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KR20240005771A - 항체 조성물의 정제 방법 - Google Patents

항체 조성물의 정제 방법 Download PDF

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KR20240005771A
KR20240005771A KR1020237040492A KR20237040492A KR20240005771A KR 20240005771 A KR20240005771 A KR 20240005771A KR 1020237040492 A KR1020237040492 A KR 1020237040492A KR 20237040492 A KR20237040492 A KR 20237040492A KR 20240005771 A KR20240005771 A KR 20240005771A
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KR
South Korea
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ser
val
thr
gly
lys
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Application number
KR1020237040492A
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English (en)
Inventor
다카유키 요시모리
스테판 이아루소
Original Assignee
치오메 바이오사이언스 가부시키가이샤
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Abstract

본 발명은, 항체 의약품의 당사슬 부가 이성체를 제거하는 방법 등의 제공을 과제로 한다.
본 발명은, 예를 들면, 항체 조성물의 정제 방법으로서, 상기 항체 조성물을 컨벤셔널 크로마토그래피에 부하하여, Fc 영역 당사슬 부가 콘센서스 영역 이외의 부위에 당사슬이 부가되어 있지 않은 항체를 크로마토그래피 담체에 흡착시키는 것, 및 상기 담체를 용출액으로 용출시킴으로써, 상기 담체에 흡착된 상기 항체를 용출시켜 정제 항체 조성물을 얻는 것을 포함하는, 상기 정제 방법을 제공하는 것이다.

Description

항체 조성물의 정제 방법
본 발명은 항체 조성물의 제조 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, Fc 영역 당사슬 결합 콘센서스 영역 이외에 당사슬이 부가된 이성체가 저감된 항체 조성물의 정제 방법에 관한 것이다.
모노클로날 항체를 유효 성분으로 하는 항체 의약품은, 항체 분자가 갖는 항원에 대한 높은 결합 친화성과 결합 특이성을 살린 분자 표적약의 하나로서 기대되어, 연구 개발이 진전되어 왔다. 항체 의약품은, 암이나 자기 면역 질환을 비롯한 다양한 질환의 치료에 불가결한 것으로 되어 있고, 현재, 100 품목 가까이의 제품이 세계에서 승인되어 사용되는 상황에 이르고 있다 (비특허문헌 1, 비특허문헌 2). 언메트 메디컬 니즈를 만족시키는 신규 항체 의약품 개발에 대한 기대는 여전히 높아, 앞으로도 다수의 새로운 항체 의약품이 연구되고 개발될 것으로 기대되고 있다.
항체 (IgG) 는, 중사슬의 Fc 부분에 존재하는 당사슬 부가 콘센서스 영역 (Asn297-X-Ser/Thr, X 는 Pro 이외의 아미노산) 중의 297 번째 잔기인 Asn 잔기 (Asn297) 에 N-결합형 당사슬을 가지고 있다. 이 당사슬 부가 콘센서스 영역에 존재하는 당사슬은 항체 분자로서의 생물 활성이나 혈중 동태, 안전성 등에 기여하는 것이 알려져 있다 (비특허문헌 3, 비특허문헌 4). 예를 들어, Asn297 의 N-결합형 당사슬의 환원 말단의 N-아세틸글루코사민 (GlcNAc) 잔기에 부가되어 있는 Fuc 잔기 (코어 푸코오스) 를 제거하면 항체 의존성 세포 상해 (ADCC) 활성이 증강되는 것이 알려져 있다. 마찬가지로, Fc 부분에 결합하는 당사슬의 비환원 말단 부분의 갈락토오스 (Gal) 잔기의 수가 많을수록 보체 제 1 성분 (C1q) 에 대한 결합이 증강되고, 결과적으로 보체 의존성 세포 상해 (CDC) 활성이 증강되는 것이 알려져 있다 (비특허문헌 5).
한편, 항체의 Fc 영역의 당사슬 부가 콘센서스 영역 이외에 당사슬이 결합한 항체 (당사슬 부가 이성체) 의 사례도 잘 알려져 있다. 예를 들면, SP2/0 세포에서 산생된 항악성 종양제인 Cetuximab 은, Fab 부분에 N-결합형 당사슬이 결합하고 있는 것이 확인되었다 (비특허문헌 3). 이것 이외에도 당사슬 부가 이성체에 대한 다양한 보고가 이루어져 있다 (비특허문헌 6, 비특허문헌 7, 비특허문헌 8).
당사슬 부가 이성체는, 생물 활성 (비특허문헌 10, 비특허문헌 11), 면역원성 (비특허문헌 8, 비특허문헌 10), 혈중 반감기 (비특허문헌 9) 등, 여러 가지 항체의 특성에 영향을 미칠 가능성이 있음이 알려져 있다. 특히, Fab 영역 또는 CDR 영역 부근에 당사슬이 결합한 경우, 생물 활성이 저하될 가능성이 우려된다. 마찬가지로, 당사슬 부가 콘센서스 영역 이외에 당사슬이 결합한 항체의 당사슬 부가 이성체는 면역원성 등의 안전성의 우려도 있다.
당사슬 부가 콘센서스 영역 이외의 당사슬의 부가로 인해, 생물 활성이 큰 폭으로 저하되거나, 면역원성이 큰 폭으로 증가하거나 하는 경우, 항체 의약품의 성분으로는 바람직하지 않은 마이너스의 영향이 발생하게 되기 때문에, 이들 당사슬 부가 이성체는 목적 물질 유래 불순물로 간주된다. 이러한 목적 물질 유래 불순물은, 의약품의 성분으로서 함유되는 것은 바람직하지 않으며, 규제상의 관점에서도 가능한 한 제거하는 것이 바람직하다 (비특허문헌 12).
항체의 Fc 영역의 당사슬 부가 콘센서스 영역 이외에 당사슬이 부가될 가능성이 있는 콘센서스 서열을 포함하는 항체가, 의약품의 개발 후보의 분자로서 발견된 경우에는, 그 부위에 당사슬이 결합하지 않도록 콘센서스 서열을 다른 아미노산 서열로 변경하는 것 등이 일반적으로 실시된다. 그 때, 원래의 항체의 성능과 비교하여 결합 활성 등의 저하를 일으키는 경우도 있어, 목적으로 하는 치료 효과를 갖는 항체를 취득할 수 없을 가능성이 있다.
항체의 당사슬 부가 콘센서스 영역 이외의 Fab 또는 CDR 등의 영역에 당사슬이 결합한 당사슬 부가 이성체는, 소량이면서 또한 고성능의 분석 레벨에서의 당사슬 부가 이성체의 분리를 실시함으로써 평가하고, 분별하는 것이 가능하다. 고속 액체 크로마토그래피와 질량 분석을 조합하여 펩티드 단편을 평가하는 방법이나, 항체로부터 잘라낸 당사슬 그 자체를 평가하는 방법이 알려져 있다 (비특허문헌 6, 비특허문헌 9). 또, 항체의 Fab 영역에 당사슬이 결합한 항체를 소수성 상호 작용 크로마토그래피 (HIC) 에 의해 분석한 사례가 알려져 있다 (비특허문헌 13). 그러나, 이들 사례에서는, 모두 분석을 목적으로 하여 극히 소량의 항체를 사용하여 분리 성능이 극히 높은 분석 레벨의 방법을 사용하고 있어, 분리된 조성물을 항체 의약품으로서 이용할 수는 없다. 또한, HIC 분석의 총설 (비특허문헌 14) 에 의해, 수많은 항체의 분리 성능의 유용성이 공개되어 있지만, HIC 에 의한 정제법으로 당사슬 부가 이성체를 분리할 수 있는 것은 일절 시사되어 있지 않다.
이와 같이, 이러한 당사슬 부가 이성체를 분리·제거하여, 당사슬 부가 콘센서스 영역 이외에 당사슬이 부가된 이성체를 포함하지 않거나, 혹은 충분히 저감된 항체 조성물의 조제 방법은 알려져 있지 않았다. 즉, 종래의 기술에서는, 당사슬 부가 이성체는 분석 레벨에서 당사슬의 부가 상황을 평가할 수 있는 것에 머물러, 항체의 당사슬 부가 이성체를 분리·제거하여, 의약품으로서 제공할 수 있는 양의 항체 조성물을 제조하는 방법은 존재하지 않으며, 그와 같은 항체 조성물도 알려져 있지 않았다.
따라서, 통상 항체의 Fc 영역에 존재하는 당사슬 부가 콘센서스 영역 이외에 당사슬이 부가되고, 그와 같은 당사슬 부가 이성체가 포함되어 버리는 경우, 이들 성분은 분리되지 않고 항체 의약품의 일부로서 함유되어 있다. 전술한 Cetuximab 도, Fc 부분의 당사슬 부가 콘센서스 영역 및 Fab 내의 비콘센서스 영역의 양방에 당사슬이 부가된 혼합물의 조성으로 개발이 이루어져 있다 (비특허문헌 3). 만일 당사슬 부가 이성체가 생물 활성을 갖지 않는 경우, 목적 물질 유래 불순물이 의약품의 성분으로서 포함되게 되어 바람직하지 않다.
또한, 소정의 당사슬에 특이적으로 결합하는 렉틴을 사용한 어피니티 크로마토그래피에 의한 당사슬 부가 이성체의 분리가 보고되어 있다 (비특허문헌 15, 비특허문헌 16). Concanavalin A 를 리간드로서 사용하는 것으로, 분리 특성도 높은 것이 알려져 있으나, 어피니티에 의한 분리이며, 천연물을 사용하기 때문에, 의약품의 제조에는 적합하지 않아, 항체 의약품의 제조에 적용된 사례는 존재하지 않는다.
항체 이외에 당사슬 성분의 분리를 실현한 기술로는, 유전자 재조합 안티트롬빈을 당사슬 개수의 차이에 의해 크로마토그래피로 분리한 사례가 알려져 있다 (특허문헌 1). 또한, 유전자 재조합 에리스로포이에틴 및 그 유도체는 시알산의 부가수의 차이에 의해 크로마토그래피에 의한 분리가 행해지고 있다 (특허문헌 2). 마찬가지로, 등전점 크로마토그래피를 사용하여 난백 알부민이나 트랜스페린을 분리한 사례가 있다 (특허문헌 3). 그러나, 이들 기술을 그대로 항체에 적용할 수는 없으며, 항체 조성물에 있어서, 당사슬 부가 이성체를 분리 제거하는 제조법은 일절 보고가 없다.
상기 이외의 기술로는, 효소 처리함으로써 당사슬을 제거하는 방법이 알려져 있다 (비특허문헌 17). 그러나, 안전성의 관점에서, 효소의 분리·제거나 유래 등도 문제가 되기 때문에, 의약품의 제조 기술로서 이용하는 것은 어렵다. 효소에 의해 항체의 당사슬을 제거하는 경우, 당사슬 부가 콘센서스 영역과 비콘센서스 영역의 당사슬을 구별하여 제거하는 것도 불가능하다.
특허문헌 4 에 기재된 항 hDLK-1 항체는, 그 항종양 활성이 기대되고 있는 항체이다.
국제 공개 제2008/120801호 일본 공개특허공보 2001-064300호 국제 공개 제2005/100379호 국제 공개 제2014/054820호
YAKUGAKU ZASSHI 137 (7), 815-816 (2017) Bull. Natl. Inst. Health Sci., 132, 36-46 (2014) CHROMATOGRAPHY, 34 (2), 83-88 (2013) Protein Cell, 9, 63-73 (2018) Front. Immunol., 8 (646), 1-8 (2017) J. Biol. Chem., 284 (47), 32493-32506 (2009) Embo J., 10, 2717-2723 (1991) J. Immunol., 196, 1435-1441 (2016) Anal. Biochem., 349, 197-207 (2006) Nature Review | Immunology, published online, 04 Feb, (2019) Biochem. J., 338 (2), 529-538 (1999) ICH Q6 B Guideline mAbs, 6 (4), 852-858 (2014) J. Pharm. Biomed. Anal., 130, 3-18 (2016) J. Biol. Chem., 285 (21), 16012-22 (2010) Oncotarget, 7 (21), 31166-76 (2016) J. Immunol. Methods, 467, 58-62 (2019)
항체의 당사슬 부가 콘센서스 영역 이외에 결합한 당사슬은 생물 활성이나 안전성의 관점에서도 바람직하지 않아, 항체 의약품이 함유하는 당사슬 부가 이성체를 충분한 레벨까지 제거할 수 있고, 간편하게 균일한 정제 항체 조성물을 조제 가능한 기술의 개발이 요구되고 있다. 따라서, 본 발명은, 항체 의약품의 당사슬 부가 이성체를 제거하는 방법의 제공을 과제로 한다.
다른 양태에 있어서, 본 발명은, 보다 유효하고 보다 안전한 항 hDLK-1 항체의 정제 조성물을 얻는 것을 과제로 한다.
전술한 종래의 기술이 나타내는 바와 같이, 분석 평가의 목적으로 당사슬 부가 이성체를 정밀하고 또한 고도의 분리능을 갖는 크로마토그래피로 분리한 보고는 있지만, 항체 의약품의 당사슬 부가 이성체를 크로마토그래피로 분리하여 제거 가능한 제조 기술 또는 조제 기술은 보고가 없었다. 본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위해 예의 연구한 결과, 놀랍게도, 컨벤셔널한 소수성 상호 작용 크로마토그래피 담체를 사용함으로써, 특히 당사슬 부가 이성체 및 목적 물질의 흡착 및 분리 조건을 최적화함으로써, 당사슬 부가 이성체가 저감된 정제 항체 조성물을 조제 가능하다는 것을 알아내었다.
또한, 본 발명자들은 새롭게 알아낸 당사슬 부가 이성체의 저감 방법을 사용하여 특허문헌 4 에 기재된 항 hDLK-1 항체에 대해 당사슬 부가 이성체의 분리, 비당사슬 부가 이성체의 정제를 실시하였다. 항체의 CDR 부근에 당사슬을 갖는 당사슬 부가 이성체는 항체의 결합 활성에 영향을 미칠지도 모르지만, 그 활성의 저하 정도는 당사슬의 크기나 결합 위치와도 관계가 있기 때문에, 활성에 영향을 미치지 않을 가능성도 생각할 수 있다. 놀랍게도 특허문헌 4 에 기재된 항 hDLK-1 항체에 있어서는, 당사슬 부가 이성체는 완전히 활성이 소실되고, 그 때문에 의약품에 있어서의 「불순물」이 되는 것을 알아내었다. 이로써, 본 발명자들은, 항 hDLK-1 항체 조(粗)정제물 중의 새로운 불순물로서 당사슬 부가 이성체를 특정하는 것에 성공하여, 그 제거를 가능하게 함으로써, 보다 유효하고 또한 보다 안전한 항 hDLK-1 항체의 정제 조성물의 제공을 달성하였다.
즉, 본 발명은, 이하의 (1) ∼ (27) 에 관한 것이다.
(1) 중사슬이 서열 번호 2, 4, 6, 8, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 및 36 에서 선택되는 아미노산 서열을 갖고, 또한 경사슬이 서열 번호 10 또는 서열 번호 12 에 기재된 아미노산 서열을 갖는, 항 hDLK-1 항체 조성물의 정제 방법으로서,
항체 조정제물을 컨벤셔널 크로마토그래피에 부하하여, Fc 영역 당사슬 부가 콘센서스 영역 이외의 부위에 당사슬이 부가되어 있지 않은 항체를 상기 크로마토그래피의 담체에 흡착시키는 것, 및
상기 담체를 용출액으로 용출시킴으로써, 상기 담체에 흡착된 상기 항체를 용출시켜 정제 항체 조성물을 얻는 것을 포함하고,
여기서, 얻어진 상기 정제 항체 조성물에 있어서의, Fc 영역 당사슬 부가 콘센서스 영역 이외의 부위에 당사슬이 부가된 당사슬 부가 이성체의 함유량이, 상기 항체 조정제물과 비교하여 감소되어 있는, 상기 방법.
(2) 상기 컨벤셔널 크로마토그래피의 담체가, 소수성 상호 작용 크로마토그래피 담체, 또는 믹스 모드 크로마토그래피 담체인, (1) 에 기재된 정제 방법.
(3) 상기 컨벤셔널 크로마토그래피의 담체의 평균 입자경이 15 ㎛ 이상인, (1) 또는 (2) 에 기재된 정제 방법.
(4) 상기 컨벤셔널 크로마토그래피의 담체의 평균 입자경이 20 ∼ 100 ㎛ 인, (1) 또는 (2) 에 기재된 정제 방법.
(5) 상기 컨벤셔널 크로마토그래피의 담체가 벤질기 또는 부틸기를 갖는, (1) ∼ (4) 중 어느 한 항에 기재된 정제 방법.
(6) 상기 컨벤셔널 크로마토그래피의 담체의 단위량당 단백질 부하량이 20 mg/mL 이상인, (1) ∼ (5) 중 어느 한 항에 기재된 정제 방법.
(7) 상기 컨벤셔널 크로마토그래피의 담체가 소수성 상호 작용 크로마토그래피 담체이고, 또한 상기 항체 조정제물을 상기 담체에 부하한 후, 용출 전에 당해 담체를 세정액으로 세정하는 것을 포함하는, (1) ∼ (6) 중 어느 한 항에 기재된 정제 방법.
(8) 상기 세정액의 염 농도가, 상기 용출액의 염 농도보다 10 mM 이상 높은 것을 특징으로 하는, (7) 에 기재된 정제 방법.
(9) 상기 세정액의 염 농도가 0.5 M 이상인 것을 특징으로 하는, (7) 또는 (8) 에 기재된 정제 방법.
(10) 상기 세정액의 염 농도가 1.0 M 이상인 것을 특징으로 하는, (7) 또는 (8) 에 기재된 정제 방법.
