KR20230091917A - 3d 인쇄용 콜라겐 잉크 - Google Patents

Abstract

본 발명은 3D 인쇄용 콜라겐 잉크에 관한 것이다. 본 발명은 또한 잉크를 얻는 방법 및 그에 주어진 용도에 관한 것이다.

Description

3D 인쇄용 콜라겐 잉크

본 발명은 3D 인쇄용 콜라겐 잉크에 관한 것이다. 본 발명은 또한 잉크를 얻는 방법 및 그에 주어진 용도에 관한 것이다.

3D 인쇄는 재생 의학 및 생물학적 연구에 서비스를 제공하기 위해 생물학적 구조물이 얻어지는 생물학 및 의학 분야에서 널리 사용되는 기술이다.

3D 인쇄에 사용되는 잉크는 예를 들어, 점성, 탄성, 다공성 및 견고성(firmness)에서 충분한 물리적 특성을 가져야 하지만, 이는 또한 조직 발달(tissue development)과 같은 다양한 응용 분야와 호환되어야 하며, 따라서 잉크는 이를 위해 충분한 생물학적 특징을 갖춰야 한다. 잉크는 프린터 노즐을 통한 압출을 용이하게 할 수 있도록 충분히 유동적이어야 하며 인쇄된 구조물은 생리적 pH에서 시간 경과시에도 그대로 유지되어야 한다.

생물학적 응용 분야를 위한 잉크에 사용되는 재료의 예는 알지네이트, 피브린 및 콜라겐이다.

콜라겐은 자연에서 가장 풍부한 단백질 중 하나이며 조직의 구조적 완전성(structural integrity)을 유지하는 역할을 한다. 콜라겐은 세포외 매트릭스에서 가장 풍부한 성분이기 때문에 세포 응용 분야에서 가장 많이 사용되는 재료이며; 이 재료는 예를 들어 세포 성장을 돕기 위한 지지 매트릭스로 사용된다. 콜라겐 섬유는 세포가 부착하고 증식할 수 있도록 하는 특정한 아미노산 서열을 갖는다. 콜라겐 매트릭스는 매우 유용하며 몇 가지 중요한 생물학적 발전이 이루어졌으나; 최적의 100% 콜라겐 매트릭스는 개발되지 않았다. 콜라겐만으로 구성된 조성물은 가용성 콜라겐으로 제조되며 일반적으로 가교제의 도움 없이 인쇄된 구조물의 완전성을 유지하는 잉크로 사용되기에 충분한 일관성(consistency)과 견고성을 갖지 않거나 천연의(native) 구성을 갖지 않는다.

콜라겐의 경우, 잉크로 사용하기에 충분한 점도와 견고성을 갖도록, 하이드로겔 형태로 제시될 수 있다. 이에 대한 예는 피부 조직(dermal tissue)의 성장을 위한 매트릭스의 3D 인쇄를 위한 생물학적 하이드로겔을 기술하는 공개 번호 CN106581753의 특허에서 찾아볼 수 있다. 하이드로겔은 1%-15% 나노결정성 셀룰로스, 65%-98% 콜라겐 및 0.01%-20% 가교제를 포함한다. 이러한 유형의 하이드로겔은 잉크로 사용하기에 적절한 점도를 갖지만, 이들이 기능을 수행할 수 있도록 콜라겐에 가교제가 첨가되지 않으면, 이로 얻어지는 구조물은 완전성(integrity)을 잃는다.

콜라겐에 생물학적 응용 분야에서 3D 인쇄 잉크로 사용되는 데 필요한 특징을 부여하기 위해, 콜라겐을 기능화하는 전략이 사용되어왔다. 공개 번호 CN106237383의 특허는 세포 성장 및 분화를 촉진하는 성장 인자를 갖는 기능화된 콜라겐 마이크로필라멘트를 기술하는 예이다. 이 경우, 섬유의 분류 및 사전 선택도 이루어지며, 매우 작은 크기의 섬유를 얻고, 압출 헤드의 바늘의 직경보다 작도록 상기 크기를 조정하며(예를 들어, 27G 바늘(needle)은 내경이 210㎛이다), SDS 및 트리톤(triton)과 같은 계면활성제로 추출한 가용성 콜라겐을 기반으로 하며 또한 최적의 결과를 얻기 위해 다른 분자로 개질된다. 또한, 달성된 잉크의 견고성 또는 레올로지 데이터(rheological data), 또는 잉크의 인쇄 가능성 또는 얻어진 구조물의 완전성을 나타내고 있지 않다. 상기 특허에서, 100, 75, 38 및 최대 25㎛의 섬유가 선택된다.

3D 인쇄용 콜라겐 매트릭스 제조에 사용되는 다른 전략은 영하(sub-zero)의 온도에서 저점도 콜라겐 용액이 디포지션(deposition)되도록 하는 극저온 인쇄(cryogenic printing) 및 원위치(in situ)에서 가교를 수행하는 것이다.

현재 콜라겐 처리에 적용되는 추출 및 정제 방법은 이의 가교 밀도를 현저하게 감소시키며 결과적으로 관련 특성 및 생물학적 반응에 영향을 미친다.

따라서, 최신 기술을 기반으로, 가교제의 도움 없이, 3D 인쇄에서 잉크로 사용하기에 충분한 일관성과 견고성을 가지고 변성되지 않은, 피브릴라 콜라겐(fibrillar collagen) 기반의 잉크 개발이 필요하다.

콜라겐은 포유류의 피부, 뼈, 연골 및 힘줄과 같은 결합 조직의 세포외 매트릭스 내에서 가장 풍부한 단백질이며 이들의 건조 중량의 90% 초과를 차지한다.

콜라겐의 필수 단위는 트로포콜라겐(tropocollagen)이라는 거대분자 단위를 구성하는, 삼중 나선(triple helix)을 형성하는 얽혀(intertwined) 있는 것으로 보이는 3개의 폴리펩타이드 사슬로 구성된다. 트로포콜라겐 분자 그룹은 함께 콜라겐 섬유를 형성한다.

