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KR20230173052A - 자성입자 및 불활성화된 유전자 가위를 포함하는 진단용 미세입자 프로브, 이를 포함하는 다중진단 시스템 및 다중진단 방법 - Google Patents

자성입자 및 불활성화된 유전자 가위를 포함하는 진단용 미세입자 프로브, 이를 포함하는 다중진단 시스템 및 다중진단 방법 Download PDF

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KR20230173052A
KR20230173052A KR1020230077305A KR20230077305A KR20230173052A KR 20230173052 A KR20230173052 A KR 20230173052A KR 1020230077305 A KR1020230077305 A KR 1020230077305A KR 20230077305 A KR20230077305 A KR 20230077305A KR 20230173052 A KR20230173052 A KR 20230173052A
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KR
South Korea
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nucleic acid
diagnostic
target nucleic
microparticle
probe
Prior art date
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Pending
Application number
KR1020230077305A
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English (en)
Inventor
정용균
최영욱
최희락
Original Assignee
주식회사 이지다이아텍
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 주식회사 이지다이아텍 filed Critical 주식회사 이지다이아텍
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Abstract

본 발명은 진단용 미세입자 프로브에 유전자 가위 기술을 도입하는 것으로 기존의 진단방법에 비하여 빠르고 정확하게 진단을 수행할 수 있을 뿐만 아니라 다중진단에도 사용할 수 있는 자성입자 및 불활성화된 유전자 가위를 포함하는 진단용 미세입자 프로브, 이를 포함하는 다중진단 시스템 및 다중진단 방법에 관한 것이다.

Description

자성입자 및 불활성화된 유전자 가위를 포함하는 진단용 미세입자 프로브, 이를 포함하는 다중진단 시스템 및 다중진단 방법{Microparticle probe for diagnosis using magnetic particles and nuclease-deficient genetic scissors, multi-diagnostic system and multi-diagnostic method using thereof}
본 발명은 자성입자 및 불활성화된 유전자 가위를 포함하는 진단용 미세입자 프로브, 이를 포함하는 다중진단 시스템 및 다중진단 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 진단용 미세입자 프로브에 유전자 가위 기술을 도입하는 것으로 기존의 진단방법에 비하여 빠르고 정확하게 진단을 수행할 수 있을 뿐만 아니라 다중진단에도 사용할 수 있는 자성입자 및 불활성화된 유전자 가위를 포함하는 진단용 미세입자 프로브, 이를 포함하는 다중진단 시스템 및 다중진단 방법에 관한 것이다.
체외진단(IVD)은 인체로부터 채취된 혈액, 소변, 세포 등의 대상물을 분석하여 건강 상태를 진단할 수 있게 하는 기술로서, 면역진단, 자가 혈당 측정, 분자 진단 기술 등이 있다. 이 중 분자진단 기술은 분자생물학적 기법을 질병의 진단에 이용하는 기술로, 유전성 질환 및 감염성 질환 분야에서 새롭게 발견된 유전자의 변이 및 감염성 질환의 등장으로 인해 그 대상이 점점 확대되고 있다.
상기 분자생물학적 기법 중 근래에 개발된 유전자가위 기술은 세포내 유전자의 특정 염기서열을 인식하여 원하는 대로 편집하는 기술로 유전병을 치료할 수 있는 혁신 기술로 각광을 받았다. 상기 유전자가위 기술은 발전을 거듭하여(1세대: 징크핑거 뉴클리에이즈, 2세대: 탈렌 TALENs(Transcription Activator-Like Effector Nuclease), 3세대: 크리스퍼(CRISPR-Cas)) 왔으며, 최근 유전자가위 기술이 ‘유전자 편집’을 넘어 더 빠르고 정확도가 높은 분자진단 기술로 개발하려는 노력들이 주목을 받고 있다.
한편 COVID-19는 현재 전 세계적인 팬데믹 상황으로 2022년 5월 현재 세계 인구의 5.2억명이 감염되고 630만명이 사망하였고, 국내에서도 1.8천만명이 감염되고 2.4만명이 사망하는 등 20세기 최악의 팬데믹이라고 일컫는 스페인 독감의 기록을 넘어서고 있다. 이러한 팬데믹 상황을 관리하기 위해서는 빠른 진단이 필요하지만, 진단에 소요되는 시간은 국내에서는 1~2일 정도가 걸리고, 미국에서는 통상 4~7일 정도가 걸려 질병 확산을 줄이는데 효과적인 대응이 불가능한 실정이다. 또한 기존 분자진단 수행 과정에서, 반응 과정 중, 표지자의 부분적인 결합 또는 중복 결합을 통해, 핵산의 증폭을 유발하게 되고, 프로브 역할을 하게 되는 서열이 양성화되어 위양성의 결과를 초래하기도 한다. 그러므로 30~40분 이내로 정확한 진단결과를 낼 수 있는 새로운 현장진단용 기술이 절실히 필요하다.
(0001) 대한민국 공개특허 제10-2022-0059418호
전술한 문제를 해결하기 위하여, 본 발명은 진단용 미세입자 프로브에 유전자 가위 기술을 도입하는 것으로 기존의 진단방법에 비하여 빠르고 정확하게 진단을 수행할 수 있을 뿐만 아니라 다중진단에도 사용할 수 있는 자성입자 및 불활성화된 유전자 가위를 포함하는 진단용 미세입자 프로브, 이를 포함하는 다중진단 시스템 및 다중진단 방법을 제공하고자 한다.
상술한 문제를 해결하기 위해, 본 발명은 미세입자; 상기 미세입자의 표면에 도입되는 포획 프로브; 및 상기 포획프로브에 결합되며 표적핵산에 상보적인 유전자 서열을 포함하는 불활성화된 유전자 가위를 포함하는 진단용 미세입자 프로브를 제공한다.
일 실시예에 있어서, 상기 불활성화된 유전자 가위는 가이드 RNA를 포함하는 것일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 가이드 RNA는 상기 표적핵산 유전자의 표적 부위와 혼성화 가능한 뉴클레오타이드 서열을 갖는 것일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 불활성화된 유전자 가위는 표적 핵산 절단기능이 불활성화된 것일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 미세입자는 내부에 자성 입자들이 함유된 것일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 미세입자는 자성 물질을 포함하는 코어와 상기 코어를 둘러싸며 균일한 두께를 갖는 쉘 층을 구비한 코어-쉘 구조를 가지는 것일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 미세입자는 수중에서 부유하지 않는 크기 및 비중을 갖는 것일 수 있다.
본 발명은 또한 상기 진단용 미세입자 프로브; 표적 핵산에 상보적으로 결합하며, biotin이 표지된 리포터 핵산; 및 핵산증폭용 시약을 포함하는 다중 진단용 시스템을 제공한다.
일 실시예에 있어서, 상기 진단용 미세입자 프로브는 직경, 두께, 길이, 형상 또는 식별 코드에 의해 서로 구분되도록 표지된 것일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 진단용 미세입자 프로브는 상이한 길이를 가지는 2종 이상의 진단용 미세입자 프로브가 혼합되어 있는 것일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 리포터 핵산은 상이한 색상을 가지는 형광체가 결합되는 2종 이상의 리포터 핵산이 혼합되어 있는 것일 수 있다.
본 발명은 또한 (a) 표적 핵산을 검체로부터 추출하는 단계; (b) 상기 표적 핵산을 증폭하고 리포터 핵산을 결합시키는 단계; (c) 미세입자; 상기 미세입자의 표면에 도입되는 포획 프로브; 및 상기 포획프로브에 결합되며 표적핵산에 상보적인 유전자 서열을 포함하는 불활성화된 유전자 가위를 포함하는 진단용 미세입자 프로브를 제공하는 단계; (d) 상기 진단용 미세입자 프로브와 상기 표적 핵산을 반응시켜 상기 표적 핵산 및 상기 리포터 핵산을 포획하는 단계; (e) 상기 리포터 핵산에 형광물질을 부착시키는 단계; 및 (f) 염색된 상기 리포터 핵산으로부터 방출되는 형광 신호를 측정하여 상기 표적 핵산을 검출하는 단계를 포함하는 표적 핵산의 검출방법을 제공한다.
일 실시예에 있어서, 상기 표적 핵산의 검출은 2종 이상의 상기 표적 핵산에 대해 2종 이상의 상기 진단용 미세입자 프로브를 이용하여 다중검출하는 것일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 다중검출은 길이, 직경, 두께, 형상, 색상 또는 식별 코드에 의해 서로 구분되도록 표지된 상기 진단용 미세입자 프로브들을 판독하는 과정을 포함할 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 (e)단계 이후, 상기 표적핵산 및 리포터 핵산이 부착된 진단용 미세입자 프로브를 세척하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 표적 핵산의 검출방법은 마이크로 웰 상에서 수행되는 것일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 진단용 미세입자 프로브는 외부 자력에 의하여 상기 마이크로 웰 사이를 이동 및 침지되는 것일 수 있다.
본 발명에 의한 진단용 미세입자 프로브, 이를 포함하는 다중진단 시스템 및 다중진단 방법은 비 특이적인 2차 절단 효소 활성을 배제함으로써, 기존의 방법보다 다중 진단이 더 용이하며, 신속한 진단이 가능하므로, 본 발명에 따른 검출방법을 사용하여 POCT(Point-Of-Care-Test) 다중 진단에 좀 더 효과적이다.
