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KR20240063188A - 생물학적 오염물질 검출용 조성물 및 방법 - Google Patents

생물학적 오염물질 검출용 조성물 및 방법 Download PDF

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Publication number
KR20240063188A
KR20240063188A KR1020247014130A KR20247014130A KR20240063188A KR 20240063188 A KR20240063188 A KR 20240063188A KR 1020247014130 A KR1020247014130 A KR 1020247014130A KR 20247014130 A KR20247014130 A KR 20247014130A KR 20240063188 A KR20240063188 A KR 20240063188A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
nucleic acid
seq
acid sequence
parvovirus
specific
Prior art date
Application number
KR1020247014130A
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English (en)
Inventor
세르지 몽푀호
셸던 밍크
폴 베시오
Original Assignee
리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Application filed by 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 filed Critical 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드
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Abstract

미생물 오염물질이 생물학적 치료제 생산 공정에 존재하는지 여부의 결정에 유용한 조성물 및 방법이 제공된다. 구체적으로는, 인공 양성 증폭 대조군 플라스미드 및 위양성 결과의 신속하고 실시간 검출을 가능하게 하는 고유 정량적 PCR 검출 프로브가 제공된다.

Description

생물학적 오염물질 검출용 조성물 및 방법{COMPOSITIONS AND METHODS FOR DETECTING A BIOLOGICAL CONTAMINANT}
관련 출원에 대한 교차-참조
본 출원은 35 USC §119(e) 하에 2015년 3월 27일에 출원된 미국 가특허 출원 번호 제62/139,321호의 우선권을 주장하며, 본 출원은 그 전문이 참조로 본원에 구체적으로 포함되어 있다.
본 발명의 분야
본 발명은 일반적으로 세포 배양을 통해 생물학적 분자를 제조하는 공정에 관한 것이다. 본 발명은, 배타적인 것은 아니지만, 더 구체적으로는, 세포 배양에서 생물학적 오염물질을 검출하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다.
생물약제, 특히 치료적 항체는 포유류 세포 배양에 의해 생산된다. 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포는 가장 일반적으로 사용되는 숙주 세포이다. 이러한 생산 시스템은 외래성 및 내인성 바이러스 감염에 취약하며, 이것은 생물약제에 대하여 잠재적인 안전성 문제를 제시한다. 그러므로 약물의 안전성을 증진시키기 위해서는 바이러스 클리어런스(clearance) 과정 및 바이러스 양 측정이 사용된다. 바이러스 양을 감소시키는데 이용된 단계는 나노여과, 열 또는 pH 유지에 의한 바이러스 불활성화, 및 크로마토그래피를 포함한다. 바이러스 양 및 바이러스 제거의 효율성은 시간 소모가 큰 감염성 검정이나 실시간 PCR 또는 정량적 폴리머라제 연쇄 반응 (Q-PCR)과 같은 급속 정량 검정에 의해 관찰될 수 있다.
Q-PCR은 신뢰할 수 있는 적절한 음성 및 양성 대조군을 필요로 한다. 적절한 핵산 추출을 제어하기 위해 핵산 추출 대조군이 테스트 샘플에 추가된다. 핵산 추출 대조군이 음성이거나 Q-PCR 동안 예상 회수 범위를 벗어난 경우, 샘플이 거부된다. 반대로, 핵산 추출 대조군이 양성이거나 Q-PCR 동안 예상 회수 범위 내에 있는 경우, 테스트 샘플로부터의 핵산 추출은 신뢰할 수 있는 것으로 간주된다. 무샘플 버퍼와 같은 음성 대조군이 보통 Q-PCR 검정에 포함된다. 음성 대조군에서 양의 신호의 존재는 Q-PCR 또는 핵산 추출 시약의 바이러스 물질로의 오염을 의미할 수도 있다.
양성 증폭 대조군이 또한 Q-PCR 바이러스 양 검정에 포함될 수도 있다. 이러한 양성 대조군은 진성 바이러스 오염물질을 증폭시키는 프라이머를 사용하여 증폭되는, 보존된 바이러스 핵산 서열을 포함할 수도 있다. Q-PCR의 양성 대조군 검출의 실패는 증폭 과정에서 바이러스 오염물질이 테스트 샘플에 존재하였는지를 검출하는데 실패하였음을 나타낼 수도 있다.
표적 오염물질을 모방한 양성 증폭 대조군의 사용은 자체적인 문제를 발생시킨다. 테스트 샘플이 미량의 양성 대조군으로 오염된 경우, Q-PCR의 정교한 민감도를 고려하면, 테스트 샘플은 위양성(false positive)을 나타낼 수도 있다. 위양성은 낮은 수준의 양성 증폭 대조군을 사용함으로써, 양성 대조군 작동을 위해 격리된 공간을 사용함으로써, dUTP를 함유한 PCR 생성물을 선택적으로 분해하기 위해 UNG/dUTP 시스템을 사용함으로써, 1회용 용기 및 대체 피펫을 사용함으로써, 그리고 작업 영역 및 장비를 철저히 청소함으로써 어느 정도 완화될 수 있다. 까다로운 상기 완화재(mitigator)의 사용에 관계없이, PCR 테스트 동안에는 위양성 결과가 발생한다.
생물약제학적 제조 단계에서는, 생물학적 오염물질에 대하여 위양성을 가질 위험을 무시할 수 없으며 값 비싼 시정 조치를 초래할 수도 있다. 특정 양성 PCR 결과가 진양성(true positive)인지 또는 양성 대조군의 교차오염으로 인한 위양성인지를 결정하기 위한 시스템 및 방법이 매우 필요하다. 본 출원인은 위양성 Q-PCR 신호의 실시간 결정을 허용하는 양성 대조군 조성물, 시스템 및 방법을 개발하였으며 이제 그것들을 개시한다.
본 출원인은 테스트 샘플의 표적 오염물질에 대한 양성 Q-PCR 신호가 진양성인지 또는 교차오염으로 인한 위양성인지를 식별하는 문제를 해결하였다. 본 출원인은 생물학적 오염물질 표적 서열 (즉, 양성 대조군 서열) 및 고유 인공 플라스미드-특이적 서열을 포함하는 양성 증폭 대조군 (PAC) 플라스미드를 생성하였다. 이 고유 인공 플라스미드-특이적 서열은 플라스미드가 샘플 내에 있을 때 검정의 당업자가 플라스미드를 특이적으로 식별할 수 있게 한다. 따라서, 양성 오염물질 신호가 검출되고 인공 플라스미드-특이적 서열이 존재하지 않다는 것이 결정될 때, 당업자는 결과가 진양성 결과임을 확신할 수 있다. 반대로, 위양성의 경우에, 고유 인공 플라스미드-서열의 존재는 당업자가 표면상 양성인 결과를 위양성으로서 신속하게 배제할 수 있게 한다.
일부 구체예에서, 양성 대조군 고유 인공 플라스미드-특이적 서열 ("고유 서열"; PACP 또는 양성 증폭 대조군 폴리뉴클레오타이드로도 공지되어 있음)은 Q-PCR 반응 혼합물에 포함되어 있는 형광 표지된 인공 올리고뉴클레오타이드 검출 프로브 ("고유 검출 프로브" 또는 "UDP")를 사용하여 검출된다. 고유 검출 프로브는 형광단에 공유 결합된 핵산 폴리머 및 소광제(quencher)를 포함한다. "고유" 핵산 폴리머는 PCR 동안에 고유 서열로 특이적으로 어닐링(anneal)되고 고유 서열의 앰플리콘 카피에 통합되도록 고안된다. "고유" 핵산 폴리머는 본 검정의 작동에 이용된 잡종화(hybridization) 조건 하에서 임의의 자연 발생 파르보바이러스(parvovirus)를 인식하거나 이것으로 어닐링되지 않도록 고안된다. 한 구체예에서, "고유" 핵산 폴리머는 17 내지 20개의 뉴클레오타이드를 포함하는데, 7 내지 10개 이하의 내부 연속 뉴클레오타이드 및 6개 이하의 연속 3-프라임 뉴클레오타이드는 임의의 파르보바이러스 서열과 동일하다. 한 구체예에서, "고유" 뉴클레오타이드 폴리머는 17 내지 20개의 뉴클레오타이드를 포함하는데, 7 내지 10개 이하의 연속 뉴클레오타이드 및 6개 이하의 연속 3-프라임 뉴클레오타이드는 서열 번호: 9 및 12-37에서 제시된 임의의 파르보바이러스 서열과 동일하다. 고유 검출 프로브의 핵산 폴리머가 앰플리콘 카피로 통합되지 않을 때, 소광제는 형광단 가까이에 남아있다. 형광단이 여기된 경우, 소광제는 방출된 광을 흡수하여 상기 광이 검출되는 것을 방지한다 (FRET 또는 접촉 소광(contact quenching)에 의해). 핵산 폴리머가 앰플리콘 카피로 통합될 때 (즉, 고유 서열이 샘플에 존재할 때), 형광단 및 소광제가 고유 검출 프로브로부터 방출되며 그러므로 공간적으로 분리된다. 이러한 경우에는, 형광단이 여기될 때, 소광제는 방출된 광을 효율적으로 소광시킬 수 없을 정도로 충분히 멀리 떨어져 있다. 그러므로 방출된 광이 검출될 수 있다. 따라서, 고유 서열이 샘플에 존재할 때, PCR이 진행됨에 따라 검출 가능한 방출 파장은 강도가 증가한다. 고유 서열이 없을 때에는, PCR이 진척됨에 따라 소광제가 효력을 발휘하여 방출 파장이 검출되지 않는다. 한 구체예에서, 형광단은 핵산 폴리머의 5-프라임 단부 또는 그 근처에 부착되고, 소광제는 3-프라임 단부 또는 그 근처에 부착된다. 대안의 구체예에서, 형광단은 핵산 폴리머의 3-프라임 단부 또는 그 근처에 부착되고, 소광제는 5-프라임 단부 또는 그 근처에 부착된다.
현재 공지되어 있거나 이후 발견된 임의의 형광단-소광제 쌍이 본 발명을 실행하는데 사용될 수도 있다. (예를 들어, S.A. Marras, "Selection of fluorophore and quencher pairs for fluorescent nucleic acid hybridization probes," Methods Mol. Biol. 2006; 335:3-16 참조). 일부 구체예에서, 형광단은 각각 495 nm, 538 nm, 또는 646 nm의 여기 파장 및 520 nm, 554 nm, 또는 669 nm의 방출 파장을 가진다. 일부 구체예에서, 소광제는 430 nm 내지 672 nm의 흡광 피크를 갖는 염료이다. 일부 구체예에서, 소광제는 DDQ-I, Dabcyl, Eclipse, Iowa Black FQ, BHQ-1, QSY-7, BHQ-2, DDQ-II, Iowa Black RQ, QSY-21, 및 DHQ-3으로 구성된 군으로부터 선택된다. 한 구체예에서, 형광단은 495 nm의 여기 파장 및 520 nm의 방출 파장을 가지며, 예를 들어, FAM이고 소광제는 BHQ-1이다. 한 구체예에서, 핵산 폴리머는 서열 번호:3 (5'-TGTCGATGGCGAATGGCTA-3')의 핵산 서열을 포함한다.
본 발명의 한 양태는, 상기 기술된 바와 같이, 핵산 폴리머 및 연결된 형광단 및 소광제를 함유하는 고유 검출 프로브 그 자체이다. 본 발명의 다른 양태는 생물학적 오염물질 표적 서열 및 고유 인공 플라스미드-특이적 서열을 함유하는 양성 증폭 대조군 (PAC) 플라스미드 그 자체, 및 세포 배양에서 표적 생물학적 오염물질의 존재를 평가하기 위한 양성 대조군으로서 상기 플라스미드의 사용을 포함한다. PAC 플라스미드는 표적 생물학적 오염물질 서열을 증폭시키도록 고안된 성공적인 PCR 증폭 반응의 제어에 사용된다. 예를 들어, 동일한 구성요소를 함유하고 테스트 샘플과 동일한 파라미터 하에서 실행되지만, 테스트 샘플 대신에 양성 대조군 플라스미드를 함유하는 별도의 병렬 PCR 반응이 실행된다. 양성 대조군 플라스미드-함유 샘플은 양성 "오염물질" 신호를 산출하지만, 테스트 샘플은 그렇지 않은 경우, 테스트 샘플에는 표적 생물학적 오염물질이 없는 것으로 결론 내릴 수도 있다. 일부 구체예에서, 테스트 샘플은 포유류 세포 배양, 예컨대 관심 치료 단백질을 생산하도록 설계된 CHO 세포를 함유하는 바이오리액터(bioreactor)에서 얻어진다.
한 구체예에서, PAC 플라스미드는 (a) 예를 들어, 파르보바이러스 핵산 서열 또는 또 다른 표적 오염물질의 서열과 같은 표적 증폭 폴리뉴클레오타이드 (TAP) 서열, 및 (b) 플라스미드 증폭 대조군 폴리뉴클레오타이드 (PACP) 서열을 함유한다. PACP 서열 (센스(sense) 또는 크릭(Crick) 가닥)은 고유 서열 프로브의 핵산 폴리머 (안티센스(antisense) 또는 왓슨(Watson) 가닥)에 상보적이다.
한 구체예에서, PAC 플라스미드는 테스트 샘플을 함유하는 Q-PCR 반응과 병행하여 별도의 Q-PCR 반응에서 전개된다. TAP 서열은 표적 생물학적 오염물질을 대표하도록 고안된다. 예를 들어, 테스트 샘플 Q-PCR 반응이 TAP 앰플리콘을 생산하는데 실패하고, 양성 대조군 (즉, PAC 플라스미드-함유 샘플) Q-PCR이 TAP 앰플리콘을 생산하는데 실패한 경우, Q-PCR 반응이 실패한 것으로 가정할 수도 있다. 한 구체예에서, 표적 생물학적 오염물질은 설치류 파르보바이러스이고 TAP 서열은 설치류 파르보바이러스 서열을 포함한다. 한 구체예에서, TAP 서열은 모든 파르보바이러스 NS1 서열 또는 그 일부를 포함하며, 이것은 여러 설치류 파르보바이러스 균주에 걸쳐 보존되어 있다. Cotmore, et al., "Replication Initiator Protein NS1 of the parvovirus Minute Virus of Mice Binds to Modular Divergent Sites Distributed throughout Duplex Viral DNA," J. Virol. 2007 Dec; 81(23):13015-13027 참조. 일부 구체예에서, 여러 설치류 파르보바이러스 균주들은 미세 마우스 프로토타입 균주 바이러스 (minute virus of mice prototype strain; MVMp), 미세 마우스 면역억제 균주 바이러스 (minute virus of mice immunosuppressive strain; MVMi), 미세 마우스 커터 균주 바이러스 (minute virus of mice Cutter strain; MVMc), 마우스 파르보바이러스 1b (MPV-1b), 마우스 파르보바이러스 1a (MPV-1a), 마우스 파르보바이러스 1c (MVP-1c), 햄스터 파르보바이러스 (HaPV), 툴란 파르보바이러스 (Toolan's parvovirus; H-1), 킬햄 래트 바이러스 (Kilham rat virus; KRV), 래트 파르보바이러스 1a (RPV-1a), 미세 래트 바이러스 (RMV), 및 래트 바이러스 L의 매사추세츠 대학 균주 (University of Massachusetts strain of rat virus L; RV-Umass)를 포함한다. O.-W. Merten, "Virus Contaminations of Cell Cultures - A Biotechnological View," Cytotechnology. 2002 July; 39(2):91-116 참조. 한 구체예에서, TAP 서열은 서열 번호:1, 서열 번호:2, 및 서열 번호:4의 보체의 핵산 서열을 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명은 PCR 칵테일 조성물 및 테스트 샘플에서 표적 오염물질을 검출하고 테스트 샘플의 PAC로의 오염으로 인한 위양성을 배제하기 위해 PCR 칵테일을 사용하는 방법에 관한 것이다.
한 구체예에서, PCR 칵테일은 그 중에서도 표적 오염물질 특이적 정방향 올리고뉴클레오타이드 프라이머, 표적 오염물질 특이적 올리고뉴클레오타이드 검출 프로브, 상기 기술된 고유 검출 프로브 (UDP)와 같은 인공 올리고뉴클레오타이드 검출 프로브, 및 표적 오염물질 특이적 역방향 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 함유한다. 표적 오염물질이 설치류 파르보바이러스인 구체예에서, PCR 칵테일은 그 중에서도 설치류 파르보바이러스 특이적 정방향 올리고뉴클레오타이드 프라이머, 설치류 파르보바이러스 특이적 올리고뉴클레오타이드 검출 프로브, 상기 기술된 고유 검출 프로브 (UDP)와 같은 인공 올리고뉴클레오타이드 검출 프로브, 및 설치류 파르보바이러스 특이적 역방향 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 함유한다. 각각의 검출 프로브 (즉, 표적 오염물질 특이적 올리고뉴클레오타이드 검출 프로브, 예컨대 설치류 파르보바이러스 특이적 올리고뉴클레오타이드 검출 프로브, 및 인공 올리고뉴클레오타이드 검출 프로브)는 한 단부 (5-프라임 또는 3-프라임)에서 형광단에 연결되고 다른 단부 (각각, 3-프라임 또는 5-프라임)에서 소광제에 연결된 핵산 서열을 함유한다.
본원에서, 설치류 파르보바이러스 특이적 정방향 올리고뉴클레오타이드 프라이머 및 설치류 파르보바이러스 특이적 올리고뉴클레오타이드 검출 프로브의 핵산 서열은 파르보바이러스의 안티센스 가닥에 잡종화된다. 설치류 파르보바이러스 특이적 역방향 올리고뉴클레오타이드 프라이머는 파르보바이러스의 센스 가닥에 잡종화된다. 한 구체예에서, 프라이머 및 파르보바이러스 특이적 올리고뉴클레오타이드 프로브가 잡종화되는 파르보바이러스 서열은 보존된 설치류 파르보바이러스 서열이다. 한 경우에, 보존된 파르보바이러스 서열은 예를 들어, 서열 번호:9에서 기술된 핵산 서열과 같은 파르보바이러스 NS1 서열이다. 보존된 서열을 사용함으로써, 단일 프로브는 설치류 파르보바이러스의 다수의 균주를 검출하는데 효과적일 것이다.
한 구체예에서, 인공 올리고뉴클레오타이드 검출 프로브는 파르보바이러스 핵산 또는 임의의 생물학적 오염물질 서열에 잡종화되지 않는다. 인공 올리고뉴클레오타이드 검출 프로브의 핵산은 합성된 것이며 어떠한 엄중도로도 임의의 생물학적 오염물질 핵산 서열에 잡종화되지 않을 것이다. 한 구체예에서, 인공 올리고뉴클레오타이드 검출 프로브의 핵산 ("고유" 핵산 폴리머 또는 고유 서열로도 공지되어 있음)은 대상 검정의 작동에 이용된 잡종화 조건 하에서 임의의 자연 발생 파르보바이러스를 인식하거나 이것으로 어닐링되지 않도록 고안된다. 한 구체예에서, "고유" 핵산 폴리머는 17 내지 20개의 뉴클레오타이드를 포함하는데, 7 내지 10개 이하의 내부 연속 뉴클레오타이드 및 6개 이하의 연속 3-프라임 뉴클레오타이드는 임의의 파르보바이러스 서열과 동일하다. 한 구체예에서, "고유" 뉴클레오타이드 폴리머는 17 내지 20개의 뉴클레오타이드를 포함하는데, 7 내지 10개의 연속 뉴클레오타이드 및 6개 이하의 연속 3-프라임 뉴클레오타이드는 서열 번호: 9 및 12-37에서 제시된 임의의 파르보바이러스 서열과 동일하다. 하지만, 인공 올리고뉴클레오타이드 검출 프로브의 핵산 (즉, 고유 서열)은 PAC 플라스미드의 PACP 서열에 잡종화된다. 따라서, 인공 올리고뉴클레오타이드 검출 프로브는 PAC 플라스미드를 검출하지만, 파르보바이러스 또는 다른 생물학적 오염물질 서열은 검출하지 않는다.
