KR20230131816A

KR20230131816A - 저면역원성 줄기세포, 줄기세포로부터 분화되거나 유래된 저면역원성 세포및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR20230131816A
Application number: KR1020237009539A
Authority: KR
Inventors: 이재영; 이강인; 손영주; 고난영; 신은지; 유환열
Original assignee: 주식회사 툴젠
Priority date: 2022-03-04
Filing date: 2023-03-06
Publication date: 2023-09-14
Also published as: CN118843688A; WO2023167575A1

Abstract

면역활성 억제 인자의 발현 또는 활성 수준이 증가되어 이식 시 면역 거부 반응을 억제할 수 있는 저면역원성 줄기세포, 줄기세포로부터 분화하거나 유래된 저면역원성 세포, 이의 제조방법 및 이를 이용한 세포 치료제가 제공된다.

Description

저면역원성 줄기세포, 줄기세포로부터 분화되거나 유래된 저면역원성 세포 및 이의 제조방법

면역활성 억제인자의 발현 또는 활성 수준이 증가되어 이식 시 면역 거부 반응을 억제할 수 있는 저면역원성 줄기세포, 줄기세포로부터 분화되거나 유래된 저면역원성 세포, 이의 제조방법 및 이를 이용한 세포 치료제가 제공된다.

유도 만능줄기세포(induced pluripotent stem cells, 이하 'iPSC') 는, 인체에서 분리된 체세포를 인위적인 자극을 통해 우리 몸의 모든 세포로 분화 가능한 만능줄기세포로 역분화한 것으로, 이의 전분화능을 이용하여 손상된 세포, 조직, 장기를 재생하기 위한 재생 세포 치료제로 주목받고 있다.

환자 자신의 세포에서 유도 만능줄기세포를 만들어 필요한 세포, 오가노이드, 장기 등으로 분화시켜 환자 자신의 치료에 사용하는 경우 면역거부 반응 이 적기 때문에 자가유래 세포 치료에 사용될 수 있다. 그러나, 이러한 맞춤형 줄기세포 치료의 경우 재생 치료를 위한 세포, 조직 등으로 제조하는데 시간과 인력 이 소요되어 상용화에 제한점이 있다.

이에 환자 본인의 세포인 자가유래(autologous) 세포 치료제가 아닌 타인으로부터 유래한 동종유래(allogenic) 세포 치료제가 대안이 될 수 있으나, 인간의 체내에서 중요한 면역 메커니즘을 담당하는 NK 세포, T 세포 등의 면역 담당 세포에 인식되어 면역거부반응이 발생할 수 있다.

자연살해세포(Natural Killer Cell, NK 세포)는 세포표면의 다양한 활성화 수용체(activating receptor)와 억제성 수용체(inhibitory receptor)를 통해 암세포, 바이러스 감염 세포 등 비정상적인 세포에 발현되는 그들의 리간드(ligands)와 결합하여 이로써 유도되는 신호간의 균형에 의해 그 활성이 조절된다. 또한 면역체계는 세포를 직접적으로 공격할 수 있는 T 세포가 과도하게 활성화되어 정상세포를 공격하는 것을 막기 위해 면역 관문(immune checkpoint)라고 불리는 억제기전을 가지고 있다. T 세포의 활성화는 그 세포 표면에 존재하는 T 세포 항원수용체(T cell receptor, TCR)가 항원제시세포(Antigen Presenting cell, APC)의 MHC 분자에 결합된 항원을 인지하는 것으로부터 시작된다. TCR-MHC 결합을 통해 항원을 인지한 후 APC에서 발현하는 CD80, CD40 등이 T 세포 표면의 리간드에 해당하는 CD28, CD40L 등과 동시에 결합함으로써 T세포의 활성화가 이루어진다. 반면에 T 세포 상의 CTLA-4, PD-1 등의 면역 관문 수용체는 암세포 등 비정상세포 상의 CD80, CD86, PD-L1 등의 면역 관문 리간드와의 결합을 통하여 T 세포를 비활성화하는 억제 신호를 보낸다.

따라서, 생체 내 이러한 면역 활성화 및 억제 관련 수용체와 작용하는 리간드를 유전적으로 조작하는 것은 면역 거부반응을 피할 수 있는 바람직한 대안이 될 수 있다.

일본공개특허 2018-515139 대한민국공개특허 10-2020-0120939

Nayoung Kim, HunSik Kim, Front. Immunol., 10 September 2018, Targeting Checkpoint Receptors and Molecules for Therapeutic Modulation of Natural Killer Cells Rupal S. Bhatt et al., November 23, 2020, Cancer Immunology Research. KIR3DL3 is an inhibitory receptor for HHLA2 that mediates an alternative immunoinhibitory pathway to PD1

본 발명의 과제는 세포, 조직, 장기이식 시 면역 거부 반응을 억제할 수 있는 저면역원성 줄기세포, 줄기세포로부터 분화되거나 유래된 저면역원성 세포, 이의 제조방법 및 이를 이용한 세포 치료제를 제공하는 것이다.

상기한 과제를 달성하기 위해, 본 발명은 줄기세포 유전체(genome)에 LGALS9(Gal-9), CLEC4G(LSECtin), PD-L1 및 HHLA2로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 면역활성 억제 인자를 코딩하는 유전자가 삽입된 인위적으로 조작된 유전자를 갖는, 인위적으로 조작된 줄기세포를 제공한다.

또한 본 발명은 줄기세포로부터 분화하거나 유래된 세포의 유전체(genome)에 LGALS9(Gal-9), CLEC4G(LSECtin), PD-L1 및 HHLA2로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 면역활성 억제 인자를 코딩하는 유전자가 삽입된 인위적으로 조작된 유전자를 갖는, 줄기세포로부터 분화하거나 유래된 인위적으로 조작된 세포를 제공한다.

또한 본 발명은 상기한 인위적으로 조작된 줄기세포로부터 분화되거나 유래한, LGALS9(Gal-9), CLEC4G(LSECtin), PD-L1 및 HHLA2로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 면역활성 억제 인자의 발현 또는 활성이 증가한 세포를 제공한다.

또한 본 발명은 줄기세포 또는 줄기세포로부터 분화하거나 유래된 세포의 유전체(genome) 내에 위치한 표적 서열을 표적화할 수 있는 가이드 핵산 또는 이를 암호화하는 핵산; LGALS9(Gal-9), CLEC4G(LSECtin), PD-L1 및 HHLA2로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 면역활성 억제 인자를 코딩하는 유전자 도너 또는 이를 암호화하는 핵산 및 에디터단백질 또는 이를 암호화하는 핵산을 포함하는 저면역원성 줄기세포 또는 줄기세포로부터 분화하거나 유래된 저면역원성 세포 제조용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 분리된 줄기세포 또는 분리된 줄기세포로부터 분화하거나 유래된 세포에 상기한 저면역원성 줄기세포 또는 줄기세포로부터 분화하거나 유래된 저면역원성 세포 제조용 조성물을 도입하는 단계; 및

상기 줄기세포 또는 분리된 줄기세포로부터 분화하거나 유래된 세포의 LGALS9(Gal-9), CLEC4G(LSECtin), PD-L1 및 HHLA2로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 면역활성 억제 인자의 발현 또는 활성을 증가시키도록 LGALS9(Gal-9), CLEC4G(LSECtin), PD-L1 및 HHLA2로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 면역활성 억제 인자를 코딩하는 유전자를 상기 줄기세포 또는 줄기세포로부터 분화하거나 유래된 세포 유전체(genome)에 넉-인(knock-in)하는 단계

를 포함하는 저면역원성 줄기세포 또는 줄기세포로부터 분화하거나 유래된 저면역원성 세포의 제조방법을 제공한다.

또한 본 발명은 상기한 인위적으로 조작된 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 세포 이식 또는 생체 조직 재생용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 상기한 줄기세포로부터 분화하거나 유래된 인위적으로 조작된 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 세포 이식 또는 생체 조직 재생용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 상기한 인위적으로 조작된 줄기세포로부터 분화되거나 유래한, LGALS9(Gal-9), CLEC4G(LSECtin), PD-L1 및 HHLA2로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 면역활성 억제 인자의 발현 또는 활성이 증가한 세포를 유효성분으로 포함하는 세포 이식 또는 생체 조직 재생용 조성물을 제공한다.

본 발명의 줄기세포 또는 줄기세포로부터 분화하거나 유래한 세포는 세포, 조직, 장기이식 시 면역 거부 반응을 회피하는 저면역원성을 나타내므로, 이를 다양한 세포로 분화하여, 자가 또는 동종 유래 환경에서 면역 거부반응을 일으키지 않는 세포 치료제로 이용될 수 있다.

도 1은 세이프 하버(Safe harbor) 사이트 중 하나인 AAVS1의 특정 사이트를 기준으로 상동성 아암(homology arm) 왼쪽과 오른쪽 사이에 3가지 유전자 LGALS9(Gal-9), CLEC4G(LSECtin) 및 HHLA2를 삽입한 모식도를 나타낸 것이다.
도 2는 실시예 1에서 제조한 유전자 3개가 넉-인(KI)된 iPSC로부터 다단일 클론(single Clone)들을 선별하기 위해, 세포의 DNA로부터 PCR반응을 수행한 결과 및 하고, 상기에서 얻은 PCR 산물을 사용하여 생어 서열분석 (Sanger sequencing)을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 실시예 1에서 넉-인한 3가지 유전자에 대한 mRNA 레벨(level) 변화를 Real time PCR 방법으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 실험예 3에서 ddPCR 방법을 이용하여 넉-인(KI)된 유전자들의 카피 수(Copy Number)를 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 실험예 4에서 유세포 분석을 통해 실시예 1에서 제조한 AAVS1-ALC3#11 clone의 HHLA2 발현량을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 6(a)는 야생형(WT) iPSC 및 실시예 1에서 제조한 유전자 3개가 넉-인(KI)된 iPSC를 내피세포(EC)로 분화시킨 후 항-CD31 항체를 이용하여 유세포 분석한 결과를 나타낸 것이고, 도 6(b)는 iPSC로부터 분화된 내피세포(EC)의 표면에서 HLA-ABC항원이 나타나는 것을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 7(a)는 K562 세포, 야생형(WT) iPSC를 분화시킨 내피세포(WT-iPSC_EC), 실시예 1에서 제조한 유전자 3개가 넉-인(KI)된 iPSC를 분화시킨 내피세포(KI-iPSC EC)를 효과기 세포인 NK 세포와 다양한 비율로 배양하여 세포독성을 확인한 결과를 나타낸 그래프이고, 도 7(b)는 HLA-ABC가 98%이상 발현되는 야생형(WT) iPSC를 분화시킨 내피세포(WT-iPSC_EC, 도 6(b))와 실시예 1에서 제조한 유전자 3개가 넉-인(KI)된 iPSC를 분화시킨 내피세포(KI-iPSC EC)에서 NK 세포의 세포독성을 평가한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 8은 LGALS9(Gal-9)/CLEC4G(LSECtin)/HHLA-2(서열번호 23), LGALS9(Gal-9)(서열번호 24), CLEC4G(LSECtin)(서열번호 25), LGALS9(Gal-9)/CLEC4G(LSECtin)(서열번호 26), LGALS9(Gal-9)/ CLEC4G(LSECtin)/PD-L1(서열번호 27)의 각각의 유전자 서열 삽입을 위한 렌티바이러스의 일 예시를 나타내는 도이다.
도 9(a)는 K562 세포, 야생형(WT) iPSC를 분화시킨 내피세포(WT-iPSC_EC), iPSC로부터 분화된 내피세포에 서열번호 24의 Gal-9 유전자가 삽입된 내피세포(Gal-9_EC), iPSC로부터 분화된 내피세포에 서열번호 25의 CLEC4G 유전자가 삽입된 내피세포(CLEC4G_EC), iPSC로부터 분화된 내피세포에 서열번호 26의 Gal-9/CLEC4G 유전자가 삽입된 내피세포(Gal-9+CLEC4G_EC), iPSC로부터 분화된 내피세포에 서열번호 27의 Gal-9/CLEC4G/PD-L1 유전자가 삽입된 내피세포(Gal-9+CLEC4G+ PD-L1_EC)를 효과기 세포인 NK 세포와 다양한 비율로 배양하여 세포독성을 확인한 결과를 나타낸 그래프이고, 도 9(b)는 효과기 세포(effector, NK 세포) : 표적 세포(EC, 내피세포)를 1:1의 비율로 공배양하여 7-AAD+한 세포를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 명세서에 있어서, "줄기세포(stem cell)"란 여러 종류의 신체 조직 세포로 분화할 수 있는 능력, 즉, 줄기세포성(stemness)을 가진 미분화 세포를 총칭하는 광의의 개념을 말한다. 이때 상기 줄기세포는 유도 만능줄기세포, 배아줄기세포, 체세포 핵치환 배아줄기세포(Somatic cell nuclear transfer-PSC) 또는 성체 줄기세포일 수 있다. 또한, 상기 세포는 인간 유래일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에 있어서, "분화"는 세포가 분열하여 증식하며 전체 개체가 성장하는 동안에 세포의 구조나 기능이 특수화되는 현상을 의미한다. 즉, 생물의 세포, 조직 등이 각각에게 주어지는 역할을 수행하기 위해 적합한 형태 및 기능으로 변하는 과정을 말하며, 예를 들어, 만능 줄기세포가 외배엽(대뇌 피질, 중뇌, 시상하부 등), 중배엽(난황낭 등) 및 내배엽 세포로 변하는 과정뿐 아니라 조혈모세포가 적혈구, 백혈구, 혈소판 등으로 변하는 과정, 즉 전구세포가 특정 분화형질을 발현하게 되는 것도 모두 분화에 포함될 수 있다.

