KR20230069219A - HER2를 표적화하여 합성된 miRNA를 함유하는 엑소좀 및 약물 조성물 - Google Patents
HER2를 표적화하여 합성된 miRNA를 함유하는 엑소좀 및 약물 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 인간 표피 성장 인자 수용체2(HER2)를 표적화하여 합성된 miRNA 및 엑소좀막에 노출되어 암 세포에서 발현되는 HER2 단백질에 특이적으로 결합하는 리간드를 포함하는 조작된 엑소좀을 개시한다.
Description
본 발명은 인간 표피 성장 인자 수용체2(HER2)를 표적화하여 합성된 miRNA를 함유하는 세포외 소포체에 관한 것으로, 특히 HER2 mRNA를 표적화하는 miRNA 및 엑소좀막에 노출되어 HER2에 결합하는 리간드를 함유하는 조작된 엑소좀에 관한 것이다. 본 발명은 또한 본원에 개시된 세포외 소포체를 포함하는 약물 조성물 및 HER2 양성 암의 치료에서의 이의 적용에 관한 것이다.
HER2는 인간 표피 성장 인자 수용체 패밀리의 구성원 중 하나이다. HER2 단백질은 인간 유방암 세포의 표면에서 높은 수준으로 발현된다. 많은 관찰 결과는 이러한 세포의 발암성 행동에서 그 역할을 뒷받침한다. 실제로, 항체로 HER2 양성 세포를 처리하면 G1-S 세포 주기 진행을 차단하고, 사이클린 의존성 키나아제2(CDK2), 사이클린E 및 CDK6의 단백질 수준을 감소시키며, 사이클린E-CDK2 관련 키나아제 활성을 감소시킬 수 있다. 항HER2 항체를 투여하는 것은 인간 HER2 양성 유방암 환자의 표준 치료 방법이다.
HER2 표적 치료의 발전은 HER2 양성 유방암 환자의 생존율을 향상시켰다. 국소 질환의 표준 치료 방법은 화학 요법과 1년 간의 보조 HER2 표적 치료(일반적으로 항HER2 항체 트라스투주맙(trastuzumab))이다. 이러한 치료는 효과적이지만, 일부 환자에는 질환 재발이 나타나므로; 상이한 HER2 표적 약물을 조합하거나 HER2 표적 치료의 지속 시간을 연장하여 치료를 업그레이드하는데 중점을 둔다. 실제로, 이중 HER2 표적 치료 및 항HER2 치료의 지속 시간 연장, 및 항HER2 항체 약물 접합체 T-DM1의 보조 치료는 모두 임상용으로 승인되었다. 그러나, 새로운 증거에 따르면, 일부 환자는 이러한 추가 치료에서 관련 독성 및/또는 비용을 상쇄하는 충분한 이점을 얻지 않은 것을 입증한다.
본 발명의 일 양태는 인간 표피 성장 인자 수용체2(HER2)를 표적화하여 합성된 miRNA를 포함하는 조작된 엑소좀에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 상기 조작된 엑소좀에 포함된 miRNA의 씨드 서열의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO. 1 또는 2에 표시된 바와 같다. 본원의 실시예는, HER2 mRNA를 표적화하고 엑소좀을 통해 HER2 양성 세포에 전달되는 miRNA가 HER2의 보충을 차단하는 것을 입증하며, 실시예에서 얻은 데이터는 또한 이러한 miRNA가 HER2를 발현하지 않는 세포에 영향을 미치지 않는 것을 입증한다.
본 발명의 다른 양태는 인간 표피 성장 인자 수용체2(HER2)를 표적화하여 합성된 miRNA 및 엑소좀막에 노출되어 암 세포에서 발현되는 HER2 단백질에 특이적으로 결합하는 리간드를 포함하는 조작된 엑소좀에 관한 것이다. 이러한 조작된 엑소좀은 2단계 방법을 통해 HER2에 대한 이중 표적화를 구현하였다. 먼저, 엑소좀막에는 HER2 결합 펩티드가 나타났고, 이는 HER2 양성 암 세포에 특이적으로 들어갈 수 있다. 2단계에서, HER2를 특이적으로 표적화하는 설계된 miRNA는 방출되어 HER2 단백질 발현을 하향 조절한다. 본원에 제시된 이러한 조작된 엑소좀은 전신 전달을 통해 증가된 체내 항종양 활성을 나타낸다.
본 발명의 다른 양태는 이를 필요로 하는 대상체에게 치료 유효량의 본원에 개시된 임의의 조작된 엑소좀을 투여하는 단계를 포함하는 HER2 양성 암을 치료하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 다른 양태는 본원에 개시된 임의의 조작된 엑소좀 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약물 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 다른 양태 및 특징은 이하의 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다.
도 1: miR-HER2-E1 및 miR-HER2-E4는 SK-OV-3 및 HEp-2 세포에서 HER2를 하향 조절한다. a. miR-HER2-E1, miR-HER2-E4 또는 비표적(NT) miRNA를 발현하는 0.5 μg의 플라스미드로 형질감염된 SK-OV-3 세포의 HER2 단백질 수준의 면역블롯팅 분석. b. GAPDH 표준화에 대한 HER2의 밴드 밀도는 SK-OV-3 세포에서 정량화된 상대적인 HER2/GAPDH 발현을 표시하고, 3개의 독립적인 실험으로부터의 평균값±표준 편차로 표시된다. c. HEp-2 세포는 miR-HER2-E1, miR-HER2-E4 또는 NT miRNA를 발현하는 0.5 μg의 플라스미드 및 His 태그된 HER2를 코딩하는 0.2 μg의 플라스미드로 동시 형질감염시킨다. GAPDH는 샘플 추가 대조로 사용된다. d. GAPDH 표준화에 대한 HER2의 밴드 밀도는 HEp-2 세포에서 정량화된 상대적인 HER2/GAPDH 발현을 표시하고, 3개의 독립적인 실험으로부터의 평균값±표준 편차로 표시된다. * p < 0.05.
도 2: miR-HER2-E1을 함유하는 엑소좀의 특성화. a. 엑소좀 마커 단백질 Alix, CD9, Annexin V, Flotillin-1 및 TSG101에 대한 항체를 사용하여 엑소좀 및 세포에 대해 면역블롯팅 분석을 수행한다. b. Izon의 qNano 기술(Izon)을 통해 miR-HER2-E1 또는 비표적(NT) 플라스미드로 형질감연된 HEK-293 세포에서 추출된 분리된 엑소좀의 입자 크기 분포 및 개수를 측정한다. c. qPCR 분석을 통해 정제된 엑소좀의 miR-HER2-E1을 정량화한다. 엑소좀 miR-HER2-E1의 양을 정량화하고 18S rRNA의 양으로 표준화한다. 보고된 데이터는 3개의 독립적인 실험을 대표한다. 모든 정량적 데이터는 모두 평균값±표준 편차로 표시된다.
도 3: 엑소좀을 통해 전달된 miR-HER2-E1은 HER2 단백질 축적을 억제한다. 엑소좀에 의해 전달된 miR-HER2-E1로 처리된 SK-OV-3 및 HEp-2 세포의 HER2 단백질 수준의 면역블롯팅 분석. a. SK-OV-3 세포는 처리되지 않았거나(Con) 지정된 엑소좀과 함께 인큐베이션하고, 상기 엑소좀은 miR-HER2-E1 또는 비표적(NT) miRNA로 형질감염된 HEK-293 세포에서 정제한다. b. 오른쪽에 표시된 밴드 강도의 정량화는 SK-OV-3 세포에서 상대적인 HER2/GAPDH 발현 수준을 나타낸다. c. HER2 발현 플라스미드로 HEp-2 세포를 36시간 동안 형질감염시킨 후, 처리하지 않거나(Con) 20 μg의 정제된 엑소좀과 함께 인큐베이션하고, 상기 엑소좀은 miR-HER2-E1 또는 NT miRNA를 코딩하는 플라스미드로 형질감염된 HEK-293 세포에 의해 생성된다. d. 오른쪽에 표시된 밴드 강도의 정량화는 HEp-2 세포에서 상대적인 HER2/GAPDH 발현 수준을 나타낸다. 보고된 데이터는 세 개의 독립적인 실험을 대표한다. 모든 정량적 데이터는 모두 평균값±표준 편차로 표시된다.* p < 0.05, N.S.는 유의미한 차이가 없음을 나타낸다.
도 4: 엑소좀을 통해 HER2 양성 암 세포에 전달된 miR-HER2-E1는 세포 활력을 감소시킨다. CCK8 시험을 통해 엑소좀에 의해 전달된 miR-HER2-E1이 HER2 양성(+) 암 세포(SK-OV-3 및 HCT116) 및 HER2 음성(-) 세포(HEp-2 및 MDA-MB-231)의 활력에 미치는 영향을 측정한다. 결과는 시뮬레이션 처리한 대조군(100%로서)과 비교하여 세포 활력 지수의 평균값±표준 편차로 표시된다. HER2 양성(+)군에서, miR-HER2-E1 엑소좀과 시뮬레이션 처리 사이의 통계학적으로 유의한 차이는 별표로 나타낸다(**, p < 0.01; ***, p < 0.001). N.S.는 유의미한 차이가 없음을 나타낸다.
도 5: 체내에서의 엑소좀에 의해 전달된 miR-HER2-E1의 항종양 효능. SK-OV-3(a), HCT116(b) 또는 MDA-MB-231(c) 종양(각 그룹의 평균 종양 크기는 90 mm3)을 포함하는 누드 마우스에 매번 10 μg의 정제된 엑소좀을 3일마다 종양내로 주사하고, 총 6회 주사한다(화살표로 표시). 3일마다 종양 크기를 측정한다. 결과는 평균 종양 부피(mm3)±표준 편차(n=6)로 표시된다. * 및 ***는 NT exo군과 비교하여 p < 0.05 및 p < 0.001을 대표한다. N.S.는 유의미한 차이가 없음을 나타낸다.
도 6: 293-miR-XS-HER2는 종양 세포 표면 HER2의 리간드 및 HER2를 표적화하는 miRNA를 발현한다. a. 안정적인 세포계에서의 miR-HER2-E1의 축적. 293-miR-XS 및 293-miR-XS-HER2 세포 침전 및 엑소좀으로부터 분리된 miR-HER2-E1을 상대적인 18S rRNA의 수준으로 표준화하여 정량화한다. b. 293-miR-XS 및 293-miR-XS-HER2 엑소좀의 상대적인 HER2 결합 친화력. 흡광도 판독값(OD 450 nm)은 Y축에 표시된다. 각 결과는 3회 반복의 평균값±표준 편차로 표시된다. ** p < 0.01.
