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KR20230142530A - 항체-약물 접합체 및 이의 의학적 용도 - Google Patents

항체-약물 접합체 및 이의 의학적 용도 Download PDF

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KR20230142530A
KR20230142530A KR1020237029060A KR20237029060A KR20230142530A KR 20230142530 A KR20230142530 A KR 20230142530A KR 1020237029060 A KR1020237029060 A KR 1020237029060A KR 20237029060 A KR20237029060 A KR 20237029060A KR 20230142530 A KR20230142530 A KR 20230142530A
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KR
South Korea
Prior art keywords
antibody
seq
antigen
bcma
pharmaceutically acceptable
Prior art date
Application number
KR1020237029060A
Other languages
English (en)
Inventor
하이칭 화
둥찌에 마오
옌 뤄
위에쥔 시에
Original Assignee
상하이 한서 바이오메디컬 컴퍼니 리미티드
장쑤 한서 파마슈티칼 그룹 캄파니 리미티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 상하이 한서 바이오메디컬 컴퍼니 리미티드, 장쑤 한서 파마슈티칼 그룹 캄파니 리미티드 filed Critical 상하이 한서 바이오메디컬 컴퍼니 리미티드
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Abstract

항-BCMA 항체-약물 접합체, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매 화물 및 이의 의학적 용도. 구체적으로, 상기 항체-약물 접합체는 항-BCMA 항체 또는 이의 항원-결합 단편 및 엑사테칸 유도체를 링커를 이용하여 연결함으로써 형성되고, 상기 항체-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물은 현저한 항종양 효과 및 우수한 안정성을 갖는다.

Description

항체-약물 접합체 및 이의 의학적 용도
본 발명은 생물의학 분야에 관한 것으로, 특히 본 발명은 항-BCMA 항체-약물 접합체 및 이의 의학적 용도에 관한 것이다.
B 세포는 림프구로 적응성 체액 면역과 항원을 특이적으로 인식하는 항체 생산에 중요한 역할을 한다. B 세포의 세 가지 하위 유형은 나이브 B 세포, 기억 B 세포 및 형질 세포이다. VDJ 재조합 과정에서, 게놈 라이브러리로부터 선택된 2개 또는 3개의 DNA 단편이 재조합되어 항체 가변 도메인의 조합 배열을 생성함으로써, 다른 계통의 B 세포에 의해 암호화된 가변 도메인을 추가로 변경하여 최대 109개의 특유한 B 세포 계통이 생성되고, 그 결과 특유한 표적에 특이적인 항체를 생성한다. B 세포는 많은 질병에 관여한다. B 세포의 악성 형질전환은 다발성 골수종 및 호지킨 림프종과 같은 일부 림프종을 포함한 암을 유발한다. B 세포는 또한 전신성 홍반성 루푸스(SLE) 및 IgA 신장병을 비롯한 자가면역 질환에 관여한다. B 세포-관련 암 및 자가면역 질환은 B 세포 기능의 이상으로 고려될 수 있으므로 이러한 질병을 제어하기 위한 가능한 전략은 병리학적 B 세포를 표적으로 하는 항체를 사용하는 것이다.
BCMA는 리간드 BAFF(B-세포 활성제) 및 APRIL(증식 유도-리간드)에 대한 비-당화 내인성 막 수용체인 TNF 수용체 슈퍼패밀리의 구성원이다. BCMA 및 해당 리간드는 체액성 면역, B 세포 발달 및 항상성의 다양한 기능을 조절할 수 있다. BCMA는 편도기억 B세포와 배중심 B세포에서 발현되고, 비장, 림프절, 흉선, 부신 및 간에서 검출되며, B 세포 계통에 대한 다양한 분석 결과는 성숙 후에 BCMA의 발현 수준이 증가함을 보여준다.
본 발명의 목적은 화학식 (I)의 항체-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물을 제공하는 것으로,
여기서:
W는 -(CReRf)g-X1-(CReRf)u-X2-(CReRf)h-이고;
Re 또는 Rf는 수소, 중수소, 하이드록실, 아미노, 알킬, 할로겐, 할로알킬, 중수소화 알킬, 하이드록시알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고; 바람직하게는 Re 또는 Rf는 수소, 중수소로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고; 보다 바람직하게는 Re 또는 Rf는 수소이고;
X1 또는 X2는 N, H, O 또는 S로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고; 바람직하게는 X1 또는 X2는 S로부터 독립적으로 선택되고; 보다 바람직하게는 X1 또는 X2는 O로부터 독립적으로 선택되고;
g, u 또는 h는 1, 2, 3 및 4 로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고; 바람직하게는 g, u 또는 h는 1, 2, 3으로부터 독립적으로 선택되고; 보다 바람직하게는 g, u 또는 h는 2이고;
y는 1 내지 20이고; 바람직하게는 y는 4 내지 10이고; 보다 바람직하게는 y는 4, 6, 8 또는 10이고;
Ab는 항-BCMA 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 상기 항-BCMA 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 여기서 중쇄 가변 영역은 서열번호: 3에 기재된 HCDR1, 서열번호: 4에 기재된 HCDR2 및 서열번호: 5에 기재된 HCDR3을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 서열번호: 6에 기재된 LCDR1, 서열번호: 7에 기재된 LCDR2 및 서열번호: 8에 기재된 LCDR3을 포함한다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 상기 항-BCMA 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 뮤린 항체, 키메라 항체, 인간 항체 또는 인간화 항체이다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 상기 항-BCMA 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 또는 이의 변이체로부터 유래된 중쇄 불변 영역을 추가로 포함하고;
바람직하게는 상기 항-BCMA 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간 IgG1, IgG2 또는 IgG4로부터 유래된 중쇄 불변 영역을 추가로 포함하고;
보다 바람직하게는 상기 항-BCMA 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 아미노산 돌연변이 후에 강화된 ADCC 독성을 갖는 IgG1 중쇄 불변 영역을 추가로 포함하고; 대안적으로, 상기 항-BCMA 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호: 22에 기재된 중쇄 불변 영역을 추가로 포함한다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 상기 항-BCMA 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간 κ 사슬, λ 사슬 또는 이의 변이체로부터 유래된 경쇄 불변 영역을 추가로 포함하고; 바람직하게는 상기 항-BCMA 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간 κ 사슬로부터 유래된 경쇄 불변 영역을 추가로 포함하고; 보다 바람직하게는 상기 항-BCMA 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호: 23에 기재된 경쇄 불변 영역을 추가로 포함한다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 상기 항-BCMA 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호: 9, 서열번호: 10 및 서열번호: 11로 이루어진 군으로부터 선택되는 중쇄 가변 영역, 또는 이들과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하고/하거나;
상기 항-BCMA 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호: 12, 서열번호: 13 및 서열번호: 14로 이루어진 군으로부터 선택되는 경쇄 가변 영역, 또는 이들과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 상기 항-BCMA 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호: 15, 서열번호: 16 및 서열번호: 17로 이루어진 군으로부터 선택되는 중쇄, 또는 이들과 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 동일성을 갖는 중쇄를 포함하고/하거나
상기 항-BCMA 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호: 18, 서열번호: 19 및 서열번호: 20으로 이루어진 군으로부터 선택되는 경쇄, 또는 이들과 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 동일성을 갖는 경쇄를 포함한다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 상기 항-BCMA 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호: 9에 기재된 중쇄 가변 영역 및 서열번호: 12에 기재된 경쇄 가변 영역을 포함하거나;
또는 상기 항-BCMA 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호: 10에 기재된 중쇄 가변 영역 및 서열번호: 13에 기재된 경쇄 가변 영역을 포함하거나;
또는 상기 항-BCMA 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호: 11에 기재된 중쇄 가변 영역 및 서열번호: 14에 기재된 경쇄 가변 영역을 포함한다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 상기 항-BCMA 항체는 서열번호: 15에 기재된 중쇄 및 서열번호: 18에 기재된 경쇄를 포함하거나;
또는 상기 항-BCMA 항체는 서열번호: 16에 기재된 중쇄 및 서열번호: 19에 기재된 경쇄를 포함하거나;
또는 상기 항-BCMA 항체는 서열번호: 17에 기재된 중쇄 및 서열번호: 20에 기재된 경쇄를 포함한다.
본 발명의 바람직한 실시양태에 있어서, 상기 항체-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물은 하기 화학식 (II)에 표시된 것, 또는 이들의 토토머, 메소머, 라세미체, 거울상이성질체, 부분입체이성질체 또는 이들의 혼합물 형태이고;
여기서, Ab는 상기 정의된 바와 같은 항-BCMA 항체 또는 항원-결합 단편이고,
y는 2 내지 10에서 선택된 수, 바람직하게는 4 내지 10에서 선택된 수, 보다 바람직하게는 4, 6, 8 또는 10이다.
본 발명의 바람직한 실시양태에 있어서, 상기 항체-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물은 하기 화학식 (III)에 기재되거나, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물이고;
여기서, Ab는 상기 정의된 바와 같은 항-BCMA 항체 또는 항원-결합 단편이고,
y는 2 내지 10에서 선택된 수, 바람직하게는 4 내지 10에서 선택된 수, 보다 바람직하게는 4, 6, 8 또는 10이다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 상기 항체-약물 접합체 또는 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물은 하기 구조로 이루어진 군으로부터 선택된다:
여기서, y는 2 내지 10에서 선택된 수, 바람직하게는 4 내지 10에서 선택된 수, 보다 바람직하게는 4, 6, 8 또는 10이다.
본 발명은 또한 다음 단계를 포함하는, 화학식 (I)의 항체-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물의 제조 방법을 제공한다:
Ab가 환원된 후, 화학식 (F)와 커플링 반응하여 화학식 (I)의 화합물을 수득하는 단계;
여기서, W는 상기 정의된 바와 같고,
Ab는 상기 정의된 바와 같은 항-BCMA 항체 또는 항원-결합 단편이며,
y는 1 내지 20에서 선택된 수, 바람직하게는 4 내지 10에서 선택된 수, 보다 바람직하게는 4, 6, 8 또는 10이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 상기 언급된 항체-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물, 및 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 부형제, 희석제 또는 담체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 BCMA-매개 질환 또는 상태를 치료 또는 예방하기 위한 약제의 제조에 있어서 상기 언급된 항체-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물, 또는 상기 언급된 약학적 조성물의 용도에 관한 것이다.