(11) 상기 세정액의 pH 가 상기 용출액의 pH 보다 0.2 유닛 이상 낮은 pH 이고, 또한 pH 4 ∼ 8 의 범위 내인, (7) ∼ (10) 중 어느 한 항에 기재된 정제 방법.
(12) 상기 세정이, 2 담체 용량 이상의 세정액을 흘림으로써 실시되는, (7) ∼ (11) 중 어느 한 항에 기재된 정제 방법.
(13) 단계적 또는 직선적으로 pH 또는/및 염 농도가 변화하는 이동상을 사용함으로써, 세정 및 용출을 실시하는 것을 특징으로 하는, (7) ∼ (12) 중 어느 한 항에 기재된 정제 방법.
(14) 상기 용출액이 0.5 M 이하의 염 농도이거나 또는 염을 함유하지 않고, 또한 pH 5 ∼ 7 인, (7) ∼ (13) 중 어느 한 항에 기재된 정제 방법.
(15) 수율이 20 ％ 이상인, (1) ∼ (14) 중 어느 한 항에 기재된 정제 방법.
(16) 상기 정제 항체 조성물 중의 전체 항체에 대한 당사슬 부가 이성체의 비율이 5 ％ 이하인, (1) ∼ (15) 중 어느 한 항에 기재된 정제 방법.
(17) 상기 항체 조정제물 중의 전체 항체에 대한 당사슬 부가 이성체의 비율이 5 ％ 보다 큰, (16) 에 기재된 정제 방법.
(18) (1) 에 기재된 항 hDLK-1 항체 조성물의 정제 방법으로서,
항체 조정제물을, 벤질기 혹은 부틸기를 갖는 입자경 20 ∼ 100 ㎛ 의 담체를 사용한 컨벤셔널 크로마토그래피에 부하하는 것,
상기 담체에, Fc 영역 당사슬 부가 콘센서스 영역 이외의 부위에 당사슬이 부가되어 있지 않은 항체를 흡착시키는 것,
pH 4 ∼ 6 의 세정액으로 상기 담체를 1 회 이상 세정함으로써 당사슬 부가 이성체를 제거하는 것, 및
0.5 M 이하의 염 농도 또는 염을 함유하지 않는 pH 5 ∼ 7 의 용출액으로 상기 담체에 흡착된 상기 항체를 용출시켜 정제 항체 조성물을 얻는 것을 포함하고,
여기서, 상기 정제 항체 조성물에 있어서의, 전체 항체에 대한 당사슬 부가 이성체의 비율이, 상기 항체 조정제물과 비교하여 저감되어 있는, 상기 방법.
(19) (1) 에 기재된 항체 조성물의 정제 방법으로서,
0.5 M 이상의 염 농도로 조정된 상기 항체 조정제물을, 벤질기 혹은 부틸기를 갖는 입자경 20 ∼ 100 ㎛ 의 담체를 사용한 컨벤셔널 크로마토그래피에 부하하여 당사슬 부가 이성체를 플로 스루 획분으로 제거하는 것,
상기 담체를 세정액으로 세정하는 것, 및
0.5 M 이하의 염 농도 또는 염을 함유하지 않는 pH 5 ∼ 7 의 용출액으로 상기 담체에 흡착된 상기 항체를 용출시켜 정제 항체 조성물을 얻는 것을 포함하고,
여기서, 상기 정제 항체 조성물에 있어서의, 전체 항체에 대한 당사슬 부가 이성체의 비율이, 상기 항체 조정제물과 비교하여 저감되어 있는, 상기 방법.
(20) (1) 에 기재된 항체 조성물의 정제 방법으로서,
pH 4 ∼ 6 으로 조정된 상기 항체 조정제물을, 벤질기 혹은 부틸기를 갖는 입자경 20 ∼ 100 ㎛ 의 담체를 사용한 컨벤셔널 크로마토그래피에 부하하여 당사슬 부가 이성체를 플로 스루 획분으로 제거하는 것,
상기 담체를 세정액으로 세정하는 것, 및
0.5 M 이하의 염 농도 또는 염을 함유하지 않는 pH 5 ∼ 7 의 용출액으로 상기 담체에 흡착된 상기 항체를 용출시켜 정제 항체 조성물을 얻는 것을 포함하고,
여기서, 상기 정제 항체 조성물에 있어서의, 전체 항체에 대한 당사슬 부가 이성체의 비율이, 상기 항체 조정제물과 비교하여 저감되어 있는, 상기 방법.
(21) 상기 컨벤셔널 크로마토그래피의 담체의 단위량당 단백질 부하량이 20 g/L 이상이고, 또한 상기 세정이, 5 담체 용량 이상의 세정액을 흘림으로써 실시되는, (1) ∼ (20) 중 어느 한 항에 기재된 방법.
(22) (1) ∼ (21) 중 어느 한 항에 기재된 정제 방법을 포함하는, Fc 영역 당사슬 부가 콘센서스 영역 이외의 부위에 당사슬이 부가되어 있지 않은 항체의, 전체 항체에 대한 비율이 95 ％ 이상인 항체 조성물의 제조 방법.
(23) 중사슬이 서열 번호 2, 4, 6, 8, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 및 36 에서 선택되는 아미노산 서열을 갖고, 또한 경사슬이 서열 번호 10 또는 서열 번호 12 에 기재된 아미노산 서열을 갖는, 항 hDLK-1 항체 정제 조성물의 제조 방법으로서,
항체 조정제물을, 벤질기 혹은 부틸기를 갖는 입자경 20 ∼ 100 ㎛ 의 담체를 사용한 컨벤셔널 크로마토그래피에 부하하는 것,
상기 담체에, Fc 영역 당사슬 부가 콘센서스 영역 이외의 부위에 당사슬이 부가되어 있지 않은 항체를 흡착시키는 것,
0.5 M 이상의 염을 함유하는 세정액으로 상기 담체를 1 회 이상 세정함으로써 당사슬 부가 이성체를 제거하는 것, 및
0.5 M 이하의 염 농도 또는 염을 함유하지 않는 pH 5 ∼ 7 의 용출액으로 상기 담체에 흡착된 상기 항체를 용출시켜 정제 항체 조성물을 얻는 것을 포함하고,
여기서, 상기 정제 항체 조성물에 있어서의, 전체 항체에 대한 당사슬 부가 이성체의 비율이, 상기 항체 조정제물과 비교하여 저감되어 있는, 상기 방법.
(24) (22) 또는 (23) 에 기재된 제조 방법에 따라 제조된 항체 조성물.
(25) 중사슬이 서열 번호 2, 4, 6, 8, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 및 36 에서 선택되는 아미노산 서열을 갖고, 또한 경사슬이 서열 번호 10 또는 서열 번호 12 에 기재된 아미노산 서열을 갖는 항 hDLK-1 항체 조정제물로부터, Fc 영역 당사슬 부가 콘센서스 영역 이외의 부위에 당사슬이 부가된 당사슬 부가 이성체를 제거하는 방법으로서,
항체 조정제물을 소수성 상호 작용 크로마토그래피 담체에 부하하여, Fc 영역 당사슬 부가 콘센서스 영역 이외의 부위에 당사슬이 부가되어 있지 않은 항체를 상기 담체에 흡착시키는 것,
상기 담체를 세정액으로 세정하는 것, 및
상기 담체로부터 용출액으로 용출시킴으로써, 상기 담체에 흡착된 상기 항체를 용출시켜 정제 항체 조성물을 얻는 것을 포함하는, 상기 방법.
(26) 중사슬이 서열 번호 2, 4, 6, 8, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 및 36 에서 선택되는 아미노산 서열을 갖고, 또한 경사슬이 서열 번호 10 또는 서열 번호 12 에 기재된 아미노산 서열을 갖는, 항 hDLK-1 항체 조성물로서, Fc 영역 당사슬 부가 콘센서스 영역 이외의 부위에 당사슬이 부가되어 있지 않은 항체를, 전체 항체의 95 ％ 이상 함유하는, 상기 항체 조성물.
(27) 중사슬이 서열 번호 2, 4, 6, 8, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 및 36 에서 선택되는 아미노산 서열을 갖고, 또한 경사슬이 서열 번호 10 또는 서열 번호 12 에 기재된 아미노산 서열을 갖는, 항 hDLK-1 항체로서, Fc 영역 당사슬 부가 콘센서스 영역 이외의 부위에 당사슬이 부가되어 있지 않은, 상기 항체.
본 발명은, 항체의 당사슬 부가 콘센서스 영역 이외에 당사슬이 부가된 당사슬 부가 이성체를 저감·제거하는 것이 가능하다.
본원 발명의 제 1 효과로는, 당사슬 부가 이성체의 비율이 감소된 의료용 항체 조성물의 제공을 행할 수 있다. 이로써 당해 방법에 의해 정제되고 당사슬 부가 이성체가 저감된 고순도의 항체 조성물은, 보다 순도가 높은 의약품 제제로 할 수 있다.
본원 발명의 제 2 효과로는, 당사슬 부가 이성체를 제거한 의료용 항체 조성물의 제공을 행할 수 있다. 이로써 활성 본체의 순도가 매우 높은 조성물, 즉 유효성과 안전성에 있어서 우수한 의약 조성물로서 제공할 수 있다.
특히, 본 발명에 있어서 정제된 항 hDLK-1 항체의 정제 조성물은, 활성을 갖지 않는 불순물인 당사슬 부가 이성체가 제거되어 있는 점에서, 유효성과 안전성에 있어서 우수한 의약 조성물로서 제공할 수 있다.
도 1 은, 인간화 항 hDLK-1 모노클로날 항체를 산생하는 세포의 배양액으로부터 취득한 조정제물의 HIC-HPLC 분석 패턴을 나타내는 그래프이다.
도 2 는, 인간화 항 hDLK-1 모노클로날 항체를 일과성 발현한 CHO 세포에 의한 배양 상청의 Protein A 정제 후의 SDS-PAGE 분석의 결과를 나타내는 사진이다.
도 3 은, Capto Butyl 소수성 상호 작용 크로마토그래피 담체에 의한 항체 조성물의 분리 프로파일을 나타내는 그래프이다.
도 4 는, Capto Butyl 담체로 분리한 정제 항체 조성물의 HIC-HPLC 에 의한 순도 분석 시험의 결과를 나타내는 그래프 및 표이다. 표 중의 Peak1 및 Peak2 는 당사슬 부가 이성체 항체 (Peak1 은 4 개의 폴리펩티드 사슬의 1 개소의 CDR 에 당사슬이 결합, Peak2 는 2 개소의 CDR 에 당사슬이 결합), Peak3 은 당사슬 부가 콘센서스 영역에만 당사슬이 결합한 항체의 비율 (％) 을 나타낸다.
도 5a 는, Capto Butyl 담체에 의한 항체 조성물의 분리 프로파일을 나타내는 그래프이다.
도 5b 는, Poros Benzyl Ultra 담체에 의한 항체 조성물의 분리 프로파일을 나타낸 그래프이다.
도 6 은, POROS Benzyl Ultra 담체를 사용한 크로마토그래피 조건의 최적화에 의한 당사슬 부가 이성체 함량의 제어를 실험 계획법에 의해 해석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 7 은, 항체 조성물의 정제 프로세스에 있어서의 크로마토그래피 스텝의 시퀀스를 나타내는 도면이다.
도 8 은, 소수성 상호 작용 크로마토그래피에 있어서의 세정액량을 변화시켰을 때의 용출 패턴 및 수율과 순도를 나타내는 그래프이다 (상측 도 : 세정액 1 이 6 CV 이고 세정액 2 가 5 CV 인 조건, 중간 도 : 세정액 1 이 8 CV 이고 세정액 2 가 5 CV 인 조건, 하측 도 : 세정액 1 이 15 CV 이고 세정액 2 가 5 CV 인 조건).
도 9 는, HIC-HPLC 분석을 사용한 항체 조정제물의 정밀 분취에 의한 단리 성분의 분석 데이터를 나타낸다. (a) 단리 전의 항체 조정제물의 HIC-HPLC 분석의 결과를 나타낸다. (b) (a) 의 HIC-HPLC 에 있어서 메인 피크로서 분취된 획분의 HIC-HPLC 분석의 결과를 나타낸다. (c) (a) 의 HIC-HPLC 에 있어서 전 (前) 피크로서 분취된 획분의 HIC-HPLC 분석의 결과를 나타낸다.
도 10 은, 당사슬 부가 이성체의 ADCC 활성을 평가한 결과를 나타내는 그래프이다. 세로축이 ADCC 활성을 나타내는 형광 강도, 가로축은 항체 농도를 나타낸다. 동그라미는 도 9(b) 의 메인 피크로서 분취된 획분 (당사슬 부가 이성체를 포함하지 않는 성분), 사각은 도 9(c) 의 전피크로서 분취된 획분 (당사슬 부가 이성체), 삼각은 도 9(a) 의 단리 전의 항체 조정제물의 결과를 나타낸다.
도 11 은, HuBA-1-3D-1 의 H 사슬 (γ1 사슬) 의 코딩 영역의 염기 서열 (서열 번호 37) 과 아미노산 서열 (서열 번호 38) 을 나타낸다. 아미노산은 1 문자 표기로 나타내고, 터미네이션 코돈의 위치는 "·" 로 나타내고 있다.
도 12 는, HuBA-1-3D-2 의 H 사슬 (γ1 사슬) 의 코딩 영역의 염기 서열 (서열 번호 41) 과 아미노산 서열 (서열 번호 42) 을 나타낸다. 아미노산은 1 문자 표기로 나타내고, 터미네이션 코돈의 위치는 "·" 로 나타내고 있다.
도 13 은, L 사슬 (κ 사슬) 의 코딩 영역의 염기 서열 (서열 번호 69) 과 아미노산 서열 (서열 번호 70) 을 나타낸다. 도 중, 아미노산은 1 문자 표기로 나타내고, 터미네이션 코돈의 위치는 "·" 로 나타내고 있다.
도 14 는, HuBA-1-3D-1 T73K 의 H 사슬 (γ1 사슬) 의 코딩 영역의 염기 서열 (서열 번호 53) 과 아미노산 서열 (서열 번호 54) 을 나타낸다. 아미노산은 1 문자 표기로 나타내고, 터미네이션 코돈의 위치는 "·" 로 나타내고 있다. 상기 HuBA-1-3D-1 T73K 의 VH 의 추정 아미노산 서열 (서열 번호 18) 중, N 말단으로부터 19 아미노산으로 이루어지는 펩티드는 시그널 펩티드이다. HuBA-1-3D-1 T73K 의 VH 의 성숙 펩티드의 cDNA 염기 서열은 서열 번호 19 에 나타내고, 그 추정 아미노산 서열은 서열 번호 20 에 나타낸다.
도 15 는, HuBA-1-3D-1 A24G/T73K 의 H 사슬 (γ1 사슬) 의 코딩 영역의 염기 서열 (서열 번호 61) 과 아미노산 서열 (서열 번호 62) 을 나타낸다. 아미노산은 1 문자 표기로 나타내고, 터미네이션 코돈의 위치는 "·" 로 나타내고 있다. 상기 HuBA-1-3D-1 A24G/T73K 의 VH 의 추정 아미노산 서열 (서열 번호 22) 중, N 말단으로부터 19 아미노산으로 이루어지는 펩티드는 시그널 펩티드이다. HuBA-1-3D-1 A24G/T73K 의 VH 의 성숙 펩티드의 cDNA 염기 서열은 서열 번호 23 에 나타내고, 그 추정 아미노산 서열은 서열 번호 24 에 나타낸다.
도 16 은, HuBA-1-3D-VH1, HuBA-1-3D-VH1 A24G, HuBA-1-3D-VH1 T73K, HuBA-1-3D-VH1 A24G/T73K, HuBA-1-3D-VH2, HuBA-1-3D-VH2 A24G, HuBA-1-3D-VH2 T73K, 및 HuBA-1-3D-VH2 A24G/T73K 의 아미노산 서열 얼라인먼트를 나타내는 도면이다. 괄호 안은 서열표에 있어서의 서열 번호를 나타낸다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다. 본 발명의 범위는 이들 설명에 구속되지 않고, 이하의 예시 이외에 대해서도, 본 발명의 취지를 손상시키지 않는 범위에서 적절히 변경하여 실시할 수 있다. 또한, 본 명세서는, 본원 우선권 주장의 기초가 되는 일본 특허출원 2021-079977호 명세서 (레이와 3 년 (2021년) 5월 10일자 출원) 의 전체를 포함한다. 본 명세서에 있어서 인용된 모든 간행물, 예를 들면 선행기술문헌, 및 공개공보, 특허공보 그 밖의 특허문헌은, 참조로서 본 명세서에 편입된다.
본 명세서에 있어서, 「당사슬 부가 콘센서스 서열」 또는 「당사슬 결합 콘센서스 서열」이란, Asn-X-Ser/Thr (X 는 Pro 이외의 아미노산) 로 나타내는 아미노산 서열을 의미하고, 항체 중에 있어서의 이 서열의 위치, 및 Asn 이 존재하는 위치는 상관하지 않는다. 본 명세서에 있어서, 「Fc 영역 당사슬 부가 콘센서스 영역」, 「당사슬 부가 콘센서스 영역」 또는 「당사슬 결합 콘센서스 영역」이란, 항체의 Fc 부분에 존재하는 통상 Asn297 을 포함하는 당사슬 부가 콘센서스 서열 (대표적으로는 Asn297-X-Ser/Thr (X 는 Pro 이외의 아미노산)) 을 말한다. 당사슬 부가 콘센서스 서열, 및 당사슬 부가 콘센서스 영역을 코드하는 염기 서열은, 당해 아미노산 서열을 코드하는 서열이면 어떠한 것도 포함된다.