본 명세서에 있어서, "발현 증가"는 야생형에서 측정된 단백질의 발 현 수준보다 높은 정도의 발현이 나타내는 것을 의미한다. 상기 증가는 유전적 변형을 갖지 않은 세포 또는 야생형 세포에 비하여 약 5% 이상, 약 10% 이상, 약 15% 이상, 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 또는 약 100% 이상 증가된 것일 수 있다. 상기 발현의 증가는 유전자 카피 수의 증가 또는 증가된 전사 또는 번역에 의하여 야기될 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "활성 증가(increase in activity)", 또는 "증가된 활성 (increased activity)"은 단백질 또는 효소 활성의 검출 가능한 증가를 나타낼 수 있다. "활성 증가 (increase in activity)", 또는 "증가된 활성(increased activity)"은 주어진 모세포 또는 야생형 세포에 비해 더 높은 수준의 단백질, 또는 효소의 활성을 의미한다.

본 명세서에 있어서, "면역활성 억제인자"는 T 세포, NK 세포 등의 면역 담당 세포에서 발현되는 면역관문 수용체(immune checkpoint receptor) 또는 면역억제성 수용체(inhibitory receptor)와 특이적으로 결합하여 면역 세포 활성을 억제할 수 있는 리간드를 의미한다.

본 명세서에 있어서, "저면역원성"은 세포가 다른 개체에게 이식 시, 야생형과 비교할 때 감소하거나 제거된 면역 거부 반응을 나타내는 것을 의미 한다. 면역 거부 반응은 20% 이상, 약 30% 이상, 약 40% 이상, 약 50% 이상, 약 55% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 또는 약 100% 감소된 것일 수 있다.

면역억제인자의 발현 또는 활성 수준이 증가되어 이식 시 면역 거부 반응을 억제할 수 있는 저면역원성 줄기세포 또는 줄기세포로부터 분화하거나 유래한 저면역원성 세포가 제공된다.

상기 줄기세포는 T세포, NK 세포 등의 면역세포 활성화를 억제하는 면역관문(immune checkpoint) 수용체와 결합하는 리간드의 발현 또는 활성, 면역억제성 수용체(inhibitory receptor)와 결합하는 리간드의 발현 또는 활성이 증가되어, 자가 또는 동종유래 환경에서 세포 치료제로 사용시 면역 거부반응이 억제되어 면역관용 상태가 될 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 줄기세포 또는 줄기세포로부터 분화하거나 유래한 세포는 야생형 줄기세포 또는 야생형 세포와 비교하여, LGALS9(Gal-9), CLEC4G(LSECtin), PD-L1 및 HHLA2로 이루어진 군에서 선택된 하 나 이상의 면역활성 억제 인자의 발현 또는 활성이 증가할 수 있다.

갈렉틴-9(Gal-9) 또는 LGALS9는 TIM-3(T-cell immunoglobulin and mucin domain protein 3)에 대한 알려진 리간드로, 렉틴, 갈락토사이드-결합, 가용성, 9(lectin, galactoside-binding, soluble, 9); 종양 항원 HOM-HD-21; 에칼렉틴 (Ecalectin); Gal-9; 요산염 수송체/채널 단백질; LGALS9A; 및 HUAT와 같은 많은 다른 명칭으로 알려져 있다. TIM-3는 면역억제성 수용체로, T세포와 조절T세포, B 세포, 수지상세포, NK세포, 대식세포에 발현되며, TIM-3의 리간드인 갈렉틴-9과 결합시 T 세포, NK 세포 등의 활성이 억제된다.

LSECtin(liver and lymph node sinusoidal endothelial cell C-type lectin)는 LAG-3(lymphocyte activation gene 3)에 대한 리간드이다. LAG-3는 TIM3, CTLA-4, PD-1, PD-L1과 같은 여러 면역관문 단백질 중 하나로, 도움 T 세포와 세포독성 T 세포, 조절T 세포, 일부 NK세포, B세포 등에서 발현된다. T 세포 등의 표면에 위치한 면역관문 단백질과 비정상세포 등에 존재하는 특이적 리간드가 결합하여 T 세포, NK 세포가 무력화됨으로써 면역회피(immune evasion)가 나타난다.

PD-L1(Programmed cell Death Ligand-1)는 정상 세포에 존재하는 막 횡단 단백질로 T 세포의 Programmed cell death protein 1(PD-1)과 결합하는 PD-1에 대한 리간드로서 PD-1과 결합하여 면역 공격 회피를 유도한다. 한편, T 세포가 활성화되기 위해서는 T 세포 수용체(receptor)와 항원의 1차 신호자극 이외에 2차 신호자극(co-stimulation)이 동시에 필요하다. 이때, 둘 중 하나의 신호라도 없으면 T 세포는 비활성화 상태가 된다. PD-1(programmed death-1)은 T 세포의 2차 신호 활성을 조절하는 2차 신호자극인자(immune check point 또는 immune modulator)로서, 활성화된 T 세포(CD8 및/또는 CD4)나 수지상 세포(dendritic cell)와 같이 세포 표면에서 발현하는 PD-L1(programmed cell death ligand 1) 또는 B7.1 (CD80) 등과 결합함으로써, T 세포의 증식을 억제하고, 사이토카인(cytokine) 발현을 감소시키는 등 T 세포의 기능을 억제하는 작용을 할 수 있다.

HHLA2(human endogenous retrovirus-H long terminal repeatassociating protein 2)는 T 세포의 기능을 조절하는 새롭게 확인된 B7 패밀리 구성원이다. HHLA2는 TMIGD2(transmembrane and immunoglobulin domain containing 2)에 대한 특이적 리간드로 확인되었고 HHLA2/TMIGD2 상호작용은 AKT-의존성 신호전달 케스케이드를 통해 인간 T-세포 성장 및 사이토카인 생산을 선택적으로 공동자극한다. 또한 HHLA2는 T 및 NK 세포 상의 수용체인 KIR3DL3(killer cell immunoglobulin-like receptor, three immunoglobulin domains and long cytoplasmic tail 3)와 결합하여 또한 T 세포 활성화도 저해한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 줄기세포는 줄기세포 유전체(genome)에 LGALS9(Gal-9), CLEC4G(LSECtin), PD-L1 및 HHLA2로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 면역활성 억제 인자를 코딩하는 유전자가 삽입된 인위적으로 조작된 유전자를 갖는, 인위적으로 조작된 줄기세포이다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 줄기세포로부터 분화하거나 유래된 세포는 줄기세포로부터 분화하거나 유래된 세포 유전체(genome)에 LGALS9(Gal-9), CLEC4G(LSECtin), PD-L1 및 HHLA2로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 면역활성 억제 인자를 코딩하는 유전자가 삽입된, 인위적으로 조작된 유전자를 갖는, 줄기세포로부터 분화하거나 유래된 인위적으로 조작된 세포이다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 줄기세포로부터 분화하거나 유래된 세포는 인간혈관내피세포, 췌장세포, 골세포, 연골세포, 심근세포, 근육세포, 표피세포, 섬유아세포, 신경세포, 간세포, 장세포, 위세포, 피부세포, 지방세포, 혈액세포, 면역세포,　세포　스페로이드 및 오가노이드로 이루어진 군에서 선택된 1종이다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 인위적으로 조작된 줄기세포의 유전자의 서열은 상기 야생형 줄기세포의 유전자 서열과 다르고, 야생형 줄기세포와 비교하여, LGALS9(Gal-9), CLEC4G(LSECtin), PD-L1 및 HHLA2로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 면역활성 억제 인자를 코딩하는 유전자 또는 LGALS9(Gal-9), CLEC4G(LSECtin), PD-L1 및 HHLA2로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 면역활성 억제 인자의 발현 또는 활성이 증가할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 줄기세포로부터 분화하거나 유래된 인위적으로 조작된 세포의 유전자의 서열은 상기 야생형 세포의 유전자 서열과 다르고, 야생형 줄기세포와 비교하여, LGALS9(Gal-9), CLEC4G(LSECtin), PD-L1 및 HHLA2로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 면역활성 억제 인자를 코딩하는 유전자 또는 LGALS9(Gal-9), CLEC4G(LSECtin), PD-L1 및 HHLA2로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 면역활성 억제 인자의 발현 또는 활성이 증가할 수 있다.

본 명세서에 있어서, "발현 또는 활성 증가"는 야생형 줄기세포 또는 야생형 세포에 비하여 높은 수준으로 발현되거나, 또는 단백질이 발현이 되더라도 그 활성이 높은 것을 의미할 수 있다.

즉, 줄기세포 또는 줄기세포로부터 분화하거나 유래된 세포에 있어서 LGALS9(Gal-9), CLEC4G(LSECtin), PD-L1 및 HHLA2로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 면역활성 억제 인자의 발현 또는 활성이 야생형 줄기세포 또는 야생형 세포의 발현 또는 활성보다 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 40% 이상, 약 50% 이상, 약 55% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 또는 약 100% 증가된 것일 수 있다.

본 발명에서, 유전자 핵산 서열 인위적인 변경은 유전자를 구성하는 핵산의 변형을 통해 이루어질 수 있다. 이는 유전자의 일부 또는 전부가 변이, 치환, 삭제되거나 상기 유전자에 하나 이상의 염기가 삽입되는 것에 의한 것일 수 있으며, 유전자 가위 기술을 이용하여 이루어질 수 있다. 일 예로, 비-상동적인 말단 연결(non-homologous end joining, NHEJ) 또는 상동 재조합 수리(homology directed repair, HDR) 기작에 의해 이루어질 수 있다.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 줄기세포 또는 줄기세포로부터 분화하거나 유래된 세포는 LGALS9(Gal-9), CLEC4G(LSECtin), PD-L1 및 HHLA2로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 면역활성 억제인자를 코딩하는 유전자가 넉-인(knock-in)될 수 있다.

본 명세서에 있어서, "넉-인(knock-in)"은 특정 핵산 또는 유전자를 세포 내 동물 유전체(animal genome) 상 표적 유전자 또는 핵산에 삽입(insertion) 하는 것을 의미한다.

세포는 임의의 이중 가닥 또는 단일 가닥 DNA 손상을 복구하기 위해 고유의 기전을 가지고 있다. DNA 이중가닥 절단(DNA double-strand break, DSB) 복구 기전은 비-상동적인 말단 연결(non-homologous end joining, NHEJ)과 상동 재조합(homologous recombination, HR)으로 분류된다.

상동 재조합 수리(homology directed repair, HDR)는 손상된 유전자 또는 핵산을 수선 또는 수복하기 위해 상동성을 가진 서열을 주형으로 이용하는 방 식으로 오류 없이 교정할 수 있는 방법이다. 일반적으로, 파손된 DNA을 수선 또는 수복하기 위해, 변형이 이루어지지 않은 상보적인 뉴클레오타이드 서열의 정보를 이용하거나 자매 염색분체의 정보를 이용하여 파손된 DNA를 수선 또는 수복한다.

HDR을 이용한 손상된 DNA 수선 또는 수복을 위해, 세포가 본래 가지는 상보적인 뉴클레오타이드 서열 또는 자매 염색분체를 이용하는 대신에, 상보적인 뉴클레오타이드 서열 또는 상동성 뉴클레오타이드 서열 정보를 이용한 인공적으로 합성한 DNA 주형, 즉, 상보적인 뉴클레오타이드 서열 또는 상동성 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 주형을 세포에 제공하여 파손된 DNA를 수선 또는 수복할 수 있다. 이때, 상기 핵산 주형에 추가로 핵산 서열 또는 핵산 조각을 포함시켜 파손된 DNA를 수선 또는 수복할 때, 파손된 DNA에 추가로 포함시킨 핵산 서열 또는 핵산 조각을 넉-인(knock-in)할 수 있다.

일 예로, CRISPR 복합체를 이용하여 표적 유전자 또는 핵산의 이중 가닥 또는 단일 가닥을 절단하고, 절단 위치와 근접한 뉴클레오타이드 서열과 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 주형을 세포에 제공하여 표적 유전자 또는 핵산의 절단된 뉴클레오타이드 서열을 HDR 방법으로 수선 또는 수복할 수 있다. 상동성-독립 표적화된 삽입(homology-independent targeted integration, HITI)은 증식 및 비 증식 세포에서 이식 유전자(transgene)의 삽입을 가능하게 한다(Suzuki et al., Nature, 2016, 540(7631):144-149). HITI는 CRISPR/Cas9를 이용하여 삽입 부위를 표적으로 하고, 특정 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 도너를 공급하여 비-상동성 말단-결합(Non-homologous end joining, NHEJ)를 통해 절단된 표적 DNA 끝 사이에 도너의 특정 뉴클레오타이드 서열이 삽입 될 수 있도록 한다.

일 예로, CRISPR/Cas9을 이용하여 표적 유전자를 절단하여 특정 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 도너를 HITI 방법을 통해 넉-인(knock-in)할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에서, LGALS9(Gal-9), CLEC4G(LSECtin), PD-L1 및 HHLA2로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 면역활성 억제 인자를 코딩하는 유전자는 줄기세포 또는 줄기세포로부터 분화하거나 유래된 세포의 유전체 중 세이프 하버 부위에 삽입될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 일 구체예에서, 상기 면역활성 억제 인자를 코딩하는 유전자는 상기 유전체 중 AAVS1 유전자좌, CCR5 유전자좌, CLYBL 유전자좌, ROSA26 유전자좌, 및 SHS231 유전자좌(chromosome 4 'safe harbor site' 231)에 삽입될 수 있다.

