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KR20230105035A - 재조합 백시니아 바이러스 - Google Patents

재조합 백시니아 바이러스 Download PDF

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Publication number
KR20230105035A
KR20230105035A KR1020220000126A KR20220000126A KR20230105035A KR 20230105035 A KR20230105035 A KR 20230105035A KR 1020220000126 A KR1020220000126 A KR 1020220000126A KR 20220000126 A KR20220000126 A KR 20220000126A KR 20230105035 A KR20230105035 A KR 20230105035A
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KR
South Korea
Prior art keywords
substitution
variant
amino acid
pharmaceutical composition
cancer
Prior art date
Application number
KR1020220000126A
Other languages
English (en)
Inventor
조셉 존 바인더
마이클 데일 아이젠브라운
클레어 리즈
제러미 숀 마이어즈
제임스 트래비스 패터슨
Original Assignee
화이자 인코포레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
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Abstract

본 개시내용은 인간 IL-2 변이체, IL-2 변이체를 포함하는 재조합 종양용해성 바이러스, IL-2 변이체 또는 재조합 종양용해성 바이러스를 포함하는 조성물, 및 개체에서 암을 치료하기 위한 IL-2 변이체, 재조합 종양용해성 바이러스, 또는 조성물의 용도를 제공한다.

Description

재조합 백시니아 바이러스 {RECOMBINANT VACCINIA VIRUS}
서열 목록에 대한 참조
본 출원은 EFS-웹을 통해 전자적으로 출원되고 있으며, .txt 형식의 전자적으로 제출된 서열 목록을 포함한다. .txt 파일은 2021년 6월 22일에 생성되고 80 KB의 크기를 갖는 "PC72649A_SequenceListing_ST25.txt"라는 명칭의 서열 목록을 함유한다. 이 .txt 파일에 함유된 서열 목록은 본 명세서의 일부이며, 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
인터류킨-2 (IL-2)는 포유동물 면역계의 다수의 기능, 예컨대 T 세포의 자극 및 자연 킬러 세포 성장에 중요한 시토카인이며, 암에 대한 면역치료제로서 입증되었다. 그러나, 다양한 인자 (예를 들어 좁은 치료 창; 잠재적인 심각한 부작용)는 그의 임상적 사용을 제한하였다. 항암제로서의 IL-2의 사용의 제한 중 하나는 그것이 (항-종양 활성을 갖는) 이펙터 T 세포 및 NK 세포를 자극시키고 확장시킬 수 있는 반면, 그것은 또한 면역 반응을 억제하는 조절 T 세포 (Treg)를 확장시킬 수 있다는 것이다.
IL-2 신호전달은 상이한 세포 유형 상에 상이한 형식으로 존재하는 IL-2 수용체 (IL-2R)를 통해 매개된다. 고 친화도 IL-2 수용체는 IL-2R 알파 ("IL-2Rα"; CD25로도 공지됨), IL-2R 베타 ("IL-2Rβ"; CD122로도 공지됨), 및 IL-2R 감마 ("IL-2Rγ"; CD132로도 공지됨)로 지칭되는 3가지 폴리펩티드 쇄를 함유한다. 고 친화도 IL-2R은 Treg 상에 구성적으로 발현되고, 활성화된 T 세포 및 NK 세포 상에 일시적으로 발현된다. 중간 친화도 IL-2R은 IL-2Rβ 및 IL-2Rγ 폴리펩티드 쇄를 함유하며, 예를 들어, 휴지 CD4+ 및 CD8+ T 세포 및 자연 킬러 (NK) 세포 상에 발현된다. 저 친화도 IL-2R은 IL-2Rα 폴리펩티드 쇄를 함유한다.
IL-2는 고 친화도 IL-2R을 통해 Treg 세포를 활성화시키고, 중간 친화도 IL-2R을 통해 휴지 CD4+ 및 CD8+ T 세포 및 자연 킬러 (NK) 세포를 활성화시키기 때문에, Treg를 활성화시키지 않으면서 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포 및 NK 세포를 선택적으로 활성화시키기 위한 한 가지 가능한 접근법은 IL-2를 중간 친화도 IL-2R에 선택적으로 표적화하는 것이다. 고 친화도 IL-2 수용체 및 저 친화도 IL-2 수용체 사이의 차이가 고 친화도 IL-2 수용체에서의 IL-2Rα 폴리펩티드 쇄의 존재임을 고려하여, IL-2는 잠재적으로 IL-2 및 IL-2Rα 폴리펩티드 쇄 사이의 상호작용을 차단하거나 손상시킴으로써 중간 친화도 IL-2R에 선택적으로 표적화될 수 있다.
종양용해성 바이러스 (OV)는 암 세포를 선택적으로 또는 우선적으로 감염시키고 살해하는 바이러스이다. 살아 있는 복제 OV는 임상 시험에서 다양한 인간 암에서 시험되었다. OV는 항-종양 면역 반응을 유도할 뿐만 아니라 종양 세포의 용해를 지정할 수 있다. OV는 자연적으로 발생할 수 있거나 다른 바이러스를 변형시킴으로써 구축될 수 있다. 통상적인 OV는 단순 포진 바이러스 (HSV), 아데노바이러스 (Ad), 홍역 바이러스 (MV), 콕사키 바이러스 (CV), 소수포 구내염 바이러스 (VSV), 및 백시니아 바이러스 (VV)의 약독화된 균주에 기반하여 구축된 것들을 포함한다.
백시니아 바이러스 (VV)는 폭스바이러스 과의 오르토폭스바이러스 속의 구성원이다. 이는 약 200개의 유전자를 코딩하는 길이로 대략 190 kb의 선형 이중-가닥 DNA 게놈을 갖는다. 백시니아 바이러스는 숙주 세포의 세포질에서 복제한다. 대형 백시니아 바이러스 게놈은 바이러스 DNA 복제에 사용되는 다양한 효소 및 단백질을 코딩한다. 복제 동안, 백시니아 바이러스는 그들의 외막에 있어서 상이한 몇몇 감염성 형태를 생산한다: 세포내 성숙한 비리온 (IMV), 세포내 외피화된 비리온 (IEV), 세포-연관된 외피화된 비리온 (CEV) 및 세포외 외피화된 비리온 (EEV). IMV는 가장 풍부한 감염성 형태이며, 숙주 사이의 확산을 담당하는 것으로 생각되고; CEV는 세포-대-세포 확산에 있어서 역할을 하는 것으로 믿어지며; EEV는 숙주 유기체 내의 긴 범위 전염에 중요한 것으로 생각된다. EEV-특이적 단백질은 유전자 A33R, A34R, A36R, A56R, B5R, 및 F13L에 의해 코딩된다. A34R 유전자에 의해 코딩되는 유형 II 막횡단 당단백질인 A34는 액틴 꼬리의 유도, 감염된 세포의 표면으로부터의 외피화된 바이러스의 방출, 및 바이러스 진입 전에 리간드 결합 후의 바이러스 외피의 파괴에 관여한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 인간 인터류킨 2 (IL-2) 변이체, 및 관련된 융합 단백질, 조성물, 방법, 및 용도를 제공한다. IL-2 변이체는 중간-친화도 이량체성 IL-2 수용체 복합체 (IL-2Rβ + IL-2Rγ를 함유함)에 결합하는 능력을 보유하지만, 야생형 인간 IL-2 폴리펩티드와 비교하여 IL-2 수용체 알파 ("IL-2Rα" / CD25)에의 감소된 결합을 갖거나 결합을 갖지 않거나, 또는 야생형 인간 IL-2 폴리펩티드와 비교하여 고-친화도 삼량체성 IL-2 수용체 복합체 (IL-2Rα + IL-2Rβ + IL-2Rγ를 함유함)에의 감소된 결합을 갖거나 결합을 갖지 않는다.
본원에서 제공된 IL-2 변이체는 야생형 인간 IL-2 아미노산 서열과 비교하여 1개 이상의 아미노산 치환을 갖는다. 일부 실시양태에서, IL-2 변이체에서의 아미노산 치환(들)은 IL-2 변이체 단백질에서 1개 이상의 조작된 N-글리코실화 부위(들)를 발생시킨다.
일부 실시양태에서, 단리된 인간 인터류킨 2 (IL-2) 변이체는 야생형 인간 IL-2와 비교하여 적어도 1개의 아미노산 치환을 포함하며, 여기서 야생형 인간 IL-2는 서열식별번호(SEQ ID NO): 1에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖고, IL-2 변이체는 a) K35, b) R38 및 L40 둘 다, c) T41 및 K43 둘 다, d) K43 및 Y45 둘 다, e) E62 및 K64 둘 다, 및 f) L72 및 Q74 둘 다로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 위치에 1개 이상의 치환을 포함한다. 임의로, 변이체는 a) K35 (여기서 K35 치환은 K35N임), b) R38 및 L40 둘 다 (여기서 R38 치환은 R38N이고, L40 치환은 L40S 또는 L40T임), c) T41 및 K43 둘 다 (여기서 T41 치환은 T41N이고, K43 치환은 K43S 또는 K43T임), d) K43 및 Y45 둘 다 (여기서 K43 치환은 K43N이고, Y45 치환은 Y45S 또는 Y45T임), e) E62 및 K64 둘 다 (여기서 E62 치환은 E62N이고, K64 치환은 K64S 또는 K64T임), 및 f) L72 및 Q74 둘 다 (여기서 L72 치환은 L72N이고, Q74 치환은 Q74S 또는 Q74T임)로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 위치에 1개 이상의 치환을 포함한다. 임의로, IL-2 변이체는 위치 K35에 치환을 포함하며, 여기서 IL-2 변이체는 a) R38 및 L40 둘 다 (여기서 R38 치환은 R38N이고, L40 치환은 L40S 또는 L40T임), b) T41 및 K43 둘 다 (여기서 T41 치환은 T41N이고, K43 치환은 K43S 또는 K43T임), c) K43 및 Y45 둘 다 (여기서 K43 치환은 K43N이고, Y45 치환은 Y45S 또는 Y45T임), d) E62 및 K64 둘 다 (여기서 E62 치환은 E62N이고, K64 치환은 K64S 또는 K64T임), e) L72 및 Q74 둘 다 (여기서 L72 치환은 L72N이고, Q74 치환은 Q74S 또는 Q74T임), 및 f) E62 (여기서 E62 치환은 E62N, E62A, E62K, 또는 E62R임)로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에 치환을 추가로 포함한다. 임의로, IL-2 변이체는 위치 R38 및 L40에 치환을 포함하며, 여기서 IL-2 변이체는 a) T41 및 K43 둘 다 (여기서 T41 치환은 T41N이고, K43 치환은 K43S 또는 K43T임), b) K43 및 Y45 둘 다 (여기서 K43 치환은 K43N이고, Y45 치환은 Y45S 또는 Y45T임), c) E62 및 K64 둘 다 (여기서 E62 치환은 E62N이고, K64 치환은 K64S 또는 K64T임), d) L72 및 Q74 둘 다 (여기서 L72 치환은 L72N이고, Q74 치환은 Q74S 또는 Q74T임), 및 e) E62 (여기서 E62 치환은 E62N, E62A, E62K, 또는 E62R임)로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에 치환을 추가로 포함한다. 임의로, IL-2 변이체는 위치 T41 및 K43에 치환을 포함하며, 여기서 IL-2 변이체는 a) E62 및 K64 둘 다 (여기서 E62 치환은 E62N이고, K64 치환은 K64S 또는 K64T임), b) L72 및 Q74 둘 다 (여기서 L72 치환은 L72N이고, Q74 치환은 Q74S 또는 Q74T임), 및 c) E62 (여기서 E62 치환은 E62N, E62A, E62K, 또는 E62R임)로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에 치환을 추가로 포함한다. 임의로, IL-2 변이체는 위치 K43 및 Y45에 치환을 포함하며, 여기서 IL-2 변이체는 a) E62 및 K64 둘 다 (여기서 E62 치환은 E62N이고, K64 치환은 K64S 또는 K64T임), b) L72 및 Q74 둘 다 (여기서 L72 치환은 L72N이고, Q74 치환은 Q74S 또는 Q74T임), 및 c) E62 (여기서 E62 치환은 E62N, E62A, E62K, 또는 E62R임)로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에 치환을 추가로 포함한다. 임의로, IL-2 변이체는 위치 E62 및 K64에 치환을 포함하며, 여기서 IL-2 변이체는 위치 L72 및 Q74 (여기서 L72 치환은 L72N이고, Q74 치환은 Q74S 또는 Q74T임)에 치환을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 단리된 인간 인터류킨 2 (IL-2) 변이체는 야생형 인간 IL-2와 비교하여 적어도 4개의 아미노산 치환을 포함하며, 여기서 야생형 인간 IL-2는 서열식별번호: 1에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖고, IL-2 변이체는 a) R38, L40, K43, 및 Y45의 각각; 또는 b) K43, Y45, L72, 및 Q74의 각각으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 위치에 치환을 포함한다. 임의로, IL-2 변이체는 아미노산 위치 R38, L40, K43, 및 Y45에 치환을 포함하고, R38 치환은 R38N이다. 임의로, IL-2 변이체는 아미노산 위치 R38, L40, K43, 및 Y45에 치환을 포함하고, L40 치환은 L40T이다. 임의로, IL-2 변이체는 아미노산 위치 R38, L40, K43, 및 Y45에 치환을 포함하고, K43 치환은 K43N이다. 임의로, IL-2 변이체는 아미노산 위치 R38, L40, K43, 및 Y45에 치환을 포함하고, Y45 치환은 Y45T이다. 임의로, IL-2 변이체는 아미노산 위치 R38, L40, K43, 및 Y45에 치환을 포함하고, R38 치환은 R38N이고, K43 치환은 K43N이다. 임의로, IL-2 변이체는 아미노산 위치 R38, L40, K43, 및 Y45에 치환을 포함하고, 아미노산 치환은 R38N, L40T, K43N, 및 Y45T이다. 임의로, IL-2 변이체는 아미노산 위치 K43, Y45, L72, 및 Q74에 치환을 포함하고, K43 치환은 K43N이다. 임의로, IL-2 변이체는 아미노산 위치 K43, Y45, L72, 및 Q74에 치환을 포함하고, Y45 치환은 Y45T이다. 임의로, IL-2 변이체는 아미노산 위치 K43, Y45, L72, 및 Q74에 치환을 포함하고, L72 치환은 L72N이다. 임의로, IL-2 변이체는 아미노산 위치 K43, Y45, L72, 및 Q74에 치환을 포함하고, Q74 치환은 Q74T이다. 임의로, IL-2 변이체는 아미노산 위치 K43, Y45, L72, 및 Q74에 치환을 포함하고, K43 치환은 K43N이고, L72 치환은 L72N이다. 임의로, IL-2 변이체는 아미노산 위치 K43, Y45, L72, 및 Q74에 치환을 포함하고, 아미노산 치환은 K43N, Y45T, L72N, 및 Q74T이다. 임의로, IL-2 변이체는 서열식별번호: 31 또는 서열식별번호: 35에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 야생형 인간 IL-2와 비교하여 적어도 1개의 아미노산 치환을 포함하는 단리된 인간 인터류킨 2 (IL-2) 변이체가 본원에서 제공되고, 여기서 야생형 인간 IL-2는 서열식별번호: 1에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖고, IL-2 변이체는 위치 E62에 아미노산 치환을 포함한다. 임의로, E62 치환은 E62N, E62A, E62K, 또는 E62R이다.
일부 실시양태에서, 서열식별번호: 31 또는 35에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 단리된 인간 인터류킨 2 (IL-2) 변이체가 본원에서 제공된다.
일부 실시양태에서, 야생형 인간 IL-2와 비교하여 적어도 4개의 아미노산 치환을 포함하는 단리된 인간 인터류킨 2 (IL-2) 변이체가 본원에서 제공되고, 여기서 야생형 인간 IL-2는 서열식별번호: 1에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖고, IL-2 변이체는 4개의 아미노산 치환 R38N, L40T, K43N, 및 Y45T를 포함한다.
일부 실시양태에서, 야생형 인간 IL-2와 비교하여 적어도 4개의 아미노산 치환을 포함하는 단리된 인간 인터류킨 2 (IL-2) 변이체가 본원에서 제공되고, 여기서 야생형 인간 IL-2는 서열식별번호: 1에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖고, IL-2 변이체는 4개의 아미노산 치환 K43N, Y45T, L72N, 및 Q74T를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 단리된 인간 인터류킨 2 (IL-2) 변이체는 야생형 인간 IL-2와 비교하여 감소된 인간 IL-2 수용체 알파 (IL-2Rα)에의 결합을 갖는다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 단리된 인간 인터류킨 2 (IL-2) 변이체는 도입된 아스파라긴 (N) 잔기 치환(들) 상에 글리코실화된다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 단리된 인간 인터류킨 2 (IL-2) 변이체는 위치 T3 및 C125 중 하나 또는 둘 다에 치환을 추가로 포함한다. 임의로, 위치 T3 및 C125에서의 치환은 T3A 또는 T3G 및 C125A 또는 C125S이다.
일부 실시양태에서, a) 본원에서 제공된 IL-2 변이체; 및 b) 인간 항체의 Fc 영역을 포함하는 단리된 융합 단백질이 본원에서 제공되고, 여기서 IL-2 변이체는 Fc 영역에 공유 연결된다.
일부 실시양태에서, a) 본원에서 제공된 단리된 융합 단백질 (여기서 인간 항체의 Fc 영역은 제1 Fc 영역임); 및 b) 인간 항체의 제2 Fc 영역을 포함하는 이종이량체성 단백질이 본원에서 제공되고, 여기서 제1 Fc 영역 및 제2 Fc 영역은 적어도 1개의 디술피드 결합에 의해 공유 연결된다. 임의로, 제1 Fc 영역은 야생형 인간 IgG Fc 영역과 비교하여 적어도 1개의 아미노산 변형을 포함하여, 놉(knob) 또는 홀(hole)을 형성하고, 여기서 제2 Fc 영역은 야생형 인간 IgG Fc 영역과 비교하여 적어도 1개의 아미노산 변형을 포함하여, 놉 또는 홀을 형성하고, 여기서 제1 및 제2 Fc 영역 중 하나는 놉을 함유하고, 제1 및 제2 Fc 영역 중 하나는 홀을 함유한다. 임의로, 놉을 포함하는 Fc 영역은 돌연변이 Y349C 및 T366W를 포함하며, 여기서 홀을 포함하는 Fc 영역은 돌연변이 S354C, T366S, L368A, 및 Y407V를 포함한다.
일부 실시양태에서, a) 본원에서 제공된 IL-2 변이체; 및 b) Fc 도메인을 포함하는 항체를 포함하는 단리된 융합 단백질이 본원에서 제공되고, 여기서 Fc 도메인은 제1 Fc 영역 및 제2 Fc 영역을 포함하고, IL-2 변이체는 항체의 Fc 영역에 공유 연결된다. 임의로, Fc 도메인은 야생형 Fc 도메인과 비교하여 감소된 항체 의존성 세포성 세포독성 (ADCC) 활성을 갖거나, 또는 활성을 갖지 않는다. 일부 실시양태에서, a) 본원에서 제공된 IL-2 변이체; 및 b) Fc 도메인을 포함하는 항체를 포함하는 단리된 융합 단백질이 본원에서 제공되고, 여기서 항체는 제1 경쇄 및 제2 경쇄를 포함하고, IL-2 변이체는 항체의 경쇄에 공유 연결된다. 임의로, Fc 도메인은 야생형 Fc 도메인과 비교하여 감소된 ADCC 활성을 갖거나, ADCC 활성을 갖지 않는다. 임의로, 항체는 종양 또는 면역 세포에 결합한다. 임의로, 항체는 항-B7H4 항체, 항-CTLA-4 항체, 항-CD3 항체, 항-B7H4 / 항-CD3 이중특이적 항체, 항-CD28 항체, 항-B7H4 / 항-CD28 이중특이적 항체, 항-EDB1 항체, 항-ULBP2 항체, 항-CD4 항체, 항-CD8 항체, 항-4-1BB 항체, 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-TIM3 항체, 항-LAG3 항체, 항-TIGIT 항체, 항-OX40 항체, 항-IL-8 항체, 항-IL-7R알파 (CD127) 항체, 항-IL15 항체, 항-HVEM 항체, 항-BTLA 항체, 항-CD40 항체, 항-CD40L 항체, 항-CD47 항체, 항-CSF1R 항체, 항-CSF1 항체, 항-MARCO 항체, 항-CXCR4 항체, 항-VEGFR1 항체, 항-VEGFR2 항체, 항-TNFR1 항체, 항-TNFR2 항체, 항-CD3 이중특이적 항체, 항-CD19 항체, 항-CD20, 항-Her2 항체, 항-EGFR 항체, 항-ICOS 항체, 항-CD22 항체, 항-CD52 항체, 항-CCR4 항체, 항-CCR8 항체, 항-CD200R 항체, 항-VISG4 항체, 항-CCR2 항체, 항-LILRb2 항체, 항-CXCR4 항체, 항-CD206 항체, 항-CD163 항체, 항-KLRG1 항체, 항-FLT3 항체, 항-B7H3 항체, KLRG1 항체, 및 항-GITR 항체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 임의로, IL-2 변이체는 각각 폴리펩티드 링커 및/또는 폴리펩티드 태그에 의해 Fc 영역 또는 경쇄에 공유 연결된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 IL-2 변이체, 융합 단백질 또는 이종이량체성 단백질을 코딩하는 단리된 핵산이 본원에서 제공된다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 치환 R38N, L40T, K43N, 및 Y45T를 함유하는 IL-2 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 본원에서 제공되고, 여기서 폴리뉴클레오티드는 서열식별번호: 32에 제시된 바와 같은 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 IL-2 변이체를 코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 발현 벡터가 본원에서 제공된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 IL-2 변이체, 융합 단백질, 또는 이종이량체성 단백질, 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물이 본원에서 제공된다.
일부 실시양태에서, 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에서 질환, 예컨대 암을 치료하는 방법으로서, 본원에 기재된 IL-2 변이체, 융합 단백질, 이종이량체성 단백질, 또는 제약 조성물의 유효량을 대상체에게 투여하여, 질환과 연관된 1종 이상의 증상이 대상체에서 개선되도록 하는 것을 포함하는 방법이 본원에서 제공된다. 임의로, 방법은 제2 치료제의 유효량을 투여하는 것을 추가로 포함하고, 임의로 여기서 투여는 별개이거나, 순차적이거나, 동시이다.
일부 실시양태에서, 면역계의 자극을 필요로 하는 대상체에서 면역계를 자극시키는 방법으로서, 본원에 기재된 IL-2 변이체, 융합 단백질, 이종이량체성 단백질, 또는 제약 조성물의 유효량을 대상체에게 투여하여, 면역계가 대상체에서 자극되도록 하는 것을 포함하는 방법이 본원에서 제공된다.
일부 실시양태에서, 질환의 치료를 필요로 하는 개체에서 질환의 치료에 사용하기 위한 의약의 제조에 사용하기 위한, 본원에 기재된 IL-2 변이체, 융합 단백질, 이종이량체성 단백질, 또는 제약 조성물이 본원에서 제공된다.
일부 실시양태에서, 참조 단백질의 당변이체를 생성하기 위해, 참조 단백질의 결합 도메인에 글리코실화 부위를 도입하는 것을 포함하는, 참조 단백질의 변이체를 제조하는 방법이 본원에서 제공되고, 여기서 참조 단백질은 결합 상대 단백질에 결합하고, 참조 단백질에서의 결합 도메인은 결합 상대 단백질과 상호작용하고, 여기서 글리코실화 부위는 아미노산 서열 N-x-S, N-x-T, S-x-N, 또는 T-x-N을 포함하고, 글리코실화 부위를 도입하는 것은 참조 단백질의 결합 도메인의 아미노산 서열에 적어도 1개의 아미노산 치환을 도입하여 아미노산 서열 N-x-S, N-x-T, S-x-N, 또는 T-x-N을 생성하는 것을 포함하며, 여기서 x는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산이고, N-x-S, N-x-T, S-x-N, 또는 T-x-N 서열에서 N, S, 또는 T 잔기(들) 중 적어도 하나는 아미노산 치환이고, 여기서 변이체는 참조 단백질과 비교하여 감소된 결합 상대 단백질에의 결합을 갖는다. 임의로, 방법은 참조 단백질의 결합 도메인에 적어도 2개의 아미노산 치환을 도입하는 것을 포함하며, 여기서 글리코실화 부위를 도입하는 것은 참조 단백질의 결합 도메인의 아미노산 서열에 적어도 2개의 아미노산 치환을 도입하여 아미노산 서열 N-x-S, N-x-T, S-x-N, 또는 T-x-N을 생성하는 것을 포함하며, 여기서 N-x-S, N-x-T, S-x-N, 또는 T-x-N 서열에서 N, S, 또는 T 잔기는 아미노산 치환이다.
일부 다른 측면에서, 본 개시내용은 본원에서 제공된 IL-2 변이체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 종양용해성 바이러스, 상기 IL-2 변이체 또는 종양용해성 바이러스를 포함하는 조성물, 뿐만 아니라 종양용해성 바이러스와 관련된 방법 및 용도를 제공한다. 일부 실시양태에서, 재조합 종양용해성 바이러스는 서열식별번호: 29의 아미노산 서열을 포함하는 인간 IL-2 변이체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 재조합 종양용해성 바이러스는 이종 티미딘 키나제 (TK) 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 이종 TK 폴리펩티드는 서열식별번호: 28의 아미노산 서열을 포함하는 HSV-TK 변이체이다.
일부 실시양태에서, 재조합 종양용해성 바이러스는 바이러스 티미딘 키나제를 결핍성이 되게 하는 변형을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 변형은 바이러스 J2R 유전자의 적어도 일부의 결실이다.
일부 다른 실시양태에서, 본 개시내용에 의해 제공된 재조합 종양용해성 바이러스는 자손 비리온의 확산을 증진시키는 변형을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 변형은 바이러스 A34R 유전자 생성물에서 K151E 치환을 발생시킨다.
일부 실시양태에서, 재조합 종양용해성 바이러스는 재조합 백시니아 바이러스이다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용은 a) 서열식별번호: 29의 IL-2 변이체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열; b) 서열식별번호: 28의 아미노산 서열을 포함하는 HSV-TK 변이체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열; c) 야생형 A34R 유전자 생성물에 비해 K151E 치환을 포함하는 A34 단백질을 코딩하는 A34R 유전자; 및 d) 바이러스 J2R 유전자의 적어도 일부의 결실을 포함하는 복제 적격, 재조합 종양용해성 백시니아 바이러스를 제공하고, 여기서 재조합 종양용해성 백시니아 바이러스는 균주 코펜하겐(Copenhagen)이다. 구체적인 실시양태에서, 바이러스의 A34R 유전자에 의해 코딩되는 A34 단백질은 서열식별번호: 38의 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 바이러스의 A34R 유전자는 서열식별번호: 39의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 다른 측면에서, 본 개시내용은 재조합 종양용해성 바이러스를 포함하는 조성물, 및 종양 또는 암을 갖는 개체에서 종양용해를 유도하거나 암을 치료하기 위한 종양용해성 바이러스 또는 조성물을 사용하는 방법을 제공한다.
일부 다른 실시양태에서, 본 개시내용은 2'-데옥시-구아노신의 합성 유사체, 예컨대 간시클로비르의 유효량을 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 바이러스가 투여된 개체의 신체에서 복제-적격, 재조합 종양용해성 바이러스의 복제를 제어하는 방법을 제공한다.
다른 측면 및 실시양태의 예는 하기에 상세하게 기재된다.
도 1. 재조합 종양용해성 바이러스 VV91, VV93, 및 VV96에 대한 전체 게놈의 개략적 제시. 약어: LITR = 좌측 역위 말단 반복부; RITR = 우측 역위 말단 반복부; A - O = HindIII 소화 단편에 의해 역사적으로 정의된 바이러스 유전자 영역; PSEL = 합성 초기 후기 프로모터; mIL2v = 마우스 인터류킨-2 변이체; * = A34 단백질의 위치 151에서 리신의 글루타메이트로의 치환을 코딩하는 돌연변이; PF17 = F17R 유전자로부터의 프로모터; HSV TK.007 = 위치 168에서 알라닌의 히스티딘으로의 치환을 코딩하는 돌연변이를 갖는 단순 포진 바이러스 티미딘 키나제 유전자.
도 2. 재조합 종양용해성 바이러스 VV94 및 IGV-121에 대한 전체 게놈의 개략적 제시. 약어: LITR = 좌측 역위 말단 반복부; RITR = 우측 역위 말단 반복부; A - O = HindIII 소화 단편에 의해 역사적으로 정의된 바이러스 유전자 영역; PSEL = 합성 초기 후기 프로모터; mIL2v = 마우스 인터류킨-2 변이체; * = A34 단백질의 위치 151에서 리신의 글루타메이트로의 치환을 코딩하는 돌연변이; PF17 = F17R 유전자로부터의 프로모터; HSV TK.007 = 위치 168에서 알라닌의 히스티딘으로의 치환을 코딩하는 돌연변이를 갖는 단순 포진 바이러스 티미딘 키나제 유전자.
도 3. 재조합 종양용해성 바이러스 VV101-VV103에 대한 전체 게놈의 개략적 제시. 약어: LITR = 좌측 역위 말단 반복부; RITR = 우측 역위 말단 반복부; A - O = HindIII 소화 단편에 의해 역사적으로 정의된 바이러스 유전자 영역; PSEL = 합성 초기 후기 프로모터; hIL2v = 인간 인터류킨-2 변이체; * = A34 단백질의 위치 151에서 리신의 글루타메이트로의 치환을 코딩하는 돌연변이; PF17 = F17R 유전자로부터의 프로모터; HSV TK.007 = 위치 168에서 알라닌의 히스티딘으로의 치환을 코딩하는 돌연변이를 갖는 단순 포진 바이러스 티미딘 키나제 유전자.
도 4. 재조합 종양용해성 백시니아 바이러스로의 세포의 감염 후의 mIL-2v 발현 분석.
도 5. 재조합 종양용해성 백시니아 바이러스로의 세포의 감염 후의 hIL-2v 발현 분석.
도 6. 재조합 종양용해성 백시니아 바이러스로의 세포의 감염 후의 HSV TK.007 발현 분석.
도 7a-7g. MC38 종양 세포로 SC 이식된 C57BL/6 암컷 마우스에 대한 바이러스요법-유도된 종양 성장 억제의 평가. 종양 성장 궤적은 비히클 단독 (a) 또는 루시페라제-2A-GFP 리포터 (Cop.Luc-GFP.A34R-K151E; VV16) (b), mIL-2v 단독 (Cop.mGM-CSF.A34R-K151E; VV27) (c), B16R 유전자 로커스에서 정방향 배향에서 mIL-2v 및 HSV TK.007 (Cop.mIL-2v.A34R-K151E.HSV TK.007 (B16R_For); VV91) (d), J2R 유전자 로커스에서 역방향 배향에서 mIL-2v 및 HSV TK.007 (Cop.mIL-2v.A34R-K151E.HSV TK.007 (J2R_Rev); VV93) (e), 또는 B16R 유전자 로커스에서 역방향 배향에서 mIL-2v 및 HSV TK.007 (Cop.mIL-2v.A34R-K151E.HSV TK.007 (B16R_Rev); VV96) (f) 중 어느 하나로 아암화된 A34R K151E 돌연변이를 함유하는 코펜하겐 백시니아 바이러스로 처리된 그룹에서의 개별적 마우스에 대해 제시되어 있다. 각각의 그래프 상의 수직 파선은 마우스가 비히클 또는 바이러스의 종양내 주사를 받은 시점을 나타낸다. 각각의 그래프 상의 수평 파선은 동물을 연구로부터 제거하는 기준으로서 사용된 종양 부피 역치를 나타낸다. 각각의 처리 그룹에 대한 평균 종양 부피 (mm3) ± 95% 신뢰 구간은 각각의 그룹에서의 모든 동물이 여전히 살아 있었던 마지막 종양 측정 시점인 종양 이식 후 제28일까지 제시되어 있다 (g).
도 8. ANCOVA를 사용한 바이러스요법-유도된 종양 성장 억제의 통계적 비교. 볼드체의 값은 p ≤ 0.05인 비교 ANCOVA 결과를 나타낸다.
도 9. 이식 후 제12일에 비히클 또는 바이러스로의 처리 후의 MC38 종양-이식된 C57BL/6 암컷 마우스의 생존. 각각의 그룹의 곡선 및 수평 파선 사이의 교차점은 그룹에 대한 중위 (50%) 생존 역치를 지시한다.
도 10. 비히클 또는 재조합 Cop 백시니아 바이러스로의 종양내 주사 후 24시간 (hr) 및 48 hr에 MC38 종양-보유 C57BL/6 암컷 마우스로부터 수집된 혈청에서의 IL-2 수준. 각각의 기호는 개별적 마우스에 대한 계산된 IL-2 혈청 수준을 나타내는 반면, 막대는 그룹 기하 평균 (N=9/그룹)을 나타낸다. 오차 막대는 95% 신뢰 구간을 나타낸다.
도 11a-11f. LLC 종양 세포로 SC 이식된 C57BL/6 암컷 마우스에 대한 바이러스요법-유도된 종양 성장 억제의 평가. 종양 성장 궤적은 비히클 단독 (a) 또는 A34R K151E 돌연변이를 함유하고, 루시페라제-2A-GFP 리포터 (Cop.Luc-GFP.A34R-K151E; VV16) (b), mIL-2v 단독 (Cop.IL-2v.A34R-K151E; VV27) (c), B16R 유전자 로커스에서 정방향 배향에서 mIL-2v 및 HSV TK.007 (Cop.mIL-2v.A34R-K151E.HSV TK.007 (B16R_For); VV91) (d), J2R 유전자 로커스에서 역방향 배향에서 mIL-2v 및 HSV TK.007 (Cop.mIL-2v.A34R-K151E.HSV TK.007 (J2R_Rev); VV93) (e), B16R 유전자 로커스에서 역방향 배향에서 mIL-2v 및 HSV TK.007 (Cop.mIL-2v.A34R-K151E.HSV TK.007 (B16R_Rev); VV96) (f) 중 어느 하나로 아암화된 코펜하겐 백시니아 바이러스로 처리된 그룹에서의 개별적 마우스에 대해 제시되어 있다. 각각의 그래프 상의 수직 파선은 마우스가 비히클 또는 바이러스의 종양내 주사를 받은 시점을 나타낸다. 각각의 그래프 상의 수평 파선은 동물을 연구로부터 제거하는 기준으로서 사용된 종양 부피 역치를 나타낸다.
도 12. 비히클 또는 재조합 Cop 백시니아 바이러스로의 종양내 주사 후 24, 48, 및 72 hr에 LLC 종양-보유 C57BL/6 암컷 마우스로부터 수집된 혈청에서 검출된 IL-2 수준. 각각의 기호는 개별적 마우스에 대한 계산된 IL-2 혈청 수준을 나타내는 반면, 막대는 그룹 기하 평균 (N=5/그룹)을 나타낸다. 오차 막대는 95% 신뢰 구간을 나타낸다.
도 13a-13f. MC38 종양 세포로 SC 이식된 C57BL/6 암컷 마우스에 대한 단일 (제11일) IV 바이러스 전달을 사용한 바이러스요법-유도된 종양 성장 억제의 평가. 종양 성장 궤적은 희생시까지 종양 이식 후 제32일까지 그룹 평균 ± 95% 신뢰 구간으로서 각각의 처리에 대해 (a) 또는 희생 또는 연구 종결시까지 각각의 그룹에서의 개별적 마우스에 대해 (b-f) 나타내어진다. 시험 바이러스는 A34R K151E 돌연변이를 함유하고, 루시페라제-2A-GFP 리포터 (WR.Luc-GFP.A34R-K151E; VV17) (c), mIL-2v 단독 (WR.mIL-2v.A34R-K151E; VV79) (d), J2R 유전자 로커스에서 역방향 배향에서 HSV TK.007을 갖는 mIL-2v (WR.mIL-2v.A34R-K151E.HSV TK.007 (J2R_Rev); VV94) (e), 및 B15R/B17R 유전자 로커스에서 정방향 배향에서 mIL-2v 및 HSV TK.007 (WR.mIL-2v.A34R-K151E.HSV TK.007 (B16R_For); IGV-121) (f) 중 어느 하나로 아암화된 WR 백시니아 바이러스를 포함하였다.
도 14. 피하 MC38 종양 모델 연구를 위한 ANCOVA를 사용한 바이러스요법-유도된 종양 성장 억제의 통계적 비교. 볼드체의 값은 p 값 ≤ 0.05가 관찰된 비교 ANCOVA 결과를 나타낸다.
도 15. SC 종양 이식 후 제11일에 재조합 종양용해성 백시니아 바이러스로의 IV 처리 후의 MC38 종양-보유 C57BL/6 암컷 마우스의 생존. P 값은 선택 바이러스 그룹 사이의 로그-순위 검정 (만텔-콕스(Mantel-Cox)) 비교의 통계적 결과를 나타낸다.
도 16. 5e7 pfu 재조합 WR 백시니아 바이러스로의 IV 주사 후 72 hr (제14일)에 MC38 종양-보유 C57BL/6 암컷 마우스로부터 수집된 혈청에서 검출된 IL-2 수준. 각각의 기호는 개별적 마우스에서 검출된 IL-2 혈청 수준을 나타내는 반면, 막대는 그룹 기하 평균 (N=10/그룹)을 나타낸다. 오차 막대는 95% 신뢰 구간을 나타낸다.
도 17a-17d. LLC 종양 세포로 SC 이식된 C57BL/6 암컷 마우스에 대한 단일 (제14일) IV 바이러스 전달을 사용한 바이러스요법-유도된 종양 성장 억제의 평가. 종양 성장 궤적은 희생시까지 종양 이식 후 제27일까지 그룹 평균 ± 95% 신뢰 구간으로서 각각의 처리에 대해 (a) 또는 희생 또는 연구 종결시까지 각각의 그룹에서의 개별적 마우스에 대해 (b-d) 나타내어진다. 시험 바이러스는 루시페라제-2A-GFP 리포터 (WR.Luc-GFP; VV3) (c), 또는 A34R K151E 돌연변이를 갖는 B15R/B17R 유전자 로커스에서 정방향 배향에서 mIL-2v 및 HSV TK.007 (WR.mIL-2v.A34R-K151E.HSV TK.007 (B16R_For); IGV-121)) (d) 중 어느 하나로 아암화된 WR 백시니아 바이러스를 포함하였다.
도 18. 피하 LLC 종양 모델 연구를 위한 ANCOVA를 사용한 바이러스요법-유도된 종양 성장 억제의 통계적 비교. 볼드체의 값은 p 값 ≤ 0.05가 관찰된 비교 ANCOVA 결과를 나타낸다.
도 19. SC 종양 이식 후 제14일에 재조합 종양용해성 백시니아 바이러스로의 IV 처리 후의 LLC 종양-보유 C57BL/6 암컷 마우스의 생존. P 값은 선택 바이러스 그룹 사이의 로그-순위 검정 (만텔-콕스) 비교의 통계적 결과를 나타낸다.
도 20a-20i. MC38 종양 세포로 SC 이식된 C57BL/6 암컷 마우스에 대한 바이러스요법-유도된 종양 성장 억제의 평가. 종양 성장 궤적은 비히클 단독 (a), 5e7 pfu로 B16R 유전자 로커스에서 정방향 배향에서 mIL-2v 및 HSV TK.007 (Cop.mIL-2v.A34R-K151E.HSV TK.007 (B16R_For); VV91)) (b), 5e7 pfu로 B16R 유전자 로커스에서 정방향 배향에서 hIL-2v 및 HSV TK.007 (Cop.hIL-2v.A34R-K151E.HSV TK.007 (B16R_For); VV102)) (c), 5e7 pfu로 mGM-CSF 및 LacZ 리포터 트랜스진 (Cop.mGM-CSF/LacZ; (VV10) (d), 2e8 pfu로 루시페라제-2A-GFP 리포터 (Cop.Luc-GFP; VV7) (e), 2e8 pfu로 B16R 유전자 로커스에서 정방향 배향에서 mIL-2v 및 HSV TK.007 (Cop.mIL-2v.A34R-K151E.HSV TK.007 (B16R_For); VV91)) (f), 2e8 pfu로 B16R 유전자 로커스에서 정방향 배향에서 hIL-2v 및 HSV TK.007 (Cop.hIL-2v.A34R-K151E.HSV TK.007 (B16R_For); VV102)) (g), 및 2e8 pfu로 mGM-CSF 및 LacZ 리포터 트랜스진 (Cop.mGM-CSF/LacZ; (VV10) (h) 중 어느 하나로 아암화된 코펜하겐 백시니아 바이러스로 처리된 그룹에서의 개별적 마우스에 대해 제시되어 있다. 각각의 그래프 상의 수직 파선은 마우스가 비히클 또는 바이러스의 종양내 주사를 받은 시점을 나타낸다. 각각의 그래프 상의 수평 파선은 동물을 연구로부터 제거하는 기준으로서 사용된 종양 부피 역치를 나타낸다. 각각의 처리 그룹에 대한 평균 종양 부피 (mm3)는 종양 이식 후 제28일까지 제시되어 있다 (i).
도 21. ANCOVA를 사용한 바이러스요법-유도된 종양 성장 억제의 통계적 비교. 칼럼은 특이적 처리 그룹 쌍 사이의 비교의 통계적 결과 (p 값)를 제시한다. 볼드체의 값은 p ≤ 0.05인 비교 ANCOVA 결과를 나타낸다.
도 22a-b. 이식 후 제11일에 비히클 또는 바이러스로의 처리 후의 MC38 종양-이식된 C57BL/6 암컷 마우스의 생존. 마우스를 종양 부피 ≥ 1400 mm3에 도달시 사망한 바와 같이 매일 표시하였다. 각각의 그룹의 곡선 및 수평 파선 사이의 교차점은 그룹에 대한 중위 (50%) 생존 역치를 지시한다. (a)는 5e7 pfu 바이러스로 투여된 그룹을 제시한다. (b)는 2e8 pfu로의 바이러스로 투여된 그룹을 제시한다.
도 23. 비히클 또는 재조합 Cop 백시니아 바이러스로의 종양내 주사 후 24 hr에 MC38 종양-보유 C57BL/6 암컷 마우스로부터 수집된 혈청에서 검출된 마우스 IL-2 수준. 각각의 기호는 개별적 마우스에 대한 계산된 IL-2 혈청 수준을 나타내는 반면, 막대는 그룹 기하 평균 (N=10/그룹)을 나타낸다. 오차 막대는 95% 신뢰 구간을 나타낸다.
도 24. 비히클 또는 재조합 Cop 백시니아 바이러스로의 종양내 주사 후 24 hr에 MC38 종양-보유 C57BL/6 암컷 마우스로부터 수집된 혈청에서 검출된 인간 IL-2 수준. 각각의 기호는 개별적 마우스에 대한 계산된 IL-2 혈청 수준을 나타내는 반면, 막대는 그룹 기하 평균 (N=9/그룹)을 나타낸다. 오차 막대는 95% 신뢰 구간을 나타낸다.
도 25. HCT-116 종양 세포로 SC 이식된 누드 암컷 마우스에 대한 바이러스요법-유도된 종양 성장 억제의 평가. 각각의 처리 그룹에 대한 평균 종양 부피 (mm3)는 종양 이식 후 제40일까지 제시되어 있다. 각각의 그래프 상의 수직 파선은 마우스가 비히클 또는 바이러스의 종양내 주사를 받은 시점을 나타낸다. 각각의 그래프 상의 수평 파선은 동물을 연구로부터 제거하는 기준으로서 사용된 종양 부피 역치를 나타낸다.
도 26. VV97-100에 대한 전체 게놈의 개략적 제시.
도 27. VV110에 대한 전체 게놈의 개략적 제시.
도 28. VV117에 대한 전체 게놈의 개략적 제시.
도 29a-c. 재조합 WR 백시니아 바이러스에 의해 발현된 IL-2 변이체 트랜스진과 함께 인큐베이션된 뮤린 비장세포에서의 STAT5 인산화의 평가. hIL-2, hIL-2 변이체, 또는 hIL-2 당변이체 중 어느 하나와 함께 인큐베이션된 뮤린 비장세포의 하위세트에서의 pSTAT5 유도의 비교. IL-2 기능성을 IL-2R-매개된 신호전달의 판독으로서 세포내 pSTAT5 수준의 측정을 사용하여 평가하였다. 상이한 IL2R 복합체를 발현하는 뮤린 림프구의 다양한 하위세트를 기술하기 위해 비장세포를 추가적으로 세포 표면 마커 (CD3, CD4, CD8, CD25, 및 NKp46) 및 세포내 단백질 (FoxP3)에 대한 항체로 염색하였다. 그래프는 지시된 바이러스에 의해 분비된 hIL-2, hIL-2 변이체, 또는 hIL-2 당변이체 단백질의 증가하는 처리 농도 (x-축)에 반응하여 pSTAT5의 세포내 염색의 중위 형광 강도 (MFI) 값의 변화 (y-축)를 제시한다. 약어: pSTAT5= 인산화된 신호 전달제 및 전사의 활성화제 5; MFI= 중위 형광 강도; Treg= CD3+CD4+CD25+Foxp3+ T 조절 세포.
도 30. 이식 후 제11일에 비히클 또는 바이러스로의 처리 후의 MC38 종양-이식된 C57BL/6 암컷 마우스의 체중.
도 31. 5e7 pfu 재조합 WR 백시니아 바이러스로의 IV 주사 후 72 hr (제14일)에 MC38 종양-보유 C57BL/6 암컷 마우스로부터 수집된 혈청에서 검출된 IL-2 수준. 통계를 *=p<0.05; **=p<0.01 및 *** =p<0.001로 VV99와 비교하여 터키(Tukey) 사후 다중 그룹 비교 검정을 갖는 1-원 Anova 검정을 사용하여 수행하였다.
도 32. 표 3. 5e7 pfu 재조합 WR 백시니아 바이러스로의 IV 주사 후 72 hr (제14일)에 MC38 종양-보유 C57BL/6 암컷 마우스로부터 수집된 혈청에서 검출된 염증성 시토카인 수준. 각각의 칼럼은 지정된 시토카인에 대한 기하 평균 시토카인 수준 (N=10/시험 그룹)을 제시한다. *=p<0.05; **=p,0.01; +=p<0.001; ^=p<0.0001
도 33. MC38 종양 세포로 SC 이식된 C57BL/6 암컷 마우스에 대한 단일 (제11일에 투여된) IV 바이러스 전달을 사용한 바이러스요법-유도된 종양 성장 억제의 평가.
도 34. 표 4. 피하 MC38 종양 모델 연구를 위한 ANCOVA를 사용한 바이러스요법-유도된 종양 성장 억제의 통계적 비교. 볼드체의 값은 p 값 ≤ 0.05가 관찰된 비교 ANCOVA 결과를 나타낸다.
도 35. SC 종양 이식 후 제11일에 재조합 종양용해성 백시니아 바이러스로의 IV 처리 후의 MC38 종양-보유 C57BL/6 암컷 마우스의 생존. 각각의 그룹의 곡선 및 수평 파선 사이의 교차점은 그룹에 대한 중위 (50%) 생존 역치를 지시한다.
도 36. 표 5. 피하 MC38 종양 모델 연구에서의 바이러스요법 후의 생존의 통계적 비교. 도 35로부터의 생존 데이터를 로그-순위 검정 (만텔-콕스)에 의해 분석하였다. P 값은 선택 바이러스 그룹 사이의 로그-순위 검정 (만텔-콕스) 비교의 통계적 결과를 나타낸다.
도 37. HCT-116 종양 세포로 SC 이식된 누드 암컷 마우스에 대한 바이러스요법-유도된 종양 성장 억제의 평가. 각각의 처리 그룹에 대한 평균 종양 부피 (mm3)는 종양 이식 후 제43일까지 제시되어 있다. 각각의 그래프 상의 수직 파선은 마우스가 비히클 또는 바이러스의 IV 주사를 받은 시점을 나타낸다.
도 38. 표 6. 누드 마우스에서의 피하 HCT-116 종양에 대한 ANCOVA를 사용한 바이러스요법-유도된 종양 성장 억제의 통계적 비교. 볼드체의 값은 p 값 ≤ 0.05가 관찰된 비교 ANCOVA 결과를 나타낸다.
도 39. HCT-116 종양 세포로 SC 이식된 누드 암컷 마우스에 대한 바이러스요법-유도된 생존의 평가. 종양이 2000mm3에 도달하면 안락사를 수행하였다. 각각의 그래프 상의 수직 파선은 마우스가 비히클 또는 바이러스 (3E6 PFU)의 IV 주사를 받은 시점을 나타낸다. 그래프 상의 수평 파선은 50 퍼센트 생존, 또는 중위 생존을 나타낸다.
도 40. 표 7. HCT-116 종양 세포로 SC 이식된 누드 암컷 마우스에서의 바이러스요법-유도된 생존의 통계적 비교. P 값은 각각의 그룹 비교를 위해 열거된다.
도 41. MC38 종양 세포로 SC 이식된 C57BL/6 암컷 마우스에 대한 단일 (제16일) IV 바이러스 전달을 사용한 바이러스요법-유도된 종양 성장 억제의 평가.
도 42. 표 8. 피하 MC38 종양 모델 연구를 위한 ANCOVA를 사용한 바이러스요법-유도된 종양 성장 억제의 통계적 비교. 볼드체의 값은 p 값 ≤ 0.05가 관찰된 비교 ANCOVA 결과를 나타낸다.
도 43. SC 종양 이식 후 제16일에 재조합 종양용해성 백시니아 바이러스로의 IV 처리 후의 MC38 종양-보유 C57BL/6 암컷 마우스의 생존. P 값은 선택 바이러스 그룹 사이의 로그-순위 검정 (만텔-콕스) 비교의 통계적 결과를 나타낸다.
도 44. 표 9. 바이러스요법-유도된 생존의 통계적 비교. 생존을 모니터링하고, 이어서 로그-순위 검정 (만텔-콕스)에 의해 분석하였다. P 값은 각각의 그룹 비교를 위해 열거된다.
도 45. 항-PD-1 항체 처리와 조합으로 B16F10 종양 세포로 SC 이식된 C57BL/6 암컷 마우스에 대한 단일 (제18일) IV 바이러스 전달을 사용한 바이러스요법-유도된 종양 성장 억제의 평가.
도 46. 표 10. 피하 B16F10 종양 모델 연구를 위한 ANCOVA를 사용한 바이러스요법-유도된 종양 성장 억제의 통계적 비교. 볼드체의 값은 p 값 ≤ 0.05가 관찰된 비교 ANCOVA 결과를 나타낸다.
도 47. SC 종양 이식 후 제18일에 재조합 종양용해성 백시니아 바이러스로의 IV 처리 후의 B16F10 종양-보유 C57BL/6 암컷 마우스의 생존.
도 48. 표 11. B16F10 종양 모델에서의 바이러스요법-유도된 생존의 통계적 비교. 생존을 모니터링하고, 이어서 로그-순위 검정 (만텔-콕스)에 의해 분석하였다. P 값은 각각의 그룹 비교를 위해 열거된다.
도 49는 Fc 도메인에 공유 연결된 IL-2 변이체를 포함하는 IL-2 변이체 융합 단백질을 도시하는 개략도를 도시한다. Fc 도메인은 제1 Fc 쇄 및 제2 Fc 쇄를 함유하고, 여기서 제1 Fc 쇄는 "놉" 아미노산 치환을 함유하고, 제2 Fc 쇄는 "홀" 아미노산 치환을 함유한다. IL-2 변이체의 N-말단은 링커를 통해 제1 Fc 쇄의 C-말단에 공유 연결된다.
도 50a-50b는 ELISA에 의해 결정된 바와 같은, HH 세포 (도 50a) 및 iTreg 세포 (도 50b)에서의 pSTAT5 수준에 대한 다양한 농도의 상이한 IL-2 융합 단백질의 효과를 요약하는 그래프를 도시한다. 도 50a 및 50b 둘 다에 대한 IL-2 변이체 융합 단백질은 도 50b에 열거된다. X-축은 IL-2 융합 단백질 농도 (nM)를 제시하고, Y-축은 pSTAT5 광학 밀도 (OD)를 제시한다.
도 51a-c는 유동 세포계측법에 의해 결정된 바와 같은, CD8 T 세포 (도 51a), NK 세포 (도 51b), 및 Treg 세포 (도 51c)에서의 pSTAT5 수준에 대한 다양한 농도의 상이한 IL-2 융합 단백질의 효과를 요약하는 그래프를 도시한다. 도 51a, 51b, 및 51c에 대한 IL-2 변이체 융합 단백질은 도 51c에 열거된다. X-축은 IL-2 융합 단백질 농도 (nM)를 제시하고, Y-축은 pSTAT5 평균 형광 강도 (MFI)를 제시한다.
도 52a-c는 유동 세포계측법에 의해 결정된 바와 같은, CD8 T 세포 (도 52a), NK 세포 (도 52b), 및 Treg 세포 (도 52c)에서의 pSTAT5 수준에 대한 다양한 농도의 상이한 IL-2 융합 단백질의 효과를 요약하는 그래프를 도시한다. 도 52a, 52b, 및 52c에 대한 IL-2 변이체 융합 단백질은 도 52c에 열거된다. X-축은 IL-2 융합 단백질 농도 (nM)를 제시하고, Y-축은 pSTAT5 평균 형광 강도 (MFI)를 제시한다.
도 53a-c는 유동 세포계측법에 의해 결정된 바와 같은, CD8 T 세포 (도 53a), NK 세포 (도 53b), 및 Treg 세포 (도 53c)에서의 pSTAT5 수준에 대한 다양한 농도의 상이한 IL-2 융합 단백질의 효과를 요약하는 그래프를 도시한다. 도 53a, 53b, 및 53c에 대한 IL-2 변이체 융합 단백질은 도 53c에 열거된다. X-축은 IL-2 융합 단백질 농도 (nM)를 제시하고, Y-축은 pSTAT5 평균 형광 강도 (MFI)를 제시한다.
도 54a-c는 유동 세포계측법에 의해 결정된 바와 같은, CD8 T 세포 (도 54a), NK 세포 (도 54b), 및 Treg 세포 (도 54c)에서의 pSTAT5 수준에 대한 다양한 농도의 상이한 IL-2 융합 단백질의 효과를 요약하는 그래프를 도시한다. 도 54a, 54b, 및 54c에 대한 IL-2 변이체 융합 단백질은 도 54c에 열거된다. X-축은 IL-2 융합 단백질 농도 (nM)를 제시하고, Y-축은 pSTAT5 평균 형광 강도 (MFI)를 제시한다.
도 55a-c는 유동 세포계측법에 의해 결정된 바와 같은, CD8 T 세포 (도 55a), NK 세포 (도 55b), 및 Treg 세포 (도 55c)에서의 pSTAT5 수준에 대한 다양한 농도의 상이한 IL-2 융합 단백질의 효과를 요약하는 그래프를 도시한다. 도 55a, 55b, 및 55c에 대한 IL-2 변이체 융합 단백질은 도 55c에 열거된다. X-축은 IL-2 융합 단백질 농도 (nM)를 제시하고, Y-축은 pSTAT5 평균 형광 강도 (MFI)를 제시한다.
도 56a-c는 CD8 T 세포 (도 56a), NK 세포 (도 56b), 및 Treg 세포 (도 56c)의 확장에 대한 다양한 농도의 상이한 IL-2 융합 단백질의 효과를 요약하는 그래프를 도시한다. X-축은 IL-2 융합 단백질 (각각 3가지 상이한 농도에서)을 제시하고, Y-축은 세포의 배수-확장을 제시한다.
도 57a-b는 마우스에서의 상이한 IL-2 융합 단백질의 내약성 (도 57a) 및 종양 성장 억제 활성 (도 57b)을 제시한다. 도 57a에서, X-축은 처리 후 일수를 제시하고, Y-축은 마우스의 퍼센트 생존을 제시한다. 상이한 단백질에 대한 생존 데이터는 하기 기호로 주석된 선과 함께 도시되어 있다: 채워진 원: PBS (단백질 없음); 비어 있는 원: Fc-IL2; 채워진 삼각형: Fc-IL2v; 비어 있는 삼각형: Fc-IL2-K43N:Y45T; 채워진 정사각형: Fc-IL2-R38N:L40T-K43N:Y45T; 비어 있는 정사각형: Fc-IL2-K43N:Y45T-L72N:Q74T. 도 57b에서, X-축은 처리 후 일수를 제시하고, Y-축은 종양 부피 (mm3)를 제시한다. 상이한 단백질에 대한 데이터는 하기 기호로 주석된 선과 함께 도시되어 있다: 별표: PBS (단백질 없음); "X": Fc-IL2-R38N:L40T-K43N:Y45T; "O": Fc-IL2-K43N:Y45T-L72N:Q74T.
도 58. 감염 후 48, 72, 및 96시간에서의 VV110 또는 VV12 (JX-594)에 의해 유도된 최대 인간 종양 세포 살해. 데이터는 평균 ± SD로서 나타내어진다.
도 59. 감염 후 48, 72, 및 96 hr에서의 VV110 또는 VV12 (JX-594)에 의해 유도된 인간 종양 세포주에서의 VV110 및 VV12의 효력. 데이터는 평균 ± SD로서 나타내어진다.
