KR20240086712A

KR20240086712A - 효율적인 현장 유전자 분자 진단 방법

Info

Publication number: KR20240086712A
Application number: KR1020220156544A
Authority: KR
Inventors: 서영준; 알람 아사 타스니마
Original assignee: 전북대학교산학협력단
Priority date: 2022-11-21
Filing date: 2022-11-21
Publication date: 2024-06-19

Abstract

본 발명은 Formamide-Ligation-RPA-PK-probe를 이용하여 현장에서 RNA 유전자 분자 진단을 위한 가장 효율적인 시스템에 관한 것으로, 본 발명의 Formamide-Ligation-RPA-PK-probe를 이용한 Covid 19 진단 기술은 현장에서 추출 키트의 사용 없이 바이러스 RNA의 추출이 가능하고, 추출된 RNA로부터 cDNA의 합성을 위해 역전사를 이용하지 않으며, 생성된 cDNA의 증폭을 위해 RPA(Recombinase Polymerase Amplification)를 사용하였고, 검출기기의 사용없이 눈으로 색의 변화를 관찰할 수 있으므로 RNA 바이러스 매개 질환을 현장에서 30분 내로 신속하고 정확하게 검출이 가능하므로 현장 진단 검사(POCT)로 매우 유용하게 이용할 수 있다.

Description

효율적인 현장 유전자 분자 진단 방법{Efficient on-site genetic molecular diagnostic method}

본 발명은 Formamide-Ligation-RPA-PK probe를 이용하여 현장에서 RNA 유전자 분자 진단을 위한 가장 효율적인 시스템에 관한 것이다.

코로나바이러스(COVID-19)는 2019년에 갑자기 발생하여 4억 4,500만 건과 함께 590만명 이상의 생명을 앗아갔으며, 동시에 세계 경제를 붕괴시키는 전 세계 공중 보건에 치명적인 영향을 끼쳤다. 코로나는 무증상 감염자도 대다수 있으므로 지속적인 검사가 필요하며, 급작스럽게 감염성 바이러스 발산 및 확산을 방지하는 것이 요구되고 있다. 미세유체 분석, 혈청학 및 핵산 검출을 기반으로 하는 검출 시스템을 포함하여 많은 검출 시스템의 가용성에도 불구하고 COVID-19 진단을 위한 효율적이고 효과적인 시스템을 개발이 필요하다.

검체 보관, 인큐베이션 중 온도 조절, 비용, 정제 및 긴 분석 시간이 필요하고, 바이러스의 변형에 따른 위검사의 한계에도 불구하고, 역전사 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR)을 사용하여 특이적으로 정확하게 바이러스 핵산을 검출할 수 있으므로 많이 이용하는 방법입니다. 그러나 RT-PCR 및 qPCR은 숙련된 인력이 있는 표준/고급 PCR 기계가 필요하므로 현장 진단 검사(POCT)에는 적합하지 않다.

바이러스를 퍼뜨리는 매개체의 역할을 고려할 때, 현장 진단 검사(POCT)는 복잡한 진단 방법을 최소화하고 최적화된 치료에 대한 의사 결정을 빠르게 진단해야할 필요성이 있으므로 검출을 빨리 하는 것을 가장 우선 순위로 생각해야 한다. 또한, 현장 진단 검사(POCT)는 간단하고 수행하기 쉬우며 견고하고 휴대가 가능해야하며 소량의 샘플만으로 검출이 가능해야한다. 예를 들어, DNA 중합효소의 가닥 치환 활성을 통해 핵산의 항온 등온 검출을 사용할 수 있다[예: 재조합효소 중합효소 증폭(RPA), RCA 및 LAMP].

RT-RPA, RT-PCR, RT-LAMP, RT-RPA/CRISPR Cas12b 및 qPCR을 기반으로 하는 많은 탐지 시스템이 잘 확립되어 있으나, RT-RPA의 경우 매우 간단하고 값비싼 장비가 필요하지 않지만, 바이러스 RNA의 전체 게놈을 표적으로 할 때 역전사(RT) 동안 프라이머의 mis- 또는 self-pairing의 기회와 함께 선택성에 상당한 단점이 있습니다. 또한, RT-RPA 시스템은 역전사 중에 원치 않는 cDNA 산물을 많이 생성할 수 있으며, 프라이머는 일부가 일치 않을 때 비표적 서열과 정확한 표적 서열을 구별하기 어려우며, 일부 프라이머는 원치 않는 표적에 비특이적으로 결합하여 비특이적 증폭 생성물을 생성할 수 있다. 따라서 표적 서열에 대한 프라이머를 디자인할 때 매우 어렵고 정확한 결과를 얻기 위해서는 세심한 디자인이 요구된다.

이에 본 발명에서는 RNA 유전자 분자 진단을 위하여 현장 진단 검사(POCT)를 하기 위하여 현장에서 추출 키트 없이 바이러스를 추출하고, 추출된 바이러스를 ligation(결찰)한 다음 눈으로 색변화를 관찰하는 시스템을 확립하였습니다.

(001) M.N. Aoki, B. de Oliveira Coelho, L.G.B. Goes, ´ P. Minoprio, E.L. Durigon, L. G. Morello, F.K. Marchini, I.N. Riediger, M. do Carmo Debur, H.I. Nakaya, L. Blanes, Colorimetric RT-LAMP SARS-CoV-2 diagnostic sensitivity relies on color interpretation and viral load, Sci. Rep. 11 (2021) 1-10, (002) C. Rodriguez Diaz, N. Lafuente-Gomez, ´ C. Coutinho, D. Pardo, H. Alarcon-Iniesta, ´M. Lopez-Valls, ´ R. Coloma, P. Milan-Rois, ´ M. Domenech, M. Abreu, R. Canton, ´ J. C. Galan, ´ R. Bocanegra, L.A. Campos, R. Miranda, M. Castellanos, A. ´ Somoza, Development of colorimetric sensors based on gold nanoparticles for SARS-CoV-2 RdRp, E and S genes detection, Talanta 243 (2022), 123393,

본 발명의 목적은 Formamide-Ligation-RPA-PK probe를 이용하여 효율적으로 현장진단 하기 위한 표적 RNA 바이러스 검출용 조성물 및 이를 포함한 키트, 표적 RNA 바이러스 검출에 관한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.

