KR20240033309A - 에멀전 제형의 면역증강제 조성물 및 이의 제조 방법 - Google Patents
에멀전 제형의 면역증강제 조성물 및 이의 제조 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 에멀전 제형의 면역증강제 조성물 및 이의 제조 방법에 관한 것으로, 본 발명의 에멀전 제형의 면역증강제 조성물은 안정성과 효능이 검증된 스쿠알렌, 알파-토코페롤, 계면활성제를 포함하는 O/W형 에멀전 기반의 제형에 TLR2 및/또는 TLR3, TLR7, TLR9 리간드 또는 지질을 첨가하여 제조하였으며, 체액성 및 세포성 면역 반응을 현저히 증가시킬 수 있도록 각 조성물의 구성 성분의 비율을 최적화하였으므로, 호흡기 바이러스 등을 포함한 다양한 바이러스 백신을 제조하는 데 유용하게 사용할 수 있다.
Description
본 발명은 에멀전 제형의 면역증강제(adjuvant) 조성물 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.
면역증강제(adjuvant)는 백신 항원과 같이 사용하여 백신의 임상적 효과를 강화하기 위해 백신 항원에 대한 면역 반응을 증가시키거나 바람직한 방향으로 유도시키는 물질 혹은 물질의 조합들이다. 면역증강제는 직접 또는 간접적인 면역 자극과 항원 전달에 작용하여 백신 항원에 대한 면역반응을 증가 및 조절하거나, 방어 효과, 유지 기간을 연장하는 등 백신의 임상적 유효성을 증진 및 개선하는 것이 주요 기능이다.
병원성 세균이나 바이러스에 감염되면 면역세포의 패턴인식수용체(Pattern Recognition Receptor)가 병원성 미생물의 특이한 패턴(Pathogen-associated molecular pattern, PAMP)을 인지하여 선천성 면역반응을 일으키게 된다. 톨유사수용체(Toll like receptor, TLR)는 대표적인 패턴인식수용체로서 사람에서는 약 13종이 알려져 있다. TLR에 반응하는 TLR 리간드(TLR ligand)는 면역 세포를 직접 자극하여 선천성 면역 반응을 활성화시키고, 백신 항원에 대한 후천성 면역인 체액성 면역과 세포성 면역 반응을 유도하여 인체를 감염원으로부터 보호하거나 조직 복구에 기여하기 때문에 면역증강제로 개발되고 있다.
에멀전 제형은 유백색의 형태로 소수성 액체가 다른 친수성 액체에 콜로이드(입자) 상태로 퍼져 있는 용액 상태를 의미하는데, 이러한 에멀전 제형은 구조적 특징별로 O/W(oil in water)형 에멀전, W/O(water in oil)형 에멀전, W/O/W(water in oil in water)형 에멀전 등으로 구분된다. 보편화 되어있는 면역증강제 제형은 O/W형 에멀전이며, 이러한 에멀전 제형은 백신 항원이 흡착되어 면역세포로 유입이 용이한 구조를 갖고 있으나, 입자의 크기에 따라 면역 유도 효율이 달라질 수 있다. O/W형 에멀전에 사용되는 소수성 물질인 오일 성분은 생체적합성과 면역보조성을 고려하여, 스쿠알렌(Squalene), 콩기름(soybean oil), 그리고 미네랄오일(mineral oil)이 주로 사용되며, 스쿠알렌과 알파-토코페롤(α-tocopherol) 등의 다른 소수성 물질이 함께 사용되기도 한다. 스쿠알렌은 아이소프렌(isoprene) 구조 단위를 기본으로 하는 아이소프레노이드(isoprenoid)의 일종으로, 이중결합의 특징에 의해 높은 면역 활성이 유도된다고 알려져 있다.
본 발명자들은 선행연구에서 TLR2 리간드인 리포펩타이드와 TLR3 리간드인 폴리(I:C)를 포함하는 면역증강제을 개발하였고, 상기 면역증강제를 포함하는 백신 조성물이 강력한 면역 반응을 유도함을 확인하여(대한민국 등록특허 제10-0900837호, 대한민국 등록특허 제10-1501583호), 이를 L-pampo라고 명명하였다. 또한, TLR2 리간드인 리포펩티드와 지질을 포함하는 리포좀 형태의 면역증강제를 개발하였으며, 상기 면역증강제를 포함하는 백신 조성물이 체액성 면역반응뿐만 아니라 세포성 면역반응 또한 높게 유도함을 확인하여(대한민국 등록특허 10-2098097), 이를 Lipo-pam으로 명명하였다.
이에 본 발명자들은 에멀전 제형의 특징인 항원 흡착성과 선천성 면역반응을 유도하는 TLR 리간드를 함께 도입함으로써 항원 흡착성과 면역 활성화의 두 가지 기능을 갖는 TLR 리간드를 포함하는 에멀전 제형의 면역증강제를 개발하였으며, 면역증강제의 조성 및 비율을 최적화함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 TLR 리간드를 포함하는 에멀전 제형의 면역증강제 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 면역증강제 조성물 및 항원을 포함하는 에멀전 제형의 백신 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 에멀전 제형의 면역증강제 조성물의 제조방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 TLR 리간드, 계면활성제, 알파-토코페롤 및 스쿠알렌을 포함하는 에멀전 제형의 면역증강제 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 면역증강제 조성물 및 항원을 포함하는 에멀전 제형의 백신 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은(a) 지질, TLR 리간드를 유기용매에 녹여 박막을 형성시키는 단계; 및(b) 상기 박막을 알파-토코페롤 및 스쿠알렌을 포함하는 오일상 및 계면활성제와 혼합시키는 단계; 를 포함하는 에멀전 제형의 면역증강제 조성물의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 알파-토코페롤 및 스쿠알렌을 포함하는 오일상과 TLR 리간드, 계면활성제를 혼합시키는 단계를 포함하는 에멀전 제형의 면역증강제 조성물의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 에멀전 제형의 면역증강제 조성물 및 이의 제조 방법에 관한 것으로, 본 발명의 에멀전 제형의 면역증강제 조성물은 안정성과 효능이 검증된 스쿠알렌, 알파-토코페롤, 계면활성제를 포함하는 O/W형 에멀전 기반의 제형에 TLR2 및/또는 TLR3, TLR7, TLR9 리간드 또는 지질을 첨가하여 제조하였으며, 체액성 및 세포성 면역 반응을 현저히 증가시킬 수 있도록 각 조성물의 구성 성분의 비율을 최적화하였으므로, 호흡기 바이러스 등을 포함한 다양한 바이러스 백신을 제조하는 데 유용하게 사용할 수 있다.
도 1은 알파-토코페롤 유/무에 따른 입자의 크기, PDI, 제타 전위를 비교한 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 알파-토코페롤 유/무에 따른 in vitro pro-inflammatory 사이토카인 분석 그래프이다.
도 3은 지질 비율에 따른 in vitro pro-inflammatory 사이토카인 분석 그래프이다.
도 4는 트윈-80 비율에 따른 in vitro pro-inflammatory 사이토카인 분석 그래프이다.
도 5는 알파-토코페롤/스쿠알렌 비율에 따른 면역원성 분석 그래프이다.
도 6은 최적화된 조성 후보군을 나타낸 도이다.
도 7은 Pam3CSK4 에멀전에 의한 in vitro pro-inflammatory 사이토카인 분석 그래프이다.
도 8은 Pam3CSK4/폴리(I:C) 에멀전의 in vitro pro-inflammatory 사이토카인 분석 그래프이다.
도 9는 Pam3CSK4/이미퀴모드 에멀전의 in vitro pro-inflammatory 사이토카인 분석 그래프이다.
도 10은 Pam3CSK4/이미퀴모드/폴리(I:C) 에멀전의 in vitro pro-inflammatory 사이토카인 분석 그래프이다.
도 11은 리포펩타이드 에멀전의 in vitro pro-inflammatory 사이토카인 분석 그래프이다.
도 12는 Pam3CSK4/CpG-ODN 에멀전의 in vitro pro-inflammatory 사이토카인 분석 그래프이다.
도 13은 동물실험 면역화 모식도이다.
도 14는 Pam3CSK4 에멀전 사용 백신 제형에 대한 마우스 체액성 면역 반응 분석 그래프이다.
도 15는 Pam3CSK4/폴리(I:C) 에멀전 사용 백신 제형에 대한 마우스 체액성 면역 반응 분석 그래프이다.
도 16은 Pam3CSK4/폴리(I:C) 에멀전 사용 백신 제형에 대한 마우스 세포성 면역 반응 분석 그래프이다.
도 17은 에멀전 용량 및 폴리(I:C) 에멀전 사용 백신 제형에 대한 마우스 체액성 면역 반응 분석 그래프이다.
도 18은 에멀전 용량 및 폴리(I:C) 에멀전 사용 백신 제형에 대한 마우스 세포성 면역 반응 분석 그래프이다.
도 19는 최적 에멀전 조성을 위한 백신 제형에 대한 마우스 체액성 면역 반응 분석 그래프이다.
도 20은 최적 에멀전 조성을 위한 백신 제형에 대한 마우스 세포성 면역 반응 분석 그래프이다.
도 21은 Pam3CSK4 에멀전, Pam3CSK4/DOPE 에멀전 백신 제형에 대한 마우스 체액성 면역 반응 분석 그래프이다.
도 22는 Pam3CSK4 에멀전, Pam3CSK4/DOPE 에멀전 백신 제형에 대한 마우스 세포성 면역반응 분석 그래프이다.
도 23은 에멀전으로 제제화한 백신의 계절형 불활화 독감 바이러스 항원에 대한 체액성 면역 반응 분석 그래프이다.
도 24는 에멀전으로 제제화한 백신의 계절형 불활화 독감 바이러스 항원에 대한 세포성 면역 반응 분석 그래프이다.
도 25는 에멀전으로 제제화한 백신의 항원 용량에 따른 백신의 체액성 면역 반응 분석 그래프이다.
도 26은 에멀전으로 제제화한 백신의 항원 용량에 따른 백신의 세포성 면역 반응 분석 그래프이다.
도 27은 에멀전으로 제제화한 백신의 Covid-19 바이러스 항원에 대한 체액성 면역 반응 분석 그래프이다.
도 28은 에멀전으로 제제화한 백신의 Covid-19 바이러스 항원에 대한 세포성 면역 반응 분석 그래프이다.
도 29는 에멀전으로 제제화한 백신의 노로 바이러스 항원에 대한 체액성 면역 반응 분석 그래프이다.
도 30은 에멀전으로 제제화한 백신의 노로 바이러스 항원에 대한 세포성 면역 반응 분석 그래프이다.
도 31은 에멀전 제형 공초점 현미경 이미지이다.
도 32는 에멀전 제형 TEM 이미지이다.
도 33은 에멀전 SDS-PAGE를 통한 항원의 흡착 평가를 나타낸 이미지이다.
도 2는 알파-토코페롤 유/무에 따른 in vitro pro-inflammatory 사이토카인 분석 그래프이다.
도 3은 지질 비율에 따른 in vitro pro-inflammatory 사이토카인 분석 그래프이다.
도 4는 트윈-80 비율에 따른 in vitro pro-inflammatory 사이토카인 분석 그래프이다.
도 5는 알파-토코페롤/스쿠알렌 비율에 따른 면역원성 분석 그래프이다.
도 6은 최적화된 조성 후보군을 나타낸 도이다.
도 7은 Pam3CSK4 에멀전에 의한 in vitro pro-inflammatory 사이토카인 분석 그래프이다.
도 8은 Pam3CSK4/폴리(I:C) 에멀전의 in vitro pro-inflammatory 사이토카인 분석 그래프이다.
도 9는 Pam3CSK4/이미퀴모드 에멀전의 in vitro pro-inflammatory 사이토카인 분석 그래프이다.
도 10은 Pam3CSK4/이미퀴모드/폴리(I:C) 에멀전의 in vitro pro-inflammatory 사이토카인 분석 그래프이다.
도 11은 리포펩타이드 에멀전의 in vitro pro-inflammatory 사이토카인 분석 그래프이다.
도 12는 Pam3CSK4/CpG-ODN 에멀전의 in vitro pro-inflammatory 사이토카인 분석 그래프이다.
도 13은 동물실험 면역화 모식도이다.
도 14는 Pam3CSK4 에멀전 사용 백신 제형에 대한 마우스 체액성 면역 반응 분석 그래프이다.
도 15는 Pam3CSK4/폴리(I:C) 에멀전 사용 백신 제형에 대한 마우스 체액성 면역 반응 분석 그래프이다.
도 16은 Pam3CSK4/폴리(I:C) 에멀전 사용 백신 제형에 대한 마우스 세포성 면역 반응 분석 그래프이다.
도 17은 에멀전 용량 및 폴리(I:C) 에멀전 사용 백신 제형에 대한 마우스 체액성 면역 반응 분석 그래프이다.
도 18은 에멀전 용량 및 폴리(I:C) 에멀전 사용 백신 제형에 대한 마우스 세포성 면역 반응 분석 그래프이다.
도 19는 최적 에멀전 조성을 위한 백신 제형에 대한 마우스 체액성 면역 반응 분석 그래프이다.
도 20은 최적 에멀전 조성을 위한 백신 제형에 대한 마우스 세포성 면역 반응 분석 그래프이다.
도 21은 Pam3CSK4 에멀전, Pam3CSK4/DOPE 에멀전 백신 제형에 대한 마우스 체액성 면역 반응 분석 그래프이다.
도 22는 Pam3CSK4 에멀전, Pam3CSK4/DOPE 에멀전 백신 제형에 대한 마우스 세포성 면역반응 분석 그래프이다.
도 23은 에멀전으로 제제화한 백신의 계절형 불활화 독감 바이러스 항원에 대한 체액성 면역 반응 분석 그래프이다.
도 24는 에멀전으로 제제화한 백신의 계절형 불활화 독감 바이러스 항원에 대한 세포성 면역 반응 분석 그래프이다.
도 25는 에멀전으로 제제화한 백신의 항원 용량에 따른 백신의 체액성 면역 반응 분석 그래프이다.
도 26은 에멀전으로 제제화한 백신의 항원 용량에 따른 백신의 세포성 면역 반응 분석 그래프이다.
도 27은 에멀전으로 제제화한 백신의 Covid-19 바이러스 항원에 대한 체액성 면역 반응 분석 그래프이다.
도 28은 에멀전으로 제제화한 백신의 Covid-19 바이러스 항원에 대한 세포성 면역 반응 분석 그래프이다.
도 29는 에멀전으로 제제화한 백신의 노로 바이러스 항원에 대한 체액성 면역 반응 분석 그래프이다.
도 30은 에멀전으로 제제화한 백신의 노로 바이러스 항원에 대한 세포성 면역 반응 분석 그래프이다.
도 31은 에멀전 제형 공초점 현미경 이미지이다.
도 32는 에멀전 제형 TEM 이미지이다.
도 33은 에멀전 SDS-PAGE를 통한 항원의 흡착 평가를 나타낸 이미지이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 TLR 리간드, 계면활성제, 알파-토코페롤 및 스쿠알렌을 포함하는 에멀전 제형의 면역증강제 조성물을 제공한다.
에멀전 제형의 면역증강제는 글로벌 제약기업에서 풍부한 임상 연구를 통해 그 안정성과 효능을 검증 받은 제형이며, 본 발명에서 개발하고자 하는 면역증강제는 이러한 제형에 새로운 면역 유도 물질을 도입하는 것이다. 본 발명은 기존의 나노미터 크기 수준의 에멀전 입자에 면역 유도 물질인 TLR 리간드를 도입하여 기존 항원 흡착의 메커니즘과 면역 반응 물질인 사이토카인을 유도하여 면역 반응을 증폭시키는 이중 기능성 면역증강제 개발을 목적으로 한다.
