KR20240112973A - 길항제 항-npr1 항체 및 이의 사용 방법 - Google Patents
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Abstract
본원의 개시내용은 나트륨이뇨 펩타이드 수용체 1 (NPR1) 단백질에 결합하는 모노클로날 항체, 및 이의 사용 방법을 제공한다. 다양한 구현예에서, 상기 항체는 NPR1에 결합하는 전장 사람 길항제 항체이다. 일부 구현예에서, 본원 개시내용의 항체는 NPR1 신호전달 및/또는 활성을 차단시키는데 유용하여, 사람에 있어서 저혈압을 포함하는 NPR1과 관련된 질환, 장애 또는 병태를 치료 또는 예방하는 수단을 제공한다.
Description
관련 출원에 대한 상호 참조
[001] 본 출원은 PCT 국제 특허 출원으로서 2022년 12월 6일자로 출원되었고 2021년 12월 6일자로 출원된 미국 가특허 출원 제63/286,476호, 및 2022년 2월 14일자로 출원된 미국 가특허 출원 제63/310,078호에 대한 우선권을 주장하고, 이들 각각의 전체 내용은 본원에 참조로 인용된다.
서열 목록에 대한 참조
[002] 본 출원은 XML 포맷으로서 전자 제출된 서열 목록을 포함한다. 서열 목록 XML은 본원에서 참조로 인용된다. 2022년 11월 24일자로 생성된 상기 XML 파일은 파일명이 40848_0112WOU1_SL.xml이며, 크기가 82,654 바이트이다.
[003] 본원의 개시내용은 나트륨이뇨 (natriuretic) 펩타이드 수용체 1 (NPR1)에 특이적으로 결합하는 길항제 항체 및 상기 항체의 항원 결합 단편, 및 이들 항체를 사용하는 치료 및 진단 방법에 관한 것이다.
발명의 배경
[004] 나트륨이뇨 펩타이드 수용체 1(NPR1, NPR-A로서 공지된)은 구아노신 트리포스페이트의 사이클릭 구아노신 모노포스페이트(cGMP)로의 세포 내 전환을 매개하는 막 결합된 구아닐레이트 사이클라제이다(문헌참조: Martinez-Rumayor, et al., 2008 Am J Cardiol 101(3a):3-8). NPR1은 콩팥, 폐, 부신, 혈관계, 뇌, 간, 내피 및 지방 조직에서 광범위하게 발현되고 심장에서는 보다 낮은 수준으로 발현된다. 이것은 심방 나트륨이뇨 펩타이드 (ANP) 또는 뇌 나트륨이뇨 펩타이드 (BNP)에 결합함에 의해 활성화된다. NPR1 활성화 및 신호전달은 많은 조직을 포함하는 많은 생리학적 반응을 자극한다. ANP-NPR1 시스템은 혈관이완, 나트륨이뇨, 이뇨, 내피 투과성에서 및 지질용해 및 면역 세포 기능과 같은 비-심혈관 기능에서의 이의 역할에 대해 널리 연구되었다(문헌참조: Potter, 2011 Pharmacol. Ther. 130: 71-82). NPR1 효능작용은 혈관 내 용적, 혈관이완, 나트륨이뇨 및 이뇨에 대한 cGMP 매개 효과를 통해 전신 혈압(BP)의 변화를 초래한다.
[005] NPR1에 대한 모노클로날 항체는 최초로 문헌(참조: Kitano et al in 1995 (Immunol. Lett. 47: 215-22))에 의해 기재되었다. 활성화 또는 효능제 항-NPR1 항체는 예를 들어, 미국 특허/공개 번호 제9090695호, 제20160168251호, 및 제20200123263호, 및 WO2010065293에 기재되어 있다.
[006] 저혈압 또는 저혈압은 비교적 양성일 수 있고, 무증상 상태일 수 있지만, 펌프 압력이 주요 장기에 산소화된 혈액을 관류하기에 충분하지 않을 경우 문제가 될 수 있다(문헌참조: Sharma, et al., updated 2021 Hypotension, available from https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK499961/). 치료하지 않은 저혈압과 심박출량 불량으로 인한 합병증은 심각하며 사망으로도 이어질 수 있다.
[007] 저혈압을 특징으로 하는 장애는 안전하고 오래 지속되는 치료요법에 대한 의학적 필요성이 매우 충족되지 않고 있다. 혈압과 혈관 내 용적을 증가시키는 약물은 상대적으로 거의 없다. 대부분의 기존 약물은 한계가 있고, 예를 들어, 경구제는 작용 시간이 짧아 하루에 여러 번 투여해야 하고, 정맥내 혈관수축제는 협소한 치료 지수로 인해 ICU에서 빈번한 모니터링과 함께 주입해야 한다.
발명의 간단한 요약
[008] 하나의 양상에서, 본원의 개시내용은 나트륨이뇨 펩타이드 수용체 1(NPR1) 단백질에 특이적으로 결합하는 길항제 항체 및 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 하나의 구현예에서, 나트륨이뇨 펩타이드 수용체 1(NPR1) 단백질에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 제공되고, 여기서 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 NPR1에 결합하여 NPR1을 차단한다. 추가의 구현예에서, NPR1을 차단하는 것은 NPR1의 신호전달 및/또는 활성을 억제하고/하거나 차단하는 것을 포함한다. 특정 구현예에서, 항-NPR1 항체는 고친화성으로 NPR1에 결합하여 NPR1을 차단하는 완전한 사람 항체이다. 본원 개시내용의 항체는 특히 NPR1 신호전달 및/또는 NPR1 단백질의 저혈압 활성을 차단하거나 감소시키기 위해 유용하다. 특정 구현예에서, 상기 항체는 대상체에서 NPR1 관련 질환 또는 장애의 적어도 하나의 증상 또는 징후를 예방, 치료 또는 개선하는데 있어서 유용하다. 특정 구현예에서, 상기 항체는 NPR1-관련 질환 또는 장애를 앓거나 이러한 질환 또는 장애에 걸릴 위험이 있는 대상체에게 예방학적으로 또는 치료학적으로 투여될 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 항체는 저혈압을 앓는 대상체에서 전신 혈압을 증가시키기 위해 사용된다. 상기 항체는 이를 필요로 하는 대상체에게 투여되는 경우 저혈압과 관련된 장애 또는 병태에 대한 치료요법으로서 사용될 수 있다.
[009] 본원에 기재된 길항제 항체는 고친화성으로 NPR1에 결합하고 개선된 약동학적 성질 (표준 치료 약물과 비교하여)을 갖는다. 본원 개시내용의 단일 용량의 항체는 혈압의 지속적인 증가를 유도하였다. 실제로, 본원에 기재된 항체는 혈압을 증가시키고 단일 용량으로서 투여되는 경우 28일 만큼 긴 기간 동안 상기 증가된 혈압을 유지하는데 효과적이다. 상기 항체는 NPR1 관련 질환 또는 장애(예를 들어, 저혈압)가 있는 대상체에서 투여 빈도의 감소와 함께 월등한 효능을 제공하는데 사용될 수 있다.
[010] 본원 개시내용의 항체는 전장 (예를 들어, IgG1 또는 IgG4 항체)일 수 있거나, 항원 결합 부분 (예를 들어, Fab, F(ab’)2 또는 scFv 단편)만을 포함할 수 있으며, 기능성에 영향을 주기 위해, 예를 들어, 숙주 내에서의 지속성을 증가시키기 위해, 또는 잔류 이펙터 기능을 제거하기 위해 변형될 수 있다(문헌참조: Reddy et al., 2000, J. Immunol. 164:1925-1933). 특정 구현예에서, 상기 항체는 이특이적일 수 있다.
[011] 제1 양상에서, 본원의 개시내용은 NPR1에 특이적으로 결합하는 단리된 재조합 모노클로날 길항제 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
[012] 일부 구현예에서, 상기 항체는 완전한 사람 모노클로날 항체이다.
[013] 본원의 개시내용의 예시적인 항-NPR1 항체는 본원에 표 1 및 2에 열거되어 있다. 표 1은 예시적인 항체의 중쇄 가변 영역 (HCVR), 경쇄 가변 영역 (LCVR), 중쇄 상보성 결정 영역 (HCDR)(HCDR1, HCDR2 및 HCDR3) 및 경쇄 상보성 결정 영역 (LCDR) (LCDR1, LCDR2 및 LCDR3)의 아미노산 서열 확인자를 제시하고 있다. 표 2는 예시적인 항체의 HCVR, LCVR, HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3의 핵산 서열 확인자를 제시하고 있다.
[014] 본원의 개시내용은 표 1에 열거된 HCVR 아미노산 서열 중의 임의의 것으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 이에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열을 포함하는 HCVR를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
[015] 또한, 본원의 개시내용은 표 1에 열거된 LCVR 아미노산 서열 중의 임의의 것으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 이에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열을 포함하는 LCVR를 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
[016] 또한 본원의 개시내용은 서열번호 2, 22, 38 및 55로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역(HCVR)을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
[017] 또한 본원의 개시내용은 서열번호 10, 30, 46 및 63으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역(LCVR)을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
[018] 본원의 개시내용은 또한 서열번호 2, 22, 38 및 55로 이루어진 그룹으로부터 선택된 중쇄 가변 영역(HCVR) 내에 포함된 3개의 상보성 결정 영역(CDR); 및 서열번호 10, 30, 46 및 63으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 경쇄 가변 영역(LCVR) 내에 포함된 3개의 CDR을 포함하는 항체, 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
[019] 또한, 본원의 개시내용은 표 1에 열거된 임의의 LCVR 아미노산 서열과 쌍을 이루는 표 1에 열거된 임의의 HCVR 아미노산 서열을 포함하는 HCVR 및 LCVR 아미노산 서열 쌍 (HCVR/LCVR)을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 특정 구현예에 따르면, 본원의 개시내용은 표 1에 열거된 임의의 예시적인 항-NPR1 항체 내에 포함된 HCVR/LCVR 아미노산 서열 쌍을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 특정 구현예에서, HCVR/LCVR 아미노산 서열 쌍은 서열번호 2/10 (예를 들어, mAb38067), 22/30(예를 들어, mAb38090) 및 55/63 (예를 들어, mAb22034) 중 하나로부터 선택된다.
[020] 본원의 개시내용은 또한 HCVR 및 LCVR을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하고, 상기 HCVR은 12개 미만의 아미노산 치환을 갖는 표 1에 열거된 아미노산 서열을 포함하고/하거나 상기 LCVR은 10개 미만의 아미노산 치환을 갖는 표 1에 열거된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR을 포함한다. 예를 들어, 본원의 개시내용은 HCVR 및 LCVR을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하고, 상기 HCVR은 표 1에 열거된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 아미노산 서열은 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개 또는 12개의 아미노산 치환을 갖는다. 또 다른 예에서, 본원의 개시내용은 HCVR 및 LCVR을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하고, 상기 LCVR은 표 1에 열거된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 아미노산 서열은 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개의 아미노산 치환을 갖는다. 하나의 구현예에서, 본원의 개시내용은 HCVR 및 LCVR을 포함하는 항-NPR1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하고, 상기 HCVR은 적어도 하나의 아미노산 치환을 갖는 표 1에 열거된 아미노산 서열을 포함하고/하거나 상기 LCVR은 적어도 하나의 아미노산 치환을 갖는 표 1에 열거된 아미노산 서열을 포함한다.
[021] 또한, 본원의 개시내용은 표 1에 열거된 HCDR1 아미노산 서열 또는 이에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열 중 어느 하나로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1 (HCDR1)을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
[022] 또한, 본원의 개시내용은 표 1에 열거된 HCDR2 아미노산 서열 또는 이에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열을 포함하는 중쇄 CDR2 (HCDR2)를 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
[023] 또한, 본원의 개시내용은 표 1에 열거된 HCDR3 아미노산 서열 또는 이에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열 중 어느 하나로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3 (HCDR3)을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
[024] 또한, 본원의 개시내용은 표 1에 열거된 LCDR1 아미노산 서열 또는 이에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열 중 어느 하나로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1 (LCDR1)을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
[025] 또한, 본원의 개시내용은 표 1에 열거된 LCDR2 아미노산 서열 또는 이에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열 중 어느 하나로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2 (LCDR2)을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
[026] 또한, 본원의 개시내용은 표 1에 열거된 LCDR3 아미노산 서열 또는 이에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열 중 어느 하나로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3 (LCDR3)을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
[027] 본원의 개시내용은 또한 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하고, 이들은 다음을 포함한다:
(a) 서열번호 4, 24, 40, 및 57로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역 (HCDR)1 도메인;
(b) 서열번호 6, 26, 42, 및 59로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 HCDR2 도메인;
(c) 서열번호 8, 28, 44, 및 61로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 HCDR3 도메인;
(d) 서열번호 12, 48 및 65로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 (LCDR)1 도메인;
(e) AAS 및 GAS로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 LCDR2 도메인; 및
(f) 서열번호 16, 32 및 69로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 LCDR3 도메인.
[028] 또한, 본원의 개시내용은 표 1에 열거된 LCDR3 아미노산 서열 중 어느 하나와 쌍을 이루는 표 1에 열거된 HCDR3 아미노산 서열 중의 어느 하나를 포함하는 HCDR3 및 LCDR3 아미노산 서열 쌍 (HCDR3/LCDR3)을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 특정 구현예에 따르면, 본원의 개시내용은 표 1에 열거된 임의의 예시적인 항-NPR1 항체 내에 포함된 HCDR3/LCDR3 아미노산 서열 쌍을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 특정 구현예에서, HCDR3/LCDR3 아미노산 서열 쌍은 서열번호 8/16 (예를 들어, mAb38067), 28/32 (예를 들어, mAb38072), 44/16 (예를 들어, mAb38090) 및 61/69 (예를 들어, mAb22034)로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
[029] 또한, 본원의 개시내용은 HCVR 및 LCVR을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하고; 상기 HCVR은 표 1에 열거된 아미노산 서열과 1개의 아미노산이 다른 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1을 포함하고, 표 1에 열거된 아미노산 서열과 1개의 아미노산이 다른 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2 및 표 1에 열거된 아미노산 서열과 1개의 아미노산이 다른 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함한다. 특정 구현예에서, 본원의 개시내용은 HCVR 및 LCVR을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하고; 상기 LCVR은 표 1에 열거된 아미노산 서열과 1개의 아미노산이 다른 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 표 1에 열거된 아미노산 서열과 1개의 아미노산이 다른 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2 및 표 1에 열거된 아미노산 서열과 1개의 아미노산이 다른 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함한다. 예를 들어, 본원의 개시내용은 HCVR 및 LCVR을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하고, 상기 HCVR은 서열번호 24의 아미노산 서열 또는 서열번호 24와 1개의 아미노산이 다른 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 26의 아미노산 서열 또는 서열번호 26과 1개의 아미노산이 다른 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2 및 서열번호 28의 아미노산 서열 또는 서열번호 28과 1개의 아미노산이 다른 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함한다. 또 다른 예시적인 구현예에서, 본원의 개시내용은 HCVR 및 LCVR을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하고, 상기 LCVR은 서열번호 12의 아미노산 서열 또는 서열번호 12와 1개의 아미노산이 다른 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, AAS의 아미노산 서열 또는 AAS와 1개의 아미노산이 다른 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2 및 서열번호 32의 아미노산 서열 또는 서열번호 32와 1개의 아미노산이 다른 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함한다.
[030] 또한, 본원의 개시내용은 표 1에 열거된 임의의 예시적인 항체 중에 함유된 6개의 CDR의 세트 (즉, HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3)를 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 특정 구현예에서, HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3 아미노산 서열 세트는 서열번호 4-서열번호 6-서열번호 8-서열번호 12-AAS-서열번호 16 (예를 들어, mAb38067), 서열번호 24-서열번호 26-서열번호 28-서열번호 12-AAS-서열번호 32 (예를 들어, mAb38072), 서열번호 40-서열번호 42-서열번호 44-서열번호 48-AAS-서열번호 16 (예를 들어, mAb38090), 및 서열번호 57-서열번호 59-서열번호 61-서열번호 65-GAS-서열번호 69 (예를 들어, mAb22034)로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
[031] 관련 구현예에서, 본원의 개시내용은 표 1에 열거된 임의의 예시적인 항체에 의해 정의된 바와 같은 HCVR/LCVR 아미노산 서열 쌍 내에 함유된 6개의 CDR의 세트 (즉, HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3)를 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 예를 들어, 본원의 개시내용은 서열번호 8/16 (예를 들어, mAb38067), 28/32(예를 들어, mAb38072), 44/16(예를 들어, mAb38090), 및 61/69 (예를 들어, mAb22034)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 HCVR/LCVR 아미노산 서열 쌍 내에 함유된 HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3 아미노산 서열 세트를 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 관련 구현예에서, 본원의 개시내용은 서열번호 2/10, 22/30, 38/46 및 55/63으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 중쇄 가변 영역(HCVR)/경쇄 가변 영역 (LCVR) 아미노산 서열 쌍을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
[032] HCVR 및 LCVR 아미노산 서열 내의 CDR을 동정하기 위한 방법 및 기술은 당업계에 널리 공지되어 있으며 본원에 기재된 특정 HCVR 및/또는 LCVR 아미노산 서열 내의 CDR을 동정하는데 사용될 수 있다. CDR의 경계를 동정하는데 사용될 수 있는 예시적인 방법으로는, 예를 들어, 카바트(Kabat) 정의, 초티아(Chothia) 정의, 및 AbM 정의를 포함한다. 일반적으로, 카바트 정의는 서열 변동성을 기반으로 하고, 초티아 정의는 구조적 루프 영역의 위치를 기반으로 하며, AbM 정의는 카바트와 초티아 접근 방법을 절충한 것이다. 예를 들어, 문헌( Kabat, "Sequences of Proteins of Immunological Interest," National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991); Al-Lazikani, et al., J. Mol. Biol. 273:927-948 (1997); and Martin, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:9268-9272 (1989))을 참조한다. 공용 데이터베이스도 항체 내의 CDR 서열을 동정하는데 활용될 수 있다.
[033] 특정 구현예에서, 본원의 개시내용은 NPR1에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하며, 여기서 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 여기서 경쇄는 서열번호 20, 36, 53 및 73으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
[034] 추가의 구현예에서, 본원의 개시내용은 NPR1에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하며, 여기서 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 여기서 중쇄는 서열번호 18, 34, 51 및 71로 이루어진 그룹으로부터 선택되고 경쇄는 서열번호 20, 36, 53 및 73으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
[035] 추가 구현예에서, 본원의 개시내용은 NPR1에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하며, 여기서 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 NPR1의 세포 외 도메인의 하부 엽(lobe)에 있는 잔기에 결합한다. 여전히 추가의 구현예에서, 본원의 개시내용은 NPR1에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하고, 여기서 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 Arg143, Leu144, Glu384, Leu401, Val402, Ala103, Ser405, Gly406, Arg407, Lys408, Trp411, Leu413, Gly414, Tyr415 및 Pro416으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 NPR1 잔기와 상호 작용한다.
[036] 추가의 구현예에서, 본원의 개시내용은 NPR1에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하며, 여기서 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 여기서 중쇄는 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하고 경쇄는 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함한다.
[037] 추가의 구현예에서, 본원의 개시내용은 NPR1에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하며, 여기서 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 여기서 중쇄는 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하고 경쇄는 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함한다.
[038] 추가의 구현예에서, 본원의 개시내용은 NPR1에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하며, 여기서 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 여기서 중쇄는 서열번호 51의 아미노산 서열을 포함하고 경쇄는 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함한다.
[039] 추가의 구현예에서, 본원의 개시내용은 NPR1에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하고, 여기서 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 여기서 중쇄는 서열번호 71의 아미노산 서열을 포함하고 경쇄는 서열번호 73의 아미노산 서열을 포함한다.
[040] 특정 구현예에서, 본원의 개시내용은 NPR1에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하고, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 중쇄 가변 영역 (HCVR) 내에 포함된 3개의 중쇄 상보성 결정 영역 (CDR) (HCDR1, HCDR2 및 HCDR3); 및 경쇄 가변 영역 (LCVR) 내에 포함된 3개의 경쇄 CDR (LCDR1, LCDR2 및 LCDR3)을 포함하고, 상기 HCVR은: (i) 서열번호 2, 22, 38 및 55로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열; (ii) 서열번호 2, 22, 38 및 55로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 90%의 동일성을 갖는 아미노산 서열; (iii) 서열번호 2, 22, 38 및 55로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열; 또는 (iv) 12개 이하의 아미노산 치환을 갖는 서열번호 2, 22, 38 및 55로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고; 상기 LCVR은: (a) 서열번호 10, 30, 46 및 63으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열; (b) 서열번호 10, 30, 46 및 63으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 90%의 동일성을 갖는 아미노산 서열; (c) 서열번호 10, 30, 46 및 63으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열; 또는 (d) 10개 이하의 아미노산 치환을 갖는 서열번호 10, 30, 46 및 63로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
[041] 특정 바람직한 구현예에서, 본원의 개시내용은 길항제 방식으로 NPR1에 특이적으로 결합하고, 즉 NPR1 결합 및/또는 활성을 차단하거나 감소시키는 항체를 포함한다.
[042] 본원의 개시내용은 변형된 당화 패턴을 갖는 항-NPR1 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, 바람직하지 않은 당화 부위를 제거하기 위한 변형, 예를 들어, 항체 의존성 세포성 세포독성(ADCC) 기능을 증가시키기 위해 올리고사카라이드 쇄 상에 존재하는 푸코스 잔기가 결핍된 항체가 유용할 수 있다(참조; Shield et al. (2002) JBC 277:26733). 또 다른 응용에서, 보체 의존성 세포독성(CDC)을 변형시키기 위해 갈락토실화의 변형이 이루어질 수 있다.
[043] 특정 구현예에서, 본원의 개시내용은 NPR1에 대한 pH-의존성 결합을 나타내는 항체 및 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 예를 들어, 본원의 개시내용은 염기성 pH에서 보다 중성 pH에서 더 높은 친화성(즉, 염기성 pH에서 감소된 결합)으로 NPR1에 결합하는 항체 및 이의 항원 결합 단편을 포함한다.
[044] 또한, 본원의 개시내용은 HCVR의 CDR 및 LCVR의 CDR을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 NPR1로의 특이적 결합에 대해 경쟁하는 항체 및 이의 항원 결합 단편을 제공하고, 여기서 상기 HCVR 및 LCVR은 각각 표 1에 열거된 HCVR 및 LCVR 서열로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는다.
[045] 또한, 본원의 개시내용은 HCVR의 CDR 및 LCVR의 CDR을 포함하는 참조 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 NPR1로의 결합에 대해 교차 경쟁하는 항체 및 이의 항원 결합 단편을 제공하고, 여기서 상기 HCVR 및 LCVR은 각각 표 1에 열거된 HCVR 및 LCVR 서열로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는다.
[046] 또한, 본원의 개시내용은 HCVR의 3개의 CDR 및 LCVR의 3개의 CDR을 포함하는 참조 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 동일한 에피토프에 결합하는 항체 및 이의 항원 결합 단편을 제공하고, 여기서 상기 HCVR 및 LCVR은 각각 표 1에 열거된 HCVR 및 LCVR 서열로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는다.
[047] 특정 구현예에서, 본원의 개시내용의 항체 또는 항원 결합 단편은 NPR1의 제1 에피토프에 대한 제1 결합 특이성 및 NPR1의 제2 에피토프에 대한 제2 결합 특이성을 포함하는 이특이적이며, 여기서, 상기 제1 및 제2 에피토프는 별개로서 중첩되지 않는다.
[048] 특정 구현예에서, 본원의 개시내용은 단리된 길항제 항-NPR1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하고, 여기서 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다음 특성 중 하나 이상을 갖는다: (a) 완전한 사람 모노클로날 항체이고; (b) 25oC에서 및 37oC에서 사람 NPR1에 결합하고 해리 상수 (KD)는 표면 플라스몬 공명 검정에서 측정시 1.7nM 미만이고; (c) 257oC 및 37oC에서 몽키 NPR1에 결합하고 KD는 표면 플라스몬 공명 검정에서 측정시 1.99nM 미만이고; (d) 25oC에서 및 37oC에서 ANP의 존재하에 사람 NPR1에 결합하고 KD는 표면 플라스몬 공명 검정에서 측정시 1.52nM 미만이고; (e) cGMP 축적 검정으로 측정시, 리간드-유도된 NPR1 활성화(예를 들어, ANP 또는 BNP에 의해 유도됨)를 억제하고; (f) ANP 또는 BNP의 존재 또는 부재하에 사람 NPR1에 결합하고 전기화학발광 기반 면역검정에 의한 측정시, EC50이 2.9nM 미만이고; (g) ANP 또는 BNP의 존재 또는 부재하에 몽키 NPR1에 결합하고 전기화학발광 기반 면역검정에 의한 측정시, EC50이 4.2nM 미만이고; (h) 정상압 및 저혈압 마우스에 투여되는 경우 전신 혈압(수축기, 확장기, 평균 동맥 및 맥박 압력 포함)을 증가시키고, 여기서, 전신 혈압에서의 증가는 단일 용량의 투여 시 최대 약 28일 동안 지속하고; (i) ANP 과발현-유도된 저혈압 마우스에 투여되는 경우 전신 혈압을 증가시키고, 여기서 전신 혈압에서의 증가는 단일 용량의 투여 시 최대 약 28일 동안 지속하고; (j) LPS-유도된 저혈압 마우스에서 전신 혈압을 증가시키고; (k) 표 1에 열거된 HCVR 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 HCVR 및 표 1에 열거된 LCVR 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 LCVR를 포함한다.
[049] 제2 양상에서, 본원의 개시내용은 항-NPR1 항체 또는 이의 부분을 암호화하는 핵산 분자를 제공한다. 특정 구현예에서, 나트륨이뇨 펩타이드 수용체 1(NPR1) 단백질에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄 가변 영역(HCVR)을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자가 제공되고, 여기서 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 NPR1에 결합하여 NPR1을 차단한다. 추가의 구현예에서, 나트륨이뇨 펩타이드 수용체 1(NPR1) 단백질에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 경쇄 가변 영역(LCVR)을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자가 제공되고, 여기서 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 NPR1에 결합하여 NPR1을 차단한다. 예를 들어, 본원의 개시내용은 표 1에 열거된 임의의 HCVR 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 분자를 제공하고; 특정 구현예에서, 상기 핵산 분자는 표 2에 열거된 임의의 HCVR 핵산 서열, 또는 이에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열로부터 선택되는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
[050] 또한, 본원의 개시내용은 표 1에 열거된 임의의 LCVR 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 분자를 제공하고; 특정 구현예에서, 상기 핵산 분자는 표 2에 열거된 임의의 LCVR 핵산 서열, 또는 이에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열로부터 선택되는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
[051] 또한, 본원의 개시내용은 표 1에 열거된 임의의 HCDR1 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 분자를 제공하고; 특정 구현예에서, 상기 핵산 분자는 표 2에 열거된 임의의 HCDR1 핵산 서열, 또는 이에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열로부터 선택되는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
[052] 또한, 본원의 개시내용은 표 1에 열거된 임의의 HCDR2 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 분자를 제공하고; 특정 구현예에서, 상기 핵산 분자는 표 2에 열거된 임의의 HCDR2 핵산 서열, 또는 이에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열로부터 선택되는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
[053] 또한, 본원의 개시내용은 표 1에 열거된 임의의 HCDR3 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 분자를 제공하고; 특정 구현예에서, 상기 핵산 분자는 표 2에 열거된 임의의 HCDR3 핵산 서열, 또는 이에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열로부터 선택되는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
[054] 또한, 본원의 개시내용은 표 1에 열거된 임의의 LCDR1 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 분자를 제공하고; 특정 구현예에서, 상기 핵산 분자는 표 2에 열거된 임의의 LCDR1 핵산 서열, 또는 이에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열로부터 선택되는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
[055] 또한, 본원의 개시내용은 표 1에 열거된 임의의 LCDR2 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 분자를 제공하고; 특정 구현예에서, 상기 핵산 분자는 표 2에 열거된 임의의 LCDR2 핵산 서열, 또는 이에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열로부터 선택되는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
[056] 또한, 본원의 개시내용은 표 1에 열거된 임의의 LCDR3 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 분자를 제공하고; 특정 구현예에서, 상기 핵산 분자는 표 2에 열거된 임의의 LCDR3 핵산 서열, 또는 이에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열로부터 선택되는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
[057] 또한, 본원의 개시내용은 HCVR을 암호화하는 핵산 분자를 제공하고, 여기서 상기 HCVR은 3개의 CDR의 세트 (즉, HCDR1-HCDR2-HCDR3)를 포함하고, 상기 HCDR1-HCDR2-HCDR3 아미노산 서열 세트는 표 1에 열거된 임의의 예시적인 항체에 의해 정의된 바와 같다.