본 명세서에 있어서 「당사슬 부가 이성체」란, 당사슬 부가 콘센서스 영역 이외의 아미노산에 당사슬이 부가되어 있는 항체를 의미한다. 당사슬 부가 콘센서스 영역 이외의 아미노산에 부가되어 있는 당사슬을 「비콘센서스 당사슬」이라고 한다. 당사슬 부가 이성체에 있어서 비콘센서스 당사슬이 결합하고 있는 영역으로는, Fab 영역, 항원과의 결합 영역인 Fv (가변) 영역, complementarity determining region (CDR) 영역, 당사슬 부가 콘센서스 영역 이외의 Fc 영역, 및 융합 항체에 있어서의 융합 서열 부분이 포함되고, 대표적으로는 CDR 영역이다. 비콘센서스 당사슬의 당사슬 부가 콘센서스 영역 이외의 아미노산에 대한 당사슬 결합 양식으로는, 당사슬 부가 콘센서스 서열인 Asn-X-Ser/Thr (X 는 Pro 이외의 아미노산) 에 대한 N 형 당사슬이어도 되고, Ser 또는 Thr 에 대한 O 형 당사슬이어도 된다.
항체 분자의 구조는, 통상, 헤테로 테트라머이고, 2 종류의 동일 폴리펩티드 사슬이 2 개씩 결합하여 형성되어 있기 때문에, 비콘센서스 당사슬의 결합 부위로는 이론적으로 항체 1 분자 중에 2 의 배수 개소씩 존재하게 된다. 본 발명의 정제 대상이 되는 항체 조정제물은, 1 개 이상의 비콘센서스 당사슬을 갖는 항체를 포함하고 있으면 된다. 항체 1 분자당 비콘센서스 당사슬의 결합수는, 1 개 이상, 2 개 이상, 3 개 이상, 4 개 이상, 5 개 이상, 6 개 이상, 7 개 이상, 8 개 이상, 9 개 이상, 또는 10 개 이상이어도 된다. 또한 항체는 4 개 (통상은 중사슬 2 개 및 경사슬 2 개) 의 폴리펩티드 사슬로 이루어지는 바, 어느 1 개에 결합하고 있는 비콘센서스 당사슬의 결합수가, 1 개 이상, 2 개 이상, 3 개 이상, 4 개 이상, 5 개 이상, 6 개 이상, 7 개 이상, 8 개 이상, 9 개 이상, 또는 10 개 이상이어도 된다. 항체 조정제물 중의 비콘센서스 당사슬의 결합 가능 영역에 대한 당사슬의 결합 비율, 즉, 당사슬 부가 이성체의 존재 비율로는, 항체 1 분자 중 편방의 「중사슬과 경사슬의 조합」 또는 그것에 해당하는 구조에 대해 비콘센서스 당사슬이 완전히 결합하고 있는 경우를 100 ％ 로 한 경우, 항체 1 분자당, 0.1 ％ 이상 200 ％ 이하여도 되고, 통상, 본 발명의 방법을 적용할 필요가 있는 경우에는, 1 ％ 이상 50 ％ 이하이다. 여기서, 200 ％ 란, 1 분자의 항체에 있어서, 쌍이 되는 「중사슬과 경사슬의 조합」의 양방 (2 개소) 에 비콘센서스 당사슬이 결합하고 있는 것을 의미한다.
본 명세서에 있어서 「항체」는, 전장 항체 외에, 항체 단편, 전장 항체 또는 항체 단편과 다른 물질의 융합물을 포함하고, 예를 들면, 마우스 항체, 마우스-인간 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 및 이들의 아미노산 개변체, 부가체, 결실체, 치환체, 당사슬 개변체 등을 포함한다. 항체의 이뮤노글로불린 클래스는 특별히 한정되는 것은 아니고, IgG, IgM, IgA, IgE, IgD, 또는 IgY 중 어느 이뮤노글로불린 클래스 (아이소타입) 여도 되고, 바람직하게는 IgG 이다. 또한, 본 발명의 항체가 IgG 인 경우, 어느 서브 클래스 (IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4) 여도 된다. 항체 단편은, 바람직하게는 항원 결합성 단편이며, F(ab')2, Fab', Fab, Fab3, 단일 가닥 Fv (이하, 「scFv」라고 한다), (탠덤) 바이스페시픽 단일 가닥 Fv (sc(Fv)2), 단일 가닥 트리플바디, 나노바디, 다이발렌트 VHH, 펜타발렌트 VHH, 미니바디, (이중 가닥) 다이아바디, 탠덤 다이아바디, 바이스페시픽 트리바디, 바이스페시픽 바이바디, 듀얼 어피니티 리타겟팅 분자 (DART), 트리아바디 (또는 트리바디), 테트라바디 (또는 [sc(Fv)2]2, 또는 (scFv-SA)4), 다이술파이드 결합 Fv (이하, 「dsFv」라고 한다), 컴팩트 IgG, 중사슬 항체, 또는 그들의 중합체를 포함한다. 항체 단편과 다른 물질의 융합물로는, 융합 단백질, 특히 Fc 융합 단백질 등을 들 수 있다.
특히, 본 명세서에 있어서의 항체로는, 중사슬이 서열 번호 2, 4, 6, 8, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 및 36 에서 선택되는 아미노산 서열을 갖고, 또한 경사슬이 서열 번호 10 또는 12 에 기재된 아미노산 서열을 갖는 항 hDLK-1 항체를 의미한다. 바람직하게는, 중사슬이 서열 번호 4, 8, 16, 20, 24, 28, 32 및 36 에서 선택되는 아미노산 서열을 갖고, 또한 경사슬이 서열 번호 12 에 기재된 아미노산 서열을 갖는 항 hDLK-1 항체이다.
본 명세서에 있어서, 정제 대상이 되는 당사슬 부가 이성체를 포함하는 항체 조성물은, 「항체 조정제물」이라고 한다. 항체 조정제물은, 당사슬 부가 이성체를 포함하는 한, 어떠한 것이라도 이용할 수 있다. 예를 들어, 항체 조정제물로서, 혈장 등 생체 유래 조성물 또는 그 처리물, 및 항체 유전자가 삽입된 형질 전환 세포의 배양액 (배양 상청이어도 된다, 이하 동일) 또는 그 처리물을 들 수 있다. 생체 유래 조성물로는, 트랜스제닉 비인간 동물 혹은 식물 등으로부터 얻어진 항체를 포함하는 조성물 등을 들 수 있다. 형질 전환 세포로는, 당사슬을 결합할 수 있는 세포이면 어느 것이라도 되고, 구체적으로는, 동물 세포, 식물 세포 혹은 효모 세포 등의 당사슬을 결합할 수 있는 성질을 갖는 세포주, 더 구체적으로는, 차이니즈 햄스터 난소 세포 (CHO 세포), 마우스 미엘로마 세포인 NS0 세포, SP2/0 세포, 래트 미엘로마 세포인 YB2/0 세포, IR983F 세포, 시리아 햄스터 신장 유래인 BHK 세포, 인간 태아 신장 유래인 293 세포, 인간 미엘로마 세포인 나말바 세포, 배성 간세포, 또는, 수정란 세포 등에 항체 유전자를 도입한 세포를 들 수 있다. 전술한 세포주로는, 초대 불사화 세포주로부터 파생된 다양한 아종을 이용하는 것도 가능하다. 예를 들어, CHO 세포라면, CHO K1 주, CHO DG44 주, CHO S 주 및 이들의 파생주 등을 이용할 수 있다 (Palsson 등, Nature Biotechnology 31 (8), 759-765, 2013). 이들 세포를, 단백질의 생산에 적합한 배지에서 배양함으로써, 배양액으로서 항체 조정제물이 얻어진다. 사용되는 배지로는, 예를 들어, 혈청 함유 배지, 혈청 알부민 혹은 혈청 분획물 등의 동물 유래 성분을 포함하지 않는 배지, 무혈청 배지 또는 무단백질 배지 등, 어느 배지나 사용할 수 있지만, 바람직하게는 무혈청 배지, 동물 유래 원료 불함유 배지, 무단백질 배지, 완전 화학 합성 배지가 사용된다.
또한, 상기 항체 조정제물로는, 여과, 염석, 1 종류 이상의 크로마토그래피, pH 조정, 완충액 치환, 농축, 희석 등의 처리를 실시한 생체 유래 조성물이나 배양액이나, 생체 유래 조성물이나 배양액에 대하여 정제 등의 조작을 실시한 중간체 조성물 등의 조성물을 이용할 수도 있다. 정제 조작을 실시한 중간체 조성물로는, 항체 의약품의 제조 프로세스를 구축하기 위한 어떠한 단위 조작 후의 용액이라도 이용할 수 있다. 예를 들어, Protein A 어피니티 크로마토그래피 후, 양이온 교환 크로마토그래피 후, 음이온 교환 크로마토그래피 후, 완충액 교환 후, 저 pH 처리 후, 여과 후의 조성물 등이 바람직하다.
N 형 당사슬의 경우, 당사슬 부가 이성체가 존재할 가능성에 대해서는 당해 항체의 아미노산 서열 또는 유전자 서열로부터 추정할 수 있다. 또한, 당사슬의 형에 상관없이, 항체의 펩티드 매핑 및 질량 분석에 의해, 당사슬 결합 위치를 추정할 수 있다. 보다 간편한 방법으로는, 펩타이드-N-글리코시다제 (PNGase) 처리한 항체와 당해 처리를 실시하지 않은 항체를 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동 (SDS-PAGE) 하여 비교함으로써, 단백질 영동대의 변화로서 당사슬의 결합을 관찰할 수 있다.
항체의 종류로는 상기에 나타낸 바와 같지만, 본 방법은, 치료용, 진단용 또는 예방용 항체를 포함하는 항체 의약품으로서의 항체의 생산에 있어서의 정제 방법으로서 적합하다. 항체 의약품은, 포함되는 항체의 이성체의 함량에 항상성이 있을 것이 필요시되고, 목적 물질 유래 불순물은 가능한 한 저감되는 것이 필요하기 때문이다 (ICH Q6B 가이드라인). 치료용 또는 예방용 항체의 예로는, 리간드에 결합하여 리간드의 활성을 중화하는 항체, 세포 표면의 수용체에 결합하여 리간드의 결합을 중화하는 항체, 세포 표면에 결합하여 세포 자신에 대한 상해 활성을 나타내는 항체를 들 수 있다. 진단용 항체의 예로는, 리간드 또는 세포 표면의 수용체에 결합하는 항체를 들 수 있다. 세포에 대한 상해 활성으로는, 항체 의존성 세포 상해 활성 (Antibody-dependent Cellular Cytototoxicity), 보체 의존성 세포 상해 활성 (Complement-Dependent Cytotoxicity), 항체 의존성 세포 탐식 (Antibody dependent cellular phagocytosis) 활성 등을 들 수 있다. 또, 항체-약물 복합체 (Antibody Drug Conjugate), 방사성 표지 항체 (Radioisotope-labelled Antibody) 등의 화학 수식 항체, 사이토카인 등과의 융합 항체, 다중 특이성 항체 (Multi-specific Antibody) (Nature, 580 (16), 330-338 (2020)) 등, 당사슬을 갖는 항체 유도체이면 본 발명의 기술을 이용할 수 있다.
더욱 구체적으로는, CD3, EGF 수용체, CD20, RS 바이러스, TNFα, CD25, IL-6 수용체, CD33, VEGF, IgE, 보체 C5, IL-12, IL-23, IL-1β, RANKL, CCR4, HER2, CD30, IL-5, IL-5 수용체, α4 인테그린, α4β7 인테그린, PD-1, CD52, IL-17, IL-17A, IL-17 수용체, CTLA-4, PCSK9, SLAMF7, BlyS, CD38, PD-L1, IL-4α 수용체, CD22, CD23, 제 IXa 인자, X 인자, CD19, 스클레로스틴, DLK-1 등의 단백질 항원 (바람직하게는, 인간에서 유래한 단백질 항원) 에 대한 항체의 정제에 본 방법을 이용하는 것이 가능하다. 융합 단백질로는, 가용성 TNF 수용체 Fc 융합 단백질, CTLA4 개변 Fc 융합 단백질, Fc-TPOR 아고니스트 펩티드 융합 단백질, VEGF 수용체-Fc 융합 단백질 등을 들 수 있다. 이들의 어떠한 항체 또는 융합 단백질 등의 정제에 본 방법을 이용하는 것이 가능하다.
가장 바람직한 사례 중 하나는, 항 DLK-1 항체의 정제이다. 구체적으로, 전술한 특허문헌 4 (WO2014/054820) 에 기재된 인간화 항인간 DLK-1 항체, 예를 들어, 서열 번호 2, 4, 6, 8, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34 및 36 에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 중사슬 (특히 이들 아미노산 서열을 가변 영역으로서 갖는 중사슬, 본 단락에 있어서 이하 동일), 및 서열 번호 10 또는 12 에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경사슬 (특히 이들 아미노산 서열을 가변 영역으로서 갖는 경사슬, 본 단락에 있어서 이하 동일) 을 포함하는 항체를 들 수 있고, 바람직하게는 서열 번호 4, 8, 16, 20, 24, 28, 32 및 36 에서 선택되는 아미노산 서열을 갖는 중사슬 및 서열 번호 12 에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경사슬을 포함하는 항체이다. 이러한 인간화 항인간 DLK-1 모노클로날 항체는, 그 경사슬의 가변 영역에 당사슬 결합 콘센서스 서열을 갖는다.
이하의 표 1 및 2 는, 전술한 특허문헌 4 (WO2014/054820) 에 기재되어 있는 항인간 DLK-1 항체의 전장 서열을 포함하는 것인데 (밑줄은 시그널 서열을 나타낸다. 성숙 단백질에 있어서는 하선부의 서열을 포함하지 않는다.), 예를 들면 당해 항체에 있어서는, 네모진 프레임으로 둘러싸인 NSS 서열의 N 이 당사슬 결합 콘센서스 서열이 된다. 그 때문에, 동물 세포 등에 이 유전자를 발현시킨 경우, 당사슬 부가 이성체를 포함하는 당사슬 조성물이 생성될 가능성이 있다. 마찬가지로, 당해 항 DLK-1 항체의 서열에 유사한 서열을 갖는 DLK-1 항체도 동일한 가능성을 갖는다. 이러한 당사슬 부가 이성체를 포함하는 항체 조정제물로부터 당사슬 부가 이성체를 제거 또는 저감하는 방법으로서 본 방법은 유용하다. 또한, 이하의 표에 기재된, HuBA-1-3D-1 의 H 사슬, HuBA-1-3D-2 의 H 사슬, HuBA-1-3D-1 A24G 의 H 사슬, HuBA-1-3D-2 A24G 의 H 사슬, HuBA-1-3D-1 T73K 의 H 사슬, HuBA-1-3D-2 T73K 의 H 사슬, HuBA-1-3D-1 A24G/T73K 의 H 사슬, HuBA-1-3D-2 A24G/T73K 의 H 사슬, 및 HuBA-1-3D 의 L 사슬의 아미노산 서열은, 각각 순서대로, 서열 번호 38, 42, 46, 50, 54, 58, 62, 66 및 70 에 기재되어 있다. 또한, 이들 서열로부터 시그널 서열을 제외한 성숙 단백질의 아미노산 서열은, 각각 순서대로, 서열 번호 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68 및 72 에 기재되어 있다. 본원 명세서 등에 있어서, 「H 사슬」은 중사슬, 「L 사슬」은 경사슬을 의미한다.
HuBA-1-3D VH1 및 HuBA-1-3D VH2 의 CDR1 의 아미노산 서열은 「DYAMH」(서열 번호 73), CDR2 의 아미노산 서열은 「VISTYYGNTNYNQKFKG」(서열 번호 74), 및 CDR3 의 아미노산 서열은 「GGLREYYYAMDY」(서열 번호 75) 이다. 또한, HuBA-1-3D VL 의 CDR1 의 아미노산 서열은 「KSSQSLLNSSNQKNYLA」(서열 번호 76), CDR2 의 아미노산 서열은 「FASTRES」(서열 번호 77), 및 CDR3 의 아미노산 서열은 「QQHYSTPPT」(서열 번호 78) 이다. 본 발명의 항체는, 이들 CDR 의 전부 또는 일부를 갖는 항체여도 된다. 한편, 이들 CDR 서열은, Kabat 등 (Sequences of Proteins of Immunological Interests, Fifth edition, NIH Publication No.91-3242, U.S.Department of Health and Human Services, 1991) 의 정의에 따랐다. 본원 명세서 등에 있어서, 「VH」는 중사슬 가변 영역, 「VL」은 경사슬 가변 영역을 의미한다.
항체 조정제물과 비교하여 당사슬 부가 이성체의 함유량이 감소한 항체 조성물 (본 명세서에 있어서, 「정제 항체 조성물」이라고 한다) 은, 당사슬 부가 이성체를 포함하는 항체 조정제물을 출발 원료로 하여, 컨벤셔널 크로마토그래피에 제공함으로써 얻어진다. 따라서 본 발명은, 항체 조정제물의 정제 방법으로서, 상기 항체 조정제물을 컨벤셔널 크로마토그래피에 부하하여, Fc 영역 당사슬 부가 콘센서스 영역 이외의 부위에 당사슬이 부가되어 있지 않은 항체를 상기 담체에 흡착시키는 것, 및 상기 담체를 용출액으로 용출시킴으로써, 상기 담체에 흡착된 상기 항체를 용출시켜 정제 항체 조성물을 얻는 것을 포함하고, 얻어진 정제 항체 조성물에 있어서의, Fc 영역 당사슬 부가 콘센서스 영역 이외의 부위에 당사슬이 부가된 당사슬 부가 이성체의 함유량이, 정제 전의 항체 조정제물과 비교하여 감소되어 있는 방법에 관한 것이다.