도 60. 인간 종양 세포주에서의 VV110 및 VV12의 상대 효력 (EC50 비). 데이터는 평균 ± SD로서 나타내어진다.
도 61. 국소 아시클로비르 처리와 함께 또는 없이, 시노몰구스 원숭이에의 VV110의 IV 투여 후에 발생한 자발적 피부 병변으로부터의 감염성 바이러스 역가. 스왑을 국소 아시클로비르 투여 없이 (그룹 1) 또는 그와 함께 (그룹 2) 5x107 PFU VV110을 IV로 받은 동물 상의 개별적 피부 병변으로부터 수집하였다.
A. 정의
용어 "항체"는 표적 항원, 예컨대 탄수화물, 폴리뉴클레오티드, 지질, 폴리펩티드 등에 특이적으로 결합할 수 있는 이뮤노글로불린 분자를 지칭한다. 이뮤노글로불린의 5가지 주요 부류: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM이 있으며, 이들 중 몇몇은 하위부류 (이소타입), 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 추가로 나누어질 수 있다. 이뮤노글로불린의 상이한 부류에 상응하는 중쇄 불변 영역은 각각 알파, 델타, 엡실론, 감마, 및 뮤로 지칭된다. 이뮤노글로불린의 상이한 부류의 서브유닛 구조 및 3차원 형태는 널리 공지되어 있다. 전체 IgG 항체 분자는 2개의 동일한 중쇄 및 2개의 동일한 경쇄를 함유한다. 중쇄 및 경쇄의 각각은 가변 영역 및 불변 영역을 함유한다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 각각 초가변 영역으로도 공지된 3개의 상보성 결정 영역 (CDR)에 의해 연결된 4개의 프레임워크 영역 (FR)으로 이루어지며, 항체의 항원 결합 부위의 형성에 기여한다. 본원에 사용된 용어 "항체"는 전체 폴리클로날 또는 모노클로날 항체 뿐만 아니라, 달리 특정되지 않는 한, 특이적 결합에 대해 무손상 항체와 경쟁하는 임의의 그의 항원 결합 부분, 항원 결합 부분을 포함하는 융합 단백질, 및 항원 인식 부위를 포함하는 이뮤노글로불린 분자의 임의의 다른 변형된 형태를 포괄한다. 항원 결합 부분은 예를 들어, Fab, Fab', F(ab')2, Fd, Fv, 도메인 항체 (dAb, 예를 들어, 상어 및 낙타 항체), 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함하는 단편, 단일 쇄 가변 단편 항체 (scFv), 맥시바디, 미니바디, 인트라바디, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, v-NAR 및 비스-scFv, 및 폴리펩티드에 대한 특이적 항원 결합을 부여하는데 충분한 이뮤노글로불린의 적어도 일부를 함유하는 폴리펩티드를 포함한다.
용어 "축중성 변이체"는 참조 핵산 서열에 비해 염기의 치환을 갖지만 참조 핵산 서열과 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열을 지칭한다.
용어 "유효량"은 포유동물에서 바람직한 효과를 유발하는데 충분한 포유동물에게 투여되는 양을 지칭한다.
용어 "Fc 영역" 또는 "Fc 쇄"는 이뮤노글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 지칭한다. "Fc 영역"은 천연 서열 Fc 영역 또는 변이체 Fc 영역일 수 있다. 이뮤노글로불린 중쇄의 Fc 영역의 경계는 다양할 수 있지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 통상적으로 위치 Cys226에서의 아미노산 잔기로부터, 또는 Pro230으로부터 그의 카르복실-말단까지의 스트레치에 한정된다. Fc 영역에서의 잔기의 넘버링은 카바트(Kabat)에서와 같은 EU 인덱스의 것이다. Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991. 이뮤노글로불린의 Fc 영역은 일반적으로 2개의 불변 도메인, 즉, CH2 및 CH3을 포함한다. 관련 기술분야에 공지된 바와 같이, Fc 영역은 이량체 또는 단량체성 형태로 존재할 수 있다.
용어 "Fc 도메인"은 2개의 Fc 영역 / Fc 쇄를 포함하는 항체의 영역을 지칭한다. 예를 들어, 표준 IgG 형식에서, 항체는 2개의 중쇄를 가지며, 이들 둘 다는 Fc 영역 / Fc 쇄를 갖는다. 집합적으로, 2개의 Fc 영역 / Fc 쇄는 본원에서 "Fc 도메인"으로 지칭된다.
용어 "숙주 세포"는 폴리뉴클레오티드 삽입물의 혼입을 위한 벡터(들)에 대한 수용자일 수 있거나 수용자였던 개별적 세포 또는 세포 배양물을 지칭한다. 숙주 세포는 단일 숙주 세포의 자손을 포함하며, 자손은 자연적, 우연적, 또는 고의적 돌연변이로 인해 원래 모 세포에 대해 반드시 완전히 동일하지는 않을 수 있다 (형태학에 있어서 또는 게놈 DNA 상보체에 있어서). 숙주 세포는 본 발명의 폴리뉴클레오티드(들)로 생체내에서 형질감염된 세포를 포함한다.
용어 "면역-이펙터-세포 증진제" 또는 "IEC 증진제"는 포유동물의 면역 이펙터 세포의 하나 이상의 유형의 수, 질, 또는 기능을 증가시키거나 증진시킬 수 있는 물질을 지칭한다. 면역 이펙터 세포의 예는 세포용해성 CD8 T 세포, CD4 T 세포, NK 세포, 및 B 세포를 포함한다.
용어 "면역-억제성-세포 억제제" 또는 "ISC 억제제"는 포유동물의 면역 억제성 세포의 수 또는 기능을 감소시키거나 억제할 수 있는 물질을 지칭한다. 면역 억제성 세포의 예는 조절 T 세포 ("Treg"), 골수-유래된 서프레서 세포, 및 종양-연관된 대식세포를 포함한다.
용어 "면역 조정제"는 숙주 포유동물의 선천성, 체액성 또는 세포성 면역계의 임의의 성분의 면역 반응 (본원에 정의된 바와 같음) 또는 작용을 변경시킬 (예를 들어, 억제하거나, 감소시키거나, 증가시키거나, 증진시키거나, 자극시킬) 수 있는 물질을 지칭한다. 따라서, 용어 "면역 조정제"는 본원에 정의된 바와 같은 "면역-이펙터-세포 증진제" 및 본원에 정의된 바와 같은 "면역-억제성-세포 억제제", 뿐만 아니라 포유동물의 면역계의 다른 성분에 영향을 미치는 물질을 포괄한다.
용어 "면역 반응"은 숙주 포유동물의 면역계에 의한 특정 물질 (예컨대 항원 또는 면역원)에 대한 임의의 검출가능한 반응, 예컨대 선천성 면역 반응 (예를 들어, 톨(Toll) 수용체 신호전달 캐스케이드의 활성화), 세포-매개된 면역 반응 (예를 들어, T 세포, 예컨대 항원-특이적 T 세포, 및 면역계의 비-특이적 세포에 의해 매개되는 반응), 및 체액성 면역 반응 (예를 들어, B 세포에 의해 매개되는 반응, 예컨대 혈장, 림프, 및/또는 조직 유체 내로의 항체의 생성 및 분비)을 지칭한다.
본원에서 상호교환가능하게 사용되는 용어 "개체", "대상체", "숙주", 및 "환자"는 뮤린 (예를 들어, 래트, 마우스), 토끼목 (예를 들어, 토끼), 비-인간 영장류, 인간, 개, 고양이, 유제류 (예를 들어, 말, 소, 양, 돼지, 염소)를 포함하나 이에 제한되지는 않는 포유동물을 지칭한다.
용어 "신생물성 장애"는 세포가 비정상적으로 높고 비제어된 속도로 증식하는 상태를 지칭하며, 속도는 주위의 정상 조직의 그것을 초과하고 그것과 비조화된다. 이는 통상적으로 "종양"으로 공지된 고형 병변 또는 덩어리를 발생시킨다. 이 용어는 양성 및 악성 신생물성 장애를 포괄한다. 본 개시내용에서 용어 "암"과 상호교환가능하게 사용되는 용어 "악성 신생물성 장애"는 신체 내의 다른 위치로 확산하는 종양 세포의 능력 ("전이"로 공지됨)을 특징으로 하는 신생물성 장애를 지칭한다. 용어 "양성 신생물성 장애"는 종양 세포가 전이하는 능력을 결여한 신생물성 장애를 지칭한다.
용어 "종양용해성" 바이러스는 정상 (비-암성) 세포에 비해 암 세포를 우선적으로 감염시키고 살해하는 바이러스를 지칭한다.
본원에서 상호교환가능하게 사용되는 용어 "폴리뉴클레오티드" 및 "핵산"은 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드 중 어느 하나인, 임의의 길이의 뉴클레오티드의 중합체성 형태를 지칭한다. 따라서, 이 용어는 단일-, 이중-, 또는 다중-가닥 DNA 또는 RNA, 게놈 DNA, cDNA, DNA-RNA 하이브리드, 또는 퓨린 및 피리미딘 염기 또는 다른 천연, 화학적으로 또는 생화학적으로 변형된, 비-천연, 또는 유도체화된 뉴클레오티드 염기를 포함하는 중합체를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
용어 "예방하는" 또는 "예방하다"는 (a) 장애가 발생하지 못하게 하는 것 또는 (b) 장애의 발병 또는 장애의 증상의 발병을 지연시키는 것을 지칭한다.
용어 "복제-적격" 바이러스는 특정 숙주 세포를 감염시키고 그 내에서 복제할 수 있는 바이러스를 지칭한다.
용어 "재조합" 바이러스는 바이러스 게놈에 대한 변화를 도입하기 위해 및/또는 바이러스 단백질에 대한 변화를 도입하기 위해, 시험관내에서, 예를 들어, 재조합 핵산 기술을 사용하여 조작된 바이러스를 지칭한다. 예를 들어, 재조합 바이러스는 야생형, 내인성 핵산 서열 및 돌연변이체 및/또는 외인성 핵산 서열 둘 다를 포함할 수 있다. 재조합 바이러스는 또한 변형된 단백질 성분을 포함할 수 있다. "재조합 백시니아 바이러스"는 백시니아 바이러스 게놈 백본에 기반하여 변형되거나 구축된 재조합 바이러스를 지칭한다.
용어 "치료", "치료하는" 등은 바람직한 약리학적 및/또는 생리학적 효과를 얻는 것, 예컨대 장애를 억제하는 것, 즉, 그의 발달을 정지시키는 것, 장애를 완화시키는 것, 즉, 장애의 퇴행을 유발하는 것, 장애의 중증도를 감소시키는 것, 또는 장애의 증상의 발생 빈도를 감소시키는 것을 지칭한다.
용어 "치료 유효량" 또는 "유효량"은 질환을 치료하기 위해 대상체에게 투여되는 경우, 의도된 효과, 질환에 대한 이러한 치료를 유발하는데 충분한 작용제 (예를 들어, 본 개시내용의 복제-적격, 재조합 종양용해성 백시니아 바이러스)의 양, 또는 2종 이상의 작용제 (예를 들어, 본 개시내용의 복제-적격, 재조합 종양용해성 백시니아 바이러스 및 제2 치료제)의 조합된 양을 지칭한다. "치료 유효량"은 작용제(들), 질환 및 그의 중증도 및 치료되는 대상체의 연령, 중량 등에 따라 다양할 것이다.
용어 "인터류킨-2" 또는 "IL-2"는 임의의 포유동물 종, 예컨대 인간, 개, 고양이, 말, 및 소의 야생형 인터류킨-2 단백질을 지칭한다. 한 예시적인 야생형 인간 IL-2는 유니프롯(Uniprot) 수탁 번호 P60568로서 발견된다. 전장, 야생형 인간 IL-2의 아미노산 서열은 서열식별번호: 21에 제공된다. 전장 야생형 인간 IL-2는 IL-2 단백질의 성숙 동안 제거되는 신호 펩티드 (최초 20개의 아미노산)를 함유한다. 신호 펩티드를 함유하지 않는 인간 IL-2의 성숙한, 활성 형태의 아미노산 서열은 서열식별번호: 1 (APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT)에 제공된다. 달리 언급되지 않는 한, 인간 IL-2 서열에서 특정 아미노산에 대한 본원의 모든 언급은 성숙한 IL-2 단백질의 아미노산 서열 (즉, 서열식별번호: 1)에 따라 넘버링된 아미노산에 대한 것이다. 예를 들어, IL-2 R38 잔기는 서열식별번호: 1에 제시된 바와 같은 아미노산 서열에서 제38 잔기 (R)를 지칭한다. 서열식별번호: 1의 아미노산 서열에서 R38 잔기는 서열식별번호: 21의 아미노산에서 R58에 상응함이 이해되어야 한다.
용어 "변이체 IL-2", "IL-2 변이체", 또는 "IL-2v"는 달리 언급되지 않는 한, 야생형 IL-2 단백질의 아미노산 서열에 비해 1개 이상의 아미노산 치환을 함유하고, 야생형 IL-2 단백질의 활성의 적어도 일부를 보유하는 폴리펩티드를 지칭한다.
용어 "IL-2 수용체 알파"는 IL-2 수용체의 알파 폴리펩티드 쇄를 지칭한다. "IL-2 수용체 알파"는 "IL-2Ra", "IL-2R 알파", "IL-2Ra", 및 "CD25"로도 공지되어 있으며, 본원에서 그렇게 지칭된다. 한 예시적인 야생형 인간 IL-2R 알파 아미노산 서열은 유니프롯 수탁 번호 P01589로서 발견된다.
용어 "IL-2 수용체 베타"는 IL-2 수용체의 베타 폴리펩티드 쇄를 지칭한다. "IL-2 수용체 베타"는 "IL-2Rb", "IL-2R 베타", "IL-2Rb", 및 "CD122"로도 공지되어 있으며, 본원에서 그렇게 지칭된다. 한 예시적인 야생형 인간 IL-2R 베타 아미노산 서열은 유니프롯 수탁 번호 P14784로서 발견된다.
용어 "IL-2 수용체 감마"는 IL-2 수용체의 감마 폴리펩티드 쇄를 지칭한다. "IL-2 수용체 감마"는 "IL-2Rγ", "IL-2R 감마", "IL-2Rg", 및 "CD132"로도 공지되어 있으며, 본원에서 그렇게 지칭된다. 한 예시적인 야생형 인간 IL-2R 감마 아미노산 서열은 유니프롯 수탁 번호 P31785로서 발견된다.
용어 "폴리펩티드", "올리고펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 임의의 길이의 아미노산의 쇄를 지칭하기 위해 본원에서 상호교환가능하게 사용된다. 쇄는 선형 또는 분지형일 수 있고/거나, 이는 변형된 아미노산을 포함할 수 있고/거나, 비-아미노산에 의해 중단될 수 있다. 상기 용어들은 또한 자연적으로 또는 개입; 예를 들어, 디술피드 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화, 또는 임의의 다른 조작 또는 변형, 예컨대 표지화 성분과의 접합에 의해 변형된 아미노산 쇄를 포괄한다. 또한, 예를 들어, 아미노산 (예를 들어, 비천연 아미노산 등을 포함함)의 1종 이상의 유사체, 뿐만 아니라 관련 기술분야에 공지된 다른 변형을 함유하는 폴리펩티드가 상기 정의 내에 포함된다. 폴리펩티드는 단일 쇄 또는 회합된 쇄로서 발생할 수 있음이 이해된다.
값의 범위가 제공되는 경우, 맥락이 명백하게 달리 나타내지 않는 한, 그 범위의 상한 및 하한 및 그 언급된 범위에서 임의의 다른 언급된 또는 개재하는 값 사이의, 하한의 단위의 1/10까지의 각각의 개재하는 값은 본 발명 내에 포함되는 것으로 이해된다. 이들 보다 작은 범위의 상한 및 하한은 독립적으로 보다 작은 범위에 포함될 수 있으며, 언급된 범위에서 임의의 구체적으로 제외된 한계를 조건으로, 또한 본 발명 내에 포함된다. 언급된 범위가 한계의 하나 또는 둘 다를 포함하는 경우, 그들 포함된 한계 중 어느 하나 또는 둘 다를 제외한 범위는 또한 본 발명에 포함된다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것들과 유사하거나 등가의 임의의 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 물질이 이제 기재된다. 본원에 언급된 모든 간행물은 본 개시내용에 대한 참조로 본원에 포함되며, 간행물이 인용하는 것에 관하여 방법 및/또는 물질을 기재한다.
본원에 및 첨부된 청구범위에 사용된 단수 형태는 맥락이 명백하게 달리 나타내지 않는 한, 복수 언급대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "백시니아 바이러스"에 대한 언급은 복수의 이러한 백시니아 바이러스를 포함하고, "변이체 IL-2 폴리펩티드"에 대한 언급은 1종 이상의 변이체 IL-2 폴리펩티드 및 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 그의 등가물에 대한 언급을 포함하는 등이다. 청구범위는 임의의 임의적 요소를 배제하도록 작성될 수 있음이 추가로 언급된다. 따라서, 이 진술은 청구항 요소의 나열 또는 "음성" 제한의 사용에 관하여 "오직", "단지" 등과 같은 배타적 용어의 사용을 위한 선행 기초로서 역할을 하는 것으로 의도된다.
명확성을 위해, 별개의 실시양태의 맥락에서 기재된 본 발명의 특정 특색은 또한 단일 실시양태에서 조합으로 제공될 수 있음이 인식된다. 반대로, 간결성을 위해, 단일 실시양태의 맥락에서 기재된 본 발명의 다양한 특색은 또한 별개로 또는 임의의 적합한 하위-조합으로 제공될 수 있다. 본 발명에 관련된 실시양태의 모든 조합은 구체적으로 본 발명에 의해 포함되며, 각각의 및 모든 조합이 개별적으로 및 명백하게 개시된 것처럼 본원에 개시된다. 또한, 다양한 실시양태 및 그의 요소의 모든 하위-조합은 또한 구체적으로 본 발명에 의해 포함되며, 각각의 및 모든 이러한 하위-조합이 개별적으로 및 명백하게 본원에 개시된 것처럼 본원에 개시된다.
본원에서 논의된 간행물은 오직 본 출원의 출원일 전의 그들의 개시내용에 대해서만 제공된다. 본원에서 어떠한 것도 본 발명이 이전 발명에 의해 이러한 간행물을 선행하는 것으로 자격이 주어지지 않는다는 인정으로서 해석되지 않아야 한다. 또한, 제공된 간행물의 날짜는 독립적으로 확인될 필요가 있을 수 있는 실제 간행 날짜와 상이할 수 있다.
B. IL-2 변이체 및 관련된 측면
B-1. IL-2 변이체
일부 제1 측면에서, 본 개시내용은 야생형 인간 IL-2 아미노산 서열과 비교하여 1개 이상의 아미노산 치환을 갖는 IL-2 변이체 (예를 들어, 인간 IL-2 변이체)를 제공한다. 일부 실시양태에서, IL-2 변이체는 하기 아미노산 위치 중 하나 이상에 성숙한 인간 야생형 IL-2 단백질 서열 (서열식별번호: 1)에 비해 1개 이상의 치환을 포함한다: T3, K35, R38, L40, T41, K43, Y45, E62, K64, L72, Q74, 및 C125.
일부 실시양태에서, IL-2 변이체는 하기 군의 위치 중 하나 이상에 아미노산 치환을 포함한다: R38 및 L40; T41 및 K43; K43 및 Y45; E62 및 K64; L72 및 Q74; R38, L40, K43, 및 Y45; K43, Y45, L72, 및 Q74; T3, R38, L40, K43, 및 Y45; T3, K43, Y45, L72, 및 Q74; R38, L40, K43, Y45, 및 C125; K43, Y45, L72, Q74, 및 C125; T3, R38, L40, K43, Y45, 및 C125; T3, K43, Y45, L72, Q74, 및 C125.
일부 실시양태에서, IL-2 변이체는 성숙한 인간 야생형 IL-2 단백질에 비해 하기 아미노산 치환 중 하나 이상을 포함한다: T3A, K35N, R38N, L40S, L40T, T41N, K43S, K43T, K43N, Y45S, Y45T, E62N, E62A, E62K, E62R, K64S, K64T, L72N, Q74S, Q74T, C125A, C125S. 일부 특정 실시양태에서, IL-2 변이체는 성숙한 인간 IL-2 단백질에 비해 하기 아미노산 치환 중 하나 이상을 포함한다: K35N, R38N, K43N, E62N, 또는 L72N.
일부 다른 실시양태에서, 본원에서 제공된 IL-2 변이체는 야생형 인간 IL-2 폴리펩티드와 비교하여 감소되거나 무시가능한 IL-2Rα에의 결합을 갖거나, 결합을 갖지 않는다. 본 발명의 IL-2 변이체는 추가로 야생형 인간 IL-2 폴리펩티드와 비교하여 감소된 고-친화도 IL-2 수용체 3차 복합체 (IL-2Rα + IL-2Rβ + IL-2Rγ를 함유함)에의 결합을 갖거나, 결합을 갖지 않는다. 본 발명의 IL-2 변이체는 중간-친화도 이량체성 IL-2 수용체 복합체 (IL-2Rβ + IL-2Rγ를 함유함)에 결합하는 능력을 보유한다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 IL-2 변이체에서 아미노산 치환은 IL-2 변이체 단백질에서 조작된 N-글리코실화 부위를 발생시킨다. N-글리코실화를 위한 컨센서스 서열은 3개의 아미노산 서열 N-x-S, N-x-T, S-x-N, 또는 T-x-N이고, 여기서 N은 아스파라긴이고, x는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산이고, S는 세린이고, T는 트레오닌이다. IL-2 아미노산 서열에서 조작된 N-글리코실화 부위를 생성하기 위해, 한 실시양태에서, 아스파라긴 (N) 치환은 야생형 세린 (S) 또는 트레오닌 (T) 잔기로부터 1개의 아미노산에 의해 분리된 위치에서 IL-2 아미노산 서열 내로 도입된다. 이 상황에서, 아미노산 서열 N-x-S, N-x-T, S-x-N, 또는 T-x-N이 IL-2 변이체에서 생성되고, 여기서 N은 아미노산 치환이고, T 또는 S는 야생형 아미노산이다. 또 다른 실시양태에서, S 또는 T 치환은 야생형 N 잔기로부터 1개의 아미노산에 의해 분리된 위치에서 IL-2 아미노산 서열 내로 도입된다. 이 상황에서, 아미노산 서열 N-x-S, N-x-T, S-x-N, 또는 T-x-N이 IL-2 변이체에서 생성되고, 여기서 T 또는 S는 아미노산 치환이고, N은 야생형 아미노산이다. 또 다른 실시양태에서, N 치환 및 S 또는 T 치환 둘 다는 서로로부터 1개의 아미노산에 의해 분리된 위치에서 IL-2 아미노산 잔기 내로 도입된다. 이 상황에서, 아미노산 서열 N-x-S, N-x-T, S-x-N, 또는 T-x-N이 IL-2 변이체에서 생성되고, 여기서 T 또는 S는 아미노산 치환이고, N은 또한 아미노산 치환이다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 IL-2 변이체는 IL-2 변이체 아미노산 서열에서 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 조작된 N-글리코실화 부위 / 컨센서스 서열을 생성하기 위해, 야생형 IL-2와 비교하여 다수의 치환을 가질 수 있다.
IL-2 아미노산 서열에서 1개 이상의 조작된 N-글리코실화 부위의 도입은 조작된 N-글리코실화 부위(들)에서 글리코실화될 수 있는 IL-2 변이체를 발생시킨다. 글리코실화는 올리고사카라이드 모이어티를 N (아스파라긴) 잔기에 연결하며; 이 올리고사카라이드는 "글리칸"으로도 지칭된다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 IL-2 변이체는 IL-2 변이체 내로 도입되는 조작된 N-글리코실화 부위의 수에 기반하여, "단일 글리칸" 또는 "이중 글리칸" 등으로 지칭된다. 예를 들어, 본원에 사용된 "단일 글리칸" IL-2 변이체는 1개의 조작된 글리코실화 부위를 갖는 IL-2 변이체를 지칭하고, "이중 글리칸" IL-2 변이체는 2개의 조작된 글리코실화 부위를 갖는 IL-2 변이체를 지칭한다.
일부 실시양태에서, 조작된 글리코실화 부위(들)에서 N 잔기의 글리코실화는 IL-2 변이체와 IL-2Rα의 상호작용을 억제한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 조작된 글리코실화 부위(들)에서 글리코실화되고, 야생형 IL-2와 비교하여 감소된 IL-2Rα에 대한 친화도를 갖는, IL-2 서열에서 1개 이상의 조작된 N-글리코실화 부위를 발생시키는 1개 이상의 아미노산 치환을 함유하는 IL-2 변이체가 본원에서 제공된다. 이론에 구애되지는 않지만, 조작된 N-글리코실화 부위 상의 첨가된 글리칸 기는 IL-2 및 IL-2Rα 사이의 상호작용을 입체적으로 차단함으로써 IL-2 및 IL-2Rα 사이의 결합을 방해하는 것으로 믿어진다. 따라서, 예를 들어, 조작된 N-글리코실화 부위가 치환 R38N 및 L40T를 도입함 (그에 의해 서열 N-x-T를 생성함)으로써 본원에서 제공된 IL-2 변이체 내로 도입되는 경우, 위치 38에서의 N 잔기는 글리코실화될 수 있다. 위치 38에서 조작된 N 잔기에 첨가된 글리칸 기는 IL-2 및 IL-2Rα 사이의 상호작용을 입체적으로 방해하는 것으로 믿어진다.
관심의 분자 (예를 들어 IL-2 변이체) 및 제2 분자 (예를 들어 IL-2Rα) 사이의 결합의 강도 / 결합 친화도는 관련 기술분야에 공지된 방법 (예를 들어 등온선 적정 열량측정법 (ITC) 또는 표면 플라스몬 공명 (SPR))에 의해 결정될 수 있다. 전형적으로, 결합 친화도는 "KD" 값 (평형 해리 상수)으로서 보고된다. 본원에 사용된 참조 분자 / 분석물 (예를 들어 야생형 IL-2)의 그것과 비교하여 관심의 분자 / 분석물 (예를 들어 IL-2 변이체) 및 리간드 (예를 들어 IL-2Rα) 사이의 "감소된 결합"은 관심의 분자가 참조 분자 및 리간드 사이의 결합 친화도보다 더 낮은 친화도로 리간드에 결합하는 상황을 지칭한다. KD 값에 대해, 보다 작은 수는 보다 강한 결합 친화도를 나타낸다 (예를 들어 1 nM의 KD는 5 nM의 KD보다 더 강한 결합 친화도이다). IL-2 변이체는 IL-2 변이체 및 IL-2Rα 사이의 상호작용에 대한 KD 값이 동일한 결합 조건 하에서 야생형 IL-2 및 IL-2Rα 사이의 상호작용에 대한 KD 값보다 더 큰 수인 경우, 야생형 IL-2와 비교하여 감소된 IL-2Rα에의 결합을 갖는다. 일부 실시양태에서, 야생형 IL-2의 그것과 비교하여 감소된 IL-2Rα에의 결합을 갖는 IL-2 변이체는 동일한 결합 조건 하에서 야생형 IL-2 및 IL-2Rα 사이의 상호작용의 KD 값보다 적어도 1.5, 2, 3, 5, 10, 15, 20, 50, 100, 200, 또는 500배 더 큰 KD 값을 갖는다. IL-2 변이체가 야생형 IL-2의 그것과 비교하여 감소된 IL-2Rα에의 결합을 갖는 상황에서, 일부 실시양태에서, a) 야생형 IL-2 - IL-2Rα 상호작용의 KD 값 대 b) IL-2 변이체 - IL-2Rα 상호작용의 KD 값 [즉, (야생형 IL-2 - IL-2Rα 상호작용의 KD 값) / (IL-2 변이체 - IL-2Rα 상호작용의 KD 값)]은 약 0.5, 0.25, 0.1, 0.05, 0.025, 0.01, 0.005, 0.0025, 또는 0.001 이하이다. 일부 실시양태에서, 야생형 IL-2의 그것과 비교하여 감소된 IL-2Rα에의 결합을 갖는 IL-2 변이체는 IL-2Rα에의 비-검출가능한 결합을 갖는 반면, 야생형 IL-2는 동일한 결합 조건 하에서 IL-2Rα에의 검출가능한 / 측정가능한 결합을 갖는다.
일부 실시양태에서, IL-2 변이체에서의 조작된 N-글리코실화 부위는 아미노산 치환 K35N에 의해 생성된다. K35N 치환 후, 조작된 IL-2 변이체의 아미노산 번호 35-37에 대한 아미노산 서열은 N35-L36-T37이다. 따라서, 컨센서스 N-글리코실화 부위 (N-x-T)는 N35 치환 및 야생형 T37 아미노산 잔기의 조합을 고려하여 K35N 치환에 의해 생성된다.
일부 실시양태에서, IL-2 변이체에서의 조작된 N-글리코실화 부위는 아미노산 치환 R38N 및 L40S 또는 L40T에 의해 생성된다. R38N 및 L40S 또는 L40T 치환 후, 조작된 IL-2 변이체의 아미노산 번호 38-40에 대한 아미노산 서열은 N38-M39-S40 또는 N38-M39-T40이다. 따라서, 컨센서스 N-글리코실화 부위 (N-x-T 또는 N-x-S)는 R38N 및 L40S 또는 L40T 치환에 의해 생성된다.
일부 실시양태에서, IL-2 변이체에서의 조작된 N-글리코실화 부위는 아미노산 치환 T41N 및 K43S 또는 K43T에 의해 생성된다. T41N 및 K43S 또는 K43T 치환 후, 조작된 IL-2 변이체의 아미노산 번호 41-43에 대한 아미노산 서열은 N41-F42-S43 또는 N41-F42-T43이다. 따라서, 컨센서스 N-글리코실화 부위 (N-x-T 또는 N-x-S)는 T41N 및 K43S 또는 K43T 치환에 의해 생성된다.
일부 실시양태에서, IL-2 변이체에서의 조작된 N-글리코실화 부위는 아미노산 치환 K43N 및 Y45S 또는 Y45T에 의해 생성된다. K43N 및 Y45S 또는 Y45T 치환 후, 조작된 IL-2 변이체의 아미노산 번호 43-45에 대한 아미노산 서열은 N43-F44-S45 또는 N43-F44-T45이다. 따라서, 컨센서스 N-글리코실화 부위 (N-x-T 또는 N-x-S)는 K43N 및 Y45S 또는 Y45T 치환에 의해 생성된다.
일부 실시양태에서, IL-2 변이체에서의 조작된 N-글리코실화 부위는 아미노산 치환 E62N 및 K64S 또는 K64T에 의해 생성된다. E62N 및 K64S 또는 K64T 치환 후, 조작된 IL-2 변이체의 아미노산 번호 62-64에 대한 아미노산 서열은 N62-L63-S64 또는 N62-L63-T64이다. 따라서, 컨센서스 N-글리코실화 부위 (N-x-T 또는 N-x-S)는 E62N 및 K64S 또는 K64T 치환에 의해 생성된다.
일부 실시양태에서, IL-2 변이체에서의 조작된 N-글리코실화 부위는 아미노산 치환 L72N 및 Q74S 또는 Q74T에 의해 생성된다. L72N 및 Q74S 또는 Q74T 치환 후, 조작된 IL-2 변이체의 아미노산 번호 72-74에 대한 아미노산 서열은 N72-A73-S74 또는 N72-A73-T74이다. 따라서, 컨센서스 N-글리코실화 부위 (N-x-T 또는 N-x-S)는 L72N 및 Q74S 또는 Q74T 치환에 의해 생성된다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 아미노산 치환은 조작된 컨센서스 N-글리코실화 부위의 일부가 아니지만, 치환은 또한 IL-2 및 IL-2Rα 사이의 결합 친화도를 감소시킨다. 예를 들어, 치환 E62A, E62K, 및 E62R은 IL-2 및 IL-2Rα 사이의 결합 친화도를 감소시키지만, 컨센서스 N-글리코실화 부위의 일부가 아니다. 또 다른 예에서, 치환 E62N은 또한 위치 K64에서의 치환 없이 도입될 수 있다 (즉, E62N 치환이 조작된 컨센서스 N-글리코실화 부위를 생성하지 않으면서 도입되도록). 이들 치환은 예를 들어, IL-2 변이체에서 1개 이상의 조작된 컨센서스 N-글리코실화 부위(들)를 생성하는 본원에서 제공된 다른 아미노산 치환과 조합될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 아미노산 치환은 IL-2 변이체의 동질성을 증가시킨다. 예를 들어, 위치 T3 또는 C125에서의 치환 (예를 들어, T3A, T3G, C125A, 또는 C125S)은 IL-2 단백질의 동질성을 증가시킬 수 있고, 예를 들어, IL-2 변이체에서 1개 이상의 조작된 컨센서스 N-글리코실화 부위(들)를 생성하는 및/또는 IL-2 및 IL-2Rα 사이의 결합 친화도를 감소시키는 본원에서 제공된 다른 아미노산 치환과 조합될 수 있다.
B-2. IL-2 변이체를 포함하는 융합 분자
일부 실시양태에서, 또 다른 단백질, 예컨대 항체 또는 항체의 Fc-영역에 연결된 본 개시내용에 의해 제공된 IL-2 변이체를 포함하는 IL-2 융합 단백질이 본원에서 제공된다. 일부 추가의 실시양태에서, 본 개시내용에 의해 제공된 IL-2 변이체 및 2개의 항체 Fc-영역을 포함하는 IL-2 이종이량체성 단백질이 본원에서 제공되고, 여기서 IL-2 변이체는 Fc 영역 중 하나에 연결되고, 2개의 Fc 영역은 디술피드 결합에 의해 공유 연결된다. IL-2 융합 단백질 및 이종이량체성 단백질은 집합적으로 IL-2 "융합 분자"로 지칭된다. 이들 IL-2 융합 분자는 IL-2 변이체 단백질 단독과 비교하여 개선된 또는 추가의 특성, 예컨대 증가된 안정성 또는 생체내 반감기를 가질 수 있다. 또 다른 예에서, IL-2 융합 분자는 항체의 Fc 영역, 중쇄, 또는 경쇄에 공유 연결된 본원에서 제공된 IL-2 변이체를 포함한다. 이들 IL-2 변이체-항체 융합 단백질은 항체의 의해 인식되는 항원을 함유하는 특이적 세포 유형 또는 조직 (예를 들어 종양 세포)에 표적화될 수 있다. 따라서, 이들 IL-2 변이체-항체 융합 단백질은 IL-2 변이체의 표적 / 말초 노출을 최소화하고, 따라서 IL-2 관련된 독성을 최소화하면서 IL-2 변이체를 바람직한 세포 유형 또는 조직 유형에 전달할 수 있다.
일부 실시양태에서, IL-2 융합 단백질은 항체 및 IL-2 변이체 사이에 폴리펩티드 링커 (예를 들어, 이종 또는 상동 서열)를 포함한다. 폴리펩티드 링커는 항체의 아미노 말단에서, 카르복실 말단에서, 또는 아미노 및 카르복실 말단 둘 다에서 연결되거나 접합될 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 링커는 글리신-세린 (GS)-링커이다.
본원에서 제공된 IL-2 융합 단백질에 유용한 항체는 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 항체 단편 (예를 들어, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fc 등), 키메라 항체, 이중특이적 항체, 이종접합체 항체, 단일 쇄 (ScFv), 그의 돌연변이체, 항체 부분을 포함하는 융합 단백질 (예를 들어, 도메인 항체), 인간화 항체, 및 항체의 글리코실화 변이체, 항체의 아미노산 서열 변이체, 및 공유 변형된 항체를 포함한, 요구되는 특이성의 항원 인식 부위를 포함하는 이뮤노글로불린 분자의 임의의 다른 변형된 형태일 수 있다. 항체는 뮤린, 래트, 인간, 또는 임의의 다른 기원 (키메라 또는 인간화 항체를 포함함)일 수 있다.
일부 실시양태에서, 항체는 IgG1, IgG2, IgG2Δa, IgG4, IgG4Δb, IgG4Δc, IgG4 S228P, IgG4Δb S228P, 및 IgG4Δc S228P로 이루어진 군으로부터 선택된 이소타입을 갖는다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 IL-2 융합 단백질의 항체는 Fc 도메인을 포함하며, 예컨대 Fc 도메인은 인간 IgG1, IgG2, 또는 IgG4일 수 있다.
일부 실시양태에서, 항체는 힌지 영역에서 위치 223, 임의로 225, 및 228 (예를 들어, (C223E 또는 C223R), (E225R), 및 (P228E 또는 P228R))에 및 인간 IgG2의 CH3 영역에서 위치 409 또는 368 (예를 들어, K409R 또는 L368E (EU 넘버링 스킴))에 아미노산 변형을 포함한다. 일부 다른 실시양태에서, 항체는 힌지 영역에서 위치 221 및 228 (예를 들어, (D221R 또는 D221E) 및 (P228R 또는 P228E))에 및 인간 IgG1의 CH3 영역에서 위치 409 또는 368 (예를 들어, K409R 또는 L368E (EU 넘버링 스킴))에 아미노산 변형을 포함한다. 추가의 다른 실시양태에서, 항체는 인간 IgG1의 CH3 영역에서 위치 349, 354, 366, 368, 및/또는 407 (EU 넘버링 스킴)에 아미노산 변형, 예를 들어, Y349C, S354C, T366W, T366S, L368A, 및/또는 Y407V를 포함한다. 일부 다른 실시양태에서, 항체는 힌지 영역에서 위치 228 (예를 들어, (S228D, S228E, S228R, 또는 S228K))에 및 인간 IgG4의 CH3 영역에서 위치 409 또는 368 (예를 들어, R409K, R409, 또는 L368E (EU 넘버링 스킴))에 아미노산 변형을 포함한다. 일부 다른 실시양태에서, 항체는 인간 IgG2의 위치 265 (예를 들어, D265A), 330 (예를 들어, A330S), 및 331 (예를 들어, P331S) 중 하나 이상에; 또는 인간 IgG1의 하나 이상의 위치 234 (예를 들어, L234A), 235 (예를 들어, L235A), 및 237 (예를 들어, G237A)에 아미노산 변형을 포함한다. 일부 다른 실시양태에서, 항체는 인간 IgG4의 아미노산 변형 E233P / F234V / L235A (IgG4Δc)를 포함한다. 추가의 또 다른 실시양태에서, 아미노산 변형은 인간 IgG4의 결실 G236 (IgG4Δb)을 갖는 E233P / F234V / L235A이다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 IL-2 융합 단백질에서의 항체는 인간 Fc 감마 수용체에 대한 증가된 또는 감소된 결합 친화도를 갖는 변형된 불변 영역을 포함하거나, 면역학적으로 불활성이거나 부분적으로 불활성이거나, 예를 들어, 보체 매개된 용해를 촉발시키지 않거나, 항체-의존성 세포 매개된 세포독성 (ADCC)을 자극시키지 않거나, 미세아교세포를 활성화시키지 않거나; 하기 중 임의의 하나 이상에서 감소된 활성을 갖는다 (비변형된 항체에 비해): 보체 매개된 용해를 촉발시키거나, ADCC를 자극시키거나, 미세아교세포를 활성화시킴. 불변 영역의 상이한 변형은 이펙터 기능의 최적 수준 및/또는 조합을 달성하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Morgan et al., Immunology 86:319-324, 1995]; [Lund et al., J. Immunology 157:4963-9 157:4963-4969, 1996]; [Idusogie et al., J. Immunology 164:4178-4184, 2000]; [Tao et al., J. Immunology 143: 2595-2601, 1989]; 및 [Jefferis et al., Immunological Reviews 163:59-76, 1998]을 참조한다. 일부 실시양태에서, 불변 영역은 문헌 [Eur. J. Immunol., 1999, 29:2613-2624]; PCT 공개 번호 WO99/058572에 기재된 바와 같이 변형된다.
일부 실시양태에서, 항체 불변 영역은 Fc 감마 수용체 및 보체 및 면역계와의 상호작용을 회피하도록 변형될 수 있다. 이러한 항체의 제조를 위한 기술은 WO 99/58572에 기재되어 있다. 예를 들어, 불변 영역은 항체가 인간에서의 임상 시험 및 치료에 사용되는 경우 면역 반응을 회피하기 위한 인간 불변 영역을 보다 닮도록 조작될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,997,867 및 5,866,692를 참조한다.
추가의 다른 실시양태에서, 항체 불변 영역은 N-연결된 글리코실화에 대해 비-글리코실화된다. 일부 실시양태에서, 불변 영역은 불변 영역에서 N-글리코실화 인식 서열의 일부인 올리고사카라이드 부착 잔기 및/또는 플랭킹 잔기를 돌연변이시킴으로써 N-연결된 글리코실화에 대해 비-글리코실화된다. 예를 들어, N-글리코실화 부위 N297은 예를 들어, A, Q, K, 또는 H로 돌연변이될 수 있다. 문헌 [Tao et al., J. Immunology 143: 2595-2601, 1989]; 및 [Jefferis et al., Immunological Reviews 163:59-76, 1998]을 참조한다. 일부 실시양태에서, 불변 영역은 N-연결된 글리코실화에 대해 비-글리코실화된다. 불변 영역은 효소적으로 (예컨대 효소 PNGase에 의해 탄수화물을 제거함), 또는 글리코실화 결핍성 숙주 세포에서의 발현에 의해 N-연결된 글리코실화에 대해 비-글리코실화될 수 있다.
본원에서 제공된 IL-2 융합 단백질에 사용되는 다른 항체의 예는 항-CTLA-4 항체, 항-CD3 항체, 항-CD4 항체, 항-CD8 항체, 항-4-1BB 항체, 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-TIM3 항체, 항-LAG3 항체, 항-TIGIT 항체, 항-OX40 항체, 항-IL-7R알파 (CD127) 항체, 항-IL-8 항체, 항-IL-15 항체, 항-HVEM 항체, 항-BTLA 항체, 항-CD40 항체, 항-CD40L 항체, 항-CD47 항체, 항-CSF1R 항체, 항-CSF1 항체, 항-MARCO 항체, 항-CXCR4 항체, 항-VEGFR1 항체, 항-VEGFR2 항체, 항-TNFR1 항체, 항-TNFR2 항체, 항-CD3 이중특이적 항체, 항-CD19 항체, 항-CD20, 항-Her2 항체, 항-EGFR 항체, 항-ICOS 항체, 항-CD22 항체, 항-CD 52 항체, 항-CCR4 항체, 항-CCR8 항체, 항-CD200R 항체, 항-VISG4 항체, 항-CCR2 항체, 항-LILRb2 항체, 항-CXCR4 항체, 항-CD206 항체, 항-CD163 항체, 항-KLRG1 항체, 항-FLT3 항체, 항-B7-H4 항체, 항-B7-H3 항체, KLRG1 항체, 항-BTN1A1 항체, 항-UL16 결합 단백질 2 (ULBP2) 항체, 및 항-GITR 항체를 포함한다.
본원에서 제공된 IL-2 변이체 및 융합 분자는 표지화제, 예컨대 형광 분자, 방사성 분자 또는 관련 기술분야에 공지된 임의의 다른 표지에 연결될 수 있다. 일반적으로 신호를 (직접적으로 또는 간접적으로) 제공하는 표지는 관련 기술분야에 공지되어 있다.
본원에서 제공된 IL-2 변이체 및 융합 분자는 관련 기술분야에 공지된 방법에 의해, 예를 들어, 합성적으로 또는 재조합적으로 구축될 수 있다. 전형적으로, 본 발명의 융합 단백질은 본원에 기재된 재조합 방법을 사용하여 그들을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제조하고 발현시킴으로써 제조되지만, 이들은 또한 예를 들어, 화학적 합성을 포함한 관련 기술분야에 공지된 다른 수단에 의해 제조될 수 있다.
B-3. 폴리뉴클레오티드, 벡터, 및 숙주 세포
본 개시내용은 본원에 기재된 바와 같은 임의의 IL-2 변이체 단백질, IL-2 변이체 융합 단백질, 및 다른 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 특정 실시양태에서, 치환 R38N, L40T, K43N, 및 Y45T를 함유하는 IL-2 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 본원에서 제공되고, 여기서 폴리뉴클레오티드는 뉴클레오티드 서열: GCCCCTACCAGCTCCTCCACCAAGAAGACCCAGCTGCAGCTGGAGCATTTACTGCTGGATTTACAGATGATTTTAAACGGCATCAACAACTACAAGAACCCCAAGCTGACTAATATGACCACCTTCAACTTCACTATGCCCAAGAAGGCCACCGAGCTGAAGCACCTCCAGTGTTTAGAGGAGGAGCTGAAGCCTTTAGAGGAGGTGCTGAATTTAGCCCAGAGCAAGAATTTCCATTTAAGGCCTCGTGATTTAATCAGCAACATCAACGTGATCGTGCTGGAGCTGAAAGGCTCCGAGACCACCTTCATGTGCGAGTACGCCGACGAGACCGCCACCATCGTGGAGTTTTTAAATCGTTGGATCACCTTCTGCCAGAGCATCATCAGCACTTTAACC (서열식별번호: 32)를 포함한다.
임의의 이러한 서열에 상보적인 폴리뉴클레오티드는 또한 본 발명에 의해 포함된다. 폴리뉴클레오티드는 단일-가닥 (코딩 또는 안티센스) 또는 이중-가닥일 수 있으며, DNA (게놈, cDNA 또는 합성) 또는 RNA 분자일 수 있다. RNA 분자는 인트론을 함유하고 1-대-1 방식으로 DNA 분자에 상응하는 HnRNA 분자, 및 인트론을 함유하지 않는 mRNA 분자를 포함한다. 추가의 코딩 또는 비-코딩 서열은 그럴 필요는 없지만 본 발명의 폴리뉴클레오티드 내에 존재할 수 있으며, 폴리뉴클레오티드는 그럴 필요는 없지만 다른 분자 및/또는 지지체 물질에 연결될 수 있다. 유전 암호의 축중성의 결과로서, 본원에 기재된 바와 같은 폴리펩티드를 코딩하는 많은 뉴클레오티드 서열이 있음은 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 인식될 것이다. 동일한 폴리펩티드 서열을 코딩하는 상이한 뉴클레오티드 서열은 또한 "축중성 변이체"로 지칭된다.
일부 다른 실시양태에서, 본 개시내용은 본원에서 제공된 IL-2 변이체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터, 예컨대 발현 벡터를 제공한다. 발현 벡터의 예는 플라스미드, 바이러스 벡터 (예컨대 아데노바이러스, 아데노-연관된 바이러스, 레트로바이러스로부터 유래된 벡터), 코스미드, 및 PCT 공개 번호 WO 87/04462에 개시된 발현 벡터(들)를 포함한다. 벡터 성분은 일반적으로 하기 성분 중 하나 이상을 포함한다: 신호 서열; 복제 원점; 하나 이상의 마커 유전자; 적합한 전사 제어 요소 (예컨대 프로모터, 인핸서 및 종결자). 발현 (즉, 번역)을 위해, 하나 이상의 번역 제어 요소, 예컨대 리보솜 결합 부위, 번역 개시 부위, 및 정지 코돈은 또한 통상적으로 요구된다. 발현 벡터는 대상체에서 IL-2 변이체 또는 IL- 변이체 융합 단백질의 발현을 지정하는데 사용될 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 생체내에서 외인성 단백질의 발현을 얻기 위한 발현 벡터의 투여에 익숙하다. 예를 들어, 미국 특허 번호 6,436,908; 6,413,942; 및 6,376,471을 참조한다. 발현 벡터의 투여는 주사, 경구 투여, 입자 총 또는 카테터화 투여, 및 국소 투여를 포함한 국소 또는 전신 투여를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 발현 벡터는 교감신경 줄기 또는 신경절에, 또는 관상 동맥, 심방, 심실, 또는 심장막 내로 직접적으로 투여된다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 임의의 폴리뉴클레오티드 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 이종 DNA를 과발현할 수 있는 임의의 숙주 세포는 관심의 항체, 폴리펩티드 또는 단백질을 코딩하는 유전자를 단리하는 목적을 위해 사용될 수 있다. 포유동물 숙주 세포의 비-제한적 예는 COS, HeLa, 및 CHO 세포를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 또한 PCT 공개 번호 WO 87/04462를 참조한다. 적합한 비-포유동물 숙주 세포는 원핵생물 (예컨대 이. 콜라이(E. coli) 또는 비. 서브틸리스(B. subtillis)) 및 효모 (예컨대 에스. 세레비지아에(S. cerevisae), 에스. 폼베(S. pombe); 또는 케이. 락티스(K. lactis))를 포함한다.
B-4. 상태를 예방하거나 치료하기 위한 조성물 및 방법
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 바와 같은 IL-2 변이체 또는 IL-2 변이체 융합 분자의 유효량을 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 항-ULBP2 항체 및 인간 IL-2 변이체를 포함하는 IL-2 변이체 융합 단백질을 포함하며, 여기서 인간 IL-2 변이체는 항체의 Fc 도메인에 공유 연결된다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 제약상 허용되는 담체를 추가로 포함한다. IL-2 변이체 또는 융합 분자를 포함하는 제약 조성물에 사용하기 위한 적합한 제약상 허용되는 담체의 예는 하기 본원에 기재된 바와 같은 재조합 종양용해성 바이러스를 포함하는 제약 조성물에 적합한 것들을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 바와 같은 IL-2 변이체 또는 IL-2 변이체 융합 분자를 포함하는 조성물 (예를 들어, 제약 조성물)의 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 암 또는 종양을 치료하는 방법, 종양 성장 또는 진행을 억제하는 방법, 또는 암 세포의 전이를 억제하는 방법을 제공한다.
암은 액상 암 또는 고형 암일 수 있다. 액상 암의 예는 다발성 골수종, 호지킨 림프종, B-세포 림프종, 급성 골수성 백혈병, 및 다른 조혈 세포 관련된 암을 포함한다. 본원에서 제공된 방법으로 치료될 수 있는 다른 종양 또는 암의 예는 하기 기재된 바와 같은 본 개시내용에 의해 제공된 재조합 종양용해성 바이러스로 치료될 수 있는 것들을 포함한다.
본원에 기재된 바와 같은 IL-2 변이체 또는 IL-2 변이체 융합 분자는 임의의 적합한 경로, 예컨대 정맥내, 근육내, 복강내, 뇌척수내, 경피, 피하, 관절내, 설하로, 윤활막내, 통기를 통해, 경막내, 경구, 흡입, 또는 국소 경로를 통해 대상체에게 투여될 수 있다.
일부 실시양태에서, IL-2 변이체 또는 IL-2 변이체 융합 분자는 1종 이상의 추가의 치료제와 조합으로 투여된다. 추가의 치료제의 예는 생물치료제, 화학치료제, 백신, CAR-T 세포-기반 요법, 방사선요법, 또 다른 시토카인 요법 (예를 들어, 면역 반응을 자극시키는 다양한 신호전달 단백질을 포함한 면역자극성 시토카인, 예컨대 인터페론, 인터류킨, 및 조혈 성장 인자), 다른 면역억제 경로의 억제제, 혈관신생의 억제제, T 세포 활성화제, 대사 경로의 억제제, mTOR (라파마이신의 기계적 표적) 억제제 (예를 들어, 라파마이신, 라파마이신 유도체, 시롤리무스, 템시롤리무스, 에베롤리무스, 및 데포롤리무스), 아데노신 경로의 억제제, 티로신 키나제 억제제, 예컨대 인리타, ALK (역형성 림프종 키나제) 억제제 (예를 들어, 크리조티닙, 세리티닙, 알렉티닙, 및 수니티닙), BRAF 억제제 (예를 들어, 베무라페닙 및 다브라페닙), 후생적 변형제, Treg 세포의 및/또는 골수-유래된 서프레서 세포의 억제제 또는 고갈제, JAK (야누스 키나제) 억제제 (예를 들어, 룩솔리티닙 및 토파시티닙, 바리시티닙, 필고티닙, 간도티닙, 레스타우르티닙, 모멜로티닙, 파크리티닙, 및 우파다시티닙), STAT (신호 전달제 및 전사의 활성화제) 억제제 (예를 들어, STAT1, STAT3, 및 STAT5 억제제, 예컨대 플루다라빈), 시클린-의존성 키나제 억제제, 면역원성 작용제 (예를 들어, 약독화된 암성 세포, 종양 항원, 항원 제시 세포, 예컨대 종양 유래된 항원 또는 핵산으로 펄싱된 수지상 세포), MEK 억제제 (예를 들어, 트라메티닙, 코비메티닙, 비니메티닙, 및 셀루메티닙), GLS1 억제제, PAP 억제제, 종양용해성 바이러스, IDO (인돌아민-피롤 2,3-디옥시게나제) 억제제, PRR (패턴 인식 수용체) 효능제, 및 면역 자극 시토카인, 예컨대 GM-CSF (그러나 이에 제한되지는 않음)를 코딩하는 유전자로 형질감염된 세포를 포함한다.
일부 실시양태에서, IL-2 변이체 또는 IL-2 변이체 융합 분자는 예를 들어, 항-PD-L1 길항제 항체; 항-PD-1 길항제 항체, 예컨대 니볼루맙 (옵디보(OPDIVO)®), 펨브롤리주맙 (키트루다(KEYTRUDA)®), 및 사산리맙; 항-CTLA-4 길항제 항체, 예컨대 예를 들어 이필리무맙 (예르보이(YERVOY)®); 항-LAG-3 길항제 항체, 예컨대 BMS-986016 및 IMP701; 항-TIM-3 길항제 항체; 항-B7-H3 길항제 항체, 예컨대 예를 들어 MGA271; 항-VISTA 길항제 항체; 항-TIGIT 길항제 항체; 항-CD28 길항제 항체; 항-CD80 항체; 항-CD86 항체; 항-B7-H4 길항제 항체; 항-ICOS 효능제 항체; 항-CD28 효능제 항체; 선천성 면역 반응 조정제 (예를 들어, TLR, KIR, NKG2A); IDO 억제제; 4-1BB (CD137) 효능제, 예컨대 PF-05082566 또는 우렐루맙 (BMS-663513); OX40 효능제 (예컨대 항-OX-40 효능제 항체); GITR 효능제 (예컨대 TRX518); 및 시토카인 (페길화된 또는 비-페길화된) 요법, 예컨대 IL-10, IL-12, IL-7, IL-15, IL-21, IL-33, CSF-1, MCSF-1 등과 함께 사용된다.
B-5. 본 개시내용의 비-제한적 실시양태의 예
본 개시내용에 의해 제공된 IL-2 변이체에 관한 발명의 다른 실시양태의 예는 하기 항목에 기재된다.
항목 1. 야생형 인간 인터류킨 2 (IL-2)와 비교하여 적어도 1개의 아미노산 치환을 포함하는 단리된 인간 IL-2 변이체로서, 여기서 야생형 인간 IL-2는 서열식별번호: 1에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖고, IL-2 변이체는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 위치에 1개 이상의 치환을 포함하는 것인 IL-2 변이체:
a) K35,
b) R38 및 L40 둘 다,
c) T41 및 K43 둘 다,
d) K43 및 Y45 둘 다,
e) E62 및 K64 둘 다, 및
f) L72 및 Q74 둘 다.
항목 2. 변이체가 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 위치에 1개 이상의 치환을 포함하는 것인 항목 1의 IL-2 변이체:
a) K35, 여기서 K35 치환은 K35N임,
b) R38 및 L40 둘 다, 여기서 R38 치환은 R38N이고, L40 치환은 L40S 또는 L40T임,
c) T41 및 K43 둘 다, 여기서 T41 치환은 T41N이고, K43 치환은 K43S 또는 K43T임,
d) K43 및 Y45 둘 다, 여기서 K43 치환은 K43N이고, Y45 치환은 Y45S 또는 Y45T임,
e) E62 및 K64 둘 다, 여기서 E62 치환은 E62N이고, K64 치환은 K64S 또는 K64T임, 및
f) L72 및 Q74 둘 다, 여기서 L72 치환은 L72N이고, Q74 치환은 Q74S 또는 Q74T임.
항목 3. IL-2 변이체가 위치 K35에 치환을 포함하고, IL-2 변이체가 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에 치환을 추가로 포함하는 것인 항목 1 또는 2의 IL-2 변이체:
a) R38 및 L40 둘 다, 여기서 R38 치환은 R38N이고, L40 치환은 L40S 또는 L40T임,
b) T41 및 K43 둘 다, 여기서 T41 치환은 T41N이고, K43 치환은 K43S 또는 K43T임,
c) K43 및 Y45 둘 다, 여기서 K43 치환은 K43N이고, Y45 치환은 Y45S 또는 Y45T임,
d) E62 및 K64 둘 다, 여기서 E62 치환은 E62N이고, K64 치환은 K64S 또는 K64T임,
e) L72 및 Q74 둘 다, 여기서 L72 치환은 L72N이고, Q74 치환은 Q74S 또는 Q74T임, 및
f) E62, 여기서 E62 치환은 E62N, E62A, E62K, 또는 E62R임.