또한 본 발명에 의한 진단용 미세입자 프로브, 이를 포함하는 다중진단 시스템 및 다중진단 방법은 기존의 진단방법에 비하여 빠른 속도로 표적핵산의 검출이 가능하므로, 바이러스나 세균에 의한 감염증 진단에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 의한 분자진단용 미세입자 프로브의 구조 및 표적 핵산, 리포터 핵산, 형광분자와의 결합관계를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 의한 진단용 미세입자 프로브의 일 구현예를 나타낸 도면이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 의한 자성 미세입자/불활성화된 유전자 가위 기술을 이용하여 표적 핵산을 검출하는 프로세스를 나타낸 도면이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 의한 자성 미세입자/불활성화된 유전자 가위 기술을 이용하여 표적 핵산을 검출하는 프로세스를 나타낸 도면으로 A는 유전자의 증폭과정 B는 유전자의 증폭과정이 없는 프로세스를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 의한 도 3의 프로세스에서 표적 유전자를 포획하는 과정을 상세하게 나타낸 도면으로 A는 유전자의 증폭과정 B는 유전자의 증폭과정이 없는 프로세스를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 의한 상기 프로세스에 따른 진단 결과를 가상적으로 나타낸 것이다.
도 7은 자성입자 기반 표적 샘플의 핵산 포집 가능성을 사전 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 의한 웰 1(Well 1)에서 웰 4(Well)까지 순차적으로 이루어지는 표적 핵산의 포집 및 증폭 프로세스를 나타낸다.
도 9는 본 발명의 일 실시예 의한 인플루엔자 B 바이러스 RNA에 대하여 핵산 포집 및 증폭 과정을 거친 결과이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 의한 증폭된 DNA를 본 발명의 다중진단 시스템에 투입한 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 의한 다중진단 방법을 이용하여 각각의 바이러스의 검출결과를 나타낸 것이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 의한 다중진단 방법을 이용하여 각각의 바이러스를 동시에 검출한 결과를 나타낸 것이다.
이하에서는 본 발명의 바람직한 실시예를 상세하게 설명한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐리게 할 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략하기로 한다. 명세서 전체에서, 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한 복수의 표현을 포함하는 것으로 이해되어야 하고, “포함하다” 또는 “가지다”등의 용어는 기술되는 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다. 또, 방법 또는 제조 방법을 수행함에 있어서, 상기 방법을 이루는 각 과정들은 문맥상 명백하게 특정 순서를 기재하지 않은 이상 명기된 순서와 다르게 일어날 수 있다. 즉, 각 과정들은 명기된 순서와 동일하게 일어날 수도 있고 실질적으로 동시에 수행될 수도 있으며 반대의 순서대로 수행될 수도 있다.
본 명세서에 개시된 기술은 여기서 설명되는 구현예들에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 단지, 여기서 소개되는 구현예들은 개시된 내용이 철저하고 완전해질 수 있도록 그리고 당업자에게 본 기술의 기술적 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위해 제공되는 것이다. 도면에서 각 장치의 구성요소를 명확하게 표현하기 위하여 상기 구성요소의 폭이나 두께 등의 크기를 다소 확대하여 나타내었다. 전체적으로 도면 설명시 관찰자 시점에서 설명하였고, 일 요소가 다른 요소 위에 위치하는 것으로 언급되는 경우, 이는 상기 일 요소가 다른 요소 위에 바로 위치하거나 또는 그들 요소들 사이에 추가적인 요소가 개재될 수 있다는 의미를 모두 포함한다. 또한, 해당 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명의 사상을 다양한 다른 형태로 구현할 수 있을 것이다. 그리고 복수의 도면들 상에서 동일 부호는 실질적으로 서로 동일한 요소를 지칭한다.
본 명세서에서, '및/또는' 이라는 용어는 복수의 기재된 항목들의 조합 또는 복수의 기재된 항목들 중의 어느 항목을 포함한다. 본 명세서에서, 'A 또는 B'는, 'A', 'B', 또는 'A와 B 모두'를 포함할 수 있다.
본 발명은 미세입자; 상기 미세입자의 표면에 도입되는 포획 프로브; 및 상기 포획프로브에 결합되며 표적핵산에 상보적인 유전자 서열을 포함하는 불활성화된 유전자 가위를 포함하는 진단용 미세입자 프로브에 관한 것이다.
이하 도 1 및 도 2를 통하여 본 발명에 의한 진단용 미세입자 프로브에 관하여 설명하기로 한다.
상기 미세입자(110)는 단일 구조를 갖거나 코어-쉘 구조를 가질 수도 있다. 바람직하게는 미세입자(110)는 코어(112)와 이를 둘러싼 보호용 쉘(114)의 코어-쉘 구조를 가질 수 있다. 미세입자(110)의 코어(112)는 자성 물질, 예를 들어 자석 반응 금속을 포함할 수 있는데, 상기 자석 반응 금속은 상자성 물질일 수 있다. 구체적으로 상기 자석 반응 금속은 철(Fe), 니켈(Ni), 코발트(Co), 망간(Mn)을 포함한 합금일 수 있다. 상기 자석 반응 금속은 철, 니켈, 코발트, 망간 등과 같은 전이금속을 주성분으로 하여 가돌리늄(Gd), 터븀(Tb), 사마륨(Sm) 등과 같은 희토류 금속을 포함할 수 있고, 기타 붕소(B), 규소(Si), 탄소(C) 등을 포함할 수 있다. 상기 자석 반응 금속의 대표적인 예로서 철 합금 또는 코발트 합금을 들 수 있다. 구체적인 철 합금의 예로는 Fe70B15Si10C5를 들 수 있고, 코발트 합금의 예로는 Co68Mn7Si10B15를 들 수 있다.
바람직하게는 미세입자(110)는 영구자석이나 전자석과 같은 외부 자석에 의해 신속하게 수집되거나 분리될 수 있도록 수상에서 부유하지 않는 크기 및 비중을 가지는 것이 바람직하다. 이때 상기 코어(112)는 상기 미세입자(110) 총 부피의 60% 이상을 차지할 수 있다. 예를 들어 상기 코어(112)의 부피는 상기 미세입자(110) 총 부피의 60 내지 99%, 바람직하게는 75 내지 99%를 가질 수 있다. 상기 코어의 부피가 60% 미만인 경우 상기 코어의 자성이 떨어져 자석봉을 사용한 이동이 어려울 수 있으며, 99%를 초과하는 경우 쉘의 두께가 얇아져 내구성이 떨어질 수 있다.
또한 상기 미세입자(110)는 그 크기(예를 들어 직경 또는 길이)가 수십 내지 수백 ㎛ 정도일 수 있으며, 비중은 5 이상인 것이 바람직하다. 상기 미세입자(130)가 1 마이크로미터 미만의 크기를 갖는 나노입자일 경우 높은 비중을 가지는 입자(ex: 철의 경우 7.876)라 하더라도 수중에서 부유할 수 있다. 이 경우 미세입자(110)를 이용하여 단일 염기 다형성 분석 과정에서 자장 인가 시 미세입자의 낮은 자력으로 말미암아 상기 미세입자의 자성 제어가 원활하지 않아 분리에 어려움을 겪을 수 있다. 면역 반응을 촉진시키기 위해 자석봉을 웰 내에서 상하 이동할 때 미세입자들의 탈부착이 발생하는데, 자석봉이 상하 이동하는 과정에서 자석봉에 한번 부착된 미세입자들이 낮은 무게로 인하여 자기장을 제거하여도 웰 바닥으로 다시 떨어지지 않고 자석봉에 비특이적 결합으로 계속 잔존할 수 있다. 이 경우 웰 내 생체물질을 검출할 때 정량분석의 재현성이 저하될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따른 진단용 미세입자 프로브의 경우 기존의 실리카 비드에 비해서 그 크기가 매우 크고, 통상 자성 입자들이 실리카 내부에 분산되어 있는 종래의 실리카 비드와 달리 자석 반응 금속(자성 코어)이 미세입자의 대부분의 부피를 차지하여 자력에 민감하게 반응하므로 정량분석 시 재현성이 우수하다
한편, 본 발명의 진단용 미세입자 프로브(100)는 중심부에 자석 반응 금속이 있고 그 주위를 둘러싼 쉘 층(shell layer)을 구비함으로써 코어-쉘 구조를 형성하는데, 쉘 층(114)은 유기물 또는 무기물로 이루어질 수 있으며, 바람직하게는 유리(glass)이다. 또한 상기 진단용 미세입자 프로브(100)의 표면에 항체, 단백질, 핵산, 대사물질 등의 포획 프로브를 고정시킬 수 있다. 바람직하게는 이를 위해 상기 표면에 아크릴기, 히드록시기, 아민기, 카르복실기와 같은 기능기가 도입된 것일 수 있다.
상기 쉘 층(114)은 상기 미세입자(110)를 실질적으로 완전히 둘러쌀 수도 있지만, 필요시 또는 제조 과정에서 미세입자의 표면이 쉘 층으로 완전히 덮이지 않고 미세입자 표면의 일부 영역이 노출될 수도 있다.
