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KR20240042354A - 생착 및 재생능 강화를 위한 장 오가노이드 주변 기질 세포층 및 이의 용도 - Google Patents

생착 및 재생능 강화를 위한 장 오가노이드 주변 기질 세포층 및 이의 용도 Download PDF

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Publication number
KR20240042354A
KR20240042354A KR1020230125805A KR20230125805A KR20240042354A KR 20240042354 A KR20240042354 A KR 20240042354A KR 1020230125805 A KR1020230125805 A KR 1020230125805A KR 20230125805 A KR20230125805 A KR 20230125805A KR 20240042354 A KR20240042354 A KR 20240042354A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
intestinal
cells
derived
organoids
mature
Prior art date
Application number
KR1020230125805A
Other languages
English (en)
Inventor
손미영
이하나
한태수
Original Assignee
한국생명공학연구원
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 한국생명공학연구원 filed Critical 한국생명공학연구원
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Abstract

본 발명은 성숙 장 오가노이드 유래 중간엽 기질 세포 및 이의 용도에 관한 것이다.
본 발명에 따른 성숙 장 오가노이드 유래 중간엽 기질 세포는 병변 부위에 직접 작용하여 재생 및 생착 효능을 크게 증진 시킬 수 있으며, 이에 따라 이식에 대한 효율을 크게 증진시킬 수 있다. 더욱이, 기존의 중간엽 줄기세포 치료제와는 다르게 손상 부위를 즉각적, 직접적으로 재생할 수 있는 점에서 우수한 효능을 지닐 뿐만 아니라 단순화된 계대 방법 적용 및 동결과 해동에도 특성을 유지하며 동종 이식 방식에도 활용 가능하다는 점에서 범용적 활용 가능성이 매우 높은 장점을 가진다.

Description

생착 및 재생능 강화를 위한 장 오가노이드 주변 기질 세포층 및 이의 용도{Stromal cell layer around intestinal organoids for enhancing engraftment and regenerative ability and use thereof}
본 발명은 생착 및 재생능 강화를 위한 장 오가노이드 주변 기질 세포층, 장 오가노이드 주변 중간엽 기질 세포 및 이의 제조방법과 용도에 관한 것이다.
기질 세포(Stromal cell)는 결합 조직 세포로써, 특정 장기(organ)나 조직(tissue)를 구성하는 실질 세포(parenchymal cell)의 기능을 지원하는 세포이며, 기질 세포는 특성이 다양한 세포들로 구성될 수 있고(heterogeneous cell population), 환경에 따라 다양하게 분화할 수 있는 세포이다.
최근 중간엽 기질 세포를 포함하여 조직공학적 방법을 통한 이식치료법이 다수 개발되고 있다. 하지만, 이러한 이식 치료 기법의 가장 큰 한계는 치료 효과가 뛰어나고 인체의 면역반응을 일으키지 않는 안정한 세포 치료제를 개발하기 어렵다는 점이다. 그 동안 여러 가지 중간엽 기질 세포를 이용하여 세포 치료제로써 활용하기 위한 시도들이 진행된 바 있다. 그러나, 통상 자가 조직을 이용하는 것으로만 상당히 국한적으로 개발이 진행되고 있으며 범용적으로 사용가능한 세포원 등에 대해서는 여전히 개발 속도가 매우 느리다.
또한, 범용적으로 사용가능한 세포원에 대한 확보가 어려운 것을 별론으로 하더라도, 기질 세포 관련 연구를 진행하기 위해서는 기질 세포의 원활한 수급이 필요한데 이의 이용에 있어서 세포를 수득하는 것에 큰 제한이 있다. 예를 들어, 제대혈, 지방조직으로부터 유래한 중간엽 기질 세포를 얻기 위해서는 침습적인 방법을 이용해야만 한다. 가장 비침습적인 방법을 이용해 얻을 수 있는 세포는 골수 채취를 통해 수득 가능한 중간엽 기질 세포이지만 이러한 세포의 수득에는 마취가 필요하고 고통을 유발하여, 그 이용에 제한이 있다. 또한, 말초혈액을 이용한 세포 획득법 등이 요구되고 있으나 말초혈액만으로는 성인에서 분리할 수 있는 중간엽 줄기세포의 수가 너무 적고 분리방법이 경제적이지 못하며, 분리해낸다고 해도 세포치료에 사용 가능한 양만큼 증식이 원활하지 않은 경우가 대부분이기에 좀 더 실용성을 높일 수 있는 대체 방안이 필요하다.
또한, 성체 유래 중간엽 기질 세포 등은 통상적으로 계대가 지날 때마다 세포능이 현저히 떨어지며 각종 인자들의 분비 및 줄기세포의 이동 능력 등이 떨어지기 때문에 이의 활용이 매우 제한적인 경우가 많다. 더욱이, 임의의 성체 유래 중간엽 기질 세포들은 그 유래에 따라 그 특성이 매우 상이하다는 점에서 활용 가치가 매우 낮을 때가 많다.
이러한 배경하에 확립된 분화 프로토콜 등을 통하여 개선된 특성을 나타내면서 이의 특성이 장기적으로 유지될 수 있는 신규의 기질 세포, 이의 제조 방법 및 활용 용도에 대한 개발이 시급한 실정이다.
본 발명자들은 전분화능 줄기세포로부터 분화된 장 오가노이드, 특히 in vitro에서 성숙된 장 오가노이드가 성체 줄기세포로부터 유래된 장 오가노이드 또는 환자(조직) 유래된 장 오가노이드와 달리 인체 장내 미세환경(microenvironment)과 같이 장 오가노이드 주변 조직에 기질 세포로 구성되는 세포층을 포함하고 있어 인체 장과 더 유사한 안정적 구조를 가지고 있음을 확인하였다. 이러한 배경하에, 장 오가노이드 주변 조직에 기질 세포로 구성되는 세포층을 얻고 이러한 기질세포 층이 기존에 알려진 기질세포들과 달리 생착 및 재생능 강화에 우수한 효과가 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 전분화능 줄기세포(PSC)로부터 분화된 장 오가노이드의 주변 기질 세포층을 제공한다.
본 발명은 전분화능 줄기세포(PSC)로부터 분화된 장 오가노이드 유래 중간엽 기질 세포를 제공한다.
본 발명은 전분화능 줄기세포(PSC)로부터 분화된 장 오가노이드 유래 중간엽 기질 세포를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
본 발명은 전분화능 줄기세포(PSC)로부터 분화된 장 오가노이드 유래 중간엽 기질 세포를 포함하는 이식 보조용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명은 전분화능 줄기세포(PSC)로부터 분화된 장 오가노이드 유래 중간엽 기질 세포를 포함하는 장질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명은 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 도면에 예시하고 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
본 출원에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 출원에서, “포함하다” 또는 “가지다” 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
본 명세서에서 양, 농도, 또는 다른 값 또는 파라미터가 범위, 바람직한 범위 또는 바람직한 상한 값 및 바람직한 하한 값의 열거로 주어지는 경우, 범위가 별도로 개시되는 지에 상관없이 임의의 한 쌍의 임의의 위쪽 범위 한계치 또는 바람직한 값 및 임의의 아래쪽 범위 한계치 또는 바람직한 값으로 형성된 모든 범위를 구체적으로 개시하는 것으로 이해되어야 한다.
수치 값의 범위가 본 명세서에서 언급될 경우, 달리 기술되지 않는다면, 그 범위는 그 종점 및 그 범위 내의 모본 발명의 범주는 범위를 정의할 때 언급되는 특정 값으로 한정되지 않는 것으로 의도된다.
전분화능 줄기세포
본원에 사용된 용어 “전분화능 줄기세포(PSC: pluripotent stem cell)”는, 또한 통상 PS 세포로도 알려져 있는데, 거의 모든 세포로 분화할 수 있는 임의의 세포, 즉, 내배엽(내부 위벽, 위장관, 폐), 중배엽(근육, 뼈, 혈액, 비뇨생식기), 및 외배엽(상피 조직 및 신경계)을 포함한 3개의 배엽(생식 상피) 중 어느 것으로부터 유래된 세포를 포함한다. PSC는 배아 줄기세포(배아 생식세포 포함)로부터 유래되거나, 특정 유전자의 발현을 강제함으로써 비-만능 세포, 예컨대 성체 체세포를 유도하여 얻은 전능성 세포의 후손일 수 있다.
본원에 사용된 용어 “유도 만능 줄기세포(iPSC: induced pluripotent stem cell)”는, 또한 통상 iPS 세포로도 약칭되는데, 특정 유전자의 “강제된” 발현을 유도함으로써 정상적으로 비만능성 세포, 예컨대 성체 체세포로부터 인공적으로 유도된 만능성 줄기세포의 타입을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 “배아 줄기세포(ESC: embryonic stem cell)”는, 또한 통상 ES 세포로도 약칭되는데, 만능성이며, 초기-단계 배아인 배반포(blastocyst)의 내세포괴(inner cell mass)로부터 유래된 세포를 지칭한다. 본 발명의 목적을 위해, 용어 “ESC”는 또한 때때로 넓게 사용되어, 배아 생식 세포도 포함한다.
기본 배지
본 발명의 방법에 사용되는 분화 배지는 기본 배지를 포함한다. 상기 기본 배지는 본 명세서에 제공된 제한이 가해진, 동물 또는 인간 세포에 적합한 임의의 기본 배지이다.
동물 또는 인간 세포 배양을 위한 기본 배지는 전형적으로, 배양된 세포의 유지를 지지하는데 필요한 다수의 성분들을 함유한다. 적합한 성분들의 조합은 하기의 내용을 고려하여 숙련가에 의해 쉽게 제형화될 수 있다. 본 발명에 사용하기 위한 기본 배지는 일반적으로 문헌 및 상기에 보다 상세히 기재된 바와 같은 표준 세포 배양 성분, 예를 들어 아미노산, 비타민, 지질 보충제, 무기염, 탄소 에너지원, 및 완충제를 포함하는 영양 용액을 포함할 것이다. 일부 실시양태에서, 상기 배양 배지는, 예를 들어 아미노산, 비타민, 액체 보충제, 무기염, 탄소 에너지원 및 완충제 중에서 선택된 하나 이상의 표준 세포 배양 성분이 추가로 보충된다.
숙련가는 본 발명의 분화 배지 중에 기본 배지로서 사용될 수도 있는 배양 배지의 유형을 통상적인 일반적인 지식으로부터 이해할 것이다. 잠재적으로 적합한 세포 배양 배지는 상업적으로 입수될 수 있으며, 비제한적으로 둘베코의 변형된 이글 배지 (DMEM), 최소 필수 배지 (MEM), 녹아웃-DMEM (KO-DMEM), 글래스고우 최소 필수 배지(G-MEM), 기본 이글 배지 (BME), DMEM/햄스 F12, 어드밴스드 DMEM/햄스 F12, 아이스코베의 변형된 둘베코의 배지 (Iscove's Modified Dulbecco's Media) 및 최소 필수 배지 (MEM), 햄스 F-10, 햄스 F-12, 배지 199, 및 RPMI 1640 배지를 포함한다.
예를 들어, 상기 기본 배지는 DMEM/F12 및/또는 RPMI 1640일 수 있다.
필요에 따라, 무혈청 배양에 대해 최적화되고 이미 인슐린을 포함하는 어드밴스드 DMEM/F12 또는 어드밴스드 RPMI가 사용된다.
장 오가노이드의 분화
전분화능 줄기 세포로부터의 장 오가노이드의 분화는 1) 전분화능 줄기세포로부터 Definitive endoderm(DE) 세포로의 분화 과정, 2) Definitive endoderm(DE) 세포로부터 Hindgut(HG)의 분화 과정 및 3) Hindgut(HG)으로부터 (성숙) 장 오가노이드로의 분화 과정을 거친다.
1) 전분화능 줄기세포로부터 완전 내배엽 (Definitive endoderm; DE) 세포로 분화
전분화능 줄기 세포에서 Definitive endoderm(DE) 세포로의 분화 과정에 하나 이상의 성장 인자가 사용된다.
구체적으로, Activin A/nodal signaling activation 또는 Phosphatidylinositol 3-kinase(PI3K) signaling inhibition에 영향을 미칠 수 있는 성장인자 등을 사용할 수 있다.
예를 들어, 분화 과정에서 사용되는 하나 이상의 성장 인자에는 TGF-ß 수퍼 패밀리에서의 성장 인자가 포함될 수 있다. 하나 이상의 성장 인자는 성장 인자의 TGF-ß 수퍼 패밀리의 Nodal/Activin 및/또는 BMP 서브 그룹을 포함할 수 있다.
일부 측면에서, 하나 이상의 성장 인자는 Nodal, Activin A, Activin B, BMP4, Wnt3a, bFGF 또는 임의의 이들 성장 인자의 조합으로 이루어진 군에서 선택된다.
일부 측면에서, 전분화능 줄기 세포는 하나 이상의 성장 인자로 6 시간 이상; 12 시간 이상; 18 시간 이상; 24 시간 이상; 36 시간 이상; 48 시간 이상; 60 시간 이상; 72 시간 이상; 84 시간 이상; 96 시간 이상; 120 시간 이상; 150 시간 이상; 180시간 이상; 또는 240 시간 이상 처리된다. 일부 측면에서, 배아 줄기 세포 또는 iPSC는 10ng/ml 이상; 20ng/ml 이상; 50ng/ml 이상; 75ng/ml 이상; 100ng/ml 또는 그 이상; 120ng/ml 또는 그 이상; 150ng/ml 이상; 200ng/ml 이상; 500ng/ml 이상; 1,000ng/ml 이상; 1,200ng/ml 이상; 1,500ng/ml 이상; 2,000ng/ml 이상; 5,000ng/ml 이상; 7,000ng/ml 이상; 10,000ng/ml 또는 그 이상; 또는 15,000ng/ml 이상의 농도로 상기 하나 이상의 성장 인자로 처리된다. 일부 측면에서, 성장 인자의 농도는 처리 과정 중에 일정한 수준으로 유지된다. 성장 인자의 농도는 처리 과정 동안 변경될 수 있다.
즉, Nodal, Activin A, Activin B, BMP4, bFGF 및 Wnt3a로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 전분화능 줄기세포에 처리하여 완전 내배엽 세포로 분화하는 단계;를 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, Activin A를 배아 줄기세포 또는 유도 만능 줄기세포에 처리하여 완전 내배엽 세포로 분화하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 일실시양태에 따르면, 전분화능 줄기세포로부터 Definitive endoderm(DE) 세포로 분화는 Activin A를 사용할 수 있다. 이러한 분화에 있어서, 이에 한정되지 않으나 예를 들어, 10 ng/ml 내지 500ng/ml의 Activin A가 사용될 수 있다. 보다 구체적으로, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500 ng/ml의 Activin A가 사용될 수 있다. 보다 구체적으로, 이에 한정되지 않으나 6 시간 내지 120 시간, 12 시간 내지 100시간으로 배양될 수 있다.
본 발명의 일실시양태에 따르면, 필요에 따라 성장 인자는 다양한 농도를 갖는 소 태아 혈청(FBS)을 포함하는 배지에 현탁된다. 예를 들어, 0.1, 0.2, 0.3, 0.5, 1.0, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0 % 와 같이 성장에 적합한 임의의 소 태아 혈청(FBS 또는 FCS), 1x B-27TM Supplement, serum free를 포함할 수 있다.
필요에 따라, micropatterned substrate/plate (예를 들어, Aggrewell, EZSPHERE) 위에서 수행되어 Aggregation(예를 들어, 스페로이드) 형태로 제작될 수 있고, 세포외기질(ECM)과 접촉하여 배양시킬 수 있다. 세포외 기질은 본 명세서 내 기재된 사항을 모두 포함하여, 본 분화 방법에 적용시킬 수 있다.
2) Definitive endoderm(DE) 세포로부터 Hindgut(HG)으로 분화
액티빈, 바람직하게 액티빈 A에 의해 유도되는 완전 내배엽(DE)은 FGF/Wnt 신호에 의해 Hindgut(HG)으로 분화 단계를 거칠 수 있다.
FGF 및 Wnt 리간드는 iPSC 또는 ESC에서 발달된 DE를 직접 분화를 통해 후장(Hindgut)으로 분화할 수 있다.
후장(Hindgut) 또는, Mid-hindgut으로 분화는 micropatterned substrate/plate (예를 들어, Aggrewell, EZSPHERE) 위에서 수행되어 Aggregation 형태로 제작되거나 bioreactor 내에서 3차원 배양 (예를 들어, Suspension)을 통해 수행될 수도 있다. Serum-free 분화의 경우, 태아 소 혈청 (FBS 또는 FCS) 대신, B-27이 첨가되고, 추가적으로 Activin A, FGF, bFGF, BMP-4, LY294002(PI3K inhibitor), CHIR99021(GSK3 inhibitor) 및 Retinoic acid가 추가될 수 있다.
임의의 FGF 리간드와 조합하여 임의의 Wnt 신호 전달 단백질의 발현을 변경하면 본원에 기술된 바와 같은 직접적인 분화를 일으킬 수 있다.
Wnt 신호 전달 경의 조절제/활성화제에는 Wnt1, Wnt2, Wnt2b, Wnt3, Wnt3a, Wnt4, Wnt5a, Wnt5b, Wnt6, Wnt7a, Wnt7b, Wnt8a, Wnt8b, Wnt9a, Wnt9b, Wnt10a, Wnt10b, Wnt11 및 Wnt16이 포함된다. 일부 측면에서, 경로의 조절은 전술한 경로를 활성화시키는 소분자 조절제 또는 단백질 조절제 또는 상기 경로를 활성화시키는 단백질의 사용을 통해 이루어질 수 있다. 예를 들어, Wnt 경로의 소형 분자 조절제에는, 비제한적으로, 염화 리튬; 2-아미노-4,6-이중 치환된 피리미딘(헤테로) 아릴피리미딘; IQ1; QS11; NSC668036; DCA 베타 카테닌; 2-아미노-4-[3,4-(메틸렌디옥시)-벤질-아미노]-6-(3-메톡시페닐) 피리미딘이 포함된다. Wnt 신호 전달의 예시적인 천연 억제제에는, 비제한적으로, Dkk1, SFRP 단백질 및 FrzB이 포함된다. 일부 측면에서, 외인성 분자에는, 비제한적으로, WAY-316606과 같은 소형 분자; SB-216763; 또는 BIO(6-브로모 인디루빈-3'-옥심)이 포함된다.
또한, Wnt 신호 전달 경로를 활성화시키는, GSK3를 억제하는 분자 또는 단백질이 포함된다.
예시적인 GSK3 억제제에는, 비제한적으로, LY2090314, BIO (6-브로모인디루빈-3'-옥심), SB216763 (3-(2,4-디클로로페닐)-4-(1-메틸-1H-인돌-3-일)-1H-피롤-2,5-디온), GSK-3ß 억제제 VII(α,4-디브로모아세토페논), L803-mts(Myr-N-GKEAPPAPPQSpP-NH2) 및 CHIR99021을 들 수 있다.
구체적으로, GSK3를 억제하는 Chiron/CHIR99021이 포함된다. GSK3 억제제는 약 0.1uM 내지 약 100uM, 또는 약 0.2uM 내지 약 50uM, 또는 약 0.3uM 내지 약 10uM의 양으로 처리될 수 있다.
섬유 아세포 성장 인자(Fibroblast growth factor, FGF)는 혈관 신생, 상처 치유 및 배아 발육과 관련된 성장인자군이다. 일부 측면에서, 임의의 FGF가 Wnt 신호 경로에서 유래된 단백질과 함께 사용될 수 있다는 것이 당업자에 의해 이해될 것이다.
일부 구현예에서, FGF 신호 전달 경로는 FGF1, FGF2, FGF3, FGF4, FGF10, FGF11, FGF12, FGF13, FGF14, FGF15, FGF16, FGF17, FGF18, FGF19, FGF20, FGF21, FGF22 및 FGF23로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 분자와 세포를 접촉시킴으로써 활성화된다.
일부 측면에서, DE 세포는 본원에 기재된 신호 전달 경로의 하나 이상의 조절제로 6 시간 이상; 12 시간 이상; 18 시간 이상; 24 시간 이상; 36 시간 이상; 48 시간 이상; 60 시간 이상; 72 시간 이상; 84 시간 이상; 96 시간 이상; 120 시간 이상; 150 시간 이상; 180 시간 이상; 200 시간 이상, 240 시간 이상; 270 시간 이상; 300 시간 이상; 350 시간 이상; 400 시간 이상; 500 시간 이상; 600 시간 이상; 700 시간 이상; 800 시간 이상; 900 시간 이상; 1,000 시간 이상; 1,200 시간 이상; 또는 1,500 시간 이상 동안 처리된다.
일부 측면에서, DE 세포는 10ng/ml 이상; 20ng/ml 이상; 50ng/ml 이상; 75ng/ml 이상; 100ng/ml 또는 그 이상; 120ng/ml 또는 그 이상; 150ng/ml 이상; 200ng/ml 이상; 500ng/ml 이상; 1,000ng/ml 이상; 1,200ng/ml 이상; 1,500ng/ml 이상; 2,000ng/ml 이상; 5,000ng/ml 이상; 7,000ng/ml 이상; 10,000ng/ml 또는 그 이상; 또는 15,000ng/ml 이상의 농도로 본원에 기재된 FGF 신호 전달 경로의 하나 이상의 분자로 처리된다.
일부 측면에서, 신호 전달 분자의 농도는 처리 과정 중에 일정하게 유지된다. 다른 측면에서, 신호 전달 경로의 분자의 농도는 처리 과정 동안 변화된다.
일부 측면에서, 본 발명에 따른 신호 전달 분자는 DMEM 배지에 현탁된다.
일부 측면에서, 본 발명에 따른 신호 전달 분자는 소 태아 혈청(fetal bovine serum, FBS 또는 FCS)을 포함하는 배지에 현탁된다.
Wnt 및 FGF 신호 전달 경로의 임의의 분자를 포함하는, 본원에 기재된 신호 경로의 임의의 공지된 분자에, 단독으로 또는 조합하여 적용 가능하다.
즉, FGF 및 Wnt 리간드를 처리하여 완전 내배엽 세포로부터 후장으로 분화하는 단계;를 포함한다. 보다 구체적으로, FGF 및 CHIR99021를 처리하여 완전 내배엽 세포로부터 후장으로 분화하는 단계를 포함한다.
본 발명의 일실시양태에 따르면, Definitive endoderm(DE)로부터 후장으로 분화는 GSK3 억제제 및 섬유 아세포 성장 인자를 통해 수행될 수 있다. 보다 구체적으로, CHIR99021 및 FGF4를 처리하여 3차원 배양을 통해 후장으로 분화를 진행할 수 있다.