바람직한 실시양태에서, 상기 BCMA-매개 질환 또는 상태는 암 또는 자가면역 질환이고; 상기 암은 바람직하게는 BCMA를 발현하는 암, 보다 바람직하게는 림프종, 백혈병 또는 골수종이고, 상기 자가면역 질환은 바람직하게는 홍반성 루푸스, IgA 신장병 및 류마티스성 관절염으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
용어
본원을 보다 쉽게 이해하기 위해 특정 기술 및 과학 용어를 아래에 구체적으로 정의한다. 본원에서 달리 명확하게 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 다른 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 숙련자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 갖는다.
본원에서 사용된 아미노산의 3문자 코드 및 1문자 코드는 문헌[참조: J. Biol. Chem, 243, p3558(1968)]에 기재된 바와 같다.
본원에서 용어 "항체"는 사슬간 이황화 결합으로 연결된 2개의 동일한 중쇄와 2개의 동일한 경쇄로 이루어진 테트라펩타이드 사슬 구조인 면역글로불린을 의미한다. 면역글로불린 중쇄 불변부위의 아미노산 조성과 배열 순서가 상이하기 때문에 항원성도 상이하다. 이에 따르면 면역글로불린은 5가지 유형 또는 면역글로불린의 동종형(isotype)으로 공지된, 즉 IgM, IgD, IgG, IgA 및 IgE으로 분류될 수 있으며, 이의 상응하는 중쇄는 각각 μ사슬, δ사슬, γ사슬, α사슬 및 ε사슬이다. 동일한 종류의 Ig라도 힌지 부위의 아미노산 조성 내 차이와 중쇄 이황화 결합의 수와 위치에 따라 서로 다른 하위분류로 분류될 수 있다. 예를 들어, IgG는 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로 분류할 수 있다. 경쇄는 불변영역의 차이에 따라 κ 사슬 또는 λ 사슬로 분류된다. 5가지 유형의 Ig는 각각 κ 사슬 또는 λ 사슬을 가질 수 있다.
본원에 있어서, 본원에 따른 항체 경쇄 가변 영역은 인간 또는 뮤린 κ, λ 사슬 또는 이의 변이체를 포함하는 경쇄 불변 영역을 추가로 포함할 수 있다.
본원에 있어서, 본원에 따른 항체 중쇄 가변 영역은 인간 또는 뮤린 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 또는 이의 변이체를 포함하는 중쇄 불변 영역을 추가로 포함할 수 있다.
항체 중쇄 및 경쇄의 N-말단 근처에 있는 약 110개 아미노산의 서열은 매우 다양하며 가변 영역(V 영역)이고; C-말단 근처에 있는 나머지 아미노산 서열은 상대적으로 안정하고 불변 영역(C 영역)이다. 가변 영역은 비교적 보존적인 서열을 갖는 3개의 초가변 영역(HVR) 및 4개의 프레임워크 영역(FR)을 포함한다. 3개의 초가변 영역은 항체의 특이성을 결정하며 상보성 결정 영역(CDR)이라고도 한다. 경쇄 가변 영역(VL) 및 중쇄 가변 영역(VH)은 각각 3개의 CDR 영역과 4개의 FR 영역으로 이루어진다. 아미노 말단에서 카르복실 말단까지의 배열 순서는 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4이다. 경쇄의 3개의 CDR 영역은 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 의미하고; 중쇄의 3개의 CDR 영역은 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 의미한다. 본원에 따른 항체 또는 항원-결합 단편의 VL 영역 및 VH 영역 내의 CDR 아미노산 잔기의 수 및 위치는 공지된 카밧(Kabat) 넘버링 기준 및 카밧, AbM 또는 IMGT 정의 기준(http://bioinf.org.uk/abs/)을 준수한다.
"항원 제시 세포" 또는 "APC"라는 용어는 세포 표면에 MHC와 복합된 외래 항원을 제시하는 세포이다. T 세포는 이러한 복합체를 인식하기 위해 T 세포 수용체(TCR)를 이용한다. APC의 예는 수지상 세포(DC), 말초 혈액 단핵 세포(PBMC), 단핵구, B 림프구 및 단핵구-유래 수지상 세포를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
용어 "항원 제시"는 APC에 의해 항원을 포획하고 예를 들어 MHC-I/MHC-II 접합체의 구성요소로서 T 세포에 의해 인식될 수 있도록 하는 과정을 의미한다.
용어 "BCMA"는 세포에 의해 자연적으로 발현되는 BCMA의 임의의 변이체 또는 동종형을 포함한다. 본원의 항체는 비인간 종으로부터 유래된 BCMA와 교차 반응할 수 있다. 대안적으로, 항체는 또한 인간 BCMA에 대해 특이적일 수 있고 다른 종과의 교차 반응성을 나타내지 않을 수 있다. BCMA 또는 이의 임의의 변이체 또는 동종형은 이를 자연적으로 발현하는 세포 또는 조직으로부터 분리될 수 있거나, 또는 당업계에서 일반적으로 사용되는 기술 및 본원에 기술된 기술을 사용하여 재조합 기술에 의해 생성될 수 있다. 바람직하게는, 항-BCMA 항체는 정상적인 글리코실화 패턴을 갖는 인간 BCMA를 표적으로 한다.
용어 "재조합 인간 항체"는 재조합 방법에 의해 제조, 발현, 생성 또는 분리된 인간 항체를 포함하며, 관련된 기술 및 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들면 다음과 같다:
1. 인간 면역글로불린 유전자를 가진 트랜스제닉 및 트랜스-염색체 동물(예를 들어, 마우스) 또는 이로부터 제조된 하이브리도마로부터 분리된 항체;
2. 트랜스펙토마(transfectoma)와 같이 항체를 발현하도록 형질전환된 숙주 세포로부터 분리된 항체;
3. 재조합 조합 인간 항체 라이브러리로부터 분리된 항체; 및
4. 인간 면역글로불린 유전자 서열을 다른 DNA 서열과 스플라이싱하는 것과 같은 방법에 의해 제조, 발현, 생성 또는 분리된 항체.
이러한 재조합 인간 항체는 생식계열 유전자에 의해 암호화되는 특정 인간 생식계열 면역글로불린 서열을 이용하는 가변 영역 및 불변 영역을 포함하지만, 또한 항체 성숙 동안 발생하는 것과 같은 후속 재배열 및 돌연변이를 포함한다.
본원에서 용어 "뮤린 항체"는 당업계의 지식 및 기술에 따라 제조된 인간 BCMA에 대한 단일클론 항체이다. 제조하는 동안 시험 대상체에게 BCMA 항원을 주사한 후, 목적하는 서열 또는 기능적 특성을 갖는 항체를 발현하는 하이브리도마를 분리한다. 본원의 바람직한 실시양태에서, 뮤린 BCMA 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 뮤린 κ, λ 사슬 또는 이의 변이체의 경쇄 불변 영역을 추가로 포함할 수 있거나, 또는 뮤린 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 또는 이의 변이체의 중쇄 불변 영역을 추가로 포함할 수 있다.
용어 "인간 항체"는 인간 생식계열 면역글로불린 서열의 가변 영역 및 불변 영역을 갖는 항체를 포함한다. 본원의 인간 항체는 인간 생식계열 면역글로불린 서열에 의해 암호화되지 않는 아미노산 잔기(예를 들어, 생체외 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이 유발 또는 생체내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다. 그러나 용어 "인간 항체"는 다른 포유류 종(예를 들어, 마우스)의 생식계열에서 유래된 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열에 이식된 항체(즉, "인간화 항체")를 포함하지 않는다.
CDR-이식 항체로도 알려진 용어 "인간화 항체"는 뮤린의 CDR 서열을 인간 항체 가변 영역의 프레임워크에 이식하여 생산된 항체를 의미한다. 인간화 항체는 많은 양의 뮤린 단백질 성분을 운반하는 키메라 항체에 의해 유도되는 강한 면역 반응의 단점을 극복할 수 있다. 면역원성 감소로 인한 활성 감소를 피하기 위해, 인간 항체 가변 영역을 최소한의 역돌연변이시켜 활성을 유지할 수 있다.
용어 "키메라 항체"는 뮤린 항체의 가변 영역을 인간 항체의 불변 영역과 융합하여 형성된 항체로, 뮤린 항체에 의해 유도된 면역 반응을 완화시킬 수 있다. 키메라 항체를 확립하는 것은 먼저 뮤린 특이적인 단일클론 항체를 분비하는 하이브리도마를 확립한 후 뮤린 하이브리도마 세포에서 가변 영역 유전자를 클로닝한 다음, 필요에 따라 인간 항체의 불변 영역 유전자를 클로닝하여 뮤린 가변 영역 유전자를 인간 불변 영역 유전자와 결합시켜 키메라 유전자를 형성하여 인간 발현 벡터에 삽입하고 최종적으로 진핵 산업 시스템 또는 원핵 산업 시스템에서 키메라 항체 분자를 발현하는 것을 필요로 한다. 인간 항체 불변 영역은 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4의 중쇄 불변 영역 또는 이의 변이체, 바람직하게는 이의 인간 IgG1, IgG2 또는 IgG4 중쇄 불변 영역, 또는 아미노산 돌연변이 후 ADCC(항체-의존성 세포-매개 세포독성: antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity)가 강화된 IgG1 중쇄 불변 영역으로부터 선택될 수 있다.