따라서 본 발명은 폼마이드(Formamide)를 포함하는 RNA(RiboNucleic Acid) 추출 시약; 상기 추출된 RNA로부터 표적 RNA 바이러스 서열을 포함하는 cDNA(complementary Deoxyribo Nucleic Acid)를 결찰(Ligation)하는 효소; 상기 표적 RNA 바이러스 서열을 포함하는 cDNA를 증폭시키는 RPA(Recombinase Polymerase Amplification); 및 하기 화학식 1의 PK-probe(pyrophosphate-sensing probe)를 포함하는 표적 RNA 바이러스 검출용 조성물 및 이를 포함하는 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 생물학적 시료에서 폼마이드(Formamide)로 RNA(Ribo Nucleic Acid)를 추출하는 단계; 추출된 RNA로부터 결찰(Ligation)을 이용하여 표적 RNA 바이러스 서열을 포함하는 cDNA(complementary Deoxyribo Nucleic Acid)를 합성하는 단계; RPA(Recombinase Polymerase Amplification)로 상기 cDNA를 증폭하는 단계;상기 cDNA를 포함하는 시료에 PK-probe(pyrophosphate-sensing probe)를 첨가하는 단계 및 상기 cDNA를 포함하는 시료의 색이 분홍색에서 무색으로 변화할 경우 표적 RNA 바이러스 서열이 포함된 것으로 진단하는 단계;를 포함하는 표적 RNA 바이러스 검출에 관한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

본 발명의 Formamide-Ligation-RPA-PK probe를 이용한 Covid 19 진단 기술은 현장에서 추출 키트의 사용 없이 바이러스 RNA의 추출이 가능하고, 추출된 RNA로부터 cDNA의 합성을 위해 역전사를 이용하지 않으며, 생성된 cDNA의 증폭을 위해 RPA(Recombinase Polymerase Amplification)를 사용하였고, 검출기기의 사용 없이 눈으로 색의 변화를 관찰할 수 있으므로 RNA 바이러스 매개 질환을 현장에서 30분 내로 신속하고 정확하게 검출이 가능하므로 현장 진단 검사(POCT)로 매우 유용하게 이용할 수 있다.