이러한 분화에 있어서, 이에 한정되지 않으나 예를 100ng/ml, 120ng/ml, 150ng/ml, 200ng/ml, 500ng/ml, 1,000ng/ml; 1,200ng/ml의 FGF4가 사용될 수 있다. 또한, CHIR99021가 약 0.3uM 내지 약 10uM의 양으로 사용될 수 있다. 필요에 따라, 소 태아 혈청(FBS 또는 FCS)을 포함하는 배지에 현탁된다. 예를 들어, 0.1, 0.2, 0.3, 0.5, 1.0, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0 % 와 같이 성장에 적합한 임의의 소 태아 혈청(FBS 또는 FCS)을 포함할 수 있다.
보다 구체적으로, 이에 한정되지 않으나 24 시간 이상; 36 시간 이상; 48 시간 이상; 60 시간 이상; 72 시간 이상; 84 시간 이상; 96 시간 이상; 120 시간 이상; 150 시간 이상; 180 시간 이상으로 배양될 수 있다.
3-1) Hindgut(HG)으로부터 장 오가노이드로 분화
Hindgut(HG)으로부터 장 오가노이드로 분화에 있어서는 BMP 억제제, Wnt 작용물질 및 수용체 타이로신 키나제 리간드를 필수적으로 포함한다. 이에 추가적으로, Rock 억제제, B27, N-아세틸시스테인, N2, 니코틴아미드, 가스트린, IGF-1, heregulin-1ß, bFGF, A-83-01 및/또는 SB202190 중에서 선택된 하나 이상의 추가적인 성분을 포함할 수 있다.
BMP 억제제는 BMP 분자에 결합하여 복합체를 형성하는 작용제이다. 상기 억제제는 BMP 수용체에 결합하고 BMP 리간드의 수용체에의 결합을 방지하는 작용제, 예를 들어 상기 수용체에 결합하는 항체일 수 있다. BMP 억제제는 단백질 또는 소분자일 수 있으며 천연, 변형 및/또는 부분적으로 또는 전적으로 합성일 수 있다. BMP 억제제는 노긴(Noggin), DAN, 또는 써베루스 및 그렘린(R&D systems)을 포함하는 DAN-유사 단백질일 수 있다. 바람직한 BMP 억제제는 노긴이다. 노긴을 임의의 적합한 농도로 사용할 수 있다. 약 10 ng/㎖ 내지 약 100 ng/㎖의 노긴을 포함할 수 있다. 예를 들어, 배양 배지는 약 10 ng/㎖, 20 ng/㎖, 30 ng/㎖, 40 ng/㎖, 50 ng/㎖ 이상의 노긴을 포함할 수 있다. 바람직하게 대략 10 내지 100 ng/㎖의 노긴을 포함할 수 있다.
Wnt 작용물질은 바람직하게 R-스폰딘 1, R-스폰딘 2, R-스폰딘 3 또는 R-스폰딘 4일수 있다. 상기 배양 배지에 50 ng/㎖, 100 ng/㎖, 200 ng/㎖, 300 ng/㎖, 500 ng/㎖, 600 ng/㎖, 700 ng/㎖, 800 ng/㎖, 900 ng/㎖, 1 ug/㎖, 1.5 ug/㎖ 또는 2 ug/㎖ 이상의 농도로 포함될 수 있다. 바람직하게 대략 50 내지 800 ng/㎖의 R-스폰딘 1을 포함할 수 있다.
수용체 타이로신 키나제 리간드는 예를 들어 상피 성장 인자(EGF), 형질전환 성장인자-알파(TGF-알파), 기본 섬유아세포 성장 인자(bFGF), 뇌-유래된 신경영양 인자(BDNF), 뉴레귤린 (NRG 1-4), 간세포 성장 인자(HGF) 및 각질세포 성장 인자(KGF)로 이루어진 성장 인자 중에서 선택된 분열촉진성 성장 인자이다.
바람직하게 EGF이다. EGF는 다양한 배양된 외배엽 및 중배엽 세포에 대한 효능 있는 분열촉진인자이며 생체 내 및 시험관 내에서 특정한 세포 및 세포 배양물 중의 일부 섬유아세포의 분화에 충분한 효과를 갖는다. 바람직한 농도는 10 ng/㎖ 20 ng/㎖, 25 ng/㎖, 30 ng/㎖, 40 ng/㎖, 45 ng/㎖, 또는 50 ng/㎖, 100 ng/㎖, 200 ng/㎖, 300 ng/㎖, 500 ng/㎖, 600 ng/㎖, 700 ng/㎖ 이상이다. 보다 바람직한 농도는 50 ng/㎖ 이상 300 ng/㎖ 이하이다.
위와 같은 BMP 억제제, Wnt 작용물질 및 수용체 타이로신 키나제 리간드의 필수적 조성 이외에 추가되는 인자들은 장 오가노이드의 알려진 임의의 인자의 추가를 더 포함하는 것으로 해석될 수 있다. 바람직하게 분화를 목적하는 형태에 따라, Rock 억제제, B27, N-아세틸시스테인, N2, 니코틴아미드, 가스트린, IGF-1, heregulin-1ß, bFGF, A-83-01 및/또는 SB202190 중에서 선택된 하나 이상의 추가적인 성분을 포함할 수 있다.
Rock 억제제는 바람직하게는 R-(+)-트랜스-4-(1-아미노에틸)-N-(4-피리딜)사이클로헥산카복스아미드 다이하이드로클로라이드 모노하이드레이트(Y-27632, Sigma-Aldrich), 5-(1,4-다이아제판-1-일설포닐)아이소퀴놀린(파수딜 또는 HA1077, Cayman Chemical), 및 (S)-(+)-2-메틸 1-[(4-메틸-5-아이소퀴놀리닐)설포닐]-헥사하이드로-1H-1,4-다이아제핀다이하이드로클로라이드(H-1 152, Tocris Bioschience) 중에서 선택된다. B27, N-아세틸시스테인, N2, 니코틴아미드, 가스트린, IGF-1, heregulin-1ß, bFGF, A-83-01 및/또는 SB202190은 예를 들어, 오가노이드의 배양 효율 및 수명을 개선시키고 세포의 증식을 조절하며 DNA의 안정성 등을 돕기 위해 필요에 따라 추가될 수도 있다.
바람직하게, B27이 추가로 더 포함될 수 있다. 보다 구체적으로, B27 보충제는 'B27 보충제 마이너스 비타민 A'(또한 본 명세서에서 “비타민 A가 없는 B27” 또는 “B27 wo VitA”로서 지칭되며; 인비트로젠(Invitrogen)(미국 캘리포니아주 칼스바드 소재); www.invitrogen.com; 현재 카탈로그 번호 12587010으로부터; 및 PAA 레보라토리즈(PAA Laboratories) GmbH(오스트리아 파싱 소재); www.paa.com; 카탈로그 번호 F01-002; 문헌[Brewer et al. (1993) J Neurosci Res.35(5):567-76]]으로부터 입수할 수 있다)이다. 일부 실시양태에서, 상기 B27 보충제는 하기 목록 중에서 선택된 성분들 중 하나 이상을 포함하는 제네릭 제형으로 대체될 수 있다: 비오틴, 콜레스테롤, 리놀레산, 리놀렌산, 프로제스테론, 푸트레신, 레티닐 아세테이트, 나트륨 셀레나이트, 트리-요오도티로닌(T3), DL-알파토코페롤(비타민 E), 알부민, 인슐린 및 트랜스페린.
필요에 따라, 상기 Hindgut으로부터 장 오가노이드로 분화시에 세포외기질(ECM)과 접촉하여 배양시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 상기 ECM은 3차원 기질이다. 일부 실시양태에서, 상기 후장은 ECM 중에 포매된다. 본 발명의 배양 배지는 3차원 ECM내로 확산될 수 있다.
Polymer Hydrogels to Guide Organotypic and Organoid Cultures(Adv Funct Mater, 2020, Valentina Magno et al.) 및 Engineering the Extracellular Matrix for Organoid Culture (Int J Stem Cells. 2022 Feb 28;15(1):60-69)에 개시된 ECM에 관한 사항은 본 발명의 참조로 포함된다.
세포외 기질은 이에 한정되지 않으나, 예를 들어 피브린, 라미닌, 콜라겐 및/또는 알지네이트를 포함한다. 세포외 기질-생성 세포의 예는 주로 콜라겐 및 프로테오글리칸을 생성시키는 연골세포, 주로 IV형 콜라겐, 라미닌, 간질성 프로콜라겐 및 피브로넥틴을 생성시키는 섬유아세포, 및 주로 콜라겐(I, III, 및 V형), 콘드로이친 설페이트 프로테오글리칸, 히아루론산, 피브로넥틴 및 테나신-C를 생성시키는 결장 근섬유아세포이다. 이들은 “자연적으로 생성된 ECM”이다. 자연적으로 생성된 ECM은 상업적으로 제공될 수 있다. 상업적으로 입수가능한 세포외 기질의 예는 세포외 기질 단백질(인비트로젠) 및 엔젤브레쓰-홀름-스웜(EHS) 마우스 육종 세포로부터의 기저막 제제(예를 들어 컬트렉스(Cultrex)(등록상표) 기저막 추출물(트레비젠 인코포레이티드(Trevigen, Inc.), I형 콜라겐(인비트로젠), 비트로젤(Vitrogel)(등록상표)(TheWell Bioscience Inc.), 리제닉스(Regenix)(등록상표)(Cellartgen Inc.), Geltrex(ThermoFisher) 또는 마트리젤(Matrigel)(상표)(BD 바이오사이언시즈))를 포함한다.
3-2) Hindgut(HG)으로부터 성숙 장 오가노이드(mature hIO)로 분화
본 발명에서 “성숙” 혹은 “성숙(maturation)된” 장 오가노이드 (mature hIO)란 미성숙 장 오가노이드와 반대되는 용어로, 성체의 소장이 갖추고 있는 소화기능, 수송시스템, 면역기능 및 숙주방어에 필요한 유전자가 발현된 장 오가노이드를 의미한다. 구체적으로 성숙한 소장은 소장 줄기세포 마커 유전자, 소화기능, 수송시스템, 광범위한 면역기능 및 숙주방어에 필요한 유전자의 발현증진을 포함한 독특한 특징을 가지고 있다. 특히, 생리학적 및 약동학적 역할에 관여하는 수송체의 적절한 발현 및 활성은 약물의 흡수, 분배 및 배설과 같은 정상적인 소장 기능의 전제 조건이다. 특히, 본 발명에 따른 성숙(maturation)된 장 오가노이드는 생착 측면에서 개선된 효능을 가진다. 보다 구체적으로, 성숙된 장 오가노이드를 구성하는 장 상피 세포층 주변에 존재하는 기질 세포층이 가지고 있는 혈관 내피 관련 인자의 발현이 높은 특성과 기질 세포의 특성인 다양한 분비 인자에 의한 것일 수 있다.
또한, 성숙 장 오가노이드는 장 오가노이드 상에 존재하는 budding structure가 발달한 특징을 나타낼 수 있다. 또한, Goblet cell의 더 높은 발달을 나타내어 장 줄기세포의 분화능 측면에서 높은 효율을 나타낸다.
Hindgut으로부터 성숙 장 오가노이드로의 분화는 상기 장 오가노이드로의 분화 인자로 언급된 사항 이외에 in vivo 장내 환경을 모방하기 위해 공배양에 사용되거나, T-림프구 공배양에서 분비되는 사이토카인 처리(즉, T-림프구 분비되는 사이토카인 처리 및/또는 STAT3 및 mTOR 신호전달 경로 활성화제 처리를 필수적으로 포함한다.
보다 구체적으로, T-림프구에 의해 분비되는 사이토카인은 IL-2(interleukin-2), IL-22(interleukin-22), IL-6(interleukin-6), IL-1ß(interleukin-1ß), IL-11(interleukin-11), EGF(epidermal growth factor), OSM(oncostatin M), 및 IL-10(interleukin-10)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으며, 더욱 구체적으로는 IL-2일 수 있다.
또한, Hindgut으로부터 성숙 장 오가노이드로의 분화는 상기 장 오가노이드로의 분화 인자로 언급된 사항 이외에 STAT3 및 mTOR 신호전달 경로 활성화제를 처리하여 장 오가노이드의 성숙화를 수행할 수 있다. 예를 들어, 콜리베린(colivelin) 처리하여 장 오가노이드의 성숙화를 수행할 수 있다.
또한, NRG-1(Neuregulin-1) 처리하여 장 오가노이드의 성숙화를 수행할 수 있다.
즉, IL-2, IL-22, IL-6, IL-1ß, IL-11, EGF, OSM, NRG-1 및, IL-10으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 사이토카인, NRG-1 및/또는 콜리베린(colivelin)이 배지 구성요소로 포함된 것일 수 있다.
본 발명에서 미성숙 장 오가노이드란 in vivo 장내 환경을 모방하기 위해 공배양을 사용되거나, T-림프구 공배양에서 분비되는 사이토카인, 또는 STAT3 및 mTOR 신호전달 경로 활성화제가 처리되지 않은 장 오가노이드를 의미한다. 바람직한 농도는 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 2.0, 3.0 ng/ml 이상이다. 보다 바람직하게, 0.3 내지 2.0 ng/ml일 수 있다.
즉, BMP 억제제, Wnt 작용물질, 수용체 타이로신 키나제 리간드 및 T-림프구 분비되는 사이토카인을 후장에 처리하여 장 오가노이드를 성숙시키는 단계를 포함한다. 보다 구체적으로, BMP 억제제로서 노긴;
Wnt 작용물질로서 R-스폰딘 1, R-스폰딘 2, R-스폰딘 3 및 R-스폰딘 4로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상;
수용체 타이로신 키나제 리간드로서 상피 성장 인자(EGF); 및
T-림프구 분비되는 사이토카인으로 IL-2, IL-22, IL-6, IL-1ß, IL-11, EGF, OSM, 및 IL-10로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상 NRG-1및/또는 콜리베린;을 후장에 처리하여 장 오가노이드를 성숙하는 단계;를 포함한다.
본 발명의 일실시양태에 따르면, Hindgut으로부터 성숙 장 오가노이드로 분화는 노긴(Noggin), EGF 및 R-스폰딘 1을 필수로 포함하고, 이에 성숙 장 오가노이드로 분화를 위한 사이토카인 및/또는 콜리베린을 첨가하여 배양하는 것일 수 있다. 이러한 사이토카인 및/또는 콜리베린의 첨가는 Hindgut의 배양 후 장 오가노이드의 배양 단계로 배지 교환시, 24 시간, 이내, 20 시간 이내, 16시간 이내, 12시간 이내, 8시간 이내, 4시간 이내, 2시간 이내, 1시간 이내 또는 동시에 사이토카인이 함께 첨가되는 것일 수 있다. 위와 같이 빠른 사이토카인의 첨가는 장 오가노이드의 성숙, 특히 생착 증진을 위한 혈관 내피 인자 발현 증진 등에 보다 큰 장점을 가질 수 있다.
또한, 앞서 언급된 추가적인 Rock 억제제, B27, N-아세틸시스테인, N2, 니코틴아미드 및 가스트린 중에서 선택된 하나 이상의 추가적인 성분을 포함할 수 있다.
성숙 장 오가노이드(Mature human intestinal organoid, mature hIO; Mat-hIO)
본 발명에서 “성숙(maturation)” 혹은 “성숙된” 장 오가노이드 (mature hIO)란 성체의 소장이 갖추고 있는 소화기능, 수송시스템, 면역기능 및 숙주방어에 필요한 유전자가 발현된 장 오가노이드를 의미한다. 구체적으로 성숙한 소장은 소장 줄기세포 마커 유전자, 소화기능, 수송시스템, 광범위한 면역기능 및 숙주방어에 필요한 유전자의 발현증진을 포함한 독특한 특징을 가지고 있다. 특히, 생리학적 및 약동학적 역할에 관여하는 수송체의 적절한 발현 및 활성은 약물의 흡수, 분배 및 배설과 같은 정상적인 소장 기능의 전제 조건이다.
본 발명에 따른 성숙 장 오가노이드는 전분화능 줄기세포로부터 유래된 장 오가노이드로부터 제조된 것이다.
본 발명에 따른 전분화능 줄기세포 유래 장 오가노이드는 장 오가노이드 상피층주변에 기질 세포층을 가지는 것을 특징으로 한다. 따라서, 중간엽 기질 세포의 마커의 발현 수준이 높으며, 이러한 중간엽 기질세포의 마커는 예를 들어, αSMA, VIM, DESMIN 등을 들 수 있으며, 이에 한정되지 않는다. 상기 αSMA은 중간엽 기질세포의 마커 뿐만 아니라 혈관주위세포(pericyte) 마커로도 기능할 수 있다.
일반적인 성체 줄기세포 유래 장 오가노이드 또는 환자(조직) 유래된 장 오가노이드는 장 오가노이드로 분화 유도시 주변 기질 세포층을 가지지 못한다. 반면, 본 발명에 따른 전분화능 줄기세포 유래 장 오가노이드는 장 오가노이드 주변 기질 세포층을 가짐으로써 기존에 알려진 성체 유래 장 오가노이드와 다른 특성을 나타낸다.
본 발명에 따른 성숙화를 위한 사이토카인 또는 콜리베린이 처리되어 분화가 진행된 성숙 장 오가노이드는 성숙화 시키지 않은 전분화능 줄기세포 유래 미성숙 장 오가노이드와 대비하여 생착 측면에서 개선된 효능을 가진다. 보다 구체적으로, 성숙된 장 오가노이드의 주변 기질 세포층은 혈관 내피 관련 인자의 발현이 높은 특성을 나타낼 수 있다.
보다 구체적으로, 성숙된 장 오가노이드는 주변 기질 세포층을 포함하는 성숙된 장 오가노이드이며, 상기 주변 기질 세포층은 장 유래 중간엽 기질세포(mesenchymal stromal cell, MSC)을 포함한다.
성숙된 장 오가노이드는 전분화능 줄기세포(PSC)로부터 유래된다.
성숙된 장 오가노이드는 VIL1, KRT20, CHGA, MUC13, LYZ, OLFM4, SI, LCT 및 DPP4로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 인자의 발현이 전분화능 줄기세포 유래 미성숙 장 오가노이드와 대비하여 높은 것을 특징으로 한다. 보다 구체적으로, 성숙된 장 오가노이드는 KRT20, CHGA, MUC13, LYZ, 및 OLFM4로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자 수준 발현이 전분화능 줄기세포 유래 미성숙 장 오가노이드와 대비하여 2fold 이상 차이가 나는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 성숙된 장 오가노이드는 특히 Xeno-free 조건 하에서도 세포 스페로이드 형성, 낮은 세포-기질 상호작용 등을 통하여 장 오가노이드의 유지 및 분화가 잘 이루어지며, 이를 통해 임상적 적용이 원활한 장 오가노이드를 제공할 수 있다.
본 발명에 따른 성숙된 장 오가노이드는 혈관 내피 관련 인자 혹은 혈관 내피세포관련 인자의 발현이 높은 특성을 나타낼 수 있다. 예를 들어, hVE-Cad, PECAM-1 및 VEGF로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 혈관 내피 세포 관련 인자의 발현 수준이 높은 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 성숙된 장 오가노이드는 혈관 마커인 hCD31, ANGPT1 및 KDR로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 발현이 성체 줄기세포 유래 오가노이드 또는 전분화능 줄기세포 유래 미성숙 장오가노이드와 대비하여 높은 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 성숙된 장 오가노이드는 소장-특이적 마커의 발현 수준이 높은 것을 특징으로 한다. 이러한 소장-특이적 마커는 예를 들어, VIL1, KRT20, CHGA, LYZ, DEFA5, OLFM4, MUC2, MUC13, DPP4, LCT, SLC5A1, CREB3L3 등을 들 수 있으며, 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 따른 성숙된 장 오가노이드는 장 오가노이드 주변에 기질 세포층에 중간엽 기질세포를 포함하며, 특히 혈관 세포(hCD31+)의 특성을 나타내는 세포를 다수 포함한다. 또한, 성체 줄기세포 유래 오가노이드 또는 전분화능 줄기세포 유래 미성숙 장 오가노이드와 대비하여 Vascular development, Mesenchyme development, Epithelial cell proliferation, Muscle tissue development 관련 그룹의 발현 수준이 매우 높다.
특히, 중간엽 기질세포 관련 마커의 높은 발현 수준과 함께 hCD31+의 높은 발현 수준을 특징으로 한다.
또한, 성숙된 장 오가노이드는 장 오가노이드 주변에 기질 세포층 및/또는 이에 존재하는 중간엽 기질세포는 Endothelial cell type 특성이 있음을 특징으로 한다.
또한, 성숙된 장 오가노이드는 장 오가노이드 주변에 기질 세포층 및/또는 이에 존재하는 중간엽 기질세포는 성체 줄기세포 유래 장 오가노이드 또는 전분화능 줄기세포 유래 미성숙 장오가노이드와 대비하여 혈관 생성 인자, 혈관 내피 관련 인자 및/또는 혈관 분비인자의 높은 발현 수준을 나타낸다.
보다 구체적으로, 혈관 생성 인자 또는 혈관 내피 관련 인자는 CD31, CDH5, ECSCR, LYVE1 및 IGF2로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다. 혈관 분비 인자인 VEGF, Angiogenin, DKK1, EGF, Osteopontin, ICAM-1, VCAM-1, IGFBP3, MCP-1 및 Activin A로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다. 본 발명에 따른 성숙된 장 오가노이드는 혈관 생성 인자, 혈관 내피 관련 인자 및/또는 혈관 분비 인자를 높은 수준으로 포함함으로써 생착에 큰 도움을 줄 수 있다.
위와 같이 장 오가노이드 주변에 기질 세포층을 가지는 성숙 장 오가노이드는 오가노이드 주변의 주변 세포층을 함께 이식함에 따른 높은 생착능 및 오가노이드 내의 장 줄기세포의 우수한 재생능을 통해 치료적으로 우수한 효능을 나타낼 수 있다.
성숙 장 오가노이드 유래 주변 기질 세포층
기존 장 오가노이드와 관련된 기술들에서는 장 오가노이드의 주변 환경에 대한 필요성, 기질세포/면역세포 등과의 상호작용 등에 대하여 충분한 연구가 이루어지지 않았다.
특히, 많은 연구 개발이 진행되고 있는 성체 줄기세포 유래 오가노이드 기술에서는 오가노이드 주변 환경에서 주변 기질 세포층이 생성되지 않거나 충분하지 않다. 또한, 전분화능 줄기세포를 활용하더라도 이러한 주변 미세환경, 특히 주변 기질 세포층에 대한 조절을 목적하는 기술은 확인되는 바가 없고 이에 대해 보고된 바도 없다.
본 발명은 상기 언급된 성숙 장 오가노이드의 제조 공정을 통하여 성숙 장 오가노이드 유래 주변 기질 세포층의 기능 및 특성을 조절하여 높은 생착능을 나타낼 수 있게 한다.