TLR 리간드는 톨-유사 수용체에 특이적으로 결합할 수 있는 특정 분자를 의미한다. 용어 TLR 리간드는 TLRs의 효능제 및 길항제 둘 다를 포함한다. TLR 리간드는 예를 들면, 소분자(유기 분자), 항체 또는 항체 단편, siRNA, 안티센스 핵산, 폴리펩타이드, DNA 및 RNA일 수 있다. 상기 TLR 리간드는 TLR1 내지 13으로부터 선택되는 하나 이상의 리간드일 수 있고, 바람직하게 상기 TLR 리간드는 TLR2, 3, 7, 8 및 9 리간드로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다.
TLR2를 통해 신호 전달 반응을 야기할 수 있는 TLR 리간드가 이용된다. 상기 TLR2 리간드의 구체예인 리포펩타이드(lipopeptide)는 박테리아와 마이코플라즈마에서 유래한 리포펩타이드의 합성유사체(synthetic analogue)로 J. Metzger 등에 의해 처음 합성되었다(Metzger, J. et al., 1991, Synthesis of novel immunologically active tripalmitoyl-S-glycerylcysteinyl lipopeptides as useful intermediates for immunogen preparations. Int. J. Peptide Protein Res. 37: 46-57). 하기 화학식(1)로 표시되는 화합물 분자구조는 N-palmitoyl-S-[2,3-bis(palmitoyloxy)-(2RS)-propyl]-[R]-cystein-SKKKK(Pam3Cys-SKKKK)이며, 이외에도 다양한 유사체들이 합성된 바 있다.
[화학식(1)]
H. Schild 등에 따르면 Pam3Cys-Ser-Ser을 인플루엔자 바이러스 T 세포 에피토프와 결합시켜 마우스에 투여한 경우, 바이러스 특이적인 세포 독성 T 림프구(cytotoxic T lymphocyte, CTL)가 유도되었다. 일반적으로 리포펩타이드는 TLR2에 대한 리간드로 알려져 있다.
상기 TLR2 리간드는 Pam3Cys-SKKKK, FSL-1(Pam2CGDPKHPKSF), Pam-Dhc-SKKKK, Dhc-SKKKK, Pam2Cys-SKKKK, PamCSKKKK, PHC-SKKKK, PamCys(Pam)-SKKKK, Ole2PamCys-SKKKK, Ole2Cys-SKKKK 및 Myr2Cys-SKKKK로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고, 바람직하게는 Pam3Cys-SKKKK, FSL-1, Pam-Dhc-SKKKK, Dhc-SKKKK, Pam2Cys-SKKKK, PamCSKKKK, PHC-SKKKK이고, 더욱 바람직하게는 Pam3Cys-SKKKK이다. 하지만, 본 발명에서 사용되는 TLR2 리간드로는 상기 열거한 종류로 특별히 제한되지 않으며, TLR2에 결합하고 TLR2 면역 반응을 자극하는 것이라면 제한없이 사용될 수 있다. 분자 내에 지방산의 숫자는 한 개이거나 그 이상일 수 있고, 리포펩타이드에 아미노산의 수는 하나이거나 그 이상일 수 있다. 또한, 지방산과 아미노산은 화학적으로 변형될 수 있다. 나아가, 리포펩타이드는 그람 양성이나 그람 음성인 박테리아나 마이코플라즈마로부터 유래한 분자 일부이거나 분자 전체 형태로된 지질 단백질일 수 있다.
TLR3을 통해 신호전달 반응을 야기할 수 있는 TLR 리간드가 이용된다. 상기 TLR3 리간드는 폴리(I:C)[poly(I:C), Polyadenylic-polyuridylic acid], PEI-폴리 (I:C), 폴리(A:U)[polyadenylic-polyuridylic acid, poly (A:U)], PEI-폴리(A:U) 및 dsRNA로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고, 바람직하게는 poly(I:C)이다. 하지만, 본 발명에서 사용되는 TLR3 리간드로는 상기 열거한 종류로 특별히 제한되지 않으며, TLR3에 결합하고 TLR3 면역 반응을 자극하는 것이라면 제한없이 사용될 수 있다.
상기 TLR3 리간드인 폴리(I:C)는 시험관 내(in vitro) 및 생체 내(in vivo) 연구에서 타입1 인터페론의 강력한 유도체로 사용되어왔다. 더욱이 폴리(I:C)는 포유류에서 가장 강력한 항원 제시 세포인 수지상세포(dendritic cell)를 안정적이고 성숙하게 형성하는 것으로 알려졌다(Rous, R. et al 2004. Poly(I:C) used for human dendritic cell maturation preserves their ability to secondarily secrete bioactive Il-12, International Immunol. 16: 767-773). 이러한 기존 보고에 따르면 폴리(I:C)는 강력한 IL-12 유도 물질이며, IL-12는 면역반응을 Th1이 발달하도록 추진하여 세포성 면역반응과 IgG2a 또는 IgG2b 항체 형성을 유도하는 중요한 사이토카인이다. 또한, 폴리(I:C)는 펩티드 항원에 대한 강력한 아쥬번트 활성을 갖는 것으로 알려졌다(Cui, Z. and F. Qui. 2005. Synthetic double stranded RNA poly I:C as a potent peptide vaccine adjuvant: Therapeutic activity against human cervical cancer in a rodent model. Cancer Immunol. Immunotherapy 16: 1-13). 폴리(I:C)는 길이가 50 내지 5,000 bp 범위일 수 있고, 50 내지 2,000 bp인 것이 적합하며, 100 내지 500 bp가 바람직하나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
TLR7을 통해 신호 전달 반응을 야기할 수 있는 TLR 리간드가 이용된다. TLR7은 선천 면역(innate immune)의 감지 체계를 구성하는 인자 가운데 하나이다. TLR7 단백질은 세포막(cellular membrane)에 묻혀 있으면서 특정 자극에만 반응한다. 일단 특정 자극을 통해 TLR7 이 활성을 획득하고 나면 면역계의 방어 기작을 가동시키는 경로가 본격적으로 작동하기 시작한다.
상기 TLR7 리간드는 이미퀴모드(Imiquimod), 이미다조퀴놀린(imidazoquinolines), 가디퀴모드(Gardiquimod), GS-9620, GSK-2245035, 레시퀴모드(resiquimod, R848), 텔라톨리모드(Telratolimod, MEDI9197, 3M-052), DSR-6434, DSP-3025(AZD8848), IMO-4200, MCT-465, 3M-051, SB-9922, 3M-052, 림톱(Limtop), TMX-30X, TMX-101, TMX-202, RG-7863 (RO6870868), RG-7795(RO-6864018), PF-4878691(3M-852A), IMO-8400, CPG-52364, 7-티아-8-옥소구아노신(7-thia-8-oxoguanosine), 7-데아자구아노신(7-deazaguanosine), 7-알릴-8-옥소구아노신(7-allyl-8-oxoguanosine) 및 7-데자구아노신(7-dezaguanosine)으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고, 바람직하게는 이미퀴모드이다. 하지만, 본 발명에서 사용되는 TLR7 리간드로는 상기 열거한 종류로 특별히 제한되지 않으며, TLR7에 결합하고 TLR7 면역 반응을 자극하는 것이라면 제한없이 사용될 수 있다.
이미퀴모드는 TLR7 항진 제제이자 리간드로서 TLR7의 활성 자극을 유도하는 생화학 제제이다.
TLR9를 통해 신호전달 반응을 야기할 수 있는 TLR 리간드가 이용된다. TLR9은 병원균 인식 및 선천적인 면역성의 활성화에서 근본적인 역할을 하는 TLR 계열의 단백질을 지칭하며, B 세포, 단핵구, 큰포식 세포 및 형질세포성 수지상세포의 엔도솜 구획에서 주로 발견된다. TLR9는 미생물이 갖는 특정한 비메틸화된 모티프를 인식하고, 주로 Th1 반응을 유도한다.
상기 TLR9 리간드인 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드 (CpG ODN)는 시티딘 트라이포스페이트 데옥시뉴클레오티드("C") 및 이어서 구아니딘 트라이포스페이트 데옥시뉴클레오티드("G")를 함유하는 짧은 단일-가닥 합성 DNA 분자이다. "p"는, 일부 ODN이 변형된 포스포로티오에이트(PS) 골격을 갖더라도, 연속적인 뉴클레오티드 사이의 포스포다이에스터 연결기를 지칭한다. 이들 CpG 모티프가 비메틸화된 경우, TLR9에 결합하고 TLR9 면역 반응을 자극한다.
상기 TLR9 리간드는 비메틸화된 시토신-포스페이트-구아노신(CpG) 모티프를 포함하는 올리고데옥시뉴클레오티드(CpG ODN)일 수 있지만, 이의 다양한 변형체 또한 포함할 수 있다. 상기 TLR9 리간드는 CpG 1018, CpG ODN 2216, CpG ODN 1585, CpG ODN 2336, CpG ODN PB4, CpG ODN 1002, CpG ODN 1668, CpG ODN 1826, CpG ODN 2006, CpG ODN 2007, CpG ODN BW006, CpG ODN D-SL01, CpG-28, CpG-685, CpG-684, CpG ODN 2395, CpG ODN M362 및 CpG ODN D-SL03으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고, 바람직하게는 CpG 1018이다. 하지만, 본 발명에서 사용되는 TLR9 리간드는 상기 열거한 종류로 특별히 제한되지 않으며, TLR9에 결합하여 TLR9의 면역 반응을 자극하는 것이라면 제한없이 사용될 수 있다.
상기 계면활성제는 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트(Polyoxyethylene sorbitan monooleate) 또는 소르비탄 트리올레에이트(Sorbitan trioleate) 또는 둘 모두의 혼합물일 수 있고, 상기 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트는 폴리소르베이트-80 또는 트윈-80(트윈-80)이고, 상기 소르비탄 트리올레에이트는 스팬85(Span85)이다. 바람직하게 상기 계면활성제는 트윈-80이다. 바람직하게 TLR 리간드에 대한 계면활성제의 비율은 9.7 이상이고, 더욱 바람직하게는 10 내지 40이며, 더욱 바람직하게 10 또는 30이다.
상기 면역증강제 조성물은 알파-토코페롤 및 스쿠알렌을 포함한다. 스쿠알렌은 isoprene 구조 단위를 기본으로 하는 isoprenoid의 일종으로, 이중결합의 특징에 의해 높은 면역 활성이 유도된다고 알려져 있다. 스쿠알렌은 토코페롤 등의 다른 소수성 물질과 함께 사용하기도 한다. 바람직하게 스쿠알렌에 대한 알파-토코페롤의 비율은 1 이하이고, 더욱 바람직하게는 0.5 내지 0.9이며, 더욱 바람직하게는 0.7 또는 0.8이다.
상기 면역증강제 조성물은 지질을 추가로 포함할 수 있다.
상기 지질은 양이온, 음이온 또는 중성 지질일 수 있다. 일례로, 상기 지질은 DOTAP(1,2-Dioleoyl-3-Trimethylammonium-Propane), DDA(Dimethyldioctadecylammonium), DC-chol(3β-[N -(N',N'-Dimethylaminoethane)-carbamoyl]cholesterol), DOPE(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), DPPC(1,2-dipalmitoyl-sn glycero-3phosphocholine), DOPC(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) 및 DOPG(1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-[Phospho-rac-(1-glycerol)])으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다. 바람직하게, TLR 리간드에 대해 지질의 비율은 0.5 이하이며, 더욱 바람직하게 0.1 내지 0.3이고, 더욱 바람직하게는 0.1 또는 0.2이다.
상기 면역증강제 조성물은 계면활성제와 TLR 리간드가 함께 오일을 둘러싸는 구조를 갖는다.
또한, 본 발명은 면역증강제 조성물 및 항원을 포함하는 에멀전 제형의 백신 조성물을 제공한다.
상기 백신 조성물은 하나 이상의 약제학적으로 허용 가능한 담체, 희석제를 더 포함할 수 있다. 일례로, 상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있고, 인체 또는 수의용으로 제형화되어 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여 경로는 경구, 복강, 정맥, 근육, 피하, 피내 등의 경로로 투여될 수 있다. 바람직하게는, 주사제로 제형화하여 투여하는 것이다. 주사제는 생리식염액, 링겔액 등의 수성용제, 식물유, 고급 지방산 에스텔(예, 올레인산에칠 등), 알코올류(예, 에탄올, 벤질알코욜, 프로필렌 글리콘, 글리세린 등) 등의 비수성 용제 등을 이용하여 제조할 수 있고, 변질 방지를 위한 안정화제(예, 아스코르빈산, 아황산수소나트륨, 피로아황산나트륨, BHA, 토코페롤, EDTA 등), 유화제, pH 조절을 위한 완충제, 미생물 발육을 저지하기 위한 보존제(예, 질산페닐수은, 치메로살, 염화벤잘코늄, 페놀, 크레솔, 벤질알코올 등) 등의 약제학적 담체를 포함할 수 있다. 상기 백신 조성물은 약제학적 유효량으로 투여할 수 있다. 이때, 용어 "약제학적 유효량"이란 예방 또는 치료 효과를 나타낼 수 있을 정도의 충분한 양과 부작용이나 심각한 또는 과도한 면역반응을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 정확한 투여 농도는 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 투여 경로, 투여 방법 등 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있으며, 1회 내 지 수회 투여가 가능하다. 일반적으로는 체중 1 kg 당 0.1 mg 내지 100 mg, 바람직하게는 0.5 mg 내지 10 mg을 2주 또는 4주 간격으로 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 질환의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
또한, 본 발명은(a) 지질, TLR 리간드를 유기용매에 녹여 박막(thin film)을 형성시키는 단계; 및(b) 상기 박막을 알파-토코페롤 및 스쿠알렌을 포함하는 오일상 및 계면활성제와 혼합시키는 단계; 를 포함하는 에멀전 제형의 면역증강제 조성물의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 알파-토코페롤 및 스쿠알렌을 포함하는 오일상과 TLR 리간드, 계면활성제를 혼합시키는 단계; 를 포함하는 에멀전 제형의 면역증강제 조성물의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 리포펩타이드와 지질을 유기용매에 녹여 박막을 형성시키고, 알파-토코페롤과 스쿠알렌의 혼합물과 트윈-80을 박막에 첨가하여 리포펩타이드 에멀전을 제조하거나(실시예 1 참조), 박막을 형성하지 않고 리포펩타이드 에멀전을 제조하였다(실시예 2 참조). 그 밖에 다른 TLR 리간드를 리포펩타이드 에멀전에 첨가하여 제조하였다.
에멀전의 조성 및 조성물의 비율을 최적화하기 위한 1차 스크리닝을 진행하였다. 먼저, 알파-토코페롤의 유무에 따른 에멀전의 특성을 확인한 결과, 알파-토코페롤을 첨가한 경우 더 안정된 입자를 형성하고, IL-6의 분비량이 증가함을 확인하였다(도 1 및 도 2 참조). 다음으로, 지질 비율을 최적화하기 위한 실험을 수행한 결과, 지질의 비율이 낮을수록 더 안정된 입자를 형성하고, 면역 반응이 향상됨을 확인하였다(표 3 및 도 3 참조). 또한, 계면활성제의 비율을 최적화하기 위한 실험을 수행한 결과, 계면활성제인 트윈-80의 비율이 작을수록 더 안정된 입자를 형성하고, 트윈-80의 비율이 증가할수록 IL-6의 분비량이 감소하는 경향을 확인하였다(표 5 및 도 4 참조). 마지막으로, 알파-토코페롤/스쿠알렌 비율을 최적화하기 위한 실험을 수행한 결과, 알파-토코페롤/스쿠알렌 비율이 낮을수록 더 안정된 입자를 형성하고, 알파-토코페롤/스쿠알렌 비율이 커질수록 에멀전에 의해 유도되는 면역 반응은 증가함을 확인하였다(표 7 및 도 5 참조). 최종적으로, 리포펩타이드에 대한 지질 비율은 0.5 이하인 0.1 또는 0.2로 설정하였고, 리포펩타이드에 대한 트윈-80 비율은 9.7 이상인 10 또는 30으로 설정하였으며, 알파-토코페롤/스쿠알렌 비율은 1을 넘지 않게 0.7 또는 0.8로 설정하였다(도 6 참조).
