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KR20240099228A - 조작된 nk 세포 및 이의 용도 - Google Patents

조작된 nk 세포 및 이의 용도 Download PDF

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KR20240099228A
KR20240099228A KR1020247014168A KR20247014168A KR20240099228A KR 20240099228 A KR20240099228 A KR 20240099228A KR 1020247014168 A KR1020247014168 A KR 1020247014168A KR 20247014168 A KR20247014168 A KR 20247014168A KR 20240099228 A KR20240099228 A KR 20240099228A
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KR
South Korea
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cells
tigit
cell
engineered
inhibitor
Prior art date
Application number
KR1020247014168A
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English (en)
Inventor
알리샤 제이. 코픽
엠디 파크룰 하산
테일러 크룸-페레즈
Original Assignee
유니버시티 오브 센트럴 플로리다 리서치 파운데이션, 인코포레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
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Abstract

Ig 및 ITIM 도메인을 갖는 T 세포 면역수용체(TIGIT: T Cell Immunoreceptor with Ig And ITIM domain)의 발현이 억제되는 조작된 NK 세포, CRISPR/Cas 엔도뉴클레아제(Cas)9 시스템을 활용하여 TIGIT 유전자 또는 이의 단편의 결실에 의해 억제되는 TIGIT 발현, 및 암 및 감염성 질환을 치료하기 위한 이의 용도가 본원에 개시된다.

Description

조작된 NK 세포 및 이의 용도
관련 출원의 교차 참조
본 출원은 2021년 9월 29일 수요일에 출원된 미국 임시 출원 제63/249,801호의 이익을 주장하며, 이는 그 전체 내용이 본원에 인용되어 명시적으로 포함된다.
NK 세포는 부분적으로는 이의 강력한 세포독성, 더 양호한 안전성, 및 기성 치료법으로서의 잠재력으로 인해 암에 대한 유망한 세포 치료법으로서 받아들여졌다. NK 세포는 내재성 면역계의 일부로서 최초 반응자이고, 암성 세포를 인식하고 직접 사멸화시키는 고유의 능력을 갖는다. T 세포와 달리, NK 세포는 MHC 및 항원 독립적 방식으로 암세포를 사멸화시킨다. NK 세포는 수용체의 리간드와 결합하는 저해성 수용체와 생식계열-인코딩된 활성화 수용체의 세트를 발현하며, 이들 저해성 수용체와 활성화 수용체의 신호전달의 균형은 NK 세포 활성화를 제어한다. 활성화 수용체는 악성 및 바이러스 감염 세포에서 보편적으로 발현되는 NK 세포의 리간드와 결합 시 이러한 NK 세포를 활성화시키는 한편, 저해성 수용체는 건강한 세포 상에서 통상 발현되는 NK 세포의 리간드, 예컨대 MHC 분자와 결합 시 이러한 NK 세포 기능을 방지한다. NK 세포 활성화 및 표적 세포의 사멸화는 이들 활성화 신호 및 저해성 신호의 미세-조정에 의존한다. 중요하게는, NK 세포는 종양 항원을 표적화하는 항체의 Fc 영역과 결합하는 FcγR CD16 활성화 수용체를 발현하고, 항체-의존적 세포성 세포독성(ADCC: antibody-dependent cellular cytotoxicity) 방식으로 암세포를 사멸화시킬 수 있다. 암세포는 저해성 수용체에 리간드를 상향조절하고, 이들 리간드와 저해성 수용체의 결합은 NK 세포의 항종양 활성을 방지하고 이의 소진(exhaustion)을 촉진한다. 다양한 암에서, 저해성 수용체 발현의 상향조절은 암세포에 대한 더 낮은 세포독성 및 전염증성 사이토카인 IFNγ의 저하된 발현을 포함하여 NK 세포의 소진적 표현형(exhaustive phenotype)과 상관관계가 있다.
NK 세포는 종양 세포를 직접 사멸화시킬 뿐만 아니라, 전염증성 사이토카인 및 케모카인의 분비를 통해 적응 면역계의 세포를 포함한 다른 면역 세포를 모집하고, 조정하고 활성화시킨다. 최근의 연구는 NK 세포가 많은 면역치료법의 효능에 중요한 역할을 함을 보여주었다. 더욱이, NK 세포는 효능 손실 없이 효율적으로 확장되며, 생존 가능하게 동결보존될 수 있고, 이식편대숙주 질환(GVHD: graft vs. host disease)과 연관이 없으며, 이는 기성 세포 치료법으로서의 동결보존된 공여자-유래 물질의 잠재적인 안전한 사용을 지지한다. 현재 다양한 암 설정에서 CAR-NK 세포를 포함한 NK 세포의 효능을 평가하는 다수의 임상 시험이 있다. PD-1/PD-L1 및 CTLA-4에 대한 관문 저해제는 여러 암에 대한 성공을 보여주었다. 그러나, 단지 소수의 환자만 이들 치료로부터 이익을 얻을 수 있다. 더욱이, 암은 종종 이들 치료법에 대한 내성을 발달시키고, 일부 환자는 면역-관련 유해 효과를 경험한다. 이들 관찰은 면역치료법의 이익을 더 많은 환자에게 그리고 더 양호한 안전성 프로파일로 확대시키기 위해 새로운 저해성 관문에 대한 관심을 촉진시켰다.
면역글로불린 및 ITIM 도메인을 갖는 T 세포 면역수용체(TIGIT: T cell immunoreceptor with immunoglobulin and ITIM domain)는 NK 세포와 T 세포 둘 다의 주요 저해성 수용체이다. TIGIT는 암세포 및 항원-제시 세포(APC) 상에 보편적으로 발현되는 리간드 CD155(PVR) 및 CD112(넥틴-2 또는 PVRL2)에 결합하기 위해 저해성 수용체 CD96(TACTILE)과 PVRIG 및 활성화 수용체 CD226(DNAM-1)과 경쟁하고, 대체로 종양 세포에서만 발현되는 TIGIT의 신규의 독특한 리간드인 PVRL4(넥틴4)에 결합한다. TIGIT 신호전달은 다수의 단계에서 종양 면역력 주기를 조절한다. 이는 T 세포 증식, 세포독성 및 이러한 세포에 의한 염증성 사이토카인 IFNγ의 생산을 방지한다. 이전의 연구는 TIGIT가 암에서 T 세포와 NK 세포 둘 다 상에서 상향조절되고 종종 이의 소진과 상관관계가 있다고 보고하였다. 마우스 모델에서, TIGIT의 차단은 NK 세포 세포독성을 복구시켰으며, IFNγ 및 TNFα 발현을 증가시켰고, 종양-특이적 T 세포 면역력을 촉진하였다. 부가적으로, TIGIT 및 PD-1 조합된 차단은 전임상 마우스 모델 및 초기 임상 시험에서 종양 제어 및 생존율을 향상시키는 상승작용 효과를 가졌다. B16 마우스 모델에서, PD-1 및 TIGIT 차단의 치료 효능은 NK 세포 고갈(depletion)이 효과를 없앴기 때문에 NK 세포의 존재에 의존하였다. 단독으로 또는 다른 관문저해제(구체적으로 항-PD-1)와 조합된 여러 항-TIGIT 항체는 I상, II상 및 III상 임상 시험에서 시험되고 있다. II상 시험이 NSCLC에서 이러한 조합으로 무진행 생존율(PFS: progression-free survival) 및 전체 생존율(OS: overall survival)의 증강을 보여주긴 하였지만, III상 SKYSCRAPER-01은 PFS의 공동-1차 평가변수(co-primary endpoint)를 충족시키지 않았으며, 한편 연구는 OS를 평가할 정도로 충분하지는 않았다. 면역 세포 기능의 TIGIT 상향조절에 대해 현재 이해하고 있는 것 대부분은 T 세포에 기초하였고/하였거나 뮤린 모델로부터 비롯된 것이며; 한편 인간 NK 세포에서 TIGIT의 제한된 기계적 시험관내 연구만 존재하고 주로 NK 세포주에 의존한다. 기능적 및/또는 분자 수준에서 치료법의 잠재적인 결점을 해결할 때 그리고 입양 NK 세포와 항-TIGIT 항체의 병용 치료의 잠재력을 평가하기 위해 필요한 인간 NK 세포의 항종양 기능에 미치는 TIGIT 차단의 효과에 대한 이해는 결여되어 있다.
일부 양태에서, Ig 및 ITIM 도메인을 갖는 T 세포 면역수용체(TIGIT)의 발현이 억제되는 조작된 NK 세포가 본원에 개시된다. TIGIT의 발현은 TIGIT 유전자 또는 이의 단편의 결실에 의해 억제될 수 있다. 일부 실시형태에서, TIGIT의 발현은 CRISPR/Cas 가이드 RNA를 갖는 CRISPR/Cas 엔도뉴클레아제(Cas)9 시스템을 NK 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는 방법을 사용하여 억제되고, 상기 가이드 RNA는 TIGIT 유전자 또는 이의 단편을 표적화한다. 일부 양태에서, TIGIT의 발현은 TIGIT 폴리뉴클레오타이드를 표적화하는 siRNA 또는 shRNA에 의해 억제된다. 일부 양태에서, 임의의 이전의 양태의 NK 세포가 1차 NK 세포 또는 NK 세포주라는 것이 본원에 개시된다. 또한 NK 세포가 확장된(expanded) NK 세포 또는 비(non)확장된 NK 세포인 임의의 이전의 양태의 NK 세포가 또한 본원에 개시된다. 일부 양태에서, NK 세포는 시험관내에서/생체내에서 NK 세포 확장 조성물(예를 들어 영양 세포(feeder cell), 조작된 PM 입자, 또는 엑소좀)에 노출될 수 있다. 일부 양태에서, 임의의 이전의 양태의 영양 세포 또는 조작된 입자는 이의 외부 표면에 결합된 Fc 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, NK 세포 확장 조성물은 NK 세포 이펙터 제제(예를 들어 IL-21 및/또는 41BBL 포함)를 추가로 포함한다.
본원에 개시된 조작된 NK 세포는 암 또는 감염성 질환에 대해 증강된 기능을 보여준다. 이에, 대상체에서 암, 전이 또는 감염성 질환을 치료하고/하거나, 감소시키고/시키거나, 저해하고/하거나, 저하시키고/저하시키거나, 개선하고/하거나 예방하는 방법이 본원에 개시되며, 대상체에게 치료적 유효량의 임의의 이전의 양태의 조작된 NK 세포를 투여하는 단계를 포함한다. 유사하게는, 본 개시내용은 대상체에서 암, 전이 또는 감염성 질환을 치료하고/하거나, 감소시키고/시키거나, 저해하고/하거나, 저하시키고/저하시키거나, 개선하고/하거나 예방하는 데 사용하기 위한 치료적 유효량의 임의의 이전의 양태의 조작된 NK 세포를 제공한다. 일부 양태에서, 조작된 NK 세포는 대상체에게 조작된 NK 세포를 투여하기 전에 TIGIT 저해제와 함께 인큐베이션될 수 있다. 일부 양태에서, 방법은 대상체에게 치료적 유효량의 TIGIT 저해제 및/또는 치료적 유효량의 관문 차단제(예를 들어 PD-1 저해제, PD-L1 저해제, PD-L2 저해제 또는 CTLA-4 저해제)를 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
NK 세포 소진은 암 또는 일부 감염성 질환을 갖는 대상체에서 발생한다. 본원에 개시된 조작된 NK 세포는 증강된 기능(예를 들어 증강된 세포독성 기능 및/또는 IFNγ, TNFα 및/또는 CD107a의 증가된 발현 포함)을 보여준다. 이에, NK 세포를 재활성화시키고/시키거나, NK 세포 소진을 역전시키고/역전시키거나 NK 세포 기능을 증강시키기 위한 방법이 본원에 개시되며, NK 세포의 TIGIT의 발현을 억제시키거나 NK 세포를 TIGIT 저해제와 인큐베이션하는 단계를 포함한다.
임의의 이전의 양태의 NK 세포를 재활성화시키고/시키거나, NK 세포 소진을 역전시키고/시키거나 NK 세포 기능을 증강시키는 방법 및/또는 임의의 이전의 양태의 암 및/또는 전이를 치료하고/하거나, 감소시키고/시키거나, 저해하고/하거나, 저하시키고/저하시키거나, 개선하고/하거나 예방하는 방법이 또한 본원에 개시되며, 상기 암은 혈액암, 림프종, 결장직장암, 결장암, 폐암, 두경부암, 난소암, 전립선암, 고환암, 신장암, 피부암, 자궁경부암, 췌장암 및 유방암으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 양태에서, 암은 고형 종양을 포함한다. 일부 양태에서, 암은 급성 골수성 백혈병, 골수이형성 증후군, 만성 골수성 백혈병, 급성 림프아구성 백혈병, 골수섬유증, 다발성 골수종으로부터 선택된다. 또 다른 양태에서, 암은 백혈병, 림프종, 육종, 암종으로부터 선택되고, 골수, 뇌, 폐, 유방, 췌장, 간, 두경부, 피부, 생식기, 전립선, 결장, 간, 신장, 복강내, 뼈, 관절 또는 눈으로부터 선택된다.
추가로, 본원에 기재된 임의의 치료 방법은 본원에 개시된 바와 같은 임의의 암 또는 감염성 질환을 치료하기 위한, 본원에 개시된 임의의 조성물의 의학적 용도인 것으로 여겨짐을 이해해야 한다.
도 1a 내지 도 1h는 TIGIT 신호전달의 차단이 PM21 NK 세포의 항종양 활성을 증강시킴을 보여준다. 도 1a는 qRT-PCR에 의한 무경험(naive) NK 세포 및 PM21 NK 세포에서 저해성 수용체의 RNA 발현 분석을 도시한다. 데이터는 4개의 생물학적 중복물의 평균 ± SD로서 제시된다. 도 1b는 무경험 NK 세포 및 PM21 NK 세포 상에서의 TIGIT 발현의 빈도를 도시한다(그룹당 n = 7). 도 1c는 이소형(isotype) 또는 항-TIGIT 항체의 존재 하에 A549 스페로이드(spheroid)에 대한 NK 세포 세포독성의 대표도를 도시한다. 데이터는 3개의 기술적 중복물의 평균으로서 제시된다. 도 1d 내지 도 1f는 NK 세포에서 CD107a(도 1d), IFNγ(도 1e) 및 TNFα(도 1f)를 발현하는 세포의 빈도를 도시한다. 데이터는 평균으로서 제시된다(그룹당 n=4). PM21 NK 세포를 A549 스페로이드와 7일 동안 공동배양 후, NK 세포는 브레펠딘 A(Brefeldin A) 및 골지 스탑(Golgi stop)의 존재 하에 PVR+ K562 세포로 6시간 동안 재자극되었고, 각각의 항체 및 이소형으로 염색되었다. 비자극된 PM21 NK 세포를 제외한 모든 그룹은 PVR+ K562 세포로 자극되었다. 도 1g는 NK 세포에서 TIGIT 넉아웃 후 5일째에 부모(parental) PM21 NK 세포(일반(regular) NK 세포) 및 TIGIT 넉아웃 PM21 NK 세포(KO PM21 NK 세포)의 대표적인 TIGIT 히스토그램 중첩을 도시한다. 도 1h는 A549 스페로이드의 상대 확장의 대표적인 그래프를 도시한다. 데이터는 3개의 기술적 중복물의 평균으로서 제시된다. 모든 그래프에 대해, P 값 * < 0.05, ** <0.01, *** < 0.001이다.
도 2는 PM21-NK 세포가 TIGIT를 유의하게 상향조절함을 도시한다.
도 3 은 TIGIT가 활성화 시 상향조절됨을 도시한다.
도 4는 TIGIT가 더 높은 세포독성 기능을 갖는 활성화된 세포 상에서 발현됨을 도시한다.
도 5는 PVR 발현이 아마도 DNAM-1을 통해 NK 세포 세포독성을 증강시킴을 도시한다.
도 6은 항-TIGIT가 PM21 NK 세포에 의한 3D A549 세포의 사멸화를 향상시킴을 도시한다.
도 7은 TIGIT 차단이 3D A549 세포의 PM21-NK 세포 사멸화를 향상시킴을 도시한다.
도 8은 TIGIT KO NK 세포가 더 높은 전반적 세포독성을 가짐을 도시한다.
도 9는 TIGIT 넉아웃 NK 세포가 아군사멸화(fratricide)를 방지하고 NK 세포수를 복구시킬 수 있음을 도시한다.
도 10은 NK 세포 아군사멸화에 미치는 티라골루맙(tiragolumab)의 효과를 도시한다.
도 11은 PM21 NK 세포가 저해성 수용체를 유의하게 상향조절함을 도시한다.
도 12는 PM21 NK 세포의 항종양 활성에 미치는 TIGIT 차단의 효과를 시험하기 위한 실험 설계를 보여주는 개략도를 도시한다.
도 13a 및 도 13b는 모든 RNA-seq 유전자를 이용한 유전자 세트 농화(enrichment) 분석을 도시한다.
도 14는 차별적으로 발현된 유전자를 이용한 유전자 세트 농화 분석을 도시한다.
도 15는 TIGIT의 항체 차단이 장기간 노출 동안 NK 세포의 PVR-매개 소진을 유도하고 폐암 세포주 스페로이드에 대한 NK 세포의 항종양 활성을 복구시키는 기전을 예시한다.
도 16a 내지 도 16c는 TIGIT+ NK 세포가 TIGIT- NK 세포와 비교하여 NK 세포 수용체의 발현을 증가시켰음을 도시한다. NK 세포는 4명의 공여자로부터의 T 세포 고갈된 PBMC로부터의 PM21 입자를 이용하여 12일 동안 확장되었다. NK 세포 활성화 수용체 및 저해성 수용체의 발현은 유세포측정법에 의해 결정되었고, TIGIT- 또는 TIGIT+ NK 세포 상에서 게이팅되었다(gated). TIGIT- NK 세포(검정색)와 비교하여 TIGIT+ NK 세포(적색) 상에서 다수의 활성의 수용체 및 저해성 수용체는 상향조절되었다(도 16a). 활성화 수용체 CD16, NKp30, NKp46, DNAM1 및 NKG2D(도 16b) 및 저해성 수용체 CD96, TIM3, NKG2A, LAG3 및 PD1(도 16c)을 발현하는 NK 세포의 퍼센트는 TIGIT+ NK 세포(적색 삼각형) 및 TIGIT- NK 세포(검정색 원형)에 대해 결정되었다. 데이터는 공여자-쌍(donor-pair) 선이 있는 레이더 플롯(radar plot) 또는 스캐터 플롯(scatter plot)으로서 제시된다. 통계적 유의성은 다중 대응 t-검정(multiple paired t-test)에 의해 결정되었다. P 값은 p<0.05이면 * 또는 p<0.01이면 **로서 표시된다.
도 17a 내지 도 17d는 TIGIT 차단이 3D 폐 종양 스페로이드에 대한 PM21-NK 세포 세포독성을 증강시켰음을 도시한다. NK 세포는 다수의 공여자로부터 수득된 T 세포-고갈된 PBMC로부터의 PM21-입자를 이용하여 14일 내지 16일 동안 확장되었다. 동적 생세포 이미지화(kinetic live-cell imaging)에 의해 측정된 단층(monolayer)의 A549-NLR 폐암 세포에 대한 세포독성은 이소형 대조군과 비교하여 α-TIGIT 항체의 존재 하에 유의하게 향상되지 않았다. 1명의 공여자로부터 시간 곡선 경과에 따른 대표적인 세포독성은 이소형 대조군과 함께(검정색 원형) 또는 α-TIGIT의 존재 하에(적색 삼각형) 0.3:1 NK 세포:A549 세포의 존재 하에 도시된다(도 17a). 0.3:1에서 다수의 공여자로부터의 NK 세포의 24시간, 48시간 및 72시간째의 세포독성에 대한 요약이 도시된다(N=3)(도 17a). 용량-의존적 세포독성 곡선은 24시간, 48시간 및 72시간째에 다수의 NK 세포:A549 세포 비에서 1명의 공여자에 대해 도시된다(도 17b). 확장된 NK 세포는 A549 종양 스페로이드와 함께 7일 동안 공동배양되었다. NK 세포 세포독성을 동적 생세포 이미지화에 의해 결정하였다. 1명의 공여자로부터의 대표적인 세포독성 곡선은 존재하는 이소형 대조군(검정색 원형) 또는 α-TIGIT(적색 삼각형)와 함께 도시된다(도 17c). 1:1 NK:A549 비에서 72시간째에 다수의 공여자로부터의 NK 세포 세포독성에 대한 요약은 TIGIT 차단이 세포독성을 유의하게 증가시켰고(N=6명의 공여자), 이소형 대조군으로 정규화되었을 때 각각의 공여자에 대해 상대 세포독성이 증가하였음을 보여준다(도 17c). 7일의 공동배양 후, NK 세포는 유세포측정법에 의해 분석되어 저해성 수용체 및 활성화 수용체 발현을 결정하였다. TIGIT 차단은 이소형 대조군(검정색 원형)과 비교하여 α-TIGIT(적색 삼각형)의 존재 하에 A549 스페로이드와 함께 공동배양되었을 때 임의의 주요 저해성 또는 활성화 수용체의 발현을 유의하게 변화시키지 않았고, 발현 수준은 비노출된 NK 세포(회색 정사각형)와 유사하였다(N=3 내지 5명의 공여자)(도 17d). 데이터는 공여자-쌍 라인이 있는 스캐터 플롯으로서 또는 표준 편차를 나타내는 오차 막대가 있는 평균으로서 표시된다. 통계적 유의성은 다중 대응 t-검정에 의해 결정되었다. 용량-의존적 세포독성 곡선의 경우, 곡선 아래 면적(AUC)이 결정되었고, 독립 t-검정에 의해 비교되었다. P 값은 p > 0.05이면 ns, p<0.0001이면 ****로서 표시된다.
도 18a 내지 도 18b는 TIGIT 차단이 다수의 장기간 3D 폐종양 스페로이드 모델에서 NK 세포-매개 사멸화를 증강시켰음을 도시한다. NK 세포는 다수의 공여자로부터 수득된 T 세포-고갈된 PBMC로부터의 PM21-입자를 이용하여 14일 내지 16일 동안 확장되었다. 확장된 NK 세포는 NCI-H1299-NLR, NCI-H358-NLR 또는 NCI-1975-NLR 폐종양 스페로이드와 함께 7일 동안 공동배양되었다. NK 세포 세포독성을 동적 생세포 이미지화에 의해 결정하였다. 1명의 공여자로부터의 대표적인 세포독성 곡선은 존재하는 이소형 대조군(검정색 원형) 또는 α-TIGIT(적색 삼각형)와 함께 시험된 각각의 세포주에 대해 도시된다(도 18a). 72시간째에 다수의 공여자로부터의 NK 세포 세포독성에 대한 요약은 TIGIT 차단이 세포독성을 유의하게 증가시키고, 각각의 공여자가 이소형 대조군으로 정규화되었을 때 상대 세포독성을 증강시켰음을 보여준다(사용된 E:T 비는 NCI-H1299에 대해 3:1, NCI-H358에 대해 1:1 및 NCI-H1975에 대해 1:3이었음; N=6명의 공여자)(도 18b). 데이터는 공여자-쌍 라인이 있는 스캐터 플롯으로서 또는 표준 편차를 나타내는 오차 막대가 있는 평균으로서 표시된다. 통계적 유의성은 다중 대응 t-검정에 의해 결정되었다. P 값은 p<0.05이면 *, p<0.01이면 **로서 표시된다.
도 19a 내지 도 19c는 TIGIT 차단이 장기간 노출 동안 PVR-매개 NK 세포 소진을 방지함을 도시한다. NK 세포는 T 세포 고갈된 PBMC로부터 14일 내지 16일 동안 확장되었다. 확장된 NK 세포는 α-TIGIT 또는 이소형 대조군의 존재 하에 A549 스페로이드와 함께 7일 동안 공동배양되었다. 7일의 공동배양 후, NK 세포는 브레펠딘 A 및 골지 스탑의 존재 하에 4시간 내지 6시간 동안 PVR 발현을 갖거나 갖지 않는 K562 암세포로 자극되었고, 표면 CD107a, IFNγ 및 TNFα의 NK 세포 발현은 유세포측정법으로 분석되었다. 비노출되고 비자극된 또는 자극된 PM21-NK 세포는 대조군으로서 사용되었다. 부가적으로, NK 세포는 A549 스페로이드와의 공동배양 후에 선택되었고, RNA 추출 및 전사체 분석(transcriptomic analysis)에 사용되었다. 실험 개략도는 (도 19a)에 도시되어 있다. 각각의 IFNγ, TNFα 및 CD107a 발현에 대해, 비자극되고 비노출된 NK 세포(회색 정사각형), 비노출되고 자극된 NK 세포(검정색 정사각형), 이소형(회색 원형) 또는 항-TIGIT 항체(적색 삼각형)의 존재 하에 종양 노출된 NK 세포는 PVR- K562 세포 또는 PVR+ K562 세포를 이용한 재자극에 대해 제시된다. TIGIT 차단은 PVR+ K562 세포(N=4명의 공여자)를 이용한 재시험감염되었을 때 IFNγ, TNFα 및 CD107a 발현을 보존하였다(도 19b). RNA-seq 데이터의 GSEA 분석은 TIGIT 차단이 IFNγ, TNFα 및 다른 관련 염증 반응 유전자 세트를 상향조절하였음을 보여준다. 요약 그래프는 이의 -log10(FDR)에 기초하여 TIGIT 차단 시 상향조절된 유전자 세트를 보여준다(도 19c). 데이터는 스캐터 플롯으로서 또는 표준 편차를 나타내는 오차 막대가 있는 막대 그래프로서 제시된다. 통계적 유의성은 다중 독립 t-검정(multiple unpaired t-test)에 의해 결정되었다. P 값은 p<0.05이면 *, p<0.01이면 **, p<0.001이면 ***, p<0.0001이면 ****로서 표시된다.
도 20은 NK 세포 증식을 자극시키기 위해 K562-mbIL21-41BBL 세포(PM21-입자)로부터 유래된 형질막 입자를 활용하는 영양 세포-무함유 확장 기술이 개발되었음을 도시한다. 이 방법은 2주 이내에 PM21-NK 세포라고 하는 NK 세포의 평균 1,700배 확장을 초래한다(18명의 공여자로부터 N=113).
도 21a 내지 도 21b는 α-TIGIT 또는 이소형 대조군의 존재 하에 10,000개의 NK 세포와 함께 인큐베이션된 NLR-발현 A549 암세포 스페로이드의 생세포 이미지화 세포독성 검정법으로부터의 대표적인 이미지를 도시하고, 0시간, 48시간, 96시간 및 144시간 후에 항-TIGIT 항체의 존재 하에 증가된 NK 세포 세포독성을 보여준다(도 21a). 1명의 공여자로부터의 대표적인 원시 데이터는 이소형 대조군(검정색 원형) 또는 항-TIGIT(적색 삼각형)와 함께 단독으로(회색 정사각형) 또는 0.3:1 NK 세포:A549 세포의 존재 하에 A549 상대 확장에 대해 표시된다.
도 22a 내지 도 22b는 NK 세포가 다수의 공여자로부터 수득된 T 세포-고갈된 PBMC로부터의 PM21-입자를 이용하여 확장되었음을 도시한다. 이들 확장된 NK 세포는 브레펠딘 A 및 골지 스탑과 함께 α-TIGIT 또는 이소형 대조군의 존재 하에 4시간 내지 6시간 동안 PVR 발현을 갖거나 갖지 않는 K562 암세포와 함께 공동배양되었다. IFNγ, TNFα 및 표면 CD107a의 발현은 유세포측정법에 의해 분석되었다. NK 세포 단독(검정색 원형)과 비교하여, TIGIT 차단(적색 삼각형)은 TIGIT 차단 시 TNFα 발현 NK 세포의 작은 유의한 증가를 제외하고는(36% ± 3% 대 32% ± 2% p = 0.008)(N = 3명의 공여자), PVR- K562 세포 또는 PVR+ K562 세포를 이용한 자극 시 IFNγ, TNFα 또는 표면 CD107a를 발현하는 공여자-일치 NK 세포의 백분율을 유의하게 증가시키지 않았다(도 22a). PM21-NK 세포 세포독성에 미치는 단기간 TIGIT 차단의 효과가 또한 결정되었다. PM21-NK 세포는 항-TIGIT 또는 이소형 대조군 항체의 존재 하에 PVR- 또는 PVR+ K562 세포와 1시간 동안 공동배양되었고, NK 세포 세포독성은 K562 세포의 아넥신 V 염색에 의해 결정되었다. 농도-의존적 세포독성 곡선은 다수의 NK:K562 비(ratio)를 사용하여 생성되었고, 곡선 아래 면적이 결정되었다. 단기간 TIGIT 차단은 이소형 대조군 항체와 비교하여 PVR- 또는 PVR+ K562 세포에 대해 PM21-NK 세포 세포독성을 유의하게 향상시키지 않았다(PVR- K562 세포에 대해 335 ± 6% 비 대 325 ± 10% 비 및 PVR+ K562 세포에 대해 346 ± 3% 비 대 341 ± 10% 비)(도 22b).
도 23은 시험관내 소진 모델의 분석에 사용된 원시 데이터에 대한 대표적인 게이팅 전략 및 유세포측정법 도트 플롯을 도시한다.
도 24는 TIGIT-넉아웃 NK 세포에 대한 특정한 발견을 요약한 개략도를 도시한다.
도 25a 내지 도 25d는 TIGIT가 생체외 확장된 NK 세포에서 효율적으로 넉아웃될 수 있음을 도시한다.
도 26a 내지 도 26h는 TIGIT 넉아웃이 NK 세포 표현형을 변화시키지 않음을 도시한다.
도 27a 내지 도 27i는 TIGIT KO NK 세포가 다양한 종양 스페로이드에 대해 더 세포독성임을 도시한다.
도 28a 내지 도 28c는 TIGIT KO NK 세포가 ADCC를 통해 더 양호하게 사멸화시킴을 도시한다.
도 29a 내지 도 29c는 TIGIT가 A549 스페로이드에 48시간 노출 후 탈과립화의 마커인 CD107a 표면 발현을 증가시켰음을 도시한다.
도 30a 내지 도 30d는 WT PM21-NK 세포와 TIGIT KO PM21-NK 세포 사이에서 해당과정 및 미토콘드리아 스트레스의 비교를 도시한다.
도 31a 내지 도 31b는 TIGIT KO NK가 티라골루맙 유도 아군사멸화를 방지하고 티라골루맙의 존재 하에 A549 스페로이드에 대해 증강된 세포독성을 초래함을 도시한다.
도 32는 TIGIT KO NK 세포가 향상된 생체내 지속성을 가짐을 도시한다.
도 33a 내지 도 33c는 NK 세포에서 TIGIT KO 시 대표적인 상향조절된 유전자 및 하향조절된 유전자 세트의 히트맵을 도시한다.
도 34a 내지 도 34d는 TIGIT KO NK 세포의 대사 분석을 도시한다.
본 발명의 화합물, 조성물, 물품, 장치 및/또는 방법이 개시되고 기재되기 전에, 이들은 달리 명시되지 않는 한 특정 합성 방법 또는 특정 재조합 생명공학 방법에 제한되지 않으며 달리 명시되지 않는 한 특정 시약에 제한되지 않고 물론 다양할 수 있음을 이해해야 한다. 또한, 본원에 사용된 용어는 단지 특정 실시형태를 설명하기 위한 것이며 제한하려는 의도가 아님을 이해해야 한다.
정의
본 출원 전반에 걸쳐, 다양한 간행물이 참조된다. 이들 간행물의 개시내용은 이에 관련된 최신 기술을 보다 완전하게 설명하기 위해 본 출원에 인용되어 포함된다. 개시된 참조문헌은 또한 참조문헌에 의존하는 문장에서 논의된 내용에 포함된 자료에 대해 개별적으로 그리고 구체적으로 본원에 인용되어 포함된다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 숙련자에 의해 보편적으로 이해되는 의미를 갖는다. 하기 참조문헌은 본 발명에 사용된 많은 용어의 일반적인 정의를 당업자에게 제공한다: 문헌[Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2nd Ed. 1994)]; 문헌[The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988)]; 문헌[The Glossary of Genetics, 5th Ed., R. Rieger et al. (eds.), Springer Verlag (1991)]; 및 문헌[Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991)]. 본원에 사용된 하기 용어는 달리 명시되지 않는 한 그에 부여된 의미를 갖는다.
