 일부 구체예에서, 숙주 세포는 포유류 세포이다. 일부 구체예에서, 숙주 세포는 불멸화된 포유류 세포주이다. 폴리뉴클레오타이드 및 벡터의 제조 및 발현에 사용하기에 적절한 세포는 기술분야에 알려져 있다.

일부 구체예에서, 세포는 본원에서 개시된 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터로 형질감염될 수 있다. 용어 "형질감염"은 핵산 분자를 세포에 도입하는 것에 대해 기술분야에 숙련된 사람에게 알려져 있는 임의의 방법을 포함한다. 그러한 방법에는, 예를 들어, 전기천공, 리포펙션, 나노입자 기반 형질감염, 바이러스 기반 형질감염, 등이 포함된다. 숙주 세포는 안정적으로 또는 일시적으로 형질감염될 수 있다.

일부 구체예에서, 숙주 세포는 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터에 의해 암호화된 항체 또는 그것의 항원 결합 단편을 발현한다. 그러한 발현에는 신호 서열의 제거, 글리코실화, 및 다른 그러한 변형과 같은 번역 후 변형이 포함될 수 있다. 관련된 측면으로, 본 개시는 제공된 항체 및 그것의 항원 결합 단편을 제조하는 방법을 제공하며, 그 방법은 항체 또는 그것의 항원 결합 단편의 발현을 허용하는 조건 하에서 충분한 시간 동안 숙주 세포를 배양하는 단계 및 항체 또는 그것의 항원 결합 단편을 분리하는 단계를 포함한다. 재조합에 의해 제조된 단백질을 분리 및 정제하기에 유용한 방법은, 예를 들어, 단백질을 배양 배지로 분비하는 적합한 숙주 세포로부터 상층액을 얻는 단계, 배지를 농축하는 단계, 및 적합한 정제 매트릭스 또는 일련의 매트릭스를 통해 농축물을 통과시킴으로써 단백질을 정제하는 단계를 포함한다. 단백질의 정제 방법은 기술분야에 잘 알려져 있다.

V. 제약학적 조성물

본원에는 또한 본원에 개시된 항체 또는 그것의 항원 결합 단편, 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 또는 숙주 세포 중 임의의 하나 이상으로부터 선택된 치료제를 단일하게 또는 임의의 조합으로 포함하고, 또한 다른 선택된 치료제를 포함할 수 있는 조성물이 제공된다. 그러한 조성물은 하나 이상의 제약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제, 또는 희석제을 추가로 포함할 수 있다.

제약학적으로 허용 가능한 담체는 무독성이고, 생체부합성이며 치료제(및 그것과 조합된 임의의 다른 치료제)의 생물학적 활성에 유해하게 영향을 미치지 않도록 선택된다. 펩타이드를 위한 제약학적으로 허용 가능한 담체의 예는 Yamada의 미국 특허 제5,211,657로에서 기술된다. 본원에서 기술된 치료제는 경구, 비경구 또는 외과적 투여를 허용하는 정제, 캡슐, 과립, 연고, 용액, 데포짓, 흡입제 및 주사제와 같은 고체, 반고체, 젤, 액체 또는 기체 형태의 제제로 제형화될 수 있다. 코팅 의료 장치 등에 의한 조성물의 국소 투여가 또한 고려된다.

주사제, 주입 또는 세척 및 국소 전달을 통한 비경구 전달에 적합한 담체에는 증류수, 생리 인산염 완충 식염수, 일반 또는 락테이트 첨가 링거액, 덱스트로스액, 행크 용액, 또는 프로판다이올이 포함된다. 더불어, 멸균된, 고정 오일이 용매 또는 현탁 매질로서 사용될 수 있다. 이 목적을 위해, 합성 모노- 또는 다이글리세라이드를 포함한 임의의 생체부합성 오일이 사용될 수 있다. 더불어, 올레산과 같은 지방 오일이 주사제의 제조에 사용될 수 있다. 담체 및 작용제는 액체, 현탁액, 중합 가능한 또는 중합 가능하지 않은 젤, 페이스트 또는 고약으로서 합성될 수 있다.

담체는 또한 작용제(들)의 전달을 지속(즉, 연장, 지연 또는 조절)시키기 위해 또는 치료제(들)의 전달, 흡수, 안정성 또는 약동학을 향상시키기 위해 전달 비히클을 포함할 수 있다. 그러한 전달 비히클에는, 비제한적인 예로서, 단백질, 리포솜, 탄수화물, 합성 유기 화합물, 무기 화합물, 중합체 또는 공중합체 하이드로겔 및 중합체 미셸로 구성된 마이크로입자, 마이크로스피어, 나노스피어 또는 나노입자가 포함될 수 있다. 적합한 하이드로겔 및 미셸 전달 시스템에는 WO 2004/009664 A2에서 개시된 PEO:PHB:PEO 공중합체 및 공중합체/사이클로덱스트린 복합체 및 미국 특허 출원 공개 공보 2002/0019369 A1에서 개시된 PEO 및 PEO/사이클로덱스트린 복합체가 포함된다. 그러한 하이드로겔은 의도된 작용 부위에 국소적으로, 또는 지속적인 방출 데포를 형성하기 위하여 피하로 또는 근육내로 주사될 수 있다.

본 발명의 조성물은 제한 없이, 국소적, 경피, 혀밑, 협측, 피하, 근육내, 정맥내, 동맥내 전달 또는 흡입제로서의 전달을 포함한 임의의 적절한 방법에 의한 전달을 위해 제형화될 수 있다.

본 발명의 조성물에는 또한 생체부합성 부형제, 예컨대 분산제 또는 습윤제, 현탁제, 희석제, 완충제, 침투 향상제, 유화제, 결합제, 증점제, 향미제(경구 투여용)가 포함될 수 있다.

본 발명의 특정 구체예에 따르는 제약학적 조성물은 그 안에 함유된 활성 성분이 환자에게 조성물의 투여시 생체에서 이용 가능하게 되는 것을 허용하기 위해 제형화된다. 대상체에게 투여될 조성물은 하나 이상의 투여 단위의 형태를 취할 수 있고, 본원에서 기술된 치료제의 용기는 복수의 투여 단위를 포함할 수 있다. 그러한 투여 형태를 제조하는 실제 방법이 이 기술분야에 숙련된 사람들이게 알려져 있거나, 또는 드러날 것이다; 예를 들어, 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition (Philadelphia College of Pharmacy and Science, 2000)]을 참고한다. 투여될 조성물은, 어떠한 경우에도, 본원의 교시에 따라 관심 있는 질환 또는 병태의 치료를 위해 유효량의 본 개시의 치료제 또는 조성물을 함유할 것이다.

조성물은 고체 또는 액체의 형태일 수 있다. 일부 구체예에서, 담체(들)는 미립자여서, 조성물은, 예를 들어, 정제 또는 분말 형태이다. 담체(들)는 액체일 수 있고, 조성물은, 예를 들어, 구강 오일, 주사 가능한 액체 또는 예를 들어 흡입 투여에 사용할 수 있는 에어로졸이다. 경구 투여를 위해 의도될 때, 제약학적 조성물은 바람직하게는 고체 또는 액체 형태이며, 반고체, 반액체, 현탁액 및 젤 형태는 본원에서 고체 또는 액체로서 간주되는 형태 내에 포함된다.

경구 투여용 고체 조성물로서, 제약학적 조성물은 분말, 과립, 압축 정제, 알약, 캡슐, 츄잉 검, 웨이퍼 등으로 제형화될 수 있다. 그러한 고체 조성물은 전형적으로 수크로스, 옥수수 전분, 또는 셀룰로스와 같은 하나 이상의 비활성 충전제 또는 희석제를 함유할 것이다. 더불어, 다음 중 하나 이상이 존재할 수 있다: 카르복시메틸셀룰로스, 에틸 셀룰로스, 미정질 셀룰로스, 트라가칸스 검 또는 젤라틴과 같은 결합제; 전분, 락토스 또는 덱스트린과 같은 부형제, 알긴산, 알긴산 나트륨, 프리모겔, 옥수수 전분 등과 같은 붕해제; 스테아르산 마그네슘 또는 스테로텍스와 같은 윤활제; 콜로이드성 이사화 규소와 같은 활택제; 수크로스 또는 사카린과 같은 감미제; 페퍼민트, 메틸 살리실레이트 또는 오렌지 향과 같은 향미제; 및 착색제. 조성물이 캡슐 형태, 예를 들어, 젤라틴 캡슐에 있을 때, 그것은 위의 유형의 물질 외에, 폴리에틸렌 글리콜 또는 오일과 같은 액체 담체를 함유할 수 있다.

조성물은 액체, 예를 들어, 엘릭시르, 시럽, 용액, 에멀젼 또는 현탁액의 형태일 수 있다. 액체는 두 가지 예로서 경구 투여용 또는 주사에 의한 전달용일 수 있다. 경구 투여를 위해 의도될 때, 바람직한 조성물은 본 발명의 화합물 외에, 감미제, 보존제, 염료/착색제 및 향 향상제 중 하나 이상을 함유한다. 주사에 의해 투여되도록 의도된 조성물에는, 계면활성제, 보존제, 습윤제, 분산제, 현탁제, 완충제, 안정화제 및 등장성 작용제 중 하나 이상이 포함될 수 있다.

액체 제약학적 조성물은, 그것이 용액, 현탁액 또는 기타 다른 형태의 여부에 관계없이, 다음 부형제 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 주사용 물, 식염수 용액, 바람직하게는 생리 식염수, 링거액, 등장성 염화 나트륨과 같은 멸균 희석제, 용매 또는 현탁 매질로서 작용할 수 있는 합성 모노 또는 다이글리세라이드, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 다른 용매와 같은 고정 오일; 벤질 알코올 또는 메틸 파라벤과 같은 항박테리아제; 아스코르브산 또는 중아황산 나트륨과 같은 항산화제; 에틸렌다이아민테트라아세트산과 같은 킬레이트화제; 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트와 같은 완충제 및 염화 나트륨 또는 덱스트로스와 같은 긴장성 조정제. 비경구 제제는 유리 또는 플라스틱으로 만들어진 앰풀, 일회용 주사기 또는 다중 용량 바이알에 동봉될 수 있다. 생리 식염수가 바람직한 부형제이다. 주사 가능한 제약학적 조성물은 바람직하게는 멸균된다.

비경구 또는 경구 투여용으로 의도된 액체 조성물은 적합한 투여량이 얻어지도록 본원에서 기술된 치료제의 일정량을 함유하여야 한다. 용어 "비경구"에는 피하, 정맥내, 근육내, 흉골내 또는 동맥내 주사 또는 주입이 포함된다. 전형적으로, 치료제는 조성물의 적어도 0.01%이다. 경구 투여를 위해 의도될 때, 이 양은 조성물의 중량의 약 0.1% 내지 약 70%가 되도록 달라질 수 있다. 특정 경구용 제약학적 조성물은 약 4% 내지 약 75%의 치료제를 함유한다.

조성물은 국소 투여를 위해 의도될 수 있고, 그 경우에 담체는 용액, 에멀젼, 연고 또는 젤 베이스를 적합하게 포함할 수 있다. 베이스는, 예를 들어, 다음 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 페트롤라툼, 라놀린, 폴리에틸렌 글리콜, 밀랍, 미네랄 오일, 물과 알코올과 같은 희석제, 및 유화제 및 안정화제. 증점제가 국소 투여용 조성물에 존재할 수 있다. 만약 경피 투여용으로 의도된다면, 조성물에는 경피 패치 또는 이온영동 장치가 포함될 수 있다. 제약학적 조성물은, 예를 들어, 직장에서 용융되어 약물을 방출하는 좌약의 형태로, 직장 투여용으로 의도될 수 있다. 직장 투여용 조성물은 적합한 비자극 부형제로서 오일 함유 베이스를 함유할 수 있다. 그러한 베이스로는 제한 없이, 라놀린, 코코아 버터 및 폴리에틸렌 글리콜을 들 수 있다.

조성물에는 고체 또는 액체 투여 단위의 물리적 형태를 변형시키는 다양한 물질이 포함될 수 있다. 예를 들어, 조성물에는 활성 성분 주위에 코팅 쉘을 형성하는 물질이 포함될 수 있다. 코팅 쉘을 형성하는 물질은 전형적으로 비활성이고, 예를 들어, 당, 쉘락, 및 기타 장용 코팅제로부터 선택될 수 있다. 대안적으로, 활성 성분은 젤라틴 캡슐에 담길 수 있다. 고체 또는 액체 형태의 조성물에는 개시의 치료제(들)에 결합하고 그로써 화합물의 전달을 보조하는 작용제가 포함될 수 있다. 이런 능력으로 작용할 수 있는 적합한 작용제에는 하나 이상의 단백질 또는 리포솜이 포함된다.

조성물은 에어로졸로서 투여될 수 있는 투여 단위로 본질적으로 이루어질 수 있다. 에어로졸이란 단어는 콜로이드 성질 범위의 시스템으로부터 가압 패키지로 이루어지는 시스템에 이르기까지 다양한 시스템을 나타내기 위해 사용된다. 전달은 액화된 또는 압축된 가스에 의해 또는 활성 성분을 분배하는 적합한 펌프 시스템에 의해 이루어질 수 있다. 에어로졸은 활성 성분(들)을 전달하기 위하여 단일 상, 이중상, 또는 삼중상 시스템으로 전달될 수 있다. 에어로졸의 전달에는 필수 용기, 활성제, 밸브, 하위용기, 등이 포함되며, 이들은 함께 키트를 형성한다. 기술분야에 통상적인 지식을 가진 사람은 불필요한 실험 없이 바람직한 에어로졸을 결정할 수 있다.

본 개시의 조성물은 또한 본원에서 기술된 것과 같이 폴리뉴클레오타이드용 담체 분자(예컨대, 지질 나노입자, 나노규모 전달 플랫폼, 등)를 포함하는 것이 이해될 것이다.

제약학적 조성물은 제약 기술분야에 잘 알려져 있는 방법론에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 주사에 의해 투여되도록 의도된 조성물은 본원에서 기술된 치료제를 포함하는 조성물 및 선택적으로 염, 완충제 및/또는 안정화제 중 하나 이상과, 용액을 형성하기 위하여 멸균되고 증류된 물을 조합함으로써 제조될 수 있다. 균질한 용액 또는 현탁액의 형성을 용이하게 하기 위하여 계면활성제가 첨가될 수 있다. 계면활성제는 수성 전달 시스템에 용해 또는 균질한 현탁을 용이하게 하기 위하여 조성물과 비공유적으로 상호작용하는 화합물이다.

VI. 방법 및 용도

추가로 본원에는 포유류 대상체에서 보체의 렉틴 경로를 활성화하는 데 본 개시의 항체 또는 항원 결합 단편, 핵산, 벡터, 세포, 또는 조성물을 사용하는 방법이 제공된다. 일부 구체예에서, 방법은 필요로 하는 포유류 대상체에게 포유류에서 보체 활성화의 렉틴 경로를 억제하기에 충분한 양의 본 개시의 항체 또는 항원 결합 단편, 핵산, 벡터, 세포, 또는 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 방법은 개시의 화합물을 대상체에게 투여하기 전에, 대상체가 렉틴 경로 질환 또는 장애에 영향을 받는 것을 결정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 포유류 대상체는 인간이다.

특정 구체예에서, 본 개시의 항체 또는 항원 결합 단편, 핵산, 벡터, 세포, 또는 조성물은 렉틴 경로 질환 또는 장애를 치료하는 방법에 사용하기 위해 제공된다. 특정 구체예에서, 본 개시의 항체 및 항원 결합 단편, 핵산, 벡터, 세포, 또는 조성물은 렉틴 경로 질환 또는 장애의 치료를 위한 의약을 제조 또는 준비하는 방법에 사용하기 위해 제공된다.

미국 특허 제7,919,094호; 미국 특허 제8,840,893호; 미국 특허 제8,652,477호; 미국 특허 제8,951,522호, 미국 특허 제9,011,860호, 미국 특허 제9,475,885호, 미국 특허 제9,644,035호, 미국 특허 출원 공개 번호 US2013/0344073, US2013/0266560, US2015/0166675, US2017/0137537, US2017/0166660, US2017/0189525, US2017/0267781, US2017/0283508, US2017/0253667, US2018/0105604, WO2018/045054, WO2018/071701, WO2019/036460, WO2019/246,367, WO2021/178902 및 공동 계류 중인 미국 특허 출원 일련 번호 17/103,672(이들 각각은 본 출원의 양수인인 오메로스 코포레이션(Omeros Corporation)에 양도되며, 본원에 참조로 포함됨)에서 기술된 것과 같이, MASP-2 의존성 보체 활성화는 수많은 급성 및 만성 질환 상태의 발병에 기여하는 것으로 함축되었다. 예를 들어, 미국 특허 제8,951,522호에서 기술된 것과 같이, 선천적 면역 시스템의 일부인 보체 시스템의 일차 기능은 감염원에 대해 숙주를 보호하는 것이지만, 보체 시스템의 부적절하거나 과다한 활성화는 심각한 질환, 예컨대 미세혈관에서 피브린 침착 및 혈소판 풍부 혈전뿐만 아니라 내피 손상이 장기 손상으로 이어지는 혈전성 미세혈관병증(aHUS, TTP 및 HUS를 포함한 TMA)으로 이어질 수 있다. 렉틴 경로는 내피 세포 스트레스 또는 손상의 환경에서 보체를 활성화하고, MASP-2의 활성화를 방지하는데 지배적인 역할을 하며 렉틴 경로는 막 공격 복합체의 형성, 혈소판 활성화 및 백혈구 모집으로 이어지는 효소 반응의 순서를 중단시킨다. 미국 특허 제8,652,477호에서 기술된 것과 같이, MASP-2는 렉틴 경로의 개시 이외에, 또한 응고 시스템을 활성화할 수 있고 프로트롬빈을 트롬빈으로 절단할 수 있다.

따라서, 일부 구체예에서, 렉틴 경로 질환 또는 장애는 혈전성 미세혈관병증(TMA), 신장 질환, 조직 또는 장기 이식으로부터 유발된 염증 반응, 허혈성 재관류 손상, 당뇨병과 관련된 합병증, 혈액투석과 관련된 합병증, 심혈관 질환 또는 장애, 염증성 위장 장애, 폐 장애, 안과 질환 또는 장애, 파종성 혈관내 응고, 이식편대숙주병, 정맥 폐쇄성 질환 및 미만성 폐포 출혈로 이루어지는 군으로부터 선택된다.

일부 구체예에서, 본 개시의 하나 이상의 항체 또는 항원 결합 단편, 핵산, 벡터, 세포, 또는 조성물 및 하나 이상의 추가 치료제를 포함하는 병용 요법이 제공된다. 그러한 병용 요법에서, 본 개시의 하나 이상의 항체 또는 항원 결합 단편, 핵산, 벡터, 세포, 또는 조성물 및 하나 이상의 추가 치료제는 임의의 시간 간격으로 또는 동시에 임의의 순서 및 임의의 순차로 투여될 수 있는 것이 인지될 것이다.

일부 구체예에서, 렉틴 경로 질환 또는 장애는 혈전성 혈소판감소성 자반증(thrombotic thrombocytopenic purpura, TTP), 난치성 TTP, 업쇼-슐만 증후군(Upshaw-Schulman Syndrome, USS), 용혈성 요독 증후군(hemolytic uremic syndrome, HUS), 비정형 용혈성 요독 증후군(aHUS), 비인자 H 의존성 비정형 용혈 증후군(non-Factor H-dependent atypical hemolytic syndrome), 감염에 이차적인 aHUS, 혈장 요법 저항성 aHUS, 암에 이차적인 TMA, 화학요법 또는 다른 항암 요법에 이차적인 TMA, 이식에 이차적인 TMA, 또는 조혈 줄기 세포 이식과 관련된 TMA, 감염에 이차적인 TMA, 및 IgA 혈관염(vasculitis)을 포함한 혈전성 미세혈관병증(TMA)이다.

일부 구체예에서, 렉틴 경로 질환 또는 장애는 급성 이식편대숙주병(GVHD), 만성 GVHD 또는 스테로이드 내성 GVHD를 포함한 이식편대숙주병(GVHD)이다. 일부 구체예에서, GVHD를 앓고 있거나 또는 발병의 위험이 있는 대상체는 조혈 줄기 세포 이식을 이전에 받았거나, 받고 있거나, 또는 받을 예정이다.

일부 구체예에서, 렉틴 경로 질환 또는 장애는 미만성 폐포 출혈(DAH)이다. 일부 구체예에서, DAH를 앓고 있거나, 또는 발병의 위험이 있는 대상체는 조혈 줄기 세포 이식을 이전에 받았거나, 받고 있거나, 또는 받을 예정이다.

