KR20230042468A

KR20230042468A - Csrp3 (시스테인 및 글리신 풍부 단백질 3) 유전자 요법

Info

Publication number: KR20230042468A
Application number: KR1020237003436A
Authority: KR
Inventors: 크리스토퍼 딘 헤르조그; 체스터 비텐코트 새크라멘토; 라이 프라바카; 데이비드 릭스
Original assignee: 스페이스크래프트 세븐, 엘엘씨
Priority date: 2020-08-05
Filing date: 2021-08-03
Publication date: 2023-03-28
Also published as: AU2021321410A1; BR112023001336A2; EP4192962A1; CA3184983A1; IL300187A; MX2023000994A; JP2023536618A; CN116234916A; US20230257431A1; WO2022031756A1

Abstract

예를 들어, 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터를 사용하여, 심근병증과 연관된 CSRP3(시스테인 및 글리신 풍부 단백질 3)-관련 유전자 결핍에 대한 유전자 요법이 본원에 제공된다. 벡터의 프로모터는 MHCK7 프로모터 또는 심장 트로포닌 T(HTNNT2) 프로모터일 수 있다. 캡시드는 AAV9 또는 AAVrh74 캡시드 또는 이의 기능적 변이체일 수 있다. 다른 프로모터 또는 캡시드가 사용될 수 있다. rAAV 벡터의 정맥내, 관상내, 경동맥내 또는 심장내 투여에 의한 것과 같은 치료 방법, 및 기타 조성물 및 방법이 추가로 제공된다.

Description

CSRP3 (시스테인 및 글리신 풍부 단백질 3) 유전자 요법

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은 2020년 8월 5일 출원된, 미국 특허 출원 제63/061,727호에 대한 우선권을 주장하며, 그 내용은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.

서열 목록에 관한 진술

본 출원과 연관된 서열 목록은 종이 사본 대신에 텍스트 형식으로 제공되며, 본 출원에 참고로 원용된다. 서열 목록을 담은 텍스트 파일의 명칭은 ROPA_020_01WO_ST25.txt이다. 텍스트 파일은 약 120 KB이며, 2021년 8월 3일 생성되고, EFS-Web을 통해 전자적으로 제출되고 있다.

시스테인 및 글리신 풍부 단백질 3(CSRP3)은 근육 LIM 단백질(MLP)을 암호화한다. CSRP3의 유전자 결함은 상염색체 우성 심근병증인, 비대성 심근병증(HCM) 및 확장성 심근병증(DCM) 모두와 연관되는데, 단백질의 상이한 도메인에서의 상염색체 우성 돌연변이가 상이한 표현형과 연결되기 때문이다. MLP 수준을 감소시키는 기능 상실 돌연변이는 단백질 비정상 위치화(protein mislocalization) 및 프로테아좀-매개성 분해를 유발하여, 심장 및 골격 근육에서 정상적인 신호전달 경로의 파괴를 초래할 수 있다. MLP 수준 변화 또는 세포내 위치화는 또한 안면 견갑상완 근이영양증(facioscapulohumeral muscular dystrophy), 네말린 근병증(nemaline myopathy), 및 지대 근이영양증(limb girdle muscular dystrophy) 2B형을 포함하는, 골격 근병증과 연관된다. 이소형 MLP-b 단백질 수준의 변화 또는 MLP:MLP-b 비율의 조절불량이 지대 근이영양증 2A형, 뒤시엔느 근이영양증 및 피부근육염 환자에서 검출되었다.

CSRP3 환자는 특이적 돌연변이에 따라 달라지는 가변적인 증상을 나타내지만, 일반적인 증상으로는 폐쇄성 HCM 또는 DCM, 심실 비대(14-32mm 범위의 심실간 중격 동반), 심실 빈맥, 운동 불내성, 협심증을 포함한다. I-II의 경증 NYHA(뉴욕 심장 협회) 점수가 통상적이다. 예를 들어, C58G 돌연변이를 가진 가족에서 갑작스런 심장사가 관찰되었다. 한 연구에서, 근육 생검을 제공한 C58G 보유자들의 대다수는 발표 시 활동성 근육통 및 경련을 호소하였다.

CSRP3-관련 질환 또는 장애에 대한 요법에 대한 충족되지 않은 수요가 존재한다. 본원에 제공된 유전자 요법은 이러한 요구를 해결한다.

본 발명은 일반적으로 MLP 또는 이의 기능적 변이체를 발현하는 벡터를 사용하여, 질환 또는 장애, 예를 들어, 심장 질환 또는 장애에 대한 유전자 요법에 관한 것이다.

일 측면에서, 본 개시는 발현 카세트 및 선택적으로 측부에 위치하는 아데노-연관 바이러스(AAV) 역위 말단 반복체(ITR)를 포함하는, 폴리뉴클레오티드를 제공하며, 여기서 폴리뉴클레오티드는 프로모터에 작동 가능하게 연결된, 근육 LIM 단백질(MLP) 또는 이의 기능적 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.

일부 실시예에서, 프로모터는 심장-특이적 프로모터이다.

일부 실시예에서, 프로모터는 근육 특이적 프로모터이다.

일부 실시예에서, 프로모터는 심근세포-특이적 프로모터이다.

일부 실시예에서, 프로모터는 MHCK7 프로모터이다.

일부 실시예에서, MHCK7 프로모터는 서열번호 31과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 공유한다.

일부 실시예에서, 프로모터는 심장 트로포닌 T(hTNNT2) 프로모터이다.

일부 실시예에서, hTNNT2 프로모터는 서열번호 32과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 공유한다.

일부 실시예에서, 발현 카세트는 심장 트로포닌 T(hTNNT2) 유전자의 엑손 1을 포함하고, 선택적으로 hTNNT2 프로모터 및 엑손 1은 서열번호 32과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 공유한다.

일부 실시예에서, 프로모터는 유비쿼터스 프로모터, 선택적으로 CMV 프로모터 또는 CAG 프로모터이다.

일부 실시예에서, 발현 카세트는 폴리A 신호를 포함한다.

일부 실시예에서, 폴리A 신호는 인간 성장 호르몬(hGH) 폴리A이다.

일부 실시예에서, 발현 카세트는 마멋(Woodchuck) 간염 바이러스 전사후 조절 요소(WPRE), 선택적으로 WPRE(x)를 포함한다.

일부 실시예에서, 근육 LIM 단백질(MLP) 또는 이의 기능성 변이체는 MLP이다.

일부 실시예에서, MLP는 인간 MLP이다.

일부 실시예에서, MLP는 MLP 이소형 A이다.

일부 실시예에서, MLP는 서열번호 1과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 공유한다.

일부 실시예에서, MLP는 MLP 이소형 B이다.

일부 실시예에서, MLP는 서열번호 2과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 공유한다.

일부 실시예에서, MLP는 서열번호 3과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 공유한다.

일부 실시예에서, MLP는 서열번호 4과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 공유한다.

일부 실시예에서, MLP를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 시스테인 및 글리신 풍부 단백질 3(CSRP3) 폴리뉴클레오티드이다.

일부 실시예에서, CSRP3 폴리뉴클레오티드는 인간 CSRP3 폴리뉴클레오티드이다.

일부 실시예에서, MLP를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 5과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 공유한다.

일부 실시예에서, MLP를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 7과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 공유한다.

일부 실시예에서, 폴리뉴클레오티드는 적어도 약 2.4 kb, 최대 약 2.6 kb, 또는 약 2.4 kb 내지 약 2.6 kb를 포함한다.

일부 실시예에서, 폴리뉴클레오티드는 적어도 약 3.0 kb, 최대 약 3.3 kb, 또는 약 3.0 kb 내지 약 3.3 kb를 포함한다.

일부 실시예에서, 폴리뉴클레오티드는 적어도 약 2.4 kb, 적어도 약 2.6 kb, 적어도 약 3.0 kb, 적어도 약 3.3 kb, 적어도 약 3.5 kb, 적어도 약 3.7 kb, 적어도 약 3.9 kb, 적어도 약 4.1 kb, 또는 적어도 약 4.3 kb를 포함한다.

일부 실시예에서, 폴리뉴클레오티드는 적어도 약 2.6 kb, 적어도 약 3.0 kb, 최대 약 3.3 kb, 최대 약 3.5 kb, 최대 약 3.7 kb, 최대 약 3.9 kb, 최대 약 4.1 kb, 최대 약 4.3 kb, 또는 최대 약 4.5 kb를 포함한다.

일부 실시예에서, 발현 카세트는 서열번호 8-11 중 어느 하나와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 공유한다.

일부 실시예에서, 폴리뉴클레오티드는 서열번호 12-15 중 어느 하나와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 공유한다.

일부 실시예에서, 발현 카세트는 5' 및 3' 역위 말단 반복(ITR), 선택적으로 AAV2 ITR, 선택적으로 서열번호 20-26 중 어느 하나와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 공유하는 ITR이 측면에 위치한다.

일부 실시예에서, 폴리뉴클레오티드는 자가-상보적이다.

일부 실시예에서, 폴리뉴클레오티드는 발현 카세트 및 발현 카세트의 역 상보체를 포함한다.

일부 실시예에서, 발현 카세트 및 발현 카세트의 역 상보체는 5' 및 3' 역위 말단 반복(ITR), 선택적으로 AAV2 ITR, 선택적으로 서열번호 23 또는 서열번호 26와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 공유하는 ITR이 측면에 위치한다.

또 다른 측면에서, 본 개시는 본 개시의 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 유전자 요법 벡터를 제공한다.

일부 실시예에서, 유전자 요법 벡터는 재조합 아데노-연관 바이러스(rAAV) 벡터이다.

일부 실시예에서, rAAV 벡터는 AAV9 또는 이의 기능적 변이체이다.

일부 실시예에서, rAAV 벡터는 서열번호 77 중 어느 하나와 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 공유하는 캡시드 단백질을 포함한다.

일부 실시예에서, rAAV 벡터는 AAVrh10 또는 이의 기능적 변이체이다.

일부 실시예에서, rAAV 벡터는 서열번호 79 중 어느 하나와 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 공유하는 캡시드 단백질을 포함한다.

일부 실시예에서, rAAV 벡터는 AAV6 또는 이의 기능적 변이체이다.

일부 실시예에서, rAAV 벡터는 서열번호 78 중 어느 하나와 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 공유하는 캡시드 단백질을 포함한다.

일부 실시예에서, rAAV 벡터는 AAVrh74 또는 이의 기능적 변이체이다.

일부 실시예에서, rAAV 벡터는 서열번호 80 중 어느 하나와 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 공유하는 캡시드 단백질을 포함한다.

일부 실시예에서, rAAV 벡터는 자가-상보적 AAV 벡터이다.

또 다른 측면에서, 본 개시는 이를 필요로 하는 대상체에서 질환 또는 장애를 치료 및/또는 예방하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 개시의 벡터를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.

일부 실시예에서, 질환 또는 장애는 심장 장애이다.

일부 실시예에서, 질환 또는 장애는 심부전이다.

일부 실시예에서, 질환 또는 장애는 비대성 심근병증이다.

일부 실시예에서, 질환 또는 장애는 확장성 심근병증이다.

일부 실시예에서, 대상체는 포유동물이다.

일부 실시예에서, 대상체는 영장류이다.

일부 실시예에서, 대상체는 인간이다.

일부 실시예에서, 대상체는 서열번호 1의 서열을 갖는 인간 MLP를 암호화하는 인간 CSRP3에 대해, C58G, L44P, S54R, E55G, 및/또는 K69R로부터 선택된 아미노산 치환을 유발하는 CSRP3 유전자에 돌연변이를 갖는다. 　

일부 실시예에서, 벡터는 정맥내 주사, 심장내 주사, 심장내 주입, 및/또는 심장 카테터 삽입에 의해 투여된다.

일부 실시예에서, 투여는 MLP 발현을 적어도 약 5%만큼 증가시킨다.

일부 실시예에서, 투여는 MLP 발현을 적어도 약 30%만큼 증가시킨다.

일부 실시예에서, 투여는 MLP 발현을 적어도 약 70%만큼 증가시킨다.

일부 실시예에서, 투여는 MLP 발현을 약 5% 내지 약 10%만큼 증가시킨다.

일부 실시예에서, 투여는 MLP 발현을 약 30% 내지 약 50%만큼 증가시킨다.

일부 실시예에서, 투여는 MLP 발현을 약 70% 내지 약 100%만큼 증가시킨다.

일부 실시예에서, 상기 방법은 질환 또는 장애를 치료 및/또는 예방한다.

또 다른 측면에서, 본 개시는 본 개시의 벡터를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.

또 다른 측면에서, 본 개시는 본 개시의 벡터 또는 약학적 조성물, 및 선택적으로 사용 지침을 포함하는 키트를 제공한다.

또 다른 측면에서, 본 개시는 선택적으로 본원에 개시된 방법 중 어느 하나에 따라, 질환 또는 장애를 치료하는 데 있어서 본 개시의 조성물의 용도를 제공한다.

또 다른 측면에서, 본 개시는 선택적으로 본원에 개시된 방법 중 어느 하나에 따라, 질환 또는 장애를 치료하는 데 사용하기 위한 본 개시의 조성물을 제공한다.

또 다른 측면에서, 본 개시는 MLP(근육 LIM 단백질) 또는 이의 기능적 변이체를 발현하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 개시의 벡터와 세포를 접촉시키는 단계를 포함한다.

일부 실시예에서, 세포는 심근세포이다.

일부 실시예에서, 심근 세포는 인간 심근세포이다.

일부 실시예에서, 프로모터는 MHCK7 프로모터이며, 여기서 MLP의 발현 수준은 hTNNT2 프로모터를 갖는 벡터로 형질도입된 세포에서의 MLP의 발현 수준보다 적어도 2배 더 크다.

일부 실시예에서, 프로모터는 MHCK7 프로모터이며, 여기서 MLP의 발현 수준은 hTNNT2 프로모터를 갖는 벡터로 형질도입된 세포에서의 MLP의 발현 수준보다 2배 내지 10배 더 크다.

다양한 다른 측면 및 실시예가 다음의 상세한 설명에 개시된다. 본 발명은 첨부된 청구범위에 의해서만 제한된다.

도 1은 벡터 게놈의 비제한적인 예의 벡터 다이어그램을 도시한다. 벡터 게놈의 전체 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 12다. 대문자 부분은 발현 카세트(서열번호 8)이다.
도 2는 벡터 게놈의 비제한적인 예의 벡터 다이어그램을 도시한다. 벡터 게놈의 전체 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 13이다. 대문자 부분은 발현 카세트(서열번호 9)이다.
도 3은 벡터 게놈의 비제한적인 예의 벡터 다이어그램을 도시한다. 벡터 게놈의 전체 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 14이다. 대문자 부분은 발현 카세트(서열번호 10)이다.
도 4는 벡터 게놈의 비제한적인 예의 벡터 다이어그램을 도시한다. 벡터 게놈의 전체 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 15다. 대문자 부분은 발현 카세트(서열번호 11)이다.
도 5a는 형질도입된 CHO-Lec2에서 CSRP3 발현을 보여준다.
도 5b는 형질도입된 심근세포(분화된 AC16 세포주 - Sigma-Aldrich® cat# SCC109)에서 CSRP3 발현을 보여준다. 세포를 각 벡터로부터 3E5 MOI로 형질도입하고; 6일 후에 세포를 용해시키고, 항-CSRP3 다클론 항체를 사용하여 웨스턴 블롯을 수행하였다 (Thermo-Fisher® PA5-29155 1:1000).

본 개시는 MLP를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 전달하는 CSPRP3에 대한 유전자 요법 벡터를, 사용 방법과 함께, 그리고 다른 조성물 및 방법을 제공하였다. CSPRP3-관련 장애의 치료는 대부분의 형태의 CSPRP3-관련 장애의 상염색체 우성 성질, 및 MLP 이소형 간의 단백질 발현 수준 및 균형이 건강한 대상체에서 정상적인 기능에 매우 중요하다는 증거에 의해 복잡하다. 또한, 심장에서 성공적인 유전자 치료는 예측가능하지 않다. 심근세포는 유전자 요법으로 표적으로 삼기에 특히 어려운 세포 유형이다. 본원에 개시된 조성물 및 방법은 이러한 문제를 해결한다.

정의

섹션 제목은 조직화를 목적으로만 제공되며, 특정 측면 또는 실시예로 기술된 주제를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.

달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 기술을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에서 설명되는 것과 유사하거나 등가인 방법 및 재료가 본 발명의 실시에 사용될 수 있지만, 적절한 방법 및 재료가 아래에 기술된다. 본원에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허 및 기타 참고 문헌은 그 전체가 참조로서 명시적으로 포함된다. 상충하는 경우, 정의를 포함하는 본 명세서가 우선할 것이다. 또한, 본원에 설명된 재료, 방법 및 예는 단지 예시일 뿐이며 한정하려는 의도가 아니다.