본 발명에서, 3D 프린터에 사용하기에 적합한 점도를 가지면서 콜라겐을 이의 천연 상태(native state)로 유지하는 3D 인쇄용 콜라겐 잉크를 개발하였다. 본 발명의 잉크는 산성 수성 매질 중의 천연 콜라겐 섬유의 분산물(dispersion)인 것을 특징으로 한다.

산성 매질(acidic medium)은 콜라겐이 물을 흡수할 수 있도록 하며 그 결과 압출 가능한 유체(fluid)가 되도록 한다.

따라서, 본 발명의 제1 측면은 0.5 내지 5의 pH에서 0.1% 내지 10%의 중량의 농도로 산성 매질(acid medium) 중의 천연 콜라겐 섬유의 분산물을 포함하는 3D 인쇄용 콜라겐 잉크에 관한 것으로, 콜라겐 잉크는 10 cP(centipoise) 내지 50 McP (million centipoise)의 점도(18℃ 내지 22℃의 온도에서 브룩필드 방법(Brookfield method))를 가지며 상기 섬유 분산물은, 1 내지 2의 pH에서 측정된, 섬유의 길이가 1 ㎛ 내지 2500 ㎛ 범위이고 섬유의 직경이 0.1 ㎛ 내지 180 ㎛ 범위인 섬유를 포함한다.

본 발명의 잉크에서 섬유는 광범위한 길이 및 직경을 가지며 잉크의 작은 크기 섬유를 얻고 선택하기 위해 분류가 필요하지 않다. 상기 잉크는, 잉크가 큰 섬유를, 길이가 1mm보다 크고 직경이 프린터의 압출 헤드의 내부 직경보다 클 수 있는(예를 들어, 22G = 152㎛) 섬유를 이의 매스(mass)의 높은 백분율로 가질 수 있더라도, 인쇄될 수 있다.

본 발명의 콜라겐 섬유는 변성되지 않고 삼중 나선 분자 구조를 유지한다. 섬유는 주로 5㎛ 내지 35㎛의 직경을 가지며, 물을 흡수하고 팽창(swell)할 수 있지만, 상기 섬유는 변성 및 가수 분해의 경우는 없다.

상기한 바와 같이, 콜라겐 분자는, 수소 가교 결합(hydrogen bridge bonding) 또는 상호 작용에 의해 안정화된 삼중 나선을 구성하는, 함께 꼬인(twisted) 세 개의 폴리펩타이드 사슬로 구성된 가늘고 긴(elongated) 분자이며, 이것이 천연 콜라겐의 구조이다. 콜라겐이, 예를 들어 물의 존재에서 이를 가열하거나 극도의 pH 값으로 이를 가열하여 변성되면, 이러한 사슬이 분리되고 용해되어 젤라틴을 형성한다. 젤라틴의 형성은 콜라겐 삼중 나선을 안정화시키는 수소결합의 파괴에 기인하며, 콜라겐이 젤라틴으로 변형되는 과정은 전형적인 변성 과정으로 여겨진다. 본원의 콜라겐 섬유의 분산물에는 젤라틴이 없거나 그 존재가 현저하지 않다.

본 설명에서, "천연 콜라겐(native collagen)"은 완전히 또는 현저하게 변성, 가수분해 또는 젤라틴화되지 않은 콜라겐을 의미하는 것으로 이해된다.

본 발명의 잉크는, 일반적으로 천연의 구조(native structure)를 보존하면서, 올바른 3D 인쇄에 적합한 레올로지 특성을 가진 유체로 조제되도록 하는 더 작은 직경과 길이의 섬유로의 분해(disintegration)를 유발하는 처리를 거친 큰 다발 및/또는 피브릴라 집합체(fibrillar aggregate)로 구성되는, 콜라겐의 생물학적 공급원으로부터 얻어지는, 최적화된 크기의 천연 피브릴라 콜라겐(native fibrillar collagen)의 산성 매질 중의 분산물의 형태로 제공된다.

3D 인쇄에 의해 본 발명의 잉크로 얻어지는 구조는, 가교제를 사용할 필요 없이 천연의, 불용성 섬유상 콜라겐의 안정하고 내성(resistant)이 있는 구조이다.

자연 환경에서 콜라겐은 구조 및 지지 단백질일 뿐만 아니라, 특히 다른 생체 분자와 상호 작용하고, 세포 부착을 중재하며 세포 기능을 안내하기 때문에, 잉크가 천연 콜라겐을 포함하는 것이 중요하다. 본 발명의 잉크가 이의 천연의 구조를 보존하는 한, 잉크가 생체 의학(biomedical) 응용 분야를 위한 인쇄에 사용될 때, 이의 생리적 기능과 관련하여 그 특징을 유지할 수 있을 것이다.

마찬가지로, 본 발명은 본 발명의 제1 측면 및 하기 기술된 구현예에 기술된 잉크를 포함하는 임의의 하이드로겔에 관한 것이다.

본 발명의 제2 측면은 다음 단계를 포함하는 콜라겐 잉크를 얻는 방법이다:

a) 콜라겐-함유 조직을 세척 및 절단하는 단계(chopping);

b) 절단된 조직을 화학적으로 매서레이팅하는 단계(macerating);

c) 단계 b)에서 얻어진 생성물을 물로 세척하는 단계;

d) c)에서 얻어진 부산물의 pH를 0.5 내지 5의 값으로 조정하여 단계 c)의 부산물을 팽창시키는 단계:

e) 단계 d)의 생성물을 기계적으로 민싱하는 단계(mincing);

f) 물에 바람직하게는 0.1% 내지 10%의 중량의 농도로 분산하는 단계.

콜라겐 매트릭스는 낮은 면역원성(immunogenicity), 우수한 생체 적합성 및 생분해성(biodegradability)을 가지며, 특히 다른 생체 분자와 상호 작용하고, 세포 모폴로지(cell morphology), 부착(adhesion), 이동 및 분화의 조절을 중재하는 특정한 서열을 포함한다. 본 발명의 잉크는 3D 인쇄 노즐을 통과하기에 적절한 점도를 갖는다.