1차 스크리닝 결과를 바탕으로 층 분리가 일어나지 않고, 크기가 균일한 입자를 형성하는 조합을 찾기 위한 2차 스크리닝을 진행하였다. 먼저, Pam3CSK4 에멀전, Pam3CSK4/지질 에멀전(DOTAP, DOPE, DOPG)을 제조하여 에멀전의 최적 조건을 확인하였고, 세포에서 면역 반응 유도 수준을 확인하여 최적 조건을 선정하였다. 또한, Pam3CSK4/지질 에멀전에 TLR3 리간드인 폴리(I:C)를 첨가한 경우, 모든 조성에서 층 분리가 일어나지 않는 것이 확인하였고, 폴리(I:C)의 첨가량에 따른 세포에서의 사이토카인 유도능에 차이가 없어 가장 작은 용량으로 선별하였다. 또한, Pam3CSK4 에멀전에 TLR7 리간드인 이미퀴모드를 첨가할 경우, Pam3CSK4 에멀전 50 μg을 기준으로 이미퀴모드를 10 내지 15μg 첨가하는 것이 입자가 안정적임을 확인하였고(표 14 참조), 사이토카인 유도능도 가장 높은 것으로 확인되었다(도 9 참조). Pam3CSK4/이미퀴모드 에멀전에 TLR3 리간드인 폴리(I:C)를 첨가한 경우, 이미퀴모드를 12.5 μg 이상 첨가하는 것이 안정하며, 이미퀴모드를 첨가하지 않은 그룹에서 사이토카인 유도능도 가장 높음을 확인하였다(표 15 및 도 10 참조). 또한, 리포펩타이드의 종류는 입자의 안정성과 사이토카인 유도능에 영향을 미치지 않음을 확인하였다(표 16 및 도 11 참조). Pam3CSK4 에멀전에 TLR9 리간드(CpG 1018)를 첨가한 경우, 모든 그룹에서 안정적인 입자가 형성되었으며, CpG 1018을 첨가하지 않은 그룹에서 가장 높은 사이토카인 유도능을 확인하여, CpG 1018 첨가로 인한 시너지 효과는 없는 것을 확인하였다(표 17 및 도 12 참조).
백신 제형에서의 면역증강제에 의한 in vivo 면역 효능의 차이를 알아보고자 인플루엔자 항원을 혼합하고, 마우스 면역 반응 평가를 진행하였다(도 13 참조). 먼저, Pam3CSK4 에멀전 및 Pam3CSK4/지질 에멀전 사용 백신 제형에 대한 마우스 면역원성을 평가한 결과, 면역증강제 없이 항원만 투여한 그룹에 비하여 Pam3CSK4 에멀전을 면역증강제로 사용한 대부분의 시험군에서 높은 면역반응을 확인하였다(도 14 참조). Pam3CSK4/TLR3 리간드 에멀전 사용 백신 제형에 대한 마우스 면역원성이 향상됨을 확인하였다(도 15 참조). 또한, 스쿠알렌의 용량이 증가할 경우, Pam3CSK4 에멀전을 이용한 백신 제형의 체액성 및 세포성 면역반응 모두 타 어쥬번트보다 높게 올라가는 것을 확인하였다(도 17 참조). 또한, 지질을 과량으로 포함하는 경우 낮은 면역원성을 보였다(도 19 및 도 20 참조). 또한, 폴리(I:C)가 포함되지 않은 경우에는 지질이 추가되면 더 높은 면역 반응이 유도되었으나, 폴리(I:C)를 추가할 경우에는 지질의 유/무 및 폴리(I:C)의 용량은 면역 반응에 영향을 주지 않음을 확인하였다(도 21 및 도 22 참조). 또한, 인플루엔자 항원 외에 H1N1 바이러스를 불활화한 독감 바이러스 항원에서도 면역 반응을 향상시킴을 확인하였고(도 23 및 도 24 참조), Pam3CSK4 에멀전 제형이 적은 항원으로도 효과적인 면역반응을 일으킴을 확인하였다(도 25 및 도 26 참조). 또한, 코로나 바이러스 및 노로바이러스 항원에 대한 면역원성을 확인하였다(도 27 내지 도 30 참조).
본 발명의 에멀전의 물성을 분석한 결과, Pam3CSK4, 지질(DOPE), 폴리(I:C)가 같은 곳에 위치함을 확인하였고(도 31 참조), 폴리(I:C)가 에멀전의 주변을 감싸고 있는 구조임을 확인하였으며(도 32 참조), Pam3CSK4 에멀전에 폴리(I:C)가 첨가된 에멀전은 항원 흡착성은 낮았으나(도 33 참조), 체액성 및 세포성 면역반응의 유도가 높게 나타나는 것으로 보아 항원의 흡착 여부에 관계없이 TLR2&3 리간드를 사용함으로써 면역증강제의 면역원성을 향상시킬 수 있음을 알 수 있었다.
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해서 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해서 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 박막(Thin film)을 이용한 에멀전(에멀전)의 제조
<실시예 1> 박막(Thin film)을 이용한 에멀전(에멀전)의 제조
박막을 이용하여 에멀전을 제조하였다.
먼저, 다양한 리포펩타이드(Lipopeptide; Pam3-CSKKKK, FSL-1, Pam-Dhc-SKKKK, Dhc-SKKKK, Pam2Cys-SKKKK, Pam-CSKKKK 또는 PHC-SKKKK, 총 7종) 및/또는 지질(lipid)을 유기용매에 녹여 박막(지질필름)을 형성시켰다. 박막 형성 시, 혼합액이 유리 용기의 기벽에 골고루 분포할 수 있도록 돌려가며 질소 가스로 10분 동안 유기용매를 기화시켜 제거하였다. 다음으로, 14 mg의 알파-토코페롤과 24 μL의 스쿠알렌을 완전히 혼합하여 준비하였다. 트윈-80(트윈-80)은 10 mM의 인산나트륨에 150 mM의 NaCl이 포함된 pH 7.0의 완충용액(PBS)에 용해하여 10 mg/mL의 농도로 제조하여 준비하였다. 그 후, 완전히 건조된 박막(지질 필름)에 960 μL의 PBS/트윈-80 용액 및 40 μL의 알파-토코페롤/스쿠알렌을 첨가하였고, 3초/3초(pulse on/off)의 조건으로 10분 동안 초음파 처리를 하여, 나노 입자(nano particle) 형태의 현탁액인 에멀전을 제조하였다.
폴리(I:C)가 첨가된 에멀전의 제조는 제조가 완료된 리포펩타이드 에멀전에 폴리(I:C)를 첨가 및 혼합하여 제조하였다. 이렇게 제조한 에멀전은 동적광산란광도계(Dynamic light scattering) 입도분석기로 측정하였을 때, 100 ~ 300 d.nm의 크기를 지닌다.
그 밖에 에멀전과 항원 성분은 간단한 혼합으로 첨가하였다.
<실시예 2> 박막(thin film)을 이용하지 않은 에멀전의 제조
박막을 이용하지 않고 에멀전을 제조하였다.
먼저, 14 mg의 알파-토코페롤과 24 μL의 스쿠알렌을 완전히 혼합하여 준비하였다. 트윈-80은 10 mM의 인산나트륨에 150 mM의 NaCl이 포함된 pH 7.0의 완충용액(PBS)에 용해하여 10 mg/mL의 농도로 제조하여 준비하였다. PBS/트윈-80 용액에 다양한 리포펩타이드(Lipopeptide; Pam3-CSKKKK, FSL-1, Pam-Dhc-SKKKK, Dhc-SKKKK, Pam2Cys-SKKKK, Pam-CSKKKK 또는 PHC-SKKKK, 총 7종)를 1 mg/mL로 용해시켰다. 또한, PBS/트윈-80 용액에 지질은 포함되거나 포함되지 않을 수 있다. 이와 같이 첨가 제조된 용액 960 μL과 알파-토코페롤/스쿠알렌 40 μL을 혼합한 후 3초/3초(pulse on/off)의 조건으로 10분 동안 초음파처리를 하여, 나노 입자(nano particle)형태의 현탁액인 에멀전을 제조하였다.
폴리(I:C)가 첨가된 에멀전의 제조는 제조가 완료된 리포펩타이드 에멀전에 폴리(I:C)를 첨가 및 혼합하여 제조한다. 이렇게 제조한 에멀전은 제타사이저 동적광산란광도계(Dynamic light scattering) 입도분석기로 측정 하였을 때, 100 ~ 300 d.nm의 크기를 지닌다.
그 밖에 에멀전과 항원 성분은 간단한 혼합으로 첨가하였다.
<3-1-1> 알파-토코페롤 유/무에 따른 입자의 안정성 확인
알파-토코페롤 첨가 여부가 에멀전의 입자 안정성에 미치는 영향을 확인하기 위한 실험을 수행하였다.
구체적으로, 실시예 1의 방법을 이용하여 에멀젼을 제조하였다. 유기 용매를 이용해 지질 및 Pam3-CSKKKK 리포펩타이드를 각각 녹여 지질 필름을 제조하였다. 완전히 건조된 지질 필름에 PBS/트윈-80 용액과 알파-토코페롤/스쿠알렌 또는 PBS/트윈-80 용액과 스쿠알렌을 첨가하여 에멀전을 제조하였다. 구체적인 조성은 하기 표 1과 같다.
동적광산란광도계(Dynamic light scattering) 입도분석기를 통해 상기 제조된 에멀전의 크기(size), PDI(Poly dispersity index), 제타 전위(zeta-potential)을 비교하였다.
| G5 | G6 | G7 | G8 | G9 | G10 | G11 | G12 | |||
| 조성(mg) | 알파-토코페롤 | - | 47.5 | - | 47.5 | - | 47.5 | - | 47.5 | |
| Pam3CSK4 | 1 | 1 | 1 | 1 | ||||||
| 지질 | DOTAP | - | 1 | - | - | |||||
| DOPE | - | - | 1 | - | ||||||
| DOPG | - | - | - | 1 | ||||||
| 스쿠알렌 | 42.8 | |||||||||
| 트윈-80 | 19.4 | |||||||||
| 완충용액(mL) | 0.9 | |||||||||
| 알파-토코페롤(v/v%) | 0/5.54 | |||||||||
| 스쿠알렌(v/v%) | 4.51 | |||||||||
| 트윈-80(v/v%) | 1.78 | |||||||||
그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이, 입자의 크기 분포(size distribution)는 알파-토코페롤이 첨가되지 않은 그룹(G5, G7, G9 및 G11)에서 2개의 피크(peak)를 보이나, 알파-토코페롤이 첨가된 그룹(G6, G8, G10 및 G12)에서 1개의 피크(peak)를 보였다.
상기의 결과는 알파-토코페롤을 첨가하지 않은 경우에는 균일하지 않고 불안정한 입자를 형성하지만, 알파-토코페롤을 첨가한 경우 더 안정된 입자를 형성함을 시사한다.
또한, 알파-토코페롤이 첨가된 그룹(G6, G8, G10 및 G12)의 PDI값은 0.273, 0.239, 0.243, 0.360이었으나, 알파-토코페롤이 첨가되지 않은 그룹(G5, G7, G9 및 G11)의 PDI값은 0.516, 0.440, 0.443, 0.397로 나타났다. PDI값이 작을수록 균일한 입자를 형성하므로 알파-토코페롤이 첨가된 그룹이 알파-토코페롤이 첨가되지 않은 그룹보다 더 균일한 입자임을 알 수 있었다.
<3-1-2> 알파-토코페롤 유/무에 따른 면역 반응 유도 수준 확인
알파-토코페롤 첨가 여부가 면역 반응 유도 수준에 미치는 영향을 확인하기 위한 실험을 수행하였다.
구체적으로, Raw 264.7 세포(마우스 대식세포주)를 12 웰 플레이트(12 well plate)에 1×105으로 분주한 후, 제형별 에멀전을 각각 처리하여 37℃, CO2 배양기에서 반응시켰다. 그 후, 배지로 분비된 전염증성 사이토카인(proinflammatory cytokine)인, IL-6의 농도를 ELISA로 분석함으로써 세포 기반의 면역 반응 유도 수준을 확인하였다. G5 내지 G12의 조성은 상기 표 1과 같고, 대조군으로 G1(PBS), G2(AS03), G3(MF59), G4(Pam3CSK4)를 이용하였다. AS03와 MF59는 Invitrogen에서 구입하였다.
그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 알파-토코페롤이 첨가되지 않은 그룹(G5, G7, G9 및 G11)에 비해 알파-토코페롤이 첨가된 그룹(G6, G8, G10 및 G12)에서 IL-6의 분비량이 증가하는 경향이 있음을 확인하였다.
이는 알파-토코페롤에 의하여 항산화 효과와 대식 세포의 활성이 유도된 것임을 시사한다.
상기의 결과를 통해, 이 후 에멀전 제조 시에는 알파-토코페롤을 첨가하여 면역 반응을 향상시킬 수 있도록 하였다.
<3-2> 지질 비율의 최적화 조건 확립
<3-2-1> 지질 비율에 따른 입자의 안정성 확인
리포펩타이드 에멀전에서 지질의 비율(중량비)을 달리한 에멀전을 제조하여 입자 안정성에 미치는 영향을 확인하기 위한 실험을 수행하였다.
구체적으로, 하기 표 2과 같이 지질은 DOTAP을 사용하였고, DOTAP을 제외한 나머지 조건은 고정한 후 지질(DOTAP)의 비율을 달리하여 제조하였다.
제조한 에멀전을 동적광산란광도계(Dynamic light scattering) 입도분석기를 통해 크기(size), PDI(Poly dispersity index), 제타 전위(zeta-potential)를 비교하였다.
| G1 | G2 | G3 | |
| Pam3CSK4(mg) | 1 | ||
| DOTAP(mg) | 0.5 | 1 | 2 |
| 트윈-80(mg) | 19.4 | ||
| 알파-토코페롤(mg) | 47.5 | ||
| 스쿠알렌(mg) | 42.8 | ||
| 완충용액(mL) | 0.9 | ||
그 결과, 표 3과 같이 지질 비율이 작아질수록, 입자의 크기와 PDI값 모두 작아지는 것을 확인하였다.
| 알파-토코페롤 첨가 | DOTAP/Pam3CSK4(W/R) | 크기(d.nm) | PDI | 제타 전위(mV) | |
| G1 | DOTAP | 0.5 | 135.3 | 0.222 | 21.4 |
| G2 | 1 | 176.8 | 0.239 | 36.8 | |
| G3 | 2 | 318.7 | 0.415 | 45.3 |
상기의 결과는 지질 비율이 작아질수록 더 안정된 입자임을 시사한다.
<3-2-2> 지질 비율에 따른 면역 반응 유도 수준 확인
리포펩타이드 에멀전에서 지질의 비율(중량비)을 달리한 에멀전을 제조하여 면역 반응 유도 수준에 미치는 영향을 확인하기 위한 실험을 수행하였다.