한 구체예에서, PCR 칵테일은 위양성 결과를 제공하는 PAC 플라스미드가 테스트 생물학적 샘플에 존재하는지를 결정하는데 사용될 수 있다. 본원에서, 테스트 샘플이 파르보바이러스 특이적 올리고뉴클레오타이드 프로브에 대해 양성 Q-PCR 신호, 및 인공 올리고뉴클레오타이드 검출 프로브에 대해 음성 Q-PCR 신호를 나타내는 경우, 테스트 샘플은 PAC 오염이 없는 것으로 추정된다 (즉, 진양성).
한 구체예에서, 표적 오염물질 특이적 정방향 올리고뉴클레오타이드 프라이머는 서열 번호:1의 서열을 포함하고; 표적 오염물질 특이적 올리고뉴클레오타이드 검출 프로브 핵산은 서열 번호:2의 서열을 포함하고; 인공 올리고뉴클레오타이드 검출 프로브 핵산 (즉, UDP)은 서열 번호:3의 서열을 포함하고; 표적 오염물질 특이적 역방향 올리고뉴클레오타이드 프라이머는 서열 번호:4의 서열을 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명은 테스트 샘플에서 생물학적 오염물질을 검출하기 위한 시스템 및 방법을 제공한다. 본원에서, 테스트 샘플은 예를 들어, 치료 단백질의 생산을 위한 산업 규모의 포유류 세포 배양과 같은 세포 배양이다. 본 발명의 실행에 유용한 포유류 세포는 CHO 세포, CHO-K1 세포, 및 EESYR 세포를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다 (미국 특허 번호 제7,771,997호 참조). 상기 시스템 및 방법은 - 상기 기술된 바와 같이 사용된 프라이머, 프로브, 칵테일 및 PAC 플라스미드에 더하여 - 핵산 추출 대조군 (NEC)의 사용을 포함한다. 한 구체예에서, NEC는 M13K07 파지이며, 이것은 핵산 추출 전 테스트 샘플에 포함되어 있다. 핵산 추출이 오염물질 DNA 또는 RNA을 검출할 목적에 적절한 경우, NEC 핵산 (예를 들어, M13K07 핵산)은 "첨가된(spiked)" 테스트 샘플에서 Q-PCR을 통해 검출된다. 특정 구체예에서, Q-PCR 반응 혼합물은 표적 오염물질 특이적 정방향 올리고뉴클레오타이드 프라이머, 표적 오염물질 특이적 올리고뉴클레오타이드 검출 프로브, 상기 기술된 고유 검출 프로브 (UDP)와 같은 인공 올리고뉴클레오타이드 검출 프로브, 표적 오염물질 특이적 역방향 올리고뉴클레오타이드 프라이머, NEC 특이적 정방향 올리고뉴클레오타이드 프라이머, NEC 특이적 올리고뉴클레오타이드 검출 프로브, 및 NEC 특이적 역방향 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 함유한다. 한 구체예에서, 테스트 샘플은 치료 단백질 생산 세포 배양으로부터 취해지며, 핵산 추출 및 차후 Q-PCR 분석 전에 NEC (예를 들어, M13K07 파지)가 첨가된다.
특정 구체예에서, 표적 오염물질은 설치류 파르보바이러스이고, 이러한 경우에 (1) 표적 오염물질 특이적 정방향 올리고뉴클레오타이드 프라이머는 설치류 파르보바이러스 특이적 정방향 올리고뉴클레오타이드 프라이머이며, 더 구체적으로는 서열 번호:1의 서열을 포함하고; (2) 표적 오염물질 특이적 올리고뉴클레오타이드 검출 프로브는 설치류 파르보바이러스 특이적 올리고뉴클레오타이드 검출 프로브이며, 더 구체적으로는 서열 번호:2의 핵산 서열을 포함하고; (3) 인공 올리고뉴클레오타이드 검출 프로브는 고유 검출 프로브 (UDP)이며, 더 구체적으로는 서열 번호:3의 핵산 서열을 포함하고; (4) 표적 오염물질 특이적 역방향 올리고뉴클레오타이드 프라이머는 설치류 파르보바이러스 특이적 역방향 올리고뉴클레오타이드 프라이머이며, 더 구체적으로는 서열 번호:4의 핵산 서열을 포함하고; (5) NEC 특이적 정방향 올리고뉴클레오타이드 프라이머는 M13 정방향 올리고뉴클레오타이드 프라이머이며, 더 구체적으로는 서열 번호:5의 핵산 서열을 포함하고; (6) NEC 특이적 올리고뉴클레오타이드 검출 프로브는 M13 검출 프로브이며, 더 구체적으로는 서열 번호:6의 핵산 서열을 포함하고; 및 (7) NEC 특이적 역방향 올리고뉴클레오타이드 프라이머는 M13 역방향 올리고뉴클레오타이드 프라이머이며, 더 구체적으로는 서열 번호:8의 핵산을 포함한다. 방법의 한 구체예에서, NEC Q-PCR 신호가 검출된 경우 (즉, 신호가 예상 회수 범위 내에 있는 경우), 테스트 샘플의 핵산 추출이 성공적인 것으로 가정할 수 있다. 다른 한편으로, NEC 신호가 검출되지 않은 경우 (즉, 신호가 예상 회수 범위 밖에 있는 경우), 테스트 샘플의 핵산 추출이 실패한 것으로 가정할 수 있으며, 임의의 음성 Q-PCR 표적 오염물질 신호는 효력이 없는 것으로 간주된다 (즉, 위음성(false negative)).
본 발명을 기술하기 전에, 본 발명이 특정 방법 및 기술된 실험 조건에 제한되는 것이 아니며, 이러한 방법 및 조건이 달라질 수도 있다는 것을 이해해야 한다. 또한 본원에서 사용된 용어는 단지 특정 구체예를 기술할 목적을 위한 것이며, 본 발명의 범위는 첨부된 청구범위에 의해서만 제한되기 때문에, 제한하려는 의도가 아니라는 것을 이해해야 한다.
달리 한정되지 않으면, 본원에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속한 업계의 당업자들이 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미를 갖는다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "약"은, 특정한 나열된 수치에 관하여 사용될 때, 나열된 값과 1% 이하만큼 다를 수도 있다는 것을 의미한다. 예를 들어, 본원에서 사용된 바와 같이, 표현 "약 100"은 99와 101 및 그 사이의 모든 값 (예를 들어, 99.1, 99.2, 99.3, 99.4, 등)을 포함한다.
본원에서 기술된 것들과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 재료들이 본 발명의 실행에 사용될 수도 있지만, 바람직한 방법 및 재료가 이제 기술된다. 본원에서 언급된 모든 간행물들은 그 전문이 참조로 포함된다. 다른 구체예들은 이어지는 상세한 설명의 검토로부터 명백해질 것이다.
본원에서 기술된 본 발명을 완전히 이해할 수 있도록, 하기 상세한 설명이 제시된다.
본 발명은 치료 단백질을 생산하는 임의의 세포 배양에서 임의의 생물학적 오염물질을 검출하기 위해 개선된 재료 및 방법에 관한 것이다. 구체적으로는, 본 발명은 위양성을 제거하기 위해 쉽게 검출되는 양성 증폭 대조군 요소 또는 단계를 포함하는 정량적 폴리머라제 연쇄 반응 (Q-PCR) 재료 및 방법에 관한 것이다.
PCR 및 정량적 PCR
본원에서 사용된 바와 같이, 구절 "폴리머라제 연쇄 반응" ("PCR")은 다회수 주기의 변성 (주형 DNA 가닥의 분리), 어닐링 (단일 가닥 올리고뉴클레오타이드의, 단일 가닥 주형 DNA 가닥으로의 잡종화), 및 DNA 합성 (DNA 폴리머라제는, 주형으로서 주형 DNA 가닥을 사용하여, 잡종화된 올리고뉴클레오타이드의 3-프라임 단부로부터 프라이밍된(primed) 새로운 DNA 가닥의 합성에 촉매작용한다)을 이용하여 핵산 (예를 들어, DNA)의 카피를 제조하는 방법을 의미한다. 증폭이 일어나기 위해서는, 적어도 두 개의 상이한 올리고뉴클레오타이드 프라이머 (요약해서 "프라이머"로서 공지되어 있음)가 PCR 반응에 사용된다. 일반적으로 정방향 프라이머라고 불리는 한 프라이머는 주형 DNA의 안티센스 가닥에 잡종화되어 새롭게 합성된 센스 가닥의 5-프라임 단부를 형성한다. 일반적으로 역방향 프라이머라고 불리는 다른 하나의 프라이머는 주형 DNA의 센스 가닥에 잡종화되어 새롭게 합성된 안티센스 가닥의 5-프라임 단부를 형성한다. 각 주기마다, 각각의 주형 가닥이 복제되어, "앰플리콘"으로도 공지되어 있는, 새로운 이중 가닥 DNA 분자를 형성한다. 따라서, 올리고뉴클레오타이드 프라이머, DNA 폴리머라제 (즉, Taq 폴리머라제 또는 다른 열안정한 DNA 폴리머라제; Innis et al., DNA sequencing with Thermus aquaticus DNA polymerase and direct sequencing of polymerase chain reaction-amplified DNA, 85(24) Proc Natl Acad Sci U S A. 9436-40 (1988) 참조), 및 뉴클레오타이드 트리포스페이트의 비제한적인 양으로는, DNA 분자 (주형 및 앰플리콘)의 개수가 각 주기마다 두 배가 된다. PCR은 미국 특허 번호 제4,683,202호 (1987년 7월 28일 등록)에 기술되어 있다. 또한 PCR Primer: A Laboratory Manual (Carl W. Dieffenbach & Gabriela S. Dveksler eds., 1995) 참조.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "주기"는 (1) "변성"이라고 불리는 DNA 가닥 융해, 이어서 (2) "어닐링"이라고 불리는 과정인, 염기쌍 형성 규칙에 따라 올리고뉴클레오타이드 프라이머의, 결과로 생긴 단일 가닥 DNA로의 잡종화, 및 (3) "증폭" 또는 "신장"이라고 불리는 과정인, 올리고뉴클레오타이드 프라이머의 3-프라임 단부에서 시작하여 5-프라임에서 3-프라임 방향으로 이동하는 새로운 DNA 가닥의 폴리머화의 단일 라운드를 의미한다. 일반적으로, 폴리머화는 Taq 폴리머라제와 같은 DNA 폴리머라제 효소를 사용하여 인접한 데옥시뉴클레오타이드 트리포스페이트 ("dNTP") 사이의 포스포디에스터 결합 형성에 촉매작용하며, 이것들은 염기쌍 형성 규칙에 따라 수소 결합에 의해 노출된 단일 가닥 주형 DNA를 따라 놓여져 있다. 변성, 어닐링, 및 증폭은 부분적으로 DNA 주형 및 올리고뉴클레오타이드 프라이머의 GC 함량, 및 복제되는 DNA 가닥의 길이에 기초한 특정 온도에서 수행된다. 변성 및 어닐링의 온도, 뿐만 아니라 반응 버퍼의 이온 강도는 잡종화의 엄중도 및 DNA 복제의 충실도를 제어한다.
"정량적 PCR" 또는 "qPCR" 또는 "Q-PCR" ("실시간 PCR"로도 공지되어 있음)은 PCR 순환 공정 동안에 앰플리콘 형성의 관찰을 가능하게 하는 PCR의 유형이다. Q-PCR은 샘플에서 특이적인 주형 DNA의 양을 정량하는데 사용될 수 있다. Q-PCR은 정방향 올리고뉴클레오타이드 프라이머 및 역방향 올리고뉴클레오타이드 프라이머에 더하여 반응 혼합물에 적어도 하나의 올리고뉴클레오타이드 검출 프로브를 포함한다. 검출 프로브는 정방향 프라이머 결합 부위 및 역방향 프라이머 결합 부위 사이 어딘가에서 표적 주형 DNA의 센스 또는 안티센스 가닥에 잡종화되는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드이다. 어닐링 단계 동안에, 올리고뉴클레오타이드 검출 프로브는 단일 가닥 주형으로 어닐링된다. 폴리머화가 일어남에 따라, 프로브는 DNA 폴리머라제의 5-프라임 뉴클레아제 활성에 의해 절단 및 분해된다. 따라서, 특이적 주형 서열의 증폭이 일어남에 따라, 검출 프로브는 기하급수적인 속도로 분해된다.
Q-PCR 올리고뉴클레오타이드 검출 프로브는 일반적으로 부착된 형광단 (리포터 형광 염료, 또는 단순하게 "리포터(reporter)"로도 공지되어 있음) 및 부착된 소광제로 구성된다. 대부분의 경우에, 형광단은 올리고뉴클레오타이드의 5-프라임 단부 또는 그 근처에 부착되고 소광제는 올리고뉴클레오타이드의 3-프라임 단부 또는 그 근처에 부착된다. 하지만, 임의의 작동 가능한 구조체가 본 발명을 실행하는데 사용될 수 있다. 올리고뉴클레오타이드 검출 프로브가 온전할 때, 형광단 및 소광제는 인접하며, 이로 인해 소광제가 여기된 형광단에 의해 방출된 광을 흡수하여 검출 가능한 형광단 방출이 크게 감소한다. 올리고뉴클레오타이드 검출 프로브가 절단 또는 분해될 때, 형광단 및 소광제는 방출되고 그 결과 공간적으로 분리된다. 소광제는 더 이상 형광단 방출을 소광시킬 정도로 근접하지 않다. 더 많은 특이적 앰플리콘이 형성되는 만큼, 더 많은 올리고뉴클레오타이드 검출 프로브가 절단되어, 더 많은 형광단 및 소광제가 방출되며, 이로 인해 더 많은 형광단/소광제 쌍이 분리되고, 형광성 방출 진폭이 증가한다. 다시 말해서, 형광단 방출 신호의 증가는 샘플 내 특이적 표적 DNA의 양과 연관성이 있다. Q-PCR의 검토를 위해, Ian M. Mackay et al., Survey and Summary: Real-Time PCR in Virology, 30(6) Nucleic Acids Research 1292-1305 (2002) 참조.
형광 소광은 리포터와 소광제의 직접적인 접촉에 의해 (정적 소광으로도 공지되어 있음) 또는 리포터와 소광제가 둘 다 서로의 포스터 반경(Forster radius) 내에 있을 때 리포터와 소광제 간의 형광 공명 에너지 전이 (FRET)에 의해 일어날 수 있다. 특이적 형광단은 광의 하나 이상의 특이적 파장 또는 최대 파장 범위 까지 여기될 수 있다. 이것은 여기 파장이라고 불린다. 형광단이 여기된 후, 그것은 바닥 상태로 되돌아가서 여기 파장보다 더 긴 파장에서 광을 방출한다. 이것은 방출 파장이라고 불린다. FRET 동안에, 형광단의 방출 스펙트럼과 일치하거나 중첩된 흡수 스펙트럼을 갖는 제2 형광단, 염료, 란탄 계열 분자, 등은 포스터 반경 내에서 여기된 형광단에 의해 방출된 광을 흡수하여 형광단 방출의 파장을 소광시키거나 감소시킨다. 접촉 소광 또는 정적 소광은 리포터 및 소광제가 형광단의 바닥 상태에서 3중 복합체를 형성할 때 일어난다. 이 3중 복합체는 무형광성이며, 즉, 본질적으로 여기될 수 없고 그러므로 예상 방출 파장에서 광을 방출하지 않는다.
정적 소광 및 FRET에 대한 검토를 위해서, Salvatore A. E. Marras et al., Efficiencies of Fluorescence Resonance Energy Transfer and Contact-Mediated Quenching in Oligonucleotide Probes, 30(21) Nucleic Acids Research e122, pp. 1-8 (2002) 참조. Marras 등은 또한 Q-PCR의 적용시 사용되는 리포터/소광제 쌍의 선택에 대해 논의한다.
핵산
용어 "폴리뉴클레오타이드", "올리고뉴클레오타이드", "프로브", "프라이머" 또는 "뉴클레오타이드 프라이머" 또는 "올리고뉴클레오타이드 프라이머", "주형" 또는 "주형 핵산" 또는 "주형 DNA"는 본원에서 분자생물학 업계의 당업자들에게 통상적인 의미에 따라 사용된다. 각각의 더 상세한 설명을 위해서는, 예를 들어, PCR Primer: A Laboratory Manual (Carl W. Dieffenbach & Gabriela S. Dveksler eds., 1995) 참조.
본원에서 사용된 바와 같이, "앰플리콘"은 PCR을 통해 주형 핵산 서열의 증폭으로부터 생성된 DNA 생성물을 말한다. PCR이 진행되고 주형이 증폭됨에 따라, 새롭게 형성된 DNA 앰플리콘은 후속 DNA 합성 라운드에 대한 주형의 역할을 한다.
세포 배양
본 발명은 세포 배양에서 생물학적 오염물질을 검출하기 위한 개선된 Q-PCR 방법에 관한 것이다. 세포 배양은 종종 치료적 용도의 복합 생물학적 분자, 예컨대 항체, 트랩(trap) 분자 및 Fc 융합 단백질을 생산하는데 사용된다. 이 배양에는 생물학적 오염물질이 없는 채로 유지되어야 한다. 오염물질의 검출은 특정 배치(batch)가 폐기되어야 하거나 또는 개선의 대상인지를 결정하는데 중요하다.
세포 배양은 배양 배지 및 보통은 단일 세포주로부터 유래된 세포를 포함한다. 본원에서, 세포주는 생체치료 단백질을 생산할 수 있는 세포를 포함한다. 단백질 생체치료제를 생산하는데 일상적으로 사용되는 세포주의 예는 그 중에서도 1차 세포, BSC 세포, HeLa 세포, HepG2 세포, LLC-MK 세포, CV-1 세포, COS 세포, VERO 세포, MDBK 세포, MDCK 세포, CRFK 세포, RAF 세포, RK 세포, TCMK-1 세포, LLCPK 세포, PK15 세포, LLC-RK 세포, MDOK 세포, BHK 세포, BHK-21 세포, CHO 세포, CHO-K1 세포, NS-1 세포, MRC-5 세포, WI-38 세포, 3T3 세포, 293 세포, Per.C6 세포 및 닭 배아 세포를 포함한다. 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포주 또는 여러 특이적인 CHO 세포 변종 중 하나 이상, 예컨대 CHO-K1 세포주는 대규모 단백질 생산에 최적화되어 있다. EESYR® 세포주가 관심 단백질의 향상된 생산에 최적화된, 특수화된 CHO 세포주이다. EESYR® 세포의 상세한 설명을 위해서는, 미국 특허 번호 제7,771,997호 (2010년 8월 10일 등록) 참조.