따라서, 본 발명의 제3 측면은 3D 인쇄에서의 본 발명의 잉크의 용도에 관한 것이다. 또한, 본 발명에는 상기한 그리고 이의 임의의 구현예에 기재된 잉크로 인쇄하는 방법이 기술되어 있다.

본 발명의 제4 측면은 본 발명의 잉크를 포함하는 구조물(structure)에 관한 것이다. 이 구조물의 유리한 점 중 하나는 생체 적합성과 흡수성(resorbable)이 높다는 것이다.

도 1은 세포 배양을 위한 생분해성 스캐폴드로서 본 발명의 잉크로 인쇄된 메쉬를 나타낸다.
도 2는 2일에 얻어진 배양물의 2일 후에 도 1의 메쉬에서 뮤린 배아 세포 섬유아세포와 메쉬의 배양을 나타낸다(10X).
도 3은 5일째 배양을 나타낸다.
도 4는 발달(development)의 6일째의 배양을 나타낸다.
도 5는 샘플 531-010, 531-020의 응력 스윕 플롯(stress sweep plot)을 나타낸다.
도 6은 샘플 431-010, 431-020의 응력 스윕 플롯을 나타낸다.
도 7은 본 발명의 잉크로 인쇄된 구조물을 나타낸다.
도 8A-8F는 잉크로 제조된 다른 구조물을 나타낸다. 도 8B, 431-010 및 8F는 중화하고 생리적 pH(pH 7.4)로 조정한 후의 구조물 A, C 및 E에 해당한다.
도 9a 및 9b는 0.1%로 희석되고 시리우스 레드(Sirius Red)로 착색된 본 발명의 잉크 531-010의 개별 입자의 광학 현미경 이미지를 나타낸다.
도 10은 실시예 8의 잉크로 인쇄된 구성요소(element)를 나타낸다.

위에서 언급한 바와 같이, 본 발명의 제1 측면은 0.5 내지 5의 pH에서 0.1% 내지 10%의 농도로 산성 매질 중의 천연 콜라겐 섬유의 분산물을 포함하는 3D 인쇄용 콜라겐 잉크에 관한 것으로, 콜라겐 잉크는 10 cP 내지 50 McP의 점도(실시예 3에 기재된 브룩필드 방법에 따름 및 18℃ 내지 22℃의 온도에서)를 가지며, 상기 섬유 분산물은, 1 내지 2의 pH에서 측정된, 섬유의 길이가 1㎛ 내지 2500㎛ 범위이고 섬유의 직경이 0.1㎛ 내지 180㎛ 범위인 섬유를 포함한다.

바람직하게는 분산물 중의 콜라겐 섬유의 매스(mass)의 90%는 섬유의 길이가 50㎛ 내지 2500㎛ 범위인 섬유를 포함한다.

바람직하게는 분산물 중의 콜라겐 섬유의 매스의 75%는 섬유의 길이가 50㎛ 내지 1000㎛ 범위인 섬유를 그리고 50%는 100㎛ 내지 500㎛ 범위인 섬유를 포함한다.

바람직하게는 콜라겐 섬유의 매스의 80%는 섬유의 직경이 5㎛ 내지 35㎛인 섬유를 포함한다.

바람직하게는 농도는 1% 내지 5%이다.

바람직하게는, pH는 pH 1 내지 3이다.

바람직하게는 점도는 2 McP 내지 15 McP이다.

본 발명의 콜라겐 매트릭스의 특징은 이를 생리적 pH로 중화한 후의 이의 완전성(integrity)이다.

본 발명의 콜라겐 매트릭스의 특징은 이를 생리적 pH로 중화한 후의 이의 완전성이다. 본 발명의 잉크의 가능한 응용 분야 중에는 세포 및 조직 배양을 위한 매트릭스의 인쇄가 있다. 이 경우에, 콜라겐이 천연(native)인 것은 이러한 방식에서 콜라겐의 원래 구조와 더 유사하여, 체내에서 세포 증식이 일어나는 원래 환경을 더 유사하게 복제(replicating)하기 때문에 매우 유리하다. 놀랍게도, 얻어진 구조물 또는 매트릭스는 생리적 pH에서 시간 경과에 따라 온전하고 견고하게 유지되기에 충분히 단단하다. 바람직하게는, 이들 응용 분야에 사용되는 잉크는 1 내지 3의 pH에서 2% 내지 5% 농도로 산성 매질 중의 천연 콜라겐 섬유의 분산물을 포함한다.

이전 단락에 기술된 잉크의 바람직한 용도는 세포 및 조직의 배양을 위한 매트릭스의 구축이다.

전술한 바와 같이, 본 발명의 제2 측면은 다음 단계를 포함하는 콜라겐-함유 조직으로부터 본 발명의 잉크를 얻는 방법에 관한 것이다:

a) 콜라겐-함유 조직을 세척 및 절단하는 단계;

b) 절단된 조직을 화학적으로 매서레이팅하는 단계;

c) 단계 b)에서 얻어진 생성물을 물로 세척하는 단계;

d) c)에서 얻어진 부산물의 pH를 0.5 내지 5의 값으로 조정하여 단계 c)의 부산물을 팽창시키는 단계:

e) 단계 d)의 생성물을 기계적으로 민싱하는 단계;

f) 물에 바람직하게는 0.1% 내지 10%의 농도로 분산하는 단계.

바람직하게는 콜라겐-함유 조직은 결합 조직이다. 결합 조직은 바람직하게는 진피(dermis), 뼈, 힘줄, 연골, 장(intestine)으로부터 선택된다. 바람직하게는 결합 조직은 진피 조직이고 보다 바람직하게는 콜라겐은 코리움(corium, 진피)으로 불리는 층으로부터 추출된다.

결합 조직의 기원은, 임의의 동물성 공급원에서 나올 수 있다. 특정 구현예에서, 결합 조직은 소, 양, 돼지, 조류, 어류 기원 또는 이들의 혼합물이다. 바람직하게는, 결합 조직은 소 기원이고 연령이 1년을 초과하는 동물의 것이다. 바람직하게는 1년 내지 3년이다.