컨벤셔널 크로마토그래피에서 사용하는 담체로는, 소수성 상호 작용 크로마토그래피 담체, 소수 크로마토그래피 담체, 혹은, 믹스 모드 크로마토그래피 담체 (멀티 모드 크로마토그래피 담체라고도 한다, 바람직하게는 소수 크로마토그래피의 성질을 갖는 믹스 모드 크로마토그래피 담체) 를 이용할 수 있다. 소수성 상호 작용 크로마토그래피 담체로는, 메틸기, 에틸기, 프로필기, 부틸기, 옥틸기, 헥실기, 프로필렌글리콜기, 페닐기, 알킬페닐기, 벤질기, 알킬벤질기 등의 소수성 관능기를 베이스 기재에 결합한 것을 사용할 수 있다. 믹스 모드 크로마토그래피 담체로는, 상기의 소수성 관능기와 이온 교환성의 관능기를 임의의 비율로 혼합한 것을 들 수 있다. 예를 들어, N-벤질-N-메틸에탄올아민 등을 관능기로서 이용할 수 있다. 양이온 교환성의 관능기의 대표적인 것에는 CM (Carboxymethyl, -O-CH2-COOH), SP (Sulfopropyl, -O-C3H6-SO3H) 등을 들 수 있고, 음이온 교환성의 대표적인 것에는 DEAE (Diethylaminoethy, -O-C2H4-N-(C2H5)2), QAE (Quaternized aminoethyl 또는 Diethyl-(2-hydroxypropyl)-aminoethyl, -O-C2H4-N-(C2H5)2(CH2-CH(OH)-CH2) 등을 들 수 있으며, 이들을 이용할 수 있다. 담체의 기재로는 셀룰로오스, 세파덱스, 가교 아가로오스, 폴리아크릴아미드, 메타크릴레이트 및 각종 합성 폴리머를 들 수 있다. 담체는 세공 (細孔) 이 있어도 없어도 되며, 어느 것이라도 이용할 수 있다. 믹스 모드 크로마토그래피 담체의 다른 형태로는, 하이드록시아파타이트 (Ca10(PO4)6(OH)2) 나 플루오로아파타이트 (Ca10(PO4)6F2) 와 같이 인산칼슘 등의 관능기를 갖는 것을 들 수 있다.
크로마토그래피 담체는 시판품으로서 입수하여 이용할 수 있다. 구체적으로는, Butyl-Sepharose (등록상표) 4 Fast Flow (평균 입자경 90 ㎛), Butyl-S Sepharose 6 Fast Flow (평균 입자경 90 ㎛), Octyl Sepharose (등록상표) 4 Fast Flow (평균 입자경 90 ㎛), Phenyl Sepharose (등록상표) 6 Fast Flow (high sub) (평균 입자경 90 ㎛), Phenyl Sepharose (등록상표) 6 Fast Flow (low sub) (평균 입자경 90 ㎛), Butyl Sepharose (등록상표) High Performance (평균 입자경 90 ㎛), Phenyl Sepharose High Performance (평균 입자경 90 ㎛), SOURCE 15ETH (평균 입자경 15 ㎛), SOURCE 15ISO (평균 입자경 15 ㎛), SOURCE 15PHE (평균 입자경 15 ㎛), Capto Phenyl (High Sub) (평균 입자경 90 ㎛), Capto Butyl (평균 입자경 90 ㎛), Capto Octyl (평균 입자경 90 ㎛), Capto Phenyl ImpRes (평균 입자경 36-44 ㎛), Capto Butyl ImpRes (평균 입자경 36-44 ㎛), Capto adhere (평균 입자경 90 ㎛), Capto adhere ImpRes (평균 입자경 36-44 ㎛), Capto MMC (평균 입자경 90 ㎛), Capto MMC ImpRes (평균 입자경 36-44 ㎛), Capto Core 700 (평균 입자경 90 ㎛), ReadyToProcess Adsorber Phenyl (이상, Cytiva 사, 영국), TOYOPEARL (등록상표) Butyl-600 (평균 입자경 40-90 ㎛), TOYOPEARL (등록상표) Phenyl-600 (평균 입자경 40-90 ㎛), TOYOPEARL (등록상표) PPG-600 (평균 입자경 40-90 ㎛), TOYOPEARL (등록상표) Butyl-650 (평균 입자경 40-90 ㎛), TOYOPEARL (등록상표) Phenyl-650 (평균 입자경 40-90 ㎛), TOYOPEARL (등록상표) SuperButyl-550 (평균 입자경 40-90 ㎛), TOYOPEARL (등록상표) Hexyl-650 (평균 입자경 50-150 ㎛), TOYOPEARL (등록상표) Ether-650 (평균 입자경 40-90 ㎛) (이상, 토소사 제조), POROS Ethyl (평균 입자경 50 ㎛), POROS Benzyl (평균 입자경 50 ㎛), POROS Benzyl Ultra (평균 입자경 50 ㎛) (이상, Thermo Fisher 사 제조), Macro-Prep t-Butyl HIC (평균 입자경 50 ㎛), Macro-Prep Methyl HIC (평균 입자경 50 ㎛), 세라믹 하이드록시아파타이트 (평균 입자경 20-80 ㎛), 세라믹 플루오로아파타이트 (평균 입자경 20-80 ㎛), 바이오겔 HT (평균 입자경 20-80 ㎛) (이상, 바이오래드사 제조), QMA Spherosil (평균 입자경 50 ㎛), Methyl Ceramic Hyper D (평균 입자경 50 ㎛) (이상, 폴사 제조), Fractogel EMD Phenyl (S) (평균 입자경 20-90 ㎛), Fractogel EMD Propyl (S) (평균 입자경 20-90 ㎛) (이상, 머크사 제조), Cellufine MAX Phenyl (평균 입자경 40-130 ㎛), Cellufine MAX Phenyl LS (평균 입자경 40-130 ㎛), Cellufine MAX Butyl (평균 입자경 40-130 ㎛) (이상, JNC 사 제조), 부틸화 키토팔, 페닐화 키토팔 (이상, 후지보 홀딩스사 제조) 등의 담체를 들 수 있으며, 이들 담체로부터 보다 적절한 담체가 선택되고, 사용된다. 보다 바람직하게는, Capto Butyl, POROS Benzyl Ultra, POROS Butyl Ultra 등의 담체이다.
본 발명의 정제 목적으로 사용되는 크로마토그래피 담체의 평균 입자경은, 15 ㎛ 이상, 20 ㎛ 이상, 30 ㎛ 이상, 또는 40 ㎛ 이상으로 할 수 있다. 또, 크로마토그래피 담체를 처리할 수 있는 항체 조정제물의 액량으로는, 100 mL 이상, 1 L 이상, 10 L 이상, 또는 100 L 이상으로 할 수 있다. 이 담체를 충전한 크로마토그래피용 칼럼은 100 mL ∼ 1,000 L 정도 (직경 5 cm ∼ 2 m 정도) 까지의 용량의 것을 사용할 수 있다. 크로마토그래피 정제에 제공되는 항체 조정제물의 양은, 적어도 1 L 이상이고, 바람직하게는 10 L 이상, 보다 바람직하게는 100 L 이상, 더욱 바람직하게는 500 L 이상, 최대 20,000 L 정도까지이다. 이와 같은 대량의 항체 조정제물을 처리하는 것이 필요해지기 때문에, 크로마토그래피에 있어서의 선유속은 1,000 cm/hr 이하, 바람직하게는 500 cm/hr 이하이다. 정제에 제공되는 항체의 양으로는 단백질량으로서 10 g 이상이고, 바람직하게는 100 g 이상, 보다 바람직하게는 1 kg 이상, 더욱 바람직하게는 10 kg 이상이다. 본 기술에서 제거 또는 저감해야 할 당사슬 부가 이성체는, 크로마토그래피에 의해 용출되는 항체 중 전반의 획분에 포함되고, 목적으로 하는 원하는 항체를 후반의 획분에 용출시킴으로써, 당사슬 부가 이성체를 분별·제거하는 것이다.
당사슬 부가 이성체를 포함하는 항체 조정제물을 컨벤셔널 크로마토그래피에 부하하는 조건으로는, 적어도 목적의 성분인 당사슬 부가 콘센서스 영역에만 당사슬이 부가된 항체 (비당사슬 부가 이성체 항체) 를 크로마토그래피 담체에 흡착시킬 수 있는 조건이 필요하다. 항체의 흡착은 항체 및 크로마토그래피 담체의 소수성·친수성의 정도로 이루어지는 상호 작용에 의해 발생한다. 완충액으로는, 소수성 상호 작용 크로마토그래피, 소수 크로마토그래피, 믹스 모드 크로마토그래피에 통상 사용하는 완충액을 이용할 수 있다. 항체가 크로마토그래피의 조건에 있어서 안정되면 어느 것이어도 되며, 예를 들어, 인산 완충액, 아세트산 완충액, 시트르산 완충액, 트리스 완충액, 글리신 완충액, 붕산 완충액, 타르타르산 완충액, MES 완충액, HEPES 완충액, MOPS 완충액, 아미노산 완충액, 및 이들의 혼합 완충액을 들 수 있다. 이들 완충액의 농도는, 0.1 mM ∼ 300 mM 정도의 일반적으로 사용되는 범위에서 임의로 선택 가능하다. 완충액의 pH 는, pH 4 ∼ 8 의 범위에서 임의로 선택할 수 있지만, pH 4 ∼ 6 이 바람직하다.
이들 완충액에, 황산나트륨, 황산암모늄, 염화나트륨, 시트르산나트륨 등의 염류를, 항체가 침전을 생성하지 않을 정도로 필요에 따라서 적당량 첨가하여, 상기한 크로마토그래피 담체와의 상호 작용을 증강시킴으로써, 크로마토그래피 담체에 대한 흡착을 실시할 수 있다. 상기 염류는 임의로 1 종류 이상에서 선택할 수 있으며, 염 농도로는, 300 mM ∼ 2 M 의 범위에서 항체가 안정적으로 존재하고, 크로마토그래피 담체에 항체가 충분히 흡착될 수 있는 농도가 사용된다. 1 M 정도의 염 농도가 바람직하고, 항체를 흡착 가능한 낮은 염 농도가 바람직하다. 단위량당 크로마토그래피 담체에 흡착할 수 있는 항체의 양은, 크로마토그래피 담체의 종류나 완충액의 조건에 의해 다양하지만, 담체 1 mg 당 10 mg 이상의 항체, 바람직하게는 담체 1 mg 당 20 mg 이상의 항체를 흡착시킬 수 있다. 크로마토그래피의 조작은 0 ℃ ∼ 40 ℃ 의 임의의 온도에서 실시 가능하다. 실온에서의 조작이 바람직하고, 온도가 관리된 조건에서의 조작이 보다 바람직하다.
전술한 조건에 있어서, 당사슬 부가 이성체를 포함하는 항체 조정제물이 크로마토그래피에 부하된 후, 용출에 의해 분리 정제가 실시된다. 크로마토그래피에 의한 당사슬 부가 이성체의 분리는, 항체를 크로마토그래피 담체에 흡착시킨 후, 단계적, 연속적, 또는 그것들을 조합하여, 칼럼에 흘려보내는 완충액의 염 농도를 저하시키거나, pH 를 올리거나, 도전율을 저하시키거나, 또는 이것들의 조합에 의해 실시할 수 있다. 크로마토그래피 담체에 항체를 흡착시킨 후, 먼저 당사슬 부가 이성체를 주로 용출시키고, 이어서, 당사슬 부가 콘센서스 영역에만 당사슬이 부가된 항체 (비당사슬 부가 이성체 항체) 를 용출시킴으로써, 목적으로 하는 정제 항체 조성물을 조제할 수 있다. 「용출」이란 크로마토그래피 담체에 소수성 상호 작용 등으로 결합한 항체 성분의 담체에 대한 결합을 약화시켜, 크로마토그래피 담체로부터 당해 항체 성분을 배출하는 것을 말한다. 당사슬 부가 이성체를 용출시키는 조건으로는, 당사슬 부가 이성체와 크로마토그래피 담체의 상호 작용이, 비당사슬 부가 이성체 항체와 크로마토그래피 담체의 상호 작용과 비교하여 충분히 약한 완충액의 조건이다. 당해 조건의 당해 완충액을 충분량 사용하여 크로마토그래피 담체를 세정함으로써, 목적하는 항체인 비당사슬 부가 이성체 항체만을 크로마토그래피 담체에 흡착시킨 채로 당사슬 부가 이성체만을 용출 제거할 수 있다.
당사슬 부가 이성체를 용출 제거하기 (세정하기) 위한 완충액은, 비당사슬 부가 이성체 항체를 용출시키는 완충액과의 사이에서, 10 mM 이상의 염 농도의 차이 및/또는 0.2 유닛 이상의 pH 의 차이가 있으면 어느 완충액도 이용할 수 있다. 비당사슬 부가 이성체 항체를 크로마토그래피 담체에 고염 농도 (통상 300 mM ∼ 2 M 의 범위가 된다) 로 흡착시킨 후, 크로마토그래피 담체를 세정하는 세정액의 염 농도는, 용출시키는 염 농도에 대하여 동등 이상의 범위로 할 수 있다. 예를 들어, 항체를 용출시킬 때의 염 농도에 대하여, 동등 또는 동등 내지 1 M 높은 염 농도까지의 범위, 혹은 동등 내지 0.5 M 높은 염 농도까지의 범위, 또는, 항체를 용출시킬 때의 염 농도보다 10 mM 이상 높은 염 농도로 할 수 있으며, 예를 들어, 0.5 M 이상 또는 1.0 M 이상으로 할 수 있다. 세정액의 pH 는, 항체를 흡착시킬 때의 pH 에 대하여, 동등 또는 최대 2 유닛 높은 pH 까지의 범위, 혹은 용출시의 pH 에 대하여, 동등 또는 최대 2 유닛까지의 낮은 범위로 할 수 있다. 예를 들어, 세정액의 pH 는, 용출액의 pH 보다 0.2 유닛 낮은 pH 여도 된다. 세정액의 pH 는, pH 4 ∼ 8 의 범위 내여도 된다. 또한, 당사슬 부가 이성체를 용출 제거하기 위한 완충액 (세정액) 의 통액량으로는, 크로마토그래피 담체 용량에 대하여 2 담체 용량 (CV) 이상, 3 CV 이상, 4 CV 이상, 5 CV 이상, 10 CV 이상, 15 CV 이상, 또는 20 CV 이상, 혹은 5 ∼ 20 CV, 5 ∼ 15 CV, 5 ∼ 10 CV, 또는 10 ∼ 20 CV 로 할 수 있다.
항체 조정제물의 부하에서 세정까지의 pH 및/또는 염 농도의 변화는 단계적 (1 단계 또는 그 이상, 2 단계 또는 그 이상, 3 단계 또는 그 이상, 수 단계 등) 이어도 되고, 연속적이어도 된다. 항체 조정제물의 부하에서 세정까지의 pH 의 범위는 통상 4 ∼ 6 의 범위 내이다.
상기 염 농도, pH 및/또는 세정액량의 조건은 원료로서 사용하는 항체 조정제물 중의 당사슬 부가 이성체의 함량, 및 항체의 등전점이나 아미노산 서열 등의 항체 그 자체의 특성 등에 따라서 적절히 설정할 수 있다.
본 명세서에 있어서의, 크로마토그래피에 의한 당사슬 부가 이성체의 분리 방법은, 당사슬 부가 이성체를 크로마토그래피 담체로부터 그대로 통과 (素通 : 플로 스루) 시키는 것, 이어서 당사슬 부가 콘센서스 영역에만 당사슬이 부가된 항체를 용출시키는 것을 포함하고 있어도 되며, 이로써, 비당사슬 부가 이성체 항체의 순도가 높은 정제 항체 조성물을 조제하는 것도 가능하다. 그대로 통과 (플로 스루) 란, 크로마토그래피 담체를 충전한 칼럼에 항체 조정제물을 부하했을 때에, 당사슬 부가 이성체를 크로마토그래피 담체에 흡착시키지 않고 그대로 칼럼 밖으로 용출시키는 것을 말한다. 이 경우, 항체 조정제물 중의 당사슬 부가 이성체는 크로마토그래피 담체와의 약한 상호 작용을 갖는 경우가 있지만, 평형화 완충액 (바람직하게는 1 칼럼 용량 이상) 을 연속 혹은 단속적으로 통액시킴으로써, 불필요한 당사슬 부가 이성체를 포함하는 성분을 칼럼 밖으로 배제할 수 있다. 당사슬 부가 이성체를 특이적으로 그대로 통과시키기 위한 완충액으로는, 당사슬 부가 이성체와 크로마토그래피 담체의 상호 작용이, 당사슬 부가 콘센서스 영역에만 당사슬이 결합한 항체와 크로마토그래피 담체의 상호 작용과 비교하여 충분히 약한 조건의 완충액을 선택한다. 충분량의 당해 완충액을 사용하여 크로마토그래피 담체로부터 당사슬 부가 이성체만을 그대로 통과시킴으로써, 목적으로 하는 항체만을 크로마토그래피 담체에 흡착시킬 수 있다. 이어서, 상기 완충액과는 염 농도 등의 조건이 상이한 완충액을 사용하여, 결합한 항체를 크로마토그래피 담체로부터 용출하여 원하는 정제 항체 조성물을 조제한다.