도 7: HER2에 부착되고 miR-HER2-E1을 발현하는 엑소좀의 항종양 효능. BALB/c 유래된 누드 마우스에 평균 부피가 80 mm3인 SK-OV-3 종양을 이식하고, 친본 HEK-293 세포계(293), miR-HER2-E1을 발현하는 안정적인 세포계(293-miR-XS) 또는 HER2 단백질 리간드와 miR-HER2-E1로 공동 발현을 갖는 안정적인 세포계(293-miR-XS-HER2)에서 정제한 엑소좀을 정맥 주사한다. 3일마다 3 μg/동물(a) 또는 30 μg/동물(b)로 엑소좀을 주사하고, 총 8회 주사한다(화살표로 표시). 3일마다 종양 크기를 측정한다. 결과는 평균 종양 부피(mm3)±표준 편차(n=6)로 표시된다. * 및 ***는 293-miR-XS군과 비교하여 p < 0.05 및 p < 0.001을 대표한다.
도 2: miR-HER2-E1을 함유하는 엑소좀의 특성화. a. 엑소좀 마커 단백질 Alix, CD9, Annexin V, Flotillin-1 및 TSG101에 대한 항체를 사용하여 엑소좀 및 세포에 대해 면역블롯팅 분석을 수행한다. b. Izon의 qNano 기술(Izon)을 통해 miR-HER2-E1 또는 비표적(NT) 플라스미드로 형질감연된 HEK-293 세포에서 추출된 분리된 엑소좀의 입자 크기 분포 및 개수를 측정한다. c. qPCR 분석을 통해 정제된 엑소좀의 miR-HER2-E1을 정량화한다. 엑소좀 miR-HER2-E1의 양을 정량화하고 18S rRNA의 양으로 표준화한다. 보고된 데이터는 3개의 독립적인 실험을 대표한다. 모든 정량적 데이터는 모두 평균값±표준 편차로 표시된다.
도 3: 엑소좀을 통해 전달된 miR-HER2-E1은 HER2 단백질 축적을 억제한다. 엑소좀에 의해 전달된 miR-HER2-E1로 처리된 SK-OV-3 및 HEp-2 세포의 HER2 단백질 수준의 면역블롯팅 분석. a. SK-OV-3 세포는 처리되지 않았거나(Con) 지정된 엑소좀과 함께 인큐베이션하고, 상기 엑소좀은 miR-HER2-E1 또는 비표적(NT) miRNA로 형질감염된 HEK-293 세포에서 정제한다. b. 오른쪽에 표시된 밴드 강도의 정량화는 SK-OV-3 세포에서 상대적인 HER2/GAPDH 발현 수준을 나타낸다. c. HER2 발현 플라스미드로 HEp-2 세포를 36시간 동안 형질감염시킨 후, 처리하지 않거나(Con) 20 μg의 정제된 엑소좀과 함께 인큐베이션하고, 상기 엑소좀은 miR-HER2-E1 또는 NT miRNA를 코딩하는 플라스미드로 형질감염된 HEK-293 세포에 의해 생성된다. d. 오른쪽에 표시된 밴드 강도의 정량화는 HEp-2 세포에서 상대적인 HER2/GAPDH 발현 수준을 나타낸다. 보고된 데이터는 세 개의 독립적인 실험을 대표한다. 모든 정량적 데이터는 모두 평균값±표준 편차로 표시된다.* p < 0.05, N.S.는 유의미한 차이가 없음을 나타낸다.
도 4: 엑소좀을 통해 HER2 양성 암 세포에 전달된 miR-HER2-E1는 세포 활력을 감소시킨다. CCK8 시험을 통해 엑소좀에 의해 전달된 miR-HER2-E1이 HER2 양성(+) 암 세포(SK-OV-3 및 HCT116) 및 HER2 음성(-) 세포(HEp-2 및 MDA-MB-231)의 활력에 미치는 영향을 측정한다. 결과는 시뮬레이션 처리한 대조군(100%로서)과 비교하여 세포 활력 지수의 평균값±표준 편차로 표시된다. HER2 양성(+)군에서, miR-HER2-E1 엑소좀과 시뮬레이션 처리 사이의 통계학적으로 유의한 차이는 별표로 나타낸다(**, p < 0.01; ***, p < 0.001). N.S.는 유의미한 차이가 없음을 나타낸다.
도 5: 체내에서의 엑소좀에 의해 전달된 miR-HER2-E1의 항종양 효능. SK-OV-3(a), HCT116(b) 또는 MDA-MB-231(c) 종양(각 그룹의 평균 종양 크기는 90 mm3)을 포함하는 누드 마우스에 매번 10 μg의 정제된 엑소좀을 3일마다 종양내로 주사하고, 총 6회 주사한다(화살표로 표시). 3일마다 종양 크기를 측정한다. 결과는 평균 종양 부피(mm3)±표준 편차(n=6)로 표시된다. * 및 ***는 NT exo군과 비교하여 p < 0.05 및 p < 0.001을 대표한다. N.S.는 유의미한 차이가 없음을 나타낸다.
도 6: 293-miR-XS-HER2는 종양 세포 표면 HER2의 리간드 및 HER2를 표적화하는 miRNA를 발현한다. a. 안정적인 세포계에서의 miR-HER2-E1의 축적. 293-miR-XS 및 293-miR-XS-HER2 세포 침전 및 엑소좀으로부터 분리된 miR-HER2-E1을 상대적인 18S rRNA의 수준으로 표준화하여 정량화한다. b. 293-miR-XS 및 293-miR-XS-HER2 엑소좀의 상대적인 HER2 결합 친화력. 흡광도 판독값(OD 450 nm)은 Y축에 표시된다. 각 결과는 3회 반복의 평균값±표준 편차로 표시된다. ** p < 0.01.
도 7: HER2에 부착되고 miR-HER2-E1을 발현하는 엑소좀의 항종양 효능. BALB/c 유래된 누드 마우스에 평균 부피가 80 mm3인 SK-OV-3 종양을 이식하고, 친본 HEK-293 세포계(293), miR-HER2-E1을 발현하는 안정적인 세포계(293-miR-XS) 또는 HER2 단백질 리간드와 miR-HER2-E1로 공동 발현을 갖는 안정적인 세포계(293-miR-XS-HER2)에서 정제한 엑소좀을 정맥 주사한다. 3일마다 3 μg/동물(a) 또는 30 μg/동물(b)로 엑소좀을 주사하고, 총 8회 주사한다(화살표로 표시). 3일마다 종양 크기를 측정한다. 결과는 평균 종양 부피(mm3)±표준 편차(n=6)로 표시된다. * 및 ***는 293-miR-XS군과 비교하여 p < 0.05 및 p < 0.001을 대표한다.
정의
용어 “하나” 또는 “하나의” 개체는 이 개체의 하나 또는 복수개를 지칭하고; 예를 들어, “엑소좀”은 하나 또는 복수개의 엑소좀을 나타내는 것으로 이해되는 것을 유의해야 한다. 따라서, 용어 “하나”, “하나 또는 복수개” 및 “적어도 하나”는 본원에서 교환하여 사용할 수 있다.
“상동성” 또는 “동일성” 또는 “유사성”은 두 개의 펩티드 사이 또는 두 개의 핵산 분자 사이의 서열 유사성을 지칭한다. 각 서열에서 비교할 수 있는 위치를 비교하여 상동성을 결정할 수 있다. 비교 서열의 위치가 동일한 염기 또는 아미노산에 의해 점유될 경우, 분자는 이 위치에서 상동하다. 서열 사이의 상동 정도는 서열이 공유하는 매칭 또는 상동 위치의 개수와 관련된다. “관련되지 않는” 또는 “비상동성” 서열은 본원의 서열 중 하나와 40％보다 작은 동일성을 공유하고, 바람직하게는 25％보다 작은 동일성을 공유한다.
하나의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 영역(또는 하나의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 영역)이 다른 하나의 서열과 특정 백분율(예를 들어 60％, 65％, 70％, 75％, 80％, 85％, 90％, 95％, 98％ 또는 99％)의 “서열 동일성”을 갖는 것은, 비교할 경우, 두 개의 서열을 비교할 경우 이 백분율의 염기(또는 아미노산)는 동일함을 지칭한다. 이러한 비교 및 백분율의 상동성 또는 서열 동일성은 본 분야의 공지된 소프트웨어 프로그램을 사용하여 결정할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 “링커”는 두 개 또는 더 많은 동일하거나 상이한 뉴클레오티드를 함유하는 뉴클레오티드 서열의 짧은 세그먼트를 지칭하고, 여기서 상기 뉴클레오티드는 아데닌(A), 구아닌(G), 시토신(C), 티민(T) 및 우라실(U)로부터 선택된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 “치료”는 치료성 치료 및 예방성 조치를 지칭하고, 종양의 진행과 같은 바람직하지 않은 생리적 변화 또는 문란을 예방하거나 완화(감소)시키는 것을 목적으로 한다. 유리하거나 원하는 임상 결과는, 검출 가능 여부에 관계없이 증상 완화, 질환 중증도 감소, 종양 상태 안정화(즉 악화 없음), 종양 성장 억제, 종양 부피 감소, 종양 진행 지연 또는 감속, 종양 상태 개선 또는 감소 및 증상 소실(부분적이든 전체적이든)을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 치료가 필요한 환자에는 이미 종양이 있는 사람, 및 종양에 쉽게 걸리는 사람을 포함된다.
“치료 유효량”은 본 발명의 엑소좀이 상술한 “치료”에 충분한 양으로 투여됨을 지칭한다. 특정된 개체의 질환 또는 병증 치료에서 치료학적 유효량은 질환의 증상 및 중증도에 따라 결정되고, 표준 임상 기술에 의해 결정될 수 있다. 이 밖에, 체외 또는 체내 측정을 선택적으로 사용하여 최적의 투여량 범위를 결정할 수 있다. 제제에 사용되는 정확한 투여량은 또한 투여 경로 및 질환 또는 병증의 중증도에 따라 결정되고, 종사자의 판단 및 각 환자의 상황에 따라 결정하여야 한다. 체외 또는 동물 모델 테스트 시스템에서 얻은 투여량-반응 곡선에서 유효 투여량을 추론할 수 있다.
“대상체” 또는 “개체” 또는 “동물” 또는 “환자” 또는 “포유 동물”은 진단, 예후 또는 치료가 필요한 임의의 대상체, 특히 포유 동물 대상체를 지칭한다. 포유 동물의 대상에는 인간, 가축, 농장 동물 및 동물원 동물, 스포츠 동물 또는 애완 동물이 포함되고, 예를 들어 개, 고양이, 기니피그, 토끼, 랫트, 마우스, 말, 소, 젖소 등이다. 본원의 대상체는 바람직하게 인간이다.
본원에 사용된 바와 같이, “치료가 필요한 환자” 또는 “치료가 필요한 대상체”와 같은 문구는 검출, 진단 절차 및/또는 치료에 사용되는 본 발명의 조성물의 투여로부터 이익을 얻은 대상체, 예컨대 포유 동물 대상체를 포함한다.
