KR20230063085A

KR20230063085A - 분할된 t7 프로모터를 이용한 등온 단일 반응용 프로브 세트 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20230063085A
Application number: KR1020210147950A
Authority: KR
Inventors: 박기수; 윤태휘; 신지예
Original assignee: 건국대학교 산학협력단
Priority date: 2021-11-01
Filing date: 2021-11-01
Publication date: 2023-05-09
Anticipated expiration: 2041-11-01
Also published as: KR102679112B1; KR102679112B9

Abstract

본 발명은 분할 된 T7 프로모터를 이용한 등온 단일 반응용 프로브 세트 및 이의 용도에 관한 것으로, 3-방향 접합 구조체에 분할된 T7 프로모터를 새롭게 도입하여, 등온에서 타겟 분자의 존재 하에 다량의 형광 RNA 압타머를 생성하도록 설계하였으며, 하나의 튜브 안에서 하나의 효소만으로 신속하고 간편한 핵산 바이오 마커검출이 가능하다. 다중 핵산 바이오 마커의 고감도 검출 및 추가적인 핵산 추출 과정 없이 분석이 진행되는 검출을 통하여 다양한 응용이 가능하며, 하나의 튜브 안에서 다중 검출(multiplex analysis)을 할 수 있을 뿐만 아니라 바이러스, 병원균을 포함하여 다양한 분자진단이 가능하여 우수하다.

Description

분할된 T7 프로모터를 이용한 등온 단일 반응용 프로브 세트 및 이의 용도{Probe Set for Isothermal One-Pot Reaction using Split T7 promoter and Uses Thereof}

본 기술은 신속, 간편하게 다양한 타겟 분자를 검출하는 시스템에 관한 것으로 3-방향 접합 구조체에 분할된 T7 프로모터를 새롭게 도입하여, 등온에서 타겟 분자의 존재 하에 다량의 형광 RNA 압타머를 생성하도록 설계하였다. 이에 따라 기존 현장진단의 한계를 극복할 수 있으며, 다중 타겟 분자의 고감도 검출 및 추가적인 추출 과정 없이 분석이 진행되는 검출을 통하여 다양한 응용이 가능하다.

2019년 12월, 새로운 호흡기 전염성 RNA 바이러스인 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스(SARS-CoV-2) 및 변이 바이러스가 발병되었으며 전 세계로 빠르게 확산되었다. 따라서 바이러스 전파를 억제하기 위한 빠르고 편리하게 SARS-CoV-2 검출하는 기술이 요구되는 실정이다.

현재 SARS-CoV-2 검출에서 가장 많이 사용되는 방법은 핵산 증폭기반의 qRT-PCR(quantitative reverse transcription polymerase chain reaction)이다. 다양한 프라이머-프로브 세트가 밝혀져 있으며 매우 민감한 검출한계를 가지는 장점이 있으나, 모든 PCR 테스트는 온도 조절 장치가 필요하며 전문　실험실에서 진행되므로 오랜 시간(1-2일)이 걸리고 가격이 비싸다는 단점이 존재한다.

이러한 온도조절기반의 방법의 단점을 보완하고 검사 편의성을 위한 다양한 strand displacement polymerase를 사용한 등온 핵산 증폭 방법들이 개발되었다. 등온 증폭 방법은 온도 제어 기반 방법의 단점을 보완하고 현장 진료 테스트를 용이하게 하기 위해 개발되었다. 그러나 대부분의 등온 증폭 방법은 반응 개시 전에 온도 조절을 통한 변성(denaturation)/어닐링(annealing) 단계가 필요하다. 또한, 다양한 효소에 대한 반응을 최적화하기가 어렵고 검출 단계가 복잡하다는 단점이 있다. 특히, SARS-CoV-2의 경우 대부분의 등온 증폭 방법은 RNA를 cDNA로 변환하는 방식으로 진행되며, DNA 증폭 산물을 대량으로 생산하기 때문에 변환된 cDNA와 증폭된 DNA가 쉽게 분해되지 않아 오염에 취약하다. 이러한 오염은 반응을 방해하여 높은 위양성을 초래할 수 있다. 따라서 SARS-CoV-2를 탐지하기 위해서는 빠른 단일 단계 등온 증폭 방법이 여전히 필요하다.

3-방향 접합(Three-way junction) 구조 기반의 signal-mediated amplification of RNA technology(SMART)는 gDNA, total RNA 등에 적용이 가능하며, 다양한 핵산 바이오 마커의 고감도 검출에 사용되어져 왔다. 하지만, SMART 기술의 우수한 장점에도 불구하고, DNA 중합효소 와 RNA 중합효소 두 가지 효소를 필요로 한다는 한계가 있으며, 두 효소가 같이 존재할 경우 비 특이적인 신호를 발생하므로 one-step 반응이 불가능하고, 반응시간도 오래 걸린다는 단점이 있다.

한편, 형광 RNA 압타머는 특정 분자에 높은 특이성과 친화력을 가지고 있어 결합 시 높은 형광 신호를 나타내는 특성을 가지고 있다. 단백질인 항체 분자와 비교하여 열적, 화학적으로 높은 안정성을 갖으므로 세포 내 실험뿐 아니라 세포 외 실험에서도 많이 사용되고 있다. 이러한 형광 RNA 압타머는 가격이 저렴하고 낮은 배경 신호를 가지며 다중 분석에도 적용 가능한 장점을 가지고 있다.

SMART 기술과 관련하여, 국제 공개특허공보 WO 99/37806은 타겟 핵산서열을 검출하기 위한 SMART 기술에 대하여 개시하고 있으나, 2개의 중합효소를 이용하여 타겟하는 핵산을 검출했으며, 하나의 중합효소만을 이용한 기술에 대해서는 개시된 바 없다.

이에, 본 발명자들은 하나의 효소를 사용하면서도 매우 특이적이며 타겟 분자의 변화를 쉽게 구별할 수 있는 3-방향 접합 구조를 사용한 타겟 검출에 중점을 두어 본 발명을 완성하였다.

이에, 본 발명자들은 기존 SMART 분석의 단점을 극복하면서 타겟 분자를 신속하게 검출할 수 있는 새로운 등온 핵산 증폭 기술을 개발하기 위해 노력한 결과, 3-방향 접합(three-way junction) 구조 기반 신규 등온 핵산증폭기술(37℃)을 발명하였으며 추가적인 라벨링 없이 저렴하고 쉽게 프로브를 디자인하여 다중 분석이 가능하도록 설계하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 제1프로브 및 제2프로브를 포함하는, 하나 이상의 타겟 분자 검출용 등온 단일반응(isothermal one-pot reaction) 프로브 세트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 상기 제1프로브 및 제2프로브를 포함하는 타겟 분자 검출용 등온 단일 반응 프로브 세트를 포함하는 타겟 분자 검출용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 상기 타겟 분자 검출용 조성물, 중합효소 및 등온 단일 반응 용액을 포함하는, 타겟 분자 검출용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 상기 타겟 분자 검출용 등온 단일 반응 프로브 세트를 이용하여 타겟 분자를 검출하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 타겟 분자 검출용 등온 단일 반응 프로브 세트를 이용한 현장용 분자 진단 방법을 제공하는 것이다.

본 명세서에서 사용한 용어는 단지 설명을 목적으로 사용된 것으로, 한정하려는 의도로 해석되어서는 안된다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다. 다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 실시예가 속 하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반 적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 다음의 제1프로브 및 제2프로브를 포함하는, 하나 이상의 타겟 분자 검출용 등온 단일반응(isothermal one-pot reaction) 프로브 세트를 제공한다:

상기 제1프로브는 하기 일반식 I 및 II를 포함하는 구조를 갖는 프로모터 프로브(promoter probe, PP)이고,

[일반식 I]

5'-X-Y-Z-3'

[일반식 II]

3'-Ya-5'

상기 일반식 I에서,

X는 검출 가능한 시그널을 발생시키는 하나의 표지(label) 또는 다수의 표지를 포함하는 상호작용적 표지 시스템을 갖는 압타머 서열 부위이고;

Y는 T7 프로모터에 상보적인 서열이며;

Z는 타겟 분자에 결합 또는 연결되는 부위이며;

X 및 Y는 디옥시리보뉴클레오타이드이며;

상기 일반식 II에서,

Ya는 T7 프로모터의 일부 서열이고; Ya는 디옥시리보뉴클레오타이드이며;

상기 제2프로브는 하기 일반식 (III)으로 이루어진 구조를 갖는 프로모터 프로브(promoter probe,PP)이고,

[일반식 III]

3'-Yb-Z'-5'

상기 일반식 (III)에서,

Yb는 존재하지 않거나, T7 프로모터의 일부 서열이고, 디옥시리보뉴클레오타이드이며;

Z’은 타겟 분자에 결합 또는 연결되는 부위이며;

상기 제1프로브 및 제2프로브는 타겟 분자와 결합 또는 연결된 후 중합효소에 의해 전사가 개시되어 시그널을 생성하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 타겟 분자는 핵산, 단백질, 세포 및 ATP일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 타겟 분자가 핵산인 경우, Z 및 Z'은 검출하고자 하는 핵산에 상보적으로 결합하는 핵산 서열이고, 상기 타겟 분자가 단백질인 경우, Z 및 Z'은 상기 단백질에 결합할 수 있는 항체, 압타머이고, 상기 타겟 분자가 세포인 경우, Z 및 Z'은 세포 외 단백질, 세포의 인지질, 균의 펩티도글라이칸 및 LPS로 이루어진 군에서 선택되는 어느 1종 이상에 결합할 수 있는 항체, 압타머이고, 상기 타겟 분자가 ATP인 경우, Z 및 Z'은 ATP에 결합할 수 있는 split 압타머인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 Ya 및 Yb는 T7 프로모터의 일부 서열이며, 상기 Ya 및 Yb는 상기 Ya 및 상기 Yb 순서로 연속적으로 배열될 경우 상기 T7 프로모터를 이루고, Ya : Yb 분할 비율은 20:0 내지 15:5 인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서, 상기 Ya : Yb 분할 비율은 16:4일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 표지는 화학적 표지, 효소 표지, 방사능 표지, 형광 표지, 발광 표지, 화학발광 표지 및 금속 표지로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 제1프로브의 상기 일반식 I은, Y와 Z 사이에 중첩서열 W를 추가로 포함한 일반식 I'로 변형될 수 있고;

[일반식 I']

5'-X-Y-W-Z-3'

상기 제2프로브의 상기 일반식 III은, Yb와 Z' 사이에 중첩서열 W'를 추가로 포함한 일반식 III'으로 변형될수 있는 것을 특징으로 하는

[일반식 III']

3'-Yb-W'-Z'-5'

타겟 분자 검출용 등온 단일 반응 프로브 세트일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 중첩서열 W 및 W'의 길이는 1bp 또는 2bp일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 등온 단일 반응은, 15℃ 내지 50℃ 범위의 일정한 온도에서 수행될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 프로브 세트는 선형 RNA(linear RNA)와 구분하여 원형 RNA(circular RNA)를 검출하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 중합효소는 박테리오파지 T7 RNA 중합 효소, 박테리오파지 T3 중합 효소, 박테리오파지 RNA 중합 효소, 박테리오파지 ΦII 중합 효소, 살모넬라 박테리오파지 sp6 중합 효소, 슈도모나스 박테리오파지 gh-1 중합효소, 대장균(E. coli) RNA 중합효소 홀로효소(holoenzyme), 대장균(E. coli) RNA 중합효소 코어 효소, 인간 RNA 중합효소 I, 인간 RNA 중합효소 II, 인간 RNA 중합효소 III, 인간 미토콘드리아 RNA 중합효소 및 이의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 등온 단일 반응은 Tris-HCl, MgCl2, DTT, 스페르미딘, rNTPs, RNase 억제제 및 SSB(Single-Stranded DNA Binding Protein)가 포함된 단일 반응 용액으로 일원화되어 동시 수행되는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 또한 상기 타겟 분자 검출용 등온 단일 반응 프로브 세트를 포함하는, 타겟 분자 검출용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 2종 이상의 타겟 분자를 검출하기 위한 2종 이상의 타겟 분자 검출용 등온 단일 반응 프로브 세트를 포함할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 2종 이상의 타겟 분자 검출용 등온 단일 반응 프로브 세트는 각각 서로 상이한 상호작용적 표지 시스템을 포함하고; 상기 2종 이상의 프로브 세트 각각은 각각 서로 상이한 타겟 분자에 결합하여; 이로 인해 서로 상이한 타겟 분자의 다중 검출이 가능할 수 있다.

본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 등온 단일 반응은, 15℃ 내지 50℃ 범위의 일정한 온도에서 수행될 수 있다.

본 발명은 또한 상기 타겟 분자 검출용 조성물, 중합효소 및 등온 단일 반응 용액을 포함하는, 타겟 분자 검출용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 타겟 분자 검출용 등온 단일 반응 프로브 세트를 이용하여 타겟 분자를 검출하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 타겟 분자를 검출하는 방법 이전에, 등온핵산증폭 반응을 수행하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 등온핵산증폭 반응은 RPA(Recombinase Polymerase Amplification)일 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 타겟 핵산서열 검출용 등온 단일 반응 프로브 세트를 이용한 현장용 분자 진단 방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 분자 진단 방법은 병원성 미생물 검출에 사용될 수 있다.

본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 병원성 미생물은 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus Aureus), 비브리오 불니피쿠스(Vibrio vulnificus), 대장균(E. coli), 중동 호흡기 증후군 코로나바이러스(Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus), 인플루엔자 A 바이러스(Influenza A virus), 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스(Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus), 호흡기 세포 융합 바이러스(RSV), 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 헤르페스 심플렉스 바이러스(HSV), 인유두종 바이러스(HPV), 인간 파라인플루엔자 바이러스(HPIV), 뎅기열 바이러스, B형 간염 바이러스(Hepatitis B Virus (HBV)), 황열병 바이러스, 광견병 바이러스, 플라스모디움, 거대세 포바이러스(CMV), 미코박테리움 튜버큘로시스, 클라미디아 트라코마티스, 로타바이러스, 인간 메타뉴모바이러스 (hMPV), 크리민 콩고 출혈열 바이러스 (Crimean-Congo hemorrhagic fever virus), 에볼라 바이러스, 지카 바이러스, 헤니파바이러스, 노로바이러스, 라사바이러스, 리노바이러스, 플라비바이러스, 리프트 밸리 열 바이러스, 수족구병 바이러스, 살모넬라(Salmonella sp.), 쉬켈라(Shigella sp.), 엔테로박테리아세(Enterobacteriaceae sp.), 슈도모나스(Pseudomonas sp.), 모락셀라(Moraxella sp.), 헬리코박터(Helicobacter sp.) 및 스테노트로 포모나스(Stenotrophomonas sp.)로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상일 수 있다.

본 발명은 하나의 튜브 안에서 하나의 효소만으로 신속하고 간편하게 타겟 분자의 검출이 가능하다. 또한, 프로브의 설계가 간편하며 추가적인 라벨링이 필요 없을 뿐만 아니라, 열처리 만으로 전처리 없는 direct 시스템의 구현이 가능한 등온 핵산증폭 방법을 제공한다. 또한, 하나의 튜브 안에서 다중 검출(multiplex analysis)이 가능하며, 바이러스, 병원균을 포함하여 다양한 분자진단이 가능하다.