용어 "항원-결합 단편"은 일반적으로 모 항체의 항원-결합 영역 또는 가변 영역(예를 들어 하나 이상의 CDR)의 적어도 일부를 포함하는 항체 및 항체 유사체의 항원-결합 단편을 의미한다. 항체 단편은 모 항체의 결합 특이성의 적어도 일부를 유지한다. 일반적으로 활성이 몰 기준으로 표시되는 경우 항체 단편은 모 결합 활성의 10% 이상을 유지한다. 바람직하게는, 항체 단편은 표적에 대한 모 항체의 결합 친화도의 적어도 20%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 이상을 유지한다. 항원-결합 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2, Fv 단편, 선형 항체, 단일-사슬 항체, 나노바디, 도메인 항체 및 다중특이적 항체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 조작된 항체 변이체는 문헌[참조: Holliger and Hudson, 2005, Nat. Biotechnol. 23: 1126-1136]에서 검토되었다.
"Fab 단편"은 하나의 경쇄와 하나의 중쇄의 CH1 및 가변 영역들로 이루어진다. Fab 분자의 중쇄는 다른 중쇄 분자와 이황화 결합을 형성할 수 없다.
"Fc" 영역은 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 2개의 항체 중쇄 단편을 포함한다. 2개의 중쇄 단편은 2개 이상의 디설파이드 결합에 의해 그리고 CH3 도메인의 소수성 상호작용을 통해 함께 유지된다.
"Fab' 단편"은 경쇄 및 VH 도메인, CH1 도메인 및 CH1과 CH2 도메인 사이의 영역을 포함하는 중쇄의 일부를 포함하여, 2개의 Fab' 단편의 2개의 중쇄 사이에 사슬간 이황화 결합이 형성되어 F(ab')2 분자를 형성할 수 있다.
"F(ab')2 단편"은 2개의 경쇄 및 CH1 및 CH2 도메인 사이의 불변 영역의 일부를 포함하는 2개의 중쇄를 포함하여, 2개의 중쇄 사이에 사슬간 이황화 결합을 형성한다. 따라서, 상기 F(ab')2 단편은 2개의 중쇄 사이의 이황화 결합에 의해 함께 유지된 2개의 Fab' 단편으로 구성된다.
"Fv 영역"은 중쇄 및 경쇄 모두로부터의 가변 영역을 포함하지만, 불변 영역은 결여되어 있다.
용어 "다중특이성 항체"는 다중 에피토프에 대해 특이성을 갖는 항체를 포함하는 가장 넓은 의미로 사용된다. 이러한 다중특이성 항체는, 중쇄 가변 영역 VH 및 경쇄 가변 영역 VL을 포함하는 항체 (여기서 VH-VL 단위는 다중 에피토프에 대한 특이성을 가짐); 2개 이상의 VL 및 VH 영역을 갖는 항체 (각각의 VH-VL 단위는 상이한 표적 또는 동일한 표적의 상이한 에피토프에 결합함); 2개 이상의 단일 가변 영역을 갖는 항체 (각각의 단일 가변 영역은 상이한 표적 또는 동일한 표적의 상이한 에피토프에 결합함); 전장 항체, 항체 단편, 디아바디, 이중특이성 디아바디 및 트리아바디, 공유 또는 비공유 결합된 항체 단편 등을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
"단일-사슬 항체"라는 용어는 링커 펩타이드를 통해 항체의 중쇄 가변 영역 VH와 경쇄 가변 영역 VL을 결합시켜 형성된 단일-사슬 재조합 단백질이다. 완전한 항원 결합 부위를 가진 최소 항체 단편이다.
용어 "도메인 항체 단편"은 중쇄 가변 영역 또는 경쇄 가변 영역을 포함하는 면역학적 기능을 갖는 면역글로불린 단편이다. 일부 경우에는 2개 이상의 VH 영역이 펩타이드 링커에 의해 공유 결합되어 2가 도메인 항체 단편을 형성한다. 상기 2가 도메인 항체 단편의 2개의 VH 영역은 동일한 항원 또는 상이한 항원을 표적으로 할 수 있다.
본원에서 "BCMA에 결합하는"이라는 용어는 인간 BCMA와 상호작용할 수 있음을 의미한다.
본원에서 용어 "항원-결합 부위"는 본원의 항체 또는 항원-결합 단편에 의해 인식되는 3차원 부위를 의미한다.
용어 "에피토프"는 면역글로불린 또는 항체에 특이적으로 결합하는 항원 상의 부위를 의미한다. 에피토프는 인접한 아미노산 또는 단백질의 3차 폴딩으로 인해 병치된 비인접한 아미노산에 의해 형성될 수 있다. 인접한 아미노산에 의해 형성된 에피토프는 일반적으로 변성 용매에 노출된 후에도 유지되는 반면, 3차 폴딩에 의해 형성된 에피토프는 일반적으로 변성 용매로 처리된 후에 손실된다. 에피토프는 일반적으로 독특한 공간 형태로 적어도 3 내지 15개의 아미노산을 포함한다. 주어진 항체에 결합된 에피토프를 결정하는 방법은 면역블롯팅, 면역침전 검출 분석 등을 포함하여 당업계에 잘 알려져 있다. 에피토프의 공간 형태를 결정하는 방법은 당업계의 기술 및 본원에 기재된 기술, 예를 들어 X선 결정 분석, 2차원 핵 자기 공명 등을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "특이적으로 결합한다" 및 "선택적으로 결합한다"는 항체가 미리 결정된 항원 상의 에피토프에 결합하는 것을 의미한다. 일반적으로 재조합 인간 BCMA를 분석물질로 사용하고 항체를 리간드로 사용하는 경우 기기에서 표면 플라즈몬 공명(SPR) 기술로 측정할 때 항체는 약 10-7 M 미만 또는 더 작은 평형 해리 상수(KD)에서 미리 결정된 항원에 결합하고, 미리 결정된 항원에 대한 결합 친화력은 미리 결정된 항원 또는 밀접하게 관련된 항원 이외의 비-특이적 항원(BSA 등)에 대한 결합 친화성이 적어도 2배이다. "항원을 인식하는 항체"라는 용어는 본 명세서에서 "특이적으로 결합하는 항체"라는 용어와 상호교환하여 사용될 수 있다.
용어 "교차 반응"은 상이한 종으로부터 유래된 BCMA에 결합하는 본원의 항체의 능력을 지칭한다. 예를 들어, 인간 BCMA에 결합하는 본원의 항체는 다른 종의 BCMA에도 결합할 수 있다. 교차 반응성은 결합 검정(예를 들어, SPR 및 ELISA)에서 정제된 항원과의 특이적 반응성 또는 생리학적으로 BCMA를 발현하는 세포와의 결합 또는 기능적 상호 작용을 감지하여 측정된다. 교차 반응성을 결정하는 방법은 예를 들어 표면 플라즈몬 공명(SPR) 분석 또는 유세포 분석과 같은 본 명세서에 기술된 바와 같은 표준 결합 검정을 포함한다.
용어 "억제" 또는 "차단"은 상호 교환적으로 사용될 수 있으며 부분 및 완전 억제/차단을 모두 포함한다. 리간드의 억제/차단은 바람직하게는 리간드 결합이 억제 또는 차단 없이 일어날 때 발생하는 정상 수준 또는 활성의 유형을 감소시키거나 변형시킨다. 억제 및 차단은 또한 항-BCMA 항체와 접촉하지 않는 리간드와 비교하여 항-BCMA 항체와 접촉할 때 리간드의 결합 친화도의 임의의 측정 가능한 감소를 포함하도록 의도된다.
용어 (예를 들어, 세포의) "성장 억제"는 세포 성장의 임의의 측정 가능한 감소를 포함하는 것으로 의도된다.
용어 "유도된 면역 반응" 및 "강화된 면역 반응"은 상호 교환적으로 사용될 수 있으며 특정 항원에 의해 자극된(즉, 수동적 또는 적응적) 면역 반응을 의미한다. CDC 또는 ADCC를 유도하기 위한 "유도하다"라는 용어는 특정한 직접적인 세포 사멸 메커니즘을 자극하는 것을 의미한다.
본원에서 "ADCC", 즉 항체-의존적 세포매개 세포독성은 Fc 수용체를 발현하는 세포가 항체의 Fc 단편을 인식하여 항체로 코팅된 표적 세포를 직접 사멸시키는 것을 의미한다. 항체의 ADCC 기능은 IgG의 Fc 단편을 변경하여 강화, 감소 또는 제거될 수 있다. 변경은 항체의 중쇄 불변 영역에서의 돌연변이를 의미한다.
항체 및 항원-결합 단편을 생산하고 정제하는 방법은 잘 알려져 있으며 문헌[참조: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, chapters 5-8 and 15]과 같은 선행 기술에서 발견할 수 있다. 예를 들어, 마우스는 인간 BCMA 또는 이의 단편으로 면역화될 수 있고, 수득된 항체는 복원 및 정제될 수 있고, 통상의 방법을 사용하여 아미노산 시퀀싱될 수 있다. 항원-결합 단편은 또한 통상적인 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편은 비-인간 CDR 영역에 하나 이상의 인간 FR 영역(들)을 부가하도록 유전적으로 조작된다. 인간 FR 생식계열 서열은 ImmunoGeneTics(IMGT) 웹사이트 http://imgt.cines.fr 또는 The Immunoglobulin FactsBook, 2001ISBN012441351에서 수득할 수 있다.
본원의 조작된 항체 또는 항원-결합 단편은 통상적인 방법에 의해 제조되고 정제될 수 있다. 상응하는 항체의 cDNA 서열은 클로닝되고 GS 발현 벡터로 재조합될 수 있다. 재조합 면역글로불린 발현 벡터는 CHO 세포를 안정적으로 형질감염시킬 수 있다. 보다 권장되는 선행 기술로서, 포유동물 발현 시스템은 특히 Fc 영역의 고도로 보존된 N-말단에서 항체의 글리코실화를 유도할 수 있다. 인간 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 발현함으로써 안정한 클론이 수득된다. 양성 클론은 항체를 생산하기 위해 생물 반응장치의 무혈청 배지에서 확장된다. 항체가 분비되는 배양액은 통상적인 기술로 정제 및 수집될 수 있다. 상기 항체는 통상적인 방법으로 여과 및 농축될 수 있다. 가용성 혼합물 및 다량체는 예를 들면 분자체 및 이온 교환과 같은 통상적인 방법으로도 제거할 수 있다. 생성된 산물은 예를 들어 -70℃에서 즉시 동결하거나 동결건조해야 한다.