항목 4. IL-2 변이체가 위치 R38 및 L40에 치환을 포함하고, IL-2 변이체가 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에 치환을 추가로 포함하는 것인 항목 1 또는 2의 IL-2 변이체:
a) T41 및 K43 둘 다, 여기서 T41 치환은 T41N이고, K43 치환은 K43S 또는 K43T임,
b) K43 및 Y45 둘 다, 여기서 K43 치환은 K43N이고, Y45 치환은 Y45S 또는 Y45T임,
c) E62 및 K64 둘 다, 여기서 E62 치환은 E62N이고, K64 치환은 K64S 또는 K64T임,
d) L72 및 Q74 둘 다, 여기서 L72 치환은 L72N이고, Q74 치환은 Q74S 또는 Q74T임, 및
e) E62, 여기서 E62 치환은 E62N, E62A, E62K, 또는 E62R임.
항목 5. IL-2 변이체가 위치 T41 및 K43에 치환을 포함하고, IL-2 변이체가 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에 치환을 추가로 포함하는 것인 항목 1 또는 2의 IL-2 변이체:
a) E62 및 K64 둘 다, 여기서 E62 치환은 E62N이고, K64 치환은 K64S 또는 K64T임,
b) L72 및 Q74 둘 다, 여기서 L72 치환은 L72N이고, Q74 치환은 Q74S 또는 Q74T임, 및
c) E62, 여기서 E62 치환은 E62N, E62A, E62K, 또는 E62R임.
항목 6. IL-2 변이체가 위치 K43 및 Y45에 치환을 포함하고, IL-2 변이체가 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에 치환을 추가로 포함하는 것인 항목 1 또는 2의 IL-2 변이체:
a) E62 및 K64 둘 다, 여기서 E62 치환은 E62N이고, K64 치환은 K64S 또는 K64T임,
b) L72 및 Q74 둘 다, 여기서 L72 치환은 L72N이고, Q74 치환은 Q74S 또는 Q74T임, 및
c) E62, 여기서 E62 치환은 E62N, E62A, E62K, 또는 E62R임.
항목 7. IL-2 변이체가 위치 E62 및 K64에 치환을 포함하고, IL-2 변이체가 위치 L72 및 Q74에 치환을 추가로 포함하며, 여기서 L72 치환은 L72N이고, Q74 치환은 Q74S 또는 Q74T인 항목 1 또는 2의 IL-2 변이체.
항목 8. 야생형 인간 인터류킨 2 (IL-2)와 비교하여 적어도 4개의 아미노산 치환을 포함하는 단리된 인간 IL-2 변이체로서, 여기서 야생형 인간 IL-2는 서열식별번호: 1에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖고, IL-2 변이체는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 위치에 치환을 포함하는 것인 IL-2 변이체:
a) R38, L40, K43, 및 Y45의 각각; 또는
b) K43, Y45, L72, 및 Q74의 각각.
항목 9. IL-2 변이체가 아미노산 위치 R38, L40, K43, 및 Y45에 치환을 포함하고, R38 치환이 R38N인 항목 8의 IL-2 변이체.
항목 10. IL-2 변이체가 아미노산 위치 R38, L40, K43, 및 Y45에 치환을 포함하고, L40 치환이 L40T인 항목 8 또는 9의 IL-2 변이체.
항목 11. K43 치환이 K43N인 항목 8 내지 10 중 어느 하나의 IL-2 변이체.
항목 12. Y45 치환이 Y45T인 항목 8 내지 11 중 어느 하나의 IL-2 변이체.
항목 13. IL-2 변이체가 아미노산 위치 K43, Y45, L72, 및 Q74에 치환을 포함하고, L72 치환이 L72N인 항목 8의 IL-2 변이체.
항목 14. IL-2 변이체가 아미노산 위치 K43, Y45, L72, 및 Q74에 치환을 포함하고, Q74 치환이 Q74T인 항목 8 또는 13 중 어느 하나의 IL-2 변이체.
항목 15. R38 치환이 R38N이고, K43 치환이 K43N인 항목 8 내지 12 중 어느 하나의 IL-2 변이체.
항목 16. K43 치환이 K43N이고, L72 치환이 L72N인 항목 8 또는 11 내지 14 중 어느 하나의 IL-2 변이체.
항목 17. IL-2 변이체가 아미노산 치환 R38N, L40T, K43N, 및 Y45T를 포함하는 것인 항목 8 내지 12 중 어느 하나의 IL-2 변이체.
항목 18. IL-2 변이체가 서열식별번호: 31에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 것인 항목 17의 IL-2 변이체.
항목 19. IL-2 변이체가 아미노산 치환 K43N, Y45T, L72N, 및 Q74T를 포함하는 것인 항목 8, 11 내지 14, 또는 16 중 어느 하나의 IL-2 변이체.
항목 20. IL-2 변이체가 서열식별번호: 35에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 것인 항목 19의 IL-2 변이체.
항목 21. 서열식별번호: 31 또는 35에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 단리된 인간 인터류킨 2 (IL-2) 변이체.
항목 22. 야생형 인간 인터류킨 2 (IL-2)와 비교하여 적어도 4개의 아미노산 치환을 포함하는 단리된 인간 IL-2 변이체로서, 여기서 야생형 인간 IL-2는 서열식별번호: 1에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖고, IL-2 변이체는 4개의 아미노산 치환 R38N, L40T, K43N, 및 Y45T를 포함하는 것인 IL-2 변이체.
항목 23. 야생형 인간 인터류킨 2 (IL-2)와 비교하여 적어도 4개의 아미노산 치환을 포함하는 단리된 인간 IL-2 변이체로서, 여기서 야생형 인간 IL-2는 서열식별번호: 1에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖고, IL-2 변이체는 4개의 아미노산 치환 K43N, Y45T, L72N, 및 Q74T를 포함하는 것인 IL-2 변이체.
항목 24. IL-2 변이체가 야생형 인간 IL-2와 비교하여 감소된 인간 IL-2 수용체 알파 (IL-2Rα)에의 결합을 갖는 것인 항목 1 내지 23 중 어느 하나의 IL-2 변이체.
항목 25. IL-2 변이체가 도입된 아스파라긴 (N) 잔기 치환(들) 상에 글리코실화된 것인 항목 1 내지 24 중 어느 하나의 IL-2 변이체.
항목 26. IL-2 변이체가 위치 T3 및 C125 중 하나 또는 둘 다에 치환을 추가로 포함하는 것인 항목 1 내지 25 중 어느 하나의 IL-2 변이체.
항목 27. T3 및 C125 치환이 T3A, T3G, C125A, 및 C125S로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 항목 26의 IL-2 변이체.
항목 28. a) 항목 1 내지 27 중 어느 하나의 IL-2 변이체; 및 b) 인간 항체의 Fc 영역을 포함하는 단리된 융합 단백질로서, 여기서 IL-2 변이체는 Fc 영역에 공유 연결된 것인 단리된 융합 단백질.
항목 29. a) 항목 28의 단리된 융합 단백질 (여기서 인간 항체의 Fc 영역은 제1 Fc 영역임); 및 b) 인간 항체의 제2 Fc 영역을 포함하는 이종이량체성 단백질로서, 여기서 제1 Fc 영역 및 제2 Fc 영역은 적어도 1개의 디술피드 결합에 의해 공유 연결된 것인 이종이량체성 단백질.
항목 30. 제1 Fc 영역이 야생형 인간 IgG Fc 영역과 비교하여 적어도 1개의 아미노산 변형을 포함하여, 놉 또는 홀을 형성하고, 제2 Fc 영역이 야생형 인간 IgG Fc 영역과 비교하여 적어도 1개의 아미노산 변형을 포함하여, 놉 또는 홀을 형성하고, 제1 및 제2 Fc 영역 중 하나가 놉을 함유하고, 제1 및 제2 Fc 영역 중 하나가 홀을 함유하는 것인 항목 29의 이종이량체성 단백질.
항목 31. 놉을 포함하는 Fc 영역이 돌연변이 Y349C 및 T366W를 포함하고, 홀을 포함하는 Fc 영역이 돌연변이 S354C, T366S, L368A, 및 Y407V를 포함하는 것인 항목 30의 이종이량체성 단백질.
항목 32. a) 항목 1 내지 27 중 임의의 것의 IL-2 변이체; 및 b) Fc 도메인을 포함하는 항체를 포함하는 단리된 융합 단백질로서, 여기서 Fc 도메인이 제1 Fc 영역 및 제2 Fc 영역을 포함하고, IL-2 변이체가 항체의 Fc 영역에 공유 연결된 것인 단리된 융합 단백질.
항목 33. Fc 도메인이 야생형 Fc 도메인과 비교하여 감소된 항체 의존성 세포성 세포독성 (ADCC) 활성을 갖거나, 또는 활성을 갖지 않는 것인 항목 32의 단리된 융합 단백질.
항목 34. a) 항목 1 내지 27 중 임의의 것의 IL-2 변이체; 및 b) Fc 도메인을 포함하는 항체를 포함하는 단리된 융합 단백질로서, 여기서 항체가 제1 경쇄 및 제2 경쇄를 포함하고, IL-2 변이체가 항체의 경쇄에 공유 연결된 것인 단리된 융합 단백질.
항목 35. Fc 도메인이 야생형 Fc 도메인과 비교하여 감소된 항체 의존성 세포성 세포독성 (ADCC) 활성을 갖거나, 또는 활성을 갖지 않는 것인 항목 34의 단리된 융합 단백질.
항목 36. 항체가 종양 또는 면역 세포에 결합하는 것인 항목 32 내지 35 중 어느 하나의 융합 단백질.
항목 37. 항체가 항-B7H4 항체, 항-CTLA-4 항체, 항-CD3 항체, 항-B7H4 / 항-CD3 이중특이적 항체, 항-CD28 항체, 항-B7H4 / 항-CD28 이중특이적 항체, 항-EDB1 항체, 항-ULBP2 항체, 항-CD4 항체, 항-CD8 항체, 항-4-1BB 항체, 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-TIM3 항체, 항-LAG3 항체, 항-TIGIT 항체, 항-OX40 항체, 항-IL-8 항체, 항-IL-7R알파 (CD127) 항체, 항-IL15 항체, 항-HVEM 항체, 항-BTLA 항체, 항-CD40 항체, 항-CD40L 항체, 항-CD47 항체, 항-CSF1R 항체, 항-CSF1 항체, 항-MARCO 항체, 항-CXCR4 항체, 항-VEGFR1 항체, 항-VEGFR2 항체, 항-TNFR1 항체, 항-TNFR2 항체, 항-CD3 이중특이적 항체, 항-CD19 항체, 항-CD20, 항-Her2 항체, 항-EGFR 항체, 항-ICOS 항체, 항-CD22 항체, 항-CD52 항체, 항-CCR4 항체, 항-CCR8 항체, 항-CD200R 항체, 항-VISG4 항체, 항-CCR2 항체, 항-LILRb2 항체, 항-CXCR4 항체, 항-CD206 항체, 항-CD163 항체, 항-KLRG1 항체, 항-FLT3 항체, 항-B7H3 항체, KLRG1 항체, 및 항-GITR 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 항목 32 내지 36 중 어느 하나의 융합 단백질.
항목 38. IL-2 변이체가 각각 폴리펩티드 링커 및/또는 폴리펩티드 태그에 의해 Fc 영역 또는 경쇄에 공유 연결된 것인 항목 22 내지 37 중 어느 하나의 단리된 융합 단백질 또는 이종이량체성 단백질.
항목 39. 항목 1 내지 38 중 어느 하나의 IL-2 변이체, 융합 단백질 또는 이종이량체성 단백질을 생산하는 세포주.
항목 40. 항목 1 내지 38 중 어느 하나의 IL-2 변이체, 융합 단백질 또는 이종이량체성 단백질을 코딩하는 단리된 핵산.
항목 41. 항목 40의 핵산을 포함하는 재조합 발현 벡터.
항목 42. 항목 40의 단리된 핵산 또는 항목 41의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
항목 43. 항목 42의 숙주 세포를 IL-2 변이체, 융합 단백질, 또는 이종이량체성 단백질의 발현에 적합한 조건 하에서 배양하는 것을 포함하는, 항목 1 내지 38 중 어느 하나의 IL-2 변이체, 융합 단백질 또는 이종이량체성 단백질을 생산하는 방법.
항목 44. 항목 43의 방법에 따라 생산된 IL-2 변이체, 융합 단백질, 또는 이종이량체성 단백질.
항목 45. 항목 1 내지 38 중 어느 하나의 IL-2 변이체, 융합 단백질, 또는 이종이량체성 단백질, 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물.
항목 46. 항목 45의 제약 조성물, 및 암의 치료를 필요로 하는 대상체에의 조성물의 투여를 위한 지시서를 포함하는, 암의 치료를 위한 키트.
항목 47. 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에서 질환을 치료하는 방법으로서, 항목 1 내지 38 또는 45 중 어느 하나의 IL-2 변이체, 융합 단백질, 이종이량체성 단백질, 또는 제약 조성물의 유효량을 대상체에게 투여하여, 질환과 연관된 1종 이상의 증상이 대상체에서 개선되도록 하는 것을 포함하는 방법.
항목 48. 질환이 암인 항목 47의 방법.
항목 49. 질환이 고형 암인 항목 48의 방법.
항목 50. 질환이 액상 암인 항목 48의 방법.
항목 51. 암이 재발성, 난치성, 또는 전이성인 항목 47 내지 50 중 어느 하나의 방법.
항목 52. 방법이 유효량의 제2 치료제를 투여하는 것을 추가로 포함하고, 임의로 여기서 투여가 개별적, 순차적, 또는 동시인 항목 47 내지 51 중 어느 하나의 방법.
항목 53. 제2 치료제가 항-CTLA-4 항체, 항-CD3 항체, 항-CD4 항체, 항-CD8 항체, 항-4-1BB 항체, 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-TIM3 항체, 항-LAG3 항체, 항-TIGIT 항체, 항-OX40 항체, 항-IL-7R알파 (CD127) 항체, 항-IL-8 항체, 항-IL-15 항체, 항-HVEM 항체, 항-BTLA 항체, 항-CD40 항체, 항-CD40L 항체, 항-CD47 항체, 항-CSF1R 항체, 항-CSF1 항체, 항-IL-7R 항체, 항-MARCO 항체, 항-CXCR4 항체, 항-VEGF 항체, 항-VEGFR1 항체, 항-VEGFR2 항체, 항-TNFR1 항체, 항-TNFR2 항체, 항-CD3 이중특이적 항체, 항-CD19 항체, 항-CD20, 항-Her2 항체, 항-EGFR 항체, 항-ICOS 항체, 항-CD22 항체, 항-CD 52 항체, 항-CCR4 항체, 항-CCR8 항체, 항-CD200R 항체, 항-VISG4 항체, 항-CCR2 항체, 항-LILRb2 항체, 항-CXCR4 항체, 항-CD206 항체, 항-CD163 항체, 항-KLRG1 항체, 항-FLT3 항체, 항-B7-H4 항체, 항-B7-H3 항체, KLRG1 항체, BTN1A1 항체, 및 항-GITR 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 항체인 항목 52의 방법.
항목 54. 면역계의 자극을 필요로 하는 대상체에서 면역계를 자극시키는 방법으로서, 항목 1 내지 38 또는 45 중 어느 하나의 IL-2 변이체, 융합 단백질, 이종이량체성 단백질, 또는 제약 조성물의 유효량을 대상체에게 투여하여, 면역계가 대상체에서 자극되도록 하는 것을 포함하는 방법.
항목 55. 질환의 치료를 필요로 하는 개체에서 질환의 치료에 사용하기 위한, 항목 1 내지 38 또는 45 중 어느 하나의 IL-2 변이체, 융합 단백질, 이종이량체성 단백질, 또는 제약 조성물.
항목 56. 질환이 암이고, 임의로 여기서 암이 고형 암 또는 액상 암이고/거나, 암이 재발성, 난치성, 또는 전이성인 항목 55의 사용하기 위한 IL-2 변이체, 융합 단백질, 이종이량체성 단백질, 또는 제약 조성물.
항목 57. 사용이 제2 치료제와 조합이고, 임의로 여기서 조합이 동시에, 공동으로, 또는 동시에 투여하기 위한 것인 항목 55 또는 56 중 어느 하나의 사용하기 위한 IL-2 변이체, 융합 단백질, 이종이량체성 단백질, 또는 제약 조성물.
항목 58. 질환의 치료를 필요로 하는 개체에서 질환의 치료에 사용하기 위한 의약의 제조에 사용하기 위한, 항목 1 내지 38 또는 45 중 어느 하나의 IL-2 변이체, 융합 단백질, 이종이량체성 단백질, 또는 제약 조성물.
C. 재조합 종양용해성 바이러스 및 관련된 측면
C-1. 재조합 종양용해성 바이러스
일부 다른 측면에서, 본 개시내용은 상기 본원에 기재된 IL-2 변이체, 예컨대 인간 IL-2 변이체 IL-2gv1 또는 IL-2gv2를 코딩하는 삽입된 뉴클레오티드 서열 (트랜스진)을 포함하는 재조합 종양용해성 바이러스를 제공한다. 바이러스는 아데노바이러스, 유형 1 단순 포진 바이러스, 유형 2 단순 포진 바이러스, 폭스 바이러스, 레트로바이러스, 랍도바이러스, 파라믹소바이러스 또는 레오바이러스, 소수포 구내염 바이러스, 뉴캐슬병 바이러스, 백시니아 바이러스, 및 이들 보다 큰 그룹 내의 임의의 종 또는 균주를 포함한, 관련 기술분야에 공지된 다양한 종양용해성 바이러스로부터 구축될 수 있다. 일부 실시양태에서, 재조합 종양용해성 바이러스는 복제-적격이다. 일부 실시양태에서, 재조합 종양용해성 바이러스는 복제-부적격이다. 일부 실시양태에서, 재조합 종양용해성 바이러스는 백시니아 바이러스이다. 특정 실시양태에서, 재조합 종양용해성 바이러스는 재조합 백시니아 바이러스 코펜하겐 균주이다.
일부 실시양태에서, IL-2 변이체를 코딩하는 삽입된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 종양용해성 바이러스는 바이러스의 1종 이상의 바람직한 항-종양 특성, 예컨대 증가된 또는 개선된 종양 선택성, 세포외 외피화된 바이러스 (EEV)의 증진된 생산, 자손 비리온의 증진된 확산, 개선된 안전성 및 PET-CT 영상화, 또는 증진된 항-종양 면역 반응을 증가시키거나 증진시키는, 바이러스 게놈, 단백질, 또는 바이러스의 다른 성분에 대한 하나 또는 변형 또는 돌연변이를 추가로 포함한다.
바이러스 게놈에 대한 특이적 변형 또는 돌연변이의 예는 하기 본원에 상세하게 기재된다.
C-1A. IL-2 변이체
상기 기재된 바와 같이, 본 개시내용에 의해 제공된 재조합 OV, 예컨대 재조합 VV는 상기 본원에 기재된 IL-2 변이체를 코딩하는 삽입된 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 재조합 OV는 야생형 IL-2 폴리펩티드, 예컨대 인간 IL-2 폴리펩티드 또는 뮤린 IL-2 폴리펩티드, 또는 그의 변이체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 야생형 인간 IL-2 (hIL-2) 폴리펩티드의 성숙한 형태의 아미노산 서열은 서열식별번호: 1에 제시된다. 야생형 hIL-2 폴리펩티드의 전장, 전구체 형태의 아미노산 서열은 서열식별번호: 21에 제시된다. 야생형 hIL-2 폴리펩티드의 전구체 형태는 신호 펩티드 (예를 들어, MYRMQLLSCIALSLALVTNS (서열식별번호: 22))를 포함한다. 야생형 마우스 IL-2 (mIL-2) 폴리펩티드의 성숙한 형태의 아미노산 서열은 서열식별번호: 23에 제시된다. 마우스 야생형 IL-2 폴리펩티드의 전구체 형태의 아미노산 서열은 서열식별번호: 24에 제시된다.
일부 실시양태에서, 변이체 인터류킨-2 (IL-2v) 폴리펩티드는 야생형 인간 IL-2 폴리펩티드와 비교하여 감소된 IL-2 수용체 알파 ("IL-2Ra" / CD25)에의 결합, 또는 감소된 고-친화도 삼량체성 IL-2 수용체 복합체 (IL-2Ra + IL-2Rb + IL-2Rg를 함유함)에의 결합을 갖지만, 중간-친화도 이량체성 IL-2 수용체 복합체 (IL-2Rb + IL-2Rg를 함유함)에 결합하는 능력을 보유한다.
일부 다른 실시양태에서, IL-2v 폴리펩티드는, 재조합 OV가 투여되는 대상체에서 발현되는 경우, 감소된 독성, 감소된 면역억제성 T-조절 세포 (T-reg 세포)의 자극, 또는 다르게는 감소된 면역억제 활성을 갖는다.
IL-2v 폴리펩티드-코딩 뉴클레오티드 서열은 재조합 OV의 게놈에 존재하며, "트랜스진"으로 지칭될 수 있다. IL-2v 폴리펩티드-코딩 뉴클레오티드 서열은 야생형 백시니아 바이러스에 자연적으로 존재하지 않으며, 따라서 야생형 백시니아 바이러스에 대해 이종이다. 따라서, IL-2v 폴리펩티드-코딩 뉴클레오티드 서열은 변이체 IL-2 폴리펩티드를 코딩하는 "이종 뉴클레오티드 서열" 또는 "삽입된 뉴클레오티드 서열"로 지칭될 수 있다.
일부 경우에, 본 개시내용의 재조합 OV에 의해 코딩되는 IL-2v 폴리펩티드는 야생형 IL-2와 비교할 경우 감소된 비바람직한 생물학적 활성을 제공한다. 일부 경우에, 상기 감소된 비바람직한 생물학적 활성은 야생형 IL-2와 비교할 경우 CD25+ CD4+ Treg 세포에서 증가된 pSTAT5 수준을 유도하는데 있어서 효력을 측정함으로써 결정된다. 일부 경우에, IL-2v 폴리펩티드는 CD25+ CD4+ Treg 세포에서 증가된 pSTAT5 수준을 유도하는데 있어서 야생형 IL-2와 비교할 경우 감소된 농도 효력을 제공한다. 일부 경우에, IL-2v 폴리펩티드는 CD25+ CD4+ Treg 세포에서 증가된 pSTAT5 수준을 유도하는데 있어서 야생형 IL-2와 비교할 경우 적어도 1, 적어도 2 또는 적어도 3 로그의 감소된 농도 효력을 제공한다. 일부 경우에, IL-2v 폴리펩티드는 CD25+ CD4+ Treg 세포에서 증가된 pSTAT5 수준을 유도하는데 있어서 야생형 IL-2와 비교할 경우 약 1, 약 2 또는 약 3 로그의 감소된 농도 효력을 제공한다. 일부 경우에, 상기 감소된 비바람직한 생물학적 활성은 실시예 9에 개시된 바와 같이, 야생형 IL-2와 비교할 경우 재조합 백시니아 바이러스에 의해 코딩되는 IL-2v 폴리펩티드로의 처리 후 염증유발성 시토카인 수준을 측정함으로써 결정된다. 일부 경우에, IL-2v 폴리펩티드는 (예를 들어 실시예 9에 개시된 시험을 사용하여) 야생형 IL-2와 비교할 경우 감소된 염증유발성 시토카인 수준을 제공한다. 일부 경우에, IL-2v 폴리펩티드는 야생형 IL-2와 비교할 경우, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 100% 감소된 염증유발성 시토카인 수준을 제공한다.
일부 경우에, 본 개시내용의 재조합 백시니아 바이러스는 신호 펩티드 (예를 들어, MYRMQLLSCIALSLALVTNS (서열식별번호: 22))를 포함하는 IL-2v 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 따라서, 예를 들어, 일부 경우에, 본 개시내용의 복제-적격, 재조합 종양용해성 백시니아 바이러스는 서열식별번호: 21 (MYRMQLLSCIALSLALVTNSAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT)에 제시된 IL-2 아미노산 서열과 적어도 95% (예를 들어, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%) 아미노산 서열 동일성을 갖고, 서열식별번호: 21에 제시된 아미노산 서열의 아미노산 넘버링에 기반하여 IL-2의 F62, Y65, 및 L92 중 하나 이상의 치환을 포함하는 IL-2v 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 인식될 것인 바와 같이, 서열식별번호: 21에 제시된 IL-2 아미노산 서열의 F62, Y65, 및 L92는 서열식별번호: 1에 제시된 아미노산 서열의 F42, Y45, 및 L72에 상응한다.
다른 적합한 IL-2v 폴리펩티드는 예를 들어, 서열식별번호: 3의 아미노산 서열과 적어도 95% (예를 들어, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%) 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, F76A, Y79A, 및 L106G 치환을 포함하는 (즉, Ala-76, Ala-79, 및 Gly-106을 포함하는) 마우스 IL-2v 폴리펩티드를 포함한다. 서열식별번호: 3의 IL-2v 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열식별번호: 2에 제시된다.
일부 경우에, 마우스 IL-2v 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 백시니아 바이러스에 대해 코돈 최적화된다. 백시니아 바이러스에 대해 코돈 최적화된 마우스 IL-2v 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 예는 서열식별번호: 19에 제시된다.
다른 적합한 IL-2v 폴리펩티드는 예를 들어, 서열식별번호: 14의 아미노산 서열과 적어도 95% (예를 들어, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%) 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, F62A, Y65A, 및 L92G 치환을 포함하는 (즉, Ala-62, Ala-65, 및 Gly-92를 포함하는) 인간 IL-2v 폴리펩티드를 포함한다.
IL-2v 폴리펩티드를 코딩하는 적합한 뉴클레오티드 서열의 예는 예를 들어, 인간 IL-2v 폴리펩티드를 코딩하고, 서열식별번호: 12의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 뉴클레오티드 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 코딩된 IL-2v 폴리펩티드는 F62A, Y65A, 및 L92G 치환을 포함한다 (즉, Ala-62, Ala-65, 및 Gly-92를 포함한다). IL-2v 폴리펩티드를 코딩하는 적합한 뉴클레오티드 서열의 다른 예는 예를 들어, 인간 IL-2v 폴리펩티드를 코딩하고, 서열식별번호: 13의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 뉴클레오티드 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 코딩된 IL-2v 폴리펩티드는 F62A, Y65A, 및 L92G 치환을 포함한다 (즉, Ala-62, Ala-65, 및 Gly-92를 포함한다).
다른 적합한 IL-2v 폴리펩티드는 예를 들어, 서열식별번호: 9의 아미노산 서열과 적어도 95% (예를 들어, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%) 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, F42A, Y45A, 및 L72G 치환을 포함하는 (즉, Ala-42, Ala-45, 및 Gly-72를 포함하는) 인간 IL-2v 폴리펩티드를 포함한다.
IL-2v 폴리펩티드를 코딩하는 적합한 뉴클레오티드 서열의 예는 예를 들어, 인간 IL-2v 폴리펩티드를 코딩하고, 서열식별번호: 10의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 뉴클레오티드 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 코딩된 IL-2v 폴리펩티드는 F42A, Y45A, 및 L72G 치환을 포함한다 (즉, Ala-42, Ala-45, 및 Gly-72를 포함한다). IL-2v 폴리펩티드를 코딩하는 적합한 뉴클레오티드 서열의 다른 예는 예를 들어, 인간 IL-2v 폴리펩티드를 코딩하고, 서열식별번호: 11의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 뉴클레오티드 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 코딩된 IL-2v 폴리펩티드는 F42A, Y45A, 및 L72G 치환을 포함한다 (즉, Ala-42, Ala-45, 및 Gly-72를 포함한다).
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 재조합 OV는 인간 성숙한 형태 IL-2v 폴리펩티드를 코딩하는 삽입된 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 인간 IL-2v 폴리펩티드는 서열식별번호: 1에 제시된 IL-2 아미노산 서열의 아미노산 넘버링에 기반하여, K35, R38, L40, T41, F42, K43, Y45, Y45, E62, K64, L72, 및 Q74로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 아미노산 치환을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용에 의해 제공된 재조합 OV는 하기 위치에 서열식별번호: 1의 인간 IL-2 단백질 서열에 비해 1개 이상의 아미노산 치환을 포함하는 인간 IL-2v 폴리펩티드를 코딩하는 삽입된 뉴클레오티드 서열을 포함한다: T3, K35, R38, L40, T41, F42, K43, Y45, E62, K64, Y65, L72, Q74, 및 C125. 일부 다른 실시양태에서, IL-2v는 하기 군의 위치 중 하나 이상에 아미노산 치환을 포함한다: R38 및 L40; T41 및 K43; K43 및 Y45; E62 및 K64; L72 및 Q74; R38, L40, K43, 및 Y45; K43, Y45, L72, 및 Q74; T3, R38, L40, K43, 및 Y45; T3, K43, Y45, L72, 및 Q74; R38, L40, K43, Y45, 및 C125; K43, Y45, L72, Q74, 및 C125; T3, R38, L40, K43, Y45, 및 C125; T3, K43, Y45, L72, Q74, 및 C125. 주어진 아미노산 위치에서의 치환의 예는 T3A, K35N, R38N, L40S, L40T, T41N, K43S, K43T, K43N, Y45S, Y45T, E62N, E62A, E62K, E62R, K64S, K64T, L72N, Q74S, Q74T, C125A, 및 C125S를 포함한다.
일부 특정 실시양태에서, 재조합 OV에 의해 코딩되는 IL-2v 폴리펩티드는 야생형 인간 IL-2와 비교하여 적어도 1개의 아미노산 치환을 포함하며, 여기서 야생형 인간 IL-2는 서열식별번호: 1에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖고, IL-2 변이체는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 치환을 포함하고:
a) K35, 여기서 K35 치환은 K35N임,
b) R38 및 L40, 여기서 R38 치환은 R38N이고, L40 치환은 L40S 또는 L40T임,
c) T41 및 K43, 여기서 T41 치환은 T41N이고, K43 치환은 K43S 또는 K43T임,
d) K43 및 Y45, 여기서 K43 치환은 K43N이고, Y45 치환은 Y45S 또는 Y45T임,
e) E62 및 K64, 여기서 E62 치환은 E62N이고, K64 치환은 K64S 또는 K64T임, 및
f) L72 및 Q74, 여기서 L72 치환은 L72N이고, Q74 치환은 Q74S 또는 Q74T임,
여기서 넘버링은 서열식별번호: 1의 아미노산 서열에 기반한다.
일부 다른 특정 실시양태에서, IL-2v는 위치 K35에 치환을 포함하고, 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에 치환을 추가로 포함한다:
a) R38 및 L40, 여기서 R38 치환은 R38N이고, L40 치환은 L40S 또는 L40T임,
b) T41 및 K43, 여기서 T41 치환은 T41N이고, K43 치환은 K43S 또는 K43T임,
c) K43 및 Y45, 여기서 K43 치환은 K43N이고, Y45 치환은 Y45S 또는 Y45T임,
d) E62 및 K64, 여기서 E62 치환은 E62N이고, K64 치환은 K64S 또는 K64T임,
e) L72 및 Q74, 여기서 L72 치환은 L72N이고, Q74 치환은 Q74S 또는 Q74T임, 및
f) E62, 여기서 E62 치환은 E62N, E62A, E62K, 또는 E62R임.
추가의 다른 특정 실시양태에서, IL-2 변이체는 위치 T41 및 K43에 치환을 포함하고, 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에 치환을 추가로 포함한다:
a) E62 및 K64, 여기서 E62 치환은 E62N이고, K64 치환은 K64S 또는 K64T임,
b) L72 및 Q74, 여기서 L72 치환은 L72N이고, Q74 치환은 Q74S 또는 Q74T임, 및
c) E62, 여기서 E62 치환은 E62N, E62A, E62K, 또는 E62R임.
일부 추가의 특정 실시양태에서, IL-2 변이체는 K43N 및 Y45T를 포함하고, 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 치환을 추가로 포함한다:
a) E62N 및 K64S 또는 K64T,
b) L72N 및 Q74S 또는 Q74T,
c) E62N, E62A, E62K, 또는 E62R;
e) R38N 및 L40T; 및
f) L72N 및 Q74T.
일부 특정 실시양태에서, 재조합 OV는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 IL-2v 폴리펩티드를 코딩하는 삽입된 뉴클레오티드 서열을 포함한다:
a) 서열식별번호: 29 (MYRMQLLSCIALSLALVTNSAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTNMTTFNFTMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT)의 아미노산 서열과 적어도 95% (예를 들어, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%) 아미노산 서열 동일성을 갖고, 치환 R58N, L60T, K63N, 및 Y65T를 포함하는 아미노산 서열; 및
b) 서열식별번호: 31 (APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTNMTTFNFTMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT)의 아미노산 서열과 적어도 95% (예를 들어, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%) 아미노산 서열 동일성을 갖고, 치환 R38N, L40T, K43N, 및 Y45T를 포함하는 아미노산 서열.
특정 실시양태에서, 삽입된 뉴클레오티드 서열은 서열식별번호: 29 또는 서열식별번호: 31의 아미노산 서열을 포함하는 IL-2v 폴리펩티드를 코딩한다.
일부 다른 특정 실시양태에서, 재조합 OV는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 IL-2v 폴리펩티드를 코딩하는 삽입된 뉴클레오티드 서열을 포함한다:
a) 서열식별번호: 33 (MYRMQLLSCIALSLALVTNSAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFNFTMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNNATSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT)의 아미노산 서열과 적어도 95% (예를 들어, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%) 아미노산 서열 동일성을 갖고, 치환 K63N, Y65T, L92N, 및 Q94T를 포함하는 아미노산 서열; 및
b) 서열식별번호: 35 (APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFNFTMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNNATSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT)의 아미노산 서열과 적어도 95% (예를 들어, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%) 아미노산 서열 동일성을 갖고, 치환 K43N, Y45T, L72N, 및 Q74T를 포함하는 아미노산 서열.
특정 실시양태에서, IL-2v 폴리펩티드를 코딩하는 삽입된 핵산은 서열식별번호: 30 (ATGTATCGTATGCAGCTGCTGAGCTGCATCGCTTTATCTTTAGCTTTAGTGACCAACAGCGCCCCTACCAGCTCCTCCACCAAGAAGACCCAGCTGCAGCTGGAGCATTTACTGCTGGATTTACAGATGATTTTAAACGGCATCAACAACTACAAGAACCCCAAGCTGACTAATATGACCACCTTCAACTTCACTATGCCCAAGAAGGCCACCGAGCTGAAGCACCTCCAGTGTTTAGAGGAGGAGCTGAAGCCTTTAGAGGAGGTGCTGAATTTAGCCCAGAGCAAGAATTTCCATTTAAGGCCTCGTGATTTAATCAGCAACATCAACGTGATCGTGCTGGAGCTGAAAGGCTCCGAGACCACCTTCATGTGCGAGTACGCCGACGAGACCGCCACCATCGTGGAGTTTTTAAATCGTTGGATCACCTTCTGCCAGAGCATCATCAGCACTTTAACC) 또는 서열식별번호: 32 (GCCCCTACCAGCTCCTCCACCAAGAAGACCCAGCTGCAGCTGGAGCATTTACTGCTGGATTTACAGATGATTTTAAACGGCATCAACAACTACAAGAACCCCAAGCTGACTAATATGACCACCTTCAACTTCACTATGCCCAAGAAGGCCACCGAGCTGAAGCACCTCCAGTGTTTAGAGGAGGAGCTGAAGCCTTTAGAGGAGGTGCTGAATTTAGCCCAGAGCAAGAATTTCCATTTAAGGCCTCGTGATTTAATCAGCAACATCAACGTGATCGTGCTGGAGCTGAAAGGCTCCGAGACCACCTTCATGTGCGAGTACGCCGACGAGACCGCCACCATCGTGGAGTTTTTAAATCGTTGGATCACCTTCTGCCAGAGCATCATCAGCACTTTAACC)의 뉴클레오티드 서열, 또는 서열식별번호: 30 또는 서열식별번호: 32의 뉴클레오티드 서열의 축중성 변이체를 포함한다.
또 다른 특정 실시양태에서, IL-2v 폴리펩티드를 코딩하는 삽입된 핵산은 서열식별번호: 34 (ATGTATCGTATGCAGCTGCTGAGCTGCATCGCTTTATCTTTAGCTTTAGTGACCAACAGCGCCCCTACCAGCTCCTCCACCAAGAAGACCCAGCTGCAGCTGGAGCATTTACTGCTGGATTTACAGATGATTTTAAACGGCATCAACAACTACAAGAACCCCAAGCTGACTCGTATGCTGACCTTCAACTTCACTATGCCCAAGAAGGCCACCGAGCTGAAGCACCTCCAGTGTTTAGAGGAGGAGCTGAAGCCTTTAGAGGAGGTGCTGAATAACGCCACCAGCAAGAATTTCCATTTAAGGCCTCGTGATTTAATCAGCAACATCAACGTGATCGTGCTGGAGCTGAAAGGCTCCGAGACCACCTTCATGTGCGAGTACGCCGACGAGACCGCCACCATCGTGGAGTTTTTAAATCGTTGGATCACCTTCTGCCAGAGCATCATCAGCACTTTAACC) 또는 서열식별번호: 36 (GCCCCTACCAGCTCCTCCACCAAGAAGACCCAGCTGCAGCTGGAGCATTTACTGCTGGATTTACAGATGATTTTAAACGGCATCAACAACTACAAGAACCCCAAGCTGACTCGTATGCTGACCTTCAACTTCACTATGCCCAAGAAGGCCACCGAGCTGAAGCACCTCCAGTGTTTAGAGGAGGAGCTGAAGCCTTTAGAGGAGGTGCTGAATAACGCCACCAGCAAGAATTTCCATTTAAGGCCTCGTGATTTAATCAGCAACATCAACGTGATCGTGCTGGAGCTGAAAGGCTCCGAGACCACCTTCATGTGCGAGTACGCCGACGAGACCGCCACCATCGTGGAGTTTTTAAATCGTTGGATCACCTTCTGCCAGAGCATCATCAGCACTTTAACC)의 뉴클레오티드 서열, 또는 서열식별번호: 34 또는 서열식별번호: 36의 뉴클레오티드 서열의 축중성 변이체를 포함한다.
일부 경우에, 본 개시내용의 복제-적격, 재조합 종양용해성 백시니아 바이러스는 IL-2v 폴리펩티드를 코딩하는 상동 재조합 공여자 단편을 포함하며, 여기서 상동 재조합 공여자 단편은 서열식별번호: 4 (VV27/VV38 상동 재조합 공여자 단편), 서열식별번호: 5 (VV39 상동 재조합 공여자 단편), 서열식별번호: 15 (hIL-2v를 함유하는 VV75 상동 재조합 공여자 단편 (인간 코돈 최적화됨)), 서열식별번호: 16 (hIL-2v를 함유하는 코펜하겐 J2R 상동 재조합 플라스미드 (인간 코돈 최적화됨)), 서열식별번호: 17 (hIL-2v를 함유하는 상동 재조합 공여자 단편 (백시니아 바이러스 코돈 최적화됨)), 서열식별번호: 18 (hIL-2v를 함유하는 코펜하겐 J2R 상동 재조합 플라스미드 (백시니아 바이러스 코돈 최적화됨)), 및 서열식별번호: 20 (마우스 IL-2 변이체 (백시니아 바이러스 코돈 최적화됨) 상동 재조합 공여자 단편) 중 어느 하나에 제시된 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 뉴클레오티드 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 경우에, 본 개시내용의 복제-적격, 재조합 종양용해성 백시니아 바이러스는 서열식별번호: 6 (코펜하겐 J2R 상동 재조합 플라스미드)에 제시된 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 뉴클레오티드 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, IL-2v 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 경우에, 본 개시내용의 복제-적격, 재조합 종양용해성 백시니아 바이러스는 서열식별번호: 7 (마우스 IL-2 변이체 (mIL-2v) 폴리펩티드를 함유하는 코펜하겐 J2R 상동 재조합 플라스미드)에 제시된 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 뉴클레오티드 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 경우에, 본 개시내용의 재조합 종양용해성 백시니아 바이러스는 서열식별번호: 8 (mIL-2v를 함유하는 웨스턴 리저브(Western Reserve) J2R 상동 재조합 플라스미드)에 제시된 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 뉴클레오티드 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 구체적인 경우에, 본 개시내용의 재조합 VV는 VV27 (A34R-K151E 및 mIL-2v 트랜스진을 함유하는 코펜하겐 백시니아)이다. 일부 경우에, 재조합 VV는 mIL-2v 폴리펩티드 대신, 상기 기재된 바와 같은 인간 IL-2 변이체 (hIL-2v) 폴리펩티드를 포함한다.
일부 구체적인 경우에, 본 개시내용의 재조합 OV는 VV38 (mIL-2v 트랜스진을 함유하는 코펜하겐 백시니아)이다. 일부 경우에, 재조합 VV는 mIL-2v 폴리펩티드 대신, 상기 기재된 바와 같은 인간 IL-2 변이체 (hIL-2v) 폴리펩티드를 포함한다.
일부 구체적인 경우에, 본 개시내용의 재조합 OV는 VV39 (mIL-2v 트랜스진을 함유하는 웨스턴 리저브 백시니아)이다. 일부 경우에, 재조합 VV는 mIL-2v 폴리펩티드 대신, 상기 기재된 바와 같은 인간 IL-2 변이체 (hIL-2v) 폴리펩티드를 포함한다.
일부 다른 구체적인 실시양태에서, 본 개시내용의 재조합 OV는 실시예에 기재된 바와 같은 VV97, VV98, VV110, 또는 VV117이다.
C-1B. 이종 티미딘 키나제 (TK) 폴리펩티드
일부 실시양태에서, 상기 본원에 기재된 바와 같은 IL-2 변이체를 코딩하는 삽입된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 복제-적격, 재조합 종양용해성 백시니아 바이러스는 이종 티미딘 키나제 (TK) 폴리펩티드를 코딩하는 삽입된 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 이종 TK 폴리펩티드는 단순 포진 바이러스 TK (HSV-TK) 폴리펩티드의 변이체이다. 야생형 HSV-TK의 변이체는 또한 본원에서 "HSV-TKv"로 지칭된다. HSV-TKv는 일부 경우에 유형 I TK 폴리펩티드, 즉, 각각 dG 모노포스페이트를 생성하는 데옥시구아노신 (dG)의 인산화를 촉매할 수 있는 TK 폴리펩티드이다.
일부 경우에, 이종 TK-코딩 뉴클레오티드 서열, 예컨대 HSV-TKv를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 백시니아 바이러스 TK-코딩 뉴클레오티드 서열의 전부 또는 일부를 대체한다. 야생형 백시니아 바이러스에서, J2R 영역은 백시니아 바이러스 TK를 코딩한다. 예를 들어, 일부 경우에, 이종 TK 폴리펩티드-코딩 뉴클레오티드 서열은 백시니아 바이러스의 J2R 영역의 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 75%, 또는 100%를 대체한다. 일부 경우에, 본 개시내용의 복제-적격, 재조합 종양용해성 백시니아 바이러스는 내인성 (백시니아 바이러스-코딩된) TK-코딩 유전자의 전사가 감소되거나 제거되도록 변형을 포함한다. 예를 들어, 일부 경우에, 내인성 (백시니아 바이러스-코딩된) TK-코딩 유전자의 전사는 변형이 없는 내인성 (백시니아 바이러스-코딩된) TK-코딩 유전자의 전사에 비해, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 90% 초과 감소된다.
일부 경우에, 복제-적격, 재조합 종양용해성 백시니아 바이러스의 복제는 야생형 HSV-TK 폴리펩티드를 코딩하는 복제-적격, 재조합 종양용해성 백시니아 바이러스의 복제가 억제되는 농도보다 더 낮은 농도에서 간시클로비르로 억제된다. 예를 들어, 야생형 HSV-TK의 변이체를 코딩하는 본 개시내용의 복제-적격, 재조합 종양용해성 백시니아 바이러스의 복제가 최대의 50% 억제되는 간시클로비르 억제 농도 (IC50)는 야생형 HSV-TK 폴리펩티드를 코딩하는 복제-적격, 재조합 종양용해성 백시니아 바이러스의 복제의 억제에 대한 간시클로비르 IC50보다 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 또는 적어도 80% 더 낮다.
일부 실시양태에서, 복제-적격, 재조합 종양용해성 백시니아 바이러스에 존재하는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 이종 TK 폴리펩티드는 야생형 HSV-TK의 변이체이고, 여기서 TKv 폴리펩티드는 야생형 HSV-TK (서열식별번호: 25)에 비해 1개 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 복제-적격, 재조합 종양용해성 백시니아 바이러스에 존재하는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 HSV-TKv 폴리펩티드는 야생형 HSV-TK에 비해 1 내지 40개의 아미노산 치환을 포함한다. 예를 들어, 본 개시내용의 복제-적격, 재조합 종양용해성 백시니아 바이러스에 존재하는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 TKv 폴리펩티드는 야생형 HSV-TK (서열식별번호: 25)에 비해 1 내지 5개, 5 내지 10개, 10 내지 15개, 15 내지 20개, 20 내지 25개, 25 내지 30개, 30 내지 35개, 또는 35 내지 40개의 아미노산 치환을 포함한다.
일부 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 재조합 백시니아 바이러스에 존재하는 이종 TK 폴리펩티드는 서열식별번호: 25 (MASYPGHQHASAFDQAARSRGHSNRRTALRPRRQQEATEVRPEQKMPTLLRVYIDGPHGMGKTTTTQLLVALGSRDDIVYVPEPMTYWRVLGASETIANIYTTQHRLDQGEISAGDAAVVMTSAQITMGMPYAVTDAVLAPHIGGEAGSSHAPPPALT LIF DRHPIA AL LCYPAARYLMGSMTPQAVLAFVALIPPTLPGTNIVLGALPEDRHIDRLAKRQRPGERLDLAMLAAIRRVYGLLANTVRYLQGGGSWREDWGQLSGTAVPPQGAEPQSNAGPRPHIGDTLFTLFRAPELLAPNGDLYNVFAWALDVLAKRLRPMHVFILDYDQSPAGCRDALLQLTSGMIQTHVTTPGSIPTICDLARTFAREMGEAN)의 야생형 HSV-TK 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 서열식별번호: 25에 비해 1개 이상의 아미노산 치환을 포함한다.
일부 경우에, 이종 TK 폴리펩티드는 서열식별번호: 25에 제시된 야생형 HSV-TK 아미노산 서열에 비해 1개 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 예를 들어, 일부 경우에, 이종 TK 폴리펩티드는 L159, I160, F161, A168, 및 L169 중 하나 이상의 치환을 포함한다.
일부 경우에, 이종 TK 폴리펩티드는 서열식별번호: 25에 제시된 야생형 HSV-TK 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하지만, L159에 치환을 가지며, 즉, 아미노산 159는 Leu 이외의 것이다. 예를 들어, 아미노산 159는 Gly, Ala, Val, Ile, Pro, Phe, Tyr, Trp, Ser, Thr, Cys, Met, Gln, Asn, Lys, Arg, His, Asp, 또는 Glu이다. 일부 경우에, 치환은 L159I 치환이다. 일부 경우에, 치환은 L159A 치환이다. 일부 경우에, 치환은 L159V 치환이다.
일부 경우에, 이종 TK 폴리펩티드는 서열식별번호: 25에 제시된 야생형 HSV-TK 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하지만, I160에 치환을 가지며, 즉, 아미노산 160은 Ile 이외의 것이다. 예를 들어, 아미노산 160은 Gly, Ala, Val, Leu, Pro, Phe, Tyr, Trp, Ser, Thr, Cys, Met, Gln, Asn, Lys, Arg, His, Asp, 또는 Glu이다. 일부 경우에, 치환은 I160L 치환이다. 일부 경우에, 치환은 I160V 치환이다. 일부 경우에, 치환은 I160A 치환이다. 일부 경우에, 치환은 I160F 치환이다. 일부 경우에, 치환은 I160Y 치환이다. 일부 경우에, 치환은 I160W 치환이다.
일부 경우에, 이종 TK 폴리펩티드는 서열식별번호: 25에 제시된 야생형 HSV-TK 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하지만, F161에 치환을 가지며, 즉, 아미노산 161은 Phe 이외의 것이다. 예를 들어, 아미노산 161은 Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Tyr, Trp, Ser, Thr, Cys, Met, Gln, Asn, Lys, Arg, His, Asp, 또는 Glu이다. 일부 경우에, 치환은 F161A 치환이다. 일부 경우에, 치환은 F161L 치환이다. 일부 경우에, 치환은 F161V 치환이다. 일부 경우에, 치환은 F161I 치환이다.
일부 경우에, 이종 TK 폴리펩티드는 서열식별번호: 25에 제시된 야생형 HSV-TK 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하지만, A168에 치환을 가지며, 즉, 아미노산 168은 Ala 이외의 것이다. 예를 들어, 아미노산 168은 Gly, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Tyr, Trp, Ser, Thr, Cys, Met, Gln, Asn, Lys, Arg, His, Asp, 또는 Glu이다. 일부 경우에, 치환은 A168H이다. 일부 경우에, 치환은 A168R이다. 일부 경우에, 치환은 A168K이다. 일부 경우에, 치환은 A168Y이다. 일부 경우에, 치환은 A168F이다. 일부 경우에, 치환은 A168W이다. 일부 경우에, TKv 폴리펩티드는 A168의 치환 이외의 임의의 다른 치환을 포함하지 않는다.
일부 경우에, 이종 TK 폴리펩티드는 서열식별번호: 25에 제시된 야생형 HSV-TK 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하지만, L169에 치환을 가지며, 즉, 아미노산 169는 Leu 이외의 것이다. 예를 들어, 아미노산 169는 Gly, Ala, Val, Ile, Pro, Phe, Tyr, Trp, Ser, Thr, Cys, Met, Gln, Asn, Lys, Arg, His, Asp, 또는 Glu이다. 일부 경우에, 치환은 L169F이다. 일부 경우에, 치환은 L169M이다. 일부 경우에, 치환은 L169Y이다. 일부 경우에, 치환은 L169W이다.
일부 경우에, 이종 TK 폴리펩티드는 서열식별번호: 25에 제시된 야생형 HSV-TK 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 i) 아미노산 159는 Leu 이외의 것이고; ii) 아미노산 160은 Ile 이외의 것이고; iii) 아미노산 161은 Phe 이외의 것이고; iv) 아미노산 168은 Ala 이외의 것이고; v) 아미노산 169는 Leu 이외의 것이다. 일부 경우에, 이종 TK 폴리펩티드는 하기 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고:
MASYPGHQHASAFDQAARSRGHSNRRTALRPRRQQEATEVRPEQKMPTLLRVYIDGPHGMGKTTTTQLLVALGSRDDIVYVPEPMTYWRVLGASETIANIYTTQHRLDQGEISAGDAAVVMTSAQITMGMPYAVTDAVLAPHIGGEAGSSHVPPPALT ILA DRHPIA YF LCYPAARYLMGSMTPQAVLAFVALIPPTLPGTNIVLGALPEDRHIDRLAKRQRPGERLDLAMLAAIRRVYGLLANTVRYLQGGGSWREDWGQLSGTAVPPQGAEPQSNAGPRPHIGDTLFTLFRAPELLAPNGDLYNVFAWALDVLAKRLRPMHVFILDYDQSPAGCRDALLQLTSGMIQTHVTTPGSIPTICDLARTFAREMGEAN ("dm30"; 서열식별번호: 26), 여기서 아미노산 159는 Ile이고, 아미노산 160은 Leu이고, 아미노산 161은 Ala이고, 아미노산 168은 Tyr이고, 아미노산 169는 Phe이다.
일부 경우에, 이종 TK 폴리펩티드는 서열식별번호: 25에 제시된 야생형 HSV-TK 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 i) 아미노산 159는 Leu 이외의 것이고; ii) 아미노산 160은 Ile 이외의 것이고; iii) 아미노산 161은 Phe 이외의 것이고; iv) 아미노산 168은 Ala 이외의 것이고; v) 아미노산 169는 Leu 이외의 것이다. 일부 경우에, 이종 TK 폴리펩티드는 하기 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고:
MASYPGHQHASAFDQAARSRGHSNRRTALRPRRQQEATEVRPEQKMPTLLRVYIDGPHGMGKTTTTQLLVALGSRDDIVYVPEPMTYWRVLGASETIANIYTTQHRLDQGEISAGDAAVVMTSAQITMGMPYAVTDAVLAPHIGGEAGSSHAPPPALT IFL DRHPIA FM LCYPAARYLMGSMTPQAVLAFVALIPPTLPGTNIVLGALPEDRHIDRLAKRQRPGERLDLAMLAAIRRVYGLLANTVRYLQGGGSWREDWGQLSGTAVPPQGAEPQSNAGPRPHIGDTLFTLFRAPELLAPNGDLYNVFAWALDVLAKRLRPMHVFILDYDQSPAGCRDALLQLTSGMIQTHVTTPGSIPTICDLARTFAREMGEAN ("SR39"; 서열식별번호: 27), 여기서 아미노산 159는 Ile이고, 아미노산 160은 Phe이고, 아미노산 161은 Leu이고, 아미노산 168은 Phe이고, 아미노산 169는 Met이다.
일부 경우에, 이종 TK 폴리펩티드는 서열식별번호: 25에 제시된 야생형 HSV-TK 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 아미노산 168은 Ala 이외의 것이고, 예를 들어, 여기서 아미노산 168은 Gly, Val, Ile, Leu, Pro, Phe, Tyr, Trp, Ser, Thr, Cys, Met, Gln, Asn, Lys, Arg, His, Asp, 또는 Glu이다. 일부 경우에, 아미노산 168은 His이다. 일부 경우에, 아미노산 168은 Arg이다. 일부 경우에, 아미노산 168은 Lys이다. 일부 경우에, 이종 TK 폴리펩티드는 하기 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고:
MASYPGHQHASAFDQAARSRGHSNRRTALRPRRQQEATEVRPEQKMPTLLRVYIDGPHGMGKTTTTQLLVALGSRDDIVYVPEPMTYWRVLGASETIANIYTTQHRLDQGEISAGDAAVVMTSAQITMGMPYAVTDAVLAPHIGGEAGSSHAPPPALTLIFDRHPIA H LLCYPAARYLMGSMTPQAVLAFVALIPPTLPGTNIVLGALPEDRHIDRLAKRQRPGERLDLAMLAAIRRVYGLLANTVRYLQGGGSWREDWGQLSGTAVPPQGAEPQSNAGPRPHIGDTLFTLFRAPELLAPNGDLYNVFAWALDVLAKRLRPMHVFILDYDQSPAGCRDALLQLTSGMIQTHVTTPGSIPTICDLARTFAREMGEAN ("TK.007"; 서열식별번호: 28), 여기서 아미노산 168은 His이다.
아미노산 168이 His인 서열식별번호: 28의 이종 TK 폴리펩티드는 또한 본 개시내용에서 "TK.007" 또는 HSV-TK.007"로 지칭된다.
C-1C. 다른 삽입, 결실, 또는 돌연변이
상기 본원에 기재된 바와 같은 IL-2v 폴리펩티드를 코딩하는 삽입된 뉴클레오티드 서열 및 이종 TK를 코딩하는 삽입된 뉴클레오티드 서열 외에도, 본 개시내용에 의해 제공된 재조합 백시니아 바이러스는 종양용해성 바이러스로서 그의 바람직한 특성을 증가시키거나 증진시키는 추가의 변형, 예컨대 특이적 단백질의 기능을 결핍성이 되게 하여, 특이적 유전자 또는 단백질의 발현을 억제하거나 증진시키는, 또는 외인성 단백질을 발현시키는 변형을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용에 의해 제공된 재조합 백시니아 바이러스는 종양용해성 백시니아 바이러스의 종양-선택성을 증가시키는 하나 이상의 변형을 추가로 포함한다. 본원에 사용된 "종양 선택적"은 정상 세포 (예를 들어, 비-종양 세포)에 대한 그것보다 더 높은 종양 세포에 대한 독성 (예를 들어, 종양용해성)을 의미한다. 이러한 변형의 예는 (1) 바이러스를 백시니아 성장 인자 (VGF)의 기능에서 결핍성이 되게 하는 변형 (McCart et al. (2001) Cancer Research 61:8751); (2) 백시니아 바이러스 TK 유전자, 헤마글루티닌 (HA) 유전자, 또는 F3 유전자 또는 중단된 F3 로커스에 대한 변형 (WO 2005/047458); (3) 백시니아 바이러스를 VGF 및 O1L의 기능에서 결핍성이 되게 하는 변형 (WO 2015/076422); (4) B5R 유전자의 3' 비코딩 영역 내로의 그의 발현이 암 세포에서 감소되는 마이크로 RNA의 삽입 (WO 2011/125469); (5) 백시니아 바이러스를 B18R (Kirn et al. (2007) PLoS Medicine 4:e353), 리보뉴클레오티드 리덕타제 (Gammon et al. (2010) PLoS Pathogens 6:e1000984), 세린 프로테아제 억제제 (예를 들어, SPI-1, SPI-2) (Guo et al. (2005) Cancer Research 65:9991), SPI-1 및 SPI-2 (Yang et al. (2007) Gene Therapy 14:638), 리보뉴클레오티드 리덕타제 유전자 F4L 또는 I4L (Child et al. (1990) Virology 174:625; Potts et al. (2017) EMBO Mol. Med. 9:638), B18R (코펜하겐 균주에서 B19R) (Symons et al. (1995) Cell 81:551), A48R (Hughes et al. (1991) J. Biol. Chem. 266:20103); B8R (Verardi et al. (2001) J. Virol. 75:11), B15R (코펜하겐 균주에서 B16R) (Spriggs et al. (1992) Cell 71:145), A41R (Ng et al. (2001) Journal of General Virology 82:2095), A52R (Bowie et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:10162), F1L (Gerlic et al. (2013) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 110:7808), E3L (Chang et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4825), A44R-A46R (Bowie et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:10162), K1L (Bravo Cruz et al. (2017) Journal of Virology 91:e00524), A48R, B18R, C11R, 및 TK (Mejias-Perez et al. (2017) Molecular Therapy: Oncolytics 8:27), E3L 및 K3L 영역 (WO 2005/007824), 또는 O1L (Schweneker et al. (2012) J. Virol. 86:2323)의 기능에서 결핍성이 되게 하는 변형을 포함한다. 더욱이, 재조합 백시니아 바이러스는 백시니아 바이러스를 B5R의 세포외 영역에서 결핍성 (Bell et al. (2004) Virology 325:425), A34R 영역에서 결핍성 (Thirunavukarasu et al. (2013) Molecular Therapy 21:1024), 인터류킨-1μ (IL-1μ) 수용체에서 결핍성 (WO 2005/030971)이 되게 하는 변형을 포함할 수 있다. 더욱이, 이러한 유전자 변형 중 2개 이상의 조합을 갖는 백시니아 바이러스는 본 개시내용의 복제-적격, 재조합 종양용해성 백시니아 바이러스에 사용될 수 있다. 백시니아 바이러스 게놈 상의 외래 유전자의 이러한 삽입 또는 유전자의 결실 또는 돌연변이는 예를 들어, 공지된 상동 재조합 또는 부위-지정 돌연변이유발에 의해 생성될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "결핍성" 또는 "결핍"은 이 용어에 의해 특정된 유전자 영역 또는 단백질이 감소된 기능을 갖거나, 기능을 갖지 않는 것을 의미한다. 재조합 종양용해성 백시니아 바이러스가 주어진 백시니아 바이러스 유전자에서 "결핍성"이 되도록 변형을 포함하는 본 개시내용의 재조합 종양용해성 백시니아 바이러스는 유전자 생성물 (예를 들어, mRNA 유전자 생성물; 폴리펩티드 유전자 생성물)의 감소된 생산 및/또는 활성을 나타내며; 예를 들어, 유전자 생성물의 양 및/또는 활성은 야생형 백시니아 바이러스에 의해, 또는 유전자 변경을 포함하지 않는 대조군 백시니아 바이러스에 의해 생산되는 동일한 유전자 생성물의 양 및/또는 활성의 75% 미만, 60% 미만, 50% 미만, 40% 미만, 30% 미만, 25% 미만, 20% 미만, 15% 미만, 10% 미만, 5% 미만, 또는 1% 미만이다.