본원에 언급된 모든 간행물 및 특허는 각각의 개별 간행물 또는 특허가 구체적으로 그리고 개별적으로 참조로서 통합되도록 표시된 것처럼 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다. 상충하는 경우, 본원의 임의의 정의를 포함하여 본 출원이 우선할 것이다. 그러나, 본원에 인용된 임의의 참고 문헌, 논문, 간행물, 특허, 특허 공개, 및 특허 출원에 대한 언급은, 이들이 유효한 선행기술을 구성하거나 세계 어느 국가에서도 통상적인 일반 지식의 일부를 구성한다는 것을 인정하거나 임의의 형태의 제안으로서 취해져선 안 된다.

본 설명에서, 달리 명시되지 않는 한, 임의의 농도 범위, 백분율 범위, 비율 범위, 또는 정수 범위는 인용된 범위 내의 임의의 정수의 값과, 적절한 경우, 이의 분수(예를 들어, 정수의 1/10 및 1/100)을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 숫자 또는 숫자 바로 앞에 있는 "약"이라는 용어는 숫자 또는 숫자 범위 ±10%임을 의미한다. 본원에서 사용된 용어 "a" 및 "an"은 달리 명시되지 않는 한 열거된 구성요소 중 "하나 이상"을 지칭함을 이해해야 한다. 선택 접속사(예를 들어, "또는")의 사용은 그 선택사항 중 하나, 둘 다, 또는 이들의 임의의 조합을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 용어 "및/또는"은 선택사항 중 하나 또는 둘 다를 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "포함하다" 및 "포함한다"는 동의어로 사용된다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "동일성" 및 "동일한"은 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열에 대해, "쿼리" 서열과 "대상" 서열의 정렬, 예컨대 BLAST 알고리즘에 의해 생성된 정렬에서 정확히 일치하는 잔기의 백분율을 지칭한다. 동일성은, 달리 명시되지 않는 한, 대상 서열의 전체 길이에 걸쳐 계산된다. 따라서, 쿼리 서열이 대상 서열에 정렬될 때, 대상 서열 내의 잔기의 적어도 x%(반내림됨)가 쿼리 서열 내의 상응하는 잔기와 정확히 일치하는 것으로 정렬되는 경우, 쿼리 서열은 대상 서열과 "적어도 x%의 동일성을 공유한다". 대상 서열이 가변 위치(예를 들어, X로 표시된 잔기)를 갖는 경우, 쿼리 서열 내의 임의의 잔기에 대한 정렬은 일치로 간주된다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "AAV 벡터" 또는 "rAAV 벡터"는 AAV 말단 반복 서열(ITR)이 측면에 위치하는 하나 이상의 관심 폴리뉴클레오티드(또는 이식유전자)를 포함하는 재조합 벡터를 지칭한다. 이러한 AAV 벡터는 rep 및 cap 유전자 산물을 암호화하고 발현하는 플라스미드로 형질감염된 숙주 세포에 존재할 때 감염성 바이러스 입자로 복제 및 패키징될 수 있다. 대안적으로, AAV 벡터는 rep 및 cap 유전자를 발현하도록 안정적으로 조작된 숙주 세포를 사용하여 감염성 입자로 패키징될 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "AAV 비리온" 또는 "AAV 바이러스 입자" 또는 "AAV 벡터 입자"는 적어도 하나의 AAV 캡시드 단백질 및 캡슐화된 폴리뉴클레오티드 AAV 벡터로 이루어진 바이러스 입자를 지칭한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 입자가 이종 폴리뉴클레오티드(즉, 포유류 세포에 전달될 이식유전자와 같은 야생형 AAV 게놈 이외의 폴리뉴클레오티드)를 포함하는 경우, 이는 일반적으로 "AAV 벡터 입자" 또는 단순히 "AAV 벡터"로서 지칭된다. 따라서, AAV 벡터 입자의 생산은 AAV 벡터의 생산을 반드시 포함하는데, 이러한 벡터가 AAV 벡터 입자 내에 포함되기 때문이다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "프로모터"는 진핵 세포에서 폴리뉴클레오티드로부터 RNA 전사의 개시를 촉진할 수 있는 폴리뉴클레오티드 서열을 지칭한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "벡터 게놈"은 측부 서열(AAV에서, 역위 말단 반복)을 포함하여, 벡터(예를 들어, rAAV 비리온)에 의해 패키징된 폴리뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 용어 "발현 카세트" 및 "폴리뉴클레오티드 카세트"는 측부 ITR 서열 사이의 벡터 게놈의 부분을 지칭한다. "발현 카세트"는 벡터 게놈이 발현을 유도하는 요소(예: 프로모터)에 작동가능하게 연결된 유전자 산물을 암호화하는 적어도 하나의 유전자를 포함한다는 것을 의미한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "필요로 하는 환자" 또는 "필요로 하는 대상체"는 본원에 개시된 재조합 유전자 요법 벡터 또는 유전자 편집 시스템으로 치료 또는 개선될 수 있는 질환, 장애 또는 병태의 위험이 있거나 이를 앓고 있는 환자 또는 대상체를 지칭한다. 예를 들어, 필요로 하는 환자 또는 대상체는 심장 관련 장애로 진단된 환자 또는 대상체일 수 있다. 대상체는 CSRP3 유전자의 돌연변이 또는 CSRP3 유전자의 전부 또는 일부의 결실, 또는 MLP 단백질의 비정상적인 발현을 유발하는, 유전자 조절 서열의 결실을 가질 수 있다. "대상체" 및 "환자"는 본원에서 상호 교환적으로 사용된다. 본원에서 설명되는 방법에 의해 치료되는 대상체는 성인 또는 아동일 수 있다. 대상체의 연령은 다양할 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "변이체" 또는 "기능적 변이체"는 부모 단백질의 하나 이상의 원하는 활성을 보유하는 부모 단백질과 비교하여 하나 이상의 아미노산 치환, 삽입 또는 결실을 갖는 단백질을 상호 교환적으로 지칭한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "유전자 파괴"는 유전자에서 기능의 부분적 또는 완전한 상실 또는 비정상적인 활성을 지칭한다. 예를 들어, 대상체는, 대상체의 적어도 일부 세포(예를 들어, 심장 세포)에서 MLP 단백질의 발현을 감소시키거나 상실 또는 비정상적인 기능을 초래하는 CSRP3 유전자에서의 발현 또는 기능의 유전자 파괴를 겪을 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "치료하는"은 질환 또는 장애의 하나 이상의 증상을 개선하는 것을 지칭한다. 용어 "예방하는"은 질환 또는 장애의 하나 이상의 증상의 개시를 지연 또는 방해하거나 CSRP3-관련 질환 또는 장애, 예를 들어 비대성 심근병증(HCM), 확장성 심근병증(DCM), 또는 골격 근병증의 진행을 늦추는 것을 지칭한다.

MLP 단백질 또는 폴리뉴클레오티드

본 개시는 근육 LIM 단백질(MLP) 단백질과 관련된 조성물 및 사용 방법을 고려한다. CSRP3의 다양한 돌연변이는 비대성 심근병증(HCM) 또는 확장성 심근병증(DCM)과 연관된 것으로 알려져 있다. 유전된 돌연변이와 드노보 돌연변이가 모두 관찰되었다. 일부 경우에, 이형접합성 미스센스 돌연변이는 질환을 유발하기에 충분하다.

MLP의 폴리펩티드 서열은 다음과 같다:

MPNWGGGAKCGACEKTVYHAEEIQCNGRSFHKTCFHCMACRKALDSTTVAAHESEIYCKVCYGRRYGPKGIGYGQGAGCLSTDTGEHLGLQFQQSPKPARSVTTSNPSKFTAKFGESEKCPRCGKSVYAAEKVMGGGKPWHKTCFRCAICGKSLESTNVTDKDGELYCKVCYAKNFGPTGIGFGGLTQQVEKKE

(서열번호 1).

MLP의 제2 이소형은 다음의 폴리펩티드 서열을 갖는다: MPNWGGGAKCGACEKTVYHAEEIQCNGRSFHKTCFHCSPQSRHAQLPPATLPNSLRSLESPRSALDVASQSMLLRRLWEVASLGTRPVSAVPSVGRVWSPQMSLTKMGNFIAKFAMPKILAPRVLGLEALHNKWKRKNEEVRRFSDFLRA

(서열번호 2).

MLP의 또 다른 이소형은 다음의 폴리펩티드 서열을 갖는다:

MPNWGGGAKCGACEKTVYHAEEIQCNGRSFHKTCFHCLC

(서열번호 3).

MLP의 또 다른 이소형은 다음의 폴리펩티드 서열을 갖는다:

MPNWGGGAKCGACEKTVYHAEEIQCNGRSFHKTCFHCTLAQDLFPLCHLWEESGVHKC

(서열번호 4).

일부 실시예에서, MLP 단백질은 서열번호 1-4 중 어느 하나와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열을 포함한다.

일부 실시예에서, 본 개시는 캡시드 및 벡터 게놈을 포함하는, 재조합 아데노-연관 바이러스(rAAV) 비리온을 제공하며, 벡터 게놈은 프로모터에 작동 가능하게 연결된, MLP 또는 이의 기능적 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, 본 개시는 캡시드 및 벡터 게놈을 포함하는, 재조합 아데노-연관 바이러스(rAAV) 비리온을 제공하며, 벡터 게놈은 프로모터에 작동 가능하게 연결된, MLP을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. MLP을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 다음과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다:

ATGCCAAACTGGGGCGGAGGCGCAAAATGTGGAGCCTGTGAAAAGACCGTCTACCATGCAGAAGAAATCCAGTGCAATGGAAGGAGTTTCCACAAGACGTGTTTCCACTGCATGGCCTGCAGGAAGGCTCTTGACAGCACGACAGTCGCGGCTCATGAGTCGGAGATCTACTGCAAGGTGTGCTATGGGCGCAGATATGGCCCCAAAGGGATCGGGTATGGACAAGGCGCTGGCTGTCTCAGCACAGACACGGGCGAGCATCTCGGCCTGCAGTTCCAACAGTCCCCAAAGCCGGCACGCTCAGTTACCACCAGCAACCCTTCCAAATTCACTGCGAAGTTTGGAGAGTCCGAGAAGTGCCCTCGATGTGGCAAGTCAGTCTATGCTGCTGAGAAGGTTATGGGAGGTGGCAAGCCTTGGCACAAGACCTGTTTCCGCTGTGCCATCTGTGGGAAGAGTCTGGAGTCCACAAATGTCACTGACAAAGATGGGGAACTTTATTGCAAAGTTTGCTATGCCAAAAATTTTGGCCCCACGGGTATTGGGTTTGGAGGCCTTACACAACAAGTGGAAAAGAAAGAA

(서열번호 5).

선택적으로, 벡터 게놈을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 GCCACCATGG(서열번호 6)를 포함하지만 이에 한정되지 않는, Kozak 서열을 포함할 수 있다. Kozak 서열은 MLP 단백질 또는 이의 기능적 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열과 중첩될 수 있다. 예를 들어, 벡터 게놈은 다음과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열(Kozak은 밑줄이 그어져 있음)을 포함할 수 있다:

gccaccATGCCAAACTGGGGCGGAGGCGCAAAATGTGGAGCCTGTGAAAAGACCGTCTACCATGCAGAAGAAATCCAGTGCAATGGAAGGAGTTTCCACAAGACGTGTTTCCACTGCATGGCCTGCAGGAAGGCTCTTGACAGCACGACAGTCGCGGCTCATGAGTCGGAGATCTACTGCAAGGTGTGCTATGGGCGCAGATATGGCCCCAAAGGGATCGGGTATGGACAAGGCGCTGGCTGTCTCAGCACAGACACGGGCGAGCATCTCGGCCTGCAGTTCCAACAGTCCCCAAAGCCGGCACGCTCAGTTACCACCAGCAACCCTTCCAAATTCACTGCGAAGTTTGGAGAGTCCGAGAAGTGCCCTCGATGTGGCAAGTCAGTCTATGCTGCTGAGAAGGTTATGGGAGGTGGCAAGCCTTGGCACAAGACCTGTTTCCGCTGTGCCATCTGTGGGAAGAGTCTGGAGTCCACAAATGTCACTGACAAAGATGGGGAACTTTATTGCAAAGTTTGCTATGCCAAAAATTTTGGCCCCACGGGTATTGGGTTTGGAGGCCTTACACAACAAGTGGAAAAGAAAGAA

(서열번호 7).

일부 실시예에서, Kozak 서열은 다음 중 어느 하나를 포함하거나 이로 구성되는 대안적인 Kozak 서열이다:

(gcc)gccRccAUGG (서열번호 16);

(gcc)gccRccAUGC (서열번호 17);

AGNNAUGN;

ANNAUGG;

ANNAUGC;

ACCAUGG;

ACCAUGC;

GACACCAUGG (서열번호 18); 및

GACACCAUGC (서열번호 19).

일부 실시예에서, 벡터 게놈은 Kozak 서열을 포함하지 않는다.

벡터 게놈

본 개시의 AAV 비리온은 벡터 게놈을 포함한다. 벡터 게놈은 발현 카세트(또는 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 필요로 하지 않는 유전자-편집 용도를 위한 폴리뉴클레오티드 카세트)를 포함할 수 있다. 임의의 적절한 역위 말단 반복(ITR)이 사용될 수 있다. ITR은 캡시드와 동일한 혈청형 또는 상이한 혈청형(예를 들어, AAV2 ITR이 사용될 수 있음)으로부터 유래될 수 있다.

일부 실시예에서, 5' ITR은 다음과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다:

CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT

(서열번호 20)

GCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTTGTAGTTAATGATTAACCCGCCATGCTACTTATCTACGTA

(서열번호 21)

CTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTTGTAGTTAATGATTAACCCGCCATGCTACTTATCTACGTA

(서열번호 22)

Ttggccactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgcccgggcaaagcccgggcgtcgggcgacctttggtcgcccggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaactccatcactaggggttcct

(서열번호 23)

일부 실시예에서, 3' ITR은 다음과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다:

AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG

(서열번호 24)

TACGTAGATAAGTAGCATGGCGGGTTAATCATTAACTACAAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGC

(서열번호 25)

aggaacccctagtgatggagactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgggcgaccaaaggtcgcccgacgcccgggctttgcccgggcggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagt

(서열번호 26)

일부 실시예에서, 벡터 게놈은 하나 이상의 필러 서열을 포함하며, 예를 들어, 다음과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다:

GCGGCAATTCAGTCGATAACTATAACGGTCCTAAGGTAGCGATTTAAATACGCGCTCTCTTAAGGTAGCCCCGGGACGCGTCAATTGACTACAAACCGAGTATCTGCAGAGGGCCCTGCGTATG (서열번호 27);

CTTCTGAGGCGGAAAGAACCAGATCCTCTCTTAAGGTAGCATCGAGATTTAAATTAGGGATAACAGGGTAATGGCGCGGGCCGC (서열번호 28); 또는

GTTACCCAGGCTGGAGTGCAGTGGCACATTTCTGCTCACTGCAACCTCCTCCTCCCTGGGTTC (서열번호 29).

프로모터

일부 실시예에서, MLP 단백질 또는 이의 기능성 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 프로모터에 작동 가능하게 연결된다.

본 개시는 다양한 프로모터의 사용을 고려한다. 본 개시의 실시예에 유용한 프로모터는, 제한 없이, 거대세포바이러스(CMV) 프로모터, 포스포글리세레이트 키나아제(PGK) 프로모터, 또는 CMV 인핸서 및 닭 베타-액틴 프로모터 및 토끼 베타-글로빈 유전자(CAG)의 일부분으로 이루어진 프로모터 서열을 포함한다. 일부 경우에, 프로모터는 합성 프로모터일 수 있다. 예시적인 합성 프로모터는 Schlabach 등의 PNAS USA. 107(6):2538-43 (2010)에 의해 제공된다. 일부 실시예에서, 프로모터는 다음과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다:

ACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGG

(서열번호 30)

일부 실시예에서, MLP 단백질 또는 이의 기능성 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 유도성 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 유도성 프로모터는 제제의 첨가 또는 축적에 반응하여 또는 제제의 제거, 분해 또는 희석에 반응하여 폴리뉴클레오티드 서열이 전사적으로 발현되게 하거나 전사적으로 발현되지 않게 하도록 구성될 수 있다. 제제는 약물일 수 있다. 제제는 테트라사이클린, 또는 독시사이클린을 포함하지만 이에 한정되지 않는, 이의 유도체 중 하나일 수 있다. 일부 경우에, 유도성 프로모터는 tet-on 프로모터, tet-off 프로모터, 화학적으로 조절된 프로모터, 물리적으로 조절된 프로모터(즉, 광의 존재 또는 부재 또는 저온 또는 고온에 반응하는 프로모터)이다. 유도성 프로모터는 중금속 이온 유도성 프로모터(예컨대 마우스 유방 종양 바이러스(mMTV) 프로모터 또는 다양한 성장 호르몬 프로모터), 및 T7 RNA 중합효소의 존재 시 활성인 T7 파지 유래의 프로모터를 포함한다. 유도성 프로모터의 이러한 목록은 비제한적이다.