보다 바람직하게는 단계 a) 전에 결합 조직이 진피(dermis)일 때, 제모 및 표백(bleach)한다. 약한 산화제를 사용한 표백 단계(bleaching stage)는 바람직하게는 세척 단계 a)에 추가하여 수행된다. 약한 산화제의 예는 묽은 과산화수소이다.

단계 b)는 바람직하게는 알칼리제(alkaline agent), 예를 들어 수산화칼슘, 수산화나트륨의 존재에서, 효소의 존재 또는 부재에서 수행된다. 특히, 단계 b)는 황염(sulfur salt) 및 알칼리성 처리, 예컨대 Na₂S 및 Ca(OH)₂로 수행된다.

바람직하게는 단계 d)에서 산성화하기 위해 사용되는 산은 염산, 젖산(lactic acid), 아세트산, 시트르산으로부터 선택된다. 바람직하게는 1 내지 3의 pH로 산성화된다.

바람직하게는 섬유상 콜라겐의 수성 분산물을 제조하기 위한 단계 f)는 1% 내지 5%의 농도로 수행된다. 보다 바람직하게는 2% 내지 5%이다.

특히, 단계 f)에서 얻어진 분산물이, 고압, 바람직하게는 50기압(atmosphere)의 최소 압력에서 분산물을 슬릿을 통과시켜 분산물에 전단력을 가하는 것으로 구성되는 기계적 균질화 공정(homogenization process)을 거치는 것이 바람직하다. 바람직하게는 50 atm 내지 100 atm이다.

실시예 3과 도 5 및 6에, 균질화 공정이 본 발명의 잉크의 레올로지(rheology) 변화를 야기함을 나타낸다. 균질화된 매스(mass)는 이의 구조를 잃지 않고 더 많은 시도(effort)를 견딜 수 있다. 콜라겐 매스(mass)의 탄성 모듈러스(G') 값은, 비균질화된 매스의 경우보다, 더 큰 변형력이 적용될 때 일정하게 유지된다.

본 발명은 또한 본 발명의 방법 및 이전 단락에 기술된 모든 구현예에 의해 얻어진 생성물에 관한 것이다.

본 발명의 잉크로 인쇄하는 방법은 상이한 구현예를 갖는다.

인쇄 방법의 일 구현예에서, 잉크는 구체적으로 성상세포(astrocytes), 배아 심근세포(embryonic cardiomyocytes), 태아 심근세포, 신생아 심근세포, 심근세포, 배아 심실 근육세포(embryonic ventricular myocytes), 각막 내피 세포, 각막 상피 세포, 홍채 색소 상피 세포, 망막 색소 상피 세포, 태아 도파민 신경 세포(fetal dopamine neuronal cells), 태아 신피질 신경 세포(fetal neocortical neuronal cells), 장 신경 세포, 간세포, 지방 조직 중간엽 줄기 세포(adipose tissue mesenchymal stem cells), 골수 중간엽 줄기 세포, 골아세포(osteoblasts), 연골 세포(chondrocytes), 췌장 세포, 요로상피 세포(urothelial cells)로부터 선택된 세포와 혼합된다.

인쇄 방법의 또 다른 구현예에서, 인쇄하기 전에, 잉크는 바람직하게는 7 내지 8의 pH로 중화되며, 특히 인산염 버퍼 식염수(phosphate buffer saline)(1X 및 10X PBS), 트리신(Tricine), MOPS(3-(n-모르폴리노)프로판술폰산), HEPES(4-2(하이드록시에틸)피페라진-1-일에탄술폰산), 트리스(tris), 탄산나트륨으로부터 선택된 염 또는 버퍼로 중화된다.

실시예

하기 실시예는 단지 본 발명을 예시하는 것일 뿐이며, 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.

실시예 1

본 발명의 잉크를 제조하기 위해, 표준 제모 공정(예, Na₂S와 같은 황염으로)을 거친 18-26개월 된 소의 피부가 사용된다.

다음으로, 피부를 분할하고 콜라겐이 얻어지는 진피(dermis)를 추출한다.

물로 여러 번 세척하고 순한 산화제(예를 들어, 묽은 과산화수소)로 표백한 후, 재료가 이의 충분한 매서레이션을 위해 필요로 하는 시간과 온도 조건 하에서 재료에 수산화칼슘을 채운다. 그 후, 남은 시약(reagent)은 다시 물로 세척하고 진한 HCl(33%)로 산성화한다. 이를 분쇄기의 도움으로 민싱하고 2.9%의 콜라겐으로 물 중에서의 콜라겐 분산물을 얻을 때까지 물로 희석한다. 그 결과 pH는 3.1이다.

실시예 2

세포 배양을 위한 기질로서 스캐폴드를 얻기 위해, 실시예 1의 분산물, 메쉬 형태의 매트릭스(5X2.5cm 및 1.2mm 공극(pore) 크기)가 10cm 페트리 접시에서 24G 노즐 니들 압출 헤드를 사용하여 3mm/s의 속도로 3D 프린터로 인쇄되었다.

메쉬가 인쇄되면, 이를 메쉬를 덮도록 50mM NaOH에 침지하여 pH를 높여 콜라겐이 응고되도록 하였다. 응고되면, 이를 메쉬를 덮기에 충분한 양으로 pH 7.4의 인산 버퍼 용액(PBS)으로 세척한 후 항생제가 풍부한 배양 배지에 담갔다. 본 발명의 이러한 분산물은 가교제를 첨가하지 않고 인쇄되고 실온에서 응고된다는 점에 유의해야 한다.

뮤린 배아 세포 섬유아세포(Murine embryonic cell fibroblasts)를 메쉬 상에서 성장시켰다. 총 300,000개의 세포를 재현탁(resuspend)시켰다.