유전자 또는 단백질을 결핍성이 되게 할 수 있는 변형은 i) 이 용어에 의해 특정된 유전자 영역의 돌연변이 (예를 들어, 치환, 역전 등) 및/또는 말단절단 및/또는 결실; ii) 유전자 영역의 발현을 제어하는 프로모터 영역의 돌연변이 및/또는 말단절단 및/또는 결실; 및 iii) 유전자 영역에 의해 코딩되는 폴리펩티드의 번역이 감소되거나 제거되도록 폴리아데닐화 서열의 돌연변이 및/또는 말단절단 및/또는 결실을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 이러한 변형의 예는 특정된 유전자 영역으로 이루어진 영역에서의 결실 또는 특정된 유전자 영역을 포함하는 이웃하는 유전자 영역에서의 결실; 유전자 영역의 전사를 감소시키는 프로모터 영역의 돌연변이 및/또는 말단절단 및/또는 결실이 결핍을 발생시킬 수 있음; 유전자 영역에 의해 코딩되는 폴리펩티드의 번역이 감소되거나 제거되도록 전사 종결 요소의 혼입; 유전자 영역의 전사를 감소시키거나 제거하는 유전자-편집 효소 또는 유전자-편집 복합체 (예를 들어, 가이드 RNA와 복합체화된 CRISPR/Cas 이펙터 폴리펩티드)의 사용을 통해; 유전자 영역의 전사를 감소시키거나 제거하는 경쟁적 역방향 프로모터/폴리머라제 점유의 사용을 통해; 및 유전자 영역 내로의 핵산의 삽입, 그에 의해 유전자 영역의 넉아웃을 포함한다.
일부 구체적인 실시양태에서, 본 개시내용의 재조합 바이러스, 예컨대 백시니아 바이러스는 상기 본원에서 제공된 IL-2v 폴리펩티드를 코딩하는 삽입된 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 바이러스는 바이러스의 내인성 티미딘 키나제 (TK) 활성을 결여한다. 본원에 사용된 용어 "내인성"은 유기체, 예컨대 바이러스, 또는 그의 세포 내에 자연적으로 존재하거나 자연적으로 발현되는 임의의 물질, 예컨대 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, 또는 단백질을 지칭한다. 백시니아 바이러스 TK는 백시니아 바이러스 게놈 상의 TK 유전자 및 오픈-리딩 프레임 (ORF) J2R에 의해 코딩된다. 내인성 TK 활성을 결여한 바이러스는 "티미딘 키나제 결핍성" 또는 "TK 결핍성"인 것으로 지칭될 수 있다. 일부 경우에, 본 개시내용의 재조합 백시니아 바이러스는 백시니아 바이러스가 TK 결핍성이도록, 백시니아 바이러스 TK 코딩 영역의 전부 또는 일부의 결실을 포함한다. 예를 들어, 일부 경우에, 본 개시내용의 복제-적격, 재조합 종양용해성 백시니아 바이러스는 J2R 결실을 포함한다. 예를 들어, 문헌 [Mejia-Perez et al. (2018) Mol. Ther. Oncolytics 8:27]을 참조한다. 일부 경우에, 본 개시내용의 복제-적격, 재조합 종양용해성 백시니아 바이러스는 J2R 영역 내로의 삽입을 포함하고, 그에 의해 감소된 백시니아 바이러스 TK 활성을 발생시키거나, 또는 활성을 발생시키지 않는다. 일부 다른 실시양태에서, 재조합 종양용해성 바이러스는 바이러스 TK 유전자 결핍성 및 B16R 유전자 결핍성 둘 다이다.
일부 다른 실시양태에서, 본 개시내용에 의해 제공된 복제-적격, 재조합 종양용해성 백시니아 바이러스는 자손 비리온의 확산을 증진시키는 변형을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용은 상기 본원에서 제공된 IL-2v 폴리펩티드를 코딩하는 삽입된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 복제-적격, 재조합 종양용해성 백시니아 바이러스를 제공하고, 여기서 바이러스의 A34R 유전자는 K151E 치환 (즉, 코딩된 폴리펩티드에 K151E 치환을 제공하는 변형을 포함함)을 포함한다. 예를 들어, 문헌 [Blasco et al. (1993) J. Virol. 67(6):3319-3325]; 및 [Thirunavukarasu et al. (2013) Mol. Ther. 21:1024]을 참조한다. A34R 유전자는 백시니아 바이러스 gp22-24 (단백질 A34로도 공지됨)를 코딩한다. A34R 유전자는 바이러스 외피 단백질 (A34 단백질)을 코딩한다. 백시니아 바이러스 균주 코펜하겐의 A34 단백질의 아미노산 서열은 유니프롯 (유니프롯KB-P21057 (Q34_VACCC))에서 이용가능하며, 이는 168개의 아미노산으로 이루어진다. K151E 치환을 포함하는 A34 단백질의 아미노산 서열은 서열식별번호: 38 (MKSLNRQTVSMFKKLSVPAAIMMILSTIISGIGTFLHYKEELMPSACANGWIQYDKHCYLDTNIKMSTDNAVYQCRKLRARLPRPDTRHLRVLFSIFYKDYWVSLKKTNNKWLDINNDKDIDISKLTNFKQLNSTTDAEACYIYKSGKLVETVCKSTQSVLCVKKFYK)에 제시된다. K151E 돌연변이를 포함하는 A34 단백질을 코딩하는 A34R 유전자의 뉴클레오티드 서열은 서열식별번호: 39 (ATGAAATCGCTTAATAGACAAACTGTAAGTATGTTTAAGAAGTTGTCGGTGCCGGCCGCTATAATGATGATACTCTCAACCATTATTAGTGGCATAGGAACATTTCTGCATTACAAAGAAGAACTGATGCCTAGTGCTTGCGCCAATGGATGGATACAATACGATAAACATTGTTATCTAGATACCAACATTAAAATGTCCACAGATAATGCGGTTTATCAGTGTCGTAAATTACGAGCTAGATTGCCTAGACCTGATACTAGACATCTGAGAGTATTGTTTAGTATTTTTTATAAAGATTATTGGGTAAGTTTAAAAAAGACCAATAATAAATGGTTAGATATTAATAATGATAAAGATATAGATATTAGTAAATTAACAAATTTTAAACAACTAAACAGTACGACGGATGCTGAAGCGTGTTATATATACAAGTCTGGAAAACTGGTTGAAACAGTATGTAAAAGTACTCAATCTGTACTATGTGTTAAAAAATTCTACAAGTGA) (야생형 유전자 서열에 비해 A415G 돌연변이를 함유함)에 제시된다.
일부 다른 실시양태에서, 본 개시내용에 의해 제공된 재조합 종양용해성 백시니아 바이러스는 (1) IL-2v 폴리펩티드를 코딩하는 삽입된 뉴클레오티드 서열; (2) 이종 TK 폴리펩티드를 코딩하는 삽입된 뉴클레오티드 서열; 및 (3) A34R 유전자에 K151E 치환을 포함하며, 여기서 재조합 백시니아 바이러스는 TK 결핍성이다. 일부 특정 실시양태에서, 재조합 백시니아 바이러스에 의해 코딩되는 IL-2v 폴리펩티드는 서열식별번호: 29의 아미노산 서열과 적어도 95% (예를 들어, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%) 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 아미노산 치환 R58N, L60T, K63N, 및 Y65T를 포함하며, 여기서 아미노산 넘버링은 서열식별번호: 29의 아미노산 서열에 기반한다. 일부 추가의 특정 실시양태에서, 이종 TK 폴리펩티드는 서열식별번호: 28에서의 아미노산 서열과 적어도 95% (예를 들어, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%) 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 아미노산 168은 His이다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용에 의해 제공된 재조합 백시니아 바이러스는 (1) IL-2v 폴리펩티드를 코딩하는 삽입된 뉴클레오티드 서열; (2) 이종 TK 폴리펩티드를 코딩하는 삽입된 뉴클레오티드 서열; 및 (3) A34R 유전자에 K151E 치환을 포함하며, 여기서 재조합 백시니아 바이러스는 균주 코펜하겐이고, TK 결핍성이고, IL-2v 폴리펩티드는 서열식별번호: 29의 아미노산 서열을 포함하고, 이종 TK 폴리펩티드는 서열식별번호: 28의 아미노산 서열을 포함한다.
C-2. 재조합 종양용해성 바이러스의 구축
본 개시내용에 의해 제공된 복제-적격, 재조합 종양용해성 바이러스는 관련 기술분야에 공지된 방법에 의해 구축될 수 있다. 구체적으로, 본 개시내용의 종양용해성 백시니아 바이러스는 현재 공지되어 있거나 장래에 발견될 백시니아 바이러스의 임의의 다양한 균주로부터 구축될 수 있다. 사용하기에 적합한 백시니아 바이러스의 균주는 균주 리스터(Lister), 뉴욕시 보건 위원회(New York City Board of Health) (NYBH), 와이어스(Wyeth), 코펜하겐, 웨스턴 리저브 (WR), 변형된 백시니아 앙카라 (MVA), EM63, 이케다(Ikeda), 달리안(Dalian), LIVP, 티안 탄(Tian Tan), IHD-J, 타쉬켄트(Tashkent), 베른(Bern), 파리(Paris), 다롄(Dairen), 및 유도체 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 경우에, 본 개시내용의 복제-적격, 재조합 종양용해성 백시니아 바이러스는 코펜하겐 균주 백시니아 바이러스이다. 일부 경우에, 본 개시내용의 복제-적격, 재조합 종양용해성 백시니아 바이러스는 WR 균주 백시니아 바이러스이다.
다양한 균주의 백시니아 바이러스의 게놈의 뉴클레오티드 서열은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Goebel et al. (1990) Virology 179:247]; [Goebel et al. (1990) Virology 179:517]을 참조한다. 코펜하겐 균주 백시니아 바이러스의 뉴클레오티드 서열은 공지되어 있으며; 예를 들어, 진뱅크(GenBank) 수탁 번호 M35027을 참조한다. WR 균주 백시니아 바이러스의 뉴클레오티드 서열은 공지되어 있으며; 예를 들어, 진뱅크 수탁 번호 AY243312; 및 진뱅크 수탁 번호 NC_006998을 참조한다. 백시니아 바이러스의 WR 균주는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection) (ATCC); ATCC VR-1354로부터 입수가능하다.
본 개시내용의 복제-적격, 재조합 종양용해성 바이러스, 예컨대 백시니아 바이러스는 종양용해 활성을 나타낸다. 바이러스의 종양용해 활성은 관련 기술분야에 공지된 임의의 적합한 방법에 의해 평가될 수 있다. 주어진 바이러스가 종양용해 활성을 나타내는지 여부를 평가하는 방법의 예는 바이러스의 첨가에 의한 암 세포의 생존율의 감소를 평가하는 시험관내 방법을 포함한다. 사용될 수 있는 암 세포 또는 세포주의 예는 악성 흑색종 세포 RPMI-7951 (예를 들어, ATCC HTB-66), 폐 선암종 HCC4006 (예를 들어, ATCC CRL-2871), 폐 암종 A549 (예를 들어, ATCC CCL-185), 폐 암종 HOP-62 (예를 들어, DCTD 튜머 레포지토리(Tumor Repository)), 폐 암종 EKVX (예를 들어, DCTD 튜머 레포지토리), 소세포 폐암 세포 DMS 53 (예를 들어, ATCC CRL-2062), 폐 편평 세포 암종 NCI-H226 (예를 들어, ATCC CRL-5826), 신장암 세포 Caki-1 (예를 들어, ATCC HTB-46), 방광암 세포 647-V (예를 들어, DSMZ ACC 414), 두경부암 세포 디트로이트(Detroit) 562 (예를 들어, ATCC CCL-138), 유방암 세포 JIMT-1 (예를 들어, DSMZ ACC 589), 유방암 세포 MDA-MB-231 (예를 들어, ATCC HTB-26), 유방암 세포 MCF7 (예를 들어, ATCC HTB-22), 유방암 HS-578T (예를 들어, ATCC HTB-126), 유방 도관 암종 T-47D (예를 들어, ATCC HTB-133), 식도암 세포 OE33 (예를 들어, ECACC 96070808), 교모세포종 U-87MG (예를 들어, ECACC 89081402), 신경모세포종 GOTO (예를 들어, JCRB JCRB0612), 골수종 RPMI 8226 (예를 들어, ATCC CCL-155), 난소암 세포 SK-OV-3 (예를 들어, ATCC HTB-77), 난소암 세포 OVMANA (예를 들어, JCRB JCRB1045), 자궁경부암 HeLa (예를 들어, ATCC CCL-2), 결장암 세포 RKO (예를 들어, ATCC CRL-2577), 결장암 세포 HT-29 (예를 들어, ATCC HTB-38), 결장암 콜로(Colo) 205 (예를 들어, ATCC CCL-222), 결장암 SW620 (예를 들어, ATCC CCL-227), 결장직장 암종 HCT 116 (예를 들어, ATCC CCL-247), 췌장암 세포 BxPC-3 (예를 들어, ATCC CRL-1687), 골 골육종 U-2 OS (예를 들어, ATCC HTB-96), 전립선암 세포 LNCaP 클론 FGC (예를 들어, ATCC CRL-1740), 간세포 암종 JHH-4 (예를 들어, JCRB JCRB0435), 중피종 NCI-H28 (예를 들어, ATCC CRL-5820), 자궁경부암 세포 SiHa (예를 들어, ATCC HTB-35), 및 위암 세포 카토(Kato) III (예를 들어, RIKEN BRC RCB2088)을 포함한다.
IL-2 변이체 폴리펩티드 또는 이종 TK 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산은 헬퍼 바이러스로의 재활성화 및 상동 재조합을 포함한 확립된 기술을 사용하여 백시니아 바이러스 내로 도입될 수 있다. 예를 들어, IL-2 변이체 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산이 삽입된 플라스미드 (전달 벡터 플라스미드 DNA로도 지칭됨)가 생성되어 재조합 전달 벡터를 생성할 수 있으며; 재조합 전달 벡터는 백시니아 바이러스로 감염된 세포 내로 도입될 수 있다. 이어서 IL-2v 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산은 상동 재조합을 통해 재조합 전달 벡터로부터 백시니아 바이러스 내로 도입된다.
유사하게, 이종 TK 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 삽입된 플라스미드 (전달 벡터 플라스미드 DNA로도 지칭됨)가 생성되어 재조합 전달 벡터를 생성할 수 있으며; 재조합 전달 벡터는 백시니아 바이러스로부터 소화된 게놈 DNA로 형질감염되고 헬퍼 바이러스로 감염된 세포 내로 도입될 수 있다. 이어서 TKv 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 상동 재조합을 통해 재조합 전달 벡터로부터 백시니아 바이러스 내로 도입된다. TKv 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 도입되는 영역은 내인성 백시니아 바이러스 TK-코딩 유전자, 예를 들어, J2R일 수 있다. TKv 폴리펩티드를 코딩하는 핵산은 백시니아 바이러스 J2R의 전부 또는 일부를 대체할 수 있다.
일부 경우에, IL-2v 폴리펩티드 또는 이종 TK 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 전사 제어 요소, 예를 들어, 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 일부 경우에, 프로모터는 종양 세포에서 폴리펩티드의 발현을 제공한다. 적합한 프로모터는 pSEL 프로모터, PSFJ1-10 프로모터, PSFJ2-16 프로모터, pHyb 프로모터, 후기-초기 최적화된 프로모터, p7.5K 프로모터, p11K 프로모터, T7.10 프로모터, CPX 프로모터, 변형된 H5 프로모터, H4 프로모터, HF 프로모터, H6 프로모터, 및 T7 하이브리드 프로모터를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
일부 경우에, IL-2v 폴리펩티드 또는 이종 TK 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 조절성 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 일부 경우에, 조절성 프로모터는 가역성 프로모터이다. 일부 경우에, IL-2v 폴리펩티드 또는 이종 TK 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 테트라시클린-조절된 프로모터 (예를 들어, 프로모터 시스템, 예컨대 테트액티베이터(TetActivator), 테트온(TetON), 테트오프(TetOFF), 테트-온 어드밴스드(Tet-On Advanced), 테트-온 3G(Tet-On 3G) 등)에 작동가능하게 연결된다. 일부 경우에, IL-2v 폴리펩티드 또는 이종 TK 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 억제성 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 일부 경우에, IL-2v 폴리펩티드 또는 이종 TK 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 테트라시클린 억제성인 프로모터에 작동가능하게 연결되며, 예를 들어, 프로모터는 테트라시클린 또는 테트라시클린 유사체 또는 유도체의 존재 하에서 억제된다. 일부 경우에, IL-2v 폴리펩티드 또는 이종 TK 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 테트오프 프로모터 시스템에 작동가능하게 연결된다. Bujard and Gossen (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5547. 예를 들어, 테트오프 프로모터 시스템은 테트라시클린 (또는 적합한 유사체 또는 유도체, 예컨대 독시시클린)의 존재 하에서 억제되며 (불활성화되며); 테트라시클린이 제거되면, 프로모터는 활성이고, 폴리펩티드의 발현을 유도한다. 일부 경우에, IL-2v 폴리펩티드 또는 이종 TK 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 테트라시클린 활성화가능한 프로모터에 작동가능하게 연결되며, 예를 들어, 프로모터는 테트라시클린 또는 테트라시클린 유사체 또는 유도체의 존재 하에서 활성화된다.
IL-2v 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산이 도입되는 영역은 백시니아 바이러스의 생활 주기에 비필수적인 유전자 영역일 수 있다. 예를 들어, IL-2v 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산이 도입되는 영역은 VGF 기능에서 결핍성인 백시니아 바이러스 중의 VGF 유전자 내의 영역, O1L 기능에서 결핍성인 백시니아 바이러스 중의 O1L 유전자 내의 영역, 또는 VGF 및 O1L 기능 둘 다에서 결핍성인 백시니아 바이러스 중의 VGF 및 O1L 유전자 중 어느 하나 또는 둘 다 내의 영역 또는 영역들일 수 있다. 상기에서, 외래 유전자(들)는 VGF 및 O1L 유전자의 그것과 동일한 또는 반대의 방향에서 전사되도록 도입될 수 있다. 또 다른 예로서, IL-2v 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산이 도입되는 영역은 B18 (B19) 기능에서 결핍성인 백시니아 바이러스 중의 B18 유전자 (코펜하겐에서 B19) 내의 영역일 수 있다. 특정 실시양태에서, IL-2 변이체 폴리펩티드를 코딩하는 삽입된 뉴클레오티드 서열은 내인성 백시니아 바이러스 TK-코딩 유전자, 예를 들어, J2R의 영역에 위치한다. IL-2 변이체 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 바이러스 J2R 유전자의 전체 또는 부분을 대체할 수 있다. 또 다른 특정 실시양태에서, 이종 tk, 예컨대 HSV-tk.007 폴리펩티드를 코딩하는 삽입된 뉴클레오티드 서열은 바이러스 B16R 유전자 (웨스턴 리저브와 같은 다른 백시니아 바이러스 균주에서 B15R 유전자로 지칭됨)의 영역에 위치하고, B16R 유전자의 전체 또는 부분을 대체할 수 있다.
C-3. 재조합 종양용해성 바이러스를 포함하는 조성물
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 본 개시내용에 의해 제공된 재조합 종양용해성 바이러스, 예컨대 백시니아 바이러스를 포함하는 조성물을 제공한다. 조성물은 포함되는 특정 활성 성분에 적합한 임의의 형태, 예컨대 용액 또는 현탁액일 수 있다. 일부 경우에, 조성물은 인간에의 투여에 적합한 제약 조성물이다.
일부 실시양태에서, 제약 조성물은 제약상 허용되는 담체를 추가로 포함한다. 본원에 사용된 용어 "약리학상 허용되는 담체"는 활성 성분과 조합되는 경우, 활성 성분이 생물학적 활성을 보유하는 것을 허용하고, 대상체에게 투여되는 경우 유의한 장기 또는 영구적인 유해한 효과를 갖지 않는 임의의 물질 또는 물질을 지칭하며, 약리학상 허용되는 "비히클", "안정화제", "희석제", "보조제" 또는 "부형제"와 같은 용어를 포괄한다. 이러한 담체는 일반적으로 활성 성분 (예를 들어, 본 개시내용의 IL-2 변이체, 또는 융합 분자, 또는 재조합 종양용해성 백시니아 바이러스)과 혼합되며, 고체, 반-고체, 또는 액체 작용제일 수 있다. 제한 없이, 완충제, 보존제, 긴장성 조정제, 염, 항산화제, 벌크화제, 유화제, 습윤화제 등을 포함한 임의의 다양한 제약상 허용되는 담체가 사용될 수 있다. 다양한 완충제 및 pH를 조정하기 위한 수단은, 생성된 제제가 제약상 허용되는 한, 본 명세서에 개시된 제약 조성물을 제조하는데 사용될 수 있다. 이러한 완충제는 제한 없이, 아세테이트 완충제, 시트레이트 완충제, 포스페이트 완충제, 중성 완충 염수, 포스페이트 완충 염수 및 보레이트 완충제를 포함한다. 산 또는 염기는 필요에 따라 조성물의 pH를 조정하는데 사용될 수 있음이 이해된다. 제약상 허용되는 항산화제는 제한 없이, 나트륨 메타비술파이트, 나트륨 티오술페이트, 아세틸시스테인, 부틸화 히드록시아니솔 및 부틸화 히드록시톨루엔을 포함한다. 유용한 보존제는 제한 없이, 벤즈알코늄 클로라이드, 클로로부탄올, 티메로살, 페닐머큐르산 아세테이트, 페닐머큐르산 니트레이트 및 안정화된 옥시 클로로 조성물, 예를 들어, 퓨라이트(PURITE)™를 포함한다. 대상 제약 조성물에 포함시키기에 적합한 긴장성 조정제는 제한 없이, 염, 예컨대, 예를 들어, 염화나트륨, 염화칼륨, 만니톨 또는 글리세린 및 다른 제약상 허용되는 긴장성 조정제를 포함한다. 약리학의 관련 기술분야에 공지된 이들 및 다른 물질은 대상 제약 조성물에 포함될 수 있음이 이해된다.
본 개시내용의 재조합 종양용해성 바이러스를 포함하는 제약 조성물은 ml당 약 102 플라크-형성 단위 (pfu) (pfu/ml) 내지 약 104 pfu/ml, 약 104 pfu/ml 내지 약 105 pfu/ml, 약 105 pfu/ml 내지 약 106 pfu/ml, 약 106 pfu/ml 내지 약 107 pfu/ml, 약 107 pfu/ml 내지 약 108 pfu/ml, 약 108 pfu/ml 내지 약 109 pfu/ml, 약 109 pfu/ml 내지 약 1010 pfu/ml, 약 1010 pfu/ml 내지 약 1011 pfu/ml, 또는 약 1011 pfu/ml 내지 약 1012 pfu/ml의 양으로 바이러스를 함유할 수 있다.
C-4. 재조합 종양용해성 바이러스의 용도
C-4A. 용도 및 투여
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 재조합 종양용해성 바이러스 및 재조합 종양용해성 바이러스를 포함하는 조성물의 용도, 뿐만 아니라 이를 사용하는 방법을 제공한다. 용도 또는 방법은 종양을 갖는 개체에서 종양용해를 유도하거나, 암을 치료하기 위한 것들을 포함하며, 방법은 본 개시내용의 복제-적격, 재조합 종양용해성 백시니아 바이러스 또는 본 개시내용의 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 것을 포함한다. 본 개시내용의 바이러스의 투여는 또한 본원에서 "바이러스요법"으로 지칭된다.
일부 경우에, 본 개시내용의 복제-적격, 재조합 종양용해성 바이러스의 "유효량"은, 이를 필요로 하는 개체에게 1개 이상의 용량으로 투여되는 경우, 개체에서 암 세포의 수 또는 종양 질량을 감소시키는 양이다. 예를 들어, 일부 경우에, 복제-적격, 재조합 종양용해성 백시니아 바이러스의 "유효량"은, 이를 필요로 하는 개체에게 1개 이상의 용량으로 투여되는 경우, 개체에서의 암 세포의 수를 재조합 바이러스의 투여 전의, 또는 재조합 백시니아 바이러스로의 투여의 부재 하에서의 개체에서의 암 세포의 수에 비해 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 감소시키는 양이다. 일부 경우에, 재조합 바이러스의 "유효량"은, 이를 필요로 하는 개체에게 1개 이상의 용량으로 투여되는 경우, 개체에서의 암 세포의 수를 비검출가능한 수준으로 감소시키는 양이다. 일부 경우에, 본 개시내용의 재조합 백시니아 바이러스의 "유효량"은, 이를 필요로 하는 개체에게 1개 이상의 용량으로 투여되는 경우, 개체에서 종양 질량을 감소시키는 양이다. 예를 들어, 일부 경우에, 본 개시내용의 재조합 백시니아 바이러스의 "유효량"은, 이를 필요로 하는 개체에게 1개 이상의 용량으로 투여되는 경우, 개체에서의 종양 질량을 재조합 바이러스의 투여 전의, 또는 복제-적격, 재조합 종양용해성 바이러스로의 투여의 부재 하에서의 개체에서의 종양 질량에 비해 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 감소시키는 양이다.
일부 경우에, 본 개시내용의 재조합 바이러스의 "유효량"은, 이를 필요로 하는 개체에게 1개 이상의 용량으로 투여되는 경우, 개체의 생존 시간을 증가시키는 양이다. 예를 들어, 일부 경우에, 본 개시내용의 재조합 바이러스의 "유효량"은, 이를 필요로 하는 개체에게 1개 이상의 용량으로 투여되는 경우, 개체의 생존 시간을 재조합 종양용해성 바이러스로의 투여의 부재 하에서의 개체의 예상된 생존 시간에 비해 적어도 1개월, 적어도 2개월, 적어도 3개월, 3개월 내지 6개월, 6개월 내지 1년, 1년 내지 2년, 2년 내지 5년, 5년 내지 10년, 또는 10년 초과 증가시키는 양이다.
일부 경우에, 본 개시내용의 재조합 종양용해성 바이러스의 "유효량"은, 이를 필요로 하는 개체에게 1개 이상의 용량으로 투여되는 경우, IFN-γ-생산 T 세포의 수의 증가를 제공하는 양이다. 예를 들어, 일부 경우에, 본 개시내용의 재조합 바이러스의 "유효량"은, 이를 필요로 하는 개체에게 1개 이상의 용량으로 투여되는 경우, 복제-적격, 재조합 종양용해성 바이러스의 투여 전의, 또는 복제-적격, 재조합 종양용해성 바이러스로의 투여의 부재 하에서의 개체에서의 IFN-γ-생산 T 세포의 수에 비해 적어도 10%, 적어도 25%, 적어도 50%, 적어도 2배, 적어도 5배, 또는 적어도 10배의 IFN-γ-생산 T 세포의 수의 증가를 제공하는 양이다.
일부 경우에, 본 개시내용의 재조합 바이러스의 "유효량"은, 이를 필요로 하는 개체에게 1개 이상의 용량으로 투여되는 경우, 개체에서의 IL-2 또는 IL-2v의 순환 수준의 증가를 제공하는 양이다. 예를 들어, 일부 경우에, 재조합 바이러스의 "유효량"은, 이를 필요로 하는 개체에게 1개 이상의 용량으로 투여되는 경우, 종양용해성 바이러스의 투여 전의, 또는 종양용해성 백시니아 바이러스로의 투여의 부재 하에서의 개체에서의 IL-2 또는 IL-2v의 순환 수준에 비해 적어도 10%, 적어도 25%, 적어도 50%, 적어도 2배, 적어도 5배, 또는 적어도 10배의 개체에서의 IL-2 또는 IL-2v의 순환 수준의 증가를 제공하는 양이다.
일부 경우에, 본 개시내용의 재조합 종양용해성 바이러스의 "유효량"은, 이를 필요로 하는 개체에게 1개 이상의 용량으로 투여되는 경우, 개체에서의 IL-2v 폴리펩티드의 순환 수준의 증가를 제공하는 양이다. 예를 들어, 일부 경우에, 본 개시내용의 재조합 바이러스의 "유효량"은, 이를 필요로 하는 개체에게 1개 이상의 용량으로 투여되는 경우, 종양용해성 백시니아 바이러스의 투여 전의, 또는 종양용해성 백시니아 바이러스로의 투여의 부재 하에서의 개체에서의 IL-2v 폴리펩티드의 순환 수준에 비해 적어도 10%, 적어도 25%, 적어도 50%, 적어도 2배, 적어도 5배, 또는 적어도 10배의 개체에서의 IL-2v 폴리펩티드의 순환 수준의 증가를 제공하는 양이다.
일부 경우에, 본 개시내용의 재조합 종양용해성 바이러스의 "유효량"은, 이를 필요로 하는 개체에게 1개 이상의 용량으로 투여되는 경우, CD8+ 종양-침윤 림프구 (TIL)의 수의 증가를 제공하는 양이다. 예를 들어, 일부 경우에, 바이러스의 "유효량"은, 이를 필요로 하는 개체에게 1개 이상의 용량으로 투여되는 경우, 바이러스의 투여 전의, 또는 바이러스로의 투여의 부재 하에서의 개체에서의 CD8+ TIL의 수에 비해 적어도 10%, 적어도 25%, 적어도 50%, 적어도 2배, 적어도 5배, 또는 적어도 10배의 CD8+ TIL의 수의 증가를 제공하는 양이다.
일부 경우에, 본 개시내용의 재조합 종양용해성 바이러스의 "유효량"은, 이를 필요로 하는 개체에게 1개 이상의 용량으로 투여되는 경우, 지속성 있는 항-종양 면역 반응, 예를 들어, 적어도 1개월, 적어도 2개월, 적어도 6개월, 또는 적어도 1년 동안 종양 세포 수 및/또는 종양 질량 및/또는 종양 성장의 감소를 제공하는 항-종양 면역 반응을 유도하는 양이다.
적합한 투여량은 다양한 임상적 인자에 기반하여, 담당 의사 또는 다른 자격 있는 의료인에 의해 결정될 수 있다. 의학 기술분야에 널리 공지된 바와 같이, 임의의 한 환자에 대한 투여량은 환자의 크기, 체표면적, 연령, 종양 부담, 및 다른 관련 인자를 포함한 많은 인자에 의존한다.
본 개시내용의 재조합 바이러스는 용량당 약 102 플라크-형성 단위 (pfu) 내지 약 104 pfu, 약 104 pfu 내지 약 105 pfu, 약 105 pfu 내지 약 106 pfu, 약 106 pfu 내지 약 107 pfu, 약 107 pfu 내지 약 108 pfu, 약 108 pfu 내지 약 109 pfu, 약 109 pfu 내지 약 1010 pfu, 또는 약 1010 pfu 내지 약 1011 pfu의 양으로 투여될 수 있다.
일부 경우에, 본 개시내용의 재조합 바이러스는 약 1 x 109 pfu 내지 5 x 1011 pfu의 총량으로 투여된다. 일부 경우에, 본 개시내용의 재조합 백시니아 바이러스는 약 1 x 109 pfu 내지 약 5 x 109 pfu, 약 5 x 109 pfu 내지 약 1010 pfu, 약 1010 pfu 내지 약 5 x 1010 pfu, 약 5 x 1010 pfu 내지 약 1011 pfu, 또는 약 1011 pfu 내지 약 5 x 1011 pfu의 총량으로 투여된다. 일부 경우에, 본 개시내용의 재조합 백시니아 바이러스는 약 2 x 1010 pfu의 총량으로 투여된다.
일부 경우에, 본 개시내용의 재조합 바이러스는 약 1 x 108 pfu/kg 환자 중량 내지 약 5 x 109 pfu/kg 환자 중량의 양으로 투여된다. 일부 경우에, 본 개시내용의 재조합 백시니아 바이러스는 약 1 x 108 pfu/kg 환자 중량 내지 약 5 x 108 pfu/kg 환자 중량, 약 5 x 108 pfu/kg 환자 중량 내지 약 109 pfu/kg 환자 중량, 또는 약 109 pfu/kg 환자 중량 내지 약 5 x 109 pfu/kg 환자 중량의 양으로 투여된다. 일부 경우에, 본 개시내용의 재조합 바이러스는 1 x 108 pfu/kg 환자 중량의 양으로 투여된다. 일부 경우에, 본 개시내용의 재조합 백시니아 바이러스는 2 x 108 pfu/kg 환자 중량의 양으로 투여된다. 일부 경우에, 본 개시내용의 재조합 백시니아 바이러스는 3 x 108 pfu/kg 환자 중량의 양으로 투여된다. 일부 경우에, 본 개시내용의 재조합 바이러스는 4 x 108 pfu/kg 환자 중량의 양으로 투여된다. 일부 경우에, 본 개시내용의 재조합 바이러스는 5 x 108 pfu/kg 환자 중량의 양으로 투여된다.
일부 경우에, 본 개시내용의 재조합 바이러스의 다중 용량이 투여된다. 본 개시내용의 재조합 바이러스의 투여의 빈도는 임의의 다양한 인자, 예를 들어, 증상의 중증도 등에 따라 다양할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 재조합 백시니아 바이러스는 1개월당 1회, 1개월당 2회, 1개월당 3회, 격주로 (qow), 1주당 1회 (qw), 1주당 2회 (biw), 1주당 3회 (tiw), 1주당 4회, 1주당 5회, 1주당 6회, 격일로 (qod), 매일 (qd), 1일 2회 (bid), 또는 1일 3회 (tid) 투여된다.
본 개시내용의 재조합 바이러스의 투여의 지속기간은 임의의 다양한 인자, 예를 들어, 환자 반응 등에 따라 다양할 수 있다. 예를 들어, 본 개시내용의 재조합 바이러스는 약 1일 내지 약 1주, 약 2주 내지 약 4주, 약 1개월 내지 약 2개월, 약 2개월 내지 약 4개월, 약 4개월 내지 약 6개월, 약 6개월 내지 약 8개월, 약 8개월 내지 약 1년, 약 1년 내지 약 2년, 또는 약 2년 내지 약 4년, 또는 그 초과의 범위의 기간에 걸쳐 투여될 수 있다.
본 개시내용의 재조합 종양용해성 바이러스는 생체내 및 생체외 방법, 뿐만 아니라 전신 및 국소화된 투여의 경로를 포함한 약물 전달에 적합한 임의의 이용가능한 방법 및 경로를 사용하여 개체에게 투여된다.
통상적인 및 제약상 허용되는 투여의 경로는 종양내, 종양주위, 근육내, 기관내, 경막내, 두개내, 피하, 진피내, 국소 적용, 정맥내, 동맥내, 복강내, 방광내, 직장, 비내, 경구, 및 다른 장내 및 비경구 투여의 경로를 포함한다. 투여의 경로는 바람직할 경우 조합되거나, 재조합 백시니아 바이러스 및/또는 바람직한 효과에 따라 조정될 수 있다. 본 개시내용의 재조합 백시니아 바이러스는 단일 용량으로 또는 다중 용량으로 투여될 수 있다.
일부 경우에, 본 개시내용의 재조합 종양용해성 바이러스는 정맥내로, 근육내로, 국소로, 종양내로, 종양주위로, 두개내로, 피하로, 동맥내로, 복강내로, 방광내 투여의 경로를 통해, 또는 경막내로 투여된다.
C-4B. 조합물
일부 경우에, 본 개시내용의 재조합 종양용해성 바이러스는 또 다른 요법 또는 작용제와 조합으로 투여된다. 예를 들어, 재조합 바이러스는 표준 암 요법에 대한 아주반트 요법으로서 투여되거나, 또 다른 암 요법과 조합으로 투여되거나, 재조합 백시니아 바이러스의 항-종양 효과를 증진시키는 작용제와 조합으로 투여될 수 있다. 표준 암 요법은 수술 (예를 들어, 암성 조직의 외과적 제거), 방사선 요법, 골수 이식, 화학치료적 치료, 항체 치료, 생물학적 반응 변형제 치료, 면역요법 치료, 및 상기의 특정 조합을 포함한다. 따라서, 한 실시양태에서, 본 개시내용은 a) 본 개시내용의 재조합 백시니아 바이러스, 또는 이를 포함하는 조성물; 및 b) 제2 암 요법을 암의 치료를 필요로 하는 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 암을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 경우에, 제2 암 요법은 화학요법, 생물학적 요법 (예컨대 항체로의 요법), 방사선요법, 면역요법, 호르몬 요법, 항-혈관 요법, 냉동요법, 독소 요법, 종양용해성 바이러스 요법 (예를 들어, 본 개시내용의 재조합 백시니아 바이러스 이외의 종양용해성 바이러스), 세포 요법, 및 수술로부터 선택된다.
방사선 요법은 외부적으로 적용된 공급원, 예컨대 빔으로부터, 또는 작은 방사성 공급원의 삽입에 의해 전달되는 x-선 또는 감마 선을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
암 치료에 사용하기 위한 적합한 항체의 예는 트라스투주맙 (헤르셉틴(Herceptin)), 베바시주맙 (아바스틴(Avastin)™), 세툭시맙 (에르비툭스(Erbitux)™), 파니투무맙 (벡티빅스(Vectibix)™), 이필리무맙 (예르보이(Yervoy)™), 리툭시맙 (리툭산(Rituxan)), 알렘투주맙 (렘트라다(Lemtrada)™), 오파투무맙 (아르제라(Arzerra)™), 오레고보맙 (오바렉스(OvaRex)™), 람브롤리주맙 (MK-3475), 페르투주맙 (페르제타(Perjeta)™), 라니비주맙 (루센티스(Lucentis)™) 등, 및 접합된 항체, 예를 들어, 겜투주맙 오조가미신 (밀로르타르그(Mylortarg)™), 브렌툭시맙 베도틴 (아드세트리스(Adcetris)™), 90Y-표지된 이브리투모맙 티욱세탄 (제발린(Zevalin)™), 131I-표지된 토시투모맙 (벡사르(Bexxar)™) 등을 포함한다. 암 치료에 사용하기 위한 적합한 항체는 예를 들어, CTLA-4를 표적화하는 이필리무맙 (흑색종, 전립선암, RCC의 치료에 사용되는 바와 같음); CTLA-4를 표적화하는 트레멜리무맙 (CRC, 위암, 흑색종, NSCLC의 치료에 사용되는 바와 같음); PD-1을 표적화하는 니볼루맙 (흑색종, NSCLC, RCC의 치료에 사용되는 바와 같음); PD-1을 표적화하는 MK-3475 (흑색종의 치료에 사용되는 바와 같음); PD-1을 표적화하는 피딜리주맙 (혈액 악성종양의 치료에 사용되는 바와 같음); PD-L1을 표적화하는 BMS-936559 (흑색종, NSCLC, 난소암, RCC의 치료에 사용되는 바와 같음); PD-L1을 표적화하는 MEDI4736; PD-L1을 표적화하는 MPDL33280A (흑색종의 치료에 사용되는 바와 같음); CD20을 표적화하는 리툭시맙 (비-호지킨 림프종의 치료에 사용되는 바와 같음); 이브리투모맙 티욱세탄 및 토시투모맙 (림프종의 치료에 사용되는 바와 같음); CD30을 표적화하는 브렌툭시맙 베도틴 (호지킨 림프종의 치료에 사용되는 바와 같음); CD33을 표적화하는 겜투주맙 오조가미신 (급성 골수성 백혈병의 치료에 사용되는 바와 같음); CD52를 표적화하는 알렘투주맙 (만성 림프구성 백혈병의 치료에 사용되는 바와 같음); EpCAM을 표적화하는 IGN101 및 아데카투무맙 (상피 종양 (유방암, 결장암 및 폐암)의 치료에 사용되는 바와 같음); CEA를 표적화하는 라베투주맙 (유방, 결장 및 폐 종양의 치료에 사용되는 바와 같음); gpA33을 표적화하는 huA33 (결장직장 암종의 치료에 사용되는 바와 같음); 뮤신을 표적화하는 펨투모맙 및 오레고보맙 (유방, 결장, 폐 및 난소 종양의 치료에 사용되는 바와 같음); TAG-72를 표적화하는 CC49 (민레투모맙) (유방, 결장 및 폐 종양의 치료에 사용되는 바와 같음); CAIX를 표적화하는 cG250 (신세포 암종의 치료에 사용되는 바와 같음); PSMA를 표적화하는 J591 (전립선 암종의 치료에 사용되는 바와 같음); 폴레이트-결합 단백질을 표적화하는 MOv18 및 MORAb-003 (파를레투주맙) (난소 종양의 치료에 사용되는 바와 같음); 강글리오시드 (예컨대 GD2, GD3 및 GM2)를 표적화하는 3F8, ch14.18 및 KW-2871 (신경외배엽 종양 및 일부 상피 종양의 치료에 사용되는 바와 같음); Le y를 표적화하는 hu3S193 및 IgN311 (유방, 결장, 폐 및 전립선 종양의 치료에 사용되는 바와 같음); VEGF를 표적화하는 베바시주맙 (종양 혈관구조의 치료에 사용되는 바와 같음); VEGFR을 표적화하는 IM-2C6 및 CDP791 (상피-유래된 고형 종양의 치료에 사용되는 바와 같음); 인테그린 _V_3을 표적화하는 에타라시주맙 (종양 혈관구조의 치료에 사용되는 바와 같음); 인테그린 _5_1을 표적화하는 볼로식시맙 (종양 혈관구조의 치료에 사용되는 바와 같음); EGFR을 표적화하는 세툭시맙, 파니투무맙, 니모투주맙 및 806 (신경아교종, 폐, 유방, 결장, 및 두경부 종양의 치료에 사용되는 바와 같음); ERBB2를 표적화하는 트라스투주맙 및 페르투주맙 (유방, 결장, 폐, 난소 및 전립선 종양의 치료에 사용되는 바와 같음); ERBB3을 표적화하는 MM-121 (유방, 결장, 폐, 난소 및 전립선 종양의 치료에 사용되는 바와 같음); MET를 표적화하는 AMG 102, METMAB 및 SCH 900105 (유방, 난소 및 폐 종양의 치료에 사용되는 바와 같음); IGF1R을 표적화하는 AVE1642, IMC-A12, MK-0646, R1507 및 CP 751871 (신경아교종, 폐, 유방, 두경부, 전립선 및 갑상선 암의 치료에 사용되는 바와 같음); EPHA3을 표적화하는 KB004 및 IIIA4 (폐, 신장 및 결장 종양, 흑색종, 신경아교종 및 혈액 악성종양의 치료에 사용되는 바와 같음); TRAILR1을 표적화하는 마파투무맙 (HGS-ETR1) (결장, 폐 및 췌장 종양 및 혈액 악성종양의 치료에 사용되는 바와 같음); TRAILR2를 표적화하는 HGS-ETR2 및 CS-1008; RANKL을 표적화하는 데노수맙 (전립선암 및 골 전이의 치료에 사용되는 바와 같음); FAP를 표적화하는 시브로투주맙 및 F19 (결장, 유방, 폐, 췌장, 및 두경부 종양의 치료에 사용되는 바와 같음); 테나신을 표적화하는 81C6 (신경아교종, 유방 및 전립선 종양의 치료에 사용되는 바와 같음); CD3을 표적화하는 블리나투모맙 (블린시토(Blincyto); 암젠(Amgen)) (ALL의 치료에 사용되는 바와 같음); 암 면역요법에 사용되는 바와 같은 PD-1을 표적화하는 펨브롤리주맙; c-Myc를 표적화하는 9E10 항체 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
일부 경우에, 본 개시내용의 방법은 a) 본 개시내용의 재조합 종양용해성 바이러스, 예컨대 백시니아 바이러스의 유효량; 및 b) 항-PD-1 항체를 투여하는 것을 포함한다. 일부 경우에, 본 개시내용의 방법은 a) 본 개시내용의 재조합 종양용해성 바이러스의 유효량; 및 b) 항-PD-L1 항체를 투여하는 것을 포함한다. 적합한 항-PD-1 항체는 펨브롤리주맙 (키트루다®; MK-3475), 니볼루맙 (옵디보®; BMS-926558; MDX1106), 피딜리주맙 (CT-011), AMP-224, AMP-514 (MEDI-0680), PDR001, 및 PF-06801591을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 적합한 항-PD-L1 항체는 BMS-936559 (MDX1105), 두르발루맙 (MEDI4736; 임핀지(Imfinzi)), 아테졸리주맙 (MPDL33280A; 테센트릭(Tecentriq))을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 예를 들어, 문헌 [Sunshine and Taube (2015) Curr. Opin. Pharmacol. 23:32]; 및 [Heery et al. (2017) The Lancet Oncology 18:587]; [Iwai et al. (2017) J. Biomed. Sci. 24:26]; [Hu-Lieskovan et al. (2017) Annals of Oncology 28: issue Suppl. 5, mdx376.048]; 및 미국 특허 공개 번호 2016/0159905를 참조한다.
일부 경우에, 적합한 항체는 이중특이적 항체, 예를 들어, 이중특이적 모노클로날 항체이다. 카투막소맙, 블리나투모맙, 솔리토맙, 파소툭시주맙, 및 플로테투주맙은 암 요법에 사용하기에 적합한 이중특이적 항체의 비-제한적 예이다. 예를 들어, 문헌 [Chames and Baty (2009) MAbs 1:539]; 및 [Sedykh et al. (2018) Drug Des. Devel. Ther. 12:195]을 참조한다.
본 개시내용의 방법과 함께 사용하기에 적합한 생물학적 반응 변형제는 (1) 티로신 키나제 (RTK) 활성의 억제제; (2) 세린/트레오닌 키나제 활성의 억제제; (3) 종양-연관된 항원 길항제, 예컨대 종양 항원에 특이적으로 결합하는 항체; (4) 아폽토시스 수용체 효능제; (5) 인터류킨-2; (6) 인터페론-α.; (7) 인터페론-γ; (8) 콜로니-자극 인자; (9) 혈관신생의 억제제; 및 (10) 종양 괴사 인자의 길항제를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
화학치료제는 암 세포의 증식을 감소시키는 비-펩티드성 (즉, 비-단백질성) 화합물이며, 세포독성제 및 세포정지제를 포괄한다. 화학치료제의 비-제한적 예는 알킬화제, 니트로소우레아, 항대사물, 항종양 항생제, 식물 (빈카) 알칼로이드, 및 스테로이드 호르몬을 포함한다.
세포 증식을 감소시키도록 작용하는 작용제는 관련 기술분야에 공지되어 있으며, 폭넓게 사용된다. 이러한 작용제는 메클로레타민, 시클로포스파미드 (시톡산(Cytoxan)™), 멜팔란 (L-사르코리신), 카르무스틴 (BCNU), 로무스틴 (CCNU), 세무스틴 (메틸-CCNU), 스트렙토조신, 클로로조토신, 우라실 머스타드, 클로르메틴, 이포스파미드, 클로람부실, 피포브로만, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌티오포스포라민, 부술판, 다카르바진, 및 테모졸로미드를 포함하나 이에 제한되지는 않는 알킬화제, 예컨대 질소 머스타드, 니트로소우레아, 에틸렌이민 유도체, 알킬 술포네이트, 및 트리아젠을 포함한다.
항대사물 작용제는 시타라빈 (CYTOSAR-U), 시토신 아라비노시드, 플루오로우라실 (5-FU), 플록수리딘 (FudR), 6-티오구아닌, 6-머캅토퓨린 (6-MP), 펜토스타틴, 5-플루오로우라실 (5-FU), 메토트렉세이트, 10-프로파르길-5,8-디데아자폴레이트 (PDDF, CB3717), 5,8-디데아자테트라히드로폴산 (DDATHF), 류코보린, 플루다라빈 포스페이트, 펜토스타틴, 및 겜시타빈을 포함하나 이에 제한되지는 않는 폴산 유사체, 피리미딘 유사체, 퓨린 유사체, 및 아데노신 데아미나제 억제제를 포함한다.
적합한 천연 생성물 및 그들의 유도체 (예를 들어, 빈카 알칼로이드, 항종양 항생제, 효소, 림포카인, 및 에피포도필로톡신)는 아라-c, 파클리탁셀 (탁솔(Taxol)®), 도세탁셀 (탁소텔(Taxotere)®), 데옥시코포르마이신, 미토마이신-C, L-아스파라기나제, 아자티오프린; 브레퀴나르; 알칼로이드, 예를 들어 빈크리스틴, 빈블라스틴, 비노렐빈, 빈데신 등; 포도필로톡신, 예를 들어 에토포시드, 테니포시드 등; 항생제, 예를 들어 안트라시클린, 다우노루비신 염산염 (다우노마이신, 루비도마이신, 세루비딘), 이다루비신, 독소루비신, 에피루비신 및 모르폴리노 유도체 등; 페녹시존 비시클로펩티드, 예를 들어 닥티노마이신; 염기성 당펩티드, 예를 들어 블레오마이신; 안트라퀴논 글리코시드, 예를 들어 플리카마이신 (미트라마이신); 안트라센디온, 예를 들어 미톡산트론; 아지리노피롤로 인돌디온, 예를 들어 미토마이신; 마크로시클릭 면역억제제, 예를 들어 시클로스포린, FK-506 (타크롤리무스, 프로그라프), 라파마이신 등; 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
다른 항-증식성 세포독성제는 나벨벤, CPT-11, 아나스트라졸, 레트라졸, 카페시타빈, 렐록사핀, 시클로포스파미드, 이포스파미드, 및 드롤록사핀이다.
항증식 활성을 갖는 미세소관 영향제는 또한 사용하기에 적합하며, 알로콜키신 (NSC 406042), 할리콘드린 B (NSC 609395), 콜키신 (NSC 757), 콜키신 유도체 (예를 들어, NSC 33410), 돌스타틴 10 (NSC 376128), 마이탄신 (NSC 153858), 리족신 (NSC 332598), 파클리탁셀 (탁솔®), 탁솔® 유도체, 도세탁셀 (탁소텔®), 티오콜키신 (NSC 361792), 트리틸 시스테린, 빈블라스틴 술페이트, 빈크리스틴 술페이트, 에포틸론 A, 에포틸론 B를 포함하나 이에 제한되지는 않는 천연 및 합성 에포틸론, 디스코데르몰리드; 에스트라무스틴, 니코다졸 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
사용하기에 적합한 호르몬 조정제 및 스테로이드 (합성 유사체를 포함함)는 부신피질스테로이드, 예를 들어 프레드니손, 덱사메타손 등; 에스트로겐 및 프레게스틴, 예를 들어 히드록시프로게스테론 카프로에이트, 메드록시프로게스테론 아세테이트, 메게스트롤 아세테이트, 에스트라디올, 클로미펜, 타목시펜 등; 및 부신피질 억제제, 예를 들어 아미노글루테티미드; 17α-에티닐에스트라디올; 디에틸스틸베스트롤, 테스토스테론, 플루옥시메스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 테스토락톤, 메틸프레드니솔론, 메틸-테스토스테론, 프레드니솔론, 트리암시놀론, 클로로트리아니센, 히드록시프로게스테론, 아미노글루테티미드, 에스트라무스틴, 메드록시프로게스테론 아세테이트, 류프롤리드, 플루타미드 (드로게닐(Drogenil)), 토레미펜 (파레스톤(Fareston)), 및 졸라덱스(Zoladex)®를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 에스트로겐은 증식 및 분화를 자극시키며, 따라서 에스트로겐 수용체에 결합하는 화합물은 이 활성을 차단하는데 사용된다. 코르티코스테로이드는 T 세포 증식을 억제할 수 있다.
다른 화학치료제는 금속 착체, 예를 들어 시스플라틴 (시스-DDP), 카르보플라틴 등; 우레아, 예를 들어 히드록시우레아; 및 히드라진, 예를 들어 N-메틸히드라진; 에피도필로톡신; 토포이소머라제 억제제; 프로카르바진; 미톡산트론; 류코보린; 테가푸르 등을 포함한다. 관심의 다른 항-증식제는 면역억제제, 예를 들어 미코페놀산, 탈리도미드, 데스옥시스페르구알린, 아자스포린, 레플루노미드, 미조리빈, 아자스피란 (SKF 105685); 이레사(Iressa)® (ZD 1839, 4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-메톡시-6-(3-(4-모르폴리닐)프로폴시)퀴나졸린) 등을 포함한다.
"탁산"은 파클리탁셀, 뿐만 아니라 임의의 활성 탁산 유도체 또는 프로-드러그를 포함한다. "파클리탁셀" (본원에서 유사체, 제제, 및 유도체, 예컨대, 예를 들어, 도세탁셀, 탁솔μ, 탁소텔μ (도세탁셀의 제제), 파클리탁셀의 10-데스아세틸 유사체 및 파클리탁셀의 3'N-데스벤조일-3'N-t-부톡시카르보닐 유사체를 포함하는 것으로 이해되어야 함)은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조되거나 (또한 WO 94/07882, WO 94/07881, WO 94/07880, WO 94/07876, WO 93/23555, WO 93/10076; 미국 특허 번호 5,294,637; 5,283,253; 5,279,949; 5,274,137; 5,202,448; 5,200,534; 5,229,529; 및 EP 590,267 참조), 예를 들어, 미국 미주리주 세인트 루이스에 소재하는 시그마 케미칼 캄파니(Sigma Chemical Co.)를 포함한 다양한 상업적 공급원으로부터 얻어질 수 있다 (탁수스 브레비폴리아(Taxus brevifolia)로부터의 T7402; 또는 탁수스 얀나넨시스(Taxus yannanensis)로부터의 T-1912).
파클리탁셀은 파클리탁셀의 통상적인 화학적으로 입수가능한 형태 뿐만 아니라, 유사체 및 유도체 (예를 들어, 상기 언급된 바와 같은 탁소텔μ 도세탁셀) 및 파클리탁셀 접합체 (예를 들어, 파클리탁셀-PEG, 파클리탁셀-덱스트란, 또는 파클리탁셀-크실로스)를 지칭하는 것으로 이해되어야 한다.
세포 요법은 키메라 항원 수용체 (CAR) T 세포 요법 (CAR-T 요법); 자연 킬러 (NK) 세포 요법; 수지상 세포 (DC) 요법 (예를 들어, DC-기반 백신); T 세포 수용체 (TCR) 조작된 T 세포-기반 요법 등을 포함한다.