[058] 또한, 본원의 개시내용은 LCVR을 암호화하는 핵산 분자를 제공하고, 여기서 상기 LCVR은 3개의 CDR의 세트 (즉, LCDR1-LCDR2-LCDR3)를 포함하고, 상기 LCDR1-LCDR2-LCDR3 아미노산 서열 세트는 표 1에 열거된 임의의 예시적인 항체에 의해 정의된 바와 같다.
[059] 또한, 본원의 개시내용은 HCVR 및 LCVR 둘다를 암호화하는 핵산 분자를 제공하고, 여기서 상기 HCVR은 표 1에 열거된 임의의 HCVR 아미노산 서열의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 LCVR은 표 1에 열거된 임의의 LCVR 아미노산 서열의 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 핵산 분자는 표 2에 열거된 임의의 HCVR 핵산 서열, 또는 이에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열로부터 선택되는 폴리뉴클레오타이드 서열, 및 표 1에 열거된 임의의 LCVR 핵산 서열, 또는 이에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열로부터 선택되는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 본원 개시내용의 상기 양상에 따른 특정 구현예에서, 상기 핵산 분자는 HCVR 및 LCVR을 암호화하고, 여기서 HCVR 및 LCVR은 둘다 표 1에 열거된 동일한 항-NPR1 항체로부터 유래한다.
[060] 관련 양상에서, 본원의 개시내용은 나트륨이뇨 펩타이드 수용체 1(NPR1) 단백질에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 HCVR을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터를 제공하고, 여기서 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 NPR1에 결합하여 NPR1을 차단한다. 또 다른 관련 양상에서, 본원의 개시내용은 나트륨이뇨 펩타이드 수용체 1(NPR1) 단백질에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 LCVR을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터를 제공하고, 여기서 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 NPR1에 결합하여 NPR1을 차단한다. 또 다른 관련 양상에서, 본원의 개시내용은 항체의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩타이드를 발현할 수 있는 재조합 발현 벡터를 제공한다. 예를 들어, 본원의 개시내용은 상기 언급한 임의의 핵산 분자, 즉, 표 2에 제시된 바와 같은 HCVR, LCVR 및/또는 CDR 서열 중 임의의 것을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 포함한다. 특정 구현예에서, 본원의 개시내용은 다음을 포함하는 발현 벡터를 제공한다: (a) NPR1에 결합하는 항체의 HCVR을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자로서, 상기 HCVR이 표 1에 열거된 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 핵산 분자; 및/또는 (b) NPR1에 결합하는 항체의 LCVR을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자로서, 상기 LCVR이 표 1에 열거된 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 핵산 분자. 또한, 항체 또는 항체 단편의 생산을 가능케 하는 조건 하에 본원의 개시내용에 따른 벡터를 포함하는 숙주 세포를 배양하고, 이렇게 하여 생산된 항체 및 항체 단편을 회수함으로써 항체 또는 이의 일부를 제조하는 방법뿐만 아니라 본원 개시내용에 따른 벡터를 포함하는 숙주 세포는 본원의 개시내용의 범위 내에 포함된다. 특정 구현예에서, 본원의 개시내용에 따른 제조 방법은 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물로서 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제형화하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, 숙주 세포는 포유동물 세포 또는 원핵 세포를 포함한다. 특정 구현예에서, 숙주 세포는 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포 또는 에스케리치아 콜리(Escherichia coli (이. 콜리(E. Coli))) 세포이다. 특정 구현예에서, 본원의 개시내용은 본원의 개시내용의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제조하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 프로모터에 작동적으로 연결된 본원의 개시내용의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 HCVR 및/또는 LCVR을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터를 숙주 세포에 도입하는 단계; 상기 숙주 세포를 핵산 서열의 발현을 위해 선호될 수 있는 조건하에 배양하는 단계; 및 상기 배양 배지 및/또는 숙주 세포로부터 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 단리하는 단계를 포함한다. 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 정제될 수 있다.
[061] 제3 양상에서, 본원의 개시내용은 나트륨이뇨 펩타이드 수용체 1(NPR1) 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공하고, 여기서 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 NPR1에 결합하여 NPR1을 차단한다. 또 다른 구현예에서, 약제학적 조성물은 NPR1에 특이적으로 결합하는, 치료학적 유효량의 적어도 하나의 재조합 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 관련 양상에서, 본원의 개시내용은 항-NPR1 항체와 제2 치료학적 제제 또는 치료요법의 조합물인 조성물을 특징으로 한다. 하나의 구현예에서, 상기 제2 치료학적 제제 또는 치료요법은 항-NPR1 항체와 유리하게 조합되는 임의의 제제 또는 치료요법이다. 길항제 항-NPR1 항체와 유리하게 조합될 수 있는 예시적인 제제 또는 치료요법으로는, 제한없이, NPR1과 결합하고/하거나 NPR1 신호 전달 및/또는 활성을 차단하는 기타 제제 (다른 항체 또는 이의 항원 결합 단편 등을 포함) 및/또는 NPR1에 직접적으로는 결합하지 않지만 NPR1-관련 질환 또는 장애의 적어도 하나의 증상 또는 징후를 치료하거나 개선시키는 제제(본원의 다른 곳에 기재된)를 포함한다. 본원의 개시내용의 항-NPR1 항체를 포함하는 추가의 조합 치료요법 및 보조 제형은 본원의 다른 곳에 기재되어 있다.
[062] 제4 양상에서, 본원의 개시내용은 항-NPR1 항체 또는 본원의 개시내용의 항체의 항원 결합 부분을 사용하여 대상체에서 NPR1과 관련된 질환 또는 장애를 치료하기 위한 치료학적 방법을 제공하고, 여기서 상기 치료학적 방법은 치료학적 유효량의 항체 또는 본원의 개시내용에 따른 항체의 항원 결합 단편을 포함하는 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 치료되는 장애는 NPR1 활성 (예를 들어, 저혈압)에 의해 개선되거나, 개량되거나, 억제되거나 예방되는 임의의 질환 또는 병태이다. 특정 구현예에서, NPR1 관련 질환 또는 장애는 저혈압, 순환기 쇼크, 패혈성 쇼크, 신경성 기립성 저혈압, 자세성 기립성 빈맥 증후군(POTS), 심부전, 심장성 쇼크, 비만, 신부전, 만성 콩팥 질환, 황반부종, 녹내장, 뇌졸중, 폐 장애, 폐 섬유증, 염증, 천식, 골격 성장 장애, 골절, 당뇨병, 저혈당 및 암으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
[063] 특정 구현예에서, 본원의 개시내용은 본원의 개시내용의 치료학적 유효량의 항-NPR1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 NPR1-관련 질환 또는 장애를 예방하거나 치료하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 대상체(예를 들어, NPR1 관련 질환 또는 장애를 앓거나 이에 걸릴 위험이 있는 대상체)에게 예방학적으로 또는 치료학적으로 투여될 수 있다. 특정 구현예에서, 본원의 개시내용에 따른 항체 또는 항원 결합 단편, 또는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물은 제2 치료학적 제제 또는 치료요법과 조합하여 투여된다. 제2 치료학적 제제 또는 치료요법은 특정 구현예에서 혈관신생 억제제, 혈관수축제(vasoconstrictor)/혈관수축제(vasopressor), 면역 억제제, 아스코르브산, 칼시뉴린 억제제, 코르티코스테로이드, VEGF 억제제, 충혈 완화제, 항우울제, 호르몬 피임약, 자극제(심장 자극제 포함), 카페인, 체외막 산소화, 심실 보조 장치, 대동맥 내 풍선 펌프, 생활 습관 교정, 식이 보충제, 항미생물성 약물, 인슐린 및 항염증 약물로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 제2 치료학적 제제 또는 치료요법은 부작용이 발생하는 경우, 본원의 개시내용의 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 관련된 가능한 임의의 부작용(들)을 해소 또는 감소시키는데 도움이 되는 제제 또는 치료요법일 수 있다. 본원의 개시내용에 따른 항체 또는 이의 단편, 또는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물은 피하, 정맥내, 피내, 복막내, 경구 또는 근육 내로 투여될 수 있다. 항체 또는 이의 단편은 대상체의 약 0.1 mg/kg 체중 내지 약 100 mg/kg 체중으로 투여될 수 있다. 특정 구현예에서, 본원의 개시내용의 항체는 10mg 내지 600 mg을 포함하는 1회 이상의 용량으로 투여될 수 있다.
[064] 또한, 본원의 개시내용은 NPR1 결합 및/또는 활성의 차단이 이득이 되는 질환 또는 장애의 치료를 위한 약제의 제조에 있어서 본원의 개시내용의 항-NPR1 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 용도를 포함한다.
[065] 다른 구현예는 계속되는 발명의 상세한 설명으로부터 자명해질 것이다.
[066] 도 1a 및 1b는 항-NPR1 항체가 (도 1a) ANP 및 (도 1b) BNP 유도된 hNPR1 활성화를 억제함을 보여준다. 세포를 37℃에서 15분 동안 증가하는 농도의 항-NPR1 항체, 대조군 mAb 또는 희석 완충액 단독으로 전처리하고 이어서, 37℃에서 30분 동안 증가하는 농도의 ANP, BNP, 0.2 nM ANP 또는 0.7 nM BNP로 전처리하였다. 실험은 이중으로 수행하였다. 열린 기호는 시험 물품이 첨가되지 않았거나 일정한 농도의 ANP 또는 BNP만 첨가된 경우의 조건을 나타내고, 닫힌 기호는 희석 완충액: 0.1% FBS를 갖는 OptiMEM를 다양한 농도로 시험 물품을 첨가한 경우의 조건을 지적한다.
[067] 도 2a-2e는 HEK293/hNPR1 세포를 사용한 (도 2a) H4H22034N, (도 2b) REGN7541, (도 2c) REGN7544 및 (도 2d) REGN7548에 의한 NPR1의 ANP 매개 활성화의 비경쟁적 억제를 보여준다. 도 2a 내지 2d의 패널 데이터를 쉴드 플롯 분석(도 2e)으로 분석하여 각 항-NPR1 항체에 대한 쉴드(Schild) 기울기를 평가하였다. 형광성 강도 및 cGMP 농도의 검출은 실험 절차에 기재된 바와 같이 계산하였다. 실험은 이중으로 수행하였다. 지적된 각 항체 농도에 대한 리간드 자극은 0.1 pM에서 플롯팅되지 않았고 쉴드 플롯 분석에 포함되지 않았다. 열린 기호는 시험 물품 없이 ANP 단독의 조건을 나타내고; 닫힌 기호는 시험 물품이 50nm, 150nm 또는 450nm의 지적된 농도에서 1pM 내지 1μM 농도 범위의 ANP; 희석 완충액: 0.1% FBS와 함께 OptiMEM; CR: 농도 비로 첨가된 경우의 조건을 나타낸다.
[068] 도 3a-3c는 항-NPR1 항체가 리간드의 부재 또는 (도 3b) 100nm ANP 또는 (도 3c) 100nm BNP의 존재하에 2차 ADC(도 3a)를 사용한 세포독성 검정으로 측정시 NPR1 내재화를 유도하는 것을 보여준다. HEK293/hNPR1 세포를 37℃에서 5분 동안 100nM ANP 또는 100nM BNP의 존재 또는 부재하에 증가하는 농도의 항-NPR1 항체, 대조군 mAb 또는 희석 완충액 단독으로 전처리함에 이어서 37℃에서 3일 동안 2차 ADC 처리를 실시하였다. 실험은 이중으로 수행하였다. 열린 기호는 시험 물품이 첨가되지 않았거나 일정한 농도의 ANP 또는 BNP만 첨가된 경우의 조건을 나타내고, 닫힌 기호는 희석 완충액: 0.1% FBS를 갖는 OptiMEM를 다양한 농도로 시험 물품을 첨가한 경우의 조건을 지적한다.
[069] 도 4는 정상 혈압 NPR1hu/hu 마우스-단일 25 mg/kg 용량의 맥박 압력에 대한 NPR1 길항제 mAb의 급성 효과를 보여준다. 원격 측정된 정상 혈압 NPR1hu / hu 마우스는 체중을 기준으로 무작위로 그룹에 할당하였다. 동물에 표 25에 기재된 바와 같은 NPR1 길항제 mAb 또는 PBS를 단일 25mg/kg의 정맥내 주사로 투여하였다. 모든 값은 평균 ± SEM, 그룹 당 n=6이다.
[070] 도 5는 정상 혈압 NPR1hu/hu 마우스-단일 25 mg/kg 용량의 수축기 혈압에 대한 NPR1 길항제 mAb의 효과를 보여준다. 원격 측정된 정상 혈압 NPR1hu / hu 마우스는 체중을 기준으로 무작위로 그룹에 할당하였다. 동물에 표 25에 기재된 바와 같은 NPR1 길항제 mAb 또는 PBS를 단일 25mg/kg의 정맥내 주사를 투여하였다. 모든 값은 평균 ± SEM, 그룹 당 n=6이다.
[071] 도 6은 정상 혈압 NPR1hu/hu 마우스-단일 1 mg/kg 용량의 수축기 혈압에 대한 NPR1 길항제 mAb의 효과를 보여준다. 원격 측정된 정상 혈압 NPR1hu / hu 마우스는 체중을 기준으로 무작위로 그룹에 할당하였다. 동물에 표 28에 기재된 바와 같이, NPR1 길항제 mAb의 단일 1 mg/kg의 피하 주사 또는 gG4P 이소타입 대조군 mAb의 단일 25mg/kg의 주사를 투여하였다. 모든 값은 평균 ± SEM, 그룹 당 n=4-5이다.
[072] 도 7은 정상 혈압 NPR1hu/hu 마우스-단일 25 mg/kg 용량의 수축기 혈압에 대한 NPR1 길항제 mAb의 효과를 보여준다. 원격 측정된 정상 혈압 NPR1hu / hu 마우스는 체중을 기준으로 무작위로 그룹에 할당하였다. 동물에 표 28에 기재된 바와 같이, NPR1 길항제 mAb 또는 IgG4P 이소타입 대조군 mAb의 단일 25mg/kg 피하 주사를 투여하였다. 모든 값은 평균 ± SEM, 그룹 당 n=4-5이다.
[073] 도 8은 ANP 과발현 유도된 저혈압 NPR1hu/hu 마우스에서 수축기 혈압에 대한 NPR1 길항제 mAb의 효과를 보여준다. 원격 측정된 정상 혈압 NPR1hu / hu 마우스는 체중을 기준으로 무작위로 그룹에 할당하였다. 동물에게 대조군 또는 ANP 플라스미드의 단일 50 ug HDD 용량을 투여함에 이어서 표 31에 기재된 바와 같이 NPR1 길항제 mAb 또는 이소타입 대조군의 단일 25 mg/kg 정맥내 주사를 투여하였다. 모든 값은 평균 ± SEM, 그룹 당 n=4-7이다.
[074] 도 9a 및 9b는 과발현 유도된 저혈압 NPR1hu/hu 마우스에 대한 절대적(도 9a) 및 상대적 심장 무게(도 9b)에 대한 NPR1 길항제 mAb의 효과를 보여준다. 원격 측정된 정상 혈압 NPR1hu / hu 마우스는 체중을 기준으로 무작위로 그룹에 할당하였다. 동물에 표 31에 기재된 바와 같이, NPR1 길항제 mAb 또는 IgG4P 이소타입 대조군 mAb의 단일 25mg/kg 피하 주사를 투여하였다. 모든 값은 평균 ± SEM, 그룹 당 n=5-8이다.
[075] 도 10은 LPS로 유도된 저혈압 NPR1hu/hu 마우스-단일 25 mg/kg 예방학적 또는 치료학적 정맥내 투여의 맥박 압력에 대한 NPR1 길항제 mAb의 효과를 보여준다. 원격 측정된 NPR1hu / hu 마우스는 체중을 기준으로 무작위로 그룹에 할당하였다. 표 35에 기재된 바와 같이 동물에게 LPS 또는 식염수의 단일 5mg/kg 복막내 주사 및 LPS 투여 약 24시간 전 또는 투여 후 약 8시간 이내에 NPR1 길항제 mAb 또는 PBS의 단일 정맥내 주사를 투여하였다. 모든 값은 평균 ± SEM, 그룹 당 n=7-10이다.
[076] 도 11은 REGN7544 또는 비히클 대조군 투여 3일 전부터 실험 종료 시까지 각 치료 그룹에 대해 기준선으로 정규화된 맥박 압력의 평균 변화를 보여준다. 데이터는 평균 ± 평균의 표준 오차(SEM)로 표현한다.
[077] 도 12는 REGN7544 또는 비히클 대조군 투여 3일 전부터 실험 종료 시까지 각 치료 그룹에 대해 기준선으로 정규화된 수축기 혈압의 평균 변화를 보여준다. 데이터는 평균 ± 평균의 표준 오차(SEM)로 표현한다. 세로 줄무늬 선은 투여 경로(즉, SC 또는 PO)에 따라 표시된 약물의 투여를 나타낸다.
[067] 도 2a-2e는 HEK293/hNPR1 세포를 사용한 (도 2a) H4H22034N, (도 2b) REGN7541, (도 2c) REGN7544 및 (도 2d) REGN7548에 의한 NPR1의 ANP 매개 활성화의 비경쟁적 억제를 보여준다. 도 2a 내지 2d의 패널 데이터를 쉴드 플롯 분석(도 2e)으로 분석하여 각 항-NPR1 항체에 대한 쉴드(Schild) 기울기를 평가하였다. 형광성 강도 및 cGMP 농도의 검출은 실험 절차에 기재된 바와 같이 계산하였다. 실험은 이중으로 수행하였다. 지적된 각 항체 농도에 대한 리간드 자극은 0.1 pM에서 플롯팅되지 않았고 쉴드 플롯 분석에 포함되지 않았다. 열린 기호는 시험 물품 없이 ANP 단독의 조건을 나타내고; 닫힌 기호는 시험 물품이 50nm, 150nm 또는 450nm의 지적된 농도에서 1pM 내지 1μM 농도 범위의 ANP; 희석 완충액: 0.1% FBS와 함께 OptiMEM; CR: 농도 비로 첨가된 경우의 조건을 나타낸다.
[068] 도 3a-3c는 항-NPR1 항체가 리간드의 부재 또는 (도 3b) 100nm ANP 또는 (도 3c) 100nm BNP의 존재하에 2차 ADC(도 3a)를 사용한 세포독성 검정으로 측정시 NPR1 내재화를 유도하는 것을 보여준다. HEK293/hNPR1 세포를 37℃에서 5분 동안 100nM ANP 또는 100nM BNP의 존재 또는 부재하에 증가하는 농도의 항-NPR1 항체, 대조군 mAb 또는 희석 완충액 단독으로 전처리함에 이어서 37℃에서 3일 동안 2차 ADC 처리를 실시하였다. 실험은 이중으로 수행하였다. 열린 기호는 시험 물품이 첨가되지 않았거나 일정한 농도의 ANP 또는 BNP만 첨가된 경우의 조건을 나타내고, 닫힌 기호는 희석 완충액: 0.1% FBS를 갖는 OptiMEM를 다양한 농도로 시험 물품을 첨가한 경우의 조건을 지적한다.
[069] 도 4는 정상 혈압 NPR1hu/hu 마우스-단일 25 mg/kg 용량의 맥박 압력에 대한 NPR1 길항제 mAb의 급성 효과를 보여준다. 원격 측정된 정상 혈압 NPR1hu / hu 마우스는 체중을 기준으로 무작위로 그룹에 할당하였다. 동물에 표 25에 기재된 바와 같은 NPR1 길항제 mAb 또는 PBS를 단일 25mg/kg의 정맥내 주사로 투여하였다. 모든 값은 평균 ± SEM, 그룹 당 n=6이다.
[070] 도 5는 정상 혈압 NPR1hu/hu 마우스-단일 25 mg/kg 용량의 수축기 혈압에 대한 NPR1 길항제 mAb의 효과를 보여준다. 원격 측정된 정상 혈압 NPR1hu / hu 마우스는 체중을 기준으로 무작위로 그룹에 할당하였다. 동물에 표 25에 기재된 바와 같은 NPR1 길항제 mAb 또는 PBS를 단일 25mg/kg의 정맥내 주사를 투여하였다. 모든 값은 평균 ± SEM, 그룹 당 n=6이다.
[071] 도 6은 정상 혈압 NPR1hu/hu 마우스-단일 1 mg/kg 용량의 수축기 혈압에 대한 NPR1 길항제 mAb의 효과를 보여준다. 원격 측정된 정상 혈압 NPR1hu / hu 마우스는 체중을 기준으로 무작위로 그룹에 할당하였다. 동물에 표 28에 기재된 바와 같이, NPR1 길항제 mAb의 단일 1 mg/kg의 피하 주사 또는 gG4P 이소타입 대조군 mAb의 단일 25mg/kg의 주사를 투여하였다. 모든 값은 평균 ± SEM, 그룹 당 n=4-5이다.
[072] 도 7은 정상 혈압 NPR1hu/hu 마우스-단일 25 mg/kg 용량의 수축기 혈압에 대한 NPR1 길항제 mAb의 효과를 보여준다. 원격 측정된 정상 혈압 NPR1hu / hu 마우스는 체중을 기준으로 무작위로 그룹에 할당하였다. 동물에 표 28에 기재된 바와 같이, NPR1 길항제 mAb 또는 IgG4P 이소타입 대조군 mAb의 단일 25mg/kg 피하 주사를 투여하였다. 모든 값은 평균 ± SEM, 그룹 당 n=4-5이다.
[073] 도 8은 ANP 과발현 유도된 저혈압 NPR1hu/hu 마우스에서 수축기 혈압에 대한 NPR1 길항제 mAb의 효과를 보여준다. 원격 측정된 정상 혈압 NPR1hu / hu 마우스는 체중을 기준으로 무작위로 그룹에 할당하였다. 동물에게 대조군 또는 ANP 플라스미드의 단일 50 ug HDD 용량을 투여함에 이어서 표 31에 기재된 바와 같이 NPR1 길항제 mAb 또는 이소타입 대조군의 단일 25 mg/kg 정맥내 주사를 투여하였다. 모든 값은 평균 ± SEM, 그룹 당 n=4-7이다.
[074] 도 9a 및 9b는 과발현 유도된 저혈압 NPR1hu/hu 마우스에 대한 절대적(도 9a) 및 상대적 심장 무게(도 9b)에 대한 NPR1 길항제 mAb의 효과를 보여준다. 원격 측정된 정상 혈압 NPR1hu / hu 마우스는 체중을 기준으로 무작위로 그룹에 할당하였다. 동물에 표 31에 기재된 바와 같이, NPR1 길항제 mAb 또는 IgG4P 이소타입 대조군 mAb의 단일 25mg/kg 피하 주사를 투여하였다. 모든 값은 평균 ± SEM, 그룹 당 n=5-8이다.
[075] 도 10은 LPS로 유도된 저혈압 NPR1hu/hu 마우스-단일 25 mg/kg 예방학적 또는 치료학적 정맥내 투여의 맥박 압력에 대한 NPR1 길항제 mAb의 효과를 보여준다. 원격 측정된 NPR1hu / hu 마우스는 체중을 기준으로 무작위로 그룹에 할당하였다. 표 35에 기재된 바와 같이 동물에게 LPS 또는 식염수의 단일 5mg/kg 복막내 주사 및 LPS 투여 약 24시간 전 또는 투여 후 약 8시간 이내에 NPR1 길항제 mAb 또는 PBS의 단일 정맥내 주사를 투여하였다. 모든 값은 평균 ± SEM, 그룹 당 n=7-10이다.
[076] 도 11은 REGN7544 또는 비히클 대조군 투여 3일 전부터 실험 종료 시까지 각 치료 그룹에 대해 기준선으로 정규화된 맥박 압력의 평균 변화를 보여준다. 데이터는 평균 ± 평균의 표준 오차(SEM)로 표현한다.
[077] 도 12는 REGN7544 또는 비히클 대조군 투여 3일 전부터 실험 종료 시까지 각 치료 그룹에 대해 기준선으로 정규화된 수축기 혈압의 평균 변화를 보여준다. 데이터는 평균 ± 평균의 표준 오차(SEM)로 표현한다. 세로 줄무늬 선은 투여 경로(즉, SC 또는 PO)에 따라 표시된 약물의 투여를 나타낸다.
[078] 본원의 방법을 기재하기 전에, 방법과 조건들은 다양할 수 있기 때문에, 본원의 개시내용은 여기에 기재된 특정한 방법과 실험 조건들에 한정되지 않는다는 점을 이해해야 한다. 또한, 본원에 사용된 용어는 단지 특정 구현예를 기술할 목적인 것이고 본 발명의 범위는 첨부된 청구항에 의해서만 제한될 것이기 때문에 제한하는 것으로 의도지 않는 것으로 이해되어야만 한다.
[079] 달리 정의되지 않는 경우, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 당업계의 기술자가 통상적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것과 유사하거나 균등한 임의의 방법과 물질들을 본 발명의 실시 또는 시험에 사용할 수 있으나, 바람직한 방법과 물질들이 지금 기재된다. 본원에서 언급한 모든 간행물들은 전문이 본원에 참고로 포함된다.
정의
[080] 또한 “NPRA”로 불리우는 용어 “NPR1”은 나트륨이뇨 펩타이드 수용체 1 (또한 나트륨이뇨 펩타이드 수용체 A로서 공지된)을 지칭한다. NPR1은 cGMP 합성을 촉매하는 효소인 동종이량체 막관통 구아닐레이트 사이클라제이다. NPR1은 심방 (ANP) 및 뇌 (BNP) 나트륨이뇨 펩타이드 둘다에 대한 수용체이고 리간드 결합 시, 세포외 도메인에서의 형태적 변화를 진행한다(문헌참조: Ogawa et al 2004, J. Biol. Chem. 279: 28625-31). 단백질은 세포외 리간드 결합 도메인, 단일 막관통 스패닝 영역, 세포내 단백질 키나제 유사 상동성 도메인 및 구아닐릴 사이클라제 촉매 도메인을 포함하는 4개의 특유한 영역을 갖는다. 전장 NPR1 단백질의 아미노산 서열은 승인 번호 P16066.1로서 UniProtKB/Swiss-Prot 에 제공된 아미노산 서열에 의해 예시된다. 용어 “NPR1“은 재조합 NPR1 단백질 또는 이의 단편을 포함한다. 상기 용어는 또한 예를 들어, 히스티딘 태그, 마우스 또는 사람 Fc, 또는 신호 서열, 예를 들어, ROR1(예를 들어, 서열번호 74-78)에 커플링된 NPR1 단백질 또는 이의 단편을 포함한다.
[081] 본원에 사용된 "항체"라는 용어는 디설파이드 결합에 의해 서로 연결된 2개의 중쇄(H) 및 2개의 경쇄(L)인 4개의 폴리펩타이드 쇄로 구성된 면역글로불린 분자 (즉, "전장 항체 분자") 및 이의 다량체 (예를 들어, IgM) 또는 이의 항원 결합 단편을 지칭하는 것으로 의도된다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역 (“HCVR” 또는 “VH”) 및 중쇄 불변 영역 (도메인 CH1, CH2 및 CH3으로 구성된)으로 구성된다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역 (“LCVR 또는 “VL”) 및 경쇄 불변 영역 (CL)으로 구성된다. 상기 VH 및 VL 영역은 프레임워크 영역 (FR)이라 호칭되는 보다 보존된 영역과 교차배치된 상보성 결정 영역 (CDR)으로 호칭되는 초가변 영역으로 더 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 하기의 순서로 아미노 말단으로부터 카복시 말단으로 정렬된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 본원 개시내용의 특정 구현예에서, 상기 항체 (또는 이의 항원 결합 단편)의 FR은 사람 생식세포 계열의 서열과 동일할 수 있거나, 천연적으로 또는 인공적으로 변형될 수 있다. 아미노산 컨센서스 서열(consensus sequence)은 2개 이상의 CDR의 병행 분석을 기반으로 정의될 수 있다.
[082] 하나 이상의 CDR 잔기의 치환 또는 하나 이상의 CDR의 생략이 또한 가능할 수 있다. 항체는 결합을 위해 하나 또는 두 개의 CDR을 생략할 수 있는 것으로 과학 문헌에 기재되어 있다. 패들란(Padlan) 등 (1995 FASEB J. 9:133-139)은 공개된 결정 구조를 기초로 항체와 이들의 항원 사이의 접촉 영역을 분석하여 CDR 잔기의 약 1/5 내지 1/3만이 실제로 항원과 접촉하고 있는 것으로 결론지었다. 또한, 패들란은 1개 또는 2개의 CDR이 항원과 접촉하고 있는 아미노산이 없는 다수의 항체도 확인하였다 (하기 문헌도 참조: Vajdos et al. 2002 J Mol Biol 320:415-428).