이러한 주변 기질 세포층은 앞서 언급된 중간엽 기질세포를 포함하는 것을 특징으로 한다. 또한, 중간엽 기질세포를 포함하여 주변 기질 세포층은 혈관 내피 또는 혈관 내피 세포 관련 인자의 발현 수준이 높은 것을 특징으로 한다.
또한, 주변 기질 세포층은 평활근세포(smooth muscle cell), 섬유아세포(fibroblast), 근섬유아세포(myofibroblas), 텔로사이트(telocyte) 및 혈관주위세포(pericyte)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 세포를 더 포함할 수 있다.
이러한 주변 기질 세포층은 장 오가노이드의 생착에 도움을 주며, 혈관 생성에 도움을 주며, 면역 세포, 기질 세포 등과의 상호 작용을 통하여 빠른 회복 및 치료 효능을 나타낼 수 있다.
성숙 장 오가노이드 유래 중간엽 기질 세포와 이의 분리 및 배양
본 발명은 성숙 장 오가노이드 유래 주변 기질 세포층에서 분리된(유래된) 중간엽 기질 세포와 이의 분리 및/또는 배양 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 중간엽 기질 세포(mesenchymal stromal cell)는 전분화능 줄기세포(PSC)으로부터 분화된 성숙 장 오가노이드의 주변 기질 세포층 유래 중간엽 기질 세포이다.
전분화능 줄기세포(PSC)으로부터 분화된 성숙 장 오가노이드의 주변 기질 세포층 유래 중간엽 기질 세포의 배양 방법은 아래 단계를 거처 수행될 수 있다:
(a) 성숙 장 오가노이드를 단일 세포 또는 작은 세포 덩어리로 분리하는 단계;
(b) 분리된 단일 세포 또는 작은 세포 덩어리를 젤라틴, 피브린 및 콜라겐 I으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나로 코팅된 배양 배지에 씨딩하는 단계; 및
(c) 상기 씨딩된 세포에서 부착되어 배양된 세포만을 수득하는 단계.
상기 (a) 단계에서 성숙 장 오가노이드는 앞서 언급된 성숙된 특징을 나타내는 장 오가노이드를 의미한다. 이러한 장 오가노이드를 단일 또는 작은 세포 덩어리로 통상의 알려진 단일세포로의 분리 방법으로 분리한다. 본 발명의 일실시양태에 따르면, 세포외기질로부터 성숙된 장 오가노이드를 분리하고 장 오가노이드 주변에 존재하는 세포층으로부터 세포를 얻어 이를 Trypsin-EDTA 등으로 처리하여 단일 세포를 분리한다.
상기 (b) 단계에서, 분리된 단일 세포 또는 작은 세포 덩어리는 젤라틴, 피브린 및 콜라겐 Ⅰ으로 이루어진 군으로부터 선택되는 코팅 배지에 씨딩한 후 이를 배양하는 것일 수 있다.
상기 (c) 단계에서, 단일 세포 또는 작은 세포 덩어리를 젤라틴, 피브린 및 콜라겐 Ⅰ으로 이루어진 군으로부터 선택되는 코팅 배지에 배양하는 경우 중간엽 기질세포의 특징을 나타내는 세포들만이 코팅 배지에 부착되어 배양된다.
이러한 부착 배양된 세포들은 중간엽 기질세포로써의 특징을 나타내며, 앞서 언급된 성숙된 장 오가노이드 유래 중간엽 기질 세포의 특성이 유지 및 발현되다. 성숙된 장 오가노이드 유래 중간엽 기질 세포의 배양에 있어서는 통상의 알려진 배양 배지를 사용할 수 있다. 바람직하게, B27, EGF, IL-2 또는 이들 모두를 포함하는 배지에서 배양할 수 있다.
특히, 본원 발명에 따른 배지 조성은 Xeno-free 조건에서도 중간엽 기질세포의 성장 및 유지에 우수한 효과를 나타낸다.
또한, 상기 전분화능 줄기세포(PSC)으로부터 분화된 성숙 장 오가노이드의 주변 기질 세포층 유래 중간엽 기질 세포의 배양 방법은 (c) 단계 이후 (d) 상기 부착되어 배양된 세포를 계대 배양하는 단계를 더 포함할 수도 있다.
상기 성숙 장오가노이드는 예를 들어 하기 단계를 통해 제조될 수 있다:
1) Nodal, Activin A, Activin B, BMP4 및 Wnt3a로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 전분화능 줄기세포에 처리하여 완전 내배엽 세포로 분화하는 단계;
2) FGF 및 Wnt 리간드를 처리하여 완전 내배엽 세포로부터 후장으로 분화하는 단계; 및
3) BMP 억제제, Wnt 작용물질, 수용체 타이로신 키나제 리간드 및 T-림프구 분비되는 사이토카인을 후장에 처리하여 장 오가노이드를 성숙하는 단계.
보다 구체적으로, 상기 1) 단계는 Activin A를 배아 줄기세포 또는 유도 만능 줄기세포에 처리하여 완전 내배엽 세포로 분화하는 단계를 포함할 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 2) 단계는 FGF 및 CHIR99021를 처리하여 완전 내배엽 세포로부터 후장으로 분화하는 단계를 포함할 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 3) 단계는 BMP 억제제로서 노긴, Wnt 작용물질로서 R-스폰딘 1, R-스폰딘 2, R-스폰딘 3 및 R-스폰딘 4로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상, 수용체 타이로신 키나제 리간드로서 상피 성장 인자(EGF) 및 T-림프구 분비되는 사이토카인으로 IL-2, IL-22, IL-6, IL-1ß, IL-11, EGF, OSM 및 IL-10으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 사이토카인을 후장에 처리하여 장 오가노이드를 성숙하는 단계;를 포함할 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 T-림프구 분비되는 사이토카인은 IL-2일 수 있다.
본 발명은 또한 상기 배양 공정을 통해 제조된 성숙 장 오가노이드의 주변 기질 세포층 유래 중간엽 기질 세포를 제공한다.
본 발명은 또한 성숙 장 오가노이드의 주변 기질 세포층 유래 중간엽 기질 세포를 제공한다. 보다 바람직하게, 상기 배양 방법을 통해 수득된 성숙 장 오가노이드의 주변 기질 세포층 유래 중간엽 기질 세포를 제공한다.
상기 성숙 장 오가노이드의 주변 기질 세포층 유래 중간엽 기질 세포는 하기로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 특징을 나타낸다:
(a) 성체 유래 중간엽 줄기세포, 전분화능 줄기세포 유래 중간엽 줄기세포 및/또는 미성숙 장 오가노이드 유래 중간엽 기질세포와 대비하여 hCD31(PECAM1)의 증진된 발현 수준;
(b) 성체 유래 중간엽 줄기세포, 전분화능 줄기세포 유래 중간엽 줄기세포 및/또는 미성숙 장 오가노이드 유래 중간엽 기질세포와 대비하여 Vascular development, Mesenchyme development, Epithelial cell proliferation, 및/또는 Muscle tissue development 관련 인자의 증진된 발현 수준;
(c) 성체 유래 중간엽 줄기세포, 전분화능 줄기세포 유래 중간엽 줄기세포 및/또는 미성숙 장 오가노이드 유래 중간엽 기질세포와 대비하여 Endothelial cell type이 증진된 발현 수준;
(d) 성체 유래 중간엽 줄기세포, 전분화능 줄기세포 유래 중간엽 줄기세포 및/또는 미성숙 장 오가노이드 유래 중간엽 기질세포와 대비하여 Gene Ontology (GO) term enrichment상 Endothelial cell 특성 인자의 증진된 발현 수준;
(e) 성체 유래 중간엽 줄기세포, 전분화능 줄기세포 유래 중간엽 줄기세포 및/또는 미성숙 장 오가노이드 유래 중간엽 기질세포와 대비하여 혈관 생성 인자, 혈관 내피 관련 인자 및/또는 혈관 분비 인자의 증진된 발현 수준,
여기서, 혈관 생성 인자 및/또는 혈관 내피 관련 인자는 hCD31(PECAM1), CDH5, ECSCR, LYVE1, 및 IGF2로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상이며, 혈관 분비 인자는 Angiogenin DKK1, EGF, Osteopontin, ICAM-1, IGFBP3, VEGF, VCAM-1, MCP-1, 및 Activin A로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상이며; 및
(f) 계대 배양시 αSMA, VIM 및 DESMIN로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 발현 수준의 유지.
성숙 장 오가노이드의 주변 기질 세포층를 구성하는 성숙 장 오가노이드 유래 중간엽 기질 세포는 또한 하기의 특징을 추가적으로 나타낼 수 있다:
성체 유래 중간엽 줄기세포 대비 CD34, RSPO3, DLL1, WNT2B, HGF, FOXL1, NOG, GLI1, WNT9A, WNT3, GLI2, 및 DLL3로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 증가된 발현 수준(예시적으로 장 관련 증진 인자로 고려됨);
성체 유래 중간엽 줄기세포 대비 VWF, PECAM1, ANGPTL1, CD34, ICAM1 및 FLT1로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 증가된 발현 수준 (예시적으로 혈관 관련 증진 인자로 고려됨);
미성숙 장 오가노이드 유래 중간엽 줄기세포와 대비하여 NOG 및/또는 WNT9A의 증진된 발현 수준(예시적으로 장 관련 증진 인자로 고려됨); 및/또는
미성숙 장 오가노이드 유래 중간엽 줄기세포와 대비하여 CD31, CDH5, ECSCR, LYVE1, IGF2, FOXF1, CXCL14, BMP4, IGFBP3, APOA1, PDGFRA, FOXF2, PTCH1, VEGFA, NKX2-3, BMP5, ITGA8, NRG1, ADAM28, COL4A5, 및 DLL1 로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 증진된 발현 수준(예시적으로 혈관 관련 증진 인자로 고려됨).
본 발명에 따른 성숙 장 오가노이드 유래 중간엽 기질 세포는 우수한 측분비(paracrine) 효과를 나타낸다. 보다 구체적으로, 본 발명에 따른 성숙 장 오가노이드 유래 중간엽 기질 세포는 Vascular development, Mesenchyme development, Epithelial cell proliferation, Muscle tissue development와 관련된 인자들의 높은 수준의 발현을 통해 관련되는 시크리톰의 높은 발현 수준을 나타낸다. 이러한 높은 측 분비 효능을 통하여 1) 세포의 증식 효능을 증대시키고, 2) 주변 세포를 생체 생성단위 물질 및 ATP를 많이 합성할 수 있는 세포로 전환시키는 능력이 우수하며, 3) 우수한 혈관 형성능을 가짐으로써 이식에 직접 사용되거나 또는 보조적으로 또한 활용 가능하다.
반면, 미성숙 장 오가노이드 유래 중간엽 기질세포는 in vivo 장내 환경을 모방하기 위해 공배양에 사용되거나, T-림프구 공배양에서 분비되는 사이토카인, NRG-1 및/또는 STAT3 및 mTOR 신호전달 경로 활성화제인 콜리베린(colivelin)이 처리되지 않은 장 오가노이드이다. 보다 구체적으로, 성숙 장 오가노이드와 달리, IL-2, IL-22, IL-6, IL-1ß, IL-11, EGF, OSM 및 IL-10으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상이 배지 구성요소로 첨가되지 않거나 NRG-1이 첨가되지 않거나 콜리베린(colivelin)이 첨가되지 않은 장 오가노이드로부터 유래된 중간엽 기질 세포를 의미한다.
성체 유래 중간엽 줄기세포란 골수, 제대혈, 지방 유래 중간엽 줄기세포와 같이 성체의 임의의 조직에 존재하는 중간엽 줄기세포를 의미한다.
전분화능 줄기세포 유래 중간엽 줄기세포란 전분화능 줄기세포의 분화 과정을 통해 중간엽 줄기세포로의 분화가 이루어진 세포를 의미한다.
위와 같이 성숙 장 오가노이드의 주변 기질 세포층 유래 중간엽 기질 세포는 아래와 같은 장점을 가짐으로써 다양한 질환의 치료제로 활용 가능성이 높다:
전분화능 줄기세포 유래 장 오가노이드로부터 분리된 중간엽 기질세포에 해당하여 동종 이식에 활용 가능하다. 상세하게는 세포, 조직, 장기이식 시 면역거부반응의 원인인 조직적합성항원(HLA, Human Leukocyte Antigen)의 발현 수준이 감소된 전분화능 줄기세포 유래 장 오가노이드로부터 분리된 중간엽 기질세포는 면역 거부 반응을 일으키지 않는 세포원으로써 치료목적으로 활용할 수 있다.
혈관 생성 인자. 혈관 내피 관련 인자 및/또는 혈관 분비 인자의 발현 수준이 높고 내피세포, 특히 혈관 내피 세포의 유전자 온톨로지를 나타내어 장 이식시 혈관 형성을 비롯하여 초기 생착률을 증진시킬 수 있다.
계대 배양시 중간엽 기질 세포의 특성을 잃지 않고 지속적으로 동등한 특성을 나타낼 수 있어 세포 특성이 달라지지 않고 장기간 유지가 가능하며 계대배양이 가능하다. 또한, Xeno-free 배지 조건 하에서에도 가능하므로 세포치료제로 사용에도 활용이 가능하다.
바람직하게 치료제로 사용을 위해서는 1계대 내지 10계대 수준, 보다 바람직하게 2내지 6 계대 수준의 중간엽 기질 세포의 사용이 바람직하다.
특히, 냉동 및 해동 조건 하에서 통상 변하거나 잃게되는 줄기세포의 특성을 지속적으로 유지하여 치료제로 활용 가능성이 높다.
위와 같은 장점 하에 본 발명에 따른 중간엽 기질 세포는 높은 생착능을 기반으로 중간엽 기질 세포 자체, 타 장 오가노이드 또는 장 줄기세포와 병용하여 우수한 재생 치료제로 활용 가능성이 높다.
의약 용도
본 발명은 성숙 장 오가노이드의 주변 기질 세포층 유래 중간엽 기질 세포를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
본 발명은 성숙 장 오가노이드의 주변 기질 세포층 유래 중간엽 기질 세포를 포함하는 장 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명은 성숙 장 오가노이드의 주변 기질 세포층 유래 중간엽 기질 세포를 포함하는 장 이식 보조용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명은 성숙 장 오가노이드의 주변 기질 세포층 유래 중간엽 기질 세포; 및 소장 오가노이드, 대장 오가노이드 또는 장 줄기세포;를 포함하는 장 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. 성숙 장 오가노이드의 주변 기질 세포층 유래 중간엽 기질 세포는 전분화능 줄기세포(PSC)으로부터 분화된 것일 수 있다.
성숙 장 오가노이드의 주변 기질 세포층 유래 중간엽 기질 세포는 중간엽 기질 세포로 특성을 나타내면서 앞서 언급된 혈관 형성, 생착 증진 등의 개선된 특징을 나타내기 때문에 중간엽 기질 세포의 투여가 필요한 다양한 질환에 대해 단독 또는 기타의 성분과 병용하여 활용할 수 있다.
특히, 세포 또는 조직의 기능을 복원시키기 위한 생체공학 기술로서 치료 목적으로 활용가능하다.
예를 들어, 상기 약학 조성물은 이식 재료로 활용 가능하며 각종 장 질환의 치료에 적용할 수 있다. 특히, 장애를 입은 (기능부전을 포함함) 장관 조직의 재생·재건용의 재료로서 이용이 고려될 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 약학 조성물은 조직 치료제일 수 있다.
본 발명에서 상기 장 질환은 장누수 증후군, 단장 증후군, 과민성 장증후군, 크론병, 궤양성 대장염, 장형 베체트병, 감염성 장염, 허혈성 장질환 및 방사선 장염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 장 질환일 수 있다.
본 발명은 전분화능 줄기세포(PSC)으로부터 분화된 성숙 장 오가노이드의 주변 기질 세포층 유래 중간엽 기질 세포는 소장 오가노이드, 대장 오가노이드 또는 장 줄기세포의 장이식을 위한 장 이식 보조용 약학 조성물로 이용될 수 있다.
이식 효율과 재생치료 효율을 위한 선결 조건은 이식된 부위에 빠르게 생착하여 혈관 생성을 통해 이식된 세포나 조직에 혈액을 공급하는 것이다. 통상의 소장 오가노이드, 대장 오가노이드 또는 장 줄기세포는 장 이식시 생착률이 떨어지고 혈관 형성 등이 충분하지 않아 초기 이식 효율이 매우 낮은 편이다. 본 발명에 따른 전분화능 줄기세포(PSC)로부터 분화된 성숙 장 오가노이드의 주변 기질 세포층 유래 중간엽 기질 세포는 이러한 장이식시 생착률 및 혈관 형성 효율을 개선하여 장 이식의 효능을 개선하는 보조제로 활용 가능하다.
또한, 전분화능 줄기세포(PSC)으로부터 분화된 성숙 장 오가노이드의 주변 기질 세포층 유래 중간엽 기질 세포; 및 소장 오가노이드, 대장 오가노이드 또는 장 줄기세포;를 포함하여 장질환 치료용 조성물로 활용 가능하다.
이러한 이식에 있어서는 전분화능 줄기세포(PSC)으로부터 분화된 성숙 장 오가노이드의 주변 기질 세포층 유래 중간엽 기질 세포; 및 소장 오가노이드, 대장 오가노이드 및/또는 장 줄기세포는 피브린, 라미닌, 콜라겐, 젤라틴, 키토산, 알지네이트, 히알루론산, 덱스트란, 폴리락트산, 폴리글리콜산(poly(glycolic acid), PGA), 폴리(락트산-co-글리콜산)(poly(lacticcoglycolic acid), PLGA), 폴리-ε-(카프로락톤), 폴리안하이드리드, 폴리오르토에스테르, 폴리비닐알코올, 폴리에틸렌글리콜, 폴리우레탄, 폴리아크릴산, 폴리-N-이소프로필아크릴아마이드, 폴리(에틸렌옥사이드)-폴리(프로필렌옥사이드)-폴리(에틸렌옥사이드) 공중합체, 이들의 공중합체, 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 생분해성 지지체와 함께 이식에 활용될 수 있다
즉, 위 이식 재료의 대상이 되는 세포 또는 오가노이드는 그대로, 혹은 앞서 언급된 지지체에 포매되어 이식에 활용될 수 있다.
또한, 세포의 보호를 목적으로 하여 디메틸술폭시드(DMSO) 등을 추가할 수 있고, 세균의 혼입을 저지하는 것을 목적으로 하여 항생 물질 등을 추가할 수 있고, 세포의 활성화, 증식 또는 분화 유도 등을 목적으로 하여 각종 성분(비타민류, 사이토카인, 성장 인자, 스테로이드 등)을 본 발명의 이식 재료에 추가할 수도 있다.
본 발명의 이식 재료는 in vivo 실험계의 구축에도 이용 가능하다. 예를 들면, 상기 언급된 이식 재료를 마우스, 래트, 모르모트, 햄스터, 돼지, 게잡이원숭이, 붉은털 원숭이, 침팬지 등의 실험 동물에 이식하여, 인간화 동물(인간 장관 모델)을 제작할 수 있다. 이와 같은 인간화 동물은 약물 동태나 독성 시험 등의 실험에 특히 유용하며, 경구약에 대한 초회 통과 효과의 영향이나 약제성 장염 등의 연구에 대한 공헌이 기대된다.
본 발명에서 예방은 상기 조성물의 투여로 장질환의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미하며, 치료는 상기 조성물의 투여로 장질환의 증세가 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 조성물은 1 ml 당 1.0×105개 내지 1.0×1010개, 바람직하게는 1.0×106개 내지 1.0×109개의 세포를 포함할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 통상의 방법에 따라 액제, 현탁액 등 다양한 제형으로 제제화될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 약학적 분야의 통상의 방법에 따라 환자의 신체 내 투여에 적합한 단위투여형의 약학적 제제로 제형화시켜 투여할 수 있으며, 상기 제제는 1회 또는 수회 투여에 의해 효과적인 투여량을 포함한다. 이러한 목적에 적합한 제형으로는 비경구투여 제제로서 주사제, 주입제, 이식제 등이 바람직하다. 또한, 상기 약학 조성물은 약학적으로 허용가능한 통상의 불활성 담체 및 희석제를 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용되는 담체 및 희석제는 중간엽 기질세포 및 이를 이식받을 수혜자에 대해 생물학적 및 생리학적으로 친화적인 것일 수 있다. 희석제로는 이에 한정되지 않으나, 염수, 수용성 완충액, 용매 및/또는 분산제(dispersion media)를 들 수 있다. 이외에도, 예를 들어, 주사제의 경우에는 보존제, 무통화제, 가용화제 또는 안정화제 등을, 국소투여용 제제의 경우에는 기제(base), 부형제, 윤활제 또는 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 동결되지 않은 채 사용되거나 차후 사용을 위해 동결될 수 있다. 동결되어야 할 경우, 표준 냉동보존제 (예를 들어 DMSO, 글리세롤, 에피라이프 (Epilife®세포 동결 배지 (Cascade Biologics))가 동결 전 세포 집단에 첨가될 수 있다.
또한, 당업계에서 통상적으로 사용하는 투여방법을 이용하여 이식 및 투여될 수 있으며, 바람직하게는 치료가 필요한 환자의 질환 부위에 직접 생착 또는 이식이 가능하나 이에 한정되지는 않는다. 또한, 상기 투여는 카테터를 이용한 비외과적 투여 및 질환부위 절개 후 주입 또는 이식 등 외과적 투여방법 모두 가능하다. 투여량은 5 x 105~108/60kg 성인 또는, 5 x 105~108/1회 로 투여할 수 있다. 그러나, 유효성분의 실제 투여량은 치료하고자 하는 질환, 질환의 중증도, 투여경로, 환자의 체중, 연령 및 성별 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되어야 하는 것으로 이해되어야 하며, 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명은 또한 장 질환 예방 또는 치료에 사용하기 위한 성숙 장 오가노이드의 주변 기질 세포층 유래 중간엽 기질 세포를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 장 질환 예방 또는 치료에 사용하기 위한 약제의 제조에 있어 성숙 장 오가노이드의 주변 기질 세포층 유래 중간엽 기질 세포의 용도를 제공한다.
성숙 장 오가노이드의 주변 기질 세포층 유래 중간엽 기질 세포를 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 장질환의 치료 방법을 제공한다.
대상체란 장 질환이 발명하였거나 발병할 수 있는 인간과, 원숭이, 소, 말, 양, 돼지, 닭, 칠면조, 메추라기, 고양이, 개, 마우스, 쥐, 토끼 또는 기니아 피그를 포함한 모든 동물을 의미한다.
본 발명은 또한 장 이식 보조에 사용하기 위한 성숙 장 오가노이드의 주변 기질 세포층 유래 중간엽 기질 세포를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 장 이식 보조에 사용하기 위한 약제의 제조에 성숙 장 오가노이드의 주변 기질 세포층 유래 중간엽 기질 세포의 용도를 제공한다.