본 발명은 줄기세포 또는 줄기세포로부터 분화하거나 유래된 세포의 LGALS9(Gal-9), CLEC4G(LSECtin), PD-L1 및 HHLA2로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 면역활성 억제 인자의 발현 또는 활성을 증가시키는 단계의 저면역원성 줄기세포 또는 줄기세포로부터 분화하거나 유래된 저면역원성 세포의 제조방법을 제공한다.

상기 면역활성 억제 인자/단백질의 발현 또는 활성의 증가는 해당 유전자의 인위적인 변형에 의해 이루어질 수 있으며, 일 예로 유전자 가위 기 술을 이용할 수 있다.

일 예로, 상기 유전자 가위 기술은 TAL 이펙터(transcription activator-like effector 또는 TALE) 도메인과 절단 도메인이 융합된 TALEN(transcription activatorlike effctor nuclease), 징크-핑거 뉴클레아제 (zinc-finger nuclease), 또는 미생물 면역체계인 CRISPR에서 유래한 CRISPR enzyme system 이 가능하며, 이에 제한되는 것은 아니다.

"TALEN"은 DNA의 타겟 영역을 인식 및 절단할 수 있는 뉴클레아제를 말한다. 상기 TALEN은 TALE 도메인 및 뉴클레오타이드 절단 도메인을 포함하는 융합 단백질이다. TAL 이펙터는 잔토모나스(Xanthomonas) 박테리아가 다양한 식물 종에 감염될 때 이들의 타입 분비 시스템을 통해 분비되는 단백질로 알려져 있다. 상기 단백질은 숙주 식물 내의 프로모터 서열과 결합하여 박테리아 감염을 돕는 식물 유전자의 발현을 활성화시킬 수 있다. 상기 단백질은 34 개 이하의 다양한 수의 아미노산 반복으로 구성된 중심 반복 도메인을 통해 식물 DNA 서열을 인식한다. "TALE 도메인" 또는 "TALE"는 하나 이상의 TALE 반복 도메인/단위를 포함하는 폴리펩타이드이다. 이 반복 도메인은 TALE과 그것의 동족 표적 DNA 서열의 결합과 관련된다. 단일 "반복 유닛은 전형적으로 33-35 아미노산 길이이며, 자연 발생한 TALE 단백질 내의 다른 TALE 반복 서열과 적어도 일부 서열 상동성을 나타낸다. 상기 TALE 도메인은 하나 이상의 TALE-반복 모듈을 통해 서열-특이적 방식으로 뉴클레오타이드에 결합하는 단백질 도메인이다.

상기 TALE DNA 결합 도메인은 적어도 하나의 TALE-반복 모듈, 보다 구체적으로 1 내지 30개의 TALE-반복 모듈을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 상기 TALE DNA 결합 도메인은 TALE-반복 모듈의 절반을 포함할 수 있다. 상기 TALE과 관련하여 국제공개특허 WO2012/093833호 또는 미국공개특허 2013-0217131호에 개시된 내용 전문이 본 명세서에 참고자료로서 포함된다.

"징크 핑거 DNA 결합 단백질"(또는 결합 도메인)은 아연 이온의 배위를 통해 그 구조가 안정화된 결합 도메인 내의 아미노산 서열 영역인 하나 이상의 징크 핑거를 통해서 서열-특이적 방식으로 DNA와 결합하는 단백질, 또는 더 큰 단백질 내의 도메인이다. 용어 "징크 핑거 DNA 결합 단백질"은 주로 징크 핑거 단백질 또는 ZFP로 약기된다.

상기 징크-핑거 뉴클레아제(zinc-finger nuclease, ZFN)는 표적 유전자 및 절단 도메인 또는 절단 하프-도메인의 표적 부위에 결합하도록 조작된 징크-핑거 단백질을 포함한다. 상기 ZFN은 징크-핑거 DNA 결합 도메인 및 DNA 절단 도메인을 포함하는 인공적인 제한효소일 수 있다. 여기서, 징크-핑거 DNA 결합 도메인은 선택된 서열에 결합하도록 조작된 것일 수 있다. 예를 들면, Beerli et al. (2002) Nature Biotechnol. 20:135-141; Pabo et al. (2001) Ann. Rev. Biochem. 70:313-340; Isalan et al, (2001) Nature Biotechnol. 19: 656-660; Segal et al. (2001) Curr. Opin. Biotechnol. 12:632-637; Choo et al. (2000) Curr. Opin. Struct. Biol.10:411-416이 본 명세서 참고자료로서 포함될 수 있다. 자연 발생된 징크 핑거 단백질과 비교하여, 조작된 징크 핑거 결합 도메인은 신규한 결합 특이성을 가질 수 있다. 조작 방법은 합리적 설계 및 다양한 타입의 선택을 포함하나 이에 국한되지는 않는다. 합리적 설계는, 예를 들어 삼중 (또는 사중) 뉴클레오티드 서열, 및 개별 징크 핑거 아미노산 서열을 포함하는 데이터베이스의 이용을 포함하며, 이때 각 삼중 또는 사중 뉴클레오티드 서열은 특정 삼중 또는 사중 서열에 결합하는 징크 핑거의 하나 이상의 서열과 연합된다.

상기 ZFN에서 표적 유전자 및 표적 서열의 선택, 융합단백질 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 설계 및 구성은 당업자에게 공지되어 있으며, 참고자료로 미국특허등록 7,888,121 및 8,409,861 전문에 상세하게 설명되며, 상기 공개특허의 전문이 본 발명의 참고자료로서 본 명세서에 포함된다. 또한, 이러한 참고 문헌 및 당업계의 다른 문헌에 개시된 대로, 징크 핑거 도메인 및/또는 다중-핑거 징크 핑거 단백질들이 임의의 적절한 링커 서열, 예를 들면 5개 이상의 아미노산 길이의 링커를 포함하는 링커에 의해 함께 연결될 수 있다.

6개 이상의 아미노산 길이의 링커 서열의 예는 미국등록특허 6,479,626; 6,903,185; 7,153,949을 참고한다. 여기 설명된 단백질들은 단백질의 각 징크 핑거 사이에 적절한 링커의 임의의 조합을 포함할 수 있다.

상기 ZFN과 같은 뉴클레아제는 뉴클레아제 활성 부분인 절단 도메인 및/또는 절단 하프-도메인을 포함한다. 일 예로, 상기 절단 도메인은 징크-핑거 DNA 결합 도메인과는 상이한 뉴클레아제로부터 유래한 절단 도메인, 즉 이종성 절단 도메인일수 있다.

또 다른 예로, 상기 절단 하프-도메인은 절단 활성을 위하여 이량체화를 필요로 하는 임의의 뉴클레아제 또는 그것의 일부로부터 유래된 융합 단백질일 수 있다. 융합 단백질이 절단 하프-도메인을 포함하는 경우, 일반적으로 2개의 융합 단백질이 절단에 필요할 수 있다. 또는, 2개의 절단 하프-도메인을 포함하는 단일 단백질이 이용될 수 있다. 2개의 절단 하프-도메인은 동일한 엔도뉴클레아제 (또는 그것의 기능적 단편들)로부터 유래할 수도 있고, 또는 각 절단 하프-도메인이 상이한 엔도뉴클레아제 (또는 그것의 기능적 단편들)로부터 유래할 수도 있다. 또한, 2개의 융합 단백질의 표적 부위는, 2 개의 융합 단백질과 그것의 각 표적 부위의 결합에 의해 절단-하프 도메인들이 서로에 대해 공간적으로 배향되어 위치됨으로써, 절단 하프-도메인이, 예를 들어 이량체화에 의해 기능성 절단 도메인을 형성할 수 있도록 하는 관계로 배치되는 것이 바람직하다.

상기 "CRISPR-enzyme system"은 가이드 핵산 및/또는 에디터단백질로 구성된다. "가이드 핵산"은 표적 핵산, 표적 유전자 또는 표적 염색체를 인지 하고, 에디터 단백질과 상호작용할 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 이때, 상기 가이드 핵산은 표적 핵산, 표적 유전자 또는 표적 염색체 내의 일부 뉴클레오타이드와 상보적인 결합을 형성할 수 있다. 상기 가이드 핵산은 표적 DNA 특이적 가이드 RNA, 상기 가이드 RNA를 코딩하는 DNA 또는 DNA/RNA 혼합의 형태 일 수 있다.

상기 가이드 핵산은 가이드 RNA일 수 있다. "가이드 RNA"는 생체 외 (in vitro) 전사된 것일 수 있고, 특히 올리고뉴클레오타이드 이중가닥, 또는 플라스미드 주형으로부터 전사된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 가이드 RNA의 설계 및 구성은 당업자에게 공지되어 있으며, 한국등록특허 10-1656236, 10-1656237, 10-1706085, 10-2052286, 10-2182847에 상세하게 설명되며, 상기 등록특허 전문이 본 발명의 참고자료로서 본 명세서에 포함된다.

상기 가이드 핵산은 스캐폴드 서열 부분과 가이드 서열 부분을 포함할 수 있다. 상기 스캐폴드 서열 부분은 Cas 단백질과 상호작용하는 부분으로, Cas 단백질과 가이드 핵산이 결합하여 복합체(ribonucleoprotein, RNP)를 이룰 수 있도록 한다. 일반적으로, 상기 스캐폴드 서열 부분은 tracrRNA와 crRNA의 일부 서열 부분을 포함하며, 상기 스캐폴드 서열은 어떤 Cas 단백질을 사용하느냐에 따라서 결정된다.

상기 가이드 서열 부분은, 표적 유전자 내 일정 길이의 뉴클레오타이드 서열 부분과 상보적으로 결합할 수 있는 부분이며, 인위적으로 변형할 수 있는 염기 부분으로, 관심 있는 표적 뉴클레오타이드 서열(또는 표적 서열)에 의해 결정된다. 이때 상기 가이드 서열은 표적 유전자 또는 표적 핵산의 가이드 핵산 결합 서열과 최소한 50%, 55%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 이상의 상보성을 가지거나 또는 완전한 상보성을 가지는 뉴클레오타이드 서열일 수 있다. 상기 가이드 서열의 가이드 도메인에 포함된 서열일 수 있다.

상기 가이드 서열 부분은 crRNA에 포함될 수 있다. 일 예로, 상기 가이드 핵산은 두 개의 RNA, 즉, crRNA(CRISPR RNA) 및 tracrRNA(trans-activating crRNA)를 구성요소로 포함하는 이중 RNA(dual RNA) 일 수 있다.

다른 일 예로, 상기 가이드 핵산은 crRNA 및 tracrRNA의 주요 부분이 연결된 형태인 sgRNA(single-chain guide RNA) 일 수 있다.

상기 표적 서열은 표적 유전자 또는 표적 핵산 내에 존재하는 일정 길이의 뉴클레오타이드 서열로, 구체적으로는 표적 유전자의 조절 영역(regulatory region), 암호화 영역(coding region; 또는 CDS, coding sequence) 또는 비 암호화 영역(non-coding region; 또는 UTR, untranslated region)으로 구분되는 표적 영역 내의 일부 뉴클레오타이드 서열이거나, 상기 표적 영역들의 조합에서 선택되는 하나 이상의 일부 뉴클레오타이드 서열들일 수 있다. 상기 표적 서열은 가이드 핵산에디터단백질 복합체(RNP)의 타겟이 될 수 있다.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 표적서열은 세이프 하버 부위(safe harbor site)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 일 구체예에서, 상기 세이프 하버 부위(safe harbor site)는 AAVS1 유전자좌, CCR5 유전자좌, CLYBL 유전자좌, ROSA26 유전자좌, 및 SHS231 유전자좌로 이루어진 군에서 선택된 하나 일 수 있다.

상기 표적 서열은 에디터 단백질이 인식하는 프로토스페이서 인접 모티프 (protospacer-adjacent motif, PAM) 서열과 인접한 주변의 뉴클레오타이드 서열로, PAM의 전체 또는 일부를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

표적서열이라 함은 두 가지의 뉴클레오타이드의 서열 정보를 모두 의미하는 용어로 사용될 수 있다. 예를 들어, 표적 유전자의 경우, 표적 서열은 표적 유전자 DNA의 transcribed strand의 서열 정보를 의미하는 것일 수도 있고, 또는 non-transcribed strand의 뉴클레오타이드 서열 정보를 의미하는 것일 수 도 있다.

표적서열은 가이드 핵산 결합 서열 또는 가이드 핵산 비결합 서열을 포함한다. 가이드핵산 결합 서열은 가이드핵산의 가이드 도메인에 포함되는 가이드 서열과 일부 또는 완전한 상보성을 가지는 뉴클레오타이드 서열로, 가이드핵산의 가이드 도메인에 포함되는 가이드 서열과 상보적인 결합을 할 수 있다. 표적 서열 및 가이드핵산 결합 서열은 표적 유전자 또는 핵산에 따라, 즉 유전자 조작 또는 교정하고자 하는 대상에 따라 달라질 수 있는 뉴클레오타이드 서열로, 가이드 핵산은 표적 유전자 또는 표적 핵산에 따라 다양하게 설계될 수 있다.

"가이드핵산 비결합 서열"은 가이드핵산의 가이드 도메인에 포함되는 가이드 서열과 일부 또는 완전한 상동성을 가지는 뉴클레오타이드 서열로, 가이 드 핵산의 가이드 도메인에 포함되는 가이드 서열과 상보적인 결합을 할 수 없다. 또한, 가이드핵산 비결합 서열은 가이드핵산 결합 서열과 상보성을 가지는 뉴클레오타이드 서열로, 가이드핵산 결합 서열과 상보적인 결합을 할 수 있다. 가이드핵산 결합 서열은 표적 서열 중 일부 뉴클레오타이드 서열로, 표적 서열의 두 가지 서로 다른 서열순서를 가지는 뉴클레오타이드 서열, 즉, 서로 상보적인 결합을 할 수 있는 두 가지의 뉴클레오타이드 서열 중 한 가지 뉴클레오타이드 서열일 수 있다. 이때, 가이드핵산 비결합 서열은 표적 서열 중 가이드핵산 결합 서열을 제외한 나머지 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.