본 개시내용의 요소 또는 이의 바람직한 실시형태(들)를 도입할 때, 관사("a", "an", "the" 및 "상기")는 하나 이상의 요소가 있음을 의미하는 것으로 의도된다. 용어 "포함하는(comprising)", "비롯하는(including)" 및 "갖는(having)"은 포괄적인 것으로 의도되며, 나열된 요소 이외의 부가적인 요소가 있을 수 있음을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "포함하는"은 조성물 및 방법이 언급된 요소를 포함하지만 다른 것을 배제하는 것은 아님을 의미하고자 한다. "본질적으로 구성되는"은 조성물 및 방법을 정의하는 데 사용될 때, 조합에 임의의 본질적인 유의성을 갖는 다른 요소를 배제함을 의미해야 한다. 그러므로, 본원에 정의된 바와 같은 요소로 본질적으로 구성된 조성물은 단리 및 정제 방법으로부터의 미량의 오염물질 및 약학적으로 허용 가능한 담체, 예컨대 포스페이트 완충 식염수, 보존제 등을 배제하지 않을 것이다. "구성되는"은 다른 성분의 미량 초과의 요소 및 본 발명의 조성물을 투여하기 위한 실질적인 방법을 배제함을 의미해야 한다. 이들 전환 용어 각각에 의해 정의된 실시형태는 본 발명의 범위 내에 있다.
범위는 본원에서 "약" 하나의 특정 값 및/또는 "약" 또 다른 특정 값으로 표현될 수 있다. 이러한 범위가 표현될 때, 또 다른 실시형태는 하나의 특정 값 및/또는 다른 특정 값을 포함한다. 유사하게는, 값이 근사치로서 표현될 때, 선행사 "약"을 사용함으로써, 특정 값이 또 다른 실시형태를 형성함을 이해할 것이다. 각각의 범위의 종점은 다른 종점과 관련하여서도 그리고 다른 종점과는 독립적으로도 중요하다는 것이 추가로 이해될 것이다. 또한, 본원에 다수의 값이 개시되어 있는 것, 그리고 각각의 값은 또한 그 값 자체에 더하여 해당 특정 값의 "약"으로 본원에 개시되어 있는 것도 이해된다. 예를 들어, 값 "10"이 개시되면, "약 10"도 개시된다. 또한, 값이 값 "이하", "값 이상" 및 값 사이의 가능한 범위가 당업자에 의해 적절하게 이해되는 바와 같이 개시되는 것으로 이해된다. 예를 들어, 값 "10"이 개시되면, "10 이하", 뿐만 아니라 "10 이상"도 개시된다. 또한 출원 전반에 걸쳐 데이터는 다수의 상이한 형식으로 제공되며, 이 데이터는 데이터 요소의 종점과 시작점, 및 임의의 조합에 대한 범위를 나타낸다. 예를 들어, 특정 데이터 포인트 "10" 및 특정 데이터 포인트 15가 개시되면, 10 및 15 초과, 이상, 미만, 이하, 및 10 및 15, 뿐만 아니라 10 내지 15가 개시되는 것으로 여겨진다. 2개의 특정 단위 사이의 각각의 단위가 또한 개시되는 것으로 이해된다. 예를 들어, 10 및 15가 개시되면, 11, 12, 13, 및 14도 개시된다.
대상체에 대한 "투여"는 대상체에게 제제를 도입하거나 전달하는 임의의 경로를 포함한다. 투여는 경구, 국소, 정맥내, 피하, 피부경유, 경피, 근육내, 관절내, 비경구, 세동맥내, 피내, 뇌실내, 두개내, 복강내, 병변내, 비강내, 직장, 질, 흡입에 의해, 이식된 저장소를 통해, 비경구(예를 들어 피하, 정맥내, 근육내, 관절내, 활막내, 흉골내, 척추강내, 복강내, 간내, 병변내 및 두개내 주사 또는 주입 기법) 등을 포함하는 임의의 적합한 경로에 의해 수행될 수 있다. 본원에 사용된 "동시에 투여", "병용 투여", "동시 투여" 또는 "동시에 투여되는"은 화합물이 동일한 시점에 또는 본질적으로 서로 직후에 투여됨을 의미한다. 후자의 경우, 2개의 화합물은 관찰된 결과가 동일한 시점에 화합물을 투여했을 때 달성된 결과와 구별할 수 없을 정도로 충분히 가까운 시간에 투여된다. "전신 투여"는 예를 들어 순환계 또는 림프계로의 진입을 통해 대상체 신체의 광범위한 영역(예를 들어 신체의 50% 초과)에 제제를 도입하거나 전달하는 경로를 통해 대상체에게 제제를 도입하거나 전달하는 것을 지칭한다. 대조적으로, "국소 투여"는 투여 지점에 바로 인접한 영역 또는 영역에 제제를 도입하거나 전달하고 치료적으로 유의한 양으로 제제를 전신적으로 도입하지 않는 경로를 통해 대상체에게 제제를 도입하거나 전달하는 것을 지칭한다. 예를 들어, 국소적으로 투여된 제제는 투여 지점의 국소적 부근에서 쉽게 검출될 수 있지만, 대상체 신체의 말단 부분에서는 검출될 수 없거나 무시할 수 있는 양으로 검출될 수 있다. 투여는 자가-투여와 타인에 의한 투여를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 조성물은 비경구, 정맥내, 복강내, 또는 피하 또는 동맥 주사, 정맥 주사, 또는 인공 카테터 매개된 주사를 통해 투여된다.
본원에 사용된 용어 "유익한 제제" 및 "활성제"는 유익한 생물학적 효과를 갖는 화학적 화합물 또는 조성물을 지칭하기 위해 본원에서 상호 교환적으로 사용된다. 유익한 생물학적 효과는 치료 효과, 즉, 장애 또는 다른 바람직하지 않은 생리학적 병태의 치료와 예방적 효과, 즉, 장애 또는 다른 바람직하지 않은 생리학적 병태의 예방을 둘 다 포함한다. 용어는 또한 염, 에스테르, 아미드, 전구약물, 활성 대사산물, 이성질체, 단편, 유사체 등을 포함하지만 이로 제한되지 않는 본원에 구체적으로 언급된 유익한 제제의 약학적으로 허용 가능한, 약리학적 활성 유도체를 포괄한다. 용어 "유익한 제제" 또는 "활성제"가 사용될 때, 또는 특정 제제가 구체적으로 식별되는 경우, 상기 용어는 제제 그 자체뿐만 아니라 약학적으로 허용 가능한 약리학적 활성 염, 에스테르, 아미드, 전구약물, 접합체, 활성 대사산물, 이성질체, 단편, 유사체 등을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
"인코딩"은 뉴클레오타이드(즉, rRNA, tRNA 및 mRNA)의 정의된 서열 또는 아미노산의 정의된 서열 및 이로부터 비롯되는 생물학적 특성을 갖는 생물학적 과정에서 다른 중합체 및 거대분자의 합성을 위한 주형으로서 역할을 하는 폴리뉴클레오타이드, 예컨대 유전자, cDNA 또는 mRNA 내 뉴클레오타이드의 특정 서열의 고유한 특성을 지칭한다. 그러므로, mRNA의 전사 및 번역이라면 유전자는 단백질을 인코딩한다.
용어 "링커"는 폴리펩타이드에 대한 부착 부위 및 또 다른 폴리펩타이드에 대한 부착 부위를 갖는 적어도 하나의 2가 모이어티를 지칭한다. 예를 들어, 폴리펩타이드는 이의 N-말단, 이의 C-말단 또는 측쇄 중 하나의 작용기를 통해 링커에 부착될 수 있다. 링커는 2개의 폴리펩타이드를 적어도 하나의 원자에 의해 그리고 일부 실시형태에서 하나 초과의 원자에 의해 분리하기에 충분하다.
본원에 사용된 용어 "선택적" 또는 "선택적으로"는 후속적으로 기재된 사건 또는 상황이 일어날 수 있거나 일어나지 않을 수도 있음을 의미하고, 설명은 상기 사건 또는 상황이 일어나는 경우와 일어나지 않는 경우를 포함한다.
용어 "유전자" 또는 "유전자 서열"은 코딩 서열 또는 제어 서열 또는 이의 단편을 지칭한다. 유전자는 코딩 서열과 제어 서열의 임의의 조합, 또는 이의 단편을 포함할 수 있다. 그러므로, 본원에 지칭되는 "유전자"는 본래의(native) 유전자의 전부 또는 일부일 수 있다. 본원에 지칭되는 폴리뉴클레오타이드 서열은 용어 "유전자"와 상호 교환적으로 사용될 수 있거나, 임의의 코딩 서열, 비코딩 서열 또는 제어 서열, 이의 단편 및 이의 조합을 포함할 수 있다. 용어 "유전자" 또는 "유전자 서열"은 예를 들어 코딩 서열의 업스트림 제어 서열(예를 들어 리보솜 결합 부위)을 포함한다.
본원에 사용되는 용어 "핵산"은 뉴클레오타이드, 예를 들어 데옥시리보뉴클레오타이드(DNA) 또는 리보뉴클레오타이드(RNA)로 이루어진 중합체를 의미한다. 본원에 사용되는 용어 "리보핵산" 및 "RNA"는 리보뉴클레오타이드로 이루어진 중합체를 의미한다. 본원에 사용되는 용어 "데옥시리보핵산" 및 "DNA"는 데옥시리보뉴클레오타이드로 이루어진 중합체를 의미한다. ("폴리뉴클레오타이드" 및 "폴리펩타이드"와 함께 사용됨).
달리 명시되지 않는 한, "아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열"은 서로의 축퇴 버전(degenerate version)이고 동일한 아미노산 서열을 인코딩하는 모든 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 어구 단백질 또는 RNA를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 또한 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열이 일부 버전에서 인트론(들)을 함유할 수 있는 정도로 인트론을 포함할 수 있다.
용어 "펩타이드", "폴리펩타이드" 및 "단백질"은 아미노산 잔기의 중합체를 지칭하기 위해 상호 교환적으로 사용된다.
용어 "폴리뉴클레오타이드"는 뉴클레오타이드 단량체로 이루어진 단일 또는 이중 가닥 중합체를 지칭한다.
"약학적으로 허용 가능한" 구성요소는 생물학적으로 또는 달리 바람직하지 않은 구성요소를 지칭할 수 있으며, 즉, 구성요소는 본 발명의 약학적 제형에 혼입될 수 있고, 본원에 기재된 바와 같이 유의한 바람직하지 못한 생물학적 효과를 야기하지 않으면서 또는 이것이 함유된 제형의 임의의 다른 구성요소와 유해한 방식으로 상호작용하지 않으면서 본원에 기재된 바와 같은 대상체에게 투여될 수 있다. 인간에게 투여하는 것과 관련하여 사용될 때 이 용어는 일반적으로 구성요소가 독성 및 제조 시험의 필수 표준을 충족하였거나 미국 식품의약국에서 준비한 비활성 성분 가이드에 포함됨을 의미한다.
"약학적으로 허용 가능한 담체"(때때로 "담체"로도 지칭됨)는 일반적으로 안전하고 무독성인 약학적 또는 치료적 조성물을 제조하는 데 유용한 담체 또는 부형제를 의미하고, 수의학 및/또는 인간의 약학적 또는 치료적 용도에 허용 가능한 담체를 포함한다. 용어 "담체" 또는 "약학적으로 허용 가능한 담체"는 포스페이트 완충 식염수, 물, 에멀젼(예컨대 오일/물 또는 물/오일 에멀젼) 및/또는 다양한 유형의 습윤제를 포함할 수 있으나 이로 제한되지 않는다.
본원에 사용된 용어 "담체"는 임의의 부형제, 희석제, 충전제, 염, 완충제, 안정화제, 가용화제, 지질, 안정화제, 또는 약학적 제형에 사용하는 것으로 당업계에 잘 알려져 있는 다른 물질을 포괄한다. 조성물에 사용할 담체의 선택은 조성물의 의도된 투여 경로에 의존할 것이다. 약학적으로 허용 가능한 담체 및 이들 물질을 함유하는 제형의 제조는 예를 들어 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 21st Edition, ed. University of the Sciences in Philadelphia, Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, PA, 2005]에 기재되어 있다. 생리학적으로 허용 가능한 담체의 예는 식염수, 글리세롤, DMSO, 완충제, 예컨대 포스페이트 완충제, 시트레이트 완충제 및 다른 유기산을 갖는 완충제; 아스코르브산을 포함한 항산화제; 저분자량(약 10개 잔기 미만) 폴리펩타이드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 리신; 단당류, 이당류, 및 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함한 다른 탄수화물; 킬레이트화제, 예컨대 EDTA; 당(sugar) 알코올, 예컨대 만니톨 또는 소르비톨; 염-형성 반대이온, 예컨대 나트륨; 및/또는 비이온성 계면활성제, 예컨대 TWEENTM(ICI, Inc.; 미국 뉴저지주 브리지워터 소재), 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 및 PLURONICSTM(BASF; 미국 뉴저지주 플로럼 파크 소재)을 포함한다. 원하는 치료적 치료를 위한 이러한 투여량의 투여를 제공하기 위해, 본원에 개시된 조성물은 유리하게는 담체 또는 희석제를 포함하는 총 조성물의 중량을 기준으로 주제 화합물 중 하나 이상을 총 0.1 중량% 내지 99 중량% 포함할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "서열 동일성"은 실질적으로 동일한 길이의 2개의 서열 사이의 동일성 정도의 정량적 측정을 나타낸다. 핵산 서열이든 아미노산 서열이든 2개 서열의 동일성 퍼센트는 2개의 정렬된 서열 사이의 정확한 일치 수를 더 짧은 서열의 길이로 나누고 100을 곱한 것이다. 핵산 서열에 대한 대략적인 정렬은 문헌[Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics 2:482-489(1981)]의 국소 상동성 알고리즘에 의해 제공된다. 이 알고리즘은 문헌[Dayhoff, Atlas of Protein Sequences and Structure, M. O. Dayhoff ed., 5 suppl. 3:353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C., USA]에 의해 개발되고 문헌[Gribskov, Nucl. Acids Res. 14(6):6745-6763 (1986)]에 의해 정규화된 스코어링 매트릭스를 사용함으로써 아미노산 서열에 적용될 수 있다. 서열의 동일성 퍼센트를 결정하기 위한 이 알고리즘의 예시적인 구현은 "BestFit" 유틸리티 애플리케이션에서 Genetics Computer Group(미국 위스콘신주 매디슨 소재)에 의해 제공된다. 서열 사이의 동일성 또는 유사성 퍼센트를 계산하기 위한 다른 적합한 프로그램은 일반적으로 당업계에 알려져 있으며, 예를 들어 또 다른 정렬 프로그램은 기본(default) 매개변수와 함께 사용되는 BLAST이다. 예를 들어, BLASTN 및 BLASTP는 하기 기본 매개변수를 사용하여 사용될 수 있다: 유전자 코드=표준; 필터=없음; 가닥=둘 다; 컷오프=60; 기대=10; 매트릭스=BLOSUM62; 설명=50 서열; 정렬 기준=높은 점수; 데이터베이스=비중복, GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS 번역+스위스 단백질+Spupdate+PIR. 이들 프로그램에 대한 자세한 내용은 GenBank 웹사이트에서 확인할 수 있다. 일반적으로, 치환은 보존적 아미노산 치환이다: 하기 그룹의 구성원 내 교환으로 제한됨: 그룹 1: 글리신, 알라닌, 발린, 류신 및 이소류신; 그룹 2: 세린, 시스테인, 트레오닌 및 메티오닌; 그룹 3: 프롤린; 그룹 4: 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판; 그룹 5: 아스파르테이트, 글루타메이트, 아스파라긴 및 글루타민.
핵산 및 아미노산 서열 동일성을 결정하는 기법은 당업계에 알려져 있다. 전형적으로, 이러한 기법은 유전자에 대한 mRNA의 뉴클레오타이드 서열을 결정하고/하거나 이에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 결정하고, 이들 서열을 제2 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열과 비교하는 것을 포함한다. 게놈 서열은 또한 이러한 방식으로 결정되고 비교될 수 있다. 일반적으로, 동일성은 각각 2개의 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 서열의 정확한 뉴클레오타이드-대-뉴클레오타이드 또는 아미노산-대-아미노산 대응(correspondence)을 지칭한다. 2개 이상의 서열(폴리뉴클레오타이드 또는 아미노산)은 이들의 동일성 퍼센트를 결정함으로써 비교될 수 있다.
"증가"는 더 많은 양의 증상, 질환, 조성, 병태 또는 활성을 초래하는 임의의 변화를 지칭할 수 있다. 증가는 통계적으로 유의한 양의 병태, 증상, 활성, 조성의 임의의 개별적인, 중앙값 또는 평균 증가일 수 있다. 그러므로, 증가가 통계적으로 유의한 한, 증가는 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 증가일 수 있다.
"감소"는 더 적은 양의 증상, 질환, 조성, 병태 또는 활성을 초래하는 임의의 변화를 지칭할 수 있다. 성분을 갖는 유전자 생성물의 유전적 산출량(output)이 성분을 갖지 않는 유전자 생성물의 산출량에 비해 적을 때 성분은 또한 유전자의 유전적 산출량을 감소시키는 것으로 이해된다. 또한 예를 들어, 감소는 증상이 이전에 관찰된 것 미만인 장애의 증상의 변화일 수 있다. 감소는 통계적으로 유의한 양의 병태, 증상, 활성, 조성의 임의의 개별적인, 중앙값 또는 평균 감소일 수 있다. 그러므로, 감소가 통계적으로 유의한 한, 감소는 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 감소일 수 있다.
"단편"은 다른 서열에 부착되었는지 아닌지의 여부에 관계없이, 단편의 활성이 비변형된 펩타이드 또는 단백질과 비교하여 유의하게 변경되거나 손상되지 않는 한 특정 영역 또는 특정 아미노산 잔기의 삽입, 결실, 치환 또는 다른 선택된 변형을 포함할 수 있다. 이러한 변형은 이황화 결합이 가능한 아미노산을 제거하거나 첨가하기 위해, 이의 생체 수명을 증가시키기 위해, 이의 분비 특징을 변경시키는 등을 위해 일부 부가적인 특성을 제공할 수 있다. 임의의 경우, 단편은 NK 세포에 미치는 생물활성 특성, 예컨대 저해 효과를 가져야 한다.
"저해하다", "저해하는" 및 "저해"는 활성, 반응, 병태, 질환 또는 다른 생물학적 매개변수를 감소시키는 것을 의미한다. 이는 활성, 반응, 병태 또는 질환의 완전한 절제를 포함할 수 있으나 이로 제한되지 않는다. 이는 또한 예를 들어 본래의 또는 대조군 수준과 비교하여 활성, 반응, 병태 또는 질환의 10% 저하를 포함할 수 있다. 그러므로, 저하는 본래의 또는 대조군 수준과 비교하여 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 또는 그 사이의 임의의 양의 저하일 수 있다.
발현 또는 활성의 "저해제"는 각각 시험관내 및 생체내 검정법을 사용하여 기재된 표적 단백질, 예를 들어 리간드, 길항제 및 이의 상동체와 모방체(mimetic)의 발현 또는 활성에 대해 식별되는 저해성 분자를 지칭하는 데 사용된다. 저해제는 예를 들어, 기재된 표적 단백질, 예를 들어 길항제의 발현을 저해하거나 이에 결합하거나, 자극 또는 프로테아제 활성을 부분적으로 또는 전체적으로 차단하거나, 이의 활성을 감소시키거나, 방지하거나, 활성화를 지연시키거나, 비활성화시키거나, 탈민감화시키거나, 하향조절하는 제제이다. 대조군 샘플(저해제로 처리되지 않음)은 100%의 상대 활성값이 지정된다. 기재된 표적 단백질의 저해는 대조군에 비해 활성값이 약 80%, 선택적으로 50%, 25%, 10%, 5% 또는 1%일 때 달성된다.
본원에 사용된 "N-말단 측면" 또는 "아미노 말단 단부(end)"는 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질의 방향성을 지칭하며, N-말단을 의미하지 않을 수 있다. 일부 양태에서, 키메라 또는 융합 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질이 논의되는 경우, N-말단 측면은 전체 구조가 아니라 키메라 또는 융합 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질의 구성요소만 지칭할 수 있다. 예를 들어, Fc 도메인이 논의되고 Fc 도메인이 세포내를 향하는 아미노 말단 또는 N-말단 측과 융합된 것으로 기재되는 경우, 신호 앵커가 키메라 또는 융합 작제물의 N-말단에 있고 실제로 세포막에 걸쳐 있는 키메라 또는 융합 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질이 본원에서 고려된다. 그러므로, 이러한 키메라에서, 막관통 앵커는 Fc 도메인의 아미노 말단 측에 부착되고, Fc 도메인의 방향성은 N-말단 측은 전형적으로 세포막에 걸쳐 있는 카르복시 말단 및 세포외 기질로 연장되는 아미노 말단 단부를 갖는 B 세포 상의 Fc 도메인에 대해 반전된 세포를 향하는 N-말단 측을 갖는다.
"저하시키다" 또는 "저하시키는" 또는 "저하"와 같은 단어의 다른 형태는 사건 또는 특징(예를 들어 종양 성장)을 낮추는 것을 의미한다. 이는 전형적으로 일부 표준 또는 예상 값과 관련되어 있음을 이해되며, 즉, 상대적이지만 참조할 표준 또는 상대 값이 항상 필요한 것은 아니라는 것이다. 예를 들어, "종양 성장을 저하시킨다"는 표준 또는 대조군에 비해 종양 성장 속도를 저하시키는 것을 의미한다.
"예방하다" 또는 "예방하는" 또는 "예방"과 같은 단어의 다른 형태는 특정 사건 또는 특징을 중지시키거나 특정 사건 또는 특징의 발증 또는 진행을 안정화하거나 지연시키거나 특정 사건 또는 특징이 발생할 가능성을 최소화하는 것을 의미한다. 예방은 전형적으로 저하보다 더 절대적이므로 대조군과 비교할 필요가 없다. 본원에 사용된 바와 같이, 어떤 것은 저하될 수는 있지만 예방되지는 않으며, 그러나 어떤 것은 저하될 뿐만 아니라 예방될 수도 있다. 마찬가지로, 어떤 것은 예방될 수는 있지만 저하될 수는 없으며, 어떤 것은 예방될 뿐만 아니라 저하될 수도 있다. 저하 또는 예방이 사용되는 경우, 달리 구체적으로 나타내지 않는 한, 다른 단어의 사용도 명시적으로 개시되는 것으로 이해된다.
용어 "대상체"는 투여 또는 치료의 표적이 되는 개체를 지칭한다. 대상체는 척추동물, 예를 들어 포유류일 수 있다. 일 양태에서, 대상체는 인간, 비인간 영장류, 소, 말, 돼지, 개 또는 고양이일 수 있다. 대상체는 기니피그, 래트, 햄스터, 토끼, 마우스 또는 두더지일 수도 있다. 그러므로, 대상체는 인간 또는 수의학적 환자일 수 있다. 용어 "환자"는 임상의, 예를 들어 의사의 치료를 받는 대상체를 지칭한다.
용어 "치료적으로 유효한"은 사용된 조성물의 양이 질환 또는 장애의 하나 이상의 원인 또는 증상을 개선하기에 충분한 양을 지칭한다. 이러한 개선은 저하 또는 변경만을 필요로 하며, 제거를 필수적으로 필요로 하는 것은 아니다.
용어 "치료"는 질환, 병리학적 병태, 또는 장애를 치유, 개선, 안정화 또는 예방할 의도로 환자를 의료적으로 관리하는 것을 지칭한다. 이 용어는 적극적인 치료, 즉 질환, 병리학적 병태, 또는 장애의 향상을 위해 특별히 지시된 치료를 포함하고, 또한 원인 치료, 즉 연관된 질환, 병리학적 병태, 또는 장애의 원인을 제거하기 위한 치료를 포함한다. 이에 더하여, 이 용어는 고식적 치료, 즉 질환, 병리학적 병태, 또는 장애의 치유보다는 증상의 경감을 위해 고안된 치료; 예방적 치료, 즉 연관된 질환, 병리학적 병태, 또는 장애의 발증을 최소화하거나 부분적으로 또는 완전히 저해하려는 치료; 및 보조적 치료, 즉 연관된 질환, 병리학적 병태, 또는 장애의 향상을 위한 또 다른 특정 치료법을 보완하는 데 이용되는 치료를 포함한다.
본원에 사용된 "치료하다", "치료하는", "치료" 및 이들의 문법적 변형은 하나 이상의 질환 또는 병태의 강도 또는 빈도, 질환 또는 병태의 증상, 또는 질환 또는 병태의 기저 원인을 부분적으로 또는 완전히 예방, 지연, 치유, 힐링, 완화, 경감, 변경, 교정, 개량, 향상, 안정화, 개선 및/또는 저하시키는 것을 의도 또는 목적으로 하는 조성물의 투여를 포함한다. 본 발명에 따른 치료는 방지적으로, 예방적으로, 완화적으로 또는 치료적으로 적용될 수 있다. 예방적 치료는 발병 전(예를 들어 암의 명백한 징후 전), 조기 발병 동안(예를 들어 암의 초기 징후 및 증상 시), 또는 확립된 암 발증 후에 대상체에게 투여된다. 예방적 투여는 질환 또는 감염의 증상이 나타나기 전 수일에서 수년 동안 발생할 수 있다.
조작된 NK 세포
일부 양태에서, Ig 및 ITIM 도메인을 갖는 T 세포 면역수용체(TIGIT)의 발현이 억제되는 조작된 NK 세포가 본원에 개시된다. TIGIT의 발현은 예를 들어 TIGIT 유전자 또는 이의 단편(예를 들어 TIGIT 유전자의 하나 이상의 엑손)의 결실에 의한 것 또는 TIGIT 폴리뉴클레오타이드를 표적화하는 siRNA 또는 shRNA에 의한 것을 포함한 임의의 수단을 사용하여 억제될 수 있다.
"TIGIT"는 본원에서 인간에서 TIGIT 유전자에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드를 지칭한다. 일부 실시형태에서, TIGIT 폴리펩타이드는 하기와 같이 하나 이상의 공개적으로 입수 가능한 데이터베이스에서 식별된다: HGNC: 26838, NCBI Entrez Gene: 201633, Ensembl: ENSG00000181847, OMIM®: 612859, UniProtKB/Swiss-Prot: Q495A1. 일부 실시형태에서, TIGIT 폴리펩타이드는 서열 번호 1의 서열, 또는 서열 번호 1과 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95% 또는 약 98% 또는 그 초과의 상동성을 갖는 폴리펩타이드 서열, 또는 서열 번호 1의 일부를 포함하는 폴리펩타이드를 포함한다. 서열 번호 1의 TIGIT 폴리펩타이드는 미성숙 또는 사전가공된 형태의 성숙 TIGIT를 나타낼 수 있으며, 이에 서열 번호 1의 TIGIT 폴리펩타이드의 성숙 또는 가공된 부분은 본원에 포함된다. 일부 실시형태에서, TIGIT 폴리펩타이드는 서열 번호 10과 적어도 약 60%(예를 들어 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99%)의 동일성을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 단편에 의해 인코딩된다.
일부 실시형태에서, TIGIT의 발현은 CRISPR/Cas 가이드 RNA를 갖는 CRISPR/Cas 엔도뉴클레아제(Cas)9 시스템을 NK 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는 방법을 사용하여 억제되고, 상기 가이드 RNA는 TIGIT 유전자 또는 이의 단편을 표적화한다.
일반적으로, "CRISPR 시스템"은 Cas 유전자를 인코딩하는 서열, tracr(trans-활성화 CRISPR) 서열(예를 들어 tracrRNA 또는 활성 부분 tracrRNA), tracr-메이트(mate) 서열(내인성 CRISPR 시스템의 맥락에서 "직접 반복부(direct repeat)" 및 tracrRNA-가공 부분 직접 반복부를 포괄함), 가이드 서열(내인성 CRISPR 시스템의 맥락에서 "스페이서"로도 지칭됨), 또는 CRISPR 유전자좌로부터의 다른 서열 및 전사체를 포함하여, CRISPR-연관("Cas") 유전자의 발현에 관여하거나 이의 활성을 지시하는 전사체 및 다른 요소를 조합적으로 지칭한다. 일부 실시형태에서, CRISPR 시스템의 하나 이상의 요소는 I형, II형 또는 III형 CRISPR 시스템으로부터 유래된다. CRISPR 시스템은 당업계에 알려져 있다. 예를 들어, 전체 내용이 본원에 인용되어 포함된 미국 특허 제8,697,359호를 참조한다.
"가이드 RNA", "단일 가이드 RNA" 및 "합성 가이드 RNA"는 상호 교환적으로 사용되고, 가이드 서열, tracr 서열 및 tracr 메이트(mate) 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 지칭한다. 용어 "가이드 서열"은 표적 부위를 명시하는 가이드 RNA 내의 약 20 bp 서열을 지칭하고, 용어 "가이드" 또는 "스페이서"와 상호 교환적으로 사용될 수 있다. TIGIT 폴리뉴클레오타이드를 표적화하기 위한 본원에 기재된 gRNA는 서열 번호 11과 적어도 약 60%(예를 들어 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99%)의 동일성을 갖는 서열 또는 이의 단편을 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA는 서열 번호 11로 표시된 서열을 포함한다. 일부 예에서, TIGIT gRNA는 TIGIT 단백질 UniProtKB/Swiss-Prot: Q495A1의 세포외 도메인 내 아미노산 잔기 113 내지 119(즉, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 113 내지 119)에 상응하는 큐레이티드(curated) TIGIT RefSeq NM_173799의 뉴클레오타이드 잔기 372 내지 391(즉, 서열 번호 10의 뉴클레오타이드 잔기 372 내지 391)을 표적화한다.
본원에서, "발현"은 핵산, 예컨대 유전자, 폴리뉴클레오타이드 및 올리고뉴클레오타이드로부터의 전사에 의한 mRNA의 생성, 또는 mRNA로부터의 전사에 의한 단백질 또는 폴리펩타이드의 생성을 의미한다. "발현의 억제"는 억제가 없는 경우와 비교하여 유의한 양의 전사 생성물 또는 번역 생성물의 감소를 지칭한다.
본원에서 TIGIT 발현의 억제는 예를 들어 TIGIT의 억제가 없는 NK 세포(예를 들어 1차 NK 세포, NK 세포주, 비확장된 NK 또는 확장된 NK)에서의 전사 생성물 또는 번역 생성물의 양과 비교하여 약 10% 이상, 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 40% 이상, 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 80% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상 또는 약 99% 이상의 양의 전사 생성물 또는 번역 생성물의 감소를 보여준다.
일부 실시형태에서, 조작된 NK 세포는 저해성 수용체의 발현이 억제된다. 일부 실시형태에서, 저해제 수용체는 폴리오바이러스 수용체-관련 면역글로불린 도메인-함유(PVRIG), CD96, 림프구 활성화 3(LAG3), TIM-3, NKG2A, PD-1 및 CTLA-4로 이루어진 군으로부터 선택된다.
폴리오바이러스 수용체(PVR)(CD155로도 지칭됨)는 상이한 유형의 종양 세포 상에서 발현되고, NK 세포 상의 활성화 또는 저해성 수용체에 의해 인식되어 이러한 리간드와 상호작용한 후 반대의 기능을 발휘하는 것으로 이해되어야 한다. 활성화 수용체는 DNAM-1(CD226)을 포함하고, 저해성 수용체는 TIGIT, CD96 및 PVRIG를 포함한다. 이에 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 조작된 NK 세포는 CD96 및 PVRIG로 이루어진 군으로부터 선택되는 저해성 수용체의 발현이 추가로 억제된다.
"폴리오바이러스 수용체-관련 면역글로불린 도메인-함유(PVRIG)"는 본원에서 인간에서 PVRIG 유전자에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드를 지칭한다. 일부 실시형태에서, PVRIG 폴리펩타이드는 하기와 같이 하나 이상의 공개적으로 입수 가능한 데이터베이스에서 식별된다: HGNC: 32190, NCBI Entrez Gene: 79037, Ensembl: ENSG00000213413, OMIM®: 617012, UniProtKB/Swiss-Prot: Q6DKI7. 일부 실시형태에서, PVRIG 폴리펩타이드는 서열 번호 2의 서열, 또는 서열 번호 2와 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95% 또는 약 98% 또는 그 초과의 상동성을 갖는 폴리펩타이드 서열, 또는 서열 번호 2의 일부를 포함하는 폴리펩타이드를 포함한다. 서열 번호 2의 PVRIG 폴리펩타이드는 미성숙 또는 사전가공된 형태의 성숙 PVRIG를 나타낼 수 있으며, 이에 서열 번호 2의 PVRIG 폴리펩타이드의 성숙 또는 가공된 부분은 본원에 포함된다.
