KR20240099216A - 슈반 세포로의 표적화 전달을 위한 설계자 세포외 소낭 - Google Patents

Abstract

슈반 세포(SC)를 표적화하는 설계자 세포외 소낭(EV)이 본원에 개시된다. 예를 들어, 일부 실시예에서, EV는 HRG1/2, NRG1 또는 이들의 조합으로 장식된다. 이들 EV는 일부 실시예에서 필요로 하는 대상체의 슈반 세포에 진단적이고/진단적이거나 치료적인 수송물을 전달하는 데 사용될 수 있다.

Description

슈반 세포로의 표적화 전달을 위한 설계자 세포외 소낭

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은 2021년 10월 26일에 출원된 미국 가출원 번호 63/271,912의 이익을 주장하며, 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.

서열 목록

본 출원은 2022년 10월 25일에 생성된 "321501_2590_서열_목록"이라는 제목의 ST.26 형식으로 제출된 서열 목록을 함유한다. 서열 목록의 내용 전체가 본원에 포함된다.

신경섬유종증 1형(NF1)은 슈반 세포(SC) 내 뉴로피브로민 1(NF1) 유전자의 돌연변이로 인해 야기되는 상염색체 우성 유전 병태이다. NF1 은 신경 기능 장애, 기형, 인접 구조에 대한 통증 손상을 야기하고 악성 변형을 거칠 수 있는 총상 신경섬유종(pNF)을 포함한 말초 신경계 종양(PNST)을 특징으로 한다. 현재 pNF를 예방하거나 치료하는 효과적인 치료법은 없다. 더욱이, 진단적이고 치료적인 목적을 위해 SC에 세포 특이적 전달에 대한 필요성이 있다.

슈반 세포(SC)를 표적화 하는 설계자 세포외 소낭(EV)이 본원에 개시된다. 예를 들어, 일부 구현예에서 EV는 NRG1, NRG2 또는 이들의 조합으로 장식된다. 다른 구현예에는 슈반 세포 분자, 예컨대 퓨린성 수용체(즉, P2X4R) 또는 RTK, 예컨대 ErbB3을 포함할 수 있다. 이들 EV는 일부 구현예에서 필요로 하는 대상체 내 슈반 세포에 진단적이고/진단적이거나 치료적인 수송물을 전달하는 데 사용될 수 있다.

따라서, 슈반 세포와 연관된 임의의 질환 또는 병태를 치료하기 위한 방법이 또한 본원에 개시된다. 슈반 세포 연관 질환 및 치료를 위한 잠재적인 치료적 분자에는 신경섬유종증 1형(NF1) 및 뉴로피브로민-1 유전자; 신경섬유종증 2형(NF2) 및 뉴로피브로민-2 유전자; 샤르코-마리-투스 질환(CMT) 및 PMP22 발현을 저해하는 표적; 길랭-바레 증후군(GBS, 급성 염증성 탈수초성 다발성신경병증 유형) 및 SMARCB1 또는 LZTR1 종양 억제자 유전자를 표적화함에 의한 신경초종증을 포함한다. 만성 염증성 탈수초성 다발신경병증(CIDP), 나병 및 지카 바이러스는 모두 슈반 세포를 수반하는 신경병증이다. 따라서, 개시된 EV는 이들 신경병증 중 하나 이상을 치료하는 데 사용될 수 있다.

일부 구현예에서, 이들 EV에는 기능성 뉴로피브로민 1이 적재되어 있으므로 대상체에서 NF1을 치료하는 데 사용될 수 있다. EV에는 조절부전 세포 증식을 저해하기 위해 Ras 경로 유전자를 표적화 하는 siRNA 또는 RNAi 분자가 적재될 수도 있다. 이 경우 작은 분자 저해제, 예컨대 다브라페닙, 셀루메티닙 또는 닐로티닙이 사용될 수도 있다. 따라서, 슈반 세포(SC)에 기능성 뉴로피브로민 1을 표적화하고 전달하는 치료적 EV를 생산하기 위해 대상체의 세포를 조작하는 단계를 수반하는 대상체에서 NF1을 치료하는 방법이 또한 본원에 개시된다. 또한, 생체 외에서 생산된 EV를 수집하고 대상체에서 NF1을 치료하는 데에서의 사용을 위한 뉴로피브로민 1을 EV에 적재하는 방법이 개시된다.

본 발명의 하나 이상의 구현예의 세부사항은 첨부된 도면 및 하기 설명에서 제시된다. 본 발명의 다른 특성, 목적 및 장점은 설명, 도면 및 청구범위로부터 명백해질 것이다.

도 1은 SC에 대한 향상된 친화성이 있는 설계자 EV가 생체 외에서 만들어지고 신경섬유종을 치료하기 위해 생체 내에서 활용될 것임을 예시한다. TNT는 SC를 표적화하고 신경섬유종을 치료하기 위해 표피를 설계자 EV 생물반응기로 바꾸는 데 사용될 것이다.
도 2a 및 2b는 터널링 나노튜브(TNT) 플랫폼(1: 플라스미드 저장소, 2: 음성 및 3: 양성 리드)을 예시한다. 도 2c는 전자현미경 사진이다. 도 2d 내지 2f는 펄스장이 천공하고 전기영동적으로 수송물을 피부로 이동시키는 것을 보여준다. 도 2g 및 2h는 TNT 대 BEP에서 집중된(실선) 대 광범위한(점선) 천공을 보여주는 시뮬레이션이다. 도 2i는 유전자 발현 대 BEP를 보여준다. *p<0.05.
도 3a 및 3b는 SC 표적화 리간드 NRG1 및 NRG2로 장식된 EV의 생성을 보여준다.
도 4는 PMEF 및 SC에 의한 SC 표적화 리간드 NRG1 및 NRG2로 장식된 EV의 백분율 흡수를 보여준다.

본 개시가 더 자세히 설명되기 전에, 본 개시는 설명된 특정 구현예에 제한되지 않고, 물론 다양할 수 있다는 점을 이해해야 한다. 또한, 본원에 사용된 전문용어는 특정 구현예를 설명하기 위한 목적일 뿐 제한하려는 의도가 아니라는 점을 이해해야 하는데 본 개시의 범위가 첨부된 청구범위에 의해서만 제한될 것이기 때문이다.

값의 범위가 제공되는 경우, 문맥에서 달리 명확하게 나타내지 않는 한 각 중간 값은 해당 범위의 상한과 하한 사이의 하한 단위의 10분의 1까지 그리고 임의의 다른 명시되거나 해당 명시된 범위의 중간 값은 개시 내에 포괄되는 것으로 이해된다. 이들 더 작은 범위의 상한 및 하한은 더 작은 범위에 독립적으로 포함될 수 있으며, 또한 명시된 범위에서 구체적으로 배제된 임의의 제한에 따라 본 개시 내에 포괄된다. 명시된 범위에 제한 중 하나 또는 둘 모두 포함되는 경우, 포함된 제한 중 하나 또는 둘 모두를 배제하는 범위 또한 개시에 포함된다.

다르게 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기법 및 과학 용어는 본 개시가 속하는 당업자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 설명된 것들과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 재료가 본 개시의 실시 또는 테스트에 사용될 수도 있지만, 이제 바람직한 방법 및 재료가 설명된다.

본 명세서에 인용된 모든 간행물 및 특허는 각각의 개별 간행물 또는 특허가 참조로 포함되도록 구체적이고 개별적으로 명시된 것처럼 참조로 본원에 포함되어 있으며, 인용된 간행물과 관련된 방법 및/또는 재료를 개시하고 설명하기 위해 본원에 참조로 포함되어 있다. 임의의 간행물의 인용은 출원일 이전의 개시를 위한 것이며, 본 개시가 사전 개시로 인해 그러한 간행물보다 앞선 자격이 없다는 것을 인정하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 추가로, 제공된 간행 날짜는 실제 간행 날짜와 상이할 수 있으므로 독립적으로 확인해야 필요가 있을 수 있다.

본 개시를 읽을 때 당업자에게 명백한 바와 같이, 본원에 설명되고 예시된 개별 구현예 각각은 본 개시의 범위나 정신에서 벗어남 없이 다른 여러 구현예 중 임의의 것의 특성과 쉽게 분리되거나 조합될 수 있는 별개의 구성요소 및 특성을 갖는다. 임의의 인용된 방법은 언급된 사건의 순서나 논리적으로 가능한 임의의 다른 순서로 실행될 수 있다.

본 개시의 구현예는 달리 명시되지 않는 한, 당업계 내의 화학, 생물학 등의 기법을 사용할 것이다.

다음 예는 방법을 수행하고 본원에 개시되고 청구된 프로브를 사용하는 법에 대한 완전한 개시 및 설명을 당업자에게 제공하기 위해 제시된다. 수(예를 들어, 양, 온도 등)에 대한 정확성을 보장하기 위해 노력하였지만 일부 오류와 편차는 감안되어야 한다. 달리 명시하지 않는 한, 부품은 중량부이고, 온도는 ℃ 단위이며, 압력은 대기압 또는 대기압에 가깝다. 표준 온도와 압력은 20℃, 1기압으로 정의된다.

본 개시의 구현예를 상세히 설명하기 전에, 달리 명시하지 않는 한, 본 개시는 특정 재료, 시약, 반응 재료, 제조 프로세스 등에 제한되지 않고 다양할 수 있음을 이해해야 한다. 또한, 본원에 사용된 전문용어는 단지 특정 구현예를 설명하기 위한 것이며 제한하려는 의도가 아니라는 점을 이해해야 한다. 본 개시에서는 논리적으로 가능한 경우 단계들이 상이한 순서로 실행될 수 있는 것도 가능하다.

명세서 및 첨부된 청구범위에 사용된 바와 같이, 단수형 "a", "an" 및 "the"는 문맥에서 달리 명확하게 나타내지 않는 한 복수형을 포함한다는 점에 주목해야 한다.

정의

용어 "대상체"는 투여 또는 치료의 표적이 되는 임의의 개체를 지칭한다. 대상체는 척추동물, 예를 들어 포유동물일 수 있다. 따라서, 대상체는 인간 또는 수의학 환자일 수 있다. 용어 "환자"는 임상의, 예를 들어 의사의 치료를 받는 대상체를 지칭한다.

용어 "치료적으로 유효한"은 사용된 조성물의 양이 질환 또는 장애의 하나 이상의 원인 또는 증상을 호전 시키기에 충분한 분량임을 지칭한다. 이러한 호전에는 저감이나 변경만 필요할 뿐 반드시 제거할 필요는 없다.

용어 "약학적으로 허용되는"은 건전한 의학적 판단의 범위 내에서 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응, 기타 문제 또는 합리적인 이익/위험 비율에 상응하는 합병증 없이 인간 및 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합한 화합물, 재료, 조성물 및/또는 투여 형태를 지칭한다.

용어 "운반체"는 화합물 또는 조성물과 조합될 때 의도된 사용 또는 목적을 위해 화합물 또는 조성물의 제조, 저장, 투여, 전달, 유효성, 선택성 또는 임의의 기타 특징을 돕거나 용이하게 하는 화합물, 조성물, 물질 또는 구조를 의미한다. 예를 들어, 활성 성분의 임의의 분해를 최소화하고 대상체에서 임의의 부정적인 부작용을 최소화하기 위해 운반체가 선택될 수 있다.

용어 "치료"는 질환, 병리학적 병태 또는 장애를 치료하거나, 호전시키거나, 안정화하거나 예방하려는 의도를 가진 환자의 의학적 관리를 지칭한다. 이 용어는 적극적 치료, 즉 질환, 병리학적 병태 또는 장애의 개선을 구체적으로 목표로 하는 치료를 포함하며, 인과적 치료, 즉 연관 질병, 병리학적 병태 또는 장애의 원인의 제거를 위한 치료 또한 포함한다. 또한 이 용어는 완화적 치료, 즉 질환, 병리학적 병태 또는 장애의 치료보다는 증상 완화를 위해 설계된 치료; 예방적 치료, 즉 연관 질환, 병리학적 병태 또는 장애의 발병을 최소화하거나 부분적으로 또는 완전히 저해하기 위한 치료; 지지 치료, 즉 연관 질환, 병리학적 병태 또는 장애의 개선을 목표로 하는 또 다른 특정 치료법을 보충하기 위해 사용되는 치료를 포함한다.

용어 "저해하다"는 활성, 반응, 병태, 질환 또는 기타 생물학적 매개변수에서의 감소를 지칭한다. 이는 활성, 반응, 병태 또는 질환의 완전한 삭제를 포함되나 이에 제한되지 않는다. 이는 또한 예를 들어 자연적인 또는 대조군 수준과 비교하여 활성, 반응, 병태 또는 질환의 10% 저감을 포함할 수 있다. 따라서, 저감은 자연적인 또는 대조군 수준과 비교하여 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100% 또는 그 사이의 임의의 저감량일 수 있다.

용어 "폴리펩티드"는 펩티드 결합 또는 변형된 펩티드 결합에 의해 서로 연결된 아미노산, 예를 들어 펩티드 동배체 등을 지칭하며, 20개의 유전자 암호화된 아미노산 이외의 변형된 아미노산을 함유할 수 있다. 폴리펩티드는 자연적 프로세스, 예컨대 번역 후 프로세스에 의해 또는 당업계에 잘 알려진 화학적 변형 기법에 의해 변형될 수 있다. 변형은 펩티드 백본, 아미노산 측쇄 및 아미노 또는 카르복실 말단을 포함하여 폴리펩티드의 임의의 곳에서나 유발할 수 있다. 동일한 유형의 변형이 주어진 폴리펩티드의 여러 부위에서 동일하거나 다양한 정도로 존재할 수 있다. 또한, 주어진 폴리펩티드는 다양한 유형의 변형을 가질 수 있다. 변형에는 아세틸화, 아실화, ADP-리보실화, 아미드화, 공유 가교 또는 환형화, 플라빈의 공유 부착, 헴 모이어티의 공유 부착, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유도체의 공유 부착, 지질 또는 지질 유도체의 공유 부착, 포스피티딜이노시톨의 공유 부착, 이황화 결합 형성, 탈메틸화, 시스테인 또는 피로글루타메이트의 형성, 포르밀화, 감마-카르복실화, 글리코실화, GPI 앵커 형성, 수산화, 요오드화, 메틸화, 미리스톨화, 산화, 퍼길화, 단백질 분해 프로세스, 인산화, 프레닐화, 라세미화, 셀레노일화, 황산화 및 단백질로의 아미노산의 이송 RNA 매개 첨가, 예컨대 아르기닐화를 비제한적으로 포함한다(Proteins - Structure and Molecular Properties 2nd Ed., T.E. Creighton, W.H. Freeman and Company, New York (1993); Posttranslational Covalent Modification of Proteins, B.C. Johnson, Ed., Academic Press, New York, pp. 1-12 (1983) 참조).