도 2는 2일 후에 얻어진 섬유아세포와 메쉬의 배양을 나타낸다. 도 3에 5일째 배양(culture)을 나타낸다. 배양 플레이트는 100% 컨플루언스(confluence)에 있고 택티즘(tactisms)과 상기 재료를 가진 세포의 지시된 성장이 관찰되기 시작한다. 도 4는 발달 6일째의 배양을 나타낸다. 일부 세포는 메쉬의 콜라겐 섬유 방향으로 성장한다.

실시예 3 잉크 레올로지

이를 위해, 20mm 플레이트-플레이트 로터가 장착된 제어된 응력 레오미터 "Modulate Advanced Rheometer System" MARS 40(Thermo Haake)가 사용되었다. 진동 응력 스윕 테스트(oscillatory stress sweep test)는 15.0℃의 측정 온도에서 플레이트 사이의 간격을 0.8 mm로 유지하면서, 1Hz의 고정 주파수에서 응력 범위(

) 1 Pa 내지 15000 Pa에서 수행되었다. 테스트 전에, 측정 온도를 보장하기 위해, 0.8mm 간격에 도달하면 플레이트 사이에서 10분 동안, 샘플이 템퍼(temper)되도록 하였다.

고정 주파수에서의 응력 스윕은 선형 점탄성(linear viscoelasticity) 구역을 식별할 수 있게 한다.

선형 점탄성 구역에서의 진동 측정은 재료의 응답이 구조에만 의존하고 응력 또는 변형과 같은 레올로지 매개변수(rheological parameter)와 무관하기 때문에 매우 중요하다.

테스트 중에, G' 및 G'' 값(세로축)은 응력(가로축)의 함수로 표시된다. 크로스오버, LVR 및 유동 한계(flow limit) 값은 응력, 즉 가로축에 해당한다.

탄성 또는 저장 모듈러스(G')는 재료에 저장된 에너지와 연관되는 반면 점성 또는 손실 모듈러스(G'')는 재료에 의해 소실되는(dissipated) 에너지와 연관된다.

크로스오버는 G'와 G''가 동일한 지점이다. 이는 G'와 G''의 곡선이 교차하는 진동 전단 응력의 값과 일치하며, 따라서 이는 매스(mass)가 탄성 재료로서의 거동을 멈추고 점성 유체로 거동하기 시작하는 응력값이다.

균질화된 매스의 크로스오버 값(crossover value)은 희석된 것의 크로스오버 값보다 약 40% 더 높으며, 이는 매스가 더 높은 응력에서 이의 탄성 거동을 유지하며, 따라서 이의 구조를 잃지 않고 더 많은 응력을 견딜 수 있음을 의미한다.

응력 스윕을 통해 재료의 항복점(yield point)을 결정할 수 있다. 탄성 모듈러스 값은 재료가 흐르지 않는 동안 일정하게 유지되지만(고체 거동) 재료가 흐르기(flow) 시작하면 이의 값이 감소한다. 재료가 흐르기 시작하는 탄성 모듈러스의 값이 흐름 한계(Flow Limit)이며 매스가 영구 변형을 받기 시작하는 지점을 나타낸다. 그 지점까지는, 매스가 겪는 변형이 회복 가능하였으며, 따라서 G'와 G''의 값이 일정했지만, 유동 한계부터 매스는 이의 탄성 성분을 잃기 시작하고 점성 성분이 증가하며, 이는 이들이 동일해지고 점성 유체 같이 거동하기 시작하는 크로스오버일 때까지 계속된다. 도 5 및 6은 샘플 531-010, 531-020 및 431-010, 431-020에 대한 응력 스윕 그래프를 나타낸다.

샘플 531-010 및 431-010은 실시예 1과 동일하지만 콜라겐 농도가 4.8±0.1%이다. 샘플 H(431-020 및 531-020)의 경우, 이들은 동일한 분산물이지만, 기본적으로 매스(mass)를 피스톤의 도움으로 그리고 50 내지 300 기압 사이의 압력에서 슬릿에 통과시키는 것으로 구성된 산업용 균질화기에서 고압 균질화 공정을 거친 후의 것이다.

희석되고 균질화된 매스 531-020 및 431-020은 희석된 비균질화된 매스 531-010 및 431-010 보다 더 높은 흐름 한계를 가지며, 따라서 그들의 탄성 성분을 온전하게 그리고 궁극적으로는 이의 구조적 특성을 유지하면서 더 큰 응력이 가하여 질 수 있다.

천연 콜라겐의 분해 및 가수분해 정도를 정량화하는 빠른 방법은 18,000rpm에서 원심분리한 후 10% 황산암모늄에서 가용성 분획을 결정하는 것이다. 이어서, 상기 분획에서의 콜라겐 단백질 함량을 Biuret 방법으로 정량하고, 그 결과를 이전에 Biuret 방법을 사용하여 정량한 콜라겐의 백분율에 대한 백분율로 나타낸다. 상기 분획은 특히 변질된(deteriorated) 콜라겐에서 나타난다.

이어서, 상기 분획에서의 콜라겐 단백질 함량을 Biuret 방법으로 정량하고 그 결과를 백분율로 나타낸다(표 2).

본 발명의 분산물의 점도를 측정하였다.

본 발명의 잉크의 점도는 브룩필드(Brookfield) 점도계 모델 DV2T HBT(Brookfield Ametek)를 사용하여 결정되었다. 점도는 선택된 스핀들 및 회전 속도를 기준으로 측정된 토크에서 계산된다.

이 방법에 사용되는 스핀들은 역(inverted) T의 스핀들이다. (T-Bar Spindle이 있는 헬리패스(Helipath)). 다음은 해당 점도계 모델에 대해 각 스핀들로 측정한 점도 범위이다.

다른 스핀들은 더 낮은 점도 범위, 2% 이하의 콜라겐 농도인 매스에 사용된다:

장치는 사용하는 스핀들 및 회전속도를 표시하여 자체적으로 점도(cP)로 전환하도록 구성된다.