[083] 항원과 접촉하지 않는 CDR 잔기는 분자 모델링 및/또는 경험적으로 이전 연구(예를 들어, CDRH2의 잔기 H60-H65은 흔히 요구되지 않음)를 기반으로 초티아 CDR 외부에 있는 카바트 CDR의 영역에서 동정될 수 있다. CDR 또는 이의 잔기(들)이 누락되는 경우, 이는 통상적으로 또 다른 사람 항체 서열 또는 이러한 서열의 컨센서스 중의 해당 위치를 차지하고 있는 아미노산으로 치환된다. CDR 내 치환을 위한 위치 및 치환할 아미노산도 경험적으로 선택될 수 있다. 경험적 치환은 보존적 또는 비보존적 치환일 수 있다.
[084] 본원에 개시된 전장 사람 항-NPR1 단일클론 항체는, 상응하는 생식세포 계열의 서열과 비교하여, 중쇄 및 경쇄 가변 도메인의 골격 및/또는 CDR 영역 내에 하나 이상의 아미노산 치환, 삽입 및/또는 결실을 포함할 수 있다. 이러한 돌연변이는 본원에 기재된 아미노산 서열을 예를 들어, 공공 항체 서열 데이터베이스로부터 이용가능한 생식세포 계열의 서열과 비교함으로써 용이하게 확인될 수 있다. 본원의 개시내용은 임의의 본원에 개시된 아미노산 서열로부터 유래되는 항체 및 이의 항원 결합 단편으로서, 하나 이상의 프레임워크 및/또는 CDR 영역 내의 하나 이상의 아미노산이 항체가 유래되는 생식세포 계열의 서열 중의 상응하는 잔기(들)로 돌연변이되거나, 또 다른 사람 생식세포 계열의 서열 중의 상응하는 잔기(들)로 돌연변이되거나, 상응하는 생식세포 계열의 잔기(들)의 보존적 아미노산 치환으로 돌연변이되는 (이러한 서열 변화들은 본원에서 총괄적으로 "생식세포 계열의 돌연변이"로 지칭함), 상기 항체 및 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 당업계의 숙련자라면 누구나, 본원에 개시된 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열로부터 출발하여, 하나 이상의 개별 생식세포 계열의 돌연변이 또는 이들의 조합을 포함하는 다수의 항체 및 항원 결합 단편을 쉽게 제조할 수 있다. 특정 구현예에서, V H 및/또는 V L 도메인 내의 모든 프레임워크 및/또는 CDR 잔기들은 항체가 이로부터 유래되는 본래의 생식계열의 서열에서 발견되는 잔기들로 복귀 돌연변이된다. 다른 구현예에서, 오직 특정 잔기들만 본래의 생식계열의 서열로 복귀 돌연변이되는데, 예를 들어, FR1의 처음 8개의 아미노산 내 또는 FR4의 마지막 8개의 아미노산 내에서 발견되는 돌연변이된 잔기들만, 또는 CDR1, CDR2 또는 CDR3 내에서 발견되는 돌연변이된 잔기들만이 본래의 생식계열의 서열로 복귀 돌연변이된다. 다른 구현예에서, 하나 이상의 프레임워크 및/또는 CDR 잔기(들)은 상이한 생식계열의 서열 (즉, 항체가 본래 유래된 생식계열의 서열과는 다른 생식계열의 서열)의 상응하는 잔기(들)로 돌연변이된다. 추가로, 본원의 개시내용의 항체는 프레임워크 및/또는 CDR 영역 내에 2개 이상의 생식세포 계열의 돌연변이의 임의의 조합, 예를 들어, 특정 개별 잔기들은 특정 생식세포 계열의 서열의 상응하는 잔기로 돌연변이되는 한편, 본래의 생식세포 계열의 서열과는 다른 특정한 다른 잔기들은 유지되거나 상이한 생식세포 계열의 서열의 상응하는 잔기로 돌연변이되는 임의의 상기 조합을 포함할 수 있다. 하나 이상의 생식세포 계열의 돌연변이를 포함하는 항체 및 항원 결합 단편은, 일단 수득되면, 하나 이상의 목적하는 성질, 예를 들어, 개선된 결합 특이성, 증가된 결합 친화성, 개선된 또는 증진된 길항성 생물학적 성질, 감소된 면역원성 등에 대하여 용이하게 시험할 수 있다. 상기 일반적인 방식으로 수득된 항체 및 항원 결합 단편은 본원 개시내용에 포함된다.
[085] 또한, 본원의 개시내용은 하나 이상의 보존적 치환을 갖는 본원에 기재된 임의의 HCVR, LCVR, 및/또는 CDR 아미노산 서열의 변이체를 포함하는 전장 사람 항-NPR1 모노클로날 항체를 포함한다. 예를 들어, 본원의 개시내용은 본원에 기재된 임의의 HCVR, LCVR 및/또는 CDR 아미노산 서열에 비해 예를 들어, 10개 이하, 8개 이하, 6개 이하, 4개 이하 등의 보존적 아미노산 치환을 갖는 HCVR, LCVR 및/또는 CDR 아미노산 서열을 갖는 항-NPR1 항체를 포함한다.
[086] 본원에 사용된 바와 같은 용어 “사람 항체” 또는 “완전한 사람 항체”는 사람 생식세포 계열의 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 불변 영역을 갖는 항체를 포함하는 것으로 의도된다. 본원 개시내용의 사람 mAb는, 예를 들어, CDR에서 및 특히 CDR3에서, 사람 생식세포 계열 면역글로불린 서열에 의해 암호화되지 않은 아미노산 잔기 (예를 들어, 시험관 내에서 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이 유발 또는 생체 내에서 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다. 그러나, 본원에 사용된 바와 같은 "사람 항체” 또는 “완전한 사람 항체”라는 용어는 또 다른 포유동물 종 (예를 들어, 마우스)의 생식세포 계열로부터 유래된 CDR 서열이 사람 FR 서열로 이식된 mAb를 포함하는 것으로 의도되지 않는다. 상기 용어는 비-사람 포유동물, 또는 비-사람 포유동물의 세포에서 재조합에 의해 제조된 항체를 포함한다. 상기 용어는 사람 대상체로부터 단리되거나 사람 대상체에서 생성된 항체를 포함하는 것으로 의도되지 않는다.
[087] 본원에서 사용된 "재조합"이라는 용어는 예를 들어, DNA 스플라이싱(splicing) 및 전이유전자 발현을 포함하는 재조합 DNA 기법으로 당업계에 공지된 기법 또는 방법들에 의해 생성되거나, 발현되거나, 단리되거나 또는 수득된 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 언급한다. 상기 용어는 사람이 아닌 포유동물 (사람이 아닌 유전자전이 포유동물, 예를 들어, 유전자전이 마우스 포함), 또는 세포 (예를 들어, CHO 세포) 발현 시스템에서 발현되거나 또는 재조합 조합형 사람 항체 라이브러리로부터 분리된 항체를 지칭한다.
[088] “특이적으로 결합한다" 또는 "에 특이적으로 결합한다" 등의 용어는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 생리학적 조건 하에서 비교적 안정한 항원과 복합체를 형성한다는 것을 의미한다. 특이적 결합은 적어도 약 1x10-8 M 이하의 평형 해리 상수를 특징으로 할 수 있다 (예를 들어, 더 작은 KD는 더 단단한 결합을 나타냄). 두 분자가 특이적으로 결합하는지의 여부를 측정하는 방법은 당업계에 널리 공지되어 있으며, 예를 들어, 평형 투석, 표면 플라스몬 공명 등을 포함한다. 본원에 기재된 바와 같이, NPR1에 특이적으로 결합하는 항체는 표면 플라스몬 공명, 예를 들어, BIACORE™에 의해 동정되었다. 또한, NPR1에서 하나의 도메인, 및 하나 이상의 추가의 항원에 결합하는 다중 특이적 항체, 또는 NPR1의 2개의 상이한 영역에 결합하는 이중 특이적 항체는 이렇더라도 본원에서 사용된 "특이적으로 결합하는" 항체로 간주된다.
[089] “높은 친화성"의 항체라는 용어는 표면 플라스몬 공명, 예를 들어, BIACORE™ 또는 용액-친화성 ELISA에 의한 측정시, 적어도 10-8 M; 바람직하게는 10-9 M; 보다 바람직하게는 10-10M, 보다 더 바람직하게는 10-11 M의 KD로 나타낸 NPR1에 대한 결합 친화성을 갖는 상기 mAb를 지칭한다.
[090] 용어 “느린 오프(slow off) 속도", "Koff" 또는 "kd"라는 용어는 표면 플라스몬 공명, 예를 들어, BIACORE™으로 측정시, 1x10-3 s-1 이하, 바람직하게는 1x10-4 s-1 이하의 속도 상수로 NPR1로부터 해리하는 항체를 의미한다.
[091] 본원에 사용된 항체의 "항원 결합 부분", 항체의 "항원 결합 단편" 등의 용어는, 항원에 특이적으로 결합하여 복합체를 형성하는 임의의 자연 발생하거나, 효소에 의해 수득할 수 있거나, 합성 또는 유전학적으로 조작된 폴리펩타이드 또는 당단백질을 포함한다. 본원에 사용된 항체의 "항원 결합 단편” 또는 “항체 단편”이라는 용어는 NPR1 단백질에 결합하는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 단편을 지칭한다.
[092] 특정 구현예에서, 본원의 개시내용의 항체 또는 항체 단편은 리간드 또는 치료학적 모이어티 ("면역접합체(immunoconjugate)")와 같은 모이어티, 제2 항-NPR1 항체, NPR1-연관된 질환 또는 장애를 치료하는데 유용한 임의의 기타 치료학적 모이어티에 접합될 수도 있다.
[093] 본원에 사용된 "단리된 항체"는, 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항체 (Ab)가 실질적으로 없는 항체를 지칭하려는 것이다 (예를 들어, NPR1에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 단편은 NPR1 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 Ab가 실질적으로 없음).
[094] 본원에서 사용되는 "길항제 항체"(또는 "NPR1 활성을 차단 또는 감소시키는 항체")는 NPR1에 결합하여 NPR1 신호 전달 및/또는 NPR1의 적어도 하나의 생물학적 활성을 차단 또는 감소시키는 항체를 지칭하기 위한 것으로 의도된다. 예를 들어, 길항제 항-NPR1 항체는 이를 필요로 하는 대상체에게 투여시 전신 혈압을 증가시킬 수 있다. 본원에 기재된 항-NPR1 항체는 길항제 항체이다.
[095] 본원에 사용된 바와 같은 “활성화 항체” 또는 "효능제 항체"(또는, “NPR1 활성을 증가시키거나 강화하는 항체” 또는 “활성화된 형태를 안정화시키는 항체”)는 항체로서 이의 NPR1으로의 결합이 NPR1의 적어도 하나의 생물학적 활성을 활성화시키는 항체를 지칭하는 것으로 의도된다. 예를 들어, 활성화 항-NPR1 항체 또는 효능제 항-NPR1 항체는 이를 필요로 하는 대상체에게 투여시 전신 혈압을 감소시킬 수 있다.
[096] 본원에 사용된 바와 같은 "표면 플라스몬 공명"이라는 용어는, 예를 들어, BIACORE™ 시스템 (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden and Piscataway, N.J.)을 사용하여 바이오센서 매트릭스 내 단백질 농도 변화의 검출에 의해 실시간 이분자 상호작용의 분석을 가능하게 하는 광학적 현상을 지칭한다.
[097] 본원에 사용된 바와 같은 "KD"라는 용어는 특정 항체-항원 상호작용의 평형 해리 상수를 지칭하고자 하는 것이다.
[098] “에피토프"라는 용어는 파라토프(paratope)로 알려져 있는 항체 분자의 가변 영역 내에서 특이적 항원 결합 부위와 상호작용하는 항원 결정기를 지칭한다. 단일 항원은 하나 초과의 에피토프를 가질 수 있다. 따라서, 상이한 항체들은 항원 상의 상이한 영역에 결합할 수도 있고 상이한 생물학적 효과를 가질 수 있다. “에피토프"라는 용어는 또한 B 및/또는 T 세포가 반응하는 항원 상의 부위를 지칭한다. 에피토프는 또한 항체에 의해 결합되는 항원 영역을 지칭한다. 에피토프는 구조적 또는 기능적으로 정의할 수 있다. 기능적 에피토프는 일반적으로 구조적 에피토프의 서브세트이고 상호 작용의 친화성에 직접적으로 기여하는 잔기를 갖는다. 에피토프는 입체적 구조일 수도 있는데, 즉, 비선형 아미노산으로 구성될 수도 있다. 특정 구현예에서, 에피토프는 아미노산, 당 측쇄, 포스포릴 그룹, 또는 설포닐 그룹과 같은 분자의 화학적 활성인 표면 그룹인 결정인자를 포함할 수 있고, 특정 구현예에서, 특이적인 3차원 구조적 특징 및/또는 특이적인 전하 특징을 가질 수도 있다.
[099] 본원에 사용된 바와 같은 용어 “교차-경쟁한다”는 항원에 결합하고 또 다른 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 결합을 억제하거나 차단시키는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 의미한다. 상기 용어는 또한 양 배향으로 2개의 항체, 즉, 제2 항체에 결합하여 그의 결합을 차단하는 제1항체 또는 이의 반대 경우의 항체 간의 경쟁을 포함한다. 특정 구현예에서, 제1 항체 및 제2 항체는 동일한 에피토프에 결합할 수 있다. 대안적으로, 제1 및 제2 항체는 하나의 결합이 예를 들어, 입체 장애를 통해 제2 항체의 결합을 억제하거나 차단하도록, 상이하지만, 중첩된 에피토프에 결합할 수 있다. 항체 간의 교차-경쟁은 당업계에 공지된 방법, 예를 들어, 실시간 무표지 바이오층 간섭굴절검정법(interferometry)에 의해 측정될 수 있다. 2개 항체 간의 교차 경쟁은 자가 결합으로 인해 배경 신호보다 적은 제2 항체의 결합으로 표현될 수 있다(여기서, 제1 및 제2 항체는 동일한 항체이다). 2개 항체 간의 교차 경쟁은 예를 들어, 기준선 자가 배경 결합 보다 적은 제2 항체의 % 결합으로 표현될 수 있다(여기서, 제1 및 제2 항체는 동일한 항체이다).
[0100] 핵산 또는 이의 단편을 지칭하는 경우에 "실질적 동일성(substantial identity)" 또는 "실질적으로 동일한(substantially identical)"이라는 용어는, 적절한 뉴클레오타이드 삽입 또는 결실로 다른 핵산(또는 이의 상보성 가닥)과 최적으로 정렬할 때, 아래에 논의된 바와 같이 FASTA, BLAST 또는 GAP과 같은 널리 알려진 서열 동일성에 대한 임의의 알고리즘으로 측정시, 뉴클레오타이드 염기 중 적어도 약 90%, 및 보다 바람직하게는 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%에서 뉴클레오타이드 서열 동일성이 있다는 것을 지적한다. 참조 핵산 분자에 대하여 실질적 동일성을 갖는 핵산 분자는, 특정 경우에는, 참조 핵산 분자에 의해 암호화된 폴리펩타이드와 동일하거나 또는 실질적으로 유사한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 암호화할 수도 있다.
[0101] 폴리펩타이드에 적용되는 것과 같이, "실질적 유사성(substantial similarity)" 또는 "실질적으로 유사한(substantially similar)"이라는 용어는, 디폴트 갭 가중치(default gap weight)를 사용하는 프로그램 GAP 또는 BESTFIT에 의해서와 같이 두 펩타이드 서열을 최적으로 정렬하는 경우, 적어도 90%의 서열 동일성, 보다 더 바람직하게는 적어도 95%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 공유하는 것을 의미한다. 바람직하게는, 동일하지 않은 잔기 위치는 보존적 아미노산 치환에 의해 달라진다. “보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 화학적 성질 (예를 들어, 전하 또는 소수성)을 갖는 측쇄 (R 그룹)를 갖는 또 다른 아미노산 잔기에 의해 치환되는 치환이다. 일반적으로, 보존적 아미노산 치환은 단백질의 기능적 성질을 실질적으로 변화시키지 않을 것이다. 2개 이상의 아미노산 서열이 서로 보존적 치환에 의해 서로 상이한 경우, 유사성의 퍼센트 또는 정도는 치환의 보존적 성질을 보정하기 위해 상향 조정될 수 있다. 상기 조정을 만들기 위한 수단은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Pearson (1994) Methods Mol. Biol. 24: 307-331]을 참조하며, 이는 본원에 참조로 인용된다. 유사한 화학적 성질을 갖는 측쇄를 갖는 아미노산 그룹의 예로는 1) 지방족 측쇄: 글리신, 알라닌, 발린, 류신 및 이소류신; 2) 지방족-하이드록실 측쇄: 세린 및 트레오닌; 3) 아미드-함유 측쇄: 아스파라긴 및 글루타민; 4) 방향족 측쇄: 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판; 5) 염기성 측쇄: 리신, 아르기닌 및 히스티딘; 6) 산성 측쇄: 아스파르테이트 및 글루타메이트, 및 7) 황-함유 측쇄: 시스테인 및 메티오닌을 포함한다. 바람직한 보존적 아미노산 치환 그룹으로는 발린-류신-이소류신, 페닐알라닌-티로신, 리신-아르기닌, 알라닌-발린, 글루타메이트-아스파르테이트 및 아스파라긴-글루타민이다. 대안적으로, 보존적 대체는 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Gonnet et al. (1992) Science 256: 144345]에 개시된 PAM250 로그-가능성 매트릭스(log-likelihood matrix)에서 양의 수치를 갖는 임의의 변화이다. “적당히 보존적인" 대체는 PAM250 로그-가능성 매트릭스에서 음이 아닌 값을 갖는 임의의 변화이다.
[0102] 폴리펩타이드에 대한 서열 유사성은 전형적으로 서열 분석 소프트웨어를 사용하여 측정한다. 단백질 분석 소프트웨어는 다양한 치환, 결실 및 보존적 아미노산 치환을 포함한 기타 변형에 지정된 유사성의 측정치를 사용하여 유사한 서열을 매칭시킨다. 예를 들어, GCG 소프트웨어는, 디폴트 파라미터를 사용하여 서로 다른 유기체 종의 상동성 폴리펩타이드와 같이 밀접하게 연관된 폴리펩타이드들 간의 서열 상동성 또는 서열 동일성, 또는 야생형 단백질과 이의 뮤테인 간의 서열 상동성 또는 서열 동일성을 결정하는데 사용될 수 있는, GAP 및 BESTFIT와 같은 프로그램을 포함하고 있다. 예를 들어, GCG 버전 6.1을 참조한다. 폴리펩타이드 서열은 GCG 버전 6.1 내의 프로그램인 디폴트 또는 추천된 파라미터와 함께 FASTA를 사용하여 비교할 수도 있다. FASTA (예를 들어, FASTA2 및 FASTA3)은 질의 탐색 및 검색 서열 간의 최상의 중복 영역에 대한 정렬 및 % 서열 동일성을 제공한다(Pearson (2000) 상기 참조). 본원 개시내용의 서열을 상이한 유기체로부터의 다수의 서열들을 포함하고 있는 데이터베이스와 비교하는 경우에 있어서의 또 다른 바람직한 알고리즘은 디폴트 파라미터를 사용하는 컴퓨터 프로그램 BLAST, 특히 BLASTP 또는 TBLASTN이다.예를 들어, 문헌(Altschul, et al., (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410 and (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402)을 참조하고 이의 각각은 본원에 참조로 인용된다.
[0103] "치료학적 유효량"이란 투여 시 목적하는 효과를 내는 양을 의미한다. 정확한 양은 치료 목적에 따라 의존하고, 당업자가 공지된 기술을 사용하여 확인할 수 있다(문헌참조: 예를 들어, Lloyd (1999) The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding). 본원에 사용된 바와 같이, 문구는 NPR1(예를 들어, NPR1 신호 전달, NPR1 활성)을 차단하고/하거나 전신 혈압을 증가시키는 양을 지칭한다.
[0104] 본원에 사용된 바와 같은 "대상체"라는 용어는 NPR1 관련 질환 또는 장애, 예를 들어, 저혈압의 개선, 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 동물, 바람직하게는 포유동물, 보다 바람직하게는 사람을 지칭한다. 상기 용어는 질병 또는 질환에 걸려있거나 걸릴 위험이 있는 사람 대상체를 포함한다.
[0105] 본원에서 사용된 "치료한다", “치료하는” 또는 "치료"라는 용어는 NPR1 관련 질환 또는 장애의 치료가 필요한 대상체에게 본원 개시내용의 길항제 항체와 같은 치료학적 제제의 투여로 인한 NPR1 관련 질환 또는 장애의 적어도 하나의 증상 또는 징후의 중증도의 감소 또는 개선을 지칭한다. 이 용어에는 질환의 진행 또는 증상/징후의 악화를 억제하는 것이 포함된다. 상기 용어는 또한 질환의 긍정적인 예후를 포함하고, 즉 대상체가 질환이 없거나 본원의 개시내용의 항체와 같은 치료학적 제제의 투여시 감소된 질환을 가질 수 있다. 치료학적 제제는 대상체에게 치료학적 용량으로 투여될 수 있다. 장애 또는 질환은 저혈압 및/또는 저혈압과 관련된 장애 또는 질환 및/또는 질환 또는 장애, 예를 들어, 패혈성 쇼크 및 신경변성 질환과 관련된 저혈압을 포함할 수 있다. 상기 장애 또는 질환은 자세성 기립성 빈맥 증후군(POTS)도 포함할 수 있다.
[0106] “예방한다", “예방하는” 또는 "예방"이라는 용어는, 본원의 개시내용의 항체의 투여 시 NPR1 관련된 질환 또는 장애의 증상의 억제 또는 이러한 질환 또는 장애의 임의의 증상 또는 징후의 억제를 지칭한다.
[0107] 본원에서 사용되는 "혈압"이라는 문구는 수축기 혈압, 확장기 혈압, 평균 동맥압(동맥압/시간 곡선 이하 면적을 심장 주기 지속 시간으로 나눈 값) 및 맥압(수축기 및 확장기 압력의 차이) 중 어느 하나를 지칭할 수 있다. 혈압 측정을 위한 방법은 당업계에 공지되어 있다. 혈압은 수은 밀리미터(mmHg) 유닛으로 측정되고 일반적으로 수축기(혈액) 혈압을 확장기(혈액) 혈압으로 나타낸다. 측정 방법은 청진, 오실로스코프, 초음파, 핑거 커프 방법을 포함한다. 예를 들어, 일반적으로 디지털 혈압 모니터나 혈압계를 사용하여 측정할 수 있다.
항체의 항원-결합 단편
[0108] 특별히 달리 명시되지 않는 한, 본원에서 사용되는 "항체"라는 용어는 2개의 면역글로불린 중쇄와 2개의 면역글로불린 경쇄를 포함하는 항체 분자(즉, "전체 항체 분자")와 이의 항원 결합 단편을 포함하는 것으로 이해해야 한다. 본원에 사용된 항체의 "항원 결합 부분", 항체의 "항원 결합 단편" 등의 용어는, 항원에 특이적으로 결합하여 복합체를 형성하는 임의의 천연적으로 발생하거나, 효소에 의해 수득할 수 있거나, 합성 또는 유전학적으로 가공된 폴리펩타이드 또는 당단백질을 포함한다. 본원에 사용된 항체의 "항원 결합 단편” 또는 “항체 단편”이라는 용어는 NPR1 단백질에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 단편을 지칭한다. 항체 단편은 Fab 단편, F(ab')2 단편, Fv 단편, dAb 단편, CDR 또는 단리된 CDR을 함유하는 단편을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, "항원 결합 단편"이라는 용어는 다중 특이적 항원 결합 분자의 폴리펩타이드 단편을 지칭한다. 항체의 항원 결합 단편은, 단백질 가수분해와 같은 임의의 적합한 표준 기법 또는 DNA 암호화 항체 가변 및 (임의로는) 불변 도메인의 조작 및 발현을 수반하는 재조합 유전자 조작 기법을 사용하여, 예를 들어, 전장 항체 분자로부터 유래될 수 있다. 상기 DNA는 공지되어 있고/있거나 예를 들어, 상업적 공급원, DNA 라이브러리 (예를 들어, 파아지-항체 라이브러리를 포함하는)로부터 용이하게 가용하거나, 합성될 수 있다. DNA는 화학적으로 또는 분자 생물학 기술을 사용함에 의해 서열 분석되고 조작되어, 예를 들어, 하나 이상의 가변 및/또는 불변 도메인을 적합한 구성으로 정렬하거나 코돈을 도입하거나, 시스테인 잔기를 생성시키거나, 아미노산을 변형시키거나, 첨가하거나 결실시키는 것등을 할 수 있다.
[0109] 항원 결합 단편의 비제한적 예로는 하기를 포함한다: (i) Fab 단편; (ii) F(ab')2 단편; (iii) Fd 단편; (iv) Fv 단편; (v) 단일쇄 Fv (scFv) 분자; (vi) dAb 단편; 및 (vii) 항체의 초가변 영역을 모방하는 아미노산 잔기로 이루어진 최소 인지 유닛 (예를 들어, 단리된 상보성 결정 영역 (CDR), 예를 들어, CDR3 펩타이드), 또는 속박된 FR3-CDR3-FR4 펩타이드. 다른 가공된 분자, 예를 들어, 도메인-특이적 항체, 단일 도메인 항체, 도메인-결실된 항체, 키메라 항체, CDR-이식된 항체, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 미니바디, 나노바디 (예를 들어. 1가 나노바디, 2가 나노바디 등), 소형 모듈러 면역약제(SMIP), 및 샤크 가변 IgNAR 도메인은 또한 본원에 사용된 바와 같은 표현 “항원 결합 단편”에 포함된다.
[0110] 항체의 항원-결합 단편은 전형적으로 적어도 하나의 가변 도메인을 포함한다. 상기 가변 도메인은 임의의 크기 또는 아미노산 조성의 도메인일 수 있으며, 일반적으로 적어도 하나의 골격 서열에 인접하고 있거나 이와 함께 골격을 이루는 적어도 하나의 CDR을 포함할 것이다. VL 도메인과 연합된 VH 도메인을 갖는 항원 결합 단편에서, VH 및 VL 도메인은 서로 상대적으로 임의의 적합한 정렬로 위치할 수 있다. 예를 들어, 가변 영역은 이량체일 수 있고 VH - VH, VH - VL 또는 VL - VL 이량체를 포함할 수 있다. 대안적으로, 항체의 항원 결합 단편은 단량체성 VH 또는 VL 도메인을 포함할 수 있다.
[0111] 특정 구현예에서, 항체의 항원-결합 단편은 적어도 하나의 불변 도메인에 공유 결합된 적어도 하나의 가변 도메인을 함유할 수 있다. 본원 개시내용의 항체의 항원 결합 단편 내에서 발견될 수 있는 가변 및 불변 도메인의 비제한적인 예시적 구성은 다음을 포함한다: (i) VH -CH1; (ii) VH -CH2; (iii) VH -CH3; (iv) VH -CH1-CH2; (v) VH -CH1-CH2-CH3; (vi) VH -CH2-CH3; (vii) VH -CL; (viii) VL -CH1; (ix) VL -CH2; (x) VL -CH3; (xi) VL -CH1-CH2; (xii) VL -CH1-CH2-CH3; (xiii) VL -CH2-CH3; 및 (xiv) VL -CL. 상기 열거된 예시적 임의의 구성을 포함하는 가변 및 불변 도메인의 임의의 구성에서, 가변 및 불변 도메인은 서로 직접적으로 연결될 수 있거나 완전한 힌지 또는 링커 영역에 의해 연결될 수 있다. 힌지 영역은 적어도 2개 (예를 들어, 5개, 10개, 15개, 20개, 40개, 60개 또는 그 이상)의 아미노산으로 이루어질 수 있으며, 이는 단일 폴리펩타이드 분자에서 인접한 가변 및/또는 불변 도메인 사이에서 가요성 또는 반가요성 결합을 유도한다. 더욱이, 본원 개시내용의 항체의 항원 결합 단편은 서로 간에 및/또는 하나 이상의 단량체 VH 또는 VL 도메인과 함께 (예를 들어, 디설파이드 결합(들)에 의해) 비-공유적 연합하에 상기 열거된 임의의 가변 및 불변 도메인 구성의 동종-이량체 또는 이종-이량체(또는 다른 다량체)를 포함할 수 있다.
[0112] 전체 항체 분자와 마찬가지로 항원 결합 단편은 단일 특이적이거나 다중 특이적(예를 들어, 이특이적)일 수 있다. 항체의 다중특이적 항원 결합 단편은 전형적으로 적어도 2개의 상이한 가변 도메인을 포함하고, 여기서, 각각의 가변 도메인은 별도의 항원에 특이적으로 결합할 수 있거나 동일한 항원 상에 상이한 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있다. 본원에서 기재된 예시적인 이특이적 항체 포맷을 포함하는 임의의 다중특이적 항체 포맷은 당업계에서 이용가능한 일상적인 기법을 사용하여 본원 개시내용의 항체의 항원-결합 단편과 관련된 사용을 위해 조정될 수 있다.