상기 쉘 층(114)의 두께는 1 내지 100㎛, 바람직하게는 1 내지 50㎛, 더 바람직하게는 1 내지 10㎛, 더더욱 바람직하게는 4 내지 8㎛일 수 있다. 쉘 층(114)의 두께가 상기 범위 미만에서는 쉘 층(114)의 표면이 부서지거나 크랙이 쉽게 발생될 수 있고, 상기 범위 초과에서는 글라스 절단 가공시 레이저 특성 및 파장에 따른 문제가 발생할 수 있다.
상기 코어-쉘 구조는 코어 금속에 액상의 쉘 성분을 도포하여 형성되거나 중공형 틀에 코어 금속 성분을 충진하여 형성된 것일 수 있다.
이때 상기 쉘층(114)은 유기물 또는 무기물의 액상 코팅액으로부터 고화된 것 일 수 있다. 좀 더 구체적으로 상기 쉘 층(114)은 유기물 또는 무기물 형태의 쉘 성분을 고온에서 녹이거나 흐름성이 있게 만드는 방식 또는 용매 중에 녹이는 방식을 통해 액상 코팅액을 만든 후 코어 금속에 도포하여 형성될 수 있다. 상기 유기물은 주로 고분자일 수 있고, 상기 무기물은 금속 혹은 세라믹, 특히 유리일 수 있다. 예를 들어, 쉘 층(114)을 형성하기 위해 플라스틱을 용매에 녹이거나 유리를 용융하여 얻은 코팅액을 딥코팅, 스프레이코팅 등의 방식으로 미세입자(110)에 도포할 수도 있다.
상기 중공형 틀로서 유리관을 사용하는 경우를 예를 들어 설명하면, 유리관 안에 금속 분말을 투입 후 금속을 높은 온도에서 용융시키며 유리관을 인발시키는 방식, 먼저 유리 재료를 인발하면서 그 내부에 용융된 금속을 주입시키는 방식, 금속 분말을 자외선 경화형 물질에 분산시킨 분산액을 유리관 내에 충진한 후 자외선을 조사하여 경화시키는 방식 등이 있다. 이러한 방식들의 경우 중공형 틀 자체가 쉘 층이 될 수 있다.
상술한 방식으로 얻어진 미세입자(110)는 표면 균일도가 매우 뛰어나다. 종래 바이오 어세이용 입자의 경우, 쉘 층(114)을 형성하기 위해 TEOS와 같은 실리카 전구체를 이용하여 코어 입자 표면 위에 성장시키는데, 이 경우 쉘 층(114)은 매우 거친 표면을 갖게 된다. 그리하여 검출대상 물질의 비특이적 결합이 많이 발생할 수 있다. 이는 불필요한 백그라운드 노이즈를 발생시키는 원인이 될 수 있다.
반면 쉘 층(114)을 형성하는 유리(glass), 예를 들어 보로실리케이트 글라스(Borosilicate glass)는 반응 시료와 화학적 반응에 의한 흡착에 의한 비특이적 반응(non-specific binding)을 최소화 시킬 수 있다. 특히 본 발명의 일 구현예에 따른 미세입자(130)는 액상의 성분으로부터 유래된 코팅층을 쉘 층(114)으로 가지고 있으므로 매우 균일한 표면을 갖는다. 쉘 층(114) 표면의 평균 표면 거칠기(Ra)는 15nm 이하, 바람직하게는 10nm 이하, 더 바람직하게는 5nm 이하, 더욱 바람직하게는 2nm 이하, 특히 1.5nm 이하일 수 있다. 또한 Ra는 예를 들어 3nm 이상, 2nm 이상, 1nm 이상일 수 있다. 상기 범위의 표면 거칠기를 가질 경우 쉘 층(114) 표면에 반응 시료의 비특이적 흡착이 최소화될 수 있다.
강도 및 투명도를 고려하여 상기 미세입자(110)의 쉘 층(114)은 유리로 된 것일 수 있다. 상기 유리는 소다라임, 보로실리케이트, 알루미노실리케이트, 실리카, 알칼리 실리케이트, 파이렉스 및 석영으로 이루어진 군 중에서 선택되는 화합물이 주성분이 될 수 있다. 바람직하게는 내열성, 내산성, 내수성이 요구되는 실험용으로 상기 유리는 보로실리케이트일 수 있다.
상기 미세입자(110)는 막대형, 평판형, 구형 등과 같은 정형적인 형태나 비정형적인 형태를 포함한 다양한 형태를 가질 수 있다. 미세입자(110)가 평판 형태를 가질 경우에도 단면은 별형, 다각형, 원형 등의 다양한 모양을 가질 수 있으며, 특별히 제한되지 않는다. 바람직하게는 상기 미세입자는 제조의 편이성과 관찰의 용이성을 위하여 마이크로로드(microrod), 마이크로디스크(microdisc), 또는 마이크로비드(microbead) 형태인 것이 바람직하며, 특히 마이크로로드의 형태를 갖는 것이 바람직하다. 상기 미세입자(130)가 마이크로로드의 형태를 가질 경우 미세입자들 간의 겹침에 의한 구분이 용이하고, 웰 내에 배치될 경우 포커싱이 쉬우며, 개별 입자가 차지하는 면적이 적어 하나의 관찰화면에 다수의 미세입자들을 관찰할 수 있다. 한편 미세입자가 별 모양과 같이 단면이 복잡한 구조를 갖는 형상을 가질 경우 웰 내부에서 움직이는 과정에서 서로 간 또는 벽과의 충돌에 의하여 모서리 부분의 깨짐이 발생할 수 있으므로 마이크로로드와 같이 단순한 형태를 갖는 것이 더욱 바람직하다.
상기 마이크로로드의 길이는 10 내지 1,000㎛ 일 수 있다. 상기 마이크로로드의 길이가 상기 범위 미만에서는 서로 다른 길이의 입자간의 구분이 쉽지 않고, 상기 범위 초과에서는 입자들의 겹침이 발생할 수 있어 관찰이 용이하지 않을 수 있다. 또한, 상기 마이크로로드의 직경 대비 길이의 비(종횡비)는 2 이상, 5 이상 또는 10 이상일 수 있다. 상기 종횡비의 상한은 20 이하, 10 이하 또는 5 이하일 수 있다. 종횡비가 상기 범위 미만에서는 구형의 미립자와 유사하여 서로 구별하기가 어려울 수 있으며 너무 크면 휘어질 수 있다.
바람직한 일 구현예로서, 상기 미세입자(110)는 유리가 코팅된 금속 미세와이어의 절단물일 수 있다. 유리가 코팅된 금속 미세와이어를 레이저로 단순히 절단함으로써 다양한 길이를 갖는 미세입자(110)를 얻을 수 있다.
상술한 미세입자는 생명체로부터 유래된 특정 검체 내의 진단용으로 적합하게 사용될 수 있다. 상기 검체는 조직 추출물, 세포 용해물, 전혈, 혈장, 혈청, 침, 안구액, 뇌척수액, 땀, 뇨, 젖, 복수액, 활액, 복막액 등일 수 있다. 신속 진단을 위해 상기 시료액의 전처리는 간소화되거나 경우에 따라서 생략될 수 있다.
생명체로부터 유래된 검체 내에 특정 검체 내의 POCT진단을 위하여 상기 미세입자들은 서로 상이한 크기, 길이 또는 형상의 입자들로 제조되어 사용될 수 있다.
상기 포획 프로브(120)는 시료로부터 유래한 바이오마커, 특히 핵산 기반 바이오마커를 포획하기 위하여 상기 미세입자(110)에 도입될 수 있다. 상기 바이오마커는 생물처리과정, 병원성을 일으키는 과정, 치료를 위한 약리학적 과정의 측정 또는 평가 등의 통상적인 과학 또는 의료분야에서 사용되는 것이면 제한없이 이용가능하다. 상기 바이오마커는 예를 들어 혈액, 타액, 소변 등의 생체액에서 검출할 수 있는 폴리펩티드, 펩티드, 핵산, 단백질 또는 대사물질일 수 있으며, 바람직하게는 특정 질병과 연관된 바이오마커를 높은 민감도 및 특이도를 가지고 검출할 수 있다는 면에서 상기 바이오마커는 핵산이다.
검체로부터 추출된 표적 핵산을 포획하기 위해 본 발명의 일 구현예에 따른 미세입자는 쉘 층(114) 위에 포획 프로브(120)가 도입될 수 있다. 포획 프로브(120)는 상기 표적 핵산에 상보적이어서 특이적으로 결합하여 상기 표적 핵산을 미세입자(110)에 고정시키는 역할을 한다.
상기 포획프로브에는 표적핵산에 상보적인 유전자 서열을 포함하는 불활성화된 유전자 가위가 포함될 수 있다.
일반적인 유전자 가위의 경우 표적 핵산과 결합된 다음, 외부 자극에 의하여 표적핵산의 일부를 절단하게 된다. 이러한 거동은 마치 가위처럼 유전자의 원하는 위치를 절단하는 것으로 보여 이를 유전자 가위 또는 크리스퍼 가위라고 부르고 있다. 본 발명의 경우 이러한 유전자 가위의 표적 핵산 결합능에 주목하여 상기 유전자 가위를 표적핵산 결합에 사용하되, 상기 유전자 가위의 표적핵산 절단 기능을 불활성화 시키는 것으로 표적 핵산을 결합하면서도 그 서열을 유지할 수 있다.