이를 위해, 매스를 250ml 비이커에 넣었다. 매스의 온도는 18℃ 내지 22℃에 포함된 범위에 있었다. 해당 스핀들은 매스의 예상 점도에 따라 사용되었다. 따라서, 94는 균질화된 매스(531-020)에 사용되었고, 95는 비균질화된 매스(531-010)에 사용되었다. 회전 속도는 1.0RPM이었고 4분 동안 250회 측정하였다.

점도 측정은 균질화 후 현저하게 감소하여, 531-010 및 531-020에 대해 각각 23.3 및 6.5 McP였다(표 1). 이러한 점도 감소는 잉크의 인쇄 가능성을 매우 용이하게 하고 프린터로 잉크를 인쇄하는 데 필요한 압력을 감소시킨다.

실시예 4. 잉크에 대한 pH의 영향

이 경우, 본 발명의 잉크와 본 발명의 중화된 잉크의 거동을 비교하였다. 생리적 pH로 중화한 후 재료의 구조 및 견고성을 유지하고 인쇄될 3D 구조물의 구조(structure) 및 형상이, 이들이 세포 성장을 위한 지지체로 사용되는 생체 의학 응용 분야에서 사용하는 데 필요한 생리적 조건 하에서 충분히 견고하게 유지되고 안정적으로 유지되도록 하는 것을 보장하는 것이 중요하다. 하기 표(표 3)에서 도출된 바와 같이, 탄성 모듈러스의 감소에도 불구하고, 중화된 재료(531-010 Neutral 및 531-020 Neutral)의 G' 값은 높게 유지된다. 따라서, 상기 재료는 다른 염기를 사용하여 생리적 pH로 중화하고 PBS, 칼슘이 풍부한 Hank 용액(HBSS-Ca) 또는 등가물과 같은 세포 배양 배지와 유사한 배지에 넣은 후, 시간 경과에 대하여 충분히 견고하게 유지된다.

레올로지 분석(rheological analysis)은, 0.01Hz 내지 100Hz 범위의 주파수 스윕을 만들고 0.8mm의 플레이트 사이의 간격으로, 15℃의 측정 온도로 하여, 100Pa의 고정 응력에서의 진동 테스트로 구성된 주파수 스윕에 의해 수행되었다. 다음 표에, 0.1Hz의 주파수(frequency)에 대해 얻어진 값이 표시되어 있으며, 여기서 콜라겐 농도가 4.8%인 실시예 3의 본 발명 재료의 안정성은, NaOH(0.05M)로 생리적 pH로 중화하고 PBS에서 균형(balancing)을 맞춘 후, 매우 높은 탄성 모듈러스(G')를 유지하는 것이 관찰될 수 있다:

동일한 방식으로, 중화된 재료의 시간 경과에 따른 안정성을 측정하였다. 이를 위해, 실시예 3의 본 발명의 겔(gel)로서 제조된 또 다른 배치(배치 6)를 NH₄OH(0.25%) 또는 NaOH(0.05M)로 중화하고 HBSS-Ca로 생리적 pH로 조정하였다. 약 0.3g의 샘플 량을 취하고 이를 덮도록 중화제(neutralizing agent)를 첨가하였다.

다음 표에서, 재료가, 일단 NaOH로 중화되고 생리적 pH에서 PBS로 세척 및 평형화된 후, 초기 강하(drop)에도 불구하고 시간 경과에 따라 높고 안정적인 탄성 모듈러스를 유지한다는 것을 알 수 있으며, 이는 세포 배양에 사용되는 것과 동등한 생리적 조건(37℃ 및 pH 7.4)에서 이의 구조가 유지됨을 확인하는 것이다. 수산화 암모늄과 같은 다른 염기 및 HBSS-Ca와 같은 다른 균형 매질(balancing media)로 유사한 관찰이 얻어지며, 이는 일반적인 배양 배지에서 안정적인 구조물 형상의 유지를 확인하는 것이다:

실시예 5. 실시예 3의 잉크로 인쇄

장비의 압력을 알맞게 조정(550kPa)하고 22G 노즐 니들 압출 헤드를 사용하여 2mm/초의 압출 속도로 인쇄하였다. 불용성 콜라겐 섬유가 포함된 잉크임에도 불구하고, 도 7에서 볼 수 있듯이 구조물의 연속성이 인정되었다.

실시예 6. 본 발명의 잉크의 인쇄성.

도 8A-8F는 3D 프린터의 압력을 알맞게 조정함으로써 5mm/초의 압출 속도로 실시예 3의 잉크로 얻어진 구조의 예를 나타낸다. 구조물의 연속성이 인정되었다.

도 8E-F는 다층 3D 구조물에 해당한다.

도 8B, 8D, 8F는 왼쪽의 동일한 구조(structure)에 해당하며, 일단 50mM NaOH로 중화되고 PBS로, 최적의 세포 증식에 적합한 pH인, 생리적 pH인, pH 7.4로 조정되었다. 모든 경우에, 구조의 완전성이 유지되고 이전에 나타낸 것과 같은 응용 분야에 대한 이의 조작이 허용된다.

상기 본 발명의 잉크가 1% 미만의 농도로 제조되었을 때, 1% 콜라겐을 포함하는 잉크에 대해, 6,000cP의 점도 값을 갖는, 구조물의 견고성의 큰 감소가 관찰되었다. 따라서, 이러한 조건은 구조물 또는 매트릭스가 중화되는 경우 최적이 아니지만, 상기 잉크는 인쇄된 구조가 중화를 필요로 하지 경우에 유용할 수 있다.

잉크의 pH를 과도하게 낮추면 비슷한 현상이 나타나는데, 잉크의 pH가 0.6일 때 531-020 잉크의 탄성이 감소하여, G'의 값이 3900 Pa로, 그리고 점도가 3.14 McP로 낮아졌다. 인쇄 후, 중화 공정 중에 구조물은 이의 견고성을 잃었다.

제조 공정의 단계 d)의 산성화 동안 염산, 젖산 또는 아세트산을 사용하여 앞서 언급한 pH 및 농도 값에서 중화 후 구조물의 완전성을 유지하는 완벽하게 인쇄 가능한 잉크가 생성되었다.