"세포 배양" 또는 "배양"은 다세포 유기체 또는 조직 외부에서 세포의 성장 및 증식을 의미한다. 포유류 세포에 적합한 배양 조건은 업계에 공지되어 있다. 예를 들어, Animal cell culture: A Practical Approach (D. Rickwood, ed., 1992) 참조. 포유류 세포는 현탁액에서 배양되거나 고체 기질에 부착될 수도 있다. 미소담체가 있거나 없고, 배치식, 유가식, 연속식, 반연속식, 또는 관류 방식으로 작동되는 유동층 바이오리액터, 중공 섬유 바이오리액터, 회전병, 진탕 플라스크, 또는 교반 탱크 바이오리액터가 포유류 세포 배양에 이용 가능하다. 배양 동안에 세포 배양 배지 또는 농축된 공급 배지가 연속적으로 또는 간격을 두고 첨가될 수도 있다 (즉, 배치식 공급). 예를 들어, 배양액은 하루 1회, 격일로, 3일마다 공급될 수도 있거나 직접적으로 또는 간접적으로 관찰되고 있는 특정 배지 성분의 농도가 원하는 범위 밖에 있을 때 공급될 수도 있다.
CHO 세포 또는 EESYR® 세포와 같은 동물 세포는 소규모 배양으로, 예컨대 약 25 ml의 배지가 들어있는 125 ml 용기, 약 50 내지 100 ml의 배지가 들어있는 250 ml 용기, 약 100 내지 200 ml의 배지가 들어있는 500 ml 용기에서 배양될 수도 있다. 대안으로, 배양은 약 300 내지 1000 ml의 배지가 들어있는 1000 ml 용기, 약 500 내지 3000 ml의 배지가 들어있는 3000 ml 용기, 약 2000 내지 8000 ml의 배지가 들어있는 8000 ml 용기, 및 약 4000 내지 15000 ml의 배지가 들어있는 15000 ml 용기와 같이 대규모일 수도 있다. 제조용 배양은 10,000 L 이상의 배지를 함유할 수 있다. 예컨대 단백질 치료제를 제조하기 위한 대규모 세포 배양은 전형적으로 세포가 원하는 단백질(들)을 생산하는 동안 수일 또는 수주 동안 유지된다. 이 기간 동안 배양 샘플이 제거되고 생물학적 오염물질의 존재에 대하여 테스트될 수도 있다.
치료 단백질의 생산
생물학적 오염에 대하여 관찰되는 세포 배양은 관심 단백질 또는 다른 생물학적 분자, 예컨대 치료적으로 유효한 항체 또는 다른 생물약제 물질을 생산하는데 사용될 수도 있다. 단백질 생성물 (관심 단백질)은 그 중에서도, 항체, 인간 항체, 인간화된 항체, 키메라 항체, 단클론성 항체, 다중특이적 항체, 이중특이적 항체, 항원 결합 항체 단편, 단일 사슬 항체, 디아바디, 트리아바디 또는 테트라바디, Fab 단편 또는 F(ab')2 단편, IgA 항체, IgD 항체, IgE 항체, IgM 항체, IgG 항체, IgG1 항체, IgG2 항체, IgG3 항체, 또는 IgG4 항체일 수 있다. 한 구체예에서, 항체는 IgG1 항체이다. 한 구체예에서, 항체는 IgG2 항체이다. 한 구체예에서, 항체는 IgG4 항체이다.
관심 단백질은 Fc 모이어티 및 또 다른 도메인을 함유하는 재조합 단백질 (예를 들어, Fc-융합 단백질)일 수 있다. Fc-융합 단백질은 Fc 모이어티에 커플링된 수용체의 하나 이상의 세포 외 도메인(들) 중 하나 이상을 함유하는 수용체 Fc-융합 단백질일 수 있다. 어떤 경우에는, Fc 모이어티는 힌지 영역에 이어서 IgG의 CH2 및 CH3 도메인을 포함한다. 어떤 경우에는, 수용체 Fc-융합 단백질은 단일 리간드 또는 다수의 리간드에 결합하는 두 개 이상의 별개의 수용체 사슬을 함유한다. 예를 들어, Fc-융합 단백질은 예를 들어, IL-1 트랩 (예를 들어, 릴로나셉트, hIgG1의 Fc 도메인에 융합된 Il-1R1 세포 외 영역에 융합된 IL-1RAcP 리간드-결합 영역을 함유함; 미국 특허 번호 제6,927,004호 참조), 또는 VEGF 트랩 (예를 들어, 애플리버셉트, Fc 도메인 of hIgG1의 Fc 도메인에 융합된 VEGF 수용체 Flk1의 Ig 도메인 3에 융합된 VEGF 수용체 Flt1의 Ig 도메인 2를 함유함; 미국 특허 번호 제7,087,411호 및 제7,279,159호 참조)과 같은 트랩이다.
본 발명은 단백질 생산을 위해 임의의 특정 유형의 세포 또는 세포주에 제한되지 않는다. 단백질 생산에 적합한 세포 유형의 예는 포유류 세포, 예컨대 CHO-유래 세포 유사 EESYR®, 곤충 세포, 조류(avian) 세포, 박테리아 세포, 및 효모 세포를 포함한다. 세포는 재조합 유전자 발현을 위한 벡터로 형질전환된 줄기 세포 또는 재조합 세포, 또는 바이러스 생성물을 생산하기 위해 바이러스로 감염된 세포일 수도 있다. 세포는 관심 단백질을 암호화하는 재조합 이종 기원 폴리뉴클레오타이드 구조를 함유할 수도 있다. 상기 구조는 에피솜 (예컨대 염색체 외 플라스미드 또는 단편)일 수도 있거나 또는 세포의 게놈으로 물리적으로 통합될 수도 있다. 세포는 또한 이종 기원 폴리펩타이드 구조 상에서 암호화된 상기 단백질을 갖지 않는 관심 단백질을 생산할 수도 있다. 다시 말해서, 항체를 생산하는 B-세포와 같은 세포는 관심 단백질을 자연적으로 암호화할 수도 있다. 관심 단백질을 발현하도록 세포 또는 세포주를 유전적으로 설계하는 방법 및 벡터는 당업자에게 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 다양한 기술들이 Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds. (Wiley & Sons, New York, 1988, 및 분기별 업데이트); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Laboratory Press, 1989); Kaufman, R. J., Large Scale Mammalian Cell Culture, 1990, pp. 15-69에 예시되어 있다. 배양에서 성장에 적합한 다양한 세포주는 American Type Culture Collection (Manassas, Va.) 및 상업적 공급업체에서 이용 가능하다.
세포는 또한 닭 배아 세포와 같은 1차 세포, 또는 1차 세포주일 수도 있다. 유용한 세포의 예는 BSC 세포, LLC-MK 세포, CV-1 세포, COS 세포, VERO 세포, MDBK 세포, MDCK 세포, CRFK 세포, RAF 세포, RK 세포, TCMK-1 세포, LLCPK 세포, PK15 세포, LLC-RK 세포, MDOK 세포, BHK-21 세포, 닭 배아 세포, NS-1 세포, MRC-5 세포, WI-38 세포, BHK 세포, 293 세포, Per.C6 세포 및 CHO 세포를 포함한다. 다양한 구체예에서, 세포주는 CHO-K1, CHO DUX B-11, CHO DG-44, Veggie-CHO, GS-CHO, S-CHO, CHO lec 돌연변이 라인, 또는 EESYR® 세포주와 같은 CHO 세포 유도체이다.
하나의 특정 시나리오에서, 세포는 이소성으로 (이종 기원으로) 단백질을 발현하는 EESYR® 세포와 같은 CHO 세포 유도체이다. 상기 단백질은 CH1, CH2, 또는 CH3 영역과 같은 면역글로불린 중쇄 영역을 포함한다. 한 구체예에서, 단백질은 인간 또는 설치류 면역글로불린 CH2 및 CH3 영역을 포함한다. 한 구체예에서, 단백질은 인간 또는 설치류 면역글로불린 CH1, CH2, 및 CH3 영역을 포함한다. 한 구체예에서, 단백질은 힌지 영역 및 CH1, CH2, 및 CH3 영역을 포함한다. 특정 구체예에서, 단백질은 면역글로불린 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 특정 구체예에서, 단백질은 면역글로불린 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 특정 구체예에서, 단백질은 면역글로불린 중쇄 가변 도메인 및 면역글로불린 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 특정 구체예에서, 단백질은 인간 항체, 설치류 항체, 또는 키메라 인간/설치류 항체 (예를 들어, 인간/마우스, 인간/래트, 또는 인간 햄스터)와 같은 항체이다.
세포 배양의 단백질 생산기는 개개의 플라스크 및 진탕 플라스크 또는 웨이브 백(wave bag)에서부터 1 리터 바이오리액터 및 대규모 산업용 바이오리액터까지 어떠한 규모의 배양으로도 실행될 있다. 대규모 공정은 약 100 리터 내지 20,000 리터 또는 그 이상의 부피로 행해질 수 있다. 단백질 생산을 제어하기 위해 여러 수단, 예컨대 온도 전이 또는 화학적 유도 중 하나 이상이 사용될 수도 있다. 세포의 성장기는 단백질이 발현 및/또는 분비되는 생산기보다 더 높은 온도에서 일어날 수도 있다. 예를 들어, 성장기는 약 35℃ 내지 38℃의 1차 온도에서 일어날 수도 있고, 약 29℃ 내지 37℃, 선택적으로 약 30℃ 내지 36℃ 또는 약 30℃ 내지 34℃의 2차 온도에서 일어날 수도 있다. 이에 더하여, 단백질 생산의 화학 유도물질, 예컨대 카페인, 부티레이트, 타목시펜, 에스트로겐, 테트라사이클린, 독시사이클린, 및 헥사메틸렌 비스아세트아미드 (HMBA)가 온도 전이와 동시에, 그 이전에, 또는 이후에 첨가될 수도 있다. 온도 전이 이후에 유도물질이 첨가되는 경우, 그것들은 온도 전이 후 1시간 내지 5일, 예컨대 온도 전이 후 1 내지 2일에 첨가될 수 있다. 생산 세포 배양은 케모스태트(chemostat)에서와 같이 (C. Altamirano et al., Biotechnol Prog. 2001 Nov-Dec; 17(6):1032-41 참조), 또는 유가식 (배치식) 공정에 따라 (Huang, 2010) 연속적 공급 배양 시스템으로서 실행될 수도 있다.
치료 단백질 생성물
본원에서 사용된 바와 같이 "펩타이드", "폴리펩타이드" 및 "단백질"은 전체에 걸쳐 교체 가능하게 사용되고 펩타이드 결합에 의해 서로 결합된 둘 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 분자를 말한다. 펩타이드, 폴리펩타이드 및 단백질은 또한 글리코실화, 지질 부착, 황산화, 글루탐산 잔기의 감마-카르복시화, 알킬화, 하이드록실화 및 ADP-리복실화와 같은 변형을 포함할 수도 있다. 펩타이드, 폴리펩타이드, 및 단백질은, 단백질-기반 약물을 포함하여, 과학적 또는 상업적으로 관심이 있을 수 있다. 펩타이드, 폴리펩타이드, 및 단백질은, 다른 것들 중에서도, 항체 및 키메라 또는 융합 단백질을 포함한다. 펩타이드, 폴리펩타이드, 및 단백질은 세포 배양 방법을 사용하여 재조합 동물 세포주에 의해 생산된다.
"항체"는 이황화 결합으로 서로 연결된 네 개의 폴리펩타이드 사슬, 두 개의 중쇄 (H) 및 두 개의 경쇄 (L)로 구성된 면역글로불린 분자를 말한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역 (HCVR 또는 VH) 및 중쇄 불변 영역을 갖는다. 중쇄 불변 영역은 세 개의 도메인, CH1, CH2 및 CH3을 함유한다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역 및 경쇄 불변 영역을 갖는다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인 (CL)으로 구성된다. VH 및 VL 영역은 프레임워크 영역 (FR)이라고 불리는 더 보존된 영역과 산재하는, 상보성 결정 영역 (CDR)이라고 불리는 초가변성의 영역으로 더 세분화될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 세 개의 CDR 및 네 개의 FR로 구성되며, 아미노-말단에서 카르복시-말단으로 다음 순서로 배치된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 용어 "항체"는 임의의 아이소타입 또는 하위분류의 글리코실화된 및 비-글리코실화된 면역글로불린 둘 다에 대한 지시대상을 포함한다. 용어 "항체"는 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 분리된 항체 분자, 예컨대 항체를 발현하도록 트랜스펙션된 숙주 세포로부터 분리된 항체를 포함한다. 용어 항체는 또한 하나 이상의 에피토프에 결합할 수 있는 헤테로테트라머 면역글로불린을 포함하는 이중특이적 항체를 포함한다. 이중특이적 항체는 일반적으로 US 특허 출원 공개 번호 제2010/0331527호에서 기술되어 있으며, 이것은 본원에 참조로 포함된다.
용어 항체의 "항원-결합 부분" (또는 "항체 단편")은 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유한 항체의 하나 이상의 단편을 말한다. 용어 항체의 "항원-결합 부분"에 포함되는 결합 단편의 예는 (i) Fab 단편, VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 구성된 1가 단편; (ii) F(ab')2 단편, 힌지 영역에서 이황화 브릿지에 의해 연결된 두 개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 구성된 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 분지의 VL 및 VH 도메인으로 구성된 Fv 단편, (v) VH 도메인으로 구성된 dAb 단편 (Ward et al. (1989) Nature 241:544-546), (vi) 단리된 CDR, 및 (vii) VL 및 VH 영역이 쌍을 이루어 1가 분자를 형성하는 단일 단백질 사슬을 형성하도록 합성 링커에 의해 결합된 Fv 단편의 두 개의 도메인, VL 및 VH로 구성된 scFv를 포함한다. 다른 형태의 단일 사슬 항체, 예컨대 디아바디가 또한 용어 "항체" 하에 포함된다 (예를 들어, Holliger et al. (1993) PNAS USA 90:6444-6448; Poljak et al. (1994) Structure 2:1121-1123 참조).
항체 또는 이것의 항원-결합 부분은 더 큰 면역접착 분자의 일부일 수도 있으며, 하나 이상의 다른 단백질 또는 펩타이드와 항체 또는 항체 일부의 공유 또는 비공유 회합에 의해 형성된다. 이러한 면역접착 분자의 예는 테트라머 scFv 분자를 제조하기 위해 스트렙타비딘 코어 영역의 사용 (Kipriyanov et al. (1995) Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101) 및 2가 및 비오티닐화된 scFv 분자를 제조하기 위해 시스테인 잔기, 마커 펩타이드 및 C-말단 폴리히스티딘 태그의 사용 (Kipriyanov et al. (1994) Mol. Immunol. 31:1047-1058)을 포함한다. 항체 일부, 예컨대 Fab 및 F(ab')2 단편은 통상적인 기술을 사용하여, 예컨대 전체 항체의 파파인 또는 펩신 분해에 의해 전체 항체로부터 제조될 수 있다. 더욱이, 항체, 항체 일부 및 면역접착 분자는 표준 재조합 DNA 기술을 사용하여 얻어질 수 있다 (Sambrook et al., 1989 참조).
용어 "인간 항체"는 인간 생식세포 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 불변 영역을 가진 항체를 포함하도록 의도된다. 본 발명의 인간 항체는, 예를 들어, CDR에서 및 특정 CDR3에서, 인간 생식세포 면역글로불린 서열에 의해 암호화되지 않는 아미노산 잔기 (예를 들어, 시험관 내 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이 유발(mutagenesis) 또는 생체 내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수도 있다. 하지만, 용어 "인간 항체"는, 본원에서 사용된 바와 같이, 또 다른 포유류 종, 예컨대 마우스의 생식세포로부터 유래된 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열로 이식된 항체를 포함하지 않는다.
용어 "재조합 인간 항체"는, 본원에서 사용된 바와 같이, 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 분리된 모든 인간 항체, 예컨대 숙주 세포로 트랜스펙션된 재조합 발현 벡터를 사용하여 발현된 항체, 재조합, 조합 인간 항체 라이브러리로부터 분리된 항체, 인간 면역글로불린 유전자에 대한 이식 유전자를 가진 동물 (예를 들어, 마우스)로부터 분리된 항체 (예를 들어, Taylor et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295 참조) 또는 인간 면역글로불린 유전자 서열의 다른 DNA 서열로의 스플라이싱을 수반하는 임의의 다른 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 분리된 항체를 포함하도록 의도된다. 이러한 재조합 인간 항체는 인간 생식세포 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 불변 영역을 가진다. 하지만, 특정 구체예에서, 이러한 재조합 인간 항체는 시험관 내 돌연변이 유발 (또는, 인간 Ig 서열에 대한 이식 유전자를 가진 동물이 사용될 때, 생체 내에서는 체세포 돌연변이 유발) 되고 따라서 재조합 항체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열은 인간 생식세포 VH 및 VL 서열로부터 유래되고 이것들에 관련된 것이지만, 생체 내에서는 인간 항체 생식세포 레퍼토리 내에 자연적으로 존재하지 않을 수도 있는 서열이다.
"Fc 융합 단백질"은 자연에서 함께 발견되지 않는 둘 이상의 단백질 중 일부 또는 전부를 포함하며, 그 중 하나는 면역글로불린 분자의 Fc 부분이다. 항체-유래 폴리펩타이드의 다양한 부분 (Fc 도메인 포함)에 융합된 특정 이종 기원 폴리펩타이드를 포함하는 융합 단백질의 제조는, 예를 들어, Ashkenazi et al., Proc. Natl. Acad. ScL USA 88: 10535, 1991; Byrn et al., Nature 344:677, 1990; 및 Hollenbaugh et al., "Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins", in Current Protocols in Immunology, Suppl. 4, pages 10.19.1 - 10.19.11, 1992에 의해 기술되었다. "수용체 Fc-융합 단백질"은 Fc 모이어티에 커플링된 수용체의 하나 이상의 세포 외 도메인(들)을 포함하며, 이것들은 일부 구체예에서는 면역글로불린의 힌지 영역에 이어서 CH2 및 CH3 도메인을 포함한다. 일부 구체예에서, Fc-융합 단백질은 하나 이상의 리간드(들)에 결합하는 둘 이상의 별개의 수용체 사슬을 함유한다. 예를 들어, Fc-융합 단백질은, 예를 들어, IL-1 트랩 (예를 들어, 릴로나셉트, hIgG1의 Fc에 융합된 IL-1R1 세포 외 영역에 융합된 IL-1RAcP 리간드 결합 영역을 함유함; 미국 특허 번호 제6,927,004호 참조), 또는 VEGF 트랩 (예를 들어, 애플리버셉트, 이것은 hIgG1의 Fc에 융합된 VEGF 수용체 Flk1의 Ig 도메인 3에 융합된 VEGF 수용체 Flt1의 Ig 도메인 2를 함유함; 미국 특허 번호 제7,087,411호 및 제7,279,159호 참조)과 같은 트랩이다.