당사슬 부가 이성체만을 그대로 통과시키는 완충액으로는, 당사슬 부가 콘센서스 영역에만 당사슬이 결합한 항체를 용출시키는 용출액과 비교하여, 10 mM 이상의 염 농도의 차이 (10 mM 이상 높은 염 농도), 및/또는, 0.2 유닛 이상의 pH 의 차이 (0.2 이상 낮은 pH ) 가 있으면 어느 완충액도 플로 스루용 세정액으로서 이용할 수 있다. 완충액의 염 농도는, 비당사슬 부가 이성체 항체를 담체로부터 용출시키는 염 농도에 대하여, 동등 또는 1 M 높은 염 농도까지의 범위 (바람직하게는 0.5 M 높은 염 농도까지의 범위) 로 할 수 있다. 이 때의 염 농도는, 통상 항체를 용출시키는 염 농도에 대하여 100 ％ 이상의 범위가 된다. 혹은, 항체의 흡착시의 pH 에 대하여 동등 또는 최대 2 유닛까지의 높은 pH 의 범위에서의 세정액, 혹은 용출시의 pH 에 대하여 동등 또는 최대 2 유닛까지의 낮은 pH 의 범위의 세정액으로 세정한다. pH 또는/및 염 농도의 변화는 일 단계여도 되고 여러 단계여도 되며, 연속적이어도 된다. 또, 통상, 당해 완충액의 염 농도나 pH 는, 원료가 되는 항체 조정제물을 크로마토그래피 담체에 부하하기 전에 적절한 범위로 조제된다. 당사슬 부가 이성체를 그대로 통과시키기 위한 완충액 (세정액) 의 통액량으로는, 크로마토그래피 담체량의 2 배 이상, 바람직하게는 5 배 이상의 조건을 선택한다. 세정액의 통액량으로서 더욱 바람직하게는 10 ∼ 20 배 이상이다. 상기 염 농도, pH, 또는/및, 세정액량은 원료로 사용하는 항체 조정제물 중의 당사슬 부가 이성체의 함량에 따라서 적절히 설정한다.
크로마토그래피 담체에 대한 항체 조정제물 중의 항체의 부하량, 즉, 단백질의 부하량은, 당사슬 부가 이성체의 분리능에 영향을 미치기 때문에, 얻어지는 정제 항체 조성물이 원하는 수율 및 순도 (당사슬 부가 이성체의 함유량) 가 되도록, 크로마토그래피 담체당의 단백질 부하량을 결정한다. 통상, 크로마토그래피 조작에 있어서, 단백질을 담체에 흡착할 수 있는 양에는 한계가 있고, 최대 동적 흡착 용량 (DBC : Dynamic Binding Capacity) 등의 파라미터를 지표로 하여 크로마토그래피 조작이 관리된다. 일반적으로, 최대 동적 흡착 용량 이하의 단백질 부하량으로 함으로써, 단백질의 회수율 및 분리능이 양호해져 원하는 크로마토그래피의 분리 효과를 기대할 수 있다. 또한, 본 발명의 방법에서는, 불필요한 당사슬 부가 이성체가 흡착되지 않도록, 일정량 이상의 부하량으로 하는 것이 바람직하고, 적어도 크로마토그래피 담체 1 g 의 단위량당 또는 크로마토그래피 담체 1 mL 의 단위량당, 20 mg 이상, 25 mg 이상, 30 mg 이상, 또는 35 mg 이상, 또한 최대 동적 흡착 용량 이하의 단백질의 부하를 실시함으로써 당사슬 부가 이성체의 분리·제거를 실시한다. 단백질의 부하량은, 정제하고자 하는 항체 조정제물 중의 당사슬 부가 이성체의 함량에 따라서 결정할 수 있다. 즉, 크로마토그래피 정제 전의 항체 조정제물에 있어서의 당사슬 부가 이성체의 함량이 많은 경우에는, 최대 동적 흡착 용량에 가까운 부하량으로 할 수 있다.
일 양태에 있어서 본 발명의 방법은, 사용하는 컨벤셔널 크로마토그래피 담체를 분리에 제공하는 항체의 성질에 따라서 선택하는 스텝, 선택한 크로마토그래피 담체에 의한 당사슬 부가 이성체의 분리 제거를 최적화하는 스텝을 포함한다.
크로마토그래피 담체를 선택하는 스텝은, 먼저, 전술한 염 농도 및 pH 조건하에서, 임의의 2 종류 이상의 크로마토그래피 담체에 정제 대상이 되는 항체 조정제물을 부하하여, 당사슬 부가 콘센서스 영역에만 당사슬이 부가된 항체가 흡착된 양이 많은 크로마토그래피 담체를 선택할 수 있다. 또한, 필요에 따라서, 염 농도를 단계적 또는 연속적으로 저하시킨 용출액으로 용출시키고, 담체를 통과한 용출액 중의 당사슬 부가 이성체 및/또는 당사슬 부가 콘센서스 영역에만 당사슬이 부가된 항체의 양을 측정하여, 당사슬 부가 이성체의 양이 적고, 또한 당사슬 부가 콘센서스 영역에만 당사슬이 부가된 항체의 양이 많은 용출액이 얻어지는 크로마토그래피 담체를, 당사슬 부가 이성체의 분리가 보다 우수한 크로마토그래피 담체로서 선택할 수 있다.
선택한 크로마토그래피 담체에 의한 당사슬 부가 이성체의 분리 제거의 최적화 스텝은, 부하시에 사용하는 완충액의 조성, 농도, 및 pH, 첨가하는 염의 종류 및 농도, 크로마토그래피 담체에 대한 항체 조정제물의 부하량, 세정시의 완충액의 조성, 농도, pH, 세정 횟수 및 세정액량, 용출시의 완충액의 조성, 농도, 및 pH, 첨가하는 염의 종류 및 염 농도와, 그것들의 변경 방법, 당사슬 부가 이성체의 흡착 또는 플로 스루에 의한 제거 등의 조건의 검토와 선택을 실시한다. 이들 최적화의 스텝은, 각각의 파라미터에 대하여 하나씩 최적화해 갈 수도 있고, 실험 계획법 등의 통계 해석 방법을 이용하여 복수의 파라미터의 상호 작용을 포함하여 최적 조건을 선정할 수도 있다.
항체의 정제 방법에는 다양한 스텝이 있다. 많은 항체의 정제 프로세스는 2 스텝 이상의 상이한 크로마토그래피의 모드로 실시되고 있지만, 통상, 3 스텝의 크로마토그래피를 이용하여 정제 프로세스가 구축되는 경우가 많다. 예를 들어, 프로틴 A 어피니티 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피, 믹스 모드 크로마토그래피, 소수성 상호 작용 크로마토그래피 등 중 2 종류 이상이 조합되어 이용되고 있다. 본 발명의 방법은, 이들 항체의 정제 프로세스 중의 컨벤셔널 크로마토그래피를 이용한 항체의 크로마토그래피의 어느 스텝에도 도입할 수 있다. 구체적으로는, 제 1 스텝에 프로틴 A 어피니티 크로마토그래피, 제 2 스텝에 양이온 교환 크로마토그래피, 제 3 스텝에 소수성 상호 작용 크로마토그래피를 이용한 정제 프로세스에 있어서, 제 3 스텝의 소수성 상호 작용 크로마토그래피를 본 발명의 방법으로 할 수 있다. 또한, 제 1 스텝에 프로틴 A 어피니티 크로마토그래피, 제 2 스텝에 믹스 모드 크로마토그래피, 제 3 스텝에 소수성 상호 작용 크로마토그래피를 이용한 정제 프로세스의 경우, 제 3 스텝의 소수성 상호 작용 크로마토그래피를 본 발명의 방법으로 할 수 있다. 또한, 제 1 스텝에 프로틴 A 어피니티 크로마토그래피, 제 2 스텝에 소수성 상호 작용 크로마토그래피, 제 3 스텝에 믹스 모드 크로마토그래피를 이용한 정제 프로세스의 경우, 제 2 스텝의 소수성 상호 작용 크로마토그래피를 본 발명의 방법으로 할 수 있다. 또한, 제 1 스텝에 프로틴 A 어피니티 크로마토그래피, 제 2 스텝에 음이온 교환 크로마토그래피, 제 3 스텝에 소수성 상호 작용 크로마토그래피를 이용한 정제 프로세스이면, 제 3 스텝의 소수성 상호 작용 크로마토그래피를 본 발명의 방법으로 할 수 있다. 또한, 이들 크로마토그래피의 시퀀스에 있어서, 소수성 상호 작용 크로마토그래피와 함께, 또는 소수성 상호 작용 크로마토그래피가 아니라, 믹스 모드 크로마토그래피의 스텝을 본 발명의 방법으로 해도 된다.
본 발명의 방법에 의해, 당사슬 부가 이성체는 효율적으로 제거되고, 원하는 함량까지로 저감된 양의 당사슬 부가 이성체를 포함하는 정제 항체 조성물을 제공 가능하다. 본 발명의 방법에 의해 정제 후의 정제 항체 조성물에 있어서의 당사슬 부가 이성체의 양의 전체 항체량에 대한 비율은, 10 ％ 이하로 할 수 있고, 보다 바람직하게는 5 ％ 이하, 4 ％ 이하, 3 ％ 이하, 2 ％ 이하, 1 ％ 이하, 0.5 ％ 이하, 또는 0.2 ％ 이하로 할 수 있다. 또, 정제 전의 항체 조정제물이 함유하는 당사슬 부가 이성체의 양의 전체 항체량에 대한 비율은, 50 ％ 이상, 20 ％ 이상, 10 ％ 이상, 또는 5 ％ 이상이어도 된다. 본 발명의 방법은, 당사슬 부가 이성체량이 저감된 항체를 20 ％ 이상, 40 ％ 이상, 또는 50 ％ 이상의 스텝 수율로 얻는 방법이어도 된다.
최종 정제 항체 조성물 또는 정제 후의 항체 조성물에 있어서의, 당사슬 부가 이성체의 함유량과 함유 비율, 및 정제 수율은, 전술한 크로마토그래피의 파라미터를 조정함으로써 달성할 수 있고, 바람직하게는 당사슬 부가 이성체가 임의의 양까지 저감되어, 항체의 생산에 허용 가능한 정제 수율이 얻어지도록 최적화된다.
당사슬 부가 이성체의 제거 상황의 확인은, 분석 평가용의 고속 액체 크로마토그래피 (HPLC : High Performance Liquid Chromatography) 또는 초고속 액체 크로마토그래피 (UHPLC : Ultra High Performance Liquid Chromatography) 에 의해 실시할 수 있다. 이들 분석에는, 평균 입자경이 15 ㎛ 이하의 담체가 사용되고, 초고유속 또한 초고압에서의 크로마토그래피에 의해 당사슬 부가 이성체의 분리가 가능하다. 예를 들면, TSKgel Butyl-NPR 칼럼 (평균 입자경 2.5 ㎛, 토소사), TSKgel Phenyl-5PR 칼럼 (평균 입자경 10 또는 13 ㎛, 토소사), TSKgel Ether-5PW 칼럼 (평균 입자경 10 ㎛, 토소사), TSKgel BioAssist Phenyl 칼럼 (평균 입자경 10 ㎛, 토소사), Protein-Pak Hi Res HIC 칼럼 (Waters 사), BioPro HIC 칼럼 (평균 입자경 2.3 또는 4 ㎛, 와이엠시사), Proteomix HIC 칼럼 (평균 입자경 1.7 또는 5 ㎛, 엠에스 기기사), AdvanceBio HIC 칼럼 (평균 입자경 3.5 ㎛, Agilent 사), MAbPac HIC-10LC 칼럼 (평균 입자경 5 ㎛, Thermo Fisher 사), MAbPac HIC-20LC 칼럼 (평균 입자경 5 ㎛, Thermo Fisher 사), MAbPac HIC-Butyl LC 칼럼 (평균 입자경 5 ㎛, Thermo Fisher사), Shim-pack Bio-HIC 칼럼 (평균 입자경 4 ㎛, 시마즈 제작소사), Shodex HIC PH-814 (평균 입자경 10 ㎛, 쇼코 통상사), COSMOSIL HIC (평균 입자경 5 ㎛, nacalai tesque 사) 등이 적합하다.
본 발명의 방법에 의해 정제된 정제 항체 조성물은, 항체 의약품의 활성 성분으로서, 인간 및 동물에 있어서의 다양한 질환의 치료약, 예방약 또는 진단약으로서 사용할 수 있다.
이하에 실시예를 사용하여 본 발명을 보다 상세하게 설명하지만, 이것은 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
실시예 1
항체의 당사슬 부가 콘센서스 영역 이외에 당사슬이 결합한 항체 조정제물 (배양 상청) 의 조제와 조성비의 평가
당사슬 부가 항체로서, 국제 공개 제2014/054820호에 기재된, H 사슬 및 L 사슬 (본원에 있어서의 H 사슬 : 서열 번호 64, L 사슬 : 서열 번호 72) 을 갖는 인간화 항인간 DLK-1 모노클로날 항체 (이하, 「항 hDLK-1 항체」라고 한다) 를 사용하였다. 이 항체는, 그 경사슬의 가변 영역에 당사슬 부가 콘센서스 서열을 갖기 때문에, 동물 세포 등에 이 유전자를 발현시킨 경우, 당사슬 부가 이성체를 포함하는 당사슬 조성물이 생성·혼입될 가능성이 있다.
항 hDLK-1 항체의 아미노산 서열을 코드하는 유전자를 갖는 발현 벡터로 CHO 세포 DG44 주를 형질 전환하여, 안정 발현 세포주 풀 DGC8-R-T11-14.2d 를 조제하였다. 이 세포주 풀을 이용하여, 1 L 스케일의 DASGIP (등록상표) Parallel Bioreactor System (Eppendorf 사 제조) 바이오리액터로 배양을 실시하였다. 배양은 무혈청의 완전 화학 합성 배지를 사용하여, 13 일간의 유가 배양법에 의해 pH 7, 34 ℃ ∼ 37 ℃ 의 조건으로 실시하였다. 이 배양 상청을 Protein A 크로마토그래피 (MabSelect SuRe 담체 (Cytiva 사)) 로 정제하여, 항체 조성물을 얻었다.
<항체 조성물의 HIC-HPLC 분석>
얻어진 항체 조성물을 이하의 조건으로 HIC-HPLC 분석을 실시하였다.
HPLC 장치 : Prominence HPLC System (시마즈 제작소)
분석 칼럼 : TSKgel Butyl-NPR 칼럼 (토소, 0014947 ; 4.6 mm×3.5 cm, 평균 입자경 2.5 ㎛)
이동상 A : 2.3 M 황산암모늄을 함유하는 0.1 M 인산나트륨 완충액 (pH 7.0)
이동상 B : 0.1 M 인산나트륨 완충액 (pH 7.0)
분석 조건 : 단백질 농도 2 mg/mL×10 μL 주입, 그래디언트 0 ∼ 3 분 ; 0 ％ B, 3 ∼ 15 분 ; 0 ∼ 100 ％ B, 15 ∼ 20 분 ; 100 ％ B, 유속 0.5 mL/min, 검출 파장 220 nm 또는 280 nm
도 1 에 나타내는 바와 같이, 3 개의 피크가 분리되어, 13 분 부근의 용출 시간에 메인 피크 (피크 3), 12.5 분 및 12.0 분 부근의 용출 시간에 각각 피크 2 및 피크 1 이 검출되었다. 피크 3 은 당사슬 부가 콘센서스 영역에만 당사슬이 결합한 항체, 피크 2 는 피크 3 의 항체에 당사슬이 다른 1 군데 결합한 당사슬 부가 이성체, 피크 1 은 피크 3 의 항체에 당사슬이 다른 2 군데 결합한 당사슬 부가 이성체라고 생각되었다 (실시예 2 참조). 이 분석 결과로부터, 상기 풀주 세포를 배양하여 얻어진 항체 조정제물에는, 당사슬 부가 이성체가 약 10 ％ 포함되어 있는 것이 확인되었다.
실시예 2
항체의 당사슬 부가 콘센서스 영역 이외에 당사슬이 결합한 항체 조정제물의 조제 (배양 상청) 와 당사슬 부가 상황의 확인
항 hDLK-1 항체의 중사슬 및 경사슬의 아미노산 서열을 코드하는 유전자 서열을 갖는 발현 벡터 (pFUSE), 및 동 항체의 경사슬의 당사슬 결합 콘센서스 서열 (Asn-Ser-Ser) 의 3 개째의 아미노산에 점변이를 넣은 변이 서열 (Asn-Ser-Ala) 및 중사슬의 아미노산 서열을 코드하는 발현 벡터 (pFUSE) 를 사용하여, 각각 ExpiCHO 세포를 형질 전환하고 항체 단백질의 일과성 발현을 실시하였다. 그 배양 상청을 Protein A 어피니티 크로마토그래피로 정제하고, 얻어진 항체 조정제물을 펩티드-N-글리코시다제 F (PNGase F) 처리, 또는 PNGase F 비처리 후, 환원 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동 (SDS-PAGE) (은 염색) 으로 분석하였다. 변이 전의 항 hDLK-1 항체를 NSS 항체, 및 경사슬의 당사슬 결합 콘센서스 서열 변이 후의 항 hDLK-1 항체를 NSA 항체로 표시한다.
그 결과, 도 2 에 나타낸 바와 같이, NSS 항체에 있어서, PNGase F 로 처리하지 않은 조건에서는 25 kDa 의 경사슬 밴드 상에 25 kDa 보다 큰 분자량을 갖는 밴드를 볼 수 있었지만, PNGase F 의 처리에 의해 그 밴드가 소실되었다. 이것으로부터, NSS 항체에는 항체의 당사슬 부가 콘센서스 영역 이외의 콘센서스 서열을 갖는 경사슬에 당사슬이 결합하고 있는 것이 확인되었다. 한편, NSA 에 있어서 PNGase F 의 처리의 유무에 관계없이 그 밴드를 볼 수 없었다. 이들 결과로부터, 일과성 발현 유래의 인간화 항 DLK-1 모노클로날 항체 (NSS 항체) 의 조정제물에는 경사슬에도 당사슬이 부가된 당사슬 부가 이성체가 포함되는 것을 알 수 있었다.