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "아미노산 서열"은 아미노산 잔기를 나타내는 약어, 글자, 문자 또는 단어의 목록을 지칭한다. 본원에 사용된 아미노산 약어는 아미노산에 대한 통상적인 한 글자 코드이며 다음과 같이 표현된다: A, 알라닌; B, 아스파라긴 또는 아스파르트산; C, 시스테인; D 아스파르트산; E, 글루타메이트, 글루타민산; F, 페닐알라닌; G, 글리신; H 히스티딘; I 이소류신; K, 라이신; L, 류신; M, 메티오닌; N, 아스파라긴; P, 프롤린; Q, 글루타민; R, 아르기닌; S, 세린; T, 트레오닌; V, 발린; W, 트립토판; Y, 티로신; Z, 글루타민 또는 글루타민산.

본원에 사용된 바와 같이 문구 "핵산"은 DNA 또는 RNA 또는 DNA-RNA 하이브리드, 단일 가닥 또는 이중 가닥, 센스 또는 안티센스 여부에 관계없이 자연적으로 유발되는 또는 합성적 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드를 지칭하며, 이는 왓슨 크릭 염기쌍에 의해 상보적인 핵산에 혼성화될 수 있다. 핵산은 또한 뉴클레오티드 유사체(예를 들어, BrdU) 및 비-포스포디에스테르 뉴클레오시드간 이음(예를 들어, 펩티드 핵산(PNA) 또는 티오디에스테르 이음)을 포함할 수 있다. 특히, 핵산에는 DNA, RNA, cDNA, gDNA, ssDNA, dsDNA 또는 이들의 임의의 조합이 비제한적으로 포함될 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이 "뉴클레오티드"는 염기 모이어티, 당 모이어티 및 포스페이트 모이어티를 함유하는 분자이다. 뉴클레오티드는 포스페이트 모이어티와 당 모이어티를 통해 서로 이어져 뉴클레오시드 간 이음을 생성할 수 있다. 용어 "올리고뉴클레오티드"는 때때로 함께 이어진 두 개 이상의 뉴클레오티드를 함유하는 분자를 지칭하는 데 사용된다. 뉴클레오티드의 염기 모이어티는 아데닌-9-일(A), 시토신-1-일(C), 구아닌-9-일(G), 우라실-1-일(U) 및 티민-1-일(T)일 수 있다. 뉴클레오티드의 당 모이어티는 리보스 또는 데옥시리보스이다. 뉴클레오티드의 포스페이트 모이어티는 5가 포스페이트이다. 뉴클레오티드의 비제한적인 예는 3'-AMP(3'-아데노신 모노포스페이트) 또는 5'-GMP(5'-구아노신 모노포스페이트)일 것이다.

뉴클레오티드 유사체는 염기, 당 및/또는 포스페이트 모이어티에 대한 일부 유형의 변형을 함유하는 뉴클레오티드이다. 뉴클레오티드에 대한 변형은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 5-메틸시토신(5-me-C), 5-히드록시메틸 시토신, 크산틴, 히포크산틴 및 2-아미노아데닌뿐만 아니라 당 또는 포스페이트 모이어티에서의 변형을 포함할 것이다.

뉴클레오티드 대체물은 뉴클레오티드와 유사한 기능적 성질을 가지지만 포스페이트 모이어티, 예컨대 펩티드 핵산(PNA)을 함유하지 않는 분자이다. 뉴클레오티드 대체물은 왓슨 크릭 또는 후그스틴 방식으로 핵산을 인식하나 포스페이트 모이어티가 아닌 다른 모이어티를 통하여 함께 이어지는 분자이다. 뉴클레오티드 대체물은 적절한 표적 핵산과 상호작용할 때 이중 나선 유형 구조를 따를 수 있다.

용어 "벡터" 또는 "구조체"는 벡터 서열이 이어진 또 다른 핵산을 세포 내로 수송할 수 있는 핵산 서열을 지칭한다. 용어 "발현 벡터"는 세포에 의한 발현에 적합한 형태(예를 들어, 전사 제어 요소에 이어진)의 유전자 구조체를 함유하는 임의의 벡터(예를 들어, 플라스미드, 코스미드 또는 파지 염색체)를 포함한다. 플라스미드는 일반적으로 사용되는 벡터 형태이므로 "플라스미드"와 "벡터"는 상호교환적으로 사용된다. 더욱이, 본 발명은 동등한 기능을 수행하는 다른 벡터를 포함하도록 의도된다.

용어 "~에 작동가능하게 이어진"은 핵산과 또 다른 핵산 서열의 기능적 관계를 지칭한다. 프로모터, 인핸서, 전사 및 번역 정지 부위 및 기타 신호 서열은 다른 서열에 작동가능하게 이어진 핵산 서열의 예이다. 예를 들어, 전사 제어 요소에 대한 DNA의 작동가능한 이음은 DNA와 프로모터 사이의 물리적이고 기능적인 관계를 지칭하므로 이러한 DNA의 전사는 DNA를 특이적으로 인식하고 결합하며 전사하는 RNA 폴리머라제에 의한 프로모터로부터 개시된다.

본원에서의 목적을 위해, 주어진 핵산 서열 D에 대한, D와 또는 D에 대항 되는 주어진 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 C의 % 서열 동일성은(대안적으로는 주어진 서열 D에 대한, D와 또는 D에 대항 되는 특정 % 서열 동일성을 갖거나 포함하는 주어진 서열 C로 표현될 수 있음) 다음과 같이 계산된다:

분수 W/Z의 100배,

여기서 W는 C와 D의 해당 프로그램 정렬에서 서열 정렬 프로그램에 의해 동일한 일치로 점수가 매겨진 뉴클레오티드 또는 아미노산의 수이고, Z는 D의 뉴클레오티드 또는 아미노산의 전체 수이다. 서열 C의 길이가 서열 D의 길이와 동일하지 않은 경우, D에 대한 C의 % 서열 동일성은 C에 대한 D의 % 서열 동일성과 동일하지 않음이 인지될 것이다. 퍼센트 서열 동일성을 결정하는 목적을 위한 정렬은 당업계의 기술 범위 내의 다양한 방식으로 달성될 수 있는데, 예를 들어, 공개적으로 이용 가능한 컴퓨터 소프트웨어, 예컨대 BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 또는 Megalign(DNASTAR) 소프트웨어를 사용하는 것이다.

"특이적으로 혼성화한다"는 것은 프로브, 프라이머 또는 올리고뉴클레오티드가 매우 엄격한 조건 하에서 실질적으로 상보적인 핵산(예를 들어, c-met 핵산)을 인식하고 물리적으로 상호작용하고(즉, 염기쌍을 이루고) 다른 핵산과 실질적으로 염기쌍을 이루지 않는다는 것을 의미한다.

본원에 사용된 바와 같이 용어 "엄격한 혼성화 조건"은 프로브와 표적 서열 사이에 적어도 95%이고 바람직하게는 적어도 97%의 서열 동일성이 있는 경우 혼성화가 일반적으로 유발될 것임을 의미한다. 엄격한 혼성화 조건의 예는 50% 포름아미드, 5X SSC(150mM NaCl, 15mM 트리소듐 시트레이트), 50mM 소듐 포스페이트(pH 7.6), 5X 덴하르트 용액, 10% 덱스트란 설페이트 및 20μg/ml의 변성되고 절단된 운반체 DNA, 예컨대 연어 정자 DNA를 포함하는 용액에서 밤새 인큐베이션 후 대략 65℃의 0.1X SSC에서 혼성화 지지체를 세척하는 것이다. 다른 혼성화 및 세척 조건은 잘 알려져 있으며 Sambrook 외 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, NY(1989), 특히 11장에 예시화되어 있다.

"제어 요소" 또는 "조절 서열"은 전사 및 번역을 실행하기 위해 숙주 세포 단백질과 상호작용하는 벡터의 비번역 영역-인핸서, 프로모터, 5' 및 3' 비번역 영역-이다. 이러한 요소는 강도와 특이성에 있어 다양할 수 있다.

"프로모터"는 일반적으로 전사 시작 부위와 관련하여 상대적으로 고정된 위치에 있을 때 기능하는 서열 또는 DNA 서열이다. "프로모터"는 RNA 폴리머라제와 전사 인자의 기본적인 상호작용에 필요한 핵심 요소를 함유하며 상류 요소와 반응 요소를 함유할 수 있다.

"인핸서"는 일반적으로 전사 시작 부위로부터 고정된 거리 없이 기능하고 전사 단위에 대해 5' 또는 3'일 수 있는 DNA 서열을 지칭한다. 뿐만 아니라, 인핸서는 인트론 내에 있을 뿐만 아니라 코딩 서열 자체 내에 있을 수도 있다. 일반적으로 길이로 10에서 300bp사이이며 시스로 기능한다. 인핸서는 근처의 프로모터로부터 전사를 증가시키는 기능을 한다. 프로모터와 같은 인핸서는 종종 전사 조절을 중재하는 반응 요소를 함유한다. 인핸서는 종종 발현 조절을 결정한다.

"내인성" 인핸서/프로모터는 게놈 내 주어진 유전자와 자연적으로 이어지는 것이다. "외인성" 또는 "이종" 인핸서/프로모터는 해당 유전자의 해당 전사가 이어진 인핸서/프로모터에 의해 지시되도록 유전자 조작처리(즉, 분자 생물학적 기법)에 의해 유전자에 병치되어 배치되는 것이다.

세포외 비히클(EV)을 표적화 하는 슈반 세포

치료적인/치료적이거나 진단적인 수송물을 적재할 수 있는 슈반 세포(SC)를 표적화 하는 EV가 본원에 개시된다. 일부 구현예에서, 방법은 치료적 EV를 생산하기 위해 대상체의 세포를 조작하는 단계를 수반한다. 일부 구현예에서, 방법은 생체 외에서 생산된 EV를 수집하고 여기에 치료적 수송물을 적재하는 단계를 수반한다.

치료적 EV를 생산하기 위한 환자 세포 조작

SC 표적화 리간드를 암호화하는 핵산 서열 및 선택적으로 치료적 수송물을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 세포안으로 세포내 전달하는 단계를 수반하는, 대상체의 세포를 EV 생산 세포로 재프로그래밍하는 방법이 개시된다. 일부 구현예에서, 세포는 피부 세포(예를 들어, 섬유아세포, 각질세포, 피부 줄기 세포), 지방세포, 수지상 세포, 말초 혈액 단핵 세포(PBMC), 췌장 세포(예를 들어, 관 상피 세포), 간 세포(예를 들어, 간세포), 면역 세포(예를 들어, T 세포, 대식세포, 골수 유래 억제자 세포)를 (비제한적으로) 포함하는 EV를 생산할 수 있는 대상체의 임의의 세포일 수 있다.

예를 들어, NF1을 치료하는 데 사용될 수 있는 시험관 내 및 생체 내 모두에서 피부 세포를 EV 생산 세포로 재프로그램화하기 위한 조성물 및 방법이 본원에 개시된다.

일부 구현예에서, 이 방법은 NRG1, NRG2 또는 이들의 임의의 조합을 암호화하는 발현 벡터로 대상체의 세포를 형질감염시키는 단계를 수반한다. 일부 구현예에서, 이 방법은 뉴로피브로민을 암호화하는 발현 벡터로 대상체의 세포를 형질감염시키는 단계를 수반한다.

마우스 NRG1에 대한 mRNA 서열은 NCBI 등록 번호 NM_178591.3에 제공되어 있으며, 이는 이 서열에 대해 참조로 포함된다. 마우스 NRG2에 대한 mRNA 서열은 NCBI 등록 번호 NM_001167891.3에 제공되어 있으며, 이는 이 서열에 대해 참조로 포함된다.

일부 구현예에서, 인간 NRG1 cDNA는 다음과 같은 핵산 서열을 갖는다: GAGCCCTTGGACCAAACTCGCCTGCGCCGAGAGCCGTCCGCGTAGAGCGCTCCGTCTCCGGCGAGATGTCCGAGCGCAAAGAAGGCAGAGGCAAAGGGAAGGGCAAGAAGAAGGAGCGAGGCTCCGGCAAGAAGCCGGAGTCCGCGGCGGGCAGCCAGAGCCCAGCCTTGCCTCCCCAATTGAAAGAGATGAAAAGCCAGGAATCGGCTGCAGGTTCCAAACTAGTCCTTCGGTGTGAAACCAGTTCTGAATACTCCTCTCTCAGATTCAAGTGGTTCAAGAATGGGAATGAATTGAATCGAAAAAACAAACCACAAAATATCAAGATACAAAAAAAGCCAGGGAAGTCAGAACTTCGCATTAACAAAGCATCACTGGCTGATTCTGGAGAGTATATGTGCAAAGTGATCAGCAAATTAGGAAATGACAGTGCCTCTGCCAATATCACCATCGTGGAATCAAACGAGATCATCACTGGTATGCCAGCCTCAACTGAAGGAGCATATGTGTCTTCAGAGTCTCCCATTAGAATATCAGTATCCACAGAAGGAGCAAATACTTCTTCATCTACATCTACATCCACCACTGGGACAAGCCATCTTGTAAAATGTGCGGAGAAGGAGAAAACTTTCTGTGTGAATGGAGGGGAGTGCTTCATGGTGAAAGACCTTTCAAACCCCTCGAGATACTTGTGCAAGTGCCAACCTGGATTCACTGGAGCAAGATGTACTGAGAATGTGCCCATGAAAGTCCAAAACCAAGAAAAGGCGGAGGAGCTGTACCAGAAGAGAGTGCTGACCATAACCGGCATCTGCATCGCCCTCCTTGTGGTCGGCATCATGTGTTTGGTGGCCTACTGCAAAACCAAGAAACAGCGGAAAAAGCTGCATGACCGTCTTCGGCAGAGCCTTCGGTCTGAACGAAACAATATGATGAACATTGCCAATGGGCCTCACCATCCTAACCCACCCCCCGAGAATGTCCAGCTGGTGAATCAATACGTATCTAAAAACGTCATCTCCAGTGAGCATATTGTTGAGAGAGAAGCAGAGACATCCTTTTCCACCAGTCACTATACTTCCACAGCCCATCACTCCACTACTGTCACCCAGACTCCTAGCCACAGCTGGAGCAACGGACACACTGAAAGCATCCTTTCCGAAAGCCACTCTGTAATCGTGATGTCATCCGTAGAAAACAGTAGGCACAGCAGCCCAACTGGGGGCCCAAGAGGACGTCTTAATGGCACAGGAGGCCCTCGTGAATGTAACAGCTTCCTCAGGCATGCCAGAGAAACCCCTGATTCCTACCGAGACTCTCCTCATAGTGAAAGGTATGTGTCAGCCATGACCACCCCGGCTCGTATGTCACCTGTAGATTTCCACACGCCAAGCTCCCCCAAATCGCCCCCTTCGGAAATGTCTCCACCCGTGTCCAGCATGACGGTGTCCATGCCTTCCATGGCGGTCAGCCCCTTCATGGAAGAAGAGAGACCTCTACTTCTCGTGACACCACCAAGGCTGCGGGAGAAGAAGTTTGACCATCACCCTCAGCAGTTCAGCTCCTTCCACCACAACCCCGCGCATGACAGTAACAGCCTCCCTGCTAGCCCCTTGAGGATAGTGGAGGATGAGGAGTATGAAACGACCCAAGAGTACGAGCCAGCCCAAGAGCCTGTTAAGAAACTCGCCAATAGCCGGCGGGCCAAAAGAACCAAGCCCAATGGCCACATTGCTAACAGATTGGAAGTGGACAGCAACACAAGCTCCCAGAGCAGTAACTCAGAGAGTGAAACAGAAGATGAAAGAGTAGGTGAAGATACGCCTTTCCTGGGCATACAGAACCCCCTGGCAGCCAGTCTTGAGGCAACACCTGCCTTCCGCCTGGCTGACAGCAGGACTAACCCAGCAGGCCGCTTCTCGACACAGGAAGAAATCCAGGCCAGGCTGTCTAGTGTAATTGCTAACCAAGACCCTATTGCTGTATAAAACCTAAATAAACACATAGATTCACCTGTAAAACTTTATTTTATATAATAAAGTATTCCACCTTAAATTAAACAATTTATTTTATTTTAGCAGTTCTGCAAATAGAAAACAGGAAAAA(서열번호 1, BC150609.1).