생물학적 오염물질
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "생물학적 오염물질"은 임의의 원치 않거나, 바람직하지 않거나, 유해하거나 잠재적으로 유해한 생물학적 실체물을 의미한다. 상기 실체물은 그 중에서도 프리온 (광우병(bovine spongiform encephalopathy)/전파성 해면양뇌증(transmissible spongiform encephalopathy)의 병원(etiological cause)), 비리온, 바이러스, 마이코플라스마, 다른 박테리아, 오염성 후생동물 세포, DNA, RNA, 트랜스포손, 다른 전이 가능 요소, 효모, 다른 균류, 조류(algae), 원생생물, 및 다른 외래성 및 내인성 작용물을 포함한다. 설치류 세포 (CHO 세포 및 CHO 세포의 유도체 등)을 사용하는 생체치료제 생산 공정에 대하여 특별히 관심있는 것은 세포 또는 배지 또는 제조 원료와 관련된 외래성 바이러스이다. 세포 배양 대량 공정 재료 및 결과로 생긴 약품의 오염은 환자의 직접적인 위험, 뿐만 아니라 의약품의 공급을 방해하는 간접적인 위험을 제공한다.
CHO 세포 배양물을 감염시킬 수 있는 외래성 및/또는 내인성 작용물의 불완전 목록은 다음을 포함한다: 단일 가닥 (-) RNA 바이러스, 예컨대 캐시 밸리 바이러스(cache valley virus), 인플루엔자 A/B 바이러스, 파라인플루엔자 1/2/3, 유인원 바이러스 5, 볼거리 바이러스(mumps virus), 소 합포성 폐염 바이러스(bovine respiratory syncytial virus), 및 수포성 구내염 바이러스(vesicular stomatitis virus); 단일 가닥 (+) RNA 바이러스, 예컨대 소 코로나바이러스(bovine coronavirus), 베시바이러스(vesivirus) 2117, 뇌척수 심근염 바이러스(encephalomyocarditis virus), 콕사키 바이러스(coxsackie virus) B-3, 샘리키 삼림열 바이러스 바이러스(semliki forest virus), 및 신드비스 바이러스(sindbis virus); 이중 가닥 RNA 바이러스, 예컨대 청설 바이러스(bluetongue virus), 가축 유행성 출혈성 질환 바이러스(epizootic hemorrhagic disease virus), 및 레오바이러스(reovirus) 1/2/3; 단일 가닥 DNA 바이러스, 예컨대 돼지 써코바이러스(porcine circovirus) 1, 및 미세 마우스 바이러스 (마우스의 미세 바이러스로도 공지되어 있음)를 포함한 특히 문제가 되는 파르보바이러스; 및 이중 가닥 DNA 바이러스, 예컨대 아데노바이러스(adenovirus) 및 위광견병 바이러스(pseudorabies virus). 이 잠재적 외래성 작용물들 중에서, 네 개의 바이러스가 다양한 제조사들 전체에 걸쳐 CHO 세포 배양물의 대량 수확 샘플을 지배하고 있다. 상기 바이러스는 2형 레오바이러스, 캐시 밸리 바이러스, 가축 유행성 질환 출혈성 바이러스, 및 설치류 파르보바이러스 미세 마우스 바이러스이다. CHO 세포 배양물의 외래성 바이러스 오염의 상세한 검토를 위해서는 Andreas Berting et al., Virus Susceptibility of Chinese Hamster Ovary (CHO) Cells and Detection of Viral Contaminations by Adventitious Agent Testing, 106(4) Biotechnology and Bioengineering 598-607 (2010), 및 Andrew Kerr & Raymond Nims, Adventitious Viruses Detected in Biopharmaceutical Bulk Harvest Samples over a 10 Year Period, 64(5) PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 481-485 (2010)를 참조하면 된다.
외래성 작용물 테스트는 두 가지 일반적인 범주로 나누어진다. 첫 번째는 시험관 내 바이러스 검정을 사용하는 고전적인 바이러스학적 접근법이다. 본원에서, 테스트 샘플이 지표 세포주에 적용되고, 14 내지 28일 동안 세포를 인큐베이션 및 계대배양한 다음, 종말점, 예컨대 세포 변성 효과 또는 헤마글루틴화가 측정된다 (Berting, 2010). 두 번째는 외래성 또는 내인성 작용물과 회합된 핵산의 존재를 실시간으로 측정하는 PCR-기반 검정이다. 예를 들어, Zhan et al., Detection of Minute Virus of Mice Using Real Time Quantitative PCR in Assessment of Virus Clearance during the Purification of Mammalian Cell Substrate Derived Biotherapeutics, 30(4) Biologicals 259-270 (2002) 참조.
미세 마우스 바이러스 (MMV, 마우스의 미세 바이러스, 또는 MVM로도 공지되어 있음)는 생체치료제 제조에 특별한 문제가 있다. 미국 식품의약품국 (U.S. Food and Drug Administration; FDA) 및 유럽 의약청(European Medicines) 둘 다는 구체적으로 MVM에 대하여 테스트를 요구한다. 이 바이러스는 파르보비리대 과 (파르보바이러스)의 일원이고 마우스에서 일반적이다. 그것은 소변 및 대변으로 배설되고, 강력하며, 환경에서 지속적이다. 그것은 생체치료제 제조 공정에 쉽게 도입될 수 있다. Moody et al., Mouse Minute Virus (MMV) Contamination - A Case Study: Detection, Root Cause Determination, and Corrective Actions, 65(6) PDA Journal of Pharmaceutical Science and Technology 580-288 (2011) 참조. 다른 설치류 파르보바이러스는 세포 배양-기반 생물약제 생산에 부정적인 영향을 미칠 수도 있다. 프로토타입 MVM 균주 외에도, 상기 설치류 파르보바이러스는 그 중에서도 MVM 면역억제 균주 및 커터 균주, 마우스 파르보바이러스 1a (MPV-1a), MPV-1b, MPV-1c, 햄스터 파르보바이러스, 툴란 파르보바이러스 (파르보바이러스 H-1), 킬햄 래트 바이러스, 래트 파르보바이러스 1a, 미세 래트 바이러스, 및 래트 바이러스 L의 Umass 균주를 포함한다. S.F. Cotmore & P. Tattersal, The Autonomously Replicating Parvoviruses of Vertebrates, 33 Advances in Virus Research 91-174 (1987), 및 Jacoby et al., Rodent Parvovirus Infections, 46(4) Lab Anim Sci. 370-80 (1996) 참조.
이 파르보바이러스들은 NS-1 (NS1)이라고 불리는, 보존된 핵산 서열을 공유하는데, 이것은 바이러스 게놈의 증폭에 수반된 큰 비-구조 단백질을 암호화한다. MVM의 보존된 NS1 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호:9에서 도시되어 있다. 상기 서열의 뉴클레오타이드 875-956은 다수의 설치류 파르보바이러스 NS1 서열 전체에 걸쳐 적어도 97% 보존되며, 그러므로 PCR-기반 외래성 및 내인성 작용물 테스트에 대한 양호한 표적 서열의 역할을 한다. 설치류 파르보바이러스 (및 다른 외래성 및 내인성 작용물)에 대한 PCR-기반 테스트는 원료, 수확 전 배양 배지에서, 생체치료 분자의 대량 공정 정제를 따라 다양한 시점에, 및 제형화 및 포장 단계에서 수행될 수 있다. 오염물질의 검출은 오염된 재료의 처분, 원료의 대체, 및 시설의 제염과 같은 정화 단계를 필요로 할 수도 있다.
제조 동안에 시정 및 예방 조치 (corrective and preventative actions; CAPAs)를 가능하게 하는, 외래성 작용물, 내인성 작용물, 및 다른 생물학적 오염물질에 대한 테스트에 더하여, 특수 제조 및 대량 공정 단계 (즉, 단위 조작)가 바이러스 오염물질을 제거하거나, 감소시키거나 또는 불활성화시키는데 이용될 수도 있다. 화학적 불활성화, 바이러스 보존 여과, 및 크로마토그래피는 수확되거나 부분적으로 정제된 세포 배양액에서 헤르페스바이러스(herpesvirus), 레트로바이러스(retrovirus), 및 파르보바이러스를 감소시키는데 효과가 있는 것으로 나타났다. 가장 빈번하게 사용되는 화학적 불활성화 단계는 저 pH 처리이며, 당업자들은 이것이 바이러스 외피 단백질의 변성 때문인 것으로 믿고 있다. 단백질 A, 하이드록시아파타이트, 양이온 교환 및 음이온 교환 크로마토그래피 단계 모두 어느 정도로 바이러스를 제거하는 것으로 나타났다. 예를 들어, Miesegaes et al., Analysis of Viral Clearance Unit Operations for Monoclonal Antibodies, 106(2) Biotechnology and Bioengineering 238-246 (2010), 및 Liu et al., Recovery and Purification Process Development for Monoclonal Antibody production, 2(5) mAbs 480-499 (2010) 참조.
Q-PCR 테스트: 양성 및 음성 대조군
생물학적 오염물질에 대한 테스트는 정확성, 확실성, 및 신뢰성을 보장하기 위해 적절하게 제어되어야 한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "음성 대조군"은 대부분의 또는 모든 실험용 시약 및 조건을 포함하지만, 테스트 샘플은 포함하지 않는다. 테스트 샘플은 관심있는 생물학적 오염물질을 함유하지 않는 것으로 알려져 있는 버퍼 또는 모의(sham) 배양 배지로 대체될 수도 있다. 또한 본원에서 사용된 바와 같이, "음성 대조군"은 생물학적 오염물질에 대하여 음성의 결과를 생성해야 한다. 음성 대조군이 양성의 생물학적 오염물질 결과를 생성한 경우, 숙련된 당업자 또는 과학자는 병행 테스트 샘플로부터 생성된 양성의 결과가 테스트 샘플이 생물학적 오염물질을 함유하는지를 정확하게 반영하지 못할 수도 있다고 추정할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 이용된 하나 이상의 "양성 대조군"은 실험 조건이 생물학적 오염물질을 검출하기에 충분히 작동 가능한지를 평가한다. 양성 대조군은 각 단계가 작동 중임을 보장하고 어느 단계에서 공정이 고장났는지 결정하기 위해 실험 공정의 어느 단계에서도 사용될 수 있다.
일부 구체예에서, 양성 대조군은 핵산 추출 단계에서는 임의의 생물학적 오염물질 핵산의 의도된 추출이 생물학적 오염물질을 검출하기에 충분히 효율적인지를 평가하는데 이용된다. 이러한 양성 대조군은 "핵산 추출 대조군" 또는 "NEC"라고 불린다. 어떤 경우에는, NEC는 단백질-핵산 구조에 관하여 표적 생물학적 오염물질을 모방하도록 선택된다. NEC가 검출되기에 충분한 방식으로 추출된 경우, 당업자는 표적 생물학적 핵산이 또한 검출되기에 충분한 방식으로 추출되었다는 것을 추정할 수도 있다. 한 구체예에서, NEC는 단일 가닥 DNA 파지이지만, 파르보바이러스와 완전히 다른 것은 아니다.
특정 구체예에서, NEC는 약 6407개의 뉴클레오타이드의 원형 단일 가닥 DNA로 구성된 M13 박테리오파지이다. 더 구체적인 구체예에서는, NEC는 클로닝 및 다른 실험식 목적으로 사용되는 일반적으로 이용 가능한 분자생물학 시약인 M13K07 균주이다. van Wezenbeek et al., Nucleotide Sequence of the Filamentous Bacteriophage M13 DNA Genome: Comparison with Phage fd, 11(1-2) Gene 129-148 (1980) 참조. M13K07 파지의 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호:8에서 도시되어 있다. 특정 구체예에서는 M13 박테리오파지, 또는 M13K07 박테리오파지 균주가 NEC로 사용될 수 있지만, 본 발명에서는 NEC로서 상기 특정 시약을 사용하는 것에 제한되지 않는다. 당업자는 본 발명의 실행에 있어서 본 발명의 범위에서 벗어나지 않으면서 NEC로서 또 다른 시약을 대체할 수도 있다 (예를 들어, 역전사 효소-PCR 검정에 대하여 MS2 파지; Kothapalli et al., Problems associated with product enhancement reverse transcriptase assay using bacteriophage MS2 RNA as a template, 109(2) J. Virol. Methods 203-207 (2003) 참조).
본 발명의 일부 구체예에서, 양성 대조군은 PCR 증폭 단계에서는 PCR 시약 (프라이머 포함) 및 PCR 단계가 생물학적 오염물질 주형 핵산을 검출하기에 충분한지/충분했는지를 평가하는데 이용된다. 이러한 양성 대조군은 "플라스미드 증폭 대조군" 또는 "PAC"라고 불린다. 어떤 경우에는, PAC는 표적 생물학적 오염물질 핵산 서열과 일치하고, 테스트 샘플 정방향 및 역방향 올리고뉴클레오타이드 프라이머와 정확히 일치하도록 선택되거나 고안된다. 특정 구체예에서, PAC는 추가적으로 표적 생물학적 오염물질 핵산에서 발견되지 않는 "고유 서열"을 함유한다. 더 구체적인 구체예에서, 고유 서열은 자연에서 발견되지 않는다. "고유" 핵산 폴리머는 이 고유 서열을 특이적으로 어닐링하고 PCR 동안에 고유 서열의 앰플리콘 카피에 통합되도록 고안된다. "고유" 핵산 폴리머는 대상 검정의 작동에 이용된 잡종화 조건 하에서 임의의 자연 발생 파르보바이러스를 인식하거나 이것으로 어닐링되지 않도록 고안된다. 한 구체예에서, "고유" 핵산 폴리머는 17 내지 20개의 뉴클레오타이드를 포함하는데, 7 내지 10개 이하의 내부 연속 뉴클레오타이드 및 6개 이하의 연속 3-프라임 뉴클레오타이드는 임의의 파르보바이러스 서열과 동일하다. 한 구체예에서, "고유" 뉴클레오타이드 폴리머는 17 내지 20개의 뉴클레오타이드를 포함하는데, 7 내지 10개 이하의 연속 뉴클레오타이드 및 6개 이하의 연속 3-프라임 뉴클레오타이드는 서열 번호: 9 및 12-37에서 제시된 임의의 파르보바이러스 서열과 동일하다.
이 고유 서열은 숙련된 당업자가 진짜(bona fide) 표적 생물학적 오염물질 서열, 및 테스트 Q-PCR 반응의 PAC 플라스미드로의 교차오염을 구별할 수 있게 한다.
한 구체예에서, PAC (플라스미드로서, PAC 플라스미드로도 공지되어 있음)는 PCR 증폭을 제어하기 위해 동일하지만 별도의 Q-PCR 반응에 포함된다. PAC 반응은 테스트 샘플 Q-PCR 반응에서 실제의 표적 생물학적 오염물질 핵산의 증폭을 정확하게 반영하기 위해 사용된 것과 정확히 같은 올리고뉴클레오타이드 프라이머 및 프로브를 사용한다. 테스트 샘플 Q-PCR 반응 및 별도의 PAC 플라스미드 Q-PCR 반응은 표적 검출 프로브 및 고유 서열 프로브를 포함한다. PAC 반응은, 적절하게 기능하는 경우, 양의 표적 신호 및 양의 고유 서열 신호를 생성할 것으로 예상된다. PAC 플라스미드-함유 반응에서 양의 표적 신호 및 양의 고유 서열 신호를 얻는다는 것은 테스트 샘플 Q-PCR 시약 및 조건이 표적 생물학적 오염물질 핵산이 존재할 때는 언제든지 테스트 샘플에서 양의 표적 신호를 생산하기 위해 충분히 작동 중임을 나타낸다.
그러므로, PAC는 적절한 PCR 증폭에 대한 대조군의 역할을 한다. 테스트 샘플에서 음의 표적 신호가 얻어지지만, PAC가 양의 표적 신호를 나타내는 경우, 당업자는 테스트 샘플에 검출 가능한 표적 오염물질 DNA가 존재하지 않는다는 것을 추정할 수 있다. 반대로, 테스트 샘플에서 양의 표적 서열 신호 및 양의 고유 서열 신호가 얻어지는 경우, 당업자는 PAC 플라스미드가 테스트 샘플을 교차오염시키며, 그러므로 양의 표적 서열 신호는 위양성일 수도 있다고 추정할 수 있다.
여러 구체예의 상세한 설명
일부 구체예에서, 폴리머라제 연쇄 반응, 더 구체적으로는, Q-PCR의 사용에 의한 생물학적 오염물질의 검출을 위해 개선된 양성 대조군 시스템 (즉, 조성물 및 방법)이 제공된다.
한 양태에서, 본 발명은 양성 증폭 대조군 플라스미드 (PAC 플라스미드)를 검출하기 위해 고유 서열 프로브 (USP)를 제공한다. USP는 고유 인공 플라스미드-특이적 서열 (고유 서열, 또는 PACP 고유 서열, 또는 UAPS로도 공지되어 있음), 형광단, 및 소광제에 잡종화할 수 있는 인공 뉴클레오타이드 서열을 함유한다. 특정 구체예에서, UAPS에 잡종화할 수 있는 인공 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호:3의 핵산 서열 (5'-TGTCGATGGCGAATGGCTA-3')을 포함하며, 이것은 UAPS 센스 가닥 서열 (예를 들어, 즉, 서열 번호:10 - 5'-TAGCCATTCGCC ATCGACA-3')에 대하여 안티센스이다.
상기 기술된 바와 같이, Q-PCR 검출 프로브는 형광단 및 소광제를 함유한다. 소광은 형광단/소광제 쌍에 따라 접촉 소광 또는 FRET에 의한 것일 수도 있다. 본원에서, 형광단 및 소광제는 USP 올리고뉴클레오타이드에 공유 결합에 의해 부착된다. 한 구체예에서, 형광단은 495 nm 내지 680 nm의 여기 파장 및 515 nm 내지 710 nm의 방출 파장을 가진다. 일부 구체예에서, 형광단은 각각 495 nm, 538 nm, 또는 646 nm의 여기 파장 및 520 nm, 554 nm, 또는 669 nm의 방출 파장을 가진다. 일부 구체예에서, 소광제는 430 nm 내지 672 nm의 흡광 피크를 갖는 염료이다. 유용한 소광제의 예는 DDQ®-I, Dabcyl, Eclipse®, Iowa Black FQ®, BHQ®-1, QSY®-7, BHQ®-2, DDQ®-II, Iowa Black RQ®, QSY®-21, 및 DHQ®-3을 포함한다. 특정 구체예에서, 형광단은 약 495 nm의 최대 흡광도 및 약 520 nm의 최대 방출을 갖는 플루오레세인 아마다이트 (FAM; 미국 특허 번호 제5,583,236호에서 기술됨 (1996년 12월 10일 등록))이고, 소광제는 480 nm 내지 580 nm에서 흡광하는 Black Hole Quencher®-1 (BHQ®-1, Biosearch Technologies, Inc., Petaluma, CA)이다. BHQ®-1은 FRET 및 접촉 소광을 통해 소광시킨다. 항상은 아니지만, 일반적으로, 소광제는 올리고뉴클레오타이드의 3-프라임 하이드록실기로의 에테르 결합을 통해 부착되고, 형광단은 올리고뉴클레오타이드의 5-프라임 포스페이트기로의 에스터 결합을 통해 부착된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 세포 배양물, 원료, 부분적으로 정제된 및 정제된 생물학적 분자, 등에서 생물학적 오염물질의 검출에 유용한 다수의 올리고뉴클레오타이드 및 프로브를 포함하는 Q-PCR 시약의 혼합물을 제공한다. 한 구체예에서, 생물학적 오염물질은 DNA 바이러스, 더 구체적으로는 파르보바이러스, 및 더 구체적으로는, 설치류 파르보바이러스, 예컨대 MVM이다. 파르보바이러스는 표 1에서 나열된 임의의 서열과 적어도 88% 동일한 핵산 서열을 가진 NS1 유전자를 함유한다. 또 다른 구체예에서, 파르보바이러스는 서열 번호:9에서 제시된 서열과 적어도 97% 동일한 핵산 서열을 가진 NS1 유전자 (즉, 미세 마우스 바이러스 (MVM) NS1 유전자)를 함유한다. 또 다른 구체예에서, 파르보바이러스는 서열 번호:37의 공통 서열을 포함하는 NS1 유전자를 함유한다.