구체적으로, Raw 264.7 세포(마우스 대식세포주)를 12 웰 플레이트에 1×105에 분주한 후, 제형별 에멀전을 각각 처리하여 37℃, CO2 배양기에서 반응시켰다. 그 후, 배지로 분비된 전염증성 사이토카인(proinflammatory 사이토카인)인 IL-6의 농도를 ELISA로 분석함으로써 세포 기반의 면역 반응 유도 수준을 확인하였다.
그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 지질의 비율이 2인 그룹(G3)에 비해 지질의 비율이 1인 그룹(G2)에서, 지질의 비율이 1인 그룹(G2)에 비해 지질의 비율이 0.5인 그룹(G1)에서 IL-6의 농도가 높음을 확인하였다
상기의 결과는 지질의 비율이 낮을수록 면역 반응이 향상됨을 시사한다.
상기의 결과를 통해, 지질 비율을 0.5 이하로 설정하여 면역 반응을 향상시킬 수 있도록 하였다.
<3-3> 계면활성제 비율의 최적화 조건 확립
<3-3-1> 계면활성제 비율에 따른 입자의 안정성 확인
계면활성제(detergent)중에 하나인 트윈-80을 이용하여 에멀전을 제조하였다. 리포펩타이드 에멀전에서 트윈-80의 비율(중량비)을 달리한 에멀전을 제조하여 입자 안정성에 미치는 영향을 확인하기 위한 실험을 수행하였다.
구체적으로, 하기 표 4와 같이 트윈-80의 비율만을 달리한 에멀전을 제조하였다.
제조한 에멀전을 동적광산란광도계(Dynamic light scattering) 입도분석기를 통해 크기(size), PDI(Poly dispersity index), 제타 전위(zeta-potential)를 비교하였다.
| DOTAP 에멀전 | |||
| G1 | G2 | G3 | |
| Pam3CSK4(mg) | 1 | ||
| DOTAP(mg) | 1 | ||
| 트윈-80(mg) | 9.7 | 19.4 | 38.3 |
| 알파-토코페롤(mg) | 47.5 | ||
| 스쿠알렌(mg) | 42.8 | ||
| 완충용액(mL) | 0.9 | ||
그 결과, 표 5와 같이, 트윈-80의 비율이 작을수록 입자의 크기와 PDI가 커지는 경향을 확인하였다.
| 알파-토코페롤 첨가 | 트윈-80(비율) | 크기(d.nm) | PDI | 제타 전위(mV) | |
| G1 | DOTAP | 9.7 | 435.5 | 0.721 | 41.1 |
| G2 | 19.4 | 176.8 | 0.239 | 36.8 | |
| G3 | 38.3 | 117.1 | 0.14 | 35.5 |
상기의 결과는 트윈-80의 비율이 클수록 더 안정된 입자임을 시사한다.
<3-3-2> 계면활성제 비율에 따른 면역 반응 유도 수준 확인
리포펩타이드 에멀전에서 계면활성제(detergent)인 트윈-80의 비율(중량비)을 달리한 에멀전을 제조하여 면역 반응 유도 수준에 미치는 영향을 확인하기 위한 실험을 수행하였다.
구체적으로, Raw 264.7 세포(마우스 대식세포주)를 12 웰 플레이트에 1×105으로 분주한 후, 제형별 에멀전을 각각 처리하여 37℃, CO2 배양기에서 반응시켰다. 그 후, 배지로 분비된 전염증성 사이토카인(proinflammatory cytokine)인 IL-6의 농도를 ELISA로 분석함으로써 세포 기반의 면역 반응 유도 수준을 확인하였다.
그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 트윈-80의 비율이 증가할수록 IL-6의 분비량이 증가하다가 어느 수준 이상에서 다시 감소함을 확인하였다.
상기의 결과를 통해, 리포펩타이드에 대한 트윈-80 비율은 9.7 이상으로 결정하여 에멀전을 제조하였다.
<3-4> 알파-토코페롤/스쿠알렌 비율의 최적화 조건 확립
<3-4-1> 알파-토코페롤/스쿠알렌 비율에 따른 입자의 안정성 확인
리포펩타이드 에멀전에서 알파-토코페롤/스쿠알렌 비율(중량비)을 달리한 에멀전을 제조하여 입자 안정성에 미치는 영향을 확인하기 위한 실험을 수행하였다.
구체적으로, 하기 표 6과 같이 알파-토코페롤/스쿠알렌 혼합물의 비율을 제외한 나머지 조건은 고정하여 제조하였다.
제조한 에멀전을 동적광산란광도계(Dynamic light scattering) 입도분석기를 통해 크기(size), PDI(Poly dispersity index), 제타 전위(zeta-potential)를 비교하였다.
| DOTAP 에멀전 | |||
| G1 | G2 | G3 | |
| Pam3CSK4(mg) | 1 | ||
| DOTAP(mg) | 1 | ||
| 트윈-80(mg) | 19.40 | ||
| 알파-토코페롤(mg) | 23.75 | 47.50 | 95.00 |
| 스쿠알렌(mg) | 42.80 | ||
| 완충용액(mL) | 0.9 | ||
그 결과, 표 7과 같이, 알파-토코페롤 비율이 증가할수록 입자의 크기와 PDI가 커지는 경향을 확인하였다.
| 알파-토코페롤 첨가 | 알파-토코페롤/스쿠알렌(비율) | 크기(d.nm) | PDI | 제타 전위(mV) | |
| G1 | DOTAP | 0.5 | 167.7 | 0.158 | 46.3 |
| G2 | 1 | 176.8 | 0.239 | 36.8 | |
| G3 | 2 | 226.9 | 0.451 | 48.2 |
상기의 결과는 알파-토코페롤 비율이 낮을수록 더 안정된 입자임을 시사한다.
이 결과를 바탕으로 알파-토코페롤/스쿠알렌 비율은 1을 넘지 않는 것으로 결정하였다.
<3-4-2> 알파-토코페롤/스쿠알렌 비율에 따른 면역 반응 유도 수준 확인
면역 세포를 이용하여 in vitro 면역 반응 유도 수준을 분석하였다.
구체적으로, Raw 264.7 세포(마우스 대식세포주)를 12 웰 플레이트에 1×105으로 분주한 후, 제형별 에멀전을 각각 처리하여 37℃, CO2 배양기에서 반응시켰다. 그 후, 배지로 분비된 전염증성 사이토카인(proinflammatory cytokine)인 IL-6의 농도를 ELISA로 분석함으로써 세포 기반의 면역 반응 유도 수준을 확인하였다.
그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 알파-토코페롤/스쿠알렌 비율이 커질수록 에멀전에 의해 유도되는 면역 반응은 증가함을 확인하였다.
그러나, 알파-토코페롤/스쿠알렌 비율이 커질수록 크기와 PDI도 증가하며 불안정한 에멀전을 형성하므로, 알파-토코페롤/스쿠알렌 비율이 1을 넘지 않는 것으로 결정하였다.
<실시예 4> 에멀전 제제연구(2차 스크리닝)
실시예 3의 결과를 바탕으로 최적화된 조성 후보군으로 제형 연구를 진행하였다(도 6). 리포펩타이드에 대한 지질 비율은 0.5 이하인 0.1 또는 0.2로 설정하였고, 리포펩타이드에 대한 트윈-80 비율은 9.7 이상인 10 또는 30으로 설정하였다. 이는 상용화된 에멀전 제형 면역증강제 중 하나인 AS03의 각각 0.5배, 1.5배로써, 트윈-80을 정맥주사로 투여할 수 있는 최대 용량을 넘지 않는 범위에서 설정하였다(최대 용량은 2% 임). 또한, 알파-토코페롤/스쿠알렌 비율은 1을 넘지 않게 0.7 또는 0.8로 설정하였다.
에멀전 제형의 면역증강제 개발을 위해 유효물질을 포함하는 에멀전을 제조한 후, 입자의 크기, 입자 분포, 층 분리 정도, 점도 등과 같은 물성학적 특성 확인을 통해 에멀전의 안정성 정도를 측정하였고, 에멀전 제형별 안정성을 평가하여, 제형화 여부를 결정하였다.
<4-1> Pam3CSK4 에멀전 및 Pam3CSK4/지질 에멀전의 최적화 조건 확립
<4-1-1> Pam3CSK4 에멀전 및 Pam3CSK4/지질 에멀전의 입자의 안정성 확인
<4-1-1-1> Pam3CSK4 에멀전의 입자의 안정성 확인
Pam3CSK4 리포펩타이드를 포함하는 에멀전을 제조하여, 층 분리가 일어나지 않고, 크기가 균일한 입자를 형성하는 조합을 찾아내는 것을 목적으로 하였으며, 이를 확인하기 위하여 동적광산란광도계(Dynamic light scattering) 입도분석기를 통해 크기(size), PDI(Poly dispersity index), 제타 전위(zeta-potential)를 비교하였다.
| No. | Pam3CSK4(mg) | 트윈-80(mg) | 스쿠알렌 (mg) | 알파-토코페롤/스쿠알렌(비율) | 크기(d.nm) | PDI | 제타 전위(mV) |
| G1 | 1 | 10 | 2 | 0.7 | 127.4 | 0.177 | -1.8 |
| G2 | 0.8 | 148.3 | 0.14 | 20.9 | |||
| G3 | 6 | 0.7 | 982.9 | 0.719 | 40.4 | ||
| G4 | 0.8 | 2080 | 1 | 54.7 | |||
| G5 | 30 | 2 | 0.7 | 68.6 | 0.262 | 10 | |
| G6 | 0.8 | 76.38 | 0.422 | 18.5 | |||
| G7 | 6 | 0.7 | 175.9 | 0.128 | 36.9 | ||
| G8 | 0.8 | 183.4 | 0.207 | 41.6 |
그 결과, 표 8과 같이, G3, G4군은 크기도 크고, PDI 값이 1 정도로 컸으며, 층 분리 현상이 확인되어 제조 조건에서 제외하였으며, 층 분리가 일어나지 않고, 입자 크기와 PDI 값이 상대적으로 작은, G1, G2, G5군을 리포펩타이드 에멀전의 최적 조건으로 선정하였다.
<4-1-1-2> Pam3CSK4/DOTAP 에멀전의 입자의 안정성 확인
Pam3CSK4 리포펩타이드와 DOTAP 지질을 함께 포함하는 에멀전을 제조하여, 층 분리가 일어나지 않고, 크기가 균일한 입자를 형성하는 조합을 찾아내는 것을 목적으로 하였으며, 이를 확인하기 위하여 동적광산란광도계(Dynamic light scattering) 입도분석기를 통해 크기(size), PDI(Poly dispersity index), 제타 전위(zeta-potential)를 비교하였다.
| No. | Pam3CSK4(mg) | DOTAP /Pam3CSK4(비율) |
트윈-80(mg) | 스쿠알렌 (mg) |
알파-토코페롤/스쿠알렌 (비율) | 크기 (d.nm) |
PDI | 제타 전위 (mV) |
| G9 | 1 | 0.1 | 10 | 2 | 0.7 | 118.5 | 0.119 | 23.1 |
| G10 | 0.8 | 145.9 | 0.133 | 41.2 | ||||
| G13 | 30 | 2 | 0.7 | 70.57 | 0.143 | 14.6 | ||
| G14 | 0.8 | 492.5 | 0.467 | 16.1 | ||||
| G15 | 6 | 0.7 | 169.2 | 0.167 | 48 | |||
| G16 | 0.8 | 173 | 0.198 | 45.4 | ||||
| G17 | 1 | 0.2 | 10 | 2 | 0.7 | 125.5 | 0.17 | 37 |
| G18 | 0.8 | 122.5 | 0.14 | 45.4 | ||||
| G19 | 30 | 2 | 0.7 | 60.17 | 0.28 | 23.6 | ||
| G20 | 0.8 | 57.66 | 0.278 | 19.8 | ||||
| G21 | 6 | 0.7 | 164 | 0.163 | 34.4 | |||
| G22 | 0.8 | 169.6 | 0.195 | 50.5 |
그 결과, 표 9와 같이 DOTAP/Pam3CSK4의 비율이 0.2일 때 0.1일 때 보다 제타 전위의 절대값이 큰 안정적인 입자가 형성됨을 확인하여 DOTAP/Pam3CSK4의 비율은 0.2를 최적 조건으로 선정하였다. 그중에서도 층 분리가 일어나지 않고 입자 크기와 PDI 값이 작은 G17, G18, G19군을 Pam3CSK4/DOTAP 에멀전을 최적 조건으로 선정하였다.
<4-1-1-3> Pam3CSK4/DOPE 에멀전의 입자의 안정성 확인
Pam3CSK4 리포펩타이드와 DOPE 지질을 함께 포함하는 에멀전을 제조하여, 층 분리가 일어나지 않고, 크기가 균일한 입자를 형성하는 조합을 찾아내기 위하여 동적광산란광도계(Dynamic light scattering) 입도분석기를 통해 크기(size), PDI(Poly dispersity index), 제타 전위(zeta-potential)를 비교하였다.
| Pam3CSK4(mg) | DOPE /Pam3CSK4 (비율) |
트윈-80(mg) | 스쿠알렌(mg) | 알파-토코페롤/스쿠알렌(비율) | 크기(d.nm) | PDI | 제타 전위(mV) | |
| G23 | 1 | 0.2 | 10 | 2 | 0.7 | 125.3 | 0.145 | 31.4 |
| G24 | 0.8 | 139 | 0.122 | 36.6 | ||||
| G25 | 30 | 2 | 0.7 | 62.75 | 0.339 | 9.06 | ||
| G26 | 6 | 0.7 | 155.1 | 0.154 | 30.1 | |||
| G27 | 0.8 | 161.7 | 0.18 | 40.9 |
그 결과, 표 10과 같이, 층 분리가 일어나지 않고 입자 크기와 PDI 값이 작은 G23, G24, G25군을 Pam3CSK4/DOPE 에멀전의 최적 조건으로 선정하였다.
<4-1-1-4> Pam3CSK4/DOPG 에멀전의 입자의 안정성 확인
Pam3CSK4 리포펩타이드와 DOPG 지질을 함께 포함하는 에멀전을 제조하여, 층 분리가 일어나지 않고, 크기가 균일한 입자를 형성하는 조합을 찾아내기 위하여 동적광산란광도계(Dynamic light scattering) 입도분석기를 통해 크기(size), PDI(Poly dispersity index), 제타 전위(zeta-potential)를 비교하였다.
| Pam3CSK4 (mg) |
DOPG /Pam3CSK4 (비율) |
트윈-80(mg) | 스쿠알렌(mg) | 알파-토코페롤/스쿠알렌(비율) | 크기(d.nm) | PDI | 제타 전위(mV) | |
| G28 | 1 | 0.2 | 10 | 2 | 0.7 | 150.3 | 0.251 | 7.63 |
| G29 | 0.8 | 119.9 | 0.12 | 35.7 | ||||
| G30 | 30 | 2 | 0.7 | 59.59 | 0.347 | 5.2 | ||
| G31 | 6 | 0.7 | 139.5 | 0.131 | 34.3 | |||
| G32 | 0.8 | 140.5 | 0.15 | 37.6 | ||||
| G33 | 1 | 2 | 10 | 2 | 0.7 | 222 | 0.278 | -47.2 |
| G34 | 0.8 | 490.9 | 0.497 | -66.1 | ||||
| G35 | 30 | 2 | 0.7 | 62.62 | 0.227 | -44.2 | ||
| G36 | 6 | 0.7 | 146.2 | 0.129 | -60.1 | |||
| G37 | 0.8 | 156.2 | 0.145 | -49.1 |
그 결과, 표 11과 같이, DOPG는 음의 전하를 띄는 지질로, 과량을 첨가하여 제조하였을 때 전체적으로 음의 전하를 띠는 에멀전이 형성됨을 확인하였다. 층 분리가 일어나지 않고, 크기와 PDI 값이 작은, G28, G29, G30, G33군을 Pam3CSK4/DOPG 에멀전의 최적 조건으로 선정하였다.