가이드핵산 결합 서열은 표적 서열, 즉, transcribed strand와 동일한 뉴클레오타이드 서열 및 non-transcribed strand와 동일한 뉴클레오타이드 서열 중 선택된 하나의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다. 이때, 가이드핵산 비결합 서열은 표적 서열 중 가이드핵산 결합 서열, 즉, transcribed strand와 동일한 뉴클레오타이드 서열 및 non-transcribed strand와 동일한 뉴클레오타이드 서열 중 선택된 하나의 뉴클레오타이드 서열을 제외한 나머지 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.

가이드핵산 결합 서열은 표적 서열의 길이와 동일할 수 있다. 가이 드핵산 비결합 서열은 표적 서열 또는 가이드핵산 결합 서열의 길이와 동일할 수 있다. 가이드핵산 결합 서열은 5 내지 50개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.

일 구체예로서 상기 가이드핵산 결합 서열은 16개의 뉴클레오타이드 서열, 17개의 뉴클레오타이드 서열, 18개의 뉴클레오타이드 서열, 19개의 뉴클레오 타이드 서열, 20개의 뉴클레오타이드 서열, 21개의 뉴클레오타이드 서열, 22개의 뉴클레오타이드 서열, 23개의 뉴클레오타이드 서열, 24개의 뉴클레오타이드 서열 또는 25개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다. 가이드핵산 비결합 서열은 5 내지 50 개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.

일 구체예로서 상기 가이드핵산 비결합 서열은 16개의 뉴클레오타이 드 서열, 17개의 뉴클레오타이드 서열, 18개의 뉴클레오타이드 서열, 19개의 뉴클레오타이드 서열, 20개의 뉴클레오타이드 서열, 21개의 뉴클레오타이드서열, 22개의 뉴클레오타이드 서열, 23개의 뉴클레오타이드 서열, 24개의 뉴클레오타이드 서열 또는 25개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.

가이드핵산 결합 서열은 가이드핵산의 가이드 도메인에 포함된 가이드 서열과 일부 또는 완전한 상보적인 결합을 할 수 있으며, 상기 가이드핵산 결합 서열의 길이는 가이드 서열의 길이와 동일할 수 있다.

상기 가이드핵산 결합 서열은 가이드핵산의 가이드 도메인에 포함된 가이드 서열에 상보적인 뉴클레오타이드 서열일 수 있으며, 예를 들어 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 이상의 상보적이거나 또는 완전하게 상보적인 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.

일 예로, 상기 가이드핵산 결합 서열은 가이드핵산의 가이드 도메인 에 포함된 가이드 서열에 상보적이지 않은 1 내지 8개의 뉴클레오타이드 서열을 가 지거나 또는 포함할 수 있다.

가이드핵산 비결합 서열은 가이드핵산의 가이드 도메인에 포함된 가이드 서열과 일부 또는 완전한 상동성을 가질 수 있으며, 상기 가이드핵산 비결합 서열의 길이는 가이드 서열의 길이와 동일할 수 있다. 일 예로, 상기 가이드 서열은 가이드 핵산 비결합 서열과 상동성을 가지는 서열을 기반으로 설계될 수 있다.

상기 가이드핵산 비결합 서열은 가이드핵산의 가이드 도메인에 포함된 가이드 서열에 상동성을 가진 뉴클레오타이드 서열일 수 있으며, 예를 들어 최 소한 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 이상의 상동성을 가지거나 또는 완전하게 상동성을 가지는 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.

일 예로, 상기 가이드핵산 비결합 서열은 가이드핵산의 가이드 도메인에 포함된 가이드 서열에 상동적이지 않은 1 내지 8개의 뉴클레오타이드 서열을 가 지거나 포함할 수 있다. 가이드핵산 비결합 서열은 가이드핵산 결합 서열과 상보적 결합을 할 수 있으며, 상기 가이드핵산 비결합 서열은 가이드핵산 결합 서열의 길이와 동일할 수 있다.

상기 가이드핵산 비결합 서열은 가이드핵산 결합서열에 상보적인 뉴 클레오타이드 서열일 수 있으며, 예를 들어 최소한 90% 또는 95% 이상의 상보적이거나 또는 완전하게 상보적인 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.

일 예로, 상기 가이드핵산 비결합 서열은 가이드핵산 결합 서열에 상보적이지 않은 1 내지 2개의 뉴클레오타이드 서열을 가지거나 포함할 수 있다. 또한, 상기 가이드핵산 결합 서열은 에디터 단백질이 인식할 수 있는 뉴클레오타이드 서열(PAM 서열)과 상보적인 서열에 근접한 위치의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.

일 예로, 상기 가이드핵산 결합 서열은 에디터단백질이 인식할 수 있는 뉴클레오타이드 서열(PAM 서열)과 상보적인 서열의 5' 말단 또는/및 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 5 내지 50개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.

또한, 상기 가이드핵산 비결합 서열은 에디터단백질이 인식할 수 있는 뉴클레오타이드 서열(PAM 서열)에 근접한 위치의 뉴클레오타이드 서열일 수 있 다.

일 예로, 상기 가이드핵산 비결합 서열은 에디터단백질이 인식할 수 있는 뉴클레오타이드 서열(PAM 서열)의 5' 말단 또는/및 3' 말단에 인접하여 위치 하는 연속하는 5 내지 50개의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.

"에디터 단백질"은 핵산과 직접적으로 결합하거나, 또는 직접 결합 하지는 않지만 상호작용할 수 있는 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질을 의미한다. 상기 에디터 단백질에 대해서 개념적으로 "인위적으로 조작된 뉴클레아제" 또는 RGEN(RNA-Guided Endonuclease)으로 칭하기도 한다.

일 구체예에서, 상기 에디터 단백질은 CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) 효소일 수 있다. "CRISPR 효소"는 CRISPR-enzyme 시스템의 주요 단백질 구성 요소로, "Cas 단백질"이라 칭하기도 하며, 가이드RNA와 혼합 또는 복합체를 형성하여 표적서열을 인지하고 DNA를 절단할 수 있는 뉴클레아제를 말한다.

CRISPR 효소는 당업자에 공지되어 있으며, 한국등록특허 10- 1656236, 10-1656237, 10-1706085, 10-2052286, 10-2182847을 참고한다. 상기 CRISPR 효소는 천연형 단백질 외에도 가이드 RNA와 협동하여 활성화된 엔도뉴클레아제(endonuclease) 또는 니카아제(nickase)로 작용할 수 있는 변이체를 모두 포함하는 개념으로 본 명세서에서 사용된다. 활성화된 엔도뉴클레아제 또는 니카아제인 경우, 표적 DNA절단을 가져올 수 있고, 이를 이용하여 유전체 교정을 가지고 올 수 있다. 또한, 불활성화된 변이체인 경우, 이를 이용하여 전사 조절 혹은 목적하는 DNA의 분리를 가져올 수 있다.

상기 CRISPR 효소는 CRISPR 효소를 암호화하는 서열을 가지는 핵산 또는 폴리펩타이드(또는 단백질)로, 대표적으로 Type II CRISPR 효소 또는 Type V CRISPR 효소가 많이 사용되며, 상기 Type II CRISPR 효소로는 Cas9(CRISPRassociated protein 9) 단백질이 있다.

상기 Cas9 단백질은 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes), 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus), 스트렙토코커스 속(Streptococcus sp.), 스트렙토마이세스 프리스티네스피랄리스(Streptomyces pristinaespiralis), 스트렙토마이세스 비리도크로모게네스(Streptomyces viridochromogenes), 스트렙토스포랑기움 로세움(Streptosporangium roseum), 스트렙토스포랑기움 로세움(Streptosporangium roseum), 캄필로박터 제주 니(Campylobacter jejuni), 스타필로코커스 아우리쿨라리스(Staphylococcus Auricularis) 등 다양한 미생물 유래일 수 있다.

Cas9 단백질이 이중 가닥 DNA 절단(double stranded DNA break)을 유도하기 위해서는 Cas9 단백질이 일정 길이의 뉴클레오타이드 서열인 프로토스페이서 인접 모티프(Protospacer Adjacent Motif, PAM) 서열을 인식하고, 가이드 RNA의 일부(상기 가이드 서열 부분)가 표적 서열이 위치하는 DNA 단일 가닥의 상보적인 가닥과 상보적으로 결합해야 한다.

이 PAM 서열은 Cas9 단백질의 종류나 기원에 따라 결정되는 서열로, 예를 들어 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes) 유래 Cas9 단백질은 표적 핵산 내 5'-NGG-3' 서열을 인식할 수 있다. 이때, 상기 N은 아데 노신(A), 티미딘(T), 사이티딘(C), 구아노신(G)중 하나이다.

또한, 상기 Type V CRISPR 효소로는 Cpf1이 있으며, 상기 Cpf1은 Streptococcus, Campylobacter, Nitratifractor, Staphylococcus, Parvibaculum, Roseburia, Neisseria, Gluconacetobacter, Azospirillum, Sphaerochaeta, Lactobacillus, Eubacterium, Corynebacter, Carnobacterium, Rhodobacter, Listeria, Paludibacter, Clostridium, Lachnospiraceae, Clostridiaridium, Leptotrichia, Francisella, Legionella, Alicyclobacillus, Methanomethyophilus, Porphyromonas, Prevotella, Bacteroidetes, Helcococcus, Letospira, Desulfovibrio, Desulfonatronum, Opitutaceae, uberibacillus, Bacillus, Brevibacilus, Methylobacterium 또는 Acidaminococcus 유래의 Cpf1일 수 있다.

상기 Cas9 또는 Cpf1 단백질 등의 CRISPR 효소는 자연상태에서 존재 하는 미생물에서 분리된 것 또는 재조합적 방법 또는 합성적 방법으로 비자연적으로 생산된 것일 수 있다. 상기 Cas 단백질은 또한 세포 내로 도입되기에 용이한 형태일 수 있다. 그 예로 Cas 단백질은 세포 침투 펩타이드 또는 단백질 전달 도메인 (protein transduction domain)과 연결될 수 있다. 상기 단백질 전달 도메인은 폴리-아르기닌 또는 HIV 유래의 TAT 단백질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 세포 침투 펩타이드 또는 단백질 전달 도메인은 상기 기술된 예외에도 다양한 종류가 당업계에 공지되어 있으므로, 당업자는 상기 예에 제한되지 않고 다양한 예를 본 명세서에 적용할 수 있다. 또한 상기 Cas 단백질은 NLS(nuclear localization sequence or signal)과 같은 기능적 도메인과 융합될 수 있다.

본 발명은 줄기세포 또는 줄기세포로부터 분화하거나 유래된 세포의 유전체(genome) 내에 위치한 표적 서열을 표적화할 수 있는 가이드 핵산 또는 이를 암호화하는 핵산; LGALS9(Gal-9), CLEC4G(LSECtin), PD-L1 및 HHLA2로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 면역활성 억제 인자를 코딩하는 유전자 도너 또는 이를 암호화하는 핵산 및 에디터단백질 또는 이를 암호화하는 핵산을 포함하는 저면역원성 줄기세포 또는 줄기세포로부터 분화하거나 유래된 저면역원성 세포 제조를 위한 유전자 조작용 조성물을 제공한다.

또한, 상기 유전자 조작용 조성물은 삽입을 원하는 특정 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 도너 또는 이를 암호화하는 핵산을 선택적으로 더 포함 할 수 있다.

상기 도너(donor)는 특정 펩타이드 또는 단백질을 발현시킬 수 있는, 외인성 뉴클레오타이드 서열(exogenous nucleotide sequences)를 의미하며, 상동 재조합 수리(homology directed repair, HDR)을 통해 게놈 DNA로 삽입될 수 있다. 이때, 상기 삽입을 원하는 핵산서열은 LGALS9(Gal-9), CLEC4G(LSECtin), PD-L1 및 HHLA2로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 면역활성 억제 인자를 코딩하는 유전자의 일부 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.

상기 도너는 이중가닥 핵산 또는 단일가닥 핵산일 수 있다. 상기 도너는 선형 또는 원형일 수 있다.

상기 도너는 바이러스 또는 비바이러스 벡터(예를 들어, 플라스미드)일 수 있다. 상기 바이러스는 DNA 바이러스 또는 RNA 바이러스일 수 있다. 이때, 상기 DNA 바이러스는 이중가닥 DNA(dsDNA) 바이러스 또는 단일가닥 DNA(ssDNA) 바이러스 일 수 있다. 이때, 상기 RNA 바이러스는 단일가닥 RNA(ssRNA) 바이러스일 수 있다. 상기 바이러스 벡터는 레트로바이러스(Retrovirus), 렌티바이러스 (Lentivirus), 아데노바이러스(Adenovirus), 아데노-연관 바이러스(Adenoassociated virus, AAV), 백시니아바이러스(Vaccinia virus), 폭스바이러스 (Poxvirus) 및 단순포진 바이러스(Herpes simplex virus, HSV)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 바이러스 벡터일 수 있다.

상기 표적 서열은 가이드핵산-에디터단백질 복합체의 타겟이 될 수 있고, 상기 표적 서열은 에디터단백질이 인식하는 PAM(protospacer-adjacent motif) 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 명세서에서, 가이드 핵산, 에디터단백질 또는 가이드핵산-에디터 단백질 복합체 및/또는 도너는 다양한 형태로 대상 내로 전달 또는 도입될 수 있다.