성숙 장 오가노이드의 주변 기질 세포층 유래 중간엽 기질 세포를 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 장 이식 보조 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 장 이식 보조에 사용하기 위한 전 성숙 장 오가노이드의 주변 기질 세포층 유래 중간엽 기질 세포를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 장 이식 보조에 사용하기 위한 약제의 제조에 있어 성숙 장 오가노이드의 주변 기질 세포층 유래 중간엽 기질 세포의 용도를 제공한다.
성숙 장 오가노이드의 주변 기질 세포층 유래 중간엽 기질 세포를 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 장 이식 보조 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 장 질환 예방 또는 치료에 사용하기 위한 성숙 장 오가노이드의 주변 기질 세포층 유래 중간엽 기질 세포; 및 소장 오가노이드, 대장 오가노이드 또는 장 줄기세포;를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 장 질환 예방 또는 치료에 사용하기 위한 약제의 제조에 있어 성숙 장 오가노이드의 주변 기질 세포층 유래 중간엽 기질 세포; 및 소장 오가노이드, 대장 오가노이드 또는 장 줄기세포;의 용도를 제공한다.
성숙 장 오가노이드의 주변 기질 세포층 유래 중간엽 기질 세포; 및 소장 오가노이드, 대장 오가노이드 또는 장 줄기세포;를 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 장질환의 치료 방법을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.
본 발명에 따른 성숙 장 오가노이드 주변 기질 세포층 유래 중간엽 기질 세포는 병변 부위에 직접 작용하여 재생 및 생착 효능을 크게 증진시킬 수 있으며, 이에 따라 이식에 대한 효율을 크게 증진시킬 수 있다. 또한, 기존의 중간엽 줄기세포 치료제와는 다르게 손상 부위를 즉각적, 직접적으로 재생할 수 있는 점에서 우수한 효능을 지닐 뿐만 아니라 단순화된 계대 방법 적용 및 동결 및 해동 기술에도 특성을 유지하며 동종 이식 방식에도 활용 가능하다는 점에서 범용적 활용 가능성이 매우 높은 장점을 가진다. 더욱이, 소장 오가노이드, 대장 오가노이드 또는 장 줄기세포와 병용시 범용적으로 모두 개선된 장 질환 치료 효과를 나타내어 장 이식을 위한 치료 보조제로 활용 가능성이 높다. 또한, 환부에서 Crypt의 depth를 크게 증가시키며, 염증을 완화하고 상피의 조직학적 회복 및 기능성 회복에 우수한 효과를 나타낸다.
도 1은 전분화능줄기세포 유래 이식용 성숙 장 오가노이드로부터 중간엽 기질세포의 분리, 배양 및 동결-해동 기술을 나타내는 도이다.
(a) 장 오가노이드로부터 중간엽 기질세포의 분리, 배양 및 동결-해동 프로토콜의 개략도를 나타내는 것이다. 전분화능 줄기세포유래 분화된 인간 장 오가노이드(hIO)는 성숙을 위하여 P0부터 IL-2 처리를 통해 성숙화되었다. 장 오가노이드 P0~P2에서 분리된 중간엽 기질세포(MSChIO)는 3~7일동안 배양 후, 계대하고, 동결 및 해동이 가능하다.
(b) 전분화능 줄기세포로부터 분화된 미성숙 장오가노이드(Cont-hIO), 성숙 장 오가노이드(Mat-hIO)와 이로부터 분리된 중간엽 기질세포의 표현형(MSC Cont-hIO, MSC Mat-hIO)을 나타내는 것이다. 분리 후 P0부터 P10까지 계대 배양의 대표적 이미지를 나타내는 것이다.
(c) 중간엽 기질세포의 대표적 세포 타입인 Smooth muscle cells 또는 pericytes, intestinal subepithelial myofibroblasts(ISEMF), Fibroblasts의 표지자(αSMA(ACTA2), Desmin, Vimentin)의 계대별(P2, P3, P4, P8) qPCR 분석 결과이다. 장 중간엽 기질세포의 마커들이 계대가 지나도 여전히 유지되고 있음을 나타낸다.
도 2는 미성숙 장 오가노이드 유래 중간엽 기질세포(MSCCont-hIO), 성숙 장 오가노이드 유래 중간엽 기질세포(MSCMat-hIO), 전분화능 줄기세포로부터 분화된 중간엽줄기세포(MSCPSC), 그리고 기 판매되는 인간 중간엽 기질세포의 유전자 수준 특성 분석을 한 도이다.
(a) 중간엽 기질세포 마커이자 혈관주위세포(pericyte) 마커(αSMA)와 혈관 마커(CD31)의 면역형광염색 결과이다. MSCCont-hIO에서 αSMA와 CD31의 발현이 높은 것을 보여준다.
(b) 히트맵은 Spearman correlation을 통해 각 샘플 간 유의적 상관도를 나타낸다. 샘플간 유사도가 높을수록 적색에 가까우며 청색에 가까울수록 유사도가 낮음을 의미한다.
(c) RNAseq 데이터로부터 Fold >2 이상의 유전자 발현 분석을 통해 MDS plot을 확인한 도이다. MSCMat-hIO가 MSCCont-hIO과도 다른 특성을 나타내고 있음을 보여준다.
(d) EnrichR, Ontology 분석을 통해 MSCCont-hIO와 비교하여, MSCMat-hIO에서 Endothelial cell type이 확인되는 것을 나타낸다.
(e) Fibroblast, iPSC, MSCCont-hIO, MSCMat-hIO, hMSC에서 혈관 내피 관련 인자(CD31(PECAM1), CDH5, ECSCR, LYVE1)의 유전자 발현을 qPCR을 통해 확인한 도이다. 분리한 MSCMat-hIO에서 유의적으로 증가하는 것을 보여준다.
(f) MSCCont-hIO, MSCMat-hIO에서 분비되는 혈관 내피 관련 인자(VEGF)를 ELISA를 통해 배양액 내에서 확인한 도이다.
도 3은 Cont-hIO와 Mat-hIO의 single cell RNAseq을 통해 각각 장 오가노이드의 구성 세포를 규명한 도이다.
(a) Cont-hIO와 Mat-hIO의 UMAP을 보여주는 도이다. 왼쪽(2 panels)은 장 오가노이드 전체의 UMAP이고, 오른쪽은 중간엽 기질세포 그룹을 확대한 도이다. Cont-hIO의 중간엽 기질세포와 Mat-hIO의 중간엽 기질세포의 그룹이 나누어지는 것을 보여준다.
(b) Pseudo-bulk의 샘플간 상관관계(Correlation)를 나타낸 도이다.
(c) scRNAseq 기반 중간엽 기질세포 그룹에서 Cont-hIO 대비 Mat-hIO에서 Differentially Expressed Genes(DEGs)를 선별하여, Gene ontology biological process(GOBP)의 cluster를 분석한 도이다. Epithelial cell adhesion cellular vascular endothelial stimulation과 관련된 Term을 보여준다.
(d) DAVID(https://david.ncifcrf.gov/summary.jsp)에서 DEG의 GOTERM_BP 분석을 통해 Cont-hIO 대비 Mat-hIO에서 Cell adhesion, Angiogenesis, Differentiation 등이 증가된 것을 확인할 수 있다.
(e) Mat-hIO의 중간엽 기질세포의 DEG의 GOTERM을 상세히 분석하면, Epithelial cell proliferation, Mesenchyme development, Vascular endothelial growth factor stimulus, Muscle tissue development가 증가된 것을 확인할 수 있다.
(f) Mat-hIO의 중간엽 기질세포 cluster에서 DEG의 volcano plot을 나타낸 도이다. Mat-hIO의 중간엽 기질세포에서 up-regulation된 유전자는 대표적으로 IGF2, FOXF1, CXCL14, BMP4, IGFBP3, APOA1, PDGFRA, FOXF2, PTCH1, VEGFA, NKX2-3, BMP5, ITGA8, NRG1, ADAM28, COL4A5, DLL1 등이 있음을 보여준다.
도 4는 대조군 및 고성능 장 오가노이드 주변 중간엽 기질세포를 분리 배양한 배양액(Conditioned medium; CM)에서 유의하게 증가하는 사이토카인 및 혈관관련 인자를 확인한 도이다.
(a) 대조군 및 고성능 장 오가노이드 주변 중간엽 기질세포의 배양액을 Human XL Cytokine Array kit를 통해 분비인자를 dot blot으로 확인한 도이다. Angiogenin, DKK1, EGF, Osteopontin, ICAM-1, IGFBP-3, VCAM-1, 의 분비가 두드러지게 증가하는 것을 보여준다.
(b) 대조군 및 고성능 장 오가노이드 주변 중간엽 기질세포의 배양액을 Human Angiogenesis Array kit를 통해 분비인자를 dot blot으로 확인한 도이다. Angiogenin, Activin A, MCP-1의 분비가 두드러지게 증가하는 것을 보여준다.
도 5는 대조군과 고성능 장 오가노이드 주변 중간엽 기질세포의 배양액이 장 줄기세포(ISC)의 성장 및 성상에 미치는 영향을 확인한 도이다.
(a) 장 줄기세포를 ISC medium, MSCCont-hIO CM(Cont-CM), MSCMat-hIO CM(Mat-CM), hMSC-CM, MSC medium(early Cont-MSC medium), MSC medium+IL-2(early Mat-MSC medium) 배양액 및 배지에서 3일동안 배양하는 모식도이다.
(b) Day 0, 1, 3에 세포 성상을 확인한 도이다. Day 1일차에 Mat-CM에서 ISC의 성상이 두드러지게 변화하는 것을 확인하였다.
(c) Day 1에서 Mat-CM 조건에서 세포의 분포를 Crystal Violet(CV) 염색으로 보여준 도이다. 세포의 분포가 Mat-CM에서 유의적으로 증가한 것을 정량적으로 확인하였다.
(d) Mat-CM에서 두드러지게 ISC의 성상과 분포를 변화시키는 인자를 확인하기 위해 scRNAseq에 근거하여 Cont-MSC에 비해 Mat-MSC에서 유의적으로 차이나는 대표적 유전자(DEG)를 선별하였다. 선별한 유전자의 성장인자(BMP4)와 각 MSC-CM을 처리하여 변화를 관찰한 도이다. BMP4를 단독처리, ISC medium, Cont-CM, Mat-CM, hMSC-CM, MSC medium, MSC medium+IL-2 1, 3일차에 변화하는 것을 보여준다.
(e) BMP4의 ISC 성상, 분포 변화의 영향을 검증하기 위하여, Cont-Cm, Cont-CM+BMP4, Mat-CM을 ISC에 1일간 처리한 도이다. Cont-CM+BMP4 처리 시 Cont-CM에 비해 세포 분포가 Mat-CM 처리와 비슷한 속도로 성상이 변화하고, 분포가 확장되는 것을 보여준다.
도 6은 장 줄기세포를 ISC medium, Cont-CM, Mat-CM, hMSC-CM으로 12시간 배양하여 실시간 세포대사를 분석한 도이다.
(a) XF analyzer로 실시간 세포대사를 관찰하기 전 0h, 12h의 세포 성상을 확인한 도이다.
(b) Basal ECAR/Basal OCR의 차이를 확인함으로써, ISC medium, MSCCont-hIO CM, MSCMat-hIO CM 에서는 해당과정 및 OXPHOS의 차이가 없음을 확인한 도이다.
(c) 산소소모율(OCR) 측정을 위해 올리고마이신, FCCP, 안티마이신 A를 순차적으로 처리하여, 측정한 도이다. Maximum respiration이 MSCMat-hIO CM 에서 유의적으로 증가하였음을 나타낸다.
(d) 세포외 산성도율(ECAR) 측정을 위해 올리고마이신, 글루코스, 2-D-글루코스를 순차적으로 처리하여, 측정한 도이다. MSCMat-hIO CM에서 Glycolytic capacity와 Glycolytic reserve가 유의적으로 높은 것 나타내며, 더 많은 해당과정의 능력을 가졌음을 확인한 도이다.
도 7은 HUVEC의 Cont-CM, Mat-CM에서 유의적으로 차이나는 대표 유전자의 성장인자(IGF2)와 각 MSC-CM을 처리하여, tubule formation을 확인한 도이다.
(a) 25,000 cells per well의 조건으로 씨딩한 그룹에서 4시간, 8시간 각각 관찰한 도이다. 성장인자(IGF2)와 EBM-2+bFGF(Basal medium), IGF2, Cont-CM, Cont-CM+IGF2, Mat-CM, EGM-2(Growth medium)을 처리하여 HUVEC tubule formation을 한 도이다. EBM-2+bFGF(Basal medium)보다 IGF2 처리시에 빠르게 tubule이 형성되며 또는 Cont-CM에 IGF2를 추가시에 Cont-CM 단독처리보다 빠르게 형성되는 것을 보여주고, 8시간에 Cont-CM+IGF2, Mat-CM 조건에서 Complete tubule 형성률이 높고, Branching의 각도가 좋으며, Cell aggregate가 적은 것을 보여준다.
(b) ImageJ의 Angiogenesis Analyzer를 통해 Tubule formation의 정량평가를 진행한 도이다. Cont-CM에 IGF2를 추가시에 Cont-CM 단독처리보다 junction과 segments의 개수가 유의적으로 증가한다. Total length의 경우, EBM-2+bFGF(Basal medium)에 비해 Cont-CM, Cont-CM+IGF2, Mat-CM 조건에서 유의적으로 증가하는 것을 보여준다.
도 8은 HUVEC의 Cont-CM, Mat-CM에서 유의적으로 차이나는 대표 유전자의 성장인자(IGF2)와 각 MSC-CM을 처리하여, wound healing(migration)을 확인한 도이다.
(a) HUVEC 세포에 wound를 형성 (0시간) 하고, 36시간에 각각 세포의 wound healing(migration)의 세포 성상 (Bright field)을 확인한 도이다.
(b) ImageJ의 wound healing size tool을 활용하여 wound size를 측정하여 정량평가를 진행한 도이다. Cont-CM+IGF2, Mat-CM, EGM-2(Growth medium)에서 migration이 빠르게 진행되는 것을 보여준다.
도 9는 EDTA 유도 장 상피손상 면역결핍마우스에 전분화능 줄기세포(배아줄기세포, 유도만능줄기세포) 유래 미성숙 장 오가노이드(Cont-hIO) 및 성숙 장 오가노이드 유래 중간엽 기질세포(MSCMat-hIO)를 이식 후 세포 생착, 재생능을 검증한 도이다.
(a) 전분화능 줄기세포(배아줄기세포, 유도만능줄기세포) 유래 장 오가노이드 및 성숙 장 오가노이드로부터 분리한 중간엽 기질세포(MSCMat-hIO)를 EDTA 유도 장 상피 손상 모델에 이식하는 것을 설명하는 모식도이다.
(b) 이식 전 미성숙 장 오가노이드(Cont-hIO)와 성숙 장 오가노이드 유래 중간엽 기질세포(MSCMat-hIO)의 세포 성상을 나타내는 도이다.
(c) 실험동물용 대장내시경을 통해 이식 전, 상피 손상 직후, 이식 2주 후 각 그룹의 대장 내 환경을 관찰한 도이다. 또한, 형광해부현미경을 통해 적출된 장의 상태 및 유도만능줄기세포 유래 리포터 장 오가노이드를 활용하여 형광 발현에 따른 생착 여부를 확인한 도이다.
(d) 세포가 이식된 직장 부근의 H&E 염색을 통해 조직학적 특성을, AB-PAS 염색을 통해 Goblet cells의 기능적 특성을 나타내는 도이다. Cont-hIO를 단독으로 이식한 그룹에 비해, Cont-hIO+MSCMat-hIO를 함께 이식한 그룹이 구조적으로 Crypt depth와 형성(복원)률이 높으며, 특히, 기능적으로 Mucin의 분비가 활발한 것을 나타낸다.
도 10은 DSS 유도 염증성 장 질환 면역결핍마우스에 전분화능 줄기세포 유래 미성숙 장 오가노이드(Cont-hIO) 또는 미성숙 장 오가노이드와 성숙 장 오가노이드 유래 중간엽 줄기세포(MSCMat-hIO) 동시 이식을 각각 수행한 후 무게 분석 및 대장내시경을 확인한 도이다.
(a) 미성숙 장 오가노이드 또는 미성숙 장 오가노이드와 성숙 장 오가노이드 유래 중간엽 줄기세포를 DSS 유도 염증성 장질환 모델에 이식하는 것을 설명하는 모식도이다.
(b) 염증성 장질환 모델에 이식 시점부터 이식 후 적출 전까지 각 그룹의 체중변화를 나타내는 도이다. Cont-hIO 단독 이식한 그룹에 비해, Cont-hIO+MSCMat-hIO 동시 이식 그룹은 체중이 회복되어 빠르게 증가하며, Cont-hIO 이식군은 Fibrin 이식군 또는 DSS-NT(질환 대조군)에 비해 초기 질환의 중증도는 감소하나 회복의 속도는 Cont-hIO+MSCMat-hIO 이식군에 비해 늦음을 보여준다.
(c) 실험동물용 대장내시경을 통해 상피손상 이식 0, 14일 차에 각 그룹의 장 내를 관찰하고, 염증 정도 및 회복을 확인한 도이다. MSCMat-hIO 단독이식군 또는 Cont-hIO 이식군에는 발적 및 일부 염증부위가 남아 있으나, Cont-hIO+MSCMat-hIO 이식한 그룹에서는 장 상피 상처로 인한 발적 및 염증 소견이 없음을 보여준다.
(d) 세포가 이식된 장의 longitudinal section에서 H&E 염색을 통해 조직학적 특성을, AB-PAS 염색을 통해 Goblet cells의 기능적 특성을 나타내는 도이다. Cont-hIO를 단독으로 이식한 그룹에 비해, Cont-hIO+MSCMat-hIO를 함께 이식한 그룹이 구조적으로 Crypt depth와 형성(복원)률이 높으며, 특히, 기능적으로 Mucin의 분비가 활발한 것을 나타낸다.
(e) Crypt depth를 수치화하여 Cont-hIO+MSCMat-hIO 동시 이식군에서 유의적으로 증가했음을 확인한 도이다.
도 11은 MSC의 부재가 있는 성숙 장 오가노이드(P7)와 MSC가 존재하는 성숙 장 오가노이드(P4)를 이식 후 14일 차에 AB-PAS를 통한 조직학적/기능적 분석을 나타낸 도이다. MSC가 존재하는 성숙 장 오가노이드(Mat-hIO P4)를 이식한 그룹이 Swiss-roll section을 통해 구조 전반적으로 Crypt depth가 높은 것을 확인하였다.
(a) 유도만능줄기세포 유래 성숙 장 오가노이드(P4, P7)을 EDTA 유도 장 상피손상 모델에 이식하는 것을 설명하는 모식도이다.
(b) 이식 전 MSC의 부재가 있는 성숙 장 오가노이드(P7)와 MSC가 존재하는 성숙 장 오가노이드(P4)의 세포 성상을 나타내는 도이다.
(c) 장 전체의 구조를 확인하기 위한 Swiss-roll section의 AB-PAS 염색을 통해 조직학적 구조와 Goblet cells의 기능적 특성을 나타내는 도이다. MSC의 부재가 있는 성숙 장 오가노이드(P7)를 이식한 그룹에 비해, MSC가 존재하는 성숙 장 오가노이드(P4)를 이식한 그룹이 구조적으로 Crypt depth와 형성(복원)률이 유의적으로 높음을 나타낸다.
도 12은 유도만능줄기세포 유래 대장 오가노이드의 분화 과정과 기존 소장 오가노이드와의 특성 분석하고, MSCMat-hIO의 활용을 확인하기 위해 DSS 유도 염증성 장질환 면역결핍마우스에 유도만능줄기세포 유래 대장 오가노이드 또는 MSCMat-hIO의 동시 이식 및 MSCMat-hIO의 단독 이식 2주 후 생착, 재생 효능을 확인한 도이다.
(a) 유도만능줄기세포 유래 대장 오가노이드의 분화과정을 나타내는 모식도이다. Hindgut 분화 과정에서 소장 오가노이드 분화와 달리 Activin A를 추가로 처리하고, 대장 오가노이드(hCO) 초기(P0)에 3일간 BMP2를 처리함으로써 대장 오가노이드로 분화시킬 수 있다.
(b) 대장 오가노이드(hCO) 분화 과정 중 Hindgut과 hCO의 계대별(P0, P1, P2, P6, P10) 오가노이드의 성상을 확인한 도이다.
(c) 장의 대표적 마커 (VIL1, KRT20, LYZ, SI, LCT, OLFM4)는 소장 오가노이드에서 더 높게 발현되고, CHGA, MUC5B, SATB2, CAII는 대장 오가노이드에서 발현이 높음을 qPCR을 통해 확인하였다.
(d) hCO, hCO+MSCMat-hIO, MSCMat-hIO를 DSS 유도 염증성 장 질환 모델에 이식하는 모식도이다.
(e) 실험동물용 대장내시경을 통해 이식 전, 이식 2주 후 각 그룹의 장 내를 관찰하고, 염증 정도 및 회복을 확인한 도이다. hCO 및 MSCMat-hIO 이식군에 비해 hCO+MSCMat-hIO 동시 이식군에서 발적이 감소한 것을 보여준다.
(f) 직장 부근의 H&E 염색을 통해 조직학적 특성을, AB-PAS 염색을 통해 Goblet cells의 기능적 특성을 나타내는 도이다. Fibrin(ECM only)을 이식한 대조군은 14일 후에도 여전히 조직학적으로 회복이 늦으며, hCO 또는, MSCMat-hIO 단독 이식 그룹은 Fibrin(대조군)에 비해 염증으로 인한 장 상피 손상의 회복되었음을 Crypt의 구조와 mucin 염색을 통해 보여주었다. 특히, hCO+MSCMat-hIO를 함께 이식한 그룹은 구조적으로 월등히 Crypt depth가 높으며, 기능적으로 Mucin의 분비가 활발한 것을 나타낸다.
도 13은 MSCMat-hIO의 활용을 확인하기 위해 인체 대장 조직의 성체 대장 줄기세포로부터 제작된 대장 오가노이드 및 MSCMat-hIO를 EDTA 유도 장 상피손상 면역결핍마우스에 이식하여 이식 초기 (Day 5)에 관찰한 도이다.
(a) Fibrin, hCN, hCN+MSCMat-hIO 를 EDTA 유도 장 상피손상 모델에 이식하는 모식도이다.
(b) 실험동물용 대장내시경을 통해 이식 전, 이식 2주 후 각 그룹의 장 내를 관찰하고, 염증 정도 및 회복을 확인한 도이다. hCN 단독 이식군에 비해 hCN+MSCMat-hIO 동시 이식군에서 직장부위 장 상피 손상이 감소한 것을 보여준다.