이때 상기 유전자 가위는 기존에 사용되는 방법에 의하여 표적핵산 절단 기능을 불활성화 시킬 수 있다. 예를 들어, 열처리, 산이나 염기처리, 자외선 조사, 이종 염기서열 삽입등에 의하여 상기 유전자 가위의 핵산 절단기능을 선택적으로 불활성화 시킬 수 있다.
상기 불활성화된 유전자 가위는 가이드 RNA를 포함하는 것일 수 있다. 상기 가이드 RNA는 표적 핵산에 특이적인 RNA(예를 들어, DNA의 표적 부위와 혼성화 가능한 RNA)를 의미하며, 절단효소와 함께 크리스퍼 시스템의 일 요소로 사용될 수 있다. 다만 본 발명의 경우 상기 크리스퍼 시스템(유전자 가위)의 절단 기능이 불활성화되어 있으므로, 상기 절단효소를 포함되지 않을 수 있다. 일반적으로 상기 가이드 RNA의 경우 상기 표적핵산과 선택적으로 결합된 다음, 상기 절단효소를 투입하게 되면 상기 표적핵산을 절단하게 되지만 본 발명의 경우 이러한 절단 기능이 불활성화된 상태이므로, 상기 가이드 RNA은 표적핵산과 선택적인 결합에만 사용될 수 있다.
상기 포획 프로브(120)는 미세입자(110)의 표면에 흡착시키거나 화학적으로 연결시켜 고정시킬 수 있으며, 바람직하게는 쉘 층(114)의 표면의 기능기와 연결될 수 있다. 예를 들어 상기 포획 프로브(114)의 표면에 비오틴(biotin)을 도입하고 미세입자(110)에는 비오틴과 결합하는 아비딘(avidin), 뉴트라비딘(neutravidin) 또는 스트렙타비딘(strepavidin)을 도입하여 포획 프로브(114)를 미세입자(110)에 부착시킬 수 있다. 또는 미세입자(110) 표면의 히드록시기, 아미노기 또는 카르복실기를 이용하여 포획 프로브(120)를 미세입자(110)에 연결시킬 수 있다.
본 발명은 또한 상기 진단용 미세입자 프로브; 표적 핵산에 상보적으로 결합하며, biotin이 표지된 리포터 핵산; 및 핵산증폭용 시약을 포함하는 POCT 다중 진단용 시스템을 제공한다.
상기 진단용 미세입자 프로브의 경우 위에서 설명한 바와 동일하기 때문에 생략한다.
상기 리포터 핵산의 경우 원하는 표적핵산의 존재여부에 따라 신호를 생성하는 핵산을 의미하는 것으로 본 발명의 리포터 핵산은 표적 핵산에 상보적으로 결합하며, biotin이 표지된 것일 수 있다.
상기와 같이 biotin이 표지된 리포터 핵산은 상기 표적 핵산의 일부 또는 전부와 상보적으로 결합될 수 있으며, 특히 표적핵산의 증폭과정에서 동시에 증폭되어 상기 표적핵산에 상보적으로 결합될 수 있다. 이를 통하여 상기 표적핵산의 경우 대부분이 상기 biotin이 표지된 리포터 핵산과 결합되어 존재하게 되며, 이는 상기 진단용 미세입자 프로브와 결합되는 대부분의 표적핵산에 biotin이 표지된 리포터 핵산에 결합되어 있음을 의미한다.
기존의 미세입자를 이용한 진단방법에서는 상기 리포터 핵산이 상기 미세입입자에 결합되는 프로브의 일부로 제공되었다. 즉 상기 리포터 핵산의 경우 상기 진단용 미세입자 프로브의 일부로서 존재하여, 이러한 리포터 핵산의 활성화 여부를 조절하여 신호를 발생시키고 있다. 하지만 이 경우 상기 표적핵산의 결합 및 검출과 상기 리포터 핵산의 활성화 여부가 각기 다른 단계에서 수행되므로 민감도가 떨어질 뿐만 아니라 추가적인 단계를 수행해야 하므로 전체적인 진단방법이 복잡해지는 결과를 가져오게 된다.
하지만 본 발명의 경우 상기와 같이 크리스퍼 시스템에 의하여 상기 표적핵산을 선택적으로 미세입자의 표면에 부착할 수 있으며, 상기 리포터 핵산의 경우 상기 표적핵산과 상보적으로 결합되어 있으므로, 높은 선택도를 가짐과 동시에 민감도 역시 높아질 수 있다.
또한 기존의 크리스퍼 시스템을 이용한 진단방법의 경우 상기와 같이 표적핵산이 결합되는 경우 상기 리포터 핵산의 일부 또는 전부를 절단하는 것으로 신호를 차단하여 표적핵산의 존재여부를 검출하였지만, 이와 같은 방법의 경우 표적핵산의 농도가 낮으면 미세입자 표면의 리포터 핵산 일부만 절단되어 신호가 차단되므로, 신호의 강도가 일부 낮아질 뿐 여전히 신호를 발산하고 있을 수 있다. 이런 결과로 인하여 위양성이 크게 증가될 수 있으며, 민감도가 낮을 수 밖에 없다. 하지만 본 발명의 경우 리포터 핵산으로 표지된 표적핵산이 상기 크리스퍼 시스템에 의하여 상기 미세입자의 표면에 포획되므로, 상기 표적 핵산의 농도가 낮더라도 상기 리포터 핵산의 일부가 신호를 발생시킬 수 있으므로, 높은 민감도를 가질 수 있다.
상기 리포터 핵산(130)은 화학적, 기계적, 광학적, 전기적 에너지를 비롯한 외부 자극에 의하여 신호, 예를 들어 광학적 또는 전기적 신호를 발생시킨다. 일 구현예에서, 리포터 핵산(130)은 발광 물질로 라벨링된 핵산일 수 있으며, 외부 광 또는 화학반응에 의해 형광 혹은 화학발광과 같은 발광 신호를 발생시킬 수 있다.
구체적으로, 상기 리포터 핵산(130)은 상기 표적핵산이 상보적인 DNA 일 수 있다. 또한, 상기 리포터 핵산은 15mer 내지 40mer의 핵산일 수 있다. 또한, 18mer 내지 30mer, 19mer 내지 25mer, 또는 20mer 내지 23mer일 수 있다.
상기 발광 물질은 상기 리포터 핵산에 연결되어 자외선, 전자선, 화학반응, 효소-기질 반응 등과 같은 외부 자극에 의해 빛을 생성함으로써 상기 표적 핵산의 존재를 검출할 수 있게 한다. 상기 발광 물질의 예로서, 형광분자, 양자점, 금속 나노입자, 자기 나노입자, 효소, 효소 기질 등을 들 수 있다. 이들 중 입수용이성 및 적용의 편이성 면에서 다양한 발광 물질로서 형광분자가 선택될 수 있다.
상기 형광분자의 예로서, FITC(fluorescein isothiocyanate), 플루오레세인(fluorescein), FAM(fluorescein amidite), PE(phycoerythrin), 유로피움(Europium), TRITC(tetramethyl-rhodamine isothiocyanate), Cy3(Cyanine 3), Cy5(Cyanine 5), Cy7(Cyanine 7), 알렉사(Alexa) 플루오르 염료, 및 로다민 (rhodamine)으로 이루어 진 군에서 선택되는 형광분자가 흔히 사용될 수 있다.
검체 내의 다양한 바이오마커의 검출을 위해 FITC, PE, Alexa-647 등의 다양한 형광단(fluorophore)을 리포터 핵산(130)의 5'- 위치에 도입하여 라벨링할 수 있다.
또한 본 발명의 경우 상기 형광물질은 상기 표적 핵산이 상기 포획 프로브이 결합된 이후 공급되어 상기 리포터 핵산과 결합될 수 있다. 이때 상기 리포터 핵산과 결합되지 않고 비특이적 결합된 형광물질의 경우 세척에 의하여 간단히 제거될 수 있으므로, 상기 미세입자의 표면에는 특이적으로 결합된 표적핵산 및 상기 형광물질만이 남아 있게 된다.
상기 다중진단 시스템은 핵산증폭용 시약을 포함할 수 있다. 상기 핵산증폭용 시약은 표적 핵산을 증폭하기 위한 것으로 특별히 제한되지 않지만, 등온 조건에서 핵산 증폭이 시행되는 루프-매개 등온증폭(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP), 단일 프라이머 등온증폭(Single primer isothermal amplification, SPIA), 재조합 폴리머라제 증폭(Recombinase polymerase amplification, RPA) 등일 수 있으며, 신속성 및 저온 반응 특성면에서 바람직하게는 RPA 시약일 수 있다. 예를 들어, RT-RPA 시약에는 표적 핵산을 특이적으로 증폭하기 위한 표적 특이적 프라이머들이 포함될 수 있다. 또한 위에서 살펴본 바와 같이 상기 표적 핵산이 증폭되는 동안 상기 리포터 핵산 역시 증폭될 수 있다. 본 발명의 리포터 핵산의 경우 상기 표적핵산에 상보적인 서열을 가지고 있다. 따라서 상기 표적핵산의 증폭과정에서 상기 리포터 핵산 역시 증폭될 수 있으며, 이 결과로 상기와 같이 증폭된 표적핵산의 경우 대부분이 상기 리포터 핵산과 결합되어 존재할 수 있다.