"CD96"은 본원에서 인간에서 CD96 유전자에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드를 지칭한다. 일부 실시형태에서, CD96 폴리펩타이드는 하기와 같이 하나 이상의 공개적으로 입수 가능한 데이터베이스에서 식별된다: HGNC: 16892, NCBI Entrez Gene: 10225, Ensembl: ENSG00000153283, OMIM®: 606037, UniProtKB/Swiss-Prot: P40200. 일부 실시형태에서, CD96 폴리펩타이드는 서열 번호 3의 서열, 또는 서열 번호 3과 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95% 또는 약 98% 또는 그 초과의 상동성을 갖는 폴리펩타이드 서열, 또는 서열 번호 3의 일부를 포함하는 폴리펩타이드를 포함한다. 서열 번호 3의 CD96 폴리펩타이드는 미성숙 또는 사전가공된 형태의 성숙 CD96을 나타낼 수 있으며, 이에 서열 번호 3의 CD96 폴리펩타이드의 성숙 또는 가공된 부분은 본원에 포함된다.
"DNAX 부속 분자-1(DNAM-1: DNAX accessory molecule-1)" 또는 "CD226"은 본원에서 인간에서 CD226 유전자에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드를 지칭한다. 일부 실시형태에서, DNAM-1 폴리펩타이드는 하기와 같이 하나 이상의 공개적으로 입수 가능한 데이터베이스에서 식별된다: HGNC: 16961, NCBI Entrez Gene: 10666, Ensembl: ENSG00000150637, OMIM®: 605397, UniProtKB/Swiss-Prot: Q15762. 일부 실시형태에서, DNAM-1 폴리펩타이드는 서열 번호 4의 서열, 또는 서열 번호 4와 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95% 또는 약 98% 또는 그 초과의 상동성을 갖는 폴리펩타이드 서열, 또는 서열 번호 4의 일부를 포함하는 폴리펩타이드를 포함한다. 서열 번호 4의 DNAM-1 폴리펩타이드는 미성숙 또는 사전가공된 형태의 성숙 DNAM-1을 나타낼 수 있으며, 이에 서열 번호 4의 DNAM-1 폴리펩타이드의 성숙 또는 가공된 부분은 본원에 포함된다.
"림프구 활성화 3(LAG3)"은 본원에서 인간에서 LAG3 유전자에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드를 지칭한다. 일부 실시형태에서, LAG3 폴리펩타이드는 하기와 같이 하나 이상의 공개적으로 입수 가능한 데이터베이스에서 식별된다: HGNC: 6476, NCBI Entrez Gene: 3902, Ensembl: ENSG00000089692, OMIM®: 153337, UniProtKB/Swiss-Prot: P18627. 일부 실시형태에서, LAG3 폴리펩타이드는 서열 번호 5의 서열, 또는 서열 번호 5와 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95% 또는 약 98% 또는 그 초과의 상동성을 갖는 폴리펩타이드 서열, 또는 서열 번호 5의 일부를 포함하는 폴리펩타이드를 포함한다. 서열 번호 5의 LAG3 폴리펩타이드는 미성숙 또는 사전가공된 형태의 성숙 LAG3을 나타낼 수 있으며, 이에 서열 번호 5의 LAG3 폴리펩타이드의 성숙 또는 가공된 부분은 본원에 포함된다.
"PD-1"은 본원에서 인간에서 PDCD1 유전자에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드를 지칭한다. 일부 실시형태에서, PD-1 폴리펩타이드는 하기와 같이 하나 이상의 공개적으로 입수 가능한 데이터베이스에서 식별된다: HGNC: 8760 NCBI Entrez Gene: 5133 Ensembl: ENSG00000188389 OMIM®: 600244 UniProtKB/Swiss-Prot: Q15116. 일부 실시형태에서, PD-1 폴리펩타이드는 서열 번호 6의 서열, 또는 서열 번호 6과 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95% 또는 약 98% 또는 그 초과의 상동성을 갖는 폴리펩타이드 서열, 또는 서열 번호 6의 일부를 포함하는 폴리펩타이드를 포함한다. 서열 번호 6의 PD-1 폴리펩타이드는 미성숙 또는 사전가공된 형태의 성숙 PD-1을 나타낼 수 있으며, 이에 서열 번호 6의 PD-1 폴리펩타이드의 성숙 또는 가공된 부분은 본원에 포함된다.
"CTLA-4"은 본원에서 인간에서 CTLA4 유전자에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드를 지칭한다. 일부 실시형태에서, CTLA-4 폴리펩타이드는 하기와 같이 하나 이상의 공개적으로 입수 가능한 데이터베이스에서 식별된다: HGNC: 2505, NCBI Entrez Gene: 1493, Ensembl: ENSG00000163599, OMIM®: 123890, UniProtKB/Swiss-Prot: P16410. 일부 실시형태에서, CTLA-4 폴리펩타이드는 서열 번호 7의 서열, 또는 서열 번호 7과 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95% 또는 약 98% 또는 그 초과의 상동성을 갖는 폴리펩타이드 서열, 또는 서열 번호 7의 일부를 포함하는 폴리펩타이드를 포함한다. 서열 번호 7의 CTLA-4 폴리펩타이드는 미성숙 또는 사전가공된 형태의 성숙 CTLA-4를 나타낼 수 있으며, 이에 서열 번호 7의 CTLA-4 폴리펩타이드의 성숙 또는 가공된 부분은 본원에 포함된다.
"TIM-3"은 본원에서 인간에서 HAVCR2 유전자에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드를 지칭한다. 일부 실시형태에서, TIM-3 폴리펩타이드는 하기와 같이 하나 이상의 공개적으로 입수 가능한 데이터베이스에서 식별된다: HGNC: 18437, NCBI Entrez Gene: 84868, Ensembl: ENSG00000135077, OMIM®: 606652, UniProtKB/Swiss-Prot: Q8TDQ0. 일부 실시형태에서, TIM-3 폴리펩타이드는 서열 번호 8의 서열, 또는 서열 번호 8과 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95% 또는 약 98% 또는 그 초과의 상동성을 갖는 폴리펩타이드 서열, 또는 서열 번호 8의 일부를 포함하는 폴리펩타이드를 포함한다. 서열 번호 8의 TIM-3 폴리펩타이드는 미성숙 또는 사전가공된 형태의 성숙 TIM-3을 나타낼 수 있으며, 이에 서열 번호 8의 TIM-3 폴리펩타이드의 성숙 또는 가공된 부분은 본원에 포함된다.
"NKG2A"은 본원에서 인간에서 KLRC1 유전자에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드를 지칭한다. 일부 실시형태에서, NKG2A 폴리펩타이드는 하기와 같이 하나 이상의 공개적으로 입수 가능한 데이터베이스에서 식별된다: HGNC: 6374 NCBI Entrez Gene: 3821 Ensembl: ENSG00000134545 OMIM®: 161555 UniProtKB/Swiss-Prot: P26715. 일부 실시형태에서, NKG2A 폴리펩타이드는 서열 번호 9의 서열, 또는 서열 번호 9와 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95% 또는 약 98% 또는 그 초과의 상동성을 갖는 폴리펩타이드 서열, 또는 서열 번호 9의 일부를 포함하는 폴리펩타이드를 포함한다. 서열 번호 9의 NKG2A 폴리펩타이드는 미성숙 또는 사전가공된 형태의 성숙 NKG2A를 나타낼 수 있으며, 이에 서열 번호 9의 NKG2A 폴리펩타이드의 성숙 또는 가공된 부분은 본원에 포함된다.
폴리펩타이드의 발현 수준을 증가시키는 방법은 당업계에 알려져 있으며, 예를 들어 유전자를 세포 내로 도입하고 발현시키는 단계를 포함한다. 발현 벡터의 맥락에서, 벡터는 당업계에서 임의의 방법에 의해 숙주 세포, 예를 들어 포유류, 박테리아, 효모 또는 곤충 세포 내로 쉽게 도입될 수 있다. 예를 들어 발현 벡터는 물리적, 화학적 또는 생물학적 수단에 의해 숙주 세포 내로 전달될 수 있다. 예를 들어 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함된 제WO2012079000A1호를 참조한다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 NK 세포는 1차 NK 세포 또는 NK 세포주이다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 NK 세포는 확장된 NK 세포 또는 비확장된 NK 세포이다. 일부 실시형태에서, NK 세포 확장 조성물은 영양 세포, 조작된 PM 입자, 또는 엑소좀을 포함한다. 일부 실시형태에서, 영양 세포 또는 조작된 입자는 이의 외부 표면에 결합된 Fc 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, NK 세포 확장 조성물은 NK 세포 이펙터 제제를 추가로 포함한다.
(I) 막 결합 Fc를 포함하는 조작된 영양 세포, 조작된 원형질막 입자 및 조작된 엑소좀
본 개시내용에 따른 조성물은 Fc-결합 영양 세포(FC)를 포함하는 조성물, Fc-결합 조작된 원형질막(PM) 입자를 포함하는 조성물, 및 Fc-결합 조작된 엑소좀을 포함하는 조성물을 포함한다. Fc-결합 조작된 PM 입자는 Fc-결합 영양 세포 유래 PM 나노입자를 포함한다. Fc 결합 조작된 엑소좀은 엑소좀 또는 Fc-결합 영양 세포 유래 다른 세포외 소포를 포함하며, 이는 또한 하기에 상세히 기재되어 있다. 대안적으로, 엑소좀은 혈소판 및 거핵구와 같은 다른 공급원으로부터 유래될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "Fc-결합"은 막관통 펩타이드를 통해 조작된 입자 또는 영양 세포의 외부 표면에 대한 역배향(즉, 아미노 말단이 세포 내부를 향함)으로의 Fc 도메인의 커플링을 지칭하는 것으로 이해되어야 한다. 이는 본원에 개시된 Fc 융합 펩타이드를 사용하여 달성될 수 있다. 그러므로, 본 개시내용의 일 양태는 적어도 하나의 Fc-결합 영양 세포, 즉 영양 세포의 외부 표면에 결합된 Fc 도메인을 포함하는 영양 세포를 포함하는 영양 세포 조성물을 제공하고, 이는 하기에 추가로 상세히 기재되어 있다. 예를 들어, 영양 세포는 영양 세포의 외부 표면에 결합된 Fc 도메인을 발현하도록, 즉 하기 추가로 기재된 바와 같은 Fc 융합 펩타이드를 발현하도록 유전적으로 변형될 수 있다. 본 개시내용의 또 다른 양태는 적어도 하나의 Fc-결합 조작된 입자, 즉 영양 세포의 외부 표면에 대해 역배향으로 결합된 Fc 도메인을 포함하는 조작된 입자를 포함하는, 영양 세포가 없는 NK 세포 확장 조성물을 제공한다. 일부 양태에서, 영양 세포는 인간화 항체로 태깅될 수 있는 리간드를 발현하도록 조작될 수 있다.
영양 세포 조성물에서, 적어도 하나의 Fc-결합 영양 세포는 적어도 하나의 세포 NK 세포 이펙터 제제를 선택적으로 포함한다. 일례에서, Fc-결합 영양 세포는 IL-15 또는 IL-21인 하나의 세포 NK 세포 이펙터를 포함한다. Fc-결합 영양 세포는 적어도 2개 이상의 상이한 NK 세포 이펙터 제제를 포함할 수 있다.
영양 세포가 없는 NK 세포 확장 조성물에서, Fc-결합 조작된 PM 입자는 적어도 하나의 세포 NK 세포 이펙터 제제를 선택적으로 포함한다. 일례에서, Fc-결합 조작된 입자는 IL-15 또는 IL-21인 하나의 세포 NK 세포 이펙터를 포함한다. Fc-결합 조작된 PM 입자는 적어도 2개 이상의 상이한 NK 세포 이펙터 제제를 포함할 수 있다.
적어도 2개의 NK 세포 이펙터 제제가 존재하는 영양 세포 조성물 또는 영양 세포가 없는 조성물에서, 제2 NK 세포 이펙터 제제는 예를 들어 41BBL일 수 있다. 영양 세포 또는 조작된 PM 입자가 하나 이상의 NK 세포 이펙터 제제를 포함하는 영양 세포 조성물 또는 영양 세포가 없는 NK 세포 확장 조성물에서, NK 세포 이펙터 제제는 41BBL, IL-15, IL-2, IL-12, IL-18, IL-21, MICA, UBLP, 2B4, LFA-1, 노치 리간드, NKp46에 대한 리간드, 또는 BCM1/SLAMF2, TLR 리간드 및 NKG2D 리간드, 또는 사이토카인으로부터 선택될 수 있다. 예시적인 이러한 조성물에서, 적어도 하나의 부가적인 NK 세포 이펙터 제제는 IL-15 또는 IL-21이다. 일부 실시형태에서, NK 세포 이펙터 제제는 IL-12, IL-15 및 IL-18로부터 선택될 수 있다.
(a) Fc-결합 영양 세포
본 개시내용은 상기 상세히 설명된 바와 같은 Fc 융합 펩타이드를 포함하는 영양 세포를 제공한다. 본원에 개시된 방법에서 사용하고 본원에 개시된 PM 입자 및 엑소좀을 제조하는 데 사용하기 위한 NK 세포 영양 세포는, 조사된(irradiated) 자가 또는 동종이계 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 또는 비조사된 자가 또는 동종이계 PBMC, RPMI8866, HFWT, 721.221 또는 K562 세포, 뿐만 아니라 EBV-LCL, 다른 비(non)-HLA 또는 저-HLA 발현 세포주 또는 종양 백신으로서 사용될 수 있는 환자 유래 1차 종양일 수 있다. Fc-결합 영양 세포는 당업계에 잘 알려진 표준 형질도입 또는 형질주입 기법을 사용하여 본원에 기재된 임의의 Fc 융합 펩타이드로 영양 세포를 형질주입 또는 형질도입함으로써 제조될 수 있다. 예를 들어, 본원에 개시된 Fc 융합 펩타이드용 cDNA 벡터는 박테리아(이. 콜라이), 곤충, 또는 포유류 세포에서 발현을 가능하게 하는 발현 플라스미드로 결찰될 수 있다. cDNA 벡터는 FLAG-태깅되거나(tagged) HIS-태깅될 수 있다. 적합한 형질주입 방법은 뉴클레오펙션(또는 전기천공), 칼슘 포스페이트-매개 형질주입, 양이온성 중합체 형질주입(예를 들어 DEAE-덱스트란 또는 폴리에틸렌이민), 바이러스 형질도입, 비로솜 형질주입, 비리온 형질주입, 리포좀 형질주입, 양이온성 리포좀 형질주입, 면역리포좀 형질주입, 비리포좀 지질 형질주입, 덴드리머 형질주입, 열 충격 형질주입, 마그네토펙션, 리포펙션, 유전자 건 전달, 임팔레펙션(impalefection), 소노포레이션(sonoporation), 광학 형질주입, 및 핵산의 전용 제제-증강 흡수를 포함한다. 형질주입 방법은 당업계에 잘 알려져 있다(예를 들어 문헌["Current Protocols in Molecular Biology" Ausubel et al., John Wiley & Sons, New York, 2003] 또는 문헌["Molecular Cloning: A Laboratory Manual" Sambrook & Russell, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 3rd edition, 2001] 참조). 대안적으로, 분자는 마이크로인젝션에 의해 세포 내로 도입될 수 있다. 예를 들어, 논의되는 세포의 세포질 또는 핵에 분자가 주입될 수 있다. 세포에 도입되는 각각의 분자의 양은 다양할 수 있으나, 당업자는 적절한 양을 결정하는 수단에 익숙하다.
다양한 분자가 동시에 또는 순차적으로 세포 내로 도입될 수 있음을 이해할 것이다. 예를 들어, Fc 융합 펩타이드 및 하나 이상의 막 결합 NK 세포 이펙터 제제는 동시에 영양 세포에 도입될 수 있다. 대안적으로, 하나가 먼저 도입된 다음, 다른 분자(들)가 이후에 세포에 도입될 수 있다. 예를 들어, 일단 Fc 융합 펩타이드로 형질주입 또는 형질도입된 영양 세포는 막 결합 NK 세포 이펙터 제제, 예컨대 IL-15 및/또는 IL-21 및/또는 41BBL로 추가로 형질주입될 수 있고/있거나 EBV-LCL 및/또는 다른 NK 세포 이펙터 제제(들)로 감염될 수 있다. 대안적으로, 영양 세포는 Fc 융합 펩타이드 및 막 결합 NK 세포 이펙터 제제, 예컨대 IL-15 및/또는 IL-21 및/또는 41BBL 및/또는 EBV-LCL 및/또는 다른 NK 세포 이펙터 제제(들)로 동시에 형질주입 또는 형질도입될 수 있다. 대안적으로, 이전에 형질주입 또는 형질도입되고 막 결합 NK 세포 이펙터 제제, 예컨대 IL-15 및/또는 IL-21 및/또는 41BBL을 발현하고/하거나 EBV-LCL 및/또는 다른 NK 세포 이펙터 제제(들)로 감염된 영양 세포는 Fc 융합 펩타이드로 형질주입 또는 형질도입될 수 있다. 또한, 당업계에 알려진 화학적 접합 방법과 같은 다른 수단이 막 결합 Fc를 달성하기 위해 사용될 수 있음이 이해될 것이다.
일반적으로, 세포는 세포 성장 및/또는 유지에 적절한 조건 하에 유지된다. 적합한 세포 배양 조건은 당업계에 잘 알려져 있고, 예를 들어 문헌[Santiago et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2008, 105:5809-5814]; 문헌[Moehle et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2007, 104:3055-3060]; 문헌[Urnov et al., Nature, 2005, 435:646-651]; 및 문헌[Lombardo et al., Nat. Biotechnol., 2007, 25:1298-1306]에 기재되어 있다. 당업자는 세포를 배양하는 방법이 당업계에 알려져 있고 세포 유형에 따라 다양할 것임을 이해한다. 모든 경우에 일상적인 최적화가 사용되어 특정 세포 유형에 대한 최상의 기법을 결정할 수 있다.
Fc-결합 영양 세포는 NK 세포를 직접 자극하기 위해 세포 배양에 사용될 수 있거나, 영양 세포로부터 유래된 PM 입자 또는 엑소좀을 제조하기 위해 사용될 수 있다.
(b) Fc-결합 PM 입자
Fc-결합 조작된 PM 입자는 잘 알려진 방법을 사용하여 Fc-결합 NK 세포 영양 세포로부터 제조될 수 있는 Fc-결합 PM 입자를 포함한다. PM 입자는 세포의 원형질막에서 만들어지거나 인공적으로 만들어진 소포(즉, 리포좀)이다. PM 입자는 지질 이중층 또는 단순히 단일 지질층을 함유할 수 있다. PM 입자는 단일 라멜라, 다중 라멜라 또는 반전된 형태로 제조될 수 있다. PM 입자는 전체 개시내용이 본원에 인용되어 포함된 미국 특허 제9,623,082호에 기재된 바와 같은 리포좀의 제조를 위한 프로토콜 또는 알려진 원형질막 제조 프로토콜을 사용하여 본원에 기재된 바와 같은 Fc-결합 영양 세포로부터 제조될 수 있다. 특정한 양태에서, 본원에 개시된 PM 입자는 평균 직경이 약 170 내지 약 300 nm 범위이다.
(c) Fc-결합 엑소좀
본원에 개시된 Fc-결합 엑소좀은 엑소좀-분비 세포로부터 제조될 수 있으며, 이는 잘 알려진 방법을 사용하여 Fc-결합 NK 세포 영양 세포로부터 제조될 수 있고, 상기 엑소좀은 이의 전체 개시내용이 본원에 인용되어 포함된 미국 특허출원 공개 US 20170333479호에 기재된 바와 같이, 엑소좀-분비 세포의 세포외 생성물이다. 엑소좀은 지질 및 단백질을 포함하고, 특정 엑소좀에서 발견된 단백질의 정체는 이를 생산한 세포(들)에 의존적이다. 본원에 개시된 엑소좀은 본원에 개시된 바와 같은 Fc 융합 펩타이드(즉, Fc-결합됨)를 포함하고, 선택적으로 하나 이상의 자극성 펩타이드(NK 세포 이펙터 제제)는 엑소좀 막에 존재한다. 엑소좀은 예를 들어 엑소좀의 향상된 형성 또는 방출을 위해 조작된 세포주로부터 생산될 수 있다. 이러한 세포주는 섹션 I(a)에서 상기 기재된 바와 같은 Fc-결합 세포주를 포함하지만 이로 제한되지는 않는다. 비제한적인 세포주는 Fc-결합 K562-mb15-41BBL 및 Fc-결합 K562이다. 특정한 양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 엑소좀은 평균 직경이 약 30 내지 약 100 nm, 또는 내지 약 160 nm 범위이다. 일 양태에서, 엑소좀은 직경이 평균 약 60 내지 80 nm이다. PM 입자로 쉽게 달성된 것보다 더 작은 입자 크기를 달성하기 위한 엑소좀의 능력은, 엑소좀이 더 작은 크기가 선호되는 용도에 더 쉽게 적응될 수 있음을 의미한다. 예를 들어, 엑소좀은 생리학적 장벽을 통한 확산, 조직 구획을 통한 증강된 생체분포, 또는 정맥 주사를 필요로 하는 적용에서 선호될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 NK 세포 확장 조성물은 적어도 하나의 가용성 배지 구성요소, 예컨대 사이토카인, IL-2, IL-12, IL-15, IL-18, IL-21, NAM, 아스코르베이트 또는 이의 임의의 조합을 포함하는 세포 배지 용액과 조합된다.
일부 예에서, 본원에 사용된 NK 세포 확장 조성물 및 본원에 기재된 NK 세포 확장 방법은 미국 특허 공개 제20200237822호에 기재된 것이며, 이의 전체 개시내용은 본원에 인용되어 포함된다.
조성물 및 방법
대상체에서 암, 전이 또는 감염성 질환을 치료하고/하거나, 감소시키고/시키거나, 저해하고/하거나, 저하시키고/저하시키거나, 개선하고/하거나 예방하는 방법이 또한 본원에 개시되며, 대상체에게 치료적 유효량의 본원에 기재된 조작된 NK 세포를 투여하는 단계를 포함하고, 상기 조작된 NK 세포는 Ig 및 ITIM 도메인을 갖는 T 세포 면역수용체(TIGIT)의 발현이 억제된다. 유사하게는, 본 개시내용은 대상체에서 암, 전이 또는 감염성 질환을 치료하고/하거나, 감소시키고/시키거나, 저해하고/하거나, 저하시키고/저하시키거나, 개선하고/하거나 예방하는 데 사용하기 위한 치료적 유효량의 본원에 개시된 조작된 NK 세포를 제공하며, 상기 조작된 NK 세포는 Ig 및 ITIM 도메인을 갖는 T 세포 면역수용체(TIGIT)의 발현이 억제된다.
대상체에서 암, 전이 또는 감염성 질환을 치료하고/하거나, 감소시키고/시키거나, 저해하고/하거나, 저하시키고/저하시키거나, 개선하고/하거나 예방하는 방법이 또한 본원에 개시되며, 대상체에게 치료적 유효량의 NK 세포 및 치료적 유효량의 Ig 및 ITIM 도메인을 갖는 T 세포 면역수용체(TIGIT) 저해제를 투여하는 단계를 포함한다. 유사하게는, 본 개시내용은 대상체에서 암, 전이 또는 감염성 질환을 치료하고/하거나, 감소시키고/시키거나, 저해하고/하거나, 저하시키고/저하시키거나, 개선하고/하거나 예방하는 데 사용하기 위한 치료적 유효량의 NK 세포 및 치료적 유효량의 TIGIT 저해제를 제공한다. 일부 실시형태에서, NK 세포는 1차 NK 세포 또는 NK 세포주이다. 일부 실시형태에서, NK 세포는 확장된 NK 세포이다. 일부 실시형태에서, 확장된 NK 세포는 시험관내에서/생체내에서 본원에 개시된 NK 세포 확장 조성물(예를 들어 영양 세포, 조작된 PM 입자, 또는 엑소좀)에 노출된다. 일부 실시형태에서, 영양 세포 또는 조작된 입자는 이의 외부 표면에 결합된 Fc 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, NK 세포 확장 조성물은 NK 세포 이펙터 제제를 추가로 포함한다. NK 세포 이펙터 제제는 41BBL, IL-15, IL-2, IL-12, IL-18, IL-21, MICA, UBLP, 2B4, LFA-1, 노치(Notch) 리간드, NKp46에 대한 리간드, 또는 BCM1/SLAMF2, TLR 리간드, NKG2D 리간드, 및 사이토카인으로부터 선택될 수 있다. 예시적인 이러한 조성물에서, 적어도 하나의 NK 세포 이펙터 제제는 IL-15 또는 IL-21이다. 일부 실시형태에서, NK 세포 이펙터 제제는 IL-12, IL-15 및 IL-18로부터 선택될 수 있다. 일부 실시형태에서, NK 세포 이펙터 제제는 IL-21 및/또는 41BBL을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법은 대상체에게 치료적 유효량의 TIGIT 저해제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, TIGIT 저해제는 항-TIGIT 항체(예를 들어 티라골루맙, 비보스톨리맙, 돔바날리맙, BMS-986207, 에티글리맙, EOS-448, COM902, ASP8374, SEA-TGT, BGB-A1217, IBI-939 또는 M6223)이다.
많은 항-TIGIT 치료법(예를 들어 항-TIGIT 항체)이 개발중에 있음을 이해해야 한다. TIGIT를 표적화하는 Fc-적격 치료용 항체는 TIGIT를 발현하는 NK 세포에서 NK 세포 아군사멸화를 유도할 수 있다. TIGIT 넉아웃 NK 세포는 아군사멸화를 방지하고 NK 세포수를 복구시킬 수 있다. 이는 예를 들어 도 9에 제시된 개략도에 의해 예시된다.
이에, 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 방법은 대상체에게 치료적 유효량의 TIGIT 저해제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, TIGIT 저해제는 항-TIGIT 항체이다. 일부 실시형태에서, 항-TIGIT 항체는 Fc 수용체(예를 들어 CD16)에 결합하는 단편 결정화 가능 영역(Fc 영역)을 포함한다. Fc 수용체에의 Fc 영역의 이러한 결합은 면역계의 이펙터 기능(예를 들어 ADCC)을 촉발할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항-TIGIT 항체는 Fc 영역이 결여되거나 참조 대조군에 비해 Fc 수용체(예를 들어 CD16)에 대해 저하된 친화도를 갖는 Fc 영역을 포함한다. 일부 예에서, 항-TIGIT 항체는 Fc 수용체에의 Fc 영역의 결합 친화도를 저하시키는 하나 이상의 돌연변이를 Fc 영역 상에 포함한다.
용어 "항체"는 본원에서 넓은 의미로 사용되고, 다중클론 항체와 단일클론 항체를 둘 다 포함한다. 온전한(intact) 면역글로불린 분자에 더하여, 용어 "항체"에는 이들 면역글로불린 분자의 단편 또는 중합체, 및 인간 또는 인간화 버전의 면역글로불린 분자 또는 이의 단편이 또한 포함되는데, TIGIT가 이의 수용체와 상호작용하는 것이 저해되도록 이들이 TIGIT와 상호작용하는 능력에 대해 선택되는 한 포함된다. 항체는 본원에 기재된 시험관내 검정법을 사용하여 또는 유사한 방법에 의해 이의 원하는 활성에 대해 시험될 수 있으며, 그 후에 이의 생체내 치료적 및/또는 예방적 활성이 기지의 임상 시험 방법에 따라 시험된다. 5개의 주요 부류의 인간 면역글로불린: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 존재하며, 이들 중 몇몇은 하위부류(이소형), 예를 들어 IgG-1, IgG-2, IgG-3 및 IgG-4; IgA-1 및 IgA-2로 추가로 나뉘어질 수 있다. 당업자는 마우스에 대한 비교 가능한 부류를 인식할 것이다. 상이한 부류의 면역글로불린에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 알파, 델타, 입실론, 감마 및 뮤라고 한다.
본원에 사용된 용어 "항체 또는 이의 단편"은 이중 또는 다중 항원 또는 에피토프 특이성을 갖는 키메라 항체와 하이브리드 항체, 및 하이브리드 단편을 포함하여 F(ab')2, Fab', Fab, Fv, sFv, 나노바디(nanobody) 등과 같은 단편을 포괄한다. 그러므로, 항체의 특이적인 항원에 결합하는 능력을 보유한 항체의 단편이 제공된다. 예를 들어 TIGIT 결합 활성을 유지하는 항체의 단편은 용어 "항체 또는 이의 단편"의 의미 내에 포함된다. 이러한 항체 및 단편은 당업계에 알려진 기법에 의해 제조될 수 있고, 실시예에 제시된 방법 및 항체를 생산하고 특이성 및 활성에 대해 항체를 스크리닝하는 일반적인 방법에 따라 특이성 및 활성에 대해 스크리닝될 수 있다(문헌[Harlow and Lane. Antibodies, A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Publications, New York, (1988)] 참조).
"항체 또는 이의 단편"의 의미 내에는 항체 단편과 항원 결합 단백질(단일 사슬 항체)의 접합체도 포함된다.
단편은 다른 서열에 부착되었는지 아닌지의 여부에 관계없이, 항체 또는 항체 단편의 활성이 비변형된 항체 또는 항체 단편과 비교하여 유의하게 변경되거나 손상되지 않는 한 특정 영역 또는 특정 아미노산 잔기의 삽입, 결실, 치환 또는 다른 선택된 변형을 포함할 수 있다. 이러한 변형은 이황화 결합이 가능한 아미노산을 제거/첨가하기 위해, 이의 생체 수명을 증가시키기 위해, 이의 분비 특징을 변경시키는 등을 위해 일부 부가적인 특성을 제공할 수 있다. 임의의 경우, 항체 또는 항체 단편은 생물활성 특성, 예컨대 이의 동족(cognate) 항원에의 특이적인 결합을 가져야 한다. 항체 또는 항체 단편의 기능적 또는 활성 영역은 단백질의 특정 영역의 돌연변이유발(mutagenesis), 뒤이어 발현되는 폴리펩타이드의 발현 및 시험에 의해 식별될 수 있다. 이러한 방법은 당업자에게 쉽게 명백한 것이며, 항체 또는 항체 단편을 인코딩하는 핵산의 부위-특이적 돌연변이유발을 포함할 수 있다. (문헌[Zoller, M.J. Curr. Opin. Biotechnol. 3:348-354, 1992]).
본원에 사용된 용어 "항체" 또는 "항체들"은 또한 인간 항체 및/또는 인간화 항체를 지칭할 수 있다. 많은 비인간 항체(예를 들어 마우스, 래트 또는 토끼로부터 유래되는 것)는 인간에서 천연적으로 항원성이며, 따라서 인간에게 투여될 때 바람직하지 못한 면역 반응을 야기할 수 있다. 따라서, 방법에서 인간 또는 인간화 항체의 사용은 인간에게 투여된 항체가 바람직하지 못한 면역 반응을 유발할 기회를 줄이는 역할을 한다. 당업자가 이해하게 되는 바와 같이, 용어 "항체"에 의해 포괄되는 면역학적 결합 시약은 전체(whole) 항체, 이량체성, 삼량체성 및 다량체성 항체를 포함한 모든 항체 및 이의 항원 결합 단편; 이중특이적 항체; 키메라 항체; 재조합 및 조작된 항체; 및 이의 단편을 포함하거나 확장된다. 그러므로, 용어 "항체"는 항원 결합 영역을 갖는 임의의 항체-유사 분자를 지칭하는 데 사용되며, 이 용어는 항원 결합 도메인을 포함하는 항체 단편, 예컨대 Fab', Fab, F(ab')2, 단일 도메인 항체(DAB), T와 Abs 이량체, Fv, scFv(단일 사슬 Fv), dsFv, ds-scFv, Fd, 선형 항체, 나노바디, 미니바디, 디아바디, 이중특이적 항체 단편, 비바디(bibody), 트리바디(tribody)(scFv-Fab 융합, 각각 이중특이적 또는 삼중특이적); sc-디아바디; 카파(람다) 바디(scFv-CL 융합); BiTE(이중특이적 T-세포 인게이저, T 세포를 유인하기 위한 scFv-scFv 탠덤); DVD-Ig(이중 가변 도메인 항체, 이중특이적 형식); SIP(작은 면역단백질, 미니바디의 한 종류); SMIP("작은 모듈형 면역약학제(small modular immunopharmaceutical)" scFv-Fc 이량체; DART(ds-안정화된 디아바디 "이중 친화도 재표적화"); 작은 항체 모방체를 포함한다.