(c) 직장 부근의 H&E 염색을 통해 조직학적 특성을, AB-PAS 염색을 통해 Goblet cells의 기능적 특성을 나타내는 도이다. Fibrin(ECM only)을 이식한 대조군 및 hCN 이식군에 비해 hCN+MSCMat-hIO를 함께 이식한 그룹은 직장부위에 빠르게 생착되어 구조를 형성하는 것을 보여주며, 기능적으로 Mucin의 분비가 활발한 것을 나타낸다.
(d) Human-특이적 항체(hECAD)의 형광 발현을 면역형광염색(IHC)로 확인한 도이다. Nuclei(DAPI) 대비 hECAD+의 면적을 정량화 하여 5일차 이식군 hCN+MSCMat-hIO 이종이식편 hCN에 비해 생착능이 좋음을 나타낸다.
도 14는 인체 대장 조직의 성체 대장 줄기세포 유래 대장 오가노이드 및 MSCMat-hIO를 EDTA 유도 장 상피손상 면역결핍마우스에 이식하여 이식 2주 후 생착, 재생 효능을 확인한 도이다.
(a) 성체 대장 줄기세포 유래 대장 오가노이드 및 MSCMat-hIO를 EDTA 유도 장 상피 손상 모델에 이식하는 것을 설명하는 모식도이다.
(b) 장 상피 손상 모델에 이식 시점부터 이식 후 적출 전까지 각 그룹의 체중변화를 나타내는 도이다. hCN 단독 이식군에 비해 hCN+MSCMat-hIO 동시 이식군은 3일차부터 체중증가를 보였으며,5~7일차에 그룹간 차이가 크고, 14일차에는 hCN 이식군도 빠르게 체중을 회복하는 것을 나타낸다.
(c) 실험동물용 대장내시경을 통해 이식 전, 상피 손상 직후, 이식 2주 후 각 그룹의 대장 내 환경을 관찰한 도이다. 이식 2주차에는 그룹간 상피 손상 정도의 차이가 적음을 보여준다.
(d) 세포가 이식된 직장 부근의 H&E 염색을 통해 조직학적 특성을 나타내는 도이다. 14일차 Fibrin 그룹에서는 직장 부근 여전히 상피 손상이 보이나, hCN, hCN+MSCMat-hIO, Mat-hIO 이식군에서는 입구에 상피 구조가 회복되었음을 보여준다.
(e) AB-PAS 염색을 통해 Goblet cells의 기능적 특성을 나타내는 도이다. 14일차 Fibrin 그룹에서는 직장 부근 여전히 상피 손상으로 인해 Mucin의 분비가 이루어지지 않는 것을 보여주며, hCN, hCN+MSCMat-hIO, Mat-hIO 이식군에서는 입구에 상피 구조가 회복되어 Mucin의 분비가 활발한 것을 나타낸다.
도 15는 DSS 유도 염증성 장질환 면역결핍마우스에 인체 대장 조직의 성체 대장 줄기세포 유래 대장 오가노이드 및 MSCMat-hIO를 이식하여 이식 2주 후 생착, 재생 효능을 확인한 도이다.
(a) 성체 대장 줄기세포 유래 대장 오가노이드 및 MSCMat-hIO를 DSS 유도 염증성 장 질환 모델에 이식하는 것을 설명하는 모식도이다.
(b) 이식 전 성체 대장 줄기세포 유래 대장 오가노이드(hCN) 및 MSCMat-hIO 의 세포 성상을 나타내는 도이다.
(c) 실험동물용 대장내시경을 통해 이식 전, 이식 1주, 2주 후 각 그룹의 대장 내 환경을 관찰한 도이다. 이식 2주차에는 hCN, hCN+ MSCMat-hIO 그룹간 상피 손상 정도의 차이가 적음을 보여준다.
(d) 세포가 이식된 직장 부근의 H&E 염색을 통해 조직학적 특성을 나타내는 도이다. 2주 후 Fibrin 그룹에서는 직장부터 장 상피 중간까지 여전히 염증으로 인해 상피에 손상이 남아 있으나, hCN, hCN+MSCMat-hIO, Mat-hIO 이식군에서는 장 전반에 걸쳐 상피 구조가 회복되었음을 보여준다.
(e) AB-PAS 염색을 통해 Goblet cells의 기능적 특성을 나타내는 도이다. 2주 후 Fibrin 그룹에서는 장 전반에 걸쳐 여전히 염증으로 인해 상피 손상이 유발되어 Mucin의 분비가 이루어지지 않는 것을 보여주며, hCN, hCN+MSCMat-hIO, Mat-hIO 이식군에서는 장 상피 구조가 회복되고, Mucin의 분비가 활발한 것을 나타낸다.
도 16은 EDTA 유도 장 상피손상 면역결핍 마우스에 유도만능줄기세포 유래 미성숙 또는 성숙 장 오가노이드로부터 장 줄기세포를 분리하여 구체 장 줄기세포(InShIO)의 이식 효능을 확인한 도이다.
(a) 미성숙 장 오가노이드 유래 장 줄기세포(InSCont-hIO)와 성숙 장 오가노이드 유래 장 줄기세포(InSMat-hIO) 및 MSCMat-hIO를 EDTA 유도 장 상피손상 모델에 이식하는 모식도이다. 또한, 이식 전 성숙 장 오가노이드 유래 장 줄기세포(InSMat-hIO)의 세포 성상을 보여준다.
(b) 이식 후 14일 차에 InSMat-hIO+MSCMat-hIO를 이식한 그룹은 Swiss-roll section의 AB-PAS 염색을 통해 특히, Goblet cells의 Mucin 분비 기능성이 회복되었음을 확인할 수 있다. 또한, Longitudinal section 샘플의 직장부근이 구조적으로 빠르게 회복되어 Crypt depth가 높고, mucin 기능성이 향상되었음을 H&E, AB-PAS 염색을 통해 확인하였다.
도 17은 MSCMat-hIO의 활용을 확인하기 위해 DSS 유도 염증성 장 질환 면역결핍마우스에 전분화능 줄기세포 유래 성숙 장 오가노이드로부터 분리한 구체 장 줄기세포(InShIO) 와 MSCMat-hIO의 동시이식 효능을 확인한 도이다.
(a) 장 줄기세포 또는 성숙 장 오가노이드 유래 중간엽 줄기세포를 DSS 유도 염증성 장질환 모델에 이식하는 것을 설명하는 모식도이다.
(b) 염증성 장질환 모델에 이식 시점부터 이식 후 적출 전까지 각 그룹의 체중변화를 나타내는 도이다. InSMat-hIO 단독 이식한 그룹에 비해, InSMat-hIO+MSCMat-hIO 이식 그룹은 아무것도 처리하지 않은 대조군 보다 빠른 속도로 체중이 증가한다. InSMat-hIO 단독 이식군은 Fibrin 이식군 또는 DSS-NT(질환 대조군)에 비해 초기 질환의 회복이 빠르며, 증상의 심화가 되지 않지만, InSMat-hIO+MSCMat-hIO 이식군에 비해 회복의 속도가 늦음을 보여준다.
(c) 실험동물용 대장내시경을 통해 상피손상 이식 0, 14일 차에 각 그룹의 장 내를 관찰하고, 염증 정도 및 회복을 확인한 도이다.
(d) 직장 부근의 H&E 염색을 통해 조직학적 특성을, AB-PAS 염색을 통해 Goblet cells의 기능적 특성을 나타내는 도이다. Fibrin(ECM only)을 이식한 대조군 및 InSMat-hIO 이식군에 비해 InSMat-hIO+MSCMat-hIO 를 함께 이식한 그룹은 장의 전반에 걸쳐 회복이 빠른 것을 보여주며, 기능적으로 Mucin의 분비가 활발한 것을 나타낸다.
도 18은 전분화능 줄기세포 유래 이식용 고성능의 성숙 장 오가노이드의 분화 및 배양 기술을 나타내는 도이다.
(a) 전분화능 줄기세포로부터 성숙 장 오가노이드로 분화 및 계대 배양하는 프로토콜의 개략도를 나타내는 것이다. 전분화능 줄기세포유래 분화된 인간 장 오가노이드(hIO)는 성숙을 위하여 P0부터 매일 1 ng/ml rhIL-2 처리를 통해 성숙화를 시킨 프로토콜을 나타낸다. 성숙 장 오가노이드는 10~14일마다 계대하고, 특히 P1부터는 Blade 또는 Chopper를 활용하여 계대 배양한다.
(b) 전분화능 줄기세포(배아줄기세포, 유도만능줄기세포)로부터 분화된 미성숙 또는 성숙 장 오가노이드(P2)의 세포 성상이다.
(c) qPCR 분석을 통해 기존 성숙 오가노이드 제작 방법(P1부터 rhIL-2 처리, surgical blade로 계대 배양 및 hIO 배지 내 80~90 ng/ml Noggin, 400~450 ng/ml R-spondin1 포함)으로 제작한 오가노이드 (conventional) 와 이식용 성숙 장 오가노이드 제작(P0 부터 rhIL-2 처리, P1부터 blade 또는 chopper로 계대 배양 및 hIO 배지 내 40~50 ng/ml Noggin, 200~250 ng/ml R-spondin1 포함)방법으로 제작한 오가노이드 (transplantable)를 비교한 결과이다. 소장 세포 유형-특이적 마커(VIL1, KRT20, CHGA, MUC2 및 LYZ) 과 장 성숙 마커인 MUC13, OLFM4, SI, LCT 및 DPP4 및 LCT의 발현을 나타낸다.
(d) qPCR 분석을 통해 이식용 미성숙 및 성숙 오가노이드를 비교한 결과이다. 장 줄기세포 마커인 ASCL2, AXIN2, OLFM4의 발현을 나타낸다.
(e) qPCR 분석을 통해 이식용 미성숙 및 성숙 오가노이드를 비교한 결과이다. 혈관-특이적 마커인 CD31, CDH5, ECSCR, LYVE1, IGF2의 발현을 나타낸다.
(f) qPCR 분석을 통해 기존 성숙 오가노이드와 이식용 성숙 장 오가노이드를 비교한 결과이다. 장 줄기세포-특이적 마커(ASCL2, AXIN2, LGR5 및 OLFM4)와 혈관 내피 관련 인자(CD31, CDH5, ECSCR 및 LYVE1)의 발현이 이식용 성숙 장 오가노이드에서 높게 발현됨을 나타낸다.
도 19는 전분화능 줄기세포로부터 ECMatrixTM-511에서 장 오가노이드로 분화된 오가노이드를 마트리젤과 임상 적용 가능한 Xeno-free ECM(Vitrogel #2, #3)을 적용하여 배양한 도이다.
(a) Vitrogel #2, #3에서 장 상피 구조가 유지되는 것을 확인하고, 5일간 배양한 세포 성상과 H&E 염색을 통한 조직학적 분석을 확인한 도이다.
(b) 소장-특이적 마커(CDX2, VIL1, LGR5, ASCL2, LYZ, MUC2 및 MUC13) 발현을 qPCR을 통해 확인한 도이다.
도 20은 동일한 면역결핍마우스의 양쪽 신장 각각에 미성숙 또는 고성능의 성숙 오가노이드를 이식하여 8주 후 이종이식편 장 오가노이드를 관찰한 도이다.
(a) 유도만능 줄기세포 유래 미성숙 장 오가노이드(Cont-hIO) 또는 성숙 장 오가노이드(Mat-hIO)를 동일한 면역결핍마우스 양쪽 신장에 각각 이식하고, 8 주 후 적출하는 과정을 나타내는 모식도이다.
(b) 유도만능 줄기세포 유래 미성숙 또는 성숙 장 오가노이드의 이식 전(P1)의 세포 성상을 보여준다.
(c) 이식 8주 후 마우스의 적출한 신장을 관찰한 도이다. 동일 마우스에 이식을 하였어도 Mat-hIO 이종이식편의 주변에 혈관형성이 되었음을 확인할 수 있다 (n=6).
(d) (왼쪽 패널) 분리한 신장과 이종이식편을 섹션하여 H&E염색을 통해 혈관 형성 및 성체 소장과 같은 구조를 조직학적으로 분석한 도이다. Mat-hIO에서 혈관형성이 되었음을 보여준다. (오른쪽 패널) Cont-hIO와 Mat-hIO 이종이식편의 Villus length를 측정한 그래프이다.
(e) 이식 8주 후 마우스의 적출한 신장으로부터 확보한 이종이식편의 면역형광화학염색을 통해 소장 상피 구조(hECAD), 중간엽 기질세포 및 혈관주위세포 마커(αSMA)와 혈관 마커인 hVE-Cad, PECAM-1(hCD31), VEGF를 확인한 도이다. Mat-hIO 이종이식 편에서 인간 소장 조직과 유사한 발현 양상을 나타낸다.
도 21은 RNAseq 데이터로부터 생체 외 배양된 미성숙 또는 고성능의 성숙 오가노이드(P2)와 신장 이종이식된 미성숙 장 오가노이드(Cont-hIO)와 성숙 장 오가노이드(Mat-hIO) 4주차 또는 8주차의 유전체를 비교하여 분석한 도이다.
(a) Elucidean distance를 이용하여 그린 3D MSC plot을 통해 생체 외 오가노이드가 이식 4주, 8주 후의 이동경로를 확인한 도이다.
(b) 각 샘플의 유전자 발현 수준에서 비교한 데이터를 히트맵으로 표현한 것이다. 8주 이종이식편 Mat-hIO와 생체 외 성숙 오가노이드가 인간 소장 조직의 유전자 발현과 더욱 유사함을 나타낸다.
(c) Cytoscape 플러그인의 ClueGO에 538개의 유전자의 선택된 용어를 기능적으로 그룹화된 주석 네트워크에서 시각화한 결과를 나타낸다. 노드(원)의 크기는 용어의 통계적 중요성을 반영한다. 가장자리는 용어 간의 연결정도를 나타낸다. 각 색상은 GO 용어 그룹을 나타낸다. 8주간 이종이식된 Cont-hIO에 비해 Mat-hIO 이종이식 그룹의 차이를 보여주는 가장 중요한 용어는 Vascular development이다.
(d) DAVID(https://david.ncifcrf.gov/summary.jsp)에서 DEG의 GOTERM_BP 분석을 통해 Cont-hIO 대비 Mat-hIO 이종이식편(8주)에서 Angiogenesis, Blood vessel development, Vasculogenesis, Cell differentiation 등이 증가된 것을 보여준다.
(e) RNAseq 결과를 기반으로 혈관 마커(hCD31, ANGPT1, KDR)와 중간엽 기질세포 마커(αSMA, VIM, DESMIN), 그리고 소장-특이적 마커(VIL1, KRT20, CHGA, LYZ, DEFA5, OLFM4, MUC2, MUC13, DPP4, LCT, SLC5A1, CREB3L3)의 mRNA 수준을 qPCR을 통해 검증한 도이다. 혈관 마커(hCD31, ANGPT1, KDR)는 Mat-hIO 이종이식 8주차 그룹에서, 중간엽 기질세포 마커이자 혈관주위세포 마커(αSMA)는 Mat-hIO 이종이식 4주차 그룹에서 증가한다.
본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예, 제조예를 제시한다. 하기의 실시예, 제조예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예, 제조예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실험예 1. 세포 배양 및 iPSC 제조
hESC(human embryonic stem cells), hiPSC(human induced pluripotent stem cells)를 포함하는 hPSC(human pluripotent stem cells)는 공지된 방법(Molecular carcinogenesis 55, 387-396 (2016), Proteomics 15, 2220-2229 (2015))으로 배양하였다. 비삽입형-hiPSC는 공지된 방법에 따라 Episomal iPSC 리프로그래밍 벡터(Cat. No. A14703. Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)로 전기천공법(electroporation)으로 트랜스펙션 시켜서 리프로그래밍 되었다.
전기천공 5일 후, 섬유아세포를 마트리젤(Matrigel)(BD Biosciences, San Diego, CA, USA)-코팅된 6-웰 플레이트에 1 x 105개/웰로 플레이팅하고, E8 배지(Stem Cell Technologies, Vancouver, Canada)로 배양하였다. 3주 후, hiPSC 콜로니를 선택하고, 계대배양 및 추후 특징 설정을 위해 세포수를 증대시켰다.
실험예 2. 미성숙 장 오가노이드(Cont-hIO) 제조를 위한 hPSCs의 장 오가노이드로(hIO)의 분화
인간 장 오가노이드(hIOs)를 공지된 방법(Nature 470, 105-109 (2011))을 이용하여 제조하였다. 완전한 내배엽을 유도하기 위해, hPSC를 마트리젤 또는 ECMatrixTM-511로 코팅된 디쉬에 플레이팅하고, 0%, 0.2% 및 2%농도의 정제된 태아 소 혈청(dFBS, Gibco, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA)을 갖는 RPMI 1640 배지에서 3일 동안 100ng/ml Activin A(R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)로 처리하였다. 또한, 3D 후장(hindgut) 스페로이드로 분화시키기 위해, 500ng/ml FGF4(R&D Systems) 및 3μM CHIR99021(TOCRIS)를 2% dFBS가 포함된 RPMI 1640 배지와 함께 4~6일 동안 처리하였다. 후장으로 유도한 4일부터, 스페로이드는 마트리젤(Matrigel, BD Biosciences)에 삽입하고, 1X B27(Invitrogen), 200~250ng/ml R-Spondin 1(R&D Systems), 100ng/ml EGF (R&D Systems) 및 40~50ng/ml Noggin(R&D Systems)이 포함된 hIO 배지(2 mM L-glutamine, 1% Penicillin-Streptomycin, and 15mM HEPES buffer in Advanced DMEM F12)에서 배양하고, 10~14일에 한번씩 계대 배양하였다. 특히 P1부터 계대 배양시 McIlwain Tissue Chopper를 활용하여 자른 후 Matrigel 또는 Vitrogel에 삽입하여 hIO 배지에 배양하였다.
실험예 3. 성숙 장 오가노이드(Mat-hIO)로 제조를 위한 배양 기법
Hindgut 분화 후, 마트리젤에 삽입한 hIO(P0)에 인터루킨 2(Interukine-2, 이하, rhIL-2(R&D Systems))를 1ng/ml(대략 13U/ml) 농도로 매일 hIO 배지에 추가하였다. hIO P2까지 매일 hIO배지에 1ng/ml rhIL-2를 처리하고, 이후, hIO P3부터 2일에 한번 배양 배지를 갈아주면서 rhIL-2를 처리할 수 있다. 특히, 상기 주변 기질 세포의 유지를 위하여 Chopper 등을 사용하여 이를 일정 크기 수준(500 um x 500 um) 이상으로 잘라 계대 배양하였다. 임의로 주변 기질 세포를 분리하지 않아, 고성능 성숙 장 오가노이드의 특성을 유지할 수 있다.
실험예 4. 미성숙(Cont-hIO) 및 성숙 장 오가노이드(Mat-hIO)로부터 중간엽 기질세포 분리 배양
중간엽 기질세포 배양을 위해 배양접시에 1시간 동안 0.2% 젤라틴을 배양접시에 코팅하였다. 미성숙(Cont-hIO) 및 성숙 장 오가노이드(Mat-hIO) P0~P2로부터 장 오가노이드 계대 배양시 오가노이드를 마트리젤 돔으로부터 분리하고, 마트리젤 돔과 바닥에 존재하는 중간엽 기질세포를 ice-Advanced DMEM/F12로 워싱하였다. 이후, Trypsin-EDTA(TE)를 37℃에서 3~5분 처리하여 단일 세포로 분리하고, hIO 배지로 1회 워싱하였다. 원심분리기로 수급한 세포는 미리 젤라틴 코팅된 배양접시에 1x B27, 100ng/ml EGF 가 포함된 hIO 배지를 넣고, 배양한다. 성숙 장 오가노이드 유래 중간엽 기질세포는 2일에 한번 배양 배지를 갈아주면서 rhIL-2(1ng/ml)를 처리할 수 있다. 3~5일 이후 1:3의 비율로 계대 배양을 동일한 방법으로 진행하였다.
실험예 5. 대장 오가노이드(hCO)로 제조를 위한 분화 및 배양 기법
인간 대장 오가노이드(hCOs)를 공지된 방법(Cell Stem Cell 21(1): 51-64 (2017))을 이용하여 제조하였다. 이전에 설명한 대로, 완전한 내배엽을 유도하기 위해, hPSC를 0%, 0.2% 및 2%농도의 정제된 태아 소 혈청(dFBS)을 갖는 RPMI 1640 배지에서 3일 동안 100ng/ml Activin A로 처리하였다. 또한, 3D 후장(hindgut) 스페로이드로 분화시키기 위해, 100ng/ml Activin A, 500ng/ml FGF4 및 3μM CHIR99021를 2% dFBS가 포함된 RPMI 1640 배지와 함께 4~6일 동안 처리하였다. 후장으로 유도한 4일부터, 최소 30개의 스페로이드는 마트리젤에 삽입하고, 1X B27, 100ng/ml EGF 및 100ng/ml BMP2(R&D Systems)이 포함된 hIO 배지(2 mM L-glutamine, 1% Penicillin-Streptomycin, and 15 mM HEPES buffer in Advanced DMEM F12)에서 3일간 패터닝을 진행하였다. 이후, 1X B27, 100ng/ml EGF 포함된 hIO 배지에 배양하고, 14일에 한번씩 계대 배양하였다. 특히 P1부터 계대 배양시 McIlwain Tissue Chopper를 활용하여 500um x 500um으로 자른 후 Matrigel에 삽입하여 1X B27, 100ng/ml EGF 포함된 hIO 배지에 배양하였다.