일부 경우에, 프로모터는 비-심장 세포에서보다 훨씬 더 큰 정도로 심장 세포에서 발현을 유도할 수 있는 프로모터와 같은, 조직-특이적 프로모터이다. 일부 실시예에서, 조직-특이적 프로모터는 데스민(Des), 알파-미오신 중쇄(α-MHC), 미오신 경쇄 2(MLC-2), 심장 트로포닌 C(cTnC), 심장 트로포닌 T(hTNNT2), 근육 크레아틴 키나아제(CK) 및 이의 프로모터/인핸서 영역들의 조합, 예컨대 MHCK7을 포함하지만 이에 한정되지 않는 임의의 다양한 심장 세포-특이적 프로모터로부터 선택된다. 일부 경우에, 프로모터는 유비쿼터스 프로모터이다. "유비쿼터스 프로모터(ubiquitous promoter)"는 실험 또는 임상 조건 하에서 조직-특이적이지 않은 프로모터를 지칭한다. 일부 경우에, 유비쿼터스 프로모터는 CMV, CAG, UBC, PGK, EF1-알파, GAPDH, SV40, HBV, 닭 베타-액틴, 및 인간 베타-액틴 프로모터 중 어느 하나이다.

일부 실시예에서, 프로모터 서열은 표 3으로부터 선택된다. 일부 실시예에서, 프로모터는 서열번호 31-51 중 어느 하나와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.

프로모터	서열	서열번호
MHCK7	ACCCTTCAGATTAAAAATAACTGAGGTAAGGGCCTGGGTAGGGGAGGTGGTGTGAGACGCTCCTGTCTCTCCTCTATCTGCCCATCGGCCCTTTGGGGAGGAGGAATGTGCCCAAGGACTAAAAAAAGGCCATGGAGCCAGAGGGGCGAGGGCAACAGACCTTTCATGGGCAAACCTTGGGGCCCTGCTGTCTAGCATGCCCCACTACGGGTCTAGGCTGCCCATGTAAGGAGGCAAGGCCTGGGGACACCCGAGATGCCTGGTTATAATTAACCCAGACATGTGGCTGCCCCCCCCCCCCCAACACCTGCTGCCTCTAAAAATAACCCTGTCCCTGGTGGATCCCCTGCATGCGAAGATCTTCGAACAAGGCTGTGGGGGACTGAGGGCAGGCTGTAACAGGCTTGGGGGCCAGGGCTTATACGTGCCTGGGACTCCCAAAGTATTACTGTTCCATGTTCCCGGCGAAGGGCCAGCTGTCCCCCGCCAGCTAGACTCAGCACTTAGTTTAGGAACCAGTGAGCAAGTCAGCCCTTGGGGCAGCCCATACAAGGCCATGGGGCTGGGCAAGCTGCACGCCTGGGTCCGGGGTGGGCACGGTGCCCGGGCAACGAGCTGAAAGCTCATCTGCTCTCAGGGGCCCCTCCCTGGGGACAGCCCCTCCTGGCTAGTCACACCCTGTAGGCTCCTCTATATAACCCAGGGGCACAGGGGCTGCCCTCATTCTACCACCACCTCCACAGCACAGACAGACACTCAGGAGCCAGCCAG	31
인간 심장 트로포닌 T 프로모터 (엑손 1 없음) hTnnT2 / HTNNT2	CTCAGTCCATTAGGAGCCAGTAGCCTGGAAGATGTCTTTACCCCCAGCATCAGTTCAAGTGGAGCAGCACATAACTCTTGCCCTCTGCCTTCCAAGATTCTGGTGCTGAGACTTATGGAGTGTCTTGGAGGTTGCCTTCTGCCCCCCAACCCTGCTCCCAGCTGGCCCTCCCAGGCCTGGGTTGCTGGCCTCTGCTTTATCAGGATTCTCAAGAGGGACAGCTGGTTTATGTTGCATGACTGTTCCCTGCATATCTGCTCTGGTTTTAAATAGCTTATCTGAGCAGCTGGAGGACCACATGGGCTTATATGGCGTGGGGTACATGTTCCTGTAGCCTTGTCCCTGGCACCTGCCAAAATAGCAGCCAACACCCCCCACCCCCACCGCCATCCCCCTGCCCCACCCGTCCCCTGTCGCACATTCCTCCCTCCGCAGGGCTGGCTCACCAGGCCCCAGCCCACATGCCTGCTTAAAGCCCTCTCCATCCTCTGCCTCACCCAGT	33
인간 심장 트로포닌 T 프로모터 (엑손 1 있음, 밑줄 쳐짐) hTnnT2 / HTNNT2	CTCAGTCCATTAGGAGCCAGTAGCCTGGAAGATGTCTTTACCCCCAGCATCAGTTCAAGTGGAGCAGCACATAACTCTTGCCCTCTGCCTTCCAAGATTCTGGTGCTGAGACTTATGGAGTGTCTTGGAGGTTGCCTTCTGCCCCCCAACCCTGCTCCCAGCTGGCCCTCCCAGGCCTGGGTTGCTGGCCTCTGCTTTATCAGGATTCTCAAGAGGGACAGCTGGTTTATGTTGCATGACTGTTCCCTGCATATCTGCTCTGGTTTTAAATAGCTTATCTGAGCAGCTGGAGGACCACATGGGCTTATATGGCGTGGGGTACATGTTCCTGTAGCCTTGTCCCTGGCACCTGCCAAAATAGCAGCCAACACCCCCCACCCCCACCGCCATCCCCCTGCCCCACCCGTCCCCTGTCGCACATTCCTCCCTCCGCAGGGCTGGCTCACCAGGCCCCAGCCCACATGCCTGCTTAAAGCCCTCTCCATCCTCTGCCTCACCCAGTCCCCGCTGAGACTGAGCAGACGCCTCCAGGATCTGTCGGCAG	32
마우스 α- 심장 미오신 중쇄 프로모터 (aMHC)	GGTACCGGATCCTGCAAGGTCACACAAGGGTCTCCACCCACCAGGTGCCCTAGTCTCAATTTCAGTTTCCATGCCTTGTTCTCACAATGCTGGCCTCCCCAGAGCTAATTTGGACTTTGTTTTTATTTCAAAAGGGCCTGAATGAGGAGTAGATCTTGTGCTACCCAGCTCTAAGGGTGCCCGTGAAGCCCTCAGACCTGGAGCCTTTGCAACAGCCCTTTAGGTGGAAGCAGAATAAAGCAATTTTCCTTAAAGCCAAAATCCTGCCTCTAGACTCTTCTTCTCTGACCTCGGTCCCTGGGCTCTAGGGTGGGGAGGTGGGGCTTGGAAGAAGAAGGTGGGGAAGTGGCAAAAGCCGATCCCTAGGGCCCTGTGAAGTTCGGAGCCTTCCCTGTACAGCACTGGCTCATAGATCCTCCTCCAGCCAAACATAGCAAGAAGTGATACCTCCTTTGTGACTTCCCCAGGCCCAGTACCTGTCAGGTTGAAACAGGATTTAGAGAAGCCTCTGAACTCACCTGAACTCTGAAGCTCATCCACCAAGCAAGCACCTAGGTGCCACTGCTAGTTAGTATCCTACGCTGATAATATGCAGAGCTGGGCCACAGAAGTCCTGGGGTGTAGGAACTGACCAGTGACTTTTCAGTCGGCAAAGGTATGACCCCCTCAGCAGATGTAGTAATGTCCCCTTAGATCCCATCCCAGGCAGGTCTCTAAGAGGACATGGGATGAGAGATGTAGTCATGTGGCATTCCAAACACAGCTATCCACAGTGTCCCTTGCCCCTTCCACTTAGCCAGGAGGACAGTAACCTTAGCCTATCTTTCTTCCTCCCCATCCTCCCAGGACACACCCCCTGGTCTGCAGTATTCATTTCTTCCTTCACGTCCCCTCTGTGACTTCCATTTGCAAGGCTTTTGACCTCTGCAGCTGCTGGAAGATAGAGTTTGGCCCTAGGTGTGGCAAGCCATCTCAAGAGAAAGCAGACAACAGGGGGACCAGATTTTGGAAGGATCAGGAACTAAATCACTGGCGGGCCTGGGGGTAGAAAAAAGAGTGAGTGAGTCCGCTCCAGCTAAGCCAAGCTAGTCCCCGAGATACTCTGCCACAGCTGGGCTGCTCGGGGTAGCTTTAGGAATGTGGGTCTGAAAGACAATGGGATTGGAAGACATCTCTTTGAGTCTCCCCTCAACCCCACCTACAGACACACTCGTGTGTGGCCAGACTCCTGTTCAACAGCCCTCTGTGTTCTGACCACTGAGCTAGGCAACCAGAGCATGGGCCCTGTGCTGAGGATGAAGAGTTGGTTACCAATAGCAAAAACAGCAGGGGAGGGAGAACAGAGAACGAAATAAGGAAGGAAGAAGGAAAGGCCAGTCAATCAGATGCAGTCAGAAGAGATGGGAAGCCAACACACAGCTTGAGCAGAGGAAACAGAAAAGGGAGAGATTCTGGGCATAAGGAGGCCACAGAAAGAAGAGCCCAGGCCCCCCAAGTCTCCTCTTTATACCCTCATCCCGTCTCCCAATTAAGCCCACTCTTCTTCCTAGATCAGACCTGAGCTGCAGCGAAGAGACCCGTAGGGAGGATCACACTGGATGAAGGAGATGTGTGGAGAAGTCCAGGGAACCTAAGAGCCAGAGCCTAAAAGAGCAAGAGATAAAGGTGCTTCAAAGGTGGCCAGGCTGTGCACACAGAGGGTCGAGGACTGGTGGTAGAGCCTCAAGATAAGGATGATGCTCAGAATGGGCGGGGGGGGGGATTCTGGGGGGGGGAGAGAGAAGGTGAGAAGGAGCCTGGAACAGAGAATCTGGAAGCGCTGGAAACGATACCATAAAGGGAAGAACCCAGGCTACCTTTAGATGTAAATCATGAAAGACAGGGAGAAGGGAAGCTGGAGAGAGTAGAAGGACCCCGGGGCAAGACATTGAAGCAAGGACAAGCCAGGTTGAGCGCTCCGTGAAATCAGCCTGCTGAAGGCAGAGCCCTGGTATGAGCACCAGAACAGCAGAGGCTAGGGTTAATGTCGAGACAGGGAACAGAAGGTAGACACAGGAACAGACAGAGACGGGGGAGCCAGGTAACAAAGGAATGGTCCTTCTCACCTGTGGCCAGAGCGTCCATCTGTGTCCACATACTCTAGAATGTTCATCAGACTGCAGGGCTGGCTTGGGAGGCAGCTGGAAAGAGTATGTGAGAGCCAGGGGAGACAAGGGGGCCTAGGAAAGGAAGAAGAGGGCAAACCAGGCCACACAAGAGGGCAGAGCCCAGAACTGAGTTAACTCCTTCCTTGTTGCATCTTCCATAGGAGGCAGTGGGAACTCTGTGACCACCATCCCCCATGAGCCCCCACTACCCATACCAAGTTTGGCCTGAGTGGCATTCTAGGTTCCCTGAGGACAGAGCCTGGCCTTTGTCTCTTGGACCTGACCCAAGCTGACCCAATGTTCTCAGTACCTTATCATGCCCTCAAGAGCTTGAGAACCAGGCAGTGACATATTAGGCCATGGGCTAACCCTGGAGCTTGCACACAGGAGCCTCAAGTGACCTCCAGGGACACAGCTGCAGACAGGTGGCCTTTATCCCCAAAGAGCAACCATTTGGCATAGGTGGCTGCAAATGGGAATGCAAGGTTGAATCAGGTCCCTTCAAGAATACTGCATGCAAGACCTAAGACCCCTGGAGAGAGGGGTATGCTCCTGCCCCCACCCACCATAAGGGGAGTGAACTATCCTAGGGGGCTGGCGACCTTGGGGAGACACCACATTACTGAGAGTGCTGAGCCCAGAAAAACTGACCGCCCTGTGTCCTGCCCACCTCCACACTCTAGAGCTATATTGAGAGGTGACAGTAGATAGGGTGGGAGCTGGTAGCAGGGAGAGTGTTCCTGGGTGTGAGGGTGTAGGGGAAAGCCAGAGCAGGGGAGTCTGGCTTTGTCTCCTGAACACAATGTCTACTTAGTTATAACAGGCATGACCTGCTAAAGACCCAACATCTACGACCTCTGAAAAGACAGCAGCCCTGGAGGACAGGGGTTGTCTCTGAGCCTTGGGTGCTTGATGGTGCCACAAAGGAGGGCATGAGTGTGAGTATAAGGCCCCAGGAGCGTTAGAGAAGGGCACTTGGGAAGGGGTCAGTCTGCAGAGCCCCTATCCATGGAATCTGGAGCCTGGGGCCAACTGGTGTAAATCTCTGGGCCTGCCAGGCATTCAAAGCAGCACCTGCATCCTCTGGCAGCCTGGGGAGGCGGAAGGGAGCAACCCCCCACTTATACCCTTTCTCCCTCAGCCCCAGGATTAACACCTCTGGCCTTCCCCCTTCCCACCTCCCATCAGGAGTGGAGGGTTGCAGAGGGAGGGTAAAAACCTACATGTCCAAACATCATGGTGCACGATATATGGATCAGTATGTGTAGAGGCAAGAAAGGAAATCTGCAGGCTTAACTGGGTTAATGTGTAAAGTCTGTGTGCATGTGTGTGTGTCTGACTGAAAACGGGCATGGCTGTGCAGCTGTTCAGTTCTGTGCGTGAGGTTACCAGACTGCAGGTTTGTGTGTAAATTGCCCAAGGCAAAGTGGGTGAATCCCTTCCATGGTTTAAAGAGATTGGATGATGGCCTGCATCTCAAGGACCATGGAAAATAGAATGGACACTCTATATGTGTCTCTAAGCTAAGGTAGCAAGGTCTTTGGAGGACACCTGTCTAGAGATGTGGGCAACAGAGACTACAGACAGTATCTGTACAGAGTAAGGAGAGAGAGGAGGGGGTGTAGAATTCTCTTACTATCAAAGGGAAACTGAGTCGTGCACCTGCAAAGTGGATGCTCTCCCTAGACATCATGACTTTGTCTCTGGGGAGCCAGCACTGTGGAACTTCAGGTCTGAGAGAGTAGGAGGCTCCCCTCAGCCTGAAGCTATGCAGATAGCCAGGGTTGAAAGGGGGAAGGGAGAGCCTGGGATGGGAGCTTGTGTGTTGGAGGCAGGGGACAGATATTAAGCCTGGAAGAGAAGGTGACCCTTACCCAGTTGTTCAACTCACCCTTCAGATTAAAAATAACTGAGGTAAGGGCCTGGGTAGGGGAGGTGGTGTGAGACGCTCCTGTCTCTCCTCTATCTGCCCATCGGCCCTTTGGGGAGGAGGAATGTGCCCAAGGACTAAAAAAAGGCCATGGAGCCAGAGGGGCGAGGGCAACAGACCTTTCATGGGCAAACCTTGGGGCCCTGCTGTCCTCCTGTCACCTCCAGAGCCAAGGGATCAAAGGAGGAGGAGCCAGGACAGGAGGGAAGTGGGAGGGAGGGTCCCAGCAGAGGACTCCAAATTTAGGCAGCAGGCATATGGGATGGGATATAAAGGGGCTGGAGCACTGAGAGCTGTCAGAGATTTCTCCAACCCAGGTAAGAGGGAGTTTCGGGTGGGGGCTCTTCACCCACACCAGACCTCTCCCCACCTAGAAGGAAACTGCCTTTCCTGGAAGTGGGGTTCAGGCCGGTCAGAGATCTGACAGGGTGGCCTTCCACCAGCCTGGGAAGTTCTCAGTGGCAGGAGGTTTCCACAAGAAACACTGGATGCCCCTTCCCTTACGCTGTCTTCTCCATCTTCCTCCTGGGGATGCTCCTCCCCGTCTTGGTTTATCTTGGCTCTTCGTCTTCAGCAAGATTTGCCCTGTGCTGTCCACTCCATCTTTCTCTACTGTCTCCGTGCCTTGCCTTGCCTTCTTGCGTGTCCTTCCTTTCCACCCATTTCTCACTTCACCTTTTCTCCCCTTCTCATTTGTATTCATCCTTCCTTCCTTCCTTCCTTCCTTCCTTCCTTCCTTCCTTCCTTCCTTTCTCCCTTCCTTCCTTCCTTCCTTCCTTCCTTCCTTCCTTCCTTCCTGTGTCAGAGTGCTGAGAATCACACCTGGGGTTCCCACCCTTATGTAAACAATCTTCCAGTGAGCCACAGCTTCAGTGCTGCTGGGTGCTCTCTTACCTTCCTCACCCCCTGGCTTGTCCTGTTCCATCCTGGTCAGGATCTCTAGATTGGTCTCCCAGCCTCTGCTACTCCTCTTCCTGCCTGTTCCTCTCTCTGTCCAGCTGCGCCACTGTGGTGCCTCGTTCCAGCTGTGGTCCACATTCTTCAGGATTCTCTGAAAAGTTAACCAGGTGAGAATGTTTCCCCTGTAGACAGCAGATCACGATTCTCCCGGAAGTCAGGCTTCCAGCCCTCTCTTTCTCTGCCCAGCTGCCCGGCACTCTTAGCAAACCTCAGGCACCCTTACCCCACATAGACCTCTGACAGAGAAGCAGGCACTTTACATGGAGTCCTGGTGGGAGAGCCATAGGCTACGGTGTAAAAGAGGCAGGGAAGTGGTGGTGTAGGAAAGTCAGGACTTCACATAGAAGCCTAGCCCACACCAGAAATGACAGACAGATCCCTCCTATCTCCCCCATAAGAGTTTGAGTCGACCCGCGGCCCCGAATTG	34
닭 심장 트로포닌 T 프로모터 (cTnT)	GGGATAAAAGCAGTCTGGGCTTTCACATGACAGCATCTGGGGCTGCGGCAGAGGGTCGGGTCCGAAGCGCTGCCTTATCAGCGTCCCCAGCCCTGGGAGGTGACAGCTGGCTGGCTTGTGTCAGCCCCTCGGGCACTCACGTATCTCCGTCCGACGGGTTTAAAATAGCAAAACTCTGAGGCCACACAATAGCTTGGGCTTATATGGGCTCCTGTGGGGGAAGGGGGAGCACGGAGGGGGCCGGGGCCGCTGCTGCCAAAATAGCAGCTCACAAGTGTTGCATTCCTCTCTGGGCGCCGGGCACATTCCTGCTGGCTCTGCCCGCCCCGGGGTGGGCGCCGGGGGGACCTTAAAGCCTCTGCCCCCCAAGGAGCCCTTCCCAGACAGCCGCCGGCACCCACCGCTCCGTGGGA	35
인간 크레아틴 키나아제 M (hCKM)	CTCTCAGCCCTGGAAGTCCTTGCTCACAGCCGAGGCGCCGAGAGCGCTTGCTCTGCCCAGATCTGCGCGAGTCTGGCGCCCGCGCTCTGAACGGCGTCGCTGCCCAGCCCCCTTCCCCGGGAGGTGGGAGCGGCCACCCAGGGCCCCGTGGCTGCCCTTGTAAGGAGGCGAGGCCCGAGGACACCCGAGACGCCCGGTTATAATTAACCAGGACACGTGGCGAACCCCCCTCCAACACCTGCCCCCGAACCCCCCCATACCCAGCGCCTCGGGTCTCGGCCTTTGCGGCAGAGGAGACAGCAAAGCGCCCTCTAAAAATAACTCCTTTCCCGGCGACCGAGACCCTCCCTGTCCCCCGCACAGCGGAAATCTCCCAGTGGCACCGAGGGGGCGAGGGTTAAGTGGGGGGGAGGGTGACCACCGCCTCCCACCCTTGCCCTGAGTTTGAATCTCTCCAACTCAGCCAGCCTCAGTTTCCCCTCCACTCAGTCCCTAGGAGGAAGGGGCGCCCAAGCGCGGGTTTCTGGGGTTAGACTGCCCTCCATTGCAATTGGTCCTTCTCCCGGCCTCTGCTTCCTCCAGCTCACAGGGTATCTGCTCCTCCTGGAGCCACACCTTGGTTCCCCGAGGTGCCGCTGGGACTCGGGTAGGGGTGAGGGCCCAGGGGGCACAGGGGGAGCCGAGGGCCACAGGAAGGGCTGGTGGCTGAAGGAGACTCAGGGGCCAGGGGACGGTGGCTTCTACGTGCTTGGGACGTTCCCAGCCACCGTCCCATGTTCCCGGCGGGGGGCCAGCTGTCCCCACCGCCAGCCCAACTCAGCACTTGGTCAGGGTATCAGCTTGGTGGGGGGGCGTGAGCCCAGCCCCTGGGGCGGCTCAGCCCATACAAGGCCATGGGGCTGGGCGCAAAGCATGCCTGGGTTCAGGGTGGGTATGGTGCGGGAGCAGGGAGGTGAGAGGCTCAGCTGCCCTCCAGAACTCCTCCCTGGGGACAACCCCTCCCAGCCAATAGCACAGCCTAGGTCCCCCTATATAAGGCCACGGCTGCTGGCCCTTCCTTTGGGTCAGTGTCACCTCCAGGATACAGACA	36
인간 베타-액틴 (HuBa)	GCCCAGCACCCCAAGGCGGCCAACGCCAAAACTCTCCCTCCTCCTCTTCCTCAATCTCGCTCTCGCTCTTTTTTTTTTTCGCAAAAGGAGGGGAGAGGGGGTAAAAAAATGCTGCACTGTGCGGCGAAGCCGGTGAGTGAGCGGCGCGGGGCCAATCAGCGTGCGCCGTTCCGAAAGTTGCCTTTTATGGCTCGAGCGGCCGCGGCGGCGCCCTATAAAACCCAGCGGCGCGACGCGCCACCACCGCCGAGTC	37
닭 베타-액틴 (CBA)	GGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGGGA	38
거대세포바이러스 (CMV)	TGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACACCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAATAACCCCGCCCCGTTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCG	39
거대세포바이러스 (CMV) (제2 버전)	TAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGT	40
거대세포바이러스 (CMV) (제3 버전)	CGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCT	41
CAG 프로모터 (제1 버전)	ACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGG	42
CAG 프로모터 (제2 버전)	CGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCG	43
인간 EF1-알파 (EF1-α)	CAACCTTTGGAGCTAAGCCAGCAATGGTAGAGGGAAGATTCTGCACGTCCCTTCCAGGCGGCCTCCCCGTCACCACCCCCCCCAACCCGCCCCGACCGGAGCTGAGAGTAATTCATACAAAAGGACTCGCCCCTGCCTTGGGGAATCCCAGGGACCGTCGTTAAACTCCCACTAACGTAGAACCCAGAGATCGCTGCGTTCCCGCCCCCTCACCCGCCCGCTCTCGTCATCACTGAGGTGGAGAATAGCATGCGTGAGGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACGGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTT	44
인간 Synapsin1 (Syn), 짧은 버전	AGTGCAAGTGGGTTTTAGGACCAGGATGAGGCGGGGTGGGGGTGCCTACCTGACGACCGACCCCGACCCACTGGACAAGCACCCAACCCCCATTCCCCAAATTGCGCATCCCCTATCAGAGAGGGGGAGGGGAAACAGGATGCGGCGAGGCGCGTGCGCACTGCCAGCTTCAGCACCGCGGACAGTGCCTTCGCCCCCGCCTGGCGGCGCGCGCCACCGCCGCCTCAGCACTGAAGGCGCGCTGACGTCACTCGCCGGTCCCCCGCAAACTCCCCTTCCCGGCCACCTTGGTCGCGTCCGCGCCGCCGCCGGCCCAGCCGGACCGCACCACGCGAGGCGCGAGATAGGGGGGCACGGGCGCGACCATCTGCGCTGCGGCGCCGGCGACTCAGCGCTGCCTC	45
3' 연장부를 갖는 인간 Synapsin1 (Syn)	AGTGCAAGTGGGTTTTAGGACCAGGATGAGGCGGGGTGGGGGTGCCTACCTGACGACCGACCCCGACCCACTGGACAAGCACCCAACCCCCATTCCCCAAATTGCGCATCCCCTATCAGAGAGGGGGAGGGGAAACAGGATGCGGCGAGGCGCGTGCGCACTGCCAGCTTCAGCACCGCGGACAGTGCCTTCGCCCCCGCCTGGCGGCGCGCGCCACCGCCGCCTCAGCACTGAAGGCGCGCTGACGTCACTCGCCGGTCCCCCGCAAACTCCCCTTCCCGGCCACCTTGGTCGCGTCCGCGCCGCCGCCGGCCCAGCCGGACCGCACCACGCGAGGCGCGAGATAGGGGGGCACGGGCGCGACCATCTGCGCTGCGGCGCCGGCGACTCAGCGCTGCCTCAGTCTGCGGTGGGCAGCGGAGGAGTCGTGTCGTGCCTGAGAGCGCAG	46
5' 연장부를 갖는 인간 Synapsin1 (Syn)	CTGCAGAGGGCCCTGCGTATGAGTGCAAGTGGGTTTTAGGACCAGGATGAGGCGGGGTGGGGGTGCCTACCTGACGACCGACCCCGACCCACTGGACAAGCACCCAACCCCCATTCCCCAAATTGCGCATCCCCTATCAGAGAGGGGGAGGGGAAACAGGATGCGGCGAGGCGCGTGCGCACTGCCAGCTTCAGCACCGCGGACAGTGCCTTCGCCCCCGCCTGGCGGCGCGCGCCACCGCCGCCTCAGCACTGAAGGCGCGCTGACGTCACTCGCCGGTCCCCCGCAAACTCCCCTTCCCGGCCACCTTGGTCGCGTCCGCGCCGCCGCCGGCCCAGCCGGACCGCACCACGCGAGGCGCGAGATAGGGGGGCACGGGCGCGACCATCTGCGCTGCGGCGCCGGCGACTCAGCGCTGCCTC	47
인간 CamKIIa (CaMKIIa)	ACTTGTGGACAAAGTTTGCTCTATTCCACCTCCTCCAGGCCCTCCTTGGGTCCATCACCCCAGGGGTGCTGGGTCCATCCCACCCCCAGGCCCACACAGGCTTGCAGTATTGTGTGCGGTATGGTCAGGGCGTCCGAGAGCAGGTTTCGCAGTGGAAGGCAGGCAGGTGTTGGGGAGGCAGTTACCGGGGCAACGGGAACAGGGCGTTTTGGAGGTGGTTGCCATGGGGACCTGGATGCTGACGAAGGCTCGCGAGGCTGTGAGCAGCCACAGTGCCCTGC	48
eSYN 프로모터	GACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGCTGCAGAGGGCCCTGCGTATGAGTGCAAGTGGGTTTTAGGACCAGGATGAGGCGGGGTGGGGGTGCCTACCTGACGACCGACCCCGACCCACTGGACAAGCACCCAACCCCCATTCCCCAAATTGCGCATCCCCTATCAGAGAGGGGGAGGGGAAACAGGATGCGGCGAGGCGCGTCGCGACTGCCAGCTTCAGCACCGCGGACAGTGCCTTCGCCCCCGCCTGGCGGCGCGCGCCACCGCCGCCTCAGCACTGAAGGCGCGCTGACGTCACTCGCCGGTCCCCCGCAAACTCCCCTTCCCGGCCACCTTGGTCGCGTCCGCGCCGCCGCCGGCCCAGCCGGACCGCACCACGCGAGGCGCGAGATAGGGGGGCACGGGCGCGACCATCTGCGCTGCGGCGCCGGCGACTCAGCGCTGCCTCAGTCTGCGGTGGGCAGCGGAGGAGTCGTGTCGTGCCTGAGAGCGCAGG	49