일부 실시형태에서, 방법은 대상체에게 치료적 유효량의 관문 차단제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 관문 저해제는 PD-1(니볼루맙(BMS-936558 또는 MDX1106), CT-011, MK-3475), PD-L1(MDX-1105(BMS-936559), MPDL3280A, MSB0010718C), PD-L2(rHIgM12B7), CTLA-4(이필리무맙(MDX-010), 트레멜리무맙(CP-675,206)), IDO, B7-H3(MGA271), B7-H4, TIM3, LAG-3(BMS-986016)을 차단하는 항체를 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 관문 차단제는 PD-1 저해제, PD-L1 저해제, PD-L2 저해제 또는 CTLA-4 저해제를 포함한다.
암은 혈액암, 림프종, 결장직장암, 결장암, 폐암, a 두경부암, 난소암, 전립선암, 고환암, 신장암, 피부암, 자궁경부암, 췌장암 및 유방암으로부터 선택될 수 있으나 이로 제한되지 않는다. 일 양태에서, 암은 고형 종양을 포함한다. 또 다른 양태에서, 암은 급성 골수성 백혈병, 골수이형성 증후군, 만성 골수성 백혈병, 급성 림프아구성 백혈병, 골수섬유증, 다발성 골수종으로부터 선택된다. 또 다른 양태에서, 암은 백혈병, 림프종, 육종, 암종으로부터 선택되고, 골수, 뇌, 폐, 유방, 췌장, 간, 두경부, 피부, 생식기, 전립선, 결장, 간, 신장, 복강내, 뼈, 관절 및 눈으로부터 선택된다.
암 전이 및/또는 재발을 저해하고/하거나, 저하시키고/시키거나 예방하는 개시된 방법은 아베막시클립(Abemaciclib), 아비라테론 아세테이트, 아비트렉세이트(Abitrexate)(메토트렉세이트), 아브락산(Abraxane)(파클리탁셀 알부민-안정화 나노입자 제형), ABVD, ABVE, ABVE-PC, AC, AC-T, 아드세트리스(Adcetris)(브렌툭시맙 베도틴(Brentuximab Vedotin)), ADE, 아도-트라스투주맙 엠탄신, 아드리아마니신(Adriamycin)(독소루비신 하이드로클로라이드), 아파티닙 디말레에이트, 아피니토르(Afinitor)(에베롤리무스), 아킨제오(Akynzeo)(네투피탄트 및 팔로노세트론 하이드로클로라이드), 알다라(Aldara)(이미퀴모드(Imiquimod)), 알데스류킨(Aldesleukin), 알레센사(Alecensa)(알렉티닙(Alectinib)), 알렉티닙, 알렘투주맙(Alemtuzumab), 알림타(Alimta)(페메트렉세드 디소듐), 알리코파(Aliqopa)(코판리십 하이드로클로라이드), 주사용 알케란(멜팔란 하이드로클로라이드), 알케란 정제(멜팔란), 알록시(Aloxi)(팔로노세트론 하이드로클로라이드), 알룬브리그(Alunbrig)(브리가티닙(Brigatinib)), 암보클로린(Ambochlorin)(클로람부실), 암보클로린 클로람부실), 아미포스틴, 아미노레뷸린산, 아나스트로졸(Anastrozole), 아프레피탄트, 아레디아(Aredia)(파미드로네이트 디소듐), 아리미덱스(Arimidex)(아나스트로졸(Anastrozole)), 아로마신(Aromasin)(엑세메스탄), 아라논(Arranon)(넬라라빈(Nelarabine)), 아르센 트리옥사이드, 아르제라(Arzerra)(오파투무맙(Ofatumumab)), 아스파라기나제 에르위니아 크리산테미, 아테졸리주맙, 아바스틴(Avastin)(베바시주맙), 아벨루맙, 악시티닙, 아자시티딘, 바벤시오(Bavencio)(아벨루맙), BEACOPP, 베세눔(Becenum)(카르무스틴), 벨레오닥(Beleodaq)(벨리노스타트(Belinostat)), 벨리노스타트, 벤다무스틴 하이드로클로라이드, BEP, 베스폰사(Besponsa)(이노투주맙 오조가미신), 베바시주맙, 벡사로텐, 벡사르(Bexxar)(토시투모맙 및 요오드 I 131 토시투모맙), 비칼루타미드(Bicalutamide), BiCNU(카르무스틴), 블레오마이신(Bleomycin), 블리나투모맙(Blinatumomab), 블린시토(Blincyto)(블리나투모맙), 보르테조밉(Bortezomib), 보술리프(Bosulif)(보수티닙(Bosutinib)), 보수티닙, 브렌툭시맙 베도틴(Brentuximab Vedotin), 브리가티닙(Brigatinib), 부멜(BuMel), 부술판, 부술펙스(Busulfex)(부술판), 카바지탁셀, 카보메틱스(Cabometyx)(카보잔티닙-S-말레이트), 카보잔티닙-S-말레이트, CAF, 캄파스(Campath)(알렘투주맙), 캄토사르(Camptosar)(이리노테칸 하이드로클로라이드), 카페시타빈, CAPOX, 카락(Carac)(플루오로우라실-국소), 카르보플라틴, 카르보플라틴-탁솔, 카르필조밉, 카르무브리스(Carmubris)(카르무스틴), 카르무스틴, 카르무스틴 임플란트, 카소덱스(Casodex)(비칼루타미드), CEM, 세리티닙, 세루비딘(Cerubidine)(다우노루비신 하이드로클로라이드, 세르바릭스(Cervarix)(재조합 HPV 2가 백신), 세툭시맙, CEV, 클로람부실, 클로람부실-프레드니손, CHOP, 시스플라틴, 클라드리빈, 클라펜(Clafen)(사이클로포스파미드), 클로파라빈(Clofarabine), 클로파렉스(Clofarex)(클로파라빈), 클로라르(Clolar)(클로파라빈), CMF, 코비메티닙(Cobimetinib), 코메트릭(Cometriq)(카보잔티닙-S-말레이트), 코판리십 하이드로클로라이드, COPDAC, COPP, COPP-ABV, 코스메겐(Cosmegen)(닥티노마이신, 코텔릭(Cotellic)(코비메티닙(Cobimetinib)), 크리조티닙, CVP, 사이클로포스파미드, 사이포스(Cyfos)(이포스파미드), 사이람자(Cyramza)(라무시루맙), 시타라빈, 시타라빈 리포좀, 시토사르-U(시타라빈), 시톡산(Cytoxan)(사이클로포스파미드), 다브라페닙, 다카바진, 다코겐(Dacogen)(데시타빈), 닥티노마이신, 다라투무맙, 다르잘렉스(Darzalex)(다라투무맙), 다사티닙(Dasatinib), 다우노루비신 하이드로클로라이드, 다우노루비신 하이드로클로라이드 및 시타라빈 리포좀, 데시타빈, 데피브로타이드 소듐, 데피텔리오(데피브로타이드 소듐), 데가렐릭스, 데닐류킨 디프티톡스, 데노수맙, 데포시트(DepoCyt)(시타라빈 리포좀), 덱사메타손, 덱스라족산 하이드로클로라이드, 디누툭시맙, 도세탁셀, 독실(독소루비신 하이드로클로라이드 리포좀), 독소루비신 하이드로클로라이드, 독소루비신 하이드로클로라이드 리포좀, Dox-SL(독소루비신 하이드로클로라이드 리포좀), DTIC-Dome(다카바진), 두르발루맙, 에푸덱스(플루오로우라실-국소), 엘리텍(Elitek)(라스부리카세), 엘렌스(Ellence)(에피루비신 하이드로클로라이드), 엘로투주맙, 엘록사틴(Eloxatin)(옥살리플라틴), 엘트롬보파그 올라민, 에멘드(아프레피탄트), 엠플리시티(엘로투주맙), 에나시데닙 메실레이트, 엔잘루타미드, 에피루비신 하이드로클로라이드, EPOCH, 에르비툭스(세툭시맙), 에리불린 메실레이트, 에리벳지(비스모데깁), 에를로티닙 하이드로클로라이드, 에르위나제(아스파라기나제 에르위니아 크리산테미), 에티올(아미포스틴), 에토포포스(에토포사이드 포스페이트), 에토포사이드, 에토포사이드 포스페이트, 에바세트(독소루비신 하이드로클로라이드 리포좀), 에베롤리무스, 에비스타(랄록시펜 하이드로클로라이드), 에보멜라(멜팔란 하이드로클로라이드), 엑세메스탄, 5-FU(플루오로우라실 주사액), 5-FU(플루오로우라실-국소), 파레스톤(토레미펜), 파리닥(Farydak)(파노비노스타트(Panobinostat)), 파슬로덱스(풀베스트란트), FEC, 페마라(레트로졸), 필그라스팀, 플루다라(플루다라빈 포스페이트), 플루다라빈 포스페이트, 플루오로플렉스(플루오로우라실-국소), 플루오로우라실 주사액, 플루오로우라실-국소, 플루타미드, 폴렉스(메토트렉세이트), 폴렉스 PFS(메토트렉세이트), 폴피리, 폴피리-베바시주맙, 폴피리-세툭시맙, 폴피리녹스, 폴폭스, 폴로틴(프랄라트렉세이트), FU-LV, 풀베스트란트, 가다실(재조합 HPV 4가 백신), 가다실 9(재조합 HPV 9가 백신), 가지바(Gazyva)(오비누투주맙), 게피티닙, 겜시타빈 하이드로클로라이드, 겜시타빈-시스플라틴, 겜시타빈-옥살리플라틴, 겜투주맙 오조가미신, 겜자(겜시타빈 하이드로클로라이드), 길로트리프(아파티닙 디말레에이트), 글리벡(이마티닙 메실레이트), 글리아델(카르무스틴 임플란트), 글리아델 웨이퍼(카르무스틴 임플란트), 글루카르피다제(Glucarpidase), 고세렐린 아세테이트, 할라벤(에리불린 메실레이트), 헤만게올(Hemangeol)(프로프라놀롤 하이드로클로라이드), 허셉틴(트라스투주맙), HPV 2가 백신, 재조합, HPV 9가 백신, 재조합, HPV 4가 백신, 재조합, 히캄틴(Hycamtin)(토포테칸 하이드로클로라이드), 하이드레아(Hydrea)(하이드록시우레아), 하이드록시우레아, 하이퍼-CVAD, 이브란스(Ibrance)(팔보시클립), 이브리투모맙 티욱세탄, 이브루티닙, ICE, 이클루시그(Iclusig)(포나티닙 하이드로클로라이드), 이다마이신(이다루비신 하이드로클로라이드), 이다루비신 하이드로클로라이드, 이델랄리십(Idelalisib), 이드히파(Idhifa)(에나시데닙 메실레이트), 이펙스(Ifex)(이포스파미드), 이포스파미드, 이포스파미듐(Ifosfamidum)(이포스파미드), IL-2(알데스류킨), 이마티닙 메실레이트, 임브루비카(Imbruvica)(이브루티닙), 임핀지(Imfinzi)(두르발루맙), 이미퀴모드(Imiquimod), 이믈리긱(Imlygic)(탈리모겐 라헤르파렙벡), 인리타(Inlyta)(악시티닙), 이노투주맙 오조가미신, 인터페론 알파-2b, 재조합, 인터류킨-2(알데스류킨), 인트론 A(재조합 인터페론 알파-2b), 요오드 I 131 토시투모맙 및 토시투모맙, 이필리무맙, 이레싸(Iressa)(게피티닙), 이리노테칸 하이드로클로라이드, 이리노테칸 하이드로클로라이드 리포좀, 이스토닥스(Istodax)(로미뎁신(Romidepsin)), 익사베필론(Ixabepilone), 익사조밉 시트레이트, 익셈프라(Ixempra)(익사베필론), 자카피(Jakafi)(룩솔리티닙 포스페이트), JEB, 제브타나(Jevtana)(카바지탁셀(Cabazitaxel)), 카드실라(Kadcyla)(아도-트라스투주맙 엠탄신), 케옥시펜(Keoxifene)(랄록시펜 하이드로클로라이드), 케피반스(Kepivance)(팔리페르민(Palifermin)), 케이트루다(Keytruda)(펨브롤리주맙), 키스칼리(Kisqali)(리보시클립), 킴리아(Kymriah)(티사겐렉류셀(Tisagenlecleucel)), 키프롤리스(Kyprolis)(카르필조밉), 란레오타이드 아세테이트, 라파티닙 디토실레이트, 라르트루보(Lartruvo)(올라라투맙), 레날리도마이드, 렌바티닙 메실레이트, 렌비마(Lenvima)(렌바티닙 메실레이트), 레트로졸, 류코보린 칼슘, 류케란(클로람부실), 류프롤라이드 아세테이트, 류스타틴(클라드리빈), 레불란(Levulan)(아미노레뷸린산), 린폴리진(Linfolizin)(클로람부실), 리포독스(LipoDox)(독소루비신 하이드로클로라이드 리포좀), 로무스틴, 론서프(Lonsurf)(트리플루리딘 및 티피라실 하이드로클로라이드), 류프론(류프롤라이드 아세테이트), 류프론 데폿(류프롤라이드 아세테이트), 류프론 데폿-Ped(류프롤라이드 아세테이트), 린파르자(Lynparza)(올라파립(Olaparib)), 마르퀴보(Marqibo)(빈크리스틴 설페이트 리포좀), 마툴란(Matulane)(프로카바진 하이드로클로라이드), 메클로레타민 하이드로클로라이드, 메게스트롤 아세테이트, 메키니스트(Mekinist)(트라메티닙), 멜팔란, 멜팔란 하이드로클로라이드, 머캅토퓨린, 메스나(Mesna), 메스넥스(Mesnex)(메스나), 메타졸라스톤(테모졸로마이드), 메토트렉세이트, 메토트렉세이트 LPF(메토트렉세이트), 메틸날트렉손 브로마이드, 멕세이트(메토트렉세이트), 멕세이트-AQ(메토트렉세이트), 미도스타우린, 미토마이신 C, 미톡산트론 하이드로클로라이드, 미토지트렉스(Mitozytrex)(미토마이신 C), MOPP, 모조빌(Mozobil)(플레릭사포르(Plerixafor)), 뮤스타르겐(Mustargen)(메클로레타민 하이드로클로라이드), 뮤타마이신(미토마이신 C), 밀레란(Myleran)(부술판), 밀로사르(Mylosar)(아자시티딘), 밀로타르그(Mylotarg)(겜투주맙 오조가미신), 나노입자 파클리탁셀(파클리탁셀 알부민-안정화된 나노입자 제형), 나벨빈(Navelbine)(비노렐빈 타르트레이트), 네시투무맙, 넬라라빈(Nelarabine), 네오사르(Neosar)(사이클로포스파미드), 네라티닙 말레에이트, 네르링스(Nerlynx)(네라티닙 말레에이트), 네투피탄트 및 팔로노세트론 하이드로클로라이드, 뉼라스타(Neulasta)(페그필그라스팀), 뉴포겐(Neupogen)(필그라스팀), 넥사바르(Nexavar)(소라페닙 토실레이트), 닐란드론(닐루타마이드), 닐로티닙, 닐루타마이드, 닌라로(Ninlaro)(익사조밉 시트레이트), 니라파립 토실레이트 모노하이드레이트, 니볼루맙, 놀바덱스(Nolvadex)(타목시펜 시트레이트), 엔플레이트(Nplate)(로미플로스팀), 오비누투주맙, 오돔조(Odomzo)(소니데깁), 오에파(OEPA), 오파투무맙(Ofatumumab), 옵프(OFF), 올라파립(Olaparib), 올라라투맙, 오마세탁신 메페숙시네이트, 온카스파르(Oncaspar)(페가스파르가제(Pegaspargase)), 온단세트론 하이드로클로라이드, 오니비데(Onivyde)(이리노테칸 하이드로클로라이드 리포좀), 온탁(Ontak)(데닐류킨 디프티톡스), 옵디보(Opdivo)(니볼루맙), 옵파(OPPA), 오시메르티닙, 옥살리플라틴, 파클리탁셀, 파클리탁셀 알부민-안정화된 나노입자 제형, PAD, 팔보시클립, 팔리페르민(Palifermin), 팔로노세트론 하이드로클로라이드, 팔로노세트론 하이드로클로라이드 및 네투피탄트, 파미드로네이트 디소듐, 파니투무맙, 파노비노스타트(Panobinostat), 파라플라트(Paraplat)(카르보플라틴), 파라플라틴(카르보플라틴), 파조파닙 하이드로클로라이드, PCV, PEB, 페가스파르가제(Pegaspargase), 페그필그라스팀, 페그인터페론 알파-2b, PEG-인트론(페그인터페론 알파-2b), 펨브롤리주맙, 페메트렉세드 디소듐, 페르제타(Perjeta)(페르투주맙), 페르투주맙, 플라티놀(Platinol)(시스플라틴), 플라티놀-AQ(시스플라틴), 플레릭사포르(Plerixafor), 포말리도마이드, 포말리스트(Pomalyst)(포말리도마이드), 포나티닙 하이드로클로라이드, 포르트라짜(Portrazza)(네시투무맙(Necitumumab)), 프랄라트렉세이트, 프레드니손, 프로카바진 하이드로클로라이드, 프로류킨(Proleukin)(알데스류킨), 프롤리아(Prolia)(데노수맙), 프로막타(Promacta)(엘트롬보파그 올라민), 프로프라놀롤 하이드로클로라이드, 프로벤제(Provenge)(시풀류셀-T), 퓨리네톨(Purinethol)(머캅토퓨린), 퓨릭산(Purixan)(머캅토퓨린), 라듐 223 디클로라이드, 랄록시펜 하이드로클로라이드, 라무시루맙, 라스부리카세, R-CHOP, R-CVP, 재조합 인간 유두종바이러스(HPV) 2가 백신, 재조합 인간 유두종바이러스(HPV) 9가 백신, 재조합 인간 유두종바이러스(HPV) 4가 백신, 재조합 인터페론 알파-2b, 레고라페닙, 렐리스토르(Relistor)(메틸날트렉손 브로마이드), R-EPOCH, 레블리미드(Revlimid)(레날리도마이드), 류마트렉스(Rheumatrex)(메토트렉세이트), 리보시클립, R-ICE, 리툭산(리툭시맙), 리툭산 하이셀라(Hycela)(리툭시맙 및 히알루로니다제 인간), 리툭시맙, 리툭시맙 및 히알루로니다제 인간, 롤라피탄트 하이드로클로라이드, 로미뎁신, 로미플로스팀, 루비도마이신(다우노루비신 하이드로클로라이드), 루브라카(Rubraca)(루카파립 캄실레이트), 루카파립 캄실레이트, 룩솔리티닙 포스페이트, 리답트(Rydapt)(미도스타우린), 스클레로솔 흉강내 에어로졸(탈크), 실툭시맙, 시풀류셀-T, 소마툴린 데폿(란레오타이드 아세테이트), 소니데깁, 소라페닙 토실레이트, 스프리셀(Sprycel)(다사티닙(Dasatinib)), STANFORD V, 멸균 탈크 분말(탈크), 스테리탈크(탈크), 스티바르가(Stivarga)(레고라페닙), 수니티닙 말레이트, 수텐트(Sutent)(수니티닙 말레이트), 실라트론(Sylatron)(페그인터페론 알파-2b), 실반트(Sylvant)(실툭시맙), 신리보(Synribo)(오마세탁신 메페숙시네이트), 타블로이드(Tabloid)(티오구아닌), TAC, 타핀라(Tafinlar)(다브라페닙), 타그리쏘(Tagrisso)(오시메르티닙), 탈크, 탈리모겐 라헤르파렙벡, 타목시펜 시트레이트, 타라빈 PFS(시타라빈), 타르세바(Tarceva)(에를로티닙 하이드로클로라이드), 타르그레틴(Targretin)(벡사로텐), 타시그나(Tasigna)(닐로티닙), 탁솔(파클리탁셀), 탁소테레(Taxotere)(도세탁셀), 테센트릭(Tecentriq), (아테졸리주맙), 테모다르(Temodar)(테모졸로마이드), 테모졸로마이드, 템시롤리무스, 탈리도마이드, 탈로미드(Thalomid)(탈리도마이드), 티오구아닌, 티오테파, 티사겐렉류셀(Tisagenlecleucel), 톨락(Tolak)(플루오로우라실-국소), 토포테칸 하이드로클로라이드, 토레미펜, 토리셀(템시롤리무스), 토시투모맙 및 요오드 I 131 토시투모맙, 토텍트(덱스라족산 하이드로클로라이드), TPF, 트라벡테딘, 트라메티닙, 트라스투주맙, 트레안다(Treanda)(벤다무스틴 하이드로클로라이드), 트리플루리딘 및 티피라실 하이드로클로라이드, 트리세녹스(Trisenox)(아르센 트리옥사이드), 티케릅(Tykerb)(라파티닙 디토실레이트), 우니툭신(Unituxin)(디누툭시맙), 우리딘 트리아세테이트, VAC, 반데타닙, VAMP, 바루비(Varubi)(롤라피탄트 하이드로클로라이드), 벡티빅스(Vectibix)(파니투무맙), VeIP, 벨반(Velban)(빈블라스틴 설페이트), 벨카드(Velcade)(보르테조밉), 벨사르(Velsar)(빈블라스틴 설페이트), 베무라페닙(Vemurafenib), 벤클렉스타(Venclexta)(베네토클락스(Venetoclax)), 베네토클락스(Venetoclax), 베르제니오(Verzenio)(아베마시클립), 비아두르(Viadur)(류프롤라이드 아세테이트), 비다자(Vidaza)(아자시티딘), 빈블라스틴 설페이트, 빈카사르 PFS(빈크리스틴 설페이트), 빈크리스틴 설페이트, 빈크리스틴 설페이트 리포좀, 비노렐빈 타르트레이트, VIP, 비스모데깁, 비스토가르드(Vistogard)(우리딘 트리아세테이트), 보락사제(Voraxaze)(글루카르피다제), 보리노스타트(Vorinostat), 보트리엔트(Votrient)(파조파닙 하이드로클로라이드), 빅세오스(Vyxeos)(다우노루비신 하이드로클로라이드 및 시타라빈 리포좀), 웰코보린(Wellcovorin)(류코보린 칼슘), 잘코리(Xalkori)(크리조티닙), 젤로다(Xeloda)(카페시타빈), XELIRI, XELOX, 엑스게바(Xgeva)(데노수맙), 조피고(Xofigo)(라듐 223 디클로라이드), 엑스탄디(Xtandi)(엔잘루타미드), 예르보이(Yervoy)(이필리무맙), 욘델리스(Yondelis)(트라벡테딘), 잘트랍(Zaltrap)(지브-아플리베르셉트(Ziv-Aflibercept)), 자륵시오(Zarxio)(필그라스팀), 제줄라(Zejula)(니라파립 토실레이트 모노하이드레이트), 젤보라프(Zelboraf)(베무라페닙(Vemurafenib)), 제발린(Zevalin)(이브리투모맙 티욱세탄), 지네카드(Zinecard)(덱스라족산 하이드로클로라이드), 지브-아플리베르셉트(Ziv-Aflibercept), 조프란(온단세트론 하이드로클로라이드), 졸라덱스(Zoladex)(고세렐린 아세테이트), 졸레드론산, 졸린자(Zolinza)(보리노스타트(Vorinostat)), 조메타(졸레드론산), 지델리그(Zydelig)(이델랄리십), 지카디아(Zykadia)(세리티닙) 및/또는 지티가(Zytiga)(아비라테론 아세테이트)를 포함하지만 이로 제한되지 않는 당업계에 알려진 임의의 항암제의 투여를 포함할 수 있는 것으로 의도된다. PD1/PDL1 차단 저해제(예를 들어 람브롤리주맙, 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 피딜리주맙, BMS-936559, 아테졸리주맙, 두르발루맙 또는 아벨루맙)인 화학치료제가 또한 본원에서 고려된다. 암 전이 및/또는 재발을 저해하고/하거나, 저하시키고/시키거나 예방하기 위한 개시된 조성물 및/또는 조작된 NK 세포 집단의 개시된 사용이 상기 나열된 제제를 포함하지만 이로 제한되지 않는 당업계에 알려진 임의의 항암제의 사용과 조합된 사용을 포함할 수 있는 것이 또한 의도된다.
일부 양태에서, 본원에 개시된 모든 조작된 NK 세포 및 모든 세포의 용도는 바이러스 감염에 의해 야기되는 감염성 질환의 치료를 위한 것이고, 상기 바이러스 감염은 단순포진 바이러스-1, 단순포진 바이러스-2, 바리셀라-조스터 바이러스, 엡스테인-바 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 인간 헤르페스 바이러스-6, 바리올라 바이러스, 수포성 구내염, A형 간염 바이러스, B형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스, D형 간염 바이러스, E형 바이러스, 리노바이러스, 코로나바이러스, 인플루엔자 바이러스 A, 인플루엔자 바이러스 B, 홍역 바이러스, 폴리오마바이러스, 인간 파필로마바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스, 아데노바이러스, 콕사키 바이러스, 뎅기 바이러스, 볼거리 바이러스, 폴리오바이러스, 광견병 바이러스, 라우스 육종 바이러스, 레오바이러스, 황열 바이러스, 지카 바이러스, 에볼라 바이러스, 마버그 바이러스, 라싸열 바이러스, 동부 말 뇌염 바이러스, 일본 뇌염 바이러스, 세인트 루이스 뇌염 바이러스, 머레이 밸리 열 바이러스, 웨스트 나일 바이러스, 리프트 밸리 열 바이러스, 로타바이러스 A, 로타바이러스 B, 로타바이러스 C, 신드비스 바이러스, 유인원 면역결핍 바이러스, 인간 T-세포 백혈병 바이러스 유형-1, 한타바이러스, 루벨라 바이러스, 유인원 면역결핍 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스 유형-1, 또는 인간 면역결핍 바이러스 유형-2의 감염을 포함한다.
대안적으로, 임의의 치료 방법 또는 치료 용도에서, 추가적인 치료제는 5-치환된 2-데옥시우리딘 유사체, 뉴클레오사이드 유사체, (비(non)뉴클레오사이드) 피로포스페이트 유사체, 뉴클레오사이드 역전사효소(RT) 저해제(NRTI), 비뉴클레오사이드 역전사효소 저해제(NNRTI), 프로테아제 저해제(PI), 및 인테그라제 저해제, 유입 저해제, 및 비사이클릭(acyclic) 구아노신 유사체, 비사이클릭 뉴클레오사이드 포스포네이트(ANP) 유사체, C형 간염 바이러스(HCV) NS5A 및 NS5B 저해제, 및 인플루엔자 바이러스 저해제, 면역자극제, 인터페론, 올리고뉴클레오타이드, 및 항유사분열 저해제로부터 선택되지만 이로 제한되지는 않는 항바이러스제일 수 있다. 항바이러스제의 비제한적인 예는 아시클로비르, 팜시클로비르, 발라시클로비르, 펜시클로비르, 간시클로비르, 리토나비르, 로피나비르, 사퀴나비르 등; 시메티딘; 라니티딘; 캅토프릴; 메트포르민; 부프로피온; 펙소페나딘; 옥스카르바제핀; 레베테라세탐; 트라마돌; 또는 임의의 이들의 이성질체, 호변이성질체, 유사체, 다형체, 용매화물, 유도체, 또는 약학적으로 허용 가능한 염이다.
일부 양태에서, 본원에 개시된 조작된 NK 세포 및 모든 세포의 용도는 박테리아 감염에 의해 야기되는 감염성 질환의 치료를 위한 것이고, 상기 박테리아 감염은 미코박테리움 튜베르큘로시스(Mycobaterium tuberculosis), 미코박테리움 보비스(Mycobaterium bovis), 미코박테리움 보비스 균주 BCG, BCG 아계, 미코박테리움 아비움(Mycobaterium avium), 미코박테리움 인트라셀룰라(Mycobaterium intracellular), 미코박테리움 아프리카눔(Mycobaterium africanum), 미코박테리움 칸사시(Mycobaterium kansasii), 미코박테리움 마리눔(Mycobaterium marinum), 미코박테리움 울세란스(Mycobaterium ulcerans), 미코박테리움 아비움 아종 파라튜베르큘로시스, 노카르디아 아스테로이데스(Nocardia asteroides), 다른 노카르디아 종, 레지오넬라 뉴모필라(Legionella pneumophila), 다른 레지오넬라 종, 아세티노박테르 바우마니(Acetinobacter baumanii), 살모넬라 타이피(Salmonella typhi), 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica), 다른 살모넬라 종, 시겔라 보이디(Shigella boydii), 시겔라 디센테리아에(Shigella dysenteriae), 시겔라 소네이(Shigella sonnei), 시겔라 플렉스네리(Shigella flexneri), 다른 시겔라 종, 예르시니아 페스티스(Yersinia pestis), 파스튜렐라 해몰리티카(Pasteurella haemolytica), 파스튜렐라 멀토시다(Pasteurella multocida), 다른 파스튜렐라 종, 악티노바실루스 플레우로뉴모니아에(Actinobacillus pleuropneumoniae), 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes), 리스테리아 이바노비(Listeria ivanovii), 브루셀라 아보르투스(Brucella abortus), 다른 브루셀라 종, 카우드리아 루미난티움(Cowdria ruminantium), 보렐리아 부르그도르페리(Borrelia burgdorferi), 보르데텔라 아비움(Bordetella avium), 보르데텔라 페르투시스(Bordetella pertussis), 보르데텔라 브론키셉티카(Bordetella bronchiseptica), 보르데텔라 트레마툼(Bordetella trematum), 보르데텔라 힌지(Bordetella hinzii), 보르데텔라 프테리(Bordetella pteri), 보르데텔라 파라페르투시스(Bordetella parapertussis), 보르데텔라 안소르파이(Bordetella ansorpii), 다른 보르데텔라 종, 부르크홀데리아 말레이(Burkholderia mallei), 부르크홀데리아 슈도말레이(Burkholderia psuedomallei), 부르크홀데리아 세파시안(Burkholderia cepacian), 클라미디아 뉴모니아에(Chlamydia pneumoniae), 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis), 클라미디아 시타시(Chlamydia psittaci), 콕시엘라 부르네티(Coxiella burnetii), 리켓시알 종(Rickettsial species), 에를리히아 종(Ehrlichia species), 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스타필로코쿠스 에피데르미디스(Staphylococcus epidermidis), 스트렙토코쿠스 뉴모니아에(Streptococcus pneumoniae), 스트렙토코쿠스 표진스(Streptococcus pyogenes), 스트렙토코쿠스 아갈락티아에(Streptococcus agalactiae), 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 비브라오 콜레라에(Vibrio cholerae), 캄필로박테르 종(Campylobacter species), 네이세리아 메닌기티디스(Neiserria meningitidis), 네이세리아 고노레아(Neiserria gonorrhea), 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 다른 슈도모나스 종, 해모필루스 인플루엔자에(Haemophilus influenzae), 해모필루스 듀크레이(Haemophilus ducreyi), 다른 해모필루스 종, 클로스트리듐 테타니(Clostridium tetani), 클로스트리듐 디피실(Clostridium difficile), 다른 클로스트리듐 종, 예르시니아 엔테롤리티카, 및 다른 예르시니아 종, 및 마이코플라즈마 종(Mycoplasma species)의 감염을 포함한다.
일부 양태에서, 본원에 개시된 조작된 NK 세포 및 모든 세포의 용도는 진균류 감염에 의해 야기되는 감염성 질환의 치료를 위한 것이고, 상기 진균류 감염은 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 크립토코쿠스 네오프로만스(Cryptococcus neoformans), 히스토플라마 캅술라툼(Histoplama capsulatum), 아스페르길루스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus), 콕시디오데스 이미티스(Coccidiodes immitis), 파라콕시디오데스 브라실리엔시스(Paracoccidiodes brasiliensis), 블라스토마이세스 데르미티디스(Blastomyces dermitidis), 뉴모시스티스 카리니(Pneumocystis carinii), 페니실리움 마르네피(Penicillium marneffi), 또는 알테나리아 알테르네이트(Alternaria alternate)의 감염을 포함한다.