실험예 6. 인체 대장 조직으로부터 확보한 성체 줄기세포 유래 대장 오가노이드(hCN) 배양
인간 성체 줄기세포 유래 대장 오가노이드(hCN)를 공지된 방법(Methods Mol Biol. 1576:327-337 (2019))을 이용하여 제작 및 배양하였다. 인간 조직은 차가운 생리식염수로 세척하고, 장 점막하(Submucosa)로부터 장 점막 및 상피(Mucosa)를 분리하고, Trypsin-EDTA(TE)로 해리(Dissociation) 하였다. 분리한 Crypt를 4~6회 워싱하고, 150 um filter mesh를 통과시켜 Crypt 또는 gland fraction을 수집한다. 수집한 Crypt를 원심분리기 (150g, 5min)로 펠렛하여 반복적으로 워싱 후 Matrigel과 human Colonoid 배지 (50% v/v Wnt-3A-conditioned medium, 10% v/v R-Spondin-1-conditioned medium, 100 ng/ml recombinant human Noggin (Peprotech, cat no. 120-10C), 50 ng/ml recombinant murine EGF (Peprotech, cat no. 315-09), 500 nM A-83-01 (Sigma-Aldrich, cat no. SML0788), 10 μM SB202190 (Sigma-Aldrich, cat no. S7067), 10 nM [Leu]15-Gastrin-1 human, SB202190 (Sigma-Aldrich, cat no. G9145), 10 mM nicotinamide (Sigma-Aldrich, cat no. N0636), 1 mM N-acetylcysteine (Sigma-Aldrich, cat no. A9165), 2 mM GlutaMAX (Life technologies, cat no. 35050-061), 10 mM HEPES (Life technologies, cat no. 15630-080), 1x penicillin-streptomycin (Life technologies, cat no. 15140-148), 1x N2 supplement (Life technologies, cat no. 17502-048), 1x B27 supplement (Life technologies, cat no. 17504-044), and 1% w/v BSA in advanced DMEM/F12 medium (Life technologies, cat no. 12634-028) 와 1:1 비율로 섞어 48-well 기준 20ul dome 내에 100 crypts가 배양될 수 있도록 씨딩한다. Matrigel dome은 10분간 37℃ CO2 incubator에 굳힌 후, 300ul의 배양액에 2.5 μM CHIR99021 and 2.5 μM thiazovivin를 첨가하여 배양하였다. 2일에 한번씩 Human Colonoid (hCN) medium을 교체하고, 6~8일 마다 1:3~4 ratio로 passaging을 진행하였다. Passaging 시에는 처음 2일간은 10 μM Y-27632를 hCN medium에 첨가하여 배양하고 2일에 한번씩 hCN medium을 교체하여 배양하였다.
실험예 7. 미성숙 또는 성숙 오가노이드 유래 구체 장 줄기세포(InS hIO )로 제조 및 배양 기법
인간 장 오가노이드(hIO)로부터 파생된 3D 장 줄기세포를 공지된 방법(Int J Stem Cells. 28;15(1):104-111 (2022))을 이용하여 제조하였다. 이전에 설명한 대로, 미성숙(Cont-hIO) 또는 성숙 장 오가노이드(Mat-hIO)를 TE를 사용하여 37℃에서 5분간 단일 세포로 분리하고, 1500rpm에서 5분간 원심분리하였다. 세포 펠렛을 마트리젤로 현탁시킨 후, InS-Matrigel 혼합물을 돔을 만들어, CO2 세포배양기에서 30분이상 배양하여 마트리젤 고형화를 진행하였다. 처음 2일 동안은 InSexp 배지(2mM l-glutamine, 15mM Hepes buffer, 1X B27 supplement, 10nM [Leu-15]-gastrin I(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), human recombinant WNT3A(100ng/ml) (R&D Systems), EGF (100 ng/ml), Noggin(100ng/ml), R-spondin1(100ng/ml), 500nM A-83-01(Tocris), 500uM SB202190(Sigma-Aldrich), 10nM prostaglandin E2(SigmaAldrich), 1mM N-acetylcysteine(Sigma-Aldrich), 10mM nicotinamide (Sigma-Aldrich) in Advanced DMEM/F12)에 10μM 의 Y-27632(Tocris) 및 1μM Jagged-1(AnaSpec, Fremont, CA, USA)을 처리하여 배양하였으며, 이후 배지를 InSexp 배지로 2일에 한번씩 교체하였다. 계대 배양의 방법 또한 TE를 사용하여 마트리젤 내부의 세포를 단일세포로 해리한 후 동일한 방법으로 계대 배양을 진행하였다. Mat-hIO로부터 분리된 InSMat-hIO는 매일 1ng/ml rhIL-2를 처리하여 배양하였다.
실험예 8. 중간엽 기질세포의 동결 및 해동
중간엽 기질세포 동결을 위해, 계대 배양 후, 3~5일이 되는 시기에 계대 배양과정과 동일하게 TE를 37℃에서 3~5분 처리하여 단일 세포로 분리하고, hIO 배지로 1회 워싱하였다. 이후, 동결배지(RecoveryTM Cell Culture Freezing Medium, Gibco) 동결하고, LN2 Tank에 장기 보관하였다. 동결한 중간엽 기질세포의 해동을 위해 미리 따뜻한 37℃ hIO 배지를 준비하였다. 동결 세포를 빠르게 해동 후, hIO 배지로 1회 워싱하고, 미리 젤라틴 코팅된 배양접시에 1x B27, 100ng/ml EGF 가 포함된 hIO 배지에서 배양하였다. 성숙 장 오가노이드 유래 중간엽 기질세포는 2일에 한번 배양 배지를 갈아주면서 rhIL-2(1ng/ml)를 처리할 수 있다. 처음 해동시 세포의 상태에 따라 3~7일간 배양 후 동일한 방법으로 계대 배양을 진행하였다.
실험예 9. 정량적 실시간 RT-PCR(qRT-PCR)
전체 RNA는 RNeasy 키트 (Qiagen)를 이용해 세포로부터 추출하였고 Superscript III cDNA 합성 키트(Invitrogen)를 이용해 역전사 시켰다. qRT-PCR은 7500 Fast Real-time PCR 시스템 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)에서 공지된 방법으로 수행하였다 (Cho et al., Oncotarget 6, 23837-23844, 2015). 모든 실험들은 3 번 반복했고, 각 타겟 유전자의 CT 값은 제조사가 제공한 소프트웨어를 이용해 계산하였다. 사용된 프라이머의 염기서열은 표 1과 같다.
Gene 프라이머 (Forward) 서열번호 프라이머 (Reverse) 서열번호
GAPDH GAA GGT GAA GGT CGG AGT C 1 GAA GAT GGT GAT GGG ATT TC 2
ACTA2 (αSMA) TTC AAT GTC CCA GCC ATG TA 3 GAA GGA ATA GCC ACG CTC AG 4
VIM AGA ACG TGC AGG AGG CAG AAG AAT 5 TTC CAT TTC ACG CAT CTG GCG TTC 6
DES CAG TGG CTA CCA GGA CAA CA 7 CTC AGA ACC CCT TTG CTC AG 8
PECAM1(CD31) TGC GGC CAA ATG TTA TTT TC 9 TGC ATG GTT TCT GAC ATC GT 10
CDH5 CAG CCC AAA GTG TGT GAG AA 11 CGG TCA AAC TGC CCA TAC TT 12
ECSCR GAG CAT GAG GGA AGA TGC GAC 13 TGA CCA CAC CAA CTA GGA TGA 14
LYVE1 GCT TTC CAT CCA GGT GTC AT 15 ACC ACG AAT CCA TCT CCA AC 16
VIL1 AGC CAG ATC ACT GCT GAG GT 17 TGG ACA GGT GTT CCT CCT TC 18
KRT20 TGG CCT ACA CAA GCA TCT GG 19 TAA CTG GCT GCT GTA ACG GG 20
LYZ AAA ACC CCA GGA GCA GTT AAT 21 CAA CCC TCT TTG CAC AAG CT 22
SI GGT AAG GAG AAA CCG GGA AG 23 GCA CGT CGA CCT ATG GAA AT 24
LCT TCC TCG CCT ACA ACC TCA AC 25 GCT GGG ACA CTC CAT TCT CT 26
OLFM4 ACC TTT CCC GTG GAC AGA GT 27 TGG ACA TAT TCC CTC ACT TTG GA 28
CHGA TGA CCT CAA CGA TGC ATT TC 29 CTG TCC TGG CTC TTC TGC TC 30
MUC5B GGG CAC CAA AGA GCA TAG AG 31 AAA GCA CAC GCA CGT TGT AG 32
SATB2 CCT CCT CCG ACT GAA GAC AG 33 TGG TCT GGG TAC AGG CCT AC 34
CA ± TGC TTT CAA CGT GGA GTT TG 35 CCC CAT ATT TGG TGT TCC AG 36
MUC2 TGT AGG CAT CGC TCT TCT CA 37 GAC ACC ATC TAC CTC ACC CG 38
MUC13 CGG ATG ACT GCC TCA ATG GT 39 AAA GAC GCT CCC TTC TGC TC 40
DPP4 CAG AAG ACT GGG AAC ATT TGA 41 CAC ACT TGA ACA CGC CAC TT 42
ASCL2 CGT GAA GCT GGT GAA CTT GG 43 GGA TGT ACT CCA CGG CTG AG 44
AXIN2 GAG TGG ACT TGT GCC GAC TTC A 45 GGT GGC TGG TGC AAA GAC ATA G 46
OCT4 GCT CGA GAA GGA TGT GGT CC 47 CGT TGT GCA TAG TCG CTG CT 48
NANOG GCA GAA GGC CTC AGC ACC TA 49 AGG TTC CCA GTC GGG TTC A 50
FOXA2 TGG GAG CGG TGA AGA TGG AAG GGC AC 51 TCA TGC CAG CGC CCA CGT ACG ACG AC 52
SOX17 CGC TTT CAT GGT GTG GGC TAA GGA CG 53 TAG TTG GGG TGG TCC TGC ATG TGC TG 54
CDX2 CTG GAG CTG GAG AAG GAG TTT C 55 ATT TTA ACC TGC CTC TCA GAG AGC 56
LGR5 TGC TCT TCA CCA ACT GCA TC 57 CTC AGG CTC ACC AGA TCC TC 58
ANGPT1 GGG GGA GGT TGG ACT GTA AT 59 GAA TAG GCT CGG TTC CCT TC 60
KDR CCC ACG TTT TCA GAG TTG GT 61 CGG CTC TTT CGC TTA CTG TT 62
DEFA5 CCT TTG CAG GAA ATG GAC TC 63 GGA CTC ACG GGT AGC ACA AC 64
SLC5A1 GTG CAG TCA GCA CAA AGT GG 65 ATG CAC ATC CGG AAT GGG TT 66
CREB3L3 ATC TCC TGT TTG ACC GGC AG 67 GTC GTC AGA GTC GGG GTT TG 68
IGF2 GTG GCA TCG TTG AGG AGT G 69 CAC GTC CCT CTC GGA CTT G 70
실험예 10. 세포 및 조직 면역형광염색
면역형광검사는 공지된 방법에 따라 수행하였다 (Kwak et al., Biochemical and biophysical research communications 457, 554-560, 2015). 구체적으로, hPSC 및 완전 내배엽 세포를 4% 파라포름알데하이드(PFA)로 고정시키고, 0.1% 트리톤 X-100을 함유하는 PBS로 투과시켰다.
hIO 및 조직을 고정시키고, 수크로오스로 동결 보호한 뒤, 최적 절단 온도(OCT) 화합물(Sakura Finetek, Tokyo, Japan)을 이용하여 동결시켰다. 이후, -20℃에서 크라이스탯 마이크로톰을 사용하여 냉동 절편을 10㎛로 절단하고, 면역형광검사를 위해 0.1% 트리톤 X-100을 함유하는 PBS로 투과시켰다.
구체적으로, 4% BSA로 블로킹 후 세포를 4℃에서 하룻밤 동안 1차 항체와 반응시켰다. 이후, 상온에서 1시간 동안 2차 항체와 반응시켰다. 사용된 일차 항체는 표 2와 같다. DAPI는 핵을 시각화하기 위해 추가하였다. 슬라이드는 EVOS FL Auto2 (ThermoFisher)와 Axiovert 200M 현미경 (Carl Zeiss, Gottingen, Germany) 또는 형광 현미경(IX51, Olympus, Japan)을 통해 관찰하였다.
항체 Catalog No. 회사 희석
anti-α-SMA A5228 Sigma 1:500 for IHC
anti-hCD31 MA5-15336 Thermo Scientific 1:400 for IHC
anti-PECAM-1 sc-376764 Santa Cruz 1:50 for IHC
anti-VE-Cadherin AF938 R&D systems 5-15 μg/mL
anti-VEGF sc-7269 Santa Cruz 1:50 for IHC
anti-E-Cadherin 610182 BD Biosciences 1:200 for IHC
anti-E-Cadherin AF648 R&D systems 1:500 for IHC
anti-E-Cadherin Ab1416 Abcam 1:100 for IHC
*IHC: Immunohistochemistry
실험예 11. RNA 시퀀싱 및 RNA 정량
RNA 염기순서 결정과 정량을 위해 우선 RNA 샘플은 Agilent 2100 Bioanalyzer system (Agilent Biotechnologies, Palo Alto, USA)을 통해 RNA Integrity Number (RIN) 값이 7.5 이상으로 준비하였고, mRNA 라이브러리는 Illumina TruSeq 키트를 통해 준비하였고, Illumina HiSeq2500 machines (Illumina, San Diego, CA, USA)을 통해 시퀀싱을 수행하였다. FastQC package를 통해 시퀀싱 퀄러티를 결정하고, 트림된 길이(trimmed read length)가 50염기 이하는 제외하였다. 그 후 HISAT2 (v2.0.5)를 통해 맵핑을 수행하였고, 인간 유전체 정보는 hg19를 활용하였다. Cuffquant와 Cuffnorm (Cufflinks v2.2.1)를 통해 샘플간 차별적으로 발현된 유전자 (DEG: differentially expressed gene)를 분석하였다.
실험예 12. 생물정보학적 분석
생물정보학적 분석은 IPA 분석 소프트웨어(Ingenuity systems, Redwood City, CA, USA), PANTHER(Protein ANalysis THrough Evolutionary Relationships, http://www.pantherdb.org) 데이터베이스 및 DAVID 생물정보학 리소스 6.7 (http://david.abcc.ncifcrf.gov)를 사용하여 진행하였다. 또한, 세포 타입을 확인하기 위한 유전자 온톨로지(GO)/경로는 EnrichR(https://maayanlab.cloud/Enrichr/)을 사용하여 분석하였다. 기능적으로 그룹화된 유전자 온톨로지(GO)/경로는 ClueGO plug-in (Version 2.2.5, http://apps.cytoscape.org/apps/cluego)와 함께 사이토스케이프 소프트웨어 플랫폼(Cytoscape software platform, version 3.3.0, http://www.cytoscape.org/what_is_cytoscape.html)을 사용하여 분석하였다.
실험예 13. Single cell RNA 시퀀싱 및 분석
10x Genomics 파이프라인 CellRanger(버전 7.0.0)를 사용하여 시퀀싱 데이터를 처리하고 기본 매개변수를 사용하여 필터링된 유전자-바코드 매트릭스를 생성하였다. 필터링된 유전자-바코드 매트릭스를 R 패키지 Seurat(버전 4.1.1)를 사용하여 다운스트림 분석을 위한 입력으로 사용하였다. 잠재적인 저품질 세포 및 이중선을 제거하기 위해 최소 200개의 유전자와 9000개 이상의 유전자가 있는 세포와 미토콘드리아 비율이 25%보다 큰 세포를 제거하였다. 그 후, SCtransform(버전 0.3.3)을 수행하여 각 데이터 세트를 정규화하고 모든 샘플에서 보존된 가장 큰 변동 소스를 식별하기 위해 표준 상관 분석을 통해 샘플 통합을 준비하였다. FindVariableFeatures 기능을 사용하여 HVG(고가변 유전자)를 식별한 후 FindIntegrationAnchors 및 Integrateddata 기능을 사용하여 여러 샘플 데이터를 통합하였다. 샘플을 통합한 후 primary component (PC)를 결정하고 처음 50개의 PC를 클러스터링 해상도가 0.8인 K-최근접 이웃 그래프를 사용하여 셀을 클러스터링하는데 사용하였다. 세포 클러스터를 UMAP을 사용하여 시각화하였다. 각 클러스터의 조건 간에 차등적으로 발현되는 유전자를 결정하기 위해 Wilcoxon Rank Sum 테스트(min.pct=0.25, logfc.threshold=0.25) 및 Bonferroni 보정에 의한 p 값 조정과 함께 FindMarkers 기능을 사용하였다.
실험예 14. 효소면역분석법(ELISA)
미성숙 또는 성숙 장 오가노이드로부터 분리한 중간엽 기질세포를 5일간 배양하고, 배양액을 모아 세포로부터 분비된 인자를 측정하였다. 혈관의 분비 인자인 VEGF의 수준을 VEGF Huma ELISA Kit(R&D Systems)를 사용하여 공고된 실험 방법에 따라 수행하였으며, 측정된 값은 총 세포의 총 단백질 농도로 표준화되었다.
실험예 15. Human XL cytokine array
미성숙 또는 성숙 장 오가노이드로부터 분리한 중간엽 기질세포를 5일간 배양하고, 배양액을 모아 세포로부터 분비된 인자를 측정하였다. Human XL Cytokine Array Kit (RY022B, R&D Systems)를 사용하여 공고된 실험 방법에 따라 수행하였으며, 측정된 값은 FujiFilm LAS-3000을 통해 Dot blot의 밀도를 측정하여 분석을 수행하였다.
실험예 16. Human Angiogenesis Array
미성숙 또는 성숙 장 오가노이드로부터 분리한 중간엽 기질세포를 5일간 배양하고, 배양액을 모아 세포로부터 분비된 인자를 측정하였다. Human Angiogenesis Array Kit (ARY007, R&D Systems)를 사용하여 공고된 실험 방법에 따라 수행하였으며, 측정된 값은 FujiFilm LAS-3000을 통해 Dot blot의 밀도를 측정하여 분석을 수행하였다.
실험예 17. 조직학적(Hematoxylin&Eosin, H&E) 염색 실험
조직병리학적 분석을 위해 결장 조직을 Transverse, Swiss-roll, Longitudinal 형태로 10% 포르말린에 고정하고 동결보존을 위해 10%, 20%, 30% 수크로오스 용액에 차례로 배양하였다. 이후, 조직을 Tissue-Tek® O.C.T 화합물(Sakura® Finetek, Tokyo, Japan)에 포매하고 5~10 μm 두께로 냉동절편하고 슬라이드 글라스에 접착시킨 후, 공고된 방법에 따라 H&E 염색을 진행하였다. 슬라이드는 광학 현미경(BX53F, Olympus, Japan)을 통해 관찰하였다.
실험예 18. 파스(PAS)/뮤시칼민(Mucicarmine) 염색 실험
성숙한 배상세포에서 방출하는 뮤신 점액질을 염색하는 기법을 이용하여 성숙 장오가노이드에서 성숙한 기능성 배상세포를 확인하였다. 먼저 대조군 및 성숙 장 오가노이드는 4% 파라포름알데히드 (para-formaldehyde)로 고정된 후 10%, 20%, 30% 수크로오스 용액으로 추가 고정시켰다. 이후 OCT를 이용하여 동결하였고, 크라이스탯 마이크로톰을 이용하여 10um두께로 냉동절편하고 슬라이드 글라스에 접착시킨 후 Alcian Blue PAS Stain Kit를 사용하여 염색을 진행하였다. 슬라이드는 광학 현미경(BX53F, Olympus, Japan)을 통해 관찰하였다.
실험예 19. 장 상피 손상 모델(EDTA-induced intestinal epithelial injury model)
EDTA로 유도된 장 상피 손상 모델은 공지된 방법(Cell Stem Cell 22(2):171-176 (2018))을 이용하여 제작되었다. NSG 또는 NIG 마우스 (수컷, 6~12주령)는 금식하지 않고, 표준 식단을 먹였으며, 12시가 낮/밤 주기 일정한 온도(20-22℃)에서 유지하였다. 250-500 mg/kg Tribromoethanol (Avertin)의 복강 주사로 마취시켰다. 장 내 내용물을 제거하기 위하여 마우스의 결장에 얇은 카테터를 삽입하여 PBS로 세척하였다. 이후, 항문 가장 자리, 직장의 손상을 위하여 50℃ 250mM EDTA/PBS 200 ul를 2분간 천천히 장내 주입하였다. EDTA/PBS 노출 2분 후, 장 내(lumen)을 PBS로 1분간 세척하였다. 이후 부드러운 치간 브러시가 장착된 전동칫솔(EW-DL22, EW0945, Panasonic Holdings Corp., Japan)을 사용하여 1분간 상피 찰과상을 생성하였다. 이때, 브러시 헤드는 결장에 1.5 cm 삽입하여 장 상피 표면을 원형으로 긁어내고, 1분 후 브러시를 PBS에 세척 시 분리된 Crypt가 관찰되면 성공 여부를 확인할 수 있다. 이후, 장 내를 PBS로 다시 세척하였다.
실험예 20. 염증성 장질환 모델(DSS-induced colitis model)
NSG 또는 NIG 마우스 (수컷, 6-12주령)는 금식하지 않고, 표준 식단을 먹였으며, 12시가 낮/밤 주기 일정한 온도(20-22℃)에서 유지하였다. DSS 유도 대장염 모델은 5~7일간 5%(w/v) DSS(36-50 kDa; MP Biomedicals, Hampton, NH, USA)가 포함된 음용수 투여하였다. 3일간 소화기간 내 DSS를 제거하기 위하여 음용수를 투여하여 이식을 준비하였다. DSS 유도 염증성 장 모델은 질병활성지수(Disease activity index, DAI) 평가를 위하여 매일 체중, 대변 일관성, 출혈 매개변수를 측정하였다.
실험예 21. 장 내 이식(Colonic transplantation)
이종 이식을 위해 마트리젤에서 10일간 성장한 오가노이드는 마트리젤에서 분리하여, 차가운 hIO 배지로 워싱하였다. 3D 세포인 hIO, hCO InShIO를 이식 전 Chopper를 활용하여 일정한 크기, 200um x 200um로 절삭하고, Matrigel/Advanced DMEM/F12(1:10) 또는 Fibrin에 현탁하였다. 100 ul 현탁액에는 1~2 x 106 세포가 포함되어있다. 또한, 오가노이드 유래 중간엽 기질세포를 계대 배양 방법과 동일하게 TE를 사용하여 단일 세포로 분리 후 100 ul 현탁액에 1~2 x 106 세포가 포함되도록 준비하였다. 오가노이드 또는 3D 장 줄기세포와 중간엽 기질세포를 동시 이식할 때에는, 1:1 비율로 전체 세포가 2 x 106 cells/100ul 이 되도록 하였다. 이식 전, 금식하지 않고, 표준 식단을 먹였으며, 250-500 mg/kg Tribromoethanol(Avertin)의 복강 주사로 마취시킨다. 장 내 내용물을 제거하기 위하여 마우스의 결장에 얇은 카테터를 삽입하여 PBS로 세척하였다. 200 ul 파이펫, 부드러운 카테터, 또는 내시경 카테터를 사용하여 질환이 유발된 마우스의 결장 내강에 주입하였다. Matrigel에 현탁하여 주입한 경우에는 이식 세포의 장내 유지를 촉진하기 위해 항문 가장자리를 접착제(Vetbond Tissue Adhesive) (3M, USA)으로 8~12시간 동안 부착하였다. 참고로 Cell + Fibrin / Thrombin ECM 활용시에는 Anal verge 단계는 하지 않아도 된다. 각 관찰 시기에, 마우스를 인도적으로 안락사 시키고 이종이식편을 분석용으로 분리하였다. 결장 조직의 이종이식편 확인을 위하여, 도립형광해부현미경 (SZX16, Olympus)를 사용하여 관찰하였다.