<4-1-2> 선정된 최적 조건의 Pam3CSK4 에멀전, Pam3CSK4/지질 에멀전의 면역 반응 유도 수준 확인
실시예 <4-1> 내지 <4-4>로부터 최종으로 선정된 하기 표 12의 그룹에서 면역 세포를 이용한 세포 기반 면역활성 실험을 통해 면역 활성이 높게 나타나는 제형을 선정하였다.
| Pam3CSK4(mg) | 지질 /Pam3CSK4 (비율) |
트윈-80(mg) | 스쿠알렌(mg) | 알파-토코페롤/스쿠알렌(비율) | 크기(nm) | PDI | 제타 전위(mV) | |
| G4 | 1 | - | 10 | 2 | 0.7 | 127.4 | 0.177 | -1.8 |
| G5 | 0.8 | 148.3 | 0.14 | 20.9 | ||||
| G6 | 20 | 0.7 | 68.6 | 0.262 | 10 | |||
| G7 | DOTAP(0.2) | 10 | 0.7 | 125.5 | 0.17 | 37 | ||
| G8 | 0.8 | 122.5 | 0.14 | 45.4 | ||||
| G9 | 20 | 0.7 | 60.17 | 0.28 | 23.6 | |||
| G10 | DOPE(0.2) | 10 | 0.7 | 125.3 | 0.145 | 31.4 | ||
| G11 | 0.8 | 139 | 0.122 | 36.6 | ||||
| G12 | 20 | 0.7 | 62.75 | 0.339 | 9.06 | |||
| G13 | DOPG(0.2) | 10 | 0.7 | 150.3 | 0.251 | 7.63 | ||
| G14 | 0.8 | 119.9 | 0.12 | 35.7 | ||||
| G15 | 20 | 0.7 | 59.59 | 0.347 | 5.2 | |||
| G16 | DOPG (2.0) | 10 | 0.7 | 222 | 0.278 | -47.2 |
구체적으로, 면역세포를 이용한 in vitro 면역 반응의 분석은 Raw 264.7 세포(마우스 대식세포주)를 12 웰 플레이트에 1×105으로 분주한 후, 제형별 에멀전을 각각 처리하여 37℃, CO2 배양기에서 반응시켰다. 그 후, 배지로 분비된 사이토카인인 TNF-α의 농도를 ELISA로 분석함으로써 세포 기반의 면역 반응 유도 수준을 확인하였다.
그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이, 트윈-80, 스쿠알렌, 알파-토코페롤/스쿠알렌의 비율에 따라 사이토카인 분비량의 차이를 보이는 것이 확인되었다. 이를 통해 최종적으로 G4, G7, G10, G13 및 G16의 5가지 Pam3CSK4 에멀전을 선정하였다.
<4-2> Pam3CSK4/지질/TLR3 리간드 에멀전의 최적화 조건 확립
<4-2-1> Pam3CSK4/지질/TLR3 리간드 에멀전의 입자의 안정성 확인
TLR2 리간드인 Pam3CSK4 및 지질를 포함하는 에멀전에 TLR3 리간드인 폴리(I:C)를 포함하는 에멀전을 제조하여, 층 분리가 일어나지 않고 크기가 균일한 입자를 형성하는 조합을 찾아내기 위하여 동적광산란광도계(Dynamic light scattering) 입도분석기를 통해 크기(size), PDI(Poly dispersity index), 제타 전위(zeta-potential)를 비교하였다.
| 에멀전 | Pam3CSK4: 폴리(I:C) | 크기(nm) | PDI | 제타 전위(mV) | |
| Pam3CSK4 | G4 | 100:0 | 138.7 | 0.106 | 19.8 |
| G5 | 100:5 | 161.1 | 0.122 | -0.25 | |
| G6 | 100:10 | 147.2 | 0.094 | -11.9 | |
| G7 | 100:20 | 141.3 | 0.133 | -16 | |
| Pam3CSK4 /DOTAP(0.2) | G8 | 100:0 | 130.2 | 0.163 | 37.4 |
| G9 | 100:05 | 148.8 | 0.183 | 32.9 | |
| G10 | 100:10 | 146.1 | 0.174 | 35.7 | |
| G11 | 100:20 | 144.6 | 0.139 | 28.7 | |
| Pam3CSK4 /DOPE(0.2) |
G12 | 100:0 | 153.2 | 0.166 | 39.5 |
| G13 | 100:05 | 163.3 | 0.168 | 39.1 | |
| G14 | 100:10 | 163.6 | 0.146 | 37.7 | |
| G15 | 100:20 | 255.8 | 0.265 | 33.9 | |
| Pam3CSK4 /DOPG(0.2) | G16 | 100:0 | 118.4 | 0.132 | 35 |
| G17 | 100:05 | 125.6 | 0.135 | 30 | |
| G18 | 100:10 | 127.7 | 0.12 | 29.3 | |
| G19 | 100:20 | 148.5 | 0.129 | 6.31 | |
| Pam3CSK4 /DOPG(2.0) | G20 | 100:0 | 222 | 0.278 | -47.2 |
| G21 | 100:05 | 225.9 | 0.236 | -43 | |
| G22 | 100:10 | 211 | 0.259 | -42.5 | |
| G23 | 100:20 | 246.4 | 0.359 | -45.7 |
그 결과, 표 13에 나타난 바와 같이, Pam3CSK4/지질 에멀전에 폴리(I:C)를 첨가한 모든 조성에서 층 분리가 일어나지 않는 것이 확인되었다.
<4-2-2> Pam3CSK4/지질/TLR3 리간드 에멀전의 면역 반응 유도 수준 확인
상기 표 13에서 면역 세포를 이용한 세포 기반 면역활성 실험을 통해 면역 활성이 높게 나타나는 제형을 선정하였다. 구체적인 실험 방법은 실시예 <4-1-2> 의 in vitro 면역 반응의 분석과 동일하다.
그 결과, 도 8에 나타난 바와 같이, 폴리(I:C)의 첨가량에 따른 세포 기반에서의 사이토카인 유도능 차이를 보이지 않아 가장 적은 양을 사용하는 G5, G9, G13, G17, G21을 선별하였다.
<4-3> Pam3CSK4/TLR7 리간드 에멀전의 최적화 조건 확립
<4-3-1> Pam3CSK4/TLR7 리간드 에멀전의 입자의 안정성 확인
Pam3CSK4 에멀전에 TLR7 리간드인 이미퀴모드를 첨가하여 제조한 후 층 분리가 일어나지 않고, 크기가 균일한 입자를 형성하는 조합을 찾아내기 위하여 동적광산란광도계(Dynamic light scattering) 입도분석기를 통해 크기(size), PDI(Poly dispersity index), 제타 전위(zeta-potential)를 비교하였다.
| Pam3CSK4 : 이미퀴모드(W/R) | 크기(d.nm) | PDI | 제타 전위(mV) | |
| G1 | PBS | |||
| G2 | 50 : 0 | 141.5 | 0.174 | +44.7 |
| G3 | 50 : 2.5 | 138 | 0.181 | +5.77 |
| G4 | 50 : 5 | 143.7 | 0.218 | +3.86 |
| G5 | 50 : 10 | 166.3 | 0.21 | +33.9 |
| G6 | 50 : 12.5 | 172.1 | 0.188 | +21.6 |
| G7 | 50 : 15 | 126.7 | 0.181 | +48.1 |
그 결과, 표 14와 같이, 이미퀴모드가 첨가되지 않은 G2 제형보다 이미퀴모드가 2.5 μg(G3), 5 μg(G4) 첨가되었을 때 제타 전위의 절대값이 작아지는 것으로 보아, 불안정한 나노입자를 형성하고 있다는 것이 확인되었다. 그러나 이미퀴모드가 10 μg 이상 첨가된 제형에서는(G5~G7) 크기, PDI, 제타 전위 모두 첨가되지 않은 제형과 비슷한 결과가 확인되는 것으로 보아 첨가된 이미퀴모드에 의해 안정적인 에멀전을 형성하고 있음을 알 수 있었다. Pam3CSK4 에멀전 50 μg을 기준으로 첨가된 이미퀴모드의 용량이 15 μg을 넘어가면 침전이 확인되어 그 이상의 제형으로는 제조하지 않기로 하였다.
<4-3-2> Pam3CSK4/TLR7 리간드 에멀전의 면역 반응 유도 수준 확인
상기 표 14에서 면역 세포를 이용한 세포 기반 면역활성 실험을 통해 면역 활성이 높게 나타나는 제형을 선정하였다. 구체적인 실험 방법은 실시예 <4-1-2> 의 in vitro 면역 반응의 분석과 동일하다.
그 결과, 도 9에 나타난 바와 같이, 이미퀴모드 용량에 따른 사이토카인 유도능의 차이가 나타났으며 이미퀴모드를 12.5 μg 첨가한 제형(G6)에서 가장 높은 사이토카인 유도능이 확인되었다.
<4-4> Pam3CSK4/TLR7 리간드/TLR3 리간드 에멀전의 최적화 조건 확립
<4-4-1> Pam3CSK4/TLR7 리간드/TLR3 리간드 에멀전의 입자의 안정성 확인
실시예 <4-3-1>에서 조제한 Pam3CSK4/이미퀴모드 에멀전에 TLR3 리간드인 폴리(I:C) 5 μg을 첨가하여 제조한 후, 동적광산란광도계(Dynamic light scattering) 입도분석기를 통해 크기(size), PDI(Poly dispersity index), 제타 전위(zeta-potential)를 비교하였다.
| Pam3CSK4 : 이미퀴모드 : 폴리(I:C)(W/R) | 크기(d.nm) | PDI | 제타 전위(mV) | |
| G1 | PBS | |||
| G2 | 50 : 0 : 5 | 171.2 | 0.202 | +20.7 |
| G3 | 50 : 2.5 : 5 | 224.3 | 0.383 | +21 |
| G4 | 50 : 5 : 5 | 245.1 | 0.399 | +22.9 |
| G5 | 50 : 10 : 5 | 190.1 | 0.325 | +26.3 |
| G6 | 50 : 12.5 : 5 | 127.5 | 0.235 | +34.6 |
| G7 | 50 : 15 : 5 | 123.5 | 0.264 | +42.3 |
그 결과, 표 15에 나타난 바와 같이, 이미퀴모드가 적게 포함되어 제조된 제형(G3~G5)에서는 PDI가 0.3이상으로 불안정한 나노 입자가 제조되는 것으로 확인되었다. 그러나 이미퀴모드가 12.5 μg(G6), 15 μg(G7) 제형에서는 PDI도 0.3 이하로 확인되었고, 제타 전위의 절대값도 큰 것으로 보아 안정적인 나노 입자가 제조되는 것으로 나타났다.
<4-4-2> Pam3CSK4/TLR7 리간드/TLR3 리간드 에멀전의 면역 반응 유도 수준 확인
상기 표 15에서 면역 세포를 이용한 세포 기반 면역활성 실험을 통해 면역 활성이 높게 나타나는 제형을 선정하였다. 구체적인 실험 방법은 실시예 <4-1-2> 의 in vitro 면역 반응의 분석과 동일하다.
그 결과, 도 10에서 나타난 바와 같이, Pam3CKS4/폴리(I:C) 에멀전(G2)에서 가장 높은 사이토카인 유도능이 나타남을 확인하였다.
<4-5> 리포펩타이드 종류에 따른 에멀전의 최적화 조건 확립
<4-5-1> 리포펩타이드 종류에 따른 에멀전의 입자의 안정성 확인
에멀전에 Pam3CSK4외에 다양한 리포펩타이드를 적용하여 제조하였다. 마찬가지로 제조 후 층 분리가 일어나지 않고, 크기가 균일한 입자를 형성하는 조합을 찾아내는 것을 목적으로 하였으며, 동적광산란광도계(Dynamic light scattering) 입도분석기를 통해 크기(size), PDI(Poly dispersity index), 제타 전위(zeta-potential)를 비교하였다.
| 리포펩타이드 | 폴리(I:C)(μg) | 크기(d.nm) | PDI | 제타 전위(mV) | |
| G1 | PBS | ||||
| G2 | Pam3-CSK4 | 0 | 111.5 | 0.147 | +16.8 |
| G3 | FSL-1 | 115.1 | 0.152 | +38.5 | |
| G4 | Pam-Dhc-SK4 | 115.8 | 0.117 | +16.6 | |
| G5 | Dhc-SK4 | 133.4 | 0.165 | +7.86 | |
| G6 | Pam2Cys-SK4 | 116.9 | 0.187 | +50.3 | |
| G7 | Pam-CSK4 | 110.6 | 0.148 | +36.7 | |
| G8 | PHC-SK4 | 124.2 | 0.168 | +49.1 | |
| G9 | Pam3-CSK4 | 5 | 115.4 | 0.241 | +26.4 |
| G10 | FSL-1 | 124 | 0.086 | -3.83 | |
| G11 | Pam-Dhc-SK4 | 123 | 0.174 | +5.77 | |
| G12 | Dhc-SK4 | 136 | 0.108 | -18.4 | |
| G13 | Pam2Cys-SK4 | 122.8 | 0.138 | +38.2 | |
| G14 | Pam-CSK4 | 118.3 | 0.199 | +25.2 | |
| G15 | PHC-SK4 | 136.5 | 0.134 | +37.9 | |
그 결과, 표 16에 나타난 바와 같이, 리포펩타이드의 종류에 관계없이 유사한 크기, PDI, 제타 전위를 가지는 안정된 나노입자가 제조됨을 확인하였다.
<4-5-2> 리포펩타이드 종류에 따른 에멀전의 면역 반응 유도 수준 확인
상기 표 16에서 면역 세포를 이용한 세포 기반 면역활성 실험을 통해 면역 활성이 높게 나타나는 제형을 선정하였다. 구체적인 실험 방법은 실시예 <4-1-2> 의 in vitro 면역 반응의 분석과 동일하다.
그 결과, 도 11에 나타난 바와 같이, 기존에 사용한 Pam3CSK4 에멀전(G2)과 비슷하거나 조금 낮은 사이토카인 유도능을 확인하였다. 여기에 폴리(I:C)를 첨가한 제형(G9~G15)은 첨가하지 않은 제형(G2~G8)보다 높거나 비슷한 수준의 사이토카인 유도능을 보이는 것을 확인하였다.
<4-6> Pam3CSK4/TLR9 리간드 에멀전의 최적화 조건 확립
<4-6-1> Pam3CSK4/TLR9 리간드 에멀전의 입자의 안정성 확인
Pam3CKS4 에멀전에 정전기적 인력으로 입자를 형성하는 TLR3 리간드(폴리(I:C))가 아닌 TLR9 리간드(CpG 1018)를 적용하여 에멀전에 적용 가능한 TLR 리간드를 확장할 수 있는 지 확인하였다. 마찬가지로, 에멀전 제조 후 층 분리가 일어나지 않고, 크기가 균일한 입자를 형성하는 조합을 찾아내기 위하여 동적광산란광도계(Dynamic light scattering) 입도분석기를 통해 크기(size), PDI(Poly dispersity index), 제타 전위(zeta-potential)를 비교하였다.
| Pam3CSK4 : CpG 1018(W/R) | 크기(d.nm) | PDI | 제타 전위(mV) | |
| G1 | PBS | |||
| G2 | 50 : 0 | 141.5 | 0.174 | +44.7 |
| G3 | 50 : 5(폴리(I:C)) | 164.6 | 0.185 | +32.4 |
| G4 | 50 : 1.25 | 133.4 | 0.187 | +36.2 |
| G5 | 50 : 5 | 133.8 | 0.162 | +37.6 |
| G6 | 50 : 10 | 137.8 | 0.159 | +31.4 |
| G7 | 50 : 20 | 144.3 | 0.168 | +15.9 |
그 결과, 표 17에 나타난 바와 같이, 기존의 Pam3CSK4 에멀전(G2)이나 Pam3CSK4/폴리(I:C) 에멀전(G3)과 마찬가지로 층분리가 일어나지 않고 안정적인 크기, PDI, 제타 전위을 갖는 나노입자가 제조됨을 확인하였다.