일부 구체예에서, 렉틴 경로 질환 또는 장애는 모세관 누출 증후군(capillary leak syndrome), 이식 증후군(engraftment syndrome), 체액 과다(fluid overload), 또는 특발성 폐렴 증후군(idiopathic pneumonia syndrome)이다. 일부 구체예에서, 이들 질환 또는 장애 중 하나 이상을 앓고 있거나, 또는 발병의 위험이 있는 대상체는 조혈 줄기 세포 이식을 이전에 받았거나, 받고 있거나, 또는 받을 예정이다.

일부 구체예에서, 렉틴 경로 질환 또는 장애는 정맥 폐쇄성 질환(VOD)이다. 일부 구체예에서, VOD를 앓고 있거나, 또는 발병의 위험이 있는 대상체는 조혈 줄기 세포 이식을 이전에 받았거나, 받고 있거나, 또는 받을 예정이다.

일부 구체예에서, 렉틴 경로 질환 또는 장애는 이식편대숙주병 또는 TMA와 관련된 신경학적 증상, 예컨대 무력증(asthenia), 이상 감각(paresthesias), 사지마비(tetraplegia), 감각운동 결핍(sensorimotor deficit), 자율신경계 다발병증(dysautonomic polyneuropathy), 또는 신경인성 방광(neurogenic bladder)이다.

일부 구체예에서, 렉틴 경로 질환 또는 장애는, 한정하는 것은 아니지만, 중막증식성 사구체신염(mesangioproliferative glomerulonephritis), 막성 사구체신염(membranous glomerulonephritis), 막증식성 사구체신염(membranoproliferative glomerulonephritis)(중막모세혈관 사구체신염(mesangiocapillary glomerulonephritis)), 급성 감염후 사구체신염(acute post infectious glomerulonephritis)(연쇄상구균 감염후 사구체신염(poststreptococcal glomerulonephritis)), C3 사구체병(C3 glomerulopathy), 한랭글로불린혈증 사구체신염(cryoglobulinemic glomerulonephritis), 소수면역괴사성 초승달 사구체신염(pauci-immune necrotizing crescentic glomerulonephritis), 루푸스 신염(lupus nephritis), 헤노흐-쉔라인 자반신염(Henoch-Schonlein purpura nephritis) 및 IgA 신병증(IgA nephropathy)을 포함한 신장 질환이다.

일부 구체예에서, 렉틴 경로 질환 또는 장애는 만성 신장 질환(chronic kidney disease), 만성 신부전(chronic renal failure), 신장 경화증(scleroderma in kidney)(경화성 신장 위기(sclerodermal renal crisis) 포함), 사구체 질환(glomerular disease)(예컨대, 국소성 분절 사구체 경화증(focal segmental glomerulosclerosis)), 면역 복합 질환(예컨대, IgA 신병증, 막성 신병증), 루푸스 신염, 신증후군, 당뇨병성 신병증, 세뇨관 간질 손상(tubulointerstitial damage) 및 사구체신염(예컨대, C3 사구체병증), 또는 한정하는 것은 아니지만, 신증후군(nephrotic syndrome), 자간전증(pre-eclampsia), 자간증(eclampsia), 신장의 독성 병변, 아밀로이드증(amyloidosis), 콜라겐 혈관 질환(예컨대, 전신성 홍반성 루푸스(systemic lupus erythematosus)), 탈수, 사구체 질환(예컨대, 막성 사구체신염, 막성 사구체 신병증, 국소성 분절 사구체신염, C3 사구체병증, 최소 변화 질환, 지질성 신장증(lipoid nephrosis)), 격렬한 운동, 스트레스, 양성 기립성(자세) 단백뇨(benign orthostatis(postural) proteinuria), 국소성 분절 사구체 경화증, IgA 신병증(즉, 버거병(Berger's disease)), IgM 신병증, 막증식성 사구체신염, 막성 신병증, 최소 변화 질환, 육종증(sarcoidosis), 알포트 증후군(Alport's syndrome), 당뇨병(diabetes mellitus)(당뇨병성 신병증), 약물 유도 독성(예컨대, NSAIDS, 니코틴, 페니실라민, 탄산 리튬, 금 및 기타 중금속, ACE 억제제, 항생물질(예컨대, 아드리아마이신) 또는 아편(예컨대, 헤로인) 또는 다른 신독소)을 포함하는 단백뇨와 관련된 질환 또는 병태; 파브리병(Fabry's disease), 감염(예컨대, HIV, 매독(syphilis), A형, B형 또는 C형 간염, 연쇄상 구균 감염(poststreptococcal infection), 요로 주혈흡충증(urinary schistosomiasis); 아미노산뇨증(aminoaciduria), 판코니 증후군(Fanconi syndrome), 고혈압성 신장경화증(hypertensive nephrosclerosis), 간질성 신장염(interstitial nephritis), 겸상 적혈구 질환(sickle cell disease), 헤모글로빈혈증(hemoglobinuria), 다발성 골수종(multiple myeloma), 미오글로빈뇨증(myoglobinuria), 장기 거부반응(예컨대, 신장 이식 거부반응), 에볼라 출혈열(ebola hemorrhagic fever), 슬개골조갑 증후군(Nail patella syndrome), 가족성 지중해열(familial Mediterranean fever), HELLP 증후군(HELLP syndrome), 전신성 홍반성 루푸스, 베게너 육아종증(Wegener's granulomatosis), 류마티스 관절염, 제1형 글리코겐 축적병(Glycogen storage disease type 1), 굿파스처 증후군(Goodpasture's syndrome), 헤노흐-숀라인 자반증, 신장으로 확산된 요로 감염(urinary tract infection), 쇼그렌 증후군(Sjogren' s syndrome) 및 감염 후 사구체신염을 앓고 있거나 발병 위험이 있는 대상체의 신장 섬유증(renal fibrosis)(예컨대, 세뇨관 간질 섬유증(tubulointerstitial fibrosis)) 및/또는 단백뇨이다.

일부 구체예에서, 렉틴 경로 질환 또는 장애는, 한정하는 것은 아니지만, 전체 장기(예컨대, 신장, 심장, 간, 췌장, 폐, 각막, 등) 또는 조직 이식(예컨대, 판막, 힘줄, 골수, 등)의 동종이식 또는 이종이식을 포함한 조직 또는 고형 장기 이식으로부터 비롯된 염증 반응이다. 일부 구체예에서, 렉틴 경로 질환 또는 장애는 지연된 이식 기능이다.

일부 구체예에서, 렉틴 경로 질환 또는 장애는, 한정하는 것은 아니지만, 심근 허혈성 재관류 손상(I/R), 위장 I/R, 신장 I/R, 및 대동맥류 복구 후 I/R, 심폐우회술과 관련된 I/R, 뇌 I/R, 뇌졸중, 장기 이식 또는 절단되거나 외상을 입은 사지 또는 손가락의 재부착과 관련된 혈관 재문합술(vascular reanastomosis), 이식 및/또는 재이식을 위한 혈관 재개통, 및 쇼크 및/또는 수술 절차 후 혈역학적 소생술을 포함한 허혈성 재관류 손상이다.

일부 구체예에서, 렉틴 경로 질환 또는 장애는 비-비만성 당뇨병(제1형 당뇨병 또는 인슐린 저항성 당뇨병)과 관련된 합병증 및/또는 한정하는 것은 아니지만 당뇨병성 혈관병증(diabetic angiopathy), 당뇨병성 신경병증(diabetic neuropathy), 당뇨병성 망막병증(diabetic retinopathy) 또는 당뇨병성 황반 부종(diabetic macular edema)을 포함한 제1형 또는 제2형(성인기 개시) 당뇨병과 관련된 합병증이다.

일부 구체예에서, 렉틴 경로 질환 또는 장애는, 한정하는 것은 아니지만, 헤노흐-숀라인 자반신염, 전신성 홍반성 루푸스 관련 혈관염, 류마티스 관절염 관련 혈관염(또한 악성 류마티스 관절염으로도 불림), 면역 복합체 혈관염, 항호중구 세포질 자가항체(ANCA) 관련 혈관염, 타카야수병(Takayasu's disease), 확장 심근병증(dilated cardiomyopathy), 당뇨병성 혈관병증(diabetic angiopathy), 가와사키병(Kawasaki's disease)(동맥염(arteritis)), 정맥 가스 색전증(venous gas embolus, VGE), 및 스텐트 배치, 회전 죽종절제술 및/또는 경피적 경혈관 관상동맥 혈관성형술(PTCA) 후 재협착 억제를 포함한 심혈관 질환 또는 장애이다.

일부 구체예에서, 렉틴 경로 질환 또는 장애는, 한정하는 것은 아니지만, 췌장염(pancreatitis), 게실염(diverticulitis), 및 크론병(Crohn's disease), 궤양성 대장염(ulcerative colitis), 과민성 장 증후군(irritable bowel syndrome) 및 염증성 장 질환(IBD)을 포함한 장 질환을 포함한 염증성 위장 장애이다. 일부 구체예에서, 렉틴 경로 질환 또는 장애는 소화관의 섬유증에 의해 유발되거나 악화된다. 일부 구체예에서, 렉틴 경로 질환 또는 장애는 췌장 섬유증(pancreatic fibrosis)이다.

일부 구체예에서, 렉틴 경로 질환 또는 장애는, 한정하는 것은 아니지만, 급성 호흡 곤란 증후군(acute respiratory distress syndrome), 수혈 관련 급성 폐 손상, 허혈/재관류 급성 폐손상(ischemia/reperfusion acute lung injury), 만성 폐쇄성 폐질환(chronic obstructive pulmonary disease), 천식(asthma), 베게너 육아종증, 항사구체 기저막 질환(antiglomerular basement membrane disease)(굿파스처병), 태변 흡인 증후군(meconium aspiration syndrome), 흡인성 폐렴(aspiration pneumonia), 폐쇄성 세기관지염 증후군(bronchiolitis obliterans syndrome), 특발성 폐섬유증(idiopathic pulmonary fibrosis), 화상에 따른 급성 폐손상, 비심인성 폐부종(non-cardiogenic pulmonary edema), 수혈 관련 호흡 곤란 및 폐기종(emphysema)을 포함한 폐 장애이다.

일부 구체예에서, 렉틴 경로 질환 또는 장애는 체외 노출 촉발된 염증 반응이며 방법은, 한정하는 것은 아니지만, 혈액투석, 혈장분리술, 백혈구분반술, 체외막 산소화(ECMO), 헤파린 유도 체외막 산소화 LDL 침전(HELP) 및 심폐 우회술(CPB)을 포함한 체외 순환 절차를 받는 대상을 치료하는 것을 포함한다.

일부 구체예에서, 렉틴 경로 질환 또는 장애는 염증성 또는 비염증성 관절염 및 한정하는 것은 아니지만, 골관절염(osteoarthritis), 류마티스 관절염, 연소성 류마티스 관절염(juvenile rheumatoid arthritis), 통풍(gout), 신경병성 관절병증(neuropathic arthropathy), 건선성 관절염(psoriatic arthritis), 강직성 척추염(ankylosing spondylitis) 또는 기타 척추관절병증(spondyloarthropathies) 및 결정성 관절병증(crystalline arthropathies), 근이영양증(muscular dystrophy) 및 전신성 홍반성 루푸스(SLE)를 포함한 다른 근골격 장애로부터 선택된다.

일부 구체예에서, 렉틴 경로 질환 또는 장애는, 한정하는 것은 아니지만, 건선, 자가면역 수포성 피부병(autoimmune bullous dermatoses), 호산구성 해면증(eosinophilic spongiosis), 수포성 유천포창(bullous pemphigoid), 후천성 표피박리증(epidermolysis bullosa acquisita), 아토피성 피부염(atopic dermatitis), 임신성 포진(herpes gestationis) 및 기타 피부 질환을 포함하며, 모세혈관 누출로 인해 발생하는 열 화상 및 화학적 화상의 치료를 위한 피부 장애이다.

일부 구체예에서, 렉틴 경로 질환 또는 장애는, 한정하는 것은 아니지만, 다발성 경화증(MS), 중증 근무력증(MG), 헌팅턴병(Huntington's disease, HD), 근위축성 축삭 경화증(amyotrophic lateral sclerosis, ALS), 길랑 바레 증후군(Guillain Barre syndrome), 뇌졸중, 퇴행성 디스크(degenerative discs), 뇌외상, 파킨슨병(Parkinson's disease, PD), 알츠하이머병(AD), 밀러-피셔 증후군(Miller-Fisher syndrome), 뇌외상 및/또는 출혈 후 재관류, 외상성 뇌 손상, CNS의 섬유증, 탈수초화(demyelination) 및 수막염(meningitis)를 포함한 말초신경계(PNS) 및/또는 중추신경계(CNS) 장애 또는 손상이다.

일부 구체예에서, 렉틴 경로 질환 또는 장애는 제한 없이, 중증 패혈증(severe sepsis), 패혈성 쇼크(septic shock), 패혈증으로 인한 급성 호흡 곤란 증후군, 용혈성 빈혈(빈혈), 전신성 염증 반응 증후군, 또는 출혈성 쇼크를 포함한 패혈증 또는 패혈증으로부터 유발된 병태이다.

일부 구체예에서, 렉틴 경로 질환 또는 장애는, 한정하는 것은 아니지만, 고통스러운 방광 질환, 감각 방광 질환(sensory bladder disease), 만성 무균성 방광염(chronic abacterial cystitis) 및 간질성 방광염(interstitial cystitis), 남성 및 여성 불임, 태반 기능 장애 및 유산 및 자간전증을 포함한 비뇨생식기 장애이다.

일부 구체예에서, 렉틴 경로 질환 또는 장애는, 제한 없이 암 병태의 치료를 위한 것을 포함한 화학요법 및/또는 방사선 요법으로 치료되고 있는 대상체에서의 염증 반응이다.

일부 구체예에서, 렉틴 경로 질환 또는 장애는, 한정하는 것은 아니지만, 고형 종양(들), 혈액 유래 종양(들), 고위험 암종 종양 및 종양 전이를 포함한 혈관신생 의존성 암이다. 일부 구체예에서, 렉틴 경로 질환 또는 장애는, 한정하는 것은 아니지만, 혈관종(hemangioma), 청신경종(acoustic neuroma), 신경섬유종(neurofibroma), 트라코마(trachoma), 암종성 종양 및 화농성 육아종(pyogenic granulomas)을 포함한 혈관신생 의존성 양성 종양이다.

일부 구체예에서, 렉틴 경로 질환 또는 장애는, 한정하는 것은 아니지만, 하시모토 갑상선염(Hashimoto's thyroiditis), 스트레스, 불안 및 프로락틴의 조절된 방출, 성장 또는 인슐린 유사 성장 인자, 및 뇌하수체로부터의 부신피질자극호르몬을 포함한 다른 잠재적 호르몬 장애를 포함하는 내분비 장애이다.

일부 구체예에서, 렉틴 경로 질환 또는 장애는, 한정하는 것은 아니지만, 연령 관련 황반 변성(macular degeneration), 녹내장(glaucoma) 및 안내염(endophthalmitis)을 포함한 안과 질환 또는 장애이다. 일부 구체예에서, 렉틴 경로 질환 또는 장애는, 한정하는 것은 아니지만 연령 관련 황반 변성, 포도막염(uveitis), 안구 흑색종, 각막 혈관신생(corneal neovascularization), 원발 익상편(primary pterygium), HSV 기질 각막염(stromal keratitis), HSV-1 유도 각막 림프관 형성(corneal lymphangiogenesis), 증식성 당뇨병성 망박병증(proliferative diabetic retinopathy), 당뇨병성 황반 부종, 미숙아 망막병증, 망막 정맥 폐쇄(retinal vein occlusion), 각막 이식 거부(corneal graft rejection), 신생혈관 녹내장(neovascular glaucoma), 증식성 당뇨병성 망막병증에 따른 유리체 출혈(vitreous hemorrhage), 시신경척수염(neuromyelitis optica), 전낭하 백내장(anterior subcapsular cataract), 후낭 혼탁(posterior capsule opacification) 및 홍반증(rubeosis)을 포함한 안구 혈관신생 질환 또는 병태이다.

일부 구체예에서, 렉틴 경로 질환 또는 장애는 신경학적 외상(예컨대, 급성 두부 손상, 문헌[Kumura et al, Acta Neurochirurgica 55:23-28 (1987)] 참고), 감염(박테리아, 바이러스, 진균, 기생충), 암, 산과적 합병증(obstetrical complication), 간 질환, 중증 독성 반응(예컨대, 뱀에 쏘임, 곤충에 쏘임, 수혈 반응), 쇼크, 심장 발작, 이식 거부반응, 혈관 동맥류, 간부전, 화학 요법이나 방사선 요법에 의한 암 치료, 화상, 또는 우발적인 방사선 노출을 포함한, 패혈증, 중증 외상에 따른 파종성 혈관내 응고(DIC)를 포함한 DIC 또는 다른 보체 매개 응고 장애이다.

일부 구체예에서, 렉틴 경로 질환 또는 장애는 급성 방사선 증후군, 치밀 침착 질환(dense deposit disease), 데고스병(Degos Disease), 치명적인 항인지질증후군(Catastrophic Antiphospholipid Syndrome, CAPS), 베체트병(Behcet's disease), 한랭글로불린혈증(cryoglobulinemia); 발작성 야간 혈색소뇨증(paroxysmal nocturnal hemoglobinuria, "PNH") 및 한랭응집소병(cold agglutinin disease)으로 이루어지는 군으로부터 선택된다.

일부 구체예에서, 렉틴 경로 질환 또는 장애는 aHUS, HSCT-TMA, IgAN, 및 루푸스 신염(LN)으로 이루어지는 군으로부터 선택된다.

일부 구체예에서, 렉틴 경로 질환 또는 장애는 보체 시스템의 피브린 유도 활성화 및 응고 및/또는 접촉 시스템의 관련 활성화와 관련된다. 일부 구체예에서, 렉틴 경로 질환 또는 장애 또는 병태는 피브린 또는 활성화된 혈소판에 의해 개시된 보체 관련 염증, 과도한 응고 또는 접촉 시스템 활성화와 관련이 있다. 일부 구체예에서, 렉틴 경로 질환 또는 장애는 동맥 혈전증(arterial thrombosis), 정맥 혈전증(venous thrombosis), 심부정맥 혈전증(deep vein thrombosis), 수술 후 혈전증, 관상동맥 우회술 및/또는 중재적 심혈관 시술(예컨대, 혈관성형술 또는 스텐트 배치) 후 재협착증(restenosis), 죽상경화증(atherosclerosis), 플라크 파열(plaque rupture), 플라크 불안정, 재협착증, 저혈압(hypotension), 급성 호흡 곤란 증후군(ARDS), 전신 염증 반응 증후군(SIRS), 파종성 혈관내 응고(DIC), 정맥 폐쇄성 질환(VOD), 혈전성 미세혈관병증, 루푸스 신염, 표재성 혈전 정맥염(superficial thrombophlebitis), 제V 인자 라이덴 돌연변이(Factor V Leiden mutation), 허혈성/재관류 손상, 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 감염, 호르몬 대체 요법(HRT)을 받고 있는 경우, 알츠하이머병 및/또는 응고항진 상태(hypercoagulable state)를 앓고 있는 경우로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 렉틴 경로는 다음: 5-FU, GM-CSF, 시스플라틴, 헤파린, COX-2 억제제, 조영제, 코르티코스테로이드 및 항정신병약물로 이루어지는 군으로부터 선택된 약물을 사용하여 진행 중인 요법; 정맥 울혈(venous stasis)(고정화, 수술, 등), 항인지질 증후군, 암(전골수성 백혈병(promyelocytic leukemia), 폐암, 유방암, 전립선암, 췌장암, 자궁경부암, 식도 편평세포암종, 위암 및 결장암), 외상 또는 수술로 인한 조직 손상, 중심 정맥에 카테터의 존재, 응고물 형성에 관여하는 단백질(예컨대, 단백질 C)의 획득된 결핍, 발작성 야간혈색소뇨증(paroxysmal nocturnal hemoglobinuria, PNH), 상승된 호모시스테인 수준, 심부전, 기계적 판막의 존재, 제자리 혈전이 있는 폐 고혈압, 심방 세동(atrial fibrillation), 헤파린 유도 혈소판 감소증(혈소판감소증, HIT), 헤파린 유도 혈소판 감소증 및 혈전증(HITT), 제자리 혈전이 있는 카와사키병, 제자리 혈전이 있는 타카야수 동맥염(Takayasu arteritis), 전이성 암의 혈전 선호증(thrombophilia), 제8 인자 수치 상승, 임신, 염증성 장 질환(IBD) 중 적어도 하나 이상으로 인해, 또는 응고항진 상태를 유발하거나 발병 위험을 증가시키는 유전적 결함, 예컨대 프로트롬빈 20210 유전자 돌연변이, MTHFR 돌연변이, 단백질 C의 결핍, 단백질 S의 결핍, 단백질 A의 결핍, 단백질 Z의 결핍, 항트롬빈 결핍 및 혈전 선호증을 유발하는 유전적 장애로 이루어지는 군으로부터 선택된 유전적 결함으로 인해 획득된 응고항진 상태이다.