도 1은 Formamide-Ligation-RPA-PK probe를 이용한 Covid 19 진단 과정을 나타낸 모식도이다.
도 2는 PK-probe/Lig-RPA 분석 과정과 결과를 나타낸 도면과 그래프이다:
(A) PAGE를 사용한 Lig-RPA 결과; 레인 M: 25/100bp,
레인 1: SARS-CoV-2 양성 환자에서 추출한 전체 게놈 RNA+SARS-CoV-2의 "N gene"에 해당하는 1~7개의 연결 템플릿+결찰 및 PK-probe가 있는 RPA 반응 혼합물; 레인 2: SARS-CoV-2 음성 환자에서 추출된 전체 게놈 RNA+SARS CoV-2의 "N" 유전자에 해당하는 1~7개의 연결 템플릿+결찰 및 PK-probe가 있는 RPA 반응 혼합물, <40mer 크기 위치 근처에서 레인 1(흐릿함, 매우 밝음) 및 레인 2(맑음),
(B) PK-probe의 색상 변경 메커니즘,
(C) PK-probe/Lig-RPA의 최적화; 2.5μM의 PK-probe 농도는 양성 반응과 음성 반응 사이의 눈에 띄게 현저한 색상 변화를 최적화하기 위해 필요함,
(D) 음성 및 양성 PK-probe/Lig-RPA 분석의 흡광도(575 nm 측정).
도 3은 PK-probe/Lig-RPA 분석의 최적화하기 위하여 시간에 따른 비색 분석한 결과를 나타낸 사진과 그래프이다:
(A) 시간에 따른 감도의 비색 분석,
레인 1: 0분-0분 Lig+0분 RPA; 레인 2: 20분-10분 Lig+10분 RPA; 레인 3: 25분-10분 Lig+15분 RPA; 레인 4: 30-15분 Lig+15분 RPA; 레인 5: 35분-15분 Lig+20분 RPA; 레인 6: 40분-15분 Lig+25분 RPA; 레인 7: 50분-20분 Lig+30분 RPA; 레인 8: 1시간-20분 Lig+40분 RPA,
(B) (A)의 비색 테스트에 따른 흡광도 스펙트럼,
(C) 온도 의존적 연구의 비색 분석,
레인 1: 37℃에서 Lig-RPA(음성); 레인 2: 20℃에서 Lig-RPA; 레인 3: 25℃에서 Lig-RPA; 레인 4: 30℃에서 Lig-RPA; 레인 5: 37℃에서 Lig-RPA(양성),
(D) (C)의 온도 의존적 연구에 따른 PK-probe/Lig-RPA 시스템의 흡광도 스펙트럼(575 nm 측정).
도 4는 PK-probe/Lig-RPA assay를 이용한 반응의 민감도를 나타낸 사진과 그래프이다:
(A) 다른 카피 수를 사용한 Lig-RPA 민감도 테스트의 PAGE 분석.
레인 M: 100-bp ; 레인 1: 50 카피; 레인 2: 20 카피; 레인 3: 10 카피; 레인 4: 5 카피; 레인 5: 2 카피; 레인 6: 1 카피; 레인 7: 0 카피,
(B) 다른 카피 수를 사용하여 PK-probe를 사용한 Lig-RPA의 감도 테스트의 비색 분석. 레인 1: 0 카피; 레인 2: 1 카피; 레인 3: 2 카피; 레인 4: 5 카피; 레인 5: 10 카피; 레인 6: 20 카피; 레인 7: 50 카피,
(C) 0에서 50 copies/reaction(copies/rxn)의 농도에서 전체 게놈 SARS-CoV-2를 사용하여 수행된 민감도 연구,
A: 표적 존재시 흡광도; A₀: 표적 부재시 흡광도; y축: 절대값. 얻은 LOD는 1,160 카피/ml(표적 RNA는 1μl 사용)로 3σ 방법[LOD = 3 × (SD/S), 여기서 SD는 표준 편차이고 S는 플롯의 기울기].
도 5는 PK-probe/Lig-RPA 선택성 실험 결과를 나타낸 사진도 그래프이다:
(A) PK-probe/Lig-RPA 선택성 시험의 PAGE 분석,
레인 M: 25/100-bp 사다리; 레인 1: 중간 1 불일치가 있는 PK-probe/Lig-RPA; 레인 2: PK-probe/Lig-RPA; 레인 3: PK-probe/Lig-RPA(1개 포함) 불일치(머리/결찰 부위); 레인 4: 2개의 불일치가 있는 PK-probe/Lig RPA(헤드 및 중간); 레인 5: 3개의 불일치가 있는 PK-probe/Lig-RPA(헤드 1 및 중간 2),
(B) cDNA 합성 중 서로 다른 불일치 역방향 프라이머를 사용한 PK-probe/RT-RPA 선택성 테스트의 PAGE 분석,
레인 M: 25/100-bp 사다리; 레인 1: PK-probe/RT-RPA 양성; 레인 2: 1개의 불일치가 있는 PK-probe/RT-RPA; 레인 3: 2개의 불일치가 있는 PK-probe/RT-RPA; 레인 4: 3개의 불일치가 있는 PK-probe/RT-RPA,
(C) PK-probe/Lig-RPA 선택성 시험의 비색 분석
레인 1: PK-probe/Lig-RPA ; 레인 2: 중간 1개의 불일치가 있는 PK-probe/Lig-RPA; 레인 3: 1개의 불일치가 있는 PK-probe/Lig-RPA(머리/결찰 부위); 레인 4: 2개의 불일치가 있는 PK-probe/Lig-RPA(헤드 및 중간); 레인 5: 3개의 불일치가 있는 PK-probe/Lig-RPA(헤드 1 및 중간 2),
(D) cDNA 합성 중 서로 다른 불일치 역방향 프라이머를 사용한 PK-probe/RT-RPA의 선택성 테스트의 비색 분석,
레인 1: PK-probe/RT-RPA 양성; 레인 2: 1개의 불일치가 있는 PK-probe/RT-RPA; 레인 3: 2개의 미스 매치가 있는 PK-probe/RT-RPA; 레인 4: 3개의 불일치가 있는 PK-probe/RT-RPA,
(E) 여러 박테리아 게놈의 존재 하에 작동되는 PK-probe/Lig-RPA 시스템의 선택성의 막대 다이어그램.
도 6은 9가지 박테리아 게놈의 존재하에 작동되는 PK-probe/Lig-RPA의 선택성을 나타내는 흡광도 스펙트럼(575 nm)을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 universal transport media(qc 재료)를 사용하는 비활성 재조합 SARS Cov-2 바이러스와 비인두에서 채취한 샘플과 함께 PK-probe/Lig-RPA 분석을 사용한 검증한 결과를 나타낸 사진과 그래프이다:
(A) 비색 테스트;
레인 1: 음성(25℃에서 추출+PK-probe/Lig-RPA, 25℃), 레인 2: 양성(65℃에서 추출+PK-probe/Lig-RPA, 25℃), 레인 3 : 양성(37℃에서 추출+PK-probe/37℃에서 Lig-RPA), 레인 4: 양성(25℃에서 추출+PK-probe/Lig-RPA, 25℃),
(B) 비색 테스트에 해당하는 흡광도 판독값.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 폼마이드(Formamide)를 포함하는 RNA(RiboNucleic Acid) 추출 시약; 상기 추출된 RNA로부터 표적 RNA 바이러스 서열을 포함하는 cDNA(complementary Deoxyribo Nucleic Acid)를 결찰(Ligation)하는 효소; 상기 표적 RNA 바이러스 서열을 포함하는 cDNA를 증폭시키는 RPA(Recombinase Polymerase Amplification); 및 하기 화학식 1의 PK-probe(pyrophosphate-sensing probe)를 포함하는 표적 RNA 바이러스 검출용 조성물을 제공한다.

[화학식 1]

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 표적 RNA 바이러스는 코로나 바이러스(Corona virus)인 것이나, 표적 RNA는 바이러스 RNA에 한정하지 않고 인간 및 다양한 동물 및 식물 질병의 RNA를 포함할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 PK-probe는 티에닐-히드라존 로다민(thienyl-hydrazone rhodamine) 유도체의 Cu²⁺복합체인 것으로, 상기 PK-probe는 Cu²⁺ 이온과 착화된 고리-오픈에 의하여 로다민 물질을 핑크색으로 나타내는 프로브이고, 이러한 프로브가 PPi와 접촉하면 해당 이온은 이전에 로다민 엔티티에 배위된 Cu²⁺이온과 복합체를 형성하게 된다. PK-probe가 Cu²⁺ 이온을 방출한 후 자동적으로 로다민 고리가 닫아지면서 분홍색이 사라지고 무색을 나타낸다.

상기 조성물을 포함하는 표적 RNA 바이러스 검출용 키트를 제공한다.

본 발명은 생물학적 시료에서 폼마이드(Formamide)로 RNA(Ribo Nucleic Acid)를 추출하는 단계; 추출된 RNA로부터 결찰(Ligation)을 이용하여 표적 RNA 바이러스 서열을 포함하는 cDNA(complementary Deoxyribo Nucleic Acid)를 합성하는 단계; RPA(Recombinase Polymerase Amplification)로 상기 cDNA를 증폭하는 단계;상기 cDNA를 포함하는 시료에 PK-probe(pyrophosphate-sensing probe)를 첨가하는 단계 및 상기 cDNA를 포함하는 시료의 색이 분홍색에서 무색으로 변화할 경우 표적 RNA 바이러스 서열이 포함된 것으로 진단하는 단계;를 포함하는 표적 RNA 바이러스 검출에 관한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 생물학적 시료는 혈액, 객담, 세균, 정액, 세포 조직, 침, 머리카락 및 소변으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 시료일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 결찰(Ligation)은 핵산 분자를 결합하는 효소에 의해 이루어지는 것일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 PK-probe는 하기 화학식 1의 화합물인 것일 수 있다.