<4-6-2> Pam3CSK4/TLR9 리간드 에멀전의 입자의 면역 반응 유도 수준 확인
상기 표 17에서 면역 세포를 이용한 세포 기반 면역활성 실험을 통해 면역 활성이 높게 나타나는 제형을 선정하였다. 구체적인 실험 방법은 실시예 <4-1-2> 의 in vitro 면역 반응의 분석과 동일하다.
그 결과, 도 12에 나타난 바와 같이, 대조군으로 사용한 Pam3CSK4/폴리(I:C) 에멀전(G3)에서 가장 높은 사이토카인 유도능을 보이는 것으로 나타났다. CpG 1018의 용량에 따른 사이토카인 유도능의 차이는 확인되지 않았고, 이는 Pam3CSK4 에멀전(G2)과 비슷한 수준으로 CpG 1018 첨가로 인한 시너지 효과는 없는 것으로 확인하였다.
<실시예 5> 마우스 면역원성 평가
백신 제형에서의 면역증강제에 의한 in vivo 면역 효능의 차이를 알아보고자 마우스 면역 반응 평가를 진행하였다. 에멀전을 인플루엔자 백신의 면역증강제로 적용하는 것에 대한 가능성을 알아보기 위하여 여러 가지 에멀전 제형 중 입자 크기가 균일하며, 층 분리가 일어나지 않는 제형을 선정하여 마우스에 투여한 후 인플루엔자 항원에 대한 면역원성을 평가하였다.
<5-1> Pam3CSK4 에멀전 및 Pam3CSK4/지질 에멀전 사용 백신 제형에 대한 마우스 면역원성 평가
Pam3CSK4 에멀전 및 Pam3CSK4/지질 에멀전을 이용한 백신을 제조하여 마우스 면역원성을 평가하였다.
구체적으로, 에멀전은 상기 실시예 1과 같은 방법으로 제조하였으며, 에멀전과 인플루엔자 항원을 혼합하여 하기 표 18과 같이 시험 백신을 제조하였다. 항원은 인플루엔자 바이러스 A형(H1N1)과 인플루엔자 바이러스 B형(BV)을 이용하였다. 두 strain과 면역증강제가 혼합된 백신 제형의 투여는 도 13과 같이 6주령의 BALB/c 마우스 암컷(오리엔트 바이오, 한국)에 0, 2주차에 2주 간격으로 총 2회 뒷다리 대퇴부 근육내로 투여하였고, 체액성 면역반응 분석을 위하여 2차 투여 후 2주째에 혈청 시료를 채취하였다. 대조군으로 인플루엔자 항원에 대하여 면역 반응을 잘 유도하는 것으로 알려진 면역증강제 중 InvivoGen社에서 판매하고 있는 AS03과 MF59를 구매하여 효능을 비교해 보았다. 또한, 기존 면역증강제인 L-pampo도 대조군으로 이용하였다.
| Ag | 면역증강제 | ||
| G1 | 0.5 μg/strain | - | - |
| G2 | AS03 | 0.485 mg 트윈-80 + 1.07 mg 스쿠알렌 + 1.18 mg 알파-토코페롤 | |
| G3 | MF59 | 1.07 mg 스쿠알렌 | |
| G4 | L-pampo | 25 μg Pam3CSK4 + 20 μg 폴리(I:C) | |
| G5 | Pam3CSK4 에멀전 | 25 μg Pam3CSK4 + 0.25 mg 트윈-80 +0.5 mg 스쿠알렌 + 0.35 mg 알파-토코페롤 |
|
| G6 | Pam3CSK4/DOTAP 에멀전 | 5 μg DOTAP + 25 μg Pam3CSK4 + 0.25 mg 트윈-80 + 0.5 mg 스쿠알렌 + 0.35 mg 알파-토코페롤 | |
| G7 | Pam3CSK4/DOPE 에멀전 | 5 μg DOPE + 25 μg Pam3CSK4 + 0.25 mg 트윈-80 + 0.5 mg 스쿠알렌 + 0.35 mg 알파-토코페롤 | |
| G8 | Pam3CSK4/DOPG 에멀전 | 5 μg DOPG + 25 μg Pam3CSK4 + 0.25 mg 트윈-80 + 0.5 mg 스쿠알렌 + 0.35 mg 알파-토코페롤 | |
| G9 | Pam3CSK4/DOPG 에멀전 | 100 μg DOPG + 25 μg Pam3CSK4 + 0.25 mg 트윈-80 + 0.5 mg 스쿠알렌 + 0.35 mg 알파-토코페롤 | |
체액성 면역 유도 수준을 확인하기 위해, 시험 백신 2차 투여 후 2주차에 채취한 혈청의 혈구 응집 억제 반응 수준 및 항체 생성 수준을 측정하였다.
그 결과, 도 14에 나타난 바와 같이, 면역증강제 없이 항원만 투여한 실험군(G1)에 비해서 상용 면역증강제와 Pam3CSK4 에멀전을 면역증강제로 사용한 대부분의 시험군에서 항원 특이적으로 높은 혈구 응집 억제 반응을 확인하였으며, 항체가 생성됨을 확인되었다. 이를 통해 시험에 사용한 에멀전 제형이 인플루엔자 백신의 면역증강제로서 활용 가능함을 확인하였다.
그러나, Pam3CSK4와 함께 첨가된 지질의 종류에 따른 면역원성의 차이는 크지 않은 것으로 나타났다. 한편, Pam3CSK4 에멀전(G5 ~ G9)이 상용 면역증강제인 G2(AS03), G3(MF59) 대비 유사하거나 낮은 면역원성을 보이는 것으로 나타났는데, 이는 마우스당 투여된 전체 스쿠알렌의 용량에 의한 차이로 예상되었다. AS03과 MF59에 포함된 스쿠알렌은 Pam3CSK4 에멀전 제형보다 약 2배 이상 첨가하고 있으므로, Pam3CSK4 에멀전의 스쿠알렌 용량을 증가하여 효능을 비교하는 실험을 추가로 수행하기로 하였다.
<5-2> Pam3CSK4/TLR3 리간드 에멀전 사용 백신 제형에 대한 마우스 면역 반응 평가
Pam3CSK4 에멀전에 TLR3 리간드인 폴리(I:C)가 추가된 제형을 면역증강제로 사용하여 마우스에서의 면역 효능의 차이를 확인하고자 하였다. 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 에멀전을 제조하였다. Pam3CSK4 에멀전에 폴리(I:C)를 농도별로 첨가하여 제조한 후 항원을 추가로 혼합하여 표 19와 같이 시험 백신을 제조하였다. 제조한 백신을 6주령, BALB/c 마우스 암컷(오리엔트 바이오, 한국)에 2주 간격으로 2회에 걸쳐서 오른쪽 대퇴부에 근육 주사하였다.
| Ag | 면역증강제 | ||
| G1 | 0.5 μg/strain | - | - |
| G2 | AS03 | 0.485 mg 트윈-80 + 1.07 mg 스쿠알렌 + 1.18 mg 알파-토코페롤 |
|
| G3 | L-pampo | 25 μg Pam3CS4 + 20 μg 폴리(I:C) | |
| G4 | Pam3CSK4 에멀전 | 25 μg Pam3CSK + 0.25 mg 트윈-80+0.5 mg 스쿠알렌 + 0.35 mg 알파-토코페롤 | |
| G5 | Pam3CSK4/폴리(I:C) 에멀전 | 25 μg Pam3CSK4 + 0.25 mg 트윈-80 + 0.5 mg 스쿠알렌 +0.35 mg 알파-토코페롤 + 1.25 μg 폴리(I:C) |
|
| G6 | Pam3CSK4/DOTAP/폴리(I:C) 에멀전 | 5 μg DOTAP + 25 μg Pam3CSK4 + 0.25 mg 트윈-80 +0.5 mg 스쿠알렌 + 0.35 mg 알파-토코페롤+ 1.25 μg 폴리(I:C) |
|
| G7 | Pam3CSK4/DOTAP/폴리(I:C) 에멀전 | 5 μg DOTAP + 25 μg Pam3CSK4 + 0.25 mg 트윈-80 +0.5 mg 스쿠알렌 + 0.35 mg 알파-토코페롤+ 5 μg 폴리(I:C) |
|
| G8 | Pam3CSK4/DOPE/폴리(I:C) 에멀전 | 5 μg DOPE + 25 μg Pam3CSK4 + 0.25 mg 트윈-80 +0.5 mg 스쿠알렌 + 0.35 mg 알파-토코페롤+ 1.25 μg 폴리(I:C) |
|
| G9 | Pam3CSK4/DOPG/폴리(I:C) 에멀전 | 5 μg DOPG + 25 μg Pam3CSK4 + 0.25 mg 트윈-80 +0.5 mg 스쿠알렌 + 0.35 mg 알파-토코페롤+ 1.25 μg 폴리(I:C) |
|
| G10 | Pam3CSK4/DOPG/폴리(I:C) 에멀전 | 100 μg DOPG + 25 μg Pam3CSK4 + 0.25 mg 트윈-80 +0.5 mg 스쿠알렌 + 0.35 mg 알파-토코페롤+ 1.25 μg 폴리(I:C) |
|
시험 백신 2차 투여 후 2주차에 채취한 혈청에서의 혈구 응집 억제 반응을 측정한 결과, 폴리(I:C)를 첨가한 시험군에서 상용화된 면역증강제 AS03(G2)보다 향상된 항원 특이적 혈구 응집 억제 반응이 나타나는 것을 통해 폴리(I:C)가 첨가된 에멀전 제형이 인플루엔자 백신의 면역증강제로서 활용 가능함을 확인할 수 있었다(도 15). 또 같은 Pam3CSK4/DOTAP 에멀전에 첨가된 폴리(I:C)의 용량에 따른 차이를 확인한 결과 1.25 μg(G6) 보다 5 μg이 첨가된 시험군(G7)에서 항원 특이적인 높은 혈구 응집 억제 반응이 유도되는 것으로 나타났다.
Pam3CSK4/지질 에멀전 실험과 마찬가지로, 상용 면역증강제인 AS03보다 Pam3CSK4/지질/폴리(I:C) 에멀전의 스쿠알렌의 용량이 낮으므로, 스쿠알렌 용량을 증가시켜 효능을 비교하는 실험을 추가로 수행하였다.
<5-3> Pam3CSK4 및/또는 TLR3 리간드 첨가, Pam3CSK4/DOPE 에멀전의 농도, TLR3 리간드의 용량에 따른 마우스 면역원성 평가
MF59는 상용화된 에멀전 면역증강제로, 여기에 Pam3CSK4 및/또는 TLR3 리간드인 폴리(I:C)를 첨가하여 항원의 면역원성이 증가하는지 확인하였으며(G4~G6), Pam3CSK4/DOPE 에멀전의 농도(G7~G9)와 폴리(I:C)의 용량(G10-1.25 μg 또는 G11-12.5 μg)에 따른 백신의 면역원성 차이를 비교하고자 하였다.
상기 실시예 1과 동일한 방법으로 에멀전을 제조하였으며, 에멀전과 인플루엔자 항원을 혼합하여 하기 표 20과 같이 시험 백신을 제조하였다. 이렇게 제조한 시험 백신을 6주령, BALB/c 마우스 암컷(오리엔트 바이오, 한국)에 2주 간격으로 2회에 걸쳐서 오른쪽 대퇴부에 근육 주사하였다.
| Ag | 면역증강제 | ||
| G1 | 0.5 μg /strain |
- | - |
| G2 | L-pampo | 25 μg Pam3CSK4 + 20 μg 폴리(I:C) | |
| G3 | AS03 | 0.485 mg 트윈-80 + 1.07 mg 스쿠알렌 + 1.18 mg 알파-토코페롤 | |
| G4 | MF59 | 2.14 mg 스쿠알렌 | |
| G5 | MF59 + Pam3CSK4 | 2.14 mg 스쿠알렌 + 25 μg Pam3CSK4 | |
| G6 | MF59 + Pam3CSK4 + 폴리(I:C) | 2.14 mg 스쿠알렌 + 25 μg Pam3CSK4 + 20 μg 폴리(I:C) | |
| G7 | Pam3CSK4/DOPE 에멀전 | 100 μg Pam3CSK4 + 40 μg DOPE + 2 mg 스쿠알렌 + 1 mg 알파-토코페롤 | |
| G8 | Pam3CSK4/DOPE 에멀전 | 50 μg Pam3CSK4 + 10 μg DOPE +1.07 mg 스쿠알렌 + 0.35 mg 알파-토코페롤 | |
| G9 | Pam3CSK4/DOPE 에멀전 | 25 μg Pam3CSK4 + 5 μg DOPE + 0.35 mg 스쿠알렌 + 0.35 mg 알파-토코페롤 | |
| G10 | Pam3CSK4/DOPE/폴리(I:C) 에멀전 | 25 μg Pam3CSK4 + 5 μg DOPE + 0.35 mg 스쿠알렌 + 0.35 mg 알파-토코페롤+ 1.25 μg 폴리(I:C) | |
| G11 | Pam3CSK4/DOPE/폴리(I:C) 에멀전 | 25 μg Pam3CSK4 + 5 μg DOPE + 0.35 mg 스쿠알렌 + 0.35 mg 알파-토코페롤+ 12.5 μg 폴리(I:C) | |
그 결과, 도 17에 나타난 바와 같이, MF59에 Pam3CSK 또는 Pam3CSK와 폴리(I:C) 모두를 추가한 시험군에서 TLR2, TLR3 리간드에 의해 항원의 면역원성이 증가되는 것으로 나타났다. 이를 통해 Pam3CSK4 에멀전뿐만 아니라 기 상용화된 에멀전 제형의 면역증강제에서도 TLR2, TLR3 리간드를 적용할 수 있음을 확인하였다.
또한, 이전 동물 실험에서 확인하였을 때 Pam3CSK4 에멀전의 스쿠알렌 농도가 MF59보다 1/4배, AS03보다 1/2배로 낮은 농도로 투여되어 이번 실험에서는 Pam3CSK4 에멀전 농도를 증가시켜 스쿠알렌의 용량에 따른 백신의 면역원성의 차이를 확인하였다.
그 결과, 도 17에 나타난 바와 같이, AS03과 같은 양의 스쿠알렌이 포함된 G8군에서 다른 시험군에 비해 면역원성이 증가하는 것으로 확인되어 에멀전의 최적 제형을 50 μg Pam3CSK4 ＋ 1.07 mg 스쿠알렌으로 설정하였다. 이 시험군은 AS03과 같은 양, MF59의 1/2의 양으로 스쿠알렌이 투여되었지만 체액성 및 세포성 면역반응 모두 타 어쥬번트보다 높게 올라가는 것으로 확인되었다.
또한, 이전 동물 실험에서는 폴리(I:C)의 용량을 1.25 μg에서 5 μg으로 증가하였을 때 항원에 대한 면역원성이 증가하는 것으로 나타났지만, 이번 실험에서 12.5 μg으로 10 배 높은 고농도의 폴리(I:C)를 투여한 결과 오히려 항원에 대한 면역원성이 감소하는 경향이 확인되었다(도 17).