이때 "대상"은 가이드핵산, 에디터단백질 또는 가이드핵산-에디터단백질 복합체가 도입되는 유기체; 가이드핵산, 에디터단백질 또는 가이드핵산-에디터단백질 복합체가 작동하는 유기체; 또는 유기체로부터 획득한 검체 또는 시료를 의미한다.

상기 대상은 가이드핵산-에디터단백질 복합체의 표적 유전자, 표적 핵산 또는 표적 염색체를 포함하는 유기체일 수 있다.

상기 유기체는 동물, 동물의 조직 또는 동물 세포일 수 있다. 이때 상기 조직은 안구, 피부, 간, 신장, 심장, 폐, 뇌, 근육 또는 혈액일 수 있다.

상기 세포는 줄기세포, 간세포, 심근세포, 내피세포 또는 췌장세포 일 수 있다. 상기 검체 또는 시료는 침, 혈액, 간조직, 뇌조직, 간세포, 신경세포, 식세포, 대식세포, T 세포, B 세포, 성상 교세포, 암세포 또는 줄기세포 등 표적 유전자, 표적 핵산 또는 표적 염색체를 포함하는 유기체에서 획득한 것 일 수 있다. 상기 가이드핵산, 에디터단백질 또는 가이드핵산-에디터단백질 복합체는 DNA, RNA 또는 이의 혼합의 형태로 대상 내로 전달 또는 도입될 수 있다.

이때, 가이드핵산 및/또는 에디터단백질을 암호화하는 DNA, RNA 또는 이의 혼합의 형태는 당업계에 공지된 방법에 의해 대상 내로 전달 또는 도입될 수 있다. 또는, 가이드핵산 및/또는 에디터단백질을 암호화하는 DNA, RNA 또는 이의 혼합의 형태는 벡터, 비벡터 또는 이들의 조합에 의해 대상 내로 전달 또 는 도입될 수 있다.

상기 벡터는 바이러스 또는 비바이러스 벡터(예를 들어, 플라스미드)일 수 있다. 상기 바이러스는 DNA 바이러스 또는 RNA 바이러스일 수 있다. 이때, 상기 DNA 바이러스는 이중가닥 DNA(dsDNA) 바이러스 또는 단일가닥 DNA(ssDNA) 바이러스일 수 있다. 이때, 상기 RNA 바이러스는 단일가닥 RNA(ssRNA) 바이러스일 수 있다. 상기 바이러스 벡터는 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스(AAV), 백시니아바이러스, 폭스바이러스 및 단순포진 바이러스로 구성된 군에서 선택되는 1이상일 수 있다.

상기 비벡터는 네이키드 DNA, DNA 복합체 또는 mRNA일 수 있다.

본 발명의 일 구현예로, 상기 가이드핵산 및/또는 에디터단백질을 암호화하는 핵산은 벡터에 의해 대상 내로 전달 또는 도입될 수 있다.

상기 벡터는 가이드핵산 및/또는 에디터단백질을 암호화하는 핵산서열을 포함할 수 있다. 일 예로, 상기 벡터는 가이드핵산과 에디터단백질을 암호화 하는 핵산서열을 동시에 포함할 수 있다. 다른 일 예로, 상기 벡터는 가이드 핵산을 암호화하는 핵산서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 가이드 핵산을 암호화하는 핵산서열은 하나의 벡터에 모두 포함되거나 또는 가이드 핵산을 암호화하는 핵산서열이 분할되어 여러 개의 벡터에 포함시킬 수 있다. 다른 일 예로, 상기 벡터는 에디터단백질을 암호화하는 핵산서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 에디터 단백질의 경우, 에디터단백질을 암호화하는 핵산서열은 하나의 벡터에 포함되거나 또는 에디터단백질을 암호화하는 핵산서열이 분할되어 여러 개의 벡터에 포함될 수 있다.

상기 에디터 단백질은 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질의 형태로 대상 내로 전달 또는 도입될 수 있다.

상기 에디터 단백질은 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질의 형태로 당업계에 공지된 방법에 의해 대상 내로 전달 또는 도입될 수 있다.

상기 가이드핵산 및 에디터단백질은 핵산-단백질 혼합의 형태로 대상 내로 전달 또는 도입될 수 있다.

상기 가이드핵산 및 에디터단백질은 가이드핵산-에디터단백질 복합 체의 형태로 대상 내로 전달 또는 도입될 수 있다. 예를 들어, 상기 가이드핵산은 DNA, RNA 또는 이의 혼합 형태일 수 있다. 상기 에디터단백질은 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질의 형태일 수 있다. 일 예로, 가이드핵산 및 에디터단백질은 RNA 형태의 가이드핵산과 단백질 형태의 에디터단백질이 가이드핵산-에디터단백질 복합체, 즉 ribonucleoprotein(RNP)의 형태로 대상 내로 전달 또는 도입될 수 있다. 또한 본 발명은 줄기세포와 상기 저면역원성 줄기세포 제조용 조성물을 접촉시켜 줄기세포의 LGALS9(Gal-9), CLEC4G(LSECtin), PD-L1 및 HHLA2로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 면역활성 억제 인자의 발현 또는 활성을 증가시키도록 LGALS9(Gal-9), CLEC4G(LSECtin), PD-L1 및 HHLA2로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 면역활성 억제 인자를 코딩하는 유전자를 편집하는 단계를 포함하는 저면역원성 줄기세포의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 저면역원성 줄기세포 또는 줄기세포로부터 분화하거나 유래된 저면역원성 세포의 제조방법은 분리된 줄기세포 또는 분리된 줄기세포로부터 분화하거나 유래된 세포에 상기한 저면역원성 줄기세포 또는 줄기세포로부터 분화하거나 유래된 저면역원성 세포 제조용 조성물을 도입하는 단계; 및

상기 줄기세포 또는 줄기세포로부터 분화하거나 유래된 세포의 LGALS9(Gal-9), CLEC4G(LSECtin), PD-L1 및 HHLA2로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 면역활성 억제 인자의 발현 또는 활성을 증가시키도록 LGALS9(Gal-9), CLEC4G(LSECtin), PD-L1 및 HHLA2로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 면역활성 억제 인자를 코딩하는 유전자를 상기 줄기세포 또는 줄기세포로부터 분화하거나 유래된 세포의 유전체(genome)에 넉-인(knock-in)하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명의 인위적으로 조작된 줄기세포, 이로부터 분화되거나 유래한 세포, 또는 줄기세포로부터 분화하거나 유래된 인위적으로 조작된 세포는 LGALS9(Gal-9), CLEC4G(LSECtin), PD-L1 및 HHLA2로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 면역활성 억제 인자의 발현 또는 활성이 증가하여 질병 또는 병태를 갖는 포유동물에게 이식 시 면역 거부 반응이 억제되어, 세포 이식 또는 생체 조직 재생용 조성물로 이용되어 여러 가지 질환의 치료로 이용될 수 있다.

본 발명의 일 구현에에 있어서, 본 발명의 인위적으로 조작된 줄기세포는, 인간혈관내피세포, 췌장세포, 골세포, 연골세포, 심근세포, 근육세포, 표피세포, 섬유아세포, 신경세포, 간세포, 장세포, 위세포, 피부세포, 지방세포, 혈액세포, 면역세포,　세포　스페로이드 및 오가노이드 등으로 분화되거나 배양되어 손상된 세포나 조직을 복원하기 위한 세포 이식 또는 생체 조직 재생용 조성물로 이용될 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 생체 조직은 궤양 또는 욕창이 형성된 조직, 세포의 변성에 의해 손상된 뇌 조직, 수술 조작에 의해 결손된 뇌 조직, 외상성 뇌 질환에 의해 손상된 뇌 조직, 염증성 뇌 질환에 의해 손상된 뇌 조직, 손상된 뼈 조직, 손상된 치주 조직, 중추 신경계 질환에 의해 손상된 조직 및 난치성 피부염에 의해 손상된 조직에서 선택되는 손상 조직일 수 있고, 생체 조직 재생은 상기 손상 조직의 복원, 표피 재생, 분비선 또는 모낭의 재현, 진피 조직의 미세혈관 형성, 상처 치유, 연부 조직의 결함 보정, 골 치유 또는 골 재생, 연골 재생 등일 수 있으나, 이로 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 세포 이식 또는 생체 조직 재생용 조성물은 세포치료제 조성물, 유전자치료제 조성물, 조직공학치료제 조성물, 면역 치료제 조성물 또는 암의 예방 또는 치료제 조성물일 수 있다.

본 명세서에 있어서, "세포 치료제"는 개체로부터 분리, 배양 및 특수한 조작을 통해 제조된 세포 및 조직으로 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품(미국 FDA 규정)으로서, 세포 혹은 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가, 동종, 또는 이종 세포를 체외에서 증식 선별하거나 다른 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품을 의미한다.

본 명세서에 있어서, "유전자 치료제"는 유전물질의 발현에 영향을 주기 위하여 투여하는 것으로서 유전물질이 변형ㆍ도입된 세포를 함유한 의약품을 의미한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 질병 또는 병태는 포유동물에서 심근경색, 심부전, 허혈성 심근병증, 심근염, 허혈성 장염, 염증성 장질환, 궤양성 대장염, 크론병, 급성 담낭염, 급성 담관염, 만성 담낭염, 급성 췌장염, 만성 췌장염, 급성 신장염, 만성 신장염, 급성 신부전, 만성 신부전, 폐렴, 간질성 폐렴, 특발성 간질성 폐렴, 박리성 간질성 폐렴, 급성 간질성 폐렴, 비특이적 간질성 폐렴, 약물 유발성 폐질환, 급성 호흡 곤란 증후군, 만성 폐색성 폐질환, 소아 뇌성 마비를 포함한 뇌성 마비 증후군, 근위축성 측삭 경화증(amyotrophic lateral sclerosis(ALS)), 다발성 신경병증, 척수성 근위축증, 급성 횡단 척수염, 뇌졸중, 다발성 경화증, 말초동맥질환(peripheral artery disease(PAD)), 폐색성 혈전 혈관염(버거병), 가와사키병(Kawasaki disease(KD)), 이식편대 숙주질환(Graft versus Host Disease(GVHD)), 파킨슨병, 치매, 알츠하이머 질환, 헌팅턴 질환, 근위축성 측색 경화증, 기억력 저하, 중증근무력증, 진행성 핵상마비, 다계통 위축증, 본태성 진전증, 피질-기저핵 퇴행증, 미만성 루이소체 질환 및 픽병으로 이루어진 군에서 선택된 1종의 질환일 수 있고, 본 발명은 이들 질환을 치료하고 예방하는데 사용될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 세포 이식 또는 생체 조직 재생용 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 비경구 투여, 예를 들어, 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피내 투여될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

상기 세포 이식 또는 생체 조직 재생용 조성물은 세포 치료에 일반적으로 사용되는 약제학적 담체와 함께 적합한 형태로 제형화될 수 있다. "약학적으로 허용되는"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 약학적으로 허용되는 담체로는 예를 들면, 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등과 같은 비경구 투여용 담체 등이 있으며 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸-파라벤 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음 의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995). 또한, 상기 조성물은 세포 치료제가 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수도 있다.

본 발명의 세포 이식 또는 생체 조직 재생용 조성물은 질환의 치료를 위하여 치료학적으로 유효한 양의 세포를 포함할 수 있다. "치료학적으로 유효한 양 (therapeutically effective amount)"은 연구자, 수의사, 의사 또는 기타 임상에 의해 생각되는 조직계, 동물 또는 인간에서 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 유효 성분 또는 약학적 조성물의 양을 의미하는 것으로, 이는 치료되는 질환 또는 장애의 증상의 완화를 유도하는 양을 포함한다.

본 발명의 조성물에 포함되는 세포는 원하는 효과에 따라 변화될 것임은 당업자에게 자명하다. 그러므로 최적의 세포 함량은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있으며, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 다른 성분의 함량, 제형의 종류, 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 포함하는 것이 중요하다. 예컨대, 본 발명의 줄기세포의 1일 투여량은 1.0Х10⁵ 내지 1.0Х10³⁰ 세포/kg 체중, 바람직 하게는 1.0Х10¹⁰ 내지 1.0Х10²⁰ 세포/kg 체중을 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 유효성분의 실제 투여량은 치료하고자 하는 질환, 질환의 중증도, 투여경로, 환자의 체중, 연령 및 성별 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되어야 하는 것으로 이해되어야 하며, 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 치료 방법에서 본 발명의 세포를 유효성분으로 포함하는 조성물은 직장, 정맥내 (intravenous therapy, i.v), 동맥내, 복강 내, 근육내, 흉골내, 경피, 국소, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다. 본 발명은 질병 또는 병태를 갖는 포유동물에게 치료학적으로 유효한 양의 상기 인위적으로 조작된 줄기세포 또는 이로부터 분화되거나 유래한 세포를 투여하는 것을 포함하는 치료방법을 제공한다. 여기에서 사용된 용어 포유동물은 치료, 관찰 또는 실험의 대상인 포유동물을 말하며, 바람직하게는 인간을 말한다.