일부 양태에서, 본원에 개시된 조작된 NK 세포 및 모든 세포의 용도는 기생충 감염에 의해 야기되는 감염성 질환의 치료를 위한 것이고, 상기 기생충 감염은 톡소플라스마 곤디(Toxoplasma gondii), 플라스모듐 팔시파룸(Plasmodium falciparum), 플라스모듐 비박스(Plasmodium vivax), 플라스모듐 말라리아에(Plasmodium malariae), 다른 플라스모듐 종, 엔타모에바 히스톨리티카(Entamoeba histolytica), 나에글레리아 포울레리(Naegleria fowleri), 리노스포리듐 시베리(Rhinosporidium seeberi), 지아르디아 람블리아(Giardia lamblia), 엔테로비우스 베르미큘라리스(Enterobius vermicularis), 엔테로비우스 그레고리(Enterobius gregorii), 아스카리스 룸브리코이데스(Ascaris lumbricoides), 안실로스토마 듀오데날레(Ancylostoma duodenale), 네카토르 아메리카누스(Necator americanus), 크립토스포리듐 spp.(Cryptosporidium spp.), 트리파노소마 브루세이(Trypanosoma brucei), 트리파노소마 크루지(Trypanosoma cruzi), 레이쉬마니아 메이저(Leishmania major), 다른 레이쉬마니아 종, 디필로보트리움 라툼(Diphyllobothrium latum), 히메놀레피스 나나(Hymenolepis nana), 히메놀레피스 디미뉴타(Hymenolepis diminuta), 에키노코쿠스 그라뉼로수스(Echinococcus granulosus), 에키노코쿠스 멀티로큘라리스(Echinococcus multilocularis), 에키노코쿠스 보겔리(Echinococcus vogeli), 에키노코쿠스 올리가르트루스(Echinococcus oligarthrus), 디필로보트리움 라툼(Diphyllobothrium latum), 클로노르키스 시넨시스(Clonorchis sinensis); 클로노르키스 비베리니(Clonorchis viverrini), 파스시올라 헤파티카(Fasciola hepatica), 파스시올라 기간티카(Fasciola gigantica), 디크로코엘리움 덴드리티쿰(Dicrocoelium dendriticum), 파스시올롭시스 부스키(Fasciolopsis buski), 메타고니무스 요코가와이(Metagonimus yokogawai), 오피스토르키스 비베리니(Opisthorchis viverrini), 오피스토르키스 펠리네우스(Opisthorchis felineus), 클로노르키스 시넨시스(Clonorchis sinensis), 트리코모나스 바지날리스(Trichomonas vaginalis), 아칸타모에바 종(Acanthamoeba species), 스키스토소마 인터칼라툼(Schistosoma intercalatum), 스키스토소마 해마토비움(Schistosoma haematobium), 스키스토소마 자포니쿰(Schistosoma japonicum), 스키스토소마 만소니(Schistosoma mansoni), 다른 스키노소마 종, 트리코빌하르지아 리젠티(Trichobilharzia regenti), 트리키넬라 스피랄리스(Trichinella spiralis), 트리키넬라 브리토비(Trichinella britovi), 트리키넬라 넬소니(Trichinella nelsoni), 트리키넬라 나티바(Trichinella nativa), 또는 엔타모에바 히스톨리티카(Entamoeba histolytica)의 감염을 포함한다.
대안적으로, 임의의 방법 또는 용도에서, 부가적인 치료제는 페니실린, 테트라사이클린, 세팔로스포린, 린코마이신, 마크롤리드, 설폰아미드, 글리코펩타이드, 아미노글리코시드 및 카르바페넴으로부터 선택되지만 이로 제한되지는 않는 항생제일 수 있다. 항균제의 비제한적인 예는 아목시실린, 독시사이클린, 세팔렉신, 시프로플록사신, 클린다마이신, 메트로니다졸, 아지트로마이신, 설파메톡사졸 및 트리메토프림, 클라불라네이트, 및 레보플록사신이다.
일부 실시형태에서, 임의의 본원에 개시된 NK 세포를 재활성화시키고/시키거나, NK 세포 소진을 역전시키고/시키거나 NK 세포 기능을 증강시키는 방법 및/또는 임의의 본원에 개시된 암, 전이 및/또는 감염성 질환을 치료하고/하거나, 감소시키고/시키거나, 저해하고/하거나, 저하시키고/저하시키거나, 개선하고/하거나 예방하는 방법에서 투여되거나 사용되는 조작된 NK 세포는 약학적으로 허용 가능한 담체 및 약학적으로 허용 가능한 부형제에서 제형화된다.
암, 전이성 병태, 또는 감염의 시기는 흔히 예측할 수 없기 때문에, 암, 전이성 병태, 또는 감염을 치료하고/하거나, 예방하고/하거나, 저하시키고/저하시키거나, 저해하는 개시된 방법, 또는 암, 전이성 병태, 또는 감염을 치료하고/하거나, 예방하고/하거나, 저하시키고/저하시키거나, 저해하기 위한 임의의 개시된 조성물 또는 조합의 용도는 암, 전이성 병태, 또는 감염의 발병 전에 또는 후에 근육 질환을 치료하고/하거나, 예방하고/하거나, 저해하고/하거나 저하시키기 위해 실시될 수 있다.
NK 세포 소진은 암 또는 특정한 감염성 질환을 갖는 대상체에서 관찰된다. 본원에 개시된 조작된 NK 세포는 증강된 기능(예를 들어 증강된 세포독성 기능 및/또는 IFNγ, TNFα 및/또는 CD107a의 증가된 발현 포함)을 보여준다. 이에, NK 세포를 재활성화시키고/시키거나, NK 세포 소진을 역전시키고/역전시키거나 NK 세포 기능을 증강시키기 위한 방법이 본원에 개시되며, NK 세포의 TIGIT의 발현을 억제시키거나 NK 세포를 TIGIT 저해제와 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 개시된 방법은 더 높은 세포독성 및/또는 ADCC 기능성을 갖는 세포를 제공한다는 추가 이점을 갖는다. 일부 예에서, 조작된 NK 세포는 TIGIT의 발현을 억제시키도록 조작되지 않은 NK 세포의 사이토카인의 세포독성 또는 발현의 약 2배의 사이토카인의 세포독성 또는 발현, 적어도 약 5배의 사이토카인의 세포독성 또는 발현, 또는 적어도 약 10배의 세포독성 또는 발현을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 비조작된 NK 세포는 소진된 NK 세포이다. 일부 실시형태에서, 소진된 NK 세포는 PD-1, TIGIT, LAG3 및 TIM3 중 하나 이상의 수준을 증가시켰다. 일부 실시형태에서, 소진된 NK 세포는 Ki67, IFNγ, TNFα 및/또는 CD107a의 수준을 감소시켰다. 일부 실시형태에서, 비조작된 NK 세포는 대상체(예를 들어 건강한 사람 또는 암 환자)로부터 유래된 1차 NK 세포이다. 일부 실시형태에서, NK 세포는 확장된 NK 세포 또는 비확장된 NK 세포이다. 일부 실시형태에서, 확장된 NK 세포는 시험관내에서 또는 생체외에서 NK 세포 확장 조성물(예를 들어 본원에 개시된 영양 세포, 조작된 PM 입자, 또는 엑소좀)에 노출된다. 조작된 NK 세포는 암 또는 특정한 감염성 질환을 갖는 대상체에게 투여될 수 있다.
일부 양태에서, 대상체에서 암, 전이 또는 감염성 질환을 치료하고/하거나, 감소시키고/시키거나, 저해하고/하거나, 저하시키고/저하시키거나, 개선하고/하거나 예방하는 방법이 본원에 개시되며, 1) NK 세포를 수득하는 단계; 2) NK 세포의 TIGIT의 발현을 억제시키거나 NK 세포를 TIGIT 저해제와 접촉시킴으로써 NK 세포를 재활성화시키고/시키거나, NK 세포의 소진을 역전시키고/시키거나, 및/또는 시험관내에서 또는 생체외에서 NK 세포의 기능을 증강시키는 단계; 및 3) 치료적 유효량의 NK 세포를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 단계 a)의 NK 세포는 소진된 NK 세포이다. 일부 실시형태에서, 소진된 NK 세포는 PD-1, TIGIT, LAG3 및 TIM3 중 하나 이상의 수준을 증가시켰다. 일부 실시형태에서, 소진된 NK 세포는 Ki67, IFNγ, TNFα 및/또는 CD107a의 수준을 감소시켰다. 일부 실시형태에서, 단계 a)의 NK 세포는 대상체(예를 들어 건강한 사람 또는 암 환자)로부터 유래된 1차 NK 세포이다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 NK 세포를 재활성화시키고/시키거나, NK 세포 소진을 역전시키고/시키거나 NK 세포 기능을 증강시키는 방법 및/또는 본원에 개시된 암, 전이 및/또는 감염성 질환을 치료하고/하거나, 감소시키고/시키거나, 저해하고/하거나, 저하시키고/저하시키거나, 개선하고/하거나 예방하는 방법은 대상체에게 TIGIT 저해제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 대상체에게 치료적 유효량의 관문 차단제를 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 관문 저해제는 PD-1(니볼루맙(BMS-936558 또는 MDX1106), CT-011, MK-3475), PD-L1(MDX-1105(BMS-936559), MPDL3280A, MSB0010718C), PD-L2(rHIgM12B7), CTLA-4(이필리무맙(MDX-010), 트레멜리무맙(CP-675,206)), IDO, B7-H3(MGA271), B7-H4, TIM3, LAG-3(BMS-986016)을 차단하는 항체를 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 관문 차단제는 PD-1 저해제, PD-L1 저해제, PD-L2 저해제 또는 CTLA-4 저해제를 포함한다.
실시예
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 개시된 발명이 속하는 기술 분야의 숙련자에 의해 일반적으로 이해된 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 인용된 문헌 및 이들이 인용된 자료는 참조로 구체적으로 포함된다.
당업자는 단지 일상적인 실험을 사용하여 본원에 기재된 본 발명의 특정 실시형태에 대한 많은 등가물을 인식하거나, 확인할 수 있을 것이다. 본 발명은 특정 실시형태 및 구현예를 참조로 기재되었지만, 본 발명의 범위 또는 본 발명의 개념을 벗어나지 않으면서 다양한 변경 및 추가 변형이 이루어질 수 있으며, 등가물이 요소에 대해 대체될 수 있음을 이해할 것이다. 이에 더하여, 본 발명의 본질적인 범위를 벗어나지 않으면서, 본 발명의 교시에 특정 상황 또는 장치를 적응시키기 위해 다수의 변형이 있을 수 있다. 이러한 등가물은 하기 청구범위에 포함되도록 의도된다. 본 발명은 본원에 개시된 특정 실행에 제한되지는 않지만, 본 발명은 첨부된 청구범위 내에 속하는 모든 실행을 포함할 것이다.
실시예 1. TIGIT 차단은 생체외 확장된 NK 세포의 항종양 활성을 향상시킨다.
이 연구에서, TIGIT 신호전달을 생체외 확장된 NK 세포의 맥락에서 검사하고, NK 세포의 항종양 활성에 미치는 TIGIT 차단의 효과를 평가하였다.
방법. NK 세포를 사이토카인으로 밤새 활성화시키거나 생체외에서 PM21-입자로 확장시켰다. TIGIT 발현을 NK 세포 상에서 qRT-PCR 및 유세포측정법으로 결정하였다. 세포독성을 3D에 배양된 A549 and NCI-H1299 세포를 이용하여 동적, 이미지화-기초 검정법(kinetic, imaging-based assay)(Incucyte S3)에 의해 평가하였다. 세포독성을 상이한 시점에서 비처리 대조군에 기초하여 계산하였다. 2명의 다수의 공여자로부터의 결과를 개별 공여자에 대해 이소형을 갖는 NK 세포의 세포독성으로 정규화하고, 항-TIGIT를 갖는 NK 세포의 세포독성과 비교하였다. 독립 t-검정을 사용하여 통계적 유의성을 결정하였다. PVR을 안정하게 발현하는 PVR+ K562 세포를 사용하여 A549 스페로이드-노출된 NK 세포를 재자극시켜 IFNγ, TNFα 및 표면 CD107a를 측정하였다. 더욱이, 활성화 수용체와 저해성 수용체의 세트를 유세포측정법에 의해 분석함으로써 TIGIT 차단 시 NK 세포의 표현형 변화를 검사하였다.
결과: TIGIT 발현에 미치는 NK 세포 확장/활성화의 효과를 평가하였다. 전사체학 분석은 TIGIT가 mRNA와 단백질 수준 둘 다에서 확장된 NK 세포 또는 사이토카인-활성화된 NK 세포 상에서 상향조절됨을 보여주었다. 생체외 확장된 NK 세포를 암세포와 함께 항-TIGIT 항체 또는 각각의 이소형의 존재 하에 공동배양함으로써 NK 세포 세포독성에 미치는 TIGIT 차단의 효과를 검사하였다. TIGIT 차단은 48시간 후에 A549(1.3배, P < 0.0001) 및 NCI-H1299(1.29배, P = 0.0003) 스페로이드에 대해 생체외 확장된 NK 세포의 세포독성을 유의하게 증가시켰다. 소진을 평가하기 위해, 7일 동안 A549 스페로이드에 노출된 NK 세포를 PVR+ K562 세포로 재자극시켰다. TIGIT 차단은 NK 세포 소진을 방지하여 재자극된 NK 세포 상에서 IFNγ, TNFα 및 표면 CD107a의 증가된 발현을 초래하였다(도 1d 내지 도 1f). TIGIT 차단은 생체외 확장된 NK 세포 상에서 저해성 수용체 및 활성화 수용체의 발현에 어떠한 유의한 변화도 초래하지 않았다.
결론: TIGIT는 생체외 확장된 및 사이토카인-활성화된 NK 세포 상에서 고도로 발현된다. 항-TIGIT 항체를 이용한 TIGIT 차단은 생체외 확장된 NK 세포의 항종양 활성을 향상시킨다. 그러므로, 생체외 확장된 NK 세포 및 항-TIGIT 항체는 전체 항종양 활성을 향상시키기 위해 유망한 병용 치료법으로서 해석 가능한 잠재력을 갖는다.
실시예 2. PM21 확장된 NK 세포에서 이의 항종양 반응을 향상시키기 위한 TIGIT 신호전달의 조사.
Treg 세포에서 TIGIT 신호전달은 저해성 IL-10 및 Fgl2 발현을 증가시키고, 이의 면역억제 특성을 증강시킨다. 이전의 연구는 또한 TIGIT가 암에서 NK 세포 상에서 상향조절되고 종종 이의 소진과 상관관계가 있음을 관찰하였다. 전임상 마우스 모델에서, TIGIT의 차단은 NK 세포 세포독성을 복구시키고 IFNγ 및 TNFα 발현을 증가시켰고, 종양-특이적 T 세포 면역력을 촉진하였다. 항-PD-L1과 조합된 항-TIGIT는 항종양 활성을 추가로 증강시켰고, 이러한 효과는 NK 세포의 존재에 의존하였다. 항-TIGIT 항체는 현재 전임상 모델과 인간 임상 둘 다에서 결과를 보여주고 있다. 전임상 마우스 모델에서, 단독으로 또는 항-PD-1/항-PD-L1/항-TIM-3과 같은 관문 저해제와 조합된 항-TIGIT 항체는 종양 성장을 방지하고, 이의 생존율을 증가시킨다. Genentech에 의한 II상 임상 시험(NCT03563716)은 항-PD-L1과 조합된 항-TIGIT가 PD-L1 발현 비소세포 폐암(NSCLC: non-small cell lung cancer) 환자에서 항-TIGIT 단독(17.2%)과 비교하여 더 높은 전체 반응율(55.2%)을 보여준다. 항-TIGIT 항체의 치료 효능은 T 세포 이펙터 기능의 복구 및 Treg 세포의 ADCC 의존적 고갈을 포함한 다수의 기전에 의존한다. 항-TIGIT를 다른 관문 저해제와 조합하는 다수의 전임상 연구 및 임상 연구가 있긴 하지만, 병용 치료법으로서의 입양 NK 세포 및 항-TIGIT의 효능은 아직 검사되지 않았다.
NK 세포는 총 말초 혈액 림프구 중 단지 5% 내지 10%를 이루는 내재성 면역계의 구성요소이고, NK 세포를 유전적으로 변형시키는 것은 과제로 남아 있으며, 이는 치료법으로서 충분한 NK 세포를 수집하는 것을 어렵게 만든다. NK 세포를 확장시키기 위해 사이토카인 및 영양 세포-기초 확장 방법을 포함한 여러 방법이 현재 사용되고 있다. 그러나, 이들 방법은 일부 단점을 갖는다. 예를 들어 사이토카인-기초 방법은 NK 세포를 유의하게 확장시킬 수 없다. 더욱이, 영양 세포 확장된 NK 세포는 확장 후에 정제되어야 하는데, 임의의 잔여 영양 세포의 존재가 암 환자에서 추가 악성 종양의 잠재적인 위험을 만들어낼 수 있기 때문이다. 추가 정제의 필요 없이 임상-등급 세포독성 NK 세포를 유의하게 확장시키는 입자(PM21) 기초 NK 세포 확장 방법이 개발되었다. 이들 NK 세포는 시험관내 및 생체내 둘 다에서 강력한 항종양 활성을 나타낸다. 이전의 연구는 PM21-NK 세포가 시험관내 및 생체내 둘 다에서 암세포 상에서의 PD-L1 발현을 유도하였음을 실증하였다. PD-L1 차단은 생체내에서 PM21-NK 세포의 항종양 활성 및 지속성을 증강시키고 종양-보유 마우스의 생존율을 연장시키긴 하였지만, PM-21 NK 세포는 대체로 PD-1 음성이다. 이들 발견은 PD-L1 차단이 PM21-NK 세포의 항종양 반응을 직접적으로 그리고 간접적으로 증강시킬 수 있음을 나타낸다.
이러한 실시예는 1) PM21 NK 세포에서 TIGIT 신호전달의 역할을 조사하고 병용 치료법으로서의 항-TIGIT와 PM21 NK 세포의 잠재력을 평가하고; 2) PM21 NK 세포에서 TIGIT 신호전달을 변형시키는 것이 이의 항종양 활성을 증강시킴을 보여준다. 본원의 데이터는 TIGIT가 NK 세포 상에서 고도로 발현되고, TIGIT의 차단이 TIGIT 리간드+ 암 스페로이드에 대한 세포독성을 향상시키고 IFNγ, TNFα 및 표면 CD107a의 발현을 증가시켰음을 보여준다. 본원의 데이터는 또한, PM21 NK 세포에서 TIGIT 결실이 TIGIT 리간드+ 암 스페로이드에 대한 세포독성을 증가시켰음을 보여준다. 이들 데이터는 TIGIT 신호전달의 차단이 PM21 NK 세포의 소진을 방지함으로써 이의 항종양 활성을 증강시킴을 나타낸다. 이 실시예는 TIGIT 신호전달이 PM21 NK 세포 특성을 조절하는 방법을 보여주고, 항종양 활성을 향상시키기 위한 억제된 TIGIT 발현을 갖는 조작된 PM21 NK 세포 및 다른 병용 치료법의 사용을 지지한다.
본원의 분석은 PM21 NK 세포가 TIGIT, CD96, NKG2A, TIM-3 및 LAG-3을 포함한 저해성 수용체를 발현하고, 이때 TIGIT가 이들 중에서 가장 상향조절되는 수용체임을 식별하였다. 본원에 제공된 데이터는 차단 또는 TIGIT 결실이 PM21 NK 세포의 세포독성을 증가시키고 IFNγ, TNFα 및 표면 CD107a의 발현을 증강시켰음을 보여준다.
이 실시예는 PM21 NK 세포에서 TIGIT 신호전달의 역할을 분석하여, PM21 NK 세포의 이펙터 기능을 향상시키는 전략의 개발을 초래하였다. NK 세포에서 TIGIT 신호전달을 차단하여 이들 NK 세포의 표현형, 대사 및 기능적 특성에 미치는 이의 효과를 분석하였다. 전사체학 분석을 실시하여 TIGIT 신호전달이 인간 NK 세포를 조절하는 방법을 이해하였다. 이 실시예는 NK 세포에서 TIGIT 신호전달의 기능적 결과를 결정할 뿐만 아니라, 암세포에 대해 더 양호한 치료 효능을 갖는 변형된 NK 세포 및 병용 면역치료법 접근을 개발하도록 도왔다.
PM21 NK 세포 상에서의 저해성 수용체의 발현을 이해하기 위해, RNA 발현을 qRT-PCR로 그리고 단백질 발현을 유세포측정법으로 측정함으로써 PD-1, CTLA-4, TIGIT, NKG2A, TIM-3, CD96 및 LAG-3을 포함한 저해성 수용체 세트를 분석하였다. 이들 연구에서, TIGIT, NKG2A, TIM-3, CD96 및 LAG-3을 포함한 다수의 저해성 수용체의 유의한 상향조절을 RNA(도 1a; 도 11)와 단백질 수준 둘 다에서 관찰하였다. 이들 중에서, TIGIT는 NK 세포에서 가장 상향조절된 것이었다(도 1b). 그러나, PD-1 또는 CTLA-4의 어떠한 유의한 단백질 발현도 관찰되지 않았다(도 11). 이러한 발현 분석에 기초하여, 추가 연구를 위해 NK 세포의 주요 저해성 수용체인 TIGIT를 선택하였다. 이전의 연구는 TIGIT 신호전달의 차단이 마우스 모델에서 NK 세포 항종양 활성을 복구시킴을 보여주었다. PM21 NK 세포의 세포독성 및 기능적 특성에 미치는 TIGIT 차단의 효과를 이해하기 위해, PM21 NK 세포를 TIGIT 리간드+ A549 3D 폐암 스페로이드와 함께 7일 동안 공동배양한 다음, 생 이미지화 시스템으로 분석하였다. 세포독성 검정법에 더하여, PM21 NK 세포의 기능적 표현형을 추가로 분석하였다. 이들 실험은 항-TIGIT 항체를 이용한 PM21 NK 세포 상에서의 TIGIT의 차단이 A549 3D 폐암 세포 스페로이드에 대한 PM21 NK 세포의 세포독성을 유의하게 증강시켰음을 보여주었다(도 1c). TIGIT 신호전달의 차단은 또한 A549 세포 스페로이드에 대한 IFNγ, TNFα 및 표면 CD107a의 발현을 증강시켰다(도 1d, 도 1e 및 도 1f).
1) PM21 NK 세포에서 TIGIT 신호전달의 역할을 조사하고 병용 치료법으로서의 항-TIGIT와 PM21 NK 세포를 평가한다. PM21 NK 세포는 무경험 또는 비확장된 NK 세포와 비교하여 TIGIT를 유의하게 상향조절하는 것으로 관찰되었다(도 1b 및 도 2). 여기서, 저해성 TIGIT 신호전달은 PM21 NK 세포의 소진을 촉진하고, 이 수용체의 차단은 TIGIT 리간드+ 암세포에 대한 PM21 NK 세포의 항종양 특성을 복구시킬 수 있는 것으로 제시된다(도 1). 이 연구를 위해, PM21 NK 세포 상에서의 TIGIT 신호전달을 차단하여 NK 세포 소진에 관여하는 TIGIT 신호전달 조절된 표현형, 기능적 및 대사 특성을 결정하였다. 더욱이, 전사체 분석을 수행하여 TIGIT 신호전달에 의해 조절되는 신호전달 경로를 식별하였다. 마지막으로, 항-TIGIT와 PM21 NK 세포의 조합을 연구하여 이러한 조합이 항종양 활성을 향상시킬 수 있음을 결정하였다.
1.1. PM21 NK 세포의 세포독성 및 이펙터 기능에 미치는 TIGIT 신호전달의 효과를 결정한다. TIGIT의 차단은 A549 스페로이드에 대한 NK 세포의 세포 세포독성 및 IFN-γ, TNF-α 및 표면 CD107a의 발현을 향상시킨 것으로 관찰되었다(도 1d 및 도 1f). TIGIT 신호전달을 7일 동안 PM21 NK 세포와 다른 TIGIT 리간드+ 암세포 3D 스페로이드의 공동배양 동안 항-TIGIT 항체로 추가로 차단한 다음, 세포독성을 생 이미지화 시스템으로 분석하였다(도 6 및 도 7). PM21 NK 세포를 음성 대조군으로서 이소형 대조군 항체의 존재 하에 암세포 스페로이드와 함께 공동배양하였다. 공동배양 후, NK 세포를 PVR+ K562 세포로 재자극시키고, IFN-γ, TNF-α 및 표면 CD107a의 빌현을 분석하여 이의 이펙터 기능을 결정하였다. 공동배양되지 않은 PM21 NK 세포를 양성 대조군으로서 사용하였다. 이들 실험의 개략도는 도 12에 도시되어 있다.
PM21 확장된 NK 세포는 TIGIT 항체의 존재 하에 더 높은 세포독성을 갖는다. PM21 NK 세포는 다른 암 스페로이드와 공동배양 시 더 적은 IFN-γ, TNF-α 및 표면 CD107a를 발현하며, 한편 TIGIT 신호전달의 차단은 이의 발현을 복구시킬 수 있다(도 1d 내지 도 1f).
1.2. PM21 NK 세포에서 TIGIT 신호전달 조절된 경로 및 유전자를 전사체 분석에 의해 식별한다. 저해성 수용체 신호전달은 항종양 활성을 방지하고 소진을 촉진하기 위해 NK 세포에서 세포성 재프로그래밍을 촉진할 수 있다. 어떤 세포성 경로 및 유전자가 NK 세포에서 TIGIT 신호전달에 의해 조절되는지 이해하기 위해, PM21 NK 세포를 항-TIGIT 및 이소형 항체의 존재 하에 A549 암 스페로이드와 함께 공동배양하였다. 암세포와의 인큐베이션 후, NK 세포를 CD56 양성 선택 키트로 선택하고, RNA를 추출하여 RNA-seq를 수행하였다. 조립 및 정규화 후, 유의하게 차별적으로 발현된 유전자를 컷오프 P 값< 0.05로 분석할 수 있다. KEGG 경로 및 유전자 종양학(GO) 분석을 수행함으로써, 이상조절된(dysregulated) 경로, 생물학적 과정 및 기능을 결정한다.
부가적으로, 소진 과정에 관여하는 기능적으로 관련된 유전자를 이해하기 위해 유전자 세트 농화 분석(GSEA: gene set enrichment analysis)를 실시하였다(도 13a 내지 도 13b 및 도 14). RNA-seq 발현 분석 결과를 qRT-PCR, 웨스턴 블롯 및 유세포측정법에 의해 추가로 확증한다.
이들 연구에서, TIGIT 신호전달에 의해 조절되는 특정 경로 및 유전자, 특히 면역계, 대사 및 후생학적 조절과 관련된 것은 NK 세포와 암 스페로이드의 공동배양 후 이상조절될 수 있는 것으로 관찰되었다. 이들 발견은 소진 과정과 관련된 유의한 식견을 제공하며, 이는 PM21 NK 세포의 항종양 활성을 추가로 향상시키기 위해 이용될 수 있다.
1.3. PM21 NK 세포의 대사 특성에 미치는 TIGIT 신호전달의 효과를 검사한다. TIGIT 신호전달이 NK 세포 대사를 조절하는지의 여부를 이해하기 위해, 미토콘드리아 호흡 및 해당과정 잠재력을 동시에 측정함으로써 세포 에너지 표현형분석을 실시한다. PM21 NK 세포를 항-TIGIT(실험) 및 이소형 대조군(음성 대조군) 항체의 존재 하에 A549 암 스페로이드와의 공동배양으로부터 양성적으로 선택할 수 있고, Seahorse XF 분석기를 사용하여 대사 표현형을 분석한다.
해당과정, 미토콘드리아 호흡, 및 결정된 이상조절된 유전자와 함께 mTOR 및 PI3K 신호전달을 포함한 대사와 관련된 경로와 관련된 유전자에 대해 GSEA 유전자 농화 분석을 실시하였다(도 13 및 도 14).
이들 연구는 TIGIT 신호전달이 NK 세포 대사를 조절하는지의 여부에 대한 중요한 식견을 제공한다. 부가적으로, 연구는 TIGIT 신호전달을 통해 조절되는 NK 세포 소진에 관여하는 대사 경로 및 유전자를 결정한다.
실시예 3. 저해성 수용체 TIGIT의 넉아웃은 생체외 확장된 NK 세포의 항종양 반응을 증강시킨다.
NK 세포는 면역계의 내재성 반응과 적응 면역 반응의 프라이밍 둘 다에서의 이의 역할로 인해 많은 면역치료법의 성공에 결정적인 중요한 면역 세포 집단이다. 최근, 입양 세포 치료법 및 조합적 면역-종양학 치료법에 사용하기 위한 고도로 세포독성인 NK 세포를 생성하는 데 많은 초점이 맞춰져 왔다. 암세포에 대한 강력한 세포독성 및 NK 세포 활성화는 활성화 신호 및 저해성 신호의 미세한 조정에 의존한다. NK 세포 저해성 수용체는 자극 및 활성화 시 종종 상향조절되고, 소진 마커일 수 있다. NK 세포와 T 세포 둘 다 상의 주요 저해성 수용체 중 하나인 TIGIT는 생체외 확장된 NK 세포에서 고도로 발현된다. 이 연구는 생체외 확장된 NK 세포에서 TIGIT의 넉아웃이 이의 항종양 활성을 증강시키는지 조사한다.
CRISPR를 사용하여 생체외 확장된 NK 세포에서 표적화된 TIGIT 넉아웃(KO)을 만들었다. 그 후에, TIGIT KO NK 세포를 야생형 NK 세포와 비교하여 표현형 마커에서 임의의 변화를 결정하였다. 그 후에, IFNγ, TNFα 및 탈과립화 마커 CD107a 발현을 암세포와의 공동배양 후 분석하였다. 마지막으로, TIGIT KO NK 세포의 세포독성을 다수의 상이한 암세포 스페로이드에 대해 동적 생세포 이미지화 검정법을 사용하여 야생형 NK 세포와 비교하였다. 다수의 NK 세포:표적 세포 비를 시간 경과에 따라 분석하여 사멸화 반감기(killing half-time) 및 최대 사멸화(maximum killing)를 결정하였다. 데이터를 또한 용량-반응 곡선으로 맞춰서 세포독성 EC50 값을 결정하였다.
TIGIT 발현을 억제시키는 효과를 검사하기 위해, PM21 NK 세포를 TIGIT 특이적 가이드 RNA 및 Cas9 RNP 복합체로 전기천공시켜 TIGIT를 넉아웃시켰다. 초기 CRISPR-기초 넉아웃 효율은 75% 초과였다(도 1g). PM21 NK 세포의 세포독성에 미치는 TIGIT 넉아웃의 효과를 검사하기 위해, TIGIT KO NK 세포를 A549 스페로이드와 공동배양하였다. 항-TIGIT 항체를 이용한 TIGIT 차단과 유사하게, PM21 NK 세포에서의 TIGIT 넉아웃은 A549 세포 스페로이드에 대한 세포독성을 증가시켰다(도 1h). 이들 발견은 TIGIT 발현의 억제가 PM21 NK 세포의 항종양 활성을 향상시킴을 강하게 나타낸다.
1) 항종양 활성을 증강시키기 위해 PM21 NK 세포의 TIGIT 신호전달을 변형시킨다. 이 연구에서, PM21 확장된 TIGIT 넉아웃 NK(TIGIT KO PM21 NK) 세포를 개발하고 확장하였고(도 1g), 암세포에 대한 이의 항종양 반응을 평가하였다(도 1h 및 도 8). 이들 실험은 TIGIT KO PM21 NK 세포가 TIGIT 리간드+ A549 폐암 세포 스페로이드에 대해 더 높은 세포독성을 나타내었음을 보여주었다(도 1h).
CRISPR-기초 넉아웃 방법은 TIGIT KO PM21 NK 세포의 더 양호한 넉아웃 효율, 생존력 및 확장을 달성하기 위해 최적화되고 확립되었다. 추가 연구를 위해, 다수의 TIGIT 리간드+ 암세포 스페로이드에 대한 TIGIT KO PM21 NK 세포의 세포독성을 결정하였다. TIGIT KO PM21 NK 세포에 미치는 효과를 이해하기 위해, TIGIT KO PM21 NK 세포의 기능적 및 표현형 특성을 시험관내에서 확장 후 그리고 암 스페로이드와의 공동배양 후 유세포측정법-기초 단백질 발현 분석 및 RNA-seq 기초 전사체 분석으로 검사하였다. PM21 NK 세포 대사에 미치는 TIGIT 넉아웃의 효과를 결정하기 위해, TIGIT KO PM21 NK 세포의 대사 표현형을 검사하였다. 마지막으로, NK 세포 지속성 및 항종양 활성에 미치는 TIGIT 넉아웃의 효과를 NSG 마우스에서 결정한다.