<5-4> 최적 에멀전 조성을 위한 지질에 따른 백신 제형에 대한 마우스 면역원성 평가
최적 지질을 선정하고자 이전 실험에서 선정된 Pam3CSK4 에멀전의 용량으로 지질의 종류 및 Pam3CSK4 에멀전과 폴리(I:C)의 용량에 따른 백신의 면역원성을 비교하였다. 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 Pam3CSK4 에멀전을 제조한 후 폴리(I:C)의 양을 다르게 첨가한 후 항원과 혼합하여 시험 백신을 제조하였다(표 21). 본 실시예에서 사용된 에멀전은 스쿠알렌의 용량을 모두 1 mg으로 증가시켜 제조하였다. 제조한 시험 백신을 6주령의 BALB/c 마우스 암컷(오리엔트 바이오, 한국)에 2주 간격으로 2회에 걸쳐서 오른쪽 대퇴부에 근육 주사하였다.
| Ag | 면역증강제 | ||
| G1 | 0.5 μg/strain | Pam3CSK4 에멀전 | 50 μg Pam3CSK4 +1 mg 스쿠알렌 + 0.7 mg 알파-토코페롤 |
| G2 | Pam3CSK4/DOTAP 에멀전 | 50 μg Pam3CSK4 +10 μg 지질 + 1 mg 스쿠알렌 + 0.7 mg 알파-토코페롤 | |
| G3 | Pam3CSK4/DOPE 에멀전 | ||
| G4 | Pam3CSK4/DOPG 에멀전 | ||
| G5 | Pam3CSK4/DOPG 에멀전 | 50 μg Pam3CSK4 + 200 μg 지질 + 1 mg 스쿠알렌 + 0.7 mg 알파-토코페롤 | |
| G6 | Pam3CSK4/DOPE/폴리(I:C) 에멀전 | 50 μg Pam3CSK4 + 10 μg 지질 + 1 mg 스쿠알렌 + 0.7 mg 알파-토코페롤+ 1.25 μg 폴리(I:C) | |
| G7 | Pam3CSK4/폴리(I:C) 에멀전 | 50 μg Pam3CSK4 + 1 mg 스쿠알렌 + 0.7 mg 알파-토코페롤+ 5 μg 폴리(I:C) | |
| G8 | Pam3CSK4/DOTAP/폴리(I:C) 에멀전 | 50 μg Pam3CSK4 + 10 μg 지질 + 1 mg 스쿠알렌 + 0.7 mg 알파-토코페롤+ 5 μg 폴리(I:C) | |
| G9 | Pam3CSK4/DOPE/폴리(I:C) 에멀전 | ||
| G10 | Pam3CSK4/DOPG/폴리(I:C) 에멀전 | ||
| G11 | Pam3CSK4/DOPG/폴리(I:C) 에멀전 | 50 μg Pam3CSK4 + 200 μg 지질 + 1 mg 스쿠알렌 + 0.7 mg 알파-토코페롤+ 5 μg 폴리(I:C) | |
Pam3CSK4 에멀전(G1)에 지질을 첨가한 G2~G5군의 체액성 및 세포성 면역 반응을 확인한 결과, DOPG를 과량 포함하는 G5군의 경우 다른 지질들에 비해 상대적으로 낮은 면역원성이 확인되어 이후 실험에서 해당 제형은 제외하기로 하였다(도 19 및 도 20).
채취한 혈청의 혈구 응집 억제반응을 측정한 결과, Pam3CSK4 에멀전(G1)과 Pam3CSK4/DOPE 에멀전(G3) 시험군, 그리고 여기에 폴리(I:C)가 첨가된 시험군인 G7, G9 시험군에서 다른 시험군에 비해 항원 특이적인 높은 혈구 응집 억제반응이 유도되는 것으로 확인하였다(도 19). 이를 바탕으로 Pam3CSK4 에멀전과 Pam3CSK4/DOPE 에멀전을 선정하여 이후의 비교 실험을 진행하였다.
<5-5> Pam3CSK4 에멀전, Pam3CSK4/DOPE 에멀전 사용 백신에서 폴리(I:C)의 용량에 따른 마우스 면역원성 평가
이전 동물실험에서 면역 반응이 가장 높게 유도된, 1) Pam3CSK4 에멀전과 2) Pam3CSK4/DOPE 에멀전의 면역원성을 비교하고, 해당 에멀전에서 폴리(I:C)의 용량에 따른 백신의 면역원성을 비교하였다.
상기 실시예 1과 동일한 방법으로 에멀전을 제조하였으며, 폴리(I:C)를 농도별로 첨가하고 항원을 혼합하여 시험 백신을 제조하였다(표 22). 제조한 시험 백신을 6주령의 BALB/c 마우스 암컷(오리엔트 바이오, 한국)에 2주 간격으로 2회에 걸쳐서 오른쪽 대퇴부에 근육 주사하였다.
| Ag | 면역증강제 | ||
| G1 | 0.5 μg/strain | - | - |
| G2 | L-pampo | 25 μg Pam3CSK4 + 20 μg 폴리(I:C) | |
| G3 | MF59 | 2.14 mg 스쿠알렌 | |
| G4 | Pam3CSK4 에멀전 | 50 μg Pam3CSK4 + 1 mg 스쿠알렌 + 0.7 mg 알파-토코페롤 | |
| G5 | Pam3CSK4/폴리(I:C) 에멀전 | 50 μg Pam3CSK4 + 1 mg 스쿠알렌 + 0.7 mg 알파-토코페롤+ 5 μg 폴리(I:C) | |
| G6 | 50 μg Pam3CSK4 + 1 mg 스쿠알렌 + 0.7 mg 알파-토코페롤+ 10 μg 폴리(I:C) | ||
| G7 | 50 μg Pam3CSK4 + 1 mg 스쿠알렌 + 0.7 mg 알파-토코페롤+ 20 μg 폴리(I:C) | ||
| G8 | Pam3CSK4/DOPE 에멀전 | 50 μg Pam3CSK4 + 10 μg DOPE + 1 mg 스쿠알렌 + 0.7 mg 알파-토코페롤 | |
| G9 | Pam3CSK4/DOPE/폴리(I:C) 에멀전 | 50 μg Pam3CSK4 + 10 μg DOPE + 1 mg 스쿠알렌 + 0.7 mg 알파-토코페롤+ 5 μg 폴리(I:C) | |
| G10 | 50 μg Pam3CSK4 + 10 μg DOPE + 1 mg 스쿠알렌 + 0.7 mg 알파-토코페롤+ 10 μg 폴리(I:C) | ||
| G11 | 50 μg Pam3CSK4 + 10 μg DOPE + 1 mg 스쿠알렌 + 0.7 mg 알파-토코페롤+ 20 μg 폴리(I:C) | ||
그 결과, 도 21 및 도 22에 나타난 바와 같이, Pam3CSK4 에멀전 기반의 G4~G7군과 Pam3CSK4/DOPE 에멀전 기반의 G8~G11시험군을 비교한 결과, 폴리(I:C)가 포함되지 않은 G4과 G8군에서는 DOPE 지질이 추가되면 더 높은 체액성 및 세포성 면역반응이 유도되었다. 그러나, 폴리(I:C)를 추가할 경우에는 DOPE의 유/무에 따른 체액성 및 세포성 면역반응에 큰 차이를 보이지 않는 것으로 확인되었다. 또한, 에멀전에 첨가된 폴리(I:C)의 용량을 도스당 5 μg, 10 μg, 20μg으로 증가하여도 항원에 대한 면역원성을 증가시키는데에는 큰 차이를 보이지 않는 것으로 확인되어 최소 용량인 5 μg만으로도 충분한 면역 반응을 유도할 수 있을 것으로 판단된다.
<5-6> Pam3CSK4 에멀전, Pam3CSK4/DOPE 에멀전으로 제제화한 백신의 계절형 불활화 독감 바이러스 항원에 대한 면역원성 비교
개발한 에멀전 제형의 면역증강제가 또 다른 호흡기 바이러스 백신으로도 적용이 가능한지 확인하기 위하여 2009년 팬데믹 H1N1 바이러스를 불활화한 독감 바이러스 항원을 이용하여 백신의 면역원성을 확인하였다. 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 에멀전을 제조하였고, 폴리(I:C)를 농도별로 첨가한 후 항원을 혼합하여 시험 백신을 제조하였다(표 23). 제조한 시험 백신을 6주령의 BALB/c 마우스 암컷(오리엔트 바이오, 한국)에 2주 간격으로 2회에 걸쳐서 오른쪽 대퇴부에 근육 주사하였다.
| Ag | 면역증강제 | ||
| G1 | 0.5 μg/strain | - | - |
| G2 | L-pampo | 25 μg Pam3CSK4 + 20 μg 폴리(I:C) | |
| G3 | MF59 | 2.14 mg 스쿠알렌 | |
| G4 | Pam3CSK4 에멀전 | 50 μg Pam3CSK4 + 1 mg 스쿠알렌 + 0.7 mg 알파-토코페롤 | |
| G5 | Pam3CSK4/폴리(I:C) 에멀전 | 50 μg Pam3CSK4 + 1 mg 스쿠알렌 + 0.7 mg 알파-토코페롤+ 1.25 μg 폴리(I:C) | |
| G6 | 50 μg Pam3CSK4 + 1 mg 스쿠알렌 + 0.7 mg 알파-토코페롤+ 5 μg 폴리(I:C) | ||
| G7 | 50 μg Pam3CSK4 + 1 mg 스쿠알렌 + 0.7 mg 알파-토코페롤+ 10 μg 폴리(I:C) | ||
| G8 | Pam3CSK4/DOPE 에멀전 | 50 μg Pam3CSK4 + 10 μg DOPE + 1 mg 스쿠알렌 + 0.7 mg 알파-토코페롤 | |
| G9 | Pam3CSK4/DOPE/폴리(I:C) 에멀전 | 50 μg Pam3CSK4 + 10 μg DOPE + 1 mg 스쿠알렌 + 0.7 mg 알파-토코페롤+ 1.25 μg 폴리(I:C) | |
| G10 | 50 μg Pam3CSK4 + 10 μg DOPE + 1 mg 스쿠알렌 + 0.7 mg 알파-토코페롤+ 5 μg 폴리(I:C) | ||
| G11 | 50 μg Pam3CSK4 + 10 μg DOPE + 1 mg 스쿠알렌 + 0.7 mg 알파-토코페롤+ 10 μg 폴리(I:C) | ||
그 결과, 도 23 및 도 24에 나타난 바와 같이, 폴리(I:C)를 포함하지 않은 경우, Pam3CSK4 에멀전인 G4에 비해 Pam3CSK4/DOPE 에멀전인 G8에서 면역반응이 더 높게 확인되지 않았다. 따라서, DOPE 지질이 추가되면 더 높은 체액성 및 세포성 면역반응이 유도된 계절형 독감 백신과는 달리, DOPE의 추가가 면역원성에 영향을 미치지 않음을 알 수 있다.
또한, 폴리(I:C)가 포함된 경우를 비교하면, Pam3CSK4 에멀전 기반의 G5~G7군과 Pam3CSK4/DOPE 에멀전 기반의 G9~G11시험군의 체액성 및 세포성 면역 반응에 큰 차이가 보이지 않았으므로, 폴리(I:C)를 포함할 경우 DOPE의 유/무는 체액성 및 세포성 면역반응에 큰 영향을 주지 않는 것으로 보인다.
또한, 에멀전에 첨가된 폴리(I:C) 용량을 도스당 1.25 μg, 5 μg, 10 μg으로 달리하여 투여한 결과(G5~G7 또는 G9~G11), 5 μg이 투여된 G6, G10군에서 체액성 면역반응과 세포성 면역반응 모두 가장 높게 유도되는 것으로 나타났다.
이러한 결과를 통해 개발된 에멀전이 다양한 호흡기 바이러스 항원에 대하여도 면역 효능을 증강시킬 수 있다는 것을 알 수 있었다.
<5-7> 에멀전으로 제제화한 백신의 항원 용량에 따른 백신의 면역원성 비교
항원 단독 또는 상용 면역증강제인 MF59와 비교하여, 항원의 용량에 따른 Pam3CSK4 에멀전 및 Pam3CSK4/폴리(I:C) 에멀전의 면역원성을 비교하였다.
에멀전은 상기 실시예 1과 같은 방법으로 제조하였으며, 에멀전과 항원을 혼합하여 하기 표 24와 같이 시험 백신을 제조하였다. 제조한 시험 백신을 6주령의 BALB/c 마우스 암컷(오리엔트 바이오, 한국)에 2주 간격으로 2회에 걸쳐서 오른쪽 대퇴부에 근육 주사하였다.
| Ag(μg/strain) | 면역증강제 | ||
| G1 | 0.5 | - | - |
| G2 | 0.5 | MF59 | 2.14 mg 스쿠알렌 |
| G3 | 0.1 | ||
| G4 | 0.5 | Pam3CSK4 에멀전 | 50 μg Pam3CSK4 + 1 mg 스쿠알렌 + 0.7 mg 알파-토코페롤 |
| G5 | 0.25 | ||
| G6 | 0.1 | ||
| G7 | 0.05 | ||
| G8 | 0.5 | Pam3CSK4/폴리(I:C) 에멀전 | 50 μg Pam3CSK4 + 1 mg 스쿠알렌 + 0.7 mg 알파-토코페롤+ 5 μg 폴리(I:C) |
| G9 | 0.25 | ||
| G10 | 0.1 | ||
| G11 | 0.05 | ||
그 결과, 도 25 및 도 26에 나타난 바와 같이, 상용 면역증강제 MF59과 Ag 0.5 μ/strain이 투여된 시험군(G2)과 비교하여 항원을 1/10 용량으로 사용한 G7, G11군에서 체액성 및 세포성 면역 반응 모두 동등 또는 그 이상의 면역원성을 나타내어, 본 발명의 Pam3CSK4 에멀전 제형의 면역증강제에 의한 항원 절감 효과를 확인할 수 있었다.
<5-8>
에멀전으로 제제화한 백신의 코로나 바이러스 항원에 대한 면역원성 비교
Pam3CSK4 에멀전과 TLR3 리간드(폴리(I:C)), TLR7 리간드(이미퀴모드), TLR9 리간드(CpG)로 제제화된 면역증강제를 사용하여 코로나 바이러스 항원에 대한 면역원성을 확인하고자 한다. 에멀전은 상기 실시예 1과 같은 방법으로 제조하였으며, 하기 표 25과 같이 시험 백신을 제조하였다.
| Ag (5 μg/strain) |
면역증강제 | ||
| G1 | Covid-19 Ag (RBD-CL delta) |
- | - |
| G2 | MF59 | 스쿠알렌 2.14 mg | |
| G3 | Pam3CSK4 에멀전 | Pam3CSK4 50 μg ＋스쿠알렌 1 mg + 알파-토코페롤0.7 mg | |
| G4 | Pam3CSK4/폴리(I:C) 에멀전 | Pam3CSK4 50 μg ＋스쿠알렌 1 mg + 알파-토코페롤0.7 mg + 폴리(I:C) 5 μg | |
| G5 | Pam3CSK4/CpG 에멀전 | Pam3CSK4 50 μg ＋스쿠알렌 1 mg + 알파-토코페롤0.7 mg + CpG-1018 20 μg | |
| G6 | Pam3CSK4/이미퀴모드 에멀전 | Pam3CSK4 50 μg ＋스쿠알렌 1 mg + 알파-토코페롤0.7 mg + 이미퀴모드 12.5 μg | |
| G7 | Pam3CSK4/이미퀴모드 /폴리(I:C) 에멀전 |
Pam3CSK4 50 μg ＋스쿠알렌 1 mg + 알파-토코페롤0.7 mg + 이미퀴모드 12.5 μg + 폴리(I:C) 5 μg | |
| G8 | Pam3CSK4/이미퀴모드 /CpG 에멀전 |
Pam3CSK4 50 μg ＋스쿠알렌 1 mg + 알파-토코페롤0.7 mg + 이미퀴모드 12.5 μg + CpG-1018 20 μg | |
그 결과, 도 27 및 도 28에 나타난 바와 같이, 본 발명의 TLR 리간드를 포함하는 에멀전 면역증강제가 Covid-19 항원에 대하여 면역원성을 향상시키는 것을 확인하였다. 그 중 Pam3CSK4/이미퀴모드 에멀전에 CpG 1080이 혼합된 시험군(G8)에서 가장 높은 중화항체와 RBD에 대한 항체 형성을 확인하였고(도 28), 세포성 면역 반응은 Pam3CSK4 에멀전에 CpG 1018이 혼합된 시험군(G5)에서 가장 높은 반응성을 보였다(도 27). 또한 폴리(I:C) 유/무에 따른 반응성을 확인한 결과, Pam3CSK4 에멀전(G3 vs. G4), Pam3CSK4/이미퀴모드 에멀전(G6 vs. G7) 모두에서 폴리(I:C)에 의한 시너지 효과를 확인하였다.