바람직한 실시예에서, 벡터 게놈은 서열번호 31과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 바람직한 실시예에서, 벡터 게놈은 서열번호 32과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 바람직한 실시예에서, 벡터 게놈은 서열번호 33과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.

프로모터의 추가 예시적인 예는 시미안 바이러스 40 유래 SV40 후기 프로모터, 바큘로바이러스 폴리헤드론 인핸서/프로모터 요소, 단순 포진 바이러스 티미딘 키나아제(HSV tk), 거대세포바이러스(CMV) 유래 즉시 초기 프로모터, 및 LTR 요소를 포함하는 다양한 레트로바이러스 프로모터이다. 다양한 다른 프로모터가 당 기술분야에 공지되어 있고 일반적으로 이용 가능하며, 많은 이러한 프로모터의 서열은 GenBank 데이터베이스와 같은 서열 데이터베이스에서 이용 가능하다.

기타 조절 요소

일부 경우에, 본 개시의 벡터는 인핸서, 인트론, 폴리-A 신호, 2A 펩티드 암호화 서열, WPRE(마멋 간염 바이러스 전사후 조절 요소), 및 HPRE(B형 간염 전사후 조절 요소)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 조절 요소를 추가로 포함한다.

일부 실시예에서, 벡터는 CMV 인핸서를 포함한다.

특정 실시예에서, 벡터는 하나 이상의 인핸서를 포함한다. 특정 실시예에서, 인핸서는 CMV 인핸서 서열, GAPDH 인핸서 서열, β-액틴 인핸서 서열, 또는 EF1-α 인핸서 서열이다. 전술한 서열들은 당 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, CMV 초기(IE) 인핸서의 서열은 다음과 같다:

ACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCA

(서열번호 50)

소정의 실시예에서, 벡터는 하나 이상의 인트론을 포함한다. 특정 실시예에서, 인트론은 토끼 글로빈 인트론 서열, 닭 β-액틴 인트론 서열, 합성 인트론 서열, SV40 인트론, 또는 EF1-α 인트론 서열이다.

소정의 실시예에서, 벡터는 폴리A 서열을 포함한다. 특정 실시예에서, 폴리A 서열은 토끼 글로빈 폴리A 서열, 인간 성장 호르몬 폴리A 서열, 소 성장 호르몬 폴리A 서열, PGK 폴리A 서열, SV40 폴리A 서열, 또는 TK 폴리A 서열이다. 일부 실시예에서, 폴리-A 신호는 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호(bGHpA)일 수 있다.

소정의 실시예에서, 벡터는 하나 이상의 전사물 안정화 요소를 포함한다. 특정 실시예에서, 전사물 안정화 요소는 WPRE 서열, HPRE 서열, 스캐폴드-부착 영역, 3' UTR, 또는 5' UTR이다. 특정 실시예에서, 벡터는 5' UTR 및 3' UTR 둘 다를 포함한다.

일부 실시예에서, 벡터는 표 4로부터 선택된 5' 미번역 영역(UTR)을 포함한다. 일부 실시예에서, 벡터 게놈은 서열번호 51-61 중 어느 하나와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.