도 1은 타겟 분자 검출을 위한 Split T7 promoter-based isothermal Amplification with RNA Aptamer(이하 "STAR"라고 명명)의 개략도를 나타낸다. 본 발명의 STAR 반응은 세 가지 중요한 구성 요소는 STAR DNA 프로브, T7 RNA 중합효소 및 형광 염료이다. 타겟 RNA의 존재 하에, STAR DNA 프로브는 3방향 접합 구조를 형성하고 닉 부위를 갖는 이중 가닥 T7 프로모터가 완성된다. T7 RNA 중합효소는 T7 프로모터에 결합할 수 있고 많은 양의 발광하게 하는 RNA 압타머 생성을 위한 전사를 개시할 수 있다. 그 후, RNA 압타머는 형광 염료와 결합하여 고도로 향상된 형광 신호를 생성한다. One-step 반응은 37℃에서 30분 이내에 일어난다.
도 2는 타겟 분자가 단백질 또는 세포인 경우의 개략도를 나타낸다.
도 3은 분할 T7 프로모터의 다양한 비율에서의 분할 결과를 나타낸다.
도 4은 중첩 길이의 최적화 결과를 나타낸다.
도 5는 3-방향 접합 구조에 bulge 구조를 넣었을 때의 T7 프로모터의 안정성에 관한 결과를 나타낸다.
도 6은 반응조건의 최적화를 위한 버퍼의 조성 중 DTT와 MgCl2의 농도를 나타낸다.
도 7은 스페르미딘과 단일 가닥 DNA 결합 단백질(SSB)의 최적의 농도를 찾기 위해 측정한 형광강도 결과이다.
도 8은 T7 RNA 중합효소 농도별, 반응시간, 반응온도, 냉각 방법에 따른 형광강도 결과를 나타낸다.
도 9는 최적화된 버퍼를 이용한 경우 3-방향 접합 구조와 선형 구조의 T7 프로모터의 전사효율을 비교한 결과이다.
도 10은 3-방향 접합 구조를 확인하기 위한 겔 전기영동 결과를 나타낸다.
도 11은 STAR의 각 요소가 없는 형광 스펙트럼 결과이다.
도 12는 선형 RNA 와 구분하여 원형 RNA(circular RNA)를 검출하는 방법으로 이용될 수 있음을 나타낸 개략도이다.
도 13은 STAR 반응을 수행하기 이전에 등온 핵산 증폭 반응을 수행하는 경우 검출 강도가 증가됨이 나타난 결과이다.
도 14는 SARS-CoV-2 N 유전자의 각 유전자 좌위의 검출 감도에 관한 것으로, 도 14A는 SARS-CoV-2 N 유전자의 일부와 타겟 RNA의 유전자좌(1-5)의 개략도를 나타내며, 도 14B는 N 유전자의 다른 유전자좌(L1-L5)에 대한 5개 세트의 DNA 프로브를 사용한 STAR의 검출 감도를 보여주는 히트맵, 도 14C는 L2 및 L4에서 STAR의 검출 한계로, STAR 프로브 세트는 각 유전자좌에 대해 100nM이다.
도 15는 감도를 개선하기 위한 두 세트의 STAR 프로브 조합을 나타낸다. 도 15A는 SARS-CoV-2 N 유전자와 다른 인간 코로나바이러스의 두 가지 다른 유전자좌의 개략도로, SARS-CoV-2와 다른 다른 바이러스 RNA 서열의 뉴클레오타이드는 회색으로 흐릿하다. 도 15B는 N 유전자 RNA로 설정된 STAR 프로브의 아가로스 겔 전기영동 이미지로, L2 및 L4 프로브 세트의 농도는 각각 500nM이고(a 및 b), L2 및 L4 프로브가 동시에 존재할 때 각 프로브 세트의 농도는 250nM(c)이다. 도 15C는 L2 프로브 세트(100nM), L4 프로브 세트(100nM), L2 및 L4 프로브 세트(50nM+50nM) 모두의 존재 하에서 측정된 형광 신호를 나타내며, 타겟 N 유전자 RNA의 농도는 1nM이다. 도 15D는 L2 및 L4에서 STAR 프로브 세트 조합 사용의 검출 한계로, STAR 프로브 세트의 농도는 각각의 다른 유전자좌에서 50nM이다. 도 15E는 2개의 STAR 프로브 세트(L2 및 L4) 사용 시 STAR 분석의 검출 특이성을 나타낸 것으로, SARS-CoV-2 N 유전자 RNA의 농도는 1nM이었고 나머지는 100nM이었으며, STAR 프로브 세트(L2 및 L4)의 농도는 각각 50nM이었다.
도 16은 SARS-CoV-2 D614G 돌연변이 검출을 위한 STAR의 적용을 나타낸 것이다. 도 16A는 SARS-CoV-2의 S 유전자에서 D614G 돌연변이에 대한 STAR 분석의 개략도를 나타내며, 돌연변이 부위는 노란색으로, 야생형 타겟에서 위양성 신호를 피하기 위해 빨간색으로 표시된 불일치 시퀀스를 추가했다. 도 16B는 N4 위치에서 다른 핵염기(A, T, G 및 C)를 사용하여 STAR 후에 얻은 말라카이트 그린(MG) 신호 강도를 나타낸다. 도 16C는 D614G 돌연변이에 대한 STAR의 검출 한계로, 타겟 RNA의 농도는 1 nM에서 100 fM 범위이다. 도 16D는 상이한 몰비(0%, 0.1%, 1%, 10%, 50% 및 100%)를 갖는 돌연변이/야생 타겟의 혼합물에서 D614G 돌연변이의 검출한 결과를 나타낸다.
도 17은 다중 검출을 위한 시스템을 나타낸다. 도 17A는 SARS-CoV-2 N 유전자 및 D614G 돌연변이의 동시 검출을 위한 one-pot 다중 STAR의 개략도이다. 도 17B는 망고 압타머 및 MG 압타머에 각각 결합하는 TO1-비오틴 및 MG의 정규화된 형광 방출 스펙트럼이다. 도 17C는 N 유전자 및 D614G 돌연변이의 원팟, 다중 검출 결과를 보여주는 히트맵으로, 타겟 RNA의 농도는 10nM이다. 도 17D는 다른 농도에서 N 유전자 및 D614G 돌연변이의 one-pot 다중 검출 결과를 나타낸다.
도 18은 병원체 검출을 위한 시스템을 나타낸다. 도 18A는 STAR를 사용한 병원체 검출의 개략도로, 병원체 검출을 위해 STAR 프로브는 병원체의 16s rRNA 영역에 대해 설계되었으며, (i) 하나는 추출된 total RNA를 이용한 STAR이고 (ii) 다른 하나는 열분해를 통해 얻은 cell lysate를 이용한 direct STAR이다. 도 18B는 STAR를 사용한 박테리아 16S rRNA의 검출. 100pg/μL에서 100fg/μL 범위의 총 RNA 농도를 테스트했다. 도 18C는 다른 병원체의 검출을 위한 직접 STAR의 결과를 보여주는 히트맵으로, 각 병원체의 농도는 10³ cells/μL이다.

상술한 바와 같이, 등온 증폭 반응을 이용하면서도, 두개의 효소를 이용하는 경우 비특이적 신호를 발생시키고, one-step 반응이 불가능하며 반응시간도 오래 걸린다는 단점을 극복하고자 하는 필요성이 대두되었다. 본 발명자들은 기존 SMART 분석의 단점을 극복하면서 타겟 분자를 신속하게 검출할 수 있는 새로운 등온 증폭 기술을 개발하기 위해 노력한 결과, 타겟 분자를 신속하게 분석할 수 있는 3-방향 접합 기반 신규 등온 증폭 기술을 발명하였다. 본 발명에 따른 발명에서는 T7 프로모터 서열의 분할 비율의 조절을 통하여 타겟 물질에 의한 전사 반응이 효과적으로 일어나도록 설계하였으며, 이를 기반으로, 타겟 분자가 존재할 경우에만 3-방향 접합 구조 기반의 T7 프로모터가 형성되고, 이를 통해 하나의 튜브안에서 중합효소 하나만으로 증폭된 신호를 얻을 수 있도록 하였다. 또한, 추가적인 민감도 상승을 위해, 타겟 분자에서 여러 영역에 결합할 수 있도록 추가적인 3-방향 접합 구조를 설계하였으며, 이를 통해 민감도 상승을 이루어 낼 수 있었다. 본 발명은 타겟 분자가 핵산 서열인 경우, 매우 특이적으로 서열의 변화를 용이하게 구별할 수 있으며, 타겟 분자를 그대로 증폭하는 것이 아닌 타겟 분자의 종속적인 서열을 증폭하는 특성을 가지며, 이를 바탕으로 각기 다른 두 종류의 light-up RNA 압타머를 디자인하여 하나의 튜브에서 두개 이상의 분자를 동시에 확인할 수 있는 다중 분석(multiplex analysis)을 구현하였다. 뿐만 아니라, 본 발명의 우수성을 바탕으로 다양한 병원균의 검출에도 적용하여 추가적인 핵산 추출 과정 없이 병원성 미생물의 핵산 바이오 마커를 성공적으로 검출할 수 있는 방식도 검증하였으므로, 기존 방식의 발명보다 간편, 신속하며 민감하게 검출할 수 있어 우수하다.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

본 발명은 제1프로브 및 제2프로브를 포함하는, 하나 이상의 타겟 분자 검출용 등온 단일반응(isothermal one-pot reaction) 프로브 세트로서,

[일반식 I]

5'-X-Y-Z-3'

[일반식 II]

3'-Ya-5'

상기 일반식 I에서,

Y는 T7 프로모터에 상보적인 서열이며;

Z는 타겟 분자에 결합 또는 연결되는 부위이며;

X 및 Y는 디옥시리보뉴클레오타이드이며;

상기 일반식 II에서,

[일반식 III]

3'-Yb-Z'-5'

상기 일반식 (III)에서,

Z’은 타겟 분자에 결합 또는 연결되는 부위이며;

상기 제1프로브 및 제2프로브는 타겟 분자와 혼성화 된 후 중합효소에 의해 전사가 개시되어 시그널을 생성하는 것을 특징으로 하는,

타겟 분자 검출용 등온 단일 반응 프로브 세트를 제공한다.

본 발명의 프로브 세트의 제1프로브는 각각 한 올리고뉴클레오타이드 분자 안에 3개의 다른 부위(portion)을 포함하는 구조와 다른 한 올리고뉴클레오타이드 분자를 포함한다: 검출 가능한 시그널을 발생시키는 하나의 표지(label) 또는 다수의 표지를 포함하는 상호작용적 표지 시스템을 갖는 압타머 서열 부위인 X, T7 프로모터에 상보적인 서열인 Y, 타겟 분자에 결합 또는 연결되는 부위인 Z; Y와 상보적인 T7 프로모터의 일부 서열인 Ya.

또한, 본 발명의 프로브 세트의 제2프로브도 한 올리고뉴클레오타이드 분자 안에 1개 또는 2개의 고유한 다른 부위를 포함하는 구조를 갖는다: Y와 상보적이고 T7 프로모터의 일부 서열이며, Ya와 연속적인 서열을 갖는 Yb; 타겟 분자에 결합 또는 연결되는 부위인 Z'. Yb는 후술하는 분할 비율에 따라 20:0인 경우는 존재하지 않을 수 있다.

이러한 구조는 본 발명의 프로브 세트가 일원화된 단계로 등온 단일 반응 조건 하에서 단시간에 높은 검출 효과를 나타내는 프로브가 되도록 한다.

본 발명에서 용어 "프로브"는 하나 이상 유형의 화학 결합을 통하여, 일반적으로 상보적 염기쌍 형성을 통하여, 보통 수소 결합 형성을 통하여 상보적인 서열의 타겟 핵산에 결합하고 따라서 이중나선(duplex) 구조를 형성할 수 있는 핵산이다. 프로브는 "프로브 결합 부위"에 결합 또는 혼성화한다. 특히, 일단 프로브가 프로브의 상보적인 타겟에 혼성화하면 프로브의 검출을 용이하게 하도록 프로브는 검출가능한 표지로 표지될 수 있다. 그러나 대안적으로, 프로브는 표지화되지 않을 수 있지만, 표지화된 리간드와의 특이적 결합에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 검출될 수 있다. 프로브는 크기가 상당히 다양할 수 있다. 일반적으로 프로브는 길이가 적어도 7 내지 15개 뉴클레오타이드다. 다른 프로브는 길이가 적어도 20, 30 또는 40개 뉴클레오타이드다. 또 다른 프로브는 다소 더 길며, 길이가 적어도 50, 60, 70, 80, 또는 90개 뉴클레오타이드다. 또 다른 프로브는 더욱 더 길며, 길이가 적어도 100, 150, 200개 또는 그 이상의 뉴클레오타이드다. 프로브는 또한 상기 값(예컨대, 길이 가 15~20개 뉴클레오타이드)의 임의의 값으로 한정된 임의의 범위 내에 있는 임의의 길이의 것일 수 있다.

본 발명에서 용어 "분자"는 검출하고자 하는 모든 종류의 생체 분자 혹은 세포를 의미하며, 생체분자는 생체를 구성하고 기능을 담당하는 표적 분자로 가장 주된 것은 단백질, 핵산, 다당류 및 지질과 같은 크기가 큰 거대 분자들과 저분자물질로 아미노산, 뉴클레오타이드, 단당류, 비타민 등의 유기물질, 철, 구리등의 금속, 무기이온 등을 의미한다. 자연 환경으로부터 추출된 생체분자, 합성에 의해 생성된 생체분자, 개시인자의 부착에 의해 변형된 생체분자를 모두 포함한다. 본 발명에서 바람직하게는 핵산, 단백질 및 세포일 수 있다.

본 발명에서 용어 "타겟 핵산서열”는 검출하고자 하는 모든 종류의 핵산을 의미하며, 서로 다른 종(species), 아종(subspecies), 또는 변종(variant) 유래의 염색체 염기서열 또는 동일 종 내 염색체 돌연변이를 포함한다. 이는 genomic DNA와 mitochondrial DNA, viral DNA를 포함하는 모든 종류의 DNA 또는 mRNA, ribosomal RNA, non-coding RNA, tRNA, viral RNA 등을 포함하는 모든 종류의 RNA를 특징으로 할 수 있으나 이에 국한되지 않는다.

본 발명에서 용어 "올리고뉴클레오타이드"는 뉴클레오타이드의 올리고머를 의미한다. 본원에 사용된 용어 "핵산"은 뉴클레오타이드의 중합체를 의미한다. 본원에 사용된 용어 "서열"은 올리고뉴클레오타이드 또는 핵산의 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 올리고뉴클레오타이드 또는 핵산은 DNA, RNA, 또는 그의 유사체(예컨대, 포스포로티오에이트 유사체)일 수 있다. 올리고뉴클레오타이드 또는 핵산은 개질된 염기 및/또는 골격(예컨대, 개질된 포스페이트 연결부 또는 개질된 당 모이어티)도 또한 포함할 수 있다. 핵산에 안정성 및/또는 다른 이점을 부여하는 합성 골격의 비-제한적 예시는 포스포로티오에이트 연결부, 펩타이드 핵산, 잠금 핵산, 자일로스핵산 또는 그의 유사체를 포함할 수 있다.

용어 핵산은, 예를 들어 유전체 DNA; 상보 DNA(cDNA)(이는 보통 전령 RNA(mRNA)의 역전사 또는 증폭으로 얻어지는 mRNA의 DNA 표현임); 합성으로 또는 증폭으로 생성된 DNA 분자; 및 mRNA를 포함한 임의의 형태의 DNA 또는 RNA를 포함한다.

용어 핵산은 단일 가닥 분자뿐만 아니라 이중 또는 삼중 가닥 핵산을 포함한다. 이중 또는 삼중 가닥 핵산에서, 핵산 가닥은 동연(coextensive)일 필요는 없다(즉, 이중 가닥 핵산은 양 가닥의 전체 길이를 따라 이중 가닥일필요는 없다).

용어 핵산은 또한 메틸화 및/또는 캡핑과 같은 것에 의한 이의 임의의 화학적 개질을 포함한다. 핵산 개질은 개별적인 핵산 염기 또는 핵산 전체에 추가적인 전하, 분극률, 수소 결합, 정전기 상호작용, 및 기능성을 포함하는 화학기의 첨가를 포함할 수 있다. 이러한 개질은 2' 위치 당 개질, 5 위치 피리미딘 개질, 8 위치 퓨린개질, 시토신 환외(exocyclic) 아민에서의 개질, 5-브로모-우라실의 치환, 주쇄 개질, 이소염기 이소시티딘 및 이소구아니딘과 같은 특이 염기 쌍 조합 등과 같은 염기 개질을 포함할 수 있다.

보다 구체적으로, 본 발명의 프로브 디자인은 두개의 단일 가닥 DNA 프로브가 타겟 인식 부위가 노출되도록 설계되어 등온에서 타겟 분자와 프로브 세트의 혼성화를 가능하게 한다.

상기 프로브에 포함되어 있는 "타겟 분자에 결합 또는 연결되는 부위"는 타겟 분자가 핵산인 경우, 타겟 분자의 핵산 서열 일부분과 상보적인 서열을 가져 타겟 분자와 혼성화 될 수 있는 서열을 의미한다. 예를 들어, 상기 "타겟 분자에 결합 또는 연결되는 부위"은 타겟 분자의 일부분과 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상 상보적인 서열을 갖는 것일 수 있다. 만일 타겟 분자가 단백질인 경우, 상기 "타겟 분자에 결합 또는 연결되는 부위"는 프로브로서 작용하는 압타머에 있어서 타겟 분자인 단백질에 결합 또는 연결될 수 있는 영역을 의미한다. 상기 "타겟 분자에 결합 또는 연결되는 부위"는 타겟 분자에 따라 적절히 그 길이를 조절할 수 있고, 특정 길이로 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 타겟 분자가 miRNA인 경우, "타겟 분자에 결합 또는 연결되는 부위"는 22개 내외의 뉴클레오타이드로 구성될 수 있으나, 타겟 분자가 mRNA나 단백질인 경우, "타겟 분자에 결합 또는 연결되는 부위"는 그보다 짧거나 더 길 수 있다.

본 발명에서 용어 "혼성화"는 상보적 염기서열을 가진 단일가닥 핵산들 간 수소결합에 의해 이중가닥 핵산이 형성되는 것을 의미하며, 어닐링(annealing)과 유사한 의미로 사용된다. 다만 조금 더 넓은 의미에서, 혼성화는 두 개의 단일가닥 간 염기서열이 완전히 상보적인 경우(perfect match)와 더불어 예외적으로 일부의 염기서열이 상보적이지 않은 경우(mismatch)까지 포함한다.

본 발명에서 용어 “상보”는 2개의 뉴클레오타이드 사이의 정확한 쌍형성에 대한 능력을 지칭한다. 즉, 핵산의 주어진 위치에서 뉴클레오타이드가 다른 핵산의 뉴클레오타이드와 수소 결합을 할 수 있다면, 2개의 핵산은 그 위치에서 서로 상보적인 것으로 여겨진다. 뉴클레오타이드의 일부만이 결합하여 2개의 단일 가닥 핵산 분자 사이의 상보성은 “부분적”일 수 있거나, 또는 전체 상보성이 단일 가닥 분자 사이에 존재할 때 상보성은 완전할 수 있다. 핵산 가닥 사이의 상보성의 정도는 핵산 가닥 사이의 혼성화의 효율 및 강도에 상당한 영향을 미친다.