일부 구체예에서, 렉틴 경로 질환 또는 장애는 유방 섬유증, 근육 섬유증, 후복막 섬유증, 갑상선 섬유증, 림프절 섬유증, 방광 섬유증, 심장 섬유증, 간 섬유증, 관절 섬유증, 피부 섬유증 또는 흉막 섬유증이다. 일부 구체예에서, 렉틴 경로 질환 또는 장애는 근골격 연조직 구조의 섬유증(예컨대, 유착성 관절낭염(adhesive capsulitis), 듀피트렌 구축(Dupuytren's contracture), 골 섬유증이 증가된 골수이형성 병태(myelodysplastic condition), 골다공증(osteoporosis), 골수 섬유증, 또는 이와 관련된 골감소증(osteopenia), 예를 들어, 낭포성 섬유증(cystic fibrosis))이다. 일부 구체예에서, 렉틴 경로 질환 또는 장애는 바이러스 감염, 예컨대 알파 바이러스 감염, 결핵 감염, 또는 인플루엔자 감염으로부터 유발된 섬유증이다. 일부 구체예에서, 렉틴 경로 질환 또는 장애는 외상과 관련된 흉터, 예컨대 수술적 합병증(예컨대, 내부 장기 사이에 흉터 조직이 형성되어 구축, 통증을 유발하고 불임을 유발할 수 있는 외과적 유착), 화학요법 약물 유도 섬유증, 또는 화상과 관련된 흉터이다. 일부 구체예에서, 렉틴 경로 질환 또는 장애는 생식 장기의 섬유증(예컨대, 자궁내막증(endometriosis) 및 페이로니병(Peyronie's disease))이다.

일부 구체예에서, 렉틴 경로 질환 또는 장애는 칼리크레인 억제제로 치료될 수 있다. 일부 구체예에서, 렉틴 경로는 유전성 혈관 부종(hereditary angioedema), 당뇨병성 황반 부종 및 심폐우회술 중 출혈로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 렉틴 경로는 트롬빈 억제제로 치료될 수 있다, 예컨대 동맥 혈전증, 정맥 혈전증, 폐색전증(pulmonary embolism), 심방 세동, 헤파린 유도 혈소판 감소증, 하나의 항응고제에서 다른 항응고제로의 전환, 또는 HIT가 있는 중증 환자의 연속 신장 대체 요법(CRRT)의 체외 회로 개통을 위한 오프 라벨 사용(유지).

일부 구체예에서, 렉틴 경로 질환 또는 장애, 예컨대 심부정맥 혈전증(일차 예방 및 확장 치료 모두), 폐색전증, 비판막성 심방 세동, 심방 세동이 있거나 없는 대상체의 급성 관상동맥 증후군 후 재발성 허혈의 예방, 말기 신장 질환, 뇌 허혈, 협심증은 인자 XII 억제제로 치료될 수 있거나, 또는 의료 장치(예컨대, 판막, 소구경 이식편, 등) 및/또는 체외 회로와 관련된 응고를 감소 또는 예방될 수 있다.

일부 구체예에서, 렉틴 경로 질환 또는 장애는 혈전색전증(thromboembolism)에 대한 성향을 증가시키는 후천적 질환 또는 장애, 예컨대 죽상동맥경화증, 항인지질 항체, 암(예컨대, 전골수성 백혈병, 폐암, 유방암, 전립선암, 췌장암, 위암 및 결장암), 고호모시스테인혈증(hyperhomocysteinemia), 감염, 조직 손상, 정맥 울혈(예컨대 수술, 정형외과적 또는 마비성 고정화, 심부전, 임신, 또는 비만으로 인한 것임) 및 에스트로겐을 함유한 경구 피임약을 복용하는 대상체로 이루어지는 군으로부터 선택된 질환 또는 장애이다. 일부 구체예에서, 대상체는 항응고제 요법을 필요로 하며 본원에서 기술된 항체 또는 그것의 항원 결합 단편, 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 숙주 세포, 및/또는 조성물은 표준 항응고제 요법(예컨대, 와파린)에 대한 대체물로서 사용된다. 일부 구체예에서, 대상체는 표준 항응고제 요법을 정상적으로 방해하는 병태, 예컨대 CNS 아밀로이드 혈관병증을 가지고 있다. 방법의 일부 구체예에서, 본원에서 기술된 항체 또는 그것의 항원 결합 단편, 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 숙주 세포, 및/또는 조성물은 그렇지 않으면 표준 항응고제 요법을 받는 대상체에서 수술 전후에 가교제로서 투여된다. 일부 구체예에서, 렉틴 경로 질환 또는 장애는 혈소판의 활성화를 수반하는 혈관 폐쇄성 장애인 겸상 적혈구 질환이다.

일부 구체예에서, 렉틴 경로 질환 또는 장애는 SARS-CoV-2 감염이다. SARS-CoV-2 감염은 여러 상이한 메커니즘에 의해 렉틴 경로 질환 또는 장애를 초래할 수 있다. 급성 또는 만성 SARS-CoV-2 감염 외에, 추가적인 만성 병태는 과거 또는 현재의 SARS-CoV-2 감염에 의해 촉발될 수 있다. SARS-CoV-2 감염과 관련된 렉틴 경로 질환 또는 장애는 MASP-2의 바이러스 단백질과의 직접적인 상호작용, 예컨대 MASP-2의 SARS-CoV-2에의 결합을 통해 일어날 수 있다. 예를 들어, 렉틴 경로 질환 또는 장애는 MASP-2의 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 N 단백질에의 결합을 통해 일어날 수 있다. 대안적으로, 일부 렉틴 경로 질환 또는 장애는 렉틴 경로 인식 분자와 바이러스 표면 또는 바이러스로 감염된 세포 표면 상에 존재하는 바이러스 당단백질과의 상호작용 후에 일어날 수 있다. 추가로, 렉틴 경로 질환 또는 장애는 SARS-CoV-2로 감염된 세포에 의해 제공된 DAMP에 의한 렉틴 경로의 활성화로부터 유발될 수 있다. 일부 구체예에서, SARS-CoV-2 감염은 급성 감염이다. 대체 구체예에서, SARS-CoV-2 감염은 만성 감염이다. 특정 구체예에서, 렉틴 경로 질환 또는 장애는 과거의 SARS-CoV-2 감염에 의해 유발된 진행 중인 만성 병태이다. 일부 구체예에서, 렉틴 경로 질환 또는 장애는 급성 호흡 곤란 증후군이다. 일부 구체예에서, 렉틴 경로 질환 또는 장애는 SARS-CoV-2 감염에 부수적이다. 일부 구체예에서, 본원에서 개시된 항체 또는 그것의 항원 결합 단편은 MASP-2의 SARS-CoV-2 S 단백질 및/또는 N 단백질에의 결합을 차단한다.

렉틴 경로 질환 및 장애의 특정 예가 아래에서 추가로 상세하게 설명된다.

비정형 용혈성 요독 증후군(aHUS).

비정형 용혈성 요독 증후군(aHUS)은 "혈전성 미세혈관병증"으로 불리는 병태 군의 일부이다. HUS의 비정형 형태(aHUS)에서, 질환은 보체 조절 결함과 관련이 있고 산발적이거나 가족성일 수 있다. aHUS의 가족성 사례는 보체 인자 H 관련 단백질 1(CFHR1) 및 보체 인자 H 관련 단백질 3(CFHR3)뿐만 아니라 보체 인자 H, 인자 I, 인자 B, 막-보조인자 단백질 억제제(CD46)를 포함한 보체 활성화 또는 보체 조절 단백질을 코딩하는 유전자의 돌연변이와 관련이 있다(Zipfel, P.F., et al., PloS Genetics 3(3):e41 (2007)). aHUS와 관련된 이런 유전자 돌연변이의 다양한 배열의 통합적인 특징은 세포 또는 조직 표면에서 향상된 보체 활성화 성향이다. 대상체는 aHUS를 나타내는 하나 이상의 증상(예컨대, 빈혈, 혈소판 감소증 및/또는 신부전(renal insufficiency)의 존재) 및/또는 대상체로부터 얻어진 생검에서 혈전성 미세혈관병증의 존재가 개시될 때 aHUS가 발병될 위험이 있다. 대상체가 aHUS가 발병할 위험이 있는지의 여부의 결정은 (예컨대 대상체의 유전자형을 함유한 데이터베이스로부터의) 유전자 정보를 평가하거나, 또는 aHUS와 관련된 유전자 마커의 존재 또는 부재를 결정하기 위하여 게놈 서열분석 또는 유전자 특이적 분석(예컨대, PCR 분석)을 통해 대상체에 대해 적어도 하나의 유전자 스크리닝 테스트를 수행함으로써 수행될 수 있는(즉, 보체 인자 H(CFH), 인자 I(CFI), 인자 B(CFB), 막 보조인자 단백질 억제제(CD46), C3, 보체 인자 H 관련 단백질 1(CFHR1), 또는 THBD(항응고 단백질 트롬보모듈린을 암호화함) 또는 보체 인자 H 관련 단백질 3(CFHR3), 또는 보체 인자 H 관련 단백질 4(CFHR4)를 암호화하는 유전자에서 aHUS와 관련된 유전자 돌연변이의 존재 또는 부재를 결정함) 대상체가 aHUS가 발생할 유전적 소인을 가졌는지의 여부를 결정하는 것, 및/또는 대상체가 aHUS의 가족력을 가졌는지를 결정하는 것을 포함한다. aHUS와 관련된 유전자 돌연변이의 존재 또는 부재에 대한 유전자 스크리닝 방법은 잘 확립되어 있다. 예를 들어, 문헌[Noris M et al. "Atypical Hemolytic-Uremic Syndrome", 2007 Nov 16 [Updated 2011 Mar 10]. In: Pagon RA, Bird TD, Dolan CR, et al., editors. GeneReviews^TM, Seattle(WA): University of Washington, Seattle]을 참고한다.

조혈 줄기 세포 이식 관련 TMA(HSCT-TMA)

조혈 줄기 세포 이식 관련 TMA(HSCT-TMA)는 내피 손상에 의해 촉발된 생명을 위협하는 합병증이다. 신장이 가장 흔하게 영향을 받는 장기지만, HSCT-TMA는 또한 폐, 장, 심장 및 뇌를 포함하는 다중 시스템 질환일 수 있다. 경미한 TMA의 발생이라도 장기간 신장 손상과 관련된다. 동종이계 후 HSCT 관련 TMA의 발생은 다양한 진단 기준 및 조건화 및 이식편대숙주병 예방 요법을 기반으로 빈도가 상이하며, 칼시뉴린 억제제가 관련된 가장 빈번한 약물이다(Ho VT et al., Biol Blood Marrow Transplant, 11(8):571-5, 2005).

면역글로불린 A 신병증(IgAN)

면역글로불린 A 신병증(IgAN)은 신장내 염증 및 신장 손상을 초래하는 자가면역 신장 질환이다. IgAN은 전세계적으로 가장 일반적인 일차 사구체 질환이다. 연간 발병률은 100,000명당 약 2.5명이며, 미국에서는 1400명 중 1명이 IgAN에 걸릴 것으로 추정된다. IgAN 환자 중 40% 정도로 많은 경우가 말기 신장 질환(ESRD)으로 발달할 것이다. 환자는 전형적으로 경도에서 중등도의 단백뇨 및 다양한 수준의 신부전증을 동반한 미세한 혈뇨를 나타낸다(Wyatt R.J., et al., NEnglJ Med 36S(25):2402-4, 2013). 손상된 신장 기능, 지속적인 고혈압, 및 심한 단백뇨(1일당 1 g 초과)와 같은 임상 지표는 불량항 예후와 연관된다(Goto M et al., Nephrol Dial Transplant 24(10):3068-74, 2009; Berthoux F. et al., J Am Soc Nephrol 22(4):752-61, 2011). 단백뇨는 다수의 대규모 관찰 연구 및 예측 실험에서 다른 위험 인자와 무관한 가장 강력한 예후 인자이다(Coppo R. et al., J Nephrol 18(5):503-12, 2005; Reich H. N., et al., J Am Soc Nephrol 18(12):3177-83, 2007). 환자의 15-20%가 치료되지 않는 상태로 방치되면 질환이 개시된 후 10년 이내에 ESRD에 도달하는 것으로 추정된다(D'Amico G., Am J Kidney Dis 36(2):227-37, 2000). IgAN의 진단적 특징은 사구체 혈관사이막에서 IgA 침착물이 단독으로 또는 IgG, IgM 또는 둘 다와 함께 우세하게 있다는 것이다.

루푸스 신염(LN)

전신성 홍반성 루푸스(SLE)의 주요 합병증은 루푸스 신염으로도 알려져 있고, 사구체신염의 이차 형태로서 분류되는 신염이다. SLE가 있는 성인의 최대 60%가 질병이 진행되는 동안 나중에 어떤 형태로든 신장에 관여하며(Koda-Kimble et al., Koda-Kimble and Young's Applied Therapeutics: the clinical use of drugs, 10th Ed, Lippincott Williams & Wilkins: pages 792-9, 2012) 미국에서는 100,000명당 20-70명의 유병률을 보인다. 루푸스 신염은 종종 피로, 열, 발진, 관절염, 장막염(serositis), 또는 중추신경계 질환을 포함한 활성 SLE의 다른 증상을 가진 환자에서 나타난다(Pisetsky D.S. et al., Med Clin North Am 81(1): 113-28, 1997). 일부 환자는 무증상 루프스 신염을 앓는다; 그러나, 정기적인 추적관찰 동안 혈청 크레아티닌 수치 상승, 알부민 수치 저하, 또는 요단백 또는 침전물과 같은 실험실적 이상은 활성 루푸스 신염을 시사한다.

VI. 서열

본 명세서 내에서 언급된 서열이 표 2에서 요약된다.

VII. 실시예

실시예 1

고친화성 항-인간 MASP-2 억제 항체의 생성

생후 7- 내지 14주령의 C57BL/6 MASP-2 녹아웃 마우스를 C 말단에 6xHis 태그를 포함하고 있는 인간 MASP-2 CCP2/SP 폴리펩타이드(서열 번호:1의 아미노산 잔기 364-686)로, Sigma 보조제 시스템(Sigma-Aldrich, St Louis, MO)을 사용하여 면역화하였다. 마우스를 마우스당 RIBI 보조제와 1:1로 혼합된 50 μg의 면역원으로 복강내로 주사하였다. 면역화된 마우스를 14일 후에 RIBI 보조제와 1:1로 혼합된 추가 면역원으로 부스팅하였다. 마우스를 14일 후에 PBS에 1:1로 혼합된 50 μg의 면역원으로 세번째 부스팅하였다. 마우스로부터의 혈청 샘플을 꼬리 출혈로부터 주기적으로 준비하여 항원 특이적 항체의 존재에 대해 ELISA에 의해 테스트하였다. 유의한 항체 역가를 보인 마우스는 비장 주입 전 4일 전에 PBS 중의 융합 전 면역원 부스트를 받았다. 융합 전 3일 전에, B 세포 수를 증가시키기 위하여 마우스를 꼬리 기저에서 PBS(R&D Systems, Minneapolis, MN) 중의 50 μg의 항-CD40 작용물질 mAb로 피하로 처리하였다.

마우스를 희생시키고 비장 세포를 수득하여 50% 폴리에틸렌 글리콜 또는 50% 폴리에틸렌 글리콜 플러스 10% DMSO를 사용하여 선택된 쥐과 골수종 세포주 P3/NSI/1-AG4-1(NS-1)(ATCC No. TIB18)에 융합시켰다. 융합으로 하이브리도마 세포가 생성되었고 그것을 비융합 세포, 골수종 하이브리드 및 비장 하이브리드의 증식을 억제하기 위하여 HAT(하이포잔틴, 아미노프테린 및 티미딘) 배지를 함유한 96 웰 조직 배양 플레이트에 플레이팅하였다. 하이브리도마 선택 후, 배양 상층액을 ELISA에 의해 MASP-2 결합에 대해 검정하고 C3 침착 검정을 사용하여 렉틴 경로 활성화 억제제 대해 검정하였다. 양성 하이브리도마를 확인하고 연속 희석 방법에 의해 하위클로닝하였다. 하이브리도마 상층액의 병렬 스크리닝으로 MASP-2 결합 및 기능(C3 침착 검정) 둘 다에 대해 양성인 75개의 초기 하이브리도마를 얻었다. 75개의 초기 하이브리도마의 추가 배양 및 재테스트 후에, 74개가 결합에 대해 양성인 것으로 확인된 반면, 39개가 기능적 활성을 가진 것으로 확인되었다; 이들 39개의 하이브리도마를 연속 희석에 의해 클로닝하였다.

실시예 2

재조합 항체의 클로닝, 정제, 및 특성화

실시예 1에서 확인된 39개의 하이브리도마 클론으로부터 RT-PCR을 사용하여 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 클로닝하고 서열분석을 하였다. 인간 IgG4 중쇄(서열 번호:66) 및 카파 경쇄(서열 번호:68) 불변 영역에 융합된 마우스 mAb 가변 영역으로 이루어진 마우스-인간 키메릭 mAb를 Expi293F 세포에서 재조합 단백질로서 제조하였다. 사용된 IgG4 불변 힌지 영역(서열 번호:66)은 안정화 S228P 아미노산 치환을 함유한다. 일부 구체예에서, 키메릭 mAb를 S228P 아미노산 치환을 함유하고 또한 낮은 pH에서 FcRn 상호작용을 촉진하는 돌연변이를 함유한 인간 IgG4 불변 힌지 영역(서열 번호:67)에 융합시켰다.

26개의 클론이 고유한 키메릭 단클론성 항체인 것으로 결정되었다. 이들 키메릭 단클론성 항체를 일시적으로 형질감염된 Expi293F 세포에서 발현시키고, 정제하고 인간 MASP-2에 대한 결합 친화성 및 MASP-2 매개 렉틴 경로 활성화를 억제하는 능력에 대해 테스트하였다.

26개의 정제된 재조합 MASP-2 항체의 인간 MASP-2(CCP1-CCP2-SP 단편)에 대한 결합을 측정하기 위하여, 고상 ELISA 검정을 다음과 같이 수행하였다. MaxiSorp ELISA 플레이트를 탄산염/중탄산염 완충액 중의 1.0 μg/mL의 인간 MASP-2(CCP1/2/SP 단편)로 밤새 4℃에서 코팅하였다. 플레이트를 후속해서 1% BSA/PBS로 차단하고, PBS로 세척한 후 차단 완충액(PBST + 0.1% BSA) 중의 재조합 MASP-2 mAb의 연속 희석과 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척하고(PBS-T, 0.05%) 검출 항체(염소 항-인간 IgG-HRP)를 실온에서 1시간 동안 첨가하였다. 또 다른 세척(PBS-T, 0.05%) 후 플레이트를 OPT EIA TMB(BD Biosciences #555214)와 함께 전개시켰다(5분). A450에서의 흡광도 판독을 Spectramax M5e 플레이트 판독기를 사용하여 측정하였다.

26개의 키메릭 mAb 중에서, 22개가 인간 MASP-2에 양호하게 결합하는 것으로 나타났다(외관상 Kd 범위는 0.1 nM 내지 1 nM임). 26개의 키메릭 mAb 중 4개가 인간 MASP-2에 대해 약한/무시할 수 있을 정도의 결합을 가진 것으로 나타났다.

26개의 정제된 재조합 MASP-2 항체가 보체 활성화의 렉틴 경로를 차단하는 능력을 측정하기 위하여, C3 침착 검정을 다음과 같이 수행하였다. 만난을 50 mM 탄산염 완충액(15 mM Na₂CO₃ + 35 mM NaHCO₃ + 1.5 mM NaN₃), pH 9.6에서 50 μg/ml의 농도로 희석하고 ELISA 플레이트 상에서 밤새 4℃에서 코팅하였다. 다음날, PBS 중의 250 μl의 1% BSA를 웰에 첨가하고 2시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 0.05% Tween-20을 함유한 300 μl PBS로 3회 세척하고 샘플을 첨가할 때까지 200 μl PBS와 함께 얼음 상에서 보관하였다.