5' 미번역 영역	서열	서열번호
인간 베타-액틴 엑손/인트론	CGCGTCCGCCCGCGAGCACAGAGCCTCGCCTTTGCCGATCCGCCGCCCGTCCACACCCGCCGCCAGGTAAGCCCGGCCAGCCGACCGGGGCATGCGGCCGCGGCCCTTCGCCCGTGCAGAGCCGCCGTCTGGGCCGCAGCGGGGGGCGCATGGGGCGGAACCGGACCGCCGTGGGGGGCGCGGGAGAAGCCCCTGGGCCTCCGGAGATGGGGGACACCCCACGCCAGTTCGCAGGCGCGAGGCCGCGCTCGGGCGGGCGCGCTCCGGGGGTGCCGCTCTCGGGGCGGGGGCAACCGGCGGGGTCTTTGTCTGAGCCGGGCTCTTGCCAATGGGGATCGCACGGTGGGCGCGGCGTAGCCCCCGTCAGGCCCGGTGGGGGCTGGGGCGCCATGCGCGTGCGCGCTGGTCCTTTGGGCGCTAACTGCGTGCGCGCTGGGAATTGGCGCTAATTGCGCGTGCGCGCTGGGACTCAATGGCGCTAATCGCGCGTGCGTTCTGGGGCCCGGGCGCTTGCGCCACTTCCTGCCCGAGCCGCTGGCGCCCGAGGGTGTGGCCGCTGCGTGCGCGCGCGCGACCCGGTCGCTGTTTGAACCGGGCGGAGGCGGGGCTGGCGCCCGGTTGGGAGGGGGTTGGGGCCTGGCTTCCTGCCGCGCGCCGCGGGGACGCCTCCGACCAGTGTTTGCCTTTTATGGTAATAACGCGGCCGGCCCGGCTTCCTTTGTCCCCAATCTGGGCGCGCGCCGGCGCCCCCTGGCGGCCTAAGGACTCGGCGCGCCGGAAGTGGCCAGGGCGGCAGCGGCTGCTCTTGGCGGCCCCGAGGTGACTATAGCCTTCTTTTGTGTCTTGATAGTTCGCCAGCCTCTGCTAACCATGTTCATGCCTTCTTCTTTTTCCTACAGCTCCTGGGCAACGTGCTGGTTATTGTGCTGTCTCATCATTTTGGCAAAGAATTC	51
닭 베타-액틴 엑손/인트론 + 토끼 글로빈 인트론	GTCGCTGCGCGCTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTAGCGCTTGGTTTAATGACGGCTTGTTTCTTTTCTGTGGCTGCGTGAAAGCCTTGAGGGGCTCCGGGAGGGCCCTTTGTGCGGGGGGAGCGGCTCGGGGGGTGCGTGCGTGTGTGTGTGCGTGGGGAGCGCCGCGTGCGGCTCCGCGCTGCCCGGCGGCTGTGAGCGCTGCGGGCGCGGCGCGGGGCTTTGTGCGCTCCGCAGTGTGCGCGAGGGGAGCGCGGCCGGGGGCGGTGCCCCGCGGTGCGGGGGGGGCTGCGAGGGGAACAAAGGCTGCGTGCGGGGTGTGTGCGTGGGGGGGTGAGCAGGGGGTGTGGGCGCGTCGGTCGGGCTGCAACCCCCCCTGCACCCCCCTCCCCGAGTTGCTGAGCACGGCCCGGCTTCGGGTGCGGGGCTCCGTACGGGGCGTGGCGCGGGGCTCGCCGTGCCGGGCGGGGGGTGGCGGCAGGTGGGGGTGCCGGGCGGGGCGGGGCCGCCTCGGGCCGGGGAGGGCTCGGGGGAGGGGCGCGGCGGCCCCCGGAGCGCCGGCGGCTGTCGAGGCGCGGCGAGCCGCAGCCATTGCCTTTTATGGTAATCGTGCGAGAGGGCGCAGGGACTTCCTTTGTCCCAAATCTGTGCGGAGCCGAAATCTGGGAGGCGCCGCCGCACCCCCTCTAGCGGGCGCGGGGCGAAGCGGTGCGGCGCCGGCAGGAAGGAAATGGGCGGGGAGGGCCTTCGTGCGTCGCCGCGCCGCCGTCCCCTTCTCCCTCTCCAGCCTCGGGGCTGTCCGCGGGGGGACGGCTGCCTTCGGGGGGGACGGGGCAGGGCGGGGTTCGGCTTCTGGCGTGTGACCGGCGGCTCTAGAGCCTCTGCTAACCATGTTCATGCCTTCTTCTTTTTCCTACAGCTCCTGGGCAACGTGCTGGTTATTGTGCTGTCTCATCATTTTGGCAAAGAATTC	52
키메라 인트론 서열	GGTAAGTTTAGTCTTTTTGTCTTTTATTTCAGGTCCCGGATCCGGTGGTGGTGCAAATCAAAGAACTGCTCCTCAGTGGATGTTGCCTTTACTTCTAGGCCTGTACGGAAGTGTTACTTCTGCTCTAAAAGCTGCGGAATTGTACCCGC	53
5' UTR-Syn1 Hs	AGTCTGCGGTGGGCAGCGGAGGAGTCGTGTCGTGCCTGAGAGCGCAGCTGTGCTCCTGGGCACCGCGCAGTCCGCCCCCGCGGCTCCTGGCCAGACCACCCCTAGGACCCCCTGCCCCAAGTCGCA	54
CMV IE 엑손	TCAGATCGCCTGGAGAGGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGTGGACACCGGGACCGATCCAGCCTCCGCGGCCGGGAACGGTGCATTGGAACGCGGATTCCCCGTGCCAAGAGTGAC	55
TPL-eMLP (아데노바이러스 유래 인핸서 요소)	CTCACTCTCTTCCGCATCGCTGTCTGCGAGGGCCAGCTGTTGGGCTCGCGGTTGAGGACAAACTCTTCGCGGTCTTTCCAGTACTCTTGGATCGGAAACCCGTCGGCCTCCGAACGGTACTCCGCCACCGAGGGACCTGAGCGAGTCCGCATCGACCGGATCGGAAAACCTCTCGAGAAAGGCGTCTAACCAGTCACAGTCGCAAGGTAGGCTGAGCACCGTGGCGGGCGGCAGCGGGTGGCGGTCGGGGTTGTTTCTGGCGGAGGTGCTGCTGATGATGTAATTAAAGTAGGCGGTCTTGAGACGGCGGATGGTCGAGGTGAGGTGTGGCAGGCTTGAGATCCAGCTGTTGGGGTGAGTACTCCCTCTCAAAAGCGGGCATTACTTCTGCGCTAAGATTGTCAGTTTCCAAAAACGAGGAGGATTTGATATTCACCTGGCCCGATCTGGCCATACACTTGAGTGACAATGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAGGTGTCCACTCCCAG	56
인간 EF1-α 인트론/엑손	CTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGGTAAGTGCCGTGTGTGGTTCCCGCGGGCCTGGCCTCTTTACGGGTTATGGCCCTTGCGTGCCTTGAATTACTTCCACCTGGCTCCAGTACGTGATTCTTGATCCCGAGCTGGAGCCAGGGGCGGGCCTTGCGCTTTAGGAGCCCCTTCGCCTCGTGCTTGAGTTGAGGCCTGGCCTGGGCGCTGGGGCCGCCGCGTGCGAATCTGGTGGCACCTTCGCGCCTGTCTCGCTGCTTTCGATAAGTCTCTAGCCATTTAAAATTTTTGATGACGTGCTGCGACGCTTTTTTTCTGGCAAGATAGTCTTGTAAATGCGGGCCAGGATCTGCACACTGGTATTTCGGTTTTTGGGCCCGCGGCCGGCGACGGGGCCCGTGCGTCCCAGCGCACATGTTCGGCGAGGCGGGGCCTGCGAGCGCGGCCACCGAGAATCGGACGGGGGTAGTCTCAAGCTGGCCGGCCTGCTCTGGTGCCTGGCCTCGCGCCGCCGTGTATCGCCCCGCCCTGGGCGGCAAGGCTGGCCCGGTCGGCACCAGTTGCGTGAGCGGAAAGATGGCCGCTTCCCGGCCCTGCTCCAGGGGGCTCAAAATGGAGGACGCGGCGCTCGGGAGAGCGGGCGGGTGAGTCACCCACACAAAGGAAAAGGGCCTTTCCGTCCTCAGCCGTCGCTTCATGTGACTCCACGGAGTACCGGGCGCCGTCCAGGCACCTCGATTAGTTCTGGAGCTTTTGGAGTACGTCGTCTTTAGGTTGGGGGGAGGGGTTTTATGCGATGGAGTTTCCCCACACTGAGTGGGTGGAGACTGAAGTTAGGCCAGCTTGGCACTTGATGTAATTCTCCTTGGAATTTGGCCTTTTTGAGTTTGGATCTTGGTTCATTCTCAAGCCTCAGACAGTGGTTCAAAGTTTTTTTCTTCCATTTCAG	57
인간 EF1-α, 인트론 A	GTAAGTGCCGTGTGTGGTTCCCGCGGGCCTGGCCTCTTTACGGGTTATGGCCCTTGCGTGCCTTGAATTACTTCCACCTGGCTGCAGTACGTGATTCTTGATCCCGAGCTTCGGGTTGGAAGTGGGTGGGAGAGTTCGAGGCCTTGCGCTTAAGGAGCCCCTTCGCCTCGTGCTTGAGTTGAGGCCTGGCCTGGGCGCTGGGGCCGCCGCGTGCGAATCTGGTGGCACCTTCGCGCCTGTCTCGCTGCTTTCGATAAGTCTCTAGCCATTTAAAATTTTTGATGACCTGCTGCGACGCTTTTTTTCTGGCAAGATAGTCTTGTAAATGCGGGCCAAGATCTGCACACTGGTATTTCGGTTTTTGGGGCCGCGGGCGGCGACGGGGCCCGTGCGTCCCAGCGCACATGTTCGGCGAGGCGGGGCCTGCGAGCGCGGCCACCGAGAATCGGACGGGGGTAGTCTCAAGCTGGCCGGCCTGCTCTGGTGCCTGGCCTCGCGCCGCCGTGTATCGCCCCGCCCTGGGCGGCAAGGCTGGCCCGGTCGGCACCAGTTGCGTGAGCGGAAAGATGGCCGCTTCCCGGCCCTGCTGCAGGGAGCTCAAAATGGAGGACGCGGCGCTCGGGAGAGCGGGCGGGTGAGTCACCCACACAAAGGAAAAGGGCCTTTCCGTCCTCAGCCGTCGCTTCATGTGACTCCACGGAGTACCGGGCGCCGTCCAGGCACCTCGATTAGTTCTCGAGCTTTTGGAGTACGTCGTCTTTAGGTTGGGGGGAGGGGTTTTATGCGATGGAGTTTCCCCACACTGAGTGGGTGGAGACTGAAGTTAGGCCAGCTTGGCACTTGATGTAATTCTCCTTGGAATTTGCCCTTTTTGAGTTTGGATCTTGGTTCATTCTCAAGCCTCAGACAGTGGTTCAAAGTTTTTTTCTTCCATTTCAG	58
5' UTR 인간 CamKIIa	TCAGAAGCCCCGGGCTCGTCAGTCAAACCGGTTCTCTGTTTGCACTCGGCAGCACGGGCAGGCAAGTGGTCCCTAGGTTCGGG	59
β-글로빈 인트론	GTGAGTCTATGGGACCCTTGATGTTTTCTTTCCCCTTCTTTTCTATGGTTAAGTTCATGTCATAGGAAGGGGAGAAGTAACAGGGTACACATATTGACCAAATCAGGGTAATTTTGCATTTGTAATTTTAAAAAATGCTTTCTTCTTTTAATATACTTTTTTGTTTATCTTATTTCTAATACTTTCCCTAATCTCTTTCTTTCAGGGCAATAATGATACAATGTATCATGCCTCTTTGCACCATTCTAAAGAATAACAGTGATAATTTCTGGGTTAAGGCAATAGCAATATTTCTGCATATAAATATTTCTGCATATAAATTGTAACTGATGTAAGAGGTTTCATATTGCTAATAGCAGCTACAATCCAGCTACCATTCTGCTTTTATTTTATGGTTGGGATAAGGCTGGATTATTCTGAGTCCAAGCTAGGCCCTTTTGCTAATCATGTTCATACCTCTTATCTTCCTCCCACAG	60
SV40 인트론	TCTAGAGGATCCGGTACTCGAGGAACTGAAAAACCAGAAAGTTAACTGGTAAGTTTAGTCTTTTTGTCTTTTATTTCAGGTCCCGGATCCGGTGGTGGTGCAAATCAAAGAACTGCTCCTCAGTGGATGTTGCCTTTACTTCTAGGCCTGTACGGAAGTGTTACTTCTGCTCTAAAAGCTGCGGAATTGTACCCGC	61

일부 실시예에서, 벡터는 표 5로부터 선택된 3' 미번역 영역을 포함한다. 일부 실시예에서, 벡터 게놈은 서열번호 62-70 중 어느 하나와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.

3' 미번역 영역	서열	서열번호
WPRE(x) (돌연변이된 마멋 간염 조절 요소 - 버전 1)	AATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCAGGCAACGTGGCGTGGTGTGCACTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAGCTCCTTTCCGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCTATTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAATCATCGTCCTTTCCTTGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGC	62
WPRE(x) (돌연변이된 마멋 간염 조절 요소 - 버전 2)	TCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCAGGCAACGTGGCGTGGTGTGCACTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAGCTCCTTTCCGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCTATTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAATCATCGTCCTTTCCTTGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGCA	63
WPRE(x) (돌연변이된 마멋 간염 조절 요소 - 버전 3)	TTCCTGTTAATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCAGGCAACGTGGCGTGGTGTGCACTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAGCTCCTTTCCGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCTATTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAGCTGACGTCCTTTCCGCGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCCTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGCCCATGTATCTTTTTCACCTGTGCCTTGTTTTTGCCTGTGTTCCGCGTCCTACTTTTCAAGCCTCCAAGCTGTGCCTTGGGCGGCTTTGGGGCATGGACATAGATCCCTATAAAGAATTTGGTTCATCTTATCAGTTGTTGAATTTTCTTCCTTTGGAC	64
CAAX	TGTGTGATAATG	65
EES	CTGTTCTCATCACATCATATCAAGGTTATATACCATCAATATTGCCACAGATGTTACTTAGCCTTTTAATATTTCTCTAATTTAGTGTATATGCAATGATAGTTCTCTGATTTCTGAGATTGAGTTTCTCATGTGTAATGATTATTTAGAGTTTCTCTTTCATCTGTTCAAATTTTTGTCTAGTTTTATTTTTTACTGATTTGTAAGACTTCTTTTTATAATCTGCATATTACAATTCTCTTTACTGGGGTGTTGCAAATATTTTCTGTCATTCTATGGCCTGACTTTTCTTAATGGTTTTTTAATTTTAAAAATAAGTCTTAATATTCATGCAATCTAATTAACAATCTTTTCTTTGTGGTTAGGACTTTGAGTCATAAGAAATTTTTCTCTACACTGAAGTCATGATGGCATGCTTCTATATTATTTTCTAAAAGATTTAAAGTTTTGCCTTCTCCATTTAGACTTATAATTCACTGGAATTTTTTTGTGTGTATGGTATGACATATGGGTTCCCTTTTATTTTTTACATATAAATATATTTCCCTGTTTTTCTAAAAAAGAAAAAGATCATCATTTTCCCATTGTAAAATGCCATATTTTTTTCATAGGTCACTTACATATATCAATGGGTCTGTTTCTGAGCTCTACTCTATTTTATCAGCCTCACTGTCTATCCCCACACATCTCATGCTTTGCTCTAAATCTTGATATTTAGTGGAACATTCTTTCCCATTTTGTTCTACAAGAATATTTTTGTTATTGTCTTTGGGCTTTCTATATACATTTTGAAATGAGGTTGACAAGTTA	66
HPRE	ATAACAGGCCTATTGATTGGAAAGTTTGTCAACGAATTGTGGGTCTTTTGGGGTTTGCTGCCCCTTTTACGCAATGTGGATATCCTGCTTTAATGCCTTTATATGCATGTATACAAGCAAAACAGGCTTTTACTTTCTCGCCAACTTACAAGGCCTTTCTCAGTAAACAGTATATGACCCTTTACCCCGTTGCTCGGCAACGGCCTGGTCTGTGCCAAGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCTTGGCCATAGGCCATCAGCGCATGCGTGGAACCTTTGTGTCTCCTCTGCCGATCCATACTGCGGAACTCCTAGCCGCTTGTTTTGCTCGCAGCAGGTCTGGAGCAAACCTCATCGGGACCGACAATTCTGTCGTACTCTCCCGCAAGTATACATCGTTTCCATGGCTGCTAGGCTGTGCTGCCAACTGGATCCTGCGCGGGACGTCCTTTGTTTACGTCCCGTCGGCGCTGAATCCCGCGGACGACCCCTCCCGGGGCCGCTTGGGGCTCTACCGCCCGCTTCTCCGTCTGCCGTACCGTCCGACCACGGGGCGCACCTCTCTTTACGCGGACTCCCCGTCTGTGCCTTCTCATCTGCCGGACCGTGTGCACTTCGCTTCACCTCTGCACGTCGCATGGAGGCCACCGTGAACGCCCACCGGAACCTGCCCAAGGTCTTGCATAAGAGGACTCTTGGACTTTCAGCAATGTCATC	67
R2V17 (HepB 유래 인핸서 요소)	TTCCTGTAAACAGGCCTATTGATTGGAAAGTTTGTCAACGAATTGTGGGTCTTTTGGGGTTTGCTGCCCCTTTTACGCAATGTGGATATCCTGCTTTAATGCCTTTATATGCATGTATACAAGCAAAACAGGCTTTTACTTTCTCGCCAACTTACAAGGCCTTTCTCAGTAAACAGTATATGACCCTTTACCCCGTTGCTCGGCAACGGCCTGGTCTGTGCCAAGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCTTGGCCATAGGCCATCAGCGCATGCGTGGAACCTTTGTGTCTCCTCTGCCGATCCATACTGCGGAACTCCTAGCCGCTTGTTTTGCTCGCAGCTGGACTGGAGCAAACCTCATCGGGACCGACAATTCTGTCGTACTCTCCCGCAAGCACTCACCGTTTCCGCGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCCTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGCCCATGTATCTTTTTCACCTGTGCCTTGTTTTTGCCTGTGTTCCGCGTCCTACTTTTCAAGCCTCCAAGCTGTGCCTTGGGCGGCTTTGGGGCATGGACATAGATCCCTATAAAGAATTTGGTTCATCTTATCAGTTGTTGAATTTTCTTCCTTTGGAC	68
3'UTR(글로빈)	GCTGGAGCCTCGGTAGCCGTTCCTCCTGCCCGCTGGGCCTCCCAACGGGCCCTCCTCCCCTCCTTGCACCGGCCCTTCCTGGTCTTTGAATAAA	69
WPRE(r)	ATTCGAGCATCTTACCGCCATTTATTCCCATATTTGTTCTGTTTTTCTTGATTTGGGTATACATTTAAATGTTAATAAAACAAAATGGTGGGGCAATCATTTACATTTTTAGGGATATGTAATTACTAGTTCAGGTGTATTGCCACAAGACAAACATGTTAAGAAACTTTCCCGTTATTTACGCTCTGTTCCTGTTAATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGATATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTGTGTGGATATGCTGCTTTAATGCCTCTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTACGGCTTTCGTTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCCGTCAACGTGGCGTGGTGTGCTCTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGCTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAACTCCTTTCTGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCGATCGCCACGGCAGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTAGGTTGCTGGGCACTGATAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAGGGCC	70

일부 실시예에서, 벡터는 표 6으로부터 선택된 폴리아데닐화(polyA) 신호를 포함한다. 일부 실시예에서, 폴리A 신호는 서열번호 71-75 중 어느 하나와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.