본 발명은 특히 안티센스 올리고머 및 유사체를 사용하여 HER2를 코딩하는 핵산 분자의 기능 또는 작용을 조절한다. 본 발명의 올리고머와 그의 표적 핵산의 혼성화는 일반적으로 “안티센스”로 지칭된다. 따라서, 본 발명의 일부 바람직한 실시형태의 실시에 포함되는 것으로 간주되는 바람직한 메커니즘은 본원에서 “안티센스 억제”로 지칭된다. 이러한 안티센스 억제는 일반적으로 올리고뉴클레오티드 사슬 또는 세그먼트의 수소 결합 기반 혼성화를 기반으로 하여 적어도 하나의 사슬 또는 세그먼트가 절단, 분해되거나 기타 방식으로 작동이 불가능하도록 한다. 이 측면에서, 현재 특정 핵산 분자 및 이러한 안티센스 억제에 사용되는 기능을 표적화하는 것이 바람직하다.
간섭된 RNA의 기능은 예를 들어 단백질 번역 사이트로의 RNA 전위, RNA 합성 사이트로부터 멀어지는 세포 내 사이트로의 RNA 전위, RNA로부터의 단백질 번역, 한가지 또는 여러 가지 RNA를 생성하기 위한 RNA의 스플라이싱, 및 RNA에 참여하거나 RNA에 의해 촉진되는 촉매 활성 또는 복합체 형성을 포함할 수 있다. 표적 핵산 기능에 대한 이러한 간섭의 하나의 바람직한 결과는 HER2의 발현을 조절하는 것이다. 본 발명의 맥락에서, “조절” 및 “발현 조절”은 유전자를 코딩하는 핵산 분자(예를 들어 DNA 또는 RNA)의 양 또는 수준을 감소(억제)하는 것을 의미한다. mRNA는 일반적으로 바람직한 표적 핵산이다.
본 발명의 맥락에서, “혼성화”는 상보적 올리고머 사슬의 페어링을 지칭한다. 본 발명에서, 바람직한 페어링 메커니즘은 수소 결합과 관련되고, 올리고머 화합물 사슬의 상보적 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 염기(핵염기) 사이의 Watson-Crick, Hoogsteen 또는 역방향 Hoogsteen 수소 결합일 수 있다. 예를 들어, 아데닌 및 티민은 상보적 핵염기이고, 수소 결합을 형성하여 페어링된다. 혼성화는 다양한 상황에서 발생할 수 있다.
본 발명에서, 문구 “엄격한 혼성화 조건” 또는 “엄격한 조건”은 본 발명의 화합물이 표적 서열에 혼성화되지만 최소 개수의 다른 서열에 혼성화되는 조건을 지칭한다. 엄격한 조건은 서열 의존적이고 상이한 상황에서 상이하며, 본 발명의 맥락에서, 올리고머 화합물은 표적 서열에 혼성화되는 “엄격한 조건”은 올리고머의 성질과 조성 및 이들이 연구되는 측정법에 의해 결정된다.
본원에 사용된 바와 같이, “상보적”은 올리고머 화합물의 두 개의 핵염기 사이에서 정확하게 페어링되는 능력을 지칭한다. 예를 들어, 만약 올리고뉴클레오티드(올리고머 화합물)의 특정 위치의 핵염기가 표적 핵산의 특정 위치의 핵염기와 수소 결합을 형성하면, 상기 표적 핵산은 DNA, RNA 또는 올리고뉴클레오티드 분자이고, 다음, 올리고뉴클레오티드와 표적 핵산 사이의 수소 결합의 위치는 상보적 위치로 간주된다. 각 분자의 충분한 개수의 상보적 위치가 서로 결합하여 수소 결합을 형성할 수 있는 핵염기에 의해 점유될 경우, 올리고뉴클레오티드 및 별도의 DNA, RNA 또는 올리고뉴클레오티드 분자는 서로 상보적이다. 따라서, “특이적으로 혼성화되는” 및 “상보적”은 충분한 정도의 정확한 페어링 또는 상보성을 나타내는 충분한 개수의 핵염기가 올리고뉴클레오티드와 표적 핵산 사이에서 안정하고 특이적으로 결합하도록 하는 용어이다.
본 분야에서 안티센스 올리고머의 서열은 표적 핵산의 서열에 100％ 상보적일 필요는 없고 특이적으로 혼성화될 수 있음을 이해해야 한다. 이 밖에, 올리고뉴클레오티드는 하나 또는 복수개의 세그먼트에 혼성화되어 삽입되거나 인접한 세그먼트가 혼성화 이벤트(예를 들어 링 구조 또는 헤어핀 구조)에 참여하지 않도록 한다. 바람직하게는 본 발명의 안티센스 화합물은 표적 핵산 내의 표적 영역과 적어도 70％, 또는 적어도 75％, 또는 적어도 80％, 또는 적어도 85％의 서열 상보성을 갖고, 보다 바람직하게는 이들이 적어도 90％의 서열 상보성을 포함하며, 나아가 보다 바람직하게는 표적화되는 표적 핵산 서열 내의 표적 영역과 적어도 95％ 또는 적어도 99％의 서열 상보성을 포함한다. 예를 들어, 안티센스 올리고머의 20개의 핵염기 중 18개는 표적 영역과 상보적이어서 특이적으로 혼성화되는 안티센스 화합물은 90％의 상보성을 대표한다. 이 실시예에서, 나머지 비상보적 핵염기는 상보적 핵염기와 클러스터링되거나 산포될 수 있고, 서로 인접하거나 상보적 핵염기에 인접할 필요가 없다. 따라서, 길이가 18개인 핵염기의 안티센스 올리고머는 4개의 비상보적 핵염기를 갖고, 표적 핵산과 완전히 상보적인 두 개의 영역으로 플랭킹되며, 표적 핵산과 77.8％의 전체 상보성을 가지므로, 본 발명의 범위에 속한다. 본 분야에 공지된 BLAST 프로그램(기본 로컬 비교 검색 도구) 및 PowerBLAST 프로그램을 사용하여 표적 핵산에 대한 안티센스 화합물 영역의 상보적 백분율을 통상적으로 결정할 수 있다.
본 발명의 맥락에서, 용어 “올리고뉴클레오티드”는 리보핵산(RNA) 또는 데옥시리보핵산(DNA)의 올리고머 또는 중합체 또는 이의 모방체, 키메라, 유사체 및 동족체를 지칭한다. 이 용어는 천연적으로 존재하는 핵염기, 당 및 공유 뉴클레오시드 사이(백본) 결합으로 구성된 올리고뉴클레오티드, 및 유사한 기능을 갖는 비천연적으로 존재하는 일부 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 이러한 변형 또는 치환된 올리고뉴클레오티드는 일반적으로 천연 형태보다 우수하고, 이는 예컨대 향상된 세포 흡수, 표적 핵산에 대한 향상된 친화력 및 뉴클레아제의 존재 하에서 증가된 안성성과 같은 필요한 성질을 갖기 때문이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 “microRNA”, “miRNA” 또는 “miR”은 전사 후 유전자 발현을 조절하는 기능을 하는 RNA를 지칭하고, 일반적으로 표적 전령 RNA(mRNA)와 결합하여 본 3’비번역 영역(3’UTRs)의 상보적 서열을 전사하여 일반적으로 유전자 침묵을 야기한다. miRNA는 일반적으로 길이가 21 또는 22개의 뉴클레오티드와 같은 작은 RNA 분자이다. 용어 “microRNA”, “miRNA” 및 “miR”은 교환하여 사용할 수 있고 전구체(pre-miRNA) 및 성숙한(성숙한 miRNA) 형태를 포함한다. 기능성 miRNA 연구의 주요 장애물은 miRNA 표적 인식을 정의하는 규칙이 지금까지 완벽하지 않기 때문에 miRNA 표적 유전자에 대한 신뢰적인 예측이다. 씨드 서열은 miRNA와 mRNA의 결합에 필수적이다. 씨드 서열 또는 씨드 영역은 보존된 7원 서열이고, 주로 miRNA 5´ 말단의 2-8위치에 위치한다. miRNA와 이의 표적 mRNA의 염기쌍이 완전히 매칭되지 않더라도, “씨드 서열”은 반드시 상보적이어야 한다.
본원에 사용된 바와 같이, “항체” 또는 “항원 결합 폴리펩티드”는 한가지 또는 여러 가지 항원을 특이적으로 인식하고 결합하는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체를 지칭한다. 항체는 완전한 항체 및 이의 임의의 항원 결합 세그먼트 및 단일 사슬일 수 있다. 따라서, 용어 “항체”는 항원 결합 생물학적 활성을 갖는 면역 글로불린 분자의 적어도 일부를 갖는 임의의 단백질 또는 펩티드를 포함한다. 이러한 실시예는, 중쇄 또는 경쇄의 상보적 결정 영역(CDR) 또는 이의 리간드 결합 부분, 중쇄 또는 경쇄의 가변 영역, 중쇄 또는 경쇄의 불변 영역, 프레임워크(FR) 영역 또는 이의 임의의 부분, 또는 결합 단백질의 적어도 일부를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 용어 항체는 활성화될 경우 항원 결합 능력을 갖는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체를 더 포함한다. 이러한 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체의 실시예는 Fab, Fv, scFv 및 (Fab’)2를 포함한다.
본원에서 상호 교환적으로 사용된 바와 같이, “HER2 양성 종양” 또는 “HER2 양성 암”은 암 세포의 성장을 촉진하는 인간 표피 성장 인자 수용체2(HER2) 단백질에 대해 양성으로 테스트된 종양 또는 암을 지칭한다. HER2는 다양한 종양 유형의 게놈 정보 요법의 유망한 표적으로 부상하고 있다. HER2에 있어서, 유전자 증폭(복수본 개수 증가)은 지금까지 가장 흔히 볼 수 있는 게놈 변경이고, 종종 단백질 과발현과 관련이 있다. HER2 과발현은 다른 ERBB 패밀리 구성원과 자발적인 수용체 동종이합체 또는 이종이합체를 생성하여, PI3K/Akt/mTOR 및 MAPK와 같은 활성화된 발암성 다운스트림 신호 전달을 초래하여, 세포 증식, 생존 및 혈관 생성을 촉진함으로써, 종양 발생을 유도한다. 특히, HER2-HER3 이종이합체는 HER3 및 PI3K의 p85 서브유닛 사이의 직접적인 결합을 통해 PI3K 신호를 형질도입한다. 이러한 이종이합체의 자발적인 형성은 HER2 유전자의 증폭으로 증가한다. HER2 분류를 위한 알고리즘은 줄곧 발전하고 있다. 예를 들어, 유방암에 있어서, IHC에 의한 3+ HER2 단백질 과발현 또는 ISH에 의해 평가된 HER2 증폭은 HER2 양성으로 간주되고, 미국 임상종양학회 및 미국병리학회는 상세한 해석 지침을 작성하였으며, 정기적으로 업데이트하고, 참조로서 여기에 통합된다.