일부 구현예에서, 인간 NRG1 mRNA는 다음의 아미노산 서열을 암호화한다: MSERKEGRGKGKGKKKERGSGKKPESAAGSQSPALPPQLKEMKSQESAAGSKLVLRCETSSEYSSLRFKWFKNGNELNRKNKPQNIKIQKKPGKSELRINKASLADSGEYMCKVISKLGNDSASANITIVESNEIITGMPASTEGAYVSSESPIRISVSTEGANTSSSTSTSTTGTSHLVKCAEKEKTFCVNGGECFMVKDLSNPSRYLCKCQPGFTGARCTENVPMKVQNQEKAEELYQKRVLTITGICIALLVVGIMCLVAYCKTKKQRKKLHDRLRQSLRSERNNMMNIANGPHHPNPPPENVQLVNQYVSKNVISSEHIVEREAETSFSTSHYTSTAHHSTTVTQTPSHSWSNGHTESILSESHSVIVMSSVENSRHSSPTGGPRGRLNGTGGPRECNSFLRHARETPDSYRDSPHSERYVSAMTTPARMSPVDFHTPSSPKSPPSEMSPPVSSMTVSMPSMAVSPFMEEERPLLLVTPPRLREKKFDHHPQQFSSFHHNPAHDSNSLPASPLRIVEDEEYETTQEYEPAQEPVKKLANSRRAKRTKPNGHIANRLEVDSNTSSQSSNSESETEDERVGEDTPFLGIQNPLAASLEATPAFRLADSRTNPAGRFSTQEEIQARLSSVIANQDPIAV(서열번호 2, AAI50610.1).

일부 구현예에서, 인간 NRG2 cDNA는 다음 핵산 서열을 갖는다: GTACAAAAAAGCAGAAGGGCCGTCAAGGCCCACCATGCGGCAGGTTTGCTGCTCAGCGCTGCCGCCGCCGCCACTGGAGAAGGGTCGGTGCAGCAGCTACAGCGACAGCAGCAGCAGCAGCAGCGAGAGGAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCGAGAGCGGCAGCAGCAGCAGGAGCAGCAGCAACAACAGCAGCATCTCTCGTCCCGCTGCGCCCCCAGAGCCGCGGCCGCAGCAACAGCCGCAGCCCCGCAGCCCCGCAGCCCGGAGAGCCGCCGCCCGTTCGCGAGCCGCAGCCGCCGGCGGCATGAGGCGCGACCCGGCCCCCGGCTTCTCCATGCTGCTCTTCGGTGTGTCGCTCGCCTGCTACTCGCCCAGCCTCAAGTCAGTGCAGGACCAGGCGTACAAGGCACCCGTGGTGGTGGAGGGCAAGGTACAGGGGCTGGTCCCAGCCGGCGGCTCCAGCTCCAACAGCACCCGAGAGCCGCCCGCCTCGGGTCGGGTGGCGTTGGTAAAGGTGCTGGACAAGTGGCCGCTCCGGAGCGGGGGGCTGCAGCGCGAGCAGGTGATCAGCGTGGGCTCCTGTGTGCCGCTCGAAAGGAACCAGCGCTACATCTTTTTCCTGGAGCCCACGGAACAGCCCTTAGTCTTTAAGACGGCCTTTGCCCCCCTCGATACCAACGGCAAAAATCTCAAGAAAGAGGTGGGCAAGATCCTGTGCACTGACTGCGCCACCCGGCCCAAGTTGAAGAAGATGAAGAGCCAGACGGGACAGGTGGGTGAGAAGCAATCGCTGAAGTGTGAGGCAGCAGCCGGTAATCCCCAGCCTTCCTACCGTTGGTTCAAGGATGGCAAGGAGCTCAACCGCAGCCGAGACATTCGCATCAAATATGGCAACGGCAGAAAGAACTCACGACTACAGTTCAACAAGGTGAAGGTGGAGGACGCTGGGGAGTATGTCTGCGAGGCCGAGAACATCCTGGGGAAGGACACCGTCCGGGGCCGGCTTTACGTCAACAGCGTGAGCACCACCCTGTCATCCTGGTCGGGGCACGCCCGGAAGTGCAACGAGACAGCCAAGTCCTATTGCGTCAATGGAGGCGTCTGCTACTACATCGAGGGCATCAACCAGCTCTCCTGCAAGTGTCCTGTGGGATACACCGGGGACAGGTGTCAGCAGTTCGCAATGGTCAACTTCTCCAAGCACCTTGGATTTGAATTAAAGGAAGCCGAGGAGCTGTACCAGAAGAGGGTCCTGACCATCACGGGCATCTGCGTGGCTCTGCTGGTCGTGGGCATCGTCTGTGTGGTGGCCTACTGCAAGACCAAAAAACAGCGGAAGCAGATGCACAACCACCTCCGGCAGAACATGTGCCCGGCCCATCAGAACCGGAGCTTGGCCAATGGGCCCAGCCACCCCCGGCTGGACCCAGAGGAGATCCAGATGGCAGATTATATTTCCAAGAACGTGCCAGCCACAGACCATGTCATCAGGAGAGAAACTGAGACCACCTTCTCTGGGAGCCACTCCTGTTCTCCTTCTCACCACTGCTCCACAGCCACACCCACCTCCAGCCACAGACACGAGAGCCACACGTGGAGCCTGGAACGTTCTGAGAGCCTGACTTCTGACTCCCAGTCGGGGATCATGCTATCATCAGTGGGTACCAGCAAATGCAACAGCCCAGCATGTGTGGAGGCCCGGGCAAGGCGGGCAGCAGCCTACAACCTGGAGGAGCGGCGCAGGGCCACCGCGCCACCCTATCACGATTCCGTGGACTCCCTTCGCGACTCCCCACACAGCGAGAGGTACGTGTCGGCCCTGACCACGCCCGCGCGCCTCTCGCCCGTGGACTTCCACTACTCGCTGGCCACGCAGGTGCCAACTTTCGAGATCACGTCCCCCAACTCGGCGCACGCCGTGTCGCTGCCGCCGGCGGCGCCCATCAGTTACCGCCTGGCCGAGCAGCAGCCGTTACTGCGGCACCCGGCGCCCCCCGGCCCGGGACCCGGACCCGGGCCCGGGCCCGGGCCCGGCGCAGACATGCAGCGCAGCTATGACAGCTACTATTACCCCGCGGCGGGGCCCGGACCGCGGCGCGGGACCTGCGCGCTCGGCGGCAGCCTGGGCAGCCTGCCTGCCAGCCCCTTCCGCATCCCCGAGGACGACGAGTACGAGACCACGCAGGAGTGCGCGCCCCCGCCGCCGCCGCGGCCGCGCGCGCGCGGTGCGTCCCGCAGGACGTCGGCGGGGCCCCGGCGCTGGCGCCGCTCGCGCCTCAACGGGCTGGCGGCGCAGCGCGCACGGGCGGCGAGGGACTCGCTGTCGCTGAGCAGCGGCTCGGGCGGCGGCTCAGCCTCGGCGTCGGACGACGACGCGGACGACGCGGACGGGGCGCTGGCGGCCGAGAGCACACCTTTCCTGGGCCTGCGTGGGGCGCACGACGCGCTGCGCTCGGACTCGCCGCCACTGTGCCCGGCGGCCGACAGCAGGACTTACTACTCACTGGACAGCCACAGCACGCGGGCCAGCAGCAGACACAGCCGCGGGCCGCCCCCGCGGGCCAAGCAGGACTCGGCGCCACTCTAGGGCCTCATGGGCCCAGCTTTCTTGTAC(서열번호 3, BC166615.1).

일부 구현예에서, 인간 NRG2 mRNA는 다음 아미노산 서열을 암호화한다: MRQVCCSALPPPPLEKGRCSSYSDSSSSSSERSSSSSSSSSESGSSSRSSSNNSSISRPAAPPEPRPQQQPQPRSPAARRAAARSRAAAAGGMRRDPAPGFSMLLFGVSLACYSPSLKSVQDQAYKAPVVVEGKVQGLVPAGGSSSNSTREPPASGRVALVKVLDKWPLRSGGLQREQVISVGSCVPLERNQRYIFFLEPTEQPLVFKTAFAPLDTNGKNLKKEVGKILCTDCATRPKLKKMKSQTGQVGEKQSLKCEAAAGNPQPSYRWFKDGKELNRSRDIRIKYGNGRKNSRLQFNKVKVEDAGEYVCEAENILGKDTVRGRLYVNSVSTTLSSWSGHARKCNETAKSYCVNGGVCYYIEGINQLSCKCPVGYTGDRCQQFAMVNFSKHLGFELKEAEELYQKRVLTITGICVALLVVGIVCVVAYCKTKKQRKQMHNHLRQNMCPAHQNRSLANGPSHPRLDPEEIQMADYISKNVPATDHVIRRETETTFSGSHSCSPSHHCSTATPTSSHRHESHTWSLERSESLTSDSQSGIMLSSVGTSKCNSPACVEARARRAAAYNLEERRRATAPPYHDSVDSLRDSPHSERYVSALTTPARLSPVDFHYSLATQVPTFEITSPNSAHAVSLPPAAPISYRLAEQQPLLRHPAPPGPGPGPGPGPGPGADMQRSYDSYYYPAAGPGPRRGTCALGGSLGSLPASPFRIPEDDEYETTQECAPPPPPRPRARGASRRTSAGPRRWRRSRLNGLAAQRARAARDSLSLSSGSGGGSASASDDDADDADGALAAESTPFLGLRGAHDALRSDSPPLCPAADSRTYYSLDSHSTRASSRHSRGPPPRAKQDSAPL(서열번호, AAI66615.1).

일부 구현예에서, EV는 슈반 세포 분자, 예컨대 퓨린성 수용체(즉, P2X4R) 또는 RTK, 예컨대 ErbB3을 포함한다.

일부 구현예에서, 인간 퓨린성 수용체 P2X4(P2RX4) cDNA는 다음 핵산 서열을 갖는다: AGACCGACTAGGGGACTGGGAGCGGGCGGCGCGGCCATGGCGGGCTGCTGCGCCGCGCTGGCGGCCTTCCTGTTCGAGTACGACACGCCGCGCATCGTGCTCATCCGCAGCCGCAAAGTGGGGCTCATGAACCGCGCCGTGCAACTGCTCATCCTGGCCTACGTCATCGGACCTGCTTTTTTAAAGGCTGCAGAAAACTTCACTCTTTTGGTTAAGAACAACATCTGGTATCCCAAATTTAATTTCAGCAAGAGGAATATCCTTCCCAACATCACCACTACTTACCTCAAGTCGTGCATTTATGATGCTAAAACAGATCCCTTCTGCCCCATATTCCGTCTTGGCAAAATAGTGGAGAACGCAGGACACAGTTTCCAGGACATGGCCGTGGAGGGAGGCATCATGGGCATCCAGGTCAACTGGGACTGCAACCTGGACAGAGCCGCCTCCCTCTGCTTGCCCAGGTACTCCTTCCGCCGCCTCGATACACGGGACGTTGAGCACAACGTATCTCCTGGCTACAATTTCAGGTTTGCCAAGTACTACAGAGACCTGGCTGGCAACGAGCAGCGCACGCTCATCAAGGCCTATGGCATCCGCTTCGACATCATTGTGTTTGGGAAGGCAGGGAAATTTGACATCATCCCCACTATGATCAACATCGGCTCTGGCCTGGCACTGCTAGGCATGGCGACCGTGCTGTGTGACATCATAGTCCTCTACTGCATGAAGAAAAGACTCTACTATCGGGAGAAGAAATATAAATATGTGGAAGATTACGAGCAGGGTCTTGCTAGTGAGCTGGACCAGTGAGGCCTACCCCACACCTGGGCTCTCCACAGCCCCATCAAAGAACAGAGAGGAGGAGGAGGGAGAAATGGCCACCACATCACCCCAGAGAAATTTCTGGAATCTGATTGAGTCTCCACTCCACAAGCACTCAGGGTTCCCCAGCAGCTCCTGTGTGTTGTGTGCAGGATCTGTTTGCCCACTCGGCCCAGGAGGTCAGCAGTCTGTTCTTGGCTGGGTCAACTCTGCTTTTCCCGCAACCTGGGGTTGTCGGGGGAGCGCTGGCCCGACGCAGTGGCACTGCTGTGGCTTTCAGGGCTGGAGCTGGCTTTGCTCAGAAGCCTCCTGTCTCCAGCTCTCTCCAGGACAGGCCCAGTCCTCTGAGGCACGGCGGCTCTGTTCAAGCACTTTATGCGGCAGGGGAGGCCGCCTGGCTGCAGTCACTAGACTTGTAGCAGGCCTGGGCTGCAGGCTTCCCCCCGACCATTCCCTGCAGCCATGCGGCAGAGCTGGCATTTCTCCTCAGAGAAGCGCTGTGCTAAGGTGATCGAGGACCAGACATTAAAGCGTGATTTTCTTAA(서열번호 5, P2RX4 전사체 변이체 X2).

일부 구현예에서, 인간 P2RX4 mRNA는 다음의 아미노산 서열을 암호화한다: MAGCCAALAAFLFEYDTPRIVLIRSRKVGLMNRAVQLLILAYVIGPAFLKAAENFTLLVKNNIWYPKFNFSKRNILPNITTTYLKSCIYDAKTDPFCPIFRLGKIVENAGHSFQDMAVEGGIMGIQVNWDCNLDRAASLCLPRYSFRRLDTRDVEHNVSPGYNFRFAKYYRDLAGNEQRTLIKAYGIRFDIIVFGKAGKFDIIPTMINIGSGLALLGMATVLCDIIVLYCMKKRLYYREKKYKYVEDYEQGLASELDQ(서열번호 6).