정상 인간 혈청을 GVB/Ca/Mg 완충액에 1.0%로 희석하고, 26개의 정제된 MASP-2 mAb를 이 완충액에 0.00001 내지 100 nM의 농도 범위로 첨가하고 얼음 상에서 10분 동안 예비 인큐베이션한 후 차단된 ELISA 플레이트에 첨가하였다. 예비 인큐베이션 혼합물을 만난 코팅된 검정 플레이트의 웰로 옮김으로써 보체 활성화 반응이 시작되었다. 실온에서 40분 동안 인큐베이션한 후에, 플레이트를 ELISA 세척 완충액으로 3회 세척함으로써 반응을 중단시켰다. C3b 침착을 항-인간 C3c 항체(Dako)와 이어서 염소 α-토끼 HRP(Southern Biotech)로 검출하였다. 음성 대조군은 혈청이 없는 완충액(C3 침착 없음)이었고, 양성 대조군은 억제 항체가 없는 혈청(최대 C3b 침착)이었다. 컷오프 기준을 무관한 mAb 및 완충액 단독의 활성의 절반으로 설정하였다.

스크리닝에서 확인된 26개의 고유한 키메릭 mAb 중에서, C3b 침착 검정에서 가장 높은 억제 LP 활성을 가진 3개의 클론은 OMS850, OMS860 및 OMS870인 것으로 결정되었다. 이들 3개 항체를 아래에서 기술되는 것과 같은 추후 특성화를 위해 선택하였다.

클론 OMS850, OMS860 및 OMS870의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 서열을 도 3에 도시하고(도 3에서 "SIN" = "서열 번호:"임) 아래에서 포함시켰다. 각각의 상보성 결정 영역(CDR) 및 프레임워크 영역(FR)을 표 1A, 1B, 및 1C(위) 및 표 3-6(아래)에 제공한다.

아래에 각각의 고친화성 MASP-2 억제 항체에 대한 중쇄 가변 영역(VH) 서열을 제공한다. Kabat CDR은 밑줄로 표시한다.

중쇄 가변 영역:

OMS850_VH: 서열 번호:7(마우스 모체)

OMS860_VH: 서열 번호:8(마우스 모체)

OMS870 VH: 서열 번호: 9(마우스 모체)

아래에 고친화성 MASP-2 억제 항체에 대한 경쇄 가변 영역(VL) 서열을 제공한다. Kabat CDR은 밑줄로 표시한다. 이들 영역은 Kabat 시스템에 의해 또는 Chothia 시스템에 의해 넘버링되는 것에 관계없이 동일하다.

경쇄 가변 영역:

OMS850_VL: 서열 번호:10(마우스 모체)

OMS860_VL: 서열 번호:11(마우스 모체)

OMS870 VL: 서열 번호:12(마우스 모체)

실시예 3

후보 MASP-2 억제 항체의 추가 특성화

1. 재조합 인간 MASP-2에 대한 결합

고상 ELISA 검정을 수행하여 실시예 1에서 기술된 것과 같이, 3개의 선택된 MASP-2 억제 항체의 인간 MASP-2(CCP1-CCP2-SP 단편)에 대한 결합을 측정하였다. 결과를 도 4A-D에 도시하며 아래의 표 7에 요약한다.

2. 인간, 시노몰구스 원숭이, 래트 및 마우스 혈청에서의 C3b 침착 검정

실시예 2에서 기술된 3개의 선택된 MASP-2 항체를 발현시키고, 정제하고 동일한 스톡 농도로 희석하고, 그것을 다시 Ca⁺⁺ 및 Mg⁺⁺ 함유 GVB 완충액(4.0 mM 바르비탈, 141 mM NaCl, 1.0 mM MgCl₂, 2.0 mM CaCl₂, 0.1% 젤라틴, pH 7.4)에 희석하여 모든 항체 클론이 동일한 양의 완충액을 갖도록 보장하였다.

A. 인간 혈청에서의 C3b 침착 검정

만난을 탄산염 완충액(15 mM Na₂CO₃ + 35 mM NaHCO₃), pH 9.6에 50 μg/ml의 농도로 희석하고 ELISA 플레이트 상에서 밤새 4℃에서 코팅하였다. 다음날, PBS 차단 용액 중의 250 μl의 1% BSA를 웰에 첨가하고 2시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 0.05% Tween-20을 함유한 300 μl PBS(ELISA 세척 완충액)로 3회 세척하였다.

정상 인간 혈청을 GVB/Ca/Mg 완충액에 1.0%로 희석하고, MASP-2 mAb 클론 OMS850, OMS860 및 OMS870을 0.00001 내지 100 nM의 농도 범위로 첨가하고 얼음 상에서 15분 동안 예비 인큐베이션하였다. 예비 인큐베이션 혼합물을 만난 코팅된, 차단된 검정 플레이트의 웰로 옮긴 후 40분 동안 실온에서 인큐베이션함으로써 반응이 시작되었다. 플레이트를 세척 완충액으로 3회 세척함으로써 반응을 중단시키고 C3b 침착을 항-인간 C3c 항체(Dako)와 이어서 염소 α-토끼 HRP(Southern Biotech)로 검출하였다. 음성 대조군은 혈청 및 항체가 없는 완충액(C3 침착을 초래하지 않음)이었고, 양성 대조군은 항체가 없는 혈청(최대 C3b 침착)이었다. 컷오프 기준을 무관한 mAb 및 완충액 단독의 활성의 절반으로 설정하였다.

B. 시노몰구스 원숭이 혈청에서의 C3b 침착 검정

만난을 탄산염 완충액(15 mM Na₂CO₃ + 35 mM NaHCO₃), pH 9.6에 50 μg/ml의 농도로 희석하고 ELISA 플레이트 상에서 밤새 4℃에서 코팅하였다. 다음날, PBS 차단 용액 중의 250 μl의 1% BSA를 웰에 첨가하고 2시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 300 μl의 PBS/Tween-20으로 3회 세척하였다.

시노몰구스 원숭이 혈청을 GVB/Ca/Mg 완충액에 0.25%로 희석하고, MASP-2 mAb 클론 OMS850, OMS860 및 OMS870을 0.00001 내지 100 nM의 농도 범위로 첨가하고 얼음 상에서 15분 동안 예비 인큐베이션하였다. 예비 인큐베이션 혼합물을 만난 코팅된, 차단된 검정 플레이트의 웰로 옮긴 후 40분 동안 실온에서 인큐베이션함으로써 반응이 시작되었다. 플레이트를 PBS/Tween-20으로 3회 세척함으로써 반응을 중단시켰다. C3b 침착을 항-인간 C3c 항체(Dako)와 이어서 염소 α-토끼 HRP(Southern Biotech)로 검출하였다. 음성 대조군은 혈청 및 항체가 없는 완충액(C3 침착을 초래하지 않음)이었고, 양성 대조군은 항체가 없는 혈청(최대 C3b 침착)이었다. 컷오프 기준을 무관한 mAb 및 완충액 단독의 활성의 절반으로 설정하였다.

C. 래트 혈청에서의 C3 침착 검정

래트 혈청을 GVB/Ca/Mg 완충액에 0.3%로 희석하고, MASP-2 mAb 클론 OMS850, OMS860 및 OMS870을 0.00001 내지 100 nM의 농도 범위로 첨가하고 얼음 상에서 15분 동안 예비 인큐베이션하였다. 예비 인큐베이션 혼합물을 만난 코팅된, 차단된 검정 플레이트의 웰로 옮긴 후 40분 동안 실온에서 인큐베이션함으로써 반응이 시작되었다. 플레이트를 세척 완충액으로 3회 세척함으로써 반응을 중단시켰다. C3b 침착을 항-인간 C3c 항체(Dako)와 이어서 염소 α-토끼 HRP(Southern Biotech)로 검출하였다. 음성 대조군은 혈청 및 항체가 없는 완충액(C3 침착을 초래하지 않음)이었고, 양성 대조군은 항체가 없는 혈청(최대 C3b 침착)이었다. 컷오프 기준을 무관한 mAb 및 완충액 단독의 활성의 절반으로 설정하였다.

D. 마우스 혈청에서의 C3b 침착 검정

마우스 혈청을 GVB/Ca/Mg 완충액에 1.0%로 희석하고, MASP-2 mAb 클론 OMS850, OMS860 및 OMS870을 0.00001 내지 100 nM의 농도 범위로 첨가하고 얼음 상에서 15분 동안 예비 인큐베이션하였다. 예비 인큐베이션 혼합물을 만난 코팅된, 차단된 검정 플레이트의 웰로 옮긴 후 40분 동안 실온에서 인큐베이션함으로써 반응이 시작되었다. 플레이트를 아이스 바스로 옮김으로써 반응을 중단시켰다. C3b 침착을 항-인간 C3c 항체(Dako)와 이어서 염소 α-토끼 HRP(Southern Biotech)로 검출하였다. 음성 대조군은 혈청 및 항체가 없는 완충액(C3 침착을 초래하지 않음)이었고, 양성 대조군은 항체가 없는 혈청(최대 C3b 침착)이었다. 컷오프 기준을 무관한 mAb 및 완충액 단독의 활성의 절반으로 설정하였다.

결과를 도 5A, 5B, 5C 및 5D에 도시하고 아래의 표 8에 요약한다. 도 5A-D에서 "완충액"으로 표시된 데이터 지점은 완충액 단독 음성 대조군이다.

3. 50% 인간 혈청에서의 C4b 침착 검정

만난을 탄산염 완충액(15 mM Na₂CO₃ + 35 mM NaHCO₃ + 1.5 mM NaN₃), pH 9.6에 50 μg/ml의 농도로 희석하고 ELISA 플레이트 상에서 밤새 4℃에서 코팅하였다. 다음날, PBS 차단 용액 중의 250 μl의 1% BSA를 웰에 첨가하고 2시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 300 μl의 PBS/Tween-20으로 3회 세척하였다.

정상 인간 혈청을 PBS에 50.0%로 희석하고, MASP-2 mAb 클론 OMS850, OMS860 및 OMS870을 0.00001 내지 100 nM의 최종 농도 범위로 이 완충액에 첨가하고 얼음 상에서 15분 동안 예비 인큐베이션하였다. 예비 인큐베이션 혼합물을 만난 코팅된, 차단된 ELISA 플레이트로 옮긴 후 7분 동안 4℃에서 인큐베이션함으로써 반응이 시작되었다. C4b 침착을 항-인간 C4c 항체(Dako)와 이어서 염소 α-토끼 HRP(Southern Biotech)로 검출하였다. 음성 대조군은 혈청 및 항체가 없는 완충액(C3 침착 없음)이었다. 배경값을 완충액만을 받은 웰에서 결정하였다. 컷오프 기준을 무관한 mAb 및 완충액 단독의 활성의 절반으로 설정하였다.

결과를 도 6에 도시하고 아래의 표 9에 제공한다. 도 6에서 "완충액"으로 표시된 데이터 지점은 완충액 단독 음성 대조군이다.

항체 OMS850을 위에서 기술된 것과 같이 인간, 마우스, 래트 및 시노몰구스 원숭이에서 양호한 효능의 관점에서 인간화 및 추후 최적화를 위해 선택하였다.

실시예 4

MASP-2 mAb OMS850의 인간화 및 변이체 제조

인간화 전에, 항-MASP-2 억제 mAb OMS850을 번역 후 변형에 대해 분석하였다. 아스파르트산 이성질체화 모티프 "DP"를 OMS850의 VH CDR2(DIDPSDSETHYIEKFKD(서열 번호: 16))에서 확인하였다. OMS850의 변이체를 P53을 A, N, D, L, S 및 T로 변형시키는 부위 지정 돌연변이생성에 의해 생성하였다. 위에서 기술된 것과 같이 변이체를 발현시키고 정제하였다. 친화도를 ELISA에 의해 결정하였고 효능을 위에서 기술된 것과 같이 온전한 IgG4 형식을 사용하여 인간 혈청에서 C3 침착 검정에 의해 평가하였다.

결과를 도 7에 도시하고 아래의 표 10에 제공한다.

도 7에서 나타낸 것과 같이, C3b 침착 검정으로 OMS850 VH P53A가 C3b 침착 검정으로 측정된 바 인간 혈청에서 최상의 효능을 가진 것으로 결정되었다. 그러므로, 이 P53A 치환을 아래에서 기술된 후속 인간화 중에 포함시켰다.

면역원성 위험을 감소시키기 위하여, 대표적인 고친화성 MASP-2 억제 항체 OMS850을 CDR 그라프팅 방법에 의해 인간화하였다. mAb OMS850의 CDR을 가장 밀접한 공통 인간 프레임워크 서열에 그라프팅하였다. Vernier 구역 잔기의 일부를 Quickchange 부위 지정 돌연변이생성(Agilent Technologies)에 의해 변형시켰다. 결과적으로 생성된 인간화된 VH 및 VL 영역을 pcDNA3.1 기반 인간 IgG4 및 IgK 발현 구성물로 옮기고, 위에서 기술된 것과 같이 재조합 항체를 발현시키고 정제하였다. 인간화된 항체의 친화도를 ELISA에 의해 결정하였고, 효능을 위의 실시예 3에서 기술된 방법을 사용하여 1% 인간 혈청 중의 온전한 IgG4 형식을 사용하여 C3 침착 검정에 의해 평가하였다.

먼저 인간화된 원형을 개발하였고 OMS852로 지정하였다. OMS852 인간화된 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 아래에 제공한다. CDR(Kabat)은 밑줄로 표시한다.

OMS852 VH(인간화된)의 전체 서열:(서열 번호: 46)

OMS852 VL(인간화된)의 전체 서열(서열 번호: 47)

OMS850 모체 mAb와 비교하여 OMS850 mAb의 다양항 변형 버전을 사용하는 C3b 침착 검정의 결과를 도 8A 및 도 8B에 도시하고 표 11에 요약한다.

인간화되었고 이전에 확인된 P53A 변형을 포함한 단클론성 항체 OMS852 4PA-1을 추후 개발을 위해 선택하였고, OMS854로 지정하였다.

인간화된 항체 OMS854의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 아래에 제공한다. CDR(Kabat)은 밑줄로 표시한다.

OMS854 VH의 전체 서열:(서열 번호: 48)

OMS854 VL(인간화된)의 전체 서열(서열 번호: 47)

표 12에서 나타낸 것과 같이, VH CDR1이 적어도 하나의, 또는 선택적으로 2개의, 또는 선택적으로 3개의 히스티딘을 포함하도록 추후 변형을 VH CDR1에 대해 만들었다. 2개의 히스티딘을 가진 변이체를 OMS856으로 지정하였다. 3개의 히스티딘을 가진 변이체를 OMS858로 지정하였다.

OMS856 VH의 전체 서열(서열 번호:49)

OMS858 VH의 전체 서열(서열 번호:50)

서열 번호:65: 인간 IgG4 불변 영역

서열 번호: 66: S228P 돌연변이가 있는 인간 IgG4 불변 영역

서열 번호: 67: S228P 돌연변이 및 또한 낮은 pH에서 FcRn 상호작용을 촉진하는 돌연변이(Xtend)가 있는 인간 IgG4 불변 영역

서열 번호:68: 인간 IgK 불변 영역

서열 번호:69: OMS850 VH를 암호화하는 DNA(마우스 모체)

서열 번호:70: OMS860 VH를 암호화하는 DNA(마우스 모체)

서열 번호:71: OMS870 VH를 암호화하는 DNA(마우스 모체)

서열 번호 :72: OMS850 VL을 암호화하는 DNA(마우스 모체)

서열 번호:73: OMS860 VL을 암호화하는 DNA(마우스 모체)

서열 번호:74: OMS870 VL을 암호화하는 DNA(마우스 모체)

서열 번호:75: OMS852 VH를 암호화하는 DNA

서열 번호:76: OMS852 VL을 암호화하는 DNA

서열 번호:77: OMS854를 암호화하는 DNA

서열 번호:78: OMS856을 암호화하는 DNA

서열 번호:79: OMS858을 암호화하는 DNA

실시예 5

항체 OMS858는 렉틴 경로를 특이적으로 차단한다

막 공격 복합체(MAC) 침착에 미치는 mAb OMS858의 영향을 렉틴 경로, 고전적 경로 및 대체 경로에 대한 경로 특이적 조건을 사용하여 분석하였다. 이 목적을 위해, Wieslab COMPL300 보체 스크리닝 키트(Wieslab, Lund, Sweden)를 제조업체의 지침에 따라 사용하였다. 고전적 경로의 경우, 보체를 IgM 상에서 활성화하였다. 렉틴 경로의 경우, 보체를 만난 상에서 활성화하였으며, 대체 경로의 경우, 보체를 LPS 상에서 활성화하였다.

도 9A는 고전적 경로 특이적 검정 조건 하에서 항-MASP-2 항체 OMS858의 존재 또는 부재시 MAC 침착 수준을 그래프로 도시한다. 도 9B는 렉틴 경로 특이적 검정 조건 하에서 항-MASP-2 항체 OMS858의 존재 또는 부재시 MAC 침착 수준을 그래프로 도시한다. 도 9C는 대체 경로 특이적 검정 조건 하에서 항-MASP-2 항체 OMS858의 존재 또는 부재시 MAC 침착 수준을 그래프로 도시한다.

도 9B에서 나타낸 것과 같이, mAb OMS858은 대략 1 nM의 IC₅₀ 값으로 MAC 침착의 렉틴 경로 매개 활성화를 차단한다. 그러나, mAb OMS858은 고전적 경로 매개 활성화에 의해 개시된 MAC 침착(도 9A) 또는 대체 경로 매개 활성화로부터의 MAC 침착(도 9C)에는 영향을 미치지 못하였다. 고전적 경로를 억제하는 것으로 알려져 있는 항-C1s 항체(TNT003)가 대조군으로서 도 9A에 포함된다. 대체 경로를 억제하는 것으로 알려져 있는 항-인자 B 항체가 대조군으로서 도 9B 및 9C에 포함된다.

실시예 6

항체 OMS850, OMS858, OMS860, OMS870에 대한 MASP-2 결합 에피토프의 분석

항체 OMS858을 비오티닐화하여 여러 개의 상이한 MASP-2 항체와 동시에 결합하는 능력에 대해 Octet 생물층 간섭계 결합 검정으로 다음과 같이 테스트하였다.

항체 OMS858을 EZ-링크 설포-NHS-LC-비오틴(Fischer Scientific, A39257)을 사용하여 비오티닐화하였다. 슈퍼 스트렙타비딘(SSA) 바이오센서(Fortebio 18-5057)를 PBS에 15분 동안 실온에서 수화시켰다. 3 mL의 50 nM 비오티닐화된 OMS858을 BLI 칩 상에 포획한 후, hMASP-2-CCP1-CCP2-SP를 포획하였다. 5개의 테스트 항-MASP-2 항체 중 하나의 500 nM 용액을 고정화 완충액(PBS, 0.02% BSA, 0.05% Tween-20, pH 7.4)에서 제조하였다. 사용한 테스트 항체는 위에서 제조에 대해 기술된 OMS850, OMS860, 및 OMS870, 및 이전에 확인된 항-MASP-2 항체 OMS721, 및 4A8이었다.

제1 칼럼의 플레이트 웰에는 200 μL의 비오티닐화된 OMS858을 넣었고 다음 칼럼의 웰에는 200 μL의 hMASP-2-CCP1-CCP2-SP를 넣었다. 플레이트 상의 별도의 칼럼에, 200 μL의 500 nM 테스트 항체를 각 웰에 첨가하였다. 또한 테스트 항체 대신 비오티닐화되지 않은 OMS858 또는 완충액 단독을 사용하여 대조군을 수행하였다.

결합 검정은 다음 단계를 사용하여 Octet에서 수행하였다: 기준선 확립(60초), 비오티닐화된 OMS858의 로딩(180초), 기준선 확립(60초), hMASP-2-CCP1-CCP2-SP의 로딩(180초), 이어서 테스트 항체의 회합(300초) 및 해리(300초).

도 10에서 나타낸 것과 같이, 항체 OMS850, OMS860 및 OMS870은 OMS858에 의해 포획된 MASP-2에 결합할 수 없었고, 이것은 이들 항체가 MASP-2 상의 동일하거나 부분적으로 중복하는 에피토프에 결합하는 것을 나타낸다. 대조적으로, 이전에 확인된 항-MASP-2 항체 OMS721 및 4A8은 OMS858에 의해 포획된 MASP-2에 결합할 수 있었고, 이것은 이들 두 항체가 OMS850, OMS860, OMS870 및 OMS858보다 MASP-2 상의 상이한 에피토프에 결합하는 것을 나타낸다.

실시예 7

MASP-2 단백질 및 Fab mAb OMS858 복합체의 결정화

1. MASP-2 단백질 제조

UniProt O00187, 인간 만난 결합 렉틴 세린 프로테아제 2를 기반으로 재조합 MASP-2 단백질을 다음과 같이 제조하였다. 인간 MASP-2 CCP2-SP 및 CCP2-SP-6HIS에 대한 발현 구성물을 이. 콜라이에서의 재조합 발현을 위해 생성하였다. 이. 콜라이에서 MASP-2의 봉입체로서의 재조합 발현 및 단백질 정제를 문헌[Ambrus G. et al., 2003]에서 기술된 방법에 따라 약간 변형시켜서 수행하였다. HIS 태그 부착 버전의 경우, MASP-2 단백질(CCP2-SP-6HIS)을 Ni-NTA Superflow Cartridge Handbook(Qiagen, March 2007)에서 기술된 방법에 따르는 변성 조건을 사용하여 정제하였다.