실험예 22. 대장내시경(Colonoscopy)
장 내 염증도 및 환경을 확인하기 위해 내시경 전 Avertin 복강 주사로 마취하였다. 장 내 내용물 제거를 위해 마우스 결장을 얇은 카테터를 삽입하여 PBS로 세척하였다. 에어펌프를 이용한 의료용 가스 주입과 견고한 HOPKINS 망원경(Karl Storz)의 내시경을 직장에 조심스럽게 삽입하여 내시경 이미지가 기록되었다.
실험예 23. 신장막하 이식(Renal Capsule Transplantation)
8~12 주령 NSG 마우스를 표준동물 유지 시설에서 수용하였다. 이종 이식을 위해 1X B27, 100ng/ml EGF가 포함된 hIO 배지에서 계대 이후 10일간 배양된 오가노이드(P1)는 마트리젤에서 분리하여, 차가운 hIO 배지로 워싱하였다. 오가노이드는 차가운 hIO 배지에 보관하였다. 이식 전, 금식하지 않고, 표준 식단을 먹였으며, 2% isoflurane(Butler Schein)으로 흡입 마취시킨다. 이소프로필 알코올과 포비딘-요오드를 사용하여 마우스 양쪽 후방 늑골을 닦아내고, 절개하였다. 신장을 노출시켜 양쪽 신장 막하에 각각 Cont-hIO와 Mat-hIO를 1개씩 이식하였다. 그런 다음 신장을 복강으로 되돌려 높고, 피부의 이중층을 suture로 닫는다. 8주 생착 후, 마우스를 인도적으로 안락사 시키고, 신장 조직의 이종이식편 확인을 위하여, 도립형광해부현미경 (SZX16, Olympus)를 사용하여 관찰하였다.
실험예 24. 배양액 및 성장인자에 따른 장 줄기세포의 세포 성상 변화 분석
인간 장 오가노이드(hIO)로부터 파생된 장 줄기세포를 공지된 방법(Int J Stem Cells. 28;15(1):104-111 (2022))을 이용하여 분리하였다. 세포를 분리하기 전 1% Matrigel in Advanced DMEM/F12(Gibco)로 1시간 동안 코팅하고, 이전에 설명한 대로 미성숙(Cont-hIO) 장 오가노이드는 TE를 사용하여 37℃에서 5분간 단일 세포로 분리하고, 1500rpm에서 5분간 원심분리하였다. 세포 펠렛을 ISC3D-hIO 배지 (InSexp 배지와 동일 (2mM l-glutamine, 15mM Hepes buffer, 1X B27 supplement, 10nM [Leu-15]-gastrin I(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), human recombinant WNT3A(100ng/ml) (R&D Systems), EGF (100 ng/ml), Noggin(100ng/ml), R-spondin1(100ng/ml), 500nM A-83-01(Tocris), 500uM SB202190(Sigma-Aldrich), 10nM prostaglandin E2(SigmaAldrich), 1mM N-acetylcysteine(Sigma-Aldrich), 10mM nicotinamide (Sigma-Aldrich) in Advanced DMEM/F12)로 배양하나, 처음 2일 동안은 10μM 의 Y-27632(Tocris) 및 1μM Jagged-1(AnaSpec, Fremont, CA, USA)을 처리하여 배양하였다, 이후 배지를 ISC3D-hIO 배지로 2일에 한번씩 교체하였다. 계대 배양의 방법 또한 TE를 사용하여 표면의 부착된 세포를 단일세포로 해리한 후 동일한 방법으로 계대 배양을 진행하였다. Cont-CM, Mat-CM, hMSC-CM에, 및 배양 배지(MSC medium: MSC3D-hIO 배지, ISC medium: ISC3D-hIO 배지)와 성장인자 (100 ng/ml, BMP4)에 따른 세포의 성상 변화를 확인하기 위하여 1~3일간 처리하고 관찰하였다.
실험예 25. 크레실 바이올렛 (Cresyl violet; CV) 염색 실험
장 줄기세포 (ISC)를 PBS로 2회 수세 후, 10% 포르말린으로 10분간 고정하였다. 고정액을 제거 후, 0.5% 크레실 바이올렛 용액을 첨가하여 10분간 배양하였다. 이후, 염료가 나오지 않을 때까지, PBS를 수세하고 관찰하였다.
실험예 26. 실시간 세포대사 분석
세포의 산소소모율(OCR)과 세포외 산성도율(ECAR)을 측정을 위해, ISC 세포를 측정 2일전에 Seahorse XF Pro M Cell Culture Microplate에 20,000 개의 세포를 배양하였다. 분석 전날, 특정 배지를 12시간 노출하였다. 분석 당일, 배양 배지를 제거하고 따뜻한 분석 배지 (Agilent Seahorse XF DMEM Medium pH 7.4, 103575-100) 로 1회 세척하였다. 산소소모율을 측정하기 위해 분석배지에 1 mM 글루타민, 1 mM 피루브산, 2 mM 글루코스을 첨가하고, 세포외 산성도율을 측정하기 위해 1 mM 글루타민을 첨가하였다. 배양 플레이트를 37°C CO2 인큐베이터에 1시간 동안 넣고 제조사의 지침에 따라 Seahorse XFe96 Pro Analyzer로 산소소모율 및 세포외 산성도율을 측정하였다. 산소소모율 측정을 위해 1.5 μM 올리고마이신, 5 μM FCCP, 1 μM 로테논 + 1 μM 안티마이신 A를 각 시점에 순차적으로 추가하였고, 세포외 산성도율 측정을 위해 1.5 μM 올리고마이신, 100 mM 글루코스 50 mM 2-D-글루코스를 각 표시된 시점에 순차적으로 추가하였다. 측정값은 단백질 정량을 통해 정규화 하여 분석하였다.
실험예 27. HUVEC 혈관 형성 시험 (Tubule formation assay)
96-well culture plate에 50 ul Matrigel (최소 단백질 농도 10 mg/ml)을 코팅하고, 30분간 37℃ CO2 incubator에 배양하였다. EGM-2 Growth medium (CC-3162, Lonza)에서 70~80% 성장한 HUVEC (C2517A, Lonza)을 TE 처리하여, 단일세포로 분리하고, EBM-2 (CC-3156, Lonza)에 2% FBS, 35 ng/ml bFGF 첨가한 배지에 각 조건의 성장인자(100 ng/ml, IGF2) 및 2% CM (Cont-CM, Mat-CM)를 넣고 세포를 희석하여 2-2.5 X 104 cells/well, 200 ul로 Matrigel 코팅된 plate에 씨딩하고, 0시간, 6시간에 관찰하였다.
실험예 28. HUVEC 상처 회복 시험 (Wound healing assay)
24-well culture plate에 0.2% Gelatin을 코팅하고, 1시간 동안 37℃ CO2 incubator에 배양하였다. EGM-2 Growth medium (CC-3162, Lonza)에서 70~80% 성장한 HUVEC (C2517A, Lonza)을 TE 처리하여, 단일세포로 분리하고, EGM-2 Growth medium를 넣고 세포를 희석하여 0.5-1 X 105 cells/well 로 씨딩하고 1일간 배양하였다. 2일차에 EBM-2 (CC-3156, Lonza)에 2% FBS, 35 ng/ml bFGF 첨가한 배지에서 1일간 배양 후 (70~80% 성장), 3일차 200㎕ tip을 활용하여 scratch를 낸 후, 각 조건의 성장인자(100 ng/ml, IGF2) 및 2% CM (Cont-CM, Mat-CM)를 넣고, 0시간, 36시간에 관찰하였다.
실험예 29. 통계 분석(Statistical analysis)
모든 생체외 실험 결과는 평균에 대한 평균 ± 표준 오차(s.e.m)로 표현되며, 최소 3회 반복되었다. 정량 분석은 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 수행하였다. P값은 양측 t-검정(two-tailed Student's t-test) 또는 단측 ANOVA를 사용하여 결정하였다. Crypt depth의 길이 분석은 Welch's t-검정(Welch's t-test)으로 결정하였다. 통계적 유의성에 대한 모든 분석은 달리 명시하지 않는 한 대조군과 비교하여 계산하였다.
실시예 1. 이식에 활용하기 위한 hPSC-유래 hIO로부터 중간엽 기질세포 분리 및 배양
전술한 바와 같이, hIO 분화 프로토콜을 사용하여, hESC 라인 또는 비삽입형-hiPSC 라인을 포함하는 hPSC로부터 hIO를 제조하였다. 이후, P0부터 1ng/ml rhIL-2와 공배양한 성숙 오가노이드와 기존의 미성숙 오가노이드 P0~P2로부터 중간엽 기질세포를 분리하였고, 계대 배양시 동결 및 해동 과정을 모식도로 보여주었다(도 1a). Cont-hIO, Mat-hIO (P2)로부터 분리한 중간엽 기질세포(P0)는 1X B27, 100ng/ml EGF가 포함된 hIO 배지에서 배양 가능하고, P10까지 유지되었다(도 1b). 또한, 계대 배양시 중간엽 기질세포의 대표 마커인 (αSMA, VIM, DES)가 발현되는 것을 확인하였다(도 1c).
분리된 중간엽 기질세포의 특성을 면밀히 확인하기 위하여, 전분화능줄기세포 (hESC-H9, hiPSC-CRL), 기판매되는 인간 중간엽 줄기세포(hMSC) 및 유도만능줄기세포로부터 분화된 중간엽줄기세포(MSCiPSC)를 대조군으로 삼았다. 면역형광염색을 통하여 Smooth muscle cells 또는 pericyte의 마커인 αSMA의 발현을 모든 세포에서 확인되었다. 하지만, 성숙 장 오가노이드 유래 중간엽 기질세포에서는 αSMA와 함께, 인간 혈관 내피 세포 마커인 hCD31+의 발현이 관찰되었다 (도 2a). 유전체 정보 분석을 위하여, RNA 시퀀싱을 진행하여, 샘플간의 유사도와, DEG 분석을 통해 그룹간 차별적 유전자를 선별하였다 (도 2b). MDS plot을 통해 Mat-hIO로부터 유래된 중간엽 기질세포(MSC)와 Cont-hIO 유래 중간엽 기질세포의 차이가 있음을 확인하고(도 2c), EnrichR의 GOterm 분석을 통해 Endothelial cell type 특성이 있음을 규명하였다(도 2d). 두 그룹 간의 차이는 qPCR을 통해 혈관생성인자 (CD31, CDH5, ECSCR, LYVE1)의 발현 확인으로 검증되었으며, ELISA를 통해 혈관 분비 인자인 VEGF를 검출함으로써 Mat-hIO 유래 MSC의 새로운 특성을 밝혔다(도 2e, f).
위와 같은 결과로부터 Mat-hIO로부터 유래된 중간엽 기질세포(MSC)가 미성숙 오가노이드 유래 중간엽 줄기세포, 기판매되는 인간 중간엽 줄기세포 및 유도만능줄기세포로부터 분화된 중간엽줄기세포와 상이한 특성을 가지고 있음이 확인되었다. 유전자 수준에서 면밀한 분석을 위하여, single cell RNAseq을 진행하여 Cont-hIO 1종, Mat-hIO 2종을 분석하였을 때, 중간엽 기질세포 그룹(Mesenchyme cluster)에서 총 7개의 그룹(8_0, 8_1, 8_2, 8_3, 8_4, 8_5, 8_6)으로 구성되어 있으며, 8_0, 8_6을 제외한 나머지 그룹에서 Mat-hIO의 중간엽 기질세포 특성을 확인하였다 (도 3a). Cont-hIO 대비 Mat-hIO의 Mesenchyme 그룹에서 Differentially Expressed Genes(DEGs)를 선별하여, Up-regulation 되는 Gene ontology biological process(GOBP)는 Epithelial cell adhesion cellular vascular endothelial stimulation과 관련된 Term이 있으며, DAVID(https://david.ncifcrf.gov/summary.jsp)에서 DEG의 GOTERM_BP 분석에서도 Cont-hIO 대비 Mat-hIO에서 Cell adhesion, Angiogenesis, Differentiation, Mesenchyme development 등이 증가된 것을 확인하였다 (도 3b 내지 e). 또한, Mat-hIO의 중간엽 기질세포 cluster에서 DEG의 volcano plot을 통해 Mat-hIO의 중간엽 기질세포에서 up-regulation된 유전자는 대표적으로 IGF2, FOXF1, CXCL14, BMP4, IGFBP3, APOA1, PDGFRA, FOXF2, PTCH1, VEGFA, NKX2-3, BMP5, ITGA8, NRG1, ADAM28, COL4A5, DLL1 등이 있음을 보여주었다 (도 3f). 상세한 gene list는 표 3과 같다.
p_val avg_log2FC
IGF2.1 9.66E-28 1.059351744
FOXF1 1.50E-25 0.839701803
CXCL14 7.19E-08 0.798390905
BMP4 4.03E-17 0.781237745
IGFBP3 9.76E-11 0.659753907
APOA1 1.09E-26 0.642983424
PDGFRA 6.20E-17 0.642415099
FOXF2 1.60E-14 0.56758628
PTCH1 1.54E-12 0.551034596
VEGFA 1.33E-10 0.491855898
NKX2-3 1.03E-13 0.487365795
BMP5 9.30E-09 0.473039399
COL9A1 2.67E-08 0.432872887
ITGA8 1.39E-06 0.419933776
NRG1 6.00E-08 0.415831905
ADAM28 1.17E-08 0.414366444
COL4A5 2.14E-06 0.397617201
DLL1 8.21E-08 0.381424539
실시예 2. 미성숙 또는 성숙 hIO 유래 중간엽 기질세포 인자 비교
scRNAseq 분석 결과를 바탕으로, Cont-hIO 유래 MSC 대비 Mat-hIO 유래 MSC의 유전자 수준의 차이 (DEG)를 확인하고, 분비되는 단백질 인자를 확인하기 위하여 Cont-MSC, Mat-MSC 배양액을 모아 사이토카인 및 혈관관련 인자를 Array kit로 확인하였다. 사이토카인 어레이 키트(Human XL Cytokine Array kit)를 통해 Angiogenin, DKK1, EGF, Osteopontin, ICAM-1, IGFBP-3, VCAM-1, 이 증가하는 것을 확인하였으며, 혈관인자 어레이 키트(Human Angiogenesis Array kit)를 통해 Angiogenin, Activin A, MCP-1이 유의하게 증가하는 것을 확인하였다 (도 4).
실시예 3. 성숙 hIO 유래 중간엽 기질세포 특이적 인자에 따른 ISC 성상 변화
scRNAseq 분석 결과를 바탕으로, Cont-hIO 유래 MSC 대비 Mat-hIO 유래 MSC의 유전자 수준의 차이에서 장 줄기세포(ISC)에 영향을 주는 인자들을 확인하였으며, 실제 ISC에 성상 변화를 확인하기 위하여, 중간엽 기질세포의 배양액 (Cont-CM, Mat-CM, hMSC-CM)을 처리하여 관찰하였다. hIO 유래 중간엽 기질세포의 배양액에서 3일차에 확연하게 세포의 성상 및 분포가 변화하는 것을 확인하였으며, 특히 Mat-CM의 경우, 1일차에서 급격한 변화를 유도하였다. CV 염색을 통해 1일차에 Mat-CM에서 세포의 성상 변화 뿐만 아니라 분포가 Cont-CM에 비해 빠르게 증가하였음을 보여준다 (도 5a 내지 c). 분비인자 중 ISC에 특히 영향을 주는 인자를 확인하기 위하여, 유전자 수준에서 유의한 증가를 보였던 성장인자 (BMP4)을 처리한 결과 BMP4 처리시에 세포의 성상이 hIO 유래 중간엽 기질세포의 배양액 처리시와 비슷한 것을 확인하였고(도 5d), Cont-CM+ BMP4 동시 처리시에 Cont-CM 단독 처리에 비해 세포의 분포가 증가하고, 성상이 더 빠르게 변화하는 경향을 보였다 (도 5e).
실시예 4. 성숙 hIO 유래 중간엽 기질세포 특이적 인자에 따른 ISC 세포대사 변화
ISC 배지에서 배양한 ISC와 Cont-CM, Mat-CM에서 배양한 ISC 간에 기초 산소소모율(Basal OCR) 및 세포외 산성도율(Basal ECAR)은 차이가 없으나, 최대호흡량(Maximum respiration)은 ISC 배지에 비해 성숙 hIO 유래 중간엽 기질세포 배양액 처리군(Mat-CM)에서 1.36 배 향상되었다 (도 6a 내지 c). 해당용량(Glycolytic capacity)과 해당 비축량(Glycolytic reserve)이 Mat-CM 그룹에서 각각 1.18 배 1.72 배 향상됨을 확인하였다 (도 6d). 이는 생체 생성단위 물질 및 ATP를 많이 합성할 수 있는 세포(분화세포)로 ISC가 전환됨을 의미한다.
실시예 5. 성숙 hIO 유래 중간엽 기질세포 특이적 인자에 따른 HUVEC 의 Tubule formation
scRNAseq 분석 결과를 바탕으로, Cont-hIO 유래 MSC 대비 Mat-hIO 유래 MSC의 유전자 수준의 차이에서 Endothelial cell(HUVEC)에 영향을 주는 인자 (IGF2) 을 처리하여, Tubule formation assay를 수행하였다. 25,000 cells per well의 조건으로 씨딩하여 4시간, 8시간을 각각 관찰하였을 때, EBM-2+bFGF(Basal medium)에 비해 IGF2 처리시 4시간부터 빠르게 Tubule가 형성되는 것을 보여주며, 8시간에 Complete tubule 형성률이 높은 것을 확인하였다 (도 7a). IGF2 인자의 효능을 확인하기 위하여, Cont-CM에 IGF2를 추가하여 비교하였다. Cont-CM 단독처리 보다 IGF2를 첨가한 배지에서 Complete tubule이 Mat-CM 처리군과 유사하게 형성되는 것을 검증하였으며, HUVEC세포의 EGM-2 배지에 비해서도 잘 형성되는 것을 확인하였다 (도 7a). ImageJ를 통해 정량평가를 진행하였을 때, Junction과 Segments의 개수가 Cont-CM에 비해 Cont-CM+IGF2, Mat-CM에서 유의적으로 증가하는 것을 검증하였다 (도 7b). EBM-2+IGF2(Basal medium)에 비해 Total length는 Cont-CM, Cont-CM+IGF2, Mat-CM에서 유의적으로 증가하는 것을 확인하였다.
실시예 6. 성숙 hIO 유래 중간엽 기질세포 특이적 인자에 따른 HUVEC 의 Wound healing(Migration)
scRNAseq 분석 결과를 바탕으로, Cont-hIO 유래 MSC 대비 Mat-hIO 유래 MSC의 유전자 수준의 차이에서 Endothelial cell(HUVEC)에 영향을 주는 인자 (IGF2) 을 처리하여, Wound healing assay를 수행하였다. 200㎕ tip을 활용하여 scratch를 낸 후 0시간, 36시간을 각각 관찰하였을 때, EBM-2+bFGF(Basal medium) 또는, Cont-CM에 비해 Cont-CM+IGF2, Mat-CM에서 유의적으로 wound size가 감소하는 것을 확인하였다 (도 8a). ImageJ를 통해 정량평가를 수행하여, 면적의 차이가 증가하는 것을 검증하였다 (도 8b).
실시예 7. 성숙 hIO 유래 중간엽 기질세포 이식 효능 검증
Mat-hIO 유래 MSC의 혈관 내피 인자 발현은 이식 시 생착에 도움을 줄 수 있다. 따라서 미성숙 또는 성숙 장 오가노이드에서 유래한 MSCMat-hIO와 Cont-hIO의 동시 이식을 통해 MSCMat-hIO의 이식 효능을 알아보았다(도 9a, b). 면역결핍마우스의 장 상피 손상 모델에 Cont-hIO 단독 이식 및 MSCMat-hIO 과 동시 이식을 수행하고 대장내시경 및 해부형광현미경을 통해 상피 손상도 및 세포 생착도를 확인하였다. Cont-hIO 단독 이식군에서는 일부 출혈과 유약한 장내 점막을 확인할 수 있었으나 동시 이식군에서 단독 이식군에 비해 2주차 상피 손상이 빠르게 회복되고, 리포터 오가노이드의 생착율이 높은 것을 검증하였다. 조직학적 분석(H&E) 및 기능 분석(AB-PAS)을 통해 상피 구조가 회복되고, 성숙한 Goblet cell의 Mucin의 분비가 활발한 것을 관찰하였다 (도 9c, d).
DSS 유도 염증성 장 질환 모델에서 MSCCont-hIO, Cont-hIO 단독 이식 및 Cont-hIO+ MSCCont-hIO 동시 이식 그룹을 비교하였다 (도 10a). 동시 이식 그룹에서 체중의 증가가 3일차부터 빠르게 증가하는 것을 확인하였다 (도 10b). 또한, 대장내시경 검사를 통해 2주차에 동시 이식군에서는 발적 및 염증 소견이 없음을 보여주었다 (도 10c). 조직학적 분석을 통해 동시 이식군에서 장 상피 전반에 걸쳐 장 상피 손상이 감소 및 재생이 확인되었으며, AB-PAS 염색을 통해 Mucin 기능성이 크게 회복되었음을 보여주었다(도 10d). 또한, 손상 부위의 Crypt depth도 동시 이식군에서 유의적으로 증가함을 확인하였다(도 10e).
이를 통해 MSCMat-hIO가 Cont-hIO 단독 이식에 비해 장내 상피 손상 치유에 도움을 주는 것을 확인할 수 있었다.
뿐만 아니라, 동일한 Mat-hIO에서도 MSC의 존재 유무에 따라 이식 후 상피 손상 회복율이 다른 것을 보여주었다 (도 11). 구체적으로, Mat-hIO의 계대 배양을 통해 MSCMat-hIO가 거의 존재하지 않는 P7을 이식한 그룹은 Mat-hIO(P4)에 비해 손상 부위의 Crypt depth가 감소되었음이 확인되었다.
이러한 결과를 고려할 때, 성숙 장 오가노이드 주변에 존재하는 중간엽 기질 세포(MSCMat-hIO)가 장 오가노이드의 생착 및 조직 개선에 중요한 역할을 하는 것을 확인하였다.