본원의 항체는 단일클론항체를 의미한다. 본원에서 단일클론 항체(mAb)는 단일 클론 세포주로부터 수득된 항체를 의미하며, 진핵, 원핵 또는 파지 클로닝 세포주로 한정되지 않는다. 단일클론항체 또는 항원-결합 단편은 예를 들어 하이브리도마 기술, 재조합 기술, 파지 디스플레이 기술, 합성 기술(예를 들어, CDR 이식) 또는 기타 기존 기술을 사용하여 재조합에 의해 수득될 수 있다.
"투여하는", "제공하는" 및 "치료하는"은 동물, 인간, 실험 대상체, 세포, 조직, 기관 또는 체액에 적용할 때 외인성 의약, 치료제, 진단제 또는 조성물을 동물, 인간, 대상체, 세포, 조직, 기관 또는 체액과 접촉시키는 것을 의미한다. "투여하는", "제공하는" 및 "치료하는"은 예를 들어 치료, 약동학, 진단, 연구 및 실험 방법을 나타낼 수 있다. 세포를 처리하는 것은 시약을 세포와 접촉시키는 것, 및 시약을 유체와 접촉시키는 것을 포함하며, 여기서 유체는 세포와 접촉한다. "투여하는", "제공하는" 및 "치료하는"은 또한 예를 들어 세포를 시약, 진단제, 결합 조성물로 또는 시험관내 및 생체외에서 또 다른 세포로 처리하는 것을 의미한다. 인간, 수의학 또는 연구 대상체에 적용될 때 "치료하는"은 치료, 예방 또는 예방 조치, 연구 및 진단 적용을 의미한다.
"치료"는 치료제가 치료 효과를 갖는 것으로 알려진 하나 이상의 질병 증상(들)을 갖는 환자에게 예를 들어 본원의 항체 중 임의의 하나를 포함하는 내부 또는 외부 치료제를 제공하는 것을 의미한다. 일반적으로, 치료제는 치료 대상체 또는 모집단에서 하나 이상의 질병 증상(들)을 경감시키거나 이러한 증상의 퇴행을 유도하거나 또는 이러한 증상의 발달을 임의의 임상적으로 측정가능한 정도로 억제하기에 효과적인 양으로 제공된다. 임의의 특정 질병 증상을 완화시키는데 효과적인 치료제의 양("치료학적으로 유효한 양"이라고도 함)은 다양한 요인, 예를 들어 환자의 질병 상태, 연령 및 체중, 및 환자에게 목적하는 치료 효과를 생산하는 약물의 능력에 따라 달라질 수 있다. 질병 증상이 완화되었는지 여부는 증상의 중증도 또는 진행을 평가하기 위해 의사 또는 기타 건강 관리 전문가가 일반적으로 사용하는 임상 검사 방법으로 평가할 수 있다. 본원의 실시양태(예를 들어, 치료 방법 또는 산물)는 각각의 목적하는 질병 증상을 완화시키는 데 비효과적일 수 있지만, 스튜던트 티-시험(Student t-test), 카이제곱 시험(chi-square test), 만 휘트니 유 시험(Mann and Whitney's U test), 크러스칼-왈리스 시험(Kruskal-Wallis test: H test), 용크헤이러 데르프스트라 시험(Jonckheere-Terpstra test), 윌콕슨 시험(Wilcoxon test) 등과 같이 당업계에 알려진 임의의 통계적 시험 방법에 의해 결정되는 바와 같이 통계적으로 유의미한 수의 환자에서 목적하는 질병 증상을 감소시켜야 한다.
명세서 및 청구범위 전반에 걸쳐 사용된 용어 "본질적으로 ...로 이루어진" 또는 이의 변형은 기재된 모든 요소 또는 요소 군을 포함하는 것을 의미하고, 기재된 요소와 본질적으로 유사하거나 성질이 다른 요소를 선택적으로 포함하는 것을 의미하며, 이는 주어진 투여 요법, 방법 또는 조성물의 기본 또는 새로운 특성을 크게 변화시키지 않는다.
본원에서 어떤 대상에 적용되는 "자연적으로 발생하는"이라는 용어는 그 대상이 자연에서 발견될 수 있다는 사실을 의미한다. 예를 들어, 천연 공급원에서 분리될 수 있고 실험실에서 인위적으로 의도적으로 변형되지 않은 유기체(바이러스 포함)에 존재하는 폴리펩타이드 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열은 자연 발생적이다.
"유효한 양"은 의학적 상태의 증상 또는 상태를 개선하거나 예방하기에 충분한 양을 포함한다. 상기 유효한 양은 또한 진단을 허용하거나 용이하게 하기에 충분한 양을 의미한다. 특정 환자 또는 수의학 대상체에 대한 유효한 양은 치료할 상태, 환자의 일반적인 건강 상태, 약물 투여의 방법, 경로 및 복용량, 및 부작용의 심각성과 같은 요인에 따라 달라질 수 있다. 유효한 양은 상당한 부작용이나 독성 효과를 피하는 최대 용량 또는 투약 요법일 수 있다.
"외인성"은 배경에 따라 유기체, 세포 또는 인체 외부에서 생성되는 물질을 의미한다.
"내인성"은 배경에 따라 세포, 유기체 또는 인체 내부에서 생성되는 물질을 의미한다.
"동일성"은 2개의 폴리뉴클레오티드 서열 사이 또는 2개의 폴리펩타이드 사이의 서열 유사성을 의미한다. 정렬된 두 서열의 위치가 동일한 염기 또는 아미노산 단량체 서브유닛에 의해 점유될 때, 예를 들어 두 DNA 분자의 각 위치가 아데닌에 의해 점유되면 분자는 해당 위치에서 상동이다. 2개의 서열 사이의 동일성 백분율은 2개의 서열이 공유하는 매칭 또는 상동 위치의 수를 비교할 위치의 수로 나눈 값 x 100%인 함수이다. 예를 들어, 최적 서열 정렬에서 두 서열의 10개 위치 중 6개 위치가 일치하거나 상동이면 두 서열은 60% 상동성이다. 일반적으로, 최대 동일성 백분율을 얻기 위해 2개의 서열이 정렬될 때 정렬이 이루어진다.
본 명세서에서 사용된 "세포", "세포주" 및 "세포 배양물"이라는 표현은 상호교환적으로 사용될 수 있으며, 이러한 모든 명칭은 이들의 자손을 포함한다. 따라서 "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"라는 용어는 계대의 수에 관계없이 1차 시험 세포 및 이로부터 유래된 배양물을 포함한다. 또한 의도적이거나 비의도적인 돌연변이로 인해 모든 자손이 DNA 함량 측면에서 정확히 동일할 수 없다는 점을 이해해야 한다. 원래 형질전환된 세포에서 스크리닝된 것과 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이 자손이 포함된다. 다른 명칭이 언급될 때 문맥에서 명확하게 나타날 수 있다. "선택적" 또는 "선택적으로"는 이후에 기재된 사건 또는 상황이 반드시 발생할 수는 없지만 발생할 수 있음을 의미하며 본원은 해당 사건 또는 상황이 발생하거나 발생하지 않는 경우를 포함한다. 예를 들어, "선택적으로 1 내지 3개의 항체 중쇄 가변 영역을 포함하는"은 특정 서열의 항체 중쇄 가변 영역이 존재할 수 있지만 존재할 필요는 없음을 의미한다.
"약학적 조성물"은 본 명세서에 기재된 하나 이상의 항체(항체들) 또는 항원-결합 단편(들) 뿐만 아니라 생리학적/약학적으로 허용가능한 담체 및 부형제와 같은 다른 성분을 포함하는 것을 의미한다. 약학적 조성물의 목적은 생물학적 활성을 나타내도록 활성 성분의 흡수에 도움이 되는 화합물을 유기체에 투여하는 것을 용이하게 하는 것이다.
용어 "약학적 염"은 본 발명의 항체-약물 접합체의 염을 지칭한다. 이러한 염은 포유동물에서 사용될 때 안전하고 효과적이며 필요한 생물학적 활성을 갖는다. 본 발명의 리간드 약물 접합체는 적어도 하나의 아미노기를 포함하여 산과 염을 형성할 수 있다. 약학적으로 허용가능한 염의 비-제한적 예는 염산염, 브롬화수소산염, 요오드화수소산염, 황산염, 중황산염, 구연산염, 초산염, 숙신산염, 아스코르빈산염, 옥살산염, 질산염, 소르빈산염, 인산수소염, 인산이수소염, 살리실산염, 구연산수소염, 타르타르산염, 말레인산염, 푸마르산염, 포름산염, 벤조산염, 메실산염, 에탄술폰산염, 벤젠술폰산염 및 p-톨루엔술폰산염을 포함한다.
용어 "용매화물"은 본 발명의 항체-약물 접합체 화합물 및 하나 이상의 용매 분자(들)에 의해 형성된 약학적으로 허용가능한 용매화물을 지칭한다. 용매 분자의 비-제한적 예는 물, 에탄올, 아세토니트릴, 이소프로판올, 에틸 아세테이트를 포함한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "세포 독성 약물"은 세포의 기능을 억제 및/또는 세포 사멸 또는 파괴를 유발하는 물질을 의미한다.