MASP-2의 정제에는 문헌[Harmat et al., J. Mol. Biol. 2004;342:1533-1546; 및 Gal et al., J. Biol. Chem. 2005;280:33435-33444; 및 Ambrus et al. J Immunol. 2003 Feb 1;170(3):1374-82]에서 기술된 것과 같은 표준 방법을 사용하는 추출, 펼침, 재접힘 및 크로마토그래피가 포함되었다. 크기 배제 크로마토그래피 후에, 재조합 MASP-2 단백질을 스핀 농축기(Amicon NMWL 10 kDa)를 사용하여 5 mg/mL로부터 20 mg/mL로 농축하였다. 농축된 MASP-2 단백질 샘플을 급속 냉동하여 복합체 형성을 위해 해동할 때까지 보관하였다. 정제 및 절단을 쿠마시 블루 Simply Blue^TM Safe Stain(Invitrogen)에 의해 염색된 SDS-PAGE에 의해 모니터링하였다.

2. Fab mAb OMS858 단백질 제조

mAb OMS858을 제조업체의 지침에 따라 FAbALACTICA® Fab 키트를 사용하여 단백질 가수분해 절단에 적용함으로써 OMS858 Fab를 생성하였다.

3. MASP-2-Fab mAb OMS858 복합체 생성

Fab mAb OMS858 및 MASP-2 단백질 샘플을 등몰 농도로 1시간 동안 인큐베이션하였다. MASP-2-Fab mAb OMS858 복합체의 성공적인 생성을 분석용 크기 배제 크로마토그래피에 의해 검증하였다.

4. MASP-2-Fab mAb OMS858 복합체 결정화

결정화 실험을 상업적으로 이용 가능한 결정화 제형과 동등한 부피의 MASP-2-Fab mAb OMS858 복합체 용액을 조합함으로써 시팅 드롭(sitting drop), 증기 확산(vapor diffusion) 실험으로 설정하였다. MASP-2-Fab mAb OMS858 복합체 단백질 샘플을 5 내지 20 mg/mL의 단백질 농도로 사용하였다. MASP-2-Fab mAb OMS858 결정은 100 mM 아세트산 나트륨 pH 5.26, 200 mM 황산 암모늄, 10.45% PEG 2000 MME를 함유한 결정화 제형으로 2개월 미만 내에 나타났다. 결정을 한랭 루프로 포획하고, 결정화 제형 중의 20% 글리세롤로 동결보호한 후 액체 질소에서 급속 냉각하였다.

실시예 8

X선 결정학

실시예 7에서 기술된 것과 같이 제조된 MASP-2-Fab mAb OMS858 복합체 결정을 1.0 Å 파장의 신크로트론 X선으로 회절시키고 X선 회절 데이터세트를 Dectris Pilatus 및 Eiger 검출기를 사용하여 빔라인 SSRL BL9-2, BL14-1, BL12-2뿐만 아니라 ALS 섹터 5에서 수집하였다. MASP-2-Fab mAb OMS858 복합체 결정에 대한 결정 매개변수, 데이터 수집 및 정제 통계의 요약을 표 14에 제공한다. X선 구조를 탐색 모델로서 구조 1Q3X의 일부분 및 3C08의 일부분을 사용하여 분자 대체에 의해 결정하였고 Buster 2.10.2 또는 Refmac 5.8로 부분적으로 정제하였다. 전자 밀도를 Coot(Emsley et al., 2010)로 검사하고 MASP-2 및 Fab mAb OMS858의 밀도가 분명하게 보이고 R 인자가 충분할 때까지 반복적인 모델 구축 및 정제 사이클을 거쳤다; 이 지점에서 부분적인 정제가 완료된 것으로 간주하였고 리간드, 용매 및 단백질에 대한 모델을 검사하였다.

실시예 9

결정 구조 분석

정제된 구조를 단백질-단백질 및 -용매 상호작용 유형 및 거리에 대해, 수소 결합 도너와 억셉터 사이의 최대 거리에 대해 3.35 Å로 설정된 매개변수; 및 소수성 접촉과 임의의 접촉 사이의 비결합 접촉 매개변수, 예컨대 최대 접촉 거리가 3.90 Å인 반 데르 발스 상호 작용을 사용하여 분석하였다.

표 15는 mAb OMS858 및 MASP-2의 원자 사이의 H 결합을 나타낸다. 표 16은 '항체' 설정을 사용하여 결정학적 구조의 LigPlot+ 기반 분석에 의해 생성된 MASP-2 원자와 Fab mAb OMS858 원자와의 반 데르 발스 상호작용을 나타낸다. LigPlot+는 이들을 '비결합 접촉' 또는 '소수성 접촉'으로 부른다. 명칭에도 불구하고, 가능한 H 결합을 포함하는 원자 쌍이 있다. 그러므로, 일부 경우에, 표 16은 또한 H 결합 상호작용을 함유한다.

도 11은 MASP-2 세린 프로테아제 도메인과 Fab mAb OMS858의 배열 및 이들 사이의 접촉을 보여주는 개략도이다.

도 12A는 MASP-2의 SP 도메인에 다음 잔기: ASP496; LYS503; SER506; PRO507; HIS508 및 TRP513을 포함하는, mAb OMS858이 결합하는 MASP-2 에피토프를 보여주는 개략도이다. 도 12A에서 나타낸 것과 같이, OMS858이 결합하는 에피토프는 2개의 패치를 포함하는데, 첫 번째는 ASP496 및 TRP513을 포함하며 두 번째는 LYS503; SER506; PRO507 및 HIS508을 포함한다.

도 12B는 도 12A에서 도시된 MASP-2 에피토프에 결합하는 mAb OMS858의 파라토프를 보여주는 개략도이다. 도 12B에서 나타낸 것과 같이, 파라토프는 중쇄 및 경쇄로부터 기여된 2개의 연결된 상응하는 패치, 특히 중쇄 잔기 HIS33; ASP50; ASP52; ASP55; GLU57; HIS59 및 경쇄 잔기 TYR31; ARG30 및 TRP90을 포함한다.

다음과 같이 3개의 수소 결합 및 36개의 반 데르 발스 접촉이 있는 것으로 결정되었다:

도 13은 상응하는 결정학적 MASP-2-화합물 공동 구조로부터 유래된 모델을 사용하는, 수소 결합 계산 매개변수에 대한 설정(수소 결합 도너와 억셉터 사이의 최대 거리에 대해 3.35 Å; 및 소수성 접촉과 임의의 접촉 사이의 비결합 접촉 매개변수, 예컨대 최대 접촉 거리가 3.90 Å인 반 데르 발스 상호 작용)을 포함한 '항체' 모드를 사용하여 LigPlot+ 소프트웨어에 의해 계산된 mAb OMS858 파라토프와 MASP-2 에피토프 사이의 상호작용을 도시한다. 수소 결합 및 극성 접촉은 파선으로 표시되며 거리는 옹스트롬 단위로 제공된다.

결정학 데이터로부터 화합물 원자와 상호작용하는 아미노산에 대한 원자뿐만 아니라 충분한 2fo-fc 전자 밀도를 갖는 화합물 원자가 도시된다. MASP-2 아미노산 잔기 넘버링(MASP-2 AA#)은 Uniprot 승인 코드 O00187을 따르고, 아미노산에 대한 원자 넘버링(AA 원자)은 단백질 데이터 뱅크(Protein Data Bank)에 의해 확립된 관례를 따르며 표 15 및 16의 것에 상응한다.

OMS858 아미노산 잔기 넘버링은 서열 번호:50으로서 제시된 VH에 따르며 VL은 서열 번호:47로서 제시된다. 중쇄 가변 영역(루프 H1, 루프 H2) 및 경쇄 가변 영역(루프 L3, 루프 L1)을 포함하는 OMS858 파라토프는 도 13에서 대시선 위에 도시되며 MASP-2 에피토프는 도 13에서 대시선 아래에 도시된다. 도 13에 도시된 아미노산 중 특정 아미노산은 방사선이 있는 활모양이며, 이것은 아미노산이 다른 아미노산의 원자와 반 데르 발스 상호작용(점선)을 가지는 것을 나타낸다. 수소 결합 및 극성 접촉은 파선으로 도시되며 거리는 옹스트롬 단위로 제공된다. 탄소 원자는 속이 꽉 찬 원형으로 도시되고; 질소 원자는 십자선이 있는 개방 원형으로 도시되며; 산소 원자는 x가 있는 개방 원형으로 도시된다. X선 구조에서 OMS858의 아미노산 Glu57 및 Arg30의 측쇄만이 부분적으로 용해되었다. 그러므로, 백본의 근접성을 감안하면, OMS858의 추가의 수소 결합 및 이온성 상호작용이 MASP-2 상에서 반대쪽 잔기를 가진 OMS858의 VH GLU57과 VL ARG30 사이에 존재할 가능성이 있다. 구체적으로, OMS858의 VL ARG30은 MASP-2의 ASP496에 이온성 결합을 형성할 수 있고 OMS858의 VL ARG30은 MASP-2의 TRP513의 방향족 모이어티와 π-π 스태킹 상호작용을 형성할 수 있으며 OMS858의 VH GLU57은 MASP-2의 LYS503의 아미노 기와 이온성 결합 또는 수소 결합을 형성할 수 있다.

도 13에서 나타낸 것과 같이, OMS858은 잔기: MASP-2의 LYS503에 대한 VH 결합에서 ASP52 및 ASP55 및 MASP-2의 HIS508에 대한 VL 결합에서 ASP50와의 3개의 H 결합을 통해 MASP-2에 결합한다. 도 13에서 추가로 나타낸 것과 같이, OMS858은 MASP-2의 SER506 및 PRO507에 대한 VH의 HIS33; MASP-2의 LYS503에 대한 VH의 ASP52, ASP55 및 GLU57; MASP-2의 HIS508에 대한 VH의 HIS59 및 ASP50, HIS508에 대한 VL의 TRP90; MASP-2의 TRP513에 대한 VL의 ARG30 및 MASP-2의 TRP513 및 ASP496에 대한 VL의 TYR31 사이의 반 데르 발스 접촉을 통해 MASP-2에 결합한다.

특정 측면으로, MASP-2 억제 항체는 MASP-2의 다음 잔기: SER506, PRO507, LYS503; HIS508; TRP513; ASP496 및 이것들의 조합 중 1, 2, 3, 4, 5, 6개, 또는 전부와 반 데르 발스 접촉을 통해 상호작용한다. 특정 측면으로 MASP-2 억제 항체는 MASP-2의 다음 잔기: LYS503 및 HIS508 중 1 또는 2개와 수소 결합을 통해 상호작용한다.

도 14A는 OMS858이 결합하는 ASP496, LYS503, SER506, PRO507, HIS508 및 TRP513을 포함하는 MASP-2 에피토프의 삼차원 구조를 도시한다. 도 14A에서 나타낸 것과 같이, 인간 MASP-2(서열 번호:1)의 아미노산 잔기 496-513에 상응하는, DIRMGTLKRLSPHYTQAW(서열 번호:6)로서 제시된 전체 MASP-2 에피토프는 단일 항-병렬 베타 가닥-루프-베타 가닥 요소 상에 위치한다.

도 14B는 MASP-2가 결합하는 중쇄의 HIS33, ASP50, ASP52, ASP55, GLU57, 및 HIS59 및 경쇄의 ARG30, TYR31 및 TRP90을 포함하는 OMS858 파라토프의 삼차원 구조를 도시한다. HIS33은 루프 H1 상에 위치한다. ASP50, ASP52, ASP55, GLU57, HIS59는 항-병렬 베타 가닥-루프-베타 가닥 요소를 형성한다. TYR31 및 ARG30은 경쇄의 루프 1 상에 있고, TRP90은 경쇄의 L3 루프 상에 있다.

도 15는 MASP-2 에피토프 DIRMGTLKRLSPHYTQAW(서열 번호:6)와 OMS858의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역 사이의 접촉을 도시한다. 특히, 도 15에서 나타낸 것과 같이, 중쇄 가변 영역 잔기 ASP55, GLU57 및 ASP52는 MASP-2의 LYS503과 상호작용하고; 중쇄 가변 영역 잔기 HIS33, HIS59 및 ASP50은 MASP-2의 SER506, HIS508 및 PRO507과 상호작용한다. 도 15에서 추가로 나타낸 것과 같이, 경쇄 가변 영역 잔기 TRP90은 MASP-2의 PRO507 및 HIS508과 상호작용하고 경쇄 가변 영역 잔기 ARG30 및 TYR31은 MASP-2의 ASP496 및 TRP513과 상호작용한다.

특정 측면으로, 서열 번호:1의 MASP-2 SP 아미노산 잔기 496-513(DIRMGTLKRLSPHYTQAW, 서열 번호:6으로 제시됨)은 반 데르 발스 상호작용을 통해 OMS858과 상호작용한다. 반 데르 발스 상호작용에는 영구적인 또는 일시적인 전기 쌍극자 모멘트의 상호 작용으로부터 발생하는 비대전 분자 사이의 약한, 단거리의 정전기적 인력이 포함된다.

표 16에서 나타낸 것과 같이, OMS858 LC ARG30 원자 CB는 TRP513의 MASP-2 원자 CZ2 및 CE2와 상호작용한다. LC TYR31 원자 CE2는 TRP513의 MASP-2 원자 CH2와 상호작용한다. HC HIS59 원자 CD2, NE2, CE1, ND1 및 CG는 HIS508의 MASP-2 원자 CD2와 상호작용한다. HC ASP50 원자 OD2는 HIS508의 MASP-2 원자 CD2와 상호작용한다. LC TRP90 원자 CH2는 HIS508의 MASP-2 원자 NE2와 상호작용한다. HC HIS59 원자 CD2, CG 및 CB는 HIS508의 MASP-2 원자 NE2와 상호작용한다. HC ASP50 원자 OD2는 HIS508의 MASP-2 원자 CD2 및 CE1과 상호작용한다. LC TRP90 원자 CZ2는 HIS508의 MASP-2 원자 CE1과 상호작용한다. HC HIS59 원자 CE1, ND1, CG, CB 및 OD2는 HIS508의 MASP-2 원자 CE1과 상호작용한다. HC HIS59 원자 CE1 및 CG는 HIS508의 MASP-2 원자 ND1과 상호작용한다. HC HIS59 원자 NE2, CE1 및 ND1은 HIS508의 MASP-2 원자 CG와 상호작용한다. HC HIS59 원자 ND1은 HIS508의 MASP-2 원자 CG와 상호작용한다. HC HIS59 원자 CE1은 HIS508의 MASP-2 원자 CB와 상호작용한다. HC ASP50 원자 CG는 HIS508의 MASP-2 원자 NE2와 상호작용한다. HC HIS33 원자 CE1 및 ND1은 PRO507의 MASP-2 원자 CD와 상호작용한다. HC HIS33 원자 CE1은 SER506의 MASP-2 원자 CA와 상호작용한다. HC GLU57 원자 CB는 LYS503의 MASP-2 원자 NZ와 상호작용한다. HC ASP55 원자 CG는 LYS503의 MASP-2 원자 NZ와 상호작용한다. HC ASP52 원자 CB는 LYS503의 MASP-2 원자 NZ와 상호작용한다. HC ASP55 원자 OD2는 LYS503의 MASP-2 원자 CE와 상호작용한다. HC ASP52 원자 OD2는 LYS503의 MASP-2 원자 CE 및 CD와 상호작용한다. LC TYR 31 원자 CE2는 ASP496의 MASP-2 원자 OD2와 상호작용한다.

요약하면, MASP-2 억제 항체 OMS858의 결정 구조 분석은 이 항체가 인간 MASP-2 세린 프로테아제 도메인의 신규한 에피토프 ₄₉₆DIRMGTLKRLSPHYTQAW₅₁₃(서열 번호:6)에 결합하는 것을 보여준다. 이 에피토프 결합 도메인은 세린 프로테아제 활성 트라이애드 영역(잔기 HIS483, ASP532 및 SER633)과 구별되는 것이 주지된다. 인간 MASP-2 세린 프로테아제 도메인의 신규한 에피토프 ₄₉₆DIRMGTLKRLSPHYTQAW₅₁₃(서열 번호:6)와 잔기 LYS503 및 TRP513을 포함하는 MASP-2 상의 C4 상호작용 부위 사이에 중복이 있는 것이 추가로 주지된다(Kidmose et al., Proc Natl Acad Sci USA 109:15425 (2012) 참고). 그러므로, 인간 MASP-2의 LYS503 및 TRP513 잔기는 OMS858 및 C4 둘 다의 결합에 관여하도록 결합할 수 있다.

도 11-15에 도시된 것과 같이 mAb OMS858과 MASP-2의 배열은 표준 항체-항원 인식 형식의 배열을 따르며 렉틴 경로 활성이 MASP-2에 대한 결합에 대해 OMS858이 C4와 경합하는 것을 통해 억제되는 작용 메커니즘을 함축한다.

비록 이런 결정 구조 분석이 실시예 6에서 증명된 것과 같이 MASP-2- Fab mAb OMS858 복합체에 대해 수행되었을뿐만 아니라, 예상과 같이 OMS858과 교차 경합하는 모 mAb OMS858에 대해서도 수행되었지만, mAb OMS860 및 mAb OMS870은 또한 OMS858과 교차 경합한다. 그러므로, OMS860 및 OMS870의 결합 에피토프는 MASP-2- Fab mAb OMS858 복합체 분석에 의해 확인된 MASP-2 세린 프로테아제 상의 에피토프와 동일하거나 중복된다. 대조적으로, MASP-2 억제 항체 4A8 및 OMS721은 OMS858과 교차 경합하지 않으며, 그러므로 MASP-2 상의 별도의 에피토프에 결합한다.

실시예 10

OMS858 결합에서 HIS508의 역할을 분석하기 위한 개 유사 인간 MASP-2의 생성

실시예 9에서 기술된 것과 같이, MASP-2/OMS858 복합체의 구조적 관찰은, HIS508이 ASP50에 대한 H 가교 및 TRP90 및 HIS59에 대한 파이 상호작용을 통해 OMS858의 가변 도메인의 중쇄 및 경쇄 둘 다와 상호작용하기 때문에, 그것이 결합 에피토프의 핵심 측쇄인 것을 보여준다.

도 16은 인간 MASP-2의 MASP-2 세린 프로테아제(SP) 도메인(서열 번호:1의 aa 445 내지 686); 시노몰구스 원숭이 MASP-2(서열 번호:4의 aa 445 내지 686); 개 MASP-2(서열 번호:5의 aa 445 내지 686); 마우스 MASP-2(서열 번호:2의 aa 444 내지 685): 및 래트 MASP-2(서열 번호:3의 aa 444 내지 685)의 아미노산 정렬이다.

서열 번호:1: 인간 MASP-2:(NP_006601.2)

서열 번호:2: 마우스 MASP-2(NP_001003893.1)

서열 번호:3: 래트 MASP-2(NP_742040.1)

서열 번호:4: 시노몰구스 MASP-2(XP_005544869.1) 예측

서열 번호:5: 개 MASP-2(XP_544572.4)

시노몰구스 원숭이 및 마우스로부터 재조합 MASP-2 단백질을 제조하여 OMS858 항체의 종 교차 반응성을 평가하였다. 인간 MASP-2의 촉매성 단편(CCP1-CCP2-SP 도메인)을 암호화하는 DNA를 Phusion 고신뢰성 DNA 중합효소(New England BioLabs)를 사용하여 PCR 증폭하고 In-Fusion HD 클로닝 키트(Clontech)를 사용하여 pET-17b 벡터(Novagen)에 클로닝하였다. 6xHis-태그를 정제를 위해 폴리펩타이드의 C 말단에 부착하였다. 시노몰구스 원숭이 및 마우스의 유사한 MASP-2 발현 구성물을 또한 제조하였다.