폴리-아데닐화 부위	서열	서열번호
토끼 글로빈 (pAGlobin-Oc)	TGGCTAATAAAGGAAATTTATTTTCATTGCAATAGTGTGTTGGAATTTTTTGTGTCTCTCACTCGGAAGAACATATGGGAGGGCAAATCATTTAAAACATCAGAATGAGTATTTGGTTTAGAGTTTGGCAACATATGCCCATATGCTGGCTGCCATGAACAAAGGTTGGCTATAAAGAGGTCATCAGTATATGAAACAGCCCCCTGCTGTCCATTCCTTATTCCATAGAAAAGCCTTGACTTGAGGTTAGATTTTTTTTATATTTTGTTTTGTGTTATTTTTTTCTTTAACATCCCTAAAATTTTCCTTACATGTTTTACTAGCCAGATTTTTCCTCCTCTCCTGACTACTCCCAGTCATAGCTGTCCCTCTTCTCTTATGGAGATC	71
소 성장 호르몬 (pAGH-Bt - 버전 1)	TTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAATACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGGTACCCAGGTGCTGAAGAATTGACCCGGTTCCTCCTGGG	72
소 성장 호르몬 (pAGH-Bt - 버전 2)	TTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGGTACCCAGGTGCTGAAGAATTGACCCGGTTCCTCCTGGG	73
소 성장 호르몬 (pAGH-Bt - 버전 3)	CTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGG	74
인간 성장 호르몬 (pAGH-Hs)	CTGCCCGGGTGGCATCCCTGTGACCCCTCCCCAGTGCCTCTCCTGGCCCTGGAAGTTGCCACTCCAGTGCCCACCAGCCTTGTCCTAATAAAATTAAGTTGCATCATTTTGTCTGACTAGGTGTCCTTCTATAATATTATGGGGTGGAGGGGGGTGGTATGGAGCAAGGGGCCCAAGTTGGGAAGAAACCTGTAGGGCCTGC	75

예시적인 벡터 게놈은 도 1 내지 도 4에 도시되어 있고, 서열번호 12-15로서 제공되어 있다. 대문자로 표시된 각 서열의 발현 카세트는 서열번호 8-11이다. 일부 실시예에서, 벡터 게놈은 서열번호 8-11 중 어느 하나와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 공유하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 구성되거나, 이로 구성되며, 선택적으로 소문자로 표시된 ITR 서열을 포함하거나 포함하지 않는다. 코딩 서열은 대문자로 표기된다.

아데노-연관 바이러스 벡터

아데노-연관 바이러스(AAV)는 복제-결핍 파보바이러스이며, 이의 단일-가닥 DNA 게놈은 2개의 ~145-뉴클레오티드 역위 말단 반복(ITR)을 포함하여 약 4.7 kb 길이이다. 항원 에피토프에 의해 분류될 때, 때때로 혈청형으로도 불리는, AAV의 다수의 공지된 변이체가 존재한다. AAV 혈청형의 게놈의 뉴클레오티드 서열은 알려져 있다. 예를 들어, AAV-1의 전체 게놈은 GenBank 수탁 번호 NC_002077에 제공되며; AAV-2의 전체 게놈은 GenBank 수탁 번호 NC_001401 및 Srivastava 등의 J. Virol., 45: 555-564 (1983)에 제공되며; AAV-3의 전체 게놈은 GenBank 수탁 번호 NC_1829에 제공되며; AAV-4의 전체 게놈은 GenBank 수탁 번호 NC_001829에 제공되며; AAV-5 게놈은 GenBank 수탁 번호 AF085716에 제공되며; AAV-6의 전체 게놈은 GenBank 수탁 번호 NC_00 1862에 제공되며; AAV-7 및 AAV-8 게놈의 적어도 일부는 GenBank 수탁 번호 AX753246 및 AX753249에 각각 제공되며; AAV-9 게놈은 Gao 등의 J. Virol., 78: 6381-6388 (2004)에 제공되며; AAV-10 게놈은 Mol. Ther., 13(1): 67-76 (2006)에 제공되며; 그리고 AAV-11 게놈은 Virology, 330(2): 375-383 (2004)에 제공된다. AAVrh.74 게놈의 서열은 본원에 참조로서 통합된, 미국 특허 제9,434,928호에 제공된다. 바이러스 DNA 복제(rep), 캡슐화/패키징 및 숙주 세포 염색체 통합을 지시하는 시스-작용 서열은 AAV ITR 내에 포함된다. 3개의 AAV 프로모터(상대 맵 위치에 대해 p5, p19 및 p40으로 명명됨)는 rep 및 cap 유전자를 암호화하는 2개의 AAV 내부 개방 해독 프레임의 발현을 유도한다. (뉴클레오티드 2107 및 2227에서) 단일 AAV 인트론의 차등적 스플라이싱과 결합된, 2개의 rep 프로모터(p5 및 p19)는 rep 유전자로부터 4개의 rep 단백질(rep78, rep68, rep52 및 rep40)을 생산한다. Rep 단백질은 궁극적으로 바이러스 게놈의 복제를 담당하는 다수의 효소 특성을 갖는다. cap 유전자는 p40 프로모터로부터 발현되고, 이는 3개의 캡시드 단백질 VP1, VP2, 및 VP3을 암호화한다. 대체 스플라이싱 및 비-컨센서스의 번역 시작 부위는 3개의 관련 캡시드 단백질의 생산을 담당한다. 단일 컨센서스 폴리아데닐화 부위는 AAV 게놈의 맵 위치 95에 위치한다. AAV의 수명 주기 및 유전학은 Muzyczka, Current Topics in Microbiology and Immunology, 158: 97-129 (1992)에서 검토된다.

AAV는, 예를 들어 유전자 요법에서 외래 DNA를 세포에 전달하기 위한 벡터로서 이를 매력적으로 만드는 고유한 특징을 갖는다. 배양물 내 세포의 AAV 감염은 비세포병변성이며, 인간 및 다른 동물의 자연 감염은 조용하고 무증상이다. 또한, AAV는 많은 포유류 세포를 감염시켜 많은 상이한 조직을 생체 내에서 표적화할 가능성을 허용한다. 또한, AAV는 서서히 분열하고 비분열 세포를 형질도입하며, 본질적으로 전사적으로 활성인 핵 에피솜(염색체 외 요소)으로서 이들 세포의 수명 동안 지속될 수 있다. AAV 프로바이러스 게놈은 플라스미드에 클로닝된 DNA로서 삽입되어, 재조합 게놈의 구축을 가능하게 한다. 또한, AAV 복제 및 게놈 캡슐화를 지시하는 신호가 AAV 게놈의 ITR 내에 포함되기 때문에, 게놈의 내부 약 4.3 kb의 일부 또는 전부(복제 및 구조적 캡시드 단백질, rep-cap을 암호화함)가 외래 DNA로 대체될 수 있다. AAV 벡터를 생성하기 위해, rep 및 cap 단백질이 트랜스로 제공될 수 있다. AAV의 또 다른 중요한 특징은 AAV가 매우 안정적이고 왕성한 바이러스라는 것이다. 이는 아데노바이러스를 불활성화하는 데 사용되는 조건(56° 내지 65°C에서 수시간 동안)을 쉽게 견디어 AAV의 저온 보존을 덜 중요하게 한다. AAV는 심지어 동결건조될 수도 있다. 마지막으로, AAV-감염 세포는 중복감염에 내성이 없다.

본 발명의 실시에 유용한 유전자 전달 바이러스 벡터는 분자 생물학 분야에 잘 알려진 방법론을 사용하여 작제될 수 있다. 일반적으로, 이식유전자를 운반하는 바이러스 벡터는 이식유전자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 적절한 조절 요소 및 세포 형질도입을 매개하는 바이러스 단백질의 생산에 필요한 요소로부터 조립된다. 이러한 재조합 바이러스는 당업계에 공지된 기술에 의해, 예를 들어, 패키징 세포를 형질감염시키거나 헬퍼 플라스미드 또는 바이러스로 일시적 형질감염시켜 생산될 수 있다. 바이러스 패키징 세포의 일반적인 예로는 HeLa 세포, SF9 세포(선택적으로 바큘로바이러스 헬퍼 벡터 포함), 293 세포 등을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 헤르페스바이러스-기반 시스템은 US20170218395A1에 기술된 바와 같이 AAV 벡터를 생산하는 데 사용될 수 있다. 이러한 복제-결함 재조합 바이러스를 생산하기 위한 상세한 프로토콜은, 예를 들어, W095/14785, W096/22378, 미국 특허 제5,882,877호, 미국 특허 제6,013,516호, 미국 특허 제4,861,719호, 미국 특허 제5,278,056호 및 W094/19478에 기술되어 있으며, 이들 각각의 전체 내용은 참조로서 본원에 통합된다.

본 발명의 실시에 유용한 AAV 벡터는 아데노바이러스-기반 및 헬퍼-프리 시스템을 포함하는 다양한 시스템을 사용하여 AAV 비리온(바이러스 입자)에 패키징될 수 있다. AAV 생물학에서의 표준 방법은 Kwon 및 Schaffer에 기술된 것을 포함한다. Pharm Res. (2008) 25(3):489-99; Wu 등 Mol. Ther. (2006) 14(3):316-27. Burger 등 Mol. Ther. (2004) 10(2):302-17; Grimm 등 Curr Gene Ther. (2003) 3(4):281-304; Deyle DR, Russell DW. Curr Opin Mol Ther. (2009) 11(4):442-447; McCarty 등 Gene Ther. (2001) 8(16):1248-54; 및 Duan 등 Mol Ther. (2001) 4(4):383-91. 헬퍼-프리 시스템에는 미국 특허 제6,004,797호; 미국 특허 제7,588,772호; 및 미국 특허 제7,094,604호에 기술된 것들이 포함되었고;

rAAV 게놈 내의 AAV DNA는 AAV 변이체 또는 혈청형 AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8, AAV-9, AAV-10, AAV-11, AAV-12, AAV-13 및 AAVrh10을 포함하지만 이에 한정되지 않는, 재조합 바이러스가 유도될 수 있는 임의의 AAV 변이체 또는 혈청형으로부터 유래될 수 있다. 위형화된 rAAV의 생산은, 예를 들어 WO 01/83692에 개시되어 있다. 다른 유형의 rAAV 변이체, 예를 들어 캡시드 돌연변이를 갖는 rAAV 또한 고려된다. 예를 들어, Marsic 등의 Molecular Therapy, 22(11): 1900-1909 (2014) 참조. 다양한 AAV 혈청형의 게놈의 뉴클레오티드 서열은 당 기술분야에 공지되어 있다.

일부 경우에, rAAV는 자가-상보적 게놈을 포함한다. 본원에서 정의된 바와 같이, "자기-상보적" 또는 "이중 가닥" 게놈을 포함하는 rAAV는, McCarty 등에 기재된 바와 같이, rAAV의 코딩 영역이 분자내 이중 가닥 DNA 주형을 형성하도록 구성되도록 조작된 rAAV를 지칭한다. 자가-상보적 재조합 아데노-연관 바이러스(scAAV) 벡터는 DNA 합성과 독립적으로 효율적인 형질도입을 촉진한다. Gene Therapy. 8 (16): 1248-54 (2001). 본 개시는, 일부 경우에, 자가-상보적 게놈을 포함하는 rAAV의 사용을 고려하는데, 그 이유는 감염(이러한 형질도입) 시, rAAV 게놈의 제2 가닥의 세포 매개 합성을 기다리기 보다는, 즉시 복제 및 전사할 준비가 된 하나의 이중 가닥 DNA(dsDNA) 유닛을 형성하기 위해 scAAV의 2개의 상보적 절반이 연관시킬 것이기 때문이다. rAAV(4.7-6 kb)에서 발견되는 전체 코딩 용량 대신에, 자가-상보적 게놈을 포함하는 rAAV는 그 양의 약 절반(

2.4 kb)만 보유할 수 있다는 것을 이해할 것이다.

다른 경우에, rAAV 벡터는 단일 가닥 게놈을 포함한다. 본원에서 정의된 바와 같이, "단일 표준" 게놈은 자가-상보적이지 않은 게놈을 지칭한다. 대부분의 경우, 비-재조합 AAV는 단일 가닥 DNA 게놈을 갖는다. 세포의 효율적인 형질도입을 달성하기 위해 rAAV가 scAAV가 되어야 한다는 몇 가지 징후가 있었다. 그러나, 본 개시는, rAAV 벡터의 다른 유전적 변형이 표적 세포에서 최적의 유전자 전사를 얻는 데 유익할 수 있다는 것을 이해하면서, 자가-상보적 게놈보다는 단일 가닥 게놈을 가질 수 있는 rAAV 벡터를 고려한다. 일부 경우에, 본 개시는 마우스 눈의 전방 분절로의 효율적인 유전자 전달을 달성할 수 있는 단일 가닥 rAAV 벡터에 관한 것이다. Wang 등 참조. 단일 가닥 아데노-연관 바이러스는 마우스 눈의 앞부분으로 효율적인 유전자 전달을 달성한다. PLoS ONE 12(8): e0182473 (2017).

일부 경우에, rAAV 벡터는 혈청형 AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAVrh10, 또는 AAVrh74이다. 위형화된 rAAV의 생산은, 예를 들어 WO- 01/83692에 개시되어 있다. 다른 유형의 rAAV 변이체, 예를 들어 캡시드 돌연변이를 갖는 rAAV 또한 고려된다. 예를 들어, Marsic 등의 Molecular Therapy, 22(11): 1900-1909 (2014) 참조. 일부 경우에, rAAV 벡터는 혈청형 AAV9이다. 일부 실시예에서, rAAV 벡터는 혈청형 AAV9이고 단일 가닥 게놈을 포함한다. 일부 실시예에서, rAAV 벡터는 혈청형 AAV9이고 자가-상보적 게놈을 포함한다. 일부 실시예에서, rAAV 벡터는 AAV2의 역위 말단 반복(ITR) 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, rAAV 벡터는 rAAV 벡터가 AAV-2/9 벡터, AAV-2/6 벡터, 또는 AAV-2/8 벡터가 되도록, AAV2 게놈을 포함한다.

대부분의 공지된 AAV에 대한 캡시드 유전자에 대한 전장 서열 및 서열은 미국 특허 제8,524,446호에 제공되며, 이는 그 전체가 본원에 통합된다.