"튜불린 억제제"는 튜불린의 중합을 억제하거나 튜불린의 응집을 촉진함으로써 세포 유사분열 과정을 방해함으로써 항종양 효과를 발휘하는 화합물의 계열을 의미한다. 이의 비-제한적 예는 메이탄시노이드(maytansinoid), 칼리케아미신(calicheamicin), 탁산(taxan), 빈크리스틴(vincristine), 콜히친(colchicine), 돌라스타틴/오리스타틴/모노메틸 오리스타틴 E(dolastatin/auristatin/monomethyl auristatin E: MMAE)/모노메틸 오리스타틴 F(monomethyl auristatin F: MMAF)를 포함한다.
"링커"는 항체가 약물의 공유 결합 또는 원자 사슬에 공유적으로 부착되는 화학 모이어티를 의미한다. 링커의 비-제한적 예는 아릴렌, 헤테로아릴렌, PEG, 폴리메틸렌옥시, 숙시네이트, 숙신아미드, 디글리콜레이트, 말로네이트 및 카프로아미드를 포함한다.
"약물 부하"(DAR)는 y로 표시되며, 이는 일반식 (A)에서 항체당 세포독성 약물의 평균 수이다. 본 발명에서 약물 부하의 범위는 항체당 1 내지 20의 세포독성 약물(D)일 수 있다. 일반식 (A)의 항체-약물 접합체는 특정 범위(1-20)의 세포독성 약물에 접합된 항체의 집합체이다. 커플링 반응으로부터 수득된 항체-약물 접합체의 약물 부하(DAR)는 통상적인 수단, 예를 들어 질량 분석법, HPLC 및 ELISA으로 확인될 수 있다. 이러한 방법을 통해 항체-약물 접합체의 y 값에 대한 정량적 분포를 결정할 수 있다.
본 발명은 또한 다양한 중수소화된 형태의 화학식 (I)의 화합물을 포함한다. 탄소 원자에 부착된 각각의 이용 가능한 수소 원자는 독립적으로 중수소 원자로 대체될 수 있다. 당업자는 관련 문헌을 참조하여 중수소화 형태의 화학식 (I)의 화합물을 합성할 수 있다. 중수소화 형태의 화학식 (I)의 화합물은 상업적으로 입수가능한 중수소화 원료를 사용하여 제조될 수 있거나, 중수소화 보란, 테트라히드로푸란 중 삼중수소화 보란, 중수소화 리튬 알루미늄 수소화물, 중수소화 요오도에탄, 중수소화 요오도메탄 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 중수소화 시약을 사용하여 통상적인 기술에 의해 합성될 수 있다.
용어 "약학적 조성물"은 본원에 기술된 하나 이상의 화합물 또는 이의 생리학적/약학적으로 허용가능한 염 또는 전구약물과 다른 화학 성분, 및 생리학적/약학적으로 허용가능한 담체 및 부형제와 같은 다른 성분의 혼합물을 의미한다. 약학적 조성물의 목적은 생물학적 활성을 나타내도록 활성 성분의 흡수에 도움이 되는 화합물을 유기체에 투여하는 것을 용이하게 하는 것이다. 통상적인 약학적 조성물의 제조는 중국 약전에서 찾을 수 있다.
용어 "약학적으로 허용가능한 염" 또는 "약학적 염"은 본 발명의 리간드-약물 접합체의 염 또는 본 발명의 화합물의 염으로서, 포유동물에서 안전하고 유효하며 목적하는 생물학적 활성을 갖는 것을 의미한다. 본 발명의 리간드-약물 접합체는 적어도 하나의 아미노를 포함하고 있어 산과 염을 형성할 수 있다. 약학적으로 허용가능한 염의 비-제한적 예는 염산염, 브롬화수소산염, 요오드화수소산염, 황산염, 중황산염, 구연산염, 초산염, 숙신산염, 아스코르빈산염, 옥살산염, 질산염, 소르빈산염, 인산수소염, 인산이수소염, 살리실산염, 구연산수소염, 타르타르산염, 말레인산염, 푸마르산염, 포름산염, 벤조산염, 메탄술폰산염, 에탄술폰산염, 벤젠술폰산염 및 p-톨루엔술폰산염을 포함한다.
용어 "약물 부하"는 화학식 (V)의 화합물에서 각각의 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 로딩된 세포독성 약물의 평균 수를 의미하며, 또한 항체 수에 대한 약물 수의 비율로 나타낼 수도 있다. 상기 약물 부하는 리간드당 0 내지 12, 바람직하게는 1 내지 10 세포독성 약물(D)의 범위일 수 있다. 본 발명의 일 실시양태에서, 약물 부하는 y로 표현되며, DAR 값으로도 알려져 있으며 예시적인 값은 평균 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10일 수 있다. 커플링 반응 후 ADC 분자당 평균 약물 수는 UV/가시광선 분광법, 질량 분석법, ELISA 시험 및 HPLC와 같은 통상적인 식별 방법으로 결정할 수 있다.
본 발명의 일 실시양태에서, 세포독성 약물은 결합 단위를 통해 리간드의 라이신 잔기의 N-말단 아미노 및/또는 ε-아미노에 접합된다. 본 발명의 일 실시양태에서, 세포독성 약물은 결합 단위를 통해 리간드의 설프히드릴기에 접합된다. 일반적으로 커플링 반응에서 항체에 접합된 약물 분자의 수는 이론적인 최대값보다 적을 것이다.
다음의 비-제한적 방법을 사용하여 리간드-세포독성 약물 접합체의 로딩을 제어할 수 있다:
(1) 단일클론 항체에 대한 결합 시약의 몰비를 조절하는 방법,
(2) 반응 시간 및 온도를 조절하는 방법,
(3) 다른 반응 시약을 선택하는 방법.
본 발명의 항체-약물 접합체 또는 이의 약학적 염 또는 용매화물은 현저한 항종양 효과 및 우수한 안전성을 갖는다.
본 발명의 상기 항체-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물은 현저한 항종양 효과 및 우수한 안전성을 가지며, 생체 내 대사 활성이 우수하고 생체 내 약물 지속 시간이 길며 임상 적용 가능성이 넓다.
실시예는 본원의 추가 설명을 위해 아래에 포함되지만, 이러한 실시예는 본원의 범위를 제한하지 않는다. 본원의 실시예에서 명시되지 않은 조건을 갖는 실험 방법은 일반적으로 문헌 [참조: Antibodies: A Laboratory Manual and Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor]에 기재된 바와 같은 통상적인 조건 또는 원료 또는 제품 제조사가 권장하는 조건을 따를 수 있다.
본 발명의 실시예에서 구체적인 조건을 명시하지 않은 실험 방법은 통상적인 조건 또는 물질 또는 제품 제조사에서 권장하는 조건에 따라 수행하였다. 특정 출처가 표시되지 않은 시약은 시판되어 구입한 기존 시약이다.
본 발명의 공지된 원료는 당업계에 공지된 방법에 의해 또는 공지 방법을 따라 합성될 수 있거나, Jiangsu Aikon 회사 등으로부터 구입할 수 있다. 하기 표에 기재되어 있다:
실시예 1-1: 화합물 a의 합성
원료 a-1(4.1 g, 9.71 mmol) 및 원료 a-2(4.3 g, 8.09 mmol, 4% 아미노 이성체 불순물 함유)를 250 mL 반응 용기에 담았다. 질소 보호 하에 DCM(54 mL) 및 MeOH(18 mL)를 첨가하고 교반하고 0℃로 냉각시켰다. DMTMM(3.6 g, 12.1 mmol)과 트리에틸아민(2.5 g, 24.2 mmol)을 첨가하고 0℃에서 1시간 동안 교반 반응을 유지하였다. HPLC에 물질 a-2가 완전히 반응한 것으로 나타나면, 반응액을 감압(<25℃)하여 건조시켰다. MTBE(120 mL)를 첨가하여 교반 고해(슬러지)하였다. 용액을 부어 여과하고, 다시 슬러지에 MTBE 120 mL를 첨가하여 고해(고화)하고, 여과하고, 여과 케이크를 물(60 mL Х 2)로 세척한 다음, 건조시켜 조 생성물을 수득하였고, 조 생성물을 디클로로메탄과 메탄올에 용해시켰다. 화합물 a(6.2 g, 7.37 mmol)는 습식 컬럼 크로마토그래피(용출액 DCM:MeOH=40:1-20:1)를 2회 실행하여 99.3%의 순도와 91%의 수율로 분리했다.
실시예 1-2: 화합물 b의 합성
화합물 a(5.7 g, 6.77 mmol)를 500 ml 3구 플라스크에 넣고 질소 보호 하에 건조 THF(114 ml)를 투입하고 교반하여 녹인 후 내부 온도를 약 -10℃로 냉각시켰다. DBU(3.09 g, 20.31 mmol)를 5분 동안 적하하여 첨가하였고, 적하하는 동안 내부 온도는 -10 내지 -5℃로 유지하였다. 적하 후 내부 온도를 -10 내지 -5℃로 유지하고 2.5시간 동안 반응을 계속하여 고체를 침전시켰다.
내부 온도를 -20℃로 냉각하고, MTBE(114 mL)를 첨가하고, 그 기간 동안 내부 온도를 -20 내지 -10℃로 유지하였다. 생성물을 완전히 침전시키고 여과하고 필터 케이크를 MTBE(57 mL Х 2)로 세척하였다. 배수 후, 6 g의 조 화합물 b를 수득하였고, 추후 사용을 위해 -78℃에 보관하였다.
실시예 1-3: 화합물 e의 합성
화합물 c(651 mg, 1 mmol)를 10 mL DCM에 용해시키고, 아이스 배스(ice bath)에서 교반을 시작하고, DBU(456 mg, 3 mmol)를 적하하여 첨가하였다. 아이스 배스에서 1시간 후에 반응이 완료되었고, 화합물 d(257 mg, 1 mmol)와 HATU(420 mg, 1.1 mmol)를 순차적으로 첨가하였다. 아이스 배스에서 30분 동안 교반을 수행하였고, LCMS로 반응이 완료되었음을 나타내었다. 반응 용액을 25℃에서 농축하고, 잔류물을 컬럼기(H2O 중 ACN, 생성물의 50%)로 정제하여 적갈색 고체의 화합물 e(130 mg, 수율 19%)를 수득하였다.