더불어, 인간 MASP-2의 "개 유사" 변이체를 제조하였다. OMS858은 개 혈청에서 렉틴 경로 활성화를 억제하지 않는 것으로 나타났다(데이터 미도시). 도 16에서 나타낸 것과 같이, 개 MASP-2와 인간 MASP-2는 서열이 다르다. 하나의 그러한 변이는 개 MASP-2에서는 GLN인 인간 MASP-2의 HIS508에 상응하는 잔기에서 발생한다. 개 MASP-2에서 글루타민은 인간 MASP-2에서 히스티딘과 상호작용하는 파라토프의 두 아미노산 중 하나와만 잘 상호작용하는 것으로 예측되며, 이것은 인간 MASP-2와 비교하여 개 MASP-2와 OMS858 사이의 상호작용을 약화시키는 효과가 있다. 인간 MASP-2의 개 유사 변이체를 생성하기 위하여, H508Q 돌연변이를 PCR 기반 부위 지정 돌연변이생성에 의해 PfuUltra II 융합 HS DNA 중합효소(Agilent)를 사용하여 도입하였다. 결정 구조 데이터를 기반으로, OMS858은 이 MASP-2 H508Q 돌연변이에 대해 야생형 인간 H508과 비교하여 더 낮은 친화도를 가질 것으로 예상되었다.

모든 발현 구성물을 BL21(DE3)pLysS 이. 콜라이(Invitrogen)에 형질전환시키고 재조합 단백질을 제조업체의 프로토콜에 따라 발현시키고 고정화된 금속 친화성 크로마토그래피(IMAC)에 의해 니켈 칼럼을 사용하여 정제하였다. 단백질 통합성 및 정제된 단백질의 효소 활성을 각각 SDS-PAGE 및 펩타이드 절단 검정에 의해 평가하였다.

생물층 간섭계(BLI)를 적용하여 다중 MASP-2 단백질에 대한 OMS858 항체 결합을 분석하였다. 모든 측정을 검정 완충액으로서 1% BSA 및 0.02% Tween 20을 함유하는 PBS를 사용하여 Octet RED96 시스템(ForteBio)으로 수행하였다. OMS858(50 nM)을 먼저 항-인간 Fc 포획 바이오센서(ForteBio) 위로 로딩하였다. 기준선의 1 단계 후, 포획한 센서를 회합 단계를 위해 상이한 농도의 표적 단백질(1.6-50 nM)을 함유한 웰에 담근 후(120초), 해리 단계를 위해 빈 웰에 옮겼다(200초). 모든 실험에서, 포획된 항체의 자연적인 해리를 보상하기 위해 단일 참조 빼기를 허용하기 위해 포획된 센서를 또한 분석물이 함유되어 있지 않은 웰에 담갔다. 기록된 결합 센소그램을 Octet 데이터 분석 소프트웨어(ForteBio)로 분석하여 결합 친화도(KD)를 결정하였다.

표 17에서 나타낸 것과 같이, H508Q "개 유사" 돌연변이를 가진 인간 MASP-2는 결합 친화도를 대략 450배 감소시켰다.

실시예 11

시노몰구스 원숭이 연구: OMS856 및 OMS858의 PK/PD

나이브 시노몰구스 원숭이(n=3마리)에게 정맥내 또는 피하로 1.5 mg/kg의 OMS856 및 OMS858을 투여하였다. 혈액 샘플을 각 동물로부터 -7일 째에 및 그런 후 용량 후 0.083, 1, 4, 24, 72, 168, 240, 336, 504, 672, 840 및 1008시간에 수집하여 렉틴 경로 활성의 존재 및 투여된 항체의 양에 대해 테스트하였다.

렉틴 경로 검정을 5 μg/ml 만난으로 코팅된 ELISA 플레이트에서 4℃에서 밤새도록 수행하였다. 그런 후 플레이트를 PBS 중의 1% BSA로 실온에서 2시간 동안 차단하였다. 시노몰구스 혈청을 PBS로 2배 희석하여 만난 코팅된 웰에 첨가하고 4℃에서 14분 동안 인큐베이션하였다. 그런 후에, 플레이트를 PBS/tween-20으로 3회 세척하고 C4 침착을 토끼 항-인간 C4c(Dako)에 의해 조사한 후 염소 α-토끼 HRP(Southern Biotech)를 첨가하였다.

도 17A 및 도 17B는 1.5 mg/kg OMS856 또는 OMS858의 각각의 정맥내 투여 후 시노몰구스 원숭이의 시간 대비 렉틴 경로 활성을 그래프로 도시한다.

도 18A 및 도 18B는 1.5 mg/kg OMS856 또는 OMS858의 각각의 피하 투여 후 시노몰구스 원숭이의 시간 대비 렉틴 경로 활성을 그래프로 도시한다.

도 17A 및 도 18A에서 나타낸 것과 같이, 시노몰구스 원숭이는 1.5 mg/kg OMS856의 정맥내 및 피하 투여 후 지속적인 전신적 렉틴 경로 억제를 나타낸다.

도 17B 및 도 18B에서 나타낸 것과 같이, 시노몰구스 원숭이는 1.5 mg/kg OMS858의 정맥내 미 피하 투여 후 지속적인 전신적 렉틴 경로 억제를 나타낸다.

실시예 12

혈전증의 마우스 모델에서 OMS858의 분석

마우스에서 염화 제2철 유도 경동맥 폐쇄 모델에서 OMS858의 최소 유효 용량 및 최대 효과를 결정하기 위해 연구를 수행하였다.

수컷 C57B1/6 마우스의 좌측 경동맥을 노출시키고 Transonic사의 소형 유동 탐침(0.7 mm)을 혈관 주위에 설치하였다. 테스트 화합물 투여 후, 3.5% FeCl₃으로 포화된 여과지 조각(1.5 mm x 1 mm)을 적용함으로써 혈전 형성을 유도하였다. 여과지를 혈관의 외측 표면과 접촉하는 경동맥에 직접 배치하였다. 3분의 노출 후에, 여과지를 제거하고, 혈관을 식염수로 세척하였다. 혈관이 완전히 폐쇄될 때까지 또는 최대 약 45분의 기간 동안 경동맥 혈액 흐름을 계속해서 기록하였다. 폐쇄까지의 시간(TTO)을 FeCl₃을 적용한 때로부터 혈액 흐름이 적어도 30초 동안 0.1 mL/분 미만으로 떨어질 때까지 또는 신호 진폭이 탐침에 의한 심장 박동 시각화를 방지하기에 충분히 감소될 때까지의 시간으로서 정의하였다. 45분 관찰 기간이 끝날 때 폐쇄되지 않은 혈관을 45분의 TTO로 채점하였다.

마우스(각 용량 그룹에 대해 n=8마리)에게 OMS858을 연구 전 24시간 전에 다음 투여량으로 피하로 투여하였다: 1 mg/kg, 3 mg/kg, 10mg/kg 및 30 mg/kg. 30 mg/kg의 아세틸살리실산(ASA)을 FeCl₃ 도전 전 1시간 전에 투여하여 양성 대조군으로서 사용하였다. 관련이 없는 항체를 음성 대조군으로서 사용하였다.

결과를 표 18에 나타내며 도 19에 그래프로 도시한다. 표 18 및 도 19에서 나타낸 것과 같이, OMS858의 최대 효과는 ASA와 비슷하였다. 표 18 및 도 19에서 추가로 나타낸 것과 같이, OMS858은 최저 테스트 투여량(1 mg/kg)에서 효과적이었다. 비히클 처리된 대조군 마우스에서 TTO는 14.7 ± 4.6분이었다. 예상과 같이, ASA로의 전처리는 TTO를 36.4 ± 5.7분까지 상당히 연장시킨 반면, 아이소타입 대조군 항체로의 전처리는 TTO를 유의하게 연장시키지 못하였고(9.3 ± 1.5분), 이것은 테스트 시스템의 적합성을 확인시켜준다. 1, 3, 10 및 30 mg/kg의 용량의 OMS858로의 마우스의 전처리는 비히클 그룹과 비교하여 TTO를 상당히 연장시켰다(각각 40.4 ± 4.6, 37.0 ± 5.2, 39.1 ± 3.9분 및 37.4 ± 5.0). 평가된 OMS858 용량 중에서 분명한 용량-반응 관계는 관찰되지 않았고, 이것은 이 마우스 모델에서 1 mg/kg 피하의 용량 수준에서 최대 약물학적 효과가 달성될 수 있음을 나타낸다.

* 비히클 대조군과 비교하여 p < 0.05; p 값을 단측, 쌍을 이루지 않은 t-테스트를 사용하여 생성함; ASA = 아스피린; N = 마우스의 수/처리 그룹; SEM = 평균의 표준 오차; TTO = 폐쇄까지의 시간

실시예 13

인간 혈청에서 고전적, 렉틴, 및 대체 경로 유도된 C5b-9 활성화에 미치는 OMS858의 영향

OMS858에 의한 렉틴 경로 억제의 기능적 선택성을 평가하기 위하여 Wieslab® 보체 시스템 스크리닝 키트를 사용하였다. OMS858의 기능적 활성을 인간 혈청 샘플과 연속 희석된 OMS858과의 예비 인큐베이션 후 경로 특이적 검정 조건 하에서의 보체 활성화 및 C5b-9 침착의 정량화에 의해 평가하였다.

경로 특이적 검정 완충액으로 희석된 인간 혈청 샘플을 OMS858의 연속 희석과 예비 인큐베이션한 후, 고전적 경로 특이적(A), 렉틴 경로 특이적(B) 또는 대체 경로 특이적(C) 보체 활성자로 사전 코팅된 적절한 Wieslab® 검정 웰에서 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 말단 보체 활성화 생성물 C5b-9(MAC로도 언급됨)의 침착을 C5b-9 네오항원에 특이적인 알칼리성 포스파타제 콘쥬게이션된 항체를 사용하여 정량화하였다.

도 20A-20C에서 나타낸 것과 같이, OMS858은 최대 500 nM 농도에서 C5b-9의 고전적 또는 대체 경로 유도 활성화에 영향을 미치지 않으면서 C5b-9의 렉틴 경로 유도 활성화를 0.81 nM(121.5 ng/mL)의 IC₅₀ 값으로 억제하였다.

실시예 14

인간 MASP-2에 결합하는 단클론성 항체 OMS858의 추가 특성화

표면 플라즈몬 공명(SPR)을 사용하여 고정화된 OMS858을 가진 인간 MASP-2의 유동상 자이모겐 및 촉매적 활성 형태의 상호작용에 대한 회합 및 해리 속도 상수(각각 kon 및 koff)를 결정하였다. 상호작용의 상세한 특성화를 위해 최적화된 방법론 및 농도 시리즈를 사용하였고, 얻어진 속도 상수를 사용하여 OMS858-MASP-2 상호작용에 대한 해리 평형 상수(KD)를 계산하였다.

OMS858에 결합하는 촉매적 활성 MASP-2의 k_on 및 k_off는 각각 3.38 x 10⁷M^-1s^-1 및 9.71 x 10^-3s^-1이었고, 287 pM의 K_D 값을 유발하였다. OMS858에 결합하는 자이모겐 MASP-2에 대한 k_on 및 k_off는 각각 2.41 x 10⁵M^-1s^-1 및 1.72 x 10^-4s^-1이었고, 715 pM의 K_D 값을 유발하였다. 표 19를 참고한다.

MASP-2에 대한 OMS858의 결합 특이성을 고상 효소 결합 면역흡착 검정(ELISA)에 의해 평가하였다. 재조합 인간 MASP-2 또는 C1r, C1s, CFD, MASP-1 및 MASP-3을 폴리스티렌 플레이트 상에 고정시키고, OMS858 결합의 용량-반응을 측정하였다. 외관상 해리 상수(KD)를 4-매개변수 로지스틱 모델을 사용하여 비선형 회귀에 의해 추정하였다.

2개의 상이한 OMS858 로트를 테스트하였다. 인간 MASP-2에 대한 OMS858 결합의 평균 외관상 KD는 0.047 μg/mL이었다. C1r, C1s, MASP-1, MASP-3 또는 인자 D에 대한 유의한 결합은 최대 100 μg/mL의 OMS858 농도에서 관찰되지 않았고, 이것은 OMS858이 보체 시스템의 밀접하게 관련된 세린 프로테아제보다 MASP-2에 대해 적어도 2000배 선택성을 가지는 것을 나타낸다. 배수 선택성을 K_D(관련된 세린 프로테아제)/평균 K_D(MASP-2)로서 계산하였다. 표 20을 참고한다.

실시예 15

다양한 포유류 종에서 단클론성 항체 OMS858 기능적 활성의 특성화

50% 혈청에서 렉틴 의존성 C4 활성화를 측정하는 효소 결합 면역흡착 검정(ELISA)을 사용하여 인간, 시노몰구스 원숭이, 개, 토끼로부터의 혈청 및 마우스 히루딘 혈장에서 OMS858의 기능적 효능을 특성화하였다. OMS858의 기능적 활성을 각각의 종으로부터의 혈청 또는 히루딘 혈장 샘플을 연속적으로 희석된 OMS858과 예비 인큐베이션한 후 혼합물을 만난 코팅된 ELISA 플레이트 웰에 첨가하여 시험관내에서 렉틴 의존성 C4 활성화를 이끌어냄으로써 평가하였다. MASP-2 활성의 OMS858 억제의 기능적 효능을 렉틴 경로 억제 농도-반응 곡선을 분석하고 IC₅₀ 값을 결정함으로써 추정하였다.

인간 혈청에서, OMS858은 1.09　nM(164　ng/mL)의 평균 IC₅₀ 값으로 렉틴 의존성 보체 활성화의 강력한 억제를 입증하였다. 시노몰구스 원숭이 혈청 및 마우스 혈장에서 측정된 렉틴 경로 활성화의 억제에 대한 OMS858의 평균 IC₅₀ 값은 각각 44.1 nM(6.620　μg/mL) 및 11.9 nM(1.79　μg/mL)이었다. 대조적으로, OMS858은 최대 500 nM의 농도에서 토끼 및 개로부터의 혈청에서 렉틴 의존성 보체 활성화를 인지할 수 있을 정도로 억제하지 못하였다. 표 21을 참고한다. 마우스 및 시노몰구스 원숭이 기능적 효능을 인간의 그것과 비교하여 OMS858이 인간에 비교하여 이들 종에서 각각 10.9배 및 40.5배 더 낮은 기능적 효능을 가지는 것을 입증하였다. 인간에 비교한 효능을 인간 혈청으로 얻어진 IC₅₀에 대한 문제 종의 IC₅₀ 값의 비율로서 계산하였다. 표 22를 참고한다.

실시예 16

마우스 및 시노몰구스 원숭이에서 OMS858의 약력학

PD 활성(렉틴 경로 활성의 억제)을 만난 코팅된 표면에 대한 혈청의 생체외 노출 후에 전기화학발광 면역검정(ECLIA)을 사용하여 보체 활성화를 평가함으로써 측정하였다. 마우스에서, 개별적인 동물 보체 활성화 단편 침착을 기준선/대조군 동물에서 수집된 샘플 중의 평균 보체 활성화 단편 침착과 비교하였고, 데이터를 퍼센트 억제로서 표시하였다. 원숭이에서, 개별적인 C4 침착 데이터를 개별적인 동물의 기준선 반응과 비교하였고 퍼센트 억제로서 표시하였다.

마우스에 대한 결과를 도 24에 도시한다. ECLIA에 의해 측정된 바 마우스에서 기준선 LP 활성에 높은 가변성이 있었다. 0.1 mg/kg에서는 검출 가능한 PD 효과가 없었다. 그러나, 평균 MASP-2 억제는 0.3 mg/kg 피하 용량 그룹에서 용량 후 최대 72시간까지, 1 mg/kg 정맥내 용량 그룹에서 용량 후 최대 504시간까지, 그리고 1 및 3 mg/kg 피하 용량 그룹에서 용량 후 최대 1008시간까지 50%보다 컸다. 용량 수준의 증가에 따라 효과 기간이 증가되는 경향 외에, 더 높은 OMS858 농도에서 MASP-2 억제가 증가되는 경향이 있었다. 6 μg/mL보다 큰 OMS858 농도(1 mg/kg 정맥내 및 피하 및 3 mg/kg 피하 용량 그룹에서 달성됨)는 지속적으로 50%보다 큰 MASP-2 억제로 이어졌다. 이들 데이터는 1 mg/kg 이상의 용량 수준의 OMS858이 연장된 기간 동안 마우스에서 MASP-2 활성의 실질적인 억제를 지속적으로 달성하는 것을 시사한다.

수컷 시노몰구스 원숭이(n=3마리/그룹)에게 0.1, 0.3, 1, 또는 3 mg/kg OMS858을 피하(SC) 주사에 의해, 또는 1 mg/kg을 정맥내(IV) 주사에 의해 투여하였다. OMS858 농도 및 OMS858 약력학적 활성의 측정을 위한 혈청 샘플을 용량 전 및 용량 후 0.083, 1, 4, 24, 48, 72, 168, 240, 336, 504, 672, 840, 1008, 1176, 1344, 1512, 1680, 1848, 및 2016시간에 수집하였다.

원숭이에 대한 결과를 도 21에 도시한다. 렉틴 경로 활성의 대략적으로 70-80% 억제가 OMS858 투여 후 24시간 내지 48시간에 시작하여 용량 후 대략 336시간 동안 지속된 것을 1 mg/kg의 OMS858을 피하로 투여한 시노몰구스 원숭이에서 관찰하였고, 그 이후에 시간 경과에 따라 억제는 점점 감소하였다. OMS858 투여 후 약 24시간에 시작하여 용량 후 대략 672시간 동안 지속된 거의 완전한(>95%) 렉틴 경로 활성 억제를 3 mg/kg의 OMS858을 피하로 투여한 시노몰구스 원숭이에서 관찰하였다. 거의 완전한 렉틴 경로 활성의 억제는 또한 1 mg/kg의 OMS858을 정맥내 투여한 후 관찰하였고, 최대 효과 기간 및 시간에 따른 점진적 감소는 1 mg/kg 피하에서 관찰된 것과 유사하였다.

시노몰구스 원숭이에서 대략 20 μg/mL을 초과하는 OMS858의 혈청 농도가 높은 정도(>80%)의 렉틴 경로 활성 억제를 초래한 반면 대략 3 μg/mL 미만의 혈청 농도는 최소 억제를 초래하는, OMS858 혈청 농도와 PD 활성 사이에 일관된 관계가 있었다. OMS858 혈청 농도의 모델링 및 PD 반응 데이터는 대략 9 μg/mL의 EC₅₀ 값(최대 절반의 렉틴 경로 억제를 초래하는 OMS858 농도)을 가지는 S자형 약물 농도-반응 프로파일을 나타냈다. 도 22를 참고한다.

실시예 17

마우스 및 시노몰구스 원숭이에서 OMS858의 약동학

0.1, 0.3, 1, 또는 3 mg/kg의 단일 피하 투여 또는 1 mg/kg의 단일 정맥내 볼루스 투여 후 OMS858의 PK를 수컷 CD-1 마우스 및 수컷 시노몰구스 원숭이에서 특성화하였다. 혈액 샘플을 마우스에서(N = 3마리/그룹/시점; 터미널 샘플링) 용량 전 및 용량 후 0.083(정맥내 단독), 24, 48, 72, 168, 240, 336, 504, 672, 840, 1008, 1176, 및 1344시간 후에 수집하였을뿐만 아니라, 원숭이에서 용량 전 및 용량 후 대략 0.083, 1, 4, 24, 48, 72, 168, 240, 336, 504, 672, 840, 1008, 1176, 1344, 1512, 1680, 1848, 및 2016시간 후에 수집하였다(N = 3마리/그룹/시점; 시리즈 샘플링).

마우스 및 원숭이에게 피하 또는 정맥내 주사에 의해 OMS858을 단일 투여한 후 측정된 PK 매개변수의 요약을 표 23에 나타낸다. 마우스(왼쪽 패널) 및 원숭이(오른쪽 패널)에게 단일 정맥내 또는 피하 투여 후 시간 경과에 따른 평균 OMS858 혈청 농도의 플롯을 도 23에 도시한다.

단일 피하 투여 후에, 최대 농도가 도달한 중앙값 시간(t_max)은 마우스에서 용량 후 24시간 내지 168시간이었고 원숭이에서 용량 후 72시간 또는 168시간이었다. 단일 피하 또는 정맥내 투여 후에, OMS858의 제거 시간 t_1/2은 마우스에서 203시간 내지 409시간이었고 원숭이에서 196시간 내지 487시간이었다. 관찰된 최대 농도(C_max) 및 총 노출(무한대로 외삽된 시간-농도 곡선 아래의 면적 [AUC_INF])은 마우스 및 원숭이에서 일반적으로 용량 비례 방식으로 용량에 따라 증가하였다. 1 mg/kg OMS858의 단일 피하 투여 후 총 노출(AUC_INF)을 사용하여 결정된 생체내 이용 가능성은 마우스에서 85.7% 및 원숭이에서 93.0%였다.

a 시간 데이터 대비 복합 평균 농도를 기반으로 한 수컷 마우스에 대해 기록된 혈청 매개변수.

b 1 mg/kg 용량 수준에서만 정맥내 그룹에 대해 결정됨.

c 생체내 이용 가능성 = AUC_INF 피하 / AUC_INF 정맥내.

d 수컷 원숭이에 대해 기록된 평균 혈청 매개변수.