HER2 표적 치료는 HER2 증폭/과발현(HER2 양성)된 유방암 및 위암/위식도암의 결과를 변경한다. 보조성 및 전이성 HER2 양성 유방암을 위한 트라스투주맙(전이성 및 보조성), 페르투주맙(pertuzumab)(전이성 및 보조성), 라파티닙(lapatinib)(전이성), 트라스투주맙 항체-약물 접합체(ado-trastuzumab emtansine)(전이성) 및 네라티닙(neratinib)(보조성)과 같은 여러 가지 요법이 승인되었다. 트라스투주맙은 또한 HER2 양성 전이성 위/위식도 접합부 암에 대해 시스플라틴(cisplatin) 및 플루오로피리미딘(카페시타빈(capecitabine) 또는 5-플루오로우라실)과의 조합으로 승인되었다. 이 외에, 트라스투주맙 바이오시밀러Trastuzumab-dkst(Ogivri; Mylan)는 트라스투주맙 태그에 포함된 모든 적응증에 대해 승인되었다.
많은 유형의 종양에 대한 게놈 분석의 증가에 따라, 사람들은 HER2 증폭이 타액암(3.9%), 질암(3.6%), 방광암(3.6%), 자궁내막암(3.4%), 자궁경부암(2.2%) 및 대장암(1.3%)을 포함하는 여러 가지 종양 유형에서 발생하는 것을 점차 인식하고 있다.
본원에 사용된 바와 같이, “담체”는 임의의 모든 용매, 분산 매질, 담체, 코팅제, 희석제, 항세균제 및 항진균제, 등장제 및 흡수 지연제, 완충제, 담체 용액, 현탁제, 콜로이드 등을 포함한다. 약물 활성 물질에 사용되는 이러한 매질 및 약제의 사용은 본 분야에서 공지된 것이다. 활성 성분과 상용되지 않는 임의의 통상적인 매질 또는 시약 외에, 다른 매질 또는 시약은 상기 치료 조성물에 사용될 수 있을 것으로 예상된다. 보조 활성 성분은 또한 조성물에 통합될 수 있다.
문구 “약학적으로 허용 가능한”은 인간에게 투여될 경우 알레르기 또는 유사한 거부반응을 일으키지 않는 분자 개체 및 성분을 지칭한다. 단백질을 활성 성분으로 함유하는 수성 조성물의 제조는 본 분야에 공지된 것이다. 전형적으로, 이러한 조성물은 주사제로 제조되고, 액체 용액 또는 현탁액이든; 주사 전에 액체에 용해 또는 현탁시키기에 적합한 고체 형태로도 제조될 수 있다.
HER2를 표적화하는 miRNA를 포함하는 엑소좀
엑소좀은 평균 직경이 50-150 nm인 작은 세포외 소포체이다. 이들은 세포 사이의 통신 수단으로 사용된다. 일반적으로, 이들은 구조 단백질 및 선택된 단백질, miRNA, mRNA 및 긴 비코딩 RNA로 구성된다. RNA는 단백질에 의해 인식되는 짧은 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 단백질은 이를 세포질에 운반하고 이를 엑소좀으로 패키징한다. 엑소좀은 페이로드를 하나의 세포에서 다른 하나의 세포로 운반한다. 수용체 세포에 들어간 후, 엑소좀 페이로드는 세포질로 방출된다.
본 발명에서, HER2의 mRNA를 표적화하는 miRNA를 포함하는 조작된 엑소좀을 제공하는데, HER2 양성암 세포에서 HER2 단백질의 보충을 차단, 감소 또는 제거한다.
일부 실시형태에서, HER2의 mRNA를 표적화하는 miRNA의 씨드 서열은 5’-ACTCAAG-3’(SEQ ID NO.1), 5’-GTGAGAG-3’(SEQ ID NO.2)의 뉴클레오티드 서열 또는 그 등가물을 갖는다. 상술한 바와 같이, 씨드 서열과 HER2의 표적 mRNA는 완전히 상보적이다. 씨드 서열의 등가물은 본원에 제공된 서열에 비해 1개 또는 2개의 뉴클레오티드의 추가 또는 결실을 갖지만 여전히 HER2의 표적 mRNA에 대해 정확히 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 예를 들어, 씨드 서열의 등가물은 본원에 제공된 씨드 서열의 5'- 또는 3'- 말단에 하나의 뉴클레오티드가 결실되거나 추가된 6원(hexa-) 또는 8원(octa-metrical) 서열일 수 있다. HER2의 mRNA를 표적화하는 miRNA는 동일한 씨드 서열을 공유할 수 있고, 예를 들어 본원에서 SEQ ID NO. 1에 표시되지만, miRNA의 전체 길이는 전구체 또는 성숙한 miRNA를 막론하고 크게 변경될 수 있다. 이들은 모두 본 발명의 범위에 있다.
바람직한 실시형태에서, HER2의 mRNA를 표적화하는 miRNA의 씨드 서열은 엑소좀 모티브에 작동 가능하게 연결되어 miRNA의 엑소좀으로의 패키징을 촉진하거나 강화시킨다. 용어 “작동 가능하게 연결”은 서열(예를 들어 엑소좀 모티브)과 핵산 서열(예를 들어 miRNA의 씨드 서열) 사이의 기능성 연결을 조절하여, miRNA의 엑소좀으로의 패키징을 강화시키거나 촉진한다. 예를 들어, 제1 핵산 서열과 제2 핵산 서열이 기능 관계인 경우, 제1 핵산 서열과 제2 핵산 서열은 작동 가능하게 연결된다. 작동 가능하게 연결된 RNA 서열은 서로 인접할 수 있고, 링커를 통해 연결될 수도 있다.
엑소좀 모티브는 바람직하게 연속적으로 또는 링커를 통해 miRNA의 씨드 서열의 다운스트림에 위치한다. 하나의 실시형태에서, 엑소좀 모티브는 디뉴클레오티드 링커를 통해 HER2의 mRNA를 표적화하는 miRNA의 씨드 서열의 다운스트림에 위치한다. 본 발명의 엑소좀 모티브에 적용되는 서열은 제한되지 않는다. 예를 들어, 본 발명에 적용되는 엑소좀 모티브는 -GGAG-(SEQ ID NO.11), -GGAGGAG-(SEQ ID NO.12)의 서열 또는 그 등가물을 갖는다. 본 발명에 적용되는 예시적인 등가 엑소좀 모티브는 WO 2020/132946에서 설명하였고, 인용을 통해 전체가 본원에 통합된다.
씨드 서열 및 엑소좀 모티브 외에, 본 발명의 miRNA는 별도의 핵산 서열을 더 포함하여 HER2의 mRNA의 표적 영역과의 결합을 촉진시킨다. 이러한 별도의 핵산은 일반적으로 엑소좀 모티브의 다운스트림에 위치하고, 예컨대 1 내지 10개의 뉴클레오티드와 같은 여러 개의 뉴클레오티드 길이를 갖는다. 별도의 핵산 서열은 바람직하게 표적 mRNA의 해당 영역과 상보적이지만, 상술한 바와 같이, 완전히 상보적인 것은 아니다.
각각의 성숙한 miRNA는 모두 전구체 전사체(pre-miRNA)에서 생성된다. pre-miRNA는 세포핵에서 세포질로 전이된 후, DICER라는 효소에 의해 성숙한 miRNA로 절단된다. 다음 성숙한 miRNA 분자는 RNA에 의해 유도된 침묵 복합체(RISC)에 결합되고, 상기 복합체는 리보뉴클레아제를 포함하는 여러 가지 단백질을 포함한다. miRNA 뉴클레오티드 서열은 단백질 복합체가 mRNA의 상보적 서열에 결합하도록 지시한다. 일단 mRNA에 결합되면, miRNA-RISC 복합체는 mRNA 분자의 표적 부위를 효소적으로 절단하여, 유전자가 단백질로 번역되는 것을 억제함으로써, 유전자가 효과적으로 침묵하도록 한다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 miRNA의 성숙한 형태는 본원에 제공된 서열 목록에 기재된 SEQ ID NO 3 내지 6 중 어느 하나로 표시되는 뉴클레오티드 서열, 또는 그 등가물을 갖는다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 miRNA의 성숙한 형태는 SEQ ID NO 5, 6으로 표시되는 뉴클레오티드 서열 또는 그 등가물을 갖는다. 성숙한 miRNA는 성숙한 miRNA의 서열의 3' 말단에 상기 엑소좀 모티브를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 엑소좀 모티브는 본 발명의 전구체 또는 성숙한 miRNA의 서열에 통합되어 그 서열의 일부를 형성한다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 성숙한 miRNA의 전구체(pre-miRNA)는 SEQ ID NO 7 내지 10 중 어느 하나로 표시되는 뉴클레오티드 서열 또는 그 등가물을 갖는다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 miRNA의 전구체(pre-miRNA)는 SEQ ID NO 9, 10으로 표시되는 뉴클레오티드 서열 또는 그 등가물을 갖는다. 상술한 바와 같이, HER2를 표적화하는 pre-miRNA는 상이한 씨드 서열을 갖고 및/또는 이들이 동일한 성숙한 miRNA로 절단되지만 이들의 길이와 뉴클레오티드 구성이 상이할 수 있음을 이해해야 한다. 본 발명은 이러한 pre-miRNA를 고려한다.
본 발명의 엑소좀은 HER2의 mRNA를 표적화하는 pre-miRNA, 및 그의 성숙한 miRNA 및 씨드 서열을 포함한다. miRNA를 엑소좀에 전이시키는 방법은 실시예에 서술된 바와 같이 miRNA 발현 벡터 및 HER2를 코딩하는 플라스미드로 세포를 형질감염시키는 것과 같이 본 분야에서 획득할 수 있는 것이다. 엑소좀의 분리, 감식 또는 특성화는 본 분야에서 기술적으로 가능한 것이다. CD9, CD63, CD81, CD82, 아넥신(Annexin), Flotillin과 같은 여러 가지 단백질은 엑소좀의 마커로 사용될 수 있다. miRNA를 엑소좀으로 패키징하는 다른 방법도 본 발명에 적용된다.
HER2 이중 표적 엑소좀
본 발명의 다른 양태는 엑소좀에 HER2 mRNA를 표적화하는 miRNA 및 엑소좀막에 노출되고 암 세포 표면의 HER2 단백질을 표적화하는 리간드를 포함하는 HER2 이중 표적 엑소좀에 관한 것이다. 본 발명의 HER2 이중 표적 엑소좀은 엑소좀막에 노출된 리간드와 HER2 단백질의 결합을 통해 조작된 엑소좀이 HER2 단백질을 발현하는 양성 암 세포에 접근하거나 근접하도록 안내한 후, HER2 양성 암 세포에 들어가 miRNA 화물을 방출하여 암 세포의 HER2 단백질의 발현을 하향 조절한다.