타겟 분자가 타겟 핵산 서열인 경우, 제1프로브는 타겟 핵산서열의 UHS(Upstream Hybridization Sequence)에 결합하며, T7 프로모터와 상보적인 서열을 지니고, 압타머 서열을 갖고 있다. 제1프로브의 일반식 II에 포함되는 Ya는 T7 프로모터의 일부 서열에 해당하며, 제2프로브의 일반식 III에서의 Yb 또한 T7 프로모터의 나머지 일부 서열이며, Ya와 Yb는 연속적인 서열로 하나의 T7 프로모터를 이루며, 분할된 두개의 조각에 해당한다. 타겟 RNA의 존재 하에, 프로브 세트는 3방향 접합 구조를 형성하고 닉 부위(nick site)를 갖는 이중 가닥 T7 프로모터가 완성된다. 따라서, 타겟 핵산 서열이 존재하지 않는 경우에는 T7 프로모터의 서열이 Ya와 Yb로 분할되어 있으므로, 중합효소가 결합할 수 없으며, 타겟 핵산 서열이 존재하는 경우에만 중합효소가 결합하여 제1프로브의 압타머 부위의 전사가 개시된다(도 1참조).

제1프로브의 압타머 서열부위 X에 의해 특정 물질에 반응하여 시그널을 생성하므로, 최종 생산물을 확인할 수 있다.

타겟 분자가 단백질 혹은 세포인 경우, 제1프로브 및 제2프로브는 각각의 타겟 단백질 혹은 세포에 결합 또는 연결되는 부위를 갖는다. 예시적으로 도 2에 나타난 바와 같이, 단백질 혹은 세포의 타겟 부위에 특이적으로 결합하는 항체(antibody) 또는 압타머(aptamer)가 결합 또는 연결된 형태로 존재할 수 있다. 압타머의 경우, 일정한 길이(~수십 뉴클레오타이드)의 올리고뉴클레오타이드(DNA 등) 등의 상보적인 서열을 통해 연결될 수 있으며 항체의 경우 NHS(N-hydroxysuccinimide) ester synthesis등으로 결합할 수 있다.

상기의 타겟 핵산서열이 존재하는 경우와 마찬가지로, 타겟 단백질 혹은 세포의 존재 하에, 프로브 세트는 3방향 접합 구조를 형성하고 닉 부위(nick site)를 갖는 이중 가닥 T7 프로모터가 완성된다. 따라서, 타겟 단백질이 존재하지 않는 경우에는 T7 프로모터의 서열이 Ya와 Yb로 분할되어 있으므로, 중합효소가 결합할 수 없으며, 타겟 단백질 혹은 세포가 존재하는 경우에만 중합효소가 결합하여 제1프로브의 압타머 부위의 전사가 개시된다(도 2 참조).

본 발명에 있어서, 리포터로 사용되는 "압타머(Aptamer)"는 그 자체로 안정된 삼차구조를 가지면서 타겟 분자에 높은 친화성과 특이성으로 결합할 수 있는 특징을 가진 단일가닥 핵산(DNA, RNA 또는 변형 핵산)이다.

SELEX(Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment)라는 압타머 발굴 기술이 개발된 이후, 저분자 유기물, 펩타이드, 막 단백질까지 다양한 타겟분자에 결합할 수 있는 압타머들이 계속해서 발굴되어 왔다. 압타머는 고유의 높은 친화성(보통 pM 수준)과 특이성으로 타겟분자에 결합할 수 있다는 특성 때문에 자주 단일 항체와 비교가 되고, 특히 "화학 항체"라고 할 만큼 대체항체로서의 높은 가능성이 있다. 또한 결합하는 물질에 따라 흡수하는 파장대와 방출되는 파장대가 달라 형광을 발현하는 등의 방법으로 압타머와 특정 화학 분자의 결합을 확인할 수 있다.

본 발명의 압타머 및 상기 압타머와 상호 작용하는 반응 물질은 목적 효과로서 검출 가능한 시그널을 발생할 수 있는 한, 어떠한 종류의 압타머 및 반응 물질을 이용할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 타겟 분자가 타겟 핵산서열인 경우, 제1프로브 및 제2프로브가 상기 타겟 핵산서열과 각각 혼성화 할 때, 제1프로브 및 제2프로브는 서로 바로 근접한 (immediately adjacent) 위치에 위치한다.

제1프로브의 Y와; 제1프로브의 Ya 및 제2프로브의 Yb가 혼성화되며, 하나의 T7 프로모터 구조가 형성된다. 본 명세서에서 제1프로브 및 제2프로브의 혼성화 위치를 언급하면서 사용되는 용어 "근접한(adjacent)"은 상기 두 프로브에서 Ya와 Yb의 말단이 서로 연결될 수 있도록 위치하였으며, Ya와 Yb가 Y와 혼성화될 수 있을 정도로 충분히 인접해 있는 것을 의미한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 타겟 분자는 단백질, 펩타이드, 핵산, 탄수화물, 지질(lipid), 다당류, 당단백질, 호르몬, 수용체, 항원, 항체, 바이러스, 병원균, 독성 물질, 기질, 대사 산물, ATP, 코카인, 수은, 전이 상태 유사체(transition state analog), 보조 인자(cofactor), 저해제, 약, 염료, 영양분, 성장 인자, 세포, 조직 등일 수 있으나, 이로 제한되지 않으며, 거의 모든 화학적 또는 생물학적 작동체(effector)가 될 것이며 어떤 크기의 분자들이든 사용될 수 있는 표적분자 등을 의미한다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 타겟 분자는 핵산, 단백질, 세포 및 ATP일 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 타겟 분자가 핵산인 경우, Z 및 Z'은 검출하고자 하는 핵산에 상보적으로 결합하는 핵산 서열이고, 상기 타겟 분자가 단백질인 경우, Z 및 Z'은 상기 단백질에 결합할 수 있는 항체 또는 압타머이고, 상기 타겟 분자가 세포인 경우, Z 및 Z'은 세포 외 단백질, 세포의 인지질, 균의 펩티도글라이칸 및 LPS로 이루어진 군에서 선택되는 어느 1종 이상에 결합할 수 있는 항체, 압타머이고, 상기 타겟 분자가 ATP인 경우, Z 및 Z'은 ATP에 결합할 수 있는 split 압타머일 수 있다.

구체적으로, 상기 타겟 분자가 ATP인 경우, 바람직하게는, ATP와 같은 물질은 크기가 작은 분자에 해당하는 바, Z와 Z'은 ATP에 결합할 수 있는 별도의 분할된 압타머 부위일 수 있다. 상세하게는 논문 A. Chen et al. " Split aptamers and their applications in sandwich aptasensors" Trends in Analytical Chemistry 80 (2016) 581-593에 개시된 내용을 참고한다. 이에 기재된 바와 같이, 타겟 분자가 ATP인 경우 온전한 ATP에 결합하는 DNA 압타머를 절반으로 잘라서, 2가닥의 DNA aptamer (Split DNA aptamer)를 만들어서 사용할 수 있음을 의미하며, 당해 기술분야에 공지된 방법에 따라 사용 가능하다.

타겟 분자에 결합 또는 연결되는 부위는 대표적으로 항체, 펩타이드, 핵산 및 압타머 등이 있다.

항체는 항원의 항원결정부(epitope)과 특이적 결합을 하여 항원-항체 반응을 일으키는 물질이다. 압타머(aptamer)는 저분자 화합물로부터 단백질까지 다양한 종류의 물질에 높은 친화성과 특이적으로 결합할 수 있는 특성을 가지는 작은 (20~60 뉴클레오타이드) 단일가닥핵산 (DNA 혹은 RNA) 조각을 뜻한다.

상기 프로브는 상기 검출 가능한 시그널을 발생시키는 하나의 표지 또는 다수의 표지를 포함하는 상호작용적 표지 시스템을 갖는 압타머 서열 부위 및 상기 타겟 분자와 결합 또는 연결되는 부위 사이에 결합된 링커(linker) 영역을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 링커 영역은 프로브의 일 말단에 타겟 분자와 결합 또는 연결되는 부위에 도달하기 위해 도입될 수 있으며, 상기 링커 영역의 구체적인 종류는 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면, 상기 링커 영역은 4 내지 10개의 짧은 핵산 서열을 갖는 뉴클레오타이드일 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 프로브 세트에 있어서, 상기 Ya 및 Yb는 T7 프로모터의 일부 서열이며, 상기 Ya 및 Yb는 상기 Ya 및 상기 Yb 순서로 연속적으로 배열될 경우 상기 T7 프로모터를 이루고, Ya : Yb 분할 비율은 20:0 내지 15:5 일 수 있다.

T7 프로모터 서열이 제1프로브와 제2프로브에 분할되어 존재하기 때문에 타겟 분자가 존재하지 않는 경우에는 T7 프로모터에 중합효소가 결합하여 전사가 개시될 수 없으며, 최종적으로 제1프로브 및 제2프로브의 전사 결과물 상의 표지로부터 나오는 시그널이 생성되지 않으므로, 타겟 분자의 검출은 달성되지 않는다. 타겟 분자가 존재하는 경우, 제1프로브의 Ya와 제2프로브의 Yb가 연속적으로 배열되어 T7 프로모터를 이루고, 중합효소에 의해 전사과정이 개시된다. 전사과정이 개시되는 경우, 상기 압타머 서열을 함유하는 제1프로브의 X의 산물이 생성될 수 있다.

기존 SMART(Signal mediated amplification of RNA technology) 기술은 DNA 중합효소를 이용하고, 그 이후 RNA 중합효소를 순차적으로 이용하여 2개의 효소를 이용해야 했으며, 이에 따라 두개의 효소가 같이 존재하는 경우 비특이적인 신호를 발생시키므로, one-step 반응이 불가능하고, 반응 시간 또한 오래 걸렸었다. 다만, 본 발명은 T7 RNA 프로모터를 DNA 중합효소에 의해 생성하는 단계를 생략하였으며, 대신 T7 프로모터를 분할하여 타겟이 존재하지 않는 경우에는 T7 프로모터 자체가 생성되지 않도록 하였다. 이를 통해 하나의 중합효소만으로도 타겟 분자를 검출할 수 있는 시스템을 도입하였으며, 하나의 효소를 사용하므로 비특이적인 신호의 발생이 적고, 반응 시간 짧아졌으므로, 신속한 반응이 가능하다.

즉, 본 발명의 핵심은 3방향 접합 구조를 유도하여 타겟 분자의 존재 하에서 분할 T7 프로모터의 효과적인 형성이기 때문에, 본 발명에 있어서, 기존의 T7 프로모터를 분할하여 각 비율에 따른 전사 효율을 분석하였다. 구체적으로, 본 발명의 일실시예에 있어서, 실시예 1-1에서는 T7 프로모터 형성을 조절하기 위해서 T7 프로모터의 5' 말단 부분부터 순차적으로 닉 부위를 삽입하여 다양한 비율로 분할된 T7 프로모터를 제작하였다. 압타머의 상보적 서열을 주형에 배치하여 전사 후, 생성된 산물의 전사 반응을 모니터링 하였다. 도 3에 도시된 바와 같이, 5' 말단 부위부터 0:20부터 5:15까지 순차적으로 삽입한 결과, 3:17 비율 이후에는 SP1의 부재로 인해 형광 값이 급격히 낮아졌으며, 이는 T7 프로모터 5'쪽의 3-뉴클레오타이드 부분이 T7 RNA 중합효소가 T7 프로모터를 특이적으로 인식하는데 중요함을 나타내며, 5:15의 경우 SP1와 SP2가 모두 존재하는 경우에도 전사가 거의 진행되지 않는 것을 확인하였으며, 이로 보아 T7 프로모터의 5'쪽의 5-mer 이후 닉 부위가 존재하면 T7 RNA 중합효소가 정상적으로 인식하지 못함을 알 수 있다. 3방향 접합구조 형성을 통하여 온전한 이중가닥 형태의 T7 프로모터를 이루기 위해서는 5' 말단 부위로부터 4:16 분할 비가 가장 적합하다는 것을 확인하였다.

따라서, 본 발명의 일실시예에 있어서, 분할비율은 적절하게 조절될 수 있으며, 가장 바람직하게는 Ya : Yb 분할 비율은 16:4일 수 있다.

본 발명의 프로브 세트에 있어서, 상기 표지는 화학적 표지, 효소 표지, 방사능 표지, 형광 표지, 발광 표지, 화학발광 표지 및 금속 표지로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서, 상기 제1프로브의 상기 일반식 I은, Y와 Z 사이에 중첩서열 W를 추가로 포함한 일반식 I'로 변형될 수 있고;

[일반식 I']

5'-X-Y-W-Z-3'

상기 제2프로브의 상기 일반식 III은, Yb와 Z' 사이에 중첩서열 W'를 추가로 포함한 일반식 III'으로 변형될수 있는 것을 특징으로 하는;

[일반식 III']

3'-Yb-W'-Z'-5'

타겟 분자 검출용 등온 단일 반응 프로브 세트일 수 있다.

상기 중첩서열은 타겟 분자가 존재하는 경우, 3방향 접합 구조가 너무 짧은 중첩으로 인해 완벽히 이루어지지 않아 T7 프로모터가 형성이 안되어 전사가 효과적으로 이루어지지 않는 점을 극복하기 위하여 도입되었다. 중첩서열 W와 W'은 서로 상보적이다.

따라서, 바람직한 일실시예에 있어서, 구체적으로, 실시예 1-2에서 상기 Ya:Yb의 16:4 비율의 T7 프로모터를 3방향 접합 구조체에 적용시키기 위한 구조 최적화를 진행하였다. T7 프로모터 3'쪽의 16-뉴클레오타이드는 단일 주형(Signal template, ST)에 상보적으로 결합하며 보편적이다. 타겟 RNA가 존재하는 경우에만 ST와 분할된 T7-16(Split T7-16, ST-16)으로 구성된 첫 번째 프로브와 두 번째 프로브(Split T7-4, ST-4)를 결합하여 닉 부위가 있는 완전한 T7 프로모터를 형성해야 하므로, 중첩서열 부분의 Tm value가 가장 중요 요인이며 추가 중첩서열(0~4bp)을 배치하여 Tm value를 조절하였다.

그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 중첩서열(N=0)이 T7 프로모터의 4bp일 경우 타겟서열이 존재하지 않을 때 형광이 나오지 않아 구조를 형성하지 않는 목적에 적합하나, 타겟 핵산서열이 존재할 때에 3방향 구조가 너무 짧은 중첩으로 인해 완벽히 이루어지지 않아 T7 프로모터가 형성이 안되어 전사가 효과적으로 수행되지 않음을 확인할 수 있다. 중첩 서열을 1bp이상 추가한 경우(N=1), 타겟서열이 존재할 때만 높은 형광 값을 나타냄을 확인하였다. 이를 통해 3-way 접합 구조를 안정적으로 형성하고 전사 반응을 유도하기 위해서는 T7 프로모터부터의 4bp 외에 적어도 1bp의 중첩이 필요함을 확인했다. 추가된 중첩 서열이 3bp를 초과하는 경우, 타겟서열이 존재하지 않아도 비특이적인 전사가 진행되므로, 적절한 추가 중첩서열은 2bp로 설정되었고, 전체 중첩 영역은 6bp(T7 프로모터로부터 4bp)로 설정되었다. 또한, 실시예 1-2에서 확인한 바와 같이, 상보적이지 않은 경우, 3-방향 접합 구조에 bulge가 형성되어 구조의 안정성이 떨어질 수 있다(도 5).

본 발명의 프로브 세트에 있어서, 상기 등온 단일 반응은, 15℃ 내지 50℃ 범위의 일정한 온도에서 수행될 수 있다. 상기 15℃ 내지 50℃ 범위의 온도는 당업계에 효소가 작용하는 것으로 알려진 온도로서, 본 발명의 목적 효과를 획득할 수 있는 한, 이에 제한되지 않는다. 다만, 본 발명의 실시예 1-3에서 확인한 바와 같이, 본 발명의 반응은 37℃인 경우, 효율이 가장 좋은 것을 확인하였다(도 8C). 따라서, 상기 등온 단일 반응의 일정한 온도는 바람직하게는 34℃ 내지 40℃이다.

본 발명의 프로브 세트에 있어서, 프로브 세트는 선형 RNA(linear RNA)와 구분하여 원형 RNA(circular RNA)를 검출할 수 있다. 구체적으로, 도 12에 나타난 바와 같이, 선형 RNA의 양 말단에 본 발명의 제1프로브와 제2프로브가 각각 결합할 수 있고, 선형 RNA의 양 말단이 결합하여 원형 RNA를 만드는 경우에만 제1프로브와 제2프로브가 결합이 가능하고, T7 프로모터가 완성된다. 따라서, 본 발명의 프로브 세트를 이용하여 선형 RNA와는 구별되게 원형 RNA의 경우에만 T7 프로모터가 형성이 될 수 있어 전사의 진행이 가능하므로 원형 RNA의 검출에 이용할 수 있다.