C-4C. 암 및 종양
본 개시내용의 방법 및 조성물에 의해 치료될 수 있는 암 세포는 임의의 기관 또는 조직, 예컨대 방광, 혈액, 골, 골수, 뇌, 유방, 결장, 식도, 위장, 치은, 두부, 신장, 간, 폐, 비인두, 경부, 난소, 전립선, 피부, 위, 척수, 고환, 혀, 또는 자궁으로부터의 또는 그 내의 암 세포를 포함한다. 또환, 암은 임의의 조직학적 유형의 것, 예를 들어: 악성 신생물; 암종; 비분화된 암종; 거대 및 방추 세포 암종; 소세포 암종; 유두상 암종; 편평 세포 암종; 림프상피 암종; 기저 세포 암종; 모기질 암종; 이행 세포 암종; 유두상 이행 세포 암종; 선암종; 악성 가스트린종; 담관암종; 간세포 암종; 복합 간세포 암종 및 담관암종; 지주 선암종; 선낭 암종; 선종 폴립에서의 선암종; 가족성 결장 폴립증 선암종; 고형 암종; 악성 카르시노이드 종양; 세기관지-폐포 선암종; 유두상 선암종; 혐색소성 암종; 호산 암종; 호산 선암종; 호염기 암종; 투명 세포 선암종; 과립 세포 암종; 소포성 선암종; 유두상 및 소포성 선암종; 비캡슐화 경화성 암종; 부신 피질 암종; 자궁내막 암종; 피부 부속기 암종; 아포크린 선암종; 피지 선암종; 귀지 선암종; 점막표피모양 암종; 낭선암종; 유두상 낭선암종; 유두상 장액성 낭선암종; 점액성 낭선암종; 점액성 선암종; 반지 세포 암종; 침윤성 도관 암종; 수질성 암종; 소엽 암종; 염증성 암종; 유방 파제트병; 세엽 세포 암종; 선편평 암종; 편평 화생을 갖는 선암종; 악성 흉선종; 악성 난소 기질 종양; 악성 난포막종; 악성 과립층 세포 종양; 악성 남성모세포종; 세르톨리 세포 암종; 악성 라이디히 세포 종양; 악성 지질 세포 종양; 악성 부신경절종; 악성 유방외 부신경절종; 크롬친화세포종; 사구맥관육종; 악성 흑색종; 멜라닌결핍성 흑색종; 표재성 확산성 흑색종; 거대 색소성 모반에서의 악성 흑색종; 상피모양 세포 흑색종; 악성 청색 모반; 육종; 섬유육종; 악성 섬유성 조직구종; 점액육종; 지방육종; 평활근육종; 횡문근육종; 배아성 횡문근육종; 폐포 횡문근육종; 기질 육종; 악성 혼합 종양; 뮬러 혼합 종양; 신장모세포종; 간모세포종; 암육종; 악성 중간엽종; 악성 브렌너 종양; 악성 엽상 종양; 윤활막 육종; 악성 중피종; 난소생식세포종; 배아성 암종; 악성 기형종; 악성 난소 갑상선종; 융모막암종; 악성 중신종; 혈관육종; 악성 혈관내피종; 카포시 육종; 악성 혈관주위세포종; 림프관육종; 골육종; 피질주위 골육종; 연골육종; 악성 연골모세포종; 중간엽 연골육종; 골의 거대 세포 종양; 유잉 육종; 악성 치원성 종양; 사기질모세포 치아육종; 악성 사기질모세포종; 사기질모세포 섬유육종; 악성 송과체종; 척삭종; 악성 신경아교종; 뇌실막세포종; 성상세포종; 원형질 성상세포종; 원섬유성 성상세포종; 성상모세포종; 교모세포종; 희소돌기아교세포종; 희소돌기아교모세포종; 원시 신경외배엽; 소뇌 육종; 신경절신경모세포종; 신경모세포종; 망막모세포종; 후각 신경원성 종양; 악성 수막종; 신경섬유육종; 악성 신경집종; 악성 과립 세포 종양; 악성 림프종; 호지킨병; 호지킨; 부육아종; 소림프구성 악성 림프종; 미만성 대세포 악성 림프종; 소포성 악성 림프종; 균상 식육종; 다른 특정된 비-호지킨 림프종; 악성 조직구증; 다발성 골수종; 비만 세포 육종; 면역증식성 소장 질환; 백혈병; 림프성 백혈병; 형질 세포 백혈병; 적백혈병; 림프육종 세포 백혈병; 골수성 백혈병; 호염기구성 백혈병; 호산구성 백혈병; 단핵구성 백혈병; 비만 세포 백혈병; 거핵모구성 백혈병; 골수성 육종; 췌장암; 직장암; 및 유모 세포 백혈병일 수 있다.
본 개시내용의 방법을 사용하여 치료될 수 있는 종양은 예를 들어, 뇌암 종양, 두경부암 종양, 식도암 종양, 피부암 종양, 폐암 종양, 흉선암 종양, 위암 종양, 결장암 종양, 간암 종양, 난소암 종양, 자궁암 종양, 방광암 종양, 고환암 종양, 직장암 종양, 유방암 종양, 또는 췌장암 종양을 포함한다.
일부 경우에, 종양은 결장직장 선암종이다. 일부 경우에, 종양은 비소세포 폐 암종이다. 일부 경우에, 종양은 삼중-음성 유방암이다. 일부 경우에, 종양은 고형 종양이다. 일부 경우에, 종양은 액상 종양이다. 일부 경우에, 종양은 재발성이다. 일부 경우에, 종양은 원발성 종양이다. 일부 경우에, 종양은 전이성이다.
다양한 대상체는 암을 치료하는 대상 방법으로의 치료에 적합하다. 적합한 대상체는 암을 갖거나, 암으로 진단되었거나, 암을 발달시킬 위험이 있거나, 암을 가졌고 암의 재발에 대한 위험이 있거나, 암을 위해 본 개시내용의 종양용해성 백시니아 바이러스 이외의 작용제로 치료되었고 이러한 치료에 반응하는데 실패했거나, 암을 위해 본 개시내용의 종양용해성 백시니아 바이러스 이외의 작용제로 치료되었으나 이러한 치료에 대한 초기 반응 후에 재발한 임의의 개체, 예를 들어, 인간 또는 비-인간 동물을 포함한다.
C-5. 종양용해성 바이러스 면역원성 조성물
또 다른 측면에서, 본 개시내용에 의해 제공된 재조합 종양용해성 바이러스는 그의 게놈에 암 항원, 예컨대 종양-연관된 항원 및 신항원을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다. 용어 "암-연관된 항원" (종양-연관된 항원으로도 공지됨)은 정상 세포에 의해서보다 암 세포에 의해 더 많이 발현되는 단백질이다. 용어 "신항원"은 암 세포에서 발현되지만 정상 세포에서는 발현되지 않는 단백질을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 재조합 백시니아 바이러스는 그의 게놈에 i) 상기 본원에 기재된 IL-2v 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열; ii) 이종 TK 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열; 및 iii) 암 항원을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 이러한 재조합 백시니아 바이러스는, 이를 필요로 하는 개체 (예를 들어, 암을 갖는 개체)에게 투여되는 경우, 개체에서 코딩된 암 항원에 대한 면역 반응을 유도하거나 증진시킬 수 있다. 면역 반응은 개체에서 암 세포의 수를 감소시킬 수 있다. 적합한 IL-2v 폴리펩티드 및 이종 TK 폴리펩티드는 상기 기재된 바와 같다.
암-연관된 항원의 예는 α-폴레이트 수용체; 카르보닉 안히드라제 IX (CAIX); CD19; CD20; CD22; CD30; CD33; CD44v7/8; 암배아 항원 (CEA); 상피 당단백질-2 (EGP-2); 상피 당단백질-40 (EGP-40); 폴레이트 결합 단백질 (FBP); 태아 아세틸콜린 수용체; 강글리오시드 항원 GD2; Her2/neu; IL-13R-a2; 카파 경쇄; LeY; L1 세포 부착 분자; 흑색종-연관된 항원 (MAGE); MAGE-A1; 메소텔린; MUC1; NKG2D 리간드; 암태아 항원 (h5T4); 전립선 줄기 세포 항원 (PSCA); 전립선-특이적 막 항원 (PSMA); 종양-연관 당단백질-72 (TAG-72); 혈관 내피 성장 인자 수용체-2 (VEGF-R2) (예를 들어, 문헌 [Vigneron et al. (2013) Cancer Immunity 13:15]; 및 [Vigneron (2015) BioMed Res. Int'l Article ID 948501] 참조); 및 표피 성장 인자 수용체 (EGFR) vIII 폴리펩티드 (예를 들어, 문헌 [Wong et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:2965]; 및 [Miao et al. (2014) PLoSOne 9:e94281] 참조); MUC1 폴리펩티드; 인간 유두종바이러스 (HPV) E6 폴리펩티드; LMP2 폴리펩티드; HPV E7 폴리펩티드; 표피 성장 인자 수용체 (EGFR) vIII 폴리펩티드; HER-2/neu 폴리펩티드; 흑색종 항원 패밀리 A, 3 (MAGE A3) 폴리펩티드; p53 폴리펩티드; 돌연변이체 p53 폴리펩티드; NY-ESO-1 폴리펩티드; 폴레이트 히드롤라제 (전립선-특이적 막 항원; PSMA) 폴리펩티드; 암배아 항원 (CEA) 폴리펩티드; T-세포에 의해 인식되는 흑색종 항원 (멜란A/MART1) 폴리펩티드; Ras 폴리펩티드; gp100 폴리펩티드; 프로테이나제3 (PR1) 폴리펩티드; bcr-abl 폴리펩티드; 티로시나제 폴리펩티드; 수르비빈 폴리펩티드; 전립선 특이적 항원 (PSA) 폴리펩티드; hTERT 폴리펩티드; 육종 전위 중단점 폴리펩티드; 윤활막 육종 X (SSX) 중단점 폴리펩티드; EphA2 폴리펩티드; 전립선 산 포스파타제 (PAP) 폴리펩티드; 아폽토시스의 흑색종 억제제 (ML-IAP) 폴리펩티드; 알파-페토단백질 (AFP) 폴리펩티드; 상피 세포 부착 분자 (EpCAM) 폴리펩티드; ERG (TMPRSS2 ETS 융합) 폴리펩티드; NA17 폴리펩티드, 쌍형성된-박스-3 (PAX3) 폴리펩티드; 역형성 림프종 키나제 (ALK) 폴리펩티드; 안드로겐 수용체 폴리펩티드; 시클린 B1 폴리펩티드; N-myc 원종양유전자 (MYCN) 폴리펩티드; Ras 동족체 유전자 패밀리 구성원 C (RhoC) 폴리펩티드; 티로시나제-관련된 단백질-2 (TRP-2) 폴리펩티드; 메소텔린 폴리펩티드; 전립선 줄기 세포 항원 (PSCA) 폴리펩티드; 흑색종 연관된 항원-1 (MAGE A1) 폴리펩티드; 시토크롬 P450 1B1 (CYP1B1) 폴리펩티드; 태반-특이적 단백질 1 (PLAC1) 폴리펩티드; BORIS 폴리펩티드 (CCCTC-결합 인자 또는 CTCF로도 공지됨); ETV6-AML 폴리펩티드; 유방암 항원 NY-BR-1 폴리펩티드 (안키린 반복 도메인-함유 단백질 30A로도 지칭됨); G-단백질 신호전달의 조절제 (RGS5) 폴리펩티드; T-세포에 의해 인식되는 편평 세포 암종 항원 (SART3) 폴리펩티드; 카르보닉 안히드라제 IX 폴리펩티드; 쌍형성된 박스-5 (PAX5) 폴리펩티드; OY-TES1 (고환 항원; 아크로신 결합 단백질로도 공지됨) 폴리펩티드; 정자 단백질 17 폴리펩티드; 림프구 세포-특이적 단백질-티로신 키나제 (LCK) 폴리펩티드; 고분자량 흑색종 연관된 항원 (HMW-MAA); A-키나제 고정 단백질-4 (AKAP-4); 윤활막 육종 X 중단점 2 (SSX2) 폴리펩티드; X 항원 패밀리 구성원 1 (XAGE1) 폴리펩티드; B7 동족체 3 (B7H3; CD276으로도 공지됨) 폴리펩티드; 레구마인 폴리펩티드 (LGMN1; 아스파라기닐 엔도펩티다제로도 공지됨); Ig 및 EGF 상동성 도메인-2를 갖는 티로신 키나제 (Tie-2; 안지오포이에틴-1 수용체로도 공지됨) 폴리펩티드; P 항원 패밀리 구성원 4 (PAGE4) 폴리펩티드; 혈관 내피 성장 인자 수용체 2 (VEGF2) 폴리펩티드; MAD-CT-1 폴리펩티드; 섬유모세포 활성화 단백질 (FAP) 폴리펩티드; 혈소판 유래된 성장 인자 수용체 베타 (PDGFβ) 폴리펩티드; MAD-CT-2 폴리펩티드; Fos-관련된 항원-1 (FOSL) 폴리펩티드; 및 윌름스 종양-1 (WT-1) 폴리펩티드를 포함한다.
암-연관된 항원의 아미노산 서열은 관련 기술분야에 공지되어 있으며; 예를 들어, MUC1 (진뱅크 CAA56734); LMP2 (진뱅크 CAA47024); HPV E6 (진뱅크 AAD33252); HPV E7 (진뱅크 AHG99480); EGFRvIII (진뱅크 NP_001333870); HER-2/neu (진뱅크 AAI67147); MAGE-A3 (진뱅크 AAH11744); p53 (진뱅크 BAC16799); NY-ESO-1 (진뱅크 CAA05908); PSMA (진뱅크 AAH25672); CEA (진뱅크 AAA51967); 멜란/MART1 (진뱅크 NP_005502); Ras (진뱅크 NP_001123914); gp100 (진뱅크 AAC60634); bcr-abl (진뱅크 AAB60388); 티로시나제 (진뱅크 AAB60319); 수르비빈 (진뱅크 AAC51660); PSA (진뱅크 CAD54617); hTERT (진뱅크 BAC11010); SSX (진뱅크 NP_001265620); Eph2A (진뱅크 NP_004422); PAP (진뱅크 AAH16344); ML-IAP (진뱅크 AAH14475); AFP (진뱅크 NP_001125); EpCAM (진뱅크 NP_002345); ERG (TMPRSS2 ETS 융합) (진뱅크 ACA81385); PAX3 (진뱅크 AAI01301); ALK (진뱅크 NP_004295); 안드로겐 수용체 (진뱅크 NP_000035); 시클린 B1 (진뱅크 CAO99273); MYCN (진뱅크 NP_001280157); RhoC (진뱅크 AAH52808); TRP-2 (진뱅크 AAC60627); 메소텔린 (진뱅크 AAH09272); PSCA (진뱅크 AAH65183); MAGE A1 (진뱅크 NP_004979); CYP1B1 (진뱅크 AAM50512); PLAC1 (진뱅크 AAG22596); BORIS (진뱅크 NP_001255969); ETV6 (진뱅크 NP_001978); NY-BR1 (진뱅크 NP_443723); SART3 (진뱅크 NP_055521); 카르보닉 안히드라제 IX (진뱅크 EAW58359); PAX5 (진뱅크 NP_057953); OY-TES1 (진뱅크 NP_115878); 정자 단백질 17 (진뱅크 AAK20878); LCK (진뱅크 NP_001036236); HMW-MAA (진뱅크 NP_001888); AKAP-4 (진뱅크 NP_003877); SSX2 (진뱅크 CAA60111); XAGE1 (진뱅크 NP_001091073; XP_001125834; XP_001125856; 및 XP_001125872); B7H3 (진뱅크 NP_001019907; XP_947368; XP_950958; XP_950960; XP_950962; XP_950963; XP_950965; 및 XP_950967); LGMN1 (진뱅크 NP_001008530); TIE-2 (진뱅크 NP_000450); PAGE4 (진뱅크 NP_001305806); VEGFR2 (진뱅크 NP_002244); MAD-CT-1 (진뱅크 NP_005893 NP_056215); FAP (진뱅크 NP_004451); PDGFβ (진뱅크 NP_002600); MAD-CT-2 (진뱅크 NP_001138574); FOSL (진뱅크 NP_005429); 및 WT-1 (진뱅크 NP_000369)을 참조한다. 이들 폴리펩티드는 또한 예를 들어, 문헌 [Cheever et al. (2009) Clin. Cancer Res. 15:5323], 및 그 안에 인용된 참고문헌; [Wagner et al. (2003) J. Cell. Sci. 116:1653]; [Matsui et al. (1990) Oncogene 5:249]; 및 [Zhang et al. (1996) Nature 383:168]에 논의되어 있다.
일부 경우에, 본 개시내용의 재조합 종양용해성 바이러스, 예컨대 백시니아 바이러스는 복제 부적격이다. 일부 경우에, 재조합 바이러스는 바이러스가 복제하지 못하는 능력을 발생시키는 바이러스 유전자의 변형을 포함한다. 복제에 요구되는 유전자 생성물을 코딩하는 1종 이상의 바이러스 유전자는 바이러스가 복제할 수 없도록 변형될 수 있다. 예를 들어, 재조합 바이러스는 중간 전사 인자 (예를 들어, A8R 및/또는 A23R) (예를 들어, 문헌 [Wyatt et al. (2017) mBio 8:e00790]; 및 [Warren et al. (2012) J. Virol. 86:9514] 참조) 및/또는 후기 전사 인자 (예를 들어, G8R, A1L, 및 A2L 중 1종 이상) (예를 들어, 문헌 [Yang et al. (2013) Virology 447:213] 참조)의 수준 및/또는 활성을 감소시키도록 변형될 수 있다. 중간 전사 인자 및/또는 후기 전사 인자의 수준 및/또는 활성을 감소시키는 것은 초기 바이러스 프로모터에 작동가능하게 연결된 뉴클레오티드 서열(들)에 의해 코딩된 폴리펩티드(들)를 발현할 수 있는 변형된 백시니아 바이러스를 발생시킬 수 있지만; 바이러스는 복제할 수 없을 것이다. 변형은 예를 들어, 유전자의 전부 또는 일부의 결실; 유전자 내로의 삽입 등을 포함한다. 예를 들어, A8R 유전자의 전부 또는 일부는 결실될 수 있다. 또 다른 예로서, A23R 유전자의 전부 또는 일부는 결실될 수 있다. 또 다른 예로서, G8R 유전자의 전부 또는 일부는 결실될 수 있다. 또 다른 예로서, A1L 유전자의 전부 또는 일부는 결실될 수 있다. 또 다른 예로서, A2L 유전자의 전부 또는 일부는 결실될 수 있다.
상기 언급된 바와 같이, 일부 경우에, 본 개시내용의 재조합 백시니아 바이러스는 비-종양용해성이다.
C-6. 2'-데옥시구아노신의 유사체의 투여
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 2'-데옥시구아노신의 합성 유사체와 조합으로 본원에 기재된 이종 TK 폴리펩티드를 포함하는 재조합 종양용해성 바이러스의 투여를 제공한다.
종양용해성 바이러스는 바이러스의 투여를 받은 대상체에서 유해 부작용을 유발할 수 있다. 부작용의 예는 피부 병변, 예컨대 소포성 병변 또는 "소포성 발진"을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 a) 본 개시내용의 복제-적격, 재조합 종양용해성 백시니아 바이러스의 유효량; 및 b) 2'-데옥시-구아노신의 합성 유사체의 유효량을 개체에게 투여하는 것을 포함하는 개체에서 암을 치료하는 방법을 제공하고, 여기서 종양용해성 백시니아 바이러스는 이종 TK 폴리펩티드를 포함한다. 일부 다른 실시양태에서, 본 개시내용은 재조합 종양용해성 백시니아 바이러스의 투여를 받은 대상체에게 2'-데옥시-구아노신의 합성 유사체의 유효량을 투여하는 것을 포함하는 본 개시내용의 재조합 종양용해성 백시니아 바이러스의 부작용을 치료하거나, 감소시키거나, 관리하는 방법을 제공하고, 여기서 종양용해성 백시니아 바이러스는 이종 TK 폴리펩티드를 포함한다.
2'-데옥시-구아노신의 합성 유사체의 "유효량"은 투여되는 복제-적격, 재조합 종양용해성 백시니아 바이러스에 의해 유발되는 유해 부작용을 감소시키는데 유효한 양이다. 예를 들어, 유해 부작용이 피부 병변인 경우, 2'-데옥시-구아노신의 합성 유사체의 유효량은, 개체에게 1개 이상의 용량으로 투여되는 경우, 개체에서의 백시니아 바이러스-유도된 피부 병변의 수 및/또는 중증도 및/또는 지속기간을 감소시키는데 유효한 양이다. 예를 들어, 2'-데옥시-구아노신의 합성 유사체의 유효량은, 개체에게 1개 이상의 용량으로 투여되는 경우, 개체에서의 백시니아 바이러스-유도된 피부 병변의 수 및/또는 중증도 및/또는 지속기간을 2'-데옥시-구아노신의 합성 유사체의 투여 전의 또는 2'-데옥시-구아노신의 합성 유사체의 투여의 부재 하에서의 개체에서의 백시니아 바이러스-유도된 피부 병변의 수 및/또는 중증도 및/또는 지속기간에 비해 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 75%, 또는 75% 초과 감소시키는데 유효한 양일 수 있다. 일부 경우에, 2'-데옥시-구아노신의 합성 유사체의 유효량은, 개체에게 1개 이상의 용량으로 투여되는 경우, 백시니아 바이러스-유도된 피부 병변으로부터의 바이러스의 쉐딩을 감소시키는데 유효한 양이다. 예를 들어, 일부 경우에, 2'-데옥시-구아노신의 합성 유사체의 유효량은, 개체에서 1개 이상의 용량으로 투여되는 경우, 백시니아 바이러스-유도된 피부 병변으로부터의 바이러스의 쉐딩을 2'-데옥시-구아노신의 합성 유사체의 투여 전의 또는 2'-데옥시-구아노신의 합성 유사체의 투여의 부재 하에서의 개체에서의 백시니아 바이러스-유도된 피부 병변으로부터의 바이러스 쉐딩의 수준 또는 정도에 비해 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 75%, 또는 75% 초과 감소시키는데 유효한 양이다. 유해 부작용이 피부 병변인 경우, 일부 경우에, 2'-데옥시-구아노신의 합성 유사체는 임의의 편리한 투여의 경로에 의해 (예를 들어, 국소로, 경구로, 정맥내로 등) 투여될 수 있다. 예를 들어, 유해 부작용이 피부 병변인 경우, 일부 경우에, 2'-데옥시-구아노신의 합성 유사체는 국소로 투여될 수 있다. 피부 병변을 감소시키기 위해, 2'-데옥시-구아노신의 합성 유사체는 전형적으로 국소로, 예를 들어, 피부의 병변 영역에의 2'-데옥시-구아노신 유사체의 적용에 의해 투여된다.
2'-데옥시-구아노신의 합성 유사체의 투여는 이종 TK 폴리펩티드를 포함하는 복제-적격, 재조합 종양용해성 백시니아 바이러스의 복제를 감소시킨다. 본 개시내용의 복제-적격, 재조합 종양용해성 백시니아 바이러스의 복제의 이러한 감소는 예를 들어, 개체에서 복제-적격, 재조합 종양용해성 백시니아 바이러스의 수준을 제어하는데, 복제-적격, 재조합 종양용해성 백시니아 바이러스의 효과를 제어하는데 등에 바람직할 수 있다. 따라서, 일부 다른 실시양태에서, 본 개시내용은 a) 본 개시내용의 복제-적격, 재조합 종양용해성 백시니아 바이러스의 유효량을 투여하고; b) 2'-데옥시-구아노신의 합성 유사체의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 암을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 경우에, 2'-데옥시-구아노신의 합성 유사체의 유효량은, 개체에게 1개 이상의 용량으로 투여되는 경우, 개체에서의 본 개시내용의 복제-적격, 재조합 종양용해성 백시니아 바이러스의 복제를 2'-데옥시-구아노신의 합성 유사체의 투여 전의 또는 2'-데옥시-구아노신의 합성 유사체의 투여의 부재 하에서의 개체에서의 복제-적격, 재조합 종양용해성 백시니아 바이러스의 복제의 수준에 비해 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 75%, 또는 75% 초과 감소시키는데 유효한 양이다.
2'-데옥시-구아노신의 합성 유사체는 본 개시내용의 복제-적격, 재조합 종양용해성 백시니아 바이러스의 투여 후에 투여될 수 있다. 예를 들어, 2'-데옥시-구아노신의 합성 유사체는 복제-적격, 재조합 종양용해성 백시니아 바이러스의 투여 후 1일 내지 7일, 7일 내지 2주, 2주 내지 1개월, 1개월 내지 3개월, 또는 3개월 초과에 투여될 수 있다.
일부 경우에, 본 개시내용의 복제-적격, 재조합 종양용해성 백시니아 바이러스가 투여된 개체에의 2'-데옥시-구아노신의 합성 유사체의 투여는 개체에서 급속한 전신 종양 용해 (암 세포의 용해)를 유도한다. 예를 들어, 2'-데옥시-구아노신의 합성 유사체는 종양 성장의 종양용해성 백시니아 바이러스-유도된의 감속이 일어나면 및/또는 바이러스 복제가 그의 피크에 또는 직후에 있으면 및/또는 백시니아 바이러스 단백질에 대한 순환 항체가 그들의 피크에 또는 직후에 있으면 개체에게 투여될 수 있다. 본 개시내용의 복제-적격, 재조합 종양용해성 백시니아 바이러스의 투여 후, 종양 성장의 감속이 일어났는지 여부는 종양 성장 및/또는 암 세포 수를 측정하는 임의의 다양한 확립된 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 개체에서 본 개시내용의 복제-적격, 재조합 종양용해성 백시니아 바이러스의 복제가 그의 피크에 또는 그의 피크 직후에 있는지 여부는 본원에 기재된 바와 같이 개체에서 TKv 폴리펩티드의 수준을 검출하고/거나 측정함으로써 결정될 수 있고, 여기서 적합한 방법의 비-제한적 예는 PET이다. 본 개시내용의 복제-적격, 재조합 종양용해성 백시니아 바이러스에 대한 순환 항체가 그의 피크에 또는 직후에 있는지 여부는 항체의 수준을 측정하는 표준 방법을 사용하여 측정될 수 있고, 여기서 이러한 방법은 예를 들어, 효소-연결 면역흡착 검정 (ELISA), 방사성면역검정 (RIA) 등을 포함한다.
예로서, 본 개시내용의 방법은 a) 본 개시내용의 재조합 종양용해성 바이러스의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에게 투여하고; b) i) 개체에서 종양 크기 및/또는 암 세포 수; 및/또는 ii) 개체에서 TKv 폴리펩티드의 수준; 및/또는 iii) 개체에서 재조합 종양용해성 바이러스에 대한 항체의 수준을 측정하고; c) 측정 단계가 i) 재조합 종양용해성 바이러스의 투여 전의 종양 성장 및/또는 암 세포의 수에 비해 종양 성장이 감속되었고/거나, 암 세포의 수가 감소되었음; 및/또는 ii) 개체에서 TKv 폴리펩티드의 수준의 그의 피크에 또는 직후에 있음; 및/또는 iii) 개체에서 재조합 종양용해성 바이러스에 대한 순환 항체의 수준이 그의 피크에 또는 직후에 있음을 지시하는 경우, 2'-데옥시-구아노신의 합성 유사체를 투여하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 개시내용의 방법은 a) 본 개시내용의 복제-적격, 재조합 종양용해성 바이러스의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에게 투여하고; b) 2'-데옥시-구아노신의 합성 유사체의 유효량을 개체에게 투여하는 것을 포함할 수 있고, 여기서 투여 단계 (b)는 단계 (a) 후 5일 내지 20일 (예를 들어, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일, 15일, 16일, 17일, 18일, 19일, 또는 20일)에 수행된다.
적합한 2'-데옥시-구아노신의 합성 유사체는 예를 들어, 아시클로비르 (아시클로구아노신), 5'-아이오도데옥시우리딘 ("아이독스우리딘"으로도 지칭됨), 간시클로비르, 발간시클로비르, 팜시클로비르, 발라시클로비르, 2'-플루오로-2'-데옥시-5-아이오도-1-베타-d-아라비노푸라노실우라실 (FIAU) 등을 포함한다. 적합한 2'-데옥시-구아노신의 합성 유사체의 일부의 구조는 하기에 제시되어 있다.
간시클로비르:
Figure pat00001
발간시클로비르:
Figure pat00002
발라시클로비르:
Figure pat00003
팜시클로비르:
Figure pat00004
일부 특정 실시양태에서, 2'-데옥시-구아노신의 합성 유사체는 간시클로비르 또는 아시클로비르이다.
2'-데옥시-구아노신의 합성 유사체는 경구로 1일당 4000 mg 미만의 용량으로 투여될 수 있다. 일부 경우에, 2'-데옥시-구아노신의 합성 유사체의 적합한 경구 용량은 1일당 약 50 mg 내지 1일당 약 2500 mg, 예를 들어, 1일당 약 50 mg 내지 1일당 약 100 mg, 1일당 약 100 mg 내지 1일당 약 200 mg, 1일당 약 200 mg 내지 1일당 약 300 mg, 1일당 약 300 mg 내지 1일당 약 400 mg, 1일당 약 400 mg 내지 1일당 약 500 mg, 1일당 약 500 mg 내지 1일당 약 600 mg, 1일당 약 600 mg 내지 1일당 약 700 mg, 1일당 약 700 mg 내지 1일당 약 800 mg, 1일당 약 800 mg 내지 1일당 약 900 mg, 1일당 약 900 mg 내지 1일당 약 1000 mg, 1일당 약 1000 mg 내지 1일당 약 1250 mg, 1일당 약 1250 mg 내지 1일당 약 1500 mg, 1일당 약 1500 mg 내지 1일당 약 1750 mg, 1일당 약 1750 mg 내지 1일당 약 2000 mg, 1일당 약 2000 mg 내지 1일당 약 2250 mg, 또는 1일당 약 2250 mg 내지 1일당 약 2500 mg의 범위이다. 일부 경우에, 2'-데옥시-구아노신의 합성 유사체의 적합한 경구 용량은 1일당 약 2500 mg 내지 1일당 약 3000 mg, 1일당 약 3000 mg 내지 1일당 약 3500 mg, 또는 1일당 약 3500 mg 내지 1일당 약 4000 mg의 범위이다.
한 비-제한적 예로서, 간시클로비르는 3000 mg의 총 1일 용량을 위해, 1일당 3회 1000 mg의 용량으로 투여될 수 있다. 간시클로비르는 3000 mg 미만 (예를 들어, 1일당 약 50 mg 내지 1일당 약 2500 mg, 예를 들어, 1일당 약 50 mg 내지 1일당 약 100 mg, 1일당 약 100 mg 내지 1일당 약 200 mg, 1일당 약 200 mg 내지 1일당 약 300 mg, 1일당 약 300 mg 내지 1일당 약 400 mg, 1일당 약 400 mg 내지 1일당 약 500 mg, 1일당 약 500 mg 내지 1일당 약 600 mg, 1일당 약 600 mg 내지 1일당 약 700 mg, 1일당 약 700 mg 내지 1일당 약 800 mg, 1일당 약 800 mg 내지 1일당 약 900 mg, 1일당 약 900 mg 내지 1일당 약 1000 mg, 1일당 약 1000 mg 내지 1일당 약 1250 mg, 1일당 약 1250 mg 내지 1일당 약 1500 mg, 1일당 약 1500 mg 내지 1일당 약 1750 mg, 1일당 약 1750 mg 내지 1일당 약 2000 mg, 1일당 약 2000 mg 내지 1일당 약 2250 mg, 또는 1일당 약 2250 mg 내지 1일당 약 2500 mg)의 총 1일 용량으로 투여될 수 있다. 일부 경우에, 간시클로비르는 경구 투여를 통해 투여된다.
또 다른 비-제한적 예로서, 아시클로비르는 1000 mg 내지 4000 mg의 총 1일 용량으로 투여될 수 있다. 아시클로비르는 4000 mg 미만 (예를 들어, 1일당 약 50 mg 내지 1일당 약 2500 mg, 예를 들어, 1일당 약 50 mg 내지 1일당 약 100 mg, 1일당 약 100 mg 내지 1일당 약 200 mg, 1일당 약 200 mg 내지 1일당 약 300 mg, 1일당 약 300 mg 내지 1일당 약 400 mg, 1일당 약 400 mg 내지 1일당 약 500 mg, 1일당 약 500 mg 내지 1일당 약 600 mg, 1일당 약 600 mg 내지 1일당 약 700 mg, 1일당 약 700 mg 내지 1일당 약 800 mg, 1일당 약 800 mg 내지 1일당 약 900 mg, 1일당 약 900 mg 내지 1일당 약 1000 mg, 1일당 약 1000 mg 내지 1일당 약 1250 mg, 1일당 약 1250 mg 내지 1일당 약 1500 mg, 1일당 약 1500 mg 내지 1일당 약 1750 mg, 1일당 약 1750 mg 내지 1일당 약 2000 mg, 1일당 약 2000 mg 내지 1일당 약 2250 mg, 또는 1일당 약 2250 mg 내지 1일당 약 2500 mg)의 총 1일 용량으로 투여될 수 있다. 일부 경우에, 아시클로비르는 경구 투여를 통해 투여된다.
또 다른 예로서 발간시클로비르는 약 900 mg 내지 약 1800 mg의 총 1일 용량으로 투여된다. 발간시클로비르는 1800 mg 미만 (예를 들어, 약 500 mg/일 내지 약 600 mg/일, 약 600 mg/일 내지 약 700 mg/일, 약 700 mg/일 내지 약 800 mg/일, 약 800 mg/일 내지 약 900 mg/일, 약 900 mg/일 내지 약 1000 mg/일, 약 1000 mg/일 내지 약 1200 mg/일, 약 1200 mg/일 내지 약 1400 mg/일, 또는 약 1400 mg/일 내지 약 1600 mg/일)의 총 1일 용량으로 투여될 수 있다. 일부 경우에, 발간시클로비르는 경구 투여를 통해 투여된다.
또 다른 예로서, 팜시클로비르는 약 2000 mg/일 내지 약 4000 mg/일의 총 1일 용량으로 투여된다. 팜시클로비르는 4000 mg 미만 (예를 들어, 1일당 약 50 mg 내지 1일당 약 2500 mg, 예를 들어, 1일당 약 50 mg 내지 1일당 약 100 mg, 1일당 약 100 mg 내지 1일당 약 200 mg, 1일당 약 200 mg 내지 1일당 약 300 mg, 1일당 약 300 mg 내지 1일당 약 400 mg, 1일당 약 400 mg 내지 1일당 약 500 mg, 1일당 약 500 mg 내지 1일당 약 600 mg, 1일당 약 600 mg 내지 1일당 약 700 mg, 1일당 약 700 mg 내지 1일당 약 800 mg, 1일당 약 800 mg 내지 1일당 약 900 mg, 1일당 약 900 mg 내지 1일당 약 1000 mg, 1일당 약 1000 mg 내지 1일당 약 1250 mg, 1일당 약 1250 mg 내지 1일당 약 1500 mg, 1일당 약 1500 mg 내지 1일당 약 1750 mg, 1일당 약 1750 mg 내지 1일당 약 2000 mg, 1일당 약 2000 mg 내지 1일당 약 2250 mg, 또는 1일당 약 2250 mg 내지 1일당 약 2500 mg)의 총 1일 용량으로 투여될 수 있다. 일부 경우에, 팜시클로비르는 경구 투여를 통해 투여된다.
또 다른 예로서 발라시클로비르는 약 2000 mg 내지 약 4000 mg의 총 1일 용량으로 투여된다. 발라시클로비르는 4000 mg 미만 (예를 들어, 1일당 약 50 mg 내지 1일당 약 2500 mg, 예를 들어, 1일당 약 50 mg 내지 1일당 약 100 mg, 1일당 약 100 mg 내지 1일당 약 200 mg, 1일당 약 200 mg 내지 1일당 약 300 mg, 1일당 약 300 mg 내지 1일당 약 400 mg, 1일당 약 400 mg 내지 1일당 약 500 mg, 1일당 약 500 mg 내지 1일당 약 600 mg, 1일당 약 600 mg 내지 1일당 약 700 mg, 1일당 약 700 mg 내지 1일당 약 800 mg, 1일당 약 800 mg 내지 1일당 약 900 mg, 1일당 약 900 mg 내지 1일당 약 1000 mg, 1일당 약 1000 mg 내지 1일당 약 1250 mg, 1일당 약 1250 mg 내지 1일당 약 1500 mg, 1일당 약 1500 mg 내지 1일당 약 1750 mg, 1일당 약 1750 mg 내지 1일당 약 2000 mg, 1일당 약 2000 mg 내지 1일당 약 2250 mg, 또는 1일당 약 2250 mg 내지 1일당 약 2500 mg)의 총 1일 용량으로 투여될 수 있다. 일부 경우에, 발라시클로비르는 경구 투여를 통해 투여된다.
또 다른 예로서, 간시클로비르는 약 10 mg/kg의 총 1일 용량으로 투여된다. 간시클로비르는 10 mg/kg 미만 (예를 들어, 약 1 mg/kg 내지 약 2 mg/kg, 약 2 mg/kg 내지 약 3 mg/kg, 약 3 mg/kg 내지 약 4 mg/kg, 약 4 mg/kg 내지 약 5 mg/kg, 약 5 mg/kg 내지 약 6 mg/kg, 약 6 mg/kg 내지 약 7 mg/kg, 약 7 mg/kg 내지 약 8 mg/kg, 또는 약 8 mg/kg 내지 약 9 mg/kg)의 총 1일 용량으로 투여될 수 있다. 일부 경우에, 간시클로비르는 주사 (예를 들어, 근육내 주사, 정맥내 주사, 또는 피하 주사)를 통해 투여된다.
또 다른 예로서, 아시클로비르는 약 15 mg/kg 내지 약 30 mg/kg, 또는 약 30 mg/kg 내지 약 45 mg/kg의 총 1일 용량으로 투여된다. 아시클로비르는 45 mg/kg 미만 (예를 들어, 약 5 mg/kg 내지 약 7.5 mg/kg, 약 7.5 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 약 10 mg/kg 내지 약 12.5 mg/kg, 약 12.5 mg/kg 내지 약 15 mg/kg, 약 15 mg/kg 내지 약 20 mg/kg, 약 20 mg/kg 내지 약 25 mg/kg, 약 25 mg/kg 내지 약 30 mg/kg, 또는 약 30 mg/kg 내지 약 35 mg/kg)의 총 1일 용량으로 투여될 수 있다. 일부 경우에, 아시클로비르는 주사 (예를 들어, 근육내 주사, 정맥내 주사, 또는 피하 주사)를 통해 투여된다.
또 다른 예로서, 발간시클로비르는 약 10 mg/kg의 총 1일 용량으로 투여된다. 발간시클로비르는 10 mg/kg 미만 (예를 들어, 약 1 mg/kg 내지 약 2 mg/kg, 약 2 mg/kg 내지 약 3 mg/kg, 약 3 mg/kg 내지 약 4 mg/kg, 약 4 mg/kg 내지 약 5 mg/kg, 약 5 mg/kg 내지 약 6 mg/kg, 약 6 mg/kg 내지 약 7 mg/kg, 약 7 mg/kg 내지 약 8 mg/kg, 또는 약 8 mg/kg 내지 약 9 mg/kg)의 총 1일 용량으로 투여될 수 있다. 일부 경우에, 발간시클로비르 는 주사 (예를 들어, 근육내 주사, 정맥내 주사, 또는 피하 주사)를 통해 투여된다.
일부 경우에, 2'-데옥시-구아노신의 합성 유사체는 국소로 투여된다. 국소 투여에 적합한 제제는 예를 들어, 피부 제제 (예를 들어, 액체, 크림, 겔 등) 및 안과 제제 (예를 들어, 크림, 액체, 겔 등)를 포함한다. 간시클로비르의 국소 용량은 예를 들어, 예를 들어, 안과 적응증을 위해, 1일당 5회 0.15% 제제의 1 방울일 수 있다. 아시클로비르의 국소 용량은 예를 들어, 피부 병변을 커버하는데 충분한 양으로 5% 제제의 1일당 6회 적용일 수 있다. 아이독스우리딘의 국소 용량은 예를 들어, 0.5% 연고 또는 0.1% 크림의 1 방울의 4시간마다의 적용일 수 있다.
일부 경우에, 2'-데옥시-구아노신의 합성 유사체는 10 mg/kg 체중 미만의 용량으로 정맥내로 투여된다. 일부 경우에, 2'-데옥시-구아노신의 합성 유사체의 적합한 정맥내 용량은 약 1 mg/kg 체중 내지 약 2.5 mg/kg 체중, 약 2.5 mg/kg 체중 내지 약 5 mg/kg 체중, 약 5 mg/kg 체중 내지 약 7.5 mg/kg 체중, 또는 약 7.5 mg/kg 체중 내지 약 10 mg/kg 체중의 범위이다.
C-7. 본 개시내용의 비-제한적 측면의 예
상기 기재된 종양용해성 바이러스-관련된 요지의 실시양태를 포함한 측면은 단독으로 또는 하나 이상의 다른 측면 또는 실시양태와 조합으로 유익할 수 있다. 상기 설명을 제한하지는 않지만, 본 개시내용의 특정 비-제한적 측면은 하기에 제공된다. 본 개시내용을 읽을 때 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것인 바와 같이, 개별적으로 넘버링된 측면의 각각은 임의의 선행 또는 하기 개별적으로 넘버링된 측면과 함께 사용되거나 조합될 수 있다. 이는 측면의 모든 이러한 조합에 대한 지지를 제공하는 것으로 의도되며, 하기 명백하게 제공된 측면의 조합에 제한되지는 않는다:
측면 1. 재조합 종양용해성 바이러스 (OV)로서, 그의 게놈에 (1) 변이체 인터류킨-2 (IL-2) 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 (여기서 변이체 IL-2 폴리펩티드는 야생형 IL-2와 비교하여 감소된 비바람직한 특성을 가짐); 및 (2) 이종 티미딘 키나제 (TK) 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 OV.
측면 2. OV가 백시니아 티미딘 키나제를 결핍성이 되게 하는 변형을 추가로 포함하는 것인 측면 1의 OV.
측면 3. 변형이 J2R 발현 및/또는 기능의 결여를 발생시키는 것인 측면 2의 OV.
측면 4. 바이러스가 코펜하겐 균주 백시니아 바이러스인 측면 1 내지 3 중 어느 하나의 OV.
측면 5. 바이러스가 WR 균주 백시니아 바이러스인 측면 1 내지 3 중 어느 하나의 OV.
측면 6. 바이러스가 K151E 치환을 포함하는 A34R 유전자를 포함하는 것인 측면 1 내지 5 중 어느 하나의 OV.
측면 7. 변이체 IL-2 폴리펩티드가 서열식별번호: 1에 제시된 IL-2 아미노산 서열의 아미노산 넘버링에 기반하여, F42, Y45, 및 L72 중 하나 이상의 치환을 포함하는 것인 측면 1 내지 6 중 어느 하나의 OV.
측면 8. IL-2v 폴리펩티드가 서열식별번호: 1에 제시된 IL-2 아미노산 서열의 아미노산 넘버링에 기반하여, F42L, F42A, F42G, F42S, F42T, F42Q, F42E, F42D, F42R, 또는 F42K 치환을 포함하는 것인 측면 1 내지 7 중 어느 하나의 OV.
측면 9. IL-2v 폴리펩티드가 서열식별번호: 1에 제시된 IL-2 아미노산 서열의 아미노산 넘버링에 기반하여, Y45A, Y45G, Y45S, Y45T, Y45Q, Y45E, Y45N, Y45D, Y45R, 또는 Y45K 치환을 포함하는 것인 측면 1 내지 8 중 어느 하나의 OV.
측면 10. IL-2v 폴리펩티드가 서열식별번호: 1에 제시된 IL-2 아미노산 서열의 아미노산 넘버링에 기반하여, L72G, L72A, L72S, L72T, L72Q, L72E, L72N, L72R, 또는 L72K 치환인 CD25를 포함하는 것인 측면 1 내지 9 중 어느 하나의 OV.
측면 11. IL-2v 폴리펩티드가 서열식별번호: 1에 제시된 IL-2 아미노산 서열의 아미노산 넘버링에 기반하여, F42A, Y45A, 및 L72G 치환을 포함하는 것인 측면 1 내지 10 중 어느 하나의 OV.
측면 12. IL-2v 폴리펩티드-코딩 뉴클레오티드 서열이 조절성 프로모터에 작동가능하게 연결된 것인 측면 1 내지 11 중 어느 하나의 OV.
측면 13. 조절성 프로모터가 테트라시클린 또는 테트라시클린 유사체 또는 유도체에 의해 조절되는 것인 측면 12의 OV.
측면 14. a) 측면 1 내지 13 중 어느 하나의 OV; 및 b) 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 조성물.
측면 15. 측면 1 내지 13 중 어느 하나의 OV, 또는 측면 14의 조성물의 유효량을 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 종양을 갖는 개체에서 종양용해를 유도하는 방법.
측면 16. 상기 투여가 바이러스 또는 조성물의 단일 용량을 투여하는 것을 포함하는 것인 측면 15의 방법.
측면 17. 단일 용량이 적어도 106 플라크 형성 단위 (pfu)의 바이러스를 포함하는 것인 측면 16의 방법.
측면 18. 단일 용량이 109 내지 1012 pfu의 바이러스를 포함하는 것인 측면 16의 방법.
측면 19. 상기 투여가 바이러스 또는 조성물의 다중 용량을 투여하는 것을 포함하는 것인 측면 15의 방법.
측면 20. 바이러스 또는 조성물이 격일로 투여되는 것인 측면 19의 방법.
측면 21. 바이러스 또는 조성물이 1주당 1회 투여되는 것인 측면 15 내지 20 중 어느 하나의 방법.
측면 22. 바이러스 또는 조성물이 격주로 투여되는 것인 측면 15 내지 20 중 어느 하나의 방법.
측면 23. 종양이 뇌암 종양, 두경부암 종양, 식도암 종양, 피부암 종양, 폐암 종양, 흉선암 종양, 위암 종양, 결장암 종양, 간암 종양, 난소암 종양, 자궁암 종양, 방광암 종양, 고환암 종양, 직장암 종양, 유방암 종양, 또는 췌장암 종양인 측면 15 내지 21 중 어느 하나의 방법.
측면 24. 종양이 결장직장 선암종인 측면 15 내지 22 중 어느 하나의 방법.
측면 25. 종양이 비소세포 폐 암종인 측면 15 내지 22 중 어느 하나의 방법.
측면 26. 종양이 삼중-음성 유방암인 측면 15 내지 22 중 어느 하나의 방법.
측면 27. 종양이 고형 종양인 측면 15 내지 22 중 어느 하나의 방법.
측면 28. 종양이 액상 종양인 측면 15 내지 22 중 어느 하나의 방법.
측면 29. 종양이 재발성인 측면 15 내지 28 중 어느 하나의 방법.
측면 30. 종양이 원발성 종양인 측면 15 내지 28 중 어느 하나의 방법.
측면 31. 종양이 전이성인 측면 15 내지 28 중 어느 하나의 방법.
측면 32. 제2 암 요법을 개체에게 투여하는 것을 추가로 포함하는 측면 15 내지 31 중 어느 하나의 방법.
측면 33. 제2 암 요법이 화학요법, 생물학적 요법, 방사선요법, 면역요법, 호르몬 요법, 항-혈관 요법, 냉동요법, 독소 요법, 종양용해성 바이러스 요법, 세포 요법, 및 수술로부터 선택되는 것인 측면 32의 방법.
측면 34. 제2 암 요법이 항-PD1 항체 또는 항-PD-L1 항체를 포함하는 것인 측면 32의 방법.
측면 35. 개체가 면역손상된 것인 측면 15 내지 34 중 어느 하나의 방법.
측면 36. 백시니아 바이러스 또는 조성물의 상기 투여가 종양내인 측면 15 내지 35 중 어느 하나의 방법.
측면 37. 백시니아 바이러스 또는 조성물의 상기 투여가 종양주위인 측면 15 내지 35 중 어느 하나의 방법.
측면 38. 백시니아 바이러스 또는 조성물의 상기 투여가 정맥내인 측면 15 내지 35 중 어느 하나의 방법.
측면 39. 백시니아 바이러스 또는 조성물의 상기 투여가 동맥내인 측면 15 내지 35 중 어느 하나의 방법.
측면 40. 백시니아 바이러스 또는 조성물의 상기 투여가 방광내인 측면 15 내지 35 중 어느 하나의 방법.
측면 41. 백시니아 바이러스 또는 조성물의 상기 투여가 경막내인 측면 15 내지 35 중 어느 하나의 방법.
측면 42. 재조합 OV로서, 그의 게놈에 변이체 인터류킨-2 (IL-2v) 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 IL-2v 폴리펩티드는 야생형 IL-2에 비해 감소된 CD25에의 결합을 제공하는 1개 이상의 아미노산 치환을 포함하는 것인 재조합 OV.
측면 43. 재조합 OV로서, 그의 게놈에 서열식별번호: 9를 포함하는 변이체 인터류킨-2 (IL-2v) 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 백시니아 바이러스는 코펜하겐 균주 백시니아 바이러스이고, 백시니아 티미딘 키나제 결핍성이고, K151E 치환을 포함하는 A34R 유전자를 포함하는 것인 재조합 OV.
측면 44. 신호 펩티드를 추가로 포함하는 측면 43의 바이러스.
측면 45. 신호 펩티드가 서열식별번호: 22를 포함하는 것인 측면 44의 바이러스.
측면 46. 재조합 OV로서, 그의 게놈에 서열식별번호: 10을 포함하는 변이체 인터류킨-2 (IL-2v) 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 백시니아 바이러스는 코펜하겐 균주 백시니아 바이러스이고, 백시니아 티미딘 키나제 결핍성이고, K151E 치환을 포함하는 A34R 유전자를 포함하는 것인 재조합 OV.
측면 47. 재조합 OV로서, 그의 게놈에 서열식별번호: 12를 포함하는 변이체 인터류킨-2 (IL-2v) 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 백시니아 바이러스는 코펜하겐 균주 백시니아 바이러스이고, 백시니아 티미딘 키나제 결핍성이고, K151E 치환을 포함하는 A34R 유전자를 포함하는 것인 재조합 OV.
측면 48. (i) 측면 42 내지 47 중 어느 하나의 바이러스 및 (ii) 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물.
측면 49. 재조합 OV로서, 그의 게놈에 변이체 인터류킨-2 (IL-2v) 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 IL-2v 폴리펩티드는 야생형 IL-2와 비교할 경우 감소된 비바람직한 생물학적 활성을 제공하는 것인 재조합 OV.
측면 50. 재조합 OV로서, 그의 게놈에 인간 변이체 IL-2를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 변이체 IL-2는 T3, R38, L40, K43, Y45, E62, Y65, L72, Q74, 및 C125로부터 선택된 위치에 서열식별번호: 1의 인간 IL-2 단백질 서열에 비해 1개 이상의 치환을 포함하는 것인 재조합 OV.
측면 51. 변이체 IL-2가 하기 군의 위치 중 하나 이상에 아미노산 치환을 포함하는 것인 측면 50의 재조합 OV: R38 및 L40; T41 및 K43; K43 및 Y45; E62 및 K64; L72 및 Q74; R38, L40, K43, 및 Y45; K43, Y45, L72, 및 Q74; T3, R38, L40, K43, 및 Y45; T3, K43, Y45, L72, 및 Q74; R38, L40, K43, Y45, 및 C125; K43, Y45, L72, Q74, 및 C125; T3, R38, L40, K43, Y45, 및 C125; T3, K43, Y45, L72, Q74, 및 C125.
측면 52. 변이체 IL-2가 T3A, K35N, R38N, L40S, L40T, T41N, K43S, K43T, K43N, Y45S, Y45T, E62N, E62A, E62K, E62R, K64S, K64T, L72N, Q74S, Q74T, C125A, 및 C125S로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 아미노산 치환을 포함하는 것인 측면 50의 재조합 OV.
측면 53. 변이체 IL-2 폴리펩티드가 서열식별번호: 1에 제시된 IL-2 아미노산 서열의 아미노산 번호에 기반하여, R38N, L40T, K43N, 및 Y45T 치환을 포함하는 것인 측면 50의 재조합 OV.
측면 54. 재조합 종양용해성 백시니아 바이러스인 측면 1 내지 53 중 어느 하나에 언급된 재조합 OV.
D. 출원에 개시된 서열의 설명
Figure pat00005
Figure pat00006
Figure pat00007
E. 실시예
하기 실시예는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 본 발명을 제조하고 사용하는 방법의 완전한 개시 및 설명을 제공하기 위해 제시되며, 본 발명자들이 그들의 발명으로서 간주하는 것의 범위를 제한하는 것으로 의도되지도 않고, 그들이 하기 실험이 수행된 모든 또는 유일한 실험이라는 것을 나타내는 것으로 의도되지도 않는다. 사용된 수 (예를 들어 양, 온도 등)에 관하여 정확성을 보장하기 위한 노력이 기울여 졌지만, 일부 실험적 오차 및 편차는 설명되어야 한다. 달리 지시되지 않는 한, 부는 중량부이고, 분자량은 중량 평균 분자량이고, 온도는 섭씨 도이고, 압력은 대기압 또는 그 부근이다. 표준 약어, 예를 들어, pl, 피코리터; s 또는 sec, 초; min, 분; h 또는 hr, 시간; aa, 아미노산(들); kb, 킬로베이스; bp, 염기 쌍(들); nt, 뉴클레오티드(들); i.m., 근육내(로); i.p., 복강내(로); s.c., 피하(로); i.v., 정맥내(로); i.t., 종양내(로) 등이 사용될 수 있다. 명확성을 위해, 실시예에 언급된 특정 트랜스진의 설명이 표 1에 제공된다:
표 1. 실시예에 언급된 특정 트랜스진의 설명
Figure pat00008
실시예 1: 재조합 백시니아 바이러스 구축물의 생성
하기 제공된 실시예와 관련하여 생성된 예시적인 재조합 백시니아 바이러스 구축물의 특정 특색은 하기 표 2에 요약된다. 표 2에서 각각의 바이러스는 J2R 유전자의 삽입적 불활성화를 갖는 VV10 및 VV18을 제외하고는 J2R 유전자의 결실을 갖는다. VV27, VV79, VV91-VV96 및 IGV-121은 마우스 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화된 마우스 IL-2 변이체 (F76A, Y79A, L106G 치환을 가짐; 서열식별번호: 3)를 코딩하는 유전자를 갖는다. VV75 및 VV100-VV103은 인간 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화된 인간 IL-2 변이체 (F62A, Y65A, 및 L92G 치환을 가짐; 서열식별번호: 14)를 코딩하는 유전자를 갖는다. VV97, VV110, 및 VV117은 인간 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화된 인간 IL-2 당변이체 ("IL-2gv" 또는 "IL-2gv1"로도 지칭됨; R58N, L60T, K63N, 및 Y65T 치환을 가짐; 서열식별번호: 29)를 코딩하는 유전자를 갖는다. VV98은 인간 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화된 인간 IL-2 당변이체 2 ("IL-2gv2"로도 지칭됨; K63N, Y65T, L92N, 및 Q94T 치환을 가짐; 서열식별번호: 33)를 코딩하는 유전자를 갖는다. VV99는 인간 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화된 인간 IL-2 (야생형)를 코딩하는 유전자를 갖는다.
표 2. 재조합 백시니아 바이러스 구축물의 특색
Figure pat00009
Figure pat00010
VV27 구축
바이러스는 백시니아의 코펜하겐 균주에 기반하며, 합성 초기 후기 프로모터 및 오퍼레이터의 제어 하에서 마우스 IL-2 변이체를 코딩하는 유전자를 운반한다. 바이러스를 A34R 유전자에서의 K151E 치환의 혼입에 의해 증진된 세포외 외피화된 바이러스 (EEV) 생산을 위해 조작하였다. VV27을 헬퍼 바이러스-매개된, 제한 효소-가이드된, 상동 재조합 복구 및 구제 기술을 사용하여 구축하였다. 먼저, 마우스 IL-2v (F76A, Y79A, L106G)를 코딩하는 유전자를 마우스 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화하고, 진위즈(GeneWiz) (미국 뉴저지주 사우쓰 플레인필드)에 의해 합성하였다. DNA를 BglII/AsiSI로 소화시키고, 또한 BglII/AsiSI로 소화된 코펜하겐 J2R 상동 재조합 플라스미드 내로 삽입하였다. 마우스 IL-2v 유전자 및 플랭킹 좌측 및 우측 백시니아 상동성 영역을 PCR에 의해 증폭시켜 상동 재조합 공여자 단편을 생성하였다. BSC-40 세포를 헬퍼 바이러스인 쇼프 섬유종 바이러스 (SFV)로 1시간 동안 감염시키고, 이어서 공여자 앰플리콘 및 J2R 영역 내에서 이전에 제한 소화된 정제된 백시니아 게놈 DNA의 혼합물로 형질감염시켰다. 모 게놈 DNA는 증진된 EEV 생산을 위해 A34R 유전자 내에 천연 J2R 유전자 대신 반딧불이 루시페라제 및 GFP 및 K151E 돌연변이 (치환)를 운반하는 코펜하겐 균주 백시니아 바이러스로부터 기원하였다. 형질감염된 세포를 유의한 세포변성 효과가 관찰될 때까지 인큐베이션하고, 총 세포 용해물을 3 라운드의 동결/해동 및 초음파처리에 의해 수거하였다. 용해물을 계열 희석하고, BSC-40 단층 상에 플레이팅하고, 한천 오버레이에 의해 커버하였다. GFP 음성 플라크를 총 3 라운드의 플라크 정제에 걸쳐 형광 현미경 하에서 단리하였다. 하나의 플라크 (KR144)를 T225 플라스크에서 BSC-40 세포에서 중간 증폭을 위해 선택한 후, 20-층 셀 팩토리에서 HeLa 세포에서 대규모 증폭시켰다. 바이러스를 수크로스 구배 초원심분리에 의해 정제하고, 전체 게놈 차세대 시퀀싱을 포함한 품질 제어 검정에서 철저하게 특징규명하였다.