[화학식 1]

.

본 발명은 SARS-CoV-2 게놈의 표적 "N gene"(뉴클레오캡시드) 검출을 위해 결찰 매개 재조합 중합효소 등온 증폭(Lig-RPA)과 PK-probe(PPi 감지 비색 프로브)를 결합한 진단 시스템을 개발하였다. RT-RPA와 같은 기존의 진단 시스템과의 비교하여, 본 발명의 시스템은 다양한 박테리아 게놈이 있는 상태에서 SARS-CoV-2에 대해 높은 선택성을 보였고 위조 가능성은 매우 낮으며 방법도 매우 간단하다. 또한, PK-probe/Lig-RPA 시스템은 현장 진단 검사(POCT)에 적용하기 매우 적합하며, 등온 증폭 반응이 실온에서 발생하고 진단 시간이 30분으로 매우 빠릅니다. 감도가 매우 높고(1,160 copies/ml) 및 비색 검출을 이용하여 육안으로 확인할 수 있다.

본 발명에 있어서, SARS-CoV-2, 특히 "N gene" 영역을 표적으로 하는 진단을 위해 PK-probe(PPi 감지 비색 프로브)를 Lig-RPA 반응과 결합하였으며, 그 결과 PK-probe/Lig-RPA 비색 등온 핵산 검출 시스템은 공정이 간단하고 높은 선택성과 감도로 작동하기 때문에 현장 진단 검사(POCT)에 적합한 분석 기법이다(도 1 참고).

본 발명의 용어 "비색 분석(colorimetric analysis)"은 물질이 용매에 용해하여, 착색용액)이 되었을 때, 그 빛깔의 농도를 표준 용액의 빛깔과 비교해서, 용액의 농도를 측정하는 방법을 비색분석법이라고 한며, 일반적으로는 용액이 붉은색이라는 것은 가시광의 파장영역(400~700nm)에서 나머지색이 흡수되는 것을 의미하고, 그 여색광이 용액을 투과했을 때의 광량의 변화를 광전관으로 측광하면 정확하게 용질의 양을 측정할 수 있으며, 용액이 무색인 경우에도 색을 나타나게 하는 시약을 가하여 용질과 화학반응으로 결합시키고, 발색시켜 눈에 보이지 않는 자외선이나 적외선의 파장역에서 빛의 흡수가 일어나고 있지 않는가를 찾아내어, 흡수가 강한 파장의 빛으로 흡수강도를 재어 측정하기도 한다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다.

그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 이에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 실험 재료 및 방법

<1-1> 실험 재료

모든 DNA 올리고뉴클레오티드는 Bioneer에서 구입하였다. SplintR ligase 및 Isothermal Amplification Buffer Pack은 New England Biolabs(USA)에서 입수하였다. RPA TwistAmp® 기본 키트는 TwistDx, TABAS03KIT(USA)에서 구입하였다. 포름아미드(F7503-100 ML)는 Sigma-Aldrich(미국)에서 구입하였다. UV-Vis 흡수 스펙트럼은 Cary Series UV-Vis 분광 광도계(Agilent Technologies, USA)를 사용하여 분석하였다. 모든 광학 측정은 석영 큐벳(경로 길이: 1cm)을 사용하여 실온에서 수행하였다. PK-probe는 이전에 보고된 절차에 따라 준비하였다. 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE)을 20% 폴리아크릴아미드 겔에서 수행하였다. 40% Acrylamide/Bis solution(BIO-RAD, USA; 2.5mL), 10X Tris borate EDTA buffer(Enzynomics, South Korea; 0.5mL), 20% ammonium persulfate(in H₂O)를 튜브와 증류수에 혼합한 다음 총 부피가 5mL가 되도록 첨가하였다. 테트라메틸에틸렌디아민(TEMED; Sigma-Aldrich, USA)을 첨가하여 20% 폴리아크릴아미드 겔을 얻었다. 겔을 전기 영동 기기(Mini-PROTEAN Tetra Cell; BIO-RAD, USA)에 로딩하고 80V에서 6시간 동안 처리하였다. 젤은 10분 동안 ethidium bromide(EtBr) 용액으로 염색되었습니다. 염색된 젤을 물로 10분 동안 세척하였고, 겔 사진 및 비색 검출 이미지는 트랜스일루미네이터 아래에서 모바일 장치를 사용하여 캡처하였다.

<1-2> 결찰(Ligation) 및 RPA 반응 조건

총 결찰 반응 부피는 용액을 포함하여 10μL였다. 7개의 결찰 올리고뉴클레오티드 템플릿(서열번호 1 내지 7, 10nM, 5μL) 중 스파이크 SARS-CoV-2 RNA(2개 카피, 1μL) 10X SplintR 리가아제 완충액(500mM Tris-HCl, 100mM MgCl₂, 10mM ATP; 25℃에서 pH 7.5; 1μL), 10X bovine serum albumin(BSA, 1μL), SplintR ligase(25U/μL, 1μL), PK-probe(0.1μL) 및 dH₂O를 추가하여 총 10μl 부피를 제공하고 37℃에서 배양 약 10분 동안 Twist Dx RPA 키트의 일반적인 절차에 따라 총 반응 부피 50μL에는 primer-free rehydration buffer(29.5μL), 정방향 및 역방향 프라이머(각각 50pmol/μL, 5μL), 100mM DTT(3μL) 및 결찰된 표적 생성물(10μL); 동결건조된 효소가 포함된 기본 반응 키트 혼합물로 처리한 다음 피펫을 사용하여 혼합하였다. 280mM Mg(OAc)₂(2.5μL)를 첨가하고 잘 혼합하였다. 반응 혼합물을 37℃에서 약 20분 동안 인큐베이션하였다.