본 발명의 프로브 세트에 있어서, 상기 중합효소는 박테리오파지 T7 RNA 중합 효소, 박테리오파지 T3 중합 효소, 박테리오파지 RNA 중합 효소, 박테리오파지 ΦII 중합 효소, 살모넬라 박테리오파지 sp6 중합 효소, 슈도모나스 박테리오파지 gh-1 중합효소, 대장균(E. coli) RNA 중합효소 홀로효소(holoenzyme), 대장균(E. coli) RNA 중합효소 코어 효소, 인간 RNA 중합효소 I, 인간 RNA 중합효소 II, 인간 RNA 중합효소 III, 인간 미토콘드리아 RNA 중합효소 및 이의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 실시예에서는 중합효소는 박테리오파지 T7 RNA 중합효소를 이용하였다.

본 발명의 프로브 세트에 있어서, 상기 등온 단일 반응은 Tris-HCl, MgCl2, DTT, 스페르미딘, rNTPs, RNase 억제제 및 SSB(Single-Stranded DNA Binding Protein)가 포함된 단일 반응 용액으로 일원화되어 동시 수행되는 것을 특징으로 할 수 있다.

구체적으로, 일 실시예에 있어서 실시예 1-3에서는 제안된 프로브세트의 최상의 성능을 얻기 위해 버퍼, 효소, 반응 시간 및 반응 온도에 대한 최적화 실험을 수행하였다.

본 발명에서, 상기 단일 반응 용액은 바람직하게는, 1 내지 50mM의 MgCl2, 0.1 내지 10mM의 DTT, 0.1 내지 10mM의 스페르미딘, 1 내지 100ng/μL의 단일 가닥 DNA 결합 단백질(SSB), 1 내지 100U의 T7 RNA 중합효소를 포함하며, 보다 바람직하게는 1 내지 30mM의 MgCl2, 0.5 내지 5mM의 DTT, 1 내지 5mM의 스페르미딘, 10 내지 50ng/μL의 단일 가닥 DNA 결합 단백질(SSB), 10 내지 50U의 T7 RNA 중합효소를 포함하고, 가장 바람직하게는 10mM의 MgCl2, 1.5mM의 DTT, 3mM의 스페르미딘, 20ng/μL의 단일 가닥 DNA 결합 단백질(SSB), 20U의 T7 RNA 중합효소를 포함할 수 있다(도 6 내지 도 9).

타겟 분자 검출용 조성물은 타겟 분자와 특이적으로 결합하는 핵산서열, 펩타이드 외에 타겟 분자의 검출 및/또는 분석에 일반적으로 사용되는 도구 및/또는 시약을 더 포함할 수 있다. 이러한 도구나 시약으로는 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지물질, 용해제, 세정제, 완충제, 안정화제 등이 포함될 수 있다. 표지물질이 형광물질인 경우에는 형광 세기를 측정하는 데 필요한 기질 등을 더 포함할 수 있다. 적합한 담체로는, 가용성 담체, 예를 들어, 당업계에 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액(예를 들어, PBS 등); 불용성 담체, 예를 들어, 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소수지, 가교 덱스트란, 폴리사카라이드 등; 라텍스에 금속을 도금한 자성 미립자와 같은 고분자, 기타 종이, 유리, 금속, 아가로스 및/또는 이들의 조합이 포함될 수 있다.

본 발명의 조성물에 있어서, 상기 조성물은 2종 이상의 타겟 분자를 검출하기 위한 2종 이상의 타겟 분자 검출용 등온 단일 반응 프로브 세트를 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물에 있어서, 상기 2종 이상의 타겟 분자 검출용 등온 단일 반응 프로브 세트는 각각 서로 상이한 상호작용적 표지 시스템을 포함하고; 상기 2종 이상의 프로브 세트 각각은 각각 서로 상이한 타겟 분자에 결합하여; 이로 인해 서로 상이한 타겟 분자의 다중 검출이 가능할 수 있다.

즉, 상기 2종 이상의 타겟은 단일 병원체에 존재하는 서로 다른 타겟 부위일 수 있으며, 이 경우, 타겟의 다른 부위를 효과적으로 검출하여 더욱 정확하고 정밀한 진단이 가능하다.

구체적으로, 본 발명의 실시예 2 및 3에서는 SARS-CoV-2를 타겟 물질로 하여 서로 다른 타겟 부위를 타겟으로 검출용 프로브를 설계하였다. 그 결과, L2, L4로 표시되는 두 유전좌위를 대상으로 하는 프로브를 디자인하였으며, 그 결과 두개의 프로브가 타겟 핵산서열의 각 영역에 특이적으로 결합하는 것으로 나타났다(도 15 참조). 따라서, 타겟의 다른 부위를 효과적으로 검출하였으므로 더욱 정확한 검출이 가능하다.

뿐만 아니라, 하나의 튜브에서 SARS-CoV-2의 D614G 돌연변이 및 N 유전자의 동시 검출을 테스트하였으며, 여기서 망고 압타머 및 말라카이트 그린 압타머는 각각 SARS-CoV-2의 N 유전자 및 D614G가 간섭 없이 형광을 방출하였다(도 17C). 100 fM까지 N 유전자와 D614G에 대한 타겟을 동시에 분석할 수 있어, 매우 민감하게 검출이 가능함을 확인하였다(도 17D).

또한, 상기 2 종 이상의 타겟은 상호작용적으로 상이한 분자 진단 대상, 예컨대, 감염성 유해 미생물일 수 있고, 이 경우, 서로 다른 병원체를 동시 검출 및 진단이 가능하다.

구체적으로, 본 발명의 실시예 6에서는 두 병원성 박테리아에 대한 검출을 수행하였으며, 그 결과 E.coli와 MRSA 모두 각각의 프로브에 특이적으로 결합하여 높은 형광 신호를 발생시키는 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명으로 서로 다른 병원체를 개별적으로 또는 동시에 검출 및 진단이 가능하다.

본 명세서에서 상술한 본 발명의 키트는 추가적으로, 다양한 폴리뉴클레오타이드 분자, 효소, 다양한 버퍼 및 시약을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 양성 대조군 및 음성 대조군 반응을 실시하는 데 필수한 시약을 포함할 수 있다. 어떤 하나의 특정 반응에서 사용되는 시약의 최적량은, 본 명세서에 개시사항을 습득한 당업자에 의해서 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명의 키트는 상기 서술된 본 발명의 프로브 세트에 의한 타겟 분자 검출을 실시하기 위하여 제작되기 때문에, 중복되는 내용은 본 명세서의 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.

또한, 본 발명은 상기 타겟 분자 검출용 등온 단일 반응 프로브 세트를 이용하여 타겟 분자를 검출하는 방법을 제공하며, 구체적으로 다음의 단계를 포함할 수 있다:

(a) 샘플에, 본 발명의 제1프로브 및 제2프로브로 구성되는 타겟 분자 검출용 등온 단일 반응(isothermal one-pot reaction) 프로브 세트를 처리하여 타겟 분자와 결합 또는 혼성화시키는 단계;

(b) 상기 (a) 단계의 혼성화 산물에 중합효소를 처리하여 전사를 개시시키는 단계; 및

(c) 상기 (b) 단계의 전사 산물에 압타머-반응 물질을 처리하여 전사 산물 내 압타머의 시그널 생성을 검출하는 단계.

이때, 상기 단계 (c)의 시그널 생성은 샘플 중 타겟 분자의 존재를 나타내는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 타겟 분자 검출 방법은, 별도의 증폭반응 없이, 등온 단일 반응 조건하에서 타겟 분자를 검출하는 것을 특징으로 한다.

따라서, 본 발명의 프로브 세트를 이용하는 타겟 분자를 검출하는 방법은 혼성화 단계, 전사 반응, 압타머의 시그널 반응까지 동시에 일어나도록 설계된 것이며, 본 발명의 (a) 내지 (c)단계는 하나의 용기 내에서 동시에 수행 가능하다.

또한, 최종 신호 확인에 사용되는 압타머는 말라카이트 그린 압타머로 제한하지 않으며 어떠한 종류의 RNA 기반의 형광 압타머도 사용 가능하다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 타겟 분자 검출용 등온 단일 반응 프로브 세트를 이용하여 타겟 분자를 검출하는 방법 이전에, 등온 핵산 증폭 반응을 수행할 수 있다.

등온 핵산 증폭 반응의 종류는 특별히 제한되지 않지만, 본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 등온 핵산 증폭 반응은 RPA(Recombinase Polymerase Amplification)일 수 있다.

본 명세서에 있어서 용어 "재조합-중합효소 증폭법"은 DNA 및 RNA 증폭을 확인할 수 있는 기술을 의미하며, 기존 PCR 과는 다르게 DNA 결합 단백질과 재조합효소(recombinase)를 이용하여 빠르고 정확하게 타겟 서열(target sequence)을 증폭시킬 수 있는 기술이다. RPA 방법은 중온성 중합효소(mesophilic polymerase)를 이용하여 등온 조건에서도 증폭이 가능하므로, 특별한 장비 없이 등온 장치만 있으면 단시간 안에 바이러스를 검출 및 진단할 수 있는 장점이 있다.

상기 (a) 단계 이전에 RPA를 실시하면, 본 발명의 STAR 반응을 진행하였을 때에 비하여 신호가 증폭되는 것을 확인하였다(도 12참조). 따라서, 본 발명과 연계하여 등온 핵산 증폭반응을 수행하여 타겟 분자를 더욱 민감하게 검출하는 방법으로 이용할 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 타겟 분자 검출용 등온 단일 반응 프로브 세트를 이용한 현장용 분자 진단 방법을 제공한다.

본 발명의 명세서에 있어서 "현장용 분자 진단 방법"이란, 의료현장에서 속하게 현장 진단이 가능하며, 세포 내의 분자 수준, 병균의 유전자(RNA, DNA)를 직접 검사하여 정밀하게 진단하는 방법을 의미한다.

상기 현장용 분자 진단 방법은 다음 단계를 포함할 수 있다:

(a) 샘플에, 제1프로브 및 제2프로브로 구성되는 타겟 분자 검출용 등온 단일 반응(isothermal one-pot reaction) 프로브 세트를 처리하여 타겟 분자와 혼성화시키는 단계;

본 발명의 현장용 분자 진단 방법에 있어서, 상기 분자 진단 방법은 병원성 미생물 검출에 사용될 수 있다.

본 발명의 명세서에 있어서 "병원성 미생물"이란, 인체에 기생하여 질환을 일으키는 미생물을 의미하며, 본 발명의 실시예에 기재된 병원성 미생물에 제한되지 않으며, 모든 병원성 미생물에 적용이 가능하다.

본 발명의 현장용 진단 방법에 있어서, 상기 병원성 미생물은 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus Aureus), 비브리오 불니피쿠스(Vibrio vulnificus), 대장균(E. coli), 중동 호흡기 증후군 코로나바이러스(Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus), 인플루엔자 A 바이러스(Influenza A virus), 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스(Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus), 호흡기 세포 융합 바이러스(RSV), 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 헤르페스 심플렉스 바이러스(HSV), 인유두종 바이러스(HPV), 인간 파라인플루엔자 바이러스(HPIV), 뎅기열 바이러스, B형 간염 바이러스(Hepatitis B Virus (HBV)), 황열병 바이러스, 광견병 바이러스, 플라스모디움, 거대세 포바이러스(CMV), 미코박테리움 튜버큘로시스, 클라미디아 트라코마티스, 로타바이러스, 인간 메타뉴모바이러스 (hMPV), 크리민 콩고 출혈열 바이러스 (Crimean-Congo hemorrhagic fever virus), 에볼라 바이러스, 지카 바이러스, 헤니파바이러스, 노로바이러스, 라사바이러스, 리노바이러스, 플라비바이러스, 리프트 밸리 열 바이러스, 수족구병 바이러스, 살모넬라(Salmonella sp.), 쉬켈라(Shigella sp.), 엔테로박테리아세(Enterobacteriaceae sp.), 슈도모나스(Pseudomonas sp.), 모락셀라(Moraxella sp.), 헬리코박터(Helicobacter sp.) 및 스테노트로 포모나스(Stenotrophomonas sp.)로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상일 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.

즉, 본 발명의 프로브 세트를 이용한 타겟 분자 검출 방법은 목적 대상의 타겟 분자 탐지를 위한 강력한 진단 방법으로 작용하여 짧은 진단 시간, 높은 감도 및 특이도(specificity) 및 간단한 분석 절차를 제공할 뿐만 아니라, 비싼 기기 및 진단 전문가를 필요로 하지 않으므로, 신속한 대응이 필요한 신종 감염병에 적합한 진단 방법이 될 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

[준비예]

시약 및 재료의 준비

모든 DNA 서열은 Bionics(서울, 한국)에 의해 합성되었다. 모든 플라스미드는 Integrated DNA Technology (Skokie, IL, USA)에서 구입했다. T7 RNA 중합효소, RNase 억제제, T4 유전자 32 단백질(단일 가닥 결합 단백질) 및 리보뉴클레오타이드(rNTP) 용액은 Enzynomics(대전, 한국)에서 구입했다. HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit, Monarch RNA Cleanup Kit 및 DNase Ⅰ은 New England Biolabs(Ipswich, GA, USA)에서 구입했다. 박테리아 RNA 키트는 OMNI International(Kennesaw, NY, USA)에서 구입했다. Tris-HCl 및 MgCl₂는 Biosesang(성남, 한국)에서 구입했다. 디티오트레이톨(DTT)은 ThermoFisher Scientific(서울, 한국)에서 구입했다. TO1-3PEG-비오틴 형광단(TO1-비오틴)은 Applied Biological Materials(캐나다 리치몬드)에서 구입했다. 말라카이트 그린 클로라이드와 스페르미딘은 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)에서 구입했다. 모든 실험은 RNA 분해를 방지하기 위해 DEPC 처리된 물로 수행되었다.

DNA 올리고뉴클레오타이드의 준비

본 발명에서 이용한 올리고뉴클레오타이드의 서열은 다음과 같다.