1.1. TIGIT KO PM21 NK 세포를 발달시키고 특징화한다. TIGIT 넉아웃 효능을 최적화하기 위해, PM21 확장된 NK 세포를 다수의 가이드 RNA 및 Cas9 뉴클레아제로 전기천공하였다. 원하는(>90%) 넉아웃 효능을 달성한 후, 본 발명자들의 방법에 최상인 가이드 RNA를 선택하였다. 표적외(off-target) 효과를 게놈-와이드 시퀀싱(가이드-seq) 방법으로 분석할 수 있다. TIGIT KO PM21 NK 세포 및 일정한 PM21 NK 세포(음성 대조군)를 TIGIT 리간드+ 암세포 스페로이드와 함께 공동배양하고, 생 이미지화 시스템으로 분석하여 PM21 NK 세포 세포독성에 미치는 TIGIT 넉아웃의 효과를 결정하였다. 세포독성 후, NK 세포를 PVR+ K562 세포로 재자극시켜 IFNγ, TNFα 및 표면 CD107a의 발현을 검사하여 TIGIT KO NK 세포의 기능적 특성을 이해하였다.
이 방법은 높은 넉아웃 효능(>90%) 및 높은 생존력을 갖는 TIGIT KO PM21 NK 세포를 생성하였다. 더욱이, TIGIT KO PM21 NK 세포는 부모(parental) PM21 NK 세포와 비교하여 TIGIT 리간드+ 암세포에 대해 일정한 PM21 NK 세포와 비교하여 유의하게 우수한 세포독성을 갖고 더 많은 IFNγ, TNFα를 발현하는 것으로 나타났다.
NK 세포를 제7일에 TIGIT 특이적 CRISPR/Cas9 리보핵단백질(RNP) 복합체(TIGIT KO PM21-NK 세포)와 함께 또는 RNP(RNP 없음 대조군 PM21-NK 세포) 없이 전기천공시키고, PM21 입자(PM21-NK 세포)를 이용하여 총 2주 동안 확장시켰다. 도 12를 참조한다. 대표적인 히스토그램은 야생형 PM21-NK 세포(WT PM21-NK 세포)(회색) 및 TIGIT KO PM21-NK 세포(적색)를 보여준다(도 25a). TIGIT 넉아웃(KO) 효율은 WT PM21-NK 세포와 비교하여 TIGIT KO PM21-NK 세포에서 90% 초과였다(도 25b). 대표적인 확장 곡선은 WT PM21-NK 세포(검정색) 및 RNP 없음 대조군 PM21-NK 세포(회색)와 비교할 만한 TIGIT KO PM21-NK 세포의 유의한 확장을 나타낸다(도 25c). 요약 그래프는 WT PM21-NK 세포(평균 3,999배) 및 TIGIT KO PM21-NK 세포(평균 702.5배)의 확장을 나타낸다(N = 11명의 공여자)(도 25d). 데이터는 스캐터 플롯으로서 또는 표준 편차를 나타내는 오차 막대가 있는 막대 그래프로서 제시된다.
1.2. NK 세포의 표현형, 대사 및 전사체학 특성에 미치는 TIGIT 결실의 효과. PM21 NK 세포에 미치는 TIGIT 넉아웃의 전체 효과를 이해하기 위해, TIGIT KO 및 부모 PM21 NK 세포의 표현형, 대사 및 전사체학 프로파일을 확장 후 그리고 암 스페로이드와의 공동배양 후 결정하였다. NK 세포를 확장 후 그리고 암 스페로이드와의 공동배양 후 수집하였다. 표현형 특성을 연구하기 위해, NK 세포를 NK 세포 마커에 대한 항체로 염색하고, 유세포측정법으로 분석하였다. 대사 특성을 검사하기 위해, 수집된 NK 세포를 시호스(Seahorse) 분석기로 분석하여 해당과정 및 미토콘드리아 호흡을 결정하였다.
WT PM21-NK 세포 및 TIGIT KO PM21-NK 세포를 12일 동안 확장시키고, WT PM21-NK 세포(검정색) 및 TIGIT KO PM21-NK 세포(적색)의 활성화 수용체 및 저해성 수용체의 발현을 유세포측정법에 의해 결정하였다. TIGIT 넉아웃은 활성화 수용체(도 26a), 저해성 수용체(도 26b) 및 CD96-DNAM1 축, FasL 및 Trail(도 26c)의 발현을 유의하게 변경하지 않았다(N = 3명의 공여자, 각각 이중복물의 평균). 확장된 WT 및 TIGIT KO PM21-NK 세포를 RNA 추출에 사용하고, 대량 RNA 시퀀싱을 실시하여 이상조절된 유전자 세트를 결정하였다. 유전자 세트 농화(GSEA) 분석은 TIGIT 넉아웃이 IL2/STAT5 신호전달을 포함한 다수의 특징 유전자 세트 및 G2M 관문 관련 유전자 세트를 상향조절하였으며(도 26d), 한편 P53 경로를 하향조절하였음(도 26e)을 나타낸다. IL2/STAT5 신호전달(도 26f), G2M 관문(도 26g) 및 P53 경로(도 26h)에 대한 농화 플롯이다. 데이터는 스캐터 플롯으로서 또는 표준 편차를 나타내는 오차 막대가 있는 막대 그래프로서 제시된다. 통계적 유의성은 다중 독립 t-검정에 의해 결정되었다. P 값은 p<0.05이면 *, p<0.01이면 **, p<0.001이면 ***, p<0.0001이면 ****로서 표시된다.
WT PM21-NK 세포 및 TIGIT KO PM21-NK 세포를 IL12(10 ng/ml), IL15(100 ng/ml) 및 IL18(50 ng/ml)와 함께 또는 없이 PVR 음성 K562 세포(K562_PVR- 세포) 또는 PVR 양성 K562 세포(K562_PVR+ 세포)로 24시간 동안 자극시키고, NK 세포를 시호스 시스템과 함께 해당과정 속도 및 미토콘드리아 스트레스 시험에 사용하였다. K562_PVR- 및 K562_PVR+ 세포 자극은 WT PM21-NK 세포(검정색 원형)(N = 6명의 공여자)와 비교하여 TIGIT KO PM21-NK 세포(굵은 적색 삼각형)에서 기저(basal) 해당과정 속도와 보상적 해당과정 속도 둘 다 유의하게 증가시켰으며(도 30a 내지 도 30b), 한편 K562_PVR- 세포만 TIGIT KO PM21-NK 세포에서 기저 산소 소비율(OCR: oxygen consumption rate)을 증가시켰다(N = 4명의 공여자)(도 30c 내지 도 30d). 데이터는 공여자-쌍 선이 있는 스캐터 플롯으로서 제시된다. 통계적 유의성은 다중 대응 t-검정(multiple paired t-test)에 의해 결정되었다. P 값은 p<0.05이면 *, p<0.01이면 **, p<0.001이면 ***, p<0.0001이면 ****로서 표시된다.
RNA를 수집된 NK 세포로부터 추출하고, 부모 및 TIGIT KO PM21 NK 세포의 전사체 프로파일링을 총 RNA seq로 수행하는 데 사용하였다. 원시 데이터를 정규화하고, 유의하게 차별적으로 발현된 유전자는 컷오프 P 값< 0.05를 가졌다.
KEGG 경로 분석, GO 분석 및 GSEA 유전자 농화 분석을 실시하여 TIGIT 조절된 경로, 생물학적 과정, 및 관련 유전자 세트의 기능을 결정하였다. 모든 이들 실험에 대해, 부모 PM21 NK 세포를 대조군으로서 사용하였다. RNA-seq 데이터의 유전자 세트 농화 분석은 TIGIT KO NK 세포가 mTORC1 신호전달 및 해당과정을 위한 특정 유전자 세트를 상향조절하였음을 보여주었고, 이는 TIGIT KO NK 세포에서 증가된 성장 및 대사를 나타내었다. 도 33은 NK 세포에서 TIGIT KO 시 대표적인 상향조절 및 하향조절된 유전자 세트의 히트맵을 도시하고, 도 34a 내지 도 34d는 TIGIT KO NK 세포의 대사 분석을 도시한다.
TIGIT 넉아웃 NK 세포는 또한 항종양 활성을 저해하는 데 관여하는 중요한 경로 및 유전자의 이상조절을 방지하고 더 활성인 표현형을 나타낼 수 있다. 더욱이, 대사 프로파일링은 TIGIT 신호전달이 NK 세포 대사를 조절하였음을 결정한다.
CRISPR는 생체외 확장된 NK 세포에서 TIGIT를 효율적으로 넉아웃시키기 위해 사용되었고, 발현 수준을 5% 미만까지 감소시켰다. TIGIT 리간드 PVR을 발현하는 Raji 세포와의 공동배양 후, TIGIT KO NK 세포는 IFNγ, TNFα 및 CD107α의 증가된 발현을 보여주었다. TIGIT KO NK 세포는 야생형 NK 세포와 비교하여 향상된 사멸화를 보여주었다. TIGIT KO 세포는 6개의 상이한 암 세포주의 3D 스페로이드 모델에서 사멸화 반감기 및 EC50 세포독성 값의 유의한 감소와 함께 더 많은 표적 세포를 더 빠르게 사멸화시켰다. NK 세포:표적 세포 비가 낮을 때, 최대 세포독성 또한 TIGIT KO 세포에서 더 높았다.
1.3 NK 세포의 사이토카인 발현, 탈과립화 및 세포독성에 미치는 TIGIT 결실의 효과. 생체외 확장된 NK 세포에서의 TIGIT 유전자의 결실은 증가된 사이토카인 발현, 탈과립화 및 세포독성을 갖는 NK 세포를 초래하였다. 향상된 항종양 활성을 갖는 이들 TIGIT 넉아웃 NK 세포는 증강된 치료 효능을 위한 잠재력을 유니버셜 이펙터 집단에 제공한다.
생체외 확장된 WT PM21-NK 세포 및 TIGIT KO PM21-NK 세포를 처리하지 않은 채로 두고, A549 스페로이드와 함께 48시간 동안 공동배양하거나 IL12(10 ng/ml), IL15(100 ng/ml) 및 IL18(50 ng/ml)로 4시간 동안 자극시켰다. 골지 스탑 및 브레펠딘 A를 유세포측정법에 의한 IFNγ, TNFα 및 표면 CD107a의 NK 세포 발현 및 분석 전 4시간째에 첨가하였다. TIGIT 넉아웃은 A549 스페로이드에 대해 TIGIT KO PM21-NK 세포(굵은 적색 삼각형) 상에서 표면 CD107a 발현을 유의하게 증가시켰으나(도 29c), WT PM21-NK 세포(굵은 검정색 원형)와 비교하여 IFNγ(도 29a) 및 TNFα(도 29b)를 증가시키지 않았다(N = 4 내지 8명의 공여자, 각각 이중복물의 평균). 데이터는 공여자-쌍 선이 있는 스캐터 플롯으로서 제시된다. 통계적 유의성은 다중 대응 t-검정(multiple paired t-test)에 의해 결정되었다. P 값은 p<0.05이면 *, p<0.01이면 **, p<0.001이면 ***, p<0.0001이면 ****로서 표시된다.
확장된 WT PM21-NK 세포 및 TIGIT KO PM21-NK 세포를 난소 SKOV3 및 폐 A549, NCI-H358, NCI-H1299, NCI-H1650 또는 NCI-H1299 암세포 스페로이드와 함께 7일 동안 공동배양하였다. NK 세포 세포독성을 동적 생세포 이미지화에 의해 결정하였다. 하나의 실험으로부터의 대표적인 원시 데이터는 단독으로(회색 정사각형) 또는 WT PM21-NK 세포(검정색) 또는 TIGIT KO PM21-NK 세포(적색)의 존재 하에 10000 NK 세포(NCI-H358) 및 3333 NK 세포(SKOV3)와 함께 NCI-H358 및 SKOV-3 상대 확장에 대해 도시된다(도 27a 및 도 27d). NK 세포 세포독성(도 27b 및 27e) 및 EC50(도 27c 및 27f)에 대한 대표적인 플롯이 또한 도시되어 있다. NK 세포 세포독성의 요약 플롯은 TIGIT KO-PM21 NK 세포가 WT PM21-NK 세포와 비교하여 EC50(도 27g), t1/2(도 27h) 및 최대 세포독성(도 27i)을 유의하게 증가시킴을 보여준다(N = 3명의 공여자, 각각 삼중복물의 평균). 데이터는 공여자-쌍 라인이 있는 스캐터 플롯으로서 또는 표준 편차를 나타내는 오차 막대가 있는 평균으로서 표시된다. 통계적 유의성은 다중 독립 또는 대응 t-검정에 의해 결정되었다. P 값은 p<0.05이면 *, p<0.01이면 **, p<0.001이면 ***, p<0.0001이면 ****로서 표시된다.
생체외 확장된 WT PM21-NK 세포 및 TIGIT KO PM21-NK 세포를 세툭시맙과 함께 그리고 없이 A549 세포(2D)와 함께 48시간 동안 공동배양하였다. NK 세포 세포독성을 동적 생세포 이미지화에 의해 결정하였다. 대표적인 그래프는 A549 세포 단독(회색 정사각형), WT PM21-NK 세포(굵은 검정색 원형), 세툭시맙과 함께 WT PM21-NK 세포(검정색 원형), TIGIT KO PM21-NK 세포(굵은 적색 삼각형) 및 세툭시맙과 함께 TIGIT KO PM21-NK 세포(적색 삼각형)의 상대 확장을 보여준다(도 28a). 대표적인 세포독성 플롯(도 28b)은 TIGIT KO(적색)가 WT NK 세포(검정색)와 비교하여 더 양호한 A549 세포를 사멸화시켰고 세툭시맙의 첨가가 WT NK 세포와 TIGIT KO NK 세포(점선) 둘 다의 NK 세포 세포독성을 추가로 향상시켰음을 실증한다. 다수의 NK:T 비에서 A549 세포에 대한 NK 세포 세포독성의 요약 플롯 및 표는 세툭시맙이 TIGIT KO PM21-NK 세포의 세포독성을 EC50 배수 변화 2.4로 추가로 향상시킴을 보여주었다(N = 2명의 공여자, 각각 이중복물의 평균)(도 28c).
도 24의 개략도에 요약된 바와 같이, TIGIT KO NK 세포는 WT NK 세포와 비교하여 증강된 증식 및 ADCC를 포함한 세포독성을 갖는다. 1) TIGIT KO NK 세포는 WT NK 세포와 비교하여 PVR+ 종양 세포로 자극 시 증가된 TNFα 생산을 갖는다. 2) 종양 스페로이드-노출 TIGIT KO NK 세포는 WT PM21-NK 세포와 비교하여 증가된 탈과립화를 갖는다. 3) mTOR 신호전달, 해당과정 및 IL2-STAT5 신호전달의 상향조절은 TIGIT KO PM21-NK 세포에서 RNA-seq 분석에 의해 관찰되었다. 4) 증강된 대사 적합도(fitness)는 PVR+ 종양 세포로 자극 시 WT PM21-NK 세포와 비교하여 관찰되었다. 5) TIGT KO는 Fc-적격 α-TIGIT 항체와 조합되었을 때 ADCC 구동 NK 세포 아군사멸화를 방지하고, 세포독성의 감소를 방지한다.
실시예 4. 생체내에서 TIGIT KO PM21 NK 세포의 지속성 및 항종양 활성을 검사한다.
암세포를 NSG 마우스에서 복강내로 시딩하고, 7일 동안 인큐베이션한다. 그 후에, 부모 및 TIGIT KO PM21 NK 세포를 복강내 주사한다. IL-2를 매주 2회 주사하여 NK 세포를 지지한다. 마우스를 시간 경과에 따라 모니터링하여 종양 성장 및 생존율을 검사한다. NK 세포 주사 14일 후, 하위그룹의 마우스를 희생시킨다. NK 세포를 수집하여 NK 세포 지속성 및 표현형을 결정한다. 부가적으로, NK 세포를 K562_PVR+ 세포로 재자극시키고, TIGIT KO 및 부모 PM21 NK 세포의 이펙터 기능을 분석하고 비교한다. 부모 PM21 NK 세포를 이들 실험에서 대조군으로서 사용한다.
TIGIT KO PM21 NK 세포는 부모 PM21 NK 세포와 비교하여 더 양호한 지속성을 갖고 생체내에서 더 강력한 항종양 활성을 보유한다. 더욱이, TIGIT KO PM21 NK 세포는 부모 PM21 NK 세포와 비교하여 종양 성장을 저하시키고, 종양-보유 마우스 생존율을 증가시킨다.
이전의 임상 연구는 TIGIT 차단 단독으로는 종양 성장 및 생존율을 유의하게 저하시킬 수 없었음을 보여주었다. 다른 연구는 TIGIT 차단이 NK 세포의 항종양 면역력을 유의하게 증가시켰음을 보여주었다. 그러나, 항-PD-1/PD-L1 또는 항-TIM3와 조합된 항-TIGIT 항체는 생존율을 유의하게 향상시키고, 종양 성장을 추가로 저하시켰다. 항-PD-1/PD-L1 또는 항-TIM3와 TIGIT KO PM21 NK 세포의 병용 치료법이 활용될 수 있다.
실시예 5. 생체내에서 TIGIT의 차단과 조합된 PM21 NK 세포의 치료 효능을 평가한다.
이 실시예는 PM21 NK 세포가 항-TIGIT의 존재 하에 더 양호한 항종양 활성을 나타낼 수 있는지의 여부를 검사하고, TIGIT 리간드+ 암세포를 NSG 마우스에게 복강내 주사한다. 생착된(engrafted) 마우스를 치료하기 위해 항-TIGIT(실험) 또는 이소형 대조군(양성 대조군)과 함께 PM21 NK 세포를 투여한다. IL-2를 매주 2회 주사하여 NK 세포를 지지한다. 종양 성장 및 생존율을 시간 경과에 따라 분석한다. 14일 후, 하위그룹의 마우스를 희생시키고, NK 세포를 복막 세척(peritoneal wash)을 통해 수집한다. 회수된 NK 세포를 분석하여 지속성 및 표현형 특성을 결정한다.
NK 세포는 항-TIGIT와 조합되어 더 높은 항종양 활성을 나타낼 수 있으며, 이는 이소형 또는 항-TIGIT 단독 주사된 마우스 그룹의 확장된 NK 세포와 비교하여 종양 제어 및 따라서 전체 생존율을 향상시킨다. 더욱이, TIGIT 차단은 NK 세포의 지속성을 증가시킨다.
생체내 연구에서, 항-TIGIT 항체와 항-PD-L1 항체 둘 다 PM21 NK 세포와 함께 주사한다. 이전의 연구는 또한 Treg 세포가 TIGIT 신호전달에서 역할을 하고 항-TIGIT 효능이 Treg 세포의 NK 세포-기초 결실에 의존함을 보여주었다. Treg 세포를 PM21 NK 세포 및 항-TIGIT 항체와 함께 주사할 수 있고, PM21 NK 세포에 미치는 TIGIT 신호전달의 효과를 생체내에서 Treg 세포의 존재 하에 검사한다.
실시예 6. TIGIT 차단은 폐암 모델에서 PVR-매개 소진을 방지함으로써 생체외 확장된 NK 세포의 항종양 활성을 향상시킨다.
생체외 확장된 자연 살해(NK) 세포는 암에 대한 이의 강력한 반응때문에 입양 면역치료법(adoptive immunotherapy)으로서 관심을 얻었다. NK 세포는 이의 활성을 조절하는 활성화 수용체 및 저해성 수용체를 발현한다. 저해성 수용체 TIGIT는 종종 암에서 NK 세포 상에서 상향조절되며, NK 세포 활성을 저해하고, NK 세포 소진을 촉진한다. NK 세포 기능에서 TIGIT의 역할에 대한 대부분의 이해는 뮤린 모델로부터 비롯되며, 한편 인간 NK 세포를 사용한 기계론적 시험관내 연구는 제한된다. 이 연구에서, 인간 생체외 확장된 NK 세포의 항종양 활성에 미치는 TIGIT 차단의 효과를 평가하였다.
TIGIT 발현을 사이토카인 활성화된 및 PM21-입자 확장된 인간 NK 세포(PM21-NK 세포) 상에서 qRT-PCR 및 유세포측정법에 의해 결정하였다. 다수의 폐암 세포주의 2D 및 3D 모델에 대한 NK 세포 세포독성을 동적 생 이미지화-기초 검정법에 의해 평가하였다. NK 세포 소진을 평가하기 위해, PVR+ 또는 PVR- K562 세포를 사용하여 A549 스페로이드-노출 PM21-NK 세포를 재자극시키고, CD107a의 표면 발현 및 IFNγ와 TNFα의 생산을 측정하였다. 이론으로 결부시키고자 하는 것은 아니지만, PVR-매개 소진을 방지하는 TIGIT 차단의 잠재적인 기전은 도 15에 예시되어 있다. RNA-seq 분석을 TIGIT 차단이 있거나 없는 A549 스페로이드와의 공동배양 후 선택된 PM21-NK 세포 상에서 수행하였다.
TIGIT는 생체외에서 확장되고 활성화된 인간 NK 세포 상에서 고도로 발현된다. TIGIT 차단은 폐암 스페로이드에 대한 PM21-NK 세포의 세포독성을 유의하게 향상시키고, 암세포 스페로이드에의 장기간 노출 후 PVR 양성 암세포에 대한 이펙터 기능을 복구시킨다.
이 실시예에서, PM21-입자 확장된-NK 세포(PM21-NK 세포)의 항종양 활성에 미치는 TIGIT 차단의 효과를 폐암 모델에서 조사하였다. 생체외 확장 및/또는 활성화는 NK 세포 상에서 TIGIT를 상향조절하였다. TIGIT 차단은 단층의 폐암 세포에 대해 PM21-NK 세포의 항종양 활성을 증가시키지 않았으며, 한편 TIGIT 차단은 종양 스페로이드에의 장기간 노출 후 3D 폐암 스페로이드에 대한 PM21-NK 세포 세포독성을 증가시키고 PVR-매개 소진을 방지하였다. TIGIT 차단은 염증 반응-관련 유전자, NFkB를 통한 TNFα 신호전달, 및 IFNγ 반응-관련 유전자 세트를 포함하여 NK 세포 항종양 반응과 관련된 다수의 유전자 세트를 상향조절하였다. 이 연구는 TIGIT 차단이 NK 세포 기능의 PVR-유도 감소를 방지하고, 생체외 확장된 1차 인간 NK 세포의 전체 항종양 반응을 증가시킴을 실증하였다.
방법.
세포 배양. 식별되지 않은 건강한 공여자로부터의 연막(백혈구 공급원)을 NK 세포 공급원으로서 사용하고, 지역 혈액 은행(OneBlood)으로부터 구매하였다. 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 밀도 구배(Ficoll-Paque Plus 용액; GE Healthcare, Chicago, IL, USA)에 의해 분리하고, 추가 사용을 위해 동결보존하였다. NK 세포를 이전에 기재된 바와 같이 PM21-입자로 확장시켰다(19,20,47). 간략하게는, T 세포-고갈 PBMC(EasySep CD3 양성 선택 키트; StemCell Technologies, Vancouver, Canada)를 200 μg/mL PM21-입자로 자극시키고, 100 U/mL IL-2(PeproTech, Cranbury, NJ, USA)와 함께 RPMI 배지 및 SCGM 배지(CellGenix GmbH, Freiburg im Breisgau, Germany)에서 2주 내지 3주 동안 배양하였다. 활성화된 NK 세포에 대해, T 세포 고갈된 PBMC를 IL-2(1000 U/ml) 또는 IL-12(10 μg/ml) + IL-15(100 μg/ml) + IL-18(50 μg/ml)로 밤새 자극시켰다. 암 세포주 K562, A549, NCI-H358 및 NCI-H1975 세포(ATCC) 및 NCI-H1299(Dr. Griffith Parks로부터의 관용적인 선물, UCF)를 10% FBS, 1% 항생제/항진균제(antimycotic) 및 2 mM 글루타맥스와 함께 RPMI에서 유지시켰다. A549-NLR, NCI-H358-NLR, NCI-H1975-NLR 및 NCI-H1299-NLR 세포를 상업적인 NucLight Red 렌티바이러스(Sartorius)를 사용한 안정한 형질도입을 통해 생성하였다. 모든 세포주를 퓨로마이신 선택, 뒤이어 균일한 양성 집단(BD FACS Aria II) 상에서의 분류(sorting)을 통해 양성적으로 선택하였다. 모든 세포를 공기 중 5%(vol/vol) CO2가 보충된 37°C에서 보습 분위기 하에 유지시켰다. 세포주를 미코플라즈마(E-Myco Plus Mycoplasma PCR 검출 키트, Bulldog-Bio, Inc., Portsmouth, NH, USA)에 대해 일상적으로 시험하고, 인간 STR 프로파일링(ATCC에 의한 서비스)을 통해 인증하였다.
안정한 세포주 생성. PVR 발현 K562-GFPLuc 세포를 PVR 코딩 유전자 서열을 함유하는 인하우스 생성된 렌티바이러스 입자(VectorBuilder Inc., Chicago, IL, USA)를 사용한 안정한 형질도입을 통해 생성하고, BD FACSAria II 세포 분류기(BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA)로 양성 집단 및 음성 집단에 대해 분류하였다. PVR+ 및 PVR- K562-GFPLuc 세포주를 필요할 때까지 동결보존하였다.
qRT-PCR. 확장 전과 후에 NK 세포를 선택하고(EasySep CD56 양성 선택 키트 StemCell Technologies, Vancouver, Canada), 총 RNA를 단리하였다(Direct-zol RNA Microprep 키트; Zymo research, Irvine, CA, USA). cDNA를 합성하고(High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit; Applied Biosystems, Waltham, MA, USA), TIGIT에 대한 유전자 발현 프라이머 세트(QuantiTect 프라이머 검정법; Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 qRT-PCR(Quantstudio 7 PCR 시스템, Applied Biosystems, USA)에 의해 RNA 발현 수준을 결정하였다. EIF3D 및 RPL13A를 대조군 유전자로서 사용하였다. 2―ΔΔ C T 방법(48)을 사용하여 표적 유전자의 상대 RNA 발현을 결정하였다.
유세포측정법. 하기 항체를 유세포측정법 분석에 사용하였다: CD56-PE(클론:5.1H11), CD56-APC/Fire™750(클론:NCAM), CD56-AF®647(클론:5.1H11), CD3-FITC(클론:UCHT1), TIGIT-PE/Cy7(클론:A15153G), CD96-PE(클론:NK92.39), DNAM-1-FITC(클론:TX25), PVRIG-APC(클론:W16216D), PVR-PE(클론:SKIL2), PVRL2-APC(클론:TX31), PVRL4-AF488(클론:337516), NKp30-PE(클론:P30-15), NKp46-PE/Dazzle™594(클론:9E2), CD16-PeCy5(클론:3G8), NKG2D-APC(클론:1D11), NKp44-PE-Cy7(클론:P44-8), LAG-3-FITC(클론:11C3C65), PD-1-PE-Dazzle™594(클론:EH12.2H7), TIM-3-PE(클론:F38-2F2), TNFα-PE/Dazzle™594(클론:MAB11), IFNγ-PerCP5.5(클론:B27), CD107a-PE(클론:H4A3), CD3-PerCP-eF710(클론:OKT3) 및 NKG2A-APC(클론:Z199). NK 세포를 사전-접합된 단백질-특이적 또는 상응하는 이소형 대조군 항체로 염색하였다. 모든 샘플을 Cytoflex(Beckman Coulter, Brea, CA, USA) 또는 Northern Lights 2000 Full Spectrum(Cytek, Fremont, CA, USA) 유세포분석기 상에서 획득하고, CytExpert(Beckman Coulter, Brea, CA, USA; v2.4) 또는 FlowJo 소프트웨어(v10.6.2)로 분석하였다.
동적 생세포 이미지화 세포독성 검정법. 추적을 위해 핵 적색 형광 단백질(NucLight Red; NLR)을 안정하게 발현하는 폐암 세포주 A549-NLR, NCI-H358-NLR, NCI-H1975-NLR 및 NCI-H1299-NLR을 표적 세포로서 사용하였다. 단층 세포독성 검정법을 위해, 6,000개의 암세포를 NK 세포 첨가 전날에 편평 바닥 96웰 플레이트에 웰당 시딩하였다. 스페로이드 세포독성 검정법의 경우, 5,000개의 암세포를 96웰 투명 둥근 바닥 초저 부착 마이크로플레이트(Corning, Corning, NY, USA)에 시딩하고, 130 x g에서 10분 동안 원심분리하고, 스페로이드를 형성하기 전에 3일 동안 인큐베이션하였다. 암세포 단층 또는 스페로이드를 NK 세포와 지시된 이펙터-대-표적(E:T) 비에서 Ultra-LEAF 이소형 또는 항-TIGIT 항체(Biolegend, San Diego, CA, USA)의 존재 하에 공동배양하였다. 단층을 72시간 동안 이미지화하였으며, 한편 스페로이드 실험을 IncuCyte® S3 생세포 분석 시스템(Sartorius, Gottingen, Germany)으로 7일 동안 수행하였다. 표적 종양 세포 성장을 2D 검정법에서 웰당 적색체 계수(ROC: red object count) 및 3D 검정법에서 총 적색체 통합 강도(ROII: red object integrated intensity)(RCU x μm2/이미지)에 의해 시간 경과에 따라 추적하였다. 정규화된 ROC(nROC) 또는 정규화된 ROII(nROII)를 결정하기 위해 NK 세포를 초기에 첨가하였을 때 ROC 또는 ROII를 0시간에서의 값(ROCt/ROCt=0 또는 ROIIt/ROIIt=0)으로 정규화함으로써 TIGIT 차단과 함께 또는 없이 단독으로 또는 NK 세포의 존재 하에 표적 세포의 상대 성장을 결정하였다. 그 후에, 세포독성(%)을 하기 방정식에 기초하여 결정하였다.
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아넥신 V 세포독성 검정법. PM21-NK 세포를 표적 PVR+ 또는 PVR- K562-GFPLuc 세포와 함께 지시된 이펙터 대 표적(E:T) 비에서 Ultra-LEAF 이소형 또는 항-TIGIT 항체(Biolegend, San Diego, CA, USA)의 존재 하에 조직 배양 인큐베이터에서 37°C에서 60분 동안 공동배양하였다. 그 후에, 세포를 원심분리하고, Annexin-V-Pacific Blue 항체로 염색하고, 4°C에서 15분 동안 인큐베이션하고, 유세포측정법에 의해 분석하였다. 세포독성은 이펙터와 함께 각각의 웰에 남아 있는 생존 가능한 표적 세포(GFP+/Annexin V-)(VTCE:T)의 절대량에 기초하고 "표적 단독" 대조군 웰(VTCT ctrl)에서의 평균 VTC로 참조하여 결정되었다.
IFNγ 및 TNFα 발현, 및 탈과립화. 30,000개의 NK 세포를 Ultra-LEAF 이소형 또는 항-TIGIT 항체(Biolegend, San Diego, CA, USA)의 존재 하에 PVR- 또는 PVR+ K562 세포와 함께 브레펠딘 A 및 골지 스탑™의 존재 하에 37°C에서 4시간 내지 6시간 동안 공동배양하였다. 샘플을 세포외 표적 단백질-특이적 항체(CD3, CD56 및 CD107a)로 염색하였다. 그 후에, NK 세포를 고정하고 투과시키고(eBiosciences IC 고정 및 투과 완충제), 세포내 단백질 표적(IFNγ 및 TNFα)에 대해 염색하였다. 데이터를 유세포측정법에 의해 획득하고, FlowJo 소프트웨어에 의해 분석하였다. 도 4를 참조한다.
시험관내 소진 모델. A549-NLR 세포(5000/웰)를 96웰 투명 둥근 바닥 초저 부착 마이크로플레이트(Corning, Corning, NY, USA)에 시딩하고, 130 x g에서 10분 동안 원심분리하고, 3일 내지 4일 동안 인큐베이션하여 스페로이드를 형성하였다. 그 후에, NK 세포를 Ultra-LEAF 이소형 또는 항-TIGIT 항체(Biolegend, San Diego, CA, USA)의 존재 하에 첨가하였다. 7일의 인큐베이션 후, NK 세포를 브레펠딘 A(eBioscience, San Diego, CA, USA) 및 골지 스탑™(BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA)의 존재 하에 PVR- 또는 PVR+ K562-GFPLuc 세포로 4시간 내지 6시간 동안 자극시켰다. 샘플을 수합하고, CD56, CD3 및 CD107a 항체로 염색하고, 고정하고, 투과시키고(eBioscience IC 고정 및 투과 완충제), IFNγ 및 TNFα에 대한 항체로 프로브하고, 뒤이어 유세포측정법을 사용하여 분석하였다. 대표적인 게이팅 전략은 도 23에 도시되어 있다.