상기의 결과는 Pam3CSK4 에멀전에 추가적인 면역증강물질을 적용함으로써 호흡기 바이러스 백신의 면역증강 효능을 향상시킬 수 있음을 시사한다.
<5-9> 에멀전으로 제제화한 백신의 노로 바이러스 항원에 대한 면역원성 비교
Pam3CSK4 에멀전에 다양한 TLR 리간드를 포함하여 제제화한 면역증강제가 노로 바이러스 항원에 대하여 면역원성을 가지는지 확인하고자 하였다.
| Ag (3 μg/strain) |
면역증강제 | ||
| G1 | Noro VLP Ag | - | - |
| G2 | |||
| MF59 | 스쿠알렌 2.14 mg | ||
| G3 | |||
| Pam3CSK4 에멀전 | Pam3CSK4 50 μg ＋스쿠알렌 1 mg + 알파-토코페롤0.7 mg | ||
| G4 | |||
| Pam3CSK4/폴리(I:C) 에멀전 | Pam3CSK4 50 μg ＋스쿠알렌 1 mg + 알파-토코페롤0.7 mg + 폴리(I:C) 5 μg | ||
| G5 | |||
| Pam3CSK4/CpG 에멀전 | Pam3CSK4 50 μg ＋스쿠알렌 1 mg + 알파-토코페롤0.7 mg + CpG-1018 20 μg | ||
| G6 | |||
| Pam3CSK4/이미퀴모드 에멀전 | Pam3CSK4 50 μg ＋스쿠알렌 1 mg + 알파-토코페롤0.7 mg + 이미퀴모드 12.5 μg | ||
| G7 | |||
| Pam3CSK4/이미퀴모드 /폴리(I:C) 에멀전 |
Pam3CSK4 50 μg ＋스쿠알렌 1 mg + 알파-토코페롤0.7 mg + 이미퀴모드 12.5 μg + 폴리(I:C) 5 μg | ||
| Pam3CSK4/이미퀴모드 /CpG 에멀전 |
Pam3CSK4 50 μg ＋스쿠알렌 1 mg + 알파-토코페롤0.7 mg + 이미퀴모드 12.5 μg + CpG-1018 20 μg | ||
| G8 | |||
그 결과, 도 29 및 도 30에 나타난 바와 같이, 세포성 면역 반응의 유도는 상용화된 면역증강제인 MF59(G2) 시험군에서 우수하였으나(도 29), 체액성 면역 반응의 경우 Pam3CSK4 에멀전에 다른 TLR 리간드가 추가된 에멀전 시험군에서 동등 또는 그 이상의 면역 효능이 유도되는 것으로 나타났다(도 30).
상기의 결과는 Pam3CSK4 에멀전이 호흡기 바이러스 백신 뿐만 아니라 노로 바이러스에 대해서도 면역원성을 가지며 다양한 백신의 면역증강제 후보 제형으로 활용 가능함을 시사한다.
<실시예 6> 에멀전의 물성 분석
<6-1> 에멀전 조성물의 위치 확인
에멀전을 구성하는 유효물질을 형광으로 표지하여 각 성분의 위치를 확인하고자 공초점현미경을 이용하여 관찰하였다.
구체적으로, 지질은 TEXAS RED, Pam3CSK4(TLR2 리간드)는 6'TAMRA, 폴리(I:C)(TLR3 리간드)는 FITC(Fluorescein isothiocyanate)를 표지한 후 상기 실시예 1에 따라 제조한 후, 공초점현미경(ZEISS, LSM 880)으로 관찰하였다. 각 형광의 파장에서 읽어낸 이미지를 병합(Merge)하여 확인하였다.
그 결과, 도 31에서 나타난 바와 같이, 모두 같은 위치에서 시그널이 확인되는 것으로 보아 Pam3CSK4, 지질(DOPE), 폴리(I:C)가 같은 곳에 위치하고 있음을 알 수 있었다.
제조한 에멀전을 이용하여 제조된 백신의 구조를 확인하기 위하여 TEM (Transmission electron microscope) 분석을 실시하였다.
구체적으로, TLR2 리간드(Pam3CSK4)와 지질-3(DOPE) 에멀전에 TLR3 리간드인 Poly(I:C)의 비율을 달리하여 분석하였다.
그 결과, 도 32에 나타난 바와 같이, 동적광산란광도계(DLS) 측정 결과와 비슷한 크기가 관찰되었고, 폴리(I:C)가 첨가됨에 따라, 에멀전 주변 전자빔의 강도가 달라지는 것으로 보아, 폴리(I:C)가 에멀전의 주변을 감싸고 있을 것으로 예상된다.
<6-3> 에멀전의 항원 흡착 평가
에멀전과 항원의 흡착성을 평가하기 위한 실험을 수행하였다.
구체적으로, 항원과 혼합된 백신 제형을 초원심분리기(Ultra-centrifuge)를 통해 크림층(cream layer), 상층액(supernatant), 펠렛(pellet) 부분으로 분리하였다. Cream layer 부분에는 항원과 결합된 에멀전 구성 성분이 존재할 것이며 supernatant 부분에는 에멀전과 흡착하지 않은 항원이, pellet 부분에는 계면활성제(detergent)가 존재할 것으로 예상하여, 각 부분을 NuPAGE 4~12% Bis-Tris gel에 로딩한 후 은 염색(silver staining)을 통해 항원을 확인하고자 하였다. Lane M은 항원의 분자량을 확인하기 위한 마커, Lane 1은 대조군으로서의 항원 단독(H1N1), Lane 2는 전체 백신 제형, Lane 3은 백신 제형을 ultra-centrifuge 하여 분리해낸 cream layer 부분, Lane 4는 ultra-centrifuge 하여 분리한 상층액(sup) 부분을 로딩(loading)하였다.
그 결과, 도 33에 나타난 바와 같이, MF59, AS03과 Pam3CSK4 에멀전은 모두 cream layer 부분과 supernatant 부분에 비슷한 양의 항원 밴드가 관찰되어 세 가지 에멀전 모두 비슷한 흡착 정도를 보이는 것으로 나타났다. 그러나, Pam3CSK4에멀전에 폴리(I:C)가 첨가된 에멀전은 cream layer 부분에서 항원 밴드가 거의 관찰되지 않고, supernatant 부분에서 대부분의 항원 밴드가 관찰되어 다른 에멀전 대비 항원의 흡착 정도가 낮은 것으로 나타났다. 이는 항원과 폴리(I:C)가 에멀전에 정전기적 인력으로 상호 작용하는데, 항원과 폴리(I:C)가 경쟁적으로 에멀전과 흡착하려고 하여 Pam3CSK4 에멀전 단독보다 낮게 나타난 것으로 생각된다. 그러나, 세포 및 동물 실험 결과에서 폴리(I:C)가 첨가된 Pam3CSK4/폴리(I:C) 에멀전 제형에서 체액성 및 세포성 면역반응의 유도가 높게 나타나는 것으로 보아 항원의 흡착 여부에 관계없이 TLR2&3 리간드를 사용함으로써 면역증강제의 면역원성을 향상시킬 수 있음을 알 수 있었다.
Claims (18)
- TLR(toll-like receptor) 리간드(ligand), 계면활성제, 알파-토코페롤(α-tocopherol) 및 스쿠알렌(squalene)을 포함하는 것을 특징으로 하는, 에멀전(emulsion) 제형의 면역증강제 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 TLR 리간드는 TLR 1 내지 13으로부터 선택되는 하나 이상의 리간드인 것을 특징으로 하는, 에멀전 제형의 면역증강제 조성물.
- 제2항에 있어서,
상기 TLR 리간드는 TLR2, TLR3, TLR7, TLR8 및 TLR9 리간드로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 에멀전 제형의 면역증강제 조성물.
- 제3항에 있어서,
상기 TLR2 리간드는 Pam3Cys-SKKKK, FSL-1(Pam2CGDPKHPKSF), Pam-Dhc-SKKKK, Dhc-SKKKK, Pam2Cys-SKKKK, PamCSKKKK, PHC-SKKKK, PamCys(Pam)-SKKKK, Ole2PamCys-SKKKK, Ole2Cys-SKKKK 및 Myr2Cys-SKKKK으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 에멀전 제형의 면역증강제 조성물.
- 제3항에 있어서,
상기 TLR3 리간드는 폴리(I:C)[poly(I:C), Polyadenylic-polyuridylic acid], PEI-폴리(I:C), 폴리(A:U)[polyadenylic-polyuridylic acid, poly (A:U)], PEI-폴리(A:U) 및 dsRNA로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 에멀전 제형의 면역증강제 조성물.
- 제3항에 있어서,
상기 TLR7 리간드는 이미퀴모드(Imiquimod), 이미다조퀴놀린(imidazoquinolines), 가디퀴모드(Gardiquimod), GS-9620, GSK-2245035, 레시퀴모드(resiquimod, R848), 텔라톨리모드(Telratolimod, MEDI9197, 3M-052), DSR-6434, DSP-3025(AZD8848), IMO-4200, MCT-465, 3M-051, SB-9922, 3M-052, 림톱(Limtop), TMX-30X, TMX-101, TMX-202, RG-7863 (RO6870868), RG-7795(RO-6864018), PF-4878691(3M-852A), IMO-8400, CPG-52364, 7-티아-8-옥소구아노신(7-thia-8-oxoguanosine), 7-데아자구아노신(7-deazaguanosine), 7-알릴-8-옥소구아노신(7-allyl-8-oxoguanosine) 및 7-데자구아노신(7-dezaguanosine)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 에멀전 제형의 면역증강제 조성물.
- 제3항에 있어서,
상기 TLR9 리간드는 CpG 1018, CpG ODN 2216, CpG ODN 1585, CpG ODN 2336, CpG ODN PB4, CpG ODN 1002, CpG ODN 1668, CpG ODN 1826, CpG ODN 2006, CpG ODN 2007, CpG ODN BW006, CpG ODN D-SL01, CpG-28, CpG-685, CpG-684, CpG ODN 2395, CpG ODN M362 및 CpG ODN D-SL03으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 에멀전 제형의 면역증강제 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 계면활성제는 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트(Polyoxyethylene sorbitan monooleate) 또는 소르비탄 트리올레에이트(Sorbitan trioleate) 또는 둘 모두의 혼합물인 것을 특징으로 하는, 에멀전 제형의 면역증강제 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 면역증강제 조성물에서 스쿠알렌에 대한 알파-토코페롤의 비율은 1 이하인 것을 특징으로 하는, 에멀전 제형의 면역증강제 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 면역증강제 조성물에서 TLR 리간드에 대한 계면활성제 비율은 9.7 이상인 것을 특징으로 하는, 에멀전 제형의 면역증강제 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 조성물은 지질을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 에멀전 제형의 면역증강제 조성물.
- 제11항에 있어서,
상기 지질은 DOTAP(1,2-Dioleoyl-3-Trimethylammonium-Propane), DDA(Dimethyldioctadecylammonium), DC-chol(3β-[N -(N',N'-Dimethylaminoethane)-carbamoyl]cholesterol), DOPE(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), DPPC(1,2-dipalmitoyl-sn glycero-3phosphocholine), DOPC(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) 및 DOPG(1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-[Phospho-rac-(1-glycerol)])을 포함하는 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 하는, 에멀전 제형의 면역증강제 조성물.
- 제11항에 있어서,
상기 지질은 TRL 리간드에 대해 0.5 이하인 것을 특징으로 하는, 에멀전 제형의 면역증강제 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 에멀전 면역증강제는 계면활성제와 TLR 리간드가 함께 오일을 둘러싸는 구조를 갖는 것을 특징으로 하는, 에멀전 제형의 면역증강제 조성물.
- 제1항의 면역증강제 조성물 및 항원을 포함하는 것을 특징으로 하는, 에멀전 제형의 백신 조성물.
- 제15항에 있어서,
상기 항원 또는 항원성 물질은 HIV-1, 인간 헤르페스 바이러스, 시토메갈로바이러스, SARS 코로나바이러스, 로타바이러스, 노로바이러스, 엡스타인 바 바이러스, 수두대상포진 바이러스, B형 간염 바이러스, A형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스 및 E형 간염 바이러스, 파라믹소바이러스: 호흡기세포 융합 바이러스, 파라인플루엔자 바이러스, 홍역 바이러스, 이하선염 바이러스, 인간 파필로마 바이러스, 플라비바이러스, 인플루엔자 바이러스 또는 이의 정제된 단백질 또는 재조합 단백질;
나이세리아종, S. 피오게네스(S. pyogenes), S. 아갈락티애(S. agalactiae), S. 뮤탄스(S. mutans); H. 듀크레이(H. ducreyi); 모락셀라종; 보르데텔라종; 코박테리움종; 레지오넬라종; 에스체리치아종; 비브리오종; 시겔라종; 예르시니아종; 캄필로박터종; 살모넬라종; 스테리아종; 헬리코박터종; 슈도모나스종; 스타필로코커스종; 엔테로코커스종; 클로스트리듐종; 바실러스종; 코리네박테리움종; 보렐리아종; 리케차종; 클라미디아종; 렙토스피라종; 트레포네마종; 플라스모디움종; 톡소플라스마종; 엔타모에바종; 바베시아종; 트리파노소마종; 지알디아종; 레시마니아종; 뉴모시스티스종; 트리코모나스종; 스키소스토마종; 캔디다종; 크립토코커스종으로부터 유래된 세균 병원체;
알레르겐 특이적 및 알레르겐 비특이적 항원; 또는
전립선암, 유방암, 직장결장암, 폐암, 췌장암, 신장암, 난소암, 흑색종, 그 외의 종양 항원;을 포함하는 군으로부터 선택된 하나 이상의 항원 또는 항원성 조성물을 포함하는 것을 특징으로 하는, 에멀전 제형의 백신 조성물.
- (a) 지질, TLR 리간드를 유기용매에 녹여 박막(thin film)을 형성시키는 단계; 및
(b) 상기 박막을 알파-토코페롤 및 스쿠알렌을 포함하는 오일상 및 계면활성제와 혼합시키는 단계;
를 포함하는 것을 특징으로 하는, 에멀전 제형의 면역증강제 조성물의 제조방법.
- 알파-토코페롤 및 스쿠알렌을 포함하는 오일상과 TLR 리간드, 계면활성제를 혼합시키는 단계; 를 포함하는 것을 특징으로 하는, 에멀전 제형의 면역증강제 조성물의 제조방법.
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