<1-3> 감도 및 선택도 측정

SARS-CoV-2 스파이크 RNA를 준비하는 동안 시뮬레이션된 샘플; 재조합 SARS-CoV-2 전체 게놈 제어 물질 200μL(1000 카피)(5000 copies/mL; AccuPlex SARS-CoV-2 Molecular Controls Kit- Full Genome, Material Number 0505-0129, SeraCare, Milford, MA)표준 표본 획득에 따라 준비된 음성인 인간 샘플의 1.8mL 완충액(eNAT, Copan Italia, Brescia, Italy)에 스파이킹되었다. 그런 다음 eMAG 시스템(bioMerieux, Marcyltoile, France)을 사용하여 총 2ml 용액(1000 카피)을 추출하였고, 제조업체에서 제공한 추출 프로토콜에 따라 200μL(100 카피)의 입력 부피로 50μL(100 카피)의 용리 부피를 얻었다. 추출된 RNA의 복제 농도는 약 2카피/μL = 2000copies/ml였습니다. 민감도 연구를 위해 RNA 샘플을 증류수에 희석하고 동결건조하여 농도가 0~50카피/μL = 0~50,000copies/ml로 다양하게 제공하였다. 각 농도의 모든 샘플은 PK-probe/Lig-RPA 시스템으로 실험하였다. 검출 한계(LOD)를 계산하기 위해 흡광도를 측정하였다. 선택성 연구는 상기도에 있는 정상 식물상으로 알려진 9종의 박테리아(Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Enterococcus faecalis, Enterococcus feacium, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter cloacae, Pseudomonas aeruginosa 및 Acineitobacter bau)를 포함하였다. 모든 박테리아 DNA는 DNA 추출 버퍼(Seegene, Seoul, South Korea)를 사용하여 boiling method으로 추출되었다. 바이러스 RNA는 임상 샘플과 동일한 검증 방식으로 추출되었다. 추출된 박테리아 DNA와 바이러스 RNA를 PK-probe/Lig-RPA 시스템으로 실험하였으며, SARS-CoV-2 검출에 대한 결과와 비교하였다. 감도 및 선택성 연구에서 ddH₂O(150μL)을 25mM PK-probe(0.1μL)와 함께 250μL 반응 튜브에 첨가하여 색상 변화를 확인하고 나중에 ddH₂O로 희석하여 1mL 용액을 만들었으며, 각 반응에 대한 혼합물의 흡광도는 PK-probe의 존재 하에 측정하였다.

<실시예 2> 실험 결과

<2-1> 표적 부위 선정 및 프라이머 디자인

본 발명에서는 SplintR ligase에서 7개의 템플릿(Lig T1, Lig T2, Lig T4, Lig T5, Lig T6, Lig T7)을 설계하여 하기 표 1에 나타내었다.

서열번호	이름	서열(5'→3')
1	Lig-T1	GAA ATT TGG ATC TTT GTC ATC CAA TTT GAT GGC
2	Lig-T2	pho ACC TGT GTA GGT CAA CCA CGT TCC CGA AGG TGT
3	Lig-T3	pho GAC TTC CAT GCC AAT GCG CGA CAT TCC GAA GAA
4	Lig-T4	pho CGC TGA AGC GCT GGG GGC AAA TTG TGC AAT TTG
5	Lig-T5	pho CGG CCA ATG TTT GTA ATC AGT TCC TTG TCT
6	Lig-T6	pho GAT CGG TAG TTC CTG GTC CCC AAA ATT TCC TTG GGT TTG
7	Lig-T7	pho TTC TGG ACC ACG TCT GCC GAA AGC TTG TGT T
8	Lig-T3 tail 1mm	pho GAC TTC CAT GCC AAT GCG CGA CAT TCC GAA TAA
9	Lig-T4 mid 1mm	pho CGC TGA AGC GCT GCG GGC AAA TTG TGC AAT TTG
10	Lig-T4 2mm	pho CGT TGA AGC GCT GGG AGC AAA TTG TGC AAT TTG
11	Target RNA (~220 mers)	aacacaag ctttcggcag acgtggtcca gaacaaaccc aaggaaattt tggggaccag gaactaatca gacaaggaac tgattacaaa cattggccgc aaattgcaca atttgccccc agcgcttcag cgttcttcgg aatgtcgcgc attggcatgg aagtcacacc ttcgggaacg tggttgacct acacaggtgc catcaaattg gatgacaaag atccaaattt c
12	Lig-RPA fwd pri	AAC ACA AGC TTT CGG CAG ACG TGG TCC AGA ACA AAC
13	Lig-RPA rev pri /RT primer	GAA ATT TGG ATC TTT GTC ATC CAA TTT GAT GGC AC
14	Lig-RPA rev pri /RT primer-1 mm	GAA ATT TGG ATC TTT GTC ATC CAA TTT GAT GGC AG
15	Lig-RPA rev pri /RT primer-2 mm	GAA ATT TGG ATC TTT GTC ATC CAA TTT GAT GGG AG
16	Lig-RPA rev pri /RT primer-3 mm	GAA ATT TGG ATC TTT GTC ATC CAA TTT GCT GCC AG

그 중 LT2(Lig-T2)에서 LT7(Lig-T7) 템플릿은 결찰(ligation)을 위해 5'-말단에 monophosphate 단위를 나타내었다, 5'-말단에 포스페이트 변형을 포함하는 주형에 완벽하게 일치하는 표적 RNA의 존재하에 SplintR ligase에 의한 결찰(ligation)이 일어나도록 하였고, 결찰(ligation) 반응 동안 PPi는 부산물로 방출되지 않았다. RNA 표적 결찰(ligation)은 RT 동안의 PPi가 방출될 기회없이 발생하였다. RPA를 증폭시키는 과정을 통하여 두 개의 프라이머(Lig-RPA fwd pri, Lig-RPA rev pri)를 설계하였다. 선택성을 조사하기 위해 1개 및 2개의 염기가 일치 하지 않는 템플릿 Lig-T3 tail 1 mm, Lig-T4 mid 1 mm, Lig-T4 2 mm)을 설계했습니다. 일치하지 않는 염기는 표 1에서 진하게 표기하였다.