VV38 구축
바이러스는 백시니아의 코펜하겐 균주에 기반하며, 합성 초기 후기 프로모터 및 오퍼레이터의 제어 하에서 마우스 IL-2 변이체를 코딩하는 유전자를 운반한다. 바이러스는 그것이 야생형 A34R 유전자를 운반하고, 증진된 EEV 생산을 위해 조작되지 않은 것을 제외하고는 VV27과 동일하다. VV38을 헬퍼 바이러스-매개된, 제한 효소-가이드된, 상동 재조합 복구 및 구제 기술을 사용하여 구축하였다. BSC-40 세포를 SFV 헬퍼 바이러스로 1-2시간 동안 감염시키고, 이어서 공여자 앰플리콘 및 J2R 영역에서 AsiSI로 이전에 소화된 정제된 백시니아 게놈 DNA의 혼합물로 형질감염시켰다. 모 게놈 DNA는 천연 J2R 유전자 대신 반딧불이 루시페라제 및 GFP를 운반하는 코펜하겐 균주 백시니아 바이러스로부터 기원하였다. 형질감염된 세포를 유의한 세포변성 효과가 관찰될 때까지 인큐베이션하고, 총 세포 용해물을 3 라운드의 동결/해동 및 초음파처리에 의해 수거하였다. 용해물을 계열 희석하고, BSC-40 단층 상에 플레이팅하고, 한천 오버레이에 의해 커버하였다. GFP 음성 플라크를 총 3 라운드의 플라크 정제를 위해 형광 현미경 하에서 단리하였다. 하나의 플라크 (LW226)를 T225 플라스크에서 BSC-40 세포에서 중간 증폭을 위해 선택한 후, 20-층 셀 팩토리에서 HeLa 세포에서 대규모 증폭시켰다. 바이러스를 수크로스 구배 초원심분리에 의해 정제하고, 전체 게놈 차세대 시퀀싱을 포함한 품질 제어 검정에서 철저하게 특징규명하였다.
VV39 구축
바이러스는 백시니아의 웨스턴 리저브 (WR) 균주에 기반하며, 합성 초기 후기 프로모터 및 오퍼레이터의 제어 하에서 마우스 IL-2 변이체를 코딩하는 유전자를 운반한다. VV39를 헬퍼 바이러스-매개된, 제한 효소-가이드된, 상동 재조합 복구 및 구제 기술을 사용하여 구축하였다. BSC-40 세포를 SFV 헬퍼 바이러스로 1-2시간 동안 감염시키고, 이어서 공여자 앰플리콘 및 J2R 영역에서 AsiSI로 이전에 소화된 정제된 백시니아 게놈 DNA의 혼합물로 형질감염시켰다. 모 게놈 DNA는 증진된 EEV 생산을 위해 조작되지 않은, 천연 J2R 유전자 및 야생형 A34R 대신 루시페라제-2A-GFP 리포터 유전자 카세트를 운반하는 WR 균주 백시니아 바이러스로부터 기원하였다. 형질감염된 세포를 유의한 세포변성 효과가 관찰될 때까지 인큐베이션하고, 총 세포 용해물을 3 라운드의 동결/해동 및 초음파처리에 의해 수거하였다. 용해물을 계열 희석하고, BSC-40 단층 상에 플레이팅하고, 한천 오버레이에 의해 커버하였다. GFP 음성 플라크를 총 3 라운드의 플라크 정제를 위해 형광 현미경 하에서 단리하였다. 하나의 플라크 (LW228)를 T225 플라스크에서 BSC-40 세포에서 중간 증폭을 위해 선택한 후, 20-층 셀 팩토리에서 HeLa 세포에서 대규모 증폭시켰다. 바이러스 (로트 #180330)를 수크로스 구배 초원심분리에 의해 정제하고, 전체 게놈 차세대 시퀀싱을 포함한 품질 제어 검정에서 철저하게 특징규명하였다.
VV79 구축
코펜하겐 VV27의 등가의 WR 균주인 VV79는 A34R K151E 치환의 첨가를 제외하고는 VV39와 동일하다. 이를 K151E 돌연변이를 VV39 모 바이러스 백본 내로 삽입하기 위해 헬퍼 바이러스 매개된, 상동 재조합 복구 및 구제 기술을 사용하여 구축하였다.
VV101 구축
VV101은 백시니아 바이러스의 코펜하겐 (Cop) 균주에 기반한 아암화된 종양용해성 바이러스이다. 이는 1) 천연 백시니아 J2R (티미딘 키나제) 유전자의 결실, 2) J2R 로커스 내의 합성 초기-후기 프로모터에 의해 제어된 인간 IL-2 변이체 (hIL-2v) 발현 카세트의 삽입, 3) hIL-2v 카세트와 반대 배향에서 J2R 로커스 내의 F17 프로모터에 의해 제어된 단순 포진 바이러스 (HSV) 티미딘 키나제 변이체 (TK.007) 발현 카세트의 삽입, 및 4) A34 단백질의 위치 151에 리신의 글루타메이트로의 치환 (K151E)을 도입하는 바이러스 A34R 유전자 내의 돌연변이를 포함한 4가지 유전자 변형에 의해 모 코펜하겐 천연두 백신 균주과 상이하다. VV101을 헬퍼 바이러스 매개된, 상동 재조합 복구 및 구제 기술을 사용하여 구축하였다. 먼저, HSV TK.007을 코딩하는 유전자를 백시니아 바이러스의 발현을 위해 코돈 최적화하고, 진스크립트(Genscript)에 의해 합성하였다. 유전자를 백시니아 코펜하겐의 J2R 영역을 표적화하는 상동 재조합 벡터에서 F17 프로모터 (PF17)의 하류에서 클로닝하였다. 두번째로, 백시니아 핵산을 정제된 VV27로부터 추출하고, HSV TK.007 / J2R 상동 재조합 플라스미드와 함께 쇼프 섬유종 바이러스 감염된 BSC-40 세포 내로 형질감염시켰다. 3-일 인큐베이션 후, 용해물을 반복된 동결 및 해동에 의해 수거하였다. 바이러스를 4 라운드의 플라크 정제를 통해 운반하고, PCR에 의해 HSV-TK.007의 존재에 대해 스크리닝하였다. 바이러스, 즉, 표지된 VV93을 HeLa 세포에서 확장시키고, 수크로스 구배 원심분리에 의해 정제하고, 전체 게놈 차세대 시퀀싱을 포함한 품질 제어 검정에서 특징규명하였다. 마지막으로, 마우스 IL-2 변이체 (mIL-2v)를 코딩하는 유전자를 상기 기재된 바와 같은 헬퍼 바이러스 매개된, 상동 재조합 복구 및 구제 기술을 사용하여 인간에서의 발현을 위해 최적화된 hIL-2v를 코딩하는 유전자로 대체함으로써 VV101을 VV93으로부터 구축하였다. 재조합, 플라크 정제 및 스크리닝 후, VV101을 HeLa 세포에서 확장시키고, 수크로스 구배 원심분리에 의해 정제하고, 전체 게놈 차세대 시퀀싱을 포함한 품질 제어 검정에서 특징규명하였다.
VV102 구축
VV102는 백시니아 바이러스의 코펜하겐 균주에 기반한 아암화된 종양용해성 바이러스이다. 이는 1) 천연 백시니아 J2R 유전자의 결실, 2) J2R 로커스 내의 합성 초기-후기 프로모터에 의해 제어된 hIL-2v 발현 카세트의 삽입, 3) 천연 B16R 유전자의 157 염기를 대체하는, B16R 로커스 내의 F17 프로모터에 의해 제어된 HSV 티미딘 키나제 변이체 (HSV TK.007; 서열식별번호: 28) 발현 카세트의 삽입, 및 4) A34 단백질의 위치 151에 리신의 글루타메이트로의 치환 (K151E)을 도입하는 바이러스 A34R 유전자 내의 돌연변이를 포함한 4가지 유전자 변형에 의해 모 코펜하겐 천연두 백신 균주와 상이하다. VV102를 헬퍼 바이러스 매개된, 상동 재조합 복구 및 구제 기술을 사용하여 구축하였다. 먼저, HSV TK.007을 코딩하는 유전자를 백시니아 바이러스에 의한 발현을 위해 코돈 최적화하고, 진스크립트에 의해 합성하였다. 유전자를 백시니아 코펜하겐의 B16R 영역을 표적화하는 상동 재조합 벡터에서 F17 프로모터 (PF17)의 하류에서 클로닝하였다. 두번째로, 백시니아 핵산을 정제된 VV27 (IGNT-001에 기재됨)로부터 추출하고, HSV TK.007 / B16 상동 재조합 플라스미드와 함께 쇼프 섬유종 바이러스 감염된 BSC-40 세포 내로 형질감염시켰다. 3-일 인큐베이션 후, 용해물을 반복된 동결 및 해동에 의해 수거하였다. 바이러스를 4 라운드의 플라크 정제를 통해 운반하고, PCR에 의해 HSV TK.007의 존재에 대해 스크리닝하였다. 바이러스, 즉, 표지된 VV91을 HeLa 세포에서 확장시키고, 수크로스 구배 원심분리에 의해 정제하고, 전체 게놈 차세대 시퀀싱을 포함한 품질 제어 검정에서 특징규명하였다. 마지막으로, mIL-2v를 코딩하는 유전자를 상기 기재된 바와 같은 헬퍼 바이러스 매개된, 상동 재조합 복구 및 구제 기술을 사용하여 인간에서의 발현을 위해 최적화된 hIL-2v를 코딩하는 유전자로 대체함으로써 VV102를 VV91로부터 구축하였다. 재조합, 플라크 정제 및 스크리닝 후, VV102를 HeLa 세포에서 확장시키고, 수크로스 구배 원심분리에 의해 정제하고, 전체 게놈 차세대 시퀀싱을 포함한 품질 제어 검정에서 특징규명하였다.
VV103 구축
VV103은 백시니아 바이러스의 코펜하겐 균주에 기반한 아암화된 종양용해성 바이러스이다. 이는 1) 천연 백시니아 J2R 유전자의 결실, 2) J2R 로커스 내의 합성 초기-후기 프로모터에 의해 제어된 hIL-2v 발현 카세트의 삽입, 3) 전체 천연 B16R 유전자를 대체하는, B16R 로커스 내의 F17 프로모터에 의해 제어된 HSV 티미딘 키나제 변이체 (TK.007) 발현 카세트의 삽입, 및 4) A34 단백질의 위치 151에 리신의 글루타메이트로의 치환 (K151E)을 도입하는 바이러스 A34R 유전자 내의 돌연변이를 포함한 4가지 유전자 변형에 의해 모 코펜하겐 천연두 백신 균주와 상이하다. VV103을 헬퍼 바이러스 매개된, 상동 재조합 복구 및 구제 기술을 사용하여 구축하였다. 먼저, HSV TK.007을 코딩하는 유전자를 백시니아 바이러스에 의한 발현을 위해 코돈 최적화하고, 진스크립트에 의해 합성하였다. 유전자를 백시니아 코펜하겐의 B16R 영역을 표적화하는 상동 재조합 벡터에서 F17 프로모터 (PF17)의 하류에서 클로닝하였다. 두번째로, 백시니아 핵산을 정제된 VV27 (IGNT-001에 기재됨)로부터 추출하고, HSV TK.007 / B16 상동 재조합 플라스미드와 함께 쇼프 섬유종 바이러스 감염된 BSC-40 세포 내로 형질감염시켰다. 3-일 인큐베이션 후, 용해물을 반복된 동결 및 해동에 의해 수거하였다. 바이러스를 4 라운드의 플라크 정제를 통해 운반하고, PCR에 의해 HSV TK.007의 존재에 대해 스크리닝하였다. 바이러스, 즉, 표지된 VV96을 HeLa 세포에서 확장시키고, 수크로스 구배 원심분리에 의해 정제하고, 전체 게놈 차세대 시퀀싱을 포함한 품질 제어 검정에서 특징규명하였다. 마지막으로, mIL-2v를 코딩하는 유전자를 상기 기재된 바와 같은 헬퍼 바이러스 매개된, 상동 재조합 복구 및 구제 기술을 사용하여 인간에서의 발현을 위해 최적화된 hIL-2v를 코딩하는 유전자로 대체함으로써 VV103을 VV96으로부터 구축하였다. 재조합, 플라크 정제 및 스크리닝 후, VV103을 HeLa 세포에서 확장시키고, 수크로스 구배 원심분리에 의해 정제하고, 전체 게놈 차세대 시퀀싱을 포함한 품질 제어 검정에서 특징규명하였다.
VV94 구축
VV94는 백시니아 바이러스의 마우스-적응된 웨스턴 리저브 (WR) 균주에 기반한 아암화된 종양용해성 바이러스이다. 이는 1) 천연 백시니아 J2R 유전자의 결실, 2) 정방향 배향에서 J2R 로커스 내의 합성 초기-후기 프로모터에 의해 제어된 mIL-2v 발현 카세트의 삽입, 3) 역방향 배향에서 J2R 로커스 내의 F17 프로모터에 의해 제어된 HSV 티미딘 키나제 변이체 (TK.007) 발현 카세트의 삽입, 및 4) A34 단백질의 위치 151에 리신의 글루타메이트로의 치환 (K151E)을 도입하는 바이러스 A34R 유전자 내의 돌연변이를 포함한 4가지 유전자 변형에 의해 모 WR 균주와 상이하다. VV94를 헬퍼 바이러스 매개된, 상동 재조합 복구 및 구제 기술을 사용하여 구축하였다. 먼저, HSV TK.007을 코딩하는 유전자를 백시니아 바이러스에 의한 발현을 위해 코돈 최적화하고, 진스크립트에 의해 합성하였다. 유전자를 WR J2R 영역을 표적화하는 상동 재조합 벡터에서 F17 프로모터 (PF17)의 하류에서 클로닝하였다. 두번째로, 백시니아 핵산을 정제된 VV79로부터 추출하고, HSVTK.007 / J2R 상동 재조합 앰플리콘과 함께 쇼프 섬유종 바이러스 감염된 BSC-40 세포 내로 형질감염시켰다. 3-일 인큐베이션 후, 용해물을 반복된 동결 및 해동에 의해 수거하였다. 바이러스를 4 라운드의 플라크 정제를 통해 운반하고, PCR에 의해 HSV-TK.007의 존재에 대해 스크리닝하였다. 바이러스, 즉, 표지된 VV94를 먼저 BSC-40 세포에서, 이어서 HeLa 세포에서 확장시키고, 수크로스 구배 원심분리에 의해 정제하고, 전체 게놈 차세대 시퀀싱을 포함한 품질 제어 검정에서 특징규명하였다.
VV110 구축
VV110은 백시니아 바이러스의 코펜하겐 균주에 기반한 아암화된 종양용해성 바이러스이다. 이는 1) 천연 백시니아 J2R 유전자의 결실, 2) J2R 로커스 내의 합성 초기-후기 프로모터에 의해 제어된 인간 IL-2 당변이체 (R58N,L60T, K63N, 및 Y65T; 서열식별번호: 29) 발현 카세트의 삽입, 3) 천연 B16R 유전자의 157 염기를 대체하는, B16R 로커스 내의 F17 프로모터에 의해 제어된 HSV 티미딘 키나제 변이체 (TK.007) 발현 카세트의 삽입, 및 4) A34 단백질의 위치 151에 리신의 글루타메이트로의 치환 (K151E)을 도입하는 바이러스 A34R 유전자 내의 돌연변이를 포함한 4가지 유전자 변형에 의해 모 코펜하겐 천연두 백신 균주와 상이하다. VV110을 헬퍼 바이러스 매개된, 상동 재조합 복구 및 구제 기술을 사용하여 구축하였다. 먼저, HSV TK.007을 코딩하는 유전자를 백시니아 바이러스에 의한 발현을 위해 코돈 최적화하고, 진스크립트에 의해 합성하였다. 유전자를 백시니아 코펜하겐의 B16R 영역을 표적화하는 상동 재조합 벡터에서 F17 프로모터 (PF17)의 하류에서 클로닝하였다. 두번째로, 백시니아 핵산을 정제된 VV27 (IGNT-001에 기재됨)로부터 추출하고, HSV TK.007 / B16 상동 재조합 플라스미드와 함께 쇼프 섬유종 바이러스 감염된 BSC-40 세포 내로 형질감염시켰다. 3-일 인큐베이션 후, 용해물을 반복된 동결 및 해동에 의해 수거하였다. 바이러스를 4 라운드의 플라크 정제를 통해 운반하고, PCR에 의해 HSV TK.007의 존재에 대해 스크리닝하였다. 바이러스, 즉, 표지된 VV91을 HeLa 세포에서 확장시키고, 수크로스 구배 원심분리에 의해 정제하고, 전체 게놈 차세대 시퀀싱을 포함한 품질 제어 검정에서 특징규명하였다. 마지막으로, 마우스 IL-2v를 코딩하는 유전자를 상기 기재된 바와 같은 헬퍼 바이러스 매개된, 상동 재조합 복구 및 구제 기술을 사용하여 인간에서의 발현을 위해 최적화된 인간 IL-2 당변이체를 코딩하는 유전자로 대체함으로써 VV110을 VV91로부터 구축하였다. 재조합, 플라크 정제 및 스크리닝 후, VV110을 HeLa 세포에서 확장시키고, 수크로스 구배 원심분리에 의해 정제하고, 전체 게놈 차세대 시퀀싱을 포함한 품질 제어 검정에서 특징규명하였다.
IGV-121 구축
IGV-121은 백시니아 바이러스의 마우스-적응된 WR 균주에 기반한 아암화된 종양용해성 바이러스이다. 이는 1) 천연 백시니아 J2R 유전자의 결실, 2) J2R 로커스 내의 합성 초기-후기 프로모터에 의해 제어된 mIL-2v 변이체 발현 카세트의 삽입, 3) B15R (WR197로도 공지됨) 및 B17L (WR198) 사이의 유전자간 영역에서 F17 프로모터에 의해 제어된 HSV 티미딘 키나제 변이체 (TK.007) 발현 카세트의 삽입, 및 4) A34 단백질의 위치 151에 리신의 글루타메이트로의 치환 (K151E)을 도입하는 바이러스 A34R 유전자 내의 돌연변이를 포함한 4가지 유전자 변형에 의해 모 WR 균주와 상이하다. IGV-121을 헬퍼 바이러스 매개된, 상동 재조합 복구 및 구제 기술을 사용하여 구축하였다. 먼저, HSV TK.007을 코딩하는 유전자를 백시니아 바이러스에 의한 발현을 위해 코돈 최적화하고, 진스크립트에 의해 합성하였다. 유전자를 백시니아 WR 균주의 B15R 및 B17L 사이의 유전자간 영역을 표적화하는 상동 재조합 벡터에서 F17 프로모터 (PF17)의 하류에서 클로닝하였다. 두번째로, 백시니아 핵산을 정제된 VV79 (마우스 IL-2v에 의해 대체된 J2R 및 A34R K151E 돌연변이를 갖는 WR 균주)로부터 추출하고, HSV TK.007 / B15R-B17L 상동 재조합 플라스미드와 함께 쇼프 섬유종 바이러스 감염된 베로(Vero)-B4 세포 내로 형질감염시켰다. 2-일 인큐베이션 후, 용해물을 반복된 동결, 해동, 및 초음파처리에 의해 수거하였다. 바이러스를 BSC-40 세포 상의 3 라운드의 플라크 정제를 통해 운반하였다. 바이러스, 즉, 표지된 IGV-121을 HeLa S3 세포에서 확장시키고, 수크로스 구배 원심분리에 의해 정제하고, 전체 게놈 차세대 시퀀싱을 포함한 품질 제어 검정에서 특징규명하였다.
VV117 구축
VV117은 백시니아 바이러스의 마우스-적응된 WR 균주에 기반한 아암화된 종양용해성 바이러스이다. 이는 1) 천연 백시니아 J2R 유전자의 결실, 2) J2R 로커스 내의 합성 초기-후기 프로모터에 의해 제어된 인간 IL-2 당변이체 (R58N, L60T, K63N, 및 Y65T; 서열식별번호: 29) 발현 카세트의 삽입, 3) B15R (WR197로도 공지됨) 및 B17L (WR198) 사이의 유전자간 영역에서 F17 프로모터에 의해 제어된 HSV 티미딘 키나제 변이체 (TK.007) 발현 카세트의 삽입, 및 4) A34 단백질의 위치 151에 리신의 글루타메이트로의 치환 (K151E)을 도입하는 바이러스 A34R 유전자 내의 돌연변이를 포함한 4가지 유전자 변형에 의해 모 WR 균주와 상이하다. VV117을 이전에 기재된 헬퍼 바이러스 매개된, 상동 재조합 복구 및 구제 기술을 사용하여 구축하였다. 백시니아 핵산을 정제된 IGV-121 (마우스 IL-2v에 의해 대체된 J2R, A34R K151E 돌연변이, 및 B15R 및 B17R 사이의 유전자간 영역 내로 삽입된 HSV TK.007을 갖는 WR 균주)로부터 추출하고, 인간 IL-2 당변이체 상동 재조합 플라스미드와 함께 쇼프 섬유종 바이러스 감염된 BSC-40 세포 내로 형질감염시켰다. 3-일 인큐베이션 후, 용해물을 반복된 동결, 해동, 및 초음파처리에 의해 수거하였다. 바이러스를 BSC-40 세포 상의 3 라운드의 플라크 정제를 통해 운반하였다. 바이러스, 즉, 표지된 VV117을 HeLa 세포에서 확장시키고, 수크로스 구배 원심분리에 의해 정제하고, 전체 게놈 차세대 시퀀싱을 포함한 품질 제어 검정에서 특징규명하였다.
도 1은 VV91, VV93, 및 VV96에 대한 전체 게놈의 개략적 제시이다.
도 2는 VV94 및 IGV-121에 대한 전체 게놈의 개략적 제시이다.
도 3은 VV101-VV103에 대한 전체 게놈의 개략적 제시이다.
도 26은 VV97-100에 대한 전체 게놈의 개략적 제시이다. 약어: LITR = 좌측 역위 말단 반복부; RITR = 우측 역위 말단 반복부; A - O = HindIII 소화 단편에 의해 역사적으로 정의된 바이러스 유전자 영역; PSEL = 합성 초기 후기 프로모터; IL-2gv = 인간 인터류킨-2 당변이체 (R58N:L60T, K63N:Y65T); IL-2gv2 = 인간 인터류킨-2 당변이체 2 (K63N:Y65T, L92N:Q94T); IL-2 = 인간 인터류킨-2 (야생형); IL-2v = 인간 인터류킨-2 변이체 (F62A, Y65A, L92G)
도 27은 VV110에 대한 전체 게놈의 개략적 제시이다. 약어: LITR = 좌측 역위 말단 반복부; RITR = 우측 역위 말단 반복부; A - O = HindIII 소화 단편에 의해 역사적으로 정의된 바이러스 유전자 영역; PSEL = 합성 초기 후기 프로모터; IL-2gv = 인간 인터류킨-2 당변이체; * = A34 단백질의 위치 151에서의 리신의 글루타메이트로의 치환을 코딩하는 돌연변이; PF17 = F17R 유전자로부터의 프로모터; HSV TK.007 = 위치 168에서의 알라닌의 히스티딘으로의 치환을 코딩하는 돌연변이를 갖는 단순 포진 바이러스 티미딘 키나제 유전자
도 28은 VV117에 대한 전체 게놈의 개략적 제시이다. 약어: LITR = 좌측 역위 말단 반복부; RITR = 우측 역위 말단 반복부; A - O = HindIII 소화 단편에 의해 역사적으로 정의된 바이러스 유전자 영역; PSEL = 합성 초기 후기 프로모터; IL2gv = 인간 인터류킨-2 당변이체; * = A34 단백질의 위치 151에서의 리신의 글루타메이트로의 치환을 코딩하는 돌연변이; PF17 = F17R 유전자로부터의 프로모터; HSV TK.007 = 위치 168에서의 알라닌의 히스티딘으로의 치환을 코딩하는 돌연변이를 갖는 단순 포진 바이러스 티미딘 키나제 유전자
실시예 2: 웨스턴 블롯에 의한 바이러스- 감염된 세포에서의 재조합 백시니아 바이러스로부터의 IL-2v 발현
HeLa 세포를 6-웰 플레이트에서 2mL의 배양 배지에서 6e5개의 세포/웰로 플레이팅하고, 배양물에서 대략 24 hr 후에 MOI = 3으로 24 hr 동안 바이러스로 감염시켰다. 이어서 각각의 웰로부터의 세포를 수거하고, 200μL 램라이(Laemmli) 완충제에 용해시키고, 이어서 밀리큐(milliQ) 물로 1:1 희석하였다. 12μL의 샘플을 환원제 및 1x 뉴페이지(NuPage) LDS 샘플 완충제를 함유하는 트리스(Tris)-완충 염수 (TBS)에서 20μL의 최종 부피로 제조한 후, 95℃에서 5min 동안 인큐베이션하고, 뉴페이지 4-12% 비스-트리스(Bis-Tris) 겔 상에 로딩하였다. 1xMES 실행 완충제로의 겔 전기영동을 200V에서 30min 동안 수행하였다. 단백질을 아이블롯(iBlot) 장치를 사용하여 PVDF 막에 옮기고, 웨스턴 블롯을 아이블롯 장치를 사용하여 수행하였다. mIL-2v의 검출을 위해 하기 항체를 사용하였다 - 1:2000 희석으로 항-IL-2 1차 항체 (앱캠(Abcam), ab11510), 1:1000 희석으로 염소 항-래트 IgG-HRP 2차 항체 (인비트로젠(Invitrogen), #629526). hIL-2v의 검출을 위해 하기 항체를 사용하였다 - 1:500 희석으로 항-IL-2 1차 항체 (노부스 바이올로지칼스(Novus Biologicals), NBP2-16948), 1:2000 희석으로 마우스 항-토끼 IgG-HRP 2차 항체 (피어스(Pierce), #31460). 이어서 TMB 기질을 막에 첨가하여 밴드를 가시화하였다. 막을 물로 세정하고, 건조시키고, 스캐닝하였다. 결과는 도 4 (재조합 종양용해성 백시니아 바이러스로의 세포의 감염 후의 mIL-2v 발현 분석) 및 도 5 (재조합 종양용해성 백시니아 바이러스로의 세포의 감염 후의 hIL-2v 발현 분석)에 제시되어 있다.
실시예 3: RT-qPCR에 의한 바이러스-감염된 세포에서의 재조합 백시니아 바이러스로부터의 HSV TK.007 발현.
HeLa 세포를 6-웰 플레이트에서 2mL의 배양 배지에서 7e4개의 세포/웰로 플레이팅하고, 배양물에서 대략 72 hr 후에 MOI = 3으로 18 hr 동안 바이러스로 감염시켰다. 이어서 각각의 웰로부터의 세포를 수거하고, RNA 추출을 위해 알엔이지 플러스 유니버셜 미니 키트(Rneasy Plus Universal Mini Kit) (퀴아젠(Qiagen), #73404)를 사용하여 프로세싱하였다. 500ng 총 RNA를 고 용량 cDNA 역전사 키트 (어플라이드 바이오시스템스(Applied Biosystems), #4368814)를 사용하여 역전사하였다. cDNA를 qPCR에 사용하기 전에 1:10 희석하여, 재조합 바이러스에서 코딩된 HSV TK.007 트랜스진에 대해 특이적인 프라이머 및 프로브 및 프라임타임(PrimeTime) 유전자 발현 마스터 믹스 (IDT, #1055772)를 사용하여 HSV TK.007 mRNA 발현 수준을 분석하였다. PCR을 ViiA7 기기 (어플라이드 바이오시스템스) 상에서 수행하였다. HSV TK.007 cDNA 서열을 함유하는 플라스미드 DNA를 표준물로서 사용하고, 각각의 시험 샘플에서 카피/μL를 표준 곡선으로부터 결정하였다. 결과는 도 6 (재조합 종양용해성 백시니아 바이러스로의 세포의 감염 후의 HSV TK.007 발현 분석)에 제시되어 있다.
실시예 4: MC38 종양-보유 C57BL/6 마우스에서의 재조합 종양용해성 백시니아 바이러스 활성 (mIL-2v를 발현하는 Cop 바이러스)
암컷 C57BL/6 마우스 (8-10주령)를 5e5개의 MC38 종양 세포로 우측 상부 후방 옆구리 상에 피하로 (SC) 이식하였다. MC38은 뮤린 결장 선암종 세포주이다. 예를 들어, 문헌 [Cancer Research (1975) vol. 35, pp. 2434-2439]을 참조한다. 종양 세포 이식 후 11일에, 마우스를 종양 부피에 기반하여 별개의 처리 그룹 (그룹당 평균 종양 부피 ~50 mm3; N=18/그룹)으로 무작위화하였다. 이식 후 제12일에, 종양을 60 μL 비히클 (30 mM 트리스, 10% 수크로스, pH 8.0) 또는 5e7 플라크 형성 단위 (pfu)의 재조합 코펜하겐 (Cop) 백시니아 바이러스 변이체를 함유하는 60 μL 비히클로 직접적으로 주사하였다. 종양-보유 마우스를 매일 관찰하고, 마우스가 i) 1400 mm3를 넘는 종양 부피 ii) ≥ 20% 체중 감소, 또는 iii) 심각하게 감소된 건강 상태 중 어느 하나로 인해 인도적으로 희생될 때까지 격주로 종양 부피 및 체중 둘 다를 측정하였다. 마우스의 그룹을 하기와 같이 처리하였다:
그룹 i) 비히클 단독;
그룹 ii) VV16: A34R-K151E 돌연변이 (아미노산 치환)를 운반하고, 루시페라제 및 녹색 형광 단백질 (Luc-2A-GFP) 이중 리포터 카세트로 아암화된 Cop 백시니아 바이러스;
그룹 iii) VV27: A34R-K151E 치환을 운반하고, mIL-2v 트랜스진으로 아암화된 Cop 백시니아 바이러스;
그룹 iv) VV91: A34R-K151E 치환을 운반하고, mIL-2v 트랜스진으로 아암화되고, HSV TK.007 (B16R 삽입, 정방향 배향)을 코딩하는 Cop 백시니아 바이러스;
그룹 v) VV93: A34R-K151E 치환을 운반하고, 뮤린 mIL-2v 트랜스진으로 아암화되고, HSV TK.007 (J2R 삽입, 역방향 배향)을 코딩하는 Cop 백시니아 바이러스; 또는
그룹 vi) VV96: A34R-K151E 치환을 운반하고, mIL-2v 트랜스진으로 아암화되고, HSV TK.007 (B16R 삽입, 역방향 배향)을 코딩하는 Cop 백시니아 바이러스.
그룹 (i) - (vi)의 종양 성장 프로파일 사이의 비교 (도 7)는 모든 시험 바이러스가 다수의 연속적 일에 걸쳐 종양 성장에 대한 통계적으로 유의한 억제 효과를 생성하였고, 모든 mIL-2v-아암화된 Cop 백시니아 바이러스 (VV27, VV91, VV93, 및 VV96)는 대조군 바이러스 (VV16)에 비해 다수의 연속적 일에 걸쳐 종양 성장에 대한 통계적으로 유의한 억제 효과를 생성하였으며 (도 8, ANCOVA 결과), VV27 (mIL-2v 단독)을 VV91, VV93, 또는 VV96 (각각은 mIL-2v 및 HSV TK.007을 가짐) 중 어느 하나와 비교할 경우 통계적으로 유의한 차이가 관찰되지 않았음을 밝혀내었다.
도 7a-7g는 MC38 종양 세포로 SC 이식된 C57BL/6 암컷 마우스에 대한 바이러스요법-유도된 종양 성장 억제의 평가의 결과를 제시한다. 종양 성장 궤적은 비히클 단독 (a) 또는 루시페라제-2A-GFP 리포터 (Cop.Luc-GFP.A34R-K151E; VV16) (b), mIL-2v 단독 (Cop.mGM-CSF.A34R-K151E; VV27) (c), B16R 유전자 로커스에서 정방향 배향에서 mIL-2v 및 HSV TK.007 (Cop.mIL-2v.A34R-K151E.HSV TK.007 (B16R_For); VV91) (d), J2R 유전자 로커스에서 역방향 배향에서 mIL-2v 및 HSV TK.007 (Cop.mIL-2v.A34R-K151E.HSV TK.007 (J2R_Rev); VV93) (e), 또는 B16R 유전자 로커스에서 역방향 배향에서 mIL-2v 및 HSV TK.007 (Cop.mIL-2v.A34R-K151E.HSV TK.007 (B16R_Rev); VV96) (f) 중 어느 하나로 아암화된 A34R K151E 돌연변이를 함유하는 코펜하겐 백시니아 바이러스로 처리된 그룹에서의 개별적 마우스에 대해 제시되어 있다. 각각의 그래프 상의 수직 파선은 마우스가 비히클 또는 바이러스의 종양내 주사를 받은 시점을 나타낸다. 각각의 그래프 상의 수평 파선은 동물을 연구로부터 제거하는 기준으로서 사용된 종양 부피 역치를 나타낸다. 각각의 처리 그룹에 대한 평균 종양 부피 (mm3) ± 95% 신뢰 구간은 각각의 그룹에서의 모든 동물이 여전히 살아 있었던 마지막 종양 측정 시점인 종양 이식 후 제28일까지 제시되어 있다 (g).
도 8은 ANCOVA를 사용한 바이러스요법-유도된 종양 성장 억제의 통계적 비교의 결과를 제시한다. 비히클/바이러스 처리 후 (종양 이식 후 제14일 내지 제27일)의 각각의 그룹에서의 개별적 마우스에 대한 종양 부피를 ANCOVA에 의해 분석하여 다양한 처리 그룹에 걸친 종양 성장에 대한 통계적으로 유의한 억제 효과를 결정하였다. 칼럼은 특이적 처리 그룹 쌍 사이의 비교의 통계적 결과 (p 값)를 제시한다. 볼드체의 값은 p ≤ 0.05인 비교 ANCOVA 결과를 나타낸다.
각각의 처리 그룹 (N=18/그룹)에서의 동물의 생존을 또한 종양 이식 후 제41일까지 평가하였다 (도 9). 비아암화된 백시니아 대조군 (VV16)은 비히클 대조군에 비해 생존을 유의하게 개선시키지 않았다 (로그 순위/만텔-콕스 검정, p=0.133). 그러나, 아암화된 백시니아 바이러스 변이체 VV27, VV91, VV93, 및 VV96으로 처리된 마우스는 리포터 트랜스진-아암화된 백시니아 대조군 (VV16) 처리 그룹에 비해 통계적으로 유의한 평균 생존 이점을 제시하였다 (로그 순위/만텔-콕스 검정, 각각 p=0.009, 0.006, <0.0001, 및 0.013).
도 9는 이식 후 제12일에 비히클 또는 바이러스로의 처리 후의 MC38 종양-이식된 C57BL/6 암컷 마우스의 생존의 결과를 제시한다. 마우스를 종양 부피 ≥ 1400 mm3에 도달시 사망한 바와 같이 매일 표시하였다. 각각의 그룹의 곡선 및 수평 파선 사이의 교차점은 그룹에 대한 중위 (50%) 생존 역치를 지시한다.
종양 성장 억제 및 생존을 모니터링하는 것 외에도, 혈청을 비히클 또는 재조합 Cop 백시니아 바이러스로의 주사 후 24 hr 및 48hr에 종양-보유 마우스로부터 수집하여 순환 IL-2 수준을 평가하였다. 종양내 주사를 받은 후 24 hr 및 48 hr에 각각의 처리 그룹으로부터 수집된 혈청에서의 순환 IL-2 수준을 ELISA에 의해 정량화하였다 (도 10). mIL-2v-아암화된 Cop 백시니아 바이러스 변이체 (VV27, VV91, VV93, 및 VV96)로 처리된 대부분의 동물로부터의 혈청에서 IL-2의 측정가능한 수준이 감출된 반면, 비히클 또는 다른 Cop 백시니아 바이러스 (VV16) 그룹으로부터의 임의의 동물에서는 IL-2의 배경 수준이 나타났다. 이 후자의 결과는 적어도 시험된 용량 수준에서 mIL-2v 트랜스진을 결여한 Cop 백시니아 바이러스의 종양내 주사가 처리된 동물의 혈청에서 증가된 순환 IL-2 수준을 유도하는데 불충분하였음을 지시한다. 따라서, mIL-2v-아암화된 Cop 백시니아 바이러스로 처리된 마우스의 혈청에서 나타난 상승된 수준은 종양내 주사 후 트랜스진-매개된 발현을 지시할 것이다.
도 10은 비히클 또는 재조합 Cop 백시니아 바이러스로의 종양내 주사 후 24 hr 및 48 hr에 MC38 종양-보유 C57BL/6 암컷 마우스로부터 수집된 혈청에서 검출된 IL-2 수준의 결과를 제시한다. 각각의 기호는 개별적 마우스에 대한 계산된 IL-2 혈청 수준을 나타내는 반면, 막대는 그룹 기하 평균 (N=9/그룹)을 나타낸다. 오차 막대는 95% 신뢰 구간을 나타낸다.
실시예 5: 루이스 폐 암종 (LLC) 종양-보유 C57BL/6 마우스에서의 mIL-2v-아암화된 백시니아 바이러스 활성 (mIL-2v를 발현하는 Cop 바이러스)
암컷 C57BL/6 마우스 (8-10주령)를 1e5개의 LLC 종양 세포로 좌측 상방 후방 옆구리 상에 피하로 (SC) 이식하였다. 종양 세포 이식 후 12일에, 마우스를 종양 부피에 기반하여 별개의 처리 그룹 (그룹당 평균 종양 부피 ~50 mm3; N=20/그룹)으로 무작위화하였다. 이식 후 제13일에, 종양을 60 μL 비히클 (30 mM 트리스, 10% 수크로스, pH 8.0) 또는 5e7 플라크 형성 단위 (pfu)의 재조합 코펜하겐 (Cop) 백시니아 바이러스 변이체를 함유하는 60 μL 비히클로 직접적으로 주사하였다. 종양-보유 마우스를 매일 관찰하고, 마우스가 i) 1400 mm3를 넘는 종양 부피 ii) ≥ 20% 체중 감소, 또는 iii) 심각하게 감소된 건강 상태 중 어느 하나로 인해 인도적으로 희생될 때까지 격주로 종양 부피 및 체중 둘 다를 측정하였다. 마우스의 그룹을 하기와 같이 처리하였다:
그룹 i) 비히클 단독;
그룹 ii) VV16: A34R-K151E 돌연변이 (아미노산 치환)를 운반하고, 루시페라제 및 녹색 형광 단백질 (Luc-2A-GFP) 이중 리포터 카세트로 아암화된 Cop 백시니아 바이러스;
그룹 iii) VV27: A34R-K151E 치환을 운반하고, mIL-2v 트랜스진으로 아암화된 Cop 백시니아 바이러스;
그룹 iv) VV91: A34R-K151E 치환을 운반하고, mIL-2v 트랜스진으로 아암화되고, HSV TK.007 (B16R 삽입, 정방향 배향)을 코딩하는 Cop 백시니아 바이러스;
그룹 v) VV93: A34R-K151E 치환을 운반하고, mIL-2v 트랜스진으로 아암화되고, HSV TK.007 (J2R 삽입, 역방향 배향)을 코딩하는 Cop 백시니아 바이러스; 또는
그룹 vi) VV96: A34R-K151E 치환을 운반하고, mIL-2v 트랜스진으로 아암화되고, HSV TK.007 (B16R 삽입, 역방향 배향)을 코딩하는 Cop 백시니아 바이러스.
그룹 (i) - (vi)의 종양 성장 프로파일 사이의 비교 (도 11)는 모든 시험 바이러스가 종양 성장에 대한 억제 효과를 생성하였고, mIL-2v-아암화된 Cop 백시니아 바이러스 (VV27, VV91, VV93, 및 VV96)로 대조군 바이러스 (VV16)에 비해 종양 성장에 대한 보다 현저한 억제 효과를 생성하였음을 밝혀내었다. 연구 상의 많은 동물은 상이한 바이러스 변이체와 연관된 종양 성장 억제의 통계적 분석을 제한하는 종양 궤양 및 연관된 감소된 건강 상태로 인해 인도적으로 희생되었다. 그러나, 개별적 동물의 분석은 7/20, 2/20, 및 1/20 종양이 각각 VV91, VV93, 또는 VV96으로의 처리 후 이식 후 제30일까지 <50mm3이거나 완전히 퇴행되었음을 입증하였으며, 다른 처리 그룹에서는 작은 종양 또는 완전한 퇴행이 관찰되지 않았다.
도 11a-11f는 LLC 종양 세포로 SC 이식된 C57BL/6 암컷 마우스에 대한 바이러스요법-유도된 종양 성장 억제의 평가의 결과를 제시한다. 종양 성장 궤적은 비히클 단독 (a) 또는 A34R K151E 돌연변이를 함유하고, 루시페라제-2A-GFP 리포터 (Cop.Luc-GFP.A34R-K151E; VV16) (b), mIL-2v 단독 (Cop.IL-2v.A34R-K151E; VV27) (c), B16R 유전자 로커스에서 정방향 배향에서 mIL-2v 및 HSV TK.007 (Cop.mIL-2v.A34R-K151E.HSV TK.007 (B16R_For); VV91) (d), J2R 유전자 로커스에서 역방향 배향에서 mIL-2v 및 HSV TK.007 (Cop.mIL-2v.A34R-K151E.HSV TK.007 (J2R_Rev); VV93) (e), B16R 유전자 로커스에서 역방향 배향에서 mIL-2v 및 HSV TK.007 (Cop.mIL-2v.A34R-K151E.HSV TK.007 (B16R_Rev); VV96) (f) 중 어느 하나로 아암화된 코펜하겐 백시니아 바이러스로 처리된 그룹에서의 개별적 마우스에 대해 제시되어 있다. 각각의 그래프 상의 수직 파선은 마우스가 비히클 또는 바이러스의 종양내 주사를 받은 시점을 나타낸다. 각각의 그래프 상의 수평 파선은 동물을 연구로부터 제거하는 기준으로서 사용된 종양 부피 역치를 나타낸다.
종양 성장 억제 및 생존을 모니터링하는 것 외에도, 혈청을 비히클 또는 재조합 Cop 백시니아 바이러스로의 주사 후 24, 48, 및 72 hr에 종양-보유 마우스로부터 수집하여 순환 IL-2 수준을 평가하였다. 종양내 주사를 받은 후 이들 시점에서 각각의 처리 그룹으로부터 수집된 혈청에서의 순환 IL-2 수준을 ELISA에 의해 정량화하였다 (도 12). mIL-2v-아암화된 Cop 백시니아 바이러스 변이체 (VV27, VV91, VV93, 및 VV96)로 처리된 대부분의 동물로부터의 혈청에서 IL-2의 측정가능한 수준이 검출된 반면, 비히클 또는 다른 Cop 백시니아 바이러스 (VV16) 그룹으로부터의 임의의 동물에서는 IL-2의 배경 수준이 나타났다. 이 후자의 결과는 적어도 시험된 용량 수준에서 mIL-2v 트랜스진을 결여한 Cop 백시니아 바이러스의 종양내 주사가 처리된 동물의 혈청에서 증가된 순환 IL-2 수준을 유도하는데 불충분하였음을 지시한다. 따라서, mIL-2v-아암화된 Cop 백시니아 바이러스로 처리된 마우스의 혈청에서 나타난 상승된 수준은 종양내 주사 후 트랜스진-매개된 발현을 지시할 것이다.
도 12는 비히클 또는 재조합 Cop 백시니아 바이러스로의 종양내 주사 후 24, 48, 및 72 hr에 LLC 종양-보유 C57BL/6 암컷 마우스로부터 수집된 혈청에서 검출된 IL-2 수준의 결과를 제시한다. 각각의 기호는 개별적 마우스에 대한 계산된 IL-2 혈청 수준을 나타내는 반면, 막대는 그룹 기하 평균 (N=5/그룹)을 나타낸다. 오차 막대는 95% 신뢰 구간을 나타낸다.
실시예 6: MC38 종양-보유 C57BL/6 마우스에서의 재조합 종양용해성 백시니아 바이러스를 사용한 단일 IV 바이러스요법 (mIL-2v를 발현하는 WR 바이러스)
C57BL/6 암컷 마우스를 5e5개의 MC38 종양 세포로 좌측 옆구리 상에 SC 이식하였다. 종양 세포 이식 후 10일에, 마우스를 종양 부피에 기반하여 별개의 처리 그룹 (그룹당 평균 종양 부피 ~50 mm3; N=15/그룹)으로 무작위화하였다. 종양 세포 이식 후 제11일에, 마우스를 100 μL의 비히클 (30 mM 트리스, 10% 수크로스, pH8.0) 또는 5e7 pfu 재조합 WR 백시니아 바이러스를 함유하는 100 μL의 비히클로 IV 주사하였다. 종양-보유 마우스를 매일 관찰하고, 마우스가 i) 1400 mm3를 넘는 종양 부피 ii) ≥ 20% 체중 감소, iii) 심각하게 감소된 건강 상태 또는 iv) 연구 종결 중 어느 하나로 인해 인도적으로 희생될 때까지 격주로 종양 부피 및 체중 둘 다를 측정하였다.
각각의 시험 바이러스에 대한 그룹 평균으로서 (도 13a) 또는 각각의 시험 그룹 내의 개별적 마우스로서 (도 13b-13f) 제시된 종양 성장 프로파일의 분석은 중요한 결과를 밝혀내었다. mIL-2v 트랜스진-아암화된 WR 바이러스 (mIL-2v 단독을 코딩하거나, HSV TK.007을 가짐)의 IV 투여는 비히클 및 리포터 트랜스진-아암화된 WR 바이러스 (VV17) 처리에 비해 MC38 종양 성장의 통계적으로 유의한 억제를 초래하였다. VV79 및 IGV-121에 의해 유도된 종양 성장 억제 사이의 통계적으로 유의한 차이는 없었지만, VV79 및 VV94 사이에 통계적으로 유의한 차이가 검출되었다 (도 14, ANCOVA 결과).
동일한 시험 바이러스에 대한 생존 결과는 종양 성장 억제에 대해 상기 보고된 것들과 매우 유사한 결과를 제시하였다. 이는 상응하는 Luc-GFP 리포터-아암화된 WR 바이러스에 비해 HSV TK.007의 존재 또는 부재 하에서 mIL-2v 트랜스진-아암화된 WR 바이러스와 연관된 통계적으로 우수한 그룹 생존을 포함하였다 (도 15). 전체적으로, mIL-2v 트랜스진-아암화된 WR 바이러스 변이체의 IV 전달은 MC38 SC 종양 모델에서 유효한 항-종양 요법인 것으로 입증되었으며, 바이러스의 단일 치료적 투여의 효력을 입증하였다.
혈청을 또한 순환 IL-2 수준의 평가를 위해 IV 바이러스 투여 후 72 hr (제14일)에 각각의 시험 그룹에서의 MC38 종양-보유 마우스로부터 수집하였다. mIL-2v 트랜스진-아암화된 바이러스를 시험한 다른 연구와 일치하게, IL-2의 상승되고 통계적으로 유의한 혈청 수준이 mIL-2v 트랜스진-아암화된 WR 바이러스가 투여된 모든 시험 그룹에서 검출되었다 (도 16).
도 13a-13f는 MC38 종양 세포로 SC 이식된 C57BL/6 암컷 마우스에 대한 단일 (제11일) IV 바이러스 전달을 사용한 바이러스요법-유도된 종양 성장 억제의 평가의 결과를 제시한다. 종양 성장 궤적은 희생시까지 종양 이식 후 제32일까지 그룹 평균 ± 95% 신뢰 구간으로서 각각의 처리에 대해 (a) 또는 희생 또는 연구 종결시까지 각각의 그룹에서의 개별적 마우스에 대해 (b-f) 제시되어 있다. 시험 바이러스는 A34R K151E 돌연변이를 함유하고, 루시페라제-2A-GFP 리포터 (WR.Luc-GFP.A34R-K151E; VV17) (c), mIL-2v 단독 (WR.mIL-2v.A34R-K151E; VV79) (d), J2R 유전자 로커스에서 역방향 배향에서 HSV TK.007을 갖는 mIL-2v (WR.mIL-2v.A34R-K151E.HSV TK.007 (J2R_Rev); VV94) (e), 및 B15R/B17R 유전자 로커스에서 정방향 배향에서 mIL-2v 및 HSV TK.007 (WR.mIL-2v.A34R-K151E.HSV TK.007 (B16R_For); IGV-121) (f) 중 어느 하나로 아암화된 WR 백시니아 바이러스를 포함하였다. 각각의 그래프 상의 수직 파선은 마우스가 바이러스의 IV 주사를 받은 시점을 나타낸다. 각각의 그래프 상의 수평 파선은 동물을 연구로부터 제거하는 기준으로서 사용된 종양 부피 역치를 나타낸다.
도 14. 피하 MC38 종양 모델 연구를 위한 ANCOVA를 사용한 바이러스요법-유도된 종양 성장 억제의 통계적 비교. 처리 후 다수의 일에 각각의 그룹에서의 개별적 마우스에 대한 종양 부피를 ANCOVA에 의해 분석하여 다양한 처리 그룹에 걸친 종양 성장에 대한 통계적으로 유의한 억제 효과를 결정하였다. 칼럼은 특이적 처리 그룹 쌍 사이의 비교의 통계적 결과 (p 값)를 제시한다. 볼드체의 값은 p 값 ≤ 0.05가 관찰된 비교 ANCOVA 결과를 나타낸다.
도 15는 SC 종양 이식 후 제11일에 재조합 종양용해성 백시니아 바이러스로의 IV 처리 후의 MC38 종양-보유 C57BL/6 암컷 마우스의 생존의 결과를 제시한다. 마우스를 종양 부피 ≥ 1400 mm3에 도달시 사망한 바와 같이 매일 표시하였다. 각각의 그룹의 곡선 및 수평 파선 사이의 교차점은 그룹에 대한 중위 (50%) 생존 역치를 지시한다. P 값은 선택 바이러스 그룹 사이의 로그-순위 검정 (만텔-콕스) 비교의 통계적 결과를 나타낸다.
도 16은 5e7 pfu 재조합 WR 백시니아 바이러스로의 IV 주사 후 72 hr (제14일)에 MC38 종양-보유 C57BL/6 암컷 마우스로부터 수집된 혈청에서 검출된 IL-2 수준의 결과를 제시한다. 각각의 기호는 개별적 마우스에서 검출된 IL-2 혈청 수준을 나타내는 반면, 막대는 그룹 기하 평균 (N=10/그룹)을 나타낸다. 오차 막대는 95% 신뢰 구간을 나타낸다.
실시예 7: LLC 종양-보유 C57BL/6 마우스에서의 재조합 종양용해성 백시니아 바이러스를 사용한 단일 IV 바이러스요법 (mIL-2v를 발현하는 WR 바이러스)
이 실험의 세트에서, C57BL/6 암컷 마우스를 1e5개의 LLC 종양 세포로 우측 옆구리 상에 SC 이식하였다. 종양 세포 이식 후 12일에, 마우스를 종양 부피에 기반하여 별개의 처리 그룹 (그룹당 평균 종양 부피 ~50 mm3; N=20/그룹)으로 무작위화하였다. 제14일에 마우스를 100 μL의 비히클 (30 mM 트리스, 10% 수크로스, pH8.0) 또는 5e7 pfu 재조합 WR 백시니아 바이러스 변이체를 함유하는 100 μL의 비히클로 IV 주사하였다. 종양-보유 마우스를 매일 관찰하고, 마우스가 i) 2000 mm3를 넘는 종양 부피 ii) ≥ 20% 체중 감소, iii) 심각하게 감소된 건강 상태 또는 iv) 연구 종결 중 어느 하나로 인해 인도적으로 희생될 때까지 격주로 종양 부피 및 체중 둘 다를 측정하였다.
각각의 시험 바이러스에 대한 그룹 평균으로서 (도 17a) 또는 각각의 시험 그룹 내의 개별적 마우스로서 (도 17b-17d) 제시된 종양 성장 프로파일의 분석은 HSV TK.007 및 A34R-K151E 돌연변이를 코딩하는 mIL-2v 트랜스진-아암화된 WR 바이러스 (IGV-121)의 IV 투여가 리포터 트랜스진-아암화된 WR 바이러스 처리에 비해 LLC 종양 성장의 통계적으로 유의한 억제를 초래하였음을 입증하였다 (도 18, ANCOVA 결과).
동일한 시험 바이러스에 대한 생존 결과는 종양 성장 억제에 대해 상기 보고된 것들과 매우 유사한 결과를 제시하였다. 이는 상응하는 Luc-GFP 리포터-아암화된 WR 바이러스에 비해 mIL-2v 및 HSV TK.007 트랜스진-아암화된 WR 바이러스와 연된 통계적으로 우수한 그룹 생존을 포함하였다 (도 19). 전체적으로, mIL-2v 트랜스진-아암화된 WR 바이러스 변이체의 IV 전달은 LLC SC 종양 모델에서 유효한 항-종양 요법인 것으로 입증되었으며, 바이러스의 단일 치료적 투여의 효력을 입증하였다.
도 17a-17d는 LLC 종양 세포로 SC 이식된 C57BL/6 암컷 마우스에 대한 단일 (제14일) IV 바이러스 전달을 사용한 바이러스요법-유도된 종양 성장 억제의 평가의 결과를 제시한다. 종양 성장 궤적은 희생시까지 종양 이식 후 제27일까지 그룹 평균 ± 95% 신뢰 구간으로서 각각의 처리에 대해 (a) 또는 희생 또는 연구 종결시까지 각각의 그룹에서의 개별적 마우스에 대해 (b-d) 제시되어 있다. 시험 바이러스는 루시페라제-2A-GFP 리포터 (WR.Luc-GFP; VV3) (c), 또는 A34R K151E 돌연변이를 갖는 B15R/B17R 유전자 로커스에서 정방향 배향에서 mIL-2v 및 HSV TK.007 (WR.mIL-2v.A34R-K151E.HSV TK.007 (B16R_For); IGV-121)) (d) 중 어느 하나로 아암화된 WR 백시니아 바이러스를 포함하였다. 각각의 그래프 상의 수직 파선은 마우스가 바이러스의 IV 주사를 받은 시점을 나타낸다. 각각의 그래프 상의 수평 파선은 동물을 연구로부터 제거하는 기준으로서 사용된 종양 부피 역치를 나타낸다.
도 18은 피하 LLC 종양 모델 연구를 위한 ANCOVA를 사용한 바이러스요법-유도된 종양 성장 억제의 통계적 비교의 결과를 제시한다. 처리 후 다수의 일에 각각의 그룹에서의 개별적 마우스에 대한 종양 부피를 ANCOVA에 의해 분석하여 다양한 처리 그룹에 걸친 종양 성장에 대한 통계적으로 유의한 억제 효과를 결정하였다. 칼럼은 특이적 처리 그룹 쌍 사이의 비교의 통계적 결과 (p 값)를 제시한다. 볼드체의 값은 p 값 ≤ 0.05가 관찰된 비교 ANCOVA 결과를 나타낸다.
도 19는 SC 종양 이식 후 제14일에 재조합 종양용해성 백시니아 바이러스로의 IV 처리 후의 LLC 종양-보유 C57BL/6 암컷 마우스의 생존의 결과를 제시한다. 마우스를 종양 부피 ≥ 2000 mm3에 도달시 사망한 바와 같이 매일 표시하였다. 각각의 그룹의 곡선 및 수평 파선 사이의 교차점은 그룹에 대한 중위 (50%) 생존 역치를 지시한다. P 값은 선택 바이러스 그룹 사이의 로그-순위 검정 (만텔-콕스) 비교의 통계적 결과를 나타낸다.