본 발명의 HER2 이중 표적 엑소좀에 포함된 HER2 mRNA를 표적화하는 miRNA는 상술한 바와 같은 HER2를 표적화하는 miRNA를 포함하는 엑소좀을 참조한다. 이 기초 상에서, 엑소좀은 HER2 양성 암 세포에서 발현되는 HER2 단백질에 결합하는 리간드를 노출시키도록 추가로 조작된다.
일부 실시형태에서, 리간드는 HER2 친화성을 갖는 펩티드이고, 바람직하게는 HER2 단백질에 특이성을 갖는다. 본 발명의 적합한 리간드는 예를 들어 항HER2 모노클로날 항체의 항원 결합 세그먼트와 같은 항HER2 항체의 세그먼트일 수 있다. 일부 실시형태에서, 항HER2 항체의 세그먼트는 Fab, Fv, scFv 및 F(ab')2로부터 선택된다. 적합한 항HER2 항체는 FDA에 의해 승인된 것이고, 즉 트라스투주맙 및 페르투주맙이다. 이 외에, 조사된 항HER2 모노클로날 항체의 세그먼트(예를 들어 MacroGenics, Inc의 Margetuximab)는 본 발명에서 사용될 수 있을 것으로 예상된다.
System Biosciences(SBI)에서 개발한 XStampTM 기술과 같이 엑소좀막에서 펩티드 리간드를 노출시키는 방법은 이미 시장에서 획득할 수 있다.
방법 및 요법
본 발명의 다른 양태는 상기 대상체에게 치료 유효량의 본원에 개시된 조작된 엑소좀을 투여하는 단계를 포함하는 이를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공한다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 방법에서, 엑소좀의 투여는 상기 대상체에게 상기 엑소좀을 포함하는 약물 조성물을 투여함으로써 구현된다.
일부 실시형태에서, 임의의 약물 조성물은 종양내, 정맥내, 근육내, 경피 또는 피내와 같은 비경구 또는 비경구 투여된다. 일부 실시형태에서, 임의의 약물 조성물은 바람직하게 종양내 투여된다. 일부 실시형태에서, 임의의 약물 조성물은 바람직하게는 정맥내 투여된다.
본 발명의 방법은 HER2 증폭 및/또는 과발현을 갖는 암을 포함하는 다양한 HER2 양성 암의 치료에 사용되는 것을 고려한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 엑소좀은 HER2에 의존하는 암의 치료에 사용된다. 본 발명에 따라 치료될 수 있는 HER2 양성 종양의 실시예는 유방암, 위암, 타액암, 질암, 방광암, 자궁내막암, 자궁경부암 및 대장암을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
약물 조성물
본 발명의 다른 양태는 본원에 제공된 임의의 엑소좀 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약물 조성물을 제공한다. 상기 약물 조성물은 대상체의 HER2 양성 암의 예방 또는 치료에 사용된다.
통상적인 저장 및 사용 조건에서, 이러한 제제/조성물은 미생물의 성장을 방지하는 방부제를 포함한다. 주사 용도에 적합한 약물 형태는 무균 수용액 또는 분산액 및 무균 주사 용액 및 분산액을 임시적으로 제조하기 위한 무균 분말을 포함한다. 모든 경우, 이 형태는 반드시 무균 상태여야 하고, 일정한 유동성을 가져야 주사하기 용이한 정도에 도달한다. 이 형태는 생산 및 저장 조건에서 안정적으로 유지되어야 하고, 미생물(예를 들어 박테리아 및 곰팡이) 오염 방지를 수행하여야 한다.
담체는 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어 글리세롤, 프로필렌글리콜 및 액체 폴리에틸렌글리콜 등), 이들의 적합한 혼합물 및/또는 식물성 오일을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 분산된 경우, 예를 들어 레시틴과 같은 코팅제를 사용하여 필요한 입자 크기를 유지하고 계면 활성제를 사용하여 적절한 유동성을 유지한다. 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살과 같은 다양한 항세균제 및 항진균제를 통해 미생물의 작용을 예방할 수 있다. 많은 경우, 당, 염화나트륨 또는 인산염 완충 식염수와 같은 등장제를 포함하는 것이 가장 좋다. 조성물에서 흡수를 지연시키는 시약(예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴)을 사용하여 주사 가능한 조성물의 흡수를 연장시킬 수 있다.
수용액으로 비경구 투여하는 경우, 예를 들어, 용액은 적절하게 완충되어야 하고(필요하면), 먼저 충분한 식염수 또는 포도당으로 등장시킨다. 이러한 특정된 수용액은 특히 정맥내, 근육내, 피하, 종양내 및 복강내 투여에 적용된다. 이와 관련하여, 본 발명의 내용에 따르면, 무균 수성 매질을 사용할 수 있는 것은 본 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 공지된 것이다. 예를 들어, 1회 투여량을 1 mL의 등장성 NaCl 용액에 용해시키고, 1000 mL의 피하 관류 용액에 첨가하거나, 권장하는 주입 위치에 주사할 수 있다.
치료하는 대상체의 상태에 따라, 투여량은 필연적으로 일부 변화를 발생할 것이다. 어쨌든, 투여 책임자는 개별 대상체에 대한 적절한 투여량을 결정한다. 사람에게 투여하는 경우, 제제는 FDA에서 요구하는 무균성, 발열성, 일반 안전성 및 순도 표준을 충족시켜야 한다.
활성 화합물을 필요한 양으로 이상에서 나열된 다양한 기타 성분과 필요에 따라 적절한 용매에 병합한 후, 여과 및 멸균하여 무균 주사 용액을 제조한다. 일반적으로, 다양한 멸균된 활성 성분을 기본 분산 매질과 상기에서 나열된 필요한 기타 성분을 포함하는 무균 담체에 통합하여 분산액을 제조한다. 무균 주사 용액의 제조를 위한 무균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 진공 건조 및 동결 건조 기술이고, 이는 이전에 무균 여과된 용액에서 활성 성분 및 임의의 다른 필요한 성분의 분말을 생성한다.
서열 목록
이하는 본 발명에서 언급된 서열의 요약이다. 서열의 전자 형태는 제조되어 본 출원에 첨부된다.
실시예
방법 및 재료
구입한 세포계: HEp-2 세포계(인간 후두암 세포)는 American Type Culture Collection(ATCC)에서 구입하였다. HEK-293 세포계(인간 배아 신장 293 세포) 및 SK-OV-3 세포계(인간 난소 상피암 세포)는 중국과학원 전형문화보존위원회 셀뱅크(중국 상해)에서 구입하였다. HCT116 세포계(인간 대장암 세포) 및 MDA-MB-231 세포계(인간 유방암 세포)는 두쥔(Du Jun) 교수(Sun Yat-Sen University, Guangzhou, China)로부터 친절하게 제공받았다. HEp-2 세포를 5%(vol/vol)의 소태아혈청(FBS)이 보충된 DMEM(고포도당)에서 배양한다. HEK-293 및 MDA-MB-231 세포를 10%(vol/vol)의 FBS를 함유한 DMEM(고포도당)에서 유지한다. SK-OV-3 세포를 10%(vol/vol)의 FBS가 보충된 McCoy 5A 배지에서 배양한다. 모든 배지에는 모두 100 U/ml의 페니실린 및 100 μg/ml의 스트렙토마이신이 함유된다. 세포를 37℃에서 5% CO2를 함유하는 습윤한 가스 분위기에서 배양한다.
안정적인 세포계의 생성: HER2를 표적화하는 miRNA를 발현하는 안정적인 세포계 293-miR-HER2는 miR-HER2-E1 플라스미드를 HEK-293 세포에 형질감염시켜 생성한 것이다. 48시간 동안 형질감염시킨 후, 최종 농도가 6 μg/ml 될 때까지 블라스티시딘(Solarbio Life Sciences)을 첨가하여 세포를 선택한다. 녹색 형광 단백질(GFP) 발현을 갖는 세포 콜로니를 선택하고 6 μg/ml의 블라스티시딘이 함유된 완전 배지에서 배양한다. 세포계의 GFP 및 miR-HER2-E1의 발현을 모니터링한다.
HER2 양성 세포 표면의 엑소좀에 부착될 수 있는 세포계를 생성하기 위하여, 제조업체의 지침(XStamp 기술, SBI: XSTP724PA-1/XSTP710PA-1)에 따라, 293-miR-HER2 세포를 렌티바이러스 벡터 XSTP724PA-1(XStamp HER2 리간드 엑소좀 HER2 수용체 표적화 렌티바이러스 벡터)로 감염시키거나, 대조 렌티바이러스 벡터 XSTP710PA-1로 감염시킨다. 이 두 가지 세포계를 각각 293-miR-XS-HER2 및 293-miR-XS(대조)로 변경시킨다. 렌티바이러스 벡터 XSTP724PA-1은 HER2 리간드의 두 개의 복사본을 함유하고, 5' N 말단 신호 서열의 리더 서열에 융합시키며 리딩 프레임에서 3' C 말단 C1C2 XStamp 도메인에 융합시켜, 전체 융합 단백질이 분비된 엑소좀의 표면에 노출되도록 지시한다. ELISA는 293-miR-XS-HER2 세포에서 정제된 엑소좀의 HER2 결합 능력을 입증하였다.
항체: 항HER2(제품 번호 #2165S) 항체는 Cell Signaling Technology에서 구입하였다. 항GAPDH, 항Alix, 항CD9, 항아넥신V, 항Flotillin-1 및 항TSG101 항체는 다른 곳에서 설명되었다.
플라스미드 구축: HER2 유전자를 표적화하는 miRNA 서열은 BLOCK-iT™ RNAi Designer(Life Technologies) 설계를 사용하여 Ige Biotechnology(중국 광주)에서 합성하였다. 합성된 miRNA 세그먼트를 BamHI 및 XhoI 제한 효소로 소화하고, pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-neg 대조 플라스미드(Invitrogen)의 해당 부위에 클로닝한다. miRNA의 서열은 다음과 같다.
miR-HER2-1:
5'-AACTCAAGCAGGAAGGAAGGTGTTTTGGCCACTGACTGACACCTTCCTCTGCTTGAGTT-3' (SEQ ID NO. 7)
miR-HER2-4:
5'-TGTGAGAGCCAGCTGGTTGTTGTTTTGGCCACTGACTGACAACAACCATGGCTCTCACA-3' (SEQ ID NO. 8)
miR-HER2-E1:
5'-AACTCAAGCAGGAAGGAGGAGGTTTTGGCCACTGACTGAC CTCCTCCTCTGCTTGAGTT-3' (SEQ ID NO. 9)
miR-HER2-E4:
5'-TGTGAGAGCCAGCTGGAGGAGGTTTTGGCCACTGACTGACCTCCTCCATGGCTCTCACA-3' (SEQ ID NO. 10)
성숙한 miRNA의 서열에는 밑줄을 그었다. miR-HER2-E1 및 miR-HER2-E4는 각각 miR-HER2-1 및 miR-HER2-4의 변형된 버전으로, 엑소좀 모티브를 포함하고 있다.