MS: 691.3 [M+23].
실시예 1-4: 화합물 f의 합성
화합물 e(130 mg, 0.19 mmol)를 DCM에 용해시키고, 아니솔(62 mg, 0.57 mmol) 및 디클로로아세트산(245 mg, 1.9 mmol)을 첨가한 다음, 실온에서 밤새 16시간 동안 교반하였다. 샘플링하고, LC-MS에 원료가 완전히 소비된 것으로 나타나면 반응을 중지시켰다. 반응 용액을 25℃에서 농축하고, 잔류물을 역상 컬럼기(ACN/H2O, 생성물의 30%)로 정제하여 분홍색 고체의 화합물 f (53 mg, 수율 54%)를 수득하였다.
MS: 519.2[M+1].
실시예 1-5: 화합물 d의 합성
화합물 f(23 mg, 0.044 mmol) 및 화합물 b(27 mg, 0.044 mmol)를 DCM(3 mL) 및 MeOH(1 mL)에 용해시키고 질소 보호 하에 -30℃로 냉각시켰다. DMTMM(20 mg, 0.067 mmol)을 첨가하고 -20℃ 내지 -10℃로 조절된 온도에서 1시간 동안 반응시켰다. 샘플링하고, LC-MS로 원료가 완전히 소비되었음을 나타내었다. 온도는 -10℃로 유지하고, 물 10 mL를 첨가하여 반응을 퀀칭(quenching)하고, DCM 30 mL를 첨가하여 층화 분리하였다. 수성상을 DCM/MeOH = 10/1(50 mL)로 추출하였다. 유기상을 모아 무수 황산나트륨으로 건조하고 25℃에서 감압 농축하였다. 잔류물을 HPLC로 정제(ACN/H2O/ 0.05% FA)하여 백색 고체의 화합물 d(12%의 수율 및 98.87%의 순도) 5.8 mg을 수득하였다.
MS: 1120.3[M+1].
실시예 2: 항원의 준비
인간 BCMA의 His-태그 세포외 도메인(BCMA-His)을 암호화하는 단백질은 시노바이올로직스(SinoBiologics, 제품번호: 10620-H08H)에 의해 합성되었다.
BCMA-His의 서열:
서열번호: 21
실시예 3: 뮤린 하이브리도마 및 항체 서열 획득
총 5마리의 Balb/c 및 5마리의 A/J 암컷 10주령 마우스를 인간 항원 BCMA-His로 면역화하였다. CFA(시그마 사의 완전 프로인트 보조제: Sigma Complete Freund's Adjuvant) 및 IFA(시그마 사의 불완전 프로인트 보조제: Sigma Incomplete Freund's Adjuvant)를 사용하였다. 면역원과 면역보조제를 1:1의 비율로 완전히 혼합하고 유화시켜 안정한 "유중수(water-in-oil)형" 액체를 제조하였다. 주사 용량은 25 μg/200 μL/마우스였다.
면역화 설계
1일 1차 면역, 완전 프로인트 보조제
21일 2차 면역, 불완전 프로인트 보조제
35일 3차 면역, 불완전 프로인트 보조제
42일 채혈 및 혈청 역가 검사(3회 면역화 이후 혈액)
49일 4차 면역, 불완전 프로인트 보조제
56일 채혈 및 혈청 역가 검사(4회 면역화 이후 혈액)
실시예 3에 따라 간접 ELISA법을 이용하여 면역화된 마우스 혈청의 혈청 역가 및 세포 표면 항원에 대한 결합능을 평가하였다. 역가 검출 결과(100,000배 이상 희석)에 따라 세포 융합의 시작을 결정하였다. 혈청 역가, 친화도 및 FACS 결합이 높은 면역화된 마우스를 최종 면역화를 위해 선택하고 희생시켰다. 비장 세포를 SP2/0 골수종 세포에 융합시키고 도말하여 하이브리도마를 수득하였다. 목적하는 하이브리도마를 간접 ELISA로 스크리닝하고 제한 희석법에 의해 단일클론 세포주로 확립했다. 생성된 항체-양성 균주는 재조합 단백질에 결합하는 하이브리도마를 선택하기 위해 간접 ELISA로 추가로 스크리닝하였다. 대수 성장기의 하이브리도마 세포를 수집하였다. RNA를 Trizol(인비트로겐: Invitrogen, 15596-018)로 추출하고 역전사(PrimeScriptTM Reverse Transcriptase, Takara #2680A)하였다. 역전사를 통해 수득한 cDNA는 마우스 Ig-프라이머 세트(Novagen, TB326 Rev.B 0503)를 사용하여 PCR로 증폭하였다. 최종적으로, 뮤린 항체 M1의 서열을 수득하였다.
뮤린 단일클론 항체 M1의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열은 다음과 같다:
M1 HCVR
서열번호 1
M1 LCVR
서열번호: 2
뮤린 단일클론 항체 M1의 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 CDR 서열
이름 서열 번호
HCDR1 서열번호: 3
HCDR2 서열번호: 4
HCDR3 서열번호: 5
LCDR1 서열번호: 6
LCDR2 서열번호: 7
LCDR3 서열번호: 8
실시예 4: 항체의 생체외 결합 활성 검출 방법
(1) 생체외 간접 ELISA 결합 검정:
BCMA His 단백질(시노 바이올로지컬 인코포레이션: Sino Biological Inc., 제품번호 10620-H08H)을 pH 7.4 PBS로 1 μg/ml의 농도로 희석하고 96-웰 고친화성 ELISA 플레이트에 100 μl/웰로 첨가하고 4℃ 냉장기에서 밤새(16 내지 20시간) 배양했다. 플레이트를 PBST(0.05% Tween-20을 함유한 pH 7.4 PBS)로 4회 세척한 후, PBST로 희석한 3% BSA(소 혈청 알부민) 차단 용액을 150 μl/웰로 첨가하고 차단을 위해 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 차단이 완료된 후, 차단 용액을 버리고 플레이트를 PBST 완충액으로 4회 세척하였다.
검사를 받는 항체는 1 μM의 초기 농도로 3% BSA를 함유하는 PBST로 10배 구배로 희석하여 10개의 희석물을 수득하고 100 μl/웰로 미세역가 플레이트(microtiter plate)에 가하여 실온에서 1시간 동안 배양했다. 배양이 완료된 후, 플레이트를 PBST로 4회 세척하였다. 3% BSA를 함유하는 PBST로 희석된 HRP-표지된 염소-항-인간 2차 항체(Abcam, 제품번호 ab97225)를 100 μl/웰로 첨가하고 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 플레이트를 PBST로 4회 세척한 다음 TMB 발색 기질(셀 시그날링 테크놀로지: Cell Signaling Technology, 제품번호 7004S)을 100 μl/웰로 첨가하고 암실에서 실온으로 1분 동안 배양했다. 정지 용액(셀 시그날링 테크놀로지, 제품번호 7002S)을 100 μl/웰로 첨가하여 반응을 종료했다. 450 nm에서의 흡광도 값은 마이크로플레이트 판독기(BioTek, 모델 Synergy H1)로 판독하였다. 데이터를 분석하였다. 다음 표에 나타낸 바와 같이 농도-신호 곡선을 플로팅하여 결과를 분석했다.
인간 BCMA 항원에 대한 뮤린 항체의 친화도(EC50 값)
뮤린 항체 인간 BCMA His 항원에 대한 결합의 EC50 (nM)
M1 0.53
(2) 생체외 세포 결합 검정:
BCMA 발현이 높은 배양 세포(BCMA를 과발현하는 HEK-293T 세포; BCMA를 발현하는 종양 세포, NCI-H929)를 수집하였다. 세포 밀도를 조정하고 세포를 96-웰 U-바닥 플레이트에 웰당 1Х105 내지 2Х105 세포로 도말하였다. 플레이트를 1200 g에서 5분 동안 원심분리하고 상층액을 제거하였다. 100 μl의 구배 희석 항체 용액 또는 마우스 면역 혈청을 첨가하고 4℃에서 60분 동안 배양했다. 플레이트를 1200 g에서 5분 동안 원심분리하고 상층액을 제거하였다. 세포를 PBS로 2회 세척하였다. 형광 표지된 2차 항체(PE-GAH 또는 PE-GAM)를 웰당 100 μl로 첨가하고 4℃에서 60분 동안 배양했다. 플레이트를 1200 g에서 5분 동안 원심분리하고 상층액을 제거하였다. 세포를 PBS로 2회 세척한 다음 PBS에 재현탁시켰다. 신호는 유세포 분석기를 사용하여 검출하고 결과 분석을 위해 농도 곡선을 플로팅했다.
BCMA를 발현하는 세포에 대한 뮤린 항체의 친화도(EC50 값)
뮤린 항체 HEK-293T/BCMA 세포에 대한 결합의 EC50 (nM) NCI-H929 세포에 대한
결합의 EC50 (nM)
M1 115.3 128.2
실시예 5: 뮤린 항체의 인간화 실험
뮤린 항-인간 BCMA 단일클론 항체의 인간화는 당업계의 다수의 문헌에 공개된 방법에 따라 수행되었다. 간단하게는, 부모(뮤린 항체) 불변 도메인을 인간 불변 도메인으로 대체하였다. 뮤린 항체와 인간 항체 간의 동일성에 따라 인간 생식계열 항체 서열을 선택하였다. 뮤린 항체 M1은 본원에서 인간화되었다.
수득한 뮤린 항체의 VH/VL CDR의 전형적인 구조에 기초하여, 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 서열을 인간 항체 생식계열 데이터베이스와 정렬하여 높은 동일성을 갖는 인간 생식계열 주형을 수득하였다.