파르보비리대 NS1 서열
유전자명 서열 번호: 서열 번호:9와의 동일성 유전자명 서열 번호: 서열 번호:9와의 동일성
MVM 림프친화 변종 12 97% MVM, 균주 M 25 95%
마우스 파르보바이러스 4b 13 96% 파르보바이러스 LuIII 26 90%
마우스 파르보바이러스 4a 14 96% 래트 파르보바이러스 UT 27 89%
마우스 파르보바이러스 1b 15 96% 킬햄 래트 바이러스 28 89%
MVM 면역억제 변종 16 96% 미세 래트 바이러스 1c 29 89%
마우스 파르보바이러스 1 17 96% 미세 래트 바이러스 1b 30 89%
마우스 파르보바이러스 5a 18 96% 미세 래트 바이러스 1a 31 89%
마우스 파르보바이러스 UT 19 96% H-1 파르보바이러스 32 89%
마우스 파르보바이러스 1e 20 96% 미세 래트 바이러스 분리체 NTU1 33 89%
마우스 파르보바이러스 1c 21 95% 파르보바이러스 h-1 34 89%
햄스터 파르보바이러스 22 95% 미세 래트 바이러스 분리체 NTU2 35 88%
마우스 파르보바이러스 3 23 95% 미세 래트 바이러스 2a 36 88%
미세 마우스 바이러스 24 95% 공통 NS1 37 100%
특정 구체예에서, 혼합물은 (1) 설치류 파르보바이러스 특이적 정방향 올리고뉴클레오타이드 프라이머; (2) 설치류 파르보바이러스 특이적 올리고뉴클레오타이드 검출 프로브; (3) 인공 올리고뉴클레오타이드 검출 프로브, 예컨대 USP; 및 (4) 설치류 파르보바이러스 특이적 역방향 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 함유한다. 이러한 혼합물은 테스트 샘플 및 양성 대조군 샘플 둘 다에서 사용될 수도 있다. 더 구체적인 구체예에서, 올리고뉴클레오타이드 프라이머 및 파르보바이러스 특이적 올리고뉴클레오타이드 검출 프로브는 예를 들어, 서열 번호:9에서 제시된 NS1 서열과 같은 NS1 서열에 잡종화된다. 더 구체적인 구체예에서, (1) 정방향 프라이머는 서열 번호:1의 서열을 포함하고; (2) 파르보바이러스 특이적 올리고뉴클레오타이드 검출 프로브는 서열 번호:2의 서열을 포함하고; (3) 인공 프로브는 USP이고 서열 번호:3의 서열을 포함하고; (4) 역방향 프라이머는 서열 번호:4의 서열을 포함한다.
상기 기술된 바와 같이, USP는 상기 서열을 함유한 앰플리콘, 즉, PAC DNA가 Q-PCR이 진행됨에 따라 실시간으로 검출될 수 있도록 형광단 및 소광제를 함유한다. 유사한 방식으로, 파르보바이러스 특이적 검출 프로브는 형광단 및 소광제가 공유 결합에 의해 부착된 올리고뉴클레오타이드를 함유한다. 실제로는, 파르보바이러스 검출 프로브의 형광단 방출 파장은 파르보바이러스 양의 신호와, 테스트 샘플의 PAC 플라스미드 또는 다른 PACP (예를 들어, 앰플리콘을 오염시키는 PACP)로의 오염으로 인한 위양성을 구별할 수 있도록 USP의 방출 파장과는 달라야 한다. 따라서, USP 형광단이 FAM인 상기 구체예에서는, 파르보바이러스 검출 프로브 올리고뉴클레오타이드에 부착된 형광단은 약 520 nm 이외의 방출 파장을 갖고 있어야 한다. 특정 구체예에서, 설치류 파르보바이러스 특이적 올리고뉴클레오타이드 검출 프로브에 부착된 형광단은 538 nm에서 최대 흡광도 및 약 554 nm의 최대 방출을 갖는 VIC® Dye (Life Technologies, Inc., Carlsbad, CA)이다. 본원에서, 소광제는 FRET 소광제 또는 접촉 소광제일 수 있다. 한 구체예에서, 소광제는 마이너 그루브(minor groove) 결합 무형광 소광제 (MGBNFQ)이다 (Sylvain et al., Rapid Screening for HLA-B27 by a TaqMan-PCR Assay Using Sequence-Specific Primers and a Minor Groove Binder Probe, a Novel Type of TaqMan™ Probe, 287(1-2) Journal of Immunological Methods 179-186 (2004) 참조).
상기 기술된 프라이머와 프로브의 혼합물은 양성 증폭 대조군 구조를 테스트하고 진짜 파르보바이러스 오염물질과 구별하기 위해 사용된다. 일부 구체예에서, 프라이머의 혼합물은 또한 핵산 추출 대조군 (NEC)을 검출하기 위해 프라이머 및 프로브의 세트를 포함한다. 특정 구체예에서, NEC는 M13 박테리오파지, 예를 들어, M13K07 균주 (서열 번호:8)이다. 따라서, 일부 구체예에서, 파르보바이러스 프라이머 및 프로브 및 UPS 프로브에 더하여, 프라이머 및 프로브의 혼합물은 (5) M13 특이적 정방향 올리고뉴클레오타이드 프라이머; (6) M13 특이적 올리고뉴클레오타이드 검출 프로브; 및 (7) M13 특이적 역방향 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 함유한다.
일부 구체예에서, M13 프라이머 및 프로브는 서열 번호:8의 서열에 잡종화된다. 특정 구체예에서, M13 특이적 정방향 올리고뉴클레오타이드 프라이머는 서열 번호:5의 핵산 서열을 포함하고; M13 특이적 올리고뉴클레오타이드 검출 프로브는 서열 번호:6의 핵산 서열을 포함하고; M13 특이적 역방향 올리고뉴클레오타이드 프라이머는 서열 번호:7의 핵산 서열을 포함한다. 파르보바이러스 프로브 및 USP에 대한 비-중첩 형광단 방출 스펙트럼의 경우에서와 같이, NEC 프로브는 비-중첩 스펙트럼에서 광을 방출하는 형광단을 함유한다. 특정 구체예에서, M13 특이적 올리고뉴클레오타이드 검출 프로브에 부착된 형광단은 Cy5, 약 650 nm의 최대 흡광도 및 약 670 nm의 최대 방출을 갖는 시아닌 염료이다 (Southwick et al., Cyanine Dye Labeling Reagents: Carboxymethylindocyanine Succinimidyl Esters, 11 Cytometry, 418-430 (1990) 참조). 본원에서, 소광제는 FRET 또는 접촉 소광을 통해 작동할 수도 있다. 한 구체예에서, 소광제는 약 579 nm에서 최대로 흡수하고, 약 550 nm 내지 약 650 nm의 범위에서 소광시키는 Black Hole Quencher®-2 (BHQ®-2, Biosearch Technologies, Inc., Petaluma, CA)이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 생물학적 분자 생산 공정에서 생물학적 오염물질을 검출하는 방법을 제공한다. 생물학적 오염물질은 더 구체적으로는 파르보바이러스, 더 구체적으로는 설치류 파르보바이러스, 및 가장 구체적으로는 MVM NS1 유전자에 대하여 적어도 97% 동일성을 공유하는 상기 파르보바이러스를 포함한다. 일부 구체예에서, NS1 유전자는 서열 번호:9의 서열을 포함한다. 한 구체예에서, 생물학적 분자 생산 공정은 항체, 트랩 분자, 또는 다른 치료적 항체를 제조하기 위한 포유류 세포 배양 공정이다. 테스트 샘플은 세포 배양 (또는 대량의 성분)으로부터 취해지고 핵산에 대하여 추출된다. 어떤 경우에는, 테스트 샘플은 NEC, 예컨대 M13 (예를 들어, 서열 번호:8)과 함께 첨가되어 Q-PCR 이전에 핵산의 적절한 추출에 대한 대조군의 역할을 한다. 방법은 (1) (a) 테스트 샘플로부터 추출된 핵산 샘플, (b) 올리고뉴클레오타이드 프라이머 및 프로브 (상기 기술됨), 및 (c) DNA 폴리머라제, 바람직하게는 5' 엑소뉴클레아제 활성을 가진 열안정한 DNA 폴리머라제, 예컨대 Taq 폴리머라제를 조합하는 단계; (2) 상기 조합을 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)시키는 단계; 및 (3) 형광 방출 진폭을 통해 다양한 앰플리콘의 생산을 관찰하는 단계를 포함한다.
특이적 앰플리콘의 형성은 테스트 샘플에서 다양한 주형 핵산의 존재 및 양과 연관성이 있다. 특이적 앰플리콘은 (1) 예를 들어, 설치류 파르보바이러스 서열 (예를 들어, 상기 생물학적 오염물질 함유 NS1 서열)과 같은 표적 증폭 폴리뉴클레오타이드 (TAP), (2) 예를 들어, M13 (예를 들어, M13K07) 폴리뉴클레오타이드 (NECP)와 같은 핵산 추출 대조군 (NEC), 및 (3) 고유 인공 플라스미드-특이적 서열 (UAPS)과 같은 플라스미드 증폭 대조군 폴리뉴클레오타이드 (PACP)를 포함한다. TAP 및 NECP가 생산되고, PACP는 생산되지 않은 경우, 테스트 샘플은 생물학적 오염물질을 함유하지만 교차오염된 양성 증폭 대조군 플라스미드를 함유하지 않는 것으로 결론 내려질 수 있다. 하지만, 테스트 샘플 Q-PCR 반응에서 TAP 및 PACP (즉, UAP) 둘 다가 생산된 경우, 테스트 샘플이 PAC 플라스미드로 교차오염되고 TAP 결과는 위양성일 수도 있는 것으로 결론 내려질 수도 있다.
특정 구체예 - 여기에서 프라이머 및 프로브는 (1) 서열 번호:1의 서열을 포함하는 설치류 파르보바이러스 특이적 정방향 올리고뉴클레오타이드 프라이머, (2) 서열 번호:2의 서열을 포함하는 설치류 파르보바이러스 특이적 올리고뉴클레오타이드 검출 프로브, VIC 형광단, 및 MGBNFQ 소광제, (3) 인공 올리고뉴클레오타이드 검출 프로브, 에컨대 서열 번호:3의 서열을 포함하고 6-FAM 및 BHQ®-1로 표지된 USP, (4) 서열 번호:4의 서열을 포함하는 설치류 파르보바이러스 특이적 역방향 올리고뉴클레오타이드 프라이머, (5) 서열 번호:5의 서열을 포함하는 M13 특이적 정방향 올리고뉴클레오타이드 프라이머, (6) 서열 번호:6의 서열을 포함하고 Cy5 및 BHQ®-2로 표지된 M13 특이적 올리고뉴클레오타이드 검출 프로브, 및 (7) 서열 번호:7의 서열을 포함하는 M13 특이적 역방향 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 포함한다 - 에서, TAP의 생산은 약 533 nm 내지 약 580 nm에서 관찰되고, PACP의 생산은 약 465 nm 내지 약 510 nm에서 관찰되고, NECP의 생산은 약 618 nm 내지 약 660 nm에서 관찰된다.
한 구체예에서, 테스트 샘플은 생산 CHO 세포 배양, 예를 들어, 배양물의 수확 96 내지 72 시간 전에 관심 단백질을 암호화하는 핵산으로 형질전환된 EESYR® 세포의 생산 배양으로부터 취해진다. TAP 및 NECP가 테스트 샘플에서 검출되지만, PACP는 테스트 샘플에서 검출되지 않은 경우, 수확 전 48시간에 같은 생산 세포 배양으로부터 얻어진 2차 테스트 샘플에서 확인 테스트가 수행될 수도 있다. TAP 및 NECP가 2차 테스트 샘플에서 다시 검출되지만, PACP는 테스트 샘플에서 검출되지 않은 경우, 세포 배양은 오염된 것으로 간주되며 더 가공되지 않을 수도 있다. 대안으로, 2차 테스트가 수행되지 않을 수도 있지만, 세포 배양은 오염된 것으로 간주될 수도 있으며 배양은 더 가공되지 않는다.
한 구체예에서, 핵산은 생산 세포 배양으로부터 취해진 테스트 샘플로부터 추출된다. 본원에서, 1 밀리리터의 테스트 샘플이 세포 용해, 단백질 가수분해, 및 열 변성된 후 이어서, 샘플을 핵산 추출 대조군 (NEC) 샘플과 조합한 다음 샘플로부터 핵산을 추출한다. 한 구체예에서, 핵산은 자동화된 핵산 추출 시스템, 예컨대 QIAsymphony® 기기 (Qiagen, Inc., Valencia, CA)를 사용하여 테스트 샘플 (또는 NEC-첨가된 테스트 샘플)로부터 추출된다 (Lee et al., Comparative evaluation of the QIAGEN QIAsymphony® SP system and bioMerieux NucliSens easyMAG automated extraction platforms in a clinical virology laboratory, 52(4) J. Clin. Virol. 339-43 (2011) 참조).
한 구체예에서, 오염된 앰플리콘을 선택적으로 분해하기 위해서 PCR을 수행하기 전에 효소 우라실-N-글리코실라제 (UNG)가 Q-PCR 반응 혼합물에 첨가된다 (Taggart et al., Use of heat labile UNG in an RT-PCR assay for enterovirus detection, 105(1) J. Virol. Methods. 57-65 (2002) 참조). 반응 혼합물은 50℃에서 적어도 2 분, 더 구체적으로는 어떤 경우에는 2 분 또는 5 분 동안 인큐베이션된다.
특정 구체예에서, 선택적 UNG 처리 후 반응 혼합물은 95℃에서 2 분 동안 인큐베이션된 후 이어서, 8 주기의 (1) 95℃에서 10 초 동안 변성과 이어서, (2) 30초 동안 어닐링 및 신장시켜서 최초 어닐링 온도가 70℃가 되도록 한 다음, 어닐링 온도는 각 주기마다 1℃씩 감소하며, 이로써 8차 어닐링은 62℃이다. 초기 8 주기 후, (1) 95℃에서 10 초 동안 변성과 이어서, (2) 62℃에서 30초 동안 어닐링 및 신장의 단계를 포함한 40 주기의 DNA 증폭을 수행하였다. 특정 구체예에서, 변성 온도에서 어닐링 온도로의 온도 변화 속도는 초 당 약 4.4℃이고, 어닐링 온도에서 변성 온도로의 온도 변화 속도는 초 당 약 2.2℃이다.
일부 구체예에서, 생산 세포 배양 배지 또는 그 생성물에서 생물학적 오염물질을 검출하는 방법은 테스트 샘플 검정과는 별도로 실행된 외부 양성 증폭 대조군 (PAC) 검정을 수행하는 단계, 및 테스트 샘플 검정 및 PAC 검정과는 별도로 실행된 외부 음성 대조군 검정을 수행하는 단계를 포함한다. 음성 대조군 또는 양성 대조군이 실패한 경우, 테스트 샘플 검정으로부터 얻어진 결과는 거부된다.
한 구체예에서, 외부 양성 대조군은 (1) 그 중에서도 테스트 샘플 없이 (a) 특정 구체예에서는 서열 번호:11의 서열을 포함하는 양성 증폭 대조군 (PAC) 플라스미드, (b) 서열 번호:1의 서열을 포함하는 설치류 파르보바이러스 특이적 정방향 올리고뉴클레오타이드 프라이머, (c) VIC 및 MGBNFQ로 표지된 서열 번호:2의 서열을 포함하는 설치류 파르보바이러스 특이적 올리고뉴클레오타이드 검출 프로브, (d) 인공 올리고뉴클레오타이드 검출 프로브, 예컨대 6-FAM 및 BHQ®-1로 표지된 서열 번호:3의 서열을 포함하는 USP, (e) 서열 번호:4의 서열을 포함하는 설치류 파르보바이러스 특이적 역방향 올리고뉴클레오타이드 프라이머, 및 (f) DNA 폴리머라제, 바람직하게는 5' 엑소뉴클레아제 활성을 가진 열안정한 DNA 폴리머라제, 예컨대 Taq 폴리머라제를 조합하는 단계; (2) 양성 대조군 혼합물을 양성 대조군 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)시키는 단계; 및 (3) PCR 동안에 (a) 표적 증폭 폴리뉴클레오타이드 (TAP), (b) 핵산 추출 대조군 증폭 폴리뉴클레오타이드 (NECP), 및 (c) 플라스미드 증폭 대조군 폴리뉴클레오타이드 (PACP)의 생산을 관찰하는 단계를 포함한다. TAP의 생산은 약 533 nm 내지 약 580 nm에서 관찰되고, PACP의 생산은 약 465 nm 내지 약 510 nm에서 관찰되고, NECP의 생산은 약 618 nm 내지 약 660 nm에서 관찰된다.
양성 증폭 대조군 PCR 반응은 테스트 샘플 PCR 반응 (상기 기술되어 있음)과 동일하게 실행된다. 양성 대조군 반응에서 TAP 및 PACP가 생산되는 경우, PCR 증폭 과정이 적절하게 작동하고 있는 것으로 결론 내려질 수 있다. 양성 증폭 대조군 반응에서 TAP가 생산되지 않는 경우, 테스트 샘플의 임의의 음성 TAP는 실패한 PCR 반응으로서 치부될 수도 있다. 한 구체예에서, NEC (즉, 예를 들어, M13K07)는 양성 증폭 대조군에 포함된다. 적절하게 기능하는 대조군은 또한 양의 NECP 신호를 나타내야 한다 (표 1 참조).
한 구체예에서, 외부 음성 대조군은 (1) 그 중에서도 테스트 샘플이 없고 PAC 플라스미드도 없이 (a) 테스트 샘플 버퍼 시스템을 모방하는 버퍼일 수도 있는 블랭크(blank), 또는 단순하게는 물, (b) 서열 번호:1의 서열을 포함하는 설치류 파르보바이러스 특이적 정방향 올리고뉴클레오타이드 프라이머, (c) VIC 및 MGBNFQ로 표지된 서열 번호:2의 서열을 포함하는 설치류 파르보바이러스 특이적 올리고뉴클레오타이드 검출 프로브, (d) 인공 올리고뉴클레오타이드 검출 프로브, 예컨대 6-FAM 및 BHQ®-1로 표지된 서열 번호:3의 서열을 포함하는 USP, (e) 서열 번호:4의 서열을 포함하는 설치류 파르보바이러스 특이적 역방향 올리고뉴클레오타이드 프라이머, 및 (f) DNA 폴리머라제, 바람직하게는 5' 엑소뉴클레아제 활성을 가진 열안정한 DNA 폴리머라제, 예컨대 Taq 폴리머라제를 조합하는 단계; (2) 양성 대조군 혼합물을 양성 대조군 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)시키는 단계; 및 (3) PCR 동안에 (a) 표적 증폭 폴리뉴클레오타이드 (TAP), (b) 핵산 추출 대조군 증폭 폴리뉴클레오타이드 (NECP), 및 (c) 플라스미드 증폭 대조군 폴리뉴클레오타이드 (PACP)의 생산을 관찰하는 단계를 포함한다. TAP의 생산은 약 533 nm 내지 약 580 nm에서 관찰되고, PACP의 생산은 약 465 nm 내지 약 510 nm에서 관찰된다.