실시예 8: MC38 종양-보유 C57BL/6 마우스에서의 재조합 종양용해성 백시니아 바이러스 활성 (mIL-2v 또는 hIL-2v를 발현하는 Cop 바이러스)
암컷 C57BL/6 마우스 (8-10주령)를 5e5개의 MC38 종양 세포로 우측 상방 후방 옆구리 상에 피하로 (SC) 이식하였다. 종양 세포 이식 후 10일에, 마우스를 종양 부피에 기반하여 별개의 처리 그룹 (그룹당 평균 종양 부피 ~50 mm3; N=20/그룹)으로 무작위화하였다. 이식 후 제11일에, 종양을 60 μL 비히클 (30 mM 트리스, 10% 수크로스, pH 8.0) 또는 5e7 또는 2e8 플라크 형성 단위 (pfu)의 재조합 코펜하겐 (Cop) 백시니아 바이러스 변이체를 함유하는 60 μL 비히클로 직접적으로 주사하였다. 종양-보유 마우스를 매일 관찰하고, 마우스가 i) 1400 mm3를 넘는 종양 부피 ii) ≥ 20% 체중 감소, 또는 iii) 심각하게 감소된 건강 상태로 인해 인도적으로 희생될 때까지 격주로 종양 부피 및 체중 둘 다를 측정하였다. 마우스의 그룹을 하기와 같이 처리하였다:
그룹 i) 비히클 단독;
그룹 ii) 2e8 pfu 용량 수준으로 VV7: 루시페라제 및 녹색 형광 단백질 (Luc-2A-GFP) 이중 리포터 카세트로 아암화된 Cop 백시니아 바이러스;
그룹 iii) 5e7 pfu 용량 수준으로 VV91: A34R-K151E 치환을 운반하고, 뮤린 인터류킨 2 변이체 (mIL-2v) 트랜스진으로 아암화되고, HSV TK.007 (B16R 삽입, 정방향 배향)을 코딩하는 Cop 백시니아 바이러스;
그룹 iv) 2e8 pfu 용량 수준으로 VV91: A34R-K151E 치환을 운반하고, 뮤린 인터류킨 2 변이체 (mIL-2v) 트랜스진으로 아암화되고, HSV TK.007 (B16R 삽입, 정방향 배향)을 코딩하는 Cop 백시니아 바이러스;
그룹 v) VV102: 5e7 pfu 용량 수준으로: A34R-K151E 치환을 운반하고, 인간 인터류킨 2 변이체 (hIL-2v) 트랜스진으로 아암화되고, HSV TK.007 (B16R 삽입, 정방향 배향)을 코딩하는 Cop 백시니아 바이러스;
그룹 vi) 2e8 pfu 용량 수준으로 VV102: A34R-K151E 치환을 운반하고, 인간 인터류킨 2 변이체 (hIL-2v) 트랜스진으로 아암화되고, HSV TK.007 (B16R 삽입, 정방향 배향)을 코딩하는 Cop 백시니아 바이러스;
그룹 vii) 5e7 pfu 용량 수준으로 VV10: 마우스 GM-CSF 및 LacZ 리포터 트랜스진으로 아암화된 Cop 백시니아 바이러스; 또는
그룹 viii) 2e8 pfu 용량 수준으로 VV10: 마우스 GM-CSF 및 LacZ 리포터 트랜스진으로 아암화된 Cop 백시니아 바이러스;
그룹 (i) - (viii)의 종양 성장 프로파일 사이의 비교 (도 20)는 모든 시험 바이러스가 다수의 연속적 일에 걸쳐 종양 성장에 대한 통계적으로 유의한 억제 효과를 생성하였으며, 마우스 및 인간 IL-2v-아암화된 Cop 백시니아 바이러스 (각각 VV91 및 VV102)가 마우스 GM-CSF-아암화된 Cop 백시니아 바이러스 (VV10)에 비해 다수의 연속적 일에 걸쳐 종양 성장에 대한 통계적으로 유의한 억제 효과를 생성하였음을 밝혀내었다 (도 21, ANCOVA 결과). VV91 (mIL-2v 및 HSV TK.007)에 의해 유도된 종양 성장 억제 효과를 VV102 (hIL-2v 및 HSV TK.007)와 비교할 경우 통계적으로 유의한 차이는 관찰되지 않았다.
도 20a-20i는 MC38 종양 세포로 SC 이식된 C57BL/6 암컷 마우스에 대한 바이러스요법-유도된 종양 성장 억제의 평가의 결과를 제시한다. 종양 성장 궤적은 비히클 단독 (a), 5e7 pfu로 B16R 유전자 로커스에서 정방향 배향에서 mIL-2v 및 HSV TK.007 (Cop.mIL-2v.A34R-K151E.HSV TK.007 (B16R_For); VV91)) (b), 5e7 pfu로 B16R 유전자 로커스에서 정방향 배향에서 hIL-2v 및 HSV TK.007 (Cop.hIL-2v.A34R-K151E.HSV TK.007 (B16R_For); VV102)) (c), 5e7 pfu로 mGM-CSF 및 LacZ 리포터 트랜스진 (Cop.mGM-CSF/LacZ; (VV10) (d), 2e8 pfu로 루시페라제-2A-GFP 리포터 (Cop.Luc-GFP; VV7) (e), 2e8 pfu로 B16R 유전자 로커스에서 정방향 배향에서 mIL-2v 및 HSV TK.007 (Cop.mIL-2v.A34R-K151E.HSV TK.007 (B16R_For); VV91)) (f), 2e8 pfu로 B16R 유전자 로커스에서 정방향 배향에서 hIL-2v 및 HSV TK.007 (Cop.hIL-2v.A34R-K151E.HSV TK.007 (B16R_For); VV102)) (g), 및 2e8 pfu로 mGM-CSF 및 LacZ 리포터 트랜스진 (Cop.mGM-CSF/LacZ; (VV10) (h) 중 어느 하나로 아암화된 코펜하겐 백시니아 바이러스로 처리된 그룹에서의 개별적 마우스에 대해 제시되어 있다. 각각의 그래프 상의 수직 파선은 마우스가 비히클 또는 바이러스의 종양내 주사를 받은 시점을 나타낸다. 각각의 그래프 상의 수평 파선은 동물을 연구로부터 제거하는 기준으로서 사용된 종양 부피 역치를 나타낸다. 각각의 처리 그룹에 대한 평균 종양 부피 (mm3)는 종양 이식 후 제28일까지 제시되어 있다 (i).
도 21은 ANCOVA를 사용한 바이러스요법-유도된 종양 성장 억제의 통계적 비교의 결과를 제시한다. 비히클/바이러스 처리 후 (종양 이식 후 제14일 내지 제28일)의 각각의 그룹에서의 개별적 마우스에 대한 종양 부피를 ANCOVA에 의해 분석하여 다양한 처리 그룹에 걸친 종양 성장에 대한 통계적으로 유의한 억제 효과를 결정하였다. 칼럼은 특이적 처리 그룹 쌍 사이의 비교의 통계적 결과 (p 값)를 제시한다. 볼드체의 값은 p ≤ 0.05인 비교 ANCOVA 결과를 나타낸다.
각각의 처리 그룹 (N=20/그룹)에서의 동물의 생존을 또한 종양 이식 후 제42일까지 평가하였다 (도 22). 이 경우, VV91 및 VV102 둘 다로 처리된 마우스는 비히클, VV7, 및 VV10 처리 그룹에 비해 통계적으로 유의한 평균 생존 이점을 제시하였다 (로그 순위/만텔-콕스 검정으로부터의 P 값에 대해서는 도 22에서의 표 참조).
도 22a-22b는 이식 후 제11일에 비히클 또는 바이러스로의 처리 후의 MC38 종양-이식된 C57BL/6 암컷 마우스의 생존의 결과를 제시한다. 마우스를 종양 부피 ≥ 1400 mm3에 도달시 사망한 바와 같이 매일 표시하였다. 각각의 그룹의 곡선 및 수평 파선 사이의 교차점은 그룹에 대한 중위 (50%) 생존 역치를 지시한다. (a)는 5e7 pfu 바이러스로 투여된 그룹을 제시한다. (b)는 2e8 pfu로의 바이러스로 투여된 그룹을 제시한다.
종양 성장 억제 및 생존을 모니터링하는 것 외에도, 혈청을 비히클 또는 재조합 Cop 백시니아 바이러스로의 주사 후 24 hr에 종양-보유 마우스로부터 수집하여 순환 IL-2 수준을 평가하였다. 종양내 주사를 받은 후 24 hr에 각각의 처리 그룹으로부터 수집된 혈청에서의 순환 마우스 IL-2 및 인간 IL-2 수준을 ELISA에 의해 정량화하였다 (각각 도 23 및 도 24). IL-2v-아암화된 Cop 백시니아 바이러스 변이체 (VV91, 및 VV102)로 처리된 대부분의 동물로부터의 혈청에서 IL-2의 측정가능한 수준이 검출된 반면, 비히클 또는 다른 Cop 백시니아 바이러스 (VV7 및 VV10) 그룹으로부터의 임의의 동물에서는 IL-2의 배경 수준이 나타났다. 특히, 마우스 IL-2의 유의하게 상승된 수준은 단지 mIL-2v 발현 바이러스 (VV91)를 받은 마우스의 혈청에서만 검출되었으며, 인간 IL-2의 유의하게 상승된 수준은 단지 hIL-2v 발현 바이러스 (VV102)를 받은 마우스의 혈청에서만 검출되었다. 따라서, IL-2v-아암화된 Cop 백시니아 바이러스로 처리된 마우스의 혈청에서 나타난 상승된 수준은 종양내 주사 후 트랜스진-매개된 발현을 지시할 것이다.
도 23은 비히클 또는 재조합 Cop 백시니아 바이러스로의 종양내 주사 후 24 hr에 MC38 종양-보유 C57BL/6 암컷 마우스로부터 수집된 혈청에서 검출된 마우스 IL-2 수준의 결과를 제시한다. 각각의 기호는 개별적 마우스에 대한 계산된 IL-2 혈청 수준을 나타내는 반면, 막대는 그룹 기하 평균 (N=10/그룹)을 나타낸다. 오차 막대는 95% 신뢰 구간을 나타낸다.
도 24는 비히클 또는 재조합 Cop 백시니아 바이러스로의 종양내 주사 후 24 hr에 MC38 종양-보유 C57BL/6 암컷 마우스로부터 수집된 혈청에서 검출된 인간 IL-2 수준의 결과를 제시한다. 각각의 기호는 개별적 마우스에 대한 계산된 IL-2 혈청 수준을 나타내는 반면, 막대는 그룹 기하 평균 (N=9/그룹)을 나타낸다. 오차 막대는 95% 신뢰 구간을 나타낸다.
실시예 9: HCT-116 종양-보유 누드 마우스에서의 재조합 종양용해성 백시니아 바이러스 활성 (hIL-2v를 발현하는 Cop 바이러스)
누드 암컷 마우스를 5e6개의 HCT-116 종양 세포로 우측 옆구리 상에 SC 이식하였다. 종양 세포 이식 후 8일에, 마우스를 종양 부피에 기반하여 별개의 처리 그룹 (그룹당 평균 종양 부피 ~50 mm3; N=20/그룹)으로 무작위화하였다. 종양 세포 이식 후 제9일에, 마우스를 100 μL의 비히클 단독 또는 준최적 용량 (3e5 pfu)의 재조합 종양용해성 Cop 백시니아 바이러스를 함유하는 비히클로 IV 주사하였다. 종양-보유 마우스를 매일 관찰하고, 마우스가 i) 1400 mm3를 넘는 종양 부피 ii) ≥ 20% 체중 감소, iii) 심각하게 감소된 건강 상태, 또는 iv) 연구 종결 중 어느 하나로 인해 인도적으로 희생될 때까지 격주로 종양 부피 및 체중 둘 다를 측정하였다. 마우스의 그룹을 하기와 같이 처리하였다:
그룹 i) 비히클 단독;
그룹 ii) VV90: 결실된 J2R 유전자 영역 내로 삽입된 트랜스진을 갖지 않는 A34R-K151E 돌연변이 (아미노산 치환)를 운반하는 Cop 백시니아 바이러스;
그룹 iii) VV27: A34R-K151E 치환을 운반하고, 뮤린 인터류킨 2 변이체 (mIL-2v) 트랜스진 (VV27)으로 아암화된 Cop 백시니아 바이러스;
그룹 iv) VV91: A34R-K151E 치환을 운반하고, 뮤린 인터류킨 2 변이체 (mIL-2v) 트랜스진으로 아암화되고, HSV TK.007 (B16R 삽입, 정방향 배향)을 코딩하는 Cop 백시니아 바이러스;
그룹 v) VV93: A34R-K151E 치환을 운반하고, 뮤린 인터류킨 2 변이체 (mIL-2v) 트랜스진으로 아암화되고, HSV TK.007 (J2R 삽입, 역방향 배향)을 코딩하는 Cop 백시니아 바이러스; 또는
그룹 vi) VV96: A34R-K151E 치환을 운반하고, 뮤린 인터류킨 2 변이체 (mIL-2v) 트랜스진으로 아암화되고, HSV TK.007 (B16R 삽입, 역방향 배향)을 코딩하는 Cop 백시니아 바이러스.
그룹 (i) - (vi)의 종양 성장 프로파일 사이의 비교 (도 25)는 모든 시험 바이러스가 인간 이종이식 종양에서 다수의 연속적 일에 걸쳐 종양 성장에 대한 통계적으로 유의한 억제 효과를 생성하였음을 밝혀내었다.
도 25는 HCT-116 종양 세포로 SC 이식된 누드 암컷 마우스에 대한 바이러스요법-유도된 종양 성장 억제의 평가의 결과를 제시한다. 각각의 처리 그룹에 대한 평균 종양 부피 (mm3)는 종양 이식 후 제40일까지 제시되어 있다. 각각의 그래프 상의 수직 파선은 마우스가 비히클 또는 바이러스의 종양내 주사를 받은 시점을 나타낸다. 각각의 그래프 상의 수평 파선은 동물을 연구로부터 제거하는 기준으로서 사용된 종양 부피 역치를 나타낸다.
실시예 10: 트랜스진 아암화된 WR 백시니아 바이러스로 감염된 세포로부터 생산된 hIL-2gv 및 hIL-2v 단백질의 기능적 평가
IL-2 수용체 복합체에의 IL-2 결합은 신호전달 분자, STAT5의 인산화를 발생시킨다. 따라서, STAT5의 인산화는 IL-2 수용체 신호전달을 측정하는데 사용될 수 있다. 백시니아 바이러스에 의해 생산된 트랜스진을 수집하기 위해, HeLa 세포를 T-150 플라스크에서 24시간 동안 MOI=3으로 지시된 바이러스로 감염시켰다. 인큐베이션 후, 상청액을 수집하고, 농축시키고, 농축된 상청액에서의 IL-2 수준을 MSD 검정에 의해 결정하고, pSTAT5 검정에서 정규화하였다. IL2 트랜스진 생체활성을 평가하기 위해, 나이브 C57BL/6 암컷 마우스로부터의 비장세포를 단리하고, 둥근 바닥 96-웰 플레이트에 1e6개의 세포/웰로 플레이팅하고, 바이러스 단리된 IL-2, IL-2 당변이체, 또는 IL-2 변이체와 함께 15분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 고정시키고, 투과화하고, 항-CD3, 항-CD4, 항-CD8, 항-CD25, 항-Foxp3, 항-NKp46, 및 항-pSTAT5 항체로 염색하고, LSR 포트레사(Fortessa) 유동 세포계측기 상에서 획득하였다. pSTAT5의 중위 형광 강도를 플로우조(FlowJo) 소프트웨어를 사용하여 특이적 세포 집단에서 분석하였다. 재조합 백시니아 바이러스에 의해 코딩된 IL-2 당변이체 (즉, IL-2gv1 및 IL-2gv2)는 pSTAT5를 유도하는데 있어서 감소된 농도 효력에 의해 지시된 바와 같이, 야생형 IL-2와 비교할 경우 감소된 Treg 세포 (CD3+CD4+CD25+ Foxp3+)에 대한 활성을 제시하였다. 대조적으로, IL-2 변이체 (IL-2v) 및 IL-2 당변이체는 CD8+ T 세포 및 NK 세포 둘 다에서 야생형 IL-2와 유사한 신호전달 농도 효력을 입증하였다. 함께 취해져, 이들 데이터는 중간-친화도 IL-2R을 발현하는 세포를 자극시키는데 있어서 야생형 hIL-2와 필적하는 인간 세포에서 생산된 hIL-2 당변이체 및 hIL-2 변이체의 예상된 능력과 일치하지만, 고-친화도 IL-2Rα (CD25로도 공지됨)를 발현하는 세포에 대해 단지 약하게 활성이다.
도 29a-29c는 재조합 WR 백시니아 바이러스에 의해 발현된 IL-2 변이체 트랜스진과 함께 인큐베이션된 뮤린 비장세포에서의 STAT5 인산화의 평가의 결과를 제시한다. hIL-2, hIL-2 변이체, 또는 hIL-2 당변이체 중 어느 하나와 함께 인큐베이션된 뮤린 비장세포에서의 하위세트의 pSTAT5 유도의 비교. IL-2 기능성을 IL-2R-매개된 신호전달의 판독으로서 세포내 pSTAT5 수준의 측정을 사용하여 평가하였다. 상이한 IL2R 복합체를 발현하는 뮤린 림프구의 다양한 하위세트를 기술하기 위해 비장세포를 추가적으로 세포 표면 마커 (CD3, CD4, CD8, CD25, 및 NKp46) 및 세포내 단백질 (FoxP3)에 대한 항체로 염색하였다. 그래프는 지시된 바이러스에 의해 분비된 hIL-2, hIL-2 변이체, 또는 hIL-2 당변이체 단백질의 증가하는 처리 농도 (x-축)에 반응하여 pSTAT5의 세포내 염색의 중위 형광 강도 (MFI) 값의 변화 (y-축)를 제시한다. 약어: pSTAT5= 인산화된 신호 전달제 및 전사의 활성화제 5; MFI= 중위 형광 강도; Treg= CD3+CD4+CD25+Foxp3+ T 조절 세포.
실시예 11: IV 투여 후의 MC38 종양-보유 C57BL/6 마우스에서의 재조합 종양용해성 백시니아 바이러스 활성 (hIL-2, hIL-2v, hIL-2gv1, hIL-2gv2를 발현하는 WR 바이러스)
C57BL/6 암컷 마우스를 5e5개의 MC38 종양 세포로 좌측 옆구리 상에 SC 이식하였다. 종양 세포 이식 후 10일에, 마우스를 종양 부피에 기반하여 별개의 처리 그룹 (그룹당 평균 종양 부피 ~60 mm3; N=20/그룹)으로 무작위화하였다. 종양 세포 이식 후 제11일에, 마우스를 100 μL의 비히클 (30 mM 트리스, 10% 수크로스, pH8.0) 또는 5e7 pfu 재조합 WR 백시니아 바이러스를 함유하는 100 μL의 비히클로 IV 주사하였다. 종양-보유 마우스를 매일 관찰하고, 마우스가 i) 1400 mm3를 넘는 종양 부피 ii) ≥ 20% 체중 감소, iii) 심각하게 감소된 건강 상태 또는 iv) 연구 종결 중 어느 하나로 인해 인도적으로 희생될 때까지 격주로 종양 부피 및 체중 둘 다를 측정하였다.
체중 분석은 야생형 IL-2 트랜스진-아암화된 WR 바이러스가 임의의 다른 변이체를 받은 동물에 비해 더 큰 체중의 감소와 연관되었음을 지시하였다 (도 30).
도 30은 이식 후 제11일에 비히클 또는 바이러스로의 처리 후의 MC38 종양-이식된 C57BL/6 암컷 마우스의 체중의 결과를 제시한다. 체중은 처리 시작에서의 개별적 체중에 기반하여 %로 제시되어 있다. 각각의 처리는 종양 이식 후 제24일까지 그룹 기하 평균± 95% 신뢰 구간으로서 제시되어 있다. 그들의 초기 체중과 비교하여 20% 초과의 체중 감소를 갖는 동물을 인도적 이유로 안락사시켰다. 시험 바이러스는 루시페라제-2A-GFP 리포터 (WR.Luc-GFP (VV3) WT IL-2, IL-2v, IL-2gv1 또는 IL-2gv2 중 어느 하나로 아암화된 WR 백시니아 바이러스를 포함하였다. 각각의 그래프 상의 수직 파선은 마우스가 바이러스의 IV 주사를 받은 시점을 나타낸다. 그래프 상의 수평선은 각각의 마우스의 초기 체중을 나타내는 100% 체중 기준선을 나타낸다.
혈청을 또한 순환 IL-2 및 염증성 시토카인 수준의 평가를 위해 IV 바이러스 투여 후 72 hr (종양 이식 후 제14일)에 각각의 시험 그룹에서의 MC38 종양-보유 마우스로부터 수집하였다. IL-2 트랜스진-아암화된 바이러스를 시험한 다른 연구와 일치하게, IL-2의 상승되고 통계적으로 유의한 혈청 수준이 IL-2 트랜스진-아암화된 WR 바이러스가 투여된 모든 시험 그룹에서 검출되었다 (도 31). 더욱이, hIL-2gv 아암화된 종양용해성 바이러스를 받은 마우스는 야생형 hIL-2 아암화된 종양용해성 바이러스를 받은 동물에 비해 IL-2의 통계적으로 유의한 상승된 혈청 수준을 가졌다. 염증성 시토카인의 분석은 hIL-2의 IV 투여가 IFNγ, IL-12p70, IL-1β, TNFα, IL-4, IL-5, 및 IL-10을 포함한 몇몇 염증유발성 시토카인에서 유의한 상승을 유발하였지만, hIL-2gv 트랜스진 아암화된 WR 백시니아 바이러스는 그렇지 않았음을 밝혀내었다 (도 32. 표 3).
도 31은 5e7 pfu 재조합 WR 백시니아 바이러스로의 IV 주사 후 72 hr (제14일)에 MC38 종양-보유 C57BL/6 암컷 마우스로부터 수집된 혈청에서 검출된 IL-2 수준의 결과를 제시한다. 각각의 기호는 개별적 마우스에서 검출된 IL-2 혈청 수준을 나타내는 반면, 막대는 그룹 기하 평균 (N=10/그룹)을 나타낸다. 오차 막대는 95% 신뢰 구간을 나타낸다. 통계를 *=p<0.05; **=p<0.01 및 *** =p<0.001로 VV99와 비교하여 터키 사후 다중 그룹 비교를 갖는 1-원 Anova 검정을 사용하여 수행하였다.
도 32 (표 3)는 5e7 pfu 재조합 WR 백시니아 바이러스로의 IV 주사 후 72 hr (제14일)에 MC38 종양-보유 C57BL/6 암컷 마우스로부터 수집된 혈청에서 검출된 염증성 시토카인 수준의 결과를 제시한다. 혈청 시토카인 수준을 MC38 종양-보유 C57BL/6 마우스의 정맥내 투여 후 72hr에 측정하였다. VV99-처리된 동물과 비교하여 검출된 시토카인 수준 사이의 통계적 비교를 터키 사후 다중 그룹 비교 검정을 갖는 1-원 ANOVA를 사용하여 수행하였다. 각각의 칼럼은 지정된 시토카인에 대한 기하 평균 시토카인 수준 (N=10/시험 그룹)을 제시한다. *=p<0.05; **=p,0.01; +=p<0.001; ^=p<0.0001
각각의 시험 바이러스에 대한 그룹 평균으로서 제시된 종양 성장 프로파일의 분석 (도 33)은 중요한 결과를 밝혀내었다. 모든 IL-2 트랜스진-아암화된 WR 바이러스의 IV 투여는 비히클 및 리포터 트랜스진-아암화된 WR 바이러스 (VV3) 처리에 비해 MC38 종양 성장의 통계적으로 유의한 억제를 초래하였다. 모든 변이체는 비히클 대조군 또는 VV3에 비해 종양 성장을 유의하게 감소시켰다. 일부 시점은 또한 야생형 IL-2에 비해 IL-2 변이체 및 당변이체 함유 바이러스 사이의 통계적으로 유의한 차이를 밝혀내었지만, 가장 현저한 결과는 IL-2의 임의의 형태를 함유한 모든 바이러스 변이체가 종양 성장의 트랜스진-매개된 감소를 발생시켰다는 것이다. (표 4, ANCOVA 결과).
도 33은 MC38 종양 세포로 SC 이식된 C57BL/6 암컷 마우스에 대한 단일 (제11일에 투여된) IV 바이러스 전달을 사용한 바이러스요법-유도된 종양 성장 억제의 평가의 결과를 제시한다. 종양 성장 곡선은 연구가 종결된 시간인 종양 이식 후 제49일까지 그룹 기하 평균 ± 95% 신뢰 구간으로서 각각의 처리에 대해 제시되어 있다. 동물의 15%가 1400mm3에 도달하는 종양 부담으로 인해 안락사되면, 그 그룹은 더 이상 기하 평균 데이터를 보고하지 않았다. 시험 바이러스는 루시페라제-2A-GFP 리포터 (WR.Luc-GFP (VV3), WT IL-2, IL-2v, IL-2gv1 또는 IL-2gv2 중 어느 하나로 아암화된 WR 백시니아 바이러스를 포함하였다. 각각의 그래프 상의 수직 파선은 마우스가 바이러스의 IV 주사를 받은 시점을 나타낸다. 각각의 그래프 상의 수평 파선은 동물을 연구로부터 제거하는 기준으로서 사용된 종양 부피 역치를 나타낸다.
도 34 (표 4)는 피하 MC38 종양 모델 연구를 위한 ANCOVA를 사용한 바이러스요법-유도된 종양 성장 억제의 통계적 비교의 결과를 제시한다. 처리 후 다수의 일에 각각의 그룹에서의 개별적 마우스에 대한 종양 부피를 ANCOVA에 의해 분석하여 다양한 처리 그룹에 걸친 종양 성장에 대한 통계적으로 유의한 억제 효과를 결정하였다. 칼럼은 특이적 처리 그룹 쌍 사이의 비교의 통계적 결과 (p 값)를 제시한다. 볼드체의 값은 p 값 ≤ 0.05가 관찰된 비교 ANCOVA 결과를 나타낸다.
동일한 시험 바이러스에 대한 생존 결과는 보다 많은 수의 동물이 종양 부담과 비관련된 이환으로 인해 사망하였고, IL-2 변이체 또는 당변이체를 보유하는 변이체에 비해 더 짧은 중위 생존을 경험한 바와 같이, WT IL-2가 변이체보다 더 낮은 내약성의 역치를 가졌음을 제시하였다 (도 35). 이는 상응하는 Luc-GFP 리포터-아암화된 WR 바이러스에 비해 IL-2v/gv 트랜스진-아암화된 WR 바이러스와 연관된 통계적으로 우수한 그룹 생존을 포함하였다 (도 36, 표 5). 전체적으로, IL-2v 또는 IL-2gv 트랜스진-아암화된 WR 바이러스 변이체의 IV 전달은 MC38 SC 종양 모델에서 유효한 항-종양 요법인 것으로 입증되었으며, 바이러스의 단일 치료적 투여의 효력 및 야생형 IL-2보다 더 낮은 독성을 입증하였다.
도 35는 SC 종양 이식 후 제11일에 재조합 종양용해성 백시니아 바이러스로의 IV 처리 후의 MC38 종양-보유 C57BL/6 암컷 마우스의 생존의 결과를 제시한다. 마우스를 매일 모니터링하고, 동물이 >20% 체중을 소실하였거나, 임상적 관찰에 기반하여 빈사 상태인 것으로 결정한 경우, 종양 부피 ≥ 1400 mm3에 도달시 사망한 바와 같이 표시하였다. 각각의 그룹의 곡선 및 수평 파선 사이의 교차점은 그룹에 대한 중위 (50%) 생존 역치를 지시한다.
도 36 (표 5)은 피하 MC38 종양 모델 연구에서의 바이러스요법 후의 생존의 통계적 비교의 결과를 제시한다. 도 35로부터의 생존 데이터를 로그-순위 검정 (만텔-콕스)에 의해 분석하였다. P 값은 선택 바이러스 그룹 사이의 로그-순위 검정 (만텔-콕스) 비교의 통계적 결과를 나타낸다.
실시예 12: HCT-116 종양-보유 누드 마우스에서의 재조합 종양용해성 백시니아 바이러스 활성 (hIL-2gv, hIL-2v를 발현하는 Cop 바이러스 및 hGM-CSF/LacZ를 발현하는 와이어스 바이러스)
누드 암컷 마우스를 5e6개의 HCT-116 종양 세포로 우측 옆구리 상에 SC 이식하였다. 종양 세포 이식 후 12일에, 마우스를 종양 부피에 기반하여 별개의 처리 그룹 (그룹당 평균 종양 부피 ~150 mm3; N=16/그룹)으로 무작위화하였다. 종양 세포 이식 후 제13일에, 마우스를 100 μL의 비히클 단독 또는 3e6 pfu의 재조합 종양용해성 Cop 백시니아 바이러스를 함유하는 비히클로 IV 주사하였다. 종양-보유 마우스를 매일 관찰하고, 마우스가 i) 1400 mm3를 넘는 종양 부피 ii) ≥ 20% 체중 감소, iii) 심각하게 감소된 건강 상태, 또는 iv) 연구 종결 중 어느 하나로 인해 인도적으로 희생될 때까지 격주로 종양 부피 및 체중 둘 다를 측정하였다. 마우스의 그룹을 하기와 같이 처리하였다: 그룹 i) 비히클 단독; 그룹 ii) VV7: 결실된 J2R 유전자 영역 내로 삽입된 luc-2A-GFP 트랜스진을 운반하는 Cop 백시니아 바이러스; 그룹 iii) VV102: K151E 돌연변이 및 HSV-TK.007을 갖는, 결실된 J2R 유전자 영역 내로 삽입된 hIL2v 트랜스진을 운반하는 Cop 백시니아 바이러스; 그룹 iv) VV75: K151E 돌연변이를 갖는, 결실된 J2R 유전자 영역 내로 삽입된 hIL2v 트랜스진을 운반하는 Cop 백시니아 바이러스; 그룹 v) VV08: 결실된 J2R 유전자 영역 내로 삽입된 luc-2A-GFP 트랜스진을 운반하는 와이어스 백시니아 바이러스; 그룹 vi) VV12: 결실된 J2R 유전자 영역 내로 삽입된 hGM-CSF 트랜스진을 운반하는 와이어스 백시니아 바이러스; 또는 그룹 vii) VV110: K151E 돌연변이 및 HSV-TK.007을 갖는, 결실된 J2R 유전자 영역 내로 삽입된 hIL2gv 트랜스진을 운반하는 Cop 백시니아 바이러스.
그룹 (i) - (vii)의 종양 성장 프로파일 사이의 비교 (도 37)는 모든 시험 바이러스가 HCT-116 인간 이종이식 모델에서 다수의 연속적 일에 걸쳐 종양 성장에 대한 억제 효과를 생성하였음을 밝혀내었다. 통계적 유의성은 도 38, 표 6에 제시된 바와 같이 상이한 비교에 대해 달성되었다.
도 37은 HCT-116 종양 세포로 SC 이식된 누드 암컷 마우스에 대한 바이러스요법-유도된 종양 성장 억제의 평가의 결과를 제시한다. 각각의 처리 그룹에 대한 평균 종양 부피 (mm3)는 종양 이식 후 제43일까지 제시되어 있다. 각각의 그래프 상의 수직 파선은 마우스가 비히클 또는 바이러스의 IV 주사를 받은 시점을 나타낸다. 그래프 상의 수평 파선은 동물을 연구로부터 제거하는 기준으로서 사용된 종양 부피 역치를 나타낸다.
도 38 (표 6)은 누드 마우스에서의 피하 HCT-116 종양에 대한 ANCOVA를 사용한 바이러스요법-유도된 종양 성장 억제의 통계적 비교의 결과를 제시한다. 처리 후 다수의 일에 각각의 그룹에서의 개별적 마우스에 대한 종양 부피를 ANCOVA에 의해 분석하여 다양한 처리 그룹에 걸친 종양 성장에 대한 통계적으로 유의한 억제 효과를 결정하였다. 칼럼은 특이적 처리 그룹 쌍 사이의 비교의 통계적 결과 (p 값)를 제시한다. 볼드체의 값은 p 값 ≤ 0.05가 관찰된 비교 ANCOVA 결과를 나타낸다.
HCT-116 종양을 보유하고 상기 기재된 바와 같이 바이러스로 IV 처리된 누드 마우스를 생존에 대해 모니터링하였다. 2000 mm3에 도달한 종양은 안락사 기준으로서 정의되었으며, 동물을 45일 동안 매일 모니터링하였다.
도 39는 HCT-116 종양 세포로 SC 이식된 누드 암컷 마우스에 대한 바이러스요법-유도된 생존의 평가의 결과를 제시한다. 종양이 2000mm3에 도달하면 안락사를 수행하였다. 각각의 그래프 상의 수직 파선은 마우스가 비히클 또는 바이러스 (3E6 PFU)의 IV 주사를 받은 시점을 나타낸다. 그래프 상의 수평 파선은 50 퍼센트 생존, 또는 중위 생존을 나타낸다.
도 40 (표 7)은 HCT-116 종양 세포로 SC 이식된 누드 암컷 마우스에서의 바이러스요법-유도된 생존의 통계적 비교의 결과를 제시한다. 생존을 모니터링하고, 이어서 로그-순위 검정 (만텔-콕스)에 의해 분석하였다. P 값은 각각의 그룹 비교를 위해 열거된다.
실시예 13: IV 투여 후 MC38 종양-보유 C57BL/6 마우스에서의 재조합 종양용해성 백시니아 바이러스 활성 (hIL-2v, hIL-2gv1, mIL-2v를 발현하는 WR 바이러스)
C57BL/6 암컷 마우스를 5e5개의 MC38 종양 세포로 좌측 옆구리 상에 SC 이식하였다. 종양 세포 이식 후 15일에, 마우스를 종양 부피에 기반하여 별개의 처리 그룹 (그룹당 평균 종양 부피 ~100 mm3; N=20/그룹)으로 무작위화하였다. 종양 세포 이식 후 제16일에, 마우스를 100 μL의 비히클 (30 mM 트리스, 10% 수크로스, pH8.0) 또는 5e7 pfu 재조합 WR 백시니아 바이러스를 함유하는 100 μL의 비히클로 IV 주사하였다. 종양-보유 마우스를 매일 관찰하고, 마우스가 i) 1400 mm3를 넘는 종양 부피 ii) ≥ 20% 체중 감소, iii) 심각하게 감소된 건강 상태 또는 iv) 연구 종결 중 어느 하나로 인해 인도적으로 희생될 때까지 격주로 종양 부피 및 체중 둘 다를 측정하였다.
각각의 시험 바이러스에 대한 그룹 평균으로서 제시된 종양 성장 프로파일의 분석 (도 41)은 중요한 결과를 밝혀내었다. 모든 IL-2 트랜스진-아암화된 WR 바이러스의 IV 투여는 비히클 및 리포터 트랜스진-아암화된 WR 바이러스 (VV3) 처리에 비해 MC38 종양 성장의 통계적으로 유의한 억제를 초래하였다. K151E 돌연변이 & HSV TK.007 트랜스진의 첨가는 종양 성장 억제를 추가로 개선시켰다. VV117 및 IGV-121에 의해 유도된 종양 성장 억제 사이에 통계적으로 유의한 차이는 없었지만, VV117 및 VV100 사이 및 IGV-121 및 VV39 사이에 통계적으로 유의한 차이가 검출되었다 (도 42, 표 8, ANCOVA 결과).
도 41은 MC38 종양 세포로 SC 이식된 C57BL/6 암컷 마우스에 대한 단일 (제16일) IV 바이러스 전달을 사용한 바이러스요법-유도된 종양 성장 억제의 평가의 결과를 제시한다. 종양 성장 궤적은 희생시까지 종양 이식 후 제55일까지 그룹 평균 ± 95% 신뢰 구간으로서 각각의 처리에 대해 제시되어 있다. 시험 바이러스는 루시페라제-2A-GFP 리포터 (WR.Luc-GFP (VV3)), hIL-2gv1 (WR.hIL-2gv1.HSV TK.007.A34K151E (VV117, IGV-121), hIL-2v (VV100) 또는 mIL-2v (VV3)) 중 어느 하나로 아암화된 WR 백시니아 바이러스를 포함하였다. 각각의 그래프 상의 수직 파선은 마우스가 바이러스의 IV 주사를 받은 시점을 나타낸다. 각각의 그래프 상의 수평 파선은 동물을 연구로부터 제거하는 기준으로서 사용된 종양 부피 역치를 나타낸다.
도 42 (표 8)는 피하 MC38 종양 모델 연구를 위한 ANCOVA를 사용한 바이러스요법-유도된 종양 성장 억제의 통계적 비교의 결과를 제시한다. 처리 후 다수의 일에 각각의 그룹에서의 개별적 마우스에 대한 종양 부피를 ANCOVA에 의해 분석하여 다양한 처리 그룹에 걸친 종양 성장에 대한 통계적으로 유의한 억제 효과를 결정하였다. 칼럼은 특이적 처리 그룹 쌍 사이의 비교의 통계적 결과 (p 값)를 제시한다. 볼드체의 값은 p 값 ≤ 0.05가 관찰된 비교 ANCOVA 결과를 나타낸다.
동일한 시험 바이러스에 대한 생존 결과는 종양 성장 억제에 대해 상기 보고된 것들과 매우 유사한 결과를 제시하였다 (도 43). 이는 상응하는 Luc-GFP 리포터-아암화된 WR 바이러스에 비해 IL-2v/gv 트랜스진-아암화된 WR 바이러스와 연관된 통계적으로 우수한 그룹 생존을 포함하였다 (도 44, 표 9). 전체적으로, IL-2v 트랜스진-아암화된 WR 바이러스 변이체의 IV 전달은 MC38 SC 종양 모델에서 유효한 항-종양 요법인 것으로 입증되었으며, 바이러스의 단일 치료적 투여의 효력을 입증하였다.
도 43은 SC 종양 이식 후 제16일에 재조합 종양용해성 백시니아 바이러스로의 IV 처리 후의 MC38 종양-보유 C57BL/6 암컷 마우스의 생존의 결과를 제시한다. 마우스를 종양 부피 ≥ 1400 mm3에 도달시 사망한 바와 같이 매일 표시하였다. 각각의 그룹의 곡선 및 수평 파선 사이의 교차점은 그룹에 대한 중위 (50%) 생존 역치를 지시한다. P 값은 선택 바이러스 그룹 사이의 로그-순위 검정 (만텔-콕스) 비교의 통계적 결과를 나타낸다.
도 44 (표 9)는 바이러스요법-유도된 생존의 통계적 비교의 결과를 제시한다. 생존을 모니터링하고, 이어서 로그-순위 검정 (만텔-콕스)에 의해 분석하였다. P 값은 각각의 그룹 비교를 위해 열거된다.
실시예 14: IV 투여 후 B16 종양-보유 C57BL/6 마우스에서의 재조합 종양용해성 백시니아 바이러스 활성 (hIL-2gv1을 발현하는 WR 바이러스).
C57BL/6 암컷 마우스를 2.5e5개의 B16F10 종양 세포로 우측 옆구리 상에 SC 이식하였다. 종양 세포 이식 후 17일에, 마우스를 종양 부피에 기반하여 별개의 처리 그룹 (그룹당 평균 종양 부피 ~100 mm3; N=20/그룹)으로 무작위화하였다. 종양 세포 이식 후 제18일에, 마우스를 100 μL의 비히클 (30 mM 트리스, 10% 수크로스, pH8.0) 또는 5e7 pfu 재조합 WR 백시니아 바이러스를 함유하는 100 μL의 비히클로 IV 주사하였다. 종양 세포 이식 후 제21일, 제24일, 제27일, 제31일, 제34일 및 제38일에, 마우스를 100 uL의 항체 제제 (2 mg/mL, 항 PD-1 또는 IgG1 이소타입)로 SC 주사하였다. 종양-보유 마우스를 매일 관찰하고, 마우스가 i) 1400 mm3를 넘는 종양 부피 ii) ≥ 20% 체중 감소, iii) 심각하게 감소된 건강 상태 또는 iv) 연구 종결 중 어느 하나로 인해 인도적으로 희생될 때까지 격주로 종양 부피 및 체중 둘 다를 측정하였다.
각각의 시험 바이러스에 대한 그룹 평균으로서 제시된 종양 성장 프로파일의 분석 (도 45)은 중요한 결과를 밝혀내었다. IL-2gv 트랜스진-아암화된 WR 바이러스의 IV 투여는 비히클 및 리포터 트랜스진-아암화된 WR 바이러스 (VV3) 처리에 비해 MC38 종양 성장의 통계적으로 유의한 억제를 초래하였다. 비히클 처리된 종양에 대한 항 PD-1 또는 IgG1 이소타입 항체 처리에 의해 유도된 종양 성장 억제 사이의 통계적으로 유의한 차이는 없었다. 그러나, VV3 및 VV117에 대해, 항 PD-1 또는 IgG1 이소타입 항체 처리 사이의 통계적으로 유의한 차이가 검출되었다. (도 46, 표 10, ANCOVA 결과).
도 45는 항-PD-1 항체 처리와 조합으로 B16F10 종양 세포로 SC 이식된 C57BL/6 암컷 마우스에 대한 단일 (제18일) IV 바이러스 전달을 사용한 바이러스요법-유도된 종양 성장 억제의 평가의 결과를 제시한다. 종양 성장 궤적은 희생시까지 종양 이식 후 제35일까지 그룹 평균 ± 95% 신뢰 구간으로서 각각의 처리에 대해 제시되어 있다. 시험 바이러스는 루시페라제-2A-GFP 리포터 (WR.Luc-GFP (VV3)) hIL-2gv1 (WR.hIL-2gv1.HSV TK.007.A34K151E (VV117) 중 어느 하나로 아암화된 WR 백시니아 바이러스를 포함하였다. 각각의 그래프 상의 수직 파선은 마우스가 바이러스의 IV 주사를 받은 시점을 나타낸다. 회색 블록은 격주 SC 항-PD1 항체 처리의 시간 창 (제21일 내지 제38일)을 지시한다. 각각의 그래프 상의 수평 파선은 동물을 연구로부터 제거하는 기준으로서 사용된 종양 부피 역치를 나타낸다.
도 46 (표 10)은 피하 B16F10 종양 모델 연구를 위한 ANCOVA를 사용한 바이러스요법-유도된 종양 성장 억제의 통계적 비교의 결과를 제시한다. 처리 후 다수의 일에 각각의 그룹에서의 개별적 마우스에 대한 종양 부피를 ANCOVA에 의해 분석하여 다양한 처리 그룹에 걸친 종양 성장에 대한 통계적으로 유의한 억제 효과를 결정하였다. 칼럼은 특이적 처리 그룹 쌍 사이의 비교의 통계적 결과 (p 값)를 제시한다. 볼드체의 값은 p 값 ≤ 0.05가 관찰된 비교 ANCOVA 결과를 나타낸다.
동일한 시험 바이러스에 대한 생존 결과는 종양 성장 억제에 대해 상기 보고된 것들과 매우 유사한 결과를 제시하였다. 이는 상응하는 Luc-GFP 리포터-아암화된 WR 바이러스에 비해 IL-2gv 트랜스진-아암화된 WR 바이러스와 연관된 통계적으로 우수한 그룹 생존을 포함하였다 (도 47). 이소타입 처리된 종양과 비교하여 항 PD-1 항체로 처리된 비히클 처리된 종양에 대해 생존 이익이 관찰되지 않았다. 그러나, VV3 및 VV117에 대해, 항 PD-1 및 IgG1 이소타입 항체 처리 사이의 통계적으로 유의한 차이가 검출되었다 (도 48, 표 11). 전체적으로, IL-2gv 트랜스진-아암화된 WR 바이러스 변이체의 IV 전달은 B16F10 SC 종양 모델에서 유효한 항-종양 요법인 것으로 입증되었으며, 바이러스의 단일 치료적 투여의 효력을 입증하였다.
도 47은 SC 종양 이식 후 제18일에 재조합 종양용해성 백시니아 바이러스로의 IV 처리 후의 B16F10 종양-보유 C57BL/6 암컷 마우스의 생존의 결과를 제시한다. 마우스를 종양 부피 ≥ 1400 mm3에 도달시 사망한 바와 같이 매일 표시하였다. 각각의 그룹의 곡선 및 수평 파선 사이의 교차점은 그룹에 대한 중위 (50%) 생존 역치를 지시한다.
도 48 (표 11)은 B16F10 종양 모델에서의 바이러스요법-유도된 생존의 통계적 비교의 결과를 제시한다. 생존을 모니터링하고, 이어서 로그-순위 검정 (만텔-콕스)에 의해 분석하였다. P 값은 각각의 그룹 비교를 위해 열거된다.
실시예 15:
이 실시예에서, 다양한 잠재적 단일 및 이중 글리칸 인간 IL-2 변이체를 발현시키고, 도입된 잠재적 글리코실화 부위에서 글리코실화에 대해 검정하였다.
IL-2 변이체의 각각은 융합 단백질로서 발현되었고, 여기서 IL-2 변이체는 아미노산 서열: GGGGSGGGGS (서열식별번호: 37)를 갖는 링커를 통해 인간 IgG1 Fc 도메인에 공유 연결되었다. Fc 도메인은 제1 Fc 쇄 및 제2 Fc 쇄를 함유하며, 여기서 Fc 쇄 사이의 이종이량체 형성을 촉진시키기 위해, 제1 Fc 쇄는 "놉" 아미노산 치환을 함유하고, 제2 Fc 쇄는 "홀" 아미노산 치환을 함유한다. IL-2 변이체의 N-말단은 링커를 통해 제1 Fc 쇄의 C-말단에 공유 연결되었다. Fc-IL-2 분자의 개략도는 도 49에 도시되어 있다.
융합 단백질을 코딩하는 유전자를 제조하기 위해, 유전자 합성을 인간 IgG1 Fc (단편 결정화가능한 유니프롯KB: P01857)의 C-말단에 융합된 인간 IL-2 (Refseq: NM_000586.3, CCDS: CCDS3726.1, 유니프롯KB: P60568)의 내인성 코돈을 사용하여 수행하였다. Fc 단편은 상부 힌지 잔기 D221 (위치 221-447 EU 넘버링)에서 시작하였으며, 이펙터 기능 불활성화 돌연변이 L234A, L235A, 및 G237A를 포함하였다. 놉-인-홀 중쇄 쌍을 이용하여 단일 IL-2 변이체를 GGGGSGGGGS 링커 (서열식별번호: 37)를 사용하여 놉 쇄의 C-말단에 융합시켰다. 놉 쇄 쌍형성 돌연변이를 Y349C 및 T366W에서 생성하고, 홀 쇄 돌연변이를 S354C, T366S, L368A, 및 Y407V에서 생성하였다. 불변 영역은 또한 G1m으로부터 nG1m1로의 D356E 및 L358M 동종이형 돌연변이를 함유하였다. 유전자를 ATUM (미국 캘리포니아주 뉴왁)에 의한 포유동물 발현 벡터 pCEP4 (인비트로젠) 내로 서브클로닝하였다.
융합 단백질을 Expi293 또는 ExpiCHO 발현 시스템 (써모피셔 사이언티픽(ThermoFisher Scientific)) 중 어느 하나를 공급업체의 지시서에 따라 사용하여 일시적 형질감염에 의해 발현시켰다. Fc-IL2 융합 단백질을 5 mL 하이트랩 맙셀렉트(HiTrap MabSelect) SuRe 칼럼 (지이 헬스케어(GE Healthcare))을 사용한 탠덤 단백질 A 친화도 크로마토그래피 및 AKTA 아반트(Avant) 25 크로마토그래피 시스템 (지이 헬스케어) 상의 하이로드(HiLoad) 16/600 슈퍼덱스(Superdex) 200 pg 칼럼 (지이 헬스케어)을 사용한 크기 배제 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 정제된 융합 단백질을 필터 멸균하고, 사용 전에 -80 ℃에서 저장하였다.
Fc-IL2 융합 단백질의 순도 및 동질성을 TSK겔 슈퍼SW(TSKgel SuperSW) mAb HR 칼럼 (토소 바이오사이언스(Tosoh Bioscience)) 상의 애질런트(Agilent) 1260 HPLC로의 분석적 크기 배제 크로마토그래피, 랩칩(LabChip) GXII 터치(Touch) (퍼킨엘머(PerkinElmer))를 사용한 마이크로유체 전기영동 분리, 및 질량 분광측정법에 의해 평가하였다. 정제된 융합 단백질의 무손상 질량을 애퀴티(Acquity) UPLC 단백질 BEH C4 300 Å 1.7 μm 칼럼 (애질런트)에 결합된 크세보(Xevo) G2-XS QTof 콰드루폴(Quadrupole) 비행 시간 질량 분광측정법 (워터스(Waters))에 의해 확인하였다.
정제된 Fc-IL2 변이체 분자를 PNGase F 처리하여 분자가 글리코실화되었는지 여부, 및 그러한 경우, 하나 또는 둘 다 (적용가능한 경우)에서 잠재적 글리코실화 부위를 도입하였는지를 검출하였다. 구체적으로, Fc-IL2 융합 단백질을 먼저 비-환원 및 환원 조건에서 급속 PNGase F 효소 (뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs), P0710S 및 P0711S)를 사용하여 탈글리코실화하여 무손상 단백질 (비-환원된) 및 환원된 단백질의 질량을 결정하였다. Fc-IL2-융합 단백질로부터의 N-연결된 글리칸의 특징규명을 '글리코웍스(GlycoWorks)TM 래피플루오르(RapiFluor)-MSTM N-글리칸 키트' (워터스)를 공급업체의 프로토콜에 따라 사용하여 수행하였다. 단백질을 래피게스트(RapiGest) 용액으로 프로세싱하고, 변성시켰다. 급속 PNGase F를 첨가하여 N-연결된 글리칸을 글리코실아민으로서 방출시켰다. 소화 후, 방출된 글리코실아민의 아미노 기를 RFMS-표지로 제조업체의 지시서에 따라 표지하였다. 표지된 N-글리칸을 포름산암모늄 중 워터스 친수성 상호작용 액체 크로마토그래피 (HILIC) μ일루션(μElution) 플레이트를 사용하여 정제하고, 이어서 아세토니트릴 용액을 LC-MS (워터스)에 의해 직접적으로 분석하였다.
표 A는 발현되고 글리코실화에 대해 검정된 잠재적 단일 및 이중 글리칸 IL-2 변이체 분자를 열거한다. 대조군으로서, Fc-IL2 (야생형) 분자를 또한 발현시키고 시험하였다. 하기 열거된 IL-2 단백질에서, "부위 1"은 단백질 명칭에서 제1 열거된 잠재적 글리코실화 부위이고, "부위 2"는 단백질 명칭에서 제2 열거된 잠재적 글리코실화 부위이다 (적용가능한 경우). 예를 들어, 단백질 "Fc-IL2-R38N:L40T-T41N:K43T"에서, 부위 1은 R38N:L40T이고, 부위 2는 T41N:K43T이다. 추가적으로, 글리코실화를 또한 질량 분광측정법에 의해 PNGase F 처리 후의 아스파르트산 형성의 검출을 통해 확인하였다. Fc 도메인 상의 Asn297 부위를 포함하는 글리칸 변형의 총 수 뿐만 아니라 융합된 IL-2 시토카인에 특이적으로 기인한 것들이 제시되어 있다. (각각의 분자는 2개의 Asn297 글리칸을 가지며, 따라서 각각의 분자는 적어도 2개의 총 N-글리칸을 갖는다).
표 A: 발현되고 글리코실화에 대해 검정된 잠재적 단일 및 이중 글리칸 IL-2 변이체 분자
Figure pat00011
1이중 글리코카인의 부분 점유는 단일 부위 점유 결과에 기반하여 할당되었다. Fc-IL2-R38N:L40T-T41N:K43T의 점유는 펩티드 맵핑의 부재 하에서 임의적으로 할당되었다.
표 A에 제시된 바와 같이, 도입된 글리코실화 부위 R38N:K40T, T41N:K43T, K43N:Y45T, 및 L72N:Q74T는 관련 아스파라긴 상에 모두 고도로 글리코실화되었다 (대부분이 >99%를 초과하는 분자의 90% 초과). 부분 글리코실화가 잠재적 글리코실화 부위 K35N에 대해 관찰되었고, 여기서 도입된 아스파라긴은 중간정도로 글리코실화되었다 (분자의 약 1/3). 대조적으로, 도입된 잠재적 글리코실화 부위 F42N:F44T, E62N:K64T, 및 E68N:L70T는 글리코실화되지 않았다.
실시예 16:
이 실시예에서, 상기 기재된 다양한 이중 글리칸 IL-2 변이체를 인간 IL-2Rα 및 인간 IL-2Rβ에 대한 결합 친화도에 대해 검정하였다.
모든 실험을 비아코어(Biacore) 8K 표면 플라스몬 공명 기반 바이오센서 (지이 헬스케어) 상에서 수행하였다. 정제된 가용성 리간드를 아민 커플링 키트 (지이 헬스케어, 제품# BR100050)를 제조업체의 권고사항에 따라 사용하여 CM5 센서 칩 상으로 공유 커플링시켰다. 농도의 범위의 HBS-EP+ 실행 완충제 (10 mM HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% P-20)를 모든 유동 세포 상에 7분 동안 20 μL/min으로 주사하였다. CD25 및 CD122는 각각 ~20 및 ~500 RU의 표면 밀도로 포획되었다. 비-유도체화된 유동 세포를 참조 표면으로서 사용하였다. 모든 유동 세포를 200 mM 보레이트 완충제 pH 8.5 중 100 mM 에틸렌디아민으로 7분 동안 10 μL/min으로 차단하였다.
단백질 상호작용 실험을 각각의 스팟 상에서 25℃에서 HBS-EP+ (pH 7.4)를 사용하여 수행하였다. 항원의 포획 후, 분석물 (1.23, 3.7, 11.1, 33.3, 100, 300, 및 900 nM 농도의 IL-2 변이체)을 50 μL/min의 유속으로 모든 유동 세포에서 50초 동안 주사하였다. 각각의 분석물 주사 후, 해리를 5분 동안 모니터링하고, 이어서 모든 유동 세포를 10 mM 글리신 (pH 2.1)의 20초 주사로 재생시켰다. 완충제 주기를 이중-참조 목적을 위해 각각의 샘플에 대해 수집하였다 (문헌 [Myszka, D.G., Improving biosensor analysis. J. Mol. Recognit. 12, 279-284 (1999)]에 기재된 바와 같은 이중-참조). 동역학 분석을 위해, 이중-참조된 센서그램을 비아코어 8K 평가 소프트웨어 버전 1.1.1.7442를 사용하여 질량 수송 결합 모델로 단순 1:1 랭뮤어에 전반적으로 적합화시켰다. 정상-상태 친화도 분석을 위해, 이중-참조된 평형 결합 반응을 비아코어 8K 평가 소프트웨어 버전 1.1.1.7442를 사용하여 1:1 랭뮤어 정상-상태 모델로 적합화시켰다.
시험된 IL-2 변이체에 대한 동역학 및 친화도 파라미터는 하기 표 B에 제시되어 있다:
표 B: 시험된 IL-2 변이체에 대한 동역학 및 친화도 파라미터
Figure pat00012
표 B에 제시된 바와 같이, Fc-IL2-R38N:L40T- K43N:Y45T 및 Fc-IL2- K43N:Y45T- L72N:Q74T 변이체는 야생형 IL-2 Fc 융합물과 유사한 인간 IL-2Rβ에 대한 결합 친화도를 보유한다. 야생형 Fc-IL-2 융합물은 IL-2Rβ보다 훨씬 더 높은 IL-2Rα에 대한 결합 친화도를 입증하였다. 대조적으로, Fc-IL2-R38N:L40T- K43N:Y45T 및 Fc-IL2- K43N:Y45T- L72N:Q74T 변이체는 IL-2Rα에의 측정가능한 결합을 갖지 않는다.
실시예 17:
이 실시예에서, 상기 기재된 다양한 단일 및 이중 글리칸 IL-2 변이체를 IL-2 CD122 / CD132 (β/γ) 수용체 복합체 (HH 세포) 또는 IL-2 CD25/CD122/CD132 (α/β/γ) 수용체 복합체 (유도된 Treg (또는 "iTreg")) 중 어느 하나를 함유하는 림프구의 활성화에 대해 검정하였다.
실시예 15에 기재된 바와 같은 다양한 Fc-연결된 단일 및 이중 글리칸 IL-2 변이체를 시험하였다. 시험된 변이체는 Fc-IL2-R38N:L40T; Fc-IL2-T41N:K43T; Fc-IL2-K43N:Y45T; Fc-IL2-E62N:K64T; Fc-IL2-L72N:Q74T; Fc-IL2-R38N:L40T-K43N:Y45T; Fc-IL2-K43N:Y45T-E62N:K64T; 및 Fc-IL2-K43N:Y45T- L72N:Q74T였다. 또한, Fc-연결된 야생형 인간 IL-2 ("Fc-IL2") 및 Fc-연결된 IL2v ("Fc-IL2v")를 또한 시험하였다. "IL2v"는 IL-2Rα 결합을 제거하는 돌연변이를 갖는 인간 IL-2의 변이체이다 (Klein, C, et al., Oncoimmunology, Vol. 6, No. 3, 2017). IL2v는 IL-2 및 IL-2Rα 사이의 상호작용을 제거하는 하기 돌연변이를 갖는다: F42A, Y45A, 및 L72G. 또한, IL2v는 돌연변이 T3A 및 C125A를 갖는다.
HH 세포 및 iTreg를 활성화시키는 IL-2 변이체의 능력을 IL-2 변이체로의 세포의 처리에 반응하여 인산화된 STAT5 (pSTAT5)의 상대 변화를 모니터링함으로써 측정하였다. pSTAT5는 IL-2 신호전달의 하류 결과인 것으로 공지되어 있다. HH T 세포 (ATCC CRL-2105)는 IL-2 수용체 복합체의 알파 쇄를 결여하지만, IL-2 수용체 복합체의 베타 및 감마 쇄를 함유하는 T 세포주이다. iTreg 세포를 스템셀 테크놀로지스(STEMCELL Technologies)로부터 얻어진 프레쉬 류코 팩스(Fresh Leuko Paks) (CAT#70500.1, 공여자#D001003551)로부터 제조하였다.