실시예 8. 성숙 hIO 유래 중간엽 기질세포의 범용적 활용
MSCMat-hIO의 범용적 활용을 평가하기 위하여 앞서 발표된 유도만능줄기세포 유래 대장 오가노이드를 제조하였다(도 12a). 제조된 대장 오가노이드(hCO)는 기존 장 오가노이드(Cont-hIO)와 비교하여 budding structure가 적고, 소장의 대표적 마커(VIL1, KRT20, LYZ, SI, LCT)의 발현이 감소되는 특성이 있다. 반면에 Enteroendocrine 마커인 CHGA의 일부 증가와 hCO의 대표적인 특성인 MUC5B, SATB2, CAII의 발현이 증가했음을 확인할 수 있었다 (도 12b, c). 이렇게 만들어진 hCO와 MSCMat-hIO는 DSS유도 염증성 장질환 면역결핍마우스에 이식하여 염증질환에 대한 재생치료제로서의 효능을 검증하였다 (도 12d). 대장 내시경을 통해 장내 염증도를 살펴본 결과 Fibrin 대조군과 hCO 단독 이식군은 여전히 출혈점이 확인되었으나, hCO+MSCMat-hIO 이식군과 MSCMat-hIO 단독 이식군에서는 장내 염증이 회복되었다(도 12e). 마지막으로 H&E를 통한 조직병리학적 검사와 AB-PAS를 통한 장 기능 검사에서는 hCO+MSCMat-hIO 이식군에서 Crypt depth가 탁월하게 향상되고, Mucin 층이 잘 형성되었음을 보여주었다(도 12f).
EDTA 유도 장 상피 손상 면역결핍마우스 모델에서 인간 성체 줄기세포 유래 대장 오가노이드(hCN) 단독 이식 및 MSCMat-hIO 동시 이식을 수행하고 이식 초기 5일차에 관찰하였다 (도 13a). 초기 생착에 MSC가 미치는 영향을 확인하기 위해, 이식 5일차에 대장내시경을 실시한 결과, 상피 손상으로 인해 생긴 염증 및 손상도가 동시이식군에서 확연하게 감소한 것을 보여주었다 (도 13b). 이는 조직학적 분석을 통해서도 직장부위 상처로 인한 상피 소실이 Fibrin과 hCN 그룹에서는 여전히 남아 있는 것을 확인하였으나, hCN+MSCMat-hIO 이식군에서는 빠르게 상피가 회복되고 기능적으로 Mucin의 분비도 일어나는 것을 보여주었다 (도 13c). Human-특이적 항체(hECAD)의 면역형광염색을 통해 Human 세포의 분포를 직접적으로 확인하였으며, Nuclei(DAPI) 대비하여 동시 이식군에서 대조군 및 단독 이식군에 비해 유의하게 증가하였음을 검증하였다 (도 13d).
상기 장 상피 손상 모델에서 Fibrin, hCN 단독 이식 및 hCN+MSCMat-hIO 동시 이식군을 2주차에 비교한 결과, 2주차에는 체중 및 대장내시경에서는 큰 차이가 없이 회복되는 것을 확인할 수 있었으며, 조직학적 분석에서 직장 부위 장 상피 구조가 회복되었으며, AB-PAS 염색을 통해 동시 이식군이 Mucin 분비가 좀 더 활발한 것을 보여주었다 (도 14).
DSS 유도 염증성 장 질환 모델에서 Fibrin, hCN 단독 이식 및 MSCMat-hIO 동시 이식군을 2주차에 대장내시경을 실시한 결과, 염증도 및 발적 정도가 단독 이식 및 동시 이식군에서 모두 감소하였음을 확인하였으며, 조직학적 분석을 통해 비슷한 수준으로 장 전반에 걸쳐 생착 및 재생되어 Mucin의 분비가 고르게 진행되고 있음을 검증하였다(도 15).
EDTA 유도 장 상피손상 면역결핍마우스 모델에서 3D 장 줄기세포(InShIO) 단독 이식과 MSCMat-hIO 동시 이식을 비교하였다(도 16a). 그 결과,앞선 결과와 동일하게 단독 이식군에 비해 동시 이식 군에서 장 구조적으로 Crypt의 depth 및 장 상피 구조 회복이 빠르고, 성숙한 Goblet 세포의 mucin 분비가 거의 정상적으로 돌아왔음을 Swiss-roll section과 Longitudinal section 모두에서 확인할 수 있었다(도 16b).
또한, 염증성 장 질환 모델에서도 InSMat-hIO+MSCMat-hIO 동시 이식군은 InSMat-hIO 단독 이식군에 비해 체중의 변화를 통해 이식 7일 이후 정상 대조군 이상으로 빠르게 회복되는 것을 보여주었으며, 대장 내시경을 통해서도 장 상피의 염증도가 정상의 수준으로 확연히 감소된 것을 관찰하였다(도 17a 내지 c). 조직학적 분석을 통해서도 대조군 및 단독 이식군에 비해 동시 이식군에서 장 전반에 걸쳐 상피의 구조가 회복되고, Mucin의 분비가 원활한 것을 보여주었다 (도 17d).
실시예 9. 성숙 hIO의 특성 확인
전술한 바와 같이, hIO 분화 프로토콜을 사용하여, hESC라인 또는 비삽입형-hiPSC 라인을 포함하는 hPSC로부터 hIO를 제조하였다. 이후, P0부터 1ng/ml rhIL-2를 처리하여 제조한 성숙 오가노이드와 기존의 미성숙 오가노이드 배양 과정을 모식도로 보여주었다(도 18a). 배아줄기세포 또는 유도만능 줄기세포 유래 미성숙, 고성능(성숙) 장 오가노이드를 제조하여 세포 성상을 관찰하고(도 18b), 기존의 성숙 장 오가노이드와 소장-특이적 유전자의 발현 레벨을 비교하였다.
그 결과, 소장 세포 유형-특이적 마커(VIL1, KRT20, CHGA, MUC2 및 LYZ) 과 장 성숙 마커인 MUC13, OLFM4, SI, LCT 및 DPP4 및 LCT의 발현 수준이 높게 발현되는 것을 확인하였다(도 18c). 또한, 장 줄기세포-특이적 마커(ASCL2, AXIN2, LGR5 및 OLFM4)와 혈관 내피 관련 인자(CD31, CDH5, ECSCR, LYVE1 및 IGF2)가 미성숙 오가노이드에 비해 이식용 고성능 장 오가노이드에서 높게 발현됨을 확인하였으며(도 18d, e), 기존의 성숙 오가노이드에 비해서도 이식용 고성능 장 오가노이드에서 상기 마커들이 높게 발현됨을 확인하였다(도 18f).
실시예 10. Xeno-free ECM의 적용시 성숙 hIO의 특성 유지 확인
앞서 제시한 분화 프로토콜을 사용하여, 배아줄기세포 및 유도만능줄기세포로부터 마트리젤과 ECMatrixTM-511이 코팅된 디쉬에서 내배엽(DE), 후장(HG) 분화를 진행하고, 3D 배양을 위해 Matrigel을 대체하기 위해 제시한 Vitrogel의 경우에는 #2 및 #3 타입에서 장 상피의 구조가 유지되는 것을 확인하였다(도 19a). Matrigel, Vitrogel #2, Vitrogel #3는 소장-특이적 마커(CDX2, VIL1, LGR5, ASCL2, LYZ, MUC2 및 MUC13)의 발현 정도는 마커 별로 일부 차이가 있었으나, 미분화 전분화능 줄기세포에 비해 상기 모든 마커들의 발현이 높게 유지되는 것을 확인함으로써(도 19b), 임상 적용이 가능한 ECMatrixTM-511 및 Vitrogel을 사용하면 Matrigel을 사용했을 때와 동일하게 장 오가노이드의 분화가 진행됨을 검증하였다.
실시예 11. 신장 막하 이식을 통한 미성숙 또는 고성능의 성숙 hIO의 이식 후 특성 비교
이식 후 마우스 간 차이를 최소화하기 위하여 동일한 면역결핍마우스의 양쪽 신장에 각각 Cont-hIO와 Mat-hIO를 이식하여 4주, 8주 후에 관찰하였다(도 20a, b). 8주 후 양쪽 신장의 이종이식편을 적출 및 관찰한 결과, 미성숙 오가노이드에 비해 성숙 오가노이드 이종이식편 주변에서 두드러진 혈관 형성을 확인하였다 (도 20c). H&E를 통한 조직학적 분석을 통해서도 이식된 장 오가노이드 주변에 형성된 혈관이 관찰되었으며, 장 오가노이드의 구조의 Villus length가 인간 성체 소장 조직과 유사하게 발달한 것을 보여주었다(도 20d). 면역형광염색을 사용하여 혈관 마커(hVE-Cad, PECAM-1, VEGF)의 발현을 통해 이종이식편 오가노이드 조직 주변의 혈관 형성 및 구조를 확인하고, 생체 내에서 장 오가노이드의 Villus 구조(hECAD)와 중간엽 기질세포 및 혈관주위세포(αSMA)의 발달을 검증하였다(도 20e). 위 결과는 성숙 장 오가노이드 주변에 존재하는 주변 세포기질층에 의해서 혈관 형성이 월등히 잘 이루어지고 장 오가노이드의 Villus 구조(hECAD)와 중간엽 기질세포 및 혈관주위세포(αSMA)의 발달 또한 우수함을 보여준다.
또한, RNAseq을 통한 유전체 분석을 통해 기존에 알려진 바와 같이 장 오가노이드의 신장 막하 이식 시 성숙화 되는 경로를 미성숙 장 오가노이드, 4주, 8주 이종이식편 장 오가노이드, 생체 외 성숙 장 오가노이드 및 인간 소장 조직의 비교를 통해 확인하였다(도 21a). 특히, 이식 8주 후 Cont-hIO 이식군과 Mat-hIO 이식군에서 차이나는 538 DEG의 GO 분석을 진행한 결과 Vascular development (혈관 발달)이 주요 그룹임을 규명하였다(도 21b 내지 d). RNAseq 유전체 분석 결과를 검증하기 위하여, qPCR을 통해 8주 이종이식편 Mat-hIO에서 Cont-hIO 대비 혈관 마커(hCD31, ANGPT1, KDR)는 Mat-hIO 이종이식 8주차 그룹에서 증가하였으며, 중간엽 기질세포 마커이자 혈관주위세포 마커(αSMA)는 Mat-hIO 이종이식 4주차 그룹에서 증가하였다(도 21e).

Claims (26)

  1. 하기로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 특징을 나타내는 성숙 장 오가노이드의 주변 기질 세포층 유래 중간엽 기질 세포:
    (a) 성체 유래 중간엽 줄기세포, 전분화능 줄기세포 유래 중간엽 줄기세포 및/또는 미성숙 장 오가노이드 유래 중간엽 기질세포와 대비하여 hCD31+ 의 증진된 발현 수준;
    (b) 성체 유래 중간엽 줄기세포, 전분화능 줄기세포 유래 중간엽 줄기세포 및/또는 미성숙 장 오가노이드 유래 중간엽 기질세포와 대비하여 Vascular development, Mesenchyme development, Epithelial cell proliferation, 및/또는 Muscle tissue development 관련 인자의 증진된 발현 수준;
    (c) 성체 유래 중간엽 줄기세포, 전분화능 줄기세포 유래 중간엽 줄기세포 및/또는 미성숙 장 오가노이드 유래 중간엽 기질세포와 대비하여 Endothelial cell type이 증진된 발현 수준;
    (d) 성체 유래 중간엽 줄기세포, 전분화능 줄기세포 유래 중간엽 줄기세포 및/또는 미성숙 장 오가노이드 유래 중간엽 기질세포와 대비하여 Gene Ontology (GO) term enrichment상 Endothelial cell 특성 인자의 증진된 발현 수준;
    (e) 성체 유래 중간엽 줄기세포, 전분화능 줄기세포 유래 중간엽 줄기세포 및/또는 미성숙 장 오가노이드 유래 중간엽 기질세포와 대비하여 혈관 생성 인자, 혈관 내피 관련 인자 및/또는 혈관 분비 인자의 증진된 발현 수준; 및
    (f) 계대 배양시 αSMA, VIM 및 DESMIN로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 발현 수준의 유지.
  2. 제1항에 있어서, 성숙 장 오가노이드의 주변 기질 세포층 유래 중간엽 기질 세포는
    성체 유래 중간엽 줄기세포, 전분화능 줄기세포 유래 중간엽 줄기세포 및/또는 미성숙 장 오가노이드 유래 중간엽 기질세포와 대비하여 hCD31+ 의 증진된 발현 수준; 및
    성체 유래 중간엽 줄기세포, 전분화능 줄기세포 유래 중간엽 줄기세포 및/또는 미성숙 장 오가노이드 유래 중간엽 기질세포와 대비하여 혈관 생성 인자, 혈관 내피 관련 인자 및/또는 혈관 분비 인자의 증진된 발현 수준의 특징을 나타내는, 성숙 장 오가노이드의 주변 기질 세포층 유래 중간엽 기질 세포.
  3. 제2항에 있어서,
    성체 유래 중간엽 줄기세포, 전분화능 줄기세포 유래 중간엽 줄기세포 및 미성숙 장 오가노이드 유래 중간엽 기질세포와 대비하여 Vascular development, Mesenchyme development, Epithelial cell proliferation 및 Muscle tissue development 관련 인자의 증진된 발현 수준의 특징을 더 나타내는, 성숙 장 오가노이드의 주변 기질 세포층 유래 중간엽 기질 세포.
  4. 제1항에 있어서, 혈관 생성 인자 및/또는 혈관 내피 관련 인자는 hCD31, CDH5, ECSCR, LYVE1, IGF2, VEGF, ANGPT1 및 KDR로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, 성숙 장 오가노이드의 주변 기질 세포층 유래 중간엽 기질 세포.
  5. 제1항에 있어서, 혈관 분비 인자는 Angiogenin, DKK1, EGF, Osteopontin, ICAM-1, IGFBP-3, VEGF, VCAM-1, MCP-1, Activin A 인, 성숙 장 오가노이드의 주변 기질 세포층 유래 중간엽 기질 세포.
  6. 제1항에 있어서, 미성숙 장 오가노이드 유래 중간엽 기질세포는 IL-2, IL-22, IL-6, IL-1ß, IL-11, EGF, OSM 및 IL-10으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 사이토카인, NRG-1 또는 STAT3 및 mTOR 신호전달 경로 활성화제인 콜리베린(colivelin)이 배지 구성요소로 포함되지 않은 장 오가노이드로부터 유래된 중간엽 기질 세포인, 성숙 장 오가노이드의 주변 기질 세포층 유래 중간엽 기질 세포.
  7. 제1항에 있어서, 성숙 장 오가노이드는 후장으로부터 장 오가노이드로 분화에 있어서 IL-2, IL-22, IL-6, IL-1ß, IL-11, EGF, OSM 및 IL-10으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 사이토카인, NRG-1 또는 STAT3 및 mTOR 신호전달 경로 활성화제인 콜리베린(colivelin)이 배지 구성요소로 포함된 것인, 성숙 장 오가노이드의 주변 기질 세포층 유래 중간엽 기질 세포.
  8. 제7항에 있어서, 상기 사이토카인은 IL-2인, 성숙 장 오가노이드의 주변 기질 세포층 유래 중간엽 기질 세포.
  9. 제1항에 있어서, 성숙 장 오가노이드의 주변 기질 세포층 유래 중간엽 기질 세포는 B27, EGF 또는 이들 모두를 포함하는 배지에서 배양된 것인, 성숙 장 오가노이드의 주변 기질 세포층 유래 중간엽 기질 세포.
  10. 하기 단계를 포함하는 전분화능 줄기세포(PSC)으로부터 분화된 성숙 장 오가노이드의 주변 기질 세포층 유래 중간엽 기질 세포의 배양 방법:
    (a) 성숙 장 오가노이드를 단일 세포 또는 작은 세포 덩어리로 분리하는 단계;
    (b) 분리된 단일 세포 또는 작은 세포 덩어리를 젤라틴, 피브린 및 콜라겐 Ⅰ으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나로 코팅된 배양 배지에 씨딩하는 단계; 및
    (c) 상기 씨딩(seeding)된 세포에서 부착되어 배양된 세포만을 수득하는 단계.
  11. 제10항에 있어서, (c) 단계 이후 (d) 상기 부착되어 배양된 세포를 계대 배양하는 단계를 더 포함하는 전분화능 줄기세포(PSC)으로부터 분화된 성숙 장 오가노이드의 주변 기질 세포층 유래 중간엽 기질 세포의 배양 방법.
  12. 제10항에 있어서, (b) 단계의 배양 배지는 B27, EGF, IL-2 또는 이들 모두를 포함하는 배양 배지인 전분화능 줄기세포(PSC)으로부터 분화된 성숙 장 오가노이드의 주변 기질 세포층 유래 중간엽 기질 세포의 배양 방법.
  13. 제10항에 있어서, 성숙 장 오가노이드는 하기 단계를 거쳐 제조된 것인, 전분화능 줄기세포(PSC)으로부터 분화된 성숙 장 오가노이드의 주변 기질 세포층 유래 중간엽 기질 세포의 배양 방법:
    1) Nodal, Activin A, Activin B, BMP4 및 Wnt3a로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 전분화능 줄기세포에 처리하여 완전 내배엽 세포로 분화하는 단계;
    2) FGF 및 Wnt 리간드를 처리하여 완전 내배엽 세포로부터 후장으로 분화하는 단계; 및
    3) BMP 억제제, Wnt 작용물질, 수용체 타이로신 키나제 리간드 및 T-림프구 분비되는 사이토카인을 후장에 처리하여 장 오가노이드를 성숙하는 단계.
  14. 제13항에 있어서, 상기 1) 단계는 Activin A를 배아 줄기세포 또는 유도 만능 줄기세포에 처리하여 완전 내배엽 세포로 분화하는 단계를 포함하는 것인 전분화능 줄기세포(PSC)으로부터 분화된 성숙 장 오가노이드의 주변 기질 세포층 유래 중간엽 기질 세포의 배양 방법.
  15. 제13항에 있어서, 상기 2) 단계는 FGF 및 CHIR99021를 처리하여 완전 내배엽 세포로부터 후장으로 분화하는 단계를 포함하는 것인 전분화능 줄기세포(PSC)으로부터 분화된 성숙 장 오가노이드의 주변 기질 세포층 유래 중간엽 기질 세포의 배양 방법.
  16. 제13항에 있어서, 3) 단계는 BMP 억제제로서 노긴, Wnt 작용물질로서 R-스폰딘 1, R-스폰딘 2, R-스폰딘 3 및 R-스폰딘 4로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상, 수용체 타이로신 키나제 리간드로서 상피 성장 인자(EGF) 및 T-림프구 분비되는 사이토카인으로 IL-2, IL-22, IL-6, IL-1ß, IL-11, EGF, OSM 및 IL-10으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 사이토카인, NRG-1 또는 STAT3 및 mTOR 신호전달 경로 활성화제인 콜리베린(colivelin)을 후장에 처리하여 장 오가노이드를 성숙하는 단계;를 포함하는 것인 전분화능 줄기세포(PSC)으로부터 분화된 성숙 장 오가노이드의 주변 기질 세포층 유래 중간엽 기질 세포의 배양 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 T-림프구 분비되는 사이토카인은 IL-2인 전분화능 줄기세포(PSC)으로부터 분화된 성숙 장 오가노이드의 주변 기질 세포층 유래 중간엽 기질 세포의 배양 방법.
  18. 제10항에 따른 전분화능 줄기세포(PSC)으로부터 분화된 성숙 장 오가노이드의 주변 기질 세포층 유래 중간엽 기질 세포의 배양 방법으로 제조된 성숙 장 오가노이드의 주변 기질 세포층 유래 중간엽 기질 세포.
  19. 제1항 내지 제9항 및 제18항으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 한 항에 따른 성숙 장 오가노이드의 주변 기질 세포층 유래 중간엽 기질 세포를 포함하는 장 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  20. 제1항 내지 제9항 및 제18항으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 한 항에 따른 성숙 장 오가노이드의 주변 기질 세포층 유래 중간엽 기질 세포를 포함하는 장 이식 보조용 약학 조성물.
  21. 제1항 내지 제9항 및 제18항으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 한 항에 따른 성숙 장 오가노이드의 주변 기질 세포층 유래 중간엽 기질 세포; 및 소장 오가노이드, 대장 오가노이드 또는 장 줄기세포;를 포함하는 장 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  22. 제19항에 있어서, 상기 장질환은 장누수 증후군, 단장 증후군, 과민성 장증후군, 크론병, 궤양성 대장염, 장형 베체트병, 감염성 장염, 허혈성 장질환 및 방사선 장염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 장 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  23. 제21항에 있어서, 상기 장질환은 장누수 증후군, 단장 증후군, 과민성 장증후군, 크론병, 궤양성 대장염, 장형 베체트병, 감염성 장염, 허혈성 장질환 및 방사선 장염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 장 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  24. 제19항에 있어서, 피브린, 콜라겐, 젤라틴, 키토산, 알지네이트, 히알루론산, 덱스트란, 폴리락트산, 폴리글리콜산(poly(glycolic acid), PGA), 폴리(락트산-co-글리콜산)(poly(lacticcoglycolic acid), PLGA), 폴리-ε-(카프로락톤), 폴리안하이드리드, 폴리오르토에스테르, 폴리비닐알코올, 폴리에틸렌글리콜, 폴리우레탄, 폴리아크릴산, 폴리-N-이소프로필아크릴아마이드, 폴리(에틸렌옥사이드)-폴리(프로필렌옥사이드)-폴리(에틸렌옥사이드) 공중합체, 이들의 공중합체, 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 생분해성 지지체를 더 포함하는 장 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  25. 제20항에 있어서, 피브린, 콜라겐, 젤라틴, 키토산, 알지네이트, 히알루론산, 덱스트란, 폴리락트산, 폴리글리콜산(poly(glycolic acid), PGA), 폴리(락트산-co-글리콜산)(poly(lacticcoglycolic acid), PLGA), 폴리-ε-(카프로락톤), 폴리안하이드리드, 폴리오르토에스테르, 폴리비닐알코올, 폴리에틸렌글리콜, 폴리우레탄, 폴리아크릴산, 폴리-N-이소프로필아크릴아마이드, 폴리(에틸렌옥사이드)-폴리(프로필렌옥사이드)-폴리(에틸렌옥사이드) 공중합체, 이들의 공중합체, 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 생분해성 지지체를 더 포함하는 장 이식 보조용 약학 조성물.
  26. 제21항에 있어서, 피브린, 콜라겐, 젤라틴, 키토산, 알지네이트, 히알루론산, 덱스트란, 폴리락트산, 폴리글리콜산(poly(glycolic acid), PGA), 폴리(락트산-co-글리콜산)(poly(lacticcoglycolic acid), PLGA), 폴리-ε-(카프로락톤), 폴리안하이드리드, 폴리오르토에스테르, 폴리비닐알코올, 폴리에틸렌글리콜, 폴리우레탄, 폴리아크릴산, 폴리-N-이소프로필아크릴아마이드, 폴리(에틸렌옥사이드)-폴리(프로필렌옥사이드)-폴리(에틸렌옥사이드) 공중합체, 이들의 공중합체, 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 생분해성 지지체를 더 포함하는 장 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
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