음성 대조군 PCR 반응은 테스트 샘플 PCR 반응 (상기 기술되어 있음)과 동일하게 실행된다. 음성 대조군 반응에서 TAP 및 PACP가 생산되는 경우, PCR 시약이 PAC 플라스미드로 오염된 것으로 결론 내려질 수 있다. 음성 대조군 반응에서 TAP가 생산되지만, PACP는 생산되지 않는 경우, PCR 시약은 파르보바이러스로 오염된 것으로 결론 내려질 수 있다. 두 경우 모두에서, 테스트 샘플 결과는 폐기된다. 하지만, 음성 대조군 반응에서 TAP 및 PACP 생산 둘 다가 음성인 경우, TAP 및 PACP 생산은 양성 증폭 대조군에서 양성이고, TAP (및 선택적으로 NECP) 생산은 양성이고, PACP 생산은 테스트 샘플 반응에서 음성이며, 그때 당업자는 테스트 샘플이 오염된 것으로 결론 내릴 수도 있다 (표 2 및 표 3 참조).
다른 양태에서, 본 발명은 양성 증폭 대조군 플라스미드 (PAC 플라스미드), 및 양성 대조군 플라스미드를 포함한 양성 대조군 시약의 혼합물을 제공한다. 한 구체예에서, PAC 플라스미드는 (1) 파르보바이러스 핵산 서열, (2) M13K07 핵산 서열, 및 (3) 플라스미드에 고유한 인공 핵산 서열 (UAPS 또는 "고유" 서열로도 공지되어 있음)을 포함한다. 특정 구체예에서, 파르보바이러스 핵산 서열은 서열 번호:1, 서열 번호:2, 및 서열 번호:4의 서열을 포함하고; M13K07 핵산 서열은 서열 번호:5, 서열 번호:6, 및 서열 번호:7의 서열을 포함하고, 고유 서열은 서열 번호:3의 안티센스 서열을 포함한다. 더 구체적인 구체예에서, PAC 플라스미드의 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호:11에서 제시된 서열로 구성된다.
일부 구체예에서, 양성 대조군 시약의 혼합물은 그 중에서도 상기 기술된 PAC 플라스미드, 설치류 파르보바이러스 특이적 정방향 올리고뉴클레오타이드 프라이머, 설치류 파르보바이러스 특이적 올리고뉴클레오타이드 검출 프로브, 인공 올리고뉴클레오타이드 검출 프로브 (즉, USP), 설치류 파르보바이러스 특이적 역방향 올리고뉴클레오타이드 프라이머, M13 특이적 정방향 올리고뉴클레오타이드 프라이머, M13 특이적 올리고뉴클레오타이드 검출 프로브, 및 M13 특이적 역방향 올리고뉴클레오타이드 프라이머, 및 버퍼를 포함한다. 혼합물은 선택적으로 dNTP 및 Taq 폴리머라제를 함유한다.
검정 대조군 및 테스트 세션 상태
검정 대조군 파르보바이러스 신호 (TAP) UAP 신호 (PACP) M13K07 신호 (NECP)
NEC 0 0 +
PAC + + +
음성 대조군 (버퍼 또는 물) 0 0 0
테스트 세션 상태 □ 유효 □ 무효
테스트 세션 상태
샘플 설명 파르보바이러스 UAP 신호 M13K07 테스트 샘플이 적합한가?
음성 테스트 샘플 0 0 + 예
위음성 테스트 샘플 0 0 0 아니오
양성 테스트 샘플 + 0 + 예
위양성 테스트 샘플 + + + 예
특정 구체예에서, 설치류 파르보바이러스 특이적 정방향 올리고뉴클레오타이드 프라이머는 서열 번호:1의 핵산 서열을 포함하고, 설치류 파르보바이러스 특이적 올리고뉴클레오타이드 검출 프로브는 VIC 형광단, 마이너 그루브 결합 소광제 (MGBNFQ), 및 서열 번호:2의 핵산 서열을 포함하고, USP는 VIC 형광단, 무형광 소광제 BHQ, 및 서열 번호:3의 핵산 서열을 포함하고, 설치류 파르보바이러스 특이적 역방향 올리고뉴클레오타이드 프라이머는 서열 번호:4의 핵산 서열을 포함하고, M13 특이적 정방향 올리고뉴클레오타이드 프라이머는 서열 번호:5의 핵산 서열을 포함하고, M13 특이적 올리고뉴클레오타이드 검출 프로브는 Cy5 형광단, BHQ-2 소광제, 서열 번호:6의 핵산 서열을 포함하고, M13 특이적 역방향 올리고뉴클레오타이드 프라이머는 서열 번호:7의 핵산 서열을 포함한다.
실시예 1: 올리고뉴클레오타이드 및 핵산 시약
설치류 파르보바이러스, M13K07, 및 인공 고유 올리고뉴클레오타이드 (올리고(Oligo))를 다양한 공급업체로부터 다양한 규모 및 다양한 포맷으로 얻었으며, 이것들은 표 4에 기술되어 있다. 모든 올리고는 공급업체로부터 수령시 3년의 유통기한이 할당되었다.
올리고뉴클레오타이드를 물에서 100 μM의 농도로 복원하여 마스터 스톡(master stock)을 생산하였다. qPCR 반응을 설정하기 전에 마스터 스톡을 더 희석하여 10X 스톡 용액을 생산하였다. 표 5는 qPCR 올리고뉴클레오타이드 (프라이머 및 프로브)의 10X 및 1X 농도를 도시한다.
파르보바이러스, M13, 및 고유 인공 서열 프라이머 및 프로브
올리고 유형 명칭 서열 (5'-3') 공급업체/규모/정제/포맷
정방향 올리고뉴클레오타이드 프라이머 MVM-FWD 5'/TGC ATA AAA GAG TAA CCT CAC CAG/3'
(서열 번호:1)		 IDT/1μM/HPLC/동결건조 또는 실험실 준비
Life Technologies/80KpMol/ HPLC/건조 또는 액체
서열 검출 프로브 MVM-MGB1 5'/VIC/ ACT GGA TGA TGA TGC AGC /MGBNFQ/3'
(서열 번호:2)		 Life Technologies/50K/HPLC/액체; 100 pmol/μL
서열 검출 프로브 파르보바이러스 Antisense Flag 5'/6-FAM/TGT CGA TGG CGA ATG GCT A /BHQ®-1/3'
(서열 번호:3)		 IDT/1μM/HPLC/동결건조 또는 실험실 준비
역방향 올리고뉴클레오타이드 프라이머 MVM-REV 5'/CCA CCT GGT TGA GCC ATC/3'
(서열 번호:4)		 IDT/1μM/HPLC/동결건조 또는 실험실 준비
Life Technologies/80K pMol/HPLC/건조 또는 액체
정방향 올리고뉴클레오타이드 프라이머 M13-FWD 5'/AAG CCT CAG CGA CCG AAT AT/3'
(서열 번호:5)		 IDT/1μM/HPLC/동결건조 또는 실험실 준비
서열 검출 프로브 M13-프로브 /5'/CY5/ TAT GCG TGG GCG ATG GTT GTT GTC A /BHQ2/3'
(서열 번호:6)		 IDT/1μM/HPLC/동결건조 또는 실험실 준비
역방향 올리고뉴클레오타이드 프라이머 M13-REV 5'/TCA GCT TGC TTT CGA GGT GAA T/3'
(서열 번호:7)		 IDT/1μM/HPLC/동결건조 또는 실험실 준비
올리고뉴클레오타이드 농도
올리고 명칭 PCR 반응 당 1X 올리고 농도 10X 농도 1 mL 10X 농도에 대한 올리고 마스터 스톡의 부피
MVM-fwd 0.15 μM 1.5 μM 15 μL
MVM-MGB1 0.15 μM 1.5 μM 15 μL
파르보바이러스 Antisense Flag 0.15 μM 1.5 μM 15 μL
MVM-rev 0.15 μM 1.5 μM 15 μL
M13-Fwd 0.1 μM 1.0 μM 10 μL
M13-Probe 0.1 μM 1.0 μM 10 μL
M13-Rev 0.1 μM 1.0 μM 10 μL
실시예 2: 양성 증폭 대조군 플라스미드
pUC57-Kan 플라스미드 (GeneWiz, Inc., South Plainfield, NJ)에서 parvo-M13 양성 증폭 대조군 (PAC) 플라스미드를 제조하였다. 이 PAC 플라스미드는 서열 번호:11에서 제시된 서열로 구성된다. 파르보바이러스-M13 PAC 플라스미드는 다음 식을 사용하여 계산된 2.1 x 108개의 카피/ng를 함유한다: [개수 = (양 * 개수/몰) / (bp * ng/g * g/bp 몰)]; 여기서 양 = ng이고, 개수/몰 = 6.022 x 1023이고, bp = 4372이고, ng/g = 1 x 109이고, g/bp 몰 = 650이다. 플라스미드의 농도를 계산하여 ng/μL로 표현하였고 102개의 카피/μL의 10X 농도로 단계 희석하였다. 102개의 카피/μL 희석액으로부터, 50 μL 앨리쿼트를 제조하여 2 mL 멸균 스크류 캡(screw cap) 튜브에 저장하였다. 모든 앨리쿼트를 ≤ 마이너스 60℃에 저장하였다.
실시예 3: m13k07 파지의 제조
100 pfu/μL의 역가로 M13K07을 얻기 위해 M13K07 파지의 10배 단계 희석을 희석제로서 MEM을 사용하여 수행하였다. 200 μL 앨리쿼트를 제조하여 ≤ 마이너스 60℃에 저장하였고 3년의 유통기한을 할당하였다.
실시예 4: Q-PCR 반응 시약 제조
설치류 파르보바이러스 실시간 PCR 검출 검정은 QIAsymphony® (Qiagen)를 사용한 자동화 DNA 정제에 이어서 LightCycler® 480 기기 (Roche Diagnostic) 상에서의 핵산 증폭 및 실시간 PCR 생성물 검출로 구성된 완전 자동화된 TaqMan® PCR 공정이다. PCR 억제자의 존재를 평가하기 위해 각각의 테스트 물품을 내부 대조군 (IC)으로서 파지 M13K07와 함께 자동적으로 첨가하였다. 설치류 파르보바이러스 프라이머 올리고뉴클레오타이드를 광범위 검출을 보장하기 위해 설치류 파르보바이러스 게놈 (NS-1 영역)의 고도로 보존된 영역 내에서 잡종화하도록 고안하였다. 검정을 복식 (즉 두 개의 표적) 포맷으로 실행하였고 설치류 파르보바이러스 및 M13K07 프라이머는 각각 대략 110 및 97 bp의 PCR 생성물을 생성하였다. PCR 생성물을 상이한 리포터 염료로 표지된 두 개의 프로브의 절단을 통해 실시간으로 검출하였다: 설치류 파르보바이러스에 대해서는 VIC 형광단 및 M13K07 파지에 대해서는 Cy5 형광단. 양성 증폭 대조군 (PAC) 플라스미드를 100개의 카피/uL의 농도로 사용하였다. 이 플라스미드는 형광단 FAM로 표지된 특이적 프로브를 사용하여 그것을 야생형 파르보바이러스와 구별하는 고유 (Flag) 서열 (USP)을 함유한다.
마스터 혼합물(Master Mix)을 2mL 튜브에 표 6에 따라 대조군을 포함한 테스트 물품의 개수의 적어도 3배의 충분한 양으로 모았다. 튜브를 2-8℃에 저장하였다. 2 mL 튜브에 물 50 uL를 첨가하여 음성 증폭 대조군 (NAC) 바이알을 제조하였다.
반응 혼합물
시약 스톡 농도 한 반응에 대한 시약 농도 한 반응에 대한 시약 스톡 농도
qPCR 2X Master Mix (TaqMan 또는 VeriQuest) 2X 1X 12.5 μL
Parvo-qPCR-Oligo Mix 10X 1X 2.5 μL
각 웰 당 혼합물 부피 15 μL
웰 당 샘플 부피 (추출된 DNA) 10 μL
실시예 5: 테스트 샘플 제조
모든 샘플이 외래성 작용물을 함유하거나 이것으로 오염될 가능성을 갖고 있기 때문에, 모든 샘플 사전 가공 단계에 대하여 무균 실험을 고수하였다. 깨끗한 생물학적 안전성 캐비닛에서 다음 단계들을 수행하였다. 항체 또는 트랩 분자를 생산하는 EESYR® 세포 배양으로부터 테스트 물품 (샘플)을 얻어서 냉동시키거나 바로 사용하였다.
PBS 1000 μL를 음성 추출 대조군 (NEC)의 역할을 하도록 적절한 2mL-튜브로 앨리쿼트하였다. 세포 배양 단계에 대한 종말점으로서 PCR을 사용할 때, 세포 배양의 양성 및 음성 대조군을 각각 양성 추출 대조군 및 음성 추출 대조군으로 사용하였다.
각 테스트 물품을 실온에서 해동시켰다. 60mL 백 내의 상기 샘플을 50mL-Falcon 튜브로 옮긴 다음 앨리쿼트하였다. 각각의 샘플 1000 μL를 사전 가공을 위해 피펫을 이용하여 2 mL-튜브로 옮겼다. 용해 버퍼 400 μL (ChargeSwitch® Lysis Buffer L13, Invitrogen, 제품 번호 CS11202 또는 동등물, Carlsbad, CA)를 각 튜브에 첨가하였고 적어도 10 초 동안 보텍싱하였다. 그 다음에 프로테이나제 K 20 μL (10 mM Tris-HCl, pH 7.5를 함유하고, 1 mM 칼슘 아세테이트가 들어있는 40% 글리세롤 (v/v) 내 ≥10 mg/mL, ≥800개 유닛/mL; SAFC, 제품 번호 P4850-5ML, Sigma Aldrich, St. Louis, MO)를 각 샘플에 첨가하고 적어도 10 초 동안 보텍싱하였다. 그 다음에 샘플을 65℃에서 30 분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 샘플을 보텍싱하였고 17,000 x g에서 10 분 동안 원심분리하였다.
동시에, 양성 증폭 대조군 (PAC; 2mL 튜브 내 102개의 카피/μL 플라스미드 최소 50uL) 및 M13K07 (102 PFU/mL) 내부 대조군 (IC; 최소 150 μL/12개의 샘플)을 해동시켰다.
실시예 6: 핵산 추출
내부 대조군 (IC)이 QIASymphony® Instrument (Qiagen, Valencia, CA) 상에서 프로그램된 추출 프로토콜에 필요하다. 기기는 복원된 IC 120μL를 각각의 샘플에 자동적으로 첨가한다. 12개 샘플 모두에 대하여, IC 1.8 mL (즉, 1개의 바이알)이 기기에 필요하다. 1650μL AVE 버퍼 (0.04% 나트륨 아지드를 함유하는 RNase가 없는 물)를 M13K07 IC 150 μL에 첨가하여 IC의 바이알을 제조하였다.
각각의 제조된 샘플을 생물학적 안정성 캐비닛 (BSC) 내에서 기기의 샘플 캐리어(Sample Carrier)에 로딩하였다. IC의 바이알(들)을 BSC 내에서 12개 샘플 당 IC 1 바이알의 비율로 별도의 (전용) 샘플 캐리어에 로딩하였다. 모든 서랍을 닫고 제조사의 권장 프로토콜에 따라 기기를 실행하였다 (QIAsymphony DNA Handbook, 09/2010 참조, http://www.algimed.by/download/EN-QIAsymphony-DNA-Handbool.pdf에서 이용 가능함).
시약 준비 카트리지를 추출을 수행하는데 필요한 모든 시약이 함유된 QIAsymphony® DSP Virus/Pathogen 시약 키트로 제조하였다 (QIAsymphony® DSP Virus/Pathogen Kit Instructions for Use (Handbook, April 2013 참조, https://www.qiagen.com/us/resources/download.aspx?id=f8bc0b3c-0aff-46ee-8807-5ed145f9e969&lang=en에서 이용 가능함). 시약 준비 카트리지는 프로테이나제 K를 함유하며 약 2주의 유통기한을 갖는다.
Q-PCR과의 통합을 용이하게 하기 위해서 96-웰 포맷 반응 플레이트에서 핵산 추출을 수행하였다. 자동화된 핵산 추출 과정이 종료되고 상태 점검이 통과된 후, 반응 플레이트를 냉각시키고 LightCycler® 480 Sealing Foil (Roche, Branchburg, NJ)로 밀봉하였다. 96-웰 플레이트를 적합한 평형추 (예를 들어, 또 다른 96-웰 플레이트)로 균형이 잡힌 플레이트 스피너(plate spinner)에 배치하여 30 내지 60초 동안 회전시켰다. 웰의 기포를 점검하였고 필요한 경우 회전을 반복하였다.
실시예 7: Q-PCR
Q-PCR을 두 개의 프로그램 - TaqMan Triplex, 및/또는 Veriquest Triplex - 중 어느 하나를 사용하여 LightCycler® 480 Instrument (Roche, Branchburg, NJ) 상에서 수행하였다. TaqMan Triplex 프로토콜은 참조 염료 (ROX)가 없는 TaqMan Fast Advance Custom Master Mix를 사용하였다. 세 개의 형광 채널 (FAM, VIC, 및 CY5) 및 2분의 UNG 단계 시간을 선택하였다. 사용된 반응 파라미터를 표 7에서 약술하였다.
역시 ROX가 없는 VeriQuest® Master Mix를 사용할 때에는, 5분의 UNG 단계 시간을 사용하였다. 사용된 반응 파라미터를 표 8에서 약술하였다.
설치류 파르보바이러스 PCR TaqMan Triplex 프로그램 단계
단계명 주기의 수 분석 방식 온도 (℃) 시간 차단 램프 속도 (℃/Sec) 단계 크기
UNG 1 없음 50 2 분 4.4
사전 인큐베이션 1 없음 95 2 분 4.4
TD 8 없음 95
70 --> 62		 10 초
30 초		 4.4
2.2		 1℃/단계
증폭 40 정량 95
62		 10 초
30 초		 4.4
2.2
냉각 1 없음 40 30 초 2.2
M13 내부 대조군, 설치류 파르보바이러스, 및 양성 증폭 대조군 플라스미드 각각에 대한 교차점 (Cp) 형광 신호를 두 개의 알고리즘 중 하나 또는 둘 다에 의해 결정하였다. 제1 알고리즘은 자동화된 2차 유도체 방법이다. 이 방법은 사용자 입력이 필요하지 않고 그 결과 일반적으로 일관성이 더 양호하며, 그러므로 바람직한 방법인 것으로 간주되었다. 두 번째 방법은 핏 포인트(Fit Points) 방법이다. 이 방법은, 백그라운드가 다른 경우, 사용자가 임계선을 설정할 수 있게 한다. 로그-선형 곡선이 상기 임계선을 교차하는 지점이 교차점이 된다. 다음 필터 콤(filter comb)을 사용하여 형광 신호를 관찰하였다: 설치류 파르보바이러스 (서브세트 "Sample-Parvo")에 대해 533-580 nm (VIC 신호); 내부 대조군 M13K07 (서브세트 "Sample-M13")에 대해 618-660 nm (Cy5 신호); 및 양성 증폭 대조군 플라스미드 (서브세트 "Sample-FAM")에 대해 465-510 nm (FAM 신호). 애매한 형광 신호의 경우에는 핏 포인트 분석을 사용하여 형광 백그라운드 수준을 결정하였다. 허용 가능한 백그라운드 형광 신호는 증폭 플롯 규모상 ≤ 1 유닛인 것으로 간주되었다. ≤ 1 유닛의 임의의 형광 신호는 허용 가능한 백그라운드 내에 있고, 따라서 음성인 것으로 간주되었다.