사람 항체의 제조
[0113] 유전자전이 마우스에서 사람 항체를 제조하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 임의의 상기 공지된 방법은 본원의 개시내용과 관련하여 NPR1에 특이적으로 결합하는 사람 항체를 제조하기 위해 사용될 수 있다.
[0114] 하기 중 임의의 하나를 포함하는 면역원을 사용하여 NPR1 단백질에 대한 항체를 생성할 수 있다. 특정 구현예에서, 본원의 개시내용의 항체는 전장의 고유 NPR1 단백질 (예를 들어, UniProtKB/Swiss-Prot승인 번호 P16066.1 참고), 또는 상기 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 DNA로 면역화된 마우스로부터 수득된다. 대안적으로, 단백질 또는 이의 단편은 표준 생화학적 기법들을 사용하여 제조되고, 면역원으로 변형되고 사용될 수 있다.
[0115] 일부 구현예에서, 상기 면역원은 이. 콜라이(E. coli) 또는 임의의 기타 진핵 또는 포유동물 세포, 예를 들어, 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포에서 발현시킨 재조합 NPR1 단백질 또는 이의 단편 (예를 들어, 서열번호 74-78)일 수 있다.
[0116] VELOCIMMUNE® 기법 [예를 들어, US 6,596,541호, 리제네론 파마슈티컬즈(Regeneron Pharmaceuticals), VELOCIMMUNE® 참조] 또는 모노클로날 항체를 생성하기 위한 임의의 기타 공지된 방법을 사용하여, 사람 가변 영역 및 마우스 불변 영역을 갖는, NPR1에 대한 높은 친화성의 키메라 항체를 먼저 단리시킨다. VELOCIMMUNE® 기법은 마우스가 항원의 자극에 반응하여 사람 가변 영역 및 마우스 불변 영역을 포함하는 항체를 생성하도록 내인성 마우스 불변 영역 유전자 자리에 작동가능하게 연결된 사람 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 게놈을 갖는 유전자전이 마우스의 생성을 수반한다. 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역을 암호화하는 DNA를 단리시켜 사람 중쇄 및 경쇄 불변 영역을 암호화하는 DNA에 작동가능하게 연결시킨다. 다음으로, 상기 DNA를 전장 사람 항체를 발현할 수 있는 세포 중에서 발현시킨다.
[0117] 일반적으로, VELOCIMMUNE® 마우스를 관심대상 항원으로 면역유발시키고, 항체를 발현하는 마우스로부터 림프성 세포 (예를 들어, B-세포)를 회수한다. 상기 림프성 세포를 골수종 세포주와 융합시켜 불멸성 하이브리도마 세포주를 제조할 수 있으며, 이러한 하이브리도마 세포주를 스크리닝하고 선별하여 관심대상 항원에 특이적인 항체를 생성하는 하이브리도마 세포주를 동정한다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역을 암호화하는 DNA를 단리하여 중쇄 및 경쇄의 목적하는 이소타입 불변 영역에 연결시킬 수 있다. 이러한 항체 단백질은 CHO 세포와 같은 세포에서 생성할 수 있다. 다르게는, 항원 특이적 키메라 항체 또는 경쇄 및 중쇄의 가변 도메인을 암호화하는 DNA를 항원 특이 림프구로부터 직접 단리할 수도 있다.
[0118] 처음에, 사람 가변 영역 및 마우스 불변 영역을 갖는 높은 친화성 키메라 항체를 단리한다. 하기 실험 부분에 기재된 바와 같이, 상기 항체를 특징에 따라 분류하여 친화성, 선택성, 에피토프 등을 비롯한 목적하는 특징들에 대해 선별한다. 상기 마우스 불변 영역들을 목적하는 사람 불변 영역으로 대체하여 본원 개시내용의 전장 사람 항체, 예를 들어 야생형 또는 변형된 IgG1 또는 IgG4를 생성한다. 선택된 불변 영역이 특정 용도에 따라 다양할 수 있지만, 높은 친화성의 항원 결합 및 표적 특이성 특징들은 가변 영역에 남아 있다.
생등가물
[0119] 본원의 개시내용의 길항제 항-NPR1 항체 및 항체 단편은 상기된 항체의 것들과는 상이하지만 NPR1 단백질에 결합하는 능력을 보유하는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 이러한 변이체 항체 및 항체 단편은 모체 서열(parent sequence)과 비교했을 때 아미노산의 하나 이상의 부가, 결실 또는 치환을 포함하지만, 본원에 기술된 항체와 본질적으로 동등한 생물학적 활성을 나타낸다. 마찬가지로, 본원의 개시내용의 항체 암호화 DNA 서열은 기재된 서열과 비교했을 때 뉴클레오타이드의 하나 이상의 부가, 결실, 또는 치환을 포함하지만, 본원의 개시내용의 항체 또는 항체 단편과 본질적으로 생물학적으로 동등한 항체 또는 항체 단편을 암호화하는 서열을 포함한다.
[0120] 2개의 항원 결합 단백질 또는 항체는, 예를 들어, 이들을 유사한 실험 조건 하에 단일 용량으로든 다중 용량으로든 간에 동일한 몰 용량으로 투여했을 때, 흡수율 및 흡수 정도가 유의적인 차이를 보이지 않는 약제학적 등가물 또는 약제학적 대체물인 경우에 생등가성인 것으로 간주된다. 일부 항체는, 이들이 흡수 정도에서는 동등하지만 흡수율에서 동등하지 않다면 동등물 또는 약제학적 대체물로 간주될 것이고, 그럼에도 생등가인 것으로 간주될 수 있는데, 그 이유는 흡수율에 있어서의 이러한 차이가 의도적인 것이고, 표지에 반영되며, 예를 들어 만성 사용시 유효 체내 약물 농도의 달성에 필수적인 것이 아니고, 연구되는 특정 약물 제품에 대해 의학적으로 무의미한 것으로 간주되기 때문이다.
[0121] 하나의 구현예에서, 2개 항원 결합 단백질은 이들의 안전성, 순도 또는 효능에 있어서 임상적으로 의미있는 차이가 없는 경우에 생등가성이다.
[0122] 하나의 구현예에서, 2개 항원 결합 단백질은 환자가 참조 제품과 생물학적 제품 간에 1회 이상 전환하는 경우라도 이러한 전환이 없는 연속 치료법에 비해 면역원성에 있어서의 임상적으로 유의적인 변화 또는 감소된 효능을 비롯한 부작용 위험의 증가가 예상되지 않는다면 생등가성이다.
[0123] 하나의 구현예에서, 2개 항원 결합 단백질은 이들이 둘다 사용 조건 또는 조건들에 대한 공통의 작용 기전들에 의해 이러한 기전이 알려져 있는 정도로 작용하는 경우라면 생등가성이다.
[0124] 생등가성은 생체내 및 시험관내 방법으로 입증될 수 있다. 생등가성 척도로는, 예를 들어, (a) 항체 또는 이의 대사물의 농도를 시간의 함수로서 혈액, 혈장, 혈청 또는 기타 생물학적 체액 내에서 측정하는, 사람 또는 기타 포유동물에서의 생체내 시험; (b) 사람 생체내 생체이용률 데이터와 상관성이 있고 이를 합리적으로 예측하는 시험관내 시험; (c) 항체 (또는 이의 표적)의 적절한 단시간의 약리학적 효과를 시간의 함수로서 측정하는 사람 또는 다른 포유동물에서의 생체내 시험; 및 (d) 항체의 안전성, 효능, 또는 생체이용률 또는 생물학적 동등성을 확립하는 잘 제어된 임상 시험을 포함한다.
[0125] 본원의 개시내용의 항체의 생등가성 변이체는 예를 들어, 잔기 또는 서열의 다양한 치환을 수행하거나 생물학적 활성에 필요치 않은 말단 또는 내부 잔기 또는 서열을 결실시킴으로써 작제될 수 있다. 예를 들어, 생물학적 활성에 필수적이지 않은 시스테인 잔기는 재생시 불필요하거나 부정확한 분자내 디설파이드 브릿지의 형성을 방지하기 위해 결실시키거나 다른 아미노산으로 대체할 수 있다. 다른 경우에서, 생등가성 항체들은 해당 항체의 당화 특성을 변형시키는 아미노산 변화, 예를 들어 당화를 없애거나 제거하는 돌연변이를 포함하는 항체 변이체를 포함할 수 있다.
Fc 변이체를 포함하는 항-NPR1 항체
[0126] 본원의 개시내용의 특정 구현예에 따르면, 예를 들어 중성 pH에 비하여, 산성 pH에서 FcRn 수용체에 대한 항체 결합을 증진시키거나 감소시키는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 Fc 도메인을 포함하는 항-NPR1 항체가 제공된다. 예를 들어, 본원의 개시내용은 Fc 도메인의 CH2 또는 CH3 영역에서 돌연변이를 포함하는 항-NPR1 항체를 포함하는데, 여기서 상기 돌연변이(들)은 산성 환경 (예를 들어, pH가 약 5.5 내지 약 6.0의 범위에 있는 엔도좀) 내에서 FcRn에 대한 Fc 도메인의 친화성을 증가시킨다. 상기 돌연변이는 동물에게 투여되는 경우 항체의 혈청 반감기의 증가를 유도할 수 있다. 이러한 Fc 변형의 비제한적인 예로는, 예를 들어, 위치 250 (예를 들어, E 또는 Q); 250 및 428 (예를 들어, L 또는 F); 252 (예를 들어, L/Y/F/W 또는 T), 254 (예를 들어, S 또는 T) 및 256 (예를 들어, S/R/Q/E/D 또는 T)에서의 변형; 또는 위치 428 및/또는 433 (예를 들어, H/L/R/S/P/Q 또는 K) 및/또는 434 (예를 들어, A, W, H, F 또는 Y [N434A, N434W, N434H, N434F 또는 N434Y])에서의 변형; 또는 위치 250 및/또는 428에서의 변형; 또는 307 또는 308(예를 들어, 308F, V308F) 및 434에서의 변형을 포함한다. 하나의 구현예에서, 상기 변형은 428L (예를 들어, M428L) 및 434S (예를 들어, N434S) 변형; 428L, 259I (예를 들어, V259I), 및 308F (예를 들어, V308F) 변형; 433K (예를 들어, H433K) 및 434 (예를 들어, 434Y) 변형; 252, 254, 및 256 (예를 들어, 252Y, 254T, 및 256E) 변형; 250Q 및 428L 변형 (예를 들어, T250Q 및 M428L); 및 307 및/또는 308 변형 (예를 들어, 308F 또는 308P)을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 변형은 265A(예를 들어, D265A) 및/또는 297A(예를 들어, N297A) 변형을 포함한다.
[0127] 예를 들어, 본원의 개시내용은 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 돌연변이의 하나 이상의 쌍 또는 그룹을 포함하는 Fc 도메인을 포함하는 항-NPR1 항체를 포함한다: 250Q 및 248L (예를 들어, T250Q 및 M248L); 252Y, 254T 및 256E (예를 들어, M252Y, S254T 및 T256E); 428L 및 434S (예를 들어, M428L 및 N434S); 257I 및 311I (예를 들어, P257I 및 Q311I); 257I 및 434H (예를 들어, P257I 및 N434H); 376V 및 434H (예를 들어, D376V 및 N434H); 307A, 380A 및 434A (예를 들어, T307A, E380A 및 N434A); 및 433K 및 434F (예를 들어, H433K 및 N434F). 상기 Fc 도메인 돌연변이, 및 본원에 기재된 항체 가변 도메인 내의 다른 돌연변이의 가능한 모든 조합들이 본원의 개시내용의 범위 내에서 고려된다.
[0128] 또한, 본원의 개시내용은 키메라 중쇄 불변 (CH) 영역을 포함하는 항-NPR1 항체를 포함하고, 여기서 상기 키메라 CH 영역은 하나 초과의 면역글로불린 이소타입의 CH 영역으로부터 유래된 세그먼트를 포함한다. 예를 들어, 본원의 개시내용의 항체는 사람 IgG1, 사람 IgG2 또는 사람 IgG4 분자로부터 유래된 CH3 도메인의 일부 또는 전부와 조합된, 사람 IgG1, 사람 IgG2 또는 사람 IgG4 분자로부터 유래된 CH2 도메인의 일부 또는 전부를 포함하는 키메라 CH 영역을 포함할 수도 있다. 특정 구현예에 따르면, 본원의 개시내용의 항체는 키메라 힌지 영역을 갖는 키메라 CH 영역을 포함한다. 예를 들어, 키메라 힌지는 사람 IgG1, 사람 IgG2 또는 사람 IgG4 힌지 영역으로부터 유래된 "하부 힌지" 서열 [EU 넘버링(numbering)에 따르면 위치 228 내지 236의 아미노산 잔기)과 조합된, 사람 IgG1, 사람 IgG2 또는 사람 IgG4 힌지 영역으로부터 유래된 "상부 힌지" 아미노산 서열 (EU 넘버링에 따르면 위치 216 내지 227의 아미노산 잔기)을 포함할 수 있다. 특정 구현예에 따르면, 상기 키메라 힌지 영역은 사람 IgG1 또는 사람 IgG4 상부 힌지로부터 유래된 아미노산 잔기 및 사람 IgG2 하부 힌지로부터 유래된 아미노산 잔기를 포함한다. 본원에 기재된 키메라 CH 영역을 포함하는 항체는 특정 구현예에서 항체의 치료학적 또는 약동학적 성질에 악영향을 미치지 않고 변형된 Fc 이펙터 기능을 나타낼 수 있다. (예를 들어, 미국 특허 출원 공개 공보 2014/0243504를 참조하고, 이의 기재내용은 이의 전문이 참조로 인용된다).
항체의 생물학적 특징
[0129] 일반적으로, 본원의 개시내용의 길항제 항체는 NPR1 단백질에 결합하여 이의 신호전달 및/또는 활성을 차단시키는 기능을 한다. 예를 들어, 본원의 개시내용은, 예를 들어, 본원의 실시예 3에 정의된 검정 포맷을 사용하여 표면 플라즈몬 공명 검정으로 측정시 25℃ 및 37℃에서 1.7nM 미만의 해리 상수(KD)로 사람 NPR1에 결합하는 항체 및 항체의 항원 결합 단편을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 예를 들어, 본원의 실시예 3에 정의된 검정 포맷, 또는 이와 실질적으로 유사한 검정을 사용하여 표면 플라스몬 공명으로 측정시 약 1.27nM 미만, 약 0.34nM 미만, 약 0.08 nM 미만, 약 0.06nM 미만의 KD로 사람 NPR1에 결합한다.
[0130] 본원의 개시내용은 또한 예를 들어, 본원의 실시예 3에 정의된 검정 포맷을 사용하여 표면 플라즈몬 공명 검정으로 측정시 25℃ 및 37℃에서 1.99nM 미만의 해리 상수(KD)로 몽키 NPR1에 결합하는 항체 및 항체의 항원 결합 단편을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 예를 들어, 본원의 실시예 3에 정의된 검정 포맷, 또는 이와 실질적으로 유사한 검정을 사용하여 표면 플라스몬 공명으로 측정시 약 1.23nM 미만, 약 0.32nM 미만, 약 0.1 nM 미만, 약 0.07nM 미만의 KD로 몽키 NPR1에 결합한다.
[0131] 본원의 개시내용은 또한 예를 들어, 본원의 실시예 3에 정의된 검정 포맷을 사용하여 표면 플라즈몬 공명 검정으로 측정시, 25℃ 및 37℃에서 ANP의 존재하에 1.52nM 미만의 KD로 사람 NPR1에 결합하는 항체 및 항체의 항원 결합 단편을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 예를 들어, 본원의 실시예 3에 정의된 검정 포맷, 또는 이와 실질적으로 유사한 검정을 사용하여 표면 플라스몬 공명으로 측정시 약 1.1nM 미만, 약 0.8nM 미만, 약 0.06 nM 미만, 약 0.5nM 미만의 KD로 25℃ 및 37℃에서 ANP의 존재하에 사람 NPR1에 결합한다.
[0132] 본원의 개시내용은 또한, 예를 들어, 본원의 실시예 6에 정의된 검정 포맷을 사용하여 cGMP 축적 검정으로 측정시, 리간드-유도 NPR1 활성화(예를 들어, ANP 또는 BNP에 의해 유도된)를 억제하는 항체 및 항체의 항원 결합 단편을 포함한다. 특정 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, 예를 들어, 본원의 실시예 6에 정의된 검정 포맷 또는 실질적으로 유사한 검정을 사용하여 cGMP 축적 검정으로 측정시, 리간드 유도된 NPR1 활성화를 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 92%, 적어도 약 99% 및 적어도 약 100%까지 억제한다.
[0133] 본원의 개시내용은 또한, 예를 들어, 본원의 실시예 7에 정의된 검정 포맷을 사용하여 전기화학발광 기반 면역검정법으로 측정시, 2.9nM 미만의 EC50으로 ANP 또는 BNP의 존재 또는 부재에서 사람 NPR1에 결합하는 항체 및 항체의 항원 결합 단편을 포함한다. 특정 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 예를 들어 본원의 실시예 7에 정의된 검정 포맷 또는 실질적으로 유사한 검정을 사용하여 전기화학발광 기반 면역 분석법으로 측정시 약 2.1nM 미만, 약 1.2nM 미만 및 약 0.6nM 미만의 EC50으로 ANP 또는 BNP의 존재 또는 부재에서 사람 NPR1에 결합한다.
[0134] 본원의 개시내용은 또한, 예를 들어, 본원의 실시예 7에 정의된 검정 포맷을 사용하여 전기화학발광 기반 면역검정법으로 측정시, 4.2nM 미만의 EC50으로 ANP 또는 BNP의 존재 또는 부재에서 몽키 NPR1에 결합하는 항체 및 항체의 항원 결합 단편을 포함한다. 특정 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 예를 들어 본원의 실시예 7에 정의된 검정 포맷 또는 실질적으로 유사한 검정을 사용하여 전기화학발광 기반 면역 검정으로 측정시 약 2.9nM 미만, 약 1.2nM 미만 및 약 0.7nM 미만의 EC50으로 ANP 또는 BNP의 존재 또는 부재에서 몽키 NPR1에 결합한다.
[0135] 본원의 개시내용은 또한 정상 혈압 및 저혈압 마우스에 투여되는 경우, 전신 혈압(수축기, 확장기, 평균 동맥 및 맥박 혈압을 포함)을 증가시키는 항체 및 항체의 항원 결합 단편을 포함하고, 여기서 전신 혈압의 증가는 예를 들어, 본원의 실시예 9에 기재된 바와 같이 단일 용량 투여 시 최대 약 28일 동안 지속된다.
[0136] 본원의 개시내용은 또한 ANP 과발현 유도된 저혈압 마우스에 투여되는 경우, 전신 혈압을 증가시키는 항체 및 항체의 항원 결합 단편을 포함하고, 여기서 전신 혈압의 증가는 예를 들어, 본원의 실시예 10에 기재된 바와 같이 단일 용량 투여 시 최대 약 28일 동안 지속된다.
[0137] 본원의 개시내용은 또한 본원의 실시예 11에 기재된 바와 같이, LPS 유도된 저혈압 마우스에서 전신 혈압을 증가시키는 항체 및 이의 항원 결합 단편을 포함한다.
[0138] 하나의 구현예에서, 본원의 개시내용은 ANP 또는 BNP의 존재 또는 부재하에 NPR1 단백질에 특이적으로 결합하여 NPR1의 신호전달 및/또는 활성을 감소시키거나 차단하는 단리된 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하고, 상기 항체 또는 이의 단편은 하기의 특징 중 하나 이상을 나타낸다: (a) 완전한 사람 모노클로날 항체이고; (b) 25℃에서 및 37℃에서 사람 NPR1에 결합하고 해리 상수 (KD)는 표면 플라스몬 공명 검정에서 측정시 1.7nM 미만이고; (c) 25℃ 및 37℃에서 몽키 NPR1에 결합하고 KD는 표면 플라스몬 공명 검정에서 측정시 1.99nM 미만이고; (d) 25℃에서 및 37℃에서 ANP의 존재하에 사람 NPR1에 결합하고 KD는 표면 플라스몬 공명 검정에서 측정시 1.52nM 미만이고; (e) cGMP 축적 검정으로 측정시, 리간드 유도된 NPR1 활성화를 억제하고; (f) ANP 또는 BNP의 존재 또는 부재하에 사람 NPR1에 결합하고 전기화학발광 기반 면역검정에 의한 측정시, EC50이 2.9nM 미만이고; (g) ANP 또는 BNP의 존재 또는 부재하에 몽키 NPR1에 결합하고 전기화학발광 기반 면역검정에 의한 측정시, EC50이 4.2nM 미만이고; (h) 정상혈압 및 저혈압 마우스에 투여되는 경우 전신 혈압을 증가시키고, 여기서 전신 혈압에서의 증가는 단일 용량의 투여 시 최대 약 28일 동안 지속하고; (i) ANP 과발현 유도된 저혈압 마우스에 투여되는 경우 전신 혈압을 증가시키고, 여기서 전신 혈압에서의 증가는 단일 용량의 투여 시 최대 약 28일 동안 지속하고; (j) LPS 유도된 저혈압 마우스에서 전신 혈압을 증가시키고; (k) 표 1에 열거된 HCVR 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 HCVR 및 표 1에 열거된 LCVR 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 LCVR를 포함한다.
[0139] 본원의 개시내용의 항체는 상기 언급된 생물학적 특징 또는 이의 임의의 조합 중 하나 이상을 소유할 수 있다. 본원의 개시내용의 항체의 다른 생물학적 특징은 본원의 실시예를 비롯한 본원의 개시내용의 검토로부터 당업자에게 분명해질 것이다.
에피토프 맵핑 및 관련 기법들
[0140] 본원의 개시내용은 NPR1 단백질 분자의 하나 이상의 영역 내에서 발견되는 하나 이상의 아미노산과 상호작용하는 길항제 항-NPR1 항체를 포함한다. 항체가 결합하는 에피토프는 NPR1 단백질 분자의 임의의 상기 언급된 도메인 내에 위치한 3개 이상 (예를 들어, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 이상)의 아미노산의 단일 연속 서열(예를 들어, 도메인 내 선형 에피토프)로 이루어질 수 있다. 대안적으로, 상기 에피토프는 단백질 분자의 상기 언급된 도메인 중 어느 하나 또는 둘다 내에 위치하는 다수의 비연속 아미노산 (또는 아미노산 서열) (예를 들어, 입체적 에피토프)로 이루어질 수 있다.
[0141] 당업계의 숙련자에게 공지된 다양한 기법들을 사용하여 항체가 폴리펩타이드 또는 단백질 내에서 "하나 이상의 아미노산과 상호작용하는지”의 여부를 결정할 수 있다. 예시적 기술로는, 예를 들어, 문헌 [참조: Antibodies, Harlow and Lane (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY)]에 기재된 것과 같은, 일반적인 교차-차단 검정을 포함한다. 다른 방법으로는 알라닌 스캐닝 돌연변이 분석, 펩타이드 블롯 분석 (Reineke (2004) Methods Mol. Biol. 248: 443-63), 펩타이드 절단 분석, 결정학 연구 및 NMR 분석을 포함한다. 또한, 에피토프 절제, 에피토프 추출 및 항원의 화학적 변형과 같은 방법이 사용될 수 있다(문헌참조: Tomer (2000) ProtTomer (2000) Prot. Sci. 9: 487-496). 항체가 상호작용하는 폴리펩타이드 내에서 아미노산을 동정하는데 사용될 수 있는 또 다른 방법은 질량 분광측정법으로 검출되는 수소/중수소 교환법이다. 일반적으로, 상기 수소/중수소 교환법은 관심대상 단백질을 중수소-표지화한 후, 항체를 중수소-표지된 단백질에 결합시키는 단계를 포함한다. 다음으로, 상기 단백질/항체 복합체를 물로 이동시키고 상기 항체 복합체에 의해 보호되는 아미노산 내에서 교환가능한 양성자는 계면의 일부가 아닌 아미노산 내에서 교환가능한 양성자보다 더 느린 속도로 중수소에서 수소로의 역교환을 진행한다. 결과로서, 상기 단백질/항체 계면의 일부를 형성하는 아미노산은 중수소를 보유할 수 있고 따라서 상기 계면에 포함되지 않은 아미노산에 비해 비교적 더 높은 질량을 나타낸다. 항체의 해리 후, 표적 단백질을 프로테아제 절단 및 질량 분광측정 분석에 적용함으로써, 상기 항체가 상호작용하는 특이적 아미노산에 상응하는 중수소-표지된 잔기를 밝혀낸다. 문헌(예를 들어, Ehring, (1999) Analytical Biochemistry 267: 252-259; Engen and Smith, (2001) Anal. Chem. 73: 256A-265A)을 참조한다.
[0142] “에피토프"라는 용어는 B 및/또는 T 세포가 반응하는 항원 상의 부위를 지칭한다. B-세포 에피토프는 연속 아미노산 또는 단백질의 3차 폴딩에 의해 병치된 비연속 아미노산 둘다로부터 형성될 수 있다. 연속 아미노산으로부터 형성된 에피토프는 전형적으로 변성 용매에 노출시 유지되는 반면에, 3차 폴딩에 의해 형성된 에피토프는 전형적으로 변성 용매로 처리시 상실된다. 에피토프는 전형적으로 적어도 3개, 및 보다 일반적으로는 적어도 5개 또는 8-10개의 아미노산을 고유한 공간적 형태로 포함한다.
[0143] 항원 구조 기반 항체 프로파일링(ASAP)으로서도 공지된 변형 지원 프로파일링(MAP)은 화학적 또는 효소적으로 변형된 항원 표면에 대한 각 항체의 결합 프로필의 유사성에 따라 동일한 항원에 대해 지시되는 다수의 모노클로날 항체(mAb)를 분류하는 방법이다(US 2004/0101920 참조, 여기서는 구체적으로 전문이 본원에 참조로 인용됨). 각 카테고리는 다른 카테고리로 대표되는 에피토프와 뚜렷하게 다르거나 부분적으로 중첩되는 고유한 에피토프를 반영할 수 있다. 이 기술을 사용하면 유전학적으로 동일한 항체를 신속하게 필터링하여 유전학적으로 구별되는 항체에 집중하여 특징 분석을 수행할 수 있다. 하이브리도마 스크리닝에 적용하면 MAP는 목적하는 특징을 갖는 mAb를 생성하는 희귀 하이브리도마 클론을 쉽게 동정할 수 있다. MAP를 사용하여 본원의 개시내용의 항체를 상이한 에피토프에 결합하는 항체의 그룹으로 분류할 수 있다.
[0144] 특정 구현예에서, 본원의 개시내용은 NPR1의 세포외 도메인내에서 발견되는 하나 이상의 에피토프와 상호작용하는 항-NPR1 항체 및 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 에피토프(들)은 NPR1의 세포외 도메인 내 위치한 3개 이상 (예를 들어, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 이상)의 아미노산의 하나 이상의 연속 서열로 이루어질 수 있다. 대안적으로, 에피토프는 NPR1 내에 위치한 다수의 비연속 아미노산 (또는 아미노산 서열)로 이루어질 수 있다.
[0145] 본원의 개시내용은 표 1에 열거된 임의의 특정 예시적 항체와 동일한 에피토프 또는 에피토프의 일부에 결합하는 길항제 항-NPR1 항체를 포함한다. 이와 마찬가지로, 본원의 개시내용은 또한 표 1에 열거된 임의의 특정 예시적 항체와 NPR1 단백질 또는 이의 단편에 결합하는 것에 대해 경쟁하는 길항제 항-NPR1 항체를 포함한다. 예를 들어, 본원의 개시내용은 표 1에 열거된 하나 이상의 항체와 NPR1 단백질에 결합하는 것에 대해 경쟁하는 길항제 항-NPR1 항체를 포함한다.
[0146] 당업자는 당업계에 공지된 일반적인 방법을 사용하여 항체가 참조 항-NPR1 항체와 동일한 에피토프에 결합하는지, 또는 참조 항-NPR1 항체와 결합하는 것에 대하여 경쟁하는지의 여부를 용이하게 결정할 수 있다. 예를 들어, 시험 항체가 본원 개시내용의 표준 항-NPR1 항체와 동일한 에피토프에 결합하는지를 결정하기 위해서, 참조 항체는 포화 조건하에서 NPR1 단백질 또는 펩타이드에 결합하도록 한다. 다음으로, NPR1 단백질 분자에 결합하는 시험 항체의 능력을 평가한다. 시험 항체가 참조 항-NPR1 항체와 포화 결합한 후에 NPR1에 결합할 수 있는 경우라면, 상기 시험 항체는 참조 항-NPR1 항체와 다른 에피토프에 결합한다는 결론을 내릴 수 있다. 한편, 시험 항체가 참조 항-NPR1 항체와 포화 결합한 후에 NPR1 단백질에 결합할 수 없는 경우라면, 상기 시험 항체는 본원의 개시내용의 참조 항-NPR1 항체에 의해 결합된 에피토프와 동일한 에피토프에 결합할 수 있다.