실시예 7. 모폴로지 분석

모폴로지 분석(morphological analysis)은 실시예 3의 잉크 531-010 및 531-020의 동적 이미지 분석에 의해 수행되었다. 이를 위해, 잉크를 탈이온수에서 약 1%로 희석하고 1M HCl로 대략 pH 1.5로 조정하였다. 희석된 샘플을 2500rpm에서 10분 동안 볼텍싱(vortexed)하고 탈이온수로 1/20 희석하였다.

측정은 4-2888μm의 입자 크기 측정 범위에서 연속 흐름 트레이(폭 0.5mm)가 있는 Sympatec QICPIC/Lixell 입자 분석기에서 수행되었다. 콜라겐 현탁액(collagen suspension)의 전형적인, 입자 분포의 큰 이질성으로 인해, 두 개의 하위 샘플에 대해 최소 3회의 개별 측정이 수행되었다. 총 1~3백만 개의 입자가 샘플당 검출되었다.

섬유 길이 및 직경 분포에 기초하여 평가하였다. 샘플 중의 콜라겐 섬유의 총 매스에서 특정 길이 또는 폭의 섬유 비율을 계산하였다. 표 5 및 6은 평균값으로부터 계산된, 전체 매스(mass)에서 콜라겐 섬유의 누적 분포의 10, 16, 50, 84 및 90%의 백분율에 대한 길이 및 직경(μm)을 나타낸다.

표 5에서 알 수 있듯이, 샘플 9D는 더 넓은 섬유 길이 분포를 나타낸다. 중앙값(median value)은 838㎛이다. 이는 샘플의 총 콜라겐 섬유 매스(mass)의 50%가 길이가 838㎛보다 큰 섬유에 의해 제공된다는 것을 의미한다. 콜라겐 매스의 84%는 섬유 길이가 336㎛를 초과하는 섬유에 의해 제공된다. 그러나, 531-020에서는, 더 작은 섬유의 비율이 훨씬 더 높다. 샘플 531-010에 대한 383㎛의 중앙값은 현저하게 더 낮다. 이는 531-010의 경우에 838㎛에 비하여, 샘플 531-020의 콜라겐 매스의 절반이 길이가 383㎛ 미만인 섬유로 구성됨을 의미한다.

따라서 균질화를 통해 섬유의 크기가 짧아지고 이는 압출 헤드를 통한 잉크의 통과, 그리고 궁극적으로 이의 인쇄 가능성을 용이하게 하여, 이를 상업용 프린터로 인쇄하는 데 필요한 압력을 감소시킨다.

샘플 531-010 및 531-020의 섬유 직경의 누적 분포(표 6)는 19㎛의 중앙값과 거의 동일하며, 섬유의 80%는 10㎛ 내지 31㎛의 직경 범위에 있다.

도 9a 및 9b는 0.1%로 희석되고 시리우스 레드(Sirius Red)로 착색된 본 발명의 잉크 531-010의 개별 입자의 광학 현미경에 의한 이미지를 나타낸다. 상기 도면은 본 발명의 잉크에 존재하는 섬유의 시각적 이미지를 갖는 것을 허용하며, 여기에서 섬유 길이 및 직경의 넓은 분포가 명확하게 관찰된다.

실시예 8

인쇄에 앞서, 실시예 1의 산성 잉크는 중화하되 농도를 5%로 하고, 이를 pH 7.4로 조정된 1M 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄(Tris)와 3:2(V:V) 비율로 혼합하여 3%의 농도를 얻었다. 더 희석된 잉크를 얻기 위해 비율을 변경할 수 있다. 마찬가지로, 버퍼의 절반을 DMEM(Dulbecco's Modification of Eagle's Medium)과 같은 배양 배지로 대체할 수 있다. 혼합을 위해, 시린지에 콜라겐 3ml를 채우고 다른 시린지에는 Tris 2ml를 채웠다. 커넥터의 도움으로, 두 개의 시린지를 연결하고 내용물을 하나에서 다른 하나로 전달하였고, 이 마지막 단계를 40회 반복하여, 내용물이 균일하게 혼합되도록 하였다. 이어서, 20G 노즐 니들 압출 헤드를 사용하여 압출 속도 5mm/s에서 압력을 70kPa로 조정하여 인쇄하였다. 제조된 인상은 도 10에 나타낸다.

실시예 9. 중성 콜라겐 잉크에서의 세포 캡슐화

세포 밀도에 대해 이 실시예에서 제안된 양은 뮤린 섬유아세포에 대한 연구를 기반으로 한다. 상이한 성분을 혼합하기 위해 본 실시예에서 사용된 방법은 중화된 잉크인 실시예 8의 방법과 유사한 방식으로 수행된다.

실시예 1에서 언급한 바와 같이 중성 pH에서 콜라겐 매스를 얻었다. 이 경우, 산성 pH에서 상응하는 버퍼와 콜라겐 매스 혼합물에 대해 계산된 양으로부터, 세포와의 후속 혼합을 위해 필요한 양을 계산하였다. 이를 위해, 콜라겐 3부분(parts), 버퍼 1부분 및 DMEM(Dulbecco's Modification of Eagle's Medium) 배양 배지 1부분을 세포와 혼합하였다. 이때, 산성 콜라겐 매스를 해당 버퍼와 40회 혼합한 후(이전 중화 잉크의 실시예에서 언급한 바와 같이), 이를 세포를 포함하는 배양 배지와 동일한 방식으로 혼합하되, 이번에는 총 20회 혼합하였다.

세포가 있는 배양 배지를 얻기 위해, 대략 200,000개 세포/ml의 밀도를 갖는 현탁액에서 이를 얻기 위해 정상 세포 수확 프로토콜(normal cell harvesting protocol)을 수행하였다.