설치류 파르보바이러스 PCR VeriQuest Triplex 프로그램 단계
단계명 주기의 수 분석 방식 온도 (℃) 시간 차단 램프 속도 (℃/Sec) 단계 크기
UNG 1 없음 50 5 분 4.4
사전 인큐베이션 1 없음 95 2 분 4.4
TD 8 없음 95
70 --> 62		 10 초
30 초		 4.4
2.2		 1℃/단계
증폭 40 정량 95
62		 10 초
30 초		 4.4
2.2
냉각 1 없음 40 30 초 2.2
실시예 8: 유효 테스트 세션에 대한 조건
유효한 것으로 간주되는 테스트 세션에 대해, 다음 조건이 충족되어야 한다. 음성 증폭 대조군 (NAC, 즉 물)은 세 개의 채널 모두에서 형광 신호에 대하여 음성이어야 한다. 음성 추출 대조군 (NEC, 즉 PBS) 또는 세포 배양 음성 대조군 플라스크는 [533 - 580] 채널 (즉 설치류 파르보바이러스 프로브 VIC 신호)에서 형광 신호에 대하여 음성이고, [465-510] 채널 (즉 양성 증폭 대조군 [PAC] 안티센스 Flag 프로브-FAM 신호)에서 형광 신호에 대하여 음성이고, [618 - 660] 채널 (즉 M13K07 프로브-CY5 신호)에서 형광 신호에 대하여 양성이어야 한다. PAC는 세 개의 채널 모두에서 형광 신호에 대하여 양성이어야 한다. NEC에서 M13K07 Cp 값을 샘플에서 억제 물질의 존재를 평가하기 위한 기준으로 사용하였다.
PCR이 설치류 파르보바이러스 양성 대조군을 갖는 세포 배양 단계의 테스트 물품에 대한 종말점으로서 사용된 경우, 양성 바이러스 대조군은 [533- 580] 채널 (즉 설치류 파르보바이러스 프로브 VIC 신호)에서 형광 신호에 대하여 양성이고, [618 - 660] 채널 (즉, M13K07 프로브-CY5 신호)에서 형광 신호에 대하여 양성이고, [465-510] 채널 (즉, PAC 안티센스 Flag 프로브-FAM 신호)에서 형광 신호에 대하여 음성이어야 한다. 세포 배양 양성 대조군 샘플에서 M13K07 Cp 값은 NEC-M13 Cp 값의 ± 4주기 범위 내에 있을 것으로 예상된다.
모든 PAC 플라스미드-함유 대조군 반응에 대하여, 형광 신호는 세 개의 채널 모두에서 양성이어야 한다.
실시예 9: 무효 테스트 세션에 대한 조건
검정은 다음 조건들 중 어느 하나 또는 그 이상이 충족될 때 무효인 것으로 간주된다: (1) PAC에 대하여 매우 낮은 증폭 곡선 (형광 규모상 < 1 유닛), (2) 결정요인의 오류 (기계, 소프트웨어, 또는 인간의 오류)가 확인되었을 때, (3) NAC가 세 개의 채널 중 어느 것에서 증폭에 대하여 양성일 때, (4) NEC가 [533-580] VIC 채널에서 증폭에 대하여 양성이거나, [465-510] FAM 채널에서 증폭에 대하여 양성이거나, 또는 [618-660] Cy5 채널에서 증폭에 대하여 음성일 때, 및 (5) PAC가 세 개의 채널 중 어느 것에서 증폭 신호에 대하여 음성일 때. 검정이 무효로 결정될 때마다 테스트 샘플의 조사 및 재검사를 수행하였다.
실시예 10: 유효 테스트에서 음성 샘플 결과에 대한 조건
유효 음성 파르보바이러스 테스트 결과를 위해서는 다음 조건들 모두가 충족되어야 한다. 샘플은 M13 [618 - 660] 채널에서는 M13K07 DNA 증폭 신호에 대하여 NEC-M13 Cp ± 4 주기의 예상 Cp 값의 범위 내에서 양성이어야 하며, PCR 억제자의 부재를 제안한다. 샘플은 파르보바이러스 [533 - 580] 채널에서 파르보바이러스 DNA 증폭 신호에 대하여 음성이어야 한다. Cp 값에 상관없이, 형광 규모상 1 유닛 미만의 형광 신호는 허용 가능한 형광 백그라운드 수준 내에 있는 것으로 간주되고, 파르보바이러스 DNA 증폭에 대하여 음성인 것으로 보고되었다. 샘플은 안티센스 Flag [465-510] 채널에서 PAC 증폭 신호에 대하여 음성이어야 한다. Cp 값 (기기에 의해 자동적으로 생성됨)에 상관없이, 형광 규모상 1 유닛 미만의 형광 신호는 허용 가능한 형광 백그라운드 수준 내에 있는 것으로 간주되고, PAC-플라스미드 DNA 증폭에 대하여 음성인 것으로 보고되었다.
실시예 11: 유효 테스트 세션에서 "샘플 없음" 결과에 대한 조건
다음 조건들 중 임의의 하나 또는 그 이상을 충족할 때, "샘플 없음" 결과가 발생한다. Cy5 채널 [618 - 660]에서 M13K07 DNA 증폭 신호에 대하여 음성이고, 파르보바이러스 채널 [533 - 580]에서 파르보보아리서 DNA 증폭 신호에 대하여 음성이고, 안티센스 Flag FAM 채널 [465-510]에서 PAC 증폭에 대하여 음성일 때마다, 샘플 또는 PCR 시약을 표준 작동 절차에 따라 조사하였다. 이 조건은 PCR 억제자의 존재 또는 적절한 핵산 추출의 실패를 제안한다. 샘플은 억제를 극복하기 위해서 희석될 수 있다 (1:2, 1:5, 1:10). 범위 (NEC M13 Cp ± 4 주기) 밖에 있는 M13 채널 [618 660]의 형광 신호에 대한 Cp 값은 PCR의 부분적인 억제 또는 파지 첨가의 오류를 나타내고 반복 테스트를 받았다. 샘플 희석 (1:2, 1:5, 1:10)은 PCR의 억제를 극복한 것으로 간주될 수 있다. 결정요인 오류 또는 샘플 적합성의 결정적인 평가를 허용하지 않는 M13 채널 [618 - 660]에서 관찰된 예상 외의 매우 낮은 형광 신호 (형광 규모상 < 1 유닛)의 증거는 "샘플 없음 결과"인 것으로 간주되며, 증폭 또는 DNA 추출 동안의 실패를 제안한다. 이것을 반복 테스트하였다.
실시예 12: 유효 테스트 세션에서 규격을 벗어난 초기의 (iOOS) 샘플 결과에 대한 조건
샘플은 (i) 파르보바이러스 채널 [533 - 580]에서 파르보바이러스 DNA 증폭 신호 (즉, 설치류 파르보바이러스 프로브 VIC 신호)에 대하여 양성이며, 형광 신호가 형광 규모상 1 유닛 초과이고 (두 개의 반복 웰 중 적어도 하나에 대하여), 및 (ii) PAC로부터의 교차오염이 없음을 나타내는, 안티센스 Flag FAM 채널 [465-510]에서 PAC 증폭에 대하여 음성일 때 iOOS인 것으로 간주되었다. 결과로서, 당업자들은 (i) GLIF (일반 실험실 조사 양식)에 착수하고, (ii) 테스트를 위해 샘플을 QC 바이러스학에 제출한 부서에 통보하고, (iii) NOE에 착수하고, (iv) 추가의 조사 (예를 들어 Flag 서열 스크리닝 또는 시퀀싱)를 위해 증폭 튜브를 보존하고 (-20℃에서 냉동시키고), (v) 검정을 반복하여 샘플을 재검사해야 한다.
실시예 13: 반복 및 재검사 계획
검정이 무효이거나 샘플 결과가 "결과 없음"으로 간주될 때마다 반복 테스트에 착수하였다. iOOS 이벤트 (즉 최초 샘플 결과가 파르보바이러스 채널 [533 - 580]에서 DNA 증폭 신호에 대하여 양성임)의 확인을 위해 재검사를 수행하였다. 재검사 또는 반복 테스트를 신선한 시약 앨리쿼트 (즉, 마스터 혼합물 시약, 추출 키트)를 사용하여 실행해야 한다.
NAC가 임의의 채널에서 형광에 대하여 양성인 경우; 신선하게 제조된 마스터 혼합물을 이용하여 이미 정제된 DNA 샘플을 사용한 증폭 (PCR) 단계로부터 시작하여 전체 테스트 세션이 반복될 것이다. NEC가 M13 채널 [618 - 660] 채널에서 형광에 대하여 음성인 경우, DNA 추출 단계로부터 시작하여 전체 테스트 세션이 반복될 것이다. NEC가 파르보바이러스 채널 [533 - 580] 또는 안티센스 Flag 채널 [465-510]에서 형광에 대하여 양성인 경우, DNA 추출 단계로부터 시작하여 전체 테스트 세션이 반복될 것이다. PAC가 임의의 채널에서 형광에 대하여 음성인 경우, 테스트 세션은 신선하게 제조된 마스터 혼합물을 이용하여 정제된 같은 DNA 샘플을 사용한 증폭 (PCR 단계)으로부터 시작하여 전체 테스트 세션이 반복될 것이다.
"샘플 없음" 결과를 얻은 상기 샘플에 대하여, 영향을 받은 샘플에 대하여 DNA 추출 단계로부터 시작하여 테스트 세션이 반복될 것이다. 억제자의 존재를 입증하기 위해 조사 및 문제 해결 과정의 일부로서 DNA 추출 전에 샘플을 희석하였다 (1:2, 1:5, 또는 1:10) (희석되지 않은 샘플에 더하여).
초기 양성 결과 (iOOS)를 확인하기 위한 재검사를 다음과 같이 네 개의 별도의 앨리쿼트를 사용하여 수행하였다: 원래의 샘플링 이벤트 (예를 들어, 최종 공급 후 1일)의 테스트 물품의 두 개의 앨리쿼트, 및 다른 샘플링 이벤트 (예를 들어, 가능한 경우, 최종 공급 후 2일) 또는 다른 샘플 백의 테스트 물품의 두 개의 앨리쿼트. 4개의 앨리쿼트의 추가적인 테스트 중 어느 것이 결정요인 오류의 증거 없이 (조사를 통해 입증됨) 양의 신호를 생성한 경우, 로트(lot)는 설치류 파르보바이러스의 바이러스 게놈 물질의 부재에 대한 요건을 충족하지 못한 것으로 간주되었다. 이러한 양성 Q-PCR 결과에 대한 최종 처분에 대하여 감염성 검정이 보증되었다. CHO-K1 세포를 검출된 핵산의 감염 상태를 결정하기 위한 지표 세포주로서 사용한다.
재검사 결과가 음성일 때마다, 설치류 파르보바이러스 게놈 물질의 부재를 확인하기 위해 다른 샘플링 이벤트시 (예를 들어, 최종 공급 후 3일) 확인 테스트가 요구된다.
실시예 14: IOOS를 가진 다른 샘플 유형에 대한 재검사 계획
예를 들어, 미가공 대량 재료, 생산 종료 세포, 시험관 내 연령이 한계인 세포, 및 콩 재료를 포함한, 초기 양성 결과 (iOOS)를 가진 다른 샘플 유형을 네 개의 별도의 앨리쿼트를 사용하여 다음과 같이 재검사하였다:
원래의 샘플 용기 (즉, 예를 들어, 백)의 테스트 물품의 두 개의 앨리쿼트 및 다른 샘플 용기의 두 개의 앨리쿼트를 표준 작동 절차에 따라 재검사하였다. CHO-K1 지표 세포를 원래의 샘플 용기의 테스트 물품의 하나의 샘플 앨리쿼트로 접종하였다. 접종된 지표 세포 CHO-K1을 검출된 핵산의 감염 상태를 결정하기 위해 표준 작동 절차에 따라 배양에서 1-3 일 후 수확하였다. 재추출된 핵산의 정량화에 대한 표준 곡선을 사용할 수도 있다.
네 개의 앨리쿼트의 추가적인 PCR 테스트 중 어느 것이 결정요인 오류의 증거 없이 (조사를 통해 입증됨) 양성일 때마다, 감염성 검정으로 물품의 최종 처분을 결정한다. 초기 OOS의 확인시, 미생물을 식별하고 임의의 실험실 오류를 배제하기 위해서 핵산의 시퀀싱 및 투과 전자 현미경 (TEM)이 고려될 수 있다.
검출된 핵산의 감염 상태를 결정하기 위해서 의심되는 오염 재료에 대한 지표 세포로서 CHO-K1을 사용하는 감염성 검정이 요구된다. 조사가 파르보바이러스 바이러스 오염의 가능성을 지지하지 못하고 테스트 물품 및 CHOK1 배양의 네 개의 앨리쿼트의 추가적인 PCR 테스트가 모두 음성일 때마다, 로트는 감염성 설치류 파르보바이러스 바이러스의 부재에 대한 요건을 충족시키는 것으로 간주되었다.
실시예 15: 재조합 단백질 생산 동안에 파르보바이러스 테스트
세포 배양액, 즉, 이종 기원 항체 중쇄 및 경쇄 구조를 함유하는 CHO 세포 유도체를 함유하는 생산 바이오리액터의 미가공 대량 재료의 테스트를 위해 중요한 공정 중(in-process) 대조군으로서 상기 기술된 Q-PCR 절차를 수행하였다. 각 이종 기원 단클론성 항체 (mAb)는 다른 표적 또는 에피토프에 결합한다. QC 바이러스학 과학자는 대규모 생체공정 생산 시설에서 양호한 제조 공정 (GMP) 테스트를 수행하였다. 상기 테스트 중 16개가 표 9에 나열된다. 각각의 경우에, 테스트 세션이 유효하였고, 검정 시스템 적합성 기준이 충족되었으며, 위양성 검출이 관찰되지 않았다. 테스트 세션 #13 및 #14에서, 위음성 검출이 발생하였는데, 이것은 PCR 억제자의 존재 또는 핵산 추출의 실패를 제안한다.
설치류 파르보바이러스 PCR 테스트
테스트 # 샘플 유형 생성물 로트 테스트
1 UPB EA mAb1 '51 설치류 Parvo PCR
2 UPB mAb1 '52 설치류 Parvo PCR
3 UPB mAb3 '07 설치류 Parvo PCR
4 UPB mAb1 '51 설치류 Parvo PCR
5 UPB EA mAb2 '35 설치류 Parvo PCR
6 UPB EA mAb4 '05 설치류 Parvo PCR
7 UPB mAb2 '36 설치류 Parvo PCR
8 UPB mAb1 '53 설치류 Parvo PCR
9 UPB mAb1 '53 설치류 Parvo PCR
10 UPB EA mAb3 '08 설치류 Parvo PCR
11 UPB EA mAb5 '01 설치류 Parvo PCR
12 UPB EA mAb1 '54 설치류 Parvo PCR
13 UPB mAb6 '01 설치류 Parvo PCR
14 UPB mAb4 '05 설치류 Parvo PCR 정량
15 UPB mAb2 '35 설치류 Parvo PCR 정량
16 UPB mAb2 '36 설치류 Parvo PCR 정량
UPB = 미가공 대량 재료; EA = 조기 경보; 설치류 Parvo PCR = 상기 기술된 Q-PCR 절차.
SEQUENCE LISTING <110> Regeneron Pharmaceuticals, Inc. <120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR DETECTING A BIOLOGICAL CONTAMINANT <130> 10107US01 <150> US 62/139,321 <151> 2015-03-15 <160> 37 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Parvovirus <400> 1 tgcataaaag agtaacctca ccag 24 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Parvovirus <400> 2 actggatgat gatgcagc 18 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Parvovirus <400> 3 tgtcgatggc gaatggcta 19 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Parvovirus <400> 4 ccacctggtt gagccatc 18 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Bacteriophage M13 <400> 5 aagcctcagc gaccgaatat 20 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Bacteriophage M13 <400> 6 tatgcgtggg cgatggttgt tgtc 24 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Bacteriophage M13 <400> 7 tcagcttgct ttcgaggtga at 22 <210> 8 <211> 6407 <212> DNA <213> Bacteriophage M13 <400> 8 aacgctacta ctattagtag aattgatgcc accttttcag ctcgcgcccc aaatgaaaat 60 atagctaaac aggttattga ccatttgcga aatgtatcta atggtcaaac taaatctact 120 cgttcgcaga 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1560 ggtgactttg gtttggtgga taagcacgaa tggcctctga tctgtgcttg gttggtgaag 1620 aatggttacc aatctaccat ggcttgttac tgtgctaaat ggggcaaagt tcctgattgg 1680 tcagaggact gggcggagcc gaagctagac actcctataa attcgctagg ttcaatgcgc 1740 tcaccatctc tgactccgag aagtacgcct ctcagccaaa actacgctct tactccactt 1800 gcatcggacc ttgcggacct agctctagag ccttggagca caccaaatac tcctgttgcg 1860 ggcactgcag caagccaaaa cactggggag gctggttcca cagcctgcca aggtgctcaa 1920 cggagcccaa cctggtccga gatcgaggcg gatttgagag cttgcttcag tcaagaacag 1980 ttggagagcg acttcaacga ggagctgacc ttggactaa 2019 <210> 35 <211> 1997 <212> DNA <213> Rat minute virus isolate NTU2 <400> 35 atgaggtttt gggagcaacc aactggctaa aggacaaaag tagccaggag gtattctcat 60 ttgtttttaa aaatgagaac gtccaactaa atgggaagga catcggttgg aatagttaca 120 gaaaggagct acaagatgac gagctgaagt ctctacaacg aggggcggag accacttggg 180 accaaagcga ggacatggaa tgggagagcg cagtggatga catgaccaaa aagcaagtat 240 tcatttttga ttctttggtt aagaagtgtc tgtttgaagt gctcagcaca aagaacatag 300 ctcctagtga tgttacttgg ttcgtgcagc atgaatgggg aaaggaccaa ggctggcact 360 gtcatgtgct gattggaggc aaggacttta gtcaagctca aggaaaatgg tggagaaggc 420 agctaaatgt gtactggagt agatggttgg tgactgcctg taatgttcaa ctaacaccag 480 ctgaaagaat taaactaaga gaaatagcag aggacagtga atgggtcact ttgcttacct 540 ataagcataa gcacaccaag aaggactata ccaagtgtgt tctttttgga aacatgattg 600 cttattactt tctaagcaaa aagaaaatat gtaccagtcc accaagggac ggaggctatt 660 ttcttagcag tgactctggc tggaaaacta actttttgaa agagggcgag cgccatctag 720 tgagcaaact gtatactgat gagatgaaac cagaaacggt cgagaccaca gtgaccactg 780 cacaggaagc taagcgcggc agaattcaaa ctagaaagga ggtctcgatt aaaaccacac 840 tcaaagagtt ggtacataaa agagtaacct caccagaaga ctggatgatg atgcagccag 900 acagttatat tgaaatgatg gctcaaccag gtggagaaaa cttgcttaaa aatacactag 960 agatatgtac actgactcta gcaagaacca aaacagcctt tgacttgatt ctggaaaaag 1020 ctgaaaccag caaactagcc aacttttcta tggctagcac cagaacctgt agaatctttg 1080 ctgagcatgg ctggaactat attaaagtct gccatgccat ctgttgtgtg ctaaatagac 1140 aaggaggcaa aaggaacact gtgctctttc 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2019 <212> DNA <213> Rat minute virus 2a <400> 36 atggctggaa acgcttactc cgatgaggtt ttgggagcaa ccaactggct aaaggacaaa 60 agtagccagg aggtgttctc atttgttttt aaaaatgaga acgtccaact aaatgggaag 120 gacatcggtt ggaatagtta cagaaaggag ctacaagatg acgagctgaa gtctctacaa 180 cgaggggcgg agaccacttg ggaccaaagc gaggacatgg aatgggagag cgcagtggat 240 gacatgacca aaaagcaagt attcattttt gattctttgg ttaagaagtg tctgtttgaa 300 gtgctcagca caaagaacat agctcctagt gatgttactt ggttcgtgca gcatgaatgg 360 ggaaaggacc aaggctggca ctgtcatgtg ctgattggag gcaaggactt tagtcaagct 420 caaggaaaat ggtggagaag gcagctaaat gtgtactgga gtagatggtt ggtgactgcc 480 tgtaatgttc aactaacacc agctgaaaga attaaactga gagaaatagc agaggacagt 540 gaatgggtca ctttgcttac ctataagcat aagcacacca agaaggacta taccaagtgt 600 gttctttttg gaaacatgat tgcttattac tttctaagca aaaagaaaat atgtaccagt 660 ccaccaaggg acggaggcta ttttcttagc agtgactctg gctggaaaac taacttcttg 720 aaagagggcg agcgccatct agtgagcaaa ctgtatactg atgagatgaa accagaaacg 780 gtcgagacca cagtgaccac tgcgcaggaa 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Claims (43)

  1. 인공 뉴클레오타이드 서열, 형광단, 및 소광제를 포함하는 조성물로서, 인공 뉴클레오타이드 서열은 3-프라임 단부에서 서열 번호:9 및 12-37 중 어느 하나의 서열과 동일한 5개 이하의 연속 핵산을 포함하는, 조성물.