AAV 벡터는 야생형 AAV 서열을 포함할 수 있거나, 야생형 AAV 서열에 대한 하나 이상의 변형을 포함할 수 있다. 소정의 실시예에서, AAV 벡터는 캡시드 단백질, 예를 들어, VP1, VP2 및/또는 VP3 내에 하나 이상의 아미노산 변형, 예를 들어, 치환, 결실 또는 삽입을 포함한다. 특정 실시예에서, 변형은 AAV 벡터가 대상체에게 제공될 때 감소된 면역원성을 제공한다.

rAAV의 캡시드 단백질은, rAAV가 내피 세포 또는 보다 구체적으로는 내피 팁 세포와 같은 관심 있는 특정 표적 조직에 표적화되도록 변형될 수 있다. 일부 실시예에서, rAAV는 대상체의 뇌실내 공간에 직접 주사된다.

일부 실시예에서, rAAV 비리온은 AAV2 rAAV 비리온이다. 캡시드는 대부분 AAV2 캡시드 또는 이의 기능적 변이체이다. 일부 실시예에서, AAV2 캡시드는 기준 AAV2 캡시드, 예를 들어,

MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEHSPVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTNTMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTNTPSGTTTQSRLQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEYSWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKTNVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNRQAATADVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL

(서열번호 76)와 적어도 98%, 99% 또는 100% 동일성을 공유한다.

일부 실시예에서, rAAV 비리온은 AAV9 rAAV 비리온이다. 캡시드는 대부분 AAV9 캡시드 또는 이의 기능적 변이체이다. 일부 실시예에서, AAV9 캡시드는 기준 AAV9 캡시드, 예를 들어,

MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALKPGAPQPKANQQHQDNARGLVLPGYKYLGPGNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRLLEPLGLVEEAAKTAPGKKRPVEQSPQEPDSSAGIGKSGAQPAKKRLNFGQTGDTESVPDPQPIGEPPAAPSGVGSLTMASGGGAPVADNNEGADGVGSSSGNWHCDSQWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNSTSGGSSNDNAYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTDNNGVKTIANNLTSTVQVFTDSDYQLPYVLGSAHEGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNDGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFSYEFENVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSKTINGSGQNQQTLKFSVAGPSNMAVQGRNYIPGPSYRQQRVSTTVTQNNNSEFAWPGASSWALNGRNSLMNPGPAMASHKEGEDRFFPLSGSLIFGKQGTGRDNVDADKVMITNEEEIKTTNPVATESYGQVATNHQSAQAQAQTGWVQNQGILPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGMKHPPPQILIKNTPVPADPPTAFNKDKLNSFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSNNVEFAVNTEGVYSEPRPIGTRYLTRNL

(서열번호 77)와 적어도 98%, 99% 또는 100% 동일성을 공유한다.

일부 실시예에서, rAAV 비리온은 AAV6 rAAV 비리온이다. 캡시드는 대부분 AAV9 캡시드 또는 이의 기능적 변이체이다. 일부 실시예에서, AAV6 캡시드는 기준 AAV6 캡시드, 예를 들어,

MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWDLKPGAPKPKANQQKQDDGRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLRYNHADAEFQERLQEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPFGLVEEGAKTAPGKKRPVEQSPQEPDSSSGIGKTGQQPAKKRLNFGQTGDSESVPDPQPLGEPPATPAAVGPTTMASGGGAPMADNNEGADGVGNASGNWHCDSTWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSASTGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTTNDGVTTIANNLTSTVQVFSDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLNRTQNQSGSAQNKDLLFSRGSPAGMSVQPKNWLPGPCYRQQRVSKTKTDNNNSNFTWTGASKYNLNGRESIINPGTAMASHKDDKDKFFPMSGVMIFGKESAGASNTALDNVMITDEEEIKATNPVATERFGTVAVNLQSSSTDPATGDVHVMGALPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPPAEFSATKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEVQYTSNYAKSANVDFTVDNNGLYTEPRPIGTRYLTRPL

(서열번호 78)와 적어도 98%, 99% 또는 100% 동일성을 공유한다.

일부 실시예에서, rAAV 비리온은 AAVrh.10 rAAV 비리온이다. 캡시드는 대부분 AAV9 캡시드 또는 이의 기능적 변이체이다. 일부 실시예에서, AAVrh.10 캡시드는 기준 AAVrh.10 캡시드, 예를 들어,

MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWDLKPGAPKPKANQQKQDDGRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLRYNHADAEFQERLQEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEGAKTAPGKKRPVEPSPQRSPDSSTGIGKKGQQPAKKRLNFGQTGDSESVPDPQPIGEPPAGPSGLGSGTMAAGGGAPMADNNEGADGVGSSSGNWHCDSTWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNGTSGGSTNDNTYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNEGTKTIANNLTSTIQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFEFSYQFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTQSTGGTAGTQQLLFSQAGPNNMSAQAKNWLPGPCYRQQRVSTTLSQNNNSNFAWTGATKYHLNGRDSLVNPGVAMATHKDDEERFFPSSGVLMFGKQGAGKDNVDYSSVMLTSEEEIKTTNPVATEQYGVVADNLQQQNAAPIVGAVNSQGALPGMVWQNRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPADPPTTFSQAKLASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSTNVDFAVNTDGTYSEPRPIGTRYLTRNL

(서열번호 79)와 적어도 98%, 99% 또는 100% 동일성을 공유한다.

일부 실시예에서, 캡시드 단백질은 전달 플라스미드에 트랜스로 플라스미드 상에 공급된 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된다. 야생형 AAVrh74 cap의 폴리뉴클레오티드 서열은 다음과 같다:

AAVrh74 캡시드 코딩 서열 (서열번호 80)

ATGGCTGCCGATGGTTATCTTCCAGATTGGCTCGAGGACAACCTCTCTGAGGGCATTCGCGAGTGGTGGGACCTGAAACCTGGAGCCCCGAAACCCAAAGCCAACCAGCAAAAGCAGGACAACGGCCGGGGTCTGGTGCTTCCTGGCTACAAGTACCTCGGACCCTTCAACGGACTCGACAAGGGGGAGCCCGTCAACGCGGCGGACGCAGCGGCCCTCGAGCACGACAAGGCCTACGACCAGCAGCTCCAAGCGGGTGACAATCCGTACCTGCGGTATAATCACGCCGACGCCGAGTTTCAGGAGCGTCTGCAAGAAGATACGTCTTTTGGGGGCAACCTCGGGCGCGCAGTCTTCCAGGCCAAAAAGCGGGTTCTCGAACCTCTGGGCCTGGTTGAATCGCCGGTTAAGACGGCTCCTGGAAAGAAGAGACCGGTAGAGCCATCACCCCAGCGCTCTCCAGACTCCTCTACGGGCATCGGCAAGAAAGGCCAGCAGCCCGCAAAAAAGAGACTCAATTTTGGGCAGACTGGCGACTCAGAGTCAGTCCCCGACCCTCAACCAATCGGAGAACCACCAGCAGGCCCCTCTGGTCTGGGATCTGGTACAATGGCTGCAGGCGGTGGCGCTCCAATGGCAGACAATAACGAAGGCGCCGACGGAGTGGGTAGTTCCTCAGGAAATTGGCATTGCGATTCCACATGGCTGGGCGACAGAGTCATCACCACCAGCACCCGCACCTGGGCCCTGCCCACCTACAACAACCACCTCTACAAGCAAATCTCCAACGGGACCTCGGGAGGAAGCACCAACGACAACACCTACTTCGGCTACAGCACCCCCTGGGGGTATTTTGACTTCAACAGATTCCACTGCCACTTTTCACCACGTGACTGGCAGCGACTCATCAACAACAACTGGGGATTCCGGCCCAAGAGGCTCAACTTCAAGCTCTTCAACATCCAAGTCAAGGAGGTCACGCAGAATGAAGGCACCAAGACCATCGCCAATAACCTTACCAGCACGATTCAGGTCTTTACGGACTCGGAATACCAGCTCCCGTACGTGCTCGGCTCGGCGCACCAGGGCTGCCTGCCTCCGTTCCCGGCGGACGTCTTCATGATTCCTCAGTACGGGTACCTGACTCTGAACAATGGCAGTCAGGCTGTGGGCCGGTCGTCCTTCTACTGCCTGGAGTACTTTCCTTCTCAAATGCTGAGAACGGGCAACAACTTTGAATTCAGCTACAACTTCGAGGACGTGCCCTTCCACAGCAGCTACGCGCACAGCCAGAGCCTGGACCGGCTGATGAACCCTCTCATCGACCAGTACTTGTACTACCTGTCCCGGACTCAAAGCACGGGCGGTACTGCAGGAACTCAGCAGTTGCTATTTTCTCAGGCCGGGCCTAACAACATGTCGGCTCAGGCCAAGAACTGGCTACCCGGTCCCTGCTACCGGCAGCAACGCGTCTCCACGACACTGTCGCAGAACAACAACAGCAACTTTGCCTGGACGGGTGCCACCAAGTATCATCTGAATGGCAGAGACTCTCTGGTGAATCCTGGCGTTGCCATGGCTACCCACAAGGACGACGAAGAGCGATTTTTTCCATCCAGCGGAGTCTTAATGTTTGGGAAACAGGGAGCTGGAAAAGACAACGTGGACTATAGCAGCGTGATGCTAACCAGCGAGGAAGAAATAAAGACCACCAACCCAGTGGCCACAGAACAGTACGGCGTGGTGGCCGATAACCTGCAACAGCAAAACGCCGCTCCTATTGTAGGGGCCGTCAATAGTCAAGGAGCCTTACCTGGCATGGTGTGGCAGAACCGGGACGTGTACCTGCAGGGTCCCATCTGGGCCAAGATTCCTCATACGGACGGCAACTTTCATCCCTCGCCGCTGATGGGAGGCTTTGGACTGAAGCATCCGCCTCCTCAGATCCTGATTAAAAACACACCTGTTCCCGCGGATCCTCCGACCACCTTCAATCAGGCCAAGCTGGCTTCTTTCATCACGCAGTACAGTACCGGCCAGGTCAGCGTGGAGATCGAGTGGGAGCTGCAGAAGGAGAACAGCAAACGCTGGAACCCAGAGATTCAGTACACTTCCAACTACTACAAATCTACAAATGTGGACTTTGCTGTCAATACTGAGGGTACTTATTCCGAGCCTCGCCCCATTGGCACCCGTTACCTCACCCGTAATCTGTAA

본 개시는 서열번호 2-4, 및 이의 상동체 또는 기능적 변이체를 포함하는, AAVrh74 VP1, VP2, 및 VP3에 대한 단백질 서열을 추가로 제공한다.

AAVrh74 VP1 (서열번호 81)

MAAGGGAPMADNNEGADGVGSSSGNWHCDSTWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNGTSGGSTNDNTYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNEGTKTIANNLTSTIQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFEFSYNFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTQSTGGTAGTQQLLFSQAGPNNMSAQAKNWLPGPCYRQQRVSTTLSQNNNSNFAWTGATKYHLNGRDSLVNPGVAMATHKDDEERFFPSSGVLMFGKQGAGKDNVDYSSVMLTSEEEIKTTNPVATEQYGVVADNLQQQNAAPIVGAVNSQGALPGMVWQNRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPADPPTTFNQAKLASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSTNVDFAVNTEGTYSEPRPIGTRYLTRNL

AAVrh74 VP2 (서열번호 82)

STIQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFEFSYNFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTQSTGGTAGTQQLLFSQAGPNNMSAQAKNWLPGPCYRQQRVSTTLSQNNNSNFAWTGATKYHLNGRDSLVNPGVAMATHKDDEERFFPSSGVLMFGKQGAGKDNVDYSSVMLTSEEEIKTTNPVATEQYGVVADNLQQQNAAPIVGAVNSQGALPGMVWQNRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPADPPTTFNQAKLASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSTNVDFAVNTEGTYSEPRPIGTRYLTRNL

AAVrh74 VP3 (서열번호 83)

RTGNNFEFSYNFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTQSTGGTAGTQQLLFSQAGPNNMSAQAKNWLPGPCYRQQRVSTTLSQNNNSNFAWTGATKYHLNGRDSLVNPGVAMATHKDDEERFFPSSGVLMFGKQGAGKDNVDYSSVMLTSEEEIKTTNPVATEQYGVVADNLQQQNAAPIVGAVNSQGALPGMVWQNRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPADPPTTFNQAKLASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSTNVDFAVNTEGTYSEPRPIGTRYLTRNL

소정의 경우에, AAVrh74 캡시드는 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, rAAV 벡터는 예를 들어, 서열번호 2에 제시된 AAVrh74 VP1의 아미노산 서열과 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 또는 89%, 보다 일반적으로 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 동일한, 서열을 포함하거나, 이들로 필수적으로 구성되거나, 이들로 추가로 구성되는 폴리펩티드를 포함한다. 　 일부 실시예에서, rAAV 벡터는 예를 들어, 서열번호 3에 제시된 AAVrh74 VP2의 아미노산 서열과 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 또는 89%, 보다 일반적으로 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 동일한, 서열을 포함하거나, 이들로 필수적으로 구성되거나, 이들로 추가로 구성되는 폴리펩티드를 포함한다. 　 일부 실시예에서, rAAV 벡터는 서열, 예를 들어, 서열번호 4에 제시된 AAVrh74 VP3의 아미노산 서열과 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 또는 89%, 보다 일반적으로 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 동일한, 서열을 포함하거나, 이들로 필수적으로 구성되거나, 이들로 추가로 구성되는 폴리펩티드를 포함한다. 　

일부 실시예에서, rAAV 비리온은 AAV-PHP.B rAAV 비리온 또는 이의 호중구 변이체, 예컨대 제한 없이 국제 특허 공개 번호 WO 2015/038958 A1 및 WO 2017/100671 A1에 개시된 것들이다. 예를 들어, AAV 캡시드는 서열 TLAVPFK(서열번호 85) 또는 KFPVALT(서열번호 86)로부터 적어도 4개의 연속 아미노산을 포함할 수 있으며, 예를 들어, AAV9의 아미노산 588 및 589를 암호화하는 서열 사이에 삽입되어 있다.

캡시드는 대부분 AAV-PHP.B 캡시드 또는 이의 기능적 변이체이다. 일부 실시예에서, AAV-PHP.B 캡시드는 기준 AAV-PHP.B 캡시드, 예를 들어,

MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALKPGAPQPKANQQHQDNARGLVLPGYKYLGPGNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRLLEPLGLVEEAAKTAPGKKRPVEQSPQEPDSSAGIGKSGAQPAKKRLNFGQTGDTESVPDPQPIGEPPAAPSGVGSLTMASGGGAPVADNNEGADGVGSSSGNWHCDSQWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNSTSGGSSNDNAYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTDNNGVKTIANNLTSTVQVFTDSDYQLPYVLGSAHEGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNDGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFSYEFENVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTINGSGQNQQTLKFSVAGPSNMAVQGRNYIPGPSYRQQRVSTTVTQNNNSEFAWPGASSWALNGRNSLMNPGPAMASHKEGEDRFFPLSGSLIFGKQGTGRDNVDADKVMITNEEEIKTTNPVATESYGQVATNHQSAQTLAVPFKAQAQTGWVQNQGILPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGMKHPPPQILIKNTPVPADPPTAFNKDKLNSFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSNNVEFAVNTEGVYSEPRPIGTRYLTRNL

(서열번호 84)와 적어도 98%, 99% 또는 100% 동일성을 공유한다.

본 개시의 rAAV 비리온에 사용된 추가 AAV 캡시드는 특허 공개 번호 WO 2009/012176 A2 및 WO 2015/168666 A2에 개시된 것을 포함한다.

이론에 구속되지 않고, 본 발명자들은 AAV9 벡터, AAVrh.74, 또는 AAVrh.10 벡터가 벡터에 바람직한 심장 향성을 부여할 것이라고 결정하였다. 이론에 구속되지 않고, 본 발명자들은 AAV9 벡터, AAVrh.74, 또는 AAVrh.10 벡터가 심장 세포에 원하는 특이성을 제공할 수 있는 것으로 추가로 결정하였다.

약학적 조성물 및 키트

일 측면에서, 본 개시는 본 개시의 rAAV 비리온 및 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.