뮤린 항체 M1의 CDR 영역을 선택된 상응하는 인간화 주형에 이식하였다. 이후, 뮤린 항체의 3차원 구조를 바탕으로, 임베딩된 잔기, 즉, CDR 영역과 직접적으로 상호작용하는 잔기 및 VL과 VH의 형태에 중요한 영향을 미치는 잔기들을 역돌연변이(back mutation)시키고 CDR 영역 내 화학적으로 불안정한 아미노산 잔기를 최적화하였다. 발현 시험 및 역돌연변이 수의 비교 후, 인간화 중쇄 가변 영역 HCVR의 서열을 선택하고 설계하였으며, 이는 다음과 같다:
HCVR1
서열번호: 9
HCVR2
서열번호: 10
HCVR3
서열번호: 11
인간화 경쇄 가변 영역 LCVR의 서열을 선택하고 설계하였으며, 이는 다음과 같다:
디자인된 중쇄 및 경쇄 가변영역 서열을 각각 인간 IgG1 중쇄 및 경쇄 불변영역 서열에 결합하였다. 예시적인 중쇄 및 경쇄 불변 영역 서열은 각각 다음과 같다:
IgG1 C
서열번호: 22
Ig kappa C
서열번호: 23
수득된 예시적인 중쇄 및 경쇄 서열은 다음과 같다:
Ab1 HC
Ab2 HC
Ab3 HC
서열번호: 17
Ab1 LC
서열번호: 18
Ab2 LC
서열번호: 19
Ab3 LC
서열번호: 20
중쇄, 경쇄 및 이의 가변 영역의 항체 및 서열번호
인간화 항체 번호 중쇄/경쇄 번호 중쇄/경쇄 가변 영역 번호
Ab1 서열번호: 15 서열번호: 9
서열번호: 18 서열번호: 12
Ab2 서열번호: 16 서열번호: 10
서열번호: 19 서열번호: 13
Ab3 서열번호: 17 서열번호: 11
서열번호: 20 서열번호: 14
상기 각 인간화 항체의 경쇄 및 중쇄 아미노산 서열에 따라 cDNA 단편을 합성하여 pcDNA3.1 발현 벡터(라이프 테크놀로지스: Life Technologies, 제품번호 V790-20)에 삽입하였다. 상기 발현 벡터를 형질감염 시약 PEI(폴리사이언스 인코포레이션: Polysciences, Inc., 제품번호 23966)와 함께 1:2의 비율로 사용하여 HEK293 세포(라이프 테크놀로지스 제품번호 11625019)를 형질감염시켰다. 세포를 CO2 인큐베이터에서 4 내지 5일 동안 배양하였다. 세포 배양액을 수집하고, 원심분리하고, 여과하였다. 이후, 시료를 항체 정제 친화 컬럼에 로딩하였다. 컬럼을 인산염 완충액으로 세척하였다. 시료를 글리신-염산 완충액(pH 2.7, 0.1M Gly-HCl)으로 용출하고 1M 트리스 염산 pH 9.0으로 중화시킨 후 인산염 완충액으로 투석하여 본원의 인간화 항체 단백질을 수득하였다.
실시예 6: 생체외 결합 친화도 및 동역학 검정
인간 BCMA 항원에 대한 각각의 인간화 항체의 친화도(EC50)는 실시예 4(1)에 따라 생체외 간접 ELISA 결합 검정을 사용하여 결정되었으며, 아래 표에 제시된다:
인간 BCMA 항원에 대한 각 인간화 항체의 친화도 (EC50)
인간화 항체 항원 친화도 EC50 (nM)
Ab1 BCMA-His 0.022
Ab2 0.033
Ab3 0.034
NCI-H929 종양 세포에 대한 각각의 인간화 항체의 친화도 (EC50)는 실시예 4(2)에 따라 생체외 세포 결합 검정을 사용하여 결정되었으며, 아래 표 7에 제시된다:
NCI-H929 종양 세포에 대한 각 인간화 항체의 친화도 (EC50)
인간화 항체 세포 친화도 EC50 (nM)
Ab1 NCI-H929 4.6
Ab2 3.5
Ab3 3.9
실시예 7: 항체의 세포내이입(endocytosis)
NCI-H929는 본 발명의 항체가 BCMA에 결합한 후 인간 BCMA와 함께 세포 내로 세포내이입(endocytosis)될 수 있는지 여부를 평가하기 위해 사용되었다. NCI-H929 세포를 트립신으로 소화시키고(PBS로 37℃에서 약 2분 동안 1회 세척후), 수집한 다음, 사전 냉각된 FACS 완충액에 재현탁시켰다. 세포 농도는 1Х106 세포/mL로 조정하였다. 세포 현탁액 1 mL를 EP 튜브에 첨가하고 1500 rpm에서 5분 동안 원심분리한 후 상등액을 제거하였다. 준비된 시험용 항체 1 mL를 첨가하여 세포를 재현탁시켰으며, 항체의 최종 농도는 20 μg/ml이었다. 세포를 4℃에서 1시간 동안 진탕기에서 배양하고, 원심분리(4℃, 1500 rpm x 5분)한 다음, 상등액을 버렸다. 세포를 FACS 완충액으로 2회 세척하고 상등액을 제거하였다. 100 μL의 형광 이차 항체 작동 용액을 각 튜브에 첨가하여 세포를 재현탁하였다. 세포를 4℃에서 30분 동안 진탕기에서 배양하고, 원심분리(4℃, 1500 rpm x 5분)한 다음, 상등액을 버렸다. 세포를 FACS 완충액으로 2회 세척하고 상등액을 제거하였다. 미리-가열한 NCI-H929 세포 완전 배지 1.0 mL를 각 튜브에 첨가하여 세포를 재현탁하고 완전히 혼합했다. 세포 현탁액을 0분 군, 블랭크 군, 30분 군 및 2시간 군으로 4개의 튜브에 각각 튜브당 200 μL씩 분주했다. 0분 및 블랭크 군은 얼음 위에 두고, 나머지 군은 세포내이입을 위해 각각 30분 및 2시간 동안 37℃의 배양기에 두었다. 해당 시점에서 EP 튜브를 꺼내 얼음 위에 놓고 5분 동안 미리 냉각시켰다. 모든 처리군을 원심분리(4℃, 1500 rpm x 5분)하고 상등액을 버렸다. 세포를 FACS 완충액으로 1회 세척하고 상등액을 제거하였다. 0분 군을 제외한 모든 처리군의 EP 튜브에 250 μL 스트립 완충액을 첨가했다. 세포를 실온에서 8분 동안 배양하고, 원심분리(4℃, 1500 rpm x 5분)한 다음, 상등액을 버렸다. 세포를 FACS 완충액으로 2회 세척하고 상등액을 제거하였다. 모든 처리군에 100 μL 고정 용액을 첨가하고 면역염색을 위해 4℃에 30분 이상 두었고 유세포 분석기 DxFlex로 검출했다. BCMA 항체 세포내이입의 백분율 = (각 시점에서의 형광 강도 값 - 0분 군의 평균 형광 강도 값) / 0분 군의 평균 형광 강도 값. 결과는 아래 표에 나타나 있다:
NCI-H929 종양 세포로의 항체의 세포내이입 (EC50)
인간화 항체 세포 세포내이입 효율%
0.5 시간 2 시간
Ab1 NCI-H929 36.6 49.5
Ab2 36.7 48
Ab3 35.5 45.7
실시예 8: 항체-약물 접합체의 제조
ADC2의 제조:
트리스(2-카르복시에틸)포스핀(10 mM, 0.347 mL, 3.47 μmol)의 제형화된 수용액을 37℃에서 항체 Ab2의 PBS 완충 수용액(pH=6.5의 0.05 M PBS 완충 수용액; 7.3 ml, 13.8 mg/ml, 0.681 μmol)에 가하였다. 반응 용액을 수조 진탕기에 넣고 37℃에서 3시간 동안 진탕한 후 반응을 정지시켰다. 반응 용액을 수조에서 25℃로 냉각하고 14.0 ml로 희석하였다. 다음 반응을 위해 3.3 ml의 용액을 취하였다.
화합물 D(3.0 mg, 3.72 μmol)를 0.15 ml DMSO에 용해시킨 후 상기 3.3 ml 용액에 첨가하였다. 반응 용액을 수조 진탕기에 넣고 25℃에서 3시간 동안 진탕한 후 반응을 정지시켰다. 반응 용액을 탈염하고 세파덱스(Sephadex) G25 겔 컬럼(용출상: 0.001M EDTA를 함유하는 pH = 6.5의 0.05 M PBS-완충 수용액)으로 정제하여 화학식 Ab2 항체 접합체(1.35 mg/ml, 13 ml)에 기재된 예시 생성물 ADC2의 PBS-완충 용액을 수득하였다. 용액을 4℃에서 동결시켰다.
평균값 y는 자외선 방법으로 결정하였다. 숙신산 나트륨 완충용액을 채운 큐벳(cuvette)을 기준흡수셀과 시료측정흡수셀에 각각 넣고, 용매 블랭크를 차감한 후 시험 용액을 채운 큐벳을 시료측정 흡수셀에 넣었다. 280 nm와 370 nm에서 흡광도를 측정하였다.
데이터 처리:
항체 함량 CAb는 표준 곡선을 설정하고 280 nm의 파장에서 흡광도를 측정하여 결정하였다. 소분자 함량 Cdrug은 370 nm의 파장에서 흡광도를 측정하여 결정하였다.
약물 부하의 평균값 y = Cdrug /CAb
예시 산물 ADC2에 대해, y는 상기 방법에 의해 4로 결정하였다. UV-HPLC 정제에 의해 ADC2 (y = 4)의 시료를 수득하였다.