AUC_(0-336h) = 용량 후 0 내지 336시간의 시간-농도 곡선 아래의 면적; AUC_{(0 336h)}/ 용량 = 용량 후 0 내지 336시간의 시간-농도 곡선 아래의 용량 표준화된 면적; AUC_(0-t) = 0 내지 t시간(마지막으로 측정된 시점)의 시간-농도 곡선 아래의 면적; AUC_INF = 무한대로 외삽된 시간-농도 곡선 아래의 면적; C₀ = 시간 0에서 추정된 농도; C_max = 최대 관찰 농도; C_max / 용량 = 용량 표준화된 최대 관찰 농도; h = 시간(들); NA = 적용할 수 없음; SC = 피하; IV = 정맥내; t½ = 말단 반감기; t_last = 마지막 측정 가능한 시점; t_max= 최대 농도에 도달된 시간; Vss = 정상 상태에서의 분포 부피; Vz = 말단 제거 단계를 기반으로 한 분포 부피.

실시예 18

건강한 인간 대상체에서 OMS858의 1기 단일 용량 임상 연구

건강한 대상체에서 OMS858의 정맥내(IV) 및 피하(SC) 투여의 단일 상승 용량 맹검 연구를 수행하여 위약에 비교한 안전성, 내약성, PK, PD, 및 면역원성을 평가한다. 총 48명의 건강한 인간 지원자를 각각 8명의 피험자의 6개 코호트로 나눈다. 각 코호트에서, 6명의 피험자에게 OMS858을 투여하고 2명의 피험자에게는 위약을 투여한다. 용량을 투여한 피험자 및 의료 종사자 모두 어떤 피험자가 OMS858을 받고 위약을 받는지와 관련하여 맹검 상태이다. 6개 코호트의 투약은 다음과 같다:

· 코호트 1: 0.01 mg/kg OMS858 또는 위약의 단일 정맥내 용량

· 코호트 2: 0.03 mg/kg OMS858 또는 위약의 단일 정맥내 용량

· 코호트 3: 0.1 mg/kg OMS858 또는 위약의 단일 정맥내 용량

· 코호트 4: 0.3 mg/kg OMS858 또는 위약의 단일 정맥내 용량

· 코호트 5: 1.0 mg/kg OMS858 또는 위약의 단일 피하 용량

· 코호트 6: 앞선 코호트로부터의 데이터를 기반으로 하여 결정된 투여량의 OMS858 또는 위약의 단일 피하 용량

피험자는 선별 시점에서 50-110 kg의 체중 및 18-30 kg/m²의 체질량 지수를 가진 18-60세의 건강한 남성 또는 여성 인간이다. 혈액 샘플을 선별시, 투여 전 -1일에, 용량 직전, 투여 후 0.5, 12, 24, 48, 72, 96, 120, 144, 및 168시간, 및 투여 후 15, 22, 29, 57, 및 85일 째에 채혈한다. 일차 종점은 OMS858의 안전성 및 내약성에 대한 평가이다. 2차 종점은 OMS858의 PK 및 PD의 특성화 및 투여 후 OMS858에 대한 항약물 항체(ADA)의 존재 평가이다. 탐색적 종점은 MASP-2 및 만난 결합 렉틴(MBL) 수준에 미치는 OMS858의 영향의 분석이다.

안전성 및 내약성 평가에는 부작용에 대한 모니터링, 바이탈 신호, 심전도, 신체 검사, 임상 평가를 위한 혈액 및 소변 샘플 테스트, 및 기타 임상 상태 측정이 포함된다. C4 침착 검정, MASP-2 수준, MBL 수준, ADA, 및 다른 관련된 생체마커에 의해 측정된 렉틴 경로 억제에 의해 측정된 것과 같이, 피험자로부터의 혈액 및/또는 혈청 샘플을 PK 분석, PD 분석에 대해 검정한다.

코호트 1, 코호트 2, 코호트 3, 및 코호트 4에 대한 중간 PK 및 PD 데이터를 도 25-26에 도시한다. 도 25-26에 도시된 시점을 통해 안전성 또는 내약성 문제는 관찰되지 않았다. OMS858에 대한 PK 측정은 도 25에 도시된 시점을 통해 용량 비례 노출을 보여주었다. 도 26에서 나타낸 것과 같이, OMS858에 대한 강력하고 지속적인 PD 반응이 3개의 코호트 모두에서 관찰되었다. 도 27에서 나타낸 것과 같이, 코호트 1-3의 데이터를 기반으로, 170 ng/mL의 EC₅₀ 및 400 ng/mL의 EC₉₀으로 유리한 PK/PD 관계가 관찰되었다.

IX. 예시의 구체예

본 명세서에서 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 및 특허는 본원에 참조로 포함된다.

발명의 특정 구체예가 예시되고 기술된 한편, 발명의 사상 및 범주로부터 벗어나지 않으면서 다양한 변화가 그 안에서 이루어질 수 있는 것이 인정될 것이다. 발명이 특정 구체예와 관련하여 기술되었지만, 청구된 발명은 그러한 특정 구체예에 부당하게 제한되지 않아야 하는 것이 이해되어야 한다. 실제로, 의학, 면역학, 약물학 분야, 또는 관련된 분야에 숙련된 사람들에게 명백한, 기술된 특정 구체예의 다양한 변형이 발명의 범주 내에 있는 것으로 의도된다.

따라서, 특정 구체예를 기술하는 다음의 번호가 매겨진 단락은 명료성을 위해 제공되지만, 청구범위를 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다.

1. 인간 MASP-2의 세린 프로테아제 도메인 내에 위치한 에피토프에 특이적으로 결합하는 분리된 단클론성 항체 또는 그것의 항원 결합 단편으로서, 상기 에피토프는 아미노산 ₄₉₆DIRMGTLKRLSPHYTQAW₅₁₃(서열 번호:6) 내에 위치하고, 항체 또는 그것의 항원 결합 단편은 렉틴 경로 보체 활성화를 억제하는, 분리된 항체 또는 그것의 항원 결합 단편.

2. 단락 1의 분리된 항체 또는 그것의 항원 결합 단편으로서, 항체 또는 항원 결합 단편이 MASP-2에 대한 결합에 대해 C4 결합과 경합하는 것인 분리된 항체 또는 그것의 항원 결합 단편.

3. 단락 1의 분리된 항체 또는 그것의 항원 결합 단편으로서, 항체 또는 그것의 항원 결합 단편은 인간 MASP-2 Lys 503 및/또는 His 508 중 적어도 하나와 수소 결합을 형성하는 것인 분리된 항체 또는 그것의 항원 결합 단편.

4. 단락 1의 분리된 항체 또는 그것의 항원 결합 단편으로서, 항체 또는 그것의 항원 결합 단편은 인간 MASP-2 His 508과 수소 결합을 형성하는 것인 분리된 항체 또는 그것의 항원 결합 단편.

5. 단락 1의 분리된 항체 또는 그것의 항원 결합 단편으로서, 항체 또는 그것의 항원 결합 단편은 다음 인간 MASP-2 아미노산: Asp 496, Lys 503, Ser 506, Pro 507, His 508 및 Trp 513 중 하나 이상과 반 데르 발스 접촉을 형성하는 것인 분리된 항체 또는 그것의 항원 결합 단편.

6. 단락 1의 분리된 항체 또는 그것의 항원 결합 단편으로서, 항체 또는 그것의 항원 결합 단편은:

(a) 서열 NXXMH를 가지며, 여기서 위치 2의 X는 H 또는 Y이고 위치 3의 X는 H 또는 W인 HC-CDR1; 서열 번호:63(DIDXSDSEXXYXXKFKD)으로서 제시되고 여기서 위치 4의 X는 P 또는 A이며; 위치 9의 X는 T 또는 I이고, 위치 10의 X는 H 또는 Y이며, 위치 12의 X는 I 또는 N이고; 위치 13의 X는 E 또는 Q인 HC-CDR2; 및 서열 번호:18(GDITTTLRYFDV)로서 제시된 HC-CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 (b) 서열 번호:64(SASSSVXYMY)로서 제시되고 여기서 위치 7의 X는 R 또는 S인 LC-CDR1; 서열 번호:34(DTSNLAS)로서 제시된 LC-CDR2 및 서열 번호:36(QQWSSYPLT)으로서 제시된 LC-CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는

(b) 서열 번호:25(SYWMH)로서 제시된 HC-CDR1, 서열 번호:27(NINPSNGGTNCNEKFKN)로서 제시된 HC-CDR2 및 서열 번호:29(WAYDAMDY)로서 제시된 HC-CDR3 및 서열 번호:41(RASESVDSYGNSFMH)로서 제시된 LC-CDR1, 서열 번호:43(FASNLES)으로서 제시된 LC-CDR2 및 서열 번호:45(QQSNEDPLT)로서 제시된 LC-CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역

을 포함하는 것인 분리된 항체 또는 그것의 항원 결합 단편.

7. 단락 6(a)의 분리된 항체 또는 그것의 항원 결합 단편으로서, HC-CDR1은 서열 번호:14(NYWMH)를 포함하는 것인 분리된 항체 또는 그것의 항원 결합 단편.

8. 단락 6(a)의 분리된 항체 또는 그것의 항원 결합 단편으로서, HC-CDR1은 서열 번호:56(NYHMH)을 포함하는 것인 분리된 항체 또는 그것의 항원 결합 단편.

9. 단락 6(a)의 분리된 항체 또는 그것의 항원 결합 단편으로서, HC-CDR1은 서열 번호: 57(NHHMH)을 포함하는 것인 분리된 항체 또는 그것의 항원 결합 단편.

10. 단락 6(a)의 분리된 항체 또는 그것의 항원 결합 단편으로서, HC-CDR2는 서열 번호:16(DIDPSDSETHYIEKFKD)을 포함하는 것인 분리된 항체 또는 그것의 항원 결합 단편.

11. 단락 6(a)의 분리된 항체 또는 그것의 항원 결합 단편으로서, HC-CDR2는 서열 번호:22(DIDPSDSEIYYNQKFKD)를 포함하는 것인 분리된 항체 또는 그것의 항원 결합 단편.

12. 단락 6(a)의 분리된 항체 또는 그것의 항원 결합 단편으로서, HC-CDR2는 서열 번호:53(DIDASDSETHYIEKFKD)을 포함하는 것인 분리된 항체 또는 그것의 항원 결합 단편.

13. 단락 6(a)의 분리된 항체 또는 그것의 항원 결합 단편으로서, LC-CDR1은 서열 번호:32(SASSSVRYMY)를 포함하는 것인 분리된 항체 또는 그것의 항원 결합 단편.

14. 단락 6(a)의 분리된 항체 또는 그것의 항원 결합 단편으로서, LC-CDR1은 서열 번호:39(SASSSVSYMY)를 포함하는 것인 분리된 항체 또는 그것의 항원 결합 단편.

15. 단락 6(a)의 분리된 항체 또는 그것의 항원 결합 단편으로서, HC-CDR1은 서열 번호:14(NYWMH); 서열 번호:56(NYHMH) 또는 서열 번호:57(NHHMH)을 포함하고, HC-CDR2는 서열 번호:16(DIDPSDSETHYIEKFKD) 또는 서열 번호:53(DIDASDSETHYIEKFKD)을 포함하며, HC-CDR3은 서열 번호:18(GDITTTLRYFDV)을 포함하고 LC-CDR1은 서열 번호:32(SASSSVRYMY)를 포함하며 LC-CDR2는 서열 번호:34(DTSNLAS)를 포함하고 LC-CDR3은 서열 번호:36(QQWSSYPLT)을 포함하는 것인 분리된 항체 또는 그것의 항원 결합 단편.

16. 단락 6(a)의 분리된 항체 또는 그것의 항원 결합 단편으로서, HC-CDR1은 서열 번호:14(NYWMH)를 포함하고; HC-CDR2는 서열 번호:16(DIDPSDSETHYIEKFKD) 또는 서열 번호:53(DIDASDSETHYIEKFKD)을 포함하며 HC-CDR3은 서열 번호:18(GDITTTLRYFDV)을 포함하고 LC-CDR1은 서열 번호:32(SASSSVRYMY)를 포함하며 LC-CDR2는 서열 번호:34(DTSNLAS)를 포함하고 LC-CDR3은 서열 번호:36(QQWSSYPLT)을 포함하는 것인 분리된 항체 또는 그것의 항원 결합 단편.

17. 단락 6(a)의 분리된 항체 또는 그것의 항원 결합 단편으로서, HC-CDR1은 서열 번호:56(NYHMH)을 포함하고; HC-CDR2는 서열 번호:16(DIDPSDSETHYIEKFKD) 또는 서열 번호:53(DIDASDSETHYIEKFKD)을 포함하며 HC-CDR3은 서열 번호:18(GDITTTLRYFDV)을 포함하고 LC-CDR1은 서열 번호:32(SASSSVRYMY)를 포함하며 LC-CDR2는 서열 번호:34(DTSNLAS)를 포함하고 LC-CDR3은 서열 번호:36(QQWSSYPLT)을 포함하는 것인 분리된 항체 또는 그것의 항원 결합 단편.

18. 단락 6(a)의 분리된 항체 또는 그것의 항원 결합 단편으로서, HC-CDR1은 서열 번호:57(NHHMH)을 포함하고; HC-CDR2는 서열 번호:16(DIDPSDSETHYIEKFKD) 또는 서열 번호:53(DIDASDSETHYIEKFKD)을 포함하며 HC-CDR3은 서열 번호:18(GDITTTLRYFDV)을 포함하고 LC-CDR1은 서열 번호:32(SASSSVRYMY)를 포함하며 LC-CDR2는 서열 번호:34(DTSNLAS)를 포함하고 LC-CDR3은 서열 번호:36(QQWSSYPLT)을 포함하는 것인 분리된 항체 또는 그것의 항원 결합 단편.

19. 단락 6(a)의 분리된 항체 또는 그것의 항원 결합 단편으로서, HC-CDR1은 서열 번호:14(NYWM)를 포함하고; HC-CDR2는 서열 번호:16(DIDPSDSETHYIEKFKD)을 포함하며, HC-CDR3은 서열 번호:18(GDITTTLRYFDV)을 포함하고 LC-CDR1은 서열 번호:32(SASSSVRYMY)를 포함하며, LC-CDR2는 서열 번호:34(DTSNLAS)를 포함하고, LC-CDR3은 서열 번호:36(QQWSSYPLT)을 포함하는 것인 분리된 항체 또는 그것의 항원 결합 단편.

20. 단락 6(a)의 분리된 항체 또는 그것의 항원 결합 단편으로서, HC-CDR1은 서열 번호:14(NYWM)를 포함하고; HC-CDR2는 서열 번호:53(DIDASDSETHYIEKFKD)을 포함하며, HC-CDR3은 서열 번호:18(GDITTTLRYFDV)을 포함하고 LC-CDR1은 서열 번호:32(SASSSVRYMY)를 포함하며, LC-CDR2는 서열 번호:34(DTSNLAS)를 포함하고, LC-CDR3은 서열 번호:36(QQWSSYPLT)을 포함하는 것인 분리된 항체 또는 그것의 항원 결합 단편.

21. 단락 6(a)의 분리된 항체 또는 그것의 항원 결합 단편으로서, HC-CDR1은 서열 번호:56(NYHMH)을 포함하고; HC-CDR2는 서열 번호:53(DIDASDSETHYIEKFKD)을 포함하며, HC-CDR3은 서열 번호:18(GDITTTLRYFDV)을 포함하고 LC-CDR1은 서열 번호:32(SASSSVRYMY)를 포함하며, LC-CDR2는 서열 번호:34(DTSNLAS)를 포함하고, LC-CDR3은 서열 번호:36(QQWSSYPLT)을 포함하는 것인 분리된 항체 또는 그것의 항원 결합 단편.

22. 단락 6(a)의 분리된 항체 또는 그것의 항원 결합 단편으로서, HC-CDR1은 서열 번호:57(NHHMH)을 포함하고; HC-CDR2는 서열 번호:53((DIDASDSETHYIEKFKD)을 포함하며 HC-CDR3은 서열 번호:18(GDITTTLRYFDV)을 포함하고 LC-CDR1은 서열 번호:32(SASSSVRYMY)를 포함하며 LC-CDR2는 서열 번호:34(DTSNLAS)를 포함하고 LC-CDR3은 서열 번호:36(QQWSSYPLT)을 포함하는 것인 분리된 항체 또는 그것의 항원 결합 단편.

23. 단락 6(a)의 분리된 항체 또는 그것의 항원 결합 단편으로서, HC-CDR1은 서열 번호:14(NYWM)를 포함하고; HC-CDR2는 서열 번호:22(DIDPSDSEIYYNQKFKD)를 포함하며 HC-CDR3은 서열 번호:18(GDITTTLRYFDV)을 포함하고 LC-CDR1은 서열 번호:39(SASSSVSYMY)를 포함하며 LC-CDR2는 서열 번호:34(DTSNLAS)를 포함하고 LC-CDR3은 서열 번호:36(QQWSSYPLT)을 포함하는 것인 분리된 항체 또는 그것의 항원 결합 단편.

24. 단락 6(a)의 분리된 항체 또는 항원 결합 단편으로서, 항체 또는 그것의 항원 결합 단편은 서열 번호:7, 서열 번호:46, 서열 번호:48, 서열 번호:49 또는 서열 번호:50에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 포함하는 중쇄 및 서열 번호:10 또는 서열 번호:47에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 포함하는 경쇄를 포함하는 것인 분리된 항체 또는 항원 결합 단편.

25. 단락 6(a)의 분리된 항체 또는 항원 결합 단편으로서, 항체 또는 그것의 항원 결합 단편은 서열 번호:46, 서열 번호:48, 서열 번호:49 또는 서열 번호:50에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 포함하는 중쇄 및 서열 번호:47에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 포함하는 경쇄를 포함하는 것인 분리된 항체 또는 항원 결합 단편.

26. 단락 6(a)의 분리된 항체 또는 항원 결합 단편으로서, 항체 또는 그것의 항원 결합 단편은 서열 번호:8에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 포함하는 중쇄 및 서열 번호:11에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 포함하는 경쇄를 포함하는 것인 분리된 항체 또는 항원 결합 단편.

27. 단락 6(b)의 분리된 항체 또는 항원 결합 단편으로서, 항체 또는 그것의 항원 결합 단편은 서열 번호:9에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 포함하는 중쇄 및 서열 번호:12에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 포함하는 경쇄를 포함하는 것인 분리된 항체 또는 항원 결합 단편.

28. 단락 1 내지 27 중 어느 하나의 분리된 항체 또는 항원 결합 단편으로서, 항체 또는 항원 결합 단편은 인간 항체, 인간화된 항체, 키메릭 항체, 쥐과 항체, 및 전술한 것들 중 임의의 것의 항원 결합 단편으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 분리된 항체 또는 항원 결합 단편.

29. 단락 1 내지 27 중 어느 하나의 분리된 항체 또는 그것의 항원 결합 단편으로서, 항체 또는 그것의 항원 결합 단편은 단일 사슬 항체, ScFv, Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, 힌지 영역이 없는 일가 항체 및 전체 항체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 분리된 항체 또는 그것의 항원 결합 단편.

30. 단락 1 내지 27 중 어느 하나의 분리된 항체 또는 그것의 항원 결합 단편으로서, 면역글로불린 불변 영역을 추가로 포함하는 것인 분리된 항체 또는 그것의 항원 결합 단편.

31. 단락 1 내지 27 중 어느 하나의 분리된 항체 또는 항원 결합 단편으로서, 항체 또는 그것의 항원 결합 단편은 인간화된 것인 분리된 항체 또는 항원 결합 단편.

32. 단락 1 내지 27 중 어느 하나의 분리된 항체 또는 그것의 항원 결합 단편으로서, 항체 또는 그것의 항원 결합 단편은 IgG1, IgG2, 및 IgG4로 이루어지는 군으로부터 선택된 IgG 면역글로불린인 것인 분리된 항체 또는 그것의 항원 결합 단편.

33. 단락 1 내지 27 중 어느 하나의 분리된 항체 또는 그것의 항원 결합 단편으로서, 항체 또는 그것의 항원 결합 단편은 Fc 영역에 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 것인 분리된 항체 또는 그것의 항원 결합 단편.

34. 단락 33의 분리된 항체 또는 그것의 항원 결합 단편으로서, Fc 영역은 S228P 아미노산 치환을 포함하는 것인 분리된 항체 또는 그것의 항원 결합 단편.

35. 단락 1 내지 34 중 어느 하나의 분리된 항체 또는 그것의 항원 결합 단편으로서, 항체 또는 그것의 항원 결합 단편은 20 nM 미만의 친화도로 인간 MASP-2의 세린 프로테아제 도메인에 결합하는 것인 분리된 항체 또는 그것의 항원 결합 단편.