실시예 3
소수성 상호 작용 크로마토그래피 담체에 의한 당사슬 부가 이성체의 분리 1
실시예 1 과 동일하게 하여, 제조한 항 hDLK-1 항체를 포함하는 배양 상청을 Protein A 어피니티 크로마토그래피로 정제하고, 당사슬 부가 이성체를 약 10 ％ 포함하는 동 항체의 조정제물을 얻었다. 이 항체 조정제물에 최종 농도 1.0 M 이 되도록 염화나트륨을 첨가한 후, pH 5.0 으로 조정하여 크로마토그래피 담체에 대한 부하용 시료로 하였다.
당해 항체 조정제물을 사용하여, Capto Butyl (평균 입자경 90 ㎛, Cytiva 사 제조) 을 충전한 소수성 상호 작용 크로마토그래피 칼럼 (담체 용량 5 mL) 에의 흡착 특성을 흡착-탈착 모드로 평가하였다. 칼럼에 대한 시료의 부하량은 담체당 단백질량으로서 15 mg/mL 로 하고, 유속은 300 cm/h 로 하였다. 이하의 이동상의 조건으로 크로마토그래피를 실시하였다.
이동상 A : 1 M 염화나트륨을 함유하는 20 mM 시트르산나트륨-15 mM Tris 완충액 (pH 5.0)
이동상 B : 20 mM 시트르산나트륨-15 mM Tris 완충액 (pH 5.0)
1. 평형화 : 100 ％ 이동상 A ; 10 칼럼 용량 (CV)
2. 부하 : 항체 조정제물의 시료
3. 세정 : 100 ％ 이동상 A ; 10 CV
4. 선형 그래디언트 용출 : 40 CV 로 0 ％ 이동상 B 에서 100 ％ 이동상 B 까지
5. 칼럼 세정 : 1 M 수산화나트륨 ; 5 CV
도 3 에 용출 크로마토그램 (HIC389) 을 나타낸다. 이 결과로부터, Capto Butyl 담체를 사용한 선형 그래디언트의 조건에서 담체에 대한 항체 성분의 흡착이 인정되었다. 칼럼에 대한 부하 시료, Capto Butyl 칼럼으로부터의 플로 스루 획분 및 동 칼럼에 대한 흡착 획분에 대하여, 실시예 1 의 HIC-HPLC 분석법으로 평가한 결과를 도 4 에 나타낸다. 부하 시료 중에 2.1 ％ (Peak 1) 및 12.1 ％ (Peak 2) 포함되는 당사슬 부가 이성체는 플로 스루 획분 (HIC389 Flow-through) 으로 제거되고, 칼럼의 흡착 획분 (HIC389 Elutte) 에는 당사슬 부가 이성체가 제거된 순도 100 ％ 의 항체 (당사슬 부가 콘센서스 영역 이외에 당사슬이 부가되어 있지 않은 항체) (Peak 3) 조성물이 얻어졌다.
이상의 결과로부터, 소수성 상호 작용 크로마토그래피 담체 (Capto Butyl) 를 사용함으로써, 당사슬 부가 이성체를 분리 가능한 것을 알 수 있었다. 선정된 크로마토그래피 담체를 사용하면, 당사슬 부가 이성체가 효율적으로 플로 스루 획분으로 제거되고, 흡착 획분에 고순도의 정제 항체 조성물이 얻어지는 것을 알 수 있었다.
실시예 4
소수성 상호 작용 크로마토그래피 담체에 의한 당사슬 부가 이성체의 분리 2
실시예 1 과 동일하게 하여, 조제한 인간화 항인간 DLK-1 모노클로날 항체를 포함하는 배양 상청을 Protein A 어피니티 크로마토그래피로 정제하여, 당사슬 부가 이성체를 약 10 ％ 포함하는 동 항체의 조정제물을 얻었다. 이 항체 조정제물에 최종 농도 1.0 M 이 되도록 염화나트륨을 첨가한 후, pH 를 4.5, 4.7 또는 5.0 으로, 도전율을 70 mS/cm 이하로 하여, 크로마토그래피 담체에 대한 부하용 시료로 하였다.
당해 항체 조정제물을 사용하여, Capto Butyl (평균 입자경 90 ㎛, Cytiva 사 제조) 및 POROS Benzyl Ultra (평균 입자경 50 ㎛, Thermo Fisher 사 제조) 의 각각의 소수성 상호 작용 크로마토그래피 칼럼 (담체 용량 5 mL) 에 대한 흡착 특성을 흡착-탈착 모드로 평가하였다. 각 칼럼에 대한 단백질 시료의 부하량은 담체당 단백질량으로서 20 mg/mL 로 실시하고, 유속은 300 cm/h 로 하였다. 이하의 이동상의 조건으로 크로마토그래피를 실시하였다.
이동상 A : 1 M 염화나트륨을 함유하는 20 mM 시트르산나트륨 완충액 (pH 4.5, 4.7, 또는 5.0)
이동상 B : 20 mM 시트르산나트륨 완충액 (pH 4.5, 4.7, 또는 5.0)
1. 평형화 : 100 ％ 이동상 A ; 5 CV
2. 부하 : 시료 용액
3. 세정 : 100 ％ 이동상 A ; 8 CV
4. 세정 1 : 100 ％ 이동상 A ; 5 CV
5. 세정 2 : 100 ％ 이동상 B＋0.8 M 염화나트륨 ; 5 CV
6. 용출 : 100 ％ 이동상 B ; 10 CV
7. 칼럼 세정 : 물 (적당량)
8. 칼럼 세정 : 1 M 수산화나트륨 (적당량)
Capto Butyl 과 POROS Benzyl Ultra 의 용출 크로마토그램을, 각각 도 5a 및 도 5b 에 나타낸다. 어느 pH 조건에서도, 항체 조성물은 Capto Butyl 담체에 흡착되고, 그 후 용출 가능하였다. POROS Benzyl Ultra 에 대해서도 양호한 흡착과 용출이 확인되었다. 구체적으로는, 도 5a 및 도 5b 의 그래프에 있어서, 가로축 0 ∼ 50 mL 부근의 피크는 흡착되지 않고 칼럼으로부터 그대로 통과되어 용출된 항체 (당사슬 부가 이성체) 이고, 50 ∼ 300 mL 의 피크로서 용출된 항체는 당사슬 부가 콘센서스 영역 이외에 당사슬이 부가되어 있지 않은 항체가 칼럼으로부터 서서히 용출되고 있는 것을 나타낸다. Capto Butyl 에서는, pH 에 관계없이 세정/용출의 전역에 걸쳐서 항체가 용출되고 있고, 용출의 중간층을 회수함으로써 당사슬 부가 콘센서스 영역 이외에 당사슬이 부가되어 있지 않은 항체를 고순도로 얻을 수 있는 것이 나타났다. 또한, Poros Benzyl Ultra 에서는, pH 에 따라 피크가 변동하는 (pH 4.5 에서는 항체가 잘 흡착되어 용출 후반에 칼럼으로부터 용출되지만, pH 5.0 에서는 80 ％ 정도가 흡착되지 않고 세정 중에 항체가 용출되는) 점에서, pH 에 따라서 용출 성분을 컨트롤 가능하다는 것이 나타났다. 이상의 결과로부터, Capto Butyl 및 POROS Benzyl Ultra 의 어느 것을 사용해도 당사슬 부가 이성체를 분리 가능한 점에서, 소수성 상호 작용 크로마토그래피 담체를 사용한 당사슬 부가 이성체의 분리가 가능하다는 것이 나타났다. 또한, 이 결과로부터, 소수성 상호 작용 크로마토그래피에 있어서, 세정/용출액의 pH, 염 농도 및 액량을 최적화함으로써, 항체 조성물을 흡착할 수 있고, 당사슬 부가 이성체의 제거를 달성할 수 있다는 것이 나타났다.
실시예 5
소수성 상호 작용 크로마토그래피 담체에 있어서의, 부하시의 염 농도, 세정시의 염 농도 및 pH, 용출 완충액의 종류에 따른, 당사슬 부가 이성체의 제거 효율 (순도 및 수율) 의 검토
Capto Butyl 과 POROS Benzyl Ultra 크로마토그래피 담체에 대하여, 단계적 용출에 의해 당사슬 부가 이성체가 제거 가능한지 여부를 검토하였다. 부하액으로는 Protein A 어피니티 크로마토그래피로 정제한 실시예 1 의 항체 조정제물을 0.5 M Tris 에 의해 pH 4.5 또는 pH 5.0 으로 조정한 것을 사용하였다. 파라미터로서, 시료 부하액의 염 농도, 세정액 (세정액 I, 세정액 II) 의 pH 및 염 농도, 그리고 용출 완충액의 종류 및 pH 를 검토하여, 항체의 수율 및 정제 분획의 비당사슬 부가 이성체 항체 순도 (당사슬 부가 콘센서스 영역 이외에 당사슬이 부가되어 있지 않은 항체의 순도) (HIC-HPLC 분석법에 의한 당사슬 부가 이성체의 함량) 를 측정하였다. 시험 결과를 표 3 에 나타낸다.
각 조건에서 실시한 Capto Butyl 담체에 의한 정제 수율은 23 ％ ∼ 73 ％ 이고, HIC-HPLC 분석에 의한 정제 항체 조성물의 순도 (당사슬 부가 이성체를 포함하지 않는 항체 성분) 는 97.1 ％ ∼ 99.3 ％ 였다. 한편, POROS Benzyl Ultra 담체의 정제 수율은 다소 낮지만 (33 ％ ∼ 67 ％), HIC-HPLC 분석에 의한 정제 항체 조성물의 순도는 모두 100 ％ 였다. 특히, POROS Benzyl Ultra 담체를 사용한 조건에 있어서, 0.8 M 염화나트륨을 함유하는 시료를 부하하여, 0.8 M 염화나트륨을 함유하는 세정액 I, 0.6 M 염화나트륨을 함유하는 세정액 II 의 순으로 세정하고, pH 6 의 시트르산나트륨 완충액으로 용출하는 조건이, 순도 및 수율의 관점에서 최적이었다.
또한, 일련의 시험의 결과, 이하의 것이 분명해졌다.
(i) 세정액 (세정액 I 및/또는 세정액 II) 의 pH 를 높이면 순도가 향상된다.
(ii) 세정액 (세정액 I 및/또는 세정액 II) 의 pH 를 높이면 수율이 저하된다.
(iii) 용출액의 pH 를 높이면 순도가 향상된다.
(iv) 용출액의 pH 를 높이면 수율이 저하된다.
(v) 부하액 및/또는 세정액의 염 농도를 낮추면 수율이 저하된다.
(vi) 항체 조성물의 순도로서 95 ％ 이상, 이상적으로는 99 ％ 이상을 달성 가능한 조건을 설정할 수 있다.
이상의 결과가 나타내는 바와 같이, 소수성 상호 작용 크로마토그래피 담체 (예를 들면, Capto Butyl 과 POROS Benzyl Ultra) 에 있어서, 부하액의 염 농도 및 pH, 세정액의 염 농도 및 pH, 세정액량, 세정 회수, 용출시의 pH 및 완충액의 종류를 최적화함으로써, 수율 및 당사슬 부가 이성체의 혼입량을 최적화할 수 있는 것을 알 수 있었다.
실시예 6
당사슬 부가 이성체의 혼입률 및 목적 물질의 순도 및 수율을 제어하기 위한 세정 조건의 최적화
실시예 1 과 동일하게 하여, 제조한 항 hDLK-1 항체를 포함하는 배양 상청을 Protein A 어피니티 크로마토그래피로 정제하여, 당사슬 부가 이성체를 약 10 ％ 포함하는 동 항체의 조정제물을 얻었다. 이 항체 조정제물에 최종 농도 1.0 M 이 되도록 염화나트륨을 첨가한 후, pH 및 도전율을 적절히 조정하여, 크로마토그래피 담체에 대한 부하용 시료로 하였다. 당해 항체 조정제물을 사용하고, POROS Benzyl Ultra 담체를 사용해서, 시료의 부하량, 세정액 I 및 세정액 II 의 액량을 인풋 파라미터로 하여, 아웃풋 파라미터인 수율 및 HIC-HPLC 분석에 의한 순도를 평가하였다.
그 결과, 크로마토그래피 담체 단위량당 단백질 부하량을 25 g/L 이상, 세정액 I 및 세정액 II 를 5 ∼ 15 칼럼 용량 (CV) 으로 조정함으로써, 97 ∼ 100 ％ 의 순도로 수율을 40 ∼ 80 ％ 로 제어할 수 있음을 알 수 있었다 (표 4). 특히, 단백질의 부하량은 25 g/L 보다도 30 g/L 또는 35 g/L 쪽이 얻어지는 정제 항체 조성물의 순도가 높은 경향이 있었다. 또한, 세정액량을 증대시킴으로써, 얻어지는 정제 항체 조성물의 수율은 저하되지만 순도가 향상되는 경향이 있었다. 이 결과는, 단백질의 부하량이 낮은 조건에서는, 세정액량을 늘림으로써, 정제 항체 조성물의 순도를 높일 수 있음을 나타낸다.
즉, 이 결과로부터, 크로마토그래피에 있어서의 단백질 부하량을 일정 이상으로 하는 것, 및/또는 세정액량을 적절하게 관리함으로써, 당사슬 부가 이성체의 함유량을 약 10 ％ 에서 3 ∼ 0 ％ 의 범위로 저감하여 관리할 수 있음이 분명해졌다. 실험 계획법 (DoE : Design of Experiment) 에 의해 당해 결과를 해석한 결과를 도 6 에 나타낸다. 세정액 I 및 세정액 II 의 액량과 수율 및 순도에 대한 영향이 등고선도로서 표현되어, 임의의 수율 및 순도를 세정액량으로 관리할 수 있음이 분명해졌다.
실시예 7
정제 프로세스 내의 당사슬 부가 이성체의 제거 스텝의 위치, 및 세정액량의 순도에 대한 영향
실시예 1 과 동일하게 하여 조제한 항 hDLK-1 항체를 포함하는 배양 상청을 Protein A 어피니티 크로마토그래피로 정제하여, 당사슬 부가 이성체를 약 10 ％ 포함하는 동 항체의 조정제물을 얻었다. 이 항체 조정제물을 pH 3 ∼ 4 로 일정 시간 유지하여, 중화시킨 것을 크로마토그래피 담체에 대한 부하용 시료로 하였다.
이 항체 조정제물에 대해서, 도 7 에 나타내는 2 종류의 플로우로 소수성 상호 작용 크로마토그래피 후에 믹스 모드 크로마토그래피, 또는 믹스 모드 크로마토그래피 후에 소수성 상호 작용 크로마토그래피의 순으로 정제하였다. 소수성 상호 작용 크로마토그래피 담체는 POROS Benzyl Ultra, 믹스 모드 크로마토그래피 담체는 Capto MMC 를 사용하였다. 소수성 상호 작용 크로마토그래피의 조건은 이하와 같이 하였다. ID No.HIC446, HIC457, 및 HIC463 은, 소수 크로마토그래피 후에 믹스 모드 크로마토그래피를 실시하고, ID No.HIC447 은 믹스 모드 크로마토그래피 후에 소수 크로마토그래피를 실시하였다.
<소수성 상호 작용 크로마토그래피의 조건>
담체 : POROS Benzyl Ultra
칼럼 사이즈 : 260 mL, 베드 높이 13.3 cm
유속 : 300 cm/h
담체당 단백질 부하량 : 30 g/L
크로마토그래피 조건 :
1. 평형화 : 0.8 M 염화나트륨을 함유하는 20 mM 시트르산나트륨 (pH 5.0) ; 5 CV
2. 부하 : 항체 조정제물의 시료
3. 세정 1 : 0.8 M 염화나트륨을 함유하는 20 mM 시트르산나트륨 (pH 5.0) ; 6 CV (HIC446/HIC447), 8 CV (HIC457), 또는 15 CV (HIC463)
4. 세정 2 : 0.6 M 염화나트륨을 함유하는 20 mM 시트르산나트륨 (pH 5.0) ; 5 CV
5. 용출 : 20 mM 시트르산나트륨 (pH 6.0) ; 6.3 CV
6. 칼럼 세정 : 1 M 수산화나트륨 수용액 ; 3 CV
소수성 상호 작용 크로마토그래피의 스텝에서 얻어진 정제 항체 조성물의 수율 및 순도를 표 5 및 도 8 에 나타낸다. 어느 정제 플로우에 있어서도, 수율은 60 ％ 이상이고, HIC-HPLC 분석에 의한 순도 (당사슬 부가 이성체의 혼입량을 나타낸다) 는 99 ％ 이상이 얻어졌다. 또, 세정 1 의 액량 (6 ∼ 15 CV) 에 따라서, 수율 및 순도를 제어할 수 있음이 분명해졌다. 즉, 항체의 순도 약 90 ％ 의 조성물은 5 CV 의 세정에서는 98 ％ 정도, 8 CV 의 세정에서는 99 ％ 정도, 15 CV 의 세정에서는 99.5 ％ 정도로 향상되는 것을 알 수 있었다.
실시예 8
당사슬 부가 이성체의 제거 스텝을 포함하는 정제 프로세스 (POROS Benzyl Ultra)
실시예 1 과 동일하게 하여 조제한 항 hDLK-1 항체를 포함하는 배양 상청을 약 200 L 얻었다. 당사슬 부가 이성체가 항체 조정제물 중에 약 10 ％ 포함되는 것을 확인하였다.
배양 상청을 여과하고, Protein A 어피니티 크로마토그래피 (MabSelect SuRe 10L ; Cytiva 사), 저 pH 바이러스 불활성화, POROS Benzyl Ultra 담체 (Thermo Fisher 사, 10 L) 를 사용한 소수성 상호 작용 크로마토그래피, Capto adhere 담체 (Cytiva 사, 10 L) 를 사용한 믹스 모드 크로마토그래피, 바이러스 여과, 탄젠셜 플로우 여과 (TFF) 에 의한 처방 완충액으로의 치환, 멸균 여과 등의 공정을 거쳐 고순도의 정제 항체 조성물을 얻었다.