실시예 9: 종양 세포에 대한 항체-약물 접합체의 사멸 활성
종양 세포에 대한 본원의 항체-약물 접합체의 사멸 효과를 시험하기 위해, BCMA 고발현 세포주 NCI-H929 세포(ATCC 기탁 번호 CRL-9068)를 평가에 사용하였다. NCI-H929 세포를 수집하고, 원심분리하고, 계수하였다. 세포 밀도를 완전 배지로 1Х105 세포/mL가 되도록 조정하고, 세포를 10,000개 세포/웰의 세포수로 웰당 100 μL로 흰색 96-웰 플레이트의 60개 웰에 도말하였다. 나머지 주변 웰에는 웰당 100 μL DPBS를 추가하였다. 세포 플레이트를 37℃, 5% CO2 배양기에 넣고 밤새 배양하였다. 실험 2일차에 항체-약물 접합체 작업 용액을 133 μM의 농도(5배 희석 및 9개 농도)를 시작으로 하여 96-웰 V-바닥 플레이트에 완전 배지로 제조하였다. 제조가 완료된 후 용액을 흰색 96-웰 플레이트에 웰당 80 μL씩 2회씩 첨가하였다. 세포 플레이트를 37℃, 5% CO2 배양기에 넣고 72시간 동안 배양하였다. 실험 5일째에 플레이트를 검출하고 판독했다. 세포 배양 플레이트를 꺼냈다. 90 μL CellTiter-Glo® 용액(프로메가: Promega, 제품번호: G7573)을 실온으로 평형화한 후 각 웰에 첨가했다. 혼합물을 진탕시키고 혼합하여 암실에서 10분 동안 방치한 후 마이크로플레이트 판독기의 발광 프로그램을 사용하여 검출하였다. IC50 값은 그라프패드 프리즘(GraphPad Prims) 소프트웨어를 사용하여 계산하였다. 화합물 D와 접합된 음성 항체 IgG1의 ADC (y=4)를 음성 대조군으로 사용하였다. 실험 결과는 아래 표에 나타나 있다:
항체-약물 접합체 사멸 효과 (IC50 nM)
NCI-H929
ADC2 (y=4) 0.76
IgG1 iso ADC (y=4) >133
실험 결과, ADC2 (y=4)는 생체외에서 종양 세포에 대한 우수한 사멸 활성을 가짐을 보여주었다.
실시예 10: 항체-약물 접합체의 종양 사멸 활성
생체 내에서 형성된 종양의 증식에 대한 항체-약물 접합체의 억제 효과를 추가로 조사하기 위해, 본원의 항체-약물 접합체의 항-종양 효과를, 마우스에 NCI-H929(ATCC 기탁 번호 CRL-9068) 세포주로 이식된 종양을 형성한 후에 평가하였다. 10Х106개의 NCI-H929 세포를 6 내지 8주령의 면역결핍 누드 마우스(NOD-SCID)의 등에 피하 주사하였다. 14일 후 꼬리 정맥을 통한 항체-약물 접합체의 정맥 주사는 1주에 1회 빈도로 3 mg/kg의 용량으로 2주 동안 연속 투여하였다. 인간 IgG1 동종형(isotype) 대조군 단백질을 3 mg/kg의 용량으로 대조군으로 사용하였다. 대조군 또는 투여군의 각 군에는 5마리의 마우스가 있었다. 종양 억제율은 다음과 같이 종양 부피를 측정하여 계산했다:
종양 억제율 TGI% = 100% - (14일째 투여군의 종양 부피 - 0일째 투여군의 종양 부피) / (14일째 대조군의 종양 부피 - 0일째 대조군의 종양 부피)
실험 결과는 아래 표에 나타나 있다:
종양에 대한 항체-약물 접합체의 사멸 활성
군 종양억제율 (%)
IgG1 iso ADC (y=4), 3 mpk -
ADC2 (y=4), 3 mpk 164.67
실험 결과, 항체-약물 접합체 ADC2 (y = 4)가 생체 내에서 우수한 종양 억제 효과를 나타냄을 보여주었다.

Claims (15)

  1. 화학식 (I)로 표시되는 항체-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물로,

    여기서:
    W는 -(CReRf)g-X1-(CReRf)u-X2-(CReRf)h-이고;
    Re 또는 Rf는 수소, 중수소, 하이드록실, 아미노, 알킬, 할로겐, 할로알킬, 중수소화 알킬, 하이드록시알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고; 바람직하게는 Re 또는 Rf는 수소, 중수소로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고; 보다 바람직하게는 Re 또는 Rf는 수소이고;
    X1 또는 X2는 N, H, O 또는 S로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고; 바람직하게는 X1 또는 X2는 S로부터 독립적으로 선택되고; 보다 바람직하게는 X1 및/또는 X2는 O로부터 독립적으로 선택되고;
    g, u 또는 h는 1, 2, 3 및 4 로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고; 바람직하게는 g, u 또는 h는 1, 2, 3으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고; 보다 바람직하게는 g, u 또는 h는 2이고;
    y는 1 내지 20이고; 바람직하게는 y는 4 내지 10이고; 보다 바람직하게는 y는 4, 6, 8 또는 10이고;
    Ab는 항-BCMA 항체 또는 이의 항원-결합 단편이고, 여기서 항-BCMA 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 여기서 중쇄 가변 영역은 서열번호: 3에 기재된 HCDR1, 서열번호: 4에 기재된 HCDR2 및 서열번호: 5에 기재된 HCDR3을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 서열번호: 6에 기재된 LCDR1, 서열번호: 7에 기재된 LCDR2 및 서열번호: 8에 기재된 LCDR3을 포함하는, 항체-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항-BCMA 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 뮤린 항체, 키메라 항체, 인간 항체 또는 인간화 항체인, 항체-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 항-BCMA 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 또는 이의 변이체로부터 유래된 중쇄 불변 영역을 추가로 포함하고; 바람직하게는 상기 항-BCMA 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 이의 인간 IgG1, IgG2 또는 IgG4로부터 유래된 중쇄 불변 영역을 추가로 포함하고; 보다 바람직하게는 상기 항-BCMA 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 아미노산 돌연변이 후에 강화된 ADCC 독성을 갖는 IgG1 중쇄 불변 영역을 추가로 포함하고; 대안적으로, 상기 항-BCMA 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호: 22에 기재된 중쇄 불변 영역을 추가로 포함하는, 항체-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물.
  4. 제2항에 있어서, 상기 항-BCMA 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간 κ 사슬, λ 사슬 또는 이의 변이체로부터 유래된 경쇄 불변 영역을 추가로 포함하고; 바람직하게는 상기 항-BCMA 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간 κ 사슬로부터 유래된 경쇄 불변 영역을 추가로 포함하고; 보다 바람직하게는, 상기 항-BCMA 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호: 23에 기재된 경쇄 불변 영역을 추가로 포함하는, 항체-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물.
  5. 제2항에 있어서, 상기 항-BCMA 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호: 9, 서열번호: 10 및 서열번호: 11로 이루어진 군으로부터 선택되는 중쇄 가변 영역, 또는 이들과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하고/하거나
    상기 항-BCMA 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호: 12, 서열번호: 13 및 서열번호: 14로 이루어진 군으로부터 선택되는 경쇄 가변 영역, 또는 이들과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항체-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 항-BCMA 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호: 9에 기재된 중쇄 가변 영역 및 서열번호: 12에 기재된 경쇄 가변 영역을 포함하거나;
    또는 상기 항-BCMA 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호: 10에 기재된 중쇄 가변 영역 및 서열번호: 13에 기재된 경쇄 가변 영역을 포함하거나;
    또는 상기 항-BCMA 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호: 11에 기재된 중쇄 가변 영역 및 서열번호: 14에 기재된 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항체-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물.
  7. 제5항에 있어서,
    상기 항-BCMA 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호: 15, 서열번호: 16 또는 서열번호: 17에 기재된 중쇄, 또는 이들과 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 동일성을 갖는 중쇄를 포함하고/하거나
    상기 항-BCMA 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호: 18, 서열번호: 19 또는 서열번호: 20에 기재된 경쇄, 또는 이들과 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 동일성을 갖는 경쇄를 포함하는, 항체-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 항-BCMA 항체는 서열번호: 15에 기재된 중쇄 및 서열번호: 18에 기재된 경쇄를 포함하거나,
    또는 상기 항-BCMA 항체는 서열번호: 16에 기재된 중쇄 및 서열번호: 19에 나타낸 경쇄를 포함하거나,
    또는 상기 항-BCMA 항체는 서열번호: 17에 기재된 중쇄 및 서열번호: 20에 기재된 경쇄를 포함하는, 항체-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물은 하기 화학식 (II)에 표시된 것, 또는 이들의 토토머, 메소머, 라세미체, 거울상이성질체, 부분입체이성질체 또는 혼합물 형태이고;

    여기서, Ab 및 y는 제1항에서 정의된 바와 같은, 항체-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 항체-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물은 하기 화학식 (III)에 표시된 것이고;

    여기서, Ab 및 y는 제1항에서 정의된 바와 같은, 항체-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물은 하기 구조로 이루어진 군으로부터 선택되고;



    여기서 y는 제1항에서 정의된 바와 같은, 항체-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물.
  12. 화학식 (I)의 항체-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물의 제조 방법으로,

    Ab가 환원된 후, 화학식 (F)와 커플링 반응하여 화학식 (I)의 화합물을 수득하는 단계를 포함하며;
    여기서, W, Ab 및 y는 제1항에서 정의된 바와 같은, 제조 방법.
  13. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 항체-약물 접합체, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물, 및 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 부형제, 희석제 또는 담체를 포함하는 약학적 조성물.
  14. BCMA-매개 질환 또는 상태를 치료 또는 예방하기 위한 약제의 제조에 있어서 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 항체-약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물, 또는 제13항에 따른 약학적 조성물의 용도.
  15. 제14항에 있어서, 상기 BCMA-매개 질환 또는 상태는 암 또는 자가면역 질환인 것을 특징으로 하고; 상기 암은 바람직하게는 BCMA를 발현하는 암, 보다 바람직하게는 림프종, 백혈병 또는 골수종이고, 상기 자가면역 질환은 바람직하게는 홍반성 루푸스, IgA 신장병 및 류마티스성 관절염으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 용도.
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