상기 진단용 미세입자 프로브는 직경, 두께, 길이, 형상 또는 식별 코드에 의해 서로 구분되도록 표지된 것일 수 있다.
본 발명의 경우 상기 크리스퍼-카스 시스템과 같은 유전자 가위를 사용하여 표적 핵산을 상기 미세입자의 표면에 포획하고 있다. 이때 상기 크리스퍼-카스 시스템과 같은 유전자 가위를 2종 이상 사용하는 경우 각기 상이한 표적핵산을 동시에 포획하는 것이 가능하다.
하지만 이와 같은 동시 포획만으로는 상기 표적핵산의 종류를 구분하기 어려우므로, 상기 미세입자의 형상을 각기 달리하여 각각의 크리스퍼-카스 시스템과 같은 유전자 가위를 사용하게 되면 형상의 차이에 의하여 각기 다른 표적 핵산을 용이하게 구분할 수 있으며, 또한 동시 검출이 가능하다.
일례로 상기 미세입자 프로브가 마이크로로드일 경우, 서로 다른 길이를 갖는 마이크로로드들을 사용하고 여기에 크리스퍼-카스 시스템과 같은 유전자 가위 기술을 이용함으로써 제1 검출핵산과 제2 검출핵산 대상으로 명시야 이미지와 형광 이미지를 분석하는 과정을 통해 신속하게 각각의 핵산의 종류와 양을 독립적으로 구할 수 있다. 예를 들어 유리 코팅 미세 와이어를 다양한 길이로 절단하여 만든 마이크로로드들을 미세입자 프로브들로 사용하면 단 1개의 형광 물질로도 단일염기 다형성 분석이 가능하다. 각 길이 정보로 코드화된 미세입자 프로브들을 이미지 분석을 통해 해석함으로써 한 번에 다중 탐지(multi-detection)가 가능하며, 고감도의 정확도를 유지할 수 있는 장점이 있다.
아울러 이와는 별도로 상기 리포터 핵산에 부착되는 형광물질을 이용하여 각 표적 핵산을 구분하는 것도 가능하다. 각 형광물질에 특이적으로 결합하는 2종 이상의 리포터 핵산을 사용하는 경우 각 표적 핵산의 종류에 따라 상기 리포터 핵산은 상이한 파장을 가지는 형광을 발광할 수 있으며, 이를 편광분석 또는 파장 분석을 통하여 구분하게 되면 2종 이상의 표적 핵산 존재여부를 동시에 판정할 수 있다. 다만 이러한 방법의 경우 형광물질과 조합되는 리포터 핵산의 종류가 한정되어 있으며, 일부 형광물질의 경우 발광파장이 겹치거나 발광을 위하여 다양한 파장의 광원이 필요하므로, 위의 미세입자의 형상을 이용하는 방법에 비하여 효율이 떨어질 수 있다.
본 발명은 또한 (a) 표적 핵산을 검체로부터 추출하는 단계; (b) 상기 표적 핵산을 증폭하고 리포터 핵산을 결합시키는 단계; (c) 미세입자; 상기 미세입자의 표면에 도입되는 포획 프로브; 및 상기 포획프로브에 결합되며 표적핵산에 상보적인 유전자 서열을 포함하는 불활성화된 유전자 가위를 포함하는 진단용 미세입자 프로브를 제공하는 단계; (d) 상기 진단용 미세입자 프로브와 상기 표적 핵산을 반응시켜 상기 표적 핵산 및 상기 리포터 핵산을 포획하는 단계; (e) 상기 리포터 핵산에 형광물질을 부착시키는 단계; 및 (f) 염색된 상기 리포터 핵산으로부터 방출되는 형광 신호를 측정하여 상기 표적 핵산을 검출하는 단계를 포함하는 표적 핵산의 검출방법을 제공한다.
먼저 (a) 표적 핵산을 검체로부터 추출한다. 검체의 세포막을 파괴하여 세포 내 핵산을 밖으로 나오도록 구아니디니움 티오시아네이트(Guanidinium thiocyanate)를 함유한 라이시스(lysis) 용액을 사용할 수 있다. 용액 내 핵산들은 자성 실리카 비드 혹은 본 발명의 실리카 코팅된 미세입자(110)에 부착시켜서 농축시키고 알코올을 이용해 세척하는 과정, 용리 버퍼(elution buffer)를 이용해 탈리하는 과정을 거칠 수 있다.
다음 (b) 상기 표적 핵산을 증폭한다. 예를 들어 역전사 실시간 중합효소연쇄반응(RT-RPA) 시약을 이용하여 표적 핵산을 특이적으로 증폭시킬 수 있다. 또한 이 과정에서 위에서 살펴본 바와 같이 상기 리포터 핵산역시 동시에 증폭될 수 있으며, 상기와 같이 증폭이 완료된 이후에는 상기 표적 핵산 및 리포터 핵산이 상보적으로 결합될 수 있다.
이어 (c) 진단용 미세입자 프로브를 제공한다. 상기 진단용 미세입자 프로브는 미세입자; 상기 미세입자의 표면에 도입되는 포획 프로브; 및 상기 포획프로브에 결합되며 표적핵산에 상보적인 유전자 서열을 포함하는 불활성화된 유전자 가위를 포함한다. 본 미세입자의 각 구성 요소들에 대한 상세한 설명은 상술한 바와 같다.
(d) 상기 진단용 미세입자 프로브와 상기 표적 핵산을 반응시켜 상기 표적 핵산 및 상기 리포터 핵산을 포획할 수 있다. 위에서 살펴본 바와 같이 상기 진단용 미세입자 프로브의 경우 상기 유전자 가위에 포함되는 가이드 RNA가 상기 표적핵산과 상보적으로 결합할 수 있으므로, 상기 표적핵산을 상기 진단용 미세입자 프로브에 선택적으로 포획할 수 있다. 이때 상기 리포터 핵산의 경우 상기 표적핵산과 상보적으로 결합되고 있으며, 상기 리포터 핵산 역시 상기 진단용 미세입자 프로브에 부착될 수 있다. 그 결과로 진단용 미세입자 프로브-핵산의 복합체를 형성할 수 있다.
또한 상기 복합체의 형성은 외부 자력을 이용한 반응 촉진 과정을 포함할 수 있다. 예를 들어 반응 촉진을 위해 반응물들이 담긴 웰은 적절한 온도로 가열될 수 있으며, 웰 내부에 자석봉을 상하로 연속적으로 이동시킴으로써 자성 물질을 함유한 미세입자들을 제어하여 반응을 촉진시킬 수 있다.
(e) 상기 리포터 핵산에 형광물질을 부착시킬 수 있다. 상기 형광물질은 상기 리포터 핵산에 부착될 수 있으며, 후술한 단계에서 외부자극에 의하여 형광을 발산할 수 있다.
또한 상기 형광물질의 경우 상기 리포터 핵산에만 부착되어야 하지만 원하지 않는 위치에 비특이적으로 부착되거나 물리적으로 흡착될 수 있다. 이러한 비정상적인 형광물질의 부착은 위양성을 나타내는 요인으로 작용하게 된다. 본 발명의 경우 이러한 비정상적으로 결합되는 형광물질은 세척에 의하여 용이하게 제거될 수 있다. 즉 상기 (e)단계 이후 상기 표적핵산 및 리포터 핵산이 부착된 진단용 미세입자 프로브를 세척하는 단계를 포함할 수 있다.
아울러 이러한 세척의 경우 상기 표적핵산에 결합되지 않은 리포터 핵산 및 이전 과정에서의 잔류시약을 제거할 수 있어 본 발명의 방법에 의한 진단시 정확도를 높일 수 있다.
상기 (f)단계는 염색된 상기 리포터 핵산으로부터 방출되는 형광 신호를 측정하여 상기 표적 핵산을 검출하는 단계일 수 있다.
상기와 같이 진단용 미세입자 프로브에 표적핵산, 리포터 핵산 및 형광물질이 부착되면, 외부자극을 통하여 상기 형광물질이 신호를 발생시킬 수 있다. 이때 상기 외부 자극에 의해 상기 복합체로부터 방출되는 상기 신호의 온-오프를 측정하여 상기 표적 핵산을 검출한다. 상기 신호는 상기 복합체 내 발광물질로부터 방출되는 발광 신호일 수 있다. 상기 외부 자극은 자외선, 전자선, 화학반응, 효소-기질 반응 등일 수 있다. 예를 들어, 상기와 같이 표적핵산 및 리포터 핵산이 상기 진단용 미세입자 프로브와 결합되기 전에는 자외선과 같은 외부 자극을 주는 경우에도 상기 진단용 미세입자 프로브는 발광하지 않는다. 하지만 상기와 같은 과정을 거쳐 가이드 RNA에 표적핵산 및 리포터 핵산이 부착되고 상기 리포터 핵산에 형광물질이 결합되면 상기와 같은 외부자극에 의하여 상기 진단용 미세입자 프로브가 발광할 수 있다. 따라서 명시야 이미지와 함께 겹쳐서 형광이미지를 분석하면 표적 핵산과 복합체를 이룬 미세입자 프로브를 특정할 수 있어 표적 핵산을 구분할 수 있다.