DNA Probe	Sequence (5'→3')	서열번호
Split promoter template	GTACGACAACTACCCCATACCAAACCTTCCTTCGTACTTA AAA ATC CCG GCC AGA TTT TGC CAA TCA CCC TAT AGT GAG TCG TAT TA GTTAGA TTT TGC CAA TCA	1
Split promoter 1-0	TTGGCAAAATCTAAC	2
Split promoter 2-20	TAATACGACTCACTATAGGG	3
Split promoter 1-1	TTGGCAAAATCTAACT	4
Split promoter 2-19	AATACGACTCACTATAGGG	5
Split promoter 1-2	TTGGCAAAATCTAACTA	6
Split promoter 2-18	ATACGACTCACTATAGGG	7
Split promoter 1-3	TTGGCAAAATCTAACTAA	8
Split promoter 2-17	TACGACTCACTATAGGG	9
Split promoter 1-4	TTGGCAAAATCTAACTAAT	10
Split promoter 2-16	ACGACTCACTATAGGG	11
Split promoter 1-5	TTGGCAAAATCTAACTAATA	12
Split promoter 2-15	CGACTCACTATAGGG	13
N gene of SARS-CoV-2
Split T7-16 (ST-16)-Universal	ACGACTCACTATAGGG	14
Overlap 0-ST	GTACGACAACTACCCCATACCAAACCTTCCTTCGTAC CCCTATAGTGAGTCGTATTATGCCAGCCATTCTAG	15
Overlap 0-ST-4	CAGCATCACCGCCATTAAT	16
Overlap 1-ST	GTACGACAACTACCCCATACCAAACCTTCCTTCGTAC CCCTATAGTGAGTCGTATTATTGCCAGCCATTCTAG	17
Overlap 1-ST-4	CAGCATCACCGCCATATAAT	18
Overlap 2-ST	GTACGACAACTACCCCATACCAAACCTTCCTTCGTAC CCCTATAGTGAGTCGTATTATTTGCCAGCCATTCTAG	19
Overlap 2-ST-4	CAGCATCACCGCCATAATAAT	20
Overlap 3-ST	GTACGACAACTACCCCATACCAAACCTTCCTTCGTAC CCCTATAGTGAGTCGTATTATTTTGCCAGCCATTCTAG	21
Overlap 3-ST-4	CAGCATCACCGCCATAAATAAT	22
Overlap 4-ST	GTACGACAACTACCCCATACCAAACCTTCCTTCGTAC CCCTATAGTGAGTCGTATTATTTTTGCCAGCCATTCTAG	23
Overlap 4-ST-4	CAGCATCACCGCCATAAAATAAT	24
Bulge 1-ST	GTACGACAACTACCCCATACCAAACCTTCCTTCGTAC CCCTATAGTGAGTCGTATTATTTTGCCAGCCATTCTAG	25
Bulge 1-ST-4	CAGCATCACCGCCATTAATAAT	26
Bulge 2-ST	GTACGACAACTACCCCATACCAAACCTTCCTTCGTAC CCCTATAGTGAGTCGTATTATTTTTGCCAGCCATTCTAG	27
Bulge 2-ST-4	CAGCATCACCGCCATTTAATAAT	28
Bulge 3-ST	GTACGACAACTACCCCATACCAAACCTTCCTTCGTAC CCCTATAGTGAGTCGTATTATTTTTTGCCAGCCATTCTAG	29
Bulge 3-ST-4	CAGCATCACCGCCATTTTAATAAT	30
Bulge 4-ST	GTACGACAACTACCCCATACCAAACCTTCCTTCGTAC CCCTATAGTGAGTCGTATTATTTTTTTGCCAGCCATTCTAG	31
Bulge 4-ST-4	CAGCATCACCGCCATTTTTAATAAT	32
Bulge 5-ST	GTACGACAACTACCCCATACCAAACCTTCCTTCGTAC CCCTATAGTGAGTCGTATTATTTTTTTTGCCAGCCATTCTAG	33
Bulge 5-ST-4	CAGCATCACCGCCATTTTTTAATAAT	34
Locus 1-ST	GTACGACAACTACCCCATACCAAACCTTCCTTCGTAC CCCTATAGTGAGTCGTATTATTATGAGGAACGAGAAG	35
Locus 1-ST-4	TGTTGCGACTACGTGAATAAT	36
Locus 2-ST	GTACGACAACTACCCCATACCAAACCTTCCTTCGTAC CCCTATAGTGAGTCGTATTATTTGCCAGCCATTCTAG	37
Locus 2-ST-4	CAGCATCACCGCCATAATAAT	38
Locus 3-ST	GTACGACAACTACCCCATACCAAACCTTCCTTCGTAC CCCTATAGTGAGTCGTATTATTGCT TTA GTG GCA GTA	39
Locus 3-ST-4	TGT GTT ACA TTG TATTAAT	40
Locus 4-ST	GTACGACAACTACCCCATACCAAACCTTCCTTCGTAC CCCTATAGTGAGTCGTATTATTTGTTACATTGTATGC	41
Locus 4-ST-4	TCTGCCGAAAGCTTGAATAAT	42
Locus 5-ST	GTACGACAACTACCCCATACCAAACCTTCCTTCGTAC CCCTATAGTGAGTCGTATTATTAGTTCCTGGTCCCCA	43
Locus 5-ST-4	GTTCCTTGTCTGATTAATAAT	44
S gene (D614G Mutation) of SARS-CoV-2
Signal template-G	GGATCCATTCGTTACCTGGCTCTCGCCAGTCGGGATCC CCCTATAGTGAGTCGTATTATTAGTT G ACACCCTGAT	45
Signal template-A	GGATCCATTCGTTACCTGGCTCTCGCCAGTCGGGATCC CCCTATAGTGAGTCGTATTATTAGTT A ACACCCTGAT	46
Signal template-T	GGATCCATTCGTTACCTGGCTCTCGCCAGTCGGGATCC CCCTATAGTGAGTCGTATTATTAGTT T ACACCCTGAT	47
Signal template-C	GGATCCATTCGTTACCTGGCTCTCGCCAGTCGGGATCC CCCTATAGTGAGTCGTATTATTAGTT C ACACCCTGAT	48
D614G Mutation ST-4	CAGGGACTTCTGTGCAATAAT	49
*16S rRNA of Escherichia coli* and *Staphylococcus aureus*
E. coli L1-ST	GTACGACAACTACCCCATACCAAACCTTCCTTCGTAC CCCTATAGTGAGTCGTATTATTCGGGTAACGTCAATG	50
E. coli L1-ST-4	CCGGTGCTTCTTCTGAATAAT	51
E. coli L2-ST	GTACGACAACTACCCCATACCAAACCTTCCTTCGTAC CCCTATAGTGAGTCGTATTATTCCACGCTTTCGCACC	52
E. coli L2-ST-4	AATCCTGTTTGCTCCAATAAT	53
S. aureus L1-ST	GTACGACAACTACCCCATACCAAACCTTCCTTCGTAC CCCTATAGTGAGTCGTATTATTCGCTTTCGCACATCA	54
S. aureus L1-ST-4	CCTGTTTGATCCCCAAATAAT	55
S. aureus L2-ST	GTACGACAACTACCCCATACCAAACCTTCCTTCGTAC CCCTATAGTGAGTCGTATTATTGGACTTAACCCAACA	56
S. aureus L2-ST-4	GTTGCGCTCGTTGCGAATAAT	57

밑줄 친 부분은 망고 압타머 서열, MG 압타머 서열을 의미하며, 굵은 글씨로 표시한 부분은 T7 프로모터 부위를 나타낸다. S gene (D614G Mutation) of SARS-CoV-2에서, 밑줄, 굵은글씨, 기울임체로 표시한 부분은 돌연변이 부위를 나타낸다.

DNA Probe	Sequence (5'→3')	서열번호
SARS-CoV-2 N gene_IVT-FP	TAATACGACTCACTATAGGGGCAGTCAAGCCTCTTCTCGT	58
SARS-CoV-2 N gene_IVT-RP	AACATTGGCCGCAAATTGCA	59
SARS-CoV-1_IVT-FP	TAATACGACTCACTATAGGGGCAGTCAAGCCTCTTCTCGC	60
SARS-CoV-1_IVT-RP	GGTGTGACTTCCATGCCAAT	61
MERS-CoV_IVT-FP	TAATACGACTCACTATAGGGATAGTCAATCATCTTCAAGA	62
MERS-CoV_IVT-RP	TTCTGATGGGTAAGTTTAAA	63
HCoV-229E-FP	TAATACGACTCACTATAGGGGTGCTCCTTCCCGGTCTCAG	64
HCoV-229E-RP	CTTCCAAAGTTGTGGTCAAG	65
HCoV-NL63-FP	TAATACGACTCACTATAGGGGCTCTAATAACTCATCTCGT	66
HCoV-NL63-RP	TCCCCCATATTGTGATTAAA	67
HCoV-OC43-FP	TAATACGACTCACTATAGGGCTGCTCCTAATTCCAGATCT	68
HCoV-OC43-RP	AACTCTAATCTTGATCCAAA	69
HCoV-HKU1-FP	TAATACGACTCACTATAGGGCTGCTTCTAATAGTCGACCA	70
HCoV-HKU1-RP	AAGTCTAATTTAGAACCAAA	71
SARS-CoV-2 S gene (G614)_IVT-FP	TAATACGACTCACTATAGGGTCTAACCAGGTTGCTGTTCTTTATCAGG G TGTTAACTGCACAGAAGTCCC	72
SARS-CoV-2 S gene (G614)_IVT-RP	GGAGTAAGTTGATCTGCATGAATAGCAACAGGGACTTCTGTGCAGTTAAC	73
SARS-CoV-2 S gene (D614)_IVT-FP	TAATACGACTCACTATAGGGTCTAACCAGGTTGCTGTTCTTTATCAGG A TGTTAACTGCACAGAAGTCCC	74
SARS-CoV-2 S gene (D614)_IVT-RP	GGAGTAAGTTGATCTGCATGAATAGCAACAGGGACTTCTGTGCAGTTAAC	75

굵은 글씨로 표시한 부분은 T7 프로모터 부위를 나타낸다. SARS-CoV-2 S gene (G614, D614G Mutation)에서, 밑줄, 굵은글씨, 기울임체로 표시한 부분은 돌연변이 부위를 나타낸다.

타겟 RNA 서열의 준비

타겟 RNA는 시험관내 전사를 통해 생성되었다. 본 발명에서 이용한 타겟 RNA의 서열 정보는 [표 3]과 같다.

Name	Sequence (5'→3')	SSize (bp)	ㅅ서열번호
SARS-CoV-2 N gene	GCAGUCAAGCCUCUUCUCGUUCCUCAUCACGUAGUCGCAACAGUUCAAGAAAUUCAACUCCAGGCAGCAGUAGGGGAACUUCUCCUGCUAGAAUGGCUGGCAAUGGCGGUGAUGCUGCUCUUGCUUUGCUGCUGCUUGACAGAUUGAACCAGCUUGAGAGCAAAAUGUCUGGUAAAGGCCAACAACAACAAGGCCAAACUGUCACUAAGAAAUCUGCUGCUGAGGCUUCUAAGAAGCCUCGGCAAAAACGUACUGCCACUAAAGCAUACAAUGUAACACAAGCUUUCGGCAGACGUGGUCCAGAACAAACCCAAGGAAAUUUUGGGGACCAGGAACUAAUCAGACAAGGAACUGAUUACAAACAUUGGCCGCAAAUUGCA	380	76
SARS-CoV-1	GCAGUCAAGCCUCUUCUCGCUCCUCAUCACGUAGUCGCGGUAAUUCAAGAAAUUCAACUCCUGGCAGCAGUAGGGGAAAUUCUCCUGCUCGAAUGGCUAGCGGAGGUGGUGAAACUGCCCUCGCGCUAUUGCUGCUAGACAGAUUGAACCAGCUUGAGAGCAAAGUUUCUGGUAAAGGCCAACAACAACAAGGCCAAACUGUCACUAAGAAAUCUGCUGCUGAGGCAUCUAAAAAGCCUCGCCAAAAACGUACUGCCACAAAACAGUACAACGUCACUCAAGCAUUUGGGAGACGUGGUCCAGAACAAACCCAAGGAAAUUUCGGGGACCAAGACCUAAUCAGACAAGGAACUGAUUACAAACAUUGGCCGCAAAUUGCACAAUUUGCUCCAAGUGCCUCUGCAUUCUUUGGAAUGUCACGCAUUGGCAUGGAAGUCACACC	442	77
MERS-CoV	AUAGUCAAUCAUCUUCAAGAGCCUCUAGCUUAAGCAGAAACUCUUCCAGAUCUAGUUCACAAGGUUCAAGAUCAGGAAACUCUACCCGCGGCACUUCUCCAGGUCCAUCUGGAAUCGGAGCAGUAGGAGGUGAUCUACUUUACCUUGAUCUUCUGAACAGACUACAAGCCCUUGAGUCUGGCAAAGUAAAGCAAUCGCAGCCAAAAGUAAUCACUAAGAAAGAUGCUGCUGCUGCUAAAAAUAAGAUGCGCCACAAGCGCACUUCCACCAAAAGUUUCAACAUGGUGCAAGCUUUUGGUCUUCGCGGACCAGGAGACCUCCAGGGAAACUUUGGUGAUCUUCAAUUGAAUAAACUCGGCACUGAGGACCCACGUUGGCCCCAAAUUGCUGAGCUUGCUCCUACAGCCAGUGCUUUUAUGGGUAUGUCGCAAUUUAAACUUACCCAUCAGAA	451	78
HCoV-229E	GUGCUCCUUCCCGGUCUCAGUCGAGGUCGCAGAGUCGCGGUCGUGGUGAAUCCAAACCUCAAUCUCGGAAUCCUUCAAGUGACAGAAACCAUAACAGUCAGGAUGACAUCAUGAAGGCAGUUGCUGCGGCUCUUAAAUCUUUAGGUUUUGACAAGCCUCAGGAAAAAGAUAAAAAGUCAGCGAAAACGGGUACUCCUAAGCCUUCUCGUAAUCAGAGUCCUGCUUCUUCUCAAACUUCUGCCAAGAGUCUUGCUCGUUCUCAGAGUUCUGAAACAAAAGAACAAAAGCAUGAAAUGCAAAAGCCACGGUGGAAAAGACAGCCUAAUGAUGAUGUGACAUCUAAUGUCACACAAUGUUUUGGCCCCAGAGACCUUGACCACAACUUUGGAAG	391	79
HCoV-NL63	GCUCUAAUAACUCAUCUCGUGCUAGCAGUCGUUCUUCAACUCGUAACAACUCACGAGACUCUUCUCGUAGCACUUCAAGACAACAGUCUCGCACUCGUUCUGAUUCUAACCAGUCUUCUUCAGAUCUUGUUGCUGCUGUUACUUUGGCUUUAAAGAACUUAGGUUUUGAUAACCAGUCGAAGUCACCUAGUUCUUCUGGUACUUCCACUCCUAAGAAACCUAAUAAGCCUCUUUCUCAACCCAGGGCUGAUAAGCCUUCUCAGUUGAAGAAACCUCGUUGGAAGCGUGUUCCUACCAGAGAGGAAAAUGUUAUUCAGUGCUUUGGUCCUCGUGAUUUUAAUCACAAUAUGGGGGA	355	80
HCoV-OC43	CUGCUCCUAAUUCCAGAUCUACUUCGCGCACAUCCAGCAGAGCCUCUAGUGCAGGAUCGCGUAGUAGAGCCAAUUCUGGCAAUAGAACCCCUACCUCUGGUGUAACACCUGACAUGGCUGAUCAAAUUGCUAGUCUUGUUCUGGCAAAACUUGGCAAGGAUGCCACUAAACCUCAGCAAGUAACUAAGCAUACUGCCAAAGAAGUCAGACAGAAAAUUUUGAAUAAGCCCCGCCAGAAGAGGAGCCCCAAUAAACAAUGCACUGUUCAGCAGUGUUUUGGUAAGAGAGGCCCUAAUCAGAAUUUUGGUGGUGGAGAAAUGUUAAAACUUGGAACUAGUGACCCACAGUUCCCCAUUCUUGCAGAACUCGCACCCACAGCUGGUGCGUUUUUCUUUGGAUCAAGAUUAGAGUU	412	81
HCoV-HKU1	CUGCUUCUAAUAGUCGACCAGGUUCACGUUCUCAAUCACGUGGACCCAAUAAUCGUUCAUUAAGUAGAAGUAAUUCUAAUUUUAGACAUUCAGAUUCUAUAGUAAAACCUGAUAUGGCUGAUGAGAUCGCUAAUCUUGUUUUAGCCAAGCUUGGUAAAGAUUCUAAACCUCAGCAAGUCACUAAGCAAAAUGCCAAGGAAAUCAGGCAUAAAAUUUUAACAAAACCUCGCCAAAAGCGAACUCCUAAUAAACAUUGUAAUGUUCAACAGUGUUUUGGUAAAAGAGGACCUUCUCAAAAUUUUGGUAAUGCUGAAAUGUUAAAGCUUGGUACUAAUGAUCCUCAGUUUCCUAUUCUUGCAGAAUUAGCUCCUACACCAGGUGCUUUUUUCUUUGGUUCUAAAUUAGACUU	409	82
SARS-CoV-2 S gene (G614)	UCUAACCAGGUUGCUGUUCUUUAUCAGGGUGUUAACUGCACAGAAGUCCCUGUUGCUAUUCAUGCAGAUCAACUUACUCC	80	83
SARS-CoV-2 S gene (D614)	UCUAACCAGGUUGCUGUUCUUUAUCAGGAUGUUAACUGCACAGAAGUCCCUGUUGCUAUUCAUGCAGAUCAACUUACUCC	80	84
E. coli 16S rRNA	AGACUCCUACGGGAGGCAGCAGUGGGGAAUAUUGCACAAUGGGCGCAAGCCUGAUGCAGCCAUGCNGCGUGUAUGAAGAAGGCCUUCGGGUUGUAAAGUACUUUCAGCGGGGAGGAAGGGAGUAAAGUUAAUACCUUUGCUCAUUGACGUUACCCGCAGAAGAAGCACCGGCUAACUCCGUGCCAGCAGCCGCGGUAAUACGGAGGGUGCAAGCGUUAAUCGGAAUUACUGGGCGUAAAGCGCACGCAGGCGGUUUGUUAAGUCAGAUGUGAAAUCCCCGGGCUCAACCUGGGAACUGCAUCUGAUACUGGCAAGCUUGAGUCUCGUAGAGGGGGGUAGAAUUCCAGGUGUAGCGGUGAAAUGCGUAGAGAUCUGGAGGAAUACCGGUGGCGAAGGCGGCCCCCUGGACGAAGACUGACGCUCAGGUGCGAAAGCGUGGGGAGCAAACAGGAUUAGAUACCCUGGUAGUCCACGCCGUAAACGAUGUCGACUUGGAGGUUGUGCCCUUGAGGCGUGGCUUCCGGANNUAACGCGUUAAGUCGACCGCCUGGGGAGUACGGCCGCAAGGUUAAAACUCAAAUGAAUUGACGGGGGCCGCACAAGCGGUGGA	610 (327-936)	85
S. aureus 16S rRNA	CAGAAGAGGAAAGUGGAAUUCCAUGUGUAGCGGUGAAAUGCGCAGAGAUAUGGAGGAACACCAGUGGCGAAGGCGACUUUCUGGUCUGUAACUGACGCUGAUGUGCGAAAGCGUGGGGAUCAAACAGGAUUAGAUACCCUGGUAGUCCACGCCGUAAACGAUGAGUGCUAAGUGUUAGGGGGUUUCCCGCCCCUUAGUGCUGCAGCUAACGCAUUAAGCACUCCGCCUGGGGAGUACGACCGCAAGGUUGAAACUCAAAGGAAUUGACGGGGACCCGCACAAGCGGUGGAGCAUGUGGUUUAAUUCGAAGCAACGCGAAGAACCUUACCAAAUCUUGACAUCCUUUGACAACUCUAGAGAUAGAGCCUUCCCCUUCGGGGGACAAAGUGACAGGUGGUGCAUGGUUGUCGUCAGCUCGUGUCGUGAGAUGUUGGGUUAAGUCCCGCAACGAGCGCAACCCUUAAGCUUAGUUGCCAUCAUUAAGUUGGGCACUCUAAGUUGACUGCCGGUGACAAACCGGAGGA	524 (666-1188)	86

Split T7 프로모터 기반 DNA 프로브 및 반응 조건의 최적화

1-1. T7 프로모터 분할 비율

본 발명의 핵심은 3방향 접합 구조를 유도하여 타겟 RNA의 존재 하에서 split T7 프로모터의 효과적인 형성이기 때문에, 우선 본 발명에 앞서 기존의 T7 프로모터를 분할하여 각 비율에 따른 전사 효율을 분석하였다. (도 2).