RNA-seq. NK 세포를 소진 모델에 기재된 바와 같이 설정하였다. 7일의 인큐베이션 후, NK 세포를 NK 세포 선택 키트(EasySep CD56+ 선택 키트; StemCell Technologies)로 단리하고, 유세포측정법(Northern Lights 2000 Full Spectrum, Cytek)에 의해 분석하여 NK 세포 순도를 결정하였다. 총 RNA를 NK 세포(Direct-zol 마이크로프렙 키트, Zymo research)로부터 추출하였다. RNA 품질(RIN 값)을 TapeStation에 의해 결정하고, polyA 선택, 라이브러리 제조 및 RNA 시퀀싱(Genewiz, Inc, South Plainfield, NJ)에 사용하였다. 원시 RNA-seq 데이터(Fastq)를 품질 관리를 위해 FastQC로 분석하였다. 트림모마틱(trimmomatic)을 어댑터 및 저품질 판독물의 트리밍(trimming)에 사용하였다. HISAT2를 hg38 인간 게놈과 함께 유전자를 맵핑하는 데 사용하고, Stringtie를 판독물 계수의 조립 및 정량화에 사용하였다. Combat-seq를 사용하여 샘플 중에서 배치 효과(batch effect)를 제거하였다. EdgeR을 사용하여 유전자 발현을 정규화하고, 차별적으로 발현된 유전자를 결정하였다. EdgeR로부터 수득된 개별 유전자의 배수 변화와 P 값을 곱하여 순위가 매겨진 유전자 목록을 만들고, 사전-순위 매겨진 유전자 세트 농화(GSEA: Pre-ranked Gene Set Enrichment) 분석에 사용하여 농화된 특징 유전자 세트를 결정하였다.
통계적 분석. 통계적 분석을 GraphPad Prism 9.3.1에 의해 수행하였다. 대응 또는 독립 이원 스튜던츠 검정을 사용하여 TIGIT 발현, 세포독성 및 기능적 검정을 분석하였다. 모든 실험을 적어도 3개의 생물학적 중복물에 대해 수행하였다. 0.05 미만의 P 값은 통계적으로 유의한 것으로 여겨졌다. P 값은 p<0.05이면 *, p<0.01이면 **, p<0.001이면 ***, p<0.0001이면 ****로서 표시된다.
결과
PM21-입자 확장된 또는 사이토카인 활성화된 NK 세포는 TIGIT를 고도로 발현한다. 건강한 공여자로부터 수득된 NK 세포를 PM21-입자를 사용하여 확장하였다(19,20). 이러한 영양 세포-무함유 확장 기술은 K562-mbIL21-41BBL 세포로부터 유래된 형질막 입자(PM21-입자)를 활용하여 NK 세포 증식을 자극시키고, 이는 2주 내에 NK 세포의 평균 1,700배 확장을 초래한다(18명의 공여자로부터 N=113, 도 20). PBMC로부터 단리된 휴지기(resting) NK 세포 및 PM21-입자를 사용하여 일치(matching) 공여자로부터 확장된 NK 세포(PM21-NK 세포)를 qRT-PCR 및 유세포측정법에 의해 TIGIT 발현에 대해 분석하였다. TIGIT는 휴지기 NK 세포와 비교하여 PM21-NK 세포에서 RNA 수준에서 상향조절되었다(6±3배; p=0.04)(도 2, 좌측 패널). 더욱이, TIGIT+ NK 세포의 백분율은 휴지기 NK 세포와 비교하여 PM21-NK 세포에서 증가되었으며(N=8, p<0.0001), 이때 발현은 휴지기 NK 세포에서 2%로부터 44%까지의 범위이고 PM21-NK 세포에서 39%로부터 88%까지의 범위였다(도 2, 우측 패널). 다른 NK 세포 활성화 방법이 또한 TIGIT 발현을 유도하는지 결정하기 위해, T 세포-고갈 PBMC를 IL-2(1000 U/mL) 또는 IL-12(10 μg/mL), IL-15(100 μg/mL) 및 IL-18(50 μg/mL)의 조합으로 밤새 자극시키고, TIGIT를 발현하는 NK 세포의 백분율을 휴지기 NK 세포의 백분율과 비교하였다. TIGIT 발현은 휴지기 NK 세포(21±13%)와 비교하여 IL-2 활성화된 NK 세포(69±3%, p<0.0001) 및 IL-12/15/18 활성화된 NK 세포(60±15%, p=0.0001)에서 상향조절되었고, PM21-NK 세포(67±16%)에서의 발현 수준과 비교할 만하였다(도 3). 종합하자면, 이들 발견은 PM21-입자 또는 사이토카인 활성화를 이용한 확장 시 NK 세포가 RNA 수준과 표면 단백질 수준 둘 다에서 TIGIT를 상향조절함을 실증한다.
TIGIT 양성 PM21-NK 세포는 TIGIT 음성 PM21-NK 세포와 비교하여 더 높은 수준의 활성화 수용체 및 저해성 수용체를 발현한다. TIGIT의 발현이 NK 세포의 표현형 및/또는 활성화 상태의 임의의 변화와 연관이 있는지 결정하기 위해, 주요 활성화 수용체 및 저해성 수용체의 발현 수준을 TIGIT+ PM21-NK 세포와 TIGIT- PM21-NK 세포 사이에서 비교하였다. 발현이 최대 수준에 있지 않고 차별적인 발현이 여전히 평가될 수 있을 때 확장 제14일 전에 세포 상에서 차이를 평가하였다. 일반적으로, 활성화 수용체 및 다른 저해성 수용체의 발현은 TIGIT- PM21-NK 세포와 비교하여 TIGIT+ PM21-NK 세포 상에서 증가되었고, 도 16a에 요약되었다. 활성화 수용체 CD16, NKp30, NKp46, DNAM-1 및 NKG2D를 발현하는 NK 세포의 퍼센트는 공여자 사이에서 다양하였으나, DNAM-1을 제외한 모든 활성화 수용체에 대해 공여자-일치 쌍에서 TIGIT+ NK 세포 대 TIGIT- NK 세포에 대해 증가되었다(p=0.02 이하). DNAM-1은 모든 PM21-NK 세포 상에서 도처에서 그리고 고도로 발현되었으며, 평균적으로 98% 초과의 TIGIT- NK 세포와 TIGIT+ NK 세포 둘 다에서 발현되었다(도 16b). 저해성 수용체 CD96, TIM-3, NKG2A 및 LAG-3이 또한 PM21-NK 세포 상에서 발현되었으며, 한편 PD-1은 2% 미만의 PM21-NK 세포 상에서 검출되었다(도 16c). 유의하게 더 높은 백분율의 TIGIT+ NK 세포는 공여자-일치 TIGIT- NK 세포와 비교하여 CD96(p=0.01) 및 TIM-3(p=0.003)을 발현하였으며, 한편 NKG2A 및 LAG-3의 발현은 TIGIT+ NK 세포와 TIGIT- NK 세포 사이에서 유의하게 상이하지 않았다. 이들 발견은 TIGIT+ NK 세포가 전형적으로 활성화 시 유도되는 중요한 활성화 수용체 및 일부 저해성 수용체를 더 높은 수준으로 발현하는 더 많이 활성화된 세포 하위집단을 나타냄을 보여준다.
TIGIT 차단은 3D 폐 종양 스페로이드에 대한 PM21-NK 세포 세포독성을 증강시킨다. PM21-NK 세포 항종양 기능에 미치는 TIGIT 차단의 효과를 평가하기 위해, A549 폐 종양 세포에 대한 PM21-NK 세포 세포독성을 검사하였다. 이 세포주는 TIGIT에 결합할 수 있는 PVRL4가 아니라 PVR 및 PVRL2를 발현한다(표 1). 3명의 공여자로부터의 PM21-NK 세포를 2D A549 폐암 세포 단층과 0.33:1 NK:A549 비로 항-TIGIT 항체 또는 이소형 대조군의 존재 하에 공동배양하였고, 세포독성을 생세포 이미지화 검정법으로 측정하였다. PM21-NK 세포 사멸화의 어떠한 유의한 증강도 72시간에 걸쳐 TIGIT 차단으로 발생하지 않았다(이소형 대조군 대 항-TIGIT 항체의 존재 하에서의 세포독성은 24시간째에 14±10% 대 15±9%이고, 48시간째에 27±11% 대 31±7%이고, 72시간째에 44±9% 대 50±4%였음)(도 17a). 농도-의존적 세포독성 곡선을 또한 1명의 공여자에 대해 이들 시점 각각에서 결정하였고, TIGIT 차단이 있을 때 또는 없을 때 어떠한 사멸화 차이도 관찰되지 않았다(24시간째에 559±18% 비(ratio) 대 525±24% 비, 48시간째에 689±17% 비 대 629±37% 비, 및 72시간째에 751±14% 비 대 697±25% 비)(도 17b).
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TIGIT의 차단이 암 환경을 더 잘 모방하는 폐암 스페로이드에의 노출 동안 PM21-NK 세포 세포독성에 영향을 미치는지 결정하기 위해, PM21-NK 세포를 A549 세포 스페로이드와 함께 공동배양하고, 시간 경과에 따른 이의 사멸화, 뿐만 아니라 NK 세포 표현형을 공동배양 종료 시 평가하였다. PM21-NK 세포를 항-TIGIT 또는 이소형 대조군 항체의 존재 하에 종양 스페로이드에 7일 동안 노출시켰다. 여러 시점에서의 대표적인 이미지는 항-TIGIT의 존재 하에 A549 스페로이드의 증가된 사멸화를 보여주며, 이는 생성된 스페로이드의 더 작은 크기(도 21a) 및 저하된 상대 확장(도 21b)에 의해 명백해진다. 시간 경과에 따른 세포독성 곡선을 결정하고, 1명의 공여자로부터의 대표적인 곡선 및 다수의 공여자로부터의 요약 세포독성 데이터를 도 17c에 도시한다. TIGIT 차단은 공여자에 걸쳐 72시간째에 A549 스페로이드에 대한 PM21-NK 세포 세포독성을 평균 20%만큼 증강시켰다(p<0.0001, 1:1 PM21-NK 세포:A549 세포, N=6)(도 17c). 다수의 활성화 수용체 및 저해성 수용체의 발현을 항-TIGIT 항체의 존재 또는 부재 하에 A549 스페로이드에의 노출 후 3명의 공여자로부터의 PM21-NK 세포 및 비노출된 대조군 PM21-NK 세포 상에서 평가하였다. 단독으로 또는 TIGIT 차단과 함께 종양 노출은 이소형 대조군 또는 비노출 NK 세포와 비교하여 저해성 수용체 TIM-3, NKG2A, LAG-3, PD-1 또는 CD96을 발현하는 NK 세포의 빈도를 변화시키지 않았다(도 17d). 유사하게는, TIGIT 차단과 함께 또는 없이 종양 노출 후 활성화 수용체 CD16, NKG2D, NKp30, NKp46 및 DNAM-1의 발현에서 어떠한 차이도 없었지만, 특히 이소형 대조군과 함께 스페로이드 노출 시 NKG2D의 감소된 발현을 향한 경향이 있었다(도 17d). TIGIT 차단 시 폐암 스페로이드에 대한 NK 세포 세포독성의 증강이 단일 세포주로 단리되지 않음을 확인하기 위해, 항-TIGIT 항체의 시험을 또한 NCI-H1299, NCI-H358 및 NCI-1075 폐암 세포주에서 수행하였다. 이들 세포주는 또한 PVR 및 PVRL2를 고도로 발현하는 한편, H358은 또한 시험된 TIGIT 리간드 중에서 PVRL4를 발현한다(표 1). 이들 세포주의 스페로이드에 대한 PM21-NK 세포 세포독성을 생세포 이미지화 검정법을 사용하여 결정하였다. 각각의 세포주는 표적 세포가 사멸화되는 상이한 속도를 가졌으나, 모두 TIGIT 차단 시 증강된 세포독성을 실증하였다(도 18a). 사멸화의 규모에서 공여자-의존 변동성이 있긴 하였지만, TIGIT 차단은 시험된 모든 세포주에 대해 공여자-일치 비교에서 세포독성을 증가시켰고(NCI-H1299 p=0.02, NCI-H358 p=0.01, NCI-1975 p=0.005), H1299의 사멸화를 평균 12%만큼, H358의 사멸화를 18%만큼, 그리고 H1975의 사멸화를 놀랍도록 88%만큼 증강시켰다(도 18b). 종합하여, 이들 발견은 3D 스페로이드 모델에서, TIGIT 차단이 NK 세포의 표현형의 변화 없이 폐암 세포에 대한 PM21-NK 세포의 세포독성을 증강시킴을 나타낸다.
TIGIT 차단은 암세포 스페로이드와의 공동배양 후 PVR 양성 암세포에 대한 PM21-NK 세포 이펙터 기능을 보존한다. NK 세포 소진은 종양 미세환경의 맥락에서 발생할 수 있으며, 이로써 종양에의 장기간 노출은 감소된 이펙터 기능, 변경된 표현형 또는 감소된 사멸화를 유발할 수 있다. NK 세포 소진을 유발하는 기전은 잘 정의되어 있지 않지만, 최근의 연구는 악화된 저해성 수용체 신호전달에 대한 역할을 보여주었다. 이전의 연구는 만성 저해성 신호전달이 세포독성 면역 세포의 소진을 촉진하고, TIGIT가 종양-보유 마우스 모델 및 암 환자에서 NK 세포 소진과 연관이 있었음을 보고하였다. TIGIT 차단이 종양 스페로이드에 노출 시 PM21-NK 세포에서 소진의 징후를 완화시킬 수 있는지 결정하기 위해, 시험관내 소진 모델을 개발하였다. PM21-NK 세포를 우선 항-TIGIT 또는 이소형 대조군 항체의 존재 하에 A549 스페로이드와 함께 7일 동안 공동배양하였다. 그 후에, NK 세포를 PVR- 또는 PVR+ K562 세포로 자극시키고, 이펙터 사이토카인의 생산 및 탈과립화를 평가하였다. 비노출된, 비자극된 PM21-NK 세포를 음성 대조군으로서 사용한 한편, PVR+ K562 또는 PVR- K562로 자극된 비노출된 PM21-NK 세포를 양성 대조군으로서 사용하였다. 생체내 소진 모델의 개략도는 도 19a에 도시되어 있다.
비노출된 PM21-NK 세포가 K562 세포로 자극되었을 때, IFNγ를 발현하는 NK 세포의 백분율은 1% 미만으로부터 PVR- K562 세포로 자극되었을 때 15±5%(p=0.0002)로 그리고 PVR+ K562 세포로 자극되었을 때 14±7%(p<0.0001)로 증가하였다(도 19b). A549 스페로이드 공동배양 후 K562 세포를 이용한 재자극은 IFNγ를 발현하는 PM21-NK 세포를 더 낮은 백분율로 초래하였고(PVR-에 대해 8±5%; p=0.03 및 PVR+ 세포에 대해 4±3%; p=0.0002)(도 19b), 감소는 PVR+ 세포를 사용하였을 때 더 컸다(p=0.04). A549 스페로이드와의 공동배양 동안 TIGIT 차단은 PVR- 세포로 재자극시킨 후 종양 유도 IFNγ 발현 감소를 경감시켰으며, 이때 여전히 단지 9±7%의 세포만 IFNγ를 발현하였다. 대조적으로, PVR+ K562 세포를 이용한 재자극은 NK 세포에서의 IFNγ 발현을 이소형 대조군 이용 시 3±2%로부터 항-TIGIT 이용 시 7±4%로 증가시켰으며, 그렇지만 유의성에 도달하지 않았다(p=0.1)(도 19b). 부가적으로, 항-TIGIT 항체가 초기 종양 공동배양물에 존재하였을 때 PVR- 또는 PVR+ K562 세포 재자극 사이에서 IFNγ 발현에 더 이상 유의한 차이가 없었으며, 이는 초기 차이가 TIGIT 의존적이었음을 나타낸다. 그러므로, 종양 노출은 IFNγ 생성 용량의 80%에 가까운 소실을 초래하였으며, 이때 이러한 소실 중 약 30%는 TIGIT/PVR 연계에 의존하였다.
TNFα 생성은 또한 종양 노출에 의해 부정적인 영향을 받았으며, 이때 대부분의 감소는 TIGIT/PVR 축(axis)에 의해 구동되었다. K562 세포를 이용한 비노출 PM21-NK 세포의 자극은 비자극 세포와 비교하여 TNFα+ NK 세포의 빈도 증가를 초래하였다(PVR- K562 세포 자극 시 4±1% 대 29±5%; p<0.0001 및 PVR+ K562 세포의 경우 4% 대 28±3%; p<0.0001)(도 19b). 비노출 세포와 비교하여, 이소형 대조군 또는 항-TIGIT 항체의 존재 하에 A549 종양 노출은 PVR- K562 세포 재자극에 반응하여 유도된 TNFα+ NK 세포의 빈도 변화를 초래하지 않았다(이소형 대조군의 존재 시 27±6% 및 항-TIGIT 항체의 경우 30±8%)(도 19b). 그러나, PVR+ K562 세포를 이용한 재자극은 PVR- K562 세포 재자극과 비교하여(PVR- 세포의 경우 27±6% 대 PVR+ 세포의 경우 15±5%; p=0.008), 또는 PVR+ K562 세포로 자극된 비노출 NK 세포와 비교하여(비노출의 경우 28±3% 대 스페로이드 노출의 경우 15±5%; p=0.0001) 이소형 대조군 항체와 함께 공동배양 후 더 낮은 빈도의 TNFα+ NK 세포를 초래하였다(도 19b). 스페로이드 공동배양 동안 TIGIT의 차단은 PVR+ K562 세포를 이용한 재자극 후 TNFα를 발현하는 NK 세포 중 28±7%와 함께 TNFα+ NK 세포의 빈도 감소를 방지하였고; 빈도는 비노출 자극된 NK 세포(28±3%) 및 PVR- K562 세포로 자극된 노출 NK 세포(27±6%)와 비교할 만하였다(도 19b). 그러므로, TIGIT의 차단은 NK 세포의 TNFα 생산 용량을 완전히 복구시켰다.
TIGIT 차단은 또한 종양 공동배양 후 PVR+ 세포 재자극 시 PM21-NK 세포가 탈과립화하는 능력의 대부분을 복구시켰다. 탈과립화의 마커인 표면 CD107a 발현은 K562 세포로 자극 시 비노출 PM21-NK 세포에서 증가하였으며, 이때 탈과립화 CD107a+ NK 세포의 빈도는 비자극 시 6±3%로부터 PVR- K562 세포로 자극 시 53±9%(p<0.0001)까지 그리고 PVR+ K562 세포 자극 후 44±5%(p<0.0001)까지 증가하였다(도 19b). 이소형 대조군 항체의 존재 하에 종양 공동배양은 K562 세포로 재자극 시 CD107a+ NK 세포의 빈도를 감소시켰으며(PVR-의 경우 37±5%; p=0.004 및 PVR+의 경우 19±8%; p<0.0001), 이때 PVR- 세포와 비교하여 PVR+ K562 세포에서 더 크게 감소되었다(p=0.005). 종양 공동배양 동안 TIGIT 차단은 단지 PVR+ K562 재자극된 NK 세포에 대해 CD107a 발현을 복구시켰으며; PVR- K562 재자극된 NK 세포에 대해 관찰된 것과 비교할 만한 빈도의 CD107a+ NK 세포를 초래하는 이소형 대조군 조건과 비교하여 CD107a+ NK 세포의 빈도 증가를 초래하였고(TIGIT 차단의 경우 41% 대 이소형 대조군의 경우 19%; p<0.0001), 이는 TIGIT 차단 후 변하지 않은 채로 있었다(PVR+ 세포 재자극의 경우 41% 대 PVR- 세포 재자극의 경우 39%).
요약하자면, 노출되지 않은 NK 세포를 K562 세포로 자극시키는 것과 비교하여 K562 세포로 재자극 후, IFNγ, TNFα를 생산하고 탈과립화하는 NK 세포의 감소된 빈도를 초래하는 종양에서의 NK 세포 소진의 증가가 관찰되었고, 이러한 감소는 PVR+ K562 세포로 재자극되었을 때 더 컸다. TIGIT 차단은 종양-노출된 PM21-NK 세포에서 PVR+ 세포로 재자극 시 IFNγ, TNFα를 생산하고 CD107a를 탈과립화하는 NK 세포의 능력을 PVR- K562 세포를 이용한 재자극과 비교할 만한 수준 또는 PVR+ K562 세포로 자극된 비노출 NK 세포에 대해 관찰된 수준으로 다시 복구시켰다.
노출-후 PM21-NK 세포의 이펙터 기능에 미치는 TIGIT 차단의 보호 효과가 전사 수준에서 발생하는지의 여부를 결정하기 위해, NK 세포를 A549 스페로이드와 함께 7일 동안 공동배양한 후 선택하였고, 시퀀싱 및 전사체학 분석을 위해 RNA를 추출하였다(도 19a에 도시된 개략도). 유전자 세트 농화 분석은 TIGIT 차단이 NFkB를 통한 TNFα 신호전달, 염증 반응, IFNγ 반응 및 IFNα 반응 유전자 세트를 포함한 특징 유전자 세트를 상향조절하였음을 드러내었다(도 19c). 전사체에서의 이들 농화는 A549 공동배양 후 TIGIT 차단 시 PM21-NK 세포의 더 활성화된 상태(57)를 나타낸다. 종합하자면, 기능적 및 전사체학 분석으로부터의 이들 관찰은 TIGIT 차단이 암세포 스페로이드에의 장기간 노출 후 PVR 양성 암세포에 대한 PM21-NK 세포 항종양 기능을 복구시킴을 실증한다.
생체외 확장된 NK 세포는 이의 넓은 항종양 기능으로 인해 유망한 암 면역치료법 플랫폼으로서 출현하였다. 이전의 임상 연구는 생체외 확장된-NK 세포 및 CAR-NK 세포가 GVHD의 유도 없이 암 치료법으로서 안전함을 실증하였다. 그러나, NK 세포는 TIGIT와 같은 다수의 저해성 수용체를 발현하며, 이러한 수용체는 NK 세포 항종양 활성을 억제시키기 위해 종양 미세환경에서 암세포에 의해 활용될 수 있고 NK 세포-기초 암 면역치료법의 효능을 제한할 수 있다. 그러므로, 저해성 수용체 신호전달을 이해하고 치료적 차단 전략을 개발하는 것은 항종양 반응을 추가로 향상시킬 수 있다.
이전의 연구는 TIGIT 신호전달이 암 면역력 주기의 다수의 단계를 조절하고 TIGIT 차단이 전임상 연구에서 종양 성장 및 생존율을 유의하게 저하시킴을 보여주었다. TIGIT+ NK 세포는 여러 암에서 더 소진적인 표현형을 나타내고, TIGIT의 차단은 암세포에 대한 NK 세포 항종양 활성을 향상시킨다. 그러므로, TIGIT 차단의 효과에 대한 연구는 전임상 마우스 모델에서 더욱 제한되었고, 인간 NK 세포에서 TIGIT 차단을 특징화하는 기계론적 시험관내 연구가 제한된다. 이 연구에서, 생체외 확장된 PM21-NK 세포에서 TIGIT 신호전달의 차단 효과를 특징화하고, NK 세포 소진에 대한 신규 시험관내 모델에서 시험하였다.
TIGIT는 PM21-NK 세포의 표면 상에서 고도로 발현되는 것으로 발견되었다. IL-2 또는 IL-12/15/18로 활성화된 PM21-NK 세포뿐만 아니라 NK 세포는 TIGIT 발현을 상향조절한다. 이는 TIGIT가 NK 세포 활성화의 마커임을 나타낸다. 이전의 연구는 IL-15 자극이 NK 세포에서 TIGIT 발현을 증가시킨 유사한 발견을 보고하였다. 표현형 분석은 TIGIT+ PM21-NK 세포가 높은 수준의 다른 저해성 수용체 및 활성화 수용체를 발현함을 드러내었고, 이는 TIGIT 발현이 확장을 통한 NK 세포 활성화의 결과임을 추가로 지지한다. 놀랍게도, TIGIT 차단은 단기간 검정법에서 PM21-NK 세포 세포독성에 미치는 어떠한 효과도 갖지 않았다. 이는 DNAM-1-PVR 구동 활성화가 단기간에 PM21-NK 세포에서의 TIGIT 저해성 신호전달을 압도함을 나타낸다. 종양 미세환경에서 TIGIT의 만성 자극을 더 양호하게 모방하고 이의 차단을 평가하기 위해, 종양 스페로이드를 사용하여 세포독성 검정법을 수행하였다. TIGIT 차단은 다수의 폐암 스페로이드에 대한 PM21-NK 세포 세포독성을 향상시켰다. 이는 종양 스페로이드에의 장기간 노출 동안, TIGIT 신호전달이 NK 세포 사멸화를 저해할 수 있음을 나타낸다. 종양에의 장기간 노출 후 NK 세포의 이펙터 기능에 미치는 TIGIT 신호전달의 효과를 추가로 특징화하기 위해, 시험관내 소진 모델을 개발하였다. 항-TIGIT 또는 이소형 대조군 항체와 함께 7일 동안 A549 종양 스페로이드에 노출 후, PM21-NK 세포를 PVR- 또는 PVR+ K562 세포로 재시험감염시켜 각각의 이펙터 기능의 저하에 대한 PVR/TIGIT 축의 기여도를 확인하였다. 이 모델로부터, NK 세포 소진의 징후는 표면 CD107a 발현에 의해 측정된 바와 같이 이펙터 사이토카인 IFNγ 및 TNFα의 감소된 발현 및 저하된 탈과립화에 의해 입증되었고, 재노출 시 만성 TIGIT 연계의 결과 상이한 정도였으며, 이는 TIGIT는 NK 세포 소진에 대한 유일한 기여자는 아니지만 주요 기여자이다. 재자극 시 TNFα 발현의 감소는 종양-노출된 NK 세포가 PVR+ 세포로 재시험감염되었을 때만 관찰되었고, 그 효과는 TIGIT 차단으로 완전히 경감되었다. 이는 이 모델에서 관찰된 TNFα 발현의 감소가 원칙적으로 TIGIT로부터 구동됨을 나타낸다. 대조적으로, 종양-노출 NK 세포에서 IFNγ 및 CD107a 발현은 PVR- 재자극과 PVR+ 재자극 둘 다에 대한 반응에서 감소된 발현을 보여주었으며, 이는 종양 노출 동안 부가적인 기전이 IFNγ 생산 및 탈과립화에서 결손(deficit)을 유발하였음을 나타내었다. 그러나, TIGIT 차단은 발현 수준을 PVR- 세포에 대한 반응과 비교할 만한 수준까지 완전히 복구시켰다. 주목할 만하게는, 비노출 NK 세포에서 TIGIT 차단은 PVR- 또는 PVR+ K562 세포를 이용한 자극 시 IFNγ, TNFα 또는 CD107a 발현에 미치는 어떠한 효과도 갖지 않았다(도 22a). PVR- 또는 PVR+ K562 세포에 대한 세포독성에 미치는 어떠한 효과도 관찰되지 않았다(도 22b). NK 세포를 PVR+ 암세포로 재자극시켰을 때 장기간 노출 모델에서만 복구 효과가 관찰되었다는 사실은 TIGIT 연계에 대한 민감화가 종양 스페로이드 노출 동안 발생함을 나타낸다.
장기간 노출 시 이펙터 기능의 감소가 관찰되긴 하였지만, PM21-NK 세포는 여전히 비노출 PM21-NK 세포와 비교하여 PVR+ K562 세포를 이용한 재자극 시 50% 더 적은 세포가 탈과립화하고 TNFα를 생산하는 어느 정도의 세포독성 기능을 여전히 보유하였다. 요약하자면, 이는 TIGIT 차단이 종양에 노출된 NK 세포에서 TIGIT-구동 소진을 완화시키기 위한 효과적인 접근법이고 PVR+ 암세포에 대한 이펙터 기능을 보존할 수 있음을 실증하였다. A549 스페로이드에의 노출 후 NK 세포의 전사체학 분석은 염증 반응 및 TNFα 신호전달에 관여하는 TIGIT 차단 상향조절된 유전자 세트를 확인시켜 주었고, 이들 NK 세포의 더 활성화된 상태를 나타내었다.
이전의 연구는 암세포가 PD-1 신호전달 차단에 대한 내성을 획득하고 T 세포 상에서 TIGIT를 상향조절할 수 있음을 보여주었다. 이러한 발견은 PM21-NK 세포의 TIGIT 차단 후 추가 내성에 관여하는 대안적인 수용체를 찾기 위해 표현형 변화를 검사하는 것이 중요함을 나타낸다. 흥미롭게도, 장기간 스페로이드 모델에서 TIGIT 차단 시 PM21-NK 세포에 미치는 활성화 수용체 및 저해성 수용체의 어떠한 유의한 변화도 없었다. 이들 관찰은 PD-1 신호전달과 달리, TIGIT 신호전달의 차단이 대안적인 내성 기전을 획득하는 경향이 더 적을 수 있음을 나타낸다. 다수의 마우스 모델에서의 연구는 TIGIT 차단이 NK 세포 소진과 T 세포 소진 둘 다를 방지할 수 있음을 나타내었다. 항-TIGIT 항체의 효능은 NK 세포에 의존하였고, NK 세포는 T 세포 항종양 활성을 증강시켰다. 그러므로, 입양 NK 세포는 NK 세포 구획이 빈번하게 결여되는 암 환자에서 암세포에 대한 전체 T 세포 면역 반응을 부스팅함으로써 항-TIGIT 항체의 효능을 추가로 향상시킬 수 있다.
요약하자면, 이 연구는 생체외 확장된-인간 NK 세포에서 TIGIT 차단의 분자 기전에 대한 식견을 제공한다. 항-TIGIT 항체는 PM21-NK 세포 종양 면역력의 효능을 유의하게 향상시킬 수 있고, 입양 PM21-NK 세포 및 항-TIGIT 항체는 폐 종양과 같은 암에 대한 병용 치료법으로서 사용될 수 있다.
실시예 7. TIGIT KO NK 세포는 폐암 세포에 대해 증강된 세포독성을 갖고, 치료적 TIGIT 항체와 조합되어 아군사멸화에 대해 내성이다.
TIGIT 차단은 암 치료를 위한 유망한 새로운 접근법이고, 현재 PD-1/PD-L1 차단과 조합되어 후기 임상 개발중에 있다. 전임상 연구는 TIGIT 항체의 항종양 반응에서 NK 세포의 관여를 나타내었다. 더욱이, 뮤린 연구는 TIGIT를 표적화하는 치료용 항체에서 ADCC-적격 Fc의 포함이 아마도 Fcγ 연계를 통해 TIGIT+ Treg의 결실 및/또는 골수성 세포의 활성화를 통해 항종양 반응에 중요하였음을 입증하였다. 그러므로, 현재 개발중에 있는 대부분의 치료용 항-TIGIT 항체는 ADCC와 연계하는 데 적격이고 일부는 이를 위해 추가로 최적화되는 Fc를 갖는다. 티라골루맙(Fc 적격, Roche)을 이용한 초기 임상 연구는 TIGIT가 항-PD-L1 단독(아테졸리주맙)과 비교하여 반응율 및 반응의 지속기간을 유의하게 증가시키지만 고빈도의 PD-L1 양성 세포(>50%)를 갖는 종양을 갖는 환자에서만 그러하였음을 보여주었다. 초기 결과가 고도로 고무적이긴 하였지만, 티라골루맙은 NSCLC 및 SCLC의 3상 연구에서 실패하였다.
대부분의 활성화된 NK 세포는 활성화 시 높은 수준의 TIGIT를 발현한다. 활성화된 NK 세포는 종양에 반응하고, 표적화된 종양 상에서 PD-L1의 유도를 유발하는 IFNγ를 분비한다. 그러므로, TIGIT 차단을 통한 활성화된 NK 세포의 존재 및 PD-L1의 유도는 PD-(L)1/TIGIT 차단 콤보에 대해 증강된 반응을 유발해야 한다. 그러나, 활성화된 NK 세포 상에서 고도로 발현되는 TIGIT에의 ADCC 적격 항체의 결합은 또한 아군사멸화 및 NK 세포 고갈을 유발할 수 있다. 그러므로, 입양 전달 전에 NK 세포에서 TIGIT의 넉아웃은 Fc 적격 항-TIGIT 치료제와 조합되어 사용된다면 종양의 NK 세포 사멸화를 증가시킬 뿐만 아니라 NK 세포 아군사멸화를 방지할 수 있다.