이때 상기 표적 핵산의 검출은 2종 이상의 단일 염기 다형성 분석을 위한 미세입자 프로브를 사용하여 각 프로브의 발광차이를 측정하는 것으로 표적 핵산의 유무를 식별하는 것일 수 있다. 즉 원하지 않는 핵산이 존재하는 경우와 원하는 표적 핵산이 존재하는 경우 각기 다른 종류의 프로브가 각각 발광하게 되므로 명시야 이미지 촬영과 형광 이미지 촬영을 병행하여 이를 구분할 수 있다. 이와는 별도고 2종이상의 표적핵산이 존재하는 경우에도 이를 각각 구분하여 각 진단용 미세입자 프로브에 부착할 수 있으므로, 형광이미지 상의 진단용 미세입자 프로브 형상을 통하여 이를 각각 구분하는 것이 가능하다(도 6 참조).
상기 표적 핵산의 검출방법은 마이크로 웰 상에서 수행되는 것일 수 있다. 상기와 같인 검출과정을 각각의 시험관 또는 용기에서 진행하는 것도 가능하지만, 마이크로웰 상에서 진행하는 것으로 소형화 및 키트화를 달성할 수 있다. 즉 상기 마이크로웰의 내부에는 진단용 미세입자 프로브, 버퍼, 증폭용 시약, 세척 버퍼 등이 순차적으로 적재되어 있을 수 있으며, 상기 검체를 공급하여 상기 진단용 미세입자 프로브를 순차적으로 이동시켜 상기 표적핵산 검출방법을 수행할 수 있다(도 3 내지 도 5 참조).
이를 상세히 살펴보면 다음과 같다.
1) Well 1: 미세입자에 핵산 바인딩
자성을 가지는 미세입자, 카오트로픽 염(chaotropic salt), 및 용해(lysis) 용액이 담겨져 있는 웰 1 (well 1)에 검체를 투입하여 검체의 막이 파괴됨으로써, 막 내 핵산이 밖으로 나오면 카오트로픽 염의 작용으로 핵산이 자성을 가지는 미세입자에 부착된다.
2) Well 2: 세척 및 불순물 제거
핵산이 부착되어 있는 자성을 가지는 미세입자를 웰 2(well 2)로 옮겨 33% 이소프로판올과 염이 포함된 용액으로 불필요한 잔존 불순물이 제거된다.
3) Well 3: 세척
핵산이 결합되어 있는 자성 자성을 가지는 미세입자를 70% 에탄올을 이용하여 세척한다. 이 과정에서 핵산 이외의 염이 제거된다.
4) Well 4: 핵산 증폭 또는 혼성화
핵산이 결합되어 있는 자성을 가지는 미세입자를 반응 버퍼(reaction buffer)가 포함된 웰 4(well 4)로 옮겨 자성을 가지는 미세입자로부터 핵산을 탈리시킨다. 그 다음 well 4에 포함된 RT-RPA 시약으로 표적 핵산의 cDNA 합성 및 증폭시키거나 표적 핵산의 상보적인 서열을 갖는 biotin이 표지된 리포터 핵산으로 표적 핵산에 혼성화 한다. RT-RPA 시약에는 RSV, 인플루엔자(Influenza), 코로나바이러스(Coronavirus) 유전자를 특이적으로 증폭하고 biotin으로 표지하기 위한 표적 특이적 프라이머들이 포함될 수 있다.
한편 서로 다른 세개의 길이를 갖는 3종의 자성 미세입자 프로브/불활성화된 유전자가위 복합체들을 준비한다. 각각의 특정 길이의 자성 미세입자 프로브 복합체에는 특정 바이러스만을 표적으로 하는 guide RNA/dCas9 복합체가 고정되어 있다. 표적 유전자가 RT-RPA에 의해 증폭됨에 따라, 이 과정에서 증폭되는 각각의 표적 유전자의 이중가닥 부위를 인식하는 자성 미세임자 복합체에 포획되어 포획체가 형성된다.
다른 한편으로 RT-RPA과정 없이 표적 핵산에 표적 핵산의 상보적인 서열을 갖는 biotin이 표지된 리포터 핵산으로 혼성되고, 서로 다른 세개의 길이를 갖는 3종의 자성 미세입자 복합체를 반응시켜 표적 유전자가 포획되어 포획체가 형성된다.
5) Well 5: 자성 미세입자 표적 핵산 포획체의 형광염색
웰 4(well 4)에서 반응이 완료된 자성 미세입자 표적 핵산 포획체를 Streptavidin, R-Phycoerythrin Conjugate(SAPE)가 포함되어 있는 웰 5(well 5)로 옮겨준다. SAPE는 자성 미세입자 표적 핵산 포획체에 표지 된 biotin에 바인딩하게 된다.
6) Well 6: 세척
반응이 완료된 자성 미세입자 표적 핵산 포획체를 세척 버퍼(washing buffer)로 세척한다.
7) Well 7: 세척
반응이 완료된 자성 미세입자 표적 핵산 포획체를 세척 버퍼로 한 번 더 세척한다.
8) Well 8: 이미지 분석
반응 및 세척이 완료된 자성 미세입자 표적 핵산 포획체를 이미징 한다. 이때 명시야 이미지(bright filed image)와 형광 이미지(fluorescence image) 모두 얻는다.
상술한 진단용 미세입자 프로브 및 이를 이용한 진단 방법은 다음과 같은 장점을 가질 수 있다. 본 발명은 크리스퍼-카스(CRISPR-CAS) 유전자 가위 기술을 이용하여 기존 RT-PCR(Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction) 방식의 POCT 분석의 한계를 극복하였다. 기존 POCT 분석을 위한 분자 진단 방법은 현장에서 검체의 채취, 수탁 기관에서 유전자 추출, 증폭, 검출의 과정이 이루어지며 고가의 장비를 이용하여 유전자 증폭의 결과를 얻었다. 이러한 과정으로 인해 현장에서 대량의 샘플 검사에 적합하지 않으며 결과를 얻을 때까지 최소 6시간 이상의 시간이 소요되었다. 그러나 본 발명은 크리스퍼-카스 유전자 가위 기술의 도입으로 유전자 추출, 증폭, 검출의 과정이 현장에서 가능하며 자동화가 가능하다(자성입자의 사용에 의해 유전자 추출, 증폭 단계에서의 시간을 대폭 줄일 수 있음). 또한 본 발명은 기존 분자 진단에서 보이는 비특이적 증폭(non-specific amplification) 현상을 불활성화된 크리스퍼-카스 유전자 가위 기술로 극복하였다. 마지막으로 기존의 활성화된 크리스퍼-카스 유전자 가위 기술을 사용한 진단방법의 경우 형광이 사라지는 것을 양성으로 판단하고 있지만 이 경우 표적 핵산의 양이 적은 경우 위양성이 발생될 가능성이 높다. 하지만 본 발명의 경우 불활성화된 유전자 가위를 사용하는 것으로 형광의 발산을 양정으로 판단하고 있으므로, 기존의 방법에 비하여 높은 선택도 및 감도를 가질 수 있다.
이하, 본 발명의 바람직한 실시예를 첨부한 도면을 참조하여 당해 분야의 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 설명하기로 한다. 또한, 본 발명을 설명함에 있어 관련된 공지의 기능 또는 공지의 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략하기로 한다. 그리고 도면에 제시된 어떤 특징들은 설명의 용이함을 위해 확대 또는 축소 또는 단순화된 것이고, 도면 및 그 구성요소들이 반드시 적절한 비율로 도시되어 있지는 않다. 그러나 당업자라면 이러한 상세 사항들을 쉽게 이해할 것이다.
실시예
실시예 1. 핵산 포집용 자성 미세입자의 제조
본 POCT 다중 진단용 시스템에 있어서 8개의 웰(well)들이 사용되었으며 각 웰들 간의 핵산 이동을 위해서는, 표적 인자로부터 추출된 핵산을 안정적으로 포집하여 웰 간 이동을 시킬 수 있는 자성 미세입자의 사용이 필수적이다. 핵산의 안정적 포집을 위해 10 내지 1000 ㎛ 크기의 원기둥형 자성 미세입자 또는 상용화된 자성 미세입자를 원재료로 사용하여 충분한 표면적을 가진 핵산 포집용 자성입자를 제조하였다.
먼저 준비된 기본형의 자성 미세입자(자사 제조, 도 2의 (110)에 해당하는 포획 프로브가 도입되어 있지 않은 코어-쉘 형태의 기본형 자성 미세입자로서, 100 - 500 ㎛ 길이를 가진 원기둥 막대형)를 0.1M의 수산화나트륨 용액으로 3회, 100% 에탄올 용액으로 3회 수세한 후, 2초 간 초음파 세척하였다.
다음 암모니아수를 포함한 용액(100% 에탄올 20 ml, 탈이온수 3 ml, 암모니아수 1 ml 조성) 10 ml에 상기 자성 미세입자 200mg을 투입하고, 단위 자성 입자 10mg 당, TEOS (Tetraethylorthosilicate) 100 ㎕ 기준으로, TEOS 용액 2 ml을 첨가하였다. 상기 용액을 로테이터(rotator) 장치(FINEPCR, Hybridization Incubator Combi-H12)를 이용하여 20분 간 20 rpm 회전시키는 과정을 1회 반응으로 하되, 각 반응 진행 시 마다, TEOS 2ml 용액을 첨가하여 총 4회 반응을 진행하여 자성 미세입자 제작을 완료하였다. 반응 후 얻어진 자성입자를 앞선 암모니아수 포함 용액으로 3회, 100% 에탄올로 3회 수세한 후, 에탄올 용액에 보관하였다.