분할 T7 프로모터로 전사를 확인하기 위해 3가지 유형의 DNA 프로브(분할 프로모터 1(Split Promoter 1, SP1), 분할 프로모터 2(Split Promoter 2, SP2) 및 주형(Template, T))를 사용하여 전사 반응을 수행했다. 반응 혼합물은 2 μL의 SP1, SP2 및 T(각각 1 μM), 2 μL 10x T7 버퍼, 0.8 μL T7 RNA 중합효소(2 U/μL), 0.4 μL RNase 억제제(0.08 U/μL), 2 μL TO1-비오틴(1μM), 1μL rNTP(각각 2.5mM) 및 11.8μL DEPC 처리수로 구성되었다. 반응 혼합물을 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 다음, 384-웰 플레이트로 옮겼다. 형광 신호는 마이크로 플레이트 리더(SpectraMax iD5 Multi-Mode Microplate Reader, Molecular Devices, USA)를 사용하여 각각 507 nm 및 547 nm의 여기(excitation) 및 방출(emission) 파장에서 측정되었다.

타겟 RNA는 시험관내 전사를 통해 생성되었다. 본 발명에서 이용한 타겟 RNA의 서열 정보 상기 [표 3]과 같다.

구체적으로, 각각의 플라스미드를 PCR 주형으로 하고, T7 프로모터 서열을 포함하는 프라이머를 이용하여 먼저 타겟 RNA 영역에 해당하는 DNA 서열을 생성하였다. 다음으로, 주형 DNA 1μg, 10X 반응 완충액 1.5μL(최종 0.75x), rNTP 1.5μL(각각 7.5mM), T7 RNA 중합효소 Mix 1.5μL, DEPC 처리수 14.5μL로 이루어진 전사 반응 용액을 준비했다. 그 다음 37℃에서 16시간 동안 인큐베이션하여 전사 반응을 수행하였고, 그 후 DNaseⅠ에 의한 PCR 산물이 분해되었다. RNA 전사 산물은 Monarch RNA Cleanup Kit를 이용하여 정제하고 260 nm 파장에서 나노드롭으로 정량하여 -80 ℃에서 보관한 후 사용하였다.

T7 프로모터 형성을 조절하기 위해서 T7 프로모터의 5' 말단 부분부터 순차적으로 닉 부위를 삽입하여 다양한 비율로 분할 된 T7 프로모터를 제작하였다. 망고 압타머의 상보적 서열을 주형에 배치하여 전사 후, TO-1 비오틴의 형광 신호를 측정함으로써, 전사 반응을 모니터링하였다. 분할된 T7 프로모터 DNA 프로브의 서열은 전술한 [표 1]의 서열번호 1 내지 13의 서열을 사용하였다.

그 결과, 도 3에 도시된 바와 같이, 온전한 T7 프로모터(0:20 분할 비율)에서 T+SP2 또는 T+SP1+SP2의 추가는 높은 형광 신호로 나타나는 효과적인 전사를 초래했다. 1:19 비율의 분할 T7 프로모터를 사용하면 닉 부위가 존재하더라도(T+SP1+SP2) 손상되지 않은 T7 프로모터에 비해 신호가 증가했다. 또한, T+SP2가 존재하는 경우 전사가 효과적으로 발생하였다. 분할 비율을 2:18에서 4:16으로 변경했을 때, 전사는 T+SP1+SP2의 존재 하에서 효과적으로 발생하였다. 3:17 비율 이후에는 SP1의 부재로 인해 형광 값이 급격히 낮아졌으며, 이는 T7 프로모터 5'쪽의 3-뉴클레오타이드 부분이 T7 RNA 중합효소가 T7 프로모터를 특이적으로 인식하는데 중요하다는 것을 의미함을 알 수 있다. 또한, 5:15의 경우 SP1와 SP2가 모두 존재하는 경우에도 전사가 거의 진행되지 않는 것을 확인하였으며, 이로 보아 T7 프로모터의 5'쪽의 5-mer 이후 닉 부위가 존재하면 T7 RNA 중합효소가 정상적으로 인식하지 못함을 의미함을 알 수 있다.

3-방향 접합 구조 형성을 통하여 온전한 이중 가닥 형태의 T7 프로모터를 이루기 위해서는 4:16 분할 비가 가장 적합하다는 것을 확인하였다.

1-2. 중첩서열의 최적화

이후 4:16 비율의 T7 프로모터를 3-방향 접합구조체에 적용시키기 위한 구조 최적화를 진행하였다(도 4).

T7 프로모터 3'쪽의 16-뉴클레오타이드는 Signal template에 상보적으로 결합하며 보편적이다. 타겟 RNA가 존재하는 경우에만 ST 및 ST-16으로 구성된 첫 번째 프로브와 두 번째 프로브(ST-4)를 결합하여 닉 부위가 있는 완전한 T7 프로모터를 형성해야 하므로, 중첩 부분의 Tm value가 가장 중요 요인이며 추가 중첩서열(0~4bp)을 배치하여 Tm value를 조절하였다. 추가 중첩서열 부분은 기본적으로 T7 프로모터 5'부분의 4bp를 포함하고 있다.

중첩처열의 최적화를 진행하기 위한 DNA 프로브의 서열은 전술한 [표 1]의 서열번호 13 내지 24의 서열을 사용하였다.

우선 중첩서열(N=0)이 T7 프로모터의 4bp일 경우 타겟서열이 존재하지 않을 때 형광이 나오지 않아 구조를 형성하지 않는 목적에 적합하였다. 하지만 target이 존재할 때에 3-방향 접합 구조가 너무 짧은 중첩으로 인해 완벽히 이루어지지 않아 T7 프로모터가 형성이 안되어 전사가 효과적으로 수행되지 않음을 확인할 수 있다. 중첩 서열을 1bp이상 추가한 경우(N=1), 타겟서열이 존재할 때만 높은 형광 값을 나타냄을 확인하였다. 이를 통해 3-방향 접합 구조를 안정적으로 형성하고 전사 반응을 유도하기 위해서는 T7 프로모터부터의 4bp 외에 적어도 1bp의 중첩이 필요함을 확인했다. 추가된 중첩 서열이 3bp를 초과하는 경우, 타겟서열이 존재하지 않아도 비특이적인 전사가 진행되었다.

따라서, 적절한 추가 중첩서열은 2bp로 설정되었고, 전체 중첩 영역은 6bp(T7 프로모터로부터 4bp)로 설정되었다.

이후 3-방향 접합 구조에 bulge구조를 넣어 이중가닥 닉 부위가 존재하는 T7 프로모터의 안정성을 실험하였다(도 5). Bulge 구조가 도입된 경우의 ST와 ST-4의 DNA서열은 전술한 [표 1]의 서열번호 25 내지 34의 서열을 사용하였다.

그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이 bulge가 들어가면 오히려 구조의 안정성이 떨어져 타겟 핵산서열이 존재하여도 three way 구조가 제대로 형성되지 못하여 전사가 덜 일어나는 것을 확인하였다. 따라서, 중첩서열은 서로 상보적인 2bp 이외에는 추가하지 않고 bulge 구조가 생성되지 않는 것이 최적화되는 구조임을 확인하였다.

1-3. 반응 조건의 최적화

제안된 STAR의 최상의 성능을 얻기 위해 버퍼, 효소, 반응 시간 및 반응 온도에 대한 최적화 실험을 수행했다.

DTT의 농도를 0.375 mM 내지 1.5mM, MgCl₂의 농도를 0 내지 20 mM으로 하여 각각의 경우의 수(25가지; 5X5)를 모두 3번씩 실험하여 형광강도를 측정하였다. 스페르미딘은 0 내지 5mM 농도에서 타겟이 있는 경우와 없는 경우를 대비하여 형광강도를 측정하였으며, 단일 가닥 DNA 결합 단백질(SSB)도 0 내지 50 ng/ul에서의 형광강도를 측정하였다. T7 RNA중합효소는 0 내지 80U에서, 반응시간은 0 내지 120 분에서, 반응 온도는 25, 30, 37, 41도에서 측정하였다. 또한, 어닐링(annealing) 방법을 최적화하기 위하여 급성냉각(Fast cooling), 느린냉각(slow cooling), 냉각을 진행하지 않음(w/o cooling)을 비교하였다.

그 결과 도 6 내지 도 9에 나타난 바와 같이, 이상적인 조건은 다음과 같았다: 10mM의 MgCl₂, 1.5mM의 DTT(도 6), 3mM의 스페르미딘, 20ng/μL의 단일 가닥 DNA 결합 단백질(SSB)(도 7), 20U의 T7 RNA 중합효소, 반응시간 30분, 반응 온도는 37℃(도 8), 냉각은 따로 진행하지 않음.

즉, 프로브와 타겟 RNA의 효율적인 혼성화를 매개할 수 있는 스페르미딘과 SSB의 최적화된 양으로 인해, 3-방향 접합 구조가 효과적으로 형성되어 초기 열 변성 및 냉각 단계 없이도 전사 반응을 유도할 수 있는 조건을 확인하였다. 따라서, 등온 조건(37℃)에서 전체 분석 작업을 수행해야 하는 필요성을 고려할 때 실제 현장 적용 측면에서 매우 유리하다.

1-4. 3-방향 접합 구조와 선형 구조인 경우의 전사 효율 비교

최종적으로 최적화된 버퍼와 3-방향 접합 구조를 기존 T7 프로모터와 비교하기 위하여 단일 가닥 RNA에 결합하여 높은 형광 신호를 방출하는 SYBR Green II를 사용하여 실시간 형광 모니터링을 수행하였다.

그 결과, 도 9에 나타난 바와 같이, 기존 T7 프로모터와 비교하여 큰 차이가 없고, 오히려 3방향 접합 구조의 전사가 선형 구조의 전사와 거의 비슷한 전사효율을 갖는다는 것을 알 수 있었다.

1-5. 3-방향 접합 구조를 확인하기 위한 겔 전기영동 수행

본 발명은 3-방향 접합 구조체 기반의 분할 T7 프로모터와 형광 RNA 압타머 기술을 융합한 기술로서 타겟 핵산 바이오 마커가 존재할 때 형광신호가 증폭된다.

DNA 프로브들은 2종류의 단일 가닥 DNA로 구성되어 있다. 단일 주형(Signal template, ST)는 형광 RNA 압타머 중 하나인 망고 압타머의 상보적인 서열(노랑), T7 프로모터 서열(파랑) 그리고 타겟 서열의 절반과 상보적인 서열 (검정)로 이루어져 있다. 분할된 T7-16(Split T7-16, ST-16)은 T7 프로모터의 일부 서열(16mer; 파랑)이며 ST의 T7 프로모터와 상보적이다. Tm 값은 56.3℃로 37℃ 반응에서 타겟물질과 상관없이 ST에 상보적으로 결합하므로 보편적이다. 3-방향 접합 구조를 확인하기 위한 겔 전기영동을 수행하였으며, 도 10는 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 결과를 나타낸다.

3-방향 접합 구조의 형성은 8% 폴리아크릴아미드 겔을 사용하여 PAGE(Poly Acrylamide Gel Electrophoresis)로 확인하였다. 샘플은 1μM의 신호 템플릿(ST), 1μM Split T7-16(ST-16), 1μM Split T7-4(ST-4), 500nM N 유전자 RNA 및 0.5U/μL T7 RNA 중합효소를 37℃에서 30분간 배양하여 준비했다. 준비된 샘플을 겔에 로드하고 40분 동안 200V에서 1X TBE 완충액으로 로딩했다. 또한, 135V에서 1시간 동안 1X TBE 완충액에서 2% 아가로스 겔을 사용하여 아가로스 겔 전기영동을 수행하였다. GreenStar Nucleic Acid 염색 용액(Bioneer, Daejeon, Korea)을 사용하여 결과를 시각화하고 ChemiDoc(Bio-rad, CA, USA)를 사용하여 겔을 스캔했다.

분할 T7-4(ST-4)는 T7 프로모터의 일부 서열 (4mer; 파랑)과 나머지 절반의 타겟서열과 상보적으로 결합 가능한 서열(검정)로 이루어져 있다. 본 발명의 모든 반응은 37℃에서 진행된다. ST의 5'-ATTATT-3' 서열이 ST-4에 상보적이나 Tm 값이 12℃ 이므로 37℃에서 결합이 불가능하도록 디자인하였다. 따라서 타겟물질이 존재하지 않으면 DNA 프로브들 중 ST와 ST-4 프로브는 결합할 수 없으며 이에 따라 3-방향 접합 구조를 이루지 못하여 완전한 이중가닥 T7 프로모터를 형성하지 못한다. 타겟물질이 존재할 때는 타겟 RNA가 우선적으로 ST와 ST-4의 각각 타겟 물질의 상보적인 서열과 결합하여 3-방향 접합 구조체를 형성한다. 이를 통해 닉 부위가 존재하는 이중 가닥의 T7 프로모터를 이루게 된다.

그 결과, 도 9에 나타난 바와 같이, PAGE 분석을 통해 타겟 및 T7 RNA 중합효소 촉매 전사 반응의 존재 하에서 3-방향 접합 구조의 형성을 확인하였다. 도 9에 도시된 바와 같이 ST와 ST-16은 서로 혼성화 되었고(a), ST, ST-16, 및 ST-4는 타겟의 부재하에서 3-방향 접합 구조를 형성하지 않았다(d). 또한, 모든 DNA 프로브와 타겟이 존재할 때(g), T7 RNA 중합효소의 존재가 전사(h)를 통해 많은 양의 light-up RNA 압타머를 생성하는 3-방향 접합 구조가 형성되었다.

1-6. 다양한 반응 조건에서 형광 방출 스펙트럼 평가

다음으로, STAR의 각 요소가 없는 형광 스펙트럼을 평가하였다(도 11). T7 RNA 중합효소에 의한 RNA 전사가 일어나게 되며 망고 압타머를 생성하게 된다. 최종적으로 망고 압타머와 결합 가능한 형광염료인 To1-비오틴과 결합하여 높은 형광신호를 나타나게 된다. DNA 프로브(ST, ST-16, ST-4) 중 하나 또는 타겟서열이 없으면 RNA 전사에 필수적인 닉 부위가 있는 이중가닥 T7 프로모터가 형성되지 않고 망고 압타머가 생성되지 않는다. 따라서 망고 압타머와 TO1-비오틴의 결합이 일어나지 않고 무시 가능한 형광 신호가 나타난다. 또한 TO1-비오틴 또는 T7 RNA 중합효소가 없는 경우에도 형광 신호가 나타나지 않는다. 모든 요소가 존재할 때만(w/all) 높은 형광 신호가 생성되어 STAR의 모든 요소가 각각 타겟 RNA의 one-pot 검출에 중요한 역할을 한다는 것을 나타낸다.

SARS-CoV-2 N 유전자의 각 유전자좌위의 검출 감도 측정

본 발명에서는 STAR의 핵심인 3-방향 접합 구조의 형성 효율이 각 타겟 영역에 대해 다를 수 있고 다른 검출 감도로 이어질 수 있다고 가정하였다. SARS-CoV-2를 타겟 물질로 선정하여 N 유전자의 일정 영역(Nucleotide positions 28809-29188)에 대하여 5 종류의 프로브를 설계하였다(도 14A). N 유전자의 서열은 NCBI Accession number NC_045512를 참고하였다. 5종의 프로브에 대한 구체적인 서열 정보는 전술한 [표 1]의 서열번호 35 내지 44의 서열을 사용하였다.

DNA STAR의 다중 서열 정렬을 통해 각 영역이 SARS-CoV-2에 특이적임을 확인한 후, 100pM(6ⅹ10⁷copy/μL)에서 100fM(6 ⅹ10⁴ copy/μL), 타겟의 존재(F) 형광 신호를 타겟의 부재(FNTC; 비타겟 대조군)로 나누어 배수 변화를 계산하였다. 도 14B의 히트맵에 나타난 바와 같이, 전사 효율은 표적화 유전자좌에 의존적이었다. 5개의 DNA 프로브 세트(Locus 1-5) 중 L2 및 L4에 대한 DNA 프로브는 다른 프로브(L1, L3 및 L5)보다 더 높은 배수 변화를 보였고 타겟 N 유전자를 100 fM까지 결정했다(도 14C). 그 결과, 각 영역에 대하여 민감도가 상이함을 확인하였으며, 5개의 영역 중 L2, L4가 정량적으로 100fM까지 검출이 가능함을 확인하였다.

STAR의 검출 감도를 향상시키기 위한 2개의 유전자좌 타겟화

영역별 실험 결과(도 14)를 바탕으로 민감도를 향상시키기 위하여 하나의 반응에서 타겟 유전자(N gene)의 다양한 영역을 타겟화하는 방식으로 두 개의 프로브를 동시에 사용하는 방법을 도입하였다. 실시예 2의 결과를 기반으로 민감도가 가장 뛰어났던 L2 및 L4를 타겟으로 하는 STAR 프로브가 선택되었다. 도 15A는 SARS-CoV-2 N 유전자와 다른 인간 코로나바이러스의 두 가지 다른 유전자좌의 개략도를 나타내며, SARS-CoV-2와 다른 다른 바이러스 RNA 서열의 뉴클레오타이드는 회색으로 흐릿한 것을 나타낸다. 각각의 DNA 프로브 서열 정보는 전술한 [표 2]와 같으며, 타겟 RNA의 서열 정보는 전술한 [표 3]과 같다.