또한 본 발명은 질병 또는 병태를 갖는 포유동물에게 치료학적으로 유효한 양의 상기한 인위적으로 조작된 줄기세포, 이로부터 분화되거나 유래한 세포 또는 줄기세포로부터 분화되거나 유래한 인위적으로 조작된 세포를 투여하는 단계를 포함하는, 줄기 세포를 사용하는 세포 요법 방법(Cell therapy method)를 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 방법은 LGALS9(Gal-9), CLEC4G(LSECtin), PD-L1 및 HHLA2로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 면역활성 억제 인자의 발현 또는 활성 수준이 증가된 인위적으로 조작된 줄기세포, 인위적으로 조작된 줄기세포로부터 분화되거나 유래한 세포, 또는 줄기세포로부터 분화되거나 유래한 인위적으로 조작된 세포가 투여됨으로써, 자가 또는 동종유래 환경에서 세포 치료제로 사용시 면역 거부반응이 억제되어 면역관용 상태가 될 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다.

이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 있어 자명할 것이다.

실시예 1: AAVS1 사이트에 유전자가 삽입(넉-인, Knock-In)된 iPSC (induced pluripotent stem cell) 세포의 제조

Cell culture(세포배양)

iPSC는 제조사의 매뉴얼에 따라 배양하였다. Vitronectin XF^TM(STEMCELL Technologies)을 이용하여 RT(room temperature)에서 1시간 코팅한 배양접시에서 TeSR^TM-E8^TM(STEMCELL Technologies) 배지를 사용하여 배양하였다.

유전자를 삽입(Knock-In, KI)

유전자를 삽입(Knock-In, KI) 하기 위하여 특정 AAVS1 site를 타겟으로 하는 가이드 RNA(sgRNA, 서열번호 1:gtcaccaatcctgtccctag)와 Cas9 단백질, 그리고 LGALS9(Gal-9), CLEC4G(LSECtin) 및 HHLA2 유전자 도너(donor)의 복합체(complex)를 전기천공법(Electroporation, Amaxa 4D nucleofector)으로 iPSC에 도입하였다.

위 sgRNA, Cas9 단백질, 유전자 도너(donor) 복합체는 20ul primary P3 buffer 처리된 4x10⁵ iPSC와 함께 nucleofector program (CA-137)을 이용하여 제조사(Lonza, 4D nucleofector) 프로토콜에 따라 전기천공을 수행하였다.

실험예 1: iPSC (induced pluripotent stem cell) 세포의 유전자 넉-인(knock-in) 확인

상기 실시예 1에서 제조한 AAVS1 사이트에 유전자가 삽입(넉-인, Knock-In)된 iPSC(induced pluripotent stem cell) 세포에 유전자가 삽입되었는지 PCR을 통해 확인하였다.

PCR(Polymerase chain reaction)

유전자 프라이머는 염기서열을 확인한 후 아래 표 1의 프라이머를 이용하였으며, PCR 반응은 98℃에서 1분간 1차 변성 후, 98℃에서 20초간 변성(denaturation), 62℃에서 30초간 어닐링(annealing), 72℃에서 3분간 연장(extension)의 과정을 총 40회 반복하여 수행 후 최종적으로 PCR 산물의 안정화를 위하여 72℃에서 5분간 연장하였다.

도 2는 실시예 1에서 제조한 유전자 3개가 넉-인(KI)된 iPSC로부터 다단일 클론(single Clone)들을 선별하기 위해, 세포의 DNA로부터 PCR반응을 수행한 결과 및 상기에서 얻은 PCR 산물을 사용하여 생어 서열분석 (Sanger sequencing)을 수행한 결과를 나타낸 것이다. 서열번호 10 내지 13은 PCR 반응으로부터 확인한 서열정보이고, 도 2에 나타낸 바와 같이 유전자를 넉-인(KI)하지 않은 WT-iPSC와 비교하여 KI-iPSC(AAVS1-ALC3#11) 단일 클론에서 삽입된 유전자의 특정 사이즈 밴드를 확인할 수 있었다.

실험예 2: 유전자 삽입( KI ) 세포의 mRNA 발현 확인

상기 실시예 1에서 넉-인(knock-in)한 3가지 유전자들의 mRNA 레벨 변화를 아래와 같이 확인하였다.

Real time PCR(qRT-PCR)

RNeasy mini kit(Qiagen)을 이용해 제조사의 프로토콜에 따라 iPSC에서 mRNA를 추출하였다. 그 후, 100ng mRNA는 cDNA reverse transcription kit(Thermo Fisher Scientific)를 이용하여 역전사시켰다. qRT-PCR은 QuantStudio 3(Thermo Fisher Scientific)를 이용해 제조사의 프로토콜에 따라 PowerUp^TM SYBR^TM Green Master Mix 100ng으로 수행하였다. 유전자 발현 수준은 CT 값을 이용해 계산하였고, GAPDH로 내인성 대조군(endogenous control)으로 사용하였다.

도 3은 실시예 1에서 넉-인(knock-in)한 3가지 유전자에 대한 mRNA 레벨(level) 변화를 Real time PCR 방법으로 확인한 결과를 나타낸 것이다. 도 3에 나타낸 바와 같이, Galectin-9, CLEC4G 및 HHLA2 모두 Mock(WT)와 비교하여 mRNA 레벨이 높은 것을 확인할 수 있었다.

실험예 3 : 넉- 인(knock-in)된 유전자 카피 수 확인

ddPCR을 아래와 같이 수행하여 상기 실시예 1에서 넉-인(knock-in)된 유전자의 카피 수를 확인하였다.

ddPCR

배양된 세포를 phosphate buffer saline (PBS)로 2회 세척 후 0.05% trypsin-EDTA 를 사용해 세포를 떼어내고 1,000 rpm에서 5분간 원심분리하였다. 세포에서 gDNA를 추출한 뒤 제한효소 처리를 수행하였다. 아래 표 2 및 표 3의 QX200 ddPCR Supermix for probes(Biorad), forward primer(100pmole/ul), reverse primer(100pmole/ul), taqman probe(10pmole/ul)를 상온에 꺼내어 준비하였다. Biorad 매뉴얼에 따라 ddPCR marster mix를 제작하였다. 제작된 master mix와 제한효소 처리한 template gDNA를 ddPCR 96 웰 플레이트에 분주하였다. PX1 PCR plate sealer(Biorad)에 plate를 sealing 한 후 QX200 Auto DG droplet digital PCR system에 장착하여 droplet을 generation 하였다. Droplet generation 완료 후 매뉴얼 프로토콜에 따라 PCR 증폭을 수행하였다. PCR 증폭완료 후 QX200 Droplet reader에서 형광값을 읽고 분석하였다.

Probe name	sequence
SV40-HA-R_probe_3	5’-CAGCTTTCTTGTACAAAGTGGGGACAGG-3’ (서열번호 20)
HHLA2_SV40_probe	5’-tcccagtgcacccgataatggc-3’ (서열번호 21)
AAVS1_HA-L_Probe2	5’-tgtcccctccaccccacagtg-3’ (서열번호 22)

도 4는 ddPCR 방법을 이용하여 넉-인(KI)진 유전자들의 카피 수(Copy Number)를 확인한 결과를 나타낸 그래프이다. KI-iPSC clone에서 유전자 2 카피(copy)가 넉-인(KI)된 것을 확인할 수 있었다.

실험예 4: 유세포 분석을 통한 넉-인( KI )한 유전자의 발현량 측정

넉-인(KI)한 유전자들의 이식 유전자 발현(Transgene expression)을 확인하기 위해 유세포 분석 방법을 이용하여 상기 실시예 1에서 제조한 AAVS1-ALC3#11 clone을 분석하였다.

Flow cytometry analysis (유세포 분석법)

배양된 세포를 phosphate buffer saline (PBS)로 2회 세척 후 0.05% trypsin-EDTA 를 사용해 세포를 떼어내고 1,000 rpm에서 5분간 원심분리하였다. 100ul의 FACS staining buffer로 cell을 suspension 시키고 antibody 를 혼합하여 1시간동안 4도에서 반응 후 PBS로 2회 washing 하고, 500ul의 PBS로 부유시켜 FACS analysis 하였다.

도 5는 실험예 4에서 유세포 분석을 통해 실시예 1에서 제조한 AAVS1-ALC3#11 clone의 HHLA 발현량을 측정한 결과를 나타낸 것으로, Isotype과 비교하여 AAVS1-ALC3#11 Clone에서 98%의 HHLA2+ 을 확인할 수 있었다.

실험예 5: 면역원성 확인

상기 실시예 1에서 제조된 유전자가 삽입(넉-인, Knock-In)된 iPSC(induced pluripotent stem cell) 세포(KI-iPSC), iPSC로 분화된 내피세포(EC, Endothelial Cell)에 도 8에 개시된 렌티바이러스를 이용하여 각각의 유전자가 삽입(넉-인, Knock-In)된 내피세포의 면역원성을 평가하기 위해서 WT 및 KI-iPSC을 아래와 같이 내피세포(EC, Endothelial Cell)로 분화하였다. 분화된 내피세포는 면역세포와 공배양하여 면역원성을 확인하였다.

Endothelial Cell Differentiation(내피세포 분화)

인간 ESC를 6-웰 플레이트(Thermo Fisher Scientific)에 시딩하고 10mM ROCK 억제제, Y-27632(Tocris)를 함유하는 TeSR™-E8™ 배지(STEMCELL Technologies)에서 1일 동안 배양하였다. 다음날 배지를 46.9%(v/v) DMEM/F12(Gibco), 50%(v/v) Neurobasal medium(Gibco), 0.97% N2(Gibco), 1.94% B27(Gibco), 0.97% β-메르캅토에탄올(Gibco), 8μM CHIR99021(Cayman Chemical) 및 25ng/ml BMP-4(Peprotech)를 함유하는 N2B27 배지로 교체한 후 세포를 3일 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음 배지를 100 ng/ml 혈관 내피 성장 인자(Peprotech), 50 ng/ml 염기성 섬유아세포 성장 인자(Peprotech), 및 2 μM forskolin(Abcam)이 보충된 StemPro-34 SFM(Thermo Fisher Scientific)으로 교체하고 세포를 2일 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음 MACS 세포 분리(Miltenyi Biotec)를 사용하여 세포 집단을 CD144+ 세포로 강화했다. CD144+ 세포는 플레이팅되어 추가 분화를 위해 적어도 7일 동안 내피 세포 성장 배지(EGM™-2blletKit™)(Lonza)를 포함하는 매트리겔 코팅된 플레이트에서 유지시켰다. 내피 세포는 항-CD31 항체(1:25, Clone WM-59, eBioscience)를 사용하여 유세포 분석법으로 분석되었다.

도 6(a)는 야생형(WT) iPSC 및 실시예 1에서 제조한 유전자 3개가 넉-인(KI)된 iPSC를 내피세포(EC)로 분화시킨 후 항-CD31 항체를 이용하여 유세포 분석한 결과를 나타낸 것으로, 약 98%이상의 세포가 EC마커인 CD31+을 발현하는 것을 관찰할 수 있었다.

도 6(b)는 야생형(WT) iPSC 및 실시예 1에서 제조한 유전자 3개가 넉-인(KI)된 iPSC를 내피세포(EC)로 분화시킨 유세포 분석한 결과를 나타낸 것으로, iPSC에서 분화된 EC 세포의 표면에(surface)에서 HLA-ABC항원이 나타나는 것을 확인하였으며, 그 level은 interferon gamma를 100ng/ml 농도로 48hr 처리한후 더 높게 증가한 것을 관찰하였다.

Cytotoxicity Assays(NK 세포 효과를 측정하기 위한 체외 형광 측정 세포독성 분석)

KI 클론(표적 세포) 및 K562 세포(ATCC)에 대한 NK 세포의 영향을 유동 세포측정법으로 평가하였다. 표적 세포를 실온에서 15분 동안 CellTraceViolet(Thermo Fisher Scientific)으로 표지한 후 37 ℃ 5% CO₂인큐베이터에서 NK 세포와 다양한 비율로 배양하였다.

세포 사멸 표적 세포의 수를 측정하기 위해 세척된 세포를 제조업체의 지침에 따라 7-Amino-Actinomycin(7-AAD, BD Bioscience)으로 염색하고 Attune Flow Cytometers(Thermo Fisher Scientific)로 분석했다.

도 7(a)는 K562 세포, 야생형(WT) iPSC를 분화시킨 내피세포(WT-iPSC_EC), 실시예 1에서 제조한 유전자 3개가 넉-인(KI)된 iPSC를 분화시킨 내피세포(KI-iPSC EC)를 효과기 세포인 NK 세포와 다양한 비율로 배양하여 세포독성을 확인한 결과를 나타낸 그래프이다. 세포사멸 세포는 7-AAD+ 세포로 검출하였으며, 이때 HLA가 발현하지 않는 K562 종양세포와 야생형(WT) iPSC를 분화시킨 내피세포(WT-iPSC_EC)가 NK 세포 세포독성에 상당히 취약함을 확인할 수 있었다.

도 7(b)는 HLA-ABC가 98%이상 발현되는 야생형(WT) iPSC를 분화시킨 내피세포(WT-iPSC_EC, 도 6(b))와 실시예 1에서 제조한 유전자 3개가 넉-인(KI)된 iPSC를 분화시킨 내피세포(KI-iPSC EC)에서 NK 세포의 세포독성을 평가한 결과를 나타낸 그래프이다. 도 7(b)를 참고하면, 효과기 세포(effector, NK 세포) : 표적 세포(EC, 내피세포)를 1:1의 비율로 공배양하여 7-AAD+한 세포를 측정한 결과, KI-iPSC_EC가 WT-iPSC_EC와 비교하여 세포 사멸된 세포의 %가 적었고, 효과기 세포(effector, NK 세포) : 표적 세포(EC, 내피세포)의 세포 비율이 커질수록 7-AAD+한 세포의 %가 증가하는 것을 확인할 수 있었다.

lentivirus을 이용한 iPSC로부터 분화된 과발현 EC세포 제조

도 8은 LGALS9(Gal-9)/CLEC4G(LSECtin)/HHLA-2(서열번호 23), LGALS9(Gal-9) (서열번호 24), CLEC4G(LSECtin) (서열번호 25), LGALS9(Gal-9)/CLEC4G(LSECtin) (서열번호 26), LGALS9(Gal-9)/ CLEC4G(LSECtin)/PD-L1(서열번호 27)의 각각의 유전자 삽입을 위한 렌티바이러스의 일 예시를 나타내는 도이다. 이때 상기 유전자는 EC 세포 유전체 상 표적서열에 삽입될 수 있다.