IL-2 활성화를 위해, HH 세포 및 iTreg 세포를 50 ul 혈청-무함유 RPMI 1640 배지 (깁코(Gibco))에 2*10e6개의 세포/웰로 플레이팅하고, 37℃에서 휴지시켰다. 휴지 후, 세포를 상기 열거된 IL-2 분자로 처리하고, 이어서 세포를 원심분리에 의해 펠릿화하였다.
IL-2 분자로의 처리 후, 세포 유도 상태를 인스탄트원(InstantOne) ELISA pSTAT5 검출 키트 (인비트로젠)에 의해 평가하였다.
도 50a 및 50b는 pSTAT5 유도의 증가에 의해 측정된 바와 같은, 각각 HH 세포 및 iTreg의 활성화에 대한 다양한 농도의 열거된 IL-2 변이체의 효과를 도시한다. 도 50a에 제시된 바와 같이, 모든 시험된 IL-2 변이체는 HH 세포를 활성화시키는데 있어서 유사한 유효성을 갖는다. 구체적으로, Fc-IL2-R38N:L40T; Fc-IL2-T41N:K43T; Fc-IL2-K43N:Y45T; Fc-IL2-E62N:K64T; Fc-IL2-L72N:Q74T; Fc-IL2-R38N:L40T-K43N:Y45T; Fc-IL2-K43N:Y45T-E62N:K64T; 및 Fc-IL2-K43N:Y45T- L72N:Q74T 단백질의 각각의 시험된 농도에 대해, 이들 분자는 상응하는 농도의 Fc-IL2 (야생형)로의 세포의 처리에 의해 생성된 것과 유사한 HH 세포에서의 pSTAT5 광학 밀도 (OD)의 증가를 발생시킨다. 대조적으로, 도 50b에 제시된 바와 같이, 시험된 IL-2 변이체의 각각은 야생형 IL-2와 비교하여 감소된 iTreg 세포의 활성화를 갖는다.
도 50a-50b에 제시된 바와 같은 데이터에 기반하여, EC50 값을 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) 8을 사용하여 최대 값의 pSTAT5 수준 50%를 발생시킨 각각의 Fc-IL-2 변이체의 농도를 계산함으로써 시험된 Fc-IL-2 분자의 각각에 대해 계산하였다. 상이한 Fc-IL-2 분자 및 세포 유형에 대한 EC50 값은 하기 표 C에 제공된다.
표 C: 상이한 Fc-IL-2 분자 및 세포 유형에 대한 EC50 값
Figure pat00013
도 50a, 50b, 및 표 C에 제시된 바와 같이, 상이한 IL-2 변이체 융합물의 대부분은 HH 세포를 활성화시키는데 있어서 야생형 IL-2 융합물과 유사한 효능 (즉, 10x / 자릿수 내)을 갖는다 (도 50a 및 표 C). 대조적으로, IL-2 변이체는 iTreg를 활성화시키는데 있어서 야생형 IL-2와 비교하여 유의하게 감소된 효능 (즉, 100배 / 2 자릿수 초과 감소됨)을 갖는다 (도 50b 및 표 C). 표 C는 또한 HH 세포 vs iTreg 세포 (EC50 HH 세포 / EC50 iTreg 세포)의 활성화에 대한 각각의 분자의 선택성에 대한 결정을 제공하고, 여기서 보다 높은 값은 HH 세포 vs. iTreg 세포에 대한 보다 큰 상대 선택성을 지시한다. 표 C에 제시된 바와 같이, IL-2 변이체 Fc-IL2-R38N:L40T- K43N:Y45T, Fc-IL2- K43N:Y45T- E62N:K64T, 및 Fc-IL2- K43N:Y45T- L72N:Q74T는 시험된 분자의 HH 세포 vs iTreg 세포에 대한 가장 큰 상대 선택성을 갖는다.
실시예 18:
이 실시예에서, 상기 기재된 다양한 단일 및 이중 글리칸 IL-2 변이체를 인간 말초 혈액 단핵 세포 (hPBMC)에서 CD8 T 세포, NK 세포, 및 Treg 세포에서 STAT5 신호전달의 그들의 활성화에 대해 시험하였다.
IL-2 변이체 - 단일 글리칸 변이체
이 실험에서, CD8 T 세포, NK 세포, 및 Treg 세포를 활성화시키는 IL-2 변이체의 능력을 IL-2 변이체로의 세포의 처리에 반응하여 pSTAT5의 상대 변화를 모니터링함으로써 측정하였다. 이 실험에서 시험된 IL-2 변이체는 각각 실시예 15에 기재된 바와 같이 인간 IgG Fc 도메인에 융합되었다. 시험된 변이체는 Fc-IL2-K35N; Fc-IL2-R38N:L40T; Fc-IL2-T41N:K43T; Fc-IL2-K43N:Y45T; Fc-IL2-E62N:K64T; Fc-IL2-L72N:Q74T였다. 또한, 실시예 3에 기재된 바와 같은 Fc-연결된 야생형 인간 IL-2 ("Fc-IL2") 및 Fc-연결된 IL2v ("Fc-IL2v")를 또한 시험하였다.
건강한 자원자로부터의 혈액을 취하고, hPBMC를 피콜-파크 (지이 헬스케어) 구배를 사용하여 단리하고, PBS로 세척하여 혈소판을 제거하고, ACK 용해 완충제 (깁코)를 사용하여 적혈구를 청소하였다. 이어서 세포를 90 uL 혈청-무함유 RPMI 1640 배지 (깁코)에 1*10e6개의 세포/웰로 플레이팅하고, 37℃에서 2-4시간 동안 휴지시켰다. 휴지 후, 세포를 지시된 농도에서 상기 열거된 IL-2 분자 (10 uL)로 37℃에서 20분 동안 처리하고, 25 uL 20% PFA를 부드럽게 피펫팅하면서 즉시 첨가하였다. 이어서 세포를 원심분리에 의해 펠릿화하고, 흡인하였다 (400 RCF, 7분).
포스플로우 펌(Phosflow Perm) 완충제 III (비디 바이오사이언시스(BD Biosciences))을 첨가하고 (200 uL), 세포를 상하로 1회 피펫팅함으로써 부드럽게 혼합하여 클럼핑을 방지하였다. 이어서 세포를 200 uL FACS 완충제로 2회 세척하고, 이어서 원심분리 (400 RCF, 7분)에 의해 펠릿화하였다. 세포를 200 uL FACS 완충제에 재현탁시키고, 표준 절차에 따라 표 D 및 표 E에서의 항체와 함께 인큐베이션하고, 이어서 FACS 분석을 위해 200 uL FACS 완충제에 현탁시켰다. 데이터를 플로우조 v10 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.
표 D:
Figure pat00014
표 E:
Figure pat00015
도 51a, 51b, 및 51c는 세포에서의 pSTAT5의 증가에 의해 측정된 바와 같은, 각각 CD8 T 세포, NK 세포, 및 Treg 세포의 활성화에 대한 다양한 농도의 열거된 IL-2 변이체의 효과를 도시한다. 도 51a 및 51b에 제시된 바와 같이, 모든 시험된 IL-2 변이체는 CD8 T 세포 및 NK 세포를 활성화시키는데 있어서 유사한 유효성을 갖는다. 구체적으로, Fc-IL2-K35N; Fc-IL2-R38N:L40T; Fc-IL2-T41N:K43T; Fc-IL2-K43N:Y45T; Fc-IL2-E62N:K64T; 및 Fc-IL2-L72N:Q74T 분자의 각각의 시험된 농도에 대해, 이들 분자는 상응하는 농도의 Fc-IL2 (야생형)로의 세포의 처리에 의해 생성된 것과 유사한 CD8 T 세포 및 NK 세포에서의 pSTAT5 평균 형광 강도 (MFI)의 증가를 발생시킨다. 대조적으로, 도 51c에 제시된 바와 같이, 시험된 Fc-IL-2 변이체의 각각은 야생형 Fc-IL-2와 비교하여 감소된 Treg 세포의 활성화를 갖는다.
도 51a-51c에 제시된 바와 같은 데이터에 기반하여, EC50 값을 상기 기재된 바와 같은 시험된 Fc-IL-2 분자의 각각에 대해 계산하였다. EC50 값은 하기 표 F에 제공된다.
표 F:
Figure pat00016
또한 CD8 T 세포 vs Treg 세포 또는 NK 세포 vs Treg 세포에 대한 각각의 IL-2 변이체의 선택성에 대한 값이 표 F에 제공되고, 여기서 보다 큰 수는 Treg 세포에 비해 CD8 T 세포 또는 NK 세포에 대한 보다 큰 선택성을 지시한다. 표 F에 제시된 바와 같이, 다양한 IL-2 변이체는 Fc-IL2 (야생형)와 유사한 EC50으로 CD8 T 세포 및 NK 세포를 활성화시키지만, 야생형 융합 단백질보다 훨씬 적게 Treg 세포를 활성화시킨다. 유사하게, Fc-IL2 변이체는 Fc-IL2 (야생형)와 비교하여 CD8 T 세포 및 NK 세포 vs Treg 세포에 대한 더 큰 선택성을 갖는다.
IL-2 변이체 - 이중 글리칸 변이체
다음으로, 다양한 이중 글리칸 IL-2 변이체를 시험하였다. 이 실험에서 시험된 IL-2 변이체는 각각 실시예 15에 기재된 바와 같이 인간 IgG Fc 도메인에 공유 연결되었다. 시험된 이중 글리칸 IL-2 변이체 분자는 Fc-IL2-R38N:L40T-K43N:Y45T; Fc-IL2-R38N:L40T-E62N:K64T; Fc-IL2-R38N:L40T-L72N:Q74T; Fc-IL2-T41N:K43T-E62N:K64T; Fc-IL2-T41N:K43T-L72N:Q74T; Fc-IL2-K43N:Y45T- E62N:K64T; 및 Fc-IL2-K43N:Y45T- L72N:Q74T였다. 또한, 단일 글리칸 IL-2 변이체 분자 Fc-IL2-R38N:L40T; Fc-IL2-T41N:K43T; 및 Fc-IL2-K43N:Y45T, 및 Fc-IL2 (야생형) 및 Fc-IL2v를 또한 비교를 위해 시험하였다.
hPBMC를 단일 글리칸 변이체에 대해 상기와 같이 제조하였다. 이어서 세포를 상기 바로 열거된 IL-2 이중 글리칸 변이체 및 관련된 대조군 IL-2 분자로 처리하고, 이어서 단일 글리칸 변이체에 대해 상기 기재된 바와 같이 유동 세포계측법을 위해 제조하였다.
도 52a, 52b, 및 52c는 세포에서의 pSTAT5의 증가에 의해 측정된 바와 같은, 각각 CD8 T 세포, NK 세포, 및 Treg 세포의 활성화에 대한 다양한 농도의 R38N:L40T-함유 이중 글리칸 IL-2 변이체의 효과를 도시한다. 도 52a 및 52b에 제시된 바와 같이, 모든 시험된 IL-2 변이체는 CD8 T 세포 및 NK 세포를 활성화시키는데 있어서 유사한 유효성을 갖는다. 대조적으로, 도 52c에 제시된 바와 같이, 시험된 R38N:L40T-함유 이중 글리칸 IL-2 변이체의 각각은 야생형 IL-2 분자와 비교하여 실질적으로 감소된 Treg 세포의 활성화, 및 또한 R38N:L40T 단일 글리칸 IL-2 변이체 분자와 비교하여 감소된 Treg 세포의 활성화를 갖는다.
도 53a, 53b, 및 53c는 세포에서의 pSTAT5의 증가에 의해 측정된 바와 같은, 각각 CD8 T 세포, NK 세포, 및 Treg 세포의 활성화에 대한 다양한 농도의 T41N:K43T-함유 이중 글리칸 IL-2 변이체의 효과를 도시한다. 도 53a 및 53b에 제시된 바와 같이, 모든 시험된 IL-2 변이체는 CD8 T 세포 및 NK 세포를 활성화시키는데 있어서 유사한 유효성을 갖는다. 대조적으로, 도 53c에 제시된 바와 같이, 시험된 T41N:K43T-함유 이중 글리칸 IL-2 변이체의 각각은 야생형 IL-2 분자와 비교하여 실질적으로 감소된 Treg 세포의 활성화, 및 또한 T41N:K43T 단일 글리칸 IL-2 변이체 분자와 비교하여 감소된 Treg 세포의 활성화를 갖는다.
도 54a, 54b, 및 54c는 세포에서의 pSTAT5의 증가에 의해 측정된 바와 같은, 각각 CD8 T 세포, NK 세포, 및 Treg 세포의 활성화에 대한 다양한 농도의 K43N-Y45T-함유 이중 글리칸 IL-2 변이체의 효과를 도시한다. 도 54a 및 54b에 제시된 바와 같이, 모든 시험된 IL-2 변이체는 CD8 T 세포 및 NK 세포를 활성화시키는데 있어서 유사한 유효성을 갖는다. 대조적으로, 도 54c에 제시된 바와 같이, 시험된 K43N-Y45T-함유 이중 글리칸 IL-2 변이체의 각각은 야생형 IL-2 분자와 비교하여 실질적으로 감소된 Treg 세포의 활성화를 갖는다.
실시예 19:
이 실시예에서, 단일 도입된 글리코실화 부위 (R38N:L40T) 및 아미노산 위치 62에 치환을 함유하는 다양한 IL-2 변이체를 CD8 T 세포, NK 세포, 및 Treg 세포의 그들의 활성화에 대해 시험하였다. 시험된 변이체는 Fc-IL2-R38N:L40T-E62A; Fc-IL2-R38N:L40T-E62N; Fc-IL2-R38N:L40T-E62K; 및 Fc-IL2-R38N:L40T-E62R이었다. 또한, 이중 글리칸 변이체 Fc-IL2-R38N:L40T- E62N:K64T, Fc-연결된 야생형 인간 IL-2 ("Fc-IL2") 및 Fc-연결된 IL2v ("Fc-IL2v")를 또한 대조군으로서 시험하였다. CD8 T 세포, NK 세포, 및 Treg 세포를 활성화시키는 IL-2 변이체의 능력을 IL-2 변이체로의 세포의 처리에 반응하여 인산화된 STAT5 (pSTAT5)의 상대 변화를 모니터링함으로써 측정하였다. 세포 활성화 / pSTAT5 검정을 실시예 18에 기재된 바와 같이 수행하였다.
도 55a, 55b, 및 55c는 세포에서의 pSTAT5의 증가에 의해 측정된 바와 같은, 각각 CD8 T 세포, NK 세포, 및 Treg 세포의 활성화에 대한 다양한 농도의 IL-2 변이체 융합 단백질의 효과를 도시한다. 도 55a 및 55b에 제시된 바와 같이, 모든 시험된 IL-2 변이체는 CD8 T 세포 및 NK 세포를 활성화시키는데 있어서 유사한 유효성을 갖는다. 대조적으로, 도 55c에 제시된 바와 같이, 시험된 IL-2 변이체의 각각은 야생형 IL-2 분자와 비교하여 실질적으로 감소된 Treg 세포의 활성화를 갖는다.
실시예 20:
이 실시예에서, 상기 기재된 다양한 단일 및 이중 글리칸 IL-2 변이체를 생체내에서 CD8 T 세포, NK 세포, 및 Treg 세포의 확장에 대한 그들의 효과에 대해 시험하였다. 시험된 변이체는 Fc-IL2-K43N:Y45T; Fc-IL2-R38N:L40T-K43N:Y45T; Fc-IL2-K43N:Y45T-L72N:Q74T였다. 또한, Fc-연결된 야생형 인간 IL-2 ("Fc-IL2") 및 Fc-연결된 IL2v ("Fc-IL2v")를 또한 대조군으로서 시험하였다.
마우스를 상기 열거된 분자 중 하나 또는 PBS 대조군을 받는 그룹으로 무작위화하였다. 처리 그룹은 하기와 같았다: PBS; Fc-IL2; Fc-IL2v; Fc-IL2-K43N:Y45T; Fc-IL2-R38N:L40T-K43N:Y45T; Fc-IL2-K43N:Y45T-L72N:Q74T. Fc-IL2 융합 분자를 피하 주사에 의해 4일의 연속적 일 동안 매일 0.5, 1, 또는 2 mg/kg으로 투여하고, 각각의 대조군 또는 IL-2 변이체를 그의 농도에서 그들의 할당된 그룹에 대해 투여하였다. 면역표현형결정을 각각의 그룹으로부터 비장을 수집함으로써 제1 처리 (제0일) 후 제3일에 수행하였다.
도 56a, 56b, 및 56c는 세포의 배수-확장에 의해 측정된 바와 같은, 각각 CD8 T 세포, NK 세포, 및 Treg 세포의 확장에 대한 다양한 농도의 열거된 단일 및 이중 글리칸 IL-2 변이체의 효과를 도시한다. 야생형 Fc-IL2 그룹에서, 1 mg/kg 그룹에서 2/3 마우스 및 2 mg/kg 그룹에서 1/3 마우스는 처리에 생존하지 않았다. 도 56a 및 56b에 제시된 바와 같이, Fc-IL2-K43N:Y45T; Fc-IL2-R38N:L40T-K43N:Y45T; 및 Fc-IL2-K43N:Y45T- L72N:Q74T의 각각은 CD8 T 세포 및 NK 세포의 확장을 촉진시켰으며, 더 큰 농도의 이들 분자는 CD8 T 세포 및 NK 세포의 확장을 증가시켰다. 대조적으로, Fc-IL2 및 Fc-IL2v는 CD8 T 세포 및 NK 세포의 확장을 증가시키지 않았으며; 사실, 증가하는 농도의 이들 분자는 전신 독성으로 인해 CD8 T 세포 및 NK 세포의 확장을 감소시켰다. 도 56c에 제시된 바와 같이, 증가하는 농도의 Fc-IL2; Fc-IL2v; Fc-IL2-K43N:Y45T의 각각은 반대 용량-반응으로 Treg 증식의 보통의 증가를 입증한 반면, Fc-IL2-R38N:L40T-K43N:Y45T 및 Fc-IL2-K43N:Y45T-L72N:Q74T는 모든 용량에서 Treg 세포의 증식에 대한 최소 효과를 가졌다.
실시예 21:
이 실시예에서, 상기 열거된 다양한 단일 및 이중 글리칸 IL-2 변이체를 마우스에서의 내약성 및 종양 성장 억제에 대해 시험하였다. 시험된 변이체는 Fc-IL2-K43N:Y45T; Fc-IL2-R38N:L40T-K43N:Y45T; Fc-IL2-K43N:Y45T-L72N:Q74T였다. 또한, Fc-연결된 야생형 인간 IL-2 ("Fc-IL2") 및 Fc-연결된 IL2v ("Fc-IL2v")를 또한 대조군으로서 시험하였다.
실험의 제0일에, 암컷 C57/BL6 마우스를 단일, 저-계대 바이알 (1*10^7개의 세포의)로부터 신선하게 해동된 대략 500,000개의 B16F10 세포로 상부 넓적다리에 피하로 이식하고, 이식을 위한 충분한 세포를 확립하는데 요구되는 최소 시간 동안 배양하였다.
실험의 제5일에, 마우스를 상기 열거된 분자 중 하나 또는 대조군을 받는 그룹으로 무작위화하였다. 처리 그룹은 하기와 같았다: PBS; Fc-IL2; Fc-IL2v; Fc-IL2-K43N:Y45T; Fc-IL2-R38N:L40T-K43N:Y45T; Fc-IL2-K43N:Y45T-L72N:Q74T. Fc-IL2 융합 분자를 피하 주사에 의해 제5일, 제6일, 제7일, 및 제8일에 1 mg/kg으로 투여하고, 각각의 대조군 또는 변이체 Fc-IL2 융합 분자를 그의 농도에서 그들의 할당된 그룹에 대해 투여하였다. 15마리의 동물의 그룹은 1 mg/kg 용량의 내약성 및 종양 성장 억제를 평가하기 위해 유지되었다. 종양 부피, 체중, 및 동물 생존을 실험의 과정 전반에 걸쳐 추적하였다. 종양이 대략 2000 mm^3에 도달하면 또는 처리 후 2주에 동물을 희생시켰다.
생존 및 종양 성장 억제를 도 57a 및 57b에 제시된 바와 같이 처리 그룹에 대한 출발 용량으로부터 대략 2주에 걸쳐 모니터링하였다. 내약성은 다른 실시예에서 나타난 바와 같이 IL-Ra 결합의 약화의 정도와 상관되었다. Fc-IL2 및 Fc-IL2v 대조군 분자 그룹은 제8일까지 생존 없이 유사하게 내성화되었다 (도 57a). Fc-IL2-K43N:Y45T는 7/15 마우스로 중간 생존을 가졌다. 이중 글리칸 변이체 Fc-IL2-R38N:L40T-K43N:Y45T 및 Fc-IL2-K43N:Y45T-L72N:Q74T로 처리된 그룹은 제1 처리 후 제12일에 11/15 및 14/15 생존 마우스를 가졌다. 종양 성장 억제를 PBS 대조군과 비교하여, 보다 양호하게 내성화된 Fc-IL2-R38N:L40T-K43N:Y45T 및 Fc-IL2-K43N:Y45T-L72N:Q74T 그룹으로부터의 생존 마우스에 대해 평가하였다. 도 57b에 제시된 바와 같이, 유의한 종양 성장 억제가 Fc-IL2-R38N:L40T-K43N:Y45T 및 Fc-IL2-K43N:Y45T-L72N:Q74T로 처리된 마우스에 대해 관찰되었다.
이들 실험은 Fc-IL2-K43N:Y45T; Fc-IL2-R38N:L40T-K43N:Y45T; 및 Fc-IL2-K43N:Y45T-L72N:Q74T 단백질이 Fc-IL2 및 Fc-IL2v보다 마우스에서 더 양호하게 내성화되며, Fc-IL2-R38N:L40T-K43N:Y45T 및 Fc-IL2-K43N:Y45T-L72N:Q74T는 종양 성장 억제 활성을 가짐을 제시한다.
실시예 22: 인간 종양 세포주의 패널에서의 VV110의 시험관내 효력
VV110 및 VV12 (JX-594 모방체)를 세포독성 검정에서 NSCLC, 흑색종, RCC, CRC 및 HCC 적응증으로부터의 인간 종양 세포주의 패널에서 시험하였다. 세포를 그들의 상응하는 완전 배지에서 배양하였다. 세포를 검정 전 24 hr에 96-웰 플레이트에 세포 유형 특이적 시딩 밀도로 플레이팅하여 검정의 일에 전면생장 단층을 형성하였다. 시험 바이러스를 2.5% FBS를 함유하는 세포주 특이적 배지에서 30의 출발 MOI로부터 계열 희석하였다 (1:5). 배지 흡인 후, 세포를 바이러스 (30 내지 1.54 x 10-5의 MOI)로 감염시켰다. 이어서 플레이트를 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 48, 72 또는 96 hr 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션의 종료시, CCK-8 시약을 각각의 웰에 첨가하고, 450 nm에서의 흡광도를 스펙트라맥스(SpectraMax) i3X를 사용하여 판독하였다. 데이터를 세포 단독 (100% 생존력) 및 용해된 세포 단독 대조군 (0% 생존력)에 대해 정규화하였다. EC50을 4 파라미터 로지스틱 적합을 사용하여 계산하였다. EC50 및 % 최대 살해를 각각의 시점에 대해 보고하였다.
시험된 모든 세포주는 세포주에 따라, 감염 후 2 내지 4일에 관찰된 ≥90% 살해로 VV110 및 VV12 둘 다에 의해 유도된 시험관내에서의 감염 및 종양용해에 대해 감수성이었다 (도 58). VV110의 효력은 시험된 가장 민감성 주 (769-P)에 대해 2.52 x 10-4 PFU/세포 내지 시험된 가장 적게 민감성 주 (SK-MEL-5)에 대해 7.08 x 10-1 PFU/세포의 EC50의 범위였으며, 다른 것들보다 VV110에 대해 일관되게 더 민감성이거나 저항성인 종양 적응증은 없었다 (도 59). 시험된 모든 세포주는 또한 JX-594 모방체인 VV12에 대해 민감성이었다. VV110에 비한 VV12의 EC50 비를 계산하였으며, VV110은 15개의 종양 세포주 중 13개에서 VV12에 비해 더 높은 시험관내 효력을 입증하였다 (도 60).
도 58: 감염 후 48, 72, 및 96 hr에서의 백분율 최대 인간 종양 세포 살해. 인간 종양 세포주를 VV110 또는 VV12 (JX-594)로 48, 72, 또는 96 hr 동안 감염시키고, 이 시점에서 세포 생존력을 결정하였다. 데이터는 평균 ± SD로서 나타내어진다.
도 59: 감염 후 48, 72, 및 96 hr에서의 인간 종양 세포주에서의 VV110 및 VV12의 효력. 인간 종양 세포주를 VV110 또는 VV12 (JX-594)로 72 hr 동안 감염시키고, 이 시점에서 세포 생존력을 결정하고, EC50 (pfu/세포)을 4-PL 로지스틱 적합을 사용하여 계산하였다. 데이터는 평균 ± SD로서 나타내어진다.
도 60: 인간 종양 세포주에서의 VV110 및 VV12의 상대 효력 (EC50 비). 인간 종양 세포주를 VV110 또는 VV12 (JX-594)로 72 hr 동안 감염시키고, 이 시점에서 세포 생존력을 결정하고, EC50 (pfu/세포)을 4-PL 로지스틱 적합을 사용하여 계산하였다. VV110에 비한 VV12의 EC50 비를 계산하였다. 데이터는 평균 ± SD로서 나타내어진다.
실시예 23: 시노몰구스 원숭이에서의 VV110의 IV 투여 후에 발생한 자발적 피부 병변의 국소 아시클로비르 치료.
시노몰구스 원숭이는 연구 제1일에 IV 투여를 통해 5x107 PFU VV110을 받았다. 동물은 연구 제5일까지 자발적 피부 병변을 발달시켰으며, 3개의 병변을 함유하는 영역을 국소 아시클로비르 (조비락스(Zovirax))로의 병변 치료 없이 (그룹 1) 또는 그와 함께 (그룹 2) 병변 진행 및 바이러스 쉐딩의 검사를 위해 확인하였다. 치료를 받는 동물은 11일 동안 1일 4회 (2시간 간격) 영역에 적용된 국소 아시클로비르를 가졌다. 병변 진행을 사진으로 문서화하였다. 병변으로부터의 바이러스 쉐딩을 제5일, 제7일, 및 제9일에 평가하였다. 개별적 병변의 스왑을 수집하고, U2OS 플라크 검정에서 감염성 바이러스 역가에 대한 검정 전에 -80℃에서 저장하였다. 간략하게, U-2OS 세포를 역가 검정 전 대략 24 h에 6-웰 플레이트에 플레이팅하였다. 1 mL의 PBS를 스왑에 첨가하고, 샘플을 초음파처리하였다. 배지를 세포로부터 제거하고, 700 μL의 계열 희석된 바이러스/스왑 샘플을 첨가하였다. 37℃ 인큐베이터에서 2 h 인큐베이션 후, 접종물을 제거하고, 2 mL의 1.5 % CMC, 10% FBS, 0.5x 맥코이(McCoy) 오버레이를 각각의 웰에 첨가하였다. 플레이트를 37℃ 인큐베이터에서 48 h 동안 인큐베이션하였다. 이 인큐베이션 기간의 종료시, 플레이트를 DPBS에서 1회 세척하고, 세포를 고정시키고, 결정 바이올렛으로 1 h 동안 염색하고, 이어서 물로 세척하였다. 화상을 이뮤노스팟(Immunospot) S6 MACRO 분석기로 획득하였다. 플라크를 CTL 이뮤노스팟 소프트웨어를 사용하여 카운팅하고, 역가 (PFU/mL)를 결정하였다.
국소 아시클로비르 치료를 받지 않은 동물인 그룹 1 상의 병변은 대략 제15일 내지 제17일까지 해결되었다. 국소 아시클로비르로 치료된 그룹 2 동물 상의 병변은 대략 제11일 내지 제13일까지 보다 빠르게 해결되었다. 그룹 1에서, 병변 스왑 역가는 제5일에 71 내지 1060 PFU/mL 내지 제7일에 <3 내지 73,000 PFU/mL의 범위였던 반면, 그룹 2 동물에서, ACV로 치료된 병변으로부터의 병변 스왑 역가는 제5일에 14 내지 9,710 PFU/mL 내지 제7일에 3 내지 54 PFU의 범위였다. 제9일 및 제11일에, 병변 스왑 중 어느 것도 임의의 검출가능한 감염성 역가를 갖지 않았다. 평균적으로, ACV로 치료된 병변 (그룹 2)의 스왑으로부터의 감염성 바이러스 역가는 비치료된 병변 (그룹 1)으로부터 검출된 것보다 더 짧은 지속기간에 걸쳐 양이 감소하였다 (도 61).
도 61: 국소 아시클로비르 치료와 함께 또는 없이, 시노몰구스 원숭이에의 VV110의 IV 투여 후에 발생한 자발적 피부 병변으로부터의 감염성 바이러스 역가. 스왑을 국소 아시클로비르 투여 없이 (그룹 1) 또는 그와 함께 (그룹 2) 5x107 PFU VV110을 IV로 받은 동물 상의 개별적 피부 병변으로부터 수집하였다.
이들 데이터는 VV110에 포함된 HSV TK.007 안전성 "오프-스위치"가 국소 항바이러스 약물에 대한 바이러스 민감성을 부여하고, VV 치료 후 일부 암 환자에서 발생할 수 있는 자발적 피부 병변으로부터의 바이러스 쉐딩의 중증도, 지속기간, 및 수준을 감소시키는 잠재적 수단을 제공한다는 개념을 뒷받침한다.
SEQUENCE LISTING <110> Pfizer Inc. Binder, Joseph J Eisenbraun, Michael D Lees, Clare Myers, Jeremy S Patterson, James T <120> Recombinant Vaccinia Virus <130> PC72649A <150> 63051628 <151> 2020-07-14 <150> 63051890 <151> 2020-07-14 <160> 39 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 133 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His 1 5 10 15 Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys 20 25 30 Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys 35 40 45 Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys 50 55 60 Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu 65 70 75 80 Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu 85 90 95 Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala 100 105 110 Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile 115 120 125 Ile Ser Thr Leu Thr 130 <210> 2 <211> 507 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 2 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215 220 Glu Arg Leu Asp Leu Ala Met Leu Ala Ala Ile Arg Arg Val Tyr Gly 225 230 235 240 Leu Leu Ala Asn Thr Val Arg Tyr Leu Gln Gly Gly Gly Ser Trp Arg 245 250 255 Glu Asp Trp Gly Gln Leu Ser Gly Thr Ala Val Pro Pro Gln Gly Ala 260 265 270 Glu Pro Gln Ser Asn Ala Gly Pro Arg Pro His Ile Gly Asp Thr Leu 275 280 285 Phe Thr Leu Phe Arg Ala Pro Glu Leu Leu Ala Pro Asn Gly Asp Leu 290 295 300 Tyr Asn Val Phe Ala Trp Ala Leu Asp Val Leu Ala Lys Arg Leu Arg 305 310 315 320 Pro Met His Val Phe Ile Leu Asp Tyr Asp Gln Ser Pro Ala Gly Cys 325 330 335 Arg Asp Ala Leu Leu Gln Leu Thr Ser Gly Met Ile Gln Thr His Val 340 345 350 Thr Thr Pro Gly Ser Ile Pro Thr Ile Cys Asp Leu Ala Arg Thr Phe 355 360 365 Ala Arg Glu Met Gly Glu Ala Asn 370 375 <210> 26 <211> 376 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 26 Met Ala Ser Tyr Pro Gly His Gln His Ala Ser Ala Phe Asp Gln Ala 1 5 10 15 Ala Arg Ser Arg Gly His Ser Asn Arg Arg Thr Ala Leu Arg Pro Arg 20 25 30 Arg Gln Gln Glu 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Tyr Leu Gln Gly Gly Gly Ser Trp Arg 245 250 255 Glu Asp Trp Gly Gln Leu Ser Gly Thr Ala Val Pro Pro Gln Gly Ala 260 265 270 Glu Pro Gln Ser Asn Ala Gly Pro Arg Pro His Ile Gly Asp Thr Leu 275 280 285 Phe Thr Leu Phe Arg Ala Pro Glu Leu Leu Ala Pro Asn Gly Asp Leu 290 295 300 Tyr Asn Val Phe Ala Trp Ala Leu Asp Val Leu Ala Lys Arg Leu Arg 305 310 315 320 Pro Met His Val Phe Ile Leu Asp Tyr Asp Gln Ser Pro Ala Gly Cys 325 330 335 Arg Asp Ala Leu Leu Gln Leu Thr Ser Gly Met Ile Gln Thr His Val 340 345 350 Thr Thr Pro Gly Ser Ile Pro Thr Ile Cys Asp Leu Ala Arg Thr Phe 355 360 365 Ala Arg Glu Met Gly Glu Ala Asn 370 375 <210> 27 <211> 376 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 27 Met Ala Ser Tyr Pro Gly His Gln His Ala Ser Ala Phe Asp Gln Ala 1 5 10 15 Ala Arg Ser Arg Gly His Ser Asn Arg Arg Thr Ala Leu Arg Pro Arg 20 25 30 Arg Gln Gln Glu Ala Thr Glu Val Arg Pro Glu Gln Lys Met Pro Thr 35 40 45 Leu Leu Arg Val Tyr Ile Asp Gly Pro His Gly Met Gly Lys Thr Thr 50 55 60 Thr Thr Gln Leu Leu Val Ala Leu Gly Ser Arg Asp Asp Ile Val Tyr 65 70 75 80 Val Pro Glu Pro Met Thr Tyr Trp Arg Val Leu Gly Ala Ser Glu Thr 85 90 95 Ile Ala Asn Ile Tyr Thr Thr Gln His Arg Leu Asp Gln Gly Glu Ile 100 105 110 Ser Ala Gly Asp Ala Ala Val Val Met Thr Ser Ala Gln Ile Thr Met 115 120 125 Gly Met Pro Tyr Ala Val Thr Asp Ala Val Leu Ala Pro His Ile Gly 130 135 140 Gly Glu Ala Gly Ser Ser His Ala Pro Pro Pro Ala Leu Thr Ile Phe 145 150 155 160 Leu Asp Arg His Pro Ile Ala Phe Met Leu Cys Tyr Pro Ala Ala Arg 165 170 175 Tyr Leu Met Gly Ser Met Thr Pro Gln Ala Val Leu Ala Phe Val Ala 180 185 190 Leu Ile Pro Pro Thr Leu Pro Gly Thr Asn Ile Val Leu Gly Ala Leu 195 200 205 Pro Glu Asp Arg His Ile Asp Arg Leu Ala Lys Arg Gln Arg Pro Gly 210 215 220 Glu Arg Leu Asp Leu Ala Met Leu Ala Ala Ile Arg Arg Val Tyr Gly 225 230 235 240 Leu Leu Ala Asn Thr Val Arg Tyr Leu Gln Gly Gly Gly Ser Trp Arg 245 250 255 Glu Asp Trp Gly Gln Leu Ser Gly Thr Ala Val Pro Pro Gln Gly Ala 260 265 270 Glu Pro Gln Ser Asn Ala Gly Pro Arg Pro His Ile Gly Asp Thr Leu 275 280 285 Phe Thr Leu Phe Arg Ala Pro Glu Leu Leu Ala Pro Asn Gly Asp Leu 290 295 300 Tyr Asn Val Phe Ala Trp Ala Leu Asp Val Leu Ala Lys Arg Leu Arg 305 310 315 320 Pro Met His Val Phe Ile Leu Asp Tyr Asp Gln Ser Pro Ala Gly Cys 325 330 335 Arg Asp Ala Leu Leu Gln Leu Thr Ser Gly Met Ile Gln Thr His Val 340 345 350 Thr Thr Pro Gly Ser Ile Pro Thr Ile Cys Asp Leu Ala Arg Thr Phe 355 360 365 Ala Arg Glu Met Gly Glu Ala Asn 370 375 <210> 28 <211> 376 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 28 Met Ala Ser Tyr Pro Gly His Gln His Ala Ser Ala Phe Asp Gln Ala 1 5 10 15 Ala Arg Ser Arg Gly His Ser Asn Arg Arg Thr Ala Leu Arg Pro Arg 20 25 30 Arg Gln Gln Glu Ala Thr Glu Val Arg Pro Glu Gln Lys Met Pro Thr 35 40 45 Leu Leu Arg Val Tyr Ile Asp Gly Pro His Gly Met Gly Lys Thr Thr 50 55 60 Thr Thr Gln Leu Leu Val Ala Leu Gly Ser Arg Asp Asp Ile Val Tyr 65 70 75 80 Val Pro Glu Pro Met Thr Tyr Trp Arg Val Leu Gly Ala Ser Glu Thr 85 90 95 Ile Ala Asn Ile Tyr Thr Thr Gln His Arg Leu Asp Gln Gly Glu Ile 100 105 110 Ser Ala Gly Asp Ala Ala Val Val Met Thr Ser Ala Gln Ile Thr Met 115 120 125 Gly Met Pro Tyr Ala Val Thr Asp Ala Val Leu Ala Pro His Ile Gly 130 135 140 Gly Glu Ala Gly Ser Ser His Ala Pro Pro Pro Ala Leu Thr Leu Ile 145 150 155 160 Phe Asp Arg His Pro Ile Ala His Leu Leu Cys Tyr Pro Ala Ala Arg 165 170 175 Tyr Leu Met Gly Ser Met Thr Pro Gln Ala Val Leu Ala Phe Val Ala 180 185 190 Leu Ile Pro Pro Thr Leu Pro Gly Thr Asn Ile Val Leu Gly Ala Leu 195 200 205 Pro Glu Asp Arg His Ile Asp Arg Leu Ala Lys Arg Gln Arg Pro Gly 210 215 220 Glu Arg Leu Asp Leu Ala Met Leu Ala Ala Ile Arg Arg Val Tyr Gly 225 230 235 240 Leu Leu Ala Asn Thr Val Arg Tyr Leu Gln Gly Gly Gly Ser Trp Arg 245 250 255 Glu Asp Trp Gly Gln Leu Ser Gly Thr Ala Val Pro Pro Gln Gly Ala 260 265 270 Glu Pro Gln Ser Asn Ala Gly Pro Arg Pro His Ile Gly Asp Thr Leu 275 280 285 Phe Thr Leu Phe Arg Ala Pro Glu Leu Leu Ala Pro Asn Gly Asp Leu 290 295 300 Tyr Asn Val Phe Ala Trp Ala Leu Asp Val Leu Ala Lys Arg Leu Arg 305 310 315 320 Pro Met His Val Phe Ile Leu Asp Tyr Asp Gln Ser Pro Ala Gly Cys 325 330 335 Arg Asp Ala Leu Leu Gln Leu Thr Ser Gly Met Ile Gln Thr His Val 340 345 350 Thr Thr Pro Gly Ser Ile Pro Thr Ile Cys Asp Leu Ala Arg Thr Phe 355 360 365 Ala Arg Glu Met Gly Glu Ala Asn 370 375 <210> 29 <211> 153 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 29 Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu 1 5 10 15 Val Thr Asn Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu 20 25 30 Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile 35 40 45 Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Asn Met Thr Thr Phe Asn Phe 50 55 60 Thr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu 65 70 75 80 Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys 85 90 95 Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile 100 105 110 Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala 115 120 125 Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe 130 135 140 Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr 145 150 <210> 30 <211> 459 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 30 atgtatcgta tgcagctgct gagctgcatc gctttatctt tagctttagt gaccaacagc 60 gcccctacca gctcctccac caagaagacc cagctgcagc tggagcattt actgctggat 120 ttacagatga ttttaaacgg catcaacaac tacaagaacc ccaagctgac taatatgacc 180 accttcaact tcactatgcc caagaaggcc accgagctga agcacctcca gtgtttagag 240 gaggagctga agcctttaga ggaggtgctg aatttagccc agagcaagaa tttccattta 300 aggcctcgtg atttaatcag caacatcaac gtgatcgtgc tggagctgaa aggctccgag 360 accaccttca tgtgcgagta cgccgacgag accgccacca tcgtggagtt tttaaatcgt 420 tggatcacct tctgccagag catcatcagc actttaacc 459 <210> 31 <211> 133 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 31 Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His 1 5 10 15 Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys 20 25 30 Asn Pro Lys Leu Thr Asn Met Thr Thr Phe Asn Phe Thr Met Pro Lys 35 40 45 Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys 50 55 60 Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu 65 70 75 80 Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu 85 90 95 Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala 100 105 110 Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile 115 120 125 Ile Ser Thr Leu Thr 130 <210> 32 <211> 399 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 32 gcccctacca gctcctccac caagaagacc cagctgcagc tggagcattt actgctggat 60 ttacagatga ttttaaacgg catcaacaac tacaagaacc ccaagctgac taatatgacc 120 accttcaact tcactatgcc caagaaggcc accgagctga agcacctcca gtgtttagag 180 gaggagctga agcctttaga ggaggtgctg aatttagccc agagcaagaa tttccattta 240 aggcctcgtg atttaatcag caacatcaac gtgatcgtgc tggagctgaa aggctccgag 300 accaccttca tgtgcgagta cgccgacgag accgccacca tcgtggagtt tttaaatcgt 360 tggatcacct tctgccagag catcatcagc actttaacc 399 <210> 33 <211> 153 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 33 Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu 1 5 10 15 Val Thr Asn Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu 20 25 30 Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile 35 40 45 Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Asn Phe 50 55 60 Thr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu 65 70 75 80 Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Asn Ala Thr Ser Lys 85 90 95 Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile 100 105 110 Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala 115 120 125 Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe 130 135 140 Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr 145 150 <210> 34 <211> 459 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 34 atgtatcgta tgcagctgct gagctgcatc gctttatctt tagctttagt gaccaacagc 60 gcccctacca gctcctccac caagaagacc cagctgcagc tggagcattt actgctggat 120 ttacagatga ttttaaacgg catcaacaac tacaagaacc ccaagctgac tcgtatgctg 180 accttcaact tcactatgcc caagaaggcc accgagctga agcacctcca gtgtttagag 240 gaggagctga agcctttaga ggaggtgctg aataacgcca ccagcaagaa tttccattta 300 aggcctcgtg atttaatcag caacatcaac gtgatcgtgc tggagctgaa aggctccgag 360 accaccttca tgtgcgagta cgccgacgag accgccacca tcgtggagtt tttaaatcgt 420 tggatcacct tctgccagag catcatcagc actttaacc 459 <210> 35 <211> 133 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 35 Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His 1 5 10 15 Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys 20 25 30 Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Asn Phe Thr Met Pro Lys 35 40 45 Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys 50 55 60 Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Asn Ala Thr Ser Lys Asn Phe His Leu 65 70 75 80 Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu 85 90 95 Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala 100 105 110 Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile 115 120 125 Ile Ser Thr Leu Thr 130 <210> 36 <211> 399 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 36 gcccctacca gctcctccac caagaagacc cagctgcagc tggagcattt actgctggat 60 ttacagatga ttttaaacgg catcaacaac tacaagaacc ccaagctgac tcgtatgctg 120 accttcaact tcactatgcc caagaaggcc accgagctga agcacctcca gtgtttagag 180 gaggagctga agcctttaga ggaggtgctg aataacgcca ccagcaagaa tttccattta 240 aggcctcgtg atttaatcag caacatcaac gtgatcgtgc tggagctgaa aggctccgag 300 accaccttca tgtgcgagta cgccgacgag accgccacca tcgtggagtt tttaaatcgt 360 tggatcacct tctgccagag catcatcagc actttaacc 399 <210> 37 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 37 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 38 <211> 168 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 38 Met Lys Ser Leu Asn Arg Gln Thr Val Ser Met Phe Lys Lys Leu Ser 1 5 10 15 Val Pro Ala Ala Ile Met Met Ile Leu Ser Thr Ile Ile Ser Gly Ile 20 25 30 Gly Thr Phe Leu His Tyr Lys Glu Glu Leu Met Pro Ser Ala Cys Ala 35 40 45 Asn Gly Trp Ile Gln Tyr Asp Lys His Cys Tyr Leu Asp Thr Asn Ile 50 55 60 Lys Met Ser Thr Asp Asn Ala Val Tyr Gln Cys Arg Lys Leu Arg Ala 65 70 75 80 Arg Leu Pro Arg Pro Asp Thr Arg His Leu Arg Val Leu Phe Ser Ile 85 90 95 Phe Tyr Lys Asp Tyr Trp Val Ser Leu Lys Lys Thr Asn Asn Lys Trp 100 105 110 Leu Asp Ile Asn Asn Asp Lys Asp Ile Asp Ile Ser Lys Leu Thr Asn 115 120 125 Phe Lys Gln Leu Asn Ser Thr Thr Asp Ala Glu Ala Cys Tyr Ile Tyr 130 135 140 Lys Ser Gly Lys Leu Val Glu Thr Val Cys Lys Ser Thr Gln Ser Val 145 150 155 160 Leu Cys Val Lys Lys Phe Tyr Lys 165 <210> 39 <211> 507 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 39 atgaaatcgc ttaatagaca aactgtaagt atgtttaaga agttgtcggt gccggccgct 60 ataatgatga tactctcaac cattattagt ggcataggaa catttctgca ttacaaagaa 120 gaactgatgc ctagtgcttg cgccaatgga tggatacaat acgataaaca ttgttatcta 180 gataccaaca ttaaaatgtc cacagataat gcggtttatc agtgtcgtaa attacgagct 240 agattgccta gacctgatac tagacatctg agagtattgt ttagtatttt ttataaagat 300 tattgggtaa gtttaaaaaa gaccaataat aaatggttag atattaataa tgataaagat 360 atagatatta gtaaattaac aaattttaaa caactaaaca gtacgacgga tgctgaagcg 420 tgttatatat acaagtctgg aaaactggtt gaaacagtat gtaaaagtac tcaatctgta 480 ctatgtgtta aaaaattcta caagtga 507

Claims (46)

  1. 서열식별번호: 1에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 야생형 인간 인터류킨 2 (IL-2)와 비교하여 적어도 1개의 아미노산 치환을 포함하는 단리된 인간 IL-2 변이체를 포함하는 제약 조성물로서, 여기서 IL-2 변이체는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 위치에 1개 이상의 치환을 포함하는 것인 제약 조성물:
    a) K35,
    b) R38 및 L40 둘 다,
    c) T41 및 K43 둘 다,
    d) K43 및 Y45 둘 다,
    e) E62 및 K64 둘 다, 및
    f) L72 및 Q74 둘 다.
  2. a) 제1항에 기재된 바와 같은 IL-2 변이체; 및 b) 인간 항체의 Fc 영역을 포함하는 단리된 융합 단백질을 포함하는 제약 조성물로서, 여기서 IL-2 변이체는 Fc 영역에 공유 연결된 것인 제약 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 대상체에서 암을 치료하기 위한 제약 조성물.
  4. a) 제1항에 기재된 바와 같은 IL-2 변이체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 종양용해성 바이러스 (OV); 및 b) 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물.
  5. 제4항에 있어서, IL-2 변이체가 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 위치에 1개 이상의 치환을 포함하는 것인 제약 조성물:
    a) K35, 여기서 K35 치환은 K35N임,
    b) R38 및 L40 둘 다, 여기서 R38 치환은 R38N이고, L40 치환은 L40S 또는 L40T임,
    c) T41 및 K43 둘 다, 여기서 T41 치환은 T41N이고, K43 치환은 K43S 또는 K43T임,
    d) K43 및 Y45 둘 다, 여기서 K43 치환은 K43N이고, Y45 치환은 Y45S 또는 Y45T임,
    e) E62 및 K64 둘 다, 여기서 E62 치환은 E62N이고, K64 치환은 K64S 또는 K64T임, 및
    f) L72 및 Q74 둘 다, 여기서 L72 치환은 L72N이고, Q74 치환은 Q74S 또는 Q74T임.
  6. 제4항에 있어서, IL-2 변이체가 위치 K35에 치환을 포함하고, IL-2 변이체가 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에 치환을 추가로 포함하는 것인 제약 조성물:
    a) R38 및 L40 둘 다, 여기서 R38 치환은 R38N이고, L40 치환은 L40S 또는 L40T임,
    b) T41 및 K43 둘 다, 여기서 T41 치환은 T41N이고, K43 치환은 K43S 또는 K43T임,
    c) K43 및 Y45 둘 다, 여기서 K43 치환은 K43N이고, Y45 치환은 Y45S 또는 Y45T임,
    d) E62 및 K64 둘 다, 여기서 E62 치환은 E62N이고, K64 치환은 K64S 또는 K64T임,
    e) L72 및 Q74 둘 다, 여기서 L72 치환은 L72N이고, Q74 치환은 Q74S 또는 Q74T임, 및
    f) E62, 여기서 E62 치환은 E62N, E62A, E62K, 또는 E62R임.
  7. 제4항에 있어서, IL-2 변이체가 위치 R38 및 L40에 치환을 포함하고, IL-2 변이체가 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에 치환을 추가로 포함하는 것인 제약 조성물:
    a) T41 및 K43 둘 다, 여기서 T41 치환은 T41N이고, K43 치환은 K43S 또는 K43T임,
    b) K43 및 Y45 둘 다, 여기서 K43 치환은 K43N이고, Y45 치환은 Y45S 또는 Y45T임,
    c) E62 및 K64 둘 다, 여기서 E62 치환은 E62N이고, K64 치환은 K64S 또는 K64T임,
    d) L72 및 Q74 둘 다, 여기서 L72 치환은 L72N이고, Q74 치환은 Q74S 또는 Q74T임, 및
    e) E62, 여기서 E62 치환은 E62N, E62A, E62K, 또는 E62R임.
  8. 제4항에 있어서, IL-2 변이체가 위치 T41 및 K43에 치환을 포함하고, IL-2 변이체가 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에 치환을 추가로 포함하는 것인 제약 조성물:
    a) E62 및 K64 둘 다, 여기서 E62 치환은 E62N이고, K64 치환은 K64S 또는 K64T임,
    b) L72 및 Q74 둘 다, 여기서 L72 치환은 L72N이고, Q74 치환은 Q74S 또는 Q74T임, 및
    c) E62, 여기서 E62 치환은 E62N, E62A, E62K, 또는 E62R임.
  9. 제4항에 있어서, IL-2 변이체가 위치 K43 및 Y45에 치환을 포함하고, IL-2 변이체가 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에 치환을 추가로 포함하는 것인 제약 조성물:
    a) E62 및 K64 둘 다, 여기서 E62 치환은 E62N이고, K64 치환은 K64S 또는 K64T임,
    b) L72 및 Q74 둘 다, 여기서 L72 치환은 L72N이고, Q74 치환은 Q74S 또는 Q74T임, 및
    c) E62, 여기서 E62 치환은 E62N, E62A, E62K, 또는 E62R임.
  10. 제4항에 있어서, IL-2 변이체가 위치 E62 및 K64에 치환을 포함하고, IL-2 변이체가 위치 L72 및 Q74에 치환을 추가로 포함하며, 여기서 L72 치환은 L72N이고, Q74 치환은 Q74S 또는 Q74T인 제약 조성물.
  11. 제4항에 있어서, IL-2 변이체가 위치 R38, L40, K43, 및 Y45에 치환을 포함하는 것인 제약 조성물.
  12. 제4항에 있어서, IL-2 변이체가 아미노산 치환 R38N, L40T, K43N, 및 Y45T를 포함하는 것인 제약 조성물.
  13. 제4항에 있어서, IL-2 변이체가 서열식별번호: 29 또는 서열식별번호: 31의 아미노산 서열을 포함하는 것인 제약 조성물.
  14. 제4항에 있어서, IL-2 변이체가 아미노산 위치 K43, Y45, L72, 및 Q74에 치환을 포함하는 것인 제약 조성물.
  15. 제4항에 있어서, IL-2 변이체가 아미노산 치환 K43N, Y45T, L72N, 및 Q74T를 포함하는 것인 제약 조성물.
  16. 제4항에 있어서, IL-2 변이체가 서열식별번호: 33 또는 서열식별번호: 35의 아미노산 서열을 포함하는 것인 제약 조성물.
  17. 제4항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, IL-2v 폴리펩티드-코딩 뉴클레오티드 서열이 조절성 프로모터에 작동가능하게 연결된 것인 제약 조성물.
  18. 제17항에 있어서, 조절성 프로모터가 테트라시클린 또는 테트라시클린 유사체 또는 유도체에 의해 조절되는 것인 제약 조성물.
  19. 제4항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, OV가 이종 티미딘 키나제 (TK) 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는 것인 제약 조성물.
  20. 제19항에 있어서, 이종 TK 폴리펩티드가 데옥시구아노신의 인산화를 촉매할 수 있는 것인 제약 조성물.
  21. 제19항에 있어서, 이종 TK 폴리펩티드가 변이체 단순 포진 바이러스 (HSV) TK 폴리펩티드인 제약 조성물.
  22. 제21항에 있어서, 변이체 HSV TK 폴리펩티드가 야생형 HSV TK와 적어도 80% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 서열식별번호: 1의 야생형 HSV TK 아미노산 서열의 아미노산 넘버링에 기반하여, L159, I160, F161, A168, 및 L169 중 하나 이상의 치환을 포함하는 것인 제약 조성물.
  23. 제22항에 있어서, 변이체 HSV TK 폴리펩티드가 A168H 치환을 포함하는 것인 제약 조성물.
  24. 제22항에 있어서, 변이체 HSV TK 폴리펩티드가 L159I 치환, I160L 치환, F161A 치환, A168Y 치환, 및 L169F 치환을 포함하는 것인 제약 조성물.
  25. 제22항에 있어서, 변이체 HSV TK 폴리펩티드가 L159I 치환, I160F 치환, F161L 치환, A168F 치환, 및 L169M 치환을 포함하는 것인 제약 조성물.
  26. 제22항에 있어서, 변이체 HSV TK 폴리펩티드가 서열식별번호: 26, 27, 또는 28의 아미노산 서열을 포함하는 것인 제약 조성물.
  27. 제4항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스가 K151E 치환을 포함하는 A34R 유전자를 포함하는 것인 제약 조성물.
  28. 제4항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스가 백시니아 티미딘 키나제를 결핍성이 되게 하는 변형을 포함하는 것인 제약 조성물.
  29. 제28항에 있어서, 백시니아 티미딘 키나제를 결핍성이 되게 하는 변형이 J2R 유전자의 전부 또는 일부의 결실인 제약 조성물.
  30. 제4항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스가 백시니아 바이러스인 제약 조성물.
  31. 제30항에 있어서, 백시니아 바이러스가 코펜하겐 균주인 제약 조성물.
  32. 제30항에 있어서, 백시니아 바이러스가 웨스턴 리저브 (WR) 균주인 제약 조성물.
  33. a) 재조합 종양용해성 백시니아 바이러스 (OV)로서, 그의 게놈에 (1) 서열식별번호: 29의 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인터류킨-2 (IL-2v) 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열; (2) 서열식별번호: 28의 아미노산 서열을 포함하는 이종 티미딘 키나제 (TK) 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열; 및 (3) A34R 유전자에 K151E 치환을 포함하며, 여기서 바이러스는 코펜하겐 균주 백시니아 바이러스이고, 백시니아 티미딘 키나제 결핍성인 OV; 및 b) 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물.
  34. 제4항 또는 제33항에 있어서, 암을 갖는 개체에서 암을 치료하기 위한 제약 조성물.
  35. 제34항에 있어서, 암이 뇌암, 두경부암, 식도암, 피부암, 폐암, 흉선암, 위암, 결장암, 간암, 난소암, 자궁암, 방광암, 고환암, 직장암, 유방암, 또는 췌장암인 제약 조성물.
  36. 제34항에 있어서, 암이 결장직장 선암종, 비소세포 폐 암종, 또는 삼중-음성 유방암인 제약 조성물.
  37. 제34항에 있어서, 암이 재발성인 제약 조성물.
  38. 제34항에 있어서, 암이 원발성 종양인 제약 조성물.
  39. 제34항에 있어서, 암이 전이성인 제약 조성물.
  40. 제34항에 있어서, 제2 암 요법을 추가로 포함하는 제약 조성물.
  41. 제40항에 있어서, 제2 암 요법이 화학요법, 생물학적 요법, 방사선요법, 면역요법, 호르몬 요법, 항-혈관 요법, 냉동요법, 독소 요법, 종양용해성 바이러스 요법, 세포 요법, 및 수술로부터 선택되는 것인 제약 조성물.
  42. 제40항에 있어서, 제2 암 요법이 항-PD1 항체 또는 항-PD-L1 항체를 포함하는 것인 제약 조성물.
  43. 제34항에 있어서, 개체가 면역손상된 것인 제약 조성물.
  44. 제34항에 있어서, 종양내로, 종양주위로, 동맥내로, 방광내 투여의 경로를 통해, 경막내로, 또는 정맥내로 투여되는 제약 조성물.
  45. 제19항에 있어서, 종양용해성 바이러스의 유해 부작용을 감소시키는데 유효한 양으로 2'-데옥시-구아노신의 합성 유사체를 추가로 포함하는, 개체에서 암을 치료하기 위한 제약 조성물.
  46. 제45항에 있어서, 2'-데옥시-구아노신의 합성 유사체가 아시클로비르, 팜시클로비르, 간시클로비르, 발라시클로비르, 및 발간시클로비르로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 제약 조성물.
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