POROS Benzyl Ultra 크로마토그래피는 담체 단위량당 단백질 부하량을 35 g/L, 30 g/L, 16 g/L 로 조정하여, 3 회의 크로마토그래피를 실시하였다. POROS Benzyl Ultra 크로마토그래피 스텝의 조건 및 POROS Benzyl Ultra 크로마토그래피 스텝의 결과를, 각각 표 6 및 표 7 에 나타낸다.
Figure pct00006
Figure pct00007
Run1 및 Run2 의 부하량은 규정량 이상의 적절한 범위 내였지만, Run3 의 부하량은 16 g/L 로 낮은 조건이었다. 그 결과, 수율은 77 ％ 가 되었지만 당사슬 부가 이성체 혼입량을 나타내는 HIC-HPLC 순도는 89.74 ％ 로 낮은 값이 얻어졌다. 그 때문에, Run1 및 Run2 의 분획액만을 통합하여, 다음의 크로마토그래피 스텝에 제공하였다.
전체 스텝을 거쳐 최종적으로 얻어진 정제 항체 조성물은 46 ％ 의 총 수율이었다. 또한, HIC-HPLC 분석에 의한 정제 항체 조성물의 순도는 100 ％ 이며, 당사슬 부가 이성체는 포함되어 있지 않았다. 이와 같이, 항체의 크로마토그래피 조건하에 있어서도, 당사슬 부가 이성체를 충분히 저감한 정제 항체 조성물을 얻는 것이 가능하였다. 또한, 크로마토그래피 담체에 대한 단백질 부하량이 당사슬 부가 이성체의 제거율에 중요하다는 것도 나타났다.
실시예 9
당사슬 부가 이성체의 제거 스텝을 포함하는 정제 프로세스 (Capto Butyl)
실시예 1 과 동일하게 하여 조제한 항 hDLK-1 항체를 포함하는 배양 상청을 얻었다. 당사슬 부가 이성체가 항체 조정제물 중에 약 10 ％ 포함되는 것을 확인하였다.
이 배양액을 사용하여 Protein A 어피니티 크로마토그래피 스텝 (담체 : MabSelect SuRe), 저 pH 바이러스 불활성화 스텝, 소수성 상호 작용 크로마토그래피 스텝 (Capto Butyl 담체), 믹스 모드 크로마토그래피 스텝 (Capto adhere) 의 순으로 정제하였다.
표 8 에 나타내는 결과와 같이, 소수성 크로마토그래피 스텝에 의해 당사슬 부가 이성체의 비함유율을 순도 99.8 ％ 까지 향상시키고, 정제 항체 조성물을 총 수율 25 ％ 로 취득할 수 있었다.
이 결과에 나타낸 바와 같이, POROS Benzyl Ultra 담체 이외의 소수성 상호 작용 크로마토그래피 담체를 사용해도 고순도의 정제 항체 조성물이 얻어지는 것을 알 수 있었다.
Figure pct00008
실시예 10
당사슬 부가 이성체의 분취 및 생물 활성의 측정
실시예 1 과 동일하게 하여 취득한 당사슬 부가 이성체를 약 10 ％ 포함하는 항 hDLK-1 항체 조정제물에 대하여, 실시예 1 에 기재한 HIC-HPLC 분석계를 사용하여 각 피크를 정밀하게 분취하였다. 분취는 약 10 회로 나누어 실시하고, 각 피크를 통합한 후, 등장 인산 완충액으로 완충액 교환하였다. 또한, 분취에 사용한 HIC-HPLC 의 이동상의 조건은 이하로 변경하였다.
이동상 A : 2.3 M 황산암모늄을 함유하는 50 mM 인산 완충액, pH 7
이동상 B : 50 mM 인산 완충액, pH 7
분취 전의 항체 조정제물 (a), 분취 후의 정제 항체 조성물 (b, c) 에 대해, 실시예 1 에 나타낸 HIC-HPLC 를 사용하여 분석한 결과를 도 9 에 나타낸다.
이들 시료에 대하여, 10 μg/mL 로부터 3 배 공비로 희석하고, ADCC Reporter Bioassay 키트 (Promega, G7010) 에 의해 E : T 비율 6 : 1 (타깃 세포는 DLK1 을 고발현하는 HEK293 세포주), 반응 시간 6 시간의 조건으로 ADCC 활성을 측정하였다. 그 결과를 도 10 에 나타낸다. 분취 전의 항체 조정제물 및 분취 후의 메인 피크 (도 9 에 있어서의 (b)) 는 거의 동일한 시그모이드 곡선이 얻어져, 동일한 생물 활성을 갖는 것이 확인되었다. 한편, 분취에 의해 단리된 당사슬 부가 이성체 (도 9 에 있어서의 (c)) 는, 어느 농도에 있어서도 시그널이 거의 얻어지지 않아, 생물 활성이 없는 것을 알 수 있었다. 이 결과로부터, 당사슬 부가 이성체는 불순물로, 바이오 의약품의 성분으로서 가능한 한 제거할 필요가 있는 성분임이 확인되었다.
본 발명에 의해, Fc 영역 당사슬 결합 콘센서스 영역 이외의 당사슬 부가 이성체가 저감된 정제 항체 조성물을 조제하여 이용할 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> CHIOME Bioscience Inc. <120> Purification method of antibody composition <130> G2920WO <150> JP 2021-079977 <151> 2021-05-10 <160> 78 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 420 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Recombinant DNA <220> <221> CDS <222> (1)..(420) <400> 1 atg ggt tgg agc tgt atc atc ttc ttt ctg gta gca aca gct aca ggc 48 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Phe Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 gtg cac tcc caa gtc cag ctg gtg cag tct ggg gct gaa gtg aag aag 96 Val His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 cct ggg gcc tca gtg aaa gtc tcc tgc aag gct tcc ggc tac aca ttc 144 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 act gat tat gct atg cac tgg gtg cga cag gcc cct gga caa ggc ctg 192 Thr Asp Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 gag tgg att gga gtt att agt act tac tat ggt aat aca aac tac aac 240 Glu Trp Ile Gly Val Ile Ser Thr Tyr Tyr Gly Asn Thr Asn Tyr Asn 65 70 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Ser Gly Thr Asp 85 90 95 ttc act ctt acc atc agc agt ctg cag gct gaa gat gtg gca gtt tac 336 Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr 100 105 110 tac tgt cag caa cat tat agc act cct ccc aca ttc ggt cag ggg acc 384 Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr 115 120 125 aag ctg gag atc aaa 399 Lys Leu Glu Ile Lys 130 <210> 10 <211> 133 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 10 Met Glu Ser Gln Thr Gln Val Leu Met Phe Leu Leu Leu Trp Val Ser 1 5 10 15 Gly Ala Cys Ala Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala 20 25 30 Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser 35 40 45 Leu Leu Asn Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln 50 55 60 Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Val Tyr Phe Ala Ser Thr Arg 65 70 75 80 Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 85 90 95 Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr 100 105 110 Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr 115 120 125 Lys Leu Glu Ile Lys 130 <210> 11 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Recombinant DNA <220> <221> CDS <222> (1)..(339) <400> 11 gac att gtc atg aca cag tct cca gac tcc ctg gct gtg tca ctg gga 48 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 gag agg gcc act atc aac tgc aag tcc agt cag agc ctt ctg aat agt 96 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30 agc aat caa aag aac tat ttg gcc tgg tac cag cag aaa cca gga cag 144 Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 cct cct aaa ctt ctg gtc tac ttt gca tcc act agg gaa tct ggg gtc 192 Pro Pro Lys Leu Leu Val Tyr Phe Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 cct gat cgc ttc agt ggc agt gga tct ggg aca gat ttc act ctt acc 240 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 atc agc agt ctg cag gct gaa gat gtg gca gtt tac tac tgt cag caa 288 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 cat tat agc act cct ccc aca ttc ggt cag ggg acc aag ctg gag atc 336 His Tyr Ser Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 aaa 339 Lys <210> 12 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 12 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30 Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Val Tyr Phe Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 His Tyr Ser Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys <210> 13 <211> 420 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Recombinant DNA <220> <221> CDS <222> (1)..(420) <400> 13 atg ggt tgg agc tgt atc atc ttc ttt ctg gta gca aca gct aca ggc 48 Met Gly Trp Ser Cys 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Leu Arg Glu Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp 115 120 125 tac tgg ggt caa gga acc atg gtc acc gtc tcc tca 420 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 130 135 140 <210> 14 <211> 140 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 14 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Phe Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Asp Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Val Ile Ser Thr Tyr Tyr Gly Asn Thr Asn Tyr Asn 65 70 75 80 Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Met Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Leu Arg Glu Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp 115 120 125 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 130 135 140 <210> 15 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Recombinant DNA <220> <221> CDS <222> 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100 105 110 caa gga acc atg gtc acc gtc tcc tca 363 Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 16 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 16 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Val Ile Ser Thr Tyr Tyr Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Met Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Leu Arg Glu Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 17 <211> 420 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Recombinant DNA <220> <221> CDS <222> (1)..(420) <400> 17 atg ggt tgg agc tgt atc atc ttc ttt ctg gta gca aca gct aca ggc 48 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Phe Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 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tac tgg ggt caa gga acc atg gtc acc gtc tcc tca 420 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 130 135 140 <210> 18 <211> 140 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 18 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Phe Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Asp Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Val Ile Ser Thr Tyr Tyr Gly Asn Thr Asn Tyr Asn 65 70 75 80 Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Leu Arg Glu Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp 115 120 125 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 130 135 140 <210> 19 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Recombinant DNA <220> <221> CDS <222> (1)..(363) <400> 19 caa gtc cag ctg gtg cag tct ggg gct gaa gtg aag aag cct ggg gcc 48 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 tca gtg aaa gtc tcc tgc aag gct tcc ggc tac aca ttc act gat tat 96 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 gct atg cac tgg gtg cga cag gcc cct gga caa ggc ctg gag tgg att 144 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 gga gtt att agt act tac tat ggt aat aca aac tac aac cag aag ttt 192 Gly Val Ile Ser Thr Tyr Tyr Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 aag ggc aag gcc aca atg act gtc gac aaa tcc acc agc aca gcc tat 240 Lys Gly Lys Ala Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 atg gaa ctt agg agc ttg aga tct gac gat act gcc gtg tat tac tgt 288 Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 gca aga gga gga ttg cga gag tat tac tat gct atg gac tac tgg ggt 336 Ala Arg Gly Gly Leu Arg Glu Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 caa gga acc atg gtc acc gtc tcc tca 363 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Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 cct ggg gcc tca gtg aaa gtc tcc tgc aag ggt tcc ggc tac aca ttc 144 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 act gat tat gct atg cac tgg gtg cga cag gcc cct gga caa ggc ctg 192 Thr Asp Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 gag tgg att gga gtt att agt act tac tat ggt aat aca aac tac aac 240 Glu Trp Ile Gly Val Ile Ser Thr Tyr Tyr Gly Asn Thr Asn Tyr Asn 65 70 75 80 cag aag ttt aag ggc cga gcc aca atg act gtc gac aca tcc acc agc 288 Gln Lys Phe Lys Gly Arg Ala Thr Met Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser 85 90 95 aca gcc tat atg gaa ctt agg agc ttg aga tct gac gat act gcc gtg 336 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val 100 105 110 tat tac tgt gca aga gga gga ttg cga gag tat tac tat gct atg gac 384 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Leu Arg Glu Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp 115 120 125 tac tgg ggt caa gga acc atg gtc acc gtc tcc tca 420 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 130 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Synthetic Construct <400> 28 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Val Ile Ser Thr Tyr Tyr Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Ala Thr Met Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Leu Arg Glu Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 29 <211> 420 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Recombinant DNA <220> <221> CDS <222> (1)..(420) <400> 29 atg ggt tgg agc tgt atc atc ttc ttt ctg gta gca aca gct aca ggc 48 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Phe Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 gtg cac tcc caa gtc cag ctg gtg cag tct ggg gct gaa gtg aag aag 96 Val His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 cct ggg gcc tca gtg aaa gtc tcc tgc aag gct tcc ggc tac aca ttc 144 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 act gat tat gct atg cac tgg gtg cga cag gcc cct gga caa ggc ctg 192 Thr Asp Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 gag tgg att gga gtt att agt act tac tat ggt aat aca aac tac aac 240 Glu Trp Ile Gly Val Ile Ser Thr Tyr Tyr Gly Asn Thr Asn Tyr Asn 65 70 75 80 cag aag ttt aag ggc cga gcc aca atg act gtc gac aaa tcc acc agc 288 Gln Lys Phe Lys Gly Arg Ala Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser 85 90 95 aca gcc tat atg gaa ctt agg agc ttg aga tct gac gat act gcc gtg 336 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val 100 105 110 tat tac tgt gca aga gga gga ttg cga gag tat tac tat gct atg gac 384 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Leu Arg Glu Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp 115 120 125 tac tgg ggt caa gga acc atg gtc acc gtc tcc tca 420 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 130 135 140 <210> 30 <211> 140 <212> PRT <213> Artificial 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144 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 act gat tat gct atg cac tgg gtg cga cag gcc cct gga caa ggc ctg 192 Thr Asp Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 gag tgg att gga gtt att agt act tac tat ggt aat aca aac tac aac 240 Glu Trp Ile Gly Val Ile Ser Thr Tyr Tyr Gly Asn Thr Asn Tyr Asn 65 70 75 80 cag aag ttt aag ggc cga gcc aca atg act gtc gac aaa tcc acc agc 288 Gln Lys Phe Lys Gly Arg Ala Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser 85 90 95 aca gcc tat atg gaa ctt agg agc ttg aga tct gac gat act gcc gtg 336 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val 100 105 110 tat tac tgt gca aga gga gga ttg cga gag tat tac tat gct atg gac 384 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Leu Arg Glu Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp 115 120 125 tac tgg ggt caa gga acc atg gtc acc gtc tcc tca 420 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 130 135 140 <210> 34 <211> 140 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 34 Met Gly 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Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 gct atg cac tgg gtg cga cag gcc cct gga caa ggc ctg gag tgg att 144 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 gga gtt att agt act tac tat ggt aat aca aac tac aac cag aag ttt 192 Gly Val Ile Ser Thr Tyr Tyr Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 aag ggc cga gcc aca atg act gtc gac aaa tcc acc agc aca gcc tat 240 Lys Gly Arg Ala Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 atg gaa ctt agg agc ttg aga tct gac gat act gcc gtg tat tac tgt 288 Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 gca aga gga gga ttg cga gag tat tac tat gct atg gac tac tgg ggt 336 Ala Arg Gly Gly Leu Arg Glu Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 caa gga acc atg gtc acc gtc tcc tca 363 Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 36 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 36 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 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Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Asp Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Val Ile Ser Thr Tyr Tyr Gly Asn Thr Asn Tyr Asn 65 70 75 80 Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Leu Arg Glu Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp 115 120 125 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys 130 135 140 Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly 145 150 155 160 Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro 165 170 175 Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr 180 185 190 Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val 195 200 205 Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn 210 215 220 Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro 225 230 235 240 Lys Ser Cys Asp 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Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 gca aga gga gga ttg cga gag tat tac tat gct atg gac tac tgg ggt 336 Ala Arg Gly Gly Leu Arg Glu Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 caa gga acc atg gtc acc gtc tcc tca gcc tcc acc aag ggc cca tcg 384 Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125 gtc ttc ccc ctg gca ccc tcc tcc aag agc acc tct ggg ggc aca gcg 432 Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 130 135 140 gcc ctg ggc tgc ctg gtc aag gac tac ttc ccc gaa ccg gtg acg gtg 480 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 tcg tgg aac tca ggc gcc ctg acc agc ggc gtg cac acc ttc ccg gct 528 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 gtc cta cag tcc tca gga ctc tac tcc ctc agc agc gtg gtg acc gtg 576 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 180 185 190 ccc tcc agc agc ttg ggc acc cag acc tac atc tgc aac gtg aat cac 624 Pro Ser 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Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn 210 215 220 Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro 225 230 235 240 Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu 245 250 255 Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 260 265 270 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 275 280 285 Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 290 295 300 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn 305 310 315 320 Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp 325 330 335 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro 340 345 350 Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu 355 360 365 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn 370 375 380 Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 385 390 395 400 Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 405 410 415 Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 420 425 430 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys 435 440 445 Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 450 455 460 Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465 470 <210> 67 <211> 1356 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antibody <220> <221> CDS <222> (1)..