아래 표 4 내지 표 8에 삽입되는 유전자를 나타내었다.

ALC3(서열번호 23)

tgctttctctgacctgcattctctcccctgggcctgtgccgctttctgtctgcagcttgtggcctgggtcacctctacggctggcccagatccttccctgccgcctccttcaggttccgtcttcctccactccctcttccccttgctctctgctgtgttgctgcccaaggatgctctttccggagcacttccttctcggcgctgcaccacgtgatgtcctctgagcggatcctccccgtgtctgggtcctctccgggcatctctcctccctcacccaaccccatgccgtcttcactcgctgggttcccttttccttctccttctggggcctgtgccatctctcgtttcttaggatggccttctccgacggatgtctcccttgcgtcccgcctccccttcttgtaggcctgcatcatcaccgtttttctggacaaccccaaagtaccccgtctccctggctttagccacctctccatcctcttgctttctttgcctggacaccccgttctcctgtggattcgggtcacctctcactcctttcatttgggcagctcccctaccccccttacctctctagtctgtgctagctcttccagccccctgtcatggcatcttccaggggtccgagagctcagctagtcttcttcctccaacccgggcccctatgtccacttcaggacagcatgtttgctgcctccagggatcctgtgtccccgagctgggaccaccttatattcccagggccggttaatgtggctctggttctgggtacttttatctgtcccctccaccccacagtggggccacta(HA-L)

tgtgcgcgaggggagcgcggccgggggcggtgccccgcggtgcggggggggctgcgaggggaacaaaggctgcgtgcggggtgtgtgcgtgggggggtgagcagggggtgtgggcgcgtcggtcgggctgcaaccccccctgcacccccctccccgagttgctgagcacggcccggcttcgggtgcggggctccgtacggggcgtggcgcggggctcgccgtgccgggcggggggtggcggcaggtgggggtgccgggcggggcggggccgcctcgggccggggagggctcgggggaggggcgcggcggcccccggagcgccggcggctgtcgaggcgcggcgagccgcagccattgccttttatggtaatcgtgcgagagggcgcagggacttcctttgtcccaaatctgtgcggagccgaaatctgggaggcgccgccgcaccccctctagcgggcgcggggcgaagcggtgcggcgccggcaggaaggaaatgggcggggagggccttcgtgcgtcgccgcgccgccgtccccttctccctctccagcctcggggctgtccgcggggggacggctgccttcgggggggacggggcagggcggggttcggcttctggcgtgtgaccggcggctctagagcctctgctaaccatgttcatgccttcttctttttcctacagctcctgggcaacgtgctggttattgtgctgtctcatcattttggcaaagaattc(CAG)

atccacacagtgcatgtagaaccgagccaagaaacagcttcccataacaaaggcttatggattttggtgccctctgcgattttggcagcttttctgctgatttggagcgtaaaatgttgcagagcccagctagaagccaggaggagcagacaccctgctgatggagcccaacaagaaagatgttgtgtccctcctggtgagcgctgtcccagtgcacccgataatggcgaagaaaatgtgcctctttcaggaaaagta
(Gal-9/CLEC4G/HHLA2)

tagaacttgtttattgcagcttataatggttacaaataaagcaatagcatcacaaatttcacaaataaagcatttttttcactgcattctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgtatcttagtcgacagtactaagcttacccagctttcttgtacaaagtgg(SV40)

Ggacaggattggtgacagaaaagccccatccttaggcctcctccttcctagtctcctgatattgggtctaacccccacctcctgttaggcagattccttatctggtgacacacccccatttcctggagccatctctctccttgccagaacctctaaggtttgcttacgatggagccagagaggatcctgggagggagagcttggcagggggtgggagggaagggggggatgcgtgacctgcccggttctcagtggccaccctgcgctaccctctcccagaacctgagctgctctgacgcggccgtctggtgcgtttcactgatcctggtgctgcagcttccttacacttcccaagaggagaagcagtttggaaaaacaaaatcagaataagttggtcctgagttctaactttggctcttcacctttctagtccccaatttatattgttcctccgtgcgtcagttttacctgtgagataaggccagtagccagccccgtcctggcagggctgtggtgaggaggggggtgtccgtgtggaaaactccctttgtgagaatggtgcgtcctaggtgttcaccaggtcgtggccgcctctactccctttctctttctccatccttctttccttaaagagtccccagtgctatctgggacatattcctccgcccagagcagggtcccgcttccctaaggccctgctctgggcttctgggtttgagtccttggcaagcccaggagaggcgctcaggcttccctgtcccccttcctcgtccaccatctcatgcccctggctctcctgccccttccctacaggggttcctggctctgctct(HA-R)

Gal9(서열번호 24)

tcaacagactggaagtggggggcgacatccagctgacccatgtgcagaca(Gal-9)

CLEC4G(서열번호 25)

gccaccatggacaccaccaggtacagcaagtggggcggcagctccgaggaggtccccggagggccctggggacgctgggtgcactggagcaggagacccctcttcttggccctggctgtcctggtcaccacagtcctttgggctgtgattctgagtatcctattgtccaaggcctccacggagcgcgcggcgctgcttgacggccacgacctgctgaggacaaacgcctcgaagcagacggcggcgctgggtgccctgaaggaggaggtcggagactgccacagctgctgctcggggacgcaggcgcagctgcagaccacgcgcgcggagcttggggaggcgcaggcgaagctgatggagcaggagagcgccctgcgggaactgcgtgagcgcgtgacccagggcttggctgaagccggcaggggccgtgaggacgtccgcactgagctgttccgggcgctggaggccgtgaggctccagaacaactcctgcgagccgtgccccacgtcgtggctgtccttcgagggctcctgctactttttctctgtgccaaagacgacgtgggcggcggcgcaggatcactgcgcagatgccagcgcgcacctggtgatcgttgggggcctggatgagcagggcttcctcactcggaacacgcgtggccgtggttactggctgggcctgagggctgtgcgccatctgggcaaggttcagggctaccagtgggtggacggagtctctctcagcttcagccactggaaccagggagagcccaatgacgcttgggggcgcgagaactgtgtcatgatgctgcacacggggctgtggaacgacgcaccgtgtgacagcgagaaggacggctggatctgtgagaaaaggcacaactgc(CLEC4G)

ALC2(서열번호 26)

tcaacagactggaagtggggggcgacatccagctgacccatgtgcagacaggaagcggagagggcaggggaagtcttctaacatgcggggacgtggaggaaaatcccggccccatggacaccaccaggtacagcaagtggggcggcagctccgaggaggtccccggagggccctggggacgctgggtgcactggagcaggagacccctcttcttggccctggctgtcctggtcaccacagtcctttgggctgtgattctgagtatcctattgtccaaggcctccacggagcgcgcggcgctgcttgacggccacgacctgctgaggacaaacgcctcgaagcagacggcggcgctgggtgccctgaaggaggaggtcggagactgccacagctgctgctcggggacgcaggcgcagctgcagaccacgcgcgcggagcttggggaggcgcaggcgaagctgatggagcaggagagcgccctgcgggaactgcgtgagcgcgtgacccagggcttggctgaagccggcaggggccgtgaggacgtccgcactgagctgttccgggcgctggaggccgtgaggctccagaacaactcctgcgagccgtgccccacgtcgtggctgtccttcgagggctcctgctactttttctctgtgccaaagacgacgtgggcggcggcgcaggatcactgcgcagatgccagcgcgcacctggtgatcgttgggggcctggatgagcagggcttcctcactcggaacacgcgtggccgtggttactggctgggcctgagggctgtgcgccatctgggcaaggttcagggctaccagtgggtggacggagtctctctcagcttcagccactggaaccagggagagcccaatgacgcttgggggcgcgagaactgtgtcatgatgctgcacacggggctgtggaacgacgcaccgtgtgacagcgagaaggacggctggatctgtgagaaaaggcacaactgc
(Gal-9/CLEC4G)

ALC2+PDL1(서열번호 27)

Gcattctctcccctgggcctgtgccgctttctgtctgcagcttgtggcctgggtcacctctacggctggcccagatccttccctgccgcctccttcaggttccgtcttcctccactccctcttccccttgctctctgctgtgttgctgcccaaggatgctctttccggagcacttccttctcggcgctgcaccacgtgatgtcctctgagcggatcctccccgtgtctgggtcctctccgggcatctctcctccctcacccaaccccatgccgtcttcactcgctgggttcccttttccttctccttctggggcctgtgccatctctcgtttcttaggatggccttctccgacggatgtctcccttgcgtcccgcctccccttcttgtaggcctgcatcatcaccgtttttctggacaaccccaaagtaccccgtctccctggctttagccacctctccatcctcttgctttctttgcctggacaccccgttctcctgtggattcgggtcacctctcactcctttcatttgggcagctcccctaccccccttacctctctagtctgtgctagctcttccagccccctgtcatggcatcttccaggggtccgagagctcagctagtcttcttcctccaacccgggcccctatgtccacttcaggacagcatgtttgctgcctccagggatcctgtgtccccgagctgggaccaccttatattcccagggccggttaatgtggctctggttctgggtacttttatctgtcccctccaccccacagtggggcaagtttgtacaaaaaagcaggct(HA-L)

gggcggtgccccgcggtgcggggggggctgcgaggggaacaaaggctgcgtgcggggtgtgtgcgtgggggggtgagcagggggtgtgggcgcgtcggtcgggctgcaaccccccctgcacccccctccccgagttgctgagcacggcccggcttcgggtgcggggctccgtacggggcgtggcgcggggctcgccgtgccgggcggggggtggcggcaggtgggggtgccgggcggggcggggccgcctcgggccggggagggctcgggggaggggcgcggcggcccccggagcgccggcggctgtcgaggcgcggcgagccgcagccattgccttttatggtaatcgtgcgagagggcgcagggacttcctttgtcccaaatctgtgcggagccgaaatctgggaggcgccgccgcaccccctctagcgggcgcggggcgaagcggtgcggcgccggcaggaaggaaatgggcggggagggccttcgtgcgtcgccgcgccgccgtccccttctccctctccagcctcggggctgtccgcggggggacggctgccttcgggggggacggggcagggcggggttcggcttctggcgtgtgaccggcggctctagagcctctgctaaccatgttcatgccttcttctttttcctacagctcctgggcaacgtgctggttattgtgctgtctcatcattttggcaaagaattcacccagctttcttgtacaaagtgg(CAG)

aaagcaagcaggagatgttgaagaaaaccccgggcctatgaggatatttgctgtctttatattcatgacctactggcatttgctgaacgcatttactgtcacggttcccaaggacctatatgtggtagagtatggtagcaatatgacaattgaatgcaaattcccagtagaaaaacaattagacctggctgcactaattgtctattgggaaatggaggataagaacattattcaatttgtgcatggagaggaagacctgaaggttcagcatagtagctacagacagagggcccggctgttgaaggaccagctctccctgggaaatgctgcacttcagatcacagatgtgaaattgcaggatgcaggggtgtaccgctgcatgatcagctatggtggtgccgactacaagcgaattactgtgaaagtcaatgccccatacaacaaaatcaaccaaagaattttggttgtggatccagtcacctctgaacatgaactgacatgtcaggctgagggctaccccaaggccgaagtcatctggacaagcagtgaccatcaagtcctgagtggtaagaccaccaccaccaattccaagagagaggagaagcttttcaatgtgaccagcacactgagaatcaacacaacaactaatgagattttctactgcacttttaggagattagatcctgaggaaaaccatacagctgaattggtcatcccagaactacctctggcacatcctccaaatgaaaggactcacttggtaattctgggagccatcttattatgccttggtgtagcactgacattcatcttccgtttaagaaaagggagaatgatggatgtgaaaaaatgtggcatccaagatacaaactcaaagaagcaaagtgatacacatttggaggagacgtaa(Gal9/CLEC4G/PDL1)

agggacaggattggtgacagaaaagccccatccttaggcctcctccttcctagtctcctgatattgggtctaacccccacctcctgttaggcagattccttatctggtgacacacccccatttcctggagccatctctctccttgccagaacctctaaggtttgcttacgatggagccagagaggatcctgggagggagagcttggcagggggtgggagggaagggggggatgcgtgacctgcccggttctcagtggccaccctgcgctaccctctcccagaacctgagctgctctgacgcggccgtctggtgcgtttcactgatcctggtgctgcagcttccttacacttcccaagaggagaagcagtttggaaaaacaaaatcagaataagttggtcctgagttctaactttggctcttcacctttctagtccccaatttatattgttcctccgtgcgtcagttttacctgtgagataaggccagtagccagccccgtcctggcagggctgtggtgaggaggggggtgtccgtgtggaaaactccctttgtgagaatggtgcgtcctaggtgttcaccaggtcgtggccgcctctactccctttctctttctccatccttctttccttaaagagtccccagtgctatctgggacatattcctccgcccagagcagggtcccgcttccctaaggccctgctctgggcttctgggtttgagtccttggcaagcccaggagaggcgctcaggcttccctgtcccccttcctcgtccaccatctcatgcccctggctctcctgccccttccctacaggggttcctggctctgctct(HA-R)

유전자를 안정적으로 과발현시키기 위해, WT-iPSC에서 분화된 EC세포에 도 8에 개시된 렌티바이러스를 전달하였다. 렌티바이러스를 전달하기 전날 500,000개의 세포를 배양 접시에 배양하였고, 24시간 후 MOI 100의 렌티바이러스 입자로 세포를 감염시켰다. 감염 후, 새로운 배지로 교체하고 표시된 대로 세포를 37°C에서 48시간동안 유지하였다. 사용된 4가지의 렌티바이러스는 VectorBuilder(Vector Builder Inc, China)에 의해 제작되었다.