핵산 포집용으로 제작된 자성 미세입자의 핵산 포집능을 확인하기 위한 목적으로, 임의의 샘플을 준비하여 실제 핵산 포집능을 확인하였다. 임의의 샘플로서 가상의 바이러스 또는 유해균을 상정해볼 수 있는데 여기서는 임의의 대장균을 대상으로 선정하여 핵산 포집 유무를 확인하였다.
도 7은 자성입자 기반 표적 샘플의 핵산 포집 가능성을 사전 확인한 결과를 나타낸 것이다. 도 7의 A는 임의의 표적 인자로 설정한 대장균 샘플을 바탕으로 기존 상용화 대장균 plasmid mini prep. kit (Bioneer, AccuPrep® Plasmid Mini Extraction Kit)을 기반으로 플라스미드 DNA(plasmid DNA)가 도입된 대장균으로부터 플라스미드 DNA를 정제 분리한 결과와 자사 자성 미세입자를 기반으로 제작된 핵산 포집용 자성 미세입자 beads를 통해 plasmid DNA 도입 대장균으로부터 plasmid DNA를 아가로즈 겔 기반의 전기영동법으로 정제 분리하여 비교한 결과이다.
도 7의 A를 참조하면, 자사의 핵산 정제용 자성입자가 100개, 및 500개가 있는 조건에서 plasmid DNA를 정제 포집할 수 있음을 알 수 있다.
Lysis buffer :　Well 1을 구성하는 버퍼(buffer) 조성 (2M guanidinium thiocyanate, 36.7 mM Tris-Cl, 16.7 mM EDTA, 2% Triton X-100, 33% isopropanol, RNase free water)을 바탕으로 배양된 1 ml 의 대장균 농축 샘플과 자사 자성 미세입자 비드를 섞은 후, 회전(rotating) 교반 10분 진행, lane 1, 2 -상용화 plasmid prep. kit 정제 결과 1, 2번, lane 3 - 자사 핵산 정제용 비드(beads) 100ea 기준 정제 결과, lane 4 - 자사 핵산 정제용 beads 500ea 기준 정제 결과, lane M : 1kb DNA ladder (솔젠트, 1 Kb Plus DNA Ladder))
도 7의 B는 도 7A와 동일한 조건에서 plasmid prep. kit과 자사 핵산 정제용 beads 500ea 기준 핵산 정제를 확인한 결과이다. 도 7의 B를 참조하면, plasmid prep. kit 대비 자사 자성입자 핵산 정제를 통해 대장균의 genomic DNA를 비롯해 plasmid DNA 모두 정제 회수할 수 있음을 확인할 수 있다.
도 7의 C는 2 ㎍ 농도의 plasmid DNA를 표적으로 자사 자성입자의 포집능을 확인한 결과이다. 도 7의 C를 참조하면, 자사 핵산 정제용 자성입자를 통해 7.3% 정도의 비율로 핵산 샘플을 포집할 수 있다는 점을 통해 임의의 핵산에 대한 포집능을 확인할 수 있다.
실시예 2. 표적 인자 lysis 및 핵산 포집 증폭 단계 (Well 1 - Well 4)
표적 샘플 lysis부터 자성입자 프로브를 이미징하기까지 과정을 단일 process 과정으로 진행하는 자사 자동화 장비 적용 가능성을 확인하였다. 라이시스(Lysis) 및 포집에 의해 얻어진 표적 핵산이 정상적으로 well 간 이동을 통해 순차적으로 프로세스가 진행되는지 확인하기 위한 이동성 테스트를 진행하였다.
도 9는 본 발명의 일 구현예에 따른 다중 진단방법에서 표적 샘플의 핵산 포집 및 표적 부위 핵산 증폭을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 웰 1(Well 1)에서 웰 4(Well 4)까지 순차적으로 이루어지는 표적 핵산의 포집 및 증폭 프로세스를 나타낸다. 도 8을 참조하면, 웰 1(Well 1)에서 Lysis/핵산 포집을 수행하며, 바이러스 샘플로부터의 추출 및 포집을 위해 Chaotropic salt를 포함한 용액(2M guanidinium thiocyanate, 36.7 mM Tris-Cl, 16.7 mM EDTA, 2% Triton X-100, 33% isopropanol, RNase free water)을 이용하여 바이러스 샘플로부터 핵산을 추출하고 포집하였다.
웰 2(Well 2)에서 첫번째 세정 과정(washing-1)이 이루어지는데 2M guanidinium thiocyanate, 36.7 mM Tris-Cl, 16.7 mM EDTA, 2% Triton X-100, RNase free water + 66% Isopropanol를 이용하여 포집된 핵산을 포함한 자성입자를 세정하고 포집 핵산을 좀더 자성입자에 농축시켰다.
웰 3(Well 3)에서 두번째 세정 과정(washing-2)이 이루어지며, 70% 에탄올을 이용하여 자성입자에 부착된 잔여 부산물(waste)을 제거하였다.
웰 4(Well 4)에서 핵산의 회수 및 증폭이 이루어지며, 자성입자에 부착된 핵산을 탈리시킨 후, 탈리된 핵산들을 증폭시켰다. 핵산 증폭을 위해 RPA(Recombinase Polymerase Amplification) 효소 복합체를 기반으로 구성된 용액을 이용하였다.
도 9는 인플루엔자의 일종인 IBVs 바이러스 RNA에 대하여 핵산 포집 및 증폭 과정을 거친 결과이다. Well 4에서 탈리된 표적 핵산을 IBVs 바이러스 RNA를 투입한 조건에서 RT-RPA(Reverse Transcriptase Recombinase Polymerase Amplification) 반응을 37도 온도 조건에서 20분 진행하였다. 이때 사용한 RPA 시약의 조성은 제조사(TwistDx, TwistAmp Liquid Kit)에서 권장하는 프로토콜을 따라 반응을 진행하였다. 도 9를 참조하면, RNA 샘플이 포집되어 Well들 사이에 이동을 거친 후에 Well 4에서 핵산 해리된 다음 RT-RPA 효소 복합체에 의해 핵산 증폭이 정상적으로 이뤄졌음을 확인할 수 있다.
하기의 표 1은 표적 서열 증폭용 프라이머를 나타낸 것이다.
COVID19 RPA
Forward 5’-/Biotin-TEG/ATAATGGACCCCAAAATCAGCCGAATGCACCCC/-3’(서열번호 1)
Reverse 5'- GTGAGAGCGGTGAACCAAGACGCAGTATTATTG-3’ (서열번호 2)
Influenza A RPA
Forward 5’-/Biotin-TEG/GAACTATTACTGGACACTAGTAGAGCCTGGAGAC-3’ (서열번호 3)
Reverse 5’-CGTGGACTGATGTATCTGAAATGATGATACCAG-3’ (서열번호 4)
Influenza B RPA
Forward 5’-/Biotin-TEG/5'-ATGTCGCTGTTTGGAGACACAATTGCCTACTTG-3’ (서열번호 5)
Reverse 5'-GTTTTTTATCCATTCCAAGGCTGAGTCTAGGTC-3’ (서열번호 6)
이상의 결과를 바탕으로, 증폭된 핵산을 바탕으로 한 표적 신호 검출 및 POCT 진단이 가능함을 간접적으로 확인할 수 있었다.
실시예 3. 신호 검출용 자성입자 프로브 제작 및 기능성 확인 (Well 4 ~ Well 5)
신호 검출용 자성입자 프로브에 있어서, 자성입자 표면에 dCas9이 커플링(coupling)되어 있으며, 표적 인자의 표적 부위 서열 인식 역할을 하는 guide RNA (gRNA)와 dCas9 복합체가 형성된 상태로 자성입자 프로브가 제작된다.
이때 사용되는 불활성화된 유전자가위(dCas9)은 IDT에서 구입한 Alt-R S.p. dCas9 Protein V3를 사용하였다.
웰 4(Well 4)에서 RT-RPA를 통해 핵산이 증폭되면 웰 7(Well 7)에 존재하는 신호 검출용 자성입자 프로브를 Well 4로 옮겨 증폭된 핵산이 gRNA/dCas9 복합체에 포획된다.
웰 4(well 4)에서 반응이 완료된 자성 미세입자 표적 핵산 포획체를 Streptavidin, R-Phycoerythrin Conjugate(SAPE)가 포함되어 있는 웰 5(well 5)로 옮겨준다. SAPE는 자성 미세입자 표적 핵산 포획체에 표지 된 biotin에 바인딩하게 된다.
도 10은 표적 핵산 존재 시, 자성입자 프로브에 의해 표적핵산 유무에 따라 형광세기가 변화하는지 보기 위해 Cas 시스템 활성을 확인한 결과이다. Cas 시스템의 컨셉을 확인하기 위한 목적으로 진행한 실험으로, biotin이 표지된 표적핵산이 자성입자 프로브의 gRNA/dCas9 복합체에 포획되어 형광 신호가 검출됨을 확인할 수 있었다.
하기의 표 2는 Guide RNA의 정보를 나타낸 것이다.