SARS-CoV-2에서 "N 유전자"를 표적으로 하는 220bp 길이의 cDNA를 7개의 주형(각각 약 32bp)을 연결하여 준비한 다음 RPA 반응을 분석하였다. 결찰(ligation) 반응을 위한 바이러스 RNA의 특정 영역에 결합하기 위한 템플릿(주형)을 설계하는 것은 선택적 검출을 위한 중요한 단계이고, 각 주형이 SARS-CoV-2의 표적 "N gene"에 결합했을 때만 full-length cDNA cDNA를 형성하게된다. 본 발명에서는 스파이크 SARS-CoV-2 전체 게놈 RNA의 100개 카피를 사용하고 7개의 템플릿과 SplintR ligase를 사용하여 cDNA 형성을 확인하기 위하여 PAGE를 통하여 분석하였다(도 2A). RPA 후 220mer cDNA의 형성을 확인하였고, SARS-CoV-2(레인 1)에 "N gene"를 추가했을 때 대략 220mer 위치에서 특정 밴드를 확인하였다. 표적이 없는 경우 해당 밴드가 관찰되지 않아 결찰(ligation)이 발생하지 않았으며(레인 2) Lig-RPA 시스템이 작동함을 확인하였다.

<2-2> Lig-RPA 시스템과 결합된 PK-probe

PK-probe는 티에닐-히드라존 로다민(thienyl-hydrazone rhodamine) 유도체의 Cu²⁺복합체이다. Cu²⁺-복합체 프로브가 DNA/RNA 증폭의 비색 검출에 사용되었으나, PPi에 선택적이어서 DTT와 교차 반응을 나타내었다. 또 다른 유형의 AuNCs-Cu²⁺시스템은 인간의 소변에서 PPi를 검출하는데 사용됨에도 불구하고 PK-probe는 dNTPs(deoxynucleotide triphosphates), DTT, cysteine이 있어도, PPi에 대해 높은 선택성을 나타내는 프로브이다. PK-probe는 Cu²⁺ 이온과 착화된 고리-오픈에 의하여 로다민 물질을 핑크색으로 나타내는 프로브이고, 이러한 프로브가 PPi와 접촉하면 해당 이온은 이전에 로다민 엔티티에 배위된 Cu²⁺이온과 복합체를 형성하게 된다. PK-probe가 Cu²⁺ 이온을 방출한 후 자동적으로 로다민 고리가 닫아지면서 분홍색이 사라지게된다(도 2B). DTT가 Cu²⁺ 착물 형성에 있어 좋은 경쟁자임에도 불구하고, PK-probe는 Cu²⁺ 이온을 PPi에 선택적으로 방출하여 PPi의 존재하에서 575 nm에서의 흡광도 감소된다. PPi를 위한 선택적인 비색 센서는 다른 모든 생체 분자 및 완충제 성분, 특히 다량의 DTT 및 인간 혈청에 대한 저항성이 높은 것을 확인하였다. PK-probe의 작동 메커니즘을 기반으로 PK-probe와 Lig-RPA 시스템의 조합을 사용하여 SARS-CoV-2를 감지할 수 있는지 확인하였다. PK-probe/Lig-RPA 시스템의 유용성을 조사하기 위해 음성 조건(SARS-CoV-2에서 표적 "N gene"가 없는 경우)과 양성 조건(표적 "N gene"가 있는 경우)을 테스트하였다. SARS-CoV-2 및 다양한 PK-probe 농도에서의 반응을 분석하였다. 도 2C에서는 양성과 음성 사이의 현저한 색상 변화가 육안으로 볼 수 있음을 확인하였다. 정성적 대조에 따른 흡광도 판독값에 따르면 575nm의 파장에서 측정된 값에도 큰 차이를 나타냄을 확인하였다(도 2D).

<2-3> 현장 진단 검사(POCT) 최적화 진단 프로세스

PK-probe/Lig-RPA 검출 분석을 최적화하는 동안 온도와 시간을 기반으로 시스템이 작동함을 확인하였다. 0분에서 1시간까지 PK-probe/Lig-RPA의 조합을 분석하였다.

그 결과, SplintR ligase에 의한 연결에는 10분이면 충분하다는 것을 입증되었으며, RPA는 DNA의 한개의 카피 수를 증폭하는 데 20분 미만이 소요됩니다. PK-probe/Lig-RPA 시스템은 이미 20분(Lig, 10분, RPA, 10분)의 총 진단 시간 내에 육안으로 구별이 가능한 색 변화를 확인하였고, 50분 후 거의 완벽하게 육안으로 구별이 가능하였다(도 3A 및 3B). 따라서 PK-probe/Lig-RPA 시스템으로 가시적인 색상 변화를 통하여 30분 이내에 SARS-CoV-2의 표적 "N gene"를 검출될 수 있음을 확인하였다.

또한, 현장 진단 검사(POCT)에 최적화된 온도를 확인하기 위하여, SplintR ligase는 37℃에서 최적화된 활성을 나타내는 것으로 보고된 반면 RPA의 경우 최적화된 활성은 39-42℃에서 발생하는 것으로 보고되고 있다. 그러나 효소는 16℃의 낮은 온도에서 활성화될 수 있으며 두 효소는 실온에서도 잘 기능할 수 있으므로 주변 조건/실온에서 감지가 가능하다면 현장 진단 검사(POCT)을 수행하는 것이 더 간단하고 실현가능성이 높으므로 20, 25, 30 및 37℃를 포함한 다양한 온도에서 Lig-RPA 분석을 테스트를 진행하였다.

그 결과, 본 발명의 시스템이 20-37℃ 범위에서 작동하였고, 20℃에서도 정성적 분석에 만족스러웠지만 효율성은 37℃에서 더 높았다(도 3C 및 3D).