[0147] 항체가 참조 항-NPR1 항체와 결합에 대하여 경쟁하는지의 여부를 결정하기 위해, 상기된 결합 방법은 두 가지 배향으로 수행된다: 첫 번째 배향에서는, 상기 참조 항체를 포화 조건 하에 NPR1 단백질에 결합시킨 후, NPR1 분자에 대한 시험 항체의 결합에 대하여 평가한다. 두 번째 배향에서는, 상기 시험 항체를 포화 조건 하에 NPR1 분자에 결합시킨 후, NPR1 분자에 대한 참조 항체의 결합에 대하여 평가한다. 배향 둘다에서, 첫 번째 (포화) 항체만이 NPR1 분자에 결합할 수 있는 경우라면, 상기 시험 항체 및 참조 항체는 NPR1에 대한 결합에 대하여 경쟁하고 있는 것으로 결론을 내린다. 당업계의 숙련자라면 알 수 있듯이, 참조 항체와 결합에 대하여 경쟁하는 항체는 반드시 표준 항체와 동일한 에피토프에 결합하지 않을 수도 있으며, 중첩되거나 인접하는 에피토프에 결합하여 참조 항체의 결합을 입체 구조적으로 차단할 수 있다.
[0148] 2개의 항체는 각각이 경쟁적으로 다른 항체의 항원으로의 결합을 억제(차단)하는 경우 동일한 또는 중첩된 에피토프에 결합한다. 즉, 하나의 항체의 1배, 5배, 10배, 20배 또는 100배 초과량은 경쟁적 결합 검정으로 측정시 적어도 50%, 바람직하게는 75%, 90% 또는 심지어 99%까지 다른 항체의 결합을 억제한다(문헌참조: 예를 들어, Junghans et al., Cancer Res. 1990 50:1495-1502). 대안적으로, 2개의 항체는 하나의 항체의 결합을 감소시키거나 제거하는 항원 내 필수적으로 모든 아미노산 돌연변이가 다른 항체의 결합을 감소시키거나 제거하는 경우 동일한 에피토프를 갖는다. 2개의 항체는 하나의 항체의 결합을 감소시키거나 제거하는 일부 아미노산 돌연변이가 다른 것의 결합을 감소시키거나 제거하는 경우 중첩 에피토프를 갖는다.
[0149] 이후에, 추가의 일반적인 실험 (예를 들어, 펩타이드 돌연변이 및 결합 분석)을 수행하여 시험 항체에서 관찰된 결합의 결여 문제가 실제로 기준 항체와 동일한 에피토프에 대한 결합으로 인한 것인지 또는 입체 차단(또는 또 다른 현상)이 관찰된 결합의 결여 문제의 원인인지를 확인할 수 있다. 이러한 종류의 실험은 ELISA, RIA, 표면 플라스몬 공명, 유동 세포 측정 또는 당업계에서 이용하는 임의의 기타 정량적 또는 정성적 항체 결합 검정을 사용하여 수행될 수 있다.
[0150] 특정 구현예에서, 본원의 개시내용은 나트륨이뇨 펩타이드 수용체 1(NPR1) 단백질에 특이적으로 결합하고 NPR1을 차단하는 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
면역접합체
[0151] 본원의 개시내용은 NPR1 관련된 질환 또는 장애 (예를 들어, 저혈압)를 치료하기 위해, 치료학적 모이어티("면역접합체")에 접합된 사람 길항제 항-NPR1 모노클로날 항체를 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "면역접합체"라는 용어는 방사능 제제, 사이토킨, 인터페론, 표적 또는 리포터 모이어티, 효소, 펩타이드 또는 단백질 또는 치료학적 제제에 화학적 또는 생물학적으로 결합되는 항체를 지칭한다. 항체는 이의 표적에 결합할 수 있는 한, 해당 분자의 어느 위치에서든 방사능 제제, 사이토킨, 인터페론, 표적 또는 리포터 모이어티, 효소, 펩타이드 또는 치료학적 제제에 결합될 수 있다. 면역접합체의 예는 항체 약물 접합체 및 항체 독소 융합 단백질을 포함한다. 하나의 구현예에서, 상기 제제는 NPR1 단백질에 대한 제2의 상이한 항체일 수 있다. 항-NPR1 항체에 접합될 수 있는 치료학적 모이어티의 유형에 대해서는, 치료될 조건 및 성취하고자 하는 목적하는 치료학적 효과를 고려한다. 면역접합체를 형성하기에 적합한 제제의 예는 당업계에 공지되어 있고; 예를 들어, WO 05/103081을 참조한다.
다중-특이적 항체
[0152] 본원 개시내용의 길항제 항체는 단일 특이적, 이특이적 또는 다중 특이적일 수 있다. 다중 특이적 항체는 하나의 표적 폴리펩타이드의 상이한 에피토프에 특이적일 수 있거나, 하나 초과의 표적 폴리펩타이드에 특이적인 항원 결합 도메인을 포함할 수 있다. 문헌(예를 들어, Tutt, et al., 1991, J. Immunol. 147:60-69; Kufer, et al., 2004, Trends Biotechnol. 22:238-244)을 참조한다.
[0153] 본원의 개시내용의 임의의 다중 특이적 항원 결합 분자 또는 이의 변이체는 당업자에게 공지된 바와 같이 표준 분자 생물학적 기술(예를 들어, 재조합 DNA 및 단백질 발현 기술)을 사용하여 작제될 수 있다.
[0154] 일부 구현예에서, NPR1-특이적 항체는, NPR1 단백질의 별개의 도메인에 결합하는 가변 영역이 함께 연결되어 단일 결합 분자 내에서 이중 도메인 특이성을 부여하는 이특이적 포맷 ("이특이적")으로 생성된다. 개별 도메인에 특이성이 있거나(예를 들어, N-말단 도메인의 분절) 하나의 도메인 내의 다른 영역에 결합할 수 있는 가변 영역은 각 영역이 개별 에피토프 또는 한 도메인 내의 다른 영역에 동시에 결합할 수 있는 구조적 스캐폴드상에서 쌍을 형성한다. 이특이성의 하나의 예로, 하나의 도메인에 특이성을 갖는 결합제의 중쇄 가변 영역(VH)을 제2 도메인에 특이성을 갖는 일련의 결합제로부터의 경쇄 가변 영역(VL)과 재조합하여 해당 VH의 본래의 특이성을 방해하지 않고 본래의 VH와 쌍을 형성할 수 있는 비동족 VL 파트너를 동정한다. 이러한 방식으로, 단일 VL 분절 (예를 들어, VL1)은 2개의 다른 VH 도메인(예를 들어, VH1 및 VH2)과 조합되어 2개의 결합 “아암” (VH1- VL1 및 VH2- VL1)으로 구성된 이특이성을 생성할 수 있다. 단일 VL 분절의 사용은 시스템의 복잡성을 감소시킴으로써 이특이성을 생성하는데 사용되는 클로닝, 발현 및 정제 공정을 단순화시켜 해당 프로세스에서의 효율성을 증가시킨다 (예를 들어, US2011/0195454 및 US2010/0331527을 참조한다).
[0155] 대안적으로, 하나 이상의 도메인과 제2 표적, 예를 들어, 이에 제한되지 않지만 제2의 다른 항-NPR1 항체와 결합하는 항체는 본원에 기재된 기술 또는 당업자에게 공지된 다른 기술을 사용하여 이특이적 포맷으로 제조될 수 있다. 별개의 영역에 결합하는 항체 가변 영역은, 예를 들어, NPR1의 세포외 도메인 상에서 관련 부위에 결합하는 가변 영역과 함께 결합시켜 단일 결합 분자 내에서 이중 항원 특이성을 부여할 수 있다. 이러한 성질의 적절하게 디자인된 이특이성은 이중 기능을 수행한다. 세포 외 도메인에 특이성을 갖는 가변 영역은 세포 외 도메인 외부에 특이성을 갖는 가변 영역과 조합되어 각 가변 영역이 별도의 항원에 결합할 수 있는 구조적 스캐폴드상에 쌍을 형성한다.
[0156] 본 발명과 관련하여 사용될 수 있는 기타 예시적인 이특이적 포맷으로는, 제한 없이, 예를 들어, scFv-기반 또는 디아바디 이특이적 포맷, IgG-scFv 융합체, 이중 가변 도메인 (DVD)-Ig, 콰드로마(Quadroma), 놉-인투-홀(knob-into-hole), 공통 경쇄 (예를 들어, 놉-인투-홀을 갖는 공통 경쇄 등), CrossMab, CrossFab, (SEED)바디, 류신 지퍼(zipper), 듀오바디(Duobody), IgG1/IgG2, 이중 작용성 Fab (DAF)-IgG 및 Mab2 이특이적 포맷을 포함한다 (상기 포맷들에 대해 살펴보려면, 예를 들어, 문헌 [Klein et al. 2012, mAbs 4:6, 1-11] 및 해당 문헌에 인용된 참고문헌들을 참조한다). 이특이적 항체는 또한 펩타이드/핵산 접합을 사용하여 작제될 수 있고, 예를 들어, 여기서, 직교 화학적 반응성을 갖는 비천연 아미노산을 사용하여 부위-특이적 항체-올리고뉴클레오타이드 접합체를 생성하고 이는 이어서 한정된 조성, 결합가 및 기하학적 구조를 갖는 다량체성 복합체로 자가 어셈블리한다. (예를 들어, 문헌(Kazane, et al., J. Am. Chem. Soc. [Epub: Dec. 4, 2012])을 참조한다).
치료학적 투여 및 제형
[0157] 본원의 개시내용은 본원의 개시내용의 길항제 항-NPR1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 치료학적 조성물을 제공한다. 본원의 개시내용에 따른 치료학적 조성물은 개선된 이동, 전달, 내성 등을 제공하기 위해 제형에 통합되는 적합한 담체, 부형제 및 기타 제제와 함께 투여될 수 있다. 다수의 적당한 제형은 모든 약제학적 화학자에게 공지된 처방에서 발견될 수 있다: Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA. 이들 제형은 예를 들어, 산제, 페이스트, 연고, 젤리, 왁스, 오일, 지질, 지질(양이온성 또는 음이온성) 함유 소포(예를 들어 LIPOFECTIN™), DNA 접합체, 무수 흡수 페이스트, 수중유 및 유중수 에멀젼, 에멀젼 카보왁스(다양한 분자량의 폴리에틸렌 글리콜), 반-고체 겔, 및 카보 왁스를 함유하는 반-고체 혼합물을 포함한다. 문헌 [Powell et al. "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA (1998) J Pharm Sci Technol 52:238-311]도 참조한다.
[0158] 항체 용량은 투여받을 대상체의 연령 및 크기, 표적 질환, 병태, 투여 경로 등에 따라 다양할 수 있다. 본원의 개시내용의 항체가 성인 환자에서 질환 또는 장애를 치료하거나 또는 이러한 질환을 예방하기 위해 사용되는 경우, 정상적으로 체중 1 kg당 약 0.1 내지 약 100 mg의 단일 용량으로 본원의 개시내용의 항체를 투여하는 것이 유리하다. 하나의 구현예에서, 본원의 개시내용에 따른 항체는 약 25 mg/kg 체중의 단일 용량으로 투여된다. 질환의 중증도에 따라, 치료의 빈도 및 지속시간을 조정할 수 있다. 특정 구현예에서, 본원의 개시내용의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 적어도 약 0.1 mg 내지 약 800 mg, 약 1 내지 약 600 mg, 약 5 내지 약 500 mg, 또는 약 10 내지 약 400 mg, 또는 약 100mg의 초기 용량으로 투여될 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 초기 용량을 투여한 후, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 제2 용량 또는 복수의 후속 용량을 상기 초기 용량과 대략 동일하거나 더 적을 수 있는 양으로 투여할 수 있는데, 이 경우, 상기 후속 용량들은 적어도 1일 내지 3일; 적어도 1주, 적어도 2주; 적어도 3주; 적어도 4주; 적어도 5주; 적어도 6주; 적어도 7주; 적어도 8주; 적어도 9주; 적어도 10주; 적어도 12주; 또는 적어도 14주로 나눈다.
[0159] 다양한 전달 시스템, 예를 들어, 리포좀 내 캡슐화, 마이크로입자, 마이크로캡슐, 돌연변이체 바이러스를 발현할 수 있는 재조합 세포, 수용체 매개된 세포 내 이입(endocytosis)이 공지되어 있어서, 본원의 개시내용의 약제학적 조성물을 투여하는데 사용할 수 있다(예를 들어, 문헌 [Wu et al. (1987) J. Biol. Chem. 262:4429-4432] 참조). 도입 방법으로는, 피부내, 경피, 근육내, 복막내, 정맥내, 피하, 비강내, 경막외 및 경구 경로를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 조성물은 임의의 간편한 경로에 의해, 예를 들어, 주입 또는 볼러스 주사에 의해, 상피 또는 점막피부 내벽(예를 들어, 경구 점막, 직장 및 장 점막 등)을 통한 흡수에 의해 투여될 수 있고 다른 생물학적 활성제와 함께 투여될 수 있다. 투여는 전신 또는 국소일 수 있다. 약제학적 조성물은 또한 소포, 특히 리포좀으로 전달될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Langer (1990) Science 249:1527-1533] 참조).
[0160] 본원의 개시내용의 항체를 전달하기 위한 나노입자의 용도는 또한 본원에서 고려된다. 항체 접합된 나노입자는 치료학적 및 진단학적 용도 둘다로 사용할 수 있다. 항체 접합된 나노입자 및 이의 제조 및 사용 방법은 본원에 참조로 인용되는 문헌 [Arruebo, M., et al. 2009 ("Antibody-conjugated nanoparticles for biomedical applications" in J. Nanomat. Volume 2009, Article ID 439389, 24 pages, doi: 10.1155/2009/439389)]에 의해 상세히 기재되어 있다. 나노 입자를 개발하여 약제학적 조성물에 포함된 항체에 접합하여 세포를 표적화할 수 있다. 약물 전달을 위한 나노입자도, 예를 들어, US 8257740 또는 US 8246995에 기재되어 있고, 이의 각각은 전문이 참조로 인용된다.
[0161] 특정 상황에서, 약제학적 조성물은 제어 방출 시스템으로 전달될 수 있다. 한 구현예에서, 펌프를 사용할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 중합체 물질을 사용할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 제어 방출형 시스템은 조성물의 표적 근방에 배치될 수 있기 때문에, 전체 용량의 일부만을 필요로 한다.
[0162] 주사가능한 제제는 정맥내, 피하, 두개내, 복막내 및 근육내 주사, 점적 주입 등을 위한 투여 형태를 포함할 수 있다. 이들 주사가능한 제제는 대중에게 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다.
[0163] 본원 개시내용의 약제학적 조성물은 표준 니들 및 주사기로 피하 또는 정맥내 전달될 수 있다. 추가로, 피하 전달과 관련하여, 펜 전달 장치는 본원 개시내용의 약제학적 조성물을 전달하는데 용이하게 적용된다. 이러한 펜 전달 장치는 재사용가능하거나 1회용일 수 있다. 재사용가능한 펜 전달 장치는 일반적으로 약제학적 조성물을 함유하는 대체가능한 카트릿지를 사용한다. 일단 카트릿지 내 모든 약제학적 조성물이 투여되고 카트릿지가 속 빈 상태가 되면, 속 빈 카트릿지는 용이하게 처분될 수 있고 약제학적 조성물을 함유하는 새로운 카트릿지로 대체될 수 있다. 그렇게 한 후, 펜 전달 장치를 재사용할 수 있다. 1회용 펜 전달 장치에서는 대체가능한 카트릿지가 없다. 차라리, 1회용 펜 전달 장치는 장치내 저장소에 유지되는 약제학적 조성물로 미리 채워진다. 일단 저장소에 약제학적 조성물이 비워지면 전체 장치를 버린다.
[0164] 유리하게, 상기된 경구 또는 비경구 사용을 위한 약제학적 조성물은 활성 성분의 용량에 맞도록 적합화된 유닛 용량 중 투여형으로 제조된다. 이러한 유닛 용량의 투여형으로는, 예를 들어, 정제, 환제, 캡슐, 주사제 (앰푸울), 좌제 등을 포함한다. 함유된 항체의 양은 일반적으로 단위 용량의 제형당 약 5 내지 약 500 mg이고; 특히 주사제 형태에 있어서는, 약 5 내지 약 300 mg으로, 다른 제형에 있어서는 약 10 내지 약 300 mg으로 항체를 함유하는 것이 바람직하다.
항체의 치료학적 용도
[0165] 본원의 개시내용의 길항제 항체는 NPR1과 관련된 질환 또는 장애 또는 병태의 치료 및/또는 예방하고/하거나, 이러한 질환, 장애 또는 병태와 관련된 적어도 하나의 증상을 개선하는데 유용하다. 특정 구현예에서, 본원의 개시내용의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 NPR1과 연관된 질환 또는 장애 또는 병태가 있는 환자에게 치료학적 용량으로 투여될 수 있다.
[0166] 장애 또는 질환은 저혈압 및/또는 저혈압과 관련된 장애 또는 질환 및/또는 질환 또는 장애, 예를 들어, 순환계 쇼크, 패혈성 쇼크 및 신경변성 질환과 관련된 저혈압을 포함할 수 있다. 저혈압은 전신 혈압의 허용되는 낮은 값 미만으로의 감소이다. 저혈압은 인정되는 표준 저혈압 값이 없는 범위로 존재하지만, 90 mmHg (수축기)/60 mmHg(확장기) 90mmHg 미만의 혈압은 저혈압으로 인정된다. 저혈압의 증상은 제한 없이 어지러움, 현기증, 실신, 흉통, 호흡 곤란, 불규칙한 심장 박동, 체온 상승, 두통, 목 결림, 중증 요통, 가래를 동반한 기침, 설사, 구토, 배뇨 장애, 급성 알레르기 반응, 피로, 시력 이상 등을 포함할 수 있다. 치료하지 않은 저혈압과 심박출량 불량으로 인한 합병증은 중증이고 궁극적으로 사망으로도 이어질 수 있다. 임박한 쇼크 또는 전격성 쇼크에서 저혈압을 치료하지 않으면 다발성 장기 부전으로 이어질 수 있다(문헌참조: Sharma, et al., updated 2021, Hypotension, available from https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK499961/). 하나의 구현예에서, 본원의 개시내용에 따른 길항성 항-NPR1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 저혈압의 한 유형의 증상 또는 징후를 치료하는 데 사용된다. 또 다른 구현예에서, 본원의 개시내용에 따른 길항성 항-NPR1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 저혈압을 갖고/갖거나 저혈압과 관련된 질환 또는 장애를 갖는 대상체의 혈압을 증가시키는 데 사용된다.
[0167] 패혈성 쇼크는 불응성 저혈압을 특징으로 하고 조직의 부적절한 관류를 유발하고 높은 사망률과 관련이 있다. 저혈압을 동반한 패혈증의 표준 치료법은 카테콜아민 또는 모방체, 바소프레신 또는 Ang II와 같은 혈관수축제를 투여하여 저혈량증의 부재하에 동맥압과 혈청 락테이트 수준를 유지하는 것이다. 그러나 표준 치료용 혈관수축제는 빈번한 적정을 포함하고, 치료 범위가 좁으며, 중심정맥 접근 및 ICU 치료가 필요하고, 능히 심지어 모세혈관 관류를 감소시키는(장기간 고용량 투여 시 조직 허혈(예를 들어, 디지털 괴사) 유발) 상당한 결점을 갖는다. 따라서 (불응성) 저혈압을 해결하기 위한 상당한 미충족 필요성이 남아 있다. 하나의 구현예에서, 본원의 개시내용에 따른 길항성 항-NPR1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 패혈성 쇼크의 증상 또는 징후를 치료하거나 패혈성 쇼크의 불응성 저혈압을 치료하는 데 사용된다. 또 다른 구현예에서, 본원의 개시내용에 따른 길항성 항-NPR1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 사용하여 패혈성 쇼크를 치료하거나 패혈성 쇼크의 불응성 저혈압을 치료하는 것은 혈관수축제의 사용을 감소시킬 수 있다. 결과로서, 중환자실(ICU) 입원 기간을 줄여야 한다.
[0168] 신경성 기립성 저혈압은 직립 자세에서 저혈압(기립하고 있을 때 혈압이 떨어져 뇌 저관류로 이어짐)을 구성하고 일반적으로 신경변성 질환과 관련된 자율 반사의 결함으로 인해 발생한다. 여러 질환을 합병하고 심각한 이환율과 관련이 있으며, 거의 50%의 환자에서 증상이 일상 활동에 미치는 영향이 심각하거나 매우 심각하다. 현재 승인된 2개의 약물 치료요법은 단지 미미한 효과가 있어 둘다 단기간에 효과가 나타나고 하루 3회(TID) 복용해야 한다. 하나의 구현예에서, 본원의 개시내용에 따른 길항성 항-NPR1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 신경성 기립성 저혈압을 치료하는 데 사용된다.
[0169] 상기 장애 또는 질환은 자세성 기립성 빈맥 증후군(POTS)도 포함할 수 있다. 상기 증후군은 저혈압은 없지만 똑바로 누운 자세에서 빈맥과 증상을 동반한다. POTS에서는 성인의 경우 수평으로부터 기립하였을 때(또는 기울어진 테이블에서 시험한 결과) 분당 적어도 30회의 심박수 증가가 등록되며, 처음 10분 동안 기립해 있는 동안 측정된다. POTS는 전형적으로 젊은 여성에 영향을 미치고 심각한 이환율을 유발한다. 기립해 있을 때 발생하는 증상은 어지러움, 떨림, 심계항진, 쇠약감, 피로, 흐릿한 시야, 가끔씩 실신 등을 포함한다. 삶의 질의 현저한 감소가 80% 이상의 POTS에서 보고된다. 플루드로코르티손, 미도드린, 및 베타차단제는 일반적으로 사용되지만 이들은 유의적인 치료 효능을 나타내지 않고; 실제로 현재 FDA 승인을 받은 특정 POTS 치료 약물은 없다. 하나의 구현예에서, 본원의 개시내용에 따른 길항성 항-NPR1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 POTS를 치료하기 위해 사용된다.
[0170] 특정 구현예에서, 본원의 개시내용의 길항제 항체는 저혈압, 순환계 쇼크, 패혈성 쇼크, 신경성 기립성 저혈압, 자세성 기립성 빈맥 증후군(POTS), 심부전, 심인성 쇼크, 비만, 신부전, 만성 콩팥 질환, 황반부종, 녹내장, 뇌졸중, 폐 장애, 폐 섬유증, 염증, 천식, 골격 성장 장애, 골절, 당뇨병, 저혈당혈증 및 암으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 질환 또는 장애의 적어도 하나의 증상 또는 징후를 치료하거나 예방하기 위해 유용하다.
[0171] 또한 본원에서 NPR1 관련된 질환 또는 장애를 앓을 위험에 처한 대상체에게 예방학적으로 본원의 개시내용의 하나 이상의 항체를 사용하는 것이 고려된다.
[0172] 본원의 개시내용의 하나의 구현예에서, 본 발명의 항체는 본원에 기재된 질환, 장애 또는 병태를 앓는 환자를 치료하기 위한 약제학적 조성물 또는 약물의 제조를 위해 사용된다. 본원의 개시내용의 또 다른 구현예에서, 본 발명의 항체는 본원에 기재된 질환, 장애 또는 병태를 치료 또는 개선하는데 유용한 당업자에게 공지된 임의의 다른 제제 또는 임의의 다른 치료요법과 함께 보조 치료요법으로서 사용된다.
조합 치료요법
[0173] 조합 치료요법은 본원의 개시내용의 길항제 항체, 및 본원 개시내용의 항체 또는 본원 개시내용의 항체의 생물학적 활성 단편과 유리하게 조합될 수 있는 임의의 추가의 치료학적 제제를 포함할 수 있다. 본원의 개시내용의 항체는 저혈압을 포함하는, NPR1 관련된 질환 또는 장애를 치료하기 위해 사용되는 하나 이상의 약물 또는 치료요법과 상승작용적으로 조합될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원의 개시내용의 항체는 상기 질환 또는 병태의 하나 이상의 증상을 개선하기 위해 제2 치료학적 제제와 조합될 수 있다.
[0174] 질환, 장애 또는 병태에 따라, 본원의 개시내용의 항체는 혈관신생 억제제, 혈관수축제(vasoconstrictor)/혈관수축제(vasopressor), 면역 억제제, 아스코르브산, 칼시뉴린 억제제, 코르티코스테로이드, VEGF 억제제, 충혈 완화제, 항우울제, 호르몬 피임약, 자극제(심장 자극제 포함), 카페인, 체외막 산소화, 심실 보조 장치, 대동맥 내 풍선 펌프, 생활 습관 교정, 식이 보충제, 항미생물 약물, 인슐린 및 항염증성 약물을 포함하지만 이에 제한되지 않는 하나 이상의 추가의 치료학적 제제와 조합하여 사용될 수 있다.
[0175] 본원에 사용되는 "와 조합된"이라는 용어는 본원 개시내용의 길항제 항-NPR1 항체의 투여 전, 투여와 동시 또는 투여 후에 추가적인 치료학적 활성 성분(들)이 투여될 수 있음을 의미한다. 또한, “와 조합된”이라는 용어는 항-NPR1 항체 및 제2 치료학적 제제 또는 치료요법의 순차적 투여 또는 동시 투여를 포함한다.
[0176] 상기 추가의 치료학적 활성 성분(들)은 본원의 개시내용의 항-NPR1 항체를 투여하기 전에 대상체에게 투여될 수 있다. 예를 들어, 제1 성분이 제2 성분의 투여 1주 전, 72시간 전, 60시간 전, 48시간 전, 36시간 전, 24시간 전, 12시간 전, 6시간 전, 5시간 전, 4시간 전, 3시간 전, 2시간 전, 1시간 전, 30분 전, 30분 미만 전에 투여되었다면, 제1 성분은 제2 성분의 투여 “전에” 투여된 것으로 간주될 수 있다. 다른 구현예에서, 상기 추가의 치료학적 활성 성분(들)은 본원의 개시내용의 항-NPR1 항체를 투여한 후에 대상체에게 투여될 수 있다. 예를 들어, 제1 성분이 제2 성분의 투여 30분 후, 1시간 후, 2시간 후, 3시간 후, 4 시간 후, 5시간 후, 6시간 후, 12시간 후, 24시간 후, 36시간 후, 48시간 후, 60시간 후, 72시간 후, 72시간 후에 투여되었다면, 제1 성분은 제2 성분의 투여 “후에” 투여된 것으로 간주될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 상기 추가의 치료학적 활성 성분(들)은 본원의 개시내용의 항-NPR1 항체의 투여와 동시에 대상체에게 투여될 수 있다. 본원의 개시내용의 목적상, “동시” 투여는 예를 들어, 항-NPR1 항체와 추가적인 치료학적 활성 성분을 단일 투여 형태로 대상체에게 투여하거나, 서로 약 30분 이내에 대상체에게 투여되는 별도의 투여 형태로 투여하는 것을 포함한다. 별도의 투여 형태로 투여되는 경우, 각각의 투여 형태는 동일한 경로를 통해 투여될 수 있고(예를 들어, 항-NPR1 항체와 추가 치료 활성 성분 둘다는 정맥내 등으로 투여될 수 있다); 대안적으로 각각의 투여 형태는 다른 경로를 통해 투여될 수 있다(예를 들어, 항-NPR1 항체는 정맥내 투여되고 추가 치료 활성 성분은 경구 투여될 수 있다). 어떤 경우든, 성분을 단일 투여 형태로 투여하거나, 동일한 경로에 의해 별도의 투여 형태로 투여하거나, 다른 경로를 통한 별도의 투여 형태로 투여하는 것은 모두 본원의 개시내용의 목적을 위해 "동시 투여"로 간주된다. 본원의 개시내용의 목적상, 항-NPR1 항체의 투여는 추가의 치료학적 활성 성분의 투여 “전’, “동시” 또는 “후”(상기 용어들이 본원에 정의된 바와 같이) 추가 치료 활성 성분과 “조합하여” 항-NPR1 항체를 투여하는 것으로 간주된다.
[0177] 본원의 개시내용은, 본원의 개시내용의 항-NPR1 항체가 본원의 다른 부분에 기재된 바와 같이 추가의 치료학적 활성 성분(들) 중 하나 이상과 동시 제형화된 약제학적 조성물을 포함한다.