일부 구현예에서, 인간 erb-b2 수용체 티로신 키나제 3(ERBB3) cDNA는 다음의 핵산 서열을 갖는다: GCAATTTGCAACCTCCGCTGCCGTCGCCGCAGCAGCCACCAATTCGCCAGCGGTTCAGGTGGCTCTTGCCTCGATGTCCTAGCCTAGGGGCCCCCGGGCCGGACTTGGCTGGGCTCCCTTCACCCTCTGCGGAGTCATGAGGGCGAACGACGCTCTGCAGGTGCTGGGCTTGCTTTTCAGCCTGGCCCGGGGCTCCGAGGTGGGCAACTCTCAGGCAGTGTGTCCTGGGACTCTGAATGGCCTGAGTGTGACCGGCGATGCTGAGAACCAATACCAGACACTGTACAAGCTCTACGAGAGGTGTGAGGTGGTGATGGGGAACCTTGAGATTGTGCTCACGGGACACAATGCCGACCTCTCCTTCCTGCAGTGGATTCGAGAAGTGACAGGCTATGTCCTCGTGGCCATGAATGAATTCTCTACTCTACCATTGCCCAACCTCCGCGTGGTGCGAGGGACCCAGGTCTACGATGGGAAGTTTGCCATCTTCGTCATGTTGAACTATAACACCAACTCCAGCCACGCTCTGCGCCAGCTCCGCTTGACTCAGCTCACCGAGATTCTGTCAGGGGGTGTTTATATTGAGAAGAACGATAAGCTTTGTCACATGGACACAATTGACTGGAGGGACATCGTGAGGGACCGAGATGCTGAGATAGTGGTGAAGGACAATGGCAGAAGCTGTCCCCCCTGTCATGAGGTTTGCAAGGGGCGATGCTGGGGTCCTGGATCAGAAGACTGCCAGACATTGACCAAGACCATCTGTGCTCCTCAGTGTAATGGTCACTGCTTTGGGCCCAACCCCAACCAGTGCTGCCATGATGAGTGTGCCGGGGGCTGCTCAGGCCCTCAGGACACAGACTGCTTTGCCTGCCGGCACTTCAATGACAGTGGAGCCTGTGTACCTCGCTGTCCACAGCCTCTTGTCTACAACAAGCTAACTTTCCAGCTGGAACCCAATCCCCACACCAAGTATCAGTATGGAGGAGTTTGTGTAGCCAGCTGTCCCCATAACTTTGTGGTGGATCAAACATCCTGTGTCAGGGCCTGTCCTCCTGACAAGATGGAAGTAGATAAAAATGGGCTCAAGATGTGTGAGCCTTGTGGGGGACTATGTCCCAAAGCCTGTGAGGGAACAGGCTCTGGGAGCCGCTTCCAGACTGTGGACTCGAGCAACATTGATGGATTTGTGAACTGCACCAAGATCCTGGGCAACCTGGACTTTCTGATCACCGGCCTCAATGGAGACCCCTGGCACAAGATCCCTGCCCTGGACCCAGAGAAGCTCAATGTCTTCCGGACAGTACGGGAGATCACAGGTTACCTGAACATCCAGTCCTGGCCGCCCCACATGCACAACTTCAGTGTTTTTTCCAATTTGACAACCATTGGAGGCAGAAGCCTCTACAACCGGGGCTTCTCATTGTTGATCATGAAGAACTTGAATGTCACATCTCTGGGCTTCCGATCCCTGAAGGAAATTAGTGCTGGGCGTATCTATATAAGTGCCAATAGGCAGCTCTGCTACCACCACTCTTTGAACTGGACCAAGGTGCTTCGGGGGCCTACGGAAGAGCGACTAGACATCAAGCATAATCGGCCGCGCAGAGACTGCGTGGCAGAGGGCAAAGTGTGTGACCCACTGTGCTCCTCTGGGGGATGCTGGGGCCCAGGCCCTGGTCAGTGCTTGTCCTGTCGAAATTATAGCCGAGGAGGTGTCTGTGTGACCCACTGCAACTTTCTGAATGGGGAGCCTCGAGAATTTGCCCATGAGGCCGAATGCTTCTCCTGCCACCCGGAATGCCAACCCATGGAGGGCACTGCCACATGCAATGGCTCGGGCTCTGATACTTGTGCTCAATGTGCCCATTTTCGAGATGGGCCCCACTGTGTGAGCAGCTGCCCCCATGGAGTCCTAGGTGCCAAGGGCCCAATCTACAAGTACCCAGATGTTCAGAATGAATGTCGGCCCTGCCATGAGAACTGCACCCAGGGGTGTAAAGGACCAGAGCTTCAAGACTGTTTAGGACAAACACTGGTGCTGATCGGCAAAACCCATCTGACAATGGCTTTGACAGTGATAGCAGGATTGGTAGTGATTTTCATGATGCTGGGCGGCACTTTTCTCTACTGGCGTGGGCGCCGGATTCAGAATAAAAGGGCTATGAGGCGATACTTGGAACGGGGTGAGAGCATAGAGCCTCTGGACCCCAGTGAGAAGGCTAACAAAGTCTTGGCCAGAATCTTCAAAGAGACAGAGCTAAGGAAGCTTAAAGTGCTTGGCTCGGGTGTCTTTGGAACTGTGCACAAAGGAGTGTGGATCCCTGAGGGTGAATCAATCAAGATTCCAGTCTGCATTAAAGTCATTGAGGACAAGAGTGGACGGCAGAGTTTTCAAGCTGTGACAGATCATATGCTGGCCATTGGCAGCCTGGACCATGCCCACATTGTAAGGCTGCTGGGACTATGCCCAGGGTCATCTCTGCAGCTTGTCACTCAATATTTGCCTCTGGGTTCTCTGCTGGATCATGTGAGACAACACCGGGGGGCACTGGGGCCACAGCTGCTGCTCAACTGGGGAGTACAAATTGCCAAGGGAATGTACTACCTTGAGGAACATGGTATGGTGCATAGAAACCTGGCTGCCCGAAACGTGCTACTCAAGTCACCCAGTCAGGTTCAGGTGGCAGATTTTGGTGTGGCTGACCTGCTGCCTCCTGATGATAAGCAGCTGCTATACAGTGAGGCCAAGACTCCAATTAAGTGGATGGCCCTTGAGAGTATCCACTTTGGGAAATACACACACCAGAGTGATGTCTGGAGCTATGGTGTGACAGTTTGGGAGTTGATGACCTTCGGGGCAGAGCCCTATGCAGGGCTACGATTGGCTGAAGTACCAGACCTGCTAGAGAAGGGGGAGCGGTTGGCACAGCCCCAGATCTGCACAATTGATGTCTACATGGTGATGGTCAAGTGTTGGATGATTGATGAGAACATTCGCCCAACCTTTAAAGAACTAGCCAATGAGTTCACCAGGATGGCCCGAGACCCACCACGGTATCTGGTCATAAAGAGAGAGAGTGGGCCTGGAATAGCCCCTGGGCCAGAGCCCCATGGTCTGACAAACAAGAAGCTAGAGGAAGTAGAGCTGGAGCCAGAACTAGACCTAGACCTAGACTTGGAAGCAGAGGAGGACAACCTGGCAACCACCACACTGGGCTCCGCCCTCAGCCTACCAGTTGGAACACTTAATCGGCCACGTGGGAGCCAGAGCCTTTTAAGTCCATCATCTGGATACATGCCCATGAACCAGGGTAATCTTGGGGAGTCTTGCCAGGAGTCTGCAGTTTCTGGGAGCAGTGAACGGTGCCCCCGTCCAGTCTCTCTACACCCAATGCCACGGGGATGCCTGGCATCAGAGTCATCAGAGGGGCATGTAACAGGCTCTGAGGCTGAGCTCCAGGAGAAAGTGTCAATGTGTAGGAGCCGGAGCAGGAGCCGGAGCCCACGGCCACGCGGAGATAGCGCCTACCATTCCCAGCGCCACAGTCTGCTGACTCCTGTTACCCCACTCTCCCCACCCGGGTTAGAGGAAGAGGATGTCAACGGTTATGTCATGCCAGATACACACCTCAAAGGTACTCCCTCCTCCCGGGAAGGCACCCTTTCTTCAGTGGGTCTCAGTTCTGTCCTGGGTACTGAAGAAGAAGATGAAGATGAGGAGTATGAATACATGAACCGGAGGAGAAGGCACAGTCCACCTCATCCCCCTAGGCCAAGTTCCCTTGAGGAGCTGGGTTATGAGTACATGGATGTGGGGTCAGACCTCAGTGCCTCTCTGGGCAGCACACAGAGTTGCCCACTCCACCCTGTACCCATCATGCCCACTGCAGGCACAACTCCAGATGAAGACTATGAATATATGAATCGGCAACGAGATGGAGGTGGTCCTGGGGGTGATTATGCAGCCATGGGGGCCTGCCCAGCATCTGAGCAAGGGTATGAAGAGATGAGAGCTTTTCAGGGGCCTGGACATCAGGCCCCCCATGTCCATTATGCCCGCCTAAAAACTCTACGTAGCTTAGAGGCTACAGACTCTGCCTTTGATAACCCTGATTACTGGCATAGCAGGCTTTTCCCCAAGGCTAATGCCCAGAGAACGTAACTCCTGCTCCCTGTGGCACTCAGGGAGCATTTAATGGCAGCTAGTGCCTTTAGAGGGTACCGTCTTCTCCCTATTCCCTCTCTCTCCCAGGTCCCAGCCCCTTTTCCCCAGTCCCAGACAATTCCATTCAATCTTTGGAGGCTTTTAAACATTTTGACACAAAATTCTTATGGTATGTAGCCAGCTGTGCACTTTCTTCTCTTTCCCAACCCCAGGAAAGGTTTTCCTTATTTTGTGTGCTTTCCCAGTCCCATTCCTCAGCTTCTTCACAGGCACTCCTGGAGATATGAAGGATTACTCTCCATATCCCTTCCTCTCAGGCTCTTGACTACTTGGAACTAGGCTCTTATGTGTGCCTTTGTTTCCCATCAGACTGTCAAGAAGAGGAAAGGGAGGAAACCTAGCAGAGGAAAGTGTAATTTTGGTTTATGACTCTTAACCCCCTAGAAAGACAGAAGCTTAAAATCTGTGAAGAAAGAGGTTAGGAGTAGATATTGATTACTATCATAATTCAGCACTTAACTATGAGCCAGGCATCATACTAAACTTCACCTACATTATCTCACTTAGTCCTTTATCATCCTTAAAACAATTCTGTGACATACATATTATCTCATTTTACACAAAGGGAAGTCGGGCATGGTGGCTCATGCCTGTAATCTCAGCACTTTGGGAGGCTGAGGCAGAAGGATTACCTGAGGCAAGGAGTTTGAGACCAGCTTAGCCAACATAGTAAGACCCCCATCTCTTTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAACTTTAGAACTGGGTGCAGTGGCTCATGCCTGTAATCCCAGCCAGCACTTTGGGAGGCTGAGATGGGAAGATCACTTGAGCCCAGAATTAGAGATAAGCCTATGGAAACATAGCAAGACACTGTCTCTACAGGGGAAAAAAAAAAAAGAAACTGAGCCTTAAAGAGATGAAATAAATTAAGCAGTAGATCCAGGATGCAAAATCCTCCCAATTCCTGTGCATGTGCTCTTATTGTAAGGTGCCAAGAAAAACTGATTTAAGTTACAGCCCTTGTTTAAGGGGCACTGTTTCTTGTTTTTGCACTGAATCAAGTCTAACCCCAACAGCCACATCCTCCTATACCTAGACATCTCATCTCAGGAAGTGGTGGTGGGGGTAGTCAGAAGGAAAAATAACTGGACATCTTTGTGTAAACCATAATCCACATGTGCCGTAAATGATCTTCACTCCTTATCCGAGGGCAAATTCACAAGGATCCCCAAGATCCACTTTTAGAAGCCATTCTCATCCAGCAGTGAGAAGCTTCCAGGTAGGACAGAAAAAAGATCCAGCTTCAGCTGCACACCTCTGTCCCCTTGGATGGGGAACTAAGGGAAAACGTCTGTTGTATCACTGAAGTTTTTTGTTTTGTTTTTATACGTGTCTGAATAAAAATGCCAAAGTTTTTTTTCA(서열번호 7, ERBB3 전사체 변이체 1).

일부 구현예에서, 인간 ERBB3 mRNA는 다음의 아미노산 서열을 암호화한다: MRANDALQVLGLLFSLARGSEVGNSQAVCPGTLNGLSVTGDAENQYQTLYKLYERCEVVMGNLEIVLTGHNADLSFLQWIREVTGYVLVAMNEFSTLPLPNLRVVRGTQVYDGKFAIFVMLNYNTNSSHALRQLRLTQLTEILSGGVYIEKNDKLCHMDTIDWRDIVRDRDAEIVVKDNGRSCPPCHEVCKGRCWGPGSEDCQTLTKTICAPQCNGHCFGPNPNQCCHDECAGGCSGPQDTDCFACRHFNDSGACVPRCPQPLVYNKLTFQLEPNPHTKYQYGGVCVASCPHNFVVDQTSCVRACPPDKMEVDKNGLKMCEPCGGLCPKACEGTGSGSRFQTVDSSNIDGFVNCTKILGNLDFLITGLNGDPWHKIPALDPEKLNVFRTVREITGYLNIQSWPPHMHNFSVFSNLTTIGGRSLYNRGFSLLIMKNLNVTSLGFRSLKEISAGRIYISANRQLCYHHSLNWTKVLRGPTEERLDIKHNRPRRDCVAEGKVCDPLCSSGGCWGPGPGQCLSCRNYSRGGVCVTHCNFLNGEPREFAHEAECFSCHPECQPMEGTATCNGSGSDTCAQCAHFRDGPHCVSSCPHGVLGAKGPIYKYPDVQNECRPCHENCTQGCKGPELQDCLGQTLVLIGKTHLTMALTVIAGLVVIFMMLGGTFLYWRGRRIQNKRAMRRYLERGESIEPLDPSEKANKVLARIFKETELRKLKVLGSGVFGTVHKGVWIPEGESIKIPVCIKVIEDKSGRQSFQAVTDHMLAIGSLDHAHIVRLLGLCPGSSLQLVTQYLPLGSLLDHVRQHRGALGPQLLLNWGVQIAKGMYYLEEHGMVHRNLAARNVLLKSPSQVQVADFGVADLLPPDDKQLLYSEAKTPIKWMALESIHFGKYTHQSDVWSYGVTVWELMTFGAEPYAGLRLAEVPDLLEKGERLAQPQICTIDVYMVMVKCWMIDENIRPTFKELANEFTRMARDPPRYLVIKRESGPGIAPGPEPHGLTNKKLEEVELEPELDLDLDLEAEEDNLATTTLGSALSLPVGTLNRPRGSQSLLSPSSGYMPMNQGNLGESCQESAVSGSSERCPRPVSLHPMPRGCLASESSEGHVTGSEAELQEKVSMCRSRSRSRSPRPRGDSAYHSQRHSLLTPVTPLSPPGLEEEDVNGYVMPDTHLKGTPSSREGTLSSVGLSSVLGTEEEDEDEEYEYMNRRRRHSPPHPPRPSSLEELGYEYMDVGSDLSASLGSTQSCPLHPVPIMPTAGTTPDEDYEYMNRQRDGGGPGGDYAAMGACPASEQGYEEMRAFQGPGHQAPHVHYARLKTLRSLEATDSAFDNPDYWHSRLFPKANAQRT(서열번호 8).