모든 성분이 혼합되면, 세포 배양을 위해 준비된 플레이트 상에 바이오인쇄(bioprint)하였었다. 구조물(construct)이 바이오인쇄되면, 전체 스캐폴드 또는 구조물(construct)을 덮기 위해 풍부한 DMEM이 첨가되었다. 세포 생존력 테스트(cell viability tests)(Live/Dead Assay)는 세포를 바이오인쇄하고 5일 후에 수행되었다. 연구를 보완하기 위해, 스캐폴드(지지체)는 조합된 트립신-EDTA 및 콜라게나아제(collagenase) 처리를 사용하여 분해(digest)되어 표면에 있는 세포와 잉크에 내장된(embedded) 세포 모두를 얻었다(트립신-EDTA 0.05%로 20분의 첫 번째 배양; 그 후 스캐폴드가 완전히 용해될 때까지 콜라게나제 500U/ml로 두 번째 배양). 그 결과 세포 생존율이 90%를 초과하는 것으로 나타났다.

Claims (24)

1. 0.1 내지 5의 pH에서 0.1% 내지 10%의 농도로 산성 매질 중의 천연 콜라겐 섬유의 분산물을 포함하는 3D 인쇄용 콜라겐 잉크로서, 콜라겐 잉크는 10 cP(centipoise) 내지 50 McP(million centipoise)의 점도(18℃ 내지 22℃의 온도에서 브룩필드 방법)를 가지며, 상기 섬유 분산물은, 1 내지 2의 pH에서 측정된, 섬유의 길이가 1㎛ 내지 2500㎛ 범위이고 섬유의 직경이 0.1㎛ 내지 150㎛ 범위인 섬유를 90% 초과로 포함하는, 3D 인쇄용 콜라겐 잉크.
2. 제1항에 있어서, 상기 분산물 중의 상기 콜라겐 섬유의 매스(mass)의 적어도 90%가 섬유의 길이가 50㎛ 내지 2500㎛ 범위인 섬유를 포함하는 것을 특징으로 하는 3D 인쇄용 콜라겐 잉크.
3. 제1항 및 제2항에 있어서, 상기 분산물 중의 상기 콜라겐 섬유의 매스의 75%가 섬유의 길이가 50㎛ 내지 1000㎛ 범위인 섬유를 포함하는 것을 특징으로 하는 3D 인쇄용 콜라겐 잉크.
4. 제1항 및 제2항에 있어서, 상기 분산물 중의 상기 콜라겐 섬유의 매스의 50%가 섬유의 길이가 100㎛ 내지 500㎛ 범위인 섬유를 포함하는 것을 특징으로 하는 3D 인쇄용 콜라겐 잉크.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 콜라겐 섬유의 매스의 80%가 섬유의 직경이 바람직하게는 5㎛ 내지 35㎛인 섬유를 포함하는 것을 특징으로 하는 3D 인쇄용 콜라겐 잉크.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 농도가 1% 내지 5%인 것을 특징으로 하는 3D 인쇄용 콜라겐 잉크.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, pH가 pH 1 내지 3인 것을 특징으로 하는 3D 인쇄용 콜라겐 잉크.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 점도가 2 McP 내지 15 McP인 것을 특징으로 하는 3D 인쇄용 콜라겐 잉크.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 잉크를 포함하는 하이드로겔.
10. 다음 단계를 포함하는 콜라겐-함유 조직으로부터 제1항 내지 제8항에 따른 잉크를 얻는 방법:
    a) 콜라겐-함유 조직을 세척 및 절단하는 단계(chopping);
    b) 절단된 조직을 제어된 방식으로 화학적으로 매서레이팅하는 단계(macerating);
    c) 단계 b)에서 얻어진 생성물을 물로 세척하는 단계;
    d) c)에서 얻어진 부산물의 pH를 0.5 내지 5의 값으로 조정하여 단계 c)의 부산물을 팽창시키는 단계:
    e) 단계 d)의 생성물을 기계적으로 민싱하는 단계(mincing);
    f) 물에 바람직하게는 0.1% 내지 10%의 농도로 분산하는 단계.
11. 제10항에 있어서, 상기 콜라겐-함유 조직이 결합 조직인 것을 특징으로 하는 방법.
12. 제11항에 있어서, 상기 결합 조직이 코리움(corium)으로 불리는 층의 진피 조직(dermis tissue)인 것을 특징으로 하는 방법.
13. 제10항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 조직이 1세 내지 3세의 소 기원인 것을 특징으로 하는 방법.
14. 제10항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 c)가 알칼리제의 존재에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
15. 제10항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 d)에서 1 내지 3으로 산성화되는 것을 특징으로 하는 방법.
16. 제10항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 e) 전에 단계 d)에서 얻어진 침전물(precipitate)의 균질화 단계가 있는 것을 특징으로 하는 방법.
17. 제10항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 섬유상 콜라겐의 상기 수성 분산이 1% 내지 5%의 농도로 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
18. 3D 구조물(structure)의 인쇄에서의 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 잉크의 용도.
19. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 잉크를 포함하는 구조물.
20. 인쇄하기 전에 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 기재된 잉크를 세포와 혼합하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 기재된 잉크로 인쇄하는 방법.
21. 제20항에 있어서, 상기 세포가 성상세포, 배아 심근세포, 태아 심근세포, 신생아 심근세포, 심근세포, 배아 심실 근육세포, 각막 내피 세포, 각막 상피 세포, 홍채 색소 상피 세포, 망막 색소 상피 세포, 태아 도파민 신경 세포, 태아 신피질 신경 세포, 장 신경 세포, 간세포, 지방 조직 중간엽 줄기 세포, 골수 중간엽 줄기 세포, 골아세포, 연골 세포, 췌장 세포, 요로상피 세포로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
22. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 기재된 잉크를 인쇄하는 방법으로서,
    상기 잉크를 생리적 pH, 바람직하게는 7 내지 8로 중화하는 단계;
    구조물을 인쇄하는 단계
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
23. 제22항에 있어서, 잉크를 세포와 혼합하는 것을 특징으로 하는 방법.
24. 제22항에 있어서, 상기 중화가 인산염 버퍼 식염수(PBS 1X 및 10X), 트리신(Tricine), MOPS, HEPES, 트리스(Tris), 탄산나트륨으로부터 선택되는 염 또는 버퍼로 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.

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