항체의 진단적 용도
[0178] 본원의 개시내용의 길항제 항체는 예를 들어, 진단 목적으로 샘플에서 NPR1을 검출하고/하거나 측정하는데 사용할 수 있다. 일부 구현예는 NPR1 관련된 질환 또는 장애를 검출하기 위한 검정에서 본원의 개시내용의 하나 이상의 항체의 용도를 고려한다. NPR1에 대한 예시적인 진단 검정은, 예를 들어, 환자로부터 수득한 샘플을 본원의 개시내용의 항-NPR1 항체와 접촉시키는 단계를 포함할 수 있고, 여기서 상기 항-NPR1 항체를 검출가능한 표지 또는 리포터 분자로 표지하거나 포획 리간드로 사용하여, 환자 샘플로부터 NPR1을 선택적으로 단리한다. 대안적으로, 비표지된 항-NPR1 항체를 자체적으로 검출 가능하게 표지된 2차 항체와 함께 진단적 응용에 사용할 수 있다. 상기 검출가능한 표지 또는 리포터 분자는, 예를 들어, 3H, 14C, 32P, 35S 또는 125I와 같은 방사성 동위원소; 플루오레세인 이소티오시아네이트 또는 로다민과 같은 형광성 또는 화학발광성 모이어티; 또는 알칼린 포스파타제, β-갈락토시다제, 서양고추냉이(horseradish) 퍼옥시다제 또는 루시퍼라제와 같은 효소일 수 있다. 샘플 중에서 NPR1를 검출 또는 측정하는데 사용될 수 있는 특정 예시적인 검정은 효소 결합 면역흡착 검정(ELISA), 방사성면역검정(RIA) 및 형광 활성화 세포 분류(FACS)를 포함한다.
[0179] 본원의 개시내용에 따른 NPR1 진단적 검정에 사용될 수 있는 샘플은 정상적인 상태 또는 병리학적 상태 하에서 검출가능한 양의 NPR1 단백질 또는 이의 단편을 함유하는, 환자로부터 수득가능한 임의의 조직 또는 체액 샘플을 포함한다. 일반적으로, 건강한 환자(NPR1과 연관된 질환에 걸리지 않은 환자)로부터 수득된 특정 샘플 중의 NPR1 수준을 측정하여 NPR1의 기준선 또는 표준 수준을 먼저 확립할 것이다. 이후, 이러한 NPR1의 기본 수준을 NPR1 관련 질환, 또는 이러한 질환과 관련된 증상을 갖는 것으로 의심되는 개체로부터 수득된 샘플 중에서 측정한 NPR1의 수준과 비교할 수 있다.
[0180] NPR1에 특이적인 항체들은 추가의 표지 또는 모이어티를 함유하지 않을 수도 있거나, 또는 이들은 N-말단 또는 C-말단 표지 또는 모이어티를 포함할 수도 있다. 하나의 구현예에서, 표지 또는 모이어티는 비오틴이다. 결합 검정에서 표지의 위치(경우에 따라)는 펩타이드가 결합된 표면에 상대적으로 펩타이드의 배향을 결정할 수 있다. 예를 들어, 표면이 아비딘으로 코팅된 경우, N-말단 비오틴을 포함하는 펩타이드는 펩타이드의 C-말단 부분이 표면의 원위에 위치하도록 배향된다.
실시예
[0181] 하기의 실시예는 당업자에게 본원 개시내용의 방법 및 조성물을 제조하고 사용하는 법의 완전한 기재 및 기술을 제공하기 위해 제시된 것이고 발명자가 이들의 본원 개시내용으로서 간주하는 것의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 사용되는 숫자(예를 들어, 양, 온도 등)와 관련하여 확실히 정확하게 하기 위해 노력하였지만 일부 실험 오차 및 편차가 고려되어야만 한다. 달리 지시하지 않는 한, 부는 중량부이고, 분자량은 평균 분자량이며, 온도는 섭씨 온도이고, 실온은 약 25℃이며, 압력은 대기압 또는 대기압 부근이다.
실시예 1: 나트륨이뇨 펩타이드 수용체 1 (NPR1)에 대한 사람 항체의 생성
[0182] 사람 면역글로불린 중쇄 및 카파 경쇄 가변 영역을 암호화하는 DNA를 포함하는 VELOCIMMUNE® 마우스에서 NPR1 단백질에 대한 사람 항체를 생성하였다. 마우스는 사람 NPR1 및 마우스 ANP DNA로 수력학적(hydrodynamic) DNA 전달에 의해 면역화시고 마우스 ANP에 복합체화된 사람 NPR1 단백질의 세포외 도메인에 의해 부스팅하였다.
[0183] 항체 면역 반응은 NPR1-특이적 면역검정에 의해 모니터링하였다. 목적하는 면역 반응이 달성된 경우, 비장 세포를 수거하고 마우스 골수종 세포와 융합시켜 이들의 생존력을 보존하고 하이브리도마 세포주를 형성하였다. 상기 하이브리도마 세포주를 스크리닝하고 선별하여 NPR1-특이적 항체를 생성하는 세포주를 동정하였다. 상기 세포주를 사용하여 수개의 항-NPR1 키메라 항체 (즉, 사람 가변 도메인 및 마우스 불변 도메인을 보유하는 항체)를 수득하였다.
[0184] 또한, 항-NPR1 항체는 미국 특허 제7,582,298호 (전문이 본원에 참조로 인용됨)에서 기재된 바와 같이, 골수종 세포에 융합시키지 않고 항원-양성 마우스 B 세포로부터 직접 단리하였다. 상기 방법을 사용하여 수개의 완전한 사람 항-NPR1 항체 (즉, 사람 가변 도메인 및 사람 불변 도메인을 갖는 항체)를 수득하였다.
[0185] 상기된 바와 같이 생성된 예시적인 항체는 mAb38067, mAb38072, mAb38090 및 mAb22034로 지정되었다.
[0186] 본 실시예의 방법에 따라 생성된 예시적인 항체들의 생물학적 특성에 대해서는 하기 제시된 실시예들에서 상세히 기술한다.
실시예 2: 중쇄 및 경쇄 가변 영역 아미노산 및 뉴클레오타이드 서열
[0187] 표 1은 선택된 본원의 개시내용의 항-NPR1 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 및 CDR에 대한 아미노산 서열 확인자(identifier)를 제시한다.
표 1: 아미노산 서열 확인자
[0188] 상응하는 핵산 서열 확인자를 표 2에 기재한다.
표 2: 핵산 서열 확인자
[0189] 본원에 언급된 항체는 전형적으로 완전한 사람 가변 영역을 갖지만 사람 또는 마우스 불변 영역을 가질 수 있다. 당업자에 의해 인지되는 바와 같이, 특정 Fc 이소타입을 갖는 항체는 상이한 Fc 이소타입을 갖는 항체 (예를 들어, 마우스 IgG1 Fc를 갖는 항체는 사람 IgG1 또는 사람 IgG4 등을 갖는 항체 등으로 전환될 수 있음)로 전환될 수 있지만, 어떠한 경우가 됐던, (CDR을 포함하는) 가변 도메인 - 표 1에서 나타낸 수치 확인자로 표시됨 - 은 동일하게 유지될 것이고, 항원에 대한 결합 성질은 Fc 도메인의 성질에 관계없이 동일하거나 실질적으로 유사할 것으로 기대된다.
[0190] 특정 구현예에서, 마우스 IgG1 Fc를 갖는 선택된 항체를 사람 IgG4 Fc를 갖는 항체로 전환시킨다. 하나의 구현예에서, IgG4 Fc 도메인은 US20100331527에 기재된 바와 같이 2개 이상의 아미노산 변화를 포함한다. 하나의 구현예에서, 사람 IgG4 Fc는 이량체 안정화를 촉진시키기 위해 힌지 영역 (S108P)에서 세린의 프롤린으로의 돌연변이를 포함한다. 달리 지적되지 않는 경우, 하기의 실시예에 사용된 모든 항체는 사람 IgG4 이소타입을 포함한다.
[0191] 힌지 영역(S108P)에서 세린에서 프롤린으로의 돌연변이를 포함하는 사람 IgG4 Fc를 포함하는 예시적인 항체 mAb38067, mAb38072, mAb38090 및 mAb22034는 각각 REGN7541, REGN7544, REGN7548 및 H4H22034로 지정되었다. 표 3은 이들 항체의 전장 중쇄 및 경쇄 서열의 핵산 및 아미노산 서열 확인자를 제시한다.
표 3: 전장 중쇄 및 경쇄 서열 확인자
하기 실시예에 사용된 대조군 작제물
[0192] 비교의 목적을 위해, 하기의 대조군 작제물 (항-NPR1 항체)을 본원에 기재된 실험에 포함시켰다: “비교인자 1," 미국 특허 제20120114659호 (Morphosys)에 따라 항체 “mAb5591”의 VH/VL 서열을 갖는 사람 NPR1에 대한 모노클로날 항체.
실시예 3: 25℃ 및 37℃에서 측정된 다양한 NPR1 시약에 결합하는 항-NPR1 모노클로날 항체의 Biacore 결합 동력학
실험 절차
[0193] 실시간 표면 플라즈몬 공명(SPR) 기반 Biacore 8k 바이오센서를 사용하여 정제된 항-NPR1 모노클로날 항체(mAb)에 결합하는 다양한 NPR1 시약에 대한 평형 해리 상수(KD)를 결정하였다. 모든 결합 연구는 25℃ 및 37℃에서 10mM HEPES, 150mM NaCl, 3mM EDTA 및 0.05% v/v 계면활성제 P20, pH 7.4 (HBS-EP) 전개 완충액중에서 수행하였다. 상기 Biacore CM5 센서 칩 표면을 항-사람 Fc 특이적 항체와의 아민 커플링으로 먼저 유도체화시켜 항-NPR1 mAb를 포획하였다. 결합 연구는 C-말단 myc-myc-헥사히스티딘과 함께 발현된 사람 NPR1 세포 외 도메인(hNPR1-MMH; 서열번호 74), C-말단 myc-myc-헥사히스티딘과 함께 발현된 몽키 NPR1 세포외 도메인(mfNPR1-MMH; 서열번호 75), C-말단 myc-myc-헥사히스티딘과 함께 발현된 마우스 NPR1 세포외 도메인(mNPR1-MMH; 서열번호 76), C-말단 myc-myc-헥사히스티딘과 함께 발현된 개 NPR1 세포외 도메인(dog_NPR1-MMH; 서열번호 77), C-말단 myc-myc-헥사히스티딘과 함께 발현된 돼지 NPR1 세포외 도메인(pig_NPR1-MMH; 서열번호 78) 및 hNPR1-MMH + 10x hANP에 대해 수행하였다.
[0194] 10배 농도의 hANP 또는 고정 농도(40nM)의 mNPR1-MMH, 개_NPR1-MMH, 돼지_NPR1-MMH의 존재하에서 다양한 농도(40nM - 0.625nM, 4배 연속 희석)의 hNPR1-MMH, mfNPR1-MMH, hNPR1-MMH를 HBS-EP 전개 완충액에서 제조하고 이어서 30μL/min의 유속으로 150초 동안 주사하고, 상이한 NPR1 시약에 결합된 mAb의 해리를 HBS-EP 전개 완충액에서 30분 동안 모니터링하였다. 각 사이클의 종료 시점에서, 10mM 인산을 12초간 주사하여 항-NPR1 mAb 포획 표면을 재생하였다. 결합 속도 (ka) 및 해리 속도(kd)는 Biacore 통찰 평가 소프트웨어를 사용하여 질량 수송이 제한된 1:1 결합 모델에 실시간 결합 센서그램을 피팅함으로써 결정하였다. 결합 해리 평형 상수 (KD) 및 해리 반감기 (t½)는 하기와 같이 동력학 속도로부터 계산하였다:
K
D
(M) =
, 및 t½ (min) =
25℃ 및 37℃에서 본원 개시내용의 상이한 항-NPR1 mAb에 결합하는 상이한 NPR1 시약에 대한 결합 동력학 파라미터는 표 4 내지 표 15에 나타낸다.
결과
[0195] 25℃에서, 항-NPR1 모노클로날 항체는 표 4에 나타낸 것과 같이 47.4pM 내지 1.27nM 범위의 KD 값으로 hNPR1-MMH에 결합하였다.
표 4:
25℃에서 다양한 항-NPR1 mAb의 hNPR1-MMH로의 결합 동력학 파라미터
[0196] 37℃에서, 항-NPR1 모노클로날 항체는 표 5에 나타낸 것과 같이 57.4pM 내지 1.7nM 범위의 KD 값으로 hNPR1-MMH에 결합하였다.
표 5: 37℃에서 다양한 항-NPR1 mAb의 hNPR1-MMH로의 결합 동력학 파라미터
[0197] 25℃에서, 항-NPR1 모노클로날 항체는 표 6에 나티낸 것과 같이 69pM 내지 1.23nM 범위의 KD 값으로 mfNPR1-MMH에 결합하였다.
표 6:
25℃에서 다양한 항-NPR1 mAb의 mfNPR1-MMH로의 결합 동력학 파라미터
[0198] 37℃에서, 항-NPR1 모노클로날 항체는 표 7에 나티낸 것과 같이 53.6pM 내지 1.99nM 범위의 KD 값으로 mfNPR1-MMH에 결합하였다.
표 7:
37℃에서 다양한 항-NPR1 mAb의 mfNPR1-MMH로의 결합 동력학 파라미터
[0199] 25℃에서, 항-NPR1 모노클로날 항체는 10배 농도의 hANP의 존재하에 표 8에 나타낸 것과 같이 78.8pM 내지 500pM 범위의 KD 값으로 hNPR1-MMH에 결합하였다.
표 8: 25℃에서 10배 농도의 hANP의 존재하에 다양한 항-NPR1 mAb의 hNPR1-MMH로의 결합 동력학 파라미터
[0200] 37℃에서, 항-NPR1 모노클로날 항체는 10배 농도의 hANP의 존재하에 표 9에 나타낸 것과 같이 642pM 내지 1.52nM 범위의 KD 값으로 hNPR1-MMH에 결합하였다.
표 9: 37℃에서 10배 농도의 hANP의 존재하에 다양한 항-NPR1 mAb의 hNPR1-MMH로의 결합 동력학 파라미터
[0201] 25℃에서, 단지 2개의 항-NPR1 모노클로날 항체는 표 10에 나타낸 것과 같이 35.8nM 내지 122nM 범위의 KD 값으로 돼지_NPR1-MMH에 결합하였다.
표 10: 25℃에서 다양한 항-NPR1 mAb의 돼지_NPR1-MMH로의 결합 동력학 파라미터.
[0202] 37℃에서, 단지 2개의 항-NPR1 모노클로날 항체는 표 11에 나타낸 것과 같이 42.1nM 내지 98.1nM 범위의 KD 값으로 돼지_NPR1-MMH에 결합하였다.
표 11: 37℃에서 다양한 항-NPR1 mAb의 돼지_NPR1-MMH로의 결합 동력학 파라미터
[0203] 25℃에서 또는 37℃에서, 항-NPR1 모노클로날 항체의 어떠한 것도 각각 표 12 및 표 13에 나타낸 바와 같이 mNPR1-MMH에 결합하지 않았다.
표 12: 25℃에서 다양한 항-NPR1 mAb의 mNPR1-MMH로의 결합 동력학 파라미터
표 13: 37℃에서 다양한 항-NPR1 mAb의 mNPR1-MMH로의 결합 동력학 파라미터
[0204] 25℃에서 또는 37℃에서, 항-NPR1 모노클로날 항체의 어떠한 것도 각각 표 14 및 표 15에 나타낸 바와 같이 개_NPR1-MMH에 결합하지 않았다.
표 14: 25℃에서 다양한 항-NPR1 mAb의 개_NPR1-MMH로의 결합 동력학 파라미터
표 15: 37℃에서 다양한 항-NPR1 mAb의 개_NPR1-MMH로의 결합 동력학 파라미터
실시예 4: 37℃에서 측정한 NPR1 시약에 결합하는 항-NPR1 모노클로날 항체의 pH 민감성
실험 절차
[0205] 실시간 표면 플라즈몬 공명(SPR) 기반 Biacore 4000 바이오센서를 사용하여 pH7.4 및 pH6.0 완충액에서 다양한 항-NPR1 모노클로날 항체(mAb)에 대한 해리 속도 상수(k d )를 결정하였다. 모든 결합 연구는 37℃에서 2개의 전개 완충액, (i) PBS, 0.05% v/v 계면활성제 Tween-20, pH7.4 (PBS-T-pH7.4), 및 (ii) PBS, 0.05% v/v 계면활성제 Tween-20, pH6.0 (PBS-T-pH6.0)를 사용하여 수행하였다. 상기 Biacore CM5 센서 칩 표면을 항-사람 Fc 특이적 항체와의 아민 커플링으로 먼저 유도체화시켜 항-NPR1 mAb를 포획하였다. C-말단 myc-myc-헥사히스티딘과 함께 발현된 다양한 농도의 사람 NPR1 세포 외 도메인(hNPR1-MMH; 서열번호 74) 또는 C-말단 myc-myc-헥사히스티딘과 함께 발현되는 몽키 NPR1 세포 외 도메인(mfNPR1-MMH; 서열번호 75)(30nM 및 10nM)을 PBS-T-pH7.4에서 제조하고 완충액을 30μL/min의 유속으로 4분 동안 주사한 후 5분 동안 PBS-T-pH7.4 또는 PBS-T-pH6.0 전개 완충액에서 결합된 NPR1 시약을 해리시켰다.
[0206] 2개의 pH 전개 완충액 중에서 해리율 상수(k d )는 Scrubber 2.0c 곡선-피팅 소프트웨어를 사용하여 1:1 결합 모델에 실시간 결합 센서그램을 피팅함에 의해 결정하였다. 해리 반감기(t½)는 다음과 같이 k d 값으로부터 계산하였다:
t½ (min) =
결과
[0207] PBS-T, pH 7.4 중에서 hNPR1-MMH 또는 mfNPR1-MMH에 결합하고 37℃에서 본원 개시내용의 PBS-T-pH 7.4 또는 PBS-T-pH 6.0에서 해리되는 다양한 항-NPR1 mAb에 대한 k d 및 t½ 값은 표 16 내지 표 19에 나타낸다.
표 16: PBS-T-pH7.4 완충액에서 다양한 항-NPR1 모노클로날 항체(mAb)의 hNPR1-MMH로의 결합 및 37℃에서 PBS-T-pH7.4 완충액에서의 해리
표 17: PBS-T-pH7.4 완충액에서 다양한 항-NPR1 모노클로날 항체(mAb)의 hNPR1-MMH로의 결합 및 37℃에서 PBS-T-pH6.0 완충액에서의 해리
표 18: PBS-T-pH7.4 완충액에서 다양한 항-NPR1 모노클로날 항체(mAb)의 mfNPR1-MMH로의 결합 및 37℃에서 PBS-T-pH7.4 완충액에서의 해리
표 19: PBS-T-pH7.4 완충액에서 다양한 항-NPR1 모노클로날 항체(mAb)의 mfNPR1-MMH로의 결합 및 37℃에서 PBS-T-pH6.0 완충액에서의 해리.
실시예 5 상이한 항-NPR1 모노클로날 항체들 간의 옥텟(Octet) 교차-경쟁
실험 절차
[0208] 옥텟 HTX 바이오센서 플랫폼(Pall ForteBio Corp.) 상에서 실시간 무표지 바이오층 간섭굴절측정(BLI) 검정을 사용하여 다양한 항-NPR1 모노클로날 항체들 간의 결합 경쟁을 결정하였다. 전체 실험은 25℃에서 10mM HEPES, 150mM NaCl, 3mM EDTA, 1mg/mL BSA, 0.02% NaN3, 0.05% v/v 계면활성제 Tween-20, pH7.4(HBS-EBT) 완충액에서 1000rpm의 속도로 플레이트를 진탕시키면서 수행하였다. 2개 항체가 C-말단 myc-myc-헥사히스티딘(hNPR1-MMH; 서열번호 74)과 함께 발현된 재조합 사람 NPR1 세포 외 도메인 상의 이들의 각각의 에피토프에 결합하는 것에 대해 서로 경쟁할 수 있는지를 평가하기 위해 약 0.64nM의 hNPR1-MMH를 먼저 60초 동안 hNPR1-MMH의 40~50μg/mL 용액을 함유하는 웰에 바이오센서 팁을 침지시킴에 의해 항-Penta-His 항체가 코팅된 옥텟 바이오센서 팁(Fortebio Inc, # 18-5122)상에 포획하였다.
[0209] 항원 포획된 바이오센서 팁을 이어서 4분동안 mAb-1의 50μg/mL 용액을 함유하는 웰에 침지시켜 제1의 항-NPR1 모노클로날 항체 (후속적으로 mAb-1으로서 언급됨)로 포화시켰다. 바이오센서 팁을 이어서 후속적으로 3분 동안 제2 항-NPR1 모노클로날 항체 (후속적으로 mAb-2로서 언급됨)의 50μg/mL 용액을 함유하는 웰에 침지시켰다. 바이오센서 팁은 실험 단계 마다 HBS-EBT 완충액 중에서 세척하였다. 실시간 결합 반응을 전체 실험 과정 동안 모니터링하였고, 매 단계의 종료시에 결합 반응을 기록하였다.
결과
[0210] mAb-1과 사전 복합체화된 hNPR1-MMH에 대한 mAb-2의 반응을 순서가 역전된 경우(mAb-2 제1 항체 결합, mAb1 제2 항체 결합)의 결합 반응과 비교하고, 표 20에 요약된 바와 같이 다양한 항-NPR1 모노클로날 항체의 경쟁적/비경쟁적 거동을 결정하였다.
표 20. hNPR1-MMH에 결합하는 것에 대해 다양한 항-NPR1 모노클로날 항체 간의 교차-경쟁
실시예 6 길항성 항-NPOR1 항체의 NPR1 길항작용의 평가
실험 절차
[0211] 사람 나트륨이뇨 펩타이드 수용체 1(hNPR1)의 조절을 평가하기 위해 C-term myc 및 FLAG 태그가 있는 hNPR1(승인 #NP_000897.3의 아미노산 M1 내지 G1061)을 안정적으로 발현하는 HEK293 세포주를 생성하고 hNPR1 발현이 높은 세포를 분류하였다. 수득한 세포주를 약칭 HEK293/hNPR1으로 약칭된 HEK293/hNPR1.MycDDK HS로 명명하고, 10% FBS, NEAA, 펜/스트렙/글루타민, 및 500μg/mL G418 설페이트를 함유하는 DMEM에서 유지하였다. 리간드의 NPR1으로의 결합은 수용체의 구아닐레이트 사이클라제 도메인을 활성화시켜 GTP로부터 cGMP의 생성을 촉매한다(문헌참조: Zois, et al., 2014 Natriuretic peptides in cardiometabolic regulation and disease. Nature Publishing Group, 11(7), 403-412). cGMP 수준을 측정하는 균질의 시간 분해 형광(HTRF) 검정을 사용하여 NPR1 활성을 평가하였다.
NPR1 길항작용의 분석
[0212] NPR1 길항작용을 평가하기 위해 HEK293/hNPR1 세포를 96웰 절반 면적 플레이트에 20,000세포/웰의 완전 성장 배지에 분주하고 밤새 배양하였다. 다음 날, 성장 배지를 다양한 농도(0.017 nM - 1μM, 항체가 없는 추가 조건)의 항-NPR1 또는 이소타입 대조군 항체가 포함된 희석 완충액(0.1% FBS가 포함된 OptiMEM)으로 교체하고 37℃에서 15분 동안 항온처리하였다. 전처리 후, 희석 완충액 또는 0.2 nM ANP 또는 0.7 nM BNP가 포함된 희석 완충액에서 다양한 농도(ANP = 0.002 - 2 nM 또는 BNP = 0.0039 - 4 nM, 리간드가 없는 추가 조건)로 리간드인 ANP 또는 BNP로 HEK293/hNPR1 세포를 자극하고 37℃에서 30분 동안 항온처리하였다.
[0213] 제조업자의 지침에 따라 HTRF 검정은 cGMP HTRF 키트(Cisbio, #62GM2PEH)를 사용하여 수행하였다. 형광 강도는 EnVision 다중표지 플레이트 판독기(Perkin Elmer)를 사용하여 검출하고 형광 공명 에너지 전달(FRET) 비율은 제조업체의 지침에 따라 계산하였다. FRET 비율을 cGMP 표준 곡선에 따라 로그 스케일의 cGMP 농도로 전환시키고 10점 농도-반응 곡선에 대해 4-파라미터 로지스틱 수학식을 사용하여 분석하여 GraphPad Prism 8을 사용하여 항-NPR1 항체에 대한 절반 최대 억제 농도(IC50) 값을 수득하였다. 리간드의 절반 최대 유효 농도(EC50) 값은 고농도에서의 정량 한계로 인해 계산되지 않았다. 최대 억제는 하기된 수학식을 사용하여 계산하였다:
[0214] 이러한 수학식에서 [Log cGMP, M]기준선, [Log cGMP, M]리간드가 있는 1μM 시험 항체 및 [Log cGMP, M]0.2nM ANP 또는 0.7nM BNP는 각각 희석 완충액 단독, 0.2nM ANP 또는 0.7nM BNP와 함께 1μM에서 항-NPR1 항체의 최고 농도, 및 0.2nM ANP 또는 0.7nM BNP 단독 처리한 세포로부터 로그 스케일의 cGMP 농도 값이다.
NPR1 길항작용 방식의 결정
[0215] ANP 매개 NPR1 활성화의 항-NPR1 항체 억제 방식은 cGMP 축적 검정의 쉴드(Schild) 분석에 의해 평가하였다(문헌참조: Kenakin 1997 Pharmacologic Analysis of Drug-Receptor Interaction. 3rd edition. Philadelphia: Lippincott-Raven). ANP 농도 반응 곡선이 cGMP 표준 곡선의 선형 범위로 떨어지도록 조건을 최적화하였다. 간략하게, 효소가 없는 세포 해리 용액을 사용하여 HEK293/hNPR1 세포를 플레이트로부터 탈착시켰다. 이어서 세포 현탁액을 희석 완충액에 1,000개의 세포/웰의 저용량 96웰 플레이트에 재분주하였다. 이어서 세포를 실온에서 15분 동안 0nM, 50nM, 150nM 또는 450nM의 고정 농도로 희석 완충액에서 항-NPR1 항체로 사전 처리하였다. 전처리 후 희석 완충액(ANP가 없는 추가 조건과 함께)에서 다양한 농도(1.0 pM 내지 1μM)의 ANP를 세포에 첨가하고 실온에서 5분 동안 항온처리하였다.
[0216] HTRF 검정, 형광 강도 검출 및 cGMP 농도 계산은 모두 이전에 기재된 바와같이 수행하였다. 96웰 저용량 플레이트를 사용하면 cGMP 표준 곡선 및 검출 시약에 필요한 용적은 96웰 절반 면적 플레이트에 사용되는 용적의 절반이었다.
[0217] 모든 검정 파라미터는 GraphPad Prism 8을 사용하여 분석하였다. 항-NPR1 항체의 존재 또는 부재하에 ANP의 EC50 값은 11-점 농도-반응 곡선에 대한 4-파라미터 로지스틱 수학식을 사용하여 계산하였다. 항-NPR1 항체에 의한 ANP 최대 반응의 감소는 수학식을 사용하여 계산하였다:
[0218] 쉴드 기울기는 길항제 농도에 대한 Y축의 로그(농도 비율 - 1)를 X축의 로그 스케일로 플롯팅하여 도출한 쉴드 플롯 분석으로 결정하였다. 농도 비는 서로 다른 농도에서 길항제의 존재하에 ANP의 EC50 값을 길항제의 부재하에 ANP의 EC50 값으로 나눈 값으로 정의된다.
세포 기반 세포 독성 검정에서 2차 항체-약물 접합체를 사용한 항-NPR1 항체 매개 내재화 분석
[0219] 항-NPR1 항체의 내재화는 세포 독성 페이로드인 모노메틸 오리스타틴 F(MMAF)와 접합된 2차 항체를 사용한 세포 독성 분석으로 간접적으로 평가하였다. 항-NPR1 항체는 세포상의 NPR1에 결합한 후 수용체와 내재화되어 항-사람 Fc fab 2차 항체-약물 접합체(2차 ADC)의 공동 내재화, 접합된 세포 독성 페이로드의 방출 및 세포 사멸을 초래한다. 따라서 세포 독성의 정도는 표적 결합 시 항체의 내재화 능력을 평가하는 데 사용할 수 있다.
[0220] 검정을 위해, HEK293/hNPR1 세포를 96웰 백색 플레이트에 1,000개 세포/웰로 완전 성장 배지에 분주하고 밤새 배양하였다. 다음 날, 세포를 37℃에서 5분 동안 100nM ANP 또는 100nM BNP의 존재 또는 부재하에 다양한 농도(희석 완충액에서 914 fM에서 6nM까지 연속 희석, 항체가 없는 추가 조건과 함께)의 항-NPR1 또는 대조군 항체로 전처리하였다. 전처리 후, 최종 농도 20nM의 2차 ADC를 HEK293/hNPR1 세포에 첨가하였다. 검정에서 최대 사멸을 평가하기 위해 최종 농도 48μg/ml의 디지토닌을 대조군 웰에 첨가하였다. 처리된 세포를 3일동안 37℃에서 항온처리하였다.