36. 단락 35의 분리된 항체 또는 그것의 항원 결합 단편으로서, 항체 또는 그것의 항원 결합 단편은 10 nM 미만의 친화도로 인간 MASP-2의 세린 프로테아제 도메인에 결합하는 것인 분리된 항체 또는 그것의 항원 결합 단편.

37. 단락 1 내지 34 중 어느 하나의 분리된 항체 또는 그것의 항원 결합 단편으로서, 항체 또는 그것의 항원 결합 단편은 포유류 혈액에서 렉틴 경로를 억제하는 것인 분리된 항체 또는 그것의 항원 결합 단편.

38. 단락 37의 분리된 항체 또는 그것의 항원 결합 단편으로서, 렉틴 경로 억제는 렉틴 경로 특이적 검정 조건 하에서 C3b 침착의 감소를 포함하는 것인 분리된 항체 또는 그것의 항원 결합 단편.

39. 단락 37의 분리된 항체 또는 그것의 항원 결합 단편으로서, 렉틴 경로 억제는 렉틴 경로 특이적 검정 조건 하에서 C4 침착의 감소를 포함하는 것인 분리된 항체 또는 그것의 항원 결합 단편.

40. 단락 37의 분리된 항체 또는 그것의 항원 결합 단편으로서, 렉틴 경로 억제는 렉틴 경로 특이적 검정 조건 하에서 MAC 침착의 감소를 포함하는 것인 분리된 항체 또는 그것의 항원 결합 단편.

41. 단락 1 내지 34 중 어느 하나의 분리된 항체 또는 그것의 항원 결합 단편으로서, 항체 또는 그것의 항원 결합 단편은 포유류 혈액에서 고전적 경로를 억제하지 않는 것인 분리된 항체 또는 그것의 항원 결합 단편.

42. 단락 1 내지 34 중 어느 하나의 항체 또는 그것의 항원 결합 단편 및 제약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 조성물.

43. 단락 42의 조성물로서, 상기 조성물은 피하 투여를 위해 제형화되는 것인 조성물.

44. 단락 1 내지 34 중 어느 하나의 항체 또는 그것의 항원 결합 단편의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오타이드.

45. 단락 1 내지 34 중 어느 하나로부터의 항체 또는 그것의 항원 결합 단편의 중쇄 가변 영역을 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오타이드 및 단락 1 내지 34 중 어느 하나로부터의 항체 또는 그것의 항원 결합 단편의 경쇄 가변 영역을 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오타이드의 조합.

46. 단락 44의 폴리뉴클레오타이드 또는 단락 45의 폴리뉴클레오타이드의 조합을 포함하는 클로닝 벡터 또는 발현 벡터.

47. 단락 1 내지 34 중 어느 하나로부터의 항체 또는 그것의 항원 결합 단편의 중쇄 가변 영역을 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 클로닝 벡터 또는 발현 벡터 및 단락 1 내지 34 중 어느 하나로부터의 항체 또는 그것의 항원 결합 단편의 경쇄 가변 영역을 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 클로닝 벡터 또는 발현 벡터의 조합.

48. 단락 46 또는 단락 47의 하나 이상의 클로닝 벡터 또는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.

49. 단락 1-34 중 어느 것의 항체 또는 항원 결합 단편을 제조하는 방법으로서, 단락 48의 숙주 세포를 배양하는 단계 및 항체 또는 그것의 항원 결합 단편을 분리하는 단계를 포함하는 방법.

50. 포유류에서 렉틴 경로 보체 활성화를 억제하는 방법으로서, 필요로 하는 포유류 대상체에게 포유류에서 렉틴 경로 보체 활성화를 억제하기에 충분한 고친화성 MASP-2 억제 항체 또는 그것의 항원 결합 단편을 포함하는 단락 42에 따르는 조성물의 양을 투여하는 단계를 포함하는 방법.

51. 단락 50의 방법으로서, 필요로 하는 대상체는: 혈전성 미세혈관병증(TMA), 신장 질환, 조직 또는 장기 이식으로부터 유발된 염증 반응, 허혈성 재관류 손상, 당뇨병과 관련된 합병증, 심혈관 질환 또는 장애, 염증성 위장 장애, 폐 장애, 안과 질환 또는 장애, 파종성 혈관내 응고, 이식편대숙주병, 정맥 폐쇄성 질환 및 미만성 폐포 출혈로 이루어지는 군으로부터 선택된 렉틴 경로 질환 또는 장애를 앓고 있거나, 또는 발병의 위험이 있는 것인 방법.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

인간 MASP-2의 세린 프로테아제 도메인 내에 위치한 에피토프에 특이적으로 결합하는 분리된 단클론성 항체 또는 그것의 항원 결합 단편으로서, 상기 에피토프는 아미노산 ₄₉₆DIRMGTLKRLSPHYTQAW₅₁₃(서열 번호:6) 내에 위치하고, 항체 또는 그것의 항원 결합 단편은 렉틴 경로 보체 활성화를 억제하는, 분리된 항체 또는 그것의 항원 결합 단편.
제1항에 있어서, 항체 또는 항원 결합 단편은 MASP-2에 대한 결합에 대해 C4 결합과 경합하는 것을 특징으로 하는 분리된 항체 또는 그것의 항원 결합 단편.
제1항에 있어서, 항체 또는 그것의 항원 결합 단편은 인간 MASP-2 Lys 503 및/또는 His 508 중 적어도 하나와 수소 결합을 형성하는 것을 특징으로 하는 분리된 항체 또는 그것의 항원 결합 단편.
제1항에 있어서, 항체 또는 그것의 항원 결합 단편은 인간 MASP-2 His 508과 수소 결합을 형성하는 것을 특징으로 하는 분리된 항체 또는 그것의 항원 결합 단편.
제1항에 있어서, 항체 또는 그것의 항원 결합 단편은 다음의 인간 MASP-2 아미노산: Asp 496, Lys 503, Ser 506, Pro 507, His 508 및 Trp 513 중 하나 이상과 반 데르 발스 접촉을 형성하는 것을 특징으로 하는 분리된 항체 또는 그것의 항원 결합 단편.
제1항에 있어서, 항체 또는 그것의 항원 결합 단편은:
(a) 서열 NXXMH를 가지며, 여기서 위치 2의 X는 H 또는 Y이고 위치 3의 X는 H 또는 W인 HC-CDR1; 서열 번호:63(DIDXSDSEXXYXXKFKD)으로서 제시되고 여기서 위치 4의 X는 P 또는 A이며; 위치 9의 X는 T 또는 I이고, 위치 10의 X는 H 또는 Y이며, 위치 12의 X는 I 또는 N이고; 위치 13의 X는 E 또는 Q인 HC-CDR2; 및 서열 번호:18(GDITTTLRYFDV)로서 제시된 HC-CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 (b) 서열 번호:64(SASSSVXYMY)로서 제시되고 여기서 위치 7의 X는 R 또는 S인 LC-CDR1; 서열 번호:34(DTSNLAS)로서 제시된 LC-CDR2 및 서열 번호:36(QQWSSYPLT)으로서 제시된 LC-CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는
(b) 서열 번호:25(SYWMH)로서 제시된 HC-CDR1, 서열 번호:27(NINPSNGGTNCNEKFKN)로서 제시된 HC-CDR2 및 서열 번호:29(WAYDAMDY)로서 제시된 HC-CDR3 및 서열 번호:41(RASESVDSYGNSFMH)로서 제시된 LC-CDR1, 서열 번호:43(FASNLES)으로서 제시된 LC-CDR2 및 서열 번호:45(QQSNEDPLT)로서 제시된 LC-CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역
을 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 항체 또는 그것의 항원 결합 단편.
제6항에 있어서, (a)에서 HC-CDR1은 서열 번호:14(NYWMH)를 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 항체 또는 그것의 항원 결합 단편.
제6항에 있어서, (a)에서 HC-CDR1은 서열 번호:56(NYHMH)을 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 항체 또는 그것의 항원 결합 단편.
제6항에 있어서, (a)에서 HC-CDR1은 서열 번호: 57(NHHMH)을 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 항체 또는 그것의 항원 결합 단편.
제6항에 있어서, (a)에서 HC-CDR2는 서열 번호:16(DIDPSDSETHYIEKFKD)을 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 항체 또는 그것의 항원 결합 단편.
제6항에 있어서, (a)에서 HC-CDR2는 서열 번호:22(DIDPSDSEIYYNQKFKD)를 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 항체 또는 그것의 항원 결합 단편.
제6항에 있어서, (a)에서 HC-CDR2는 서열 번호:53(DIDASDSETHYIEKFKD)을 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 항체 또는 그것의 항원 결합 단편.
제6항에 있어서, (a)에서 LC-CDR1은 서열 번호:32(SASSSVRYMY)를 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 항체 또는 그것의 항원 결합 단편.
제6항에 있어서, (a)에서 LC-CDR1은 서열 번호:39(SASSSVSYMY)를 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 항체 또는 그것의 항원 결합 단편.
제6항에 있어서, (a)에서 HC-CDR1은 서열 번호:14(NYWMH); 서열 번호:56(NYHMH) 또는 서열 번호:57(NHHMH)을 포함하고, HC-CDR2는 서열 번호:16(DIDPSDSETHYIEKFKD) 또는 서열 번호:53(DIDASDSETHYIEKFKD)을 포함하며, HC-CDR3은 서열 번호:18(GDITTTLRYFDV)을 포함하고 LC-CDR1은 서열 번호:32(SASSSVRYMY)를 포함하며 LC-CDR2는 서열 번호:34(DTSNLAS)를 포함하고 LC-CDR3은 서열 번호:36(QQWSSYPLT)을 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 항체 또는 그것의 항원 결합 단편.
제6항에 있어서, (a)에서 HC-CDR1은 서열 번호:14(NYWMH)를 포함하고; HC-CDR2는 서열 번호:16(DIDPSDSETHYIEKFKD) 또는 서열 번호:53(DIDASDSETHYIEKFKD)을 포함하며 HC-CDR3은 서열 번호:18(GDITTTLRYFDV)을 포함하고 LC-CDR1은 서열 번호:32(SASSSVRYMY)를 포함하며 LC-CDR2는 서열 번호:34(DTSNLAS)를 포함하고 LC-CDR3은 서열 번호:36(QQWSSYPLT)을 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 항체 또는 그것의 항원 결합 단편.
제6항에 있어서, (a)에서 HC-CDR1은 서열 번호:56(NYHMH)을 포함하고; HC-CDR2는 서열 번호:16(DIDPSDSETHYIEKFKD) 또는 서열 번호:53(DIDASDSETHYIEKFKD)을 포함하며 HC-CDR3은 서열 번호:18(GDITTTLRYFDV)을 포함하고 LC-CDR1은 서열 번호:32(SASSSVRYMY)를 포함하며 LC-CDR2는 서열 번호:34(DTSNLAS)를 포함하고 LC-CDR3은 서열 번호:36(QQWSSYPLT)을 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 항체 또는 그것의 항원 결합 단편.
제6항에 있어서, (a)에서 HC-CDR1은 서열 번호:57(NHHMH)을 포함하고; HC-CDR2는 서열 번호:16(DIDPSDSETHYIEKFKD) 또는 서열 번호:53(DIDASDSETHYIEKFKD)을 포함하며 HC-CDR3은 서열 번호:18(GDITTTLRYFDV)을 포함하고 LC-CDR1은 서열 번호:32(SASSSVRYMY)를 포함하며 LC-CDR2는 서열 번호:34(DTSNLAS)를 포함하고 LC-CDR3은 서열 번호:36(QQWSSYPLT)을 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 항체 또는 그것의 항원 결합 단편.
제6항에 있어서, (a)에서 HC-CDR1은 서열 번호:14(NYWM)를 포함하고; HC-CDR2는 서열 번호:16(DIDPSDSETHYIEKFKD)을 포함하며, HC-CDR3은 서열 번호:18(GDITTTLRYFDV)을 포함하고 LC-CDR1은 서열 번호:32(SASSSVRYMY)를 포함하며, LC-CDR2는 서열 번호:34(DTSNLAS)를 포함하고, LC-CDR3은 서열 번호:36(QQWSSYPLT)을 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 항체 또는 그것의 항원 결합 단편.
제6항에 있어서, (a)에서 HC-CDR1은 서열 번호:14(NYWM)를 포함하고; HC-CDR2는 서열 번호:53(DIDASDSETHYIEKFKD)을 포함하며, HC-CDR3은 서열 번호:18(GDITTTLRYFDV)을 포함하고 LC-CDR1은 서열 번호:32(SASSSVRYMY)를 포함하며, LC-CDR2는 서열 번호:34(DTSNLAS)를 포함하고, LC-CDR3은 서열 번호:36(QQWSSYPLT)을 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 항체 또는 그것의 항원 결합 단편.
제6항에 있어서, (a)에서 HC-CDR1은 서열 번호:56(NYHMH)을 포함하고; HC-CDR2는 서열 번호:53(DIDASDSETHYIEKFKD)을 포함하며, HC-CDR3은 서열 번호:18(GDITTTLRYFDV)을 포함하고 LC-CDR1은 서열 번호:32(SASSSVRYMY)를 포함하며, LC-CDR2는 서열 번호:34(DTSNLAS)를 포함하고, LC-CDR3은 서열 번호:36(QQWSSYPLT)을 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 항체 또는 그것의 항원 결합 단편.
제6항에 있어서, (a)에서 HC-CDR1은 서열 번호:57(NHHMH)을 포함하고; HC-CDR2는 서열 번호:53((DIDASDSETHYIEKFKD)을 포함하며 HC-CDR3은 서열 번호:18(GDITTTLRYFDV)을 포함하고 LC-CDR1은 서열 번호:32(SASSSVRYMY)를 포함하며 LC-CDR2는 서열 번호:34(DTSNLAS)를 포함하고 LC-CDR3은 서열 번호:36(QQWSSYPLT)을 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 항체 또는 그것의 항원 결합 단편.
제6항에 있어서, (a)에서 HC-CDR1은 서열 번호:14(NYWM)를 포함하고; HC-CDR2는 서열 번호:22(DIDPSDSEIYYNQKFKD)를 포함하며 HC-CDR3은 서열 번호:18(GDITTTLRYFDV)을 포함하고 LC-CDR1은 서열 번호:39(SASSSVSYMY)를 포함하며 LC-CDR2는 서열 번호:34(DTSNLAS)를 포함하고 LC-CDR3은 서열 번호:36(QQWSSYPLT)을 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 항체 또는 그것의 항원 결합 단편.
제6항에 있어서, (a)에서 항체 또는 그것의 항원 결합 단편은 서열 번호:7, 서열 번호:46, 서열 번호:48, 서열 번호:49 또는 서열 번호:50에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 포함하는 중쇄 및 서열 번호:10 또는 서열 번호:47에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 포함하는 경쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 항체 또는 항원 결합 단편.
제6항에 있어서, (a)에서 항체 또는 그것의 항원 결합 단편은 서열 번호:46, 서열 번호:48, 서열 번호:49 또는 서열 번호:50에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 포함하는 중쇄 및 서열 번호:47에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 포함하는 경쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 항체 또는 항원 결합 단편.
제6항에 있어서, (a)에서 항체 또는 그것의 항원 결합 단편은 서열 번호:8에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 포함하는 중쇄 및 서열 번호:11에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 항체 또는 항원 결합 단편.
제6항에 있어서, (b)에서 항체 또는 그것의 항원 결합 단편은 서열 번호:9에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 포함하는 중쇄 및 서열 번호:12에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 포함하는 경쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 항체 또는 항원 결합 단편.
제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 항원 결합 단편은 인간 항체, 인간화된 항체, 키메릭 항체, 쥐과 항체, 및 전술한 것들 중 임의의 것의 항원 결합 단편으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 분리된 항체 또는 그것의 항원 결합 단편.
제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 그것의 항원 결합 단편은 단일 사슬 항체, ScFv, Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, 힌지 영역이 없는 일가 항체 및 전체 항체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 분리된 항체 또는 그것의 항원 결합 단편.
제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 면역글로불린 불변 영역을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 항체 또는 그것의 항원 결합 단편.
제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 그것의 항원 결합 단편은 인간화된 것을 특징으로 하는 분리된 항체 또는 그것의 항원 결합 단편.
제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 그것의 항원 결합 단편은 IgG1, IgG2, 및 IgG4로 이루어지는 군으로부터 선택된 IgG 면역글로불린인 것을 특징으로 하는 분리된 항체 또는 그것의 항원 결합 단편.
제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 그것의 항원 결합 단편은 Fc 영역에 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 항체 또는 그것의 항원 결합 단편.
제33항에 있어서, Fc 영역은 S228P 아미노산 치환을 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 항체 또는 그것의 항원 결합 단편.
제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 그것의 항원 결합 단편은 20 nM 미만의 친화도로 인간 MASP-2의 세린 프로테아제 도메인에 결합하는 것을 특징으로 하는 분리된 항체 또는 그것의 항원 결합 단편.
제35항에 있어서, 항체 또는 그것의 항원 결합 단편은 10 nM 미만의 친화도로 인간 MASP-2의 세린 프로테아제 도메인에 결합하는 것을 특징으로 하는 분리된 항체 또는 그것의 항원 결합 단편.
제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 그것의 항원 결합 단편은 포유류 혈액에서 렉틴 경로를 억제하는 것을 특징으로 하는 분리된 항체 또는 그것의 항원 결합 단편.
제37항에 있어서, 렉틴 경로 억제는 렉틴 경로 특이적 검정 조건 하에서 C3b 침착의 감소를 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 항체 또는 그것의 항원 결합 단편.
제37항에 있어서, 렉틴 경로 억제는 렉틴 경로 특이적 검정 조건 하에서 C4 침착의 감소를 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 항체 또는 그것의 항원 결합 단편.
제37항에 있어서, 렉틴 경로 억제는 렉틴 경로 특이적 검정 조건 하에서 MAC 침착의 감소를 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 항체 또는 그것의 항원 결합 단편.
제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 그것의 항원 결합 단편은 포유류 혈액에서 고전적 경로를 억제하지 않는 것을 특징으로 하는 분리된 항체 또는 그것의 항원 결합 단편.
제1항 내지 제34항 중 어느 한 항의 항체 또는 그것의 항원 결합 단편 및 제약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 조성물.
제42항에 있어서, 상기 조성물은 피하 투여를 위해 제형화되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항 내지 제34항 중 어느 한 항으로부터의 항체 또는 그것의 항원 결합 단편의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오타이드.
제1항 내지 제34항 중 어느 한 항으로부터의 항체 또는 그것의 항원 결합 단편의 중쇄 가변 영역을 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오타이드 및 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항으로부터의 항체 또는 그것의 항원 결합 단편의 경쇄 가변 영역을 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오타이드의 조합.
제44항의 폴리뉴클레오타이드 또는 제45항의 폴리뉴클레오타이드의 조합을 포함하는 클로닝 벡터 또는 발현 벡터.
제1항 내지 제34항 중 어느 한 항으로부터의 항체 또는 그것의 항원 결합 단편의 중쇄 가변 영역을 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 클로닝 벡터 또는 발현 벡터 및 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항으로부터의 항체 또는 그것의 항원 결합 단편의 경쇄 가변 영역을 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 클로닝 벡터 또는 발현 벡터의 조합.
제46항 또는 제47항의 하나 이상의 클로닝 벡터 또는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
제1항 내지 제34항 중 어느 한 항의 항체 또는 항원 결합 단편을 제조하는 방법으로서, 제48항의 숙주 세포를 배양하는 단계 및 항체 또는 그것의 항원 결합 단편을 분리하는 단계를 포함하는 방법.
포유류에서 렉틴 경로 보체 활성화를 억제하는 방법으로서, 필요로 하는 포유류 대상체에게 포유류에서 렉틴 경로 보체 활성화를 억제하기에 충분한 고친화성 MASP-2 억제 항체 또는 그것의 항원 결합 단편을 포함하는 제42항에 따르는 조성물의 양을 투여하는 단계를 포함하는 방법.
제50항에 있어서, 필요로 하는 대상체는: 혈전성 미세혈관병증(TMA), 신장 질환, 조직 또는 장기 이식으로부터 유발된 염증 반응, 허혈성 재관류 손상, 당뇨병과 관련된 합병증, 심혈관 질환 또는 장애, 염증성 위장 장애, 폐 장애, 안과 질환 또는 장애, 파종성 혈관내 응고, 이식편대숙주병, 정맥 폐쇄성 질환 및 미만성 폐포 출혈로 이루어지는 군으로부터 선택된 렉틴 경로 질환 또는 장애를 앓고 있거나, 또는 발병의 위험이 있는 것을 특징으로 하는 방법.