NK 세포 아군사멸화에 미치는 Fc-적격 TIGIT 항체의 효과를 평가한다. 이전이 연구는 항-TIGIT 항체의 효과가 TIGIT 발현 Treg 세포의 Fc-의존적 고갈을 통한 것인지 검사하였다. PM21 NK 세포가 TIGIT를 고도로 발현하기 때문에, Fc-적격 항-TIGIT 항체가 PM21 NK 세포 아군사멸화를 유도하는지의 여부를 시험하였다. 이 실험에서, PM21 NK 세포 및 TIGIT KO NK 세포를 Fc-적격 항-TIGIT 항체(실험), Fc-적격이 아닌 항-TIGIT 항체, 및 Fc-적격 항-CD38(양성 대조군)과 함께 인큐베이션하였고, 아군사멸화 효과를 이해하기 위해 절대 생(live) NK 세포를 결정하였다. PM21 NK 세포 단독을 음성 대조군으로서 사용할 수 있다. 도 9 및 도 10은 Fc-적격(인간화) TIGIT 항체(티라골루맙)가 TIGIT KO PM21 NK 세포가 아니라 PM21 NK 세포의 중등도(moderate) 아군사멸화를 유도할 수 있음을 보여준다.
도 31a에 도시된 바와 같이, WT PM21-NK 세포 및 TIGIT KO PM21-NK 세포를 비(non)-Fc 적격 항-TIGIT 항체 및 Fc 적격 항-TIGIT 항체(티라골루맙)와 함께 24시간 동안 공동배양하였다. NK 세포를 Dioc6 및 Draq7로 염색하여 생존한 NK 세포를 계수하였다. 티라골루맙은 TIGIT KO PM21-NK 세포에 대해서가 아니가 WT PM21-NK 세포에 대해 유의한 아군사멸화를 유도하였다(N = 3명의 공여자, 각각 삼중복물). 데이터는 스캐터 플롯으로서 또는 표준 편차를 나타내는 오차 막대가 있는 막대 그래프로서 제시된다. 통계적 유의성은 다중 독립 t-검정에 의해 결정되었다. P 값은 p<0.05이면 *, p<0.01이면 **, p<0.001이면 ***, p<0.0001이면 ****로서 표시된다. 도 31b) 확장된 WT PM21-NK 세포 및 TIGIT KO PM21-NK 세포(3333 NK 세포/웰)를 비-Fc 적격 항-TIGIT 항체 또는 Fc-적격 항-TIGIT 항체(티라골루맙)와 함께 또는 없이 A549 스페로이드와 함께 7일 동안 공동배양하였다. NK 세포 세포독성을 동적 생세포 이미지화에 의해 결정하였다. 요약 플롯은 WT PM21-NK 세포가 비-Fc 적격 항-TIGIT 항체(굵은 청색 정사각형)와 비교하여 Fc-적격 항-TIGIT 항체(굵은 적색 삼각형)의 존재 하에 A549 스페로이드에 대해 유의하게 더 낮은 세포독성을 보여주며, 비-Fc 적격 항-TIGIT 항체 및 Fc 적격 항-TIGIT 항체(N = 3명의 공여자, 각각 삼중복물)의 존재 하에 TIGIT KO PM21-NK 세포에 대해 어떠한 유의한 변화도 없었음을 보여준다. 데이터는 스캐터 플롯으로서 또는 표준 편차를 나타내는 오차 막대가 있는 막대 그래프로서 제시된다. 통계적 유의성은 다중 독립 t-검정에 의해 결정되었다. P 값은 p<0.05이면 *, p<0.01이면 **, p<0.001이면 ***, p<0.0001이면 ****로서 표시된다.
TIGIG KO NK 세포가 향상된 생체내 지속성을 나타내었는지의 여부를 시험하기 위해, 1 × 106개의 폐암 세포주 NCI-H358-GFP-luc 또는 NCI-H1299-GFP-luc를 NSG(NOD-scid IL-2Rγnull) 암컷 마우스의 복강내(i.p.) 공간에 주사하고, 3일 동안 시딩되게 하였다. 그 후에, 마우스를 1명의 공여자로부터의 WT 또는 TIGIT KO NK 세포로 치료하고, IL-2(25,000 U, 3x/주)와 함께 i.p. 주사하였다. 마우스를 NK 세포 주사 후 12일째에 안락시시켰다. 복부 세척액을 유세포측정법에 의해 분석하여, hCD45+ 세포 상에서 게이팅하였다. hNK(CD3-, CD56+)의 백분율을 hCD45+ 집단에서 결정하였다. H358 또는 H1299 폐 종양 세포가 주사된 마우스로부터의 WT NK 세포(검정색 원형)와 비교하여 TIGIT KO NK 세포(적색 삼각형)로 치료된 마우스로부터 더 많은 NK 세포를 회수하였고, H358-보유 마우스는 통계적 유의성에 도달하였다(도 32). 통계적 유의성은 독립 t-검정에 의해 결정되었다. P 값은 p < 0.05이면 *로 표시된다.
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서열
서열 번호 1(TIGIT에 대한 폴리펩타이드 서열)
MRWCLLLIWAQGLRQAPLASGMMTGTIETTGNISAEKGGSIILQCHLSSTTAQVTQVNWEQQDQLLAICNADLGWHISPSFKDRVAPGPGLGLTLQSLTVNDTGEYFCIYHTYPDGTYTGRIFLEVLESSVAEHGARFQIPLLGAMAATLVVICTAVIVVVALTRKKKALRIHSVEGDLRRKSAGQEEWSPSAPSPPGSCVQAEAAPAGLCGEQRGEDCAELHDYFNVLSYRSLGNCSFFTETG
서열 번호 2(PVRIG에 대한 폴리펩타이드 서열)
MRTEAQVPALQPPEPGLEGAMGHRTLVLPWVLLTLCVTAGTPEVWVQVRMEATELSSFTIRCGFLGSGSISLVTVSWGGPNGAGGTTLAVLHPERGIRQWAPARQARWETQSSISLILEGSGASSPCANTTFCCKFASFPEGSWEACGSLPPSSDPGLSAPPTPAPILRADLAGILGVSGVLLFGCVYLLHLLRRHKHRPAPRLQPSRTSPQAPRARAWAPSQASQAALHVPYATINTSCRPATLDTAHPHGGPSWWASLPTHAAHRPQGPAAWASTPIPARGSFVSVENGLYAQAGERPPHTGPGLTLFPDPRGPRAMEGPLGVR
서열 번호 3(CD96에 대한 폴리펩타이드 서열)
MEKKWKYCAVYYIIQIHFVKGVWEKTVNTEENVYATLGSDVNLTCQTQTVGFFVQMQWSKVTNKIDLIAVYHPQYGFYCAYGRPCESLVTFTETPENGSKWTLHLRNMSCSVSGRYECMLVLYPEGIQTKIYNLLIQTHVTADEWNSNHTIEIEINQTLEIPCFQNSSSKISSEFTYAWSVENSSTDSWVLLSKGIKEDNGTQETLISQNHLISNSTLLKDRVKLGTDYRLHLSPVQIFDDGRKFSCHIRVGPNKILRSSTTVKVFAKPEIPVIVENNSTDVLVERRFTCLLKNVFPKANITWFIDGSFLHDEKEGIYITNEERKGKDGFLELKSVLTRVHSNKPAQSDNLTIWCMALSPVPGNKVWNISSEKITFLLGSEISSTDPPLSVTESTLDTQPSPASSVSPARYPATSSVTLVDVSALRPNTTPQPSNSSMTTRGFNYPWTSSGTDTKKSVSRIPSETYSSSPSGAGSTLHDNVFTSTARAFSEVPTTANGSTKTNHVHITGIVVNKPKDGMSWPVIVAALLFCCMILFGLGVRKWCQYQKEIMERPPPFKPPPPPIKYTCIQEPNESDLPYHEMETL
서열 번호 4(DNAM-1에 대한 폴리펩타이드 서열)
MDYPTLLLALLHVYRALCEEVLWHTSVPFAENMSLECVYPSMGILTQVEWFKIGTQQDSIAIFSPTHGMVIRKPYAERVYFLNSTMASNNMTLFFRNASEDDVGYYSCSLYTYPQGTWQKVIQVVQSDSFEAAVPSNSHIVSEPGKNVTLTCQPQMTWPVQAVRWEKIQPRQIDLLTYCNLVHGRNFTSKFPRQIVSNCSHGRWSVIVIPDVTVSDSGLYRCYLQASAGENETFVMRLTVAEGKTDNQYTLFVAGGTVLLLLFVISITTIIVIFLNRRRRRERRDLFTESWDTQKAPNNYRSPISTSQPTNQSMDDTREDIYVNYPTFSRRPKTRV
서열 번호 5(LAG3에 대한 폴리펩타이드 서열)
MWEAQFLGLLFLQPLWVAPVKPLQPGAEVPVVWAQEGAPAQLPCSPTIPLQDLSLLRRAGVTWQHQPDSGPPAAAPGHPLAPGPHPAAPSSWGPRPRRYTVLSVGPGGLRSGRLPLQPRVQLDERGRQRGDFSLWLRPARRADAGEYRAAVHLRDRALSCRLRLRLGQASMTASPPGSLRASDWVILNCSFSRPDRPASVHWFRNRGQGRVPVRESPHHHLAESFLFLPQVSPMDSGPWGCILTYRDGFNVSIMYNLTVLGLEPPTPLTVYAGAGSRVGLPCRLPAGVGTRSFLTAKWTPPGGGPDLLVTGDNGDFTLRLEDVSQAQAGTYTCHIHLQEQQLNATVTLAIITVTPKSFGSPGSLGKLLCEVTPVSGQERFVWSSLDTPSQRSFSGPWLEAQEAQLLSQPWQCQLYQGERLLGAAVYFTELSSPGAQRSGRAPGALPAGHLLLFLILGVLSLLLLVTGAFGFHLWRRQWRPRRFSALEQGIHPPQAQSKIEELEQEPEPEPEPEPEPEPEPEPEQ
서열 번호 6(PD-1에 대한 폴리펩타이드 서열)
MQIPQAPWPVVWAVLQLGWRPGWFLDSPDRPWNPPTFSPALLVVTEGDNATFTCSFSNTSESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDCRFRVTQLPNGRDFHMSVVRARRNDSGTYLCGAISLAPKAQIKESLRAELRVTERRAEVPTAHPSPSPRPAGQFQTLVVGVVGGLLGSLVLLVWVLAVICSRAARGTIGARRTGQPLKEDPSAVPVFSVDYGELDFQWREKTPEPPVPCVPEQTEYATIVFPSGMGTSSPARRGSADGPRSAQPLRPEDGHCSWPL
서열 번호 7(CTLA-4에 대한 폴리펩타이드 서열)
MACLGFQRHKAQLNLATRTWPCTLLFFLLFIPVFCKAMHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKATEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYLGIGNGTQIYVIDPEPCPDSDFLLWILAAVSSGLFFYSFLLTAVSLSKMLKKRSPLTTGVYVKMPPTEPECEKQFQPYFIPIN
서열 번호 8(TIM-3에 대한 폴리펩타이드 서열)
MFSHLPFDCVLLLLLLLLTRSSEVEYRAEVGQNAYLPCFYTPAAPGNLVPVCWGKGACPVFECGNVVLRTDERDVNYWTSRYWLNGDFRKGDVSLTIENVTLADSGIYCCRIQIPGIMNDEKFNLKLVIKPAKVTPAPTRQRDFTAAFPRMLTTRGHGPAETQTLGSLPDINLTQISTLANELRDSRLANDLRDSGATIRIGIYIGAGICAGLALALIFGALIFKWYSHSKEKIQNLSLISLANLPPSGLANAVAEGIRSEENIYTIEENVYEVEEPNEYYCYVSSRQQPSQPLGCRFAMP
서열 번호 9(NKG2A에 대한 폴리펩타이드 서열)
MDNQGVIYSDLNLPPNPKRQQRKPKGNKNSILATEQEITYAELNLQKASQDFQGNDKTYHCKDLPSAPEKLIVGILGIICLILMASVVTIVVIPSTLIQRHNNSSLNTRTQKARHCGHCPEEWITYSNSCYYIGKERRTWEESLLACTSKNSSLLSIDNEEEMKFLSIISPSSWIGVFRNSSHHPWVTMNGLAFKHEIKDSDNAELNCAVLQVNRLKSAQCGSSIIYHCKHKL
서열 번호 10(TIGIT, RefSeq NM_173799에 대한 폴리뉴클레오타이드 서열)
ACATCTGCTTCCTGTAGGCCCTCTGGGCAGAAGCATGCGCTGGTGTCTCCTCCTGATCTGGGCCCAGGGGCTGAGGCAGGCTCCCCTCGCCTCAGGAATGATGACAGGCACAATAGAAACAACGGGGAACATTTCTGCAGAGAAAGGTGGCTCTATCATCTTACAATGTCACCTCTCCTCCACCACGGCACAAGTGACCCAGGTCAACTGGGAGCAGCAGGACCAGCTTCTGGCCATTTGTAATGCTGACTTGGGGTGGCACATCTCCCCATCCTTCAAGGATCGAGTGGCCCCAGGTCCCGGCCTGGGCCTCACCCTCCAGTCGCTGACCGTGAACGATACAGGGGAGTACTTCTGCATCTATCACACCTACCCTGATGGGACGTACACTGGGAGAATCTTCCTGGAGGTCCTAGAAAGCTCAGTGGCTGAGCACGGTGCCAGGTTCCAGATTCCATTGCTTGGAGCCATGGCCGCGACGCTGGTGGTCATCTGCACAGCAGTCATCGTGGTGGTCGCGTTGACTAGAAAGAAGAAAGCCCTCAGAATCCATTCTGTGGAAGGTGACCTCAGGAGAAAATCAGCTGGACAGGAGGAATGGAGCCCCAGTGCTCCCTCACCCCCAGGAAGCTGTGTCCAGGCAGAAGCTGCACCTGCTGGGCTCTGTGGAGAGCAGCGGGGAGAGGACTGTGCCGAGCTGCATGACTACTTCAATGTCCTGAGTTACAGAAGCCTGGGTAACTGCAGCTTCTTCACAGAGACTGGTTAGCAACCAGAGGCATCTTCTGGAAGATACACTTTTGTCTTTGCTATTATAGATGAATATATAAGCAGCTGTACTCTCCATCAGTGCTGCGTGTGTGTGTGTGTGTGTATGTGTGTGTGTGTTCAGTTGAGTGAATAAATGTCATCCTCTTCTCCATCTTCATTTCCTTGGCCTTTTCGTTCTATTCCATTTTGCATTATGGCAGGCCTAGGGTGAGTAACGTGGATCTTGATCATAAATGCAAAATTAAAAAATATCTTGACCTGGTTTTAAATCTGGCAGTTTGAGCAGATCCTATGTCTCTGAGAGACACATTCCTCATAATGGCCAGCATTTTGGGCTACAAGGTTTTGTGGTTGATGATGAGGATGGCATGACTGCAGAGCCATCCTCATCTCATTTTTTCACGTCATTTTCAGTAACTTTCACTCATTCAAAGGCAGGTTATAAGTAAGTCCTGGTAGCAGCCTCTATGGGGAGATTTGAGAGTGACTAAATCTTGGTATCTGCCCTCAAGAACTTACAGTTAAATGGGGAGACAATGTTGTCATGAAAAGGTATTATAGTAAGGAGAGAAGGAGACATACACAGGCCTTCAGGAAGAGACGACAGTTTGGGGTGAGGTAGTTGGCATAGGCTTATCTGTGATGAAGTGGCCTGGGAGCACCAAGGGGATGTTGAGGCTAGTCTGGGAGGAGCAGGAGTTTTGTCTAGGGAACTTGTAGGAAATTCTTGGAGCTGAAAGTCCCACAAAGAAGGCCCTGGCACCAAGGGAGTCAGCAAACTTCAGATTTTATTCTCTGGGCAGGCATTTCAAGTTTCCTTTTGCTGTGACATACTCATCCATTAGACAGCCTGATACAGGCCTGTAGCCTCTTCCGGCCGTGTGTGCTGGGGAAGCCCCAGGAAACGCACATGCCCACACAGGGAGCCAAGTCGTAGCATTTGGGCCTTGATCTACCTTTTCTGCATCAATACACTCTTGAGCCTTTGAAAAAAGAACGTTTCCCACTAAAAAGAAAATGTGGATTTTTAAAATAGGGACTCTTCCTAGGGGAAAAAGGGGGGCTGGGAGTGATAGAGGGTTTAAAAAATAAACACCTTCAAACTAACTTCTTCGAACCCTTTTATTCACTCCCTGACGACTTTGTGCTGGGGTTGGGGTAACTGAACCGCTTATTTCTGTTTAATTGCATTCAGGCTGGATCTTAGAAGACTTTTATCCTTCCACCATCTCTCTCAGAGGAATGAGCGGGGAGGTTGGATTTACTGGTGACTGATTTTCTTTCATGGGCCAAGGAACTGAAAGAGAATGTG
서열 번호 11(TIGIT를 표적화하는 gRNA에 대한 서열)
ACCCTGATGGGACGTACACT
서열목록 전자파일 첨부

Claims (87)

  1. Ig 및 ITIM 도메인을 갖는 T 세포 면역수용체(TIGIT: T Cell Immunoreceptor with Ig And ITIM domain)의 발현이 억제되는 조작된 NK 세포.
  2. 제1항에 있어서, TIGIT의 발현은 TIGIT 유전자 또는 이의 단편의 결실에 의해 억제되는, 조작된 NK 세포.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, TIGIT의 발현은 CRISPR/Cas 가이드 RNA를 갖는 CRISPR/Cas 엔도뉴클레아제(Cas)9 시스템을 NK 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는 방법을 사용하여 억제되고, 상기 가이드 RNA는 TIGIT 유전자 또는 이의 단편을 표적화하는, 조작된 NK 세포.
  4. 제1항에 있어서, TIGIT의 발현은 TIGIT 폴리뉴클레오타이드를 표적화하는 siRNA 또는 shRNA에 의해 억제되는, 조작된 NK 세포.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리오바이러스 수용체-관련 면역글로불린 도메인-함유(PVRIG), CD96, 림프구 활성화 3(LAG3), TIM-3, NKG2A, PD-1 및 CTLA-4로 이루어진 군으로부터 선택되는 저해성 수용체의 발현이 억제되는 조작된 NK 세포.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, NK 세포는 1차 NK 세포 또는 NK 세포주인, 조작된 NK 세포.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, NK 세포는 확장된(expanded) NK 세포 또는 비(non)확장된 NK 세포인, 조작된 NK 세포.
  8. 제7항에 있어서, 확장된 NK 세포는 시험관내에서 또는 생체외에서 NK 세포 확장 조성물에 노출되는, 조작된 NK 세포.
  9. 제8항에 있어서, NK 세포 확장 조성물은 영양 세포(feeder cell), 조작된 PM 입자, 또는 엑소좀을 포함하는, 조작된 NK 세포.
  10. 제9항에 있어서, 영양 세포 또는 조작된 입자는 이의 외부 표면에 결합된 Fc 도메인을 포함하는, 조작된 NK 세포.
  11. 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, NK 세포 확장 조성물은 NK 세포 이펙터 제제(effector agent)를 추가로 포함하는, 조작된 NK 세포.
  12. 제11항에 있어서, NK 세포 이펙터 제제는 IL-21 및/또는 41BBL을 포함하는, 조작된 NK 세포.
  13. 대상체에서 암, 전이 또는 감염성 질환을 치료하고/하거나, 감소시키고/시키거나, 저해하고/하거나, 저하시키고/저하시키거나, 개선하고/하거나 예방하는 방법으로서, 대상체에게 치료적 유효량의 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 조작된 NK 세포를 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  14. 제13항에 있어서, 대상체에게 치료적 유효량의 TIGIT 저해제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  15. 제14항에 있어서, TIGIT 저해제는 항-TIGIT 항체인, 방법.
  16. 제15항에 있어서, 항-TIGIT 항체는 Fc 수용체에 결합하는 단편 결정화 가능 영역(Fc 영역: fragment crystallizable region)을 포함하는, 방법.
  17. 제15항에 있어서, 항-TIGIT 항체는 Fc 영역이 결여되거나 참조 대조군에 비해 Fc 수용체에 대해 저하된 친화도를 갖는 Fc 영역을 포함하는, 방법.
  18. 제13항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에게 치료적 유효량의 관문 차단제(checkpoint blockade)를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  19. 제18항에 있어서, 관문 차단제는 PD-1 저해제, PD-L1 저해제, PD-L2 저해제 또는 CTLA-4 저해제를 포함하는, 방법.
  20. 대상체에서 암, 전이 또는 감염성 질환을 치료하고/하거나, 감소시키고/시키거나, 저해하고/하거나, 저하시키고/저하시키거나, 개선하고/하거나 예방하는 방법으로서, 대상체에게 치료적 유효량의 조작된 NK 세포를 투여하는 단계를 포함하며, 상기 조작된 NK 세포는 Ig 및 ITIM 도메인을 갖는 T 세포 면역수용체(TIGIT)의 발현이 억제되는, 방법.
  21. 제20항에 있어서, TIGIT의 발현은 TIGIT 유전자 또는 이의 단편의 결실에 의해 억제되는, 방법.
  22. 제20항 또는 제21항에 있어서, TIGIT의 발현은 CRISPR/Cas 가이드 RNA를 갖는 CRISPR/Cas 엔도뉴클레아제(Cas)9 시스템을 NK 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는 방법을 사용하여 억제되고, 상기 가이드 RNA는 TIGIT 유전자 또는 이의 단편을 표적화하는, 방법.
  23. 제22항에 있어서, TIGIT의 발현은 TIGIT 폴리뉴클레오타이드를 표적화하는 siRNA 또는 shRNA에 의해 억제되는, 방법.
  24. 제20항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 조작된 NK 세포는 폴리오바이러스 수용체-관련 면역글로불린 도메인-함유(PVRIG), CD96, 림프구 활성화 3(LAG3), TIM-3, NKG2A, PD-1 및 CTLA-4로 이루어진 군으로부터 선택되는 저해성 수용체의 발현이 억제되는, 방법.
  25. 제20항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, NK 세포는 1차 NK 세포 또는 NK 세포주인, 방법.
  26. 제20항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, NK 세포는 확장된 NK 세포 또는 비확장된 NK 세포인, 방법.
  27. 제26항에 있어서, 확장된 NK 세포는 시험관내에서 또는 생체외에서 NK 세포 확장 조성물에 노출되는, 방법.
  28. 제27항에 있어서, NK 세포 확장 조성물은 영양 세포, 조작된 PM 입자, 또는 엑소좀을 포함하는, 방법.
  29. 제28항에 있어서, 영양 세포 또는 조작된 입자는 이의 외부 표면에 결합된 Fc 도메인을 포함하는, 방법.
  30. 제27항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, NK 세포 확장 조성물은 NK 세포 이펙터 제제를 추가로 포함하는, 방법.
  31. 제30항에 있어서, NK 세포 이펙터 제제는 IL-21 및/또는 41BBL을 포함하는, 방법.
  32. 제20항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에게 치료적 유효량의 TIGIT 저해제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  33. 제32항에 있어서, TIGIT 저해제는 항-TIGIT 항체인, 방법.
  34. 제33항에 있어서, 항-TIGIT 항체는 Fc 수용체에 결합하는 단편 결정화 가능 영역(Fc 영역)을 포함하는, 방법.
  35. 제34항에 있어서, 항-TIGIT 항체는 Fc 영역이 결여되거나 참조 대조군에 비해 Fc 수용체에 대해 저하된 친화도를 갖는 Fc 영역을 포함하는, 방법.
  36. 제20항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에게 치료적 유효량의 관문 차단제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  37. 제36항에 있어서, 관문 차단제는 PD-1 저해제, PD-L1 저해제, PD-L2 저해제 또는 CTLA-4 저해제를 포함하는, 방법.
  38. NK 세포를 재활성화시키고/시키거나, NK 세포 소진(exhaustion)을 역전시키고/역전시키거나 NK 세포 기능을 증강시키기 위한 시험관내 또는 생체외 방법으로서, NK 세포의 Ig 및 ITIM 도메인을 갖는 T 세포 면역수용체(TIGIT)의 발현을 억제시키거나 NK 세포를 TIGIT 저해제와 인큐베이션하는 단계를 포함하는, 방법.
  39. 제38항에 있어서, TIGIT의 발현은 TIGIT 유전자 또는 이의 단편의 결실에 의해 억제되는, 방법.
  40. 제38항 또는 제39항에 있어서, TIGIT의 발현은 CRISPR/Cas 가이드 RNA를 갖는 CRISPR/Cas 엔도뉴클레아제(Cas)9 시스템을 NK 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는 방법을 사용하여 억제되고, 상기 가이드 RNA는 TIGIT 유전자 또는 이의 단편을 표적화하는, 방법.
  41. 제40항에 있어서, TIGIT의 발현은 TIGIT 폴리뉴클레오타이드를 표적화하는 siRNA 또는 shRNA에 의해 억제되는, 방법.
  42. 제38항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 조작된 NK 세포는 폴리오바이러스 수용체-관련 면역글로불린 도메인-함유(PVRIG), CD96, 림프구 활성화 3(LAG3), TIM-3, NKG2A, PD-1 및 CTLA-4로 이루어진 군으로부터 선택되는 저해성 수용체의 발현이 억제되는, 방법.
  43. 제38항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, NK 세포는 1차 NK 세포 또는 NK 세포주인, 방법.
  44. 제38항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, NK 세포는 확장된 NK 세포 또는 비확장된 NK 세포인, 방법.
  45. 제44항에 있어서, 확장된 NK 세포는 시험관내에서 또는 생체외에서 NK 세포 확장 조성물에 노출되는, 방법.
  46. 제45항에 있어서, NK 세포 확장 조성물은 영양 세포, 조작된 PM 입자, 또는 엑소좀을 포함하는, 방법.
  47. 제46항에 있어서, 영양 세포 또는 조작된 입자는 이의 외부 표면에 결합된 Fc 도메인을 포함하는, 방법.
  48. 제45항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, NK 세포 확장 조성물은 NK 세포 이펙터 제제를 추가로 포함하는, 방법.
  49. 제48항에 있어서, NK 세포 이펙터 제제는 IL-21 및/또는 41BBL을 포함하는, 방법.
  50. 제38항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, NK 세포를 TIGIT 저해제와 인큐베이션하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  51. 제38항 또는 제50항에 있어서, TIGIT 저해제는 항-TIGIT 항체인, 방법.
  52. 제51항에 있어서, 항-TIGIT 항체는 Fc 수용체에 결합하는 단편 결정화 가능 영역(Fc 영역)을 포함하는, 방법.
  53. 제51항에 있어서, 항-TIGIT 항체는 Fc 영역이 결여되거나 참조 대조군에 비해 Fc 수용체에 대해 저하된 친화도를 갖는 Fc 영역을 포함하는, 방법.
  54. 제38항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, NK 세포를 관문 차단제와 인큐베이션하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  55. 제54항에 있어서, 관문 차단제는 PD-1 저해제, PD-L1 저해제, PD-L2 저해제 또는 CTLA-4 저해제를 포함하는, 방법.
  56. 대상체에서 암, 전이 또는 감염성 질환을 치료하고/하거나, 감소시키고/시키거나, 저해하고/하거나, 저하시키고/저하시키거나, 개선하고/하거나 예방하는 방법으로서, 대상체에게 치료적 유효량의 제38항 내지 제55항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 NK 세포를 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  57. 대상체에서 암, 전이 또는 감염성 질환을 치료하고/하거나, 감소시키고/시키거나, 저해하고/하거나, 저하시키고/저하시키거나, 개선하고/하거나 예방하는 방법으로서, 대상체에게 치료적 유효량의 NK 세포 및 치료적 유효량의 Ig 및 ITIM 도메인을 갖는 T 세포 면역수용체(TIGIT) 저해제를 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  58. 제57항에 있어서, NK 세포는 1차 NK 세포 또는 NK 세포주인, 방법.
  59. 제57항 또는 제58항에 있어서, NK 세포는 확장된 NK 세포인, 방법.
  60. 제59항에 있어서, 확장된 NK 세포는 시험관내에서 또는 생체외에서 NK 세포 확장 조성물에 노출되는, 방법.
  61. 제60항에 있어서, NK 세포 확장 조성물은 영양 세포, 조작된 PM 입자, 또는 엑소좀을 포함하는, 방법.
  62. 제61항에 있어서, 영양 세포 또는 조작된 입자는 이의 외부 표면에 결합된 Fc 도메인을 포함하는, 방법.
  63. 제60항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, NK 세포 확장 조성물은 NK 세포 이펙터 제제를 추가로 포함하는, 방법.
  64. 제63항에 있어서, NK 세포 이펙터 제제는 IL-21 및/또는 41BBL을 포함하는, 방법.
  65. 제57항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, TIGIT 저해제는 항-TIGIT 항체인, 방법.
  66. 제65항에 있어서, 항-TIGIT 항체는 Fc 수용체에 결합하는 단편 결정화 가능 영역(Fc 영역)을 포함하는, 방법.
  67. 제65항에 있어서, 항-TIGIT 항체는 Fc 영역이 결여되거나 참조 대조군에 비해 Fc 수용체에 대해 저하된 친화도를 갖는 Fc 영역을 포함하는, 방법.
  68. 제57항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에게 치료적 유효량의 관문 차단제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  69. 제68항에 있어서, 관문 차단제는 PD-1 저해제, PD-L1 저해제, PD-L2 저해제 또는 CTLA-4 저해제를 포함하는, 방법.
  70. 대상체에서 암, 전이 또는 감염성 질환을 치료하고/하거나, 감소시키고/시키거나, 저해하고/하거나, 저하시키고/저하시키거나, 개선하고/하거나 예방하는 방법으로서, 대상체에게 치료적 유효량의 조작된 NK 세포를 투여하는 단계를 포함하며, 상기 조작된 NK 세포는 Ig 및 ITIM 도메인을 갖는 T 세포 면역수용체(TIGIT)의 발현이 억제되고, 조작된 NK 세포는 투여 단계 전에 시험관내에서 또는 생체외에서 TIGIT 저해제와 함께 인큐베이션되는, 방법.
  71. 제70항에 있어서, TIGIT의 발현은 TIGIT 유전자 또는 이의 단편의 결실에 의해 억제되는, 방법.
  72. 제70항 또는 제71항에 있어서, TIGIT의 발현은 CRISPR/Cas 가이드 RNA를 갖는 CRISPR/Cas 엔도뉴클레아제(Cas)9 시스템을 NK 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는 방법을 사용하여 억제되고, 상기 가이드 RNA는 TIGIT 유전자 또는 이의 단편을 표적화하는, 방법.
  73. 제72항에 있어서, TIGIT의 발현은 TIGIT 폴리뉴클레오타이드를 표적화하는 siRNA 또는 shRNA에 의해 억제되는, 방법.
  74. 제70항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 조작된 NK 세포는 폴리오바이러스 수용체-관련 면역글로불린 도메인-함유(PVRIG), CD96, 림프구 활성화 3(LAG3), TIM-3, NKG2A, PD-1 및 CTLA-4로 이루어진 군으로부터 선택되는 저해성 수용체의 발현이 억제되는, 방법.
  75. 제70항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, NK 세포는 1차 NK 세포 또는 NK 세포주인, 방법.
  76. 제70항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, NK 세포는 확장된 NK 세포 또는 비확장된 NK 세포인, 방법.
  77. 제76항에 있어서, 확장된 NK 세포는 시험관내에서 또는 생체외에서 NK 세포 확장 조성물에 노출되는, 방법.
  78. 제77항에 있어서, NK 세포 확장 조성물은 영양 세포, 조작된 PM 입자, 또는 엑소좀을 포함하는, 방법.
  79. 제78항에 있어서, 영양 세포 또는 조작된 입자는 이의 외부 표면에 결합된 Fc 도메인을 포함하는, 방법.
  80. 제77항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, NK 세포 확장 조성물은 NK 세포 이펙터 제제를 추가로 포함하는, 방법.
  81. 제80항에 있어서, NK 세포 이펙터 제제는 IL-21 및/또는 41BBL을 포함하는, 방법.
  82. 제70항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에게 치료적 유효량의 TIGIT 저해제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  83. 제70항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, TIGIT 저해제는 항-TIGIT 항체인, 방법.
  84. 제83항에 있어서, 항-TIGIT 항체는 Fc 수용체에 결합하는 단편 결정화 가능 영역(Fc 영역)을 포함하는, 방법.
  85. 제84항에 있어서, 항-TIGIT 항체는 Fc 영역이 결여되거나 참조 대조군에 비해 Fc 수용체에 대해 저하된 친화도를 갖는 Fc 영역을 포함하는, 방법.
  86. 제70항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에게 치료적 유효량의 관문 차단제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  87. 제86항에 있어서, 관문 차단제는 PD-1 저해제, PD-L1 저해제, PD-L2 저해제 또는 CTLA-4 저해제를 포함하는, 방법.
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