<2-4> 감광도 분석

PK-probe/Lig-RPA 시스템을 사용할 때 감지 감도를 분석하기 위하여, LOD 계산을 위한 시뮬레이션 샘플을 제작하였다. 할당된 카피 번호(2 카피/μl)가 있는 스파이크 SARS-CoV-2-양성 RNA 샘플을 사용하고 민감도 연구를 위해 다양한 농도의 샘플을 준비하였고, 575 nm에서 흡광도로 감도를 측정하였다. 0 ~ 50개/μl = 0 ~ 50,000개/ml를 사용하여 감도 테스트를 수행하고, PAGE를 통하여 확인하였다.

그 결과, 다른 카피 번호는 특정 증폭 산물(ca.220mer) 표적 SARS-CoV-2 RNA의 1에서 50 카피 수를 사용할 때, 0 카피 경우는 이 위치에서는 밴드를 확인할 수 없었다(도 4A). 0-카피 반응은 모두 핑크색을 나타내는 반면, 타겟 카피 수를 증가시키면 PK-probe의 무색 특성이 더 많이 나타났다(도 4B).

또한, 각각의 특정 농도에서 흡광도의 평균 변화를 측정하였다. 도 4(C)의 삽입은 3σ 방법[LOD = 3 × (SD/S), 여기서 SD는 표준 편차이고 S는 플롯의 기울기]을 통해 LOD를 계산하면 데이터 값사이의 직선식을 나타내어 선형 관계를 확인하였다(도 4C). 계산된 LOD는 Pearson의 r 값이 0.99843인 표적의 1,160 copies/ml로 높은 감도를 나타내므로 본 발명의 PK-probe/Lig-RPA 시스템은 SARS-CoV-2의 바이러스 RNA 카피 수가 적은 경우에도 민감하게 작동하였다. 본 발명의 PK-probe/Lig-RPA 시스템에서는 LOD가 1,160 copies/ml로 Yang M, et al.과 Corman et al.에서 보고한 같이 RT-qPCR 방법과 유사하고, 하기 표 2에서 언급한 다른 방법의 비색 검출 방법에 비하여 매우 검출 감도가 매우 민감함을 확인하였다.

검출방법	LOD	참고문헌
RT-qPCR	1,040 copies/ml	V.M. Corman, O. Landt, M. Kaiser, R. Molenkamp, A. Meijer, D.K.W. Chu, T. Bleicker, S. Brunink, J. Schneider, M.L. Schmidt, D.G.J.C. Mulders, B. L. Haagmans, B. Van Der Veer, S. Van Den Brink, L. Wijsman, G. Goderski, J. L. Romette, J. Ellis, M. Zambon, M. Peiris, H. Goossens, C. Reusken, M.P. G. Koopmans, C. Drosten, Detection of 2019 novel Corona virus (2019-nCoV) by real-time RT-PCR, Euro Surveill. 25 (2020) 1,
dLig-LAMP (colorimetric)	12,280 copies/ml	M.H. Choi, J. Lee, Y.J. Seo, Dual-site ligation-assisted loop-mediated isothermal amplification (dLig-LAMP) for colorimetric and point-of-care determination of real ARS-CoV-2, Microchim. Acta 189 (2022)
RT-LAMP (colorimetric)	48,000 ~ 4,800 copies/ml	M.N. Aoki, B. de Oliveira Coelho, L.G.B. Goes, ´ P. Minoprio, E.L. Durigon, L. \. Morello, F.K. Marchini, I.N. Riediger, M. do Carmo Debur, H.I. Nakaya, L. Blanes, Colorimetric RT-LAMP SARS-CoV-2 diagnostic sensitivity relies on color interpretation and viral load, Sci. Rep. 11 (2021) 1?10
AuNP (colorimetric)	10,00,000~100,00,000 copies/ml	C. Rodriguez Diaz, N. Lafuente-Gomez, ´ C. Coutinho, D. Pardo, H. Alarcon-Iniesta, ´ M. Lopez-Valls, ´ R. Coloma, P. Milan-Rois, ´ M. Domenech, M. Abreu, R. Canton, ´ J. C. Galan, ´ R. Bocanegra, L.A. Campos, R. Miranda, M. Castellanos, A. ´ Somoza, Development of colorimetric sensors based on gold nanoparticles for SARS-CoV-2 RdRp, E and S genes detection, Talanta 243 (2022), 123393
PK-probe/Lig-RPA (colorimetric)	1,160 copies/ml	본 발명

<2-5> 선택성 분석

이론적으로 일반적인 RT-RPA 시스템은 완벽하게 일치하는 시퀀스를 1개 또는 2의 염기가 일치하지 않은 시퀀스와 구별할 수 없으며, 반응 프라이머가 RT 과정을 위한 표적 RNA에 결합할 때, 여러 개의 불일치 서열을 증폭하여 유전자를 증폭할 수 있기 때문에 위양성을 나타낼 수 있다. 반면에 본 발명의 Lig-RPA 시스템은 결찰 단계에서 불일치 지점을 식별할 수 있을 것으로 예상했기 때문에 모든 결찰 템플릿이 SARS-CoV-2의 바이러스 RNA와 일치할 때만 전장 cDNA를 형성하기 시작하고, SplintR ligase는 상보적인 cDNA 서열을 생성한다. 즉, 일치하는 표적 RNA 서열의 존재; 결찰 템플릿 중 하나가 일치하지 않으면 cDNA가 합성되지 않기 때문에 따본 발명의 Lig-RPA을 이용한 분석의 선택성이 일반 RT-RPA보다 우수할 것으로 예상하였다. Lig-RPA 검출 방법의 선택성을 결정하기 위해 결찰 템플릿 플레이트(LT3, tail region; LT4, head and mid region)에 단일, 이중 및 삼중 불일치를 확인하였다. PK-probe/Lig-RPA 시스템의 선택성을 평가하기 위해 PK-probe/RT-RPA 시스템의 선택도와 선택성을 비교하였다. Lig-RPA와 RT-RPA의 비교를 위해 PAGE를 사용하여 증폭된 산물을 PAGE로 확인하였다.

그 결과, SARS CoV-2의 표적 RNA와 함께 Lig-RPA를 사용하면 1-3개의 불일치에 따라 일치하지 않는 서로 다른 시퀀스 때문에 밴드 패턴이 다르게 나타났다(도 5A 및 5B). 대조적으로, RT-RPA 분석은 1~3개가 일치하지 않아도 거의 동일한 겔 밴드 패턴을 나타내어 RT-RPA 시스템이 유사한 서열에 대한 잘못된 결합을 구별할 수 없었다.