각각의 STAR 프로브는 타겟 RNA 영역의 각각의 유전자좌에 결합하여 신호를 생성하므로 신호를 증폭할 수 있다. 두 영역(L2 및 L4)의 STAR 프로브가 동시에 하나의 타겟에 결합하는지 확인하기 위해 실시예 1-5에서 전술한 바와 같이 아가로스 겔 전기영동을 먼저 수행하였다. L2 및 L4 프로브 세트의 농도는 각각 500nM이며(a 및 b), L2 및 L4 프로브가 동시에 존재할 때 각 프로브 세트의 농도는 250nM(c)이다. 그 결과, 도 15B와 같이 두 개의 프로브 세트가 동시에 존재하는 경우(c) 단일 프로브 세트(L2 또는 L4)만 존재하는 경우(a 및 b)보다 전기영동 이동도가 감소하며, 이는 더 높은 밴드 위치에 의해 확인되었다. 이러한 결과는 두 개의 STAR 프로브가 타겟 RNA의 각 영역에 특이적으로 결합한다는 것을 증명한다.

타겟 RNA의 검출을 위해 STAR에 대한 모든 시약이 미리 혼합되었다; 4 μL 10X STAR 완충액(400mM Tris-HCl, 100mM MgCl2, 15mM DTT, 30mM 스페르미딘), 6μL STAR 프로브 세트(2μL Signal Template (2μM), 2μL Split T7-16(2 μM) 및 2 μL Split T7-4(2 μM)), 4 μL TO1-비오틴(1 μM) 또는 2 μL 말라카이트 그린 염화물(100 μM)), 4 μL SSB(20 ng/μL), 4 μL rNTP (각각 2.5mM), 0.4μL T7 RNA 중합효소(0.5U/μl), 0.8μL RNase 억제제(0.08U/μL) 및 DEPC-물(최대 36μL). 타겟 RNA가 첨가되기 전까지 시약의 혼합 순서는 임의로 혼합될 수 있다. 다음, 4μL의 타겟 RNA를 첨가하고 반응 혼합물을 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. N 유전자에서 이중 타겟화를 위해(도 15A), 각 STAR 프로브 세트(L2 및 L4)의 50nM이 추가되었다. 마지막으로, 반응 혼합물을 384-웰 플레이트로 옮기고, 여기서 망고 압타머에 대한 TO1-비오틴 결합에 상응하는 형광 신호는 마이크로플레이트 판독기(SpectraMax iD5 Multi-Mode Microplate Reader, Molecular Devices, USA)를 사용하여 각각 507 nm 및 547 nm의 여기 및 방출 파장에서 측정되었다. 말라카이트 그린 압타머에 결합하는 말라카이트 그린에서 나오는 형광 신호 측정은 616 nm 및 665 nm를 여기 및 방출 파장으로 사용하였다.

두 개의 프로브 세트를 동시에 사용하는 경우 형광 강도를 하나만 사용한 경우와 비교하였다. L2 프로브 세트(100nM), L4 프로브 세트(100nM), 개별적으로, L2 및 L4 프로브 세트(50nM+50nM) 모두의 존재하에서 측정된 형광 신호를 측정하였으며, 타겟 N 유전자 RNA의 농도는 1nM였다. 두 개의 프로브 세트를 동시에(L2+L4) 사용하는 경우 형광 신호가 증가함을 확인하였으며(도 15C), 특히 타겟 RNA 농도가 낮은 제한된 상황에서 특히나 신호 개선을 위한 좋은 방법으로 사용할 수 있음을 나타내었다.

L2 및 L4에서 STAR 프로브 세트 조합 사용시 검출 한계를 측정하였다. STAR 프로브 세트의 농도는 각각의 다른 유전자좌에서 50nM이다. 타겟 RNA는 2개의 유전자좌 타겟화를 통해 10²copy/μL까지 결정이 가능함을 나타냈으며, 하나의 유전자좌를 타겟으로 하는 것에 비해 600배 개선되었고, 이는 실제 임상 상황에서 SARS-CoV-2의 스크리닝에 충분함을 나타낸다(도 15D).

뿐만 아니라, STAR의 특이성은 다른 알파 코로나바이러스 및 베타 코로나바이러스를 포함하여 6개의 인간 코로나바이러스에 결합하지 않도록 설계된 DNA 프로브로 평가되었다. SARS-CoV-2 영역과 다른 6개의 코로나바이러스의 뉴클레오타이드는 회색으로 표시된다(도 15A). 100nM 농도의 6개의 코로나바이러스 RNA가 존재할 때 형광 신호는 NTC에서 관찰된 것과 유사했으며 고도로 강화된 형광 신호는 1nM의 SARS-CoV-2 N 유전자에 대해서만 생성되었다(도 15E). 이는 RNA 타겟 농도가 작은 상황에서도 타겟으로 하는 SARS-CoV-2만을 특이적이고 민감하게 검출할 수 있음을 나타낸다.

4-1. SARS-CoV-2 D614G 돌연변이 검출을 위한 Multiplex STAR

SARS-CoV-2의 D614G 돌연변이를 타겟으로 선택하여 STAR의 다용도 적용 가능성을 입증하는 실험을 진행했다. 또한 단일 튜브에서 SARS-CoV-2의 D614G 변이와 N 유전자의 동시 검출을 위한 다중 검출도 확인했다.

D614G 돌연변이는 알파, 베타, 델타 등 모든 SARS-CoV-2 변이체에 존재하는 것으로 알려져 있다. 도 16A에서 돌연변이는 노란색으로 표시하였으며, 와일드 타겟에서 위양성 신호를 피하기 위해 빨간색으로 표시된 불일치 시퀀스를 추가하였다. SARS-CoV-2 genomic RNA의 23403번 위치에서 아데닌(A)이 구아닌(G)으로 치환됨에 따라 이러한 변화를 식별할 수 있도록 특정 STAR 프로브를 합리적으로 설계하였으며, 다중화 실험을 위해 말라카이트 그린 압타머 및 다른 파장을 갖는 fluorogenic 염료(말라카이트 그린)를 사용하였다(도 16A). DNA 프로브의 서열은 전술한 [표 1]의 서열번호 45 내지 49의 서열을 사용하였다.

다중 분석은 4μL 10xSTAR 완충액(400mM Tris-HCl, 100mM MgCl2, 15mM DTT, 30mM 스페르미딘), 3μL L2 프로브 세트(각 2μM), 3μL L4 프로브 세트(각 2μM), 6μL D614G 돌연변이 프로브 세트(각각 2μM), 4μL TO1-비오틴(1μM), 2μL 말라카이트 그린 클로라이드(100μM), 4μL SSB(20ng/μL), 4μL rNTP(각 2.5mM), 0.4μL T7 RNA 중합효소(0.5U/μL), 0.8μL RNase 억제제(0.08U/μL) 및 DEPC-water(최대 32μL)에 8μL의 타겟 RNA가 추가되었다.

4번째 위치(N4)에서 상이한 핵염기들(A, T, G, 및 C)을 평가하여 야생 타겟(wild type)으로부터 돌연변이체(D614G)의 효과적인 구별을 부여하는 최상의 것을 찾아내었으며, 그 결과 도 16B의 결과는 N4 위치의 G가 돌연변이 타겟(D614G)의 존재 하에 높은 형광 신호를 생성하면서 야생 타겟의 존재 하에 백그라운드 노이즈를 최소화한다는 것을 나타냈다. DNA 프로브 서열은 전술한 [표 2]의 서열번호 72 내지 75의 서열을 사용하였으며, 타겟 RNA 서열정보는 전술한 [표 3]의 서열번호 83 및 84를 사용하였다.

그 결과, 돌연변이에 대하여 100fM의 검출 한계를 얻었으며 야생형(wild type)이 돌연변이 검출에 간섭이 없는 것을 확인하였다(도 16C). 또한, 제안된 STAR를 사용하여 서로 다른 몰비(0%, 0.1%, 1%, 10%, 50% 및 100%)를 갖는 돌연변이체/야생 타겟의 혼합물을 분석하였다.

또한, 도 16D는 돌연변이 타겟의 0.1%가 야생 타겟과 구별됨을 나타내며, 이는 다른 방법과 비슷하거나 다른 방법보다 우수하므로, 본 발명의 우수한 특이성을 확인시켜준다.

5-2. 다중 검출을 위한 시스템

하나의 튜브에서 SARS-CoV-2의 D614G 돌연변이 및 N 유전자의 동시 검출을 위한 다중 STAR가 입증되었으며, 여기서 망고 압타머 및 말라카이트 그린 압타머는 각각 SARS-CoV-2의 N 유전자 및 D614G에 해당한다. 도 17A는 SARS-CoV-2 N 유전자 및 D614G 돌연변이의 동시 검출을 위한 one-pot 다중 STAR의 개략도를 나타낸다.

동시 검출을 위해 망고 및 말라카이트 그린 압타머를 이용했으므로, 두개의 압타머가 간섭 없이 형광 방출여부를 확인하고자 하였다. 그 결과, 도 17B는 망고 압타머 및 MG 압타머에 각각 결합하는 TO1-비오틴 및 MG의 정규화된 형광 방출 스펙트럼을 나타낸다. TO1-비오틴의 형광 방출 스펙트럼(fluorescence emission spectra)은 520 nm에서 570 nm 및 여기 파장(excitation wavelength) 480 nm에서 기록되었고, 말라카이트 그린의 형광 방출 스펙트럼은 640 nm에서 720 nm 및 여기 파장 600 nm에서 기록되었다. 망고 및 말라카이트 그린 압타머에 각각 결합한 후 TO1-비오틴 및 말라카이트 그린은 간섭 없이 뚜렷한 형광 방출 스펙트럼(녹색 및 적색)을 생성함을 확인했다(도 17B).

또한, N 유전자에 대한 STAR 프로브는 SARS-CoV-2의 N 유전자가 존재할 때만 망고 압타머의 생성을 통해 고도로 강화된 형광 신호(녹색)를 생성했으며, D614G 돌연변이에 대한 STAR 프로브는 고도로 강화된 형광 신호를 생성했다. 도 17C는 N 유전자 및 D614G 돌연변이의 one-pot 다중 검출 결과를 보여주는 히트맵을 나타낸다. 타겟 RNA의 농도는 10nM이었으며, D614G 돌연변이가 존재할 때만 말라카이트 그린 압타머를 형성하여 형광 신호(적색)를 생성하여 다중 분석 가능성을 입증했다(도 17C).

N 유전자에 대한 STAR 프로브와 D614G에 대한 STAR 프로브가 동시에 존재하는 다중화 실험에서 SARS-CoV-2의 N 유전자와 D614G 모두에 대한 민감도를 평가하였다. 100 fM까지 N 유전자와 D614G에 대한 타겟을 동시에 분석할 수 있음을 확인하였다(도 17D).

따라서, 본 발명의 STAR 프로브로 상이한 타겟 핵산서열의 다중 검출을 민감하고 간섭없이 수행할 수 있음을 확인하였다.

병원균 검출을 위한 시스템

STAR 분석이 다양한 응용에 사용되는지 확인하기 위해 두 병원성 박테리아인 E. coli(Escherichia coli)와 S. aureus(Staphylococcus Aureus)를 검출하는 실험을 수행했다(도 18). 민감하고 특이적 검출을 위해, 병원균 내에 다량 존재하는 16S rRNA를 타겟으로 선택하고 다른 박테리아 속으로 서열 분석 후 E. coli 및 S. aureus에 특이적인 STAR 프로브를 설계했다.

타겟 RNA 서열은 전술한 [표 3]의 서열번호 85 및 86의 서열을 사용하였으며, 사용한 DNA 프로브의 서열 정보는 전술한 [표 1]의 서열번호 50 내지 57의 서열을 사용하였다.

실험은 두 가지 방법으로 진행되었다. 하나의 방법은 병원체에서 추출한 total RNA를 검출하는 것이고 다른 하나는 추가적인 핵산 추출과정 없이 병원균의 열 처리 후에 바로 분석이 진행되는 direct 실험을 진행하여 검출하는 것이다(도 17A).

두 가지 실험 방법 중 핵산을 추출하는 과정을 진행하는 방법은 다음과 같이 진행된다. E. coli와 S. aureus는 먼저 Luria-Bertani 액체 배지에서 37℃에서 24시간 동안 진탕(150rpm)하면서 배양하였다. 그런 다음 1ml 배지를 박테리아 RNA 추출 키트를 사용하여 총 RNA를 추출했다.

추가적인 핵산추출 과정 없이 진행하는 direct 방법의 경우 5000rpm에서 원심분리한 후 박테리아 펠릿을 DEPC 처리된 물에 재현탁하고 95℃에서 5분 동안 가열 용해했다. 4 μL의 용해물을 전술한 절차에 따라 STAR 분석에 사용하였다.

도 18B에 도시된 바와 같이, E. coli 와 MRSA 모두, 각각의 프로브에 특이적으로 결합하여 높은 형광 신호를 발생하는 것을 확인하였다. 추출된 총 RNA를 100pg/μL ~ 100fg/μL 범위의 농도에서 정량적으로 측정하였으며, 100fg/μL의 농도에서도 검출이 가능한 것을 확인하였다.

또한 10³cells/μL 농도의 병원체를 이용하여 direct STAR를 수행하였다. 95℃에서 5분간 가열하여 각 병원체(E. coli 및 S. aureus)의 용해물을 제조한 후, E. coli 및 S. aureus 특이적 STAR 프로브로 STAR를 실행하였다. 도 18C는 병원성 세균의 검출을 위한 direct STAR의 결과를 보여주는 히트맵을 나타낸다. 각 병원체의 농도는 10³cells/μL이다.

결과적으로, 본 발명의 방법이 바이러스뿐만 아니라 병원성 박테리아의 다양한 바이오마커의 검출에 사용될 수 있으며, 전처리 없이 열처리만으로도 바로 검출이 가능함을 나타낸다. 따라서, 본 발명을 이용하는 경우 하나의 튜브 안에서 하나의 효소만으로 다중 검출 및 direct시스템의 구축이 가능하며 간편하고 신속하게 병원성 박테리아의 검출에 이용될 수 있다.