일부 구현예에서, 핵산 서열은 비바이러스 벡터에 존재한다. 일부 구현예에서, 핵산 서열은 발현 제어 서열에 작동가능하게 이어진다. 다른 구현예에서, 핵산은 2개 이상의 발현 제어 서열에 작동가능하게 이어진다.

바이러스 및 비바이러스 매개 기법을 포함한 다양한 방법이 당업계에 알려져 있으며 핵산의 세포 내로의 도입을 위해 적합한다. 전형적인 비바이러스 매개 기법의 예에는 전기천공, 칼슘 포스페이트 매개 이송, 뉴클레오펙션, 초음파천공, 열 충격, 자기감염, 리포솜 매개 이송, 미세주사, 미세투사체 매개 이송(나노입자), 양이온성 중합체 매개 이송(DEAE-덱스트란, 폴리에틸렌이민, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 등) 또는 세포 융합을 포함하나 이에 제한되지 않는다.

일부 구현예에서, 개시된 핵산 서열을 함유하는 EV는 대상체의 세포에 투여되고, 이는 이후 대상체의 세포가 EV 생산 세포가 되도록 유도할 수 있다. 따라서, 개시된 치료적 유전자를 함유하거나 발현하는 세포로부터 생산된 세포외 소낭에 세포를 노출시키는 단계를 수반하는 세포를 EV 생산 세포로 재프로그래밍하는 방법이 또한 개시된다.

엑소솜과 미세소낭은 생물 발생 프로세스와 크기와 표면 단백질 마커를 포함한 생물물리학적 성질에 따라 상이한 EV이다. 엑소좀은 크기가 40 내지 150nm 범위인 균질한 작은 입자이며 일반적으로 세포내 이입성 재활용 경로로부터 유래된다. 세포내 이입에서는, 세포내 이입성 소낭이 원형질막에서 형성되고 융합되어 초기 엔도솜을 형성한다. 이들은 성숙되어 관내 소낭이 소낭 내 내강으로 버딩하는 후기 엔도솜이 된다. 리소좀과 융합하는 대신, 이들 다포체는 원형질막과 직접 융합하여 엑소좀을 세포외 공간으로 방출한다. 엑소좀 생물 발생, 단백질 수송물 분류 및 방출에는 수송에 필요한 엔도솜 분류 복합체(ESCRT 복합체) 및 기타 연관 단백질, 예컨대 Alix 및 Tsg101이 수반된다. 대조적으로, 미세소낭은 원형질막으로부터 막 소낭의 외부 버딩 및 분열을 통해 직접 생산되므로, 이들의 표면 마커는 기원 막의 조성에 크게 의존한다. 더욱이, 그들은 직경으로 150 내지 1000nm 범위인 더 크고 더 이종인 세포외 소낭 집단을 구성하는 경향이 있다. 그러나, 두 가지 유형의 소낭 모두 기능성 mRNA, miRNA 및 단백질을 수여자 세포에 전달하는 것으로 보여졌다.

일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 유전자 총, 이러한 전달에 적합한 마이크로입자 또는 나노입자, 전기천공에 의한 형질감염, 3차원 나노채널 전기천공, 조직 나노형질감염 장치, 이러한 전달에 적합한 리포솜 또는 심부 국소 조직 나노 전기 주입 장치를 통하여 세포내로 세포에 전달된다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터가 사용될 수 있다. 그러나 다른 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 바이러스적으로 전달되지 않는다.

전기천공은 세포막의 투과성을 증가시키기 위해 전기장을 세포에 적용하여 수송물(예를 들어, 재프로그래밍 인자)이 세포 내로 도입되도록 하는 기법이다. 전기천공은 외래 DNA를 세포내로 도입하는 일반적인 기법이다.

조직 나노형질감염은 배열된 나노채널을 통해 매우 강렬하고 집중된 전기장을 적용하여 세포 내로 수송물(예를 들어, 재프로그래밍 인자)의 직접적인 세포질 전달을 가능하게 하고, 이는 병치된 조직 세포 구성원을 양성적으로 나노천공하고 전기영동적으로 수송물을 세포내로 이동시킨다.

폴리펩티드 또는 기능성 핵산을 발현하기 위해, 뉴클레오티드 코딩 서열을 적절한 발현 벡터에 삽입할 수 있다. 따라서, 본원에 개시된 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 비바이러스 벡터가 또한 개시되며, 여기서 핵산 서열은 발현 제어 서열에 작동가능하게 이어진다. 일부 구현예에서, 핵산 서열은 단일 발현 제어 서열에 작동가능하게 이어진다. 다른 구현예에서, 핵산 서열은 2개 이상의 별도의 발현 제어 서열에 작동가능하게 이어진다.

유전적 서열 및 적절한 전사 및 번역 제어 요소를 함유하는 발현 벡터를 구축하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 이들 방법에는 시험관 내 재조합 DNA 기법, 합성 기법 및 생체 내 유전적 재조합이 포함된다. 이러한 기법은 Sambrook 외, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y., 1989) 및 Ausubel 외, Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, New York, N.Y., 1989)에 설명되어 있다.

발현 벡터는 일반적으로 삽입된 코딩 서열의 번역 및/또는 전사를 위해 필요한 요소인 조절 서열을 함유한다. 예를 들어, 코딩 서열은 바람직하게는 원하는 유전자 산물의 발현 제어를 돕기 위해 프로모터 및/또는 인핸서에 작동가능하게 이어진다.

생명공학에 사용되는 프로모터는 유전자 발현 제어의 의도된 유형에 따라 상이한 유형이 있다. 이들은 일반적으로 구성적 프로모터, 조직 특이적 또는 발달 과정 특이적 프로모터, 유도성 프로모터 및 합성 프로모터로 나눌 수 있다.

구성적 프로모터는 사실상 모든 조직에서 발현을 지시하며 전체적으로는 아니더라도 대체로 환경적이고 발달적인 인자와 무관한다. 그들의 발현은 일반적으로 내인성 인자에 의해 좌우되지 않기 때문에 구성적 프로모터는 대개 종에 걸쳐 심지어 계에 걸쳐 활성적이다. 구성적 프로모터의 예에는 CMV, EF1a, SV40, PGK1, Ubc, 인간 베타 액틴 및 CAG가 포함된다.

조직 특이적 또는 발달 과정 특이적 프로모터는 특정 조직 또는 발달의 특정 과정에서 유전자 발현을 지시한다. 식물의 경우, 관다발계, 광합성 조직, 괴경, 뿌리 및 기타 영양 기관 또는 종자 및 기타 생식 기관에서 발현되거나 유전자 발현에 영향을 미치는 프로모터 요소가 이종 시스템(예를 들어, 멀게 관련된 종 또는 심지어 다른 계)에서 발견될 수 있으나 가장 특이성은 일반적으로 동종 프로모터(즉, 동일한 종, 속 또는 과로부터)로 달성된다. 이는 아마도 프로모터의 활성의 조절을 위해 전사 인자의 조화로운 발현이 필요하기 때문일 것이다.

유도성 프로모터의 성능은 내인성 인자가 아니라 인위적으로 제어할 수 있는 환경적 조건과 외부 자극에 따라 조정되지 않는다. 이 그룹에는 비생물적 인자, 예컨대 빛, 산소 수준, 열, 추위 및 상처에 의해 조절되는 프로모터가 있다. 이들 인자 중 일부는 실험적 배경의 외부에서 제어하기 어렵기 때문에 관심 있는 유기체에서 자연적으로 발견되지 않는 화학적 화합물에 반응하는 프로모터가 특히 흥미롭다. 이러한 맥락에서, 다른 화합물 중 항생제, 구리, 알코올, 스테로이드 및 제초제에 반응하는 프로모터는 다른 생물적 또는 비생물적 인자와 관계없이 마음대로 유전자 활성의 유도를 가능하게 하도록 적응되고 정제되었다.

진핵생물 세포 생물학의 조사에 가장 일반적으로 사용되는 두 가지 유도성 발현 시스템은 Tet-Off와 Tet-On으로 불린다. Tet-Off 시스템은 대장균에서 발견되는 하나의 단백질인 TetR (테트라사이클린 억제자)을 단순 헤르페스 바이러스에서 발견되는 또 다른 단백질인 VP16의 활성화 도메인과 융합하여 생성되는 테트라사이클린 전사활성자(tTA) 단백질을 사용한다. 생성된 tTA 단백질은 특정 TetO 작동자 서열에서 DNA에 결합할 수 있다. 대부분의 Tet-Off 시스템에서는, 이러한 TetO 서열의 여러 반복이 최소 프로모터, 예컨대 CMV 프로모터의 상류에 배치된다. 최소 프로모터를 갖는 여러 TetO 서열 전체를 테트라사이클린 반응 요소(TRE)라고 하는데, 이는 유전자의 증가된 발현 또는 프로모터 하류의 유전자에 의해 테트라사이클린 전사활성자 단백질 tTA의 결합에 반응하기 때문이다. Tet-Off 시스템에서, TRE 제어 유전자의 발현은 테트라사이클린 및 그 유도체에 의해 억제될 수 있다. 그들은 tTA에 결합하여 TRE 서열에 결합할 수 없도록 만들어 TRE 제어 유전자의 전사활성화를 예방한다. Tet-On 시스템은 유사하게 작동하지만 반대 방식으로 작동한다. Tet-Off 시스템에 있는 동안, Tet-On 시스템에서 rtTA 단백질이 테트라사이클린 또는 그 유도체, 예컨대 독시사이클린 중 하나에 결합되지 않은 경우에만 tTA가 작동자에 결합할 수 있으며, rtTA 단백질은 테트라사이클린에 결합된 경우에만 작동자에 결합할 수 있다. 따라서 독시사이클린의 시스템으로의 도입은 유전적 산물의 전사를 개시한다. Tet-On 시스템은 더 빠른 응답성을 위해 Tet-Off보다 선호되는 경우가 있다.

일부 구현예에서, 본원에 개시된 핵산 서열은 동일한 발현 제어 서열에 작동가능하게 이어진다. 대안적으로, 내부 리보솜 진입 부위(IRES) 요소를 사용하여 다중 유전자 또는 다시스트론 메시지를 생성할 수 있다. IRES 요소는 5' 메틸화된 Cap 의존성 번역의 리보솜 스캐닝 모델을 우회하고 내부 부위에서 번역을 시작할 수 있다. IRES 요소는 이종 개방형 판독 프레임에 이어질 수 있다. 다중 개방형 판독 프레임은 함께 전사될 수 있으며 각각은 IRES로 분리되어 다시스트론 메시지를 생성할 수 있다. IRES 요소 덕분에, 각각의 개방형 판독 프레임은 효율적인 번역을 위해 리보솜에 접근할 수 있다. 단일 메시지를 전사하기 위해 단일 프로모터/인핸서를 사용하여 다수의 유전자를 효율적으로 발현할 수 있다.

발현 제어 서열에 작동가능하게 이어진 본원에 개시된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 함유하는 비바이러스 벡터가 개시된다. 이러한 비바이러스 벡터의 예에는 올리고뉴클레오티드 단독 또는 적합한 단백질, 다당류 또는 지질 제형과의 조합이 포함된다. 비바이러스 방법은 단순 대규모 생산과 낮은 숙주 면역원성 두 가지에서 바이러스 방법에 비해 확실한 장점을 제시한다. 이전에는 유전자의 낮은 수준의 형질감염과 발현이 비바이러스 방법에 불리한 단점이었으나; 최근 벡터 기술의 발전은 바이러스 방법과 유사한 형질감염 효율을 가진 분자와 기법이 양산되었다.

적합한 비바이러스 벡터의 예에는 pIRES-hrGFP-2a, pCMV6, pMAX, pCAG, pAd-IRES-GFP 및 pCDNA3.0이 포함되나 이에 제한되지 않는다.

개시된 조성물은 약학적으로 허용되는 운반체와 조합하여 치료적으로 사용될 수 있다. "약학적으로 허용되는"이란 생물학적으로 또는 달리 바람직하지 않은 재료를 의미하는데, 즉, 재료는 임의의 바람직하지 않은 생물학적 효과를 야기하거나 그것이 함유된 약학적 조성물의 다른 구성요소 중 임의의 것과 유해한 방식으로 상호작용하지 않고 핵산 또는 벡터와 함께 대상체에게 투여될 수 있다. 당업자에게 잘 알려진 바와 같이, 운반체는 활성 성분의 임의의 분해를 최소화하고 대상체에서 임의의 부정적인 부작용을 최소화하도록 자연적으로 선택될 것이다.

치료적 EV

또한 생체 외에서 생산되고 NF1 치료에서의 사용을 위한 치료적 수송물을 적재한 EV가 개시된다. 개시된 EV는 일부 구현예에서 세포에 의해 분비될 수 있는 임의의 소낭일 수 있다. 세포는 세포사멸체(1-5μm), 미세소낭 (크기로 100-1000nm), 엑소솜으로 알려진 엔도솜 기원의 소낭(50-150nm)을 포함하여 광범위한 직경과 기능을 가진 세포외 소낭(EV)을 분비한다.

일부 구현예에서, 공여자 세포는 피부 세포(예를 들어, 섬유아세포, 각질세포, 피부 줄기 세포), 지방세포, 수지상 세포, 말초 혈액 단핵 세포(PBMC), 췌장 세포(예를 들어, 관 상피 세포), 간 세포(예를 들어, 간세포), 면역 세포(예를 들어, T 세포, 대식세포, 골수 유래 억제자 세포)를 (비제한적으로) 포함하는 EV를 생산할 수 있는 임의의 공여자 세포일 수 있다.