  2. 제1 항에 있어서, 형광단은 495 nm 내지 680 nm에서 여기 파장, 및 515 nm 내지 710 nm에서 방출 파장을 갖는 형광단의 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제2 항에 있어서, 소광제는 430 nm 내지 672 nm에서 흡광 피크를 갖는 염료의 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제1 항에 있어서, 형광단은 495 nm의 여기 파장 및 520 nm의 방출 파장을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 제4 항에 있어서, 형광단은 FAM인 것을 특징으로 하는 조성물.
  6. 제5 항에 있어서, 소광제는 BHQ-1인 것을 특징으로 하는 조성물.
  7. 제1 항에 있어서, 형광단은 인공 뉴클레오타이드 서열의 5-프라임 단부에 부착되고 소광제는 인공 뉴클레오타이드 서열의 3-프라임 단부에 부착되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  8. 제1 항에 있어서, 인공 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호:3의 핵산 서열 (5'-TGTCGATGGCGAATGGCTA-3')을 포함하는 조성물.
  9. a. 설치류 파르보바이러스 특이적 정방향 올리고뉴클레오타이드 프라이머;
    b. 설치류 파르보바이러스 특이적 올리고뉴클레오타이드 검출 프로브;
    c. 인공 올리고뉴클레오타이드 검출 프로브;
    d. 설치류 파르보바이러스 특이적 역방향 올리고뉴클레오타이드 프라이머;
    e. M13 특이적 정방향 올리고뉴클레오타이드 프라이머;
    f. M13 특이적 올리고뉴클레오타이드 검출 프로브; 및
    g. M13 특이적 역방향 올리고뉴클레오타이드 프라이머
    를 포함하는 조성물.
  10. 제9 항에 있어서, a, b, 및 d의 올리고뉴클레오타이드 서열은 각각 미세 마우스 프로토타입 균주 바이러스 (MVMp), 미세 마우스 면역억제 균주 바이러스 (MVMi), 미세 마우스 커터 균주 바이러스 (MVMc); 마우스 파르보바이러스 1b (MPV-1b), 마우스 파르보바이러스 1a (MPV-1a), 마우스 파르보바이러스 1c (MPV-1c), 햄스터 파르보바이러스 (HaPV), 툴란 파르보바이러스 (H-1), 킬햄 래트 바이러스 (KRV), 래트 파르보바이러스 1a, 미세 래트 바이러스, 및 래트 바이러스 L의 Umass 균주 (RV-Umass)로 구성되는 군으로부터 선택된 설치류 파르보바이러스의 NS-1 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  11. 제9 항에 있어서, 인공 올리고뉴클레오타이드 검출 프로브는 3-프라임 단부에서 서열 번호:9 및 12-37 중 어느 하나의 서열과 동일한 5개 이하의 연속 핵산을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  12. 제10 항에 있어서, a, b, 및 d의 올리고뉴클레오타이드 서열은 서열 번호:37에 잡종화되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  13. 제9 항에 있어서, b, c, 및 f의 각각의 검출 프로브는 각각의 검출 프로브에 대한 형광단이 다른 파장에서 광을 방출하도록 형광단 및 소광제를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  14. 제13 항에 있어서, 각각의 프로브의 형광단은 495 nm 내지 680 nm에서 여기 파장, 및 515 nm 내지 710 nm에서 방출 파장을 갖는 형광단의 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  15. 제14 항에 있어서, 소광제는 430 nm 내지 672 nm에서 흡광 피크를 갖는 염료의 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  16. 제13 항에 있어서, 인공 올리고뉴클레오타이드 검출 프로브 (c)는 형광단 FAM 및 소광제 BHQ-1을 포함하고; 설치류 파르보바이러스 특이적 올리고뉴클레오타이드 검출 프로브 (b)는 형광단 VIC 및 마이너 그루브 결합 무형광 소광제 (MGBNFQ)를 포함하고; 및 M13 특이적 올리고뉴클레오타이드 검출 프로브는 형광단 Cy5 및 소광제 BHQ2를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  17. 제12 항에 있어서, 설치류 파르보바이러스 특이적 정방향 올리고뉴클레오타이드 프라이머 (a)는 서열 번호:1의 핵산 서열을 포함하고; 설치류 파르보바이러스 특이적 역방향 올리고뉴클레오타이드 프라이머 (d)는 서열 번호:4의 핵산 서열을 포함하고; 설치류 파르보바이러스 특이적 올리고뉴클레오타이드 검출 프로브 (b)는 서열 번호:2의 핵산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  18. 제11 항에 있어서, 인공 올리고뉴클레오타이드 검출 프로브 (c)는 서열 번호:3의 핵산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  19. 제9 항에 있어서, M13 특이적 정방향 올리고뉴클레오타이드 프라이머 (e)는 서열 번호:5의 핵산 서열을 포함하고; M13 특이적 올리고뉴클레오타이드 검출 프로브 (f)는 서열 번호:6의 핵산 서열을 포함하고; M13 특이적 역방향 올리고뉴클레오타이드 프라이머 (g)는 서열 번호:7의 핵산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  20. 테스트 샘플에서 생물학적 오염물질을 검출하는 방법으로서,
    a. 반응 혼합물을 제조하기 위해, (i) 테스트 샘플로부터 유도된 핵산 샘플, (ii) 올리고뉴클레오타이드, 및 (iii) DNA 폴리머라제를 포함한 성분들을 조합하는 단계;
    b. 반응 혼합물을 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)시키는 단계;
    c. PCR 동안에 (i) 표적 증폭 폴리뉴클레오타이드 (TAP), (ii) 핵산 추출 대조군 증폭 폴리뉴클레오타이드 (NACP), 및 (iii) 플라스미드 증폭 대조군 폴리뉴클레오타이드 (PACP)의 생산을 관찰하는 단계; 및
    d. TAP의 생산을 NACP 및 PACP의 생산과 비교하는 단계로서,
    PCR 동안에 생산된 TAP의 존재, NACP의 존재, 및 PACP의 부재는 테스트 샘플이 생물학적 오염물질을 함유하고 양성 증폭 대조군 플라스미드를 함유하지 않는다는 것을 나타내는 단계
    를 포함하는 방법.
  21. 제20 항에 있어서, 올리고뉴클레오타이드는 (a) 설치류 파르보바이러스 특이적 정방향 올리고뉴클레오타이드 프라이머, (b) 설치류 파르보바이러스 특이적 올리고뉴클레오타이드 검출 프로브, (c) 인공 올리고뉴클레오타이드 검출 프로브, (d) 설치류 파르보바이러스 특이적 역방향 올리고뉴클레오타이드 프라이머, (e) M13 특이적 정방향 올리고뉴클레오타이드 프라이머, (f) M13 특이적 올리고뉴클레오타이드 검출 프로브, 및 (g) M13 특이적 역방향 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제20 항에 있어서, 테스트 샘플은 포유류 세포 배양 또는 이것의 정제된 부분으로부터 얻어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제20 항에 있어서, 테스트 샘플은 M13K07 파지가 첨가된 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제20 항에 있어서, 핵산 샘플은 약 1 mL의 테스트 샘플을 용해, 단백질 가수분해, 및 열 변성시킨 후 이어서, 샘플을 추출 대조군 샘플과 조합한 다음 샘플로부터 핵산을 추출함으로써 제조되는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제24 항에 있어서, 추출 대조군 샘플은 M13K07 파지인 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제25 항에 있어서, (a) 설치류 파르보바이러스 특이적 정방향 올리고뉴클레오타이드 프라이머는 서열 번호:1의 핵산 서열을 포함하고; (b) 설치류 파르보바이러스 특이적 올리고뉴클레오타이드 검출 프로브는 VIC 형광단, 마이너 그루브 결합 무형광 소광제 (MGBNFQ), 및 서열 번호:2의 핵산 서열을 포함하고; (c) 인공 올리고뉴클레오타이드 검출 프로브는 FAM 형광단, 무형광 소광제 BHQ, 및 서열 번호:3의 핵산 서열을 포함하고; (d) 설치류 파르보바이러스 특이적 역방향 올리고뉴클레오타이드 프라이머는 서열 번호:4의 핵산 서열을 포함하고; (e) M13 특이적 정방향 올리고뉴클레오타이드 프라이머는 서열 번호:5의 핵산 서열을 포함하고; (f) M13 특이적 올리고뉴클레오타이드 검출 프로브는 Cy5 형광단, BHQ-2 소광제, 및 서열 번호:6의 핵산 서열을 포함하고; M13 특이적 역방향 올리고뉴클레오타이드 프라이머는 서열 번호:7의 핵산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제20 항에 있어서, 성분은 우라실-N-글리코실라제 (UNG)를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제20 항에 있어서, 50℃에서 적어도 2 분 동안 반응 혼합물을 인큐베이션하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 제28 항에 있어서, PCR 단계 (b)는 (i) 반응 혼합물을 95℃에서 2 분 동안 인큐베이션하는 단계; 이어서 (ii) 8 주기의 (1) 95℃에서 10 초 동안 변성과 이어서, (2) 30초 동안 어닐링하는 단계로서, 8 주기 중 처음의 어닐링 온도는 70℃이고, 어닐링 온도는 각 주기에서 1℃씩 감소하며, 8 주기 중 마지막의 어닐링 온도는 62℃인 단계; 이어서 (iii) (1) 95℃에서 10 초 동안 변성과 이어서, (2) 30초 동안 62℃에서 어닐링하는 단계를 포함하는 적어도 40 주기의 DNA 증폭 단계를 포함하며, 변성 온도에서 어닐링 온도로의 온도 변화 속도는 초 당 약 4.4℃이고, 어닐링 온도에서 변성 온도로의 온도 변화 속도는 초 당 약 2.2℃인 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제26 항에 있어서, (a) TAP의 생산은 각 증폭 주기에서 533 - 580 nm에서 형광을 측정함으로써 관찰되고; (b) NACP의 생산은 각 증폭 주기에서 618 - 660 nm에서 형광을 측정함으로써 관찰되고; (c) PACP의 생산은 각 증폭 주기에서 465 - 510 nm에서 형광을 측정함으로써 관찰되는 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 제20 항에 있어서, 테스트 샘플에서 작동된 상기 방법으로부터 얻어진 결과를 외부 양성 대조군 및 외부 음성 대조군과 비교하는 단계를 포함하며, 음성 대조군 또는 양성 대조군이 실패한 경우, 테스트 샘플에서 작동된 상기 방법으로부터 얻어진 결과는 거부되는 것을 특징으로 하는 방법.
  32. 제31 항에 있어서, 외부 양성 대조군은
    a. 양성 대조군 혼합물을 제조하기 위해, (i) 양성 증폭 대조군 (PAC) 플라스미드, 및 (ii) 양성 대조군 올리고뉴클레오타이드 칵테일을 포함하고, (iii) 테스트 샘플을 포함하지 않는 양성 대조군 성분을 조합하는 단계;
    b. 양성 대조군 혼합물을 양성 대조군 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)시키는 단계; 및
    c. PCR 동안에 (i) 표적 증폭 폴리뉴클레오타이드 (TAP), (ii) 핵산 추출 대조군 증폭 폴리뉴클레오타이드 (NACP), 및 (iii) 플라스미드 증폭 대조군 폴리뉴클레오타이드 (PACP)의 생산을 관찰하는 단계로서,
    PCR 동안에 생산된 TAP, NACP, 및 PACP의 존재는 PCR이 적절하게 기능하고 있다는 것을 나타내고, TAP, NACP, 또는 PACP 중 어느 하나 이상의 부재시에는 양성 대조군이 실패했다는 것을 나타내는 단계
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  33. 제32 항에 있어서, PAC 플라스미드는 (i) 파르보바이러스 핵산 서열, (ii) M13K07 핵산 서열, 및 (iii) 플라스미드에 고유한 인공 핵산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  34. 제33 항에 있어서, (i) 파르보바이러스 핵산 서열은 서열 번호:37의 서열을 포함하고, (ii) M13K07 핵산 서열은 서열 번호:8의 서열을 포함하고, (iii) 플라스미드에 고유한 인공 핵산 서열은 서열 번호:10의 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  35. 제34 항에 있어서, PAC 플라스미드는 서열 번호:11의 핵산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  36. 제33 항에 있어서, 양성 대조군 올리고뉴클레오타이드 칵테일은
    서열 번호:1의 핵산 서열을 포함하는 설치류 파르보바이러스 특이적 정방향 올리고뉴클레오타이드 프라이머;
    VIC 형광단, MGBNFQ 소광제, 및 서열 번호:2의 핵산 서열을 포함하는 설치류 파르보바이러스 특이적 올리고뉴클레오타이드 검출 프로브;
    FAM 형광단, BHQ 소광제, 및 서열 번호:3의 핵산 서열을 포함하는 인공 올리고뉴클레오타이드 검출 프로브;
    서열 번호:4의 핵산 서열을 포함하는 설치류 파르보바이러스 특이적 역방향 올리고뉴클레오타이드 프라이머;
    서열 번호:5의 핵산 서열을 포함하는 M13 특이적 정방향 올리고뉴클레오타이드 프라이머;
    Cy5 형광단, BHQ-2 소광제, 및 서열 번호:6의 핵산 서열을 포함하는 M13 특이적 올리고뉴클레오타이드 검출 프로브; 및
    서열 번호:7의 핵산 서열을 포함하는 M13 특이적 역방향 올리고뉴클레오타이드 프라이머
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  37. 제36 항에 있어서, 양성 대조군 PCR은
    a. 양성 대조군 혼합물을 95℃에서 2 분 동안 배양하는 단계; 이어서
    b. 8 주기의 (i) 95℃에서 10 초 동안 변성과 이어서, (ii) 30초 동안 어닐링하여, 8 주기 중 처음의 어닐링 온도가 70℃가 되도록 하는 단계로서, 어닐링 온도는 각 주기에서 1℃씩 감소하며, 8 주기 중 마지막의 어닐링 온도는 62℃인 단계; 및 이어서
    c. (i) 95℃에서 10 초 동안 변성 후, (ii) 62℃에서 30초 동안 어닐링하는 단계를 포함하는 적어도 40 주기의 DNA 증폭 단계
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  38. 제36 항에 있어서, 양성 대조군 PCR에서 TAP의 생산은 각 증폭 주기에서 533 - 580 nm에서 형광을 측정함으로써 관찰되고, 양성 대조군 PCR에서 NACP의 생산은 각 증폭 주기에서 618 - 660 nm에서 형광을 측정함으로써 관찰되고; 양성 대조군 PCR에서 PACP의 생산은 각 증폭 주기에서 465 - 510 nm에서 형광을 측정함으로써 관찰되는 것을 특징으로 하는 방법.
  39. a. 양성 증폭 대조군 (PAC) 플라스미드;
    b. 설치류 파르보바이러스 특이적 정방향 올리고뉴클레오타이드 프라이머;
    c. 설치류 파르보바이러스 특이적 올리고뉴클레오타이드 검출 프로브;
    d. 인공 올리고뉴클레오타이드 검출 프로브;
    e. 설치류 파르보바이러스 특이적 역방향 올리고뉴클레오타이드 프라이머;
    f. M13 특이적 정방향 올리고뉴클레오타이드 프라이머;
    g. M13 특이적 올리고뉴클레오타이드 검출 프로브;
    h. M13 특이적 역방향 올리고뉴클레오타이드 프라이머; 및
    i. 버퍼
    를 포함하는 조성물.
  40. 제39 항에 있어서, PAC 플라스미드는 (i) 파르보바이러스 핵산 서열, (ii) M13K07 핵산 서열, 및 (iii) 플라스미드에 고유한 인공 핵산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  41. 제40 항에 있어서, 파르보바이러스 핵산 서열은 서열 번호:37의 서열을 포함하고, M13K07 핵산 서열은 서열 번호:8의 서열을 포함하고, 고유 핵산 서열은 서열 번호:10의 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  42. 제41 항에 있어서, PAC 플라스미드는 서열 번호:11의 핵산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  43. 제42 항에 있어서,
    설치류 파르보바이러스 특이적 정방향 올리고뉴클레오타이드 프라이머는 서열 번호:1의 핵산 서열을 포함하고;
    설치류 파르보바이러스 특이적 올리고뉴클레오타이드 검출 프로브는 VIC 형광단, 마이너 그루브 결합 소광제 (MGBNFQ), 및 서열 번호:2의 핵산 서열을 포함하고;
    인공 올리고뉴클레오타이드 검출 프로브는 VIC 형광단, 무형광 소광제 BHQ, 및 서열 번호:3의 핵산 서열을 포함하고;
    설치류 파르보바이러스 특이적 역방향 올리고뉴클레오타이드 프라이머는 서열 번호:4의 핵산 서열을 포함하고;
    M13 특이적 정방향 올리고뉴클레오타이드 프라이머는 서열 번호:5의 핵산 서열을 포함하고;
    M13 특이적 올리고뉴클레오타이드 검출 프로브는 Cy5 형광단, BHQ-2 소광제, 및 서열 번호:6의 핵산 서열을 포함하고;
    M13 특이적 역방향 올리고뉴클레오타이드 프라이머는 서열 번호:7의 핵산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
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