SEQUENCE LISTING <110> KONKUK UNIVERSITY INDUSTRIAL COOPERATION CORP <120> Probe Set for Isothermal One-Pot Reaction using Split T7 promoter and Uses Thereof <130> 1069767 <160> 86 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 105 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Split promoter template <400> 1 gtacgacaac taccccatac caaaccttcc ttcgtactta aaaatcccgg ccagattttg 60 ccaatcaccc tatagtgagt cgtattagtt agattttgcc aatca 105 <210> 2 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Split promoter 1-0 <400> 2 ttggcaaaat ctaac 15 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Split promoter 2-20 <400> 3 taatacgact cactataggg 20 <210> 4 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Split promoter 1-1 <400> 4 ttggcaaaat ctaact 16 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Split promoter 2-19 <400> 5 aatacgactc actataggg 19 <210> 6 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Split promoter 1-2 <400> 6 ttggcaaaat ctaacta 17 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> 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<220> <223> HCoV-NL63-RP <400> 67 tcccccatat tgtgattaaa 20 <210> 68 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> HCoV-OC43-FP <400> 68 taatacgact cactataggg ctgctcctaa ttccagatct 40 <210> 69 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> HCoV-OC43-RP <400> 69 aactctaatc ttgatccaaa 20 <210> 70 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> HCoV-HKU1-FP <400> 70 taatacgact cactataggg ctgcttctaa tagtcgacca 40 <210> 71 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> HCoV-HKU1-RP <400> 71 aagtctaatt tagaaccaaa 20 <210> 72 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> SARS-CoV-2 S gene (G614)_IVT-FP <400> 72 taatacgact cactataggg tctaaccagg ttgctgttct ttatcagggt gttaactgca 60 cagaagtccc 70 <210> 73 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> SARS-CoV-2 S gene (G614)_IVT-RP <400> 73 ggagtaagtt gatctgcatg aatagcaaca gggacttctg tgcagttaac 50 <210> 74 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> SARS-CoV-2 S gene (D614)_IVT-FP <400> 74 taatacgact cactataggg tctaaccagg ttgctgttct ttatcaggat gttaactgca 60 cagaagtccc 70 <210> 75 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> SARS-CoV-2 S gene (D614)_IVT-RP <400> 75 ggagtaagtt gatctgcatg aatagcaaca gggacttctg tgcagttaac 50 <210> 76 <211> 380 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> SARS-CoV-2 N gene <400> 76 gcagucaagc cucuucucgu uccucaucac guagucgcaa caguucaaga aauucaacuc 60 caggcagcag uaggggaacu ucuccugcua gaauggcugg caauggcggu gaugcugcuc 120 uugcuuugcu gcugcuugac agauugaacc agcuugagag caaaaugucu gguaaaggcc 180 aacaacaaca aggccaaacu gucacuaaga aaucugcugc ugaggcuucu aagaagccuc 240 ggcaaaaacg uacugccacu aaagcauaca auguaacaca agcuuucggc agacgugguc 300 cagaacaaac ccaaggaaau uuuggggacc aggaacuaau cagacaagga acugauuaca 360 aacauuggcc gcaaauugca 380 <210> 77 <211> 442 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> SARS-CoV-1 <400> 77 gcagucaagc cucuucucgc uccucaucac guagucgcgg uaauucaaga aauucaacuc 60 cuggcagcag uaggggaaau ucuccugcuc gaauggcuag cggagguggu gaaacugccc 120 ucgcgcuauu gcugcuagac agauugaacc agcuugagag caaaguuucu gguaaaggcc 180 aacaacaaca aggccaaacu gucacuaaga aaucugcugc ugaggcaucu aaaaagccuc 240 gccaaaaacg uacugccaca aaacaguaca acgucacuca agcauuuggg agacgugguc 300 cagaacaaac ccaaggaaau uucggggacc aagaccuaau cagacaagga acugauuaca 360 aacauuggcc gcaaauugca caauuugcuc caagugccuc ugcauucuuu ggaaugucac 420 gcauuggcau ggaagucaca cc 442 <210> 78 <211> 451 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> MERS-CoV <400> 78 auagucaauc aucuucaaga gccucuagcu uaagcagaaa cucuuccaga ucuaguucac 60 aagguucaag aucaggaaac ucuacccgcg gcacuucucc agguccaucu ggaaucggag 120 caguaggagg ugaucuacuu uaccuugauc uucugaacag acuacaagcc cuugagucug 180 gcaaaguaaa gcaaucgcag ccaaaaguaa ucacuaagaa agaugcugcu gcugcuaaaa 240 auaagaugcg ccacaagcgc acuuccacca aaaguuucaa cauggugcaa gcuuuugguc 300 uucgcggacc aggagaccuc cagggaaacu uuggugaucu ucaauugaau aaacucggca 360 cugaggaccc acguuggccc caaauugcug agcuugcucc uacagccagu gcuuuuaugg 420 guaugucgca auuuaaacuu acccaucaga a 451 <210> 79 <211> 391 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> HCoV-229E <400> 79 gugcuccuuc ccggucucag ucgaggucgc agagucgcgg ucguggugaa uccaaaccuc 60 aaucucggaa uccuucaagu gacagaaacc auaacaguca ggaugacauc augaaggcag 120 uugcugcggc ucuuaaaucu uuagguuuug acaagccuca ggaaaaagau aaaaagucag 180 cgaaaacggg uacuccuaag ccuucucgua aucagagucc ugcuucuucu caaacuucug 240 ccaagagucu ugcucguucu cagaguucug aaacaaaaga acaaaagcau gaaaugcaaa 300 agccacggug gaaaagacag ccuaaugaug augugacauc uaaugucaca caauguuuug 360 gccccagaga ccuugaccac aacuuuggaa g 391 <210> 80 <211> 355 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> HCoV-NL63 <400> 80 gcucuaauaa cucaucucgu gcuagcaguc guucuucaac ucguaacaac ucacgagacu 60 cuucucguag cacuucaaga caacagucuc gcacucguuc ugauucuaac cagucuucuu 120 cagaucuugu ugcugcuguu acuuuggcuu uaaagaacuu agguuuugau aaccagucga 180 agucaccuag uucuucuggu acuuccacuc cuaagaaacc uaauaagccu cuuucucaac 240 ccagggcuga uaagccuucu caguugaaga aaccucguug gaagcguguu ccuaccagag 300 aggaaaaugu uauucagugc uuugguccuc gugauuuuaa ucacaauaug gggga 355 <210> 81 <211> 412 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> HCoV-OC43 <400> 81 cugcuccuaa uuccagaucu acuucgcgca cauccagcag agccucuagu gcaggaucgc 60 guaguagagc caauucuggc aauagaaccc cuaccucugg uguaacaccu gacauggcug 120 aucaaauugc uagucuuguu cuggcaaaac uuggcaagga ugccacuaaa ccucagcaag 180 uaacuaagca uacugccaaa gaagucagac agaaaauuuu gaauaagccc cgccagaaga 240 ggagccccaa uaaacaaugc acuguucagc aguguuuugg uaagagaggc ccuaaucaga 300 auuuuggugg uggagaaaug uuaaaacuug gaacuaguga cccacaguuc cccauucuug 360 cagaacucgc acccacagcu ggugcguuuu ucuuuggauc aagauuagag uu 412 <210> 82 <211> 409 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> HCoV-HKU1 <400> 82 cugcuucuaa uagucgacca gguucacguu cucaaucacg uggacccaau aaucguucau 60 uaaguagaag uaauucuaau uuuagacauu cagauucuau aguaaaaccu gauauggcug 120 augagaucgc uaaucuuguu uuagccaagc uugguaaaga uucuaaaccu cagcaaguca 180 cuaagcaaaa ugccaaggaa aucaggcaua aaauuuuaac aaaaccucgc caaaagcgaa 240 cuccuaauaa acauuguaau guucaacagu guuuugguaa aagaggaccu ucucaaaauu 300 uugguaaugc ugaaauguua aagcuuggua cuaaugaucc ucaguuuccu auucuugcag 360 aauuagcucc uacaccaggu gcuuuuuucu uugguucuaa auuagacuu 409 <210> 83 <211> 80 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> SARS-CoV-2 S gene (G614) <400> 83 ucuaaccagg uugcuguucu uuaucagggu guuaacugca cagaaguccc uguugcuauu 60 caugcagauc aacuuacucc 80 <210> 84 <211> 80 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> SARS-CoV-2 S gene (D614) <400> 84 ucuaaccagg uugcuguucu uuaucaggau guuaacugca cagaaguccc uguugcuauu 60 caugcagauc aacuuacucc 80 <210> 85 <211> 610 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> E. coli 16S rRNA <220> <221> misc_feature <222> (66)..(66) <223> n is a, c, g, or u <220> <221> misc_feature <222> (526)..(527) <223> n is a, c, g, or u <400> 85 agacuccuac gggaggcagc aguggggaau auugcacaau gggcgcaagc cugaugcagc 60 caugcngcgu guaugaagaa ggccuucggg uuguaaagua cuuucagcgg ggaggaaggg 120 aguaaaguua auaccuuugc ucauugacgu uacccgcaga agaagcaccg gcuaacuccg 180 ugccagcagc cgcgguaaua cggagggugc aagcguuaau cggaauuacu gggcguaaag 240 cgcacgcagg cgguuuguua agucagaugu gaaauccccg ggcucaaccu gggaacugca 300 ucugauacug gcaagcuuga gucucguaga gggggguaga auuccaggug uagcggugaa 360 augcguagag aucuggagga auaccggugg cgaaggcggc ccccuggacg aagacugacg 420 cucaggugcg aaagcguggg gagcaaacag gauuagauac ccugguaguc cacgccguaa 480 acgaugucga cuuggagguu gugcccuuga ggcguggcuu ccggannuaa cgcguuaagu 540 cgaccgccug gggaguacgg ccgcaagguu aaaacucaaa ugaauugacg ggggccgcac 600 aagcggugga 610 <210> 86 <211> 524 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> S. aureus 16S rRNA <400> 86 cagaagagga aaguggaauu ccauguguag cggugaaaug cgcagagaua uggaggaaca 60 ccaguggcga aggcgacuuu cuggucugua acugacgcug augugcgaaa gcguggggau 120 caaacaggau uagauacccu gguaguccac gccguaaacg augagugcua aguguuaggg 180 gguuucccgc cccuuagugc ugcagcuaac gcauuaagca cuccgccugg ggaguacgac 240 cgcaagguug aaacucaaag gaauugacgg ggacccgcac aagcggugga gcaugugguu 300 uaauucgaag caacgcgaag aaccuuacca aaucuugaca uccuuugaca acucuagaga 360 uagagccuuc cccuucgggg gacaaaguga cagguggugc augguugucg ucagcucgug 420 ucgugagaug uuggguuaag ucccgcaacg agcgcaaccc uuaagcuuag uugccaucau 480 uaaguugggc acucuaaguu gacugccggu gacaaaccgg agga 524

Claims

제1프로브 및 제2프로브를 포함하는, 하나 이상의 타겟 분자 검출용 등온 단일반응(isothermal one-pot reaction) 프로브 세트로서,
상기 제1프로브는 하기 일반식 I 및 II를 포함하는 구조를 갖는 프로모터 프로브(promoter probe, PP)이고,
[일반식 I]
5'-X-Y-Z-3'
[일반식 II]
3'-Ya-5'
상기 일반식 I에서,
X는 검출 가능한 시그널을 발생시키는 하나의 표지(label) 또는 다수의 표지를 포함하는 상호작용적 표지 시스템을 갖는 압타머 서열 부위이고;
Y는 T7 프로모터에 상보적인 서열이며;
Z는 타겟 분자에 결합 또는 연결되는 부위이며;
X 및 Y는 디옥시리보뉴클레오타이드이며;
상기 일반식 II에서,
Ya는 T7 프로모터의 일부 서열이고; Ya는 디옥시리보뉴클레오타이드이며;
상기 제2프로브는 하기 일반식 (III)으로 이루어진 구조를 갖는 프로모터 프로브(promoter probe,PP)이고,
[일반식 III]
3'-Yb-Z'-5'
상기 일반식 (III)에서,
Yb는 존재하지 않거나, T7 프로모터의 일부 서열이고, 디옥시리보뉴클레오타이드이며;
Z’은 타겟 분자에 결합 또는 연결되는 부위이며;
상기 제1프로브 및 제2프로브는 타겟 분자와 결합 또는 연결된 후 중합효소에 의해 전사가 개시되어 시그널을 생성하는 것을 특징으로 하는,
타겟 분자 검출용 등온 단일 반응 프로브 세트.
제1항에 있어서,
상기 타겟 분자는 핵산, 단백질, 세포 및 ATP로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 타겟 분자 검출용 등온 단일 반응 프로브 세트.
제2항에 있어서,
상기 타겟 분자가 핵산인 경우, Z 및 Z'은 검출하고자 하는 핵산에 상보적으로 결합하는 핵산 서열이고,
상기 타겟 분자가 단백질인 경우, Z 및 Z'은 상기 단백질에 결합할 수 있는 항체, 압타머이고,
상기 타겟 분자가 세포인 경우, Z 및 Z'은 세포 외 단백질, 세포의 인지질, 균의 펩티도글라이칸 및 LPS로 이루어진 군에서 선택되는 어느 1종 이상에 결합할 수 있는 항체, 압타머이고,
상기 타겟 분자가 ATP인 경우, Z 및 Z'은 ATP에 결합할 수 있는 split 압타머인 것을 특징으로 하는,
타겟 분자 검출용 등온 단일 반응 프로브 세트.
제1항에 있어서,
상기 Ya 및 Yb는 T7 프로모터의 일부 서열이며,
상기 Ya 및 Yb는 상기 Ya 및 상기 Yb 순서로 연속적으로 배열될 경우 상기 T7 프로모터를 이루고,
Ya : Yb 분할 비율은 20:0 내지 15:5 인 것을 특징으로 하는, 타겟 분자 검출용 등온 단일 반응 프로브 세트.
제4항에 있어서,
상기 Ya : Yb 분할 비율은 16:4 인 것을 특징으로 하는, 타겟 분자 검출용 등온 단일 반응 프로브 세트.
제1항에 있어서,
상기 표지는 화학적 표지, 효소 표지, 방사능 표지, 형광 표지, 발광 표지, 화학발광 표지 및 금속 표지로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 타겟 분자 검출용 등온 단일 반응 프로브 세트.
제1항에 있어서,
상기 제1프로브의 상기 일반식 I은, Y와 Z 사이에 중첩서열 W를 추가로 포함한 일반식 I'로 변형될 수 있고;
[일반식 I']
5'-X-Y-W-Z-3'
상기 제2프로브의 상기 일반식 III은, Yb와 Z' 사이에 중첩서열 W'를 추가로 포함한 일반식 III'으로 변형될수 있는 것을 특징으로 하는;
[일반식 III']
3'-Yb-W'-Z'-5'
타겟 분자 검출용 등온 단일 반응 프로브 세트.
제7항에 있어서,
중첩서열 W 및 W'의 길이는 1bp 또는 2bp인 것을 특징으로 하는, 타겟 분자 검출용 등온 단일 반응 프로브 세트.
제1항에 있어서,
상기 등온 단일 반응은, 15℃ 내지 50℃ 범위의 일정한 온도에서 수행되는 것을 특징으로 하는, 타겟 분자 검출용 등온 단일 반응 프로브 세트.
제1항에 있어서,
상기 프로브 세트는 선형 RNA(linear RNA)와 구분하여 원형 RNA(circular RNA)를 검출하는 것을 특징으로 하는, 타겟 분자 검출용 등온 단일 반응 프로브 세트.
제1항에 있어서,
상기 중합효소는 박테리오파지 T7 RNA 중합 효소, 박테리오파지 T3 중합 효소, 박테리오파지 RNA 중합 효소, 박테리오파지 ΦII 중합 효소, 살모넬라 박테리오파지 sp6 중합 효소, 슈도모나스 박테리오파지 gh-1 중합효소, 대장균(E. coli) RNA 중합효소 홀로효소(holoenzyme), 대장균(E. coli) RNA 중합효소 코어 효소, 인간 RNA 중합효소 I, 인간 RNA 중합효소 II, 인간 RNA 중합효소 III, 인간 미토콘드리아 RNA 중합효소 및 이의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 타겟 분자 검출용 등온 단일 반응 프로브 세트.
제1항에 있어서,
상기 등온 단일 반응은 Tris-HCl, MgCl₂, DTT, 스페르미딘, rNTPs, RNase 억제제 및 SSB(Single-Stranded DNA Binding Protein)가 포함된 단일 반응 용액으로 일원화되어 동시 수행되는 것을 특징으로 하는, 타겟 분자 검출용 등온 단일 반응 프로브 세트.
제1항의 제1프로브 및 제2프로브를 포함하는 타겟 분자 검출용 등온 단일 반응 프로브 세트를 포함하는, 타겟 분자 검출용 조성물.
제13항에 있어서,
상기 조성물은 2종 이상의 타겟 분자를 검출하기 위한 2종 이상의 타겟 분자 검출용 등온 단일 반응 프로브 세트를 포함하는 것을 특징으로 하는, 타겟 분자 검출용 조성물.
제14항에 있어서,
상기 2종 이상의 타겟 분자 검출용 등온 단일 반응 프로브 세트는 각각 서로 상이한 상호작용적 표지 시스템을 포함하고; 상기 2종 이상의 프로브 세트 각각은 각각 서로 상이한 타겟 분자에 결합하여; 이로 인해 서로 상이한 타겟 분자의 다중 검출이 가능한 것을 특징으로 하는, 타겟 분자 검출용 조성물.
제13항에 있어서,
상기 등온 단일 반응은, 15℃내지 50℃범위의 일정한 온도에서 수행되는 것을 특징으로 하는, 타겟 분자 검출용 조성물.
제13항 내지 제16항 중 어느 한 항의 타겟 분자 검출용 조성물, 중합효소 및 등온 단일 반응 용액을 포함하는, 타겟 분자 검출용 키트.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 타겟 분자 검출용 등온 단일 반응 프로브 세트를 이용하여 타겟 분자를 검출하는 방법.
제18항에 있어서,
상기 타겟 분자를 검출하는 방법 이전에, 등온 핵산 증폭 반응을 수행하는 단계를 포함하는 타겟 분자를 검출하는 방법.
제19항에 있어서,
상기 등온핵산증폭 반응은 RPA(Recombinase Polymerase Amplification)인 것을 특징으로 하는 타겟 분자를 검출하는 방법.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 타겟 분자 검출용 등온 단일 반응 프로브 세트를 이용한 현장용 분자 진단 방법.
제21항에 있어서,
상기 분자 진단 방법은 병원성 미생물 검출에 사용되는 것을 특징으로 하는, 현장용 분자 진단 방법.
제22항에 있어서,
상기 병원성 미생물은 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus Aureus), 비브리오 불니피쿠스(Vibrio vulnificus), 대장균(E. coli), 중동 호흡기 증후군 코로나바이러스(Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus), 인플루엔자 A 바이러스(Influenza A virus), 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스(Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus), 호흡기 세포 융합 바이러스(RSV), 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 헤르페스 심플렉스 바이러스(HSV), 인유두종 바이러스(HPV), 인간 파라인플루엔자 바이러스(HPIV), 뎅기열 바이러스, B형 간염 바이러스(Hepatitis B Virus (HBV)), 황열병 바이러스, 광견병 바이러스, 플라스모디움, 거대세 포바이러스(CMV), 미코박테리움 튜버큘로시스, 클라미디아 트라코마티스, 로타바이러스, 인간 메타뉴모바이러스 (hMPV), 크리민 콩고 출혈열 바이러스 (Crimean-Congo hemorrhagic fever virus), 에볼라 바이러스, 지카 바이러스, 헤니파바이러스, 노로바이러스, 라사바이러스, 리노바이러스, 플라비바이러스, 리프트 밸리 열 바이러스, 수족구병 바이러스, 살모넬라(Salmonella sp.), 쉬켈라(Shigella sp.), 엔테로박테리아세(Enterobacteriaceae sp.), 슈도모나스(Pseudomonas sp.), 모락셀라(Moraxella sp.), 헬리코박터(Helicobacter sp.) 및 스테노트로 포모나스(Stenotrophomonas sp.)로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상인 것을 특징으로 하는, 현장용 분자 진단 방법.