개시된 세포외 소낭은 당업계에 알려진 방법에 따라 제조될 수 있다. 예를 들어, 개시된 세포외 소낭은 세포 표적화 리간드를 암호화하는 mRNA를 진핵 세포에서 발현시킴으로써 제조될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 또한 치료적 수송물을 암호화하는 mRNA를 발현한다. 세포 표적화 리간드 및 치료적 수송물에 대한 mRNA는 개시된 EV를 생산하기 위해 적합한 생산 세포에 형질감염된 벡터로부터 발현될 수 있다. 세포 표적화 리간드 및 치료적 수송물에 대한 mRNA는 동일한 벡터(예를 들어, 벡터가 세포 표적화 리간드에 대한 mRNA 및 별도의 프로모터로부터 치료적 수송물을 발현하는 경우)로부터 발현될 수 있거나, 세포 표적화 리간드와 치료적 수송물에 대한 mRNA는 별도의 벡터에서 발현될 수 있다. 세포 표적화 리간드 및 치료적 수송물에 대한 mRNA를 발현하기 위한 벡터 또는 벡터들은 개시된 세포외 소낭을 제조하기 위해 설계된 키트에 포장될 수 있다.

적합한 운반체 및 이의 제형은 Remington: The Science and Practice of Pharmacy (19th ed.) ed. A.R. Gennaro, Mack Publishing Company, Easton, PA 1995에 설명되어 있다. 전형적으로, 제형을 등장성으로 만들기 위해 적절한 양의 약학적으로 허용되는 염이 제형에 사용된다. 약학적으로 허용되는 운반체의 예로는 식염수, 링거액, 덱스트로스 용액이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 용액의 pH는 바람직하게는 약 5 내지 약 8, 더욱 바람직하게는 약 7 내지 약 7.5이다. 추가 운반체에는 지속 방출 제제, 예컨대 항체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스가 포함되며, 이 매트릭스는 성형품, 예를 들어 필름, 리포솜 또는 미세입자 형태이다. 예를 들어, 투여 루트 및 투여되는 조성물의 농도에 따라 특정 운반체가 더 바람직할 수 있다는 것이 당업자에게 명백할 것이다.

약학적 운반체는 당업자에게 알려져 있다. 이들은 가장 전형적으로 용액, 예컨대 멸균수, 식염수 및 생리학적 pH의 완충 용액을 포함하여 인간에게 약물 투여를 위한 표준 운반체일 것이다. 조성물은 근육내 또는 피하로 투여될 수 있다. 다른 화합물은 당업자가 사용하는 표준 절차에 따라 투여될 것이다.

약학적 조성물은 선택된 분자에 더하여 운반체, 증점제, 희석제, 완충액, 방부제, 표면활성제 등을 포함할 수 있다. 약학적 조성물은 또한 하나 이상의 활성 성분, 예컨대 항미생물제, 항염증제, 마취제 등을 포함할 수 있다.

비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수성 또는 비수성 용액, 현탁제, 유제가 포함된다. 비수성 용제의 예에는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물성 오일, 예컨대 올리브 오일, 주사 가능한 유기 에스테르, 예컨대 에틸 올레이트가 있다. 수성 운반체에는 물, 알코올성/수성 용액, 식염수 및 완충 매질을 포함한 유제 또는 현탁제가 포함된다. 비경구 비히클에는 소듐 클로라이드 용액, 링거 덱스트로스, 덱스트로스 및 소듐 클로라이드, 젖산 링거 또는 고정 오일이 포함된다. 정맥내 비히클에는 체액 및 영양 보충제, 전해질 보충제(예컨대, 링거 덱스트로스 기반의 것) 등이 포함된다. 방부제 및 기타 첨가제, 예컨대, 예를 들어 항균제, 항산화제, 킬레이트제 및 불활성 가스 등이 또한 존재할 수 있다.

국소 투여를 위한 제형에는 연고, 로션, 크림, 젤, 점적제, 좌약, 스프레이, 액체 및 분말이 포함될 수 있다. 통상적인 약학적 운반체, 수성, 분말 또는 유성 베이스, 증점제 등이 필요하거나 바람직할 수 있다.

경구 투여용 조성물에는 분말 또는 과립제, 물 또는 비수성 매질 중 현탁제 또는 용액, 캡슐, 향낭 또는 정제가 포함된다. 증점제, 향료, 희석제, 유화제, 분산 보조제 또는 결합제가 바람직할 수 있다.

조성물 중 일부는 잠재적으로 무기산, 예컨대 염산, 브롬화수소산, 과염소산, 질산, 티오시안산, 황산 및 인산, 유기산, 예컨대 포름산, 아세트산, 프로피온산, 글리콜산, 젖산, 피루브산, 옥살산, 말론산, 숙신산, 말레산 및 푸마르산과의 반응, 또는 무기 염기, 예컨대 소듐 히드록사이드, 암모늄 히드록사이드, 포타슘 히드록사이드 및 유기 염기, 예컨대 모노-, 디-, 트리알킬 및 아릴 아민 및 치환된 에탄올아민과의 반응에 의해 형성된 약학적으로 허용되는 산- 또는 염기-부가염으로 투여될 수 있다.

약학적 조성물을 포함한 본원에 개시된 조성물은 국부 또는 전신 치료가 바람직한지 여부, 그리고 치료할 영역에 따라 다양한 방식으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 개시된 조성물은 정맥내, 복강내, 근육내, 피하, 강내 또는 경피적으로 투여될 수 있다. 조성물은 경구, 비경구(예를 들어, 정맥내), 근육내 주사, 복강내 주사, 경피, 체외, 안구, 질, 직장, 비강내, 국소 등으로 투여될 수 있으며, 이는 국소적인 비강내 투여 또는 흡입제에 의한 투여를 포함한다.

치료적 수송물

개시된 세포외 소낭에는 치료제가 적재될 수 있으며, 여기서 세포외 소낭은 제제물을 SC로 전달한다. 적합한 치료제에는 치료적 약물(예를 들어, 작은 분자 약물), 치료적 단백질 및 치료적 핵산(예를 들어, 치료적 RNA 또는 DNA)이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 개시된 세포외 소낭은 치료적 RNA 또는 DNA(본원에서는 "수송물 RNA" 또는 "수송물 DNA"라고도 지칭됨)를 포함한다. 특정 구현예에서, 수송물은 NF1 유전자의 뉴로피브로민 1이다.

예를 들어, 일부 구현예에서 세포 표적화 단백질은 또한 세포외 소낭이 세포로부터 분비되기 전에 수송물 RNA를 세포외 소낭 안으로 포장하기 위하여 수송물 RNA에 존재하는 하나 이상의 RNA-모티프에 결합하는 RNA 도메인(예를 들어, 융합 단백질의 세포질 C 말단에서)을 포함한다. 마찬가지로, 일부 구현예에서 세포 표적화 단백질은 또한 세포외 소낭이 세포로부터 분비되기 전에 수송물 DNA가 세포외 소낭 안으로 포장하기 위하여 수송물 DNA에 존재하는 하나 이상의 DNA 모티프에 결합하는 DNA 도메인(예를 들어, 융합 단백질의 세포질 C 말단에서)을 포함한다. 이처럼, 단백질은 “세포 표적화 단백질”과 “포장 단백질” 두 가지 모두를 기능할 수 있다. 일부 구현예에서, 포장 단백질은 세포외 소낭 적재 단백질 또는 "EV 적재 단백질"로 지칭될 수 있다.

개시된 세포외 소낭의 수송물 RNA 또는 수송물 DNA는 임의의 적합한 길이일 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서 수송물 RNA 또는 수송물 DNA는 적어도 약 10nt, 20nt, 30nt, 40nt, 50nt, 100nt, 200nt, 500nt, 1000nt, 2000nt, 5000nt 이상의 뉴클레오티드 길이를 가질 수 있다. 다른 구현예에서, 수송물 RNA는 약 5000nt, 2000nt, 1000nt, 500nt, 200nt, 100nt, 50nt, 40nt, 30nt, 20nt, 또는 10nt 이하의 뉴클레오티드 길이를 가질 수 있다. 추가 구현예에서, 수송물 RNA는 이들 고려되는 뉴클레오티드 길이 범위 내의 뉴클레오티드 길이, 예를 들어 약 10nt-5000nt 범위 사이 또는 다른 범위의 뉴클레오티드 길이를 가질 수 있다. 개시된 세포외 소낭의 수송물 RNA 또는 수송물 DNA는 상대적으로 길 수 있다.

일부 구현예에서, 치료적 수송물은 세포에 의해 분비된 후 EV에 적재되는 막투과성 약리학적 화합물이다.

작은 RNA를 EV로 적재하는 것을 달성하기 위해, 형질감염 기반 접근 방식이 제안되었다. 다른 보고서는 세포에서 작은 RNA의 벡터 유도 발현을 사용하여 EV로의 작은 RNA의 적재를 달성할 수 있다는 것을 보여준다. 대안적으로, EV 공여자 세포는 작은 RNA로 직접 형질감염될 수 있다. 화학치료적 약물과 함께 종양 세포의 인큐베이션은 약물을 EV에 포장하는 또 다른 방법이기도 하다. 약물 적재된 EV의 형성을 자극하기 위해, 세포에 자외선을 조사하여 세포사멸을 유도한다. 대안적인 접근 방식, 예컨대 융해성 리포솜은 또한 약물을 EV에 적재하는 것으로 이어진다.

일부 구현예에서, 치료적 수송물은 농도 구배를 통한 확산에 의해 EV로 적재된다.

방법

개시된 EV를 사용하여 슈반 세포에 진단적이거나 치료적인 수송물을 전달하기 위한 방법이 본원에 개시된다. 따라서, 슈반 세포와 연관된 임의의 질환 또는 병태를 치료하기 위한 방법 또한 본원에 개시된다.

예를 들어, 신경초종은 신경계에 형성되는 드문 유형의 종양이다. 신경초종 종양은 양성인 경우가 많으며 이는 암이 아님을 의미한다. 그러나 드물게 암이 될 수도 있다.

신경섬유종증 1형(NF1)은 슈반 세포(SC) 내 뉴로피브로민 1(NF1) 유전자의 돌연변이로 인해 야기되는 상염색체 우성 유전적 병태이다. 폰 레클링하우젠 질환이라고도 불리는 NF1은 신경과 피부의 다발성 비암성(양성) 종양(신경섬유종)과 비정상적인 피부색(색소침착)의 영역의 발병을 특징으로 한다. 비정상적인 피부 색소침착 영역에는 전형적으로 옅은 황갈색 또는 연한 갈색 변색(카페오레 반점), 비정형 위치, 예컨대 팔 아래(액와 부위) 또는 서혜부(서혜부 부위)의 주근깨를 포함한다. 이러한 피부 색소침착의 이상은 대개 1세경에 뚜렷하며 시간이 지남에 따라 크기와 수가 증가하는 경향이 있다.

출생 시 또는 유아기 초기에, 영향을 받은 개체는 신경 다발과 기타 조직으로 구성된 상대적으로 큰 양성 종양(총상 신경섬유종)을 가질 수 있다. NF1가 있는 개체는 또한 눈의 착색된 부위에 양성 결절(리쉬 결절) 또는 시각 경로의 신경에 종양(시신경교종)이 발병할 수도 있다. 더 드물게, 영향을 받은 개체에게 특정 악성(암성) 종양이 발병할 수 있다.

NF1은 또한 비정상적으로 큰 머리 크기(대두증)와 상대적으로 짧은 키를 특징으로 한다. 추가적인 이상, 예컨대 뇌의 제어되지 않는 전기적 활성(발작)의 에피소드; 학습 장애 및 주의력 결핍; 언어 장애; 비정상적으로 증가된 활성(과다활성); 및 척추의 진행성 만곡(척추측만증), 다리의 휘어짐(가관절증) 및 특정 뼈의 부적절한 발달을 포함한 골격 기형이 존재할 수도 있다. 연관 증상 및 발견은 동일한 가족 내에서도 사람마다 범위와 중증도가 크게 다를 수 있다. NF1을 가진 대부분의 사람들은 정상적인 지능을 가지고 있지만 NF1을 가진 어린이의 약 50%에서 학습 장애가 나타난다.

1987년 국립보건원(NIH) 합의 회의에 따르면, 환자가 다음 중 적어도 두 가지를 나타내는 경우 NF1의 임상적 진단이 내려질 수 있다: (1) 크기로 적어도 5밀리미터[mm](사춘기 이전) 또는 크기로 15mm(사춘기 이후) 6개 이상의 카페오레 반점; (2) 겨드랑이(액와) 또는 서혜부(사타구니) 부위의 주근깨; (3) 눈의 착색된 부분에 비정상적인 색소 덩어리(리쉬 결절); (4) 머리의 특정 뼈 발달 이상(접형형 날개 이형성증) 또는 뼈의 비정상적인 휘어짐(가관절증); (5) 임의 유형의 2개 이상의 신경섬유종 또는 1개의 총상 신경섬유종; (6) NF1이 확인된 영향을 받은 부모, 형제자매 또는 아이.

NF1의 증상은 대개 아동기에 시작되며, 상황에 따라 4세 이하까지 명확한 진단이 이루어질 수 있는 경우가 많다. 장애는 일생에 걸쳐 점진적으로 진행된다. 어떤 경우에는, NF1 증상이 사춘기, 임신 또는 호르몬 변화가 유발될 때 악화되는 것으로 설명되었지만 이러한 상관 관계는 아직 완전히 이해되지 않았다. NF1 증상의 범위와 중증도는 영향을 받는 개체사이에서 크게 다르며, 이 장애의 진행 속도는 예측할 수 없다. 그러나 대다수의 환자(대략 60%)는 "경증" 형태의 병태를 갖고 있는 것으로 설명된다.

종종 NF1의 첫 번째 징후는 피부에 다수의 갈색 반점(카페오레 반점)이나 겨드랑이(액와) 또는 서혜부(사타구니) 부위에 주근깨의 출현인데, 이는 출생 또는 유아기 초기에 유발할 수 있다. 리쉬 결절은 생애 초기에 나타날 수도 있으며 영향을 받은 개체의 대략 97%에서 유발하므로 NF1 진단이 높게 시사된다.

다발성 비암성(양성) 종양(신경섬유종)은 피부 아래 또는 신체의 더 깊은 영역의 신경(초) 내벽을 따라 NF1에서 발생한다. 신경섬유종은 신체의 임의의 기관에서 형성될 수 있다. 피부(피부) 신경섬유종 또는 덜 분리된 신경섬유종(총상 신경섬유종)은 미관손상을 야기할 수 있다. 때때로, 종양은 뇌, 뇌에서 나가는 신경 및/또는 척수에서 발생할 수 있다. 성인의 신경섬유종의 전체 수는 몇 개에서 수백 개, 심지어 수천 개 범위이며, 이들 종양의 수는 나이가 들수록 증가하는 경향이 있다. 통증은 영향을 받은 말초 신경으로부터 유발하거나 인접 구조에 대한 부위적 군집 효과의 결과로 유발할 수 있다. 영향을 받은 개체의 8-15%에서, 신경섬유종은 암성(악성 말초 신경 초 종양)으로 변할 수 있으며, 이는 통증, 중량 감소, 야간 발한과 연관되어 긴급 평가 및 치료를 필요로 한다.