도 9(a)는 K562 세포, 야생형(WT) iPSC를 분화시킨 내피세포(WT-iPSC_EC), 서열번호 24의 Gal-9 유전자가 삽입된 iPSC로부터 분화된 내피세포(Gal-9_EC), 서열번호 25의 CLEC4G 유전자가 삽입된 iPSC로부터 분화된 내피세포 (CLEC4G_EC), 서열번호 26의 Gal-9/CLEC4G 유전자가 삽입된 iPSC로부터 분화된 내피세포(Gal-9+CLEC4G_EC), 서열번호 27의 Gal-9/CLEC4G/PD-L1 유전자가 삽입된 iPSC로부터 분화된 내피세포(Gal-9+CLEC4G+ PD-L1_EC)를 효과기 세포인 NK 세포와 다양한 비율로 배양하여 세포독성을 확인한 결과를 나타낸 그래프이고, 도 9(b)는 효과기 세포(effector, NK 세포) : 표적 세포(EC, 내피세포)를 1:1의 비율로 공배양하여 7-AAD+한 세포를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.

도 9에서 보듯이, iPSC로부터 분화된 내피세포에 서열번호 24의 Gal-9 유전자가 삽입된 내피세포(Gal-9_EC), iPSC로부터 분화된 내피세포에 서열번호 25의 CLEC4G 유전자가 삽입된 내피세포(CLEC4G_EC), iPSC로부터 분화된 내피세포에 서열번호 26의 Gal-9/CLEC4G 유전자가 삽입된 내피세포(Gal-9+CLEC4G_EC), iPSC로부터 분화된 내피세포에 서열번호 27의 Gal-9/CLEC4G/PD-L1 유전자가 삽입된 내피세포(Gal-9+CLEC4G+ PD-L1_EC)는 야생형(WT) iPSC를 분화시킨 내피세포(WT-iPSC_EC) 보다 세포 사멸된 세포의 %가 적었으며, 효과기 세포(effector, NK 세포) : 표적 세포(EC, 내피세포)의 세포 비율이 커질수록 7-AAD+한 세포의 %가 증가하는 것을 확인할 수 있었다.

Claims

줄기세포 유전체(genome)에 LGALS9(Gal-9), CLEC4G(LSECtin), PD-L1 및 HHLA2로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 면역활성 억제 인자를 코딩하는 유전자가 삽입된 인위적으로 조작된 유전자를 갖는, 인위적으로 조작된 줄기세포.
제1항에 있어서,
상기 인위적으로 조작된 줄기세포의 유전자의 서열은 야생형 줄기세포의 유전자 서열과 다르고,
상기 인위적을 조작된 줄기세포는 LGALS9(Gal-9), CLEC4G(LSECtin), PD-L1 및 HHLA2로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 면역활성 억제 인자를 코딩하는 유전자 또는 LGALS9(Gal-9), CLEC4G(LSECtin), PD-L1 및 HHLA2로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 면역활성 억제 인자의 발현 또는 활성이 증가하는 것인 인위적으로 조작된 줄기세포.
제1항에 있어서, 상기 인위적으로 조작된 줄기세포 내에서,
상기 인위적으로 조작된 유전자로부터 전사되는 mRNA는, 야생형 줄기세포 내에서 야생형 줄기세포의 유전자로부터 전사되는 mRNA의 발현수준과 비교하여, 그 mRNA 발현수준이 더 높거나, 또는 서열이 상이한 것을 특징으로 하는 인위적으로 조작된 줄기세포.
제1항에 있어서, 상기 줄기세포는 유도만능줄기세포(iPSC), 배아줄기세포, 체세포 핵치환 배아줄기세포(Somatic cell nuclear transfer-PSC) 또는 성체줄기세포인 것인 인위적으로 조작된 줄기세포.
제1항에 있어서, 상기 LGALS9(Gal-9), CLEC4G(LSECtin), PD-L1 및 HHLA2로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 면역활성 억제 인자를 코딩하는 유전자는 상기 줄기세포 유전체(genome)에 넉-인(knock in)된 것 또는 유전체에 삽입된 것인 인위적으로 조작된 줄기세포.
줄기세포로부터 분화하거나 유래된 세포의 유전체(genome)에 LGALS9(Gal-9), CLEC4G(LSECtin), PD-L1 및 HHLA2로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 면역활성 억제 인자를 코딩하는 유전자가 삽입된 인위적으로 조작된 유전자를 갖는, 줄기세포로부터 분화하거나 유래된 인위적으로 조작된 세포.
제6항에 있어서,
상기 줄기세포로부터 분화하거나 유래된 인위적으로 조작된 세포의 유전자의 서열은 야생형 세포의 유전자 서열과 다르고,
상기 줄기세포로부터 분화하거나 유래된 인위적으로 조작된 세포는 LGALS9(Gal-9), CLEC4G(LSECtin), PD-L1 및 HHLA2로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 면역활성 억제 인자를 코딩하는 유전자 또는 LGALS9(Gal-9), CLEC4G(LSECtin), PD-L1 및 HHLA2로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 면역활성 억제 인자의 발현 또는 활성이 증가하는 것인 줄기세포로부터 분화하거나 유래된 인위적으로 조작된 세포.
제6항에 있어서, 상기 줄기세포로부터 분화하거나 유래된 인위적으로 조작된 세포 내에서,
상기 인위적으로 조작된 유전자로부터 전사되는 mRNA는, 야생형 세포 내에서 야생형 세포의 유전자로부터 전사되는 mRNA의 발현수준과 비교하여, 그 mRNA 발현수준이 더 높거나, 또는 서열이 상이한 것을 특징으로 하는 줄기세포로부터 분화하거나 유래된 인위적으로 조작된 세포.
제6항에 있어서, 상기 LGALS9(Gal-9), CLEC4G(LSECtin), PD-L1 및 HHLA2로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 면역활성 억제 인자를 코딩하는 유전자는 상기 줄기세포로부터 분화하거나 유래된 세포 유전체(genome)에 넉-인(knock in)된 것 또는 유전체에 삽입된 것인 줄기세포로부터 분화하거나 유래된 인위적으로 조작된 세포.
제6항에 있어서, 상기 줄기세포로부터 분화하거나 유래된 세포는 인간혈관내피세포, 췌장세포, 골세포, 연골세포, 심근세포, 근육세포, 표피세포, 섬유아세포, 신경세포, 간세포, 장세포, 위세포, 피부세포, 지방세포, 혈액세포, 면역세포,　세포　스페로이드 및 오가노이드로 이루어진 군에서 선택된 1종인 것인 줄기세포로부터 분화하거나 유래된 인위적으로 조작된 세포.
제6항에 있어서, 상기 줄기세포는 유도만능줄기세포(iPSC), 배아줄기세포, 체세포 핵치환 배아줄기세포(Somatic cell nuclear transfer-PSC) 또는 성체줄기세포인 것인 줄기세포로부터 분화하거나 유래된 인위적으로 조작된 세포.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 인위적으로 조작된 줄기세포로부터 분화되거나 유래한, LGALS9(Gal-9), CLEC4G(LSECtin), PD-L1 및 HHLA2로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 면역활성 억제 인자의 발현 또는 활성이 증가한 세포.
제12항에 있어서, 상기 세포는 인간혈관내피세포, 췌장세포, 골세포, 연골세포, 심근세포, 근육세포, 표피세포, 섬유아세포, 신경세포, 간세포, 장세포, 위세포, 피부세포, 지방세포, 혈액세포, 면역세포,　세포　스페로이드 및 오가노이드로 이루어진 군에서 선택된 1종인 것인 세포.
줄기세포 또는 줄기세포로부터 분화하거나 유래된 세포의 유전체(genome) 내에 위치한 표적 서열을 표적화할 수 있는 가이드 핵산 또는 이를 암호화하는 핵산;
LGALS9(Gal-9), CLEC4G(LSECtin), PD-L1 및 HHLA2로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 면역활성 억제 인자를 코딩하는 유전자 도너 또는 이를 암호화하는 핵산 및
에디터단백질 또는 이를 암호화하는 핵산
을 포함하는 저면역원성 줄기세포 또는 줄기세포로부터 분화하거나 유래된 저면역원성 세포 제조용 조성물.
제14항에 있어서, 상기 조성물은
상기 에디터 단백질 및 상기 가이드 핵산을 리보뉴클레오프로테인(RNP) 형태로 포함하는 것인 저면역원성 줄기세포 또는 줄기세포로부터 분화하거나 유래된 저면역원성 세포 제조용 조성물.
제14항에 있어서, 상기 조성물은
상기 에디터 단백질을 암호화하는 핵산 및 상기 가이드 핵산을 암호화하는 핵산을 1 이상의 벡터 형태로 포함하는 것인 저면역원성 줄기세포 제조용 또는 줄기세포로부터 분화하거나 유래된 저면역원성 세포 조성물.
제16항에 있어서, 상기 벡터는 플라스미드, 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스, 백시니아바이러스, 폭스바이러스 및 단순포진 바이러스로 구성된 군에서 선택된 것인 저면역원성 줄기세포 또는 줄기세포로부터 분화하거나 유래된 저면역원성 세포 제조용 조성물.
분리된 줄기세포 또는 분리된 줄기세포로부터 분화하거나 유래된 세포에 제14항의 저면역원성 줄기세포 또는 줄기세포로부터 분화하거나 유래된 저면역원성 세포 제조용 조성물을 도입하는 단계; 및
상기 줄기세포 또는 분리된 줄기세포로부터 분화하거나 유래된 세포의 LGALS9(Gal-9), CLEC4G(LSECtin), PD-L1 및 HHLA2로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 면역활성 억제 인자의 발현 또는 활성을 증가시키도록 LGALS9(Gal-9), CLEC4G(LSECtin), PD-L1 및 HHLA2로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 면역활성 억제 인자를 코딩하는 유전자를 상기 줄기세포 또는 줄기세포로부터 분화하거나 유래된 세포 유전체(genome)에 넉-인(knock-in)하는 단계
를 포함하는 저면역원성 줄기세포 또는 분리된 줄기세포로부터 분화하거나 유래된 저면역원성 세포의 제조방법.
제18항에 있어서, 상기 조성물은 상기 에디터 단백질을 암호화하는 핵산 및 상기 가이드 핵산을 암호화하는 핵산을 1 이상의 벡터 형태로 포함하는, 저면역원성 줄기세포 또는 분리된 줄기세포로부터 분화하거나 유래된 저면역원성 세포의 제조방법.
제18항에 있어서, 상기 줄기세포 또는 줄기세포로부터 분화하거나 유래된 세포의 유전체(genome) 내에 위치한 표적서열에, 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes) 유래 Cas9 단백질 및 표적서열을 표적화 할 수 있는 가이드 RNA를 포함하는 CRISPR/Cas9 복합체를 접촉시킴으로써, 상기 표적 서열 내에 인델이 발생되는 것을 특징으로 하는 저면역원성 줄기세포 또는 줄기세포로부터 분화하거나 유래된 저면역원성 세포의 제조방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 인위적으로 조작된 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 세포 이식 또는 생체 조직 재생용 조성물.
제21항에 있어서, 상기 세포 이식 또는 생체 조직 재생용 조성물은 세포치료제 조성물, 유전자치료제 조성물, 조직공학치료제 조성물, 면역 치료제 조성물 또는 암의 예방 또는 치료제 조성물인 것인, 세포 이식 또는 생체 조직 재생용 조성물.
제6항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 줄기세포로부터 분화하거나 유래된 인위적으로 조작된 세포를 유효성분으로 포함하는 세포 이식 또는 생체 조직 재생용 조성물.
제23항에 있어서, 상기 세포 이식 또는 생체 조직 재생용 조성물은 세포치료제 조성물, 유전자치료제 조성물, 조직공학치료제 조성물, 면역 치료제 조성물 또는 암의 예방 또는 치료제 조성물인 것인, 세포 이식 또는 생체 조직 재생용 조성물.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 인위적으로 조작된 줄기세포로부터 분화되거나 유래한, LGALS9(Gal-9), CLEC4G(LSECtin), PD-L1 및 HHLA2로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 면역활성 억제 인자의 발현 또는 활성이 증가한 세포를 유효성분으로 포함하는 세포 이식 또는 생체 조직 재생용 조성물.
제25항에 있어서, 상기 세포는 인간혈관내피세포, 골세포, 연골세포, 심근세포, 근육세포, 표피세포, 섬유아세포, 신경세포, 간세포, 장세포, 위세포, 피부세포, 지방세포, 혈액세포, 면역세포,　세포　스페로이드 및 오가노이드로 이루어진 군에서 선택된 1종인 것인 세포 이식 또는 생체 조직 재생용 조성물.
제25항에 있어서, 상기 세포 이식 또는 생체 조직 재생용 조성물은 세포치료제 조성물, 유전자치료제 조성물, 조직공학치료제 조성물, 면역 치료제 조성물 또는 암의 예방 또는 치료제 조성물인 것인, 세포 이식 또는 생체 조직 재생용 조성물.