HER2 유전자의 3'-UTR 서열을 함유하는 HER2 발현 플라스미드를 다음과 같이 생성한다. 먼저, 이하의 프라이머를 사용하여 PCR로 His 태그된 HER2 코딩 서열을 증폭한다.
정방향, 5’-CCCAAGCTTATGGAGCTGGCGGCCTTGTG-3’ (SEQ ID NO. 13) 및
역방향, 5’-ATAAGAATGCGGCCGCTTATCAGTGATGGTGATGGTGATGCACTGGCACGTCCAGACCCAG (SEQ ID NO. 14).
다음 PCR 세그먼트를 pcDNA3.1(+)의 HindIII/NotI 부위에 서브클로닝하여 pHER2-His를 생성한다. 3'-UTR 서열은 Ige Biotechnology(중국 광주)에서 합성하고, NotI 및 XbaI 제한 제한 엔도뉴클레아제로 소화하며 pHER2-His의 해당 부위에 클로닝한다.
엑소좀 분리 및 정량화: T150 플라스크에 접종된 HEK-293 세포(1 × 107)를 시뮬레이션 형질감염시키거나 10 μg NT 또는 miR-HER2-E1의 플라스미드로 형질감염시킨다. 4시간 동안 인큐베이션한 후, 세포를 인산염 완충 식염수(PBS)로 철저히 세척하고, 무혈청 배지에서 48시간 동안 더 인큐베이션한다. 안정적인 세포계의 세포를 T150 플라스크에 24시간 동안 접종하고, PBS로 철저히 세척하며 무혈청 배지에서 48시간 동안 더 인큐베이션한다. 300 × g에서 10분 동안 원심분리하여 세포를 제거하고, 엑소좀을 함유하는 무세포 세포외 배지를 수집한다. 다음 상청액을 10,000 × g에서 30분 동안 원심분리하여 죽은 세포와 세포 파편을 제거한다. 마지막으로, 정화된 상청액을 100,000 × g로 70분 동안 원심분리하여 엑소좀을 침전시킨다. 모든 원심분리 단계는 4℃에서 수행된다. 면역블롯팅에 있어서, 침전된 엑소좀을 RIPA 완충액에 재현탁시킨다. 세포 또는 마우스를 치료하기 위하여, 침전된 엑소좀을 PBS에 재현탁시킨다. 제조업체의 지침에 따라 강화형 BCA 단백질 검출 키트(Beyotime)를 사용하여 BCA 방법을 통해 엑소좀을 정량화한다.
엑소좀 크기 분석: Izon qNano 시스템(Izon, 크라이스트처치, 뉴질랜드; www.izon.com)를 사용하여 엑소좀의 크기 분포를 분석하고, 상기 시스템은 단일 분자 전기영동을 사용하여 나노포어를 통과하는 세포외 소포체를 검출한다. 상기 프로그램은 직경 범위가 75 내지 300 nm인 엑소좀의 입자 수를 정확하게 산출하였다. 구체적으로, 정제된 엑소좀은 0.05% Tween 20을 함유하는 PBS에 1: 10으로 희석하고, 격렬하게 진탕하며, 제조업체의 지침에 따라 NP200(A53942) 나노포어 기공 크기를 사용하여 측정한다. Izon Control Suite 소프트웨어 v3.3(Izon Science)을 사용하여 결과를 분석한다.
miRNA의 정량적 RT-PCR: 제조업체의 지침에 따라, TRIzol 시약(Thermo Fisher Scientific) 및 TRIzol LS 시약(Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 세포 및 현탁 엑소좀의 전체 RNA를 분리한다. TaqMan miRNA 역전사 키트 지침(Applied Biosystems, Inc.)의 지침에 따라, 이중으로 특정된 스템 루프 프라이머를 사용하여 50 ng의 전체 RNA에서 테스트된 miRNA를 역전사한다. Applied Biosystems, Inc에서 구입한 TaqMan Universal Master Mix II 키트를 사용하여, 실시간 PCR로 miRNA 발현을 측정한다. miRNA 복사본 수를 세포 내 18S rRNA의 복수본 개수로 표준화시킨다. miR-HER2-E1에 특이적인 프라이머는 Ige Biotechnology에서 설계하고 합성한다. 서열은 다음과 같다.
miR-HER2-E1스템 루프 프라이머,
5’-GTCGGTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCTCCTCCT-3’ (SEQ ID NO. 15);
정방향 프라이머, 5’-AACCAAGCAGGAAGGAGG-3’ (SEQ ID NO. 16);
역방향 프라이머, 5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’ (SEQ ID NO. 17);
프로브, 5’-(6-FAM) TCGCACTGGATACG (MGB)-3’ (SEQ ID NO. 18).
플라스미드 형질감염: SK-OV-3 또는 HEp-2 세포를 웰당 2.5 × 105개의 세포로 12웰 플레이트에 접종한다. 제조업체의 지침에 따라, Lipofectamine 2000 시약(Thermo Fisher Scientific)을 사용하여, 0.5 μg의 발현 miR-HER2-E1, miR-HER2-E4 또는 비표적(NT) miRNA의 플라스미드로 세포를 형질감염시키거나, 0.2 μg의 코딩 His 태그된 HER2의 플라스미드로 HEp-2세포를 공동 형질감염시킨다. 형질감염 72시간 후에 세포를 수확하고 면역블롯팅 분석에 사용한다.
엑소좀 인큐베이션: SK-OV-3 세포를 웰당 2.5 × 105개의 세포로 상이한 농도(0.1 μg, 5 μg 또는 20 μg)의 miR-HER2-E1을 포함하는 정제된 엑소좀또는 NT로 형질감염된 HEK-293 세포에 의해 생성된 정제된 엑소좀에 노출시키거나 72시간 처리하지 않는다(Con). HEp-2 세포에 있어서, 웰당 2.5 × 105의 밀도로, His 태그된 HER2를 코딩하는 0.2 μg의 플라스미드로 36시간 동안 형질감염시킨 후, miR-HER2-E1 또는 NT miRNA를 코딩하는 20 μg의 플라스미드로 형질감염된 HEK-293 세포에 의해 생성된 정제된 엑소좀과 인큐베이션하거나 계속하여 36시간 동안 치료하지 않는다. 다음 세포를 수확하여 면역블롯팅을 통해 내인성 및 외인성 HER2 발현의 분석에 사용된다.
면역블롯팅 분석: 세포 침전 또는 정제된 엑소좀을 수확하고, 프로테아제 억제제 페닐메틸설포닐 플루오라이드(PMSF)(1 mM; Beyotime) 및 포스파타제 억제제(Beyotime)가 보충된 RIPA 용해 완충액(Beyotime)으로 용해시킨다. 세포 용해물과 엑소좀을 100℃ 인큐베이터에서 10분 동안 열 변성시키고, 10% 또는 8% SDS-PAGE로 분리하여 폴리비닐리덴 디플루오라이드막(Millipore)으로 전이시킨다. 적절한 1차 항체와 인큐베이션한 후, HRP 접합된 2차 항체(Pierce)와 인큐베이션하여 단백질을 감식한다. ECL 시약(Pierce)을 사용하여 면역 반응을 관찰하고, ChemiDoc Touch 이미징 시스템(Bio-Rad)을 사용하여 이미지를 획득하며 Image Lab 소프트웨어를 사용하여 분석한다. ImageJ 소프트웨어를 사용하여 해당 밴드의 밀도를 정량화한다.
세포 활력 테스트: 엑소좀에 노출되기 하루 전에, SK-OV-3, HCT116, HEp-2 및 MDA-MB-231 세포를 웰당 1×104개의 세포의 밀도로 96웰 플레이트에 접종한다. 3중 웰의 세포를 시뮬레이션 처리(시뮬레이션)하거나 1 μg의 정제된 엑소좀으로 인큐베이션하고, 상기 엑소좀은 miR-HER2-E1 또는 비표적(NT) miRNA를 코딩하는 플라스미드로 형질감염된 HEK-293 세포에 의해 생성된다. 72시간 인큐베이션 후, 제조업체의 프로토콜에 따라 CCK8 시험을 통해 상대적인 세포 활력을 결정한다.
동물 모델: 6-7주령의 BALB/c 누드 마우스를 Weitong Lihua Experimental Animal Technology Co., Ltd.(중국 북경)에서 구입하였다. 누드 마우스의 옆구리에 5 × 106의 SK-OV-3, HCT116 또는 MDA-MB-231 세포를 피하 주사한다. 엑소좀에 의해 전달된 miR-HER2-E1 처리에서, 종양 평균 부피는 90 mm3의 마우스에 매번 10 μg의 정제된 엑소좀을 함유하는 50 μl를 종양내 주사한다. 각각의 종양 보유 동물을 제1, 4, 7, 10, 13 및 16일에 주사하고, 총 6회 주사한다. 제1, 4, 7, 10, 13, 16, 19 및 22일에 종양의 크기를 측정한다. 엑소좀에 의해 전달된 293-miR-XS-HER2 처리에서, BALB/c 유래된 누드 마우스의 옆구리에 5×106 SK-OV-3 세포를 피하 주사한다. 평균 80 mm3의 종양에 제1, 4, 7, 10, 13, 16, 19 및 22일에 293-miR-XS-HER2, 293-miR- XS 또는 친본 HEK-293 세포에서 정제된 3 μg/동물 또는 30 μg/동물의 엑소좀을 정맥내 주사한다. 캘리퍼스를 사용하여 제1, 4, 7, 10, 13, 16, 19, 22, 25 및 28일에 종양의 크기를 측정하고, 부피를 (길이×폭2)×0.5로 계산한다.
ELISA: 293-miR-XS 또는 293-miR-XS-HER2 안정적인 세포계로부터 정제된 엑소좀을 96웰 ELISA 플레이트(Corning)의 세 개의 평행웰에 코팅한다(1 μg/웰). 코팅 용액을 제거한 후, 2% BSA로 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하여 비특이적 결합 부위를 차단한다. 플레이트를 세척하고, HER2 단백질(Sino Biological, 중국)에 2시간 동안 노출시키며, 다시 세척하고, HRP 접합된 토끼 항HER2 항체(제품번호 1004-R205, Sino Biological)와 1시간 동안 더 반응시킨다. 다음 플레이트를 다시 세척하고 TMB에 노출시켜 발색한다. 정지 용액을 첨가하여 반응을 정지시킨다. BioTek 마이크로플레이트 판독기에서 450 nm의 파장에서 플레이트를 판독한다.