[0221] 세포 생존력을 측정하기 위해 제조업체의 지침에 따라 Promega CellTiter-Glo를 사용하였다. 발광 강도는 EnVision 다중표지 플레이트 판독기를 사용하여 검출하고 9점 농도-반응 곡선에 대해 4-파라미터 로지스틱 수학식을 사용하여 분석하여 항-NPR1 항체의 IC50 값을 수득하고 GraphPad Prism 8을 사용하였다. 세포 생존력 또는 세포 사멸의 퍼센트는 아래 기재된 수학식을 사용하여 계산하였다:
결과
항-NPR1 항체에 의한 리간드 매개 NPR1 활성화의 억제 평가
[0222] ANP와 BNP는 모두 HEK293/hNPR1 세포를 활성화하여 농도 의존적인 방식으로 cGMP 축적을 자극하였다(도 1a 및 1b). 모든 항-NPR1 항체는 7.0 - 51nM의 IC50 값과 82% - 107%의 최대 억제율로 0.2nM ANP 또는 0.7nM BNP로 유도된 NPR1 활성화를 유의적으로 차단하였다(도 1a 및 1b 및 표 21). 이소타입 대조군 항체는 0.2 nM ANP 또는 0.7 nM BNP로 유도된 NPR1 활성화에 대해 어떠한 유의적인 억제를 보이지 않았다(도 1a, 1b 및 표 21).
표 21. 항-NPR1 항체는 cGMP 축적 검정으로 측정시, 리간드 유도된 NPR1 활성화를 유의적으로 억제하였다
ND: 신호에서 농도 의존적 변화의 결핍으로 인해 결정되지 않음;
Max Inh.: 최대 억제.
[0223] 종합해보면, H4H22034N, REGN7541, REGN7544 및 REGN7548은 cGMP 축적 검정으로 측정시 리간드 유도된 NPR1 활성화의 유의적인 억제를 보여주었다.
항-NPR1 항체가 ANP 매개된 NPR1 활성화를 억제하는 방식의 평가
[0224] 쉴드 분석을 수행하여 ANP 매개된 NPR1 활성화에 대한 항-NPR1 항체 억제 방식을 결정하였다. 분석에서 최대 반응을 변경하지 않고 쉴드 기울기가 ~1인 효능제 농도-반응 곡선의 평행한 우측 방향 이동은 경쟁적인 길항제를 나타낸다. 대조적으로, 쉴드 기울기가 1에 근접하지 않은 효능제 농도-반응 곡선의 비평행 우측 방향 이동은 비경쟁적인 길항제를 나타낸다. 효능제의 최대 반응을 변화시킬 수 있는 길항제를 극복 불가능한 길항제로 정의하고, 효능제의 최대 반응을 변화시키지 않는 길항제를 극복 가능한 길항제로 정의한다(문헌참조: Kenakin, 1997).
[0225] 쉴드 분석을 사용하여 H4H22034N, REGN7541, REGN7544 및 REGN7548은 cGMP 축적 검정에서 ANP 효능제에 대한 비경쟁적 억제를 입증하였다(도 2a-2e). 4개의 항-NPR1 항체의 농도를 증가시키면 쉴드 기울기가 1에 근접하지 않은 ANP 농도-반응 곡선의 비평행 우측 방향 이동을 초래하였다. 또한, H4H22034N에 의한 억제는 ANP의 최대 반응을 변화시키지 않은 반면, REGN7541, REGN7544 및 REGN7548에 의한 억제는 ANP의 최대 반응을 10 - 62%까지 감소시켰다(도 2a-2e 및 표 22).
표 22. 항-NPR1 항체는 쉴드 분석에서 비경쟁적 길항작용을 보여주었다
[0226] 종합해보면, H4H22034N, REGN7541, REGN7544 및 REGN7548은 최대 리간드 반응에 다양한 효과를 갖는 비경쟁적 길항작용을 입증하였다.
항-NPR1 항체 유도된 NPR1 내재화의 평가
[0227] 항-NPR1 항체의 내재화는 리간드의 존재 또는 부재하에 2차 ADC 매개된 세포독성 검정을 사용하여 평가하였다. 리간드의 부재하에, 모든 항-NPR1 항체는 농도 의존적 방식으로 NPR1 내재화를 유도하였고, IC50 값은 58 - 243 pM이고, 최대 사멸은 82% - 85%이다(도 3a-3c 및 표 23). 100nM 리간드의 존재하에, 항-NPR1 항체는 132 - 703pM의 IC50 값과 50% - 82%의 최대 사멸로 NPR1 내재화를 유도하였다. 이소타입 대조군 항체는 리간드의 존재 또는 부재하에 임의의 유의적인 NPR1 내재화를 보이지 않았다(도 3a-3c 및 표 23).
표 23. 2차 ADC 매개된 세포독성 검정으로 측정시 리간드의 존재 또는 부재하에 항-NPR1 항체의 내재화
ND: 신호에서 농도 의존적 변화의 결핍으로 인해 결정되지 않음.
[0228] 종합하면, H4H22034N, REGN7541, REGN7544 및 REGN7548은 2차 ADC 매개된 세포독성 검정으로 측정시 리간드의 존재 또는 부재하에 NPR1의 항-NPR1 항체 내재화를 보여주었다.
실시예 7 전기화학발광 기반 검출을 사용한 세포 표면상에서 NPR1 단독에 결합하거나 ANP 또는 BNP와 복합체화되는 항-NPR1 항체의 효능 및 특이성
실험 절차
[0229] 사람 심방(ANP) 또는 사람 뇌(BNP) 나트륨이뇨 펩타이드 리간드의 존재 또는 부재하에 사람 또는 몽키(마카카 파시큘라리스(Macaca fascicularis)) NPR1(hNPR1 또는 mfNPR1) 발현 세포에 결합하는 항-사람 NPR1 모노클로날 항체의 능력을 전기화학발광(ECL) 기반 면역검정을 사용하여 결정하였다.
[0230] 간략하게, HEK293/hNPR1 발현 세포는 사람 배아 콩팥(HEK) 293 세포에 사람 NPR1(아미노산 M1-G1061, UniProtKB - P16066)을 암호화하는 네오마이신 내성 pLVX.hNPR1.myc.DDK 플라스미드를 형질감염시켜 생성하였다. 유사하게, HEK293/mfNPR1 세포는 전장 몽키 NPR1(아미노산 M1-G1061, 승인 번호 XP_005541809.1)을 암호화하는 네오마이신 내성 pRG984 플라스미드를 HEK293 세포에 형질감염시켜 생성하였다. 형광 활성화된 세포 분류(FACS)에 의해 상업용 항-hNRP1 항체의 검출가능하지 않은 결합을 보여주었던 비형질감염된 HEK293 세포주를 비특이적 결합 대조군으로서 실험에 포함시켰다.
[0231] 실험은 하기의 과정에 따라 수행하였다. 상기된 세포주의 배양물은 Ca2+/Mg2+가 부재인 1x PBS중에서 1회 세정하고 효소 부재 세포 해리 용액과 37℃에서 10분동안 항온처리하여 세포를 플라스크로부터 탈착시켰다. 수거된 세포 펠릿은 Ca2+/Mg2+을 갖는 1 x PBS로 1회 세척하고 여기에 재현탁시키고 이어서 세포를 CellometerTM 자동 T4 세포 계수기 (Nexcelom Bioscience, Lawrence, MA)를 사용하여 계수하였다. 웰당 대략 2.0x104개의 세포를 96웰 탄소 전극 플레이트(Meso Scale Diagnostics, Rockville, MD)에 씨딩하고 37℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. 비특이적 결합 부위는 실온(RT)에서 1시간 동안 Ca2+/Mg2+을 포함하는 1x PBS 중에서 2% BSA (w/v)를 사용하여 차단시켰다. 후속적으로, HEK293/hNPR1 및 HEK293/mfNPR1 세포는 실온에서 0.5시간 동안 10nM hANP (Tocris, Minneapolis, MN), 100nM hBNP (Tocris, Minneapolis, MN), 또는 샘플 희석 완충액 단독으로 항온처리하고, HEK293 세포는 샘플 희석 완충액 단독으로 처리하였다. 세척하지 않고 항-NPR1, 비교인자 1 또는 이소타입 대조군 항체의 1.7pM 내지 100nM 범위의 연속 희석액 또는 항체가 없는 완충액을 세포에 첨가한 후 실온에서 1시간 항온처리하였다. 이어서 플레이트는 세포 세척 헤드를 갖는 AquaMax2000 플레이트 세척기(MDS Analytical Technologies, Sunnyvale, CA)를 사용하여 세척하여 결합되지 않은 항체, hANP 및 hBNP를 제거하였다. 플레이트 결합된 항체는 실온에서 1시간 동안 세포와 함께 항온처리된 중쇄 및 경쇄에 특이적인 SULFO-TAGTM-접합된 폴리클로날 염소 항-사람 IgG 항체(Jackson Immunoresearch, West Grove, PA)로 검출하였다.
[0232] 세척 후, 플레이트는 제조업자의 추천된 과정에 따라 판독(Read) 완충액 (Meso Scale Diagnostics, Rockville, MD)으로 전개하였고, 발광 신호는 SECTOR Imager 600 (Meso Scale Diagnostics, Rockville, MD)를 사용하여 기록하였다. RLU의 유닛에서 결합 신호는 항체 농도의 함수로서 분석하였고 데이터는 R 통계학적 팩키지 (개방 소스)를 사용한 S자 (4-파라미터 로지스틱) 용량-반응 모델로 피팅하였다. 최대 결합 신호의 50%가 검출되는 항체의 농도로 정의되는 EC50 값은 세포 표면상의 NPR1에 복합체화된 ANP 또는 BNP의 존재 또는 부재하에 NPR1 발현 세포에 대한 항-NPR1 항체의 결합 효능을 나타내는 것으로 확인되었다.
결과
[0233] 항-NPR1 모노클로날 항체가 ANP 또는 BNP의 존재 또는 부재하에 사람 또는 몽키 NPR1을 발현하도록 가공된 HEK293 세포 표면에 특이적으로 결합하는 능력을 전기화학발광 기반 면역검정을 사용하여 평가하였다. 항체 결합의 농도 의존성을 분석하고 EC50 값을 결정하였다. 결과는 표 24에 요약한다.
표 24: NPR1 리간드의 존재 또는 부재하에 NPR1 발현 세포에 결합하는 항-NPR1 항체의 효능
[0234] 본원 개시내용의 4개의 항-NPR1 항체(H4H22034, REGN7541, REGN7544, REGN7548)는 10nM hANP 또는 100nM hBNP의 존재하에서 사람 NPR1 가공된 세포에 결합하였다. 10nM hANP 또는 100nM hBNP의 존재하에 HEK293/hNPR1.myc.DDK 세포에 대한 이들 항체의 효능은 각각 0.56nM 내지 2.9nM 또는 0.43nM 내지 1.5nM의 EC50 값 범위였다(표 24). hNPR1을 발현하는 세포에서 hANP와 hBNP의 부재하에 유사한 결합 효능이 확인되었고, EC50 값은 0.34nM 내지 1.7nM 범위이다. 동일한 실험 조건하에 모체 HEK293 세포에서는 이러한 항체에 대한 결합을 검출할 수 없음이 관찰되었다. 이들 결과는 항체가 NPR1 특이적 결합제이고, 이들 항체에 대한 사람 NPR1 결합 효능은 ANP 또는 BNP의 존재에 의해 영향을 받지 않음을 시사한다.
[0235] 대조적으로, 비교인자 1은 hANP 또는 hBNP가 존재할 때(10nM hANP 또는 100nM hBNP)에만 hNPR1 세포에 결합 특이성을 나타냈고, EC50 값은 각각 0.57nM 및 1.8nM이었고, hANP 및 hBNP의 부재하에서는 검출 가능한 결합이 관찰되지 않아 NPR1-ANP/BNP 복합체 단독 결합제로 분류되었다.
[0236] 항-NPR1 항체 H4H22034, REGN7541, REGN7544, REGN7548은 몽키 NPR1 발현 세포(HEK293/mfNPR1)에도 결합하고 EC50 값은 0.33nM에서 1.7nM 범위이다. hNPR1 세포와 유사하게, 10nM hANP 또는 100nM의 hBNP를 첨가해도 HEK293/mfNPR1 세포에 대한 항-NPR1 항체 결합에 영향을 미치지 않았고; 항체 결합에 대한 EC50 값은 hANP와 hBNP의 존재하에 각각 0.67nM 내지 4.2nM 또는 0.42nM 내지 1.7nM 범위였고(표 24) 모체 HEK293 세포상에 어떤 항체에도 결합이 검출되지 않았다. 대조적으로, 비교인자 1은 10nM hANP 또는 100nM hBNP의 존재하에서만 HEK293/mfNPR1 가공된 세포에 특이적으로 결합했지만, S자 곡률이 결핍된 농도 의존적 결합 곡선으로 인해 EC50 값을 결정할 수 없었고 결합 모델에 데이터를 피팅할 수 없었다.
[0237] 상기 실험에서 이소타입 대조군은 HEK293/hNPR1, HEK293/mfNPR1, HEK293 세포에 결합하지 않았다.
실시예 8 정상 혈압 원격측정한 NPR1
hu/hu
마우스에서 NPR1 길항제 mAb의 단일 25 mg/kg 정맥 내 투여 후 전신 혈압에 미치는 급성 효과의 특징 분석
실험 절차
[0238] 상기 연구의 목적은 원격 측정된 정상 혈압 NPR1hu/hu 마우스에서 기준선 전신 혈압에 대한 NPR1 길항제 항체의 급성 효과를 평가하는 것이었다. ~14-16주령의 수컷 NPR1hu/hu (n=30) 마우스에는 PA-C10 원격 측정기(DSI, St. Paul, Mn)를 이식하고 적어도 7일 동안 회복하도록 방치하였다. 동물은 체중을 기준으로 그룹(그룹 1-5)으로 분류하였다(표 25). 동물은 개별적으로 표준 조건 (64°F 내지 84°F(18℃ 내지 29℃)의 온도; 30% 내지 70%의 상대적 습도)하에 거주시키고 12시간 광/12시간 암 사이클을 유지하였다. 음식물(연구 식이 표준 펠렛 저작물) 및 물을 자유롭게 제공하였다.
표 25. 용량 및 용량 그룹의 요약
[0239] 시험 단백질을 0일째에 단일 정맥내 주사로 적당한 동물에 투여하였다. 각각의 동물에 대한 용량 용적은 가장 최근의 체중 측정을 기준으로 하였다.
[0240] 수축기 혈압, 확장기 혈압, 평균 동맥 혈압, 맥박 압력 및 심박수는 시험 기간의 지속 기간 동안 매분 10초 동안 수집하였다. 원격 측정 데이터는 평균 60분 또는 24시간 값으로 나타낸다. 모든 데이터는 평균 ±SEM으로서 제공된다.
결과
[0241] 생체 내 평가는 PBS 대조군과 비교했을 때 NPR1 길항제 항체를 투여받은 동물이 평가된 임의의 항체를 단일 정맥내 투여한 후 전신 혈압이 신속하고 지속적으로 증가함을 입증하였다(도 4). 압력 변화는 거의 즉시 발생했으며(도 4), 실험 기간인 7일차까지 지속되었다(도 5). 기준선으로 부터 평균(투여 후 48-시간) 수축기 혈압 변화에 의한 평가시 급성 혈압 증가의 정도는 +7.64±1.13 (REGN7541) 내지 +9.81±1.03 (H4H22034N) mmHg 범위이다. 기준선으로 부터 평균(투여 후 7일의) 수축기 혈압 변화에 의한 평가시 혈압 증가의 정도는 +7.65±1.03 (REGN7548) 내지 +9.55±1.16 (H4H22034N) mmHg 범위이다.
[0242] 확장기, 평균 동맥 및 맥박 혈압(표 26 및 표 27)도 NPR1 차단 mAb 투여 후 유의적으로 변화하였고, 수축기 혈압에서 관찰 및 보고된 효과의 크기와 지속 시간과 일치하였다. 심박수 반응은 다양하였고(표 26 및 표 27), 급격한 변화는 일반적으로 기준선에 비해 심박수가 더 많이 감소하는 경향을 가졌다. 이들 변화는 관찰된 압력 증가와 일치한다. 7일 후 심박수를 평가한 결과 REGN7548을 투여받은 동물의 심박수가 상대적으로 크게 증가한 것으로 나타났다.
표 26. 투여 후 48시간 동안의 기준선 혈압 및 심박수 평균 변화
표 27. 투여 후 7일 동안의 기준선 혈압 및 심박수 평균 변화
[0243] NPR1 길항제 항체 H4H22034N, REGN7541, REGN7544 및 REGN7548은 정상 혈압의 NPR1hu/hu 마우스에 단일 피하 주사 후 수 시간 내에 전신 혈압을 유의적이고 신속하게 증가시켰다. 관찰된 혈역학적 효과는 7일간의 실험 기간 동안 지속되었다.
실시예 9 정상 혈압 NPR1
hu/hu
마우스에서 NPR1 길항제 mAb의 단일 1 또는 25 mg/kg의 전신 혈압에 미치는 효과의 특징 분석
실험 절차
[0244] 상기 연구의 목적은 원격 측정된 정상 혈압 NPR1hu/hu 마우스에서 기준선 전신 혈압에 대한 NPR1 길항제 항체의 효과를 평가하는 것이다. ~20-24주령의 수컷 NPR1hu/hu (n=54) 마우스에는 PA-C10 원격 측정기(DSI, St. Paul, MN)를 이식하고 적어도 7일 동안 회복하도록 방치하였다. 동물은 체중과 기준선 수축기 및 맥박 압력을 기준으로 그룹(그룹 1-10)으로 분류한 후 그룹에 할당하였다(표 28). 동물은 개별적으로 표준 조건 (64°F 내지 84°F(18℃ 내지 29℃)의 온도; 30% 내지 70%의 상대적 습도)하에 거주시키고 12시간 광/12시간 암 사이클을 유지하였다. 음식물(연구 식이 표준 펠렛 저작물) 및 물을 자유롭게 제공하였다.
표 28. 용량 및 용량 그룹의 요약
[0245] 시험 단백질을 0일째에 단일 피하 주사로 적당한 동물에 투여하였다. 각각의 동물에 대한 용량 용적은 가장 최근의 체중 측정을 기준으로 하였다.
[0246] 수축기 혈압, 확장기 혈압, 평균 동맥 혈압, 맥박 압력 및 심박수는 시험 기간의 지속 기간 동안 10분 마다 10초 동안 수집하였다. 원격측정 데이터는 평균 24시간 값으로 나타낸다. 모든 데이터는 평균 ±SEM으로서 제공된다.
결과
[0247] NPR1 길항제 항체의 생체 내 특징 분석 결과, IgG4P 이소타입 및 PBS 대조군 투여 동물과 비교했을 때 NPR1 길항제를 투여받은 NPR1hu/hu 마우스는 평가된 임의의 NPR1 길항제 항체를 1 또는 25 mg/kg 피하 1회 투여한 후 전신 혈압이 유의적으로 및 지속적으로 증가한 것으로 나타났다(표 29, 표 30, 도 6, 도 7). 피하 1mg/kg 1회 투여 후 혈압 증가의 정도는 기준선 대비 평균(투여 후 0 내지 14일째) 수축기 혈압 변화로 평가했을 때 +6.81±0.76(REGN7548) 내지 +11.22±0.93(REGN7541) mmHg 범위였다(표 29 및 도 6). 피하 25 mg/kg 1회 투여 후 혈압 증가의 정도는 기준선 대비 평균(투여 후 0 내지 14일째) 수축기 혈압 변화로 평가했을 때 +8.82±0.64(H4H22034) 내지 +9.76±0.92(REGN7544) mmHg 범위였다(표 29 및 도 7).
표 29. 투여 후 14일 동안의 기준선 혈압 및 심박수 평균 변화
표 30. 투여 후 15 내지 27일 동안의 기준선 혈압 및 심박수 평균 변화
[0248] 이들 NPR1 길항제 항체의 만성 효과는 27일 동안 평가하였다(표 30 및 도 6 및 도 7). 0일에 피하 1mg/kg을 1회 주사한 후, 시험 기간 동안 평가한 4개의 NPR1 차단 mAb 중 3개에서 전신 혈압이 유의적으로 상승한 상태를 유지하였다(표 30 및 도 6). 피하 1mg/kg 1회 투여 후 혈압 증가의 정도는 기준선 대비 평균(투여 후 15 내지 27일째) 수축기 혈압 변화로 평가시 +4.04±0.30(H4H22034) 내지 +9.03±0.32(REGN7541) mmHg 범위였다. 0일째에 25 mg/kg 피하 1회 주사 후, 평가한 모든 NPR1 차단 mAb의 전신 혈압은 유의적으로 상승한 상태를 유지하였다. 피하 25 mg/kg 1회 투여 후 혈압 증가의 정도는 기준선 대비 평균(투여 후 15 내지 27일째) 수축기 혈압 변화로 평가시 +10.53±0.43(H4H22034) 내지 +14.2±0.42(REGN7544) mmHg 범위였다. 심박수 반응은 다양하였고(표 29 및 표 30), 관찰된 전신 혈압의 증가와 일치하는 일반적인 심박수 감소 경향을 가졌다. 확장기, 평균 동맥 및 맥박 혈압(표 29 및 표 30)도 NPR1 차단 mAb 투여 후 유의적으로 변화하였고, 수축기 혈압에서 관찰 및 보고된 효과의 크기와 지속 시간과 일치하였다.
[0249] NPR1 길항제 항체 H4H22034N, REGN7541, REGN7544 및 REGN7548은 정상 혈압의 NPR1hu/hu 마우스에 1회 피하 주사 후 최대 27일 동안 전신 혈압을 유의적으로 증가시켰다.
실시예 10 유체역학적 DNA 전달을 통한 ANP의 과발현이 전신 혈압에 미치는 효과와 저혈압 NPR1
hu/hu
마우스에서 단일 25 mg/kg 용량의 NPR1 길항제 mAb 투여 후 효과를 역전시키는 능력의 특징 분석
실험 절차
[0250] 본 연구의 목적은 원격 측정된 저혈압 NPR1hu/hu 마우스에서 NPR1 길항제 항체의 효과와 과발현에 대한 ANP의 혈압 강하 효과를 역전시키는 능력을 평가하는 것이었다. ~12-16주령의 수컷 NPR1hu/hu (n=48) 마우스에는 PA-C10 원격 측정기(DSI, St. Paul, MN)를 이식하고 적어도 7일 동안 회복하도록 방치하였다. 동물은 체중을 기준으로 그룹(그룹 1-6)으로 분류하였다(표 31). 동물은 개별적으로 표준 조건 (64°F 내지 84°F(18℃ 내지 29℃)의 온도; 30% 내지 70%의 상대적 습도)하에 거주시키고 12시간 광/12시간 암 사이클을 유지하였다. 음식물(연구 식이 표준 펠렛 저작물) 및 물을 자유롭게 제공하였다.
표 31. 용량 및 용량 그룹의 요약
[0251] HDD 플라스미드와 시험 단백질을 각각 0일째와 7일째에 해당 동물에 단일 정맥내 주사에 의해 투여하였다. 시험 단백질의 투여를 위한 용량 용적은 가장 최근의 체중 측정을 기준으로 하였다.
[0252] 수축기 혈압, 확장기 혈압, 평균 동맥 혈압, 맥박 압력 및 심박수는 시험 기간의 지속 기간 동안 매분 10초 동안 수집하였다. 원격측정 데이터는 평균 24시간 값으로 나타낸다. 모든 데이터는 평균 ±SEM으로서 제공된다.
결과
[0253] NPR1 길항제 항체의 생체 내 특징 분석 결과, IgG4P 이소타입 대조군 투여 동물과 비교했을 때 NPR1 길항제 항체가 NPR1hu/hu 마우스에서 ANP 과발현 유도된 전신 혈압 감소를 신속하고 지속적으로 정상화할 수 있었다(표 32 및 표 33). 혈청 NTproANP 농도는 시험 기간 동안 유의적이고 지속적으로 증가하였고(표 34), 이는 ANP의 효과적인 과발현을 나타낸다. NPR1 차단제 25 mg/kg을 1회 정맥내 투여한 후 ANP HDD 유도된 저혈압 마우스의 혈압 증가 정도는 기준선 대비 평균(투여 후 7일 내지 28일) 수축기 혈압 변화로 평가시 ANP HDD 투여 전 대비 -9.27±0.61(H4H22034N)에서 +10.26±1.48(REGN7544) mmHg(표 33 및 도 8)의 범위였다.
표 32. HDD 투여 후 7일 동안의 기준선 혈압 및 심박수 평균 변화
표 33. HDD 투여 후 8 내지 28일 동안의 기준선 혈압 및 심박수 평균 변화
표 34. 14, 21 및 28일째 혈청 NTproANP 농도
[0254] 전신 압력의 현저하고 지속적인 감소와 좌심실 후부하의 감소 가능성에 따라 ANP HDD를 투여받은 마우스에서 절대 및 상대 심장 무게가 현저하게 감소하였다(도 9a 및 9b). NPR1 차단 mAb를 투여받은 동물의 심장은 정상 혈압 대조군과 차이가 없었으며 전신 및 심실 혈압에서 효과적인 증가를 지적한다.
[0255] NPR1 길항제 항체 H4H22034N, REGN7541, REGN7544 및 REGN7548은 ANP HDD 유도된 저혈압 NPR1hu/hu 마우스에서 최대 28일 동안 전신 혈압을 유의적으로 및 지속적으로 증가시켰다.
실시예 11 원격 측정된 NPR1
hu/hu
마우스에서 LPS 유도된 쇼크 모델을 사용한 예방학적 및 치료학적 투여에서의 NPR1 차단
실험 절차
[0256] 본 연구의 목적은 LPS 투여로 인해 저혈압이 발생한 원격 측정된 NPR1hu/hu 마우스에 예방학적 또는 치료학적으로 투여된 NPR1 길항제 항체의 효과를 평가하는 것이었다. ~12-17주령의 수컷 NPR1hu/hu (n=58) 마우스에는 PA-C10 원격 측정기(DSI, St. Paul, MN)를 이식하고 적어도 7일 동안 회복하도록 방치하였다. 동물은 체중과 수축기 및 맥박 압력을 기준으로 그룹(그룹 1-6)으로 분류한 후 그룹에 할당하였다(표 35). 동물은 개별적으로 표준 조건 (64°F 내지 84°F(18℃ 내지 29℃)의 온도; 30% 내지 70%의 상대적 습도)하에 거주시키고 12시간 광/12시간 암 사이클을 유지하였다. 음식물(연구 식이 표준 펠렛 저작물) 및 물을 자유롭게 제공하였다.
표 35. 용량 및 용량 그룹의 요약
[0257] 동물에게 0일째에 5mg/kg LPS 또는 PBS를 복막내 1회 투여하였다. 시험 단백질을 해당 동물에게 LPS 투여 ~24시간 전 또는 투여 후 8시간에 정맥내 1회 주사로 투여하였다. 각각의 동물에 대한 용량 용적은 가장 최근의 체중 측정을 기준으로 하였다.
[0258] 수축기 혈압, 확장기 혈압, 평균 동맥 혈압, 맥박 압력 및 심박수는 시험 기간의 지속 기간 동안 10분 마다 10초 동안 수집하였다. 원격측정 데이터는 평균 24시간 값으로 나타낸다. 모든 데이터는 평균 ±SEM으로서 제공된다.
결과
[0259] LPS 유도된 저혈압 NPR1hu/hu 마우스에 예방학적으로 또는 치료학적으로 투여한 NPR1 길항제 항체의 생체 내 특징 분석 결과, 전신 혈압이 유의적이고 지속적으로 증가하는 것으로 나타났다(표 36, 표 37, 도 10). 예방학적으로 투여받은 동물은 신속한 압력 증가를 보였다(표 36). 25 mg/kg 정맥내 주사 1회 투여 후 이 연구의 예방 아암에서 기준선 대비 수축기 혈압 변화의 평균(LPS 투여 24시간 전부터 투여 시점까지)으로 평가시 혈압 증가 정도는 +7.24±1.18(REGN7548)에서 +9.07±1.10(REGN7541) mmHg 범위였다(표 36 및 도 10). LPS 투여 8시간 후 25 mg/kg 용량을 정맥 내 1회 투여 받은 후 혈압 증가의 정도는 기준선 대비 평균(LPS 투여 후 8시간 내지 48시간) 수축기 혈압 변화로 평가한시 -1.49±2.244(REGN7548)에서 -1.49±2.24(REGN7544) mmHg 범위였다(표 37). 치료학적 용량을 투여받은 동물의 맥박 압력은 기준선 대비 평균(LPS 투여 후 8시간 내지 48시간) 맥박 압력 변화로 평가시 0.27±0.93(REGN7548)에서 -0.40±0.91(REGN7544) mmHg 범위였다(표 37, 도 10).