NF1를 갖는 사람의 대략 15%에서 뇌종양(신경교종)이 발생하며, 이는 거의 항상 아동기 동안에 발생한다. 이는 흔히 눈의 신경(시신경종)에 발생하며 시력에 영향을 미치거나 잠재적으로 실명으로 이어질 수 있다. 추가적으로, 위장관 간질 종양(GIST)을 포함하여 NF1 환자에게서 다양한 다른 종양이 발생할 수 있다. NF1이 있는 여성에서, 유방암 발생 위험은 3.5배 증가하고, 50세 이전에 유방암 발생 위험은 5배 증가한다.

척추 만곡(척추측만증), 비정상적인 두개골 성장(접형형 날개 이형성증) 또는 뼈 조직 손실, 골절, 중량을 지탱하는 긴 뼈의 비정상적인 치유 및 휘어짐(가관절증)을 특징으로 하는 병태를 포함한 NF1로 인해 정형외과적 문제가 발생할 수 있다. 추가적으로, 골밀도 장애(골감소증 및 골다공증)는 일반 집단에서 보다 NF1이 있는 사람들에게서 더 흔하다. 이들 병태가 발생하는 프로세스는완전히 이해되지 않았지만 감소된 활성화된 비타민 D 수치, 증가된 부갑상선 호르몬 수치 및 증가된 뼈 파괴 지표와 연관이 있다. NF1을 가진 사람들은 연령에 비해 키가 평균 이하이고 근력이 평균 이하이며 머리 크기가 평균 이상인 경향이 있다.

높은 혈압(고혈압)은 일반 집단에 비해 NF1 집단에서 더 높은 빈도로 나타난다. 이에 대한 원인은 확실하지 않지만, 일부 사례에서는 NF1과 직접적인 관련이 있는 것이 아니라 신장으로 이어지는 혈관의 연관된 변화(신장 동맥 협착증)와 관련이 있을 수 있다. 더 드물게 NF1가 있는 환자는 부신 종양(황색세포종)이 발생할 위험이 있으며, 이는 치료 없이 심각한 혈압 상승을 야기할 수 있다.

성 발달은 NF1가 있는 개체에서 지연될 수 있거나 조기(조숙한 사춘기) 유발할 수 있다. (이 장애에 대한 자세한 내용을 보려면 희귀 질환 데이터베이스에서 검색 용어로 "조숙한 사춘기"를 선택) 또한, NF1가 있는 개체의 50% 초과가 학습 장애, 예컨대 주의력 결핍 과잉 행동 장애(ADHD)를 경험한다. 발작이 유발할 수도 있다. 다른 증상으로는 두통, 무감각 및/또는 약화가 포함된다.

분절성 신경섬유종증으로 알려진 국부화된 형태의 NF1에서는 비정상적인 색소침착 및/또는 종양이 신체의 한 영역에 제한될 수 있다.

신경섬유종증 2(NF2)는 NF1과 유전적으로 다른 희귀 장애이다. NF2는 청각 신경(전정 신경초종)과 신체의 다른 영역 모두에서의 양성 종양을 특징으로 한다. 수막종 및/또는 뇌실막세포종을 포함하여 중추신경계의 다른 종양이 발생할 수 있다. NF2가 있는 개체는 전형적으로 카페오레 기미나 비정상적인 피부 주근깨를 가지고 있지 않는다. NF2의 다른 증상으로는 균형 문제, 귀에서 윙윙거리는 소리 또는 울림(이명), 점진적인 청력 상실 또는 안면 약화가 포함될 수 있다. 일부 구현예에서, 개시된 조성물 및 방법은 NF2를 치료하는데 사용될 수 있다.

개시된 EV는 임의의 적합한 수단에 의해 대상체에게 투여될 수 있다. 인간 또는 동물 대상체에 대한 투여는 비경구, 근육내, 뇌내, 혈관내, 피하 또는 경피 투여로부터 선택될 수 있다. 전형적으로, 전달 방법은 주사이다. 바람직하게는 주사는 근육내 또는 혈관내(예를 들어, 정맥내)이다. 의사는 각 특정 환자에게 필요한 투여 루트를 결정할 수 있다.

EV는 바람직하게는 조성물로서 전달된다. 조성물은 비경구, 근육내, 뇌내, 혈관내(정맥내 포함), 피하 또는 경피 투여용으로 제형화될 수 있다. 비경구 투여용 조성물은 완충액, 희석제 및 기타 적합한 첨가제를 또한 함유할 수 있는 멸균 수용액을 포함할 수 있다. EV는 약학적 조성물로 제형화될 수 있으며, 이는 EV 외에 약학적으로 허용되는 운반체, 증점제, 희석제, 완충액, 방부제, 기타 약학적으로 허용되는 운반체 또는 부형제 등을 포함할 수 있다.

비경구 투여는 일반적으로 주사, 예컨대 피하, 근육내 또는 정맥내를 특징으로 한다. 비경구 투여를 위한 제제에는 즉시 주사 가능한 멸균 용액, 피하정제를 포함한 사용 직전에 용매와 즉시 조합할 수 있는 멸균 건조 용성 산물, 예컨대 동결건조 분말, 바로 주사 가능한 멸균 현탁제, 사용 직전에 비히클과 조합 가능한 멸균 건조 불용성 산물 및 멸균 유제를 포함한다. 용액은 수성 또는 비수성일 수 있다.

정맥으로 투여하는 경우, 적합한 운반체에는 생리 식염수 또는 포스페이트 완충 식염수(PBS), 및 증점제 및 용해제, 예컨대 글루코스, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜 및 이들의 혼합물을 함유하는 용액이 포함된다. 비경구 제제에 사용되는 약학적으로 허용되는 운반체에는 수성 비히클, 비수성 비히클, 항미생물제, 등장제, 완충액, 항산화제, 국부 마취제, 현탁제 및 분산제, 유화제, 봉쇄제 또는 킬레이트제 및 기타 약학적으로 허용되는 물질이 포함된다. 수성 비히클의 예로는 소듐 클로라이드 주사, 링거 주사, 등장성 덱스트로스 주사, 멸균수 주사, 덱스트로스 및 젖산화 링거 주사가 포함된다. 비수성 비경구 비히클에는 식물 기원의 고정 오일, 면실 오일, 옥수수 오일, 참깨 오일 및 땅콩 오일이 포함된다. 정균 또는 정진균 농도의 항미생물제는 페놀 또는 크레졸, 수은, 벤질 알코올, 클로로부탄올, 메틸 및 프로필 p-히드록시벤조산 에스테르, 티메로살, 벤잘코늄 클로라이드 및 벤제토늄 클로라이드를 포함하는 다회 용량 용기에 포장된 비경구 제제에 첨가되어야 한다. 등장성 제제에는 소듐 클로라이드 및 덱스트로스가 포함된다. 완충액에는 포스페이트와 시트레이트가 포함된다. 항산화제에는 소듐 비설페이트가 포함된다. 국부 마취제에는 프로카인 히드로클로라이드가 포함된다. 현탁제 및 분산제에는 소듐 카르복시메틸셀룰로스, 히드록시프로필 메틸셀룰로스 및 폴리비닐피롤리돈이 포함된다.

유화제에는 Polysorbate 80(TWEEN® 80)이 포함된다. 금속 이온의 봉쇄제 또는 킬레이트제에는 EDTA가 포함된다. 약학적 운반체에는 수혼화성 비히클을 위한 에틸 알코올, 폴리에틸렌 글리콜 및 프로필렌 글리콜; 및 pH 조정을 위한 소듐 히드록시드, 염산, 구연산 또는 젖산이 포함된다. 약학적 활성 화합물의 농도는 주사가 원하는 약리학적 효과를 생산하기에 유효한 양을 제공하도록 조정된다. 정확한 용량은 당업계에 알려진 바와 같이 환자 또는 동물의 연령, 중량 및 병태에 따라 달라진다.

단위 용량의 비경구 제제는 앰플, 바이알 또는 바늘이 있는 주사기에 포장될 수 있다. 비경구 투여를 위한 모든 제제는 당업계에 알려져 있고 실행되는 바와 같이 멸균되어야 한다.

치료적 유효량의 조성물이 투여된다. 용량은 다양한 매개변수, 특히 치료할 환자의 병태, 연령 및 중량의 중증도; 투여 루트; 및 필요한 요법에 따라 결정될 수 있다. 의사는 임의의 특정 환자에게 필요한 투여 루트와 복용량을 결정할 수 있을 것이다. 최적의 복용량은 개별 구조체의 상대적 효능에 따라 달라질 수 있으며 일반적으로 시험관 내 및 생체 내 동물 모델에서 유효한 것으로 밝혀진 EC50을 기반으로 추정할 수 있다. 일반적으로, 복용량은 체중 kg 당 0.01mg/kg 내지 100mg이다. 전형적인 일일 용량은 특정 구조체의 효능, 치료할 대상체의 연령, 중량 및 병태, 질환의 중증도, 투여 빈도 및 루트에 따라 kg 당 약 0.1 내지 50mg, 바람직하게는 체중의 약 0.1mg/kg 내지 10mg/kg이다. 투여가 근육내 주사인지 전신(정맥내 또는 피하) 주사인지에 따라 구조체의 상이한 복용량이 투여될 수 있다.

바람직하게는, 단일 근육내 주사의 용량은 약 5 내지 20μg 범위이다. 바람직하게는, 단일 또는 다중 전신 주사의 용량은 체중의 10 내지 100mg/kg 범위이다.

구조체 정리(및 임의의 표적화 분자의 분해)로 인해, 환자는 반복적으로, 예를 들어 매일, 매주, 매월 또는 매년 1회 이상 치료를 받아야 할 수도 있다. 당업자는 측정된 체류 시간 및 체액 또는 조직 내 구조체의 농도에 기초하여 복용에 대한 반복 속도를 쉽게 추정할 수 있다. 성공적인 치료 후에, 환자가 유지 치료법을 거치게 하는 것이 바람직할 수 있으며, 여기서 구조체는 체중 kg 당 0.01mg/kg 내지 100mg 범위의 유지 용량으로 매일 1회 이상 내지 20년에 1회 투여된다.

실시예 구현예

구현예 1. NRG1, NRG2 또는 이들의 조합을 발현하도록 조작된 공여자 세포로부터 생산된 세포외 소낭(EV)을 포함하는 조성물.

구현예 2. 구현예 1에 있어서, 공여자 세포는 자가조직인 것인, 조성물.

구현예 3. 구현예 1 또는 2에 있어서 공여자 세포는 피부 세포인 것인, 조성물.

구현예 4. 구현예 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, EV는 치료적 수송물을 캡슐화하는, 조성물.

구현예 5. 구현예 4에 있어서, 치료적 수송물은 NF1 또는 뉴로피브로민을 암호화하는 핵산을 포함하는, 조성물.

구현예 6. 구현예 1에 있어서, EV는 슈반 세포를 선택적으로 표적화 하는, 조성물.

구현예 7. 유효량의 구현예 4를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 슈반 세포로 치료적 수송물을 선택적으로 전달하는 방법.

구현예 8. 유효량의 구현예 1 내지 6 중 어느 하나의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 신경섬유종증 1형(NF1)을 치료하는 방법.

구현예 9. NRG1, NRG2 또는 이들의 조합을 암호화하는 핵산 서열, 및 뉴로피브로민을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 대상체의 피부 세포 내로 세포내 전달하는 단계를 포함하는, 대상체에서 신경섬유종증 1형(NF1)을 치료하기 위한 방법으로서, 여기서 피부 세포는 NRG1, NRG2 또는 이들의 조합으로 장식되고 치료적 수송물로서 뉴로피브로민을 캡슐화하는 EV를 생산하는, 방법.

본 발명의 다수의 구현예가 설명되었다. 그럼에도 불구하고, 본 발명의 사상 및 범위를 벗어남 없이 다양한 변형이 이루어질 수 있음이 이해될 것이다. 따라서, 다른 구현예는 다음 청구범위의 범위 내에 있다.

실시예

실시예 1: 표적화 전달을 위한 설계자 EV 개발

나노형질감염은 섬유아세포를 조작하여 SC에 대한 친화성이 있는 EV를 생산하고 SC에 치료적 페이로드를 전신적으로 전달하기 위해 조작하는 데 사용된다(도 1). 터널링 나노튜브 (TNT)는 또한 SC에 친화성이 있는 설계자 EV를 방출하고(인-시추) SC에 치료적 페이로드를 전신적으로 전달하기 위해 피부 패치를 조작하는 데에도 사용된다 (도 1).

NF1은 SC에서 NF1 유전자의 돌연변이/결실에 의해 주도된다. NF1에는 많은 주요 기능(예를 들어, Ras-GTPase의 조절)을 가지므로, 이러한 돌연변이/결실은 신경섬유종으로 이어진다. 따라서, NF1 기능을 회복하기 위해 유전자 치료법이 연구되었다. 기능을 회복하기 위해 레트로바이러스 및 아데노 연관 바이러스 벡터를 사용하여 NF1의 GAP 관련 도메인을 형질감염시켰다. 그러나, 이들 연구는 효율성이 낮은 경우가 많다. 더욱이, 바이러스 벡터는 캡시드 크기 한계로 인해 전장 NF1을 운반하지 못한다.

바이러스 벡터는 유전자 치료법에 대한 최적 표준이 되었다. 그러나 바이러스는 유망하지만 캡시드 크기 제약을 넘어서는 몇 가지 제한이 있다. 예를 들어, 바이러스 벡터 유도 면역은 재복용을 예방하거나 생물안전성 염려를 제기할 수 있다. 따라서 EV는 유전자 치료법을 위한 유망한 치료적 운반체로 등장하였다. 바이러스 또는 합성 등 대부분의 운반체 시스템과 비교하여, EV는 큰 수송물을 포장할 수 있고 개선된 생체적합성, 저감된 면역원성, 향상된 안정성 및 생물학적 장벽을 통과할 수 있는 타고난 능력을 보여준다. 따라서, 상이한 질환에 대한 치료적 EV를 조작하는데 상당한 양의 조사가 이루어지고 있다. 그러나, 현재 NF1에 대한 치료적 페이로드의 전달을 위한 설계자 EV에 대한 조사는 부족하다.

TNT는 생체 내 비바이러스(즉, 캡시드 크기 한계 없음) 유전자 전달에 사용될 수 있다. TNT는 실리콘 나노채널과 전기장을 사용하여 빠르고(~100밀리초) 효율적이며 순한 방식으로 고체 조직으로 수송물을 전달한다(도 2). 이는 나노규모 전기천공과 전기영동의 조합을 통해 달성된다. 인실리코 및 생체 내 연구는 TNT 대 표준 벌크 전기천공법(BEP)의 우월성을 입증한다. TNT는 마우스에서 피부(cNF) 및 총상 신경섬유종(pNF)에 대한 유전자 치료법을 주도하는 데 사용될 것이다.