Lig-RPA를 사용하여 수행된 비색 테스트에서 다양한 불일치 시스템 간에 명확하게 구별 가능한 색상 변화가 나타난 반면에, RT-RPA 기반 비색 테스트는거의 동일한 색상 변화를 나타내어 위양성 결과의 가능성이 높았다(도 5C 및 5D). 따라서 PAGE 및 비색 테스트를 통하여 PK-probe/Lig-RPA 시스템이 표적 기반 검출에 대해 더 높은 선택성을 가짐을 확인하였다.

또한, 선택성을 더 연구하기 위해 PK-probe/Lig-RPA 시스템을 사용할 때 교차 반응이 발생했는지 여부를 조사하기 위해 다양한 종류의 박테리아 게놈을 사용하였다. 호흡기 상부에 존재하는 정상 세균총 또는 호흡기계 감염이 쉽게 일어나는 병원체 9가지의 게놈(S. aureus, S. epidermidis, E. faecalis, E. feacium, E. coli, K. pneumoniae, E. cloacae, P. aeruginosa 및 A. baumannii)을 이용하여 PK-probe/Lig-RPA 반응을 수행하였다. COVID-19 샘플은 일반적으로 입과 코에서 채취하기 때문에 박테리아 감염이 있는 경우 바이러스와 이러한 박테리아 중 일부가 존재할 수 있으며, 박테리아와 반응하는 모든 진단 시스템은 환자를 위양성으로 진단합니다. 따라서 실제 적용을 위해서는 선택적 탐지가 필수적이다.

그 결과, 9개의 박테리아는 PK-probe/Lig-RPA 시스템과 반응하지 않았으며, 증폭이 일어나지 않았기 때문에 흡광도 값은 거의 음수였고, PPi를 생성할 수 없었다(도 5E 및 도 6).

막대 다이어그램에 표시된 대로 비색 검출은 흡광도 변화와 일치하였고, 이 선택성 데이터를 기반으로 본 발명의 PK-probe/Lig-RPA 시스템은 PK-probe/RT-RPA 시스템보다 더 강한 선택성을 나타냄을 확인하였다.

<2-6> 재조합 SARS-CoV-2의 검증

스파이크 SARS Cov-2 RNA에는 인간 게놈 RNA도 포함되어 있으므로 재조합 SARS-CoV-2로 검증하였다.

구체적으로, 범용 수송 배지(T-SWAB TRANSPORT Universal Transport Medium, Noble Biosciences, Hwaseong, Korea)를 사용하여 비인두 샘플과 함께 비활성 재조합 SARS Cov-2 전체 게놈 물질(실제 바이러스 단백질 코트로 완전히 추출 가능)을 사용하였다. 바이러스 배양, 항원 테스트 및 PCR(추출에 의한)에 사용되었다. 샘플과 함께 작동하는 탐지 시스템이 있다면 해당 시스템은 실제 샘플에서도 작동을 해야한다. 현장 진단 검사(POCT)에 실제로 이용할 수 있음에 중점을 두고 25℃에서 10분 이내에 RNA를 추출하기 위해 1X 등온 증폭 버퍼로 6% 포름아미드 준비하였고, 재조합 SARS Cov-2 바이러스 실험은 상기 추출 완충액을 사용할 때 모든 온도(25℃, 37℃ 또는 65℃)에서 RNA 추출이 가능하다는 것을 보여주었다. PK-probe/Lig-RPA 시스템은 시뮬레이션된 재조합 SARS Cov-2 바이러스 실험에서 잘 작동됨을 확인하였으므로 실제 샘플에서도 현장 진단 검사가 가능함을 확인하였다(도 7).

서열목록 전자파일 첨부

Claims

폼마이드(Formamide)를 포함하는 RNA(RiboNucleic Acid) 추출 시약;
상기 추출된 RNA로부터 표적 RNA 바이러스 서열을 포함하는 cDNA(complementary Deoxyribo Nucleic Acid)를 결찰(Ligation)하는 효소;
상기 표적 RNA 바이러스 서열을 포함하는 cDNA를 증폭시키는 RPA(Recombinase Polymerase Amplification); 및
하기 화학식 1의 PK-probe(pyrophosphate-sensing probe)를 포함하는
표적 RNA 바이러스 검출용 조성물:
[화학식 1]
.
상기 제 1항의 조성물을 포함하는 표적 RNA 바이러스 검출용 키트.
생물학적 시료에서 폼마이드(Formamide)로 RNA(Ribo Nucleic Acid)를 추출하는 단계;
추출된 RNA로부터 결찰(Ligation)을 이용하여 표적 RNA 바이러스 서열을 포함하는 cDNA(complementary Deoxyribo Nucleic Acid)를 합성하는 단계;
RPA(Recombinase Polymerase Amplification)로 상기 cDNA를 증폭하는 단계;
상기 cDNA를 포함하는 시료에 PK-probe(pyrophosphate-sensing probe)를 첨가하는 단계 및
상기 cDNA를 포함하는 시료의 색이 분홍색에서 무색으로 변화할 경우 표적 RNA 바이러스 서열이 포함된 것으로 진단하는 단계;
를 포함하는 표적 RNA 바이러스 검출에 관한 정보를 제공하는 방법.
제 3항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 혈액, 객담, 세균, 정액, 세포 조직, 침, 머리카락 및 소변으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 시료인 것인 표적 RNA 바이러스 검출에 관한 정보를 제공하는 방법.
제 3항에 있어서, 상기 결찰(Ligation)은 핵산 분자를 결합하는 효소에 의해 이루어지는 것인 표적 RNA 바이러스 검출에 관한 정보를 제공하는 방법.
제 3항에 있어서, 상기 PK-probe는 하기 화학식 1의 화합물인 것인 표적 RNA 바이러스 검출에 관한 정보를 제공하는 방법:
[화학식 1]
.