HER2 합성을 억제할 수 있는 엑소좀 모티브를 갖는 miRNA의 설계 및 감식
첫번째 일련의 실험의 목표는 HER2를 표적화하는 miRNA를 설계하는 것이다. 이를 위해, 7개의 miRNA를 구축하였고, HER2 양성암 세포계 및 HER2를 코딩하는 플라스미드로 형질감염된 세포계에서 HER2 합성을 가장 효과적으로 차단하는 miRNA를 선택하였다. 재료 및 방법에 설명된 바와 같이, miRNA 서열을 명칭이 pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-neg인 miRNA 발현 벡터에 클로닝하고, EGFP를 코딩하는 오픈 리딩 프레임의 다운스트림에 위치한다.
최초 선별에서, miRNA를 코딩하는 플라스미드로 SK-OV-3(HER2 발현이 높은 세포계) 및 HEp-2(HER2를 코딩하는 플라스미드로 형질감염된 HER2 음성 세포계)를 형질감염시킨다. 테스트한 7가지 miRNA에서, 1번과 4번 miRNA가 단백질 수준에서의 HER2의 축적을 가장 효과적으로 억제하였다. 이러한 결과의 기초 상에서, 1번과 4번 miRNA를 선택하여 추가 연구하고, 각각 miR-HER2-1 및 miR-HER2-4로 명명한다.
다음으로, 엑소좀 패키징 관련 모티프(엑소좀 모티브)를 포함하는 서열을 추가하여 이 두 가지 miRNA를 변형시킨다. 다음 HER2를 발현하는 SK-OV-3 세포 및 HEp-2 세포에서 miR-HER2-E1 및 miR-HER2-E4의 HER2 억제 효능을 다시 테스트하였다. 면역블롯팅으로 분석한 단백질 축적을 통해, miR-HER2-E1 및 miR-HER2-E4는 모두 SK-OV-3 세포의 내인성 HER2 발현(도 1a, b) 및 HER2 플라스미드로 형질감염된 HEp-2 세포의 외인성 HER2 발현을 유의하게 하향 조절할 수 있음을 입증한다(도 1c, d). 이러한 결과에 기반하여, miR-HER2-E1을 선택하여 추가 연구하였다. miR-HER2-1, miR-HER2-4, miR-HER2-E1 및 miR-HER2-E4의 서열은 재료 및 방법에 나열되어 있다.
miR-HER2-E1 캡슐화 엑소좀의 생성 및 특성화
본 발명에 설명된 모든 실험에서, HEK-293 세포에 의해 생성된 엑소좀을 사용한다. 이러한 엑소좀의 특성은 아래에 간략히 설명된 바와 같이 연구하였다.
엑소좀의 단백질 함량을 평가하기 위하여, 면역블롯팅을 통해 미처리(293) 또는 비표적(NT) 또는 miR-HER2-E1 플라스미드로 형질감염된 HEK-293 세포의 정제된 엑소좀을 분석한다. Alix, CD9, Annexin V, Flotillin-1 및 TSG101은 엑소좀의 마커 단백질로 사용된다. 예상대로, 엑소좀 관련 단백질은 처리되지 않은 HEK-293, NT miRNA로 형질감염되고 miR-HER2-E1로 형질감염된 세포의 정제된 엑소좀에 존재한다(도 2a).
엑소좀의 크기 분포를 결정하기 위하여, 재료 및 방법에 기재된 바와 같이, Izon의 qNano 기술을 통해 miR-HER2-E1로 형질감염된 HEK-293 세포로부터 정제된 엑소좀을 분석한다. 결과(도 2b)는, HEK-293 세포의 엑소좀이 NT 또는 miR-HER2-E1로 형질감염된 세포의 엑소좀과 유사한 크기 분포를 갖는 것을 나타내고, 직경 범위는 75-150 nm이다.
도 2c는 정량적 PCR(qPCR)에 의해 측정된 성숙한 miR-HER2-E1의 발현 수준을 도시한다. 예상대로, miR-HER2-E1 플라스미드러 형질감염된 HEK-293 세포의 엑소좀에서 높은 수준의 성숙한 miR-HER2-E1을 검출하고, 이는 miR-HER2-E1에 함유된 엑소좀 모티브가 miRNA를 엑소좀으로 패키징하는데 도움이 되는 것을 입증한다. 대조적으로, 친본 HEK-293 세포 및 NT miRNA로 형질감염된 세포에서 정제된 엑소좀은 검출 가능한 양의 miR-HER2-E1을 함유하지 않는다.
miR-HER2-E1을 전달하는 엑소좀은 HER2의 축적을 줄이고 HER2 발현 수준이 높은 세포의 활력을 저하시킨다.
이 일련의 실험에서, HEK-293 세포에 의해 생성되고 엑소좀을 통해 전달되는 miR-HER2-E1이 HER2의 축적을 효과적으로 차단하는지 여부를 검사하였다. 아래에 2개의 일련의 실험을 보고한다.
첫번째 일련의 실험에서, SK-OV-3 세포는 상이한 농도의 miR-HER2-E1을 포함하는 정제된 엑소좀 또는 NT로 형질감염된 HEK-293 세포에 의해 생성된 정제된 엑소좀에 노출되거나 처리하지 않는다(Con). 결과는, miR-HER2-E1을 함유하는 엑소좀에 노출된 SK-OV-3 세포에서 HER2의 축적은 투여량 의존적 감소를 나타낸다. 특히, 최고 농도(20 μg)의 정제된 miR-HER2-E1 캡슐화된 엑소좀으로 처리할 경우, SK-OV-3 세포에서 HER2 발현이 유의하게 감소되지만, NT로 형질감염된 세포의 엑소좀은 HER2 발현에 영향을 미치지 않는다(도 3a, b).
두번째 일련의 실험은 miR-HER2-E1을 발현하는 엑소좀이 또한 외인성 HER2의 축적을 억제할 수 있는지 여부를 결정하기 위한 것이다. HER2를 코딩하는 플라스미드로 HEp-2 세포를 형질감염시킨 후, 상기 정제된 엑소좀에 노출시킨다. 도 3c 및 d는 외인성 HER2의 발현이 miR-HER2-E1을 함유하는 엑소좀의 세포에서 감소되지만, NT로 형질감염된 HEK-293 세포로부터의 엑소좀에서는 감소되지 않았다.
엑소좀을 통해 전달된 miR-HER2-E1에 의한 HER2 발현의 하향 조절은 HER2 양성 암 세포의 활력을 억제할 수 있다.
HER2 양성의 SK-OV-3과 HCT116 암 세포 및 HER2 음성의 MDA-MB-231과 HEp-2암 세포에서 단백질의 보충을 차단하여, 엑소좀에 의해 전달된 miR-HER2-E1이 HER2 의존성 세포에 대해 종양 살상 효과를 갖는다는 가설을 검증하고, 네 가지 세포계는 각각 miR-HER2-E1로 형질감염된 HEK-293 세포로부터 정제된 1 μg의 엑소좀에 노출시킨다.
CCK8 시험을 통해 상대적인 세포 활력을 결정한다. 결과(도 4)는 다음과 같다.
(i)NT miRNA를 포함하는 엑소좀으로 처리된 SK-OV-3 세포에 비해, miR-HER2-E1을 포함하는 엑소좀에 노출된 SK-OV-3 세포는 60%의 활력을 나타내고;
(ii)NT miRNA를 포함하는 엑소좀으로 처리된 HCT116 세포의 90% 활력에 비해, miR-HER2-E1을 포함하는 엑소좀에 노출된 HCT116 세포는 40%의 활력을 나타내며;
(iii)HEp-2 및 MDA-MB-231 세포(두 가지 유형의 HER2 음성 세포)는 miR-HER2-E1을 포함하는 엑소좀에 노출된 후 90-100%의 활력을 나타낸다.
이러한 결과는, (i)엑소좀에 의해 전달된 miR-HER2-E1이 단백질의 보충을 차단하여, HER2 의존성 세포에 항종양 작용을 갖고, (ii)miR-HER2-E1은 HER2에 의존하지 않는 세포의 활력에 영향을 미치지 않는 것을 입증한다.
체내에 투여된 엑소좀을 통해 전달된 miR-HER2-E1의 항종양 효능
SK-OV-3(HER2 양성), HCT116(HER2 양성) 또는 MDA-MB-231(HER2 음성) 세포는 체내 연구의 종양 모델로 사용되어, 엑소좀의 종양내 투여를 통해 전달된 miR-HER2-E1의 항종양 효능을 평가한다. 플라스미드로 형질감염된 HEK-293 세포로부터 정제된 10 μg의 엑소좀을 3일마다 종양내 주사하고, 총 6회 주사한다. 3일마다 종양의 크기를 측정한다. 결과(도 5)는, miR-HER2-E1을 포함하는 엑소좀이 SK-OV-3 종양(도 5a) 및 HCT116 종양(도 5b) 부피를 감소시키지만, HER2 음성의 MDA-MB-231 종양 세포에 의한 종양 부피를 감소시키지 않는 것을 입증한다(도 5c). 이러한 결과는, 엑소좀을 통해 전달된 miR-HER2-E1은 체내에서 HER2 발현을 간섭하고, HER2 양성 종양 성장을 특이적으로 억제할 수 있으며, 이는 세포 배양 연구에서 얻은 결과와 일치한 것을 입증한다.
HER2 이중 표적 엑소좀을 생성하는 안정적인 세포계의 생성
위에서 언급한 실험 결과는, miR-HER2-E1을 포함하는 엑소좀이 HER2 양성 및 HER2 음성 세포에 동시에 들어가지만, 최종적으로 HER2 양성 세포에서만 종양 살상 효과를 나타내는 것을 입증한다. 종양은 이질적이고, HER2 양성 암 세포 및 HER2 음성 세포를 포함할 수 있다. 연구에 따르면 HER2를 표적화하는 miRNA를 포함하는 엑소좀은 HER2 음성 세포에 영향을 미치지 않는 것을 입증하지만, 여전히 HER2 양성 종양 세포가 HER2를 표적화하는 miRNA를 포함하는 엑소좀의 흡수를 증가시켜야 한다. 이를 위해, 표면 펩티드로 엑소좀을 변형시켜, 이들이 암 세포 표면의 HER2에 결합하도록 한다. 아래에 설명된 연구의 목적은 HER2 양성 세포에 들어가는 엑소좀의 효율을 향상시키는 것이다. 이 목표를 달성하기 위하여, 새로운 엑소좀을 생성하는 두 가지 세포계를 생성하였다. 293-miR-XS-HER2 엑소좀의 표면에는 이러한 엑소좀이 HER2 양성 세포 표면의 HER2에 부착할 수 있도록 하는 펩티드가 포함된다. 대조적으로, 293-miR-XS 엑소좀의 표면에는 HER2 부착 펩티드가 결여된다. miR-HER2-E1은 두 가지 유형의 엑소좀에 패키징된다. 생성된 두 개의 세포계의 구축 및 특성화에 대한 자세한 내용은 재료 및 방법에 설명되어 있다.