표 36. LPS 투여 24시간 전부터 0시간까지의 기준선 혈압 및 심박수 평균 변화
표 37. LPS 투여 후 8 내지 48 시간 동안의 기준선 혈압 및 심박수 평균 변화
[0260] NPR1 길항제 항체 REGN7544 및 REGN7548은 LPS를 복막 내 1회 투여한 후 LPS 유도된 저혈압이 발생한 마우스에 예방학적 또는 치료학적으로 투여했을 때 전신 혈압을 유의적으로 및 지속적으로 증가시켰다.
실시예 12 각 NPR1 단량체는 하나의 REGN7544 Fab에 결합한다
실험 절차
NPR1 + REGN7544 Fab + ANP의 복합체 형성
[0261] C-말단 myc-myc-6xHis 태그를 갖는 사람 NPR1 세포 외 도메인(hNPR1-mmh; 서열번호 74)을 심방 나트륨이뇨 인자(ANP, Tocris) 및 REGN7544 Fab를 1 hNPR1-mmh + 2 ANP + 1 REGN7544 Fab의 몰 비로 혼합하였다. 복합체를 4℃에서 밤새 항온처리한 다음 50mM Tris pH 7.5, 150mM NaCl로 평형화한 Superdex 200 증가 10/300 GL 겔 여과 컬럼을 통해 정제하였다. 피크 분획을 수거하고 10kDa MWCO 원심 농축기(Amicon)를 사용하여 농축시켰다.
냉동 EM 그리드 제조 및 데이터 수집
[0262] NPR1-ANP-REGN7544 복합체를 0.87 mg/ml로 희석하고 폴리(말레산 무수물 알트-1-데센)를 3-(디메틸 아미노) 프로필아민(PMAL-C8; Anatrace Cat. #P5008)으로 치환하여 최종 농도 0.15%로 첨가하였다. 샘플을 새롭게 혈장 세정된 UltrAufoil 그리드(Quantifoil GmbH)상에 증착시켰다. 여분의 용액을 여과지로 닦아내고 Vitrobot Mark IV(Thermo Fisher 부품 #1086439 )를 사용하여 액체 에탄에 급랭 동결시켰다. 그리드는 Bioquantum 에너지 필터 + K3 직접 전자 검출기(Gatan Inc, Part # 1147213)가 장착된 Titan Krios G3i(Thermo Fisher, Part #1137337 )에 부하하였다. 동영상은 0.86Å의 픽셀 크기에 상응하는 105,000배 배율에서 EPU v 2.7(Thermo Fisher)을 사용하여 수집하였다. 초당 픽셀당 15 전자의 선량률을 사용하였고, 각 동영상은 2초 46프레임으로 총 선량은 Å2당 ~40전자에 상응한다.
냉동-EM 데이터 처리
[0263] 모든 냉동-EM 데이터 처리는 cryoSPARC v3.2.0(Structura Biotechnology Inc.)을 사용하여 수행되었다. 동영상은 패치 모션 보정 및 패치 CTF 추정을 사용하여 정렬되었다. 총 6692개의 동영상을 수집한 후 모션 보정 및 패치 CTF를 거쳐 6474개의 동영상을 선별하였다. Blob 픽커(picker)를 사용하여 선별한 초기 입자 세트는 2D 분류를 거쳐 템플레이트 선별을 위한 템플레이트를 생성하였다. ~템플릿 선별에 의해 선별된 ~160만 개의 입자를 여러 차례의 2D 분류 과정을 거쳐 814,655개의 '양호한' 복합체 입자를 생성하였다. 6개의 부류로 Ab 초기 재구성한 후 이종성 세분화를 통해 등방성 맵에서 전체 NPR1-ANP-REGN7544 Fab에 상응하는 310,944개의 입자를 포함하는 하나의 "양호한" 부류를 생성하였다. "양호한" 부류의 입자를 비-균일 세분화한 후 국소적으로 세분화하여 모델 구축에 사용된 3.15Å 해상도(FSC=0.143)의 맵을 생성하였다. 상기 맵에 NPR1(PDB 코드 1T34에서 취한)과 2개의 Fab(이전 Regeneron 항체 구조에서 취한)의 모델을 수동으로 배치하였다. 이어서 이들 모델들은 Coot(v 0.8.2 분자생물학 의학연구위원회 연구소)를 사용하여 수동으로 재구축하고, 실제 공간은 Phenix(v 1.15.2 PHENIX 인더스트리얼 컨소시엄)를 사용하여 맵에 맞게 다듬었다.
NPR1 + REGN7544 Fab의 복합체 형성
[0264] C-말단 myc-myc-6xHis 태그를 갖는 사람 NPR1 세포 외 도메인(hNPR1-mmh; 서열번호 74)을 REGN7544 Fab와 1 hNPR1-mmh + 1 REGN7544 Fab의 몰 비로 혼합하였다. 복합체를 4℃에서 밤새 항온처리한 다음 50mM Tris pH 7.5, 150mM NaCl로 평형화한 Superdex 200 증가 10/300 GL 겔 여과 컬럼을 통해 정제하였다. 피크 분획을 수거하고 10kDa MWCO 원심 농축기(Amicon)를 사용하여 농축시켰다.
Cryo EM 그리드 제조 및 데이터 수집
[0265] NPR1-REGN7544 복합체를 0.8 mg/ml로 희석하고 폴리(말레산 무수물 알트-1-데센)를 3-(디메틸 아미노) 프로필아민(PMAL-C8; Anatrace Cat. #P5008)으로 치환하여 최종 농도 0.15%로 첨가하였다. 샘플을 새롭게 혈장 세정된 UltrAufoil 그리드(Quantifoil GmbH)상에 증착시켰다. 여분의 용액을 여과지로 닦아내고 Vitrobot Mark IV(Thermo Fisher Part #1086439 )를 사용하여 액체 에탄에 급랭 동결시켰다. 그리드는 Bioquantum 에너지 필터 + K3 직접 전자 검출기(Gatan Inc, Part # 1147213)가 장착된 Titan Krios G3i(Thermo Fisher, Part # 1137337 )에 부하하였다. 동영상은 0.86Å의 픽셀 크기에 상응하는 105,000배 배율에서 EPU v 2.7(Thermo Fisher)을 사용하여 수집하였다. 초당 픽셀당 15 전자의 선량률을 사용하였고, 각 동영상은 2초 46프레임으로 총 선량은 Å2당 ~40전자에 상응한다.
냉동-EM 데이터 처리
[0266] 모든 냉동-EM 데이터 처리는 cryoSPARC v3.2.0(Structura Biotechnology Inc.)을 사용하여 수행되었다. 동영상은 패치 모션 보정 및 패치 CTF 추정을 사용하여 정렬되었다. 총 10,378개의 동영상을 수집한 후 모션 보정 및 패치 CTF를 거쳐 9660개의 동영상을 선별하였다. Blob 픽커(picker)를 사용하여 선별한 초기 입자 세트는 2D 분류를 거쳐 템플레이트 선별을 위한 템플레이트를 생성하였다. 템플레이트 선별에 의해 선별된 ~170만 개의 입자를 여러 차례의 2D 분류 과정을 거쳐 762,681개의 '양호한' 복합체 입자를 생성하였다. 6개의 부류로 Ab 초기 재구성한 후 이종성 세분화를 통해 등방성 맵에서 전체 NPR1-REGN7544 Fab에 상응하는 256,375개의 입자를 포함하는 하나의 "양호한" 부류를 생성하였다. “양호한" 부류의 입자를 비-균일 세분화한 후 국소적으로 세분화하여 모델 구축에 사용된 3.15Å 해상도(FSC=0.143)의 맵을 생성하였다. 상기 맵에 NPR1(PDB 코드 1DP4에서 취한)과 2개의 Fab(이전 Regeneron 항체 구조에서 취한)의 모델을 수동으로 배치하였다. 이어서 이들 모델들은 Coot(v 0.8.2 분자생물학 의학연구위원회 연구소)를 사용하여 수동으로 재구축하고, 실제 공간은 Phenix(v 1.15.2 PHENIX Industrial Consortium)를 사용하여 맵에 맞게 다듬었다.
결과
[0267] hNPR1 + ANP + REGN7544 Fab 및 hNPR1 + REGN7544 Fab의 구조는 각 NPR1 단량체가 하나의 REGN7544 Fab과 결합함을 보여주었다. Fab는 세포 외 도메인의 하부(C-말단, 세포막에 더 가까운) 엽에 있는 잔기에 결합한다. REGN7544가 결합된 상태에서 NPR1 이량체는 ANP의 부재하에 비활성 형태를 취하고 ANP의 존재하에 활성 형태를 취한다. 이들 형태는 ANP의 존재 또는 부재하에 항체가 결합하지 않은 상태에서 관찰된 NPR1의 상태와 매우 유사하지만, 이들 연구는 전체 막 결합 형태의 NPR1이 아닌 용해성 세포 외 도메인으로 수행하였다. REGN7544의 중쇄와 경쇄 둘다는 NPR1 세포 외 도메인과 상호작용한다. NPR1 세포 외 도메인의 접촉 잔기는 ANP의 존재 또는 부재하에 동일하게 유지된다. 중쇄를 통한 접촉 잔기는 15개이고, 경쇄를 통한 접촉 잔기는 7개이다. REGN7544 Fab와 직접 상호작용하는 NPR1 세포 외 도메인의 잔기는 Arg143, Leu144, Glu384, Leu401, Val402, Ala103, Ser405, Gly406, Arg407, Lys408, Trp411, Leu413, Gly414, Tyr415 및 Pro416이다.
실시예 13 혈관 확장제가 REGN7544 유도된 혈압 변화를 역전시키는 능력 평가
[0268] 서로 다른 기전적 표적을 가진 3개의 상이한 혈관 확장제(니페디핀(Sigma-Aldrich), 에날라프릴(Sigma-Aldrich) 및 몰시도민(Sigma-Aldrich))가 REGN7544 유도된 혈압 증가를 역전시키는 능력을 NPR1 사람화된 마우스에서 평가하였다. 사용된 3개의 혈관 확장제인 에날라프릴, 몰시도민 및 니페디핀을 경구 투여하였다. 에날라프릴은 혈관 수축제인 안지오텐신 II의 생성을 감소시키고 혈관 직경을 증가시키는 펩타이드인 브라디키닌의 수준을 증가시켜 혈압을 저하시키는 안지오텐신 전환 효소(ACE)를 억제하여 혈압을 저하시킨다. 산화질소 공여자인 몰시도민과 칼슘 채널 차단제인 니페디핀은 또한 혈압을 저하시킨다.
[0269] 원격 측정된 NPR1 사람화된 마우스에서 혈관 확장제에 의한 REGN7544 유도된 효과의 역전을 평가하기 위한 투여 방식은 하기 표에 요약되어 있다:
표 38
[0270] 13 내지 15주령의 수컷 원격 측정된 NPR1 사람화된 마우스에 0일째 피하(SC) 주사를 통해 25 mg/kg REGN7544(n=28) 또는 비히클 대조군(즉, PBS)(n=7)을 단일 용량으로 투여하였다. 7일째(SC 투여 후 169시간)부터 개시하여 REGN7544로 전처리된 마우스는 니페디핀(20 mg/kg), 에날라프릴(25 mg/kg), 몰시도민(10 mg/kg) 또는 물(n=7/그룹)을 매일 경구 위관영양법(PO)으로 투여하기 시작했고, 비히클 대조군으로 전처리된 모든 마우스에는 물을 투여하였다. 모든 동물의 확장기 및 수축기 혈압은 REGN7544 또는 비히클 대조군 투여 72시간 전부터 실험 종료 시까지 지속적으로 기록하였고, 이들 측정치를 사용하여 맥박 압력을 계산하였다. 각 치료 그룹에 대한 기준선으로 정규화된 맥박 압력의 평균 변화는 i) REGN7544 또는 비히클 대조군 투여 후 149시간에서 221시간 사이에, 및 ii) REGN7544 또는 비히클 대조군 투여 3일 전부터 실험 종료 시까지 측정하였다.
[0271] 시험된 각 혈관 확장제는 REGN7544로 전처리된 NPR1 사람화된 마우스의 맥박 압력(PP)을 저하시켰다(도 11). 실제로 혈관 확장제의 투여는 REGN7544의 맥박 압력 증가 효과를 역전시키는 것으로 나타났다.
[0272] 13 내지 15주령의 수컷 원격 측정된 NPR1 사람화된 마우스에 0일째 피하(SC) 주사를 통해 25 mg/kg REGN7544(n=28) 또는 비히클 대조군(즉, PBS)(n=7)을 단일 용량으로 투여하였다. 7일째부터 개시하여 REGN7544로 전처리된 마우스는 니페디핀(20 mg/kg), 에날라프릴(25 mg/kg), 몰시도민(10 mg/kg) 또는 물(n=7/그룹)을 매일 경구 위관영양법(PO)으로 투여하기 시작했고, 비히클 대조군으로 전처리된 모든 마우스에는 물을 투여하였다. 맥박 압력은 REGN7544 또는 비히클 대조군 투여 72시간 전부터 실험 종료 시까지 지속적으로 모든 동물에 대해 기록하였다. REGN7544 또는 비히클 대조군 투여 3일 전부터 실험 종료 시까지 각 치료 그룹에 대해 기준선으로 정규화된 수축기 압력의 평균 변화를 측정하였다.
[0273] 혈관 확장제는 REGN7544로 전처리된 NPR1 사람화된 마우스에서 수축기 혈압(SBP)을 감소시켰다(도 12). 실제로 혈관 확장제를 투여하면 REGN7544 유도된 수축기 혈압 증가를 역전시키는 것으로 밝혀졌다.
[0274] 13 내지 15주령의 수컷 원격 측정된 NPR1 사람화된 마우스에 0일째 피하(SC) 주사를 통해 25 mg/kg REGN7544(n=28) 또는 비히클 대조군(즉, PBS)(n=7)을 단일 용량으로 투여하였다. 7일째부터 개시하여 REGN7544로 전처리된 마우스는 니페디핀(20 mg/kg), 에날라프릴(25 mg/kg), 몰시도민(10 mg/kg) 또는 물(n=7/그룹)을 매일 경구 위관영양법(PO)으로 투여하기 시작했고, 비히클 대조군으로 전처리된 모든 마우스에는 물을 투여하였다. 맥박 압력은 REGN7544 또는 비히클 대조군 투여 72시간 전부터 실험 종료 시까지 지속적으로 모든 동물에 대해 기록하였다. REGN7544 또는 비히클 대조군 투여 3일 전부터 실험 종료 시까지 각 치료 그룹에 대해 기준선으로 정규화된 심박수의 평균 변화를 측정하였다.
[0275] 에날라프릴, 몰시도민 및 니페디핀 투여 후 심박수에 대한 관찰 가능한 효과는 기록되지 않았다(데이터는 나타내지 않음). 실제로 REGN7544의 존재하에 혈관 확장제를 투여해도 심박수에 효과를 갖지 않는 것으로 나타났다.
[0276] 13 내지 15주령의 수컷 원격 측정된 NPR1 사람화된 마우스에 0일째 피하(SC) 주사를 통해 25 mg/kg REGN7544(n=28) 또는 비히클 대조군(즉, PBS)(n=7)을 단일 용량으로 투여하였다. 7일째부터 개시하여 REGN7544로 전처리된 마우스는 니페디핀(20 mg/kg), 에날라프릴(25 mg/kg), 몰시도민(10 mg/kg) 또는 물(n=7/그룹)을 매일 경구 위관영양법(PO)으로 투여하기 시작했고, 비히클 대조군으로 전처리된 모든 마우스에는 물을 투여하였다. 모든 동물의 수축기 및 확장기 혈압은 REGN7544 또는 비히클 대조군 투여 72시간 전부터 실험 종료 시까지 지속적으로 기록하였고, 이들 측정치를 사용하여 맥박 압력을 계산하였다. REGN7544 또는 비히클 대조군 투여 3일 전부터 실험 종료 시까지 각 치료 그룹에 대해 평균 맥박 압력을 측정하였다. 혈관 확장제를 투여하면 REGN7544의 단일 SC 용량의 맥박 압력 증가 효과를 역전시켰다(데이터는 나타내지 않음).
[0277] 13 내지 15주령의 수컷 원격 측정된 NPR1 사람화된 마우스에 0일째 피하(SC) 주사를 통해 25 mg/kg REGN7544(n=28) 또는 비히클 대조군(즉, PBS)(n=7)을 단일 용량으로 투여하였다. 7일째부터 개시하여 REGN7544로 전처리된 마우스는 니페디핀(20 mg/kg), 에날라프릴(25 mg/kg), 몰시도민(10 mg/kg) 또는 물(n=7/그룹)을 매일 경구 위관영양법(PO)으로 투여하기 시작했고, 비히클 대조군으로 전처리된 모든 마우스에는 물을 투여하였다. 수축기 혈압은 REGN7544 또는 비히클 대조군 투여 72시간 전부터 실험 종료 시까지 지속적으로 모든 동물에 대해 기록하였다. REGN7544 또는 비히클 대조군 투여 3일 전부터 실험 종료 시까지 각 치료 그룹에 대해 평균 수축기 혈압을 측정하였다. 혈관 확장제를 투여하면 REGN7544의 단일 SC 용량의 수축기 혈압 증가 효과를 역전시켰다(데이터는 나타내지 않음).
[0278] 13 내지 15주령의 수컷 원격 측정된 NPR1 사람화된 마우스에 0일째 피하(SC) 주사를 통해 25 mg/kg REGN7544(n=28) 또는 비히클 대조군(즉, PBS)(n=7)을 단일 용량으로 투여하였다. 7일째부터 개시하여 REGN7544로 전처리된 마우스는 니페디핀(20 mg/kg), 에날라프릴(25 mg/kg), 몰시도민(10 mg/kg) 또는 물(n=7/그룹)을 매일 경구 위관영양법(PO)으로 투여하기 시작했고, 비히클 대조군으로 전처리된 모든 마우스에는 물을 투여하였다. 심박수는 REGN7544 또는 비히클 대조군 투여 72시간 전부터 실험 종료 시까지 지속적으로 모든 동물에 대해 기록하였다. REGN7544 또는 비히클 대조군 투여 3일 전부터 실험 종료 시까지 각 치료 그룹에 대해 평균 심박수를 측정하였다. REGN7544의 단일 용량을 투여한 후 혈관 확장제를 투여해도 심박수에 대한 보상 효과는 갖지 않았다(데이터는 나타내지 않음).
[0279] 13 내지 15주령의 수컷 원격 측정된 NPR1 사람화된 마우스에 0일째 피하(SC) 주사를 통해 25 mg/kg REGN7544(n=28) 또는 비히클 대조군(즉, PBS)(n=7)을 단일 용량으로 투여하였다. 7일째부터 개시하여 REGN7544로 전처리된 마우스는 니페디핀(20 mg/kg), 에날라프릴(25 mg/kg), 몰시도민(10 mg/kg) 또는 물(n=7/그룹)을 매일 경구 위관영양법(PO)으로 투여하기 시작했고, 비히클 대조군으로 전처리된 모든 마우스에는 물을 투여하였다. 확장기 혈압은 REGN7544 또는 비히클 대조군 투여 72시간 전부터 실험 종료 시까지 지속적으로 모든 동물에 대해 기록하였다. REGN7544 또는 비히클 대조군 투여 3일 전부터 실험 종료 시까지 (i) 기준선으로 정규화된 및 (ii) 각 치료 그룹에 대해 비정규화된 평균 확장기 혈압을 측정하였다. 에날라프릴의 투여는 REGN7544의 단일 SC 용량의 확장기 혈압 증가 효과를 역전시켰다(데이터는 나타내지 않음).
[0280] 따라서 3개의 임상 혈관 확장제를 경구 위관영양법에 의해 25 mg/kg REGN7544의 SC 투여 후 혈역학적 효과의 가역성을 시험하였다. 3개의 상이한 혈관 확장제인 니페디핀, 에날라프릴 및 몰시도민은 각각 REGN7544 유도된 PP 증가를 역전시켰지만 심박수에 대한 관찰할 수 있는 유의적인 효과를 미치지 않았다. REGN7544 매개된 PP의 증가는 경구 위관영양법에 의해 투여된 3개의 임상 혈관 확장제(니페디핀, 에날라프릴 및 몰시도민) 중 어느 하나에 의해 개별적으로 역전되었다.
[0281] 본원의 개시내용은 본원에 기재된 특정 구현예에 의해 범위로 제한되지 말아야 한다. 실제로, 본원에 기재된 것들 이외의 본원 개시내용의 다양한 변형들은 상기 상세한 설명과 첨부한 도면으로부터 당업계의 숙련자들에게는 명백해질 것이다. 상기 변형은 첨부된 청구항의 범위내에 있는 것으로 의도된다.
서열목록 전자파일 첨부
Claims (36)
- 나트륨이뇨 펩타이드 수용체 1(NPR1) 단백질에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 NPR1에 결합하여 NPR1을 차단하는, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
- 제1항에 있어서, 상기 항체가 완전한 사람 모노클로날 항체인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 항체가 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 성질을 갖는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편: (a) 완전한 사람 모노클로날 항체이고; (b) 25oC 및 37oC에서 사람 NPR1에 결합하고 해리 상수 (KD)는 표면 플라스몬 공명 검정에서 측정시 1.7nM 미만이고; (c) 25oC 및 37oC에서 몽키 NPR1에 결합하고 KD는 표면 플라스몬 공명 검정에서 측정시 1.99nM 미만이고; (d) 25oC 및 37oC에서 ANP의 존재하에 사람 NPR1에 결합하고 KD는 표면 플라스몬 공명 검정에서 측정시 1.52nM 미만이고; (e) cGMP 축적 검정으로 측정시, 리간드 유도된 NPR1 활성화를 억제하고; (f) ANP 또는 BNP의 존재 또는 부재하에 사람 NPR1에 결합하고 EC50은 전기화학발광 기반 면역검정에 의한 측정시 2.9nM 미만이고; (g) ANP 또는 BNP의 존재 또는 부재하에 몽키 NPR1에 결합하고 EC50은 전기화학발광 기반 면역검정에 의한 측정시 4.2nM 미만이고; (h) 정상혈압 및 저혈압 마우스에 투여되는 경우 전신 혈압을 증가시키고, 여기서 전신 혈압에서의 증가는 단일 용량의 투여 시 최대 약 28일 동안 지속하고; (i) ANP 과발현 유도된 저혈압 마우스에 투여되는 경우 전신 혈압을 증가시키고, 여기서 전신 혈압에서의 증가는 단일 용량의 투여 시 최대 약 28일 동안 지속하고; (j) LPS 유도된 저혈압 마우스에서 전신 혈압을 증가시킨다.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 중쇄 가변 영역 (HCVR) 내에 포함된 3개의 중쇄 상보성 결정 영역 (CDR) (HCDR1, HCDR2 및 HCDR3); 및 경쇄 가변 영역 (LCVR) 내에 포함된 3개의 경쇄 CDR (LCDR1, LCDR2 및 LCDR3)을 포함하고, 상기 HCVR은:
(i) 서열번호 2, 22, 38 및 55로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열;
(ii) 서열번호 2, 22, 38 및 55로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열;
(iii) 서열번호 2, 22, 38 및 55로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열; 또는
(iv) 서열번호 2, 22, 38 및 55로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 12개 이하의 아미노산 치환을 갖는 아미노산 서열을 포함하고;
상기 LCVR은:
(a) 서열번호 10, 30, 46 및 63으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열;
(b) 서열번호 10, 30, 46 및 63으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열;
(c) 서열번호 10, 30, 46 및 63으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열; 또는
(d) 서열번호 10, 30, 46 및 63으로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 10개 이하의 아미노산 치환을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편. - 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 2, 22, 38 및 55로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역(HCVR)을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 10, 30, 46 및 63으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역(LCVR)을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 2, 22, 38 및 55로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 중쇄 가변 영역(HCVR) 내에 포함된 3개의 상보성 결정 영역(CDR); 및 서열번호 10, 30, 46 및 63으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 경쇄 가변 영역(LCVR) 내에 포함된 3개의 CDR을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 2/10, 22/30, 38/46, 및 55/63으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 중쇄 가변 영역(HCVR)/경쇄 가변 영역 (LCVR) 아미노산 서열 쌍을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 하기를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편:
(a) 서열번호 4, 24, 40 및 57로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역 (HCDR)1 도메인;
(b) 서열번호 6, 26, 42 및 59로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 HCDR2 도메인;
(c) 서열번호 8, 28, 44 및 61로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 HCDR3 도메인;
(d) 서열번호 12, 48 및 65로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 (LCDR)1 도메인;
(e) AAS 및 GAS로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 LCDR2 도메인; 및
(f) 서열번호 16, 32 및 69로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 LCDR3 도메인. - 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, (a) 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 12, AAS, 및 서열번호 16; (b) 서열번호 24, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 12, AAS, 및 서열번호 32; (c) 서열번호 40, 서열번호 42, 서열번호 44, 서열번호 48, AAS, 및 서열번호 16; 및 (d) 서열번호 57, 서열번호 59, 서열번호 61, 서열번호 65, GAS, 및 서열번호 69로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 2/10, 22/30, 38/46 및 55/63으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 중쇄 가변 영역(HCVR)/경쇄 가변 영역 (LCVR) 아미노산 서열 쌍을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 상기 중쇄가 서열번호 18, 34, 51 및 71로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 상기 경쇄가 서열번호 20, 36, 53 및 73로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 상기 중쇄가 서열번호 18, 34, 51 및 71로 이루어진 그룹으로부터 선택되고; 상기 경쇄가 서열번호 20, 36, 53 및 73으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
- 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 NPR1의 세포 외 도메인의 하부 엽(lobe)에 있는 잔기에 결합하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 Arg143, Leu144, Glu384, Leu401, Val402, Ala103, Ser405, Gly406, Arg407, Lys408, Trp411, Leu413, Gly414, Tyr415 및 Pro416으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 NPR1 잔기와 상호 작용하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
- 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 상기 중쇄가 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하고; 상기 경쇄가 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
- 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 상기 중쇄가 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하고; 상기 경쇄가 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
- 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 상기 중쇄가 서열번호 51의 아미노산 서열을 포함하고; 상기 경쇄가 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
- 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 상기 중쇄가 서열번호 71의 아미노산 서열을 포함하고; 상기 경쇄가 서열번호 73의 아미노산 서열을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
- 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 나트륨이뇨 펩타이드 수용체 1 (NPR1) 단백질에 결합하는 것에 대해 경쟁하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
- 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 동일한 에피토프에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
- 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제를 포함하는 약제학적 조성물.
- 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 제시된 항체의 중쇄 가변 영역(HCVR)을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
- 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 제시된 항체의 경쇄 가변 영역(LCVR)을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
- 제24항의 폴리뉴클레오타이드 분자를 포함하는 벡터.
- 제25항의 폴리뉴클레오타이드 분자를 포함하는 벡터.
- 제26항 및/또는 제27항의 벡터를 발현하는 숙주 세포.
- 제28항의 숙주 세포를 상기 항체 또는 단편의 생성을 허용하는 조건하에서 성장시키는 단계 및 상기 생성된 항체 또는 단편을 회수하는 단계를 포함하는, 항-NPR1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 생성하는 방법.
- 제29항에 있어서, 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물로서 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제형화하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
- NPR1 관련 질환 또는 장애의 적어도 하나의 증상 또는 징후를 치료, 예방 또는 개선하는 방법으로서, 상기 방법이 치료학적 유효량의 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하는 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제31항에 있어서, 상기 NPR1 관련 질환 또는 장애가 저혈압, 순환기 쇼크, 패혈성 쇼크, 신경성 기립성 저혈압, 자세성 기립성 빈맥 증후군(POTS), 심부전, 심장성 쇼크, 비만, 신부전, 만성 콩팥 질환, 황반부종, 녹내장, 뇌졸중, 폐 장애, 폐 섬유증, 염증, 천식, 골격 성장 장애, 골절, 당뇨병, 저혈당 및 암으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
- 제31항 또는 제32항에 있어서, 상기 약제학적 조성물이 이를 필요로 하는 대상체에게 예방학적으로 또는 치료학적으로 투여되는, 방법.
- 제31항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약제학적 조성물이 제2 치료학적 제제 또는 치료요법과 함께 투여되는, 방법.
- 제34항에 있어서, 상기 제2 치료학적 약제 또는 치료요법이 혈관신생 억제제, 혈관수축제(vasoconstrictor)/혈관수축제(vasopressor), 면역 억제제, 아스코르브산, 칼시뉴린 억제제, 코르티코스테로이드, VEGF 억제제, 충혈 완화제, 항우울제, 호르몬 피임약, 자극제(심장 자극제 포함), 카페인, 체외막 산소화, 심실 보조 장치, 대동맥 내 풍선 펌프, 생활 습관 교정, 식이 보충제, 항미생물성 약물, 인슐린 및 항염증 약물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
- 제31항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약제학적 조성물이 피하, 정맥내, 피부내, 복막내 또는 근육내 투여되는, 방법.
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