(1356) <400> 67 caa gtc cag ctg gtg cag tct ggg gct gaa gtg aag aag cct ggg gcc 48 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 tca gtg aaa gtc tcc tgc aag ggt tcc ggc tac aca ttc act gat tat 96 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 gct atg cac tgg gtg cga cag gcc cct gga caa ggc ctg gag tgg att 144 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 gga gtt att agt act tac tat ggt aat aca aac tac aac cag aag ttt 192 Gly Val Ile Ser Thr Tyr Tyr Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 aag ggc cga gcc aca atg act gtc gac aaa tcc acc agc aca gcc tat 240 Lys Gly Arg Ala Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 atg gaa ctt agg agc ttg aga tct gac gat act gcc gtg tat tac tgt 288 Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 gca aga gga gga ttg cga gag tat tac tat gct atg gac tac tgg ggt 336 Ala Arg Gly Gly Leu Arg Glu Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 caa gga acc atg gtc acc gtc tcc tca gcc tcc acc aag ggc cca tcg 384 Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125 gtc ttc ccc ctg gca ccc tcc tcc aag agc acc tct ggg ggc aca gcg 432 Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 130 135 140 gcc ctg ggc tgc ctg gtc aag gac tac ttc ccc gaa ccg gtg acg gtg 480 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 tcg tgg aac tca ggc gcc ctg acc agc ggc gtg cac acc ttc ccg gct 528 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 gtc cta cag tcc tca gga ctc tac tcc ctc agc agc gtg gtg acc gtg 576 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 180 185 190 ccc tcc agc agc ttg ggc acc cag acc tac atc tgc aac gtg aat cac 624 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 195 200 205 aag ccc agc aac acc aag gtg gac aag aaa gtt gag ccc aaa tct tgt 672 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 210 215 220 gac aaa act cac aca tgc cca ccg tgc cca gca cct gaa ctc ctg ggg 720 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 225 230 235 240 gga ccg tca gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag gac acc ctc atg 768 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 245 250 255 atc tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc gtg gtg gtg gac gtg agc cac 816 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 260 265 270 gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag gtg 864 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 275 280 285 cat aat gcc aag aca aag ccg cgg gag gag cag tac aac agc acg tac 912 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 290 295 300 cgt gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg cac cag gac tgg ctg aat ggc 960 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 305 310 315 320 aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa gcc ctc cca gcc ccc atc 1008 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 325 330 335 gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggg cag ccc cga gaa cca cag gtg 1056 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 340 345 350 tac acc ctg ccc cca tcc cgg gat gag ctg acc aag aac cag gtc agc 1104 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 355 360 365 ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc agc gac atc gcc gtg gag 1152 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 370 375 380 tgg gag agc aat ggg cag ccg gag aac aac tac aag acc acg cct ccc 1200 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 385 390 395 400 gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tac agc aag ctc acc gtg 1248 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 405 410 415 gac aag agc agg tgg cag cag ggg aac gtc ttc tca tgc tcc gtg atg 1296 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 420 425 430 cat gag gct ctg cac aac cac tac acg cag aag agc ctc tcc ctg tct 1344 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 435 440 445 ccg ggt aaa tga 1356 Pro Gly Lys 450 <210> 68 <211> 451 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 68 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Val Ile Ser Thr Tyr Tyr Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Ala Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Leu Arg Glu Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125 Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 130 135 140 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 180 185 190 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 195 200 205 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 210 215 220 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 225 230 235 240 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 245 250 255 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 260 265 270 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 275 280 285 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 290 295 300 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 305 310 315 320 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 325 330 335 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 340 345 350 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 355 360 365 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 370 375 380 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 385 390 395 400 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 405 410 415 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 420 425 430 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 435 440 445 Pro Gly Lys 450 <210> 69 <211> 723 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antibody <220> <221> CDS <222> (1)..(723) <400> 69 atg gaa tca cag acc cag gtc ctc atg ttt ctt ctg ctc tgg gta tct 48 Met Glu Ser Gln Thr Gln Val Leu Met Phe Leu Leu Leu Trp Val Ser 1 5 10 15 ggt gcc tgt gca gac att gtc atg aca cag tct cca gac tcc ctg gct 96 Gly Ala Cys Ala Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala 20 25 30 gtg tca ctg gga gag agg gcc act atc aac tgc aag tcc agt cag agc 144 Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser 35 40 45 ctt ctg aat agt agc aat caa aag aac tat ttg gcc tgg tac cag cag 192 Leu Leu Asn Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln 50 55 60 aaa cca gga cag cct cct aaa ctt ctg gtc tac ttt gca tcc act agg 240 Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Val Tyr Phe Ala Ser Thr Arg 65 70 75 80 gaa tct ggg gtc cct gat cgc ttc agt ggc agt gga tct ggg aca gat 288 Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 85 90 95 ttc act ctt acc atc agc agt ctg cag gct gaa gat gtg gca gtt tac 336 Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr 100 105 110 tac tgt cag caa cat tat agc act cct ccc aca ttc ggt cag ggg acc 384 Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr 115 120 125 aag ctg gag atc aaa cga act gtg gct gca cca tct gtc ttc atc ttc 432 Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe 130 135 140 ccg cca tct gat gag cag ttg aaa tct gga act gcc tct gtt gtg tgc 480 Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys 145 150 155 160 ctg ctg aat aac ttc tat ccc aga gag gcc aaa gta cag tgg aag gtg 528 Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val 165 170 175 gat aac gcc ctc caa tcg ggt aac tcc cag gag agt gtc aca gag cag 576 Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln 180 185 190 gac agc aag gac agc acc tac agc ctc agc agc acc ctg acg ctg agc 624 Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser 195 200 205 aaa gca gac tac gag aaa cac aaa gtc tac gcc tgc gaa gtc acc cat 672 Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His 210 215 220 cag ggc ctg agc tcg ccc gtc aca aag agc ttc aac agg gga gag tgt 720 Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 240 tag 723 <210> 70 <211> 240 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 70 Met Glu Ser Gln Thr Gln Val Leu Met Phe Leu Leu Leu Trp Val Ser 1 5 10 15 Gly Ala Cys Ala Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala 20 25 30 Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser 35 40 45 Leu Leu Asn Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln 50 55 60 Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Val Tyr Phe Ala Ser Thr Arg 65 70 75 80 Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 85 90 95 Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr 100 105 110 Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr 115 120 125 Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe 130 135 140 Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys 145 150 155 160 Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val 165 170 175 Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln 180 185 190 Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser 195 200 205 Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His 210 215 220 Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 240 <210> 71 <211> 663 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antibody <220> <221> CDS <222> (1)..(663) <400> 71 gac att gtc atg aca cag tct cca gac tcc ctg gct gtg tca ctg gga 48 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 gag agg gcc act atc aac tgc aag tcc agt cag agc ctt ctg aat agt 96 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30 agc aat caa aag aac tat ttg gcc tgg tac cag cag aaa cca gga cag 144 Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 cct cct aaa ctt ctg gtc tac ttt gca tcc act agg gaa tct ggg gtc 192 Pro Pro Lys Leu Leu Val Tyr Phe Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 cct gat cgc ttc agt ggc agt gga tct ggg aca gat ttc act ctt acc 240 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 atc agc agt ctg cag gct gaa gat gtg gca gtt tac tac tgt cag caa 288 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 cat tat agc act cct ccc aca ttc ggt cag ggg acc aag ctg gag atc 336 His Tyr Ser Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 aaa cga act gtg gct gca cca tct gtc ttc atc ttc ccg cca tct gat 384 Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp 115 120 125 gag cag ttg aaa tct gga act gcc tct gtt gtg tgc ctg ctg aat aac 432 Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn 130 135 140 ttc tat ccc aga gag gcc aaa gta cag tgg aag gtg gat aac gcc ctc 480 Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu 145 150 155 160 caa tcg ggt aac tcc cag gag agt gtc aca gag cag gac agc aag gac 528 Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp 165 170 175 agc acc tac agc ctc agc agc acc ctg acg ctg agc aaa gca gac tac 576 Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr 180 185 190 gag aaa cac aaa gtc tac gcc tgc gaa gtc acc cat cag ggc ctg agc 624 Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser 195 200 205 tcg ccc gtc aca aag agc ttc aac agg gga gag tgt tag 663 Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 220 <210> 72 <211> 220 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 72 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30 Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Val Tyr Phe Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 His Tyr Ser Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp 115 120 125 Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn 130 135 140 Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu 145 150 155 160 Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp 165 170 175 Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr 180 185 190 Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser 195 200 205 Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 220 <210> 73 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH1 <400> 73 Asp Tyr Ala Met His 1 5 <210> 74 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH2 <400> 74 Val Ile Ser Thr Tyr Tyr Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 75 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH3 <400> 75 Gly Gly Leu Arg Glu Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 76 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL1 <400> 76 Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu 1 5 10 15 Ala <210> 77 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL2 <400> 77 Phe Ala Ser Thr Arg Glu Ser 1 5 <210> 78 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL3 <400> 78 Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Pro Thr 1 5

Claims (27)

  1. 중사슬이 서열 번호 2, 4, 6, 8, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 및 36 에서 선택되는 아미노산 서열을 갖고, 또한 경사슬이 서열 번호 10 또는 서열 번호 12 에 기재된 아미노산 서열을 갖는, 항 hDLK-1 항체 조성물의 정제 방법으로서,
    항체 조정제물을 컨벤셔널 크로마토그래피에 부하하여, Fc 영역 당사슬 부가 콘센서스 영역 이외의 부위에 당사슬이 부가되어 있지 않은 항체를 상기 크로마토그래피의 담체에 흡착시키는 것, 및
    상기 담체를 용출액으로 용출시킴으로써, 상기 담체에 흡착된 상기 항체를 용출시켜 정제 항체 조성물을 얻는 것을 포함하고,
    여기서, 얻어진 상기 정제 항체 조성물에 있어서의, Fc 영역 당사슬 부가 콘센서스 영역 이외의 부위에 당사슬이 부가된 당사슬 부가 이성체의 함유량이, 상기 항체 조정제물과 비교하여 감소되어 있는, 상기 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 컨벤셔널 크로마토그래피의 담체가, 소수성 상호 작용 크로마토그래피 담체, 또는 믹스 모드 크로마토그래피 담체인, 정제 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 컨벤셔널 크로마토그래피의 담체의 평균 입자경이 15 ㎛ 이상인, 정제 방법.
  4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 컨벤셔널 크로마토그래피의 담체의 평균 입자경이 20 ∼ 100 ㎛ 인, 정제 방법.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 컨벤셔널 크로마토그래피의 담체가 벤질기 또는 부틸기를 갖는, 정제 방법.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 컨벤셔널 크로마토그래피의 담체의 단위량당 단백질 부하량이 20 mg/mL 이상인, 정제 방법.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 컨벤셔널 크로마토그래피의 담체가 소수성 상호 작용 크로마토그래피 담체이고, 또한 상기 항체 조정제물을 상기 담체에 부하한 후, 용출 전에 당해 담체를 세정액으로 세정하는 것을 포함하는, 정제 방법.
  8. 제 7 항에 있어서,
    상기 세정액의 염 농도가, 상기 용출액의 염 농도보다 10 mM 이상 높은 것을 특징으로 하는, 정제 방법.
  9. 제 7 항 또는 제 8 항에 있어서,
    상기 세정액의 염 농도가 0.5 M 이상인 것을 특징으로 하는, 정제 방법.
  10. 제 7 항 또는 제 8 항에 있어서,
    상기 세정액의 염 농도가 1.0 M 이상인 것을 특징으로 하는, 정제 방법.
  11. 제 7 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세정액의 pH 가 상기 용출액의 pH 보다 0.2 유닛 이상 낮은 pH 이고, 또한 pH 4 ∼ 8 의 범위 내인, 정제 방법.
  12. 제 7 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세정이, 2 담체 용량 이상의 세정액을 흘림으로써 실시되는, 정제 방법.
  13. 제 7 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서,
    단계적 또는 직선적으로 pH 또는/및 염 농도가 변화하는 이동상을 사용함으로써, 세정 및 용출을 실시하는 것을 특징으로 하는, 정제 방법.
  14. 제 7 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 용출액이 0.5 M 이하의 염 농도이거나 또는 염을 함유하지 않고, 또한 pH 5 ∼ 7 인, 정제 방법.
  15. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,
    수율이 20 ％ 이상인, 정제 방법.
  16. 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 정제 항체 조성물 중의 전체 항체에 대한 당사슬 부가 이성체의 비율이 5 ％ 이하인, 정제 방법.
  17. 제 16 항에 있어서,
    상기 항체 조정제물 중의 전체 항체에 대한 당사슬 부가 이성체의 비율이 5 ％ 보다 큰, 정제 방법.
  18. 제 1 항에 기재된 항 hDLK-1 항체 조성물의 정제 방법으로서,
    항체 조정제물을, 벤질기 혹은 부틸기를 갖는 입자경 20 ∼ 100 ㎛ 의 담체를 사용한 컨벤셔널 크로마토그래피에 부하하는 것,
    상기 담체에, Fc 영역 당사슬 부가 콘센서스 영역 이외의 부위에 당사슬이 부가되어 있지 않은 항체를 흡착시키는 것,
    pH 4 ∼ 6 의 세정액으로 상기 담체를 1 회 이상 세정함으로써 당사슬 부가 이성체를 제거하는 것, 및
    0.5 M 이하의 염 농도 또는 염을 함유하지 않는 pH 5 ∼ 7 의 용출액으로 상기 담체에 흡착된 상기 항체를 용출시켜 정제 항체 조성물을 얻는 것을 포함하고,
    여기서, 상기 정제 항체 조성물에 있어서의, 전체 항체에 대한 당사슬 부가 이성체의 비율이, 상기 항체 조정제물과 비교하여 저감되어 있는, 상기 방법.
  19. 제 1 항에 기재된 항체 조성물의 정제 방법으로서,
    0.5 M 이상의 염 농도로 조정된 상기 항체 조정제물을, 벤질기 혹은 부틸기를 갖는 입자경 20 ∼ 100 ㎛ 의 담체를 사용한 컨벤셔널 크로마토그래피에 부하하여 당사슬 부가 이성체를 플로 스루 획분으로 제거하는 것,
    상기 담체를 세정액으로 세정하는 것, 및
    0.5 M 이하의 염 농도 또는 염을 함유하지 않는 pH 5 ∼ 7 의 용출액으로 상기 담체에 흡착된 상기 항체를 용출시켜 정제 항체 조성물을 얻는 것을 포함하고,
    여기서, 상기 정제 항체 조성물에 있어서의, 전체 항체에 대한 당사슬 부가 이성체의 비율이, 상기 항체 조정제물과 비교하여 저감되어 있는, 상기 방법.
  20. 제 1 항에 기재된 항체 조성물의 정제 방법으로서,
    pH 4 ∼ 6 으로 조정된 상기 항체 조정제물을, 벤질기 혹은 부틸기를 갖는 입자경 20 ∼ 100 ㎛ 의 담체를 사용한 컨벤셔널 크로마토그래피에 부하하여 당사슬 부가 이성체를 플로 스루 획분으로 제거하는 것,
    상기 담체를 세정액으로 세정하는 것, 및
    0.5 M 이하의 염 농도 또는 염을 함유하지 않는 pH 5 ∼ 7 의 용출액으로 상기 담체에 흡착된 상기 항체를 용출시켜 정제 항체 조성물을 얻는 것을 포함하고,
    여기서, 상기 정제 항체 조성물에 있어서의, 전체 항체에 대한 당사슬 부가 이성체의 비율이, 상기 항체 조정제물과 비교하여 저감되어 있는, 상기 방법.
  21. 제 1 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 컨벤셔널 크로마토그래피의 담체의 단위량당 단백질 부하량이 20 g/L 이상이고, 또한 상기 세정이, 5 담체 용량 이상의 세정액을 흘림으로써 실시되는, 방법.
  22. 제 1 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 기재된 정제 방법을 포함하는, Fc 영역 당사슬 부가 콘센서스 영역 이외의 부위에 당사슬이 부가되어 있지 않은 항체의, 전체 항체에 대한 비율이 95 ％ 이상인 항체 조성물의 제조 방법.
  23. 중사슬이 서열 번호 2, 4, 6, 8, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 및 36 에서 선택되는 아미노산 서열을 갖고, 또한 경사슬이 서열 번호 10 또는 서열 번호 12 에 기재된 아미노산 서열을 갖는, 항 hDLK-1 항체 정제 조성물의 제조 방법으로서,
    항체 조정제물을, 벤질기 혹은 부틸기를 갖는 입자경 20 ∼ 100 ㎛ 의 담체를 사용한 컨벤셔널 크로마토그래피에 부하하는 것,
    상기 담체에, Fc 영역 당사슬 부가 콘센서스 영역 이외의 부위에 당사슬이 부가되어 있지 않은 항체를 흡착시키는 것,
    0.5 M 이상의 염을 함유하는 세정액으로 상기 담체를 1 회 이상 세정함으로써 당사슬 부가 이성체를 제거하는 것, 및
    0.5 M 이하의 염 농도 또는 염을 함유하지 않는 pH 5 ∼ 7 의 용출액으로 상기 담체에 흡착된 상기 항체를 용출시켜 정제 항체 조성물을 얻는 것을 포함하고,
    여기서, 상기 정제 항체 조성물에 있어서의, 전체 항체에 대한 당사슬 부가 이성체의 비율이, 상기 항체 조정제물과 비교하여 저감되어 있는, 상기 방법.
  24. 제 22 항 또는 제 23 항에 기재된 제조 방법에 의해 제조된 항체 조성물.
  25. 중사슬이 서열 번호 2, 4, 6, 8, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 및 36 에서 선택되는 아미노산 서열을 갖고, 또한 경사슬이 서열 번호 10 또는 서열 번호 12 에 기재된 아미노산 서열을 갖는 항 hDLK-1 항체 조정제물로부터, Fc 영역 당사슬 부가 콘센서스 영역 이외의 부위에 당사슬이 부가된 당사슬 부가 이성체를 제거하는 방법으로서,
    항체 조정제물을 소수성 상호 작용 크로마토그래피 담체에 부하하여, Fc 영역 당사슬 부가 콘센서스 영역 이외의 부위에 당사슬이 부가되어 있지 않은 항체를 상기 담체에 흡착시키는 것,
    상기 담체를 세정액으로 세정하는 것, 및
    상기 담체로부터 용출액으로 용출시킴으로써, 상기 담체에 흡착된 상기 항체를 용출시켜 정제 항체 조성물을 얻는 것을 포함하는, 상기 방법.
  26. 중사슬이 서열 번호 2, 4, 6, 8, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 및 36 에서 선택되는 아미노산 서열을 갖고, 또한 경사슬이 서열 번호 10 또는 서열 번호 12 에 기재된 아미노산 서열을 갖는, 항 hDLK-1 항체 조성물로서, Fc 영역 당사슬 부가 콘센서스 영역 이외의 부위에 당사슬이 부가되어 있지 않은 항체를, 전체 항체의 95 ％ 이상 함유하는, 상기 항체 조성물.
  27. 중사슬이 서열 번호 2, 4, 6, 8, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 및 36 에서 선택되는 아미노산 서열을 갖고, 또한 경사슬이 서열 번호 10 또는 서열 번호 12 에 기재된 아미노산 서열을 갖는, 항 hDLK-1 항체로서, Fc 영역 당사슬 부가 콘센서스 영역 이외의 부위에 당사슬이 부가되어 있지 않은, 상기 항체.
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