먼저, 두 가지 세포계에 의해 생성된 엑소좀에 miR-HER2-E1이 존재하는 것을 검증하였다. 도 6a에 도시된 바와 같이, 세포 침전 및 정제된 엑소좀을 분석하여 두 가지 세포계에 의해 생성된 엑소좀에 모두 성숙한 miR-HER2-E1을 함유하는 것을 결정한다.
다음으로, 두 가지 세포계에 의해 생성된 엑소좀을 정제하고 ELISA 테스트하여, HER2 단백질에 부착하는 능력을 검증한다. 도 6b에 도시된 바와 같이, 293-miR-XS-HER2 세포로부터 생성된 정제된 엑소좀은 HER2 단백질에 우선적으로 결합한다. 결과는 이중 표적 293-miR-XS-HER2 엑소좀이 HER2 유전자를 표적화하는 miR-HER2-E1을 패키징하고 그 표면에 HER2 지시 펩티드를 노출시켜, 293-miR-XS-HER2 엑소좀이 우선적으로 HER2 miRNA를 HER2 양성 세포에 전달하도록 하는 것을 입증한다.
miR-HER2-E1을 포함하고 HER2에 부착하는 엑소좀의 항종양 효능
HER2 이중 표적 엑소좀(293-miR-XS-HER2)을 HER2 단일 표적 miRNA(293-miR-XS) 및 비표적 엑소좀(293)만으로 비교하고, 정맥 투여를 통해 체내에 향상된 항종양 효능을 갖는지 검증하기 위하여, HER2 양성 종양 세포 SK-OV-3를 BALB/c 누드 마우스 체내에 이식한다. 결과는, HEK-293 또는 293-miR-XS 세포에 의해 정제된 엑소좀에 비해, 293-miR-XS-HER2 세포에 의해 정제된 엑소좀은 HER2 양성 종양의 성장을 감소시키는데 유의하게 효과적임을 입증한다(도 7a 및 b). 이 외에, 각 마우스에 3 μg 및 30 μg 293-miR-XS-HER2 엑소좀을 주사한 후 종양 크기의 감소는 거의 동일하고, 이는 3 μg의 투여량이 감소성 세포에 대한 종양 살상 효과를 나타내는데 필요한 투여량에 가깝거나 그 이사임을 입증한다. 따라서, HER2 양성 세포에 의해 HER2에 대해 지시된 miRNA를 포함하는 엑소좀의 흡수를 유의하게 향상시켰다.
본 발명은 바람직한 실시형태 및 선택적 특징을 통해 개시되었지만, 본원에서 제시된 내용에 대한 수정, 개선 및 변경은 본 분야의 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 인식할 수 있고, 이러한 수정, 개선 및 변경은 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 간주되는 것을 이해해야 한다. 본원에서 제공하는 재료, 방법 및 실시예는 바람직한 실시형태의 대표이고, 예시적이며, 본 발명의 범위를 제한하도록 의도되지 않는다.
본원에서 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허 및 기타 참조 문헌은 모두 인용을 통해 전체가 본원에 명확하게 통합되고, 그 정도는 매 하나가 단독으로 인용을 통해 통합되는 것과 동일하다. 충돌이 발생하면, 본 명세서(정의 포함)를 기준으로 한다. 본원에서 설명적으로 설명된 개시 내용은 본 명세서에서 구체적으로 개시되지 않은 어떠한 요소, 제한이 없는 경우 적절하게 실시될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 용어 “포함”, “포함”, “함유” 등은 광범위하게 열독되어야 하고 제한을 받지 않는다. 이 밖에, 본원에서 사용하는 용어 및 표현은 설명적인 것으로 제한적인 용어가 아니고, 이러한 용어 및 표현을 사용하여 표시 및 상기 특징의 어떠한 균등물 또는 일부를 배제하려는 의도는 없지만, 본 발명이 보호하고자 하는 범위 내에서 다양한 수정이 이루어질 수 있음을 인식해야 한다.
SEQUENCE LISTING
<110> IMMVIRA CO., LIMITED
<120> Exosomes containing miRNAs targeting HER2 synthesis and
pharmaceutical compositions
<130> 191581-21D-WOP
<150> PCT/CN2020/123619
<151> 2020-10-26
<160> 18
<170> PatentIn version 3.5
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actcaag 7
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<223> EXO-motif
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<223> EXO-motif
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<223> Forward primer for HER2 PCR
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cccaagctta tggagctggc ggccttgtg 29
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for HER2 PCR
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g 61
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<223> miR-HER2-E1 stem-loop primer
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<223> miR-HER2-E1 Forward primer
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aaccaagcag gaaggagg 18
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<223> miR-HER2-E1 Reverse primer
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> miR-HER2-E1 Probe
<220>
<221> misc_feature
<223> 6-Carboxy-fluorescein(6-FAM) is attached to 5' end and Minor
Groove Binder(MGB) is attached to 3' end
<400> 18
tcgcactgga tacg 14
Claims (28)
- 인간 표피 성장 인자 수용체2(HER2)를 표적화하여 합성된 miRNA 및 엑소좀막에 노출되어 암 세포에서 발현되는 HER2 단백질에 특이적으로 결합하는 리간드를 포함하는 것을 특징으로 하는 조작된 엑소좀.
- 제1항에 있어서,
상기 miRNA의 씨드 서열은 SEQ ID NO. 1 또는 2로 표시되는 뉴클레오티드 서열 또는 그 등가물을 갖는 것을 특징으로 하는 조작된 엑소좀. - 제2항에 있어서,
상기 miRNA의 씨드 서열은 엑소좀 모티브에 작동 가능하게 연결된 것을 특징으로 하는 조작된 엑소좀. - 제3항에 있어서,
상기 엑소좀 모티브는 상기 씨드 서열의 다운스트림에 위치하는 것을 특징으로 하는 조작된 엑소좀. - 제3항 또는 제4항에 있어서,
상기 엑소좀 모티브는 -GGAG-, -GGAGGAG-의 서열 또는 그 등가물을 갖는 것을 특징으로 하는 조작된 엑소좀. - 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 miRNA의 성숙한 형태는 SEQ ID NO. 3 내지 6 중 어느 하나로 표시되는 뉴클레오티드 서열 또는 그 등가물을 갖는 것을 특징으로 하는 조작된 엑소좀. - 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 miRNA의 성숙한 형태는 SEQ ID NO. 5 또는 6으로 표시되는 뉴클레오티드 서열 또는 그 등가물을 갖는 것을 특징으로 하는 조작된 엑소좀. - 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 miRNA의 전구체는 SEQ ID NO. 7 내지 10 중 어느 하나로 표시되는 뉴클레오티드 서열 또는 그 등가물을 갖는 것을 특징으로 하는 조작된 엑소좀. - 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 miRNA의 전구체는 SEQ ID NO. 9 또는 10으로 표시되는 뉴클레오티드 서열 또는 그 등가물을 갖는 것을 특징으로 하는 조작된 엑소좀. - 제1항에 있어서,
상기 리간드는 상기 암 세포의 표면에 발현되는 HER2 단백질에 친화성을 갖는 펩티드인 것을 특징으로 하는 조작된 엑소좀. - 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 리간드는 상기 암 세포의 표면에 발현되는 HER2 단백질에 특이적으로 결합하는 펩티드인 것을 특징으로 하는 조작된 엑소좀. - 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 리간드는 항HER2 항체의 세그먼트인 것을 특징으로 하는 조작된 엑소좀. - 제12항에 있어서,
상기 항HER2 항체의 세그먼트는 Fab, Fv, scFv 및 F(ab')2로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조작된 엑소좀. - 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 암 세포의 생존은 HER2에 의존하는 것을 특징으로 하는 조작된 엑소좀. - 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 암 세포는 HER2의 과발현 또는 증폭을 갖는 것을 특징으로 하는 조작된 엑소좀. - 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 암 세포는 유방암, 위암, 타액암, 질암, 방광암, 자궁내막암, 자궁경부암 및 대장암 세포로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조작된 엑소좀. - 인간 표피 성장 인자 수용체2(HER2)를 표적화하여 합성된 miRNA를 포함하는 조작된 엑소좀에 있어서,
상기 miRNA의 씨드 서열은 SEQ ID NO. 1 또는 2로 표시되는 뉴클레오티드 서열 또는 그 등가물을 갖는 것을 특징으로 하는 조작된 엑소좀. - 제17항에 있어서,
상기 miRNA의 씨드 서열은 엑소좀 모티브에 작동 가능하게 연결된 것을 특징으로 하는 조작된 엑소좀. - 제18항에 있어서,
상기 엑소좀 모티브는 상기 씨드 서열의 다운스트림에 위치하는 것을 특징으로 하는 조작된 엑소좀. - 제18항 또는 제19항에 있어서,
상기 엑소좀 모티브는 -GGAG-, -GGAGGAG-의 서열 또는 그 등가물을 갖는 것을 특징으로 하는 조작된 엑소좀. - 제17항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 miRNA의 성숙한 형태는 SEQ ID NO. 3 내지 6 중 어느 하나로 표시되는 뉴클레오티드 서열 또는 그 등가물을 갖는 것을 특징으로 하는 조작된 엑소좀. - 제17항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 miRNA의 성숙한 형태는 SEQ ID NO. 5 또는 6으로 표시되는 뉴클레오티드 서열 또는 그 등가물을 갖는 것을 특징으로 하는 조작된 엑소좀. - 제17항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 miRNA의 전구체는 SEQ ID NO. 7 내지 10 중 어느 하나로 표시되는 뉴클레오티드 서열 또는 그 등가물을 갖는 것을 특징으로 하는 조작된 엑소좀. - 제17항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 miRNA의 전구체는 SEQ ID NO. 9 또는 10으로 표시되는 뉴클레오티드 서열 또는 그 등가물을 갖는 것을 특징으로 하는 조작된 엑소좀. - 제17항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 엑소좀은 HEK-293 세포로부터 유래된 것을 특징으로 하는 조작된 엑소좀. - 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 따른 조작된 엑소좀 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는 약물 조성물.
- 제26항에 있어서,
상기 약물 조성물은 주사 가능한 형태로 조제되는 것을 특징으로 하는 약물 조성물. - 제26항 또는 제27항에 있어서,
상기 약물 조성물은 정맥내 투여용으로 조제되는 것을 특징으로 하는 약물 조성물.
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