고형 조직에 직접 유전자 전달을 가능하게 하는 것 외에도, TNT는 TNT 처리된 유전자의 사본과 전사물이 적재된 표피로부터 설계자 EV의 방출을 주도할 수도 있다. 연구는 TNT 처리된 피부가 피부 외부로 형질감염을 증폭시키는 데 잠재적으로 사용될 수 있는 EV를 생산할 수 있음을 시사한다. 생체 외에서 만들어진 설계자 EV의 전신 전달 외에도 여기서 TNT는 표피가 특정 수용체-리간드 상호 작용을 통해 전신적으로 cNF 및 pNF로 지시될 수 있는 SC 표적화 설계자 EV(생체 내)를 생산하도록 "강제"하는 데 사용된다.

NF1에 대한 유전자 치료법을 활용하기 위한 EV 기반 접근 방식은 일부 구현예에서 SC 표적화 EV를 피부로부터 보냄으로써 생산된다. 예를 들어, cNF에 대한 치료적 유전자를 직접 전달하는 것 외에도 TNT는 표피를 프로그래밍하여 SC 친화성이 있는 설계자 EV를 전신적으로 방출하는데 사용된다.

전장 NF1은 모델 수송물로 사용되지만, 제안된 EV 기술은 상이한 유형의 치료적 수송물(예를 들어, CRISPR/Cas9)을 전달하는 데 사용될 수 있다.

실시예 2: SC 표적화 전달을 위한 설계자 EV 개발

설계자 EV 제형은 SC에 대한 향상된 친화성을 갖도록 개발되었다. 이는 SC 표적화 리간드(HRG1/2, NRG1)를 과발현하거나 SC(SOX10, EGR2)로의 전환을 주도하기 위해 플라스미드를 이용하여 마우스 진피 섬유아세포(MDF)를 나노형질감염시켜 수행된다. 작동 가설은 SC 표적화 리간드 플라스미드로 MDF를 나노형질감염시키는 것은 리간드-수용체 상호작용(HRG1/2-ErbB2/3, NRG1-EGF/ErbB3)을 통해 SC에 우선적으로 결합할 기능화된 EV의 방출로 이어질 것이라는 것이다. 따라서 더 쉽게 풍부한 세포로부터 유래된 EV에 대한 SC 친화성을 부여하는 방법이 필요하다.

표적화 리간드로 장식된 EV:

나노형질감염 플랫폼은 앞에서 설명한 바와 같이 SC 표적화 리간드를 위한 플라스미드를 MDF로 전달하기 위해 제작되고 사용된다. 간단히 말하면, MDF(ScienCell)는 나노채널과 직접 접촉하여 도금되고 펄스 전기장(~250V, 10ms 펄스, 10펄스)을 사용하여 플라스미드를 전달한다. 동일한 백본을 가진 가짜 플라스미드가 대조군으로 사용된다. 플라스미드는 개별적으로 또는 이중 순열로 혼합되어 등몰농도로 형질감염된다. EV는 ExoQuick 키트를 사용하여 6-72시간에 상층액으로부터 단리된다. 표적화 리간드를 이용한 EV 기능화는 웨스턴 블롯(WB)으로 평가된다. NanoSight는 EV 농도와 크기를 정량화하는데 사용된다.

선택적 흡수:

설계자 EV 제형의 선택적 SC 흡수는 SC와 MDF의 공동 배양에서 감정된다. SC(ATCC)와 MDF를 1:1 비율로 혼합한다. 세포와 EV는 상이한 파장(~490, 560 및 650nm)의 형광단으로 표지된다. 공동 배양은 ~10⁹-10¹⁰EVs/ml에 노출되고 SC 대 MDF의 선택적 흡수는 공초점 현미경을 통해 평가된다. SC로부터 유래된 EV는 양성 대조군으로 사용된다.

생체분포:

cNF/pNF에서 SC에 대한 친화성이 향상된 EV 제형을 확인하기 위해 NF1의 쥐 모델이 사용되며, 여기서 Nf1 대립 유전자는 SOX10+ 세포에서 비활성화되어 cNF 및 pNF의 형성으로 이어진다. 간단히 말하면, 동형접합성 Nf1^fl/fl 마우스(재고 번호: 017640, JAX)를 타목시펜 유도성 SOX10-CreERT2 마우스(재고 번호: 027651, JAX)와 교배시킨다. 자손으로부터 Nf1^fl/-:SOX10-CreERT2^+/0 마우스를 Nf1^fl/fl 마우스와 교배시킨다. 자손의 대략 25%는 Nf1flox 대립 유전자에 대한 동형접합성 유전자형과 SOX10-CreERT2 대립 유전자(Nf1^fl/fl:SOX10-CreERT2^+/0)에 대한 반접합성 유전자형을 가지며 실험 계통으로 사용된다. Nf1flox 대립유전자에 대한 자손 동형접합성 및 SOX10-CreERT2 대립유전자에 대한 비대립(Nf1^fl/fl:SOX10-CreERT2^0/0)이 대조군으로 사용된다. 생후 ~1개월에 마우스를 타목시펜으로 처리한다. cNF/pNF 병변/증상(칙칙한 털, 구부정한 자세, 절름발이, 사지 마비)이 확인되면 타목시펜 유도 후 ~6개월 후에 EV 제형을 꼬리 정맥을 통해 주사한다. SC로부터 유래된 EV는 양성 대조군으로 사용된다. EV는 MemGlow로 형광 태깅된다. 마우스에는 매일 중량의 ~10¹²EV/그램의 볼루스를 주사하고 1-5회 주사한 마우스를 비교한다. 마지막 주사 후 24시간 후에 마우스를 안락사시키고, cNF 병변, 척수/좌골 신경(pNF를 검사하기 위해), 간, 폐, 비장 및 신장을 수집하고 IVIS로 영상화하여 EV 분포를 평가한다. 조직은 이후 조직학을 위해 프로세스된다. 신경섬유종은 S100β, GAP43, SOX10, Iba1 및 비만 세포에 대해 면역염색 된다. 조직 섹션에서 EV의 존재는 공초점 이미징으로 정량화된다.

cNF/pNF로의 NF1 전달:

최적의 리간드 세트가 식별되면, 모델 수송물로써 전장 NF1을 적재한 EV가 생산된다. MDF는 NF1(~13.4kb, Origene) 및 최적화된 리간드 플라스미드로 공동 나노형질감염(1:1 비율)된다. 양성 대조군 EV는 NF1을 SC에 전달하여 준비된다. 음성 대조군 EV는 가짜+리간드 플라스미드를 공동 전달하여 준비된다. 설계자 EV는 6-72시간에 상층액에서 수집되고 EV 기능화 및 NF1 적재는 WB 및 qRT-PCR에 의해 평가된다. NF1 적재된 EV의 SC에 의한 선택적 흡수가 평가된다. qRT-PCR은 SC에서 NF1 발현을 평가하는 데 사용된다. EV는 매일 중량의 ~10¹²EV/그램의 볼루스로 꼬리 정맥을 통해 타목시펜 처리된 Nf1fl/fl:SOX 10-CreERT2^+/0 마우스에 전달되고 1-5회 주사된 마우스를 비교한다. 생체분포가 감정된다. NF1 전달 cNF/pNF 및 기능은 NF1에 대한 qRT-PCR, 뉴로피브로민, p-ERK에 대한 면역염색 및 SOX10+ 및 비만 세포의 정량화에 의해 평가된다. 추가적인 감정에는 신경섬유종의 수와 부피뿐만 아니라 TUNEL 및 BrdU 염색의 정량화가 포함된다. EV가 NF1을 운반했는지 입증하기 위해, 레이저 포착 미세해부(LCM)를 사용하여 조직 섹션의 형광 태깅된 부분(태깅된 EV 축적을 가리킴)을 단리하고 PCR/qRT-PCR을 사용하여 해당 위치에서 NF1 플라스미드/mRNA를 정량화한다.

실시예 3: SC 표적화 EV의 현장 활용을 위한 TNT 프로토콜 개발

표피가 신경 섬유종을 치료하기 위해 SC 표적화 EV를 생산하도록 함으로써 TNT를 이용하여 NF1에 대한 EV 기반 치료법을 활용하는 대안적인 접근 방식이 테스트되었다. 피부를 치료적 EV의 현장 공급원으로 사용하는 것은 단리/정제의 필요성이 제거되므로 잠재적으로 규모 확대 및 번역을 용이하게 한다. 작동 가설은 NF1의 TNT 기반 공동 전달 + SC 표적화 리간드의 최적화된 제형이 (1) cNF 내 SC로의 NF1 직접 전달과 (2) NF1이 적재된 표피 EV 방출과 SC 표적화 리간드로 "장식되는" 것을 초래할 수 있다. 이러한 EV의 말초 림프절 또는 전신 순환으로의 계속적인 배액은 피부를 넘어 전신적인 퍼짐과 cNF 및 pNF 내 SC로 귀환을 초래할 가능성이 높다.

TNT 장치 제작:

TNT 플랫폼은 앞서 보여진 바와 같이 4" Si 웨이퍼로부터 웨이퍼 규모의 클린룸 절차를 사용하여 제작된다. 간단히 말하면, 깊은 반응성 이온 에칭과 함께 투영 및 접촉 리소그래피의 조합을 사용하여 나노채널(~300nm Ø, ~20μm 깊이)이 Si에 에칭된다. 전자 현미경을 통해 프로세스의 각 단계에서 수행된 특성화는 장치 품질을 보장한다. 프로세스된 웨이퍼는 1cm² 장치로 잘려서 플라스틱 케이스에 붙여져 플라스미드 저장소를 형성한다.

형질감염:

NF1을 위한 플라스미드와 리간드를 표적화하기 위한 최적화된 제형은 공동 TNT(1:1 비율)이다. TNT는 타목시펜 유도 Nf1^fl/fl:SOX10-CreERT2^+/0 마우스의 cNF 또는 정상 피부에 직접 수행된다. TNT 전에 피부를 네이어드한다. 가짜 플라스미드 단독의 TNT 및 가짜 + 표적화 리간드 플라스미드가 대조군 역할을 한다. 플라스미드는 플라스미드 저장소와 피부 사이에 위치한 한 쌍의 전극에 걸쳐 펄스 전기장(250V, 10ms 펄스, 10펄스)을 적용하여 전달된다. TNT 절차의 지속 시간은 ~100ms에 불과하므로 마우스당 1-4개 지점이 TNT이다. 재복용 효과를 평가하기 위해 TNT를 1-5주 동안 매주 수행한다. 마우스를 안락사시키고 TNT 처리된 피부, cNF 병변, 척수/신경, 간, 비장, 신장 및 폐를 수집한다. 표피 EV를 추적하기 위해, 피부는 NF1의 TNT 및 리간드 플라스미드를 타겟팅하기 24시간 전에 EV 추적자 플라스미드(pCT-CD63-GFP, Systems Bio)를 사용하여 사전 TNT된다.

TNT 결과:

cNF 또는 정상 피부로의 NF1의 성공적인 전달/발현은 표피 및 진피의 LCM로 평가하고 이어 PCR/qRT-PCR 및 면역염색을 통해 플라스미드 전달 및 발현(mRNA 및 단백질 수준)을 평가한다. EV는 피부 생검으로부터 단리되며 장식 및 적재는 WB 및 qRT-PCR로 특성화 된다. CD63-GFP 태깅된 EV의 생체분포가 평가된다. 직접적으로 TNT 처리되지 않은 cNF와 pNF에서 NF1의 EV 기반 전달/발현은 표피 EV가 축적된 GFP+ 부위를 분석하기 위해 LCM/qRT-PCR로 특성화 한다. 기능성 감정은 cNF 및 pNF에서도 수행된다.

실시예 4: EV를 생성하기 위한 프로토콜

공여자 세포의 형질감염 24시간 후에 EV를 배양 배지로부터 단리시켰다. 배양 배지를 2,000g에서 30분간 4℃에서 원심분리하여 사멸 세포와 잔해를 제거하였다. 원심분리 후, 무세포 배양 배지를 여과하고 300kDa 분자량 컷오프를 갖는 Vivaspin 필터(Sartorius, 76408-886)를 사용하여 농축하였다. EV는 이후 두 가지 방법 중 하나를 사용하여 단리되었다. 1) EV를 함유하는 농축된 용액을 qEV Original SEC 컬럼을 사용하여 qEV Automatic Fraction Collector (Izon Science Ltd.)에서 크기 배제 크로마토그래피에 적용하고 3개의 EV가 풍부한 분획을 수집하고 후속 분석을 위해 저장하거나; 2) 전체 엑소좀 단리 시약(Thermo Fisher Scientific, 44-783-59)을 제조업체의 지침에 따라 무세포 배양 배지를 함유하는 상층액에 첨가하였다. 모든 EV는 나노입자 추적 분석(NTA) 기법을 통해 농도와 크기 분포를 측정하여 용액에서 특성화되었으며 정량적 qRT-PCR을 사용하여 임의의 실험 전에 EV 내부의 분자 수송물의 패킹을 입증하였다.

다르게 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 개시된 발명이 속하는 기술 분야의 숙련자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 인용된 간행물과 이들이 인용된 자료는 참조로 구체적으로 포함되어 있다.

당업자는 단지 일상적인 실험을 사용하여 본원에 설명된 본 발명의 특정 구체적인 구현예에 대한 많은 동등물을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 그러한 동등물은 다음 청구범위에 포괄되도록 의도된다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims (9)

1. NRG1, NRG2 또는 이들의 조합을 발현하도록 조작된 공여자 세포로부터 생산된 세포외 소낭(EV)을 포함하는, 조성물.
2. 제1항에 있어서, 공여자 세포는 자가조직인 것인, 조성물.
3. 제1항에 있어서, 공여자 세포는 피부 세포인 것인, 조성물.
4. 제1항에 있어서, EV는 치료적 수송물을 캡슐화하는, 조성물.
5. 제4항에 있어서, 치료적 수송물은 NF1 또는 뉴로피브로민을 암호화하는 핵산을 포함하는, 조성물.
6. 제1항에 있어서, EV는 슈반 세포를 선택적으로 표적화 하는, 조성물.
7. 유효량의 제4항을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 슈반 세포로 치료적 수송물을 선택적으로 전달하는, 방법.
8. 유효량의 제1항의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 신경섬유종증 1형(NF1)을 치료하는, 방법.
9. 대상체에서 신경섬유종증 1형(NF1)을 치료하기 위한 방법으로서, NRG1, NRG2 또는 이들의 조합을 암호화하는 핵산 서열, 및 뉴로피브로민을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 대상체의 피부 세포 내로 세포내 전달하는 단계를 포함하며, 피부 세포는 NRG1, NRG2 또는 이들의 조합으로 장식되고 치료적 수송물로서 뉴로피브로민을 캡슐화하는 EV를 생산하는, 방법.

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