COVID19
5’-AAA CGU AAU GCG GGG UGC AUG UUU UAG AGC UAG AAA UAG CAA GUU AAA AUA AGG CUA GUC CGU UAU CAA CUU GAA AAA GUG GCA CCG AGU CGG UGC UUU U-3’ (서열번호 7) 볼드체 염기서열은 2'-o-methyl phosphorothioate이 되어 있음
Influenza A
5’-UUC GAA UGU UAU CUU GUC UCG UUU UAG AGC UAG AAA UAG CAA GUU AAA AUA AGG CUA GUC CGU UAU CAA CUU GAA AAA GUG GCA CCG AGU CGG UGC UUU U-3’ (서열번호 8) 볼드체 염기서열은 2'-o-methyl phosphorothioate이 되어 있음
nfluenza B
5’-UUC UAU CAA UGA AAG CAA GUG UUU UAG AGC UAG AAA UAG CAA GUU AAA AUA AGG CUA GUC CGU UAU CAA CUU GAA AAA GUG GCA CCG AGU CGG UGC UUU U-3’ (서열번호 9) 볼드체 염기서열은 2'-o-methyl phosphorothioate이 되어 있음
실시예 4. 신호 검출용 자성입자 프로브의 바이러스 검출 확인
표적 인자 검출 가능성을 확인한 앞선 실시예를 바탕으로, 단일 표적 인자를 진단할 수 있는지 확인하였다.
단일 표적 인자에 대한 신호 검출 확인을 위해 3종의 호흡기 바이러스 표적 자성입자 프로브를 구성하여, 인플루엔자 A, 인플루엔자 B, COVID19 바이러스 표적에 대한 신호 검출 결과를 확인하였다.
도 11의 경우 인플루엔자 A, 인플루엔자 B, COVID19 바이러스를 해당 신호 검출용 자성입자 프로브를 이용하여 각각 검출이 가능함을 확인한 결과이다.
표적핵산이 존재하지 않는 negative control의 형광신호 세기값 (808.79) 대비 인플루엔자 A 표적이 존재하는 해당 신호 검출용 자성입자 프로브 그룹에서 형광신호 세기값(3412.74)이 현저히 높은 것을 확인하였다.
또한, 인플루엔자 B 검출용 자성입자 프로브를 사용한 실험에서도 negative control 형광신호 세기값(505.836) 대비 인플루엔자 B 검출 형광신호 세기값이 7384.3으로 확인되었으며, COVID19 검출용 자성입자 프로브를 사용한 실험에서도 negative control 형광신호 세기값(446.189) 대비 COVID19 검출 형광신호 세기값이 9215.27으로 확인되었다. 따라서 각각의 호흡기 바이러스가 존재할 경우 해당 바이러스의 RNA가 추출 및 증폭되고, 해당 길이를 갖는 신호 검출용 자성입자 프로브에 포획되어 형광 신호가 검출됨을 확인할 수 있었다.
실시예 5. 신호 검출용 자성입자 프로브의 다중검출 확인
호흡기 바이러스를 각각 검출이 가능함을 확인한 앞선 실시예를 바탕으로, 호흡기 바이러스 3종에 대해 다중검출이 가능한지 확인하였다.
200 um 길이의 자성입자 프로브는 인플루엔자 A를 검출하기 위한 것이며, 300 um 길이의 자성입자 프로브는 인플루엔자 B를 검출하기 위한 것이며, 400 um 길이의 자성입자 프로브는 COVID19를 검출하기 위한 것이다. 3가지 서로 다른 길이의 자성입자 프로브가 모두 존재할 경우 다중진단을 할 수 있음을 확인하는 실험을 진행하였다.
도 12의 인플루엔자 A Positive의 경우 3가지 서로 다른 길이의 자성입자 프로브가 존재하는 환경에서 인플루엔자 A 표적을 특이적으로 검출하는 실험을 진행하였다. 인플루엔자 A 표적 자성입자 프로브의 형광신호 세기값 (2507.45) 대비 인플루엔자 B 표적 자성입자 프로브의 형광신호 세기값(2136.23)과 COVID19 표적 자성입자 프로브의 형광신호 세기값(2046.03)이 낮게 확인되었다.
도 12의 인플루엔자 B Positive의 경우 3가지 서로 다른 길이의 자성입자 프로브가 존재하는 환경에서 인플루엔자 B 표적을 특이적으로 검출하는 실험을 진행하였다. 인플루엔자 B 표적 자성입자 프로브의 형광신호 세기값 (5194.37) 대비 인플루엔자 A 표적 자성입자 프로브의 형광신호 세기값(4231.45)과 COVID19 표적 자성입자 프로브의 형광신호 세기값(3657.74)이 낮게 확인되었다.
도 12의 COVID19 Positive의 경우 3가지 서로 다른 길이의 자성입자 프로브가 존재하는 환경에서 COVID19 표적을 특이적으로 검출하는 실험을 진행하였다. COVID19 표적 자성입자 프로브의 형광신호 세기값 (12443.7) 대비 인플루엔자 A 표적 자성입자 프로브의 형광신호 세기값(9215.27)과 인플루엔자 B 표적 자성입자 프로브의 형광신호 세기값(8388.55)이 낮게 확인되었다. 따라서 각각의 표적이 존재할 경우와, 표적이 모두 존재할 경우, 각 표적 존재를 인식하여 각각의 자성입자 프로브 역할을 할 수 있음을 도 12 그래프 분석 결과에서 확인할 수 있었다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (17)

  1. 미세입자;
    상기 미세입자의 표면에 도입되는 포획 프로브; 및
    상기 포획프로브에 결합되며 표적핵산에 상보적인 유전자 서열을 포함하는 불활성화된 유전자 가위;
    를 포함하는 진단용 미세입자 프로브.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 불활성화된 유전자 가위는 가이드 RNA를 포함하는 것인 진단용 미세입자 프로브.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 가이드 RNA는 상기 표적핵산 유전자의 표적 부위와 혼성화 가능한 뉴클레오타이드 서열을 갖는 것인 진단용 미세입자 프로브.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 불활성화된 유전자 가위는 표적 핵산 절단기능이 불활성화된 것인 진단용 미세입자 프로브.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 미세입자는 내부에 자성 입자들이 함유된 것인 진단용 미세입자 프로브.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 미세입자는 자성 물질을 포함하는 코어와 상기 코어를 둘러싸며 균일한 두께를 갖는 쉘 층을 구비한 코어-쉘 구조를 가지는 것인 진단용 미세입자 프로브.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 미세입자는 수중에서 부유하지 않는 크기 및 비중을 갖는 것인 진단용 미세입자 프로브.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 진단용 미세입자 프로브;
    표적 핵산에 상보적으로 결합하며, biotin이 표지된 리포터 핵산; 및
    핵산증폭용 시약;
    을 포함하는 POCT 다중 진단용 시스템.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 진단용 미세입자 프로브는 직경, 두께, 길이, 형상 또는 식별 코드에 의해 서로 구분되도록 표지된 것인 POCT 다중 진단용 시스템.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 진단용 미세입자 프로브는 상이한 길이를 가지는 2종 이상의 진단용 미세입자 프로브가 혼합되어 있는 것인 POCT 다중 진단용 시스템.
  11. 제8항에 있어서,
    상기 리포터 핵산은 상이한 색상을 가지는 형광체가 결합되는 2종 이상의 리포터 핵산이 혼합되어 있는 것인 POCT 다중 진단용 시스템.
  12. (a) 표적 핵산을 검체로부터 추출하는 단계;
    (b) 상기 표적 핵산을 증폭하고 리포터 핵산을 결합시키는 단계;
    (c) 미세입자; 상기 미세입자의 표면에 도입되는 포획 프로브; 및 상기 포획프로브에 결합되며 표적핵산에 상보적인 유전자 서열을 포함하는 불활성화된 유전자 가위를 포함하는 진단용 미세입자 프로브를 제공하는 단계;
    (d) 상기 진단용 미세입자 프로브와 상기 표적 핵산을 반응시켜 상기 표적 핵산 및 상기 리포터 핵산을 포획하는 단계;
    (e) 상기 리포터 핵산에 형광물질을 부착시키는 단계;
    (f) 염색된 상기 리포터 핵산으로부터 방출되는 형광 신호를 측정하여 상기 표적 핵산을 검출하는 단계;
    를 포함하는 표적 핵산의 검출방법.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 표적 핵산의 검출은 2종 이상의 상기 표적 핵산에 대해 2종 이상의 상기 진단용 미세입자 프로브를 이용하여 다중검출하는 것인 표적 핵산의 검출방법.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 다중검출은 길이, 직경, 두께, 형상, 색상 또는 식별 코드에 의해 서로 구분되도록 표지된 상기 진단용 미세입자 프로브들을 판독하는 과정을 포함하는 것인 표적 핵산의 검출방법.
  15. 제12항에 있어서,
    상기 (e)단계 이후,
    상기 표적핵산 및 리포터 핵산이 부착된 진단용 미세입자 프로브를 세척하는 단계를 추가로 포함하는 표적 핵산의 검출방법.
  16. 제12항에 있어서,
    상기 표적 핵산의 검출방법은 마이크로 웰 상에서 수행되는 것인 표적 핵산의 검출방법.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 진단용 미세입자 프로브는 외부 자력에 의하여 상기 마이크로 웰 사이를 이동 및 침지되는 것인 표적 핵산의 검출방법.
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