투여 목적을 위해, 예를 들어, 주사에 의해, 멸균 수용액과 같은, 다양한 용액이 사용될 수 있다. 이러한 수용액은 원하는 경우 완충될 수 있고, 액체 희석제는 식염수 또는 포도당으로 등장성으로 된다. 유리 산(DNA는 산성 인산염기를 함유함) 또는 약리학적으로 허용 가능한 염으로서의 rAAV의 용액은, 예를 들어, 0.001% 또는 0.01%로, 폴록사머 188과 같은 계면활성제와 적절히 혼합된 물에서 제조될 수 있다. rAAV의 분산액은 또한 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜 및 이들의 혼합물 및 오일에서 제조될 수 있다. 일반적인 보관 및 사용 조건 하에서, 이들 제제는 미생물의 성장을 방지하기 위한 보존제를 함유한다. 이와 관련하여, 사용된 멸균 수성 매질은 당해 기술분야의 통상의 기술을 가진 자에게 주지된 표준 기술에 의해 모두 쉽게 수득될 수 있다.

주사용에 적합한 약학적 형태는 멸균 수용액 또는 분산액 및 멸균 주사용 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 모든 경우에, 형태는 멸균 상태이고, 쉽게 주사할 수 있는 정도로 유동적이어야 한다. 이는 제조 및 보관 조건 하에서 안정적이어야 하며, 박테리아 및 곰팡이와 같은 미생물의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다. 담체는, 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 적절한 혼합물, 및 식물성 오일을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은, 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅의 사용에 의해, 분산액의 경우에 요구되는 입자 크기의 유지에 의해, 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물의 작용을 예방하는 것은 다양한 항균제 및 항진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 등에 의해 이루어질 수 있다. 많은 경우에, 당류 또는 염화나트륨과 같은 등장화제를 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사용 조성물의 연장된 흡수는 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴의 사용에 의해 이루어질 수 있다.

멸균 주사용 용액은 필요에 따라 위에 열거된 다양한 다른 성분과 함께 적절한 용매에 필요한 양으로 rAAV를 혼입한 후 필터 멸균하여 제조할 수 있다. 일반적으로, 분산액은 멸균된 활성 성분을, 염기성 분산 매질 및 상기 열거된 것들로부터 요구되는 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클에 혼입함으로써 제조된다. 멸균 주사용 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 활성 성분에 이전에 멸균 여과된 용액으로부터 임의의 원하는 추가 성분을 더한 분말을 생성하는 진공 건조 및 동결건조 기술이다.

또 다른 측면에서, 본 개시는 본 개시의 rAAV 비리온 및 사용 지침을 포함하는 키트를 포함한다.

사용 방법

일 측면에서, 본 개시는 세포에서 MLP 활성을 증가시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 개시의 rAAV와 세포를 접촉시키는 단계를 포함한다. 또 다른 측면에서, 본 개시는 대상체에서 MLP 활성을 증가시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 개시의 rAAV에 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시예에서, 세포 및/또는 대상체는 CSRP3 전령 RNA 또는 MLP 단백질 발현 수준 및/또는 활성이 결핍되어 있고/있거나 CSRP3의 기능 상실 돌연변이를 포함한다. 세포는 심장 세포, 예를 들어, 심근 세포일 수 있다.

일부 실시예에서, 상기 방법은 심장 세포, 예를 들어, 세포 배양 및/또는 생체 내에서, 심근 세포의 생존을 촉진한다. 일부 실시예에서, 상기 방법은 심장의 기능을 촉진 및/또는 회복시킨다.

치료 방법

또 다른 측면에서, 본 개시는 질환 또는 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에서 이를 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 개시의 rAAV 비리온의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시예에서, 질환 또는 장애는 심장 질환 또는 장애이다. 예시적인 심장 장애는 심부전, 비대성 심근병증, 및 확장성 심근병증을 포함한다. 일부 실시예에서, 대상체는 CSRP3 발현 또는 기능의 유전자 파괴를 겪는다. 일부 실시예에서, 질환 또는 장애는 HCM 또는 DCM이다. 일부 실시예에서, 질환 또는 장애는 가족성 비대성 심근병증-12(CMH12)이다. 일부 실시예에서, 질환 또는 장애는 확장성 심근병증-1M(CMD1M)이다. 일부 실시예에서, 질환 또는 장애는 골격 근병증이다. 일부 실시예에서, 질환 또는 장애는 얼굴 견갑상완 근이영양증, 네말린 근병증, 또는 지대 근이영양증 2B형이다. 일부 실시예에서, 질환 또는 장애는 지대 근이영양증 2A형, 뒤시엔느 근이영양증, 또는 피부근염이다.

심장으로의 AAV 매개 MLP 단백질 전달은 수명을 증가시키고, 심장 세포 변성, 심부전, 흉터, 박출 계수 감소, 부정맥, 협심증, 폐쇄성 HCM 또는 DCM, 심실 비대(IVS: 범위 14-32 mm), 심실 빈맥, 경증 NYHA 점수 I-II 공통, 운동 불내성, 협심증 (흉통), 갑작스러운 심장사, 운동성 근육통 및 경련을 예방하거나 약화시킬 수 있다.

본원에 개시된 방법은 심장에서 효율적인 생체분포를 제공할 수 있다. 이들은 심장 세포, 예를 들어, 심근 세포의 전부 또는 실질적인 분획에서 지속적인 발현을 초래할 수 있다. 특히, 본원에 개시된 방법은 AAV 벡터 투여 후 대상체의 수명 전반에 걸쳐 MLP 단백질의 장기적인 발현을 제공할 수 있다.

병용 요법 또한 본 발명에 의해 고려된다. 신규한 요법과의 조합에서와 마찬가지로, 표준 의학적 치료(예: 코르티코스테로이드 또는 국소 감압 약물)와 본 발명의 방법의 조합이 구체적으로 고려된다. 일부 경우에, 대상체는 본원에서 설명되는 rAAV의 투여에 대한 면역 반응을 예방하거나 감소시키기 위해 스테로이드 및/또는 면역 억제제의 조합으로 치료될 수 있다.

일부 실시예에서, AAV 벡터는 대상체의 총 체질량 킬로그램 당 AAV 벡터(vg/kg)의 약 1Х10¹² 내지 5Х10¹⁴ 벡터 게놈(vg)의 투여량으로 투여된다. 일부 실시예에서, AAV 벡터는 약 1Х10¹³ 내지 5Х10¹⁴ vg/kg의 투여량으로 투여된다. 일부 실시예에서, AAV 벡터는 약 5Х10¹³ 내지 3Х10¹⁴ vg/kg의 투여량으로 투여된다. 일부 실시예에서, AAV 벡터는 약 5Х10¹³ 내지 1Х10¹⁴ vg/kg의 투여량으로 투여된다. 일부 실시예에서, AAV 벡터는 약 1Х10¹² vg/kg 미만, 약 3Х10¹² vg/kg 미만, 약 5Х10¹² vg/kg 미만, 약 7Х10¹² vg/kg 미만, 약 1Х10¹³ vg/kg 미만, 약 3Х10¹³ vg/kg 미만, 약 5Х10¹³ vg/kg 미만, 약 7Х10¹³ vg/kg 미만, 약 1Х10¹⁴ vg/kg 미만, 약 3Х10¹⁴ vg/kg 미만, 약 5Х10¹⁴ vg/kg 미만, 약 7Х10¹⁴ vg/kg 미만, 약 1Х10¹⁵ vg/kg 미만, 약 3Х10¹⁵ vg/kg 미만, 약 5Х10¹⁵ vg/kg 미만, 또는 약 7Х10¹⁵ vg/kg 미만의 투여량으로 투여된다.

일부 실시예에서, AAV 벡터는 약 1Х10¹² vg/kg, 약 3Х10¹² vg/kg, 약 5Х10¹² vg/kg, 약 7Х10¹² vg/kg, 약 1Х10¹³ vg/kg, 약 3Х10¹³ vg/kg, 약 5Х10¹³ vg/kg, 약 7Х10¹³ vg/kg, 약 1Х10¹⁴ vg/kg, 약 3Х10¹⁴ vg/kg, 약 5Х10¹⁴ vg/kg, 약 7Х10¹⁴ vg/kg, 약 1Х10¹⁵ vg/kg, 약 3Х10¹⁵ vg/kg, 약 5Х10¹⁵ vg/kg, 또는 약 7Х10¹⁵ vg/kg의 투여량으로 투여된다.

일부 실시예에서, AAV 벡터는 1Х10¹² vg/kg, 3Х10¹² vg/kg, 5Х10¹² vg/kg, 7Х10¹² vg/kg, 1Х10¹³ vg/kg, 3Х10¹³ vg/kg, 5Х10¹³ vg/kg, 7Х10¹³ vg/kg, 1Х10¹⁴ vg/kg, 3Х10¹⁴ vg/kg, 5Х10¹⁴ vg/kg, 7Х10¹⁴ vg/kg, 1Х10¹⁵ vg/kg, 3Х10¹⁵ vg/kg, 5Х10¹⁵ vg/kg, 또는 7Х10¹⁵ vg/kg의 투여량으로 투여된다.

일부 실시예에서, AAV 벡터는 대상체의 총 체질량 킬로그램당 AAV 벡터(vg/kg)의 약 1Х10¹² 내지 5Х10¹⁴ 벡터 게놈(vg)의 투여량으로 전신 투여된다. 일부 실시예에서, AAV 벡터는 약 1Х10¹³ 내지 5Х10¹⁴ vg/kg의 투여량으로 전신 투여된다. 일부 실시예에서, AAV 벡터는 약 5Х10¹³ 내지 3Х10¹⁴ vg/kg의 투여량으로 전신 투여된다. 일부 실시예에서, AAV 벡터는 약 5Х10¹³ 내지 1Х10¹⁴ vg/kg의 투여량으로 전신 투여된다. 일부 실시예에서, AAV 벡터는 약 1Х10¹² vg/kg 미만, 약 3Х10¹² vg/kg 미만, 약 5Х10¹² vg/kg 미만, 약 7Х10¹² vg/kg 미만, 약 1Х10¹³ vg/kg 미만, 약 3Х10¹³ vg/kg 미만, 약 5Х10¹³ vg/kg 미만, 약 7Х10¹³ vg/kg 미만, 약 1Х10¹⁴ vg/kg 미만, 약 3Х10¹⁴ vg/kg 미만, 약 5Х10¹⁴ vg/kg 미만, 약 7Х10¹⁴ vg/kg 미만, 약 1Х10¹⁵ vg/kg 미만, 약 3Х10¹⁵ vg/kg 미만, 약 5Х10¹⁵ vg/kg 미만, 또는 약 7Х10¹⁵ vg/kg 미만의 투여량으로 전신 투여된다.

일부 실시예에서, AAV 벡터는 약 1Х10¹² vg/kg, 약 3Х10¹² vg/kg, 약 5Х10¹² vg/kg, 약 7Х10¹² vg/kg, 약 1Х10¹³ vg/kg, 약 3Х10¹³ vg/kg, 약 5Х10¹³ vg/kg, 약 7Х10¹³ vg/kg, 약 1Х10¹⁴ vg/kg, 약 3Х10¹⁴ vg/kg, 약 5Х10¹⁴ vg/kg, 약 7Х10¹⁴ vg/kg, 약 1Х10¹⁵ vg/kg, 약 3Х10¹⁵ vg/kg, 약 5Х10¹⁵ vg/kg, 또는 약 7Х10¹⁵ vg/kg의 투여량으로 전신 투여된다.

일부 실시예에서, AAV 벡터는 1Х10¹² vg/kg, 3Х10¹² vg/kg, 5Х10¹² vg/kg, 7Х10¹² vg/kg, 1Х10¹³ vg/kg, 3Х10¹³ vg/kg, 5Х10¹³ vg/kg, 7Х10¹³ vg/kg, 1Х10¹⁴ vg/kg, 3Х10¹⁴ vg/kg, 5Х10¹⁴ vg/kg, 7Х10¹⁴ vg/kg, 1Х10¹⁵ vg/kg, 3Х10¹⁵ vg/kg, 5Х10¹⁵ vg/kg, 또는 7Х10¹⁵ vg/kg의 투여량으로 전신 투여된다.

일부 실시예에서, AAV 벡터는 대상체의 총 체질량 킬로그램당 AAV 벡터(vg/kg)의 약 1Х10¹² 내지 5Х10¹⁴ 벡터 게놈(vg)의 투여량으로 정맥내 투여된다. 일부 실시예에서, AAV 벡터는 약 1Х10¹³ 내지 5Х10¹⁴ vg/kg의 투여량으로 정맥내 투여된다. 일부 실시예에서, AAV 벡터는 약 5Х10¹³ 내지 3Х10¹⁴ vg/kg의 투여량으로 정맥내 투여된다. 일부 실시예에서, AAV 벡터는 약 5Х10¹³ 내지 1Х10¹⁴ vg/kg의 투여량으로 정맥내 투여된다. 일부 실시예에서, AAV 벡터는 약 1Х10¹² vg/kg 미만, 약 3Х10¹² vg/kg 미만, 약 5Х10¹² vg/kg 미만, 약 7Х10¹² vg/kg 미만, 약 1Х10¹³ vg/kg 미만, 약 3Х10¹³ vg/kg 미만, 약 5Х10¹³ vg/kg 미만, 약 7Х10¹³ vg/kg 미만, 약 1Х10¹⁴ vg/kg 미만, 약 3Х10¹⁴ vg/kg 미만, 약 5Х10¹⁴ vg/kg 미만, 약 7Х10¹⁴ vg/kg 미만, 약 1Х10¹⁵ vg/kg 미만, 약 3Х10¹⁵ vg/kg 미만, 약 5Х10¹⁵ vg/kg 미만, 또는 약 7Х10¹⁵ vg/kg 미만의 투여량으로 정맥내 투여된다.

일부 실시예에서, AAV 벡터는 약 1Х10¹² vg/kg, 약 3Х10¹² vg/kg, 약 5Х10¹² vg/kg, 약 7Х10¹² vg/kg, 약 1Х10¹³ vg/kg, 약 3Х10¹³ vg/kg, 약 5Х10¹³ vg/kg, 약 7Х10¹³ vg/kg, 약 1Х10¹⁴ vg/kg, 약 3Х10¹⁴ vg/kg, 약 5Х10¹⁴ vg/kg, 약 7Х10¹⁴ vg/kg, 약 1Х10¹⁵ vg/kg, 약 3Х10¹⁵ vg/kg, 약 5Х10¹⁵ vg/kg, 또는 약 7Х10¹⁵ vg/kg의 투여량으로 정맥내 투여된다.

일부 실시예에서, AAV 벡터는 1Х10¹² vg/kg, 3Х10¹² vg/kg, 5Х10¹² vg/kg, 7Х10¹² vg/kg, 1Х10¹³ vg/kg, 3Х10¹³ vg/kg, 5Х10¹³ vg/kg, 7Х10¹³ vg/kg, 1Х10¹⁴ vg/kg, 3Х10¹⁴ vg/kg, 5Х10¹⁴ vg/kg, 7Х10¹⁴ vg/kg, 1Х10¹⁵ vg/kg, 3Х10¹⁵ vg/kg, 5Х10¹⁵ vg/kg, 또는 7Х10¹⁵ vg/kg의 투여량으로 정맥내 투여된다.

기능 개선의 증거, 환자에서의 임상적 이익 또는 효능은 뉴욕 심장 협회 기능 분류(NYHA 클래스)의 변화, 병리학적 심전도, 좌심실 확장기말/수축기말 직경, 최대 심실간 벽 두께, 최대 후방 벽 두께, 피크 E 및 피크 A 속도, 피크 초기 및 피크 후기 승모판 혈류유입 속도, 초기 확장기 및 후기 확장기 조직 도플러 속도, 고혈압 및 심장 비대 정도에 의해 밝혀질 수 있다. 추가적인 심근 조직학은 베이스라인 또는 질환-일치 대조군 환자와 비교하여 심근세포의 비대 감소, 근세포 어레이 감소, 간질 및 혈관주위 섬유증 및 흉터 형성 감소를 보여주면서 AAV 매개 MLP의 이점을 보여줄 것이다.

조성물의 투여

유효 투여량의 조성물의 투여는 전신, 국소, 직접 주사, 정맥내, 심장내 투여를 포함하지만 이에 한정되지 않는, 당 기술분야에서 표준 경로에 의해 이루어질 수 있다. 일부 경우에, 투여는 전신, 국소, 직접 주사, 정맥내, 심장내 주사를 포함한다. 투여는 심장 도관술로 실시할 수 있다.

일부 실시예에서, 본 개시는 본 발명의 rAAV 및 조성물의 유효 투여량의 국소 투여 및 전신 투여를 제공한다. 예를 들어, 전신 투여는 전신이 영향을 받도록 순환계로의 투여일 수 있다. 전신 투여는 주사, 주입 또는 이식을 통한 비경구 투여를 포함한다. 본원에 개시된 조성물에 대한 투여 경로는 정맥내("IV") 투여, 복강내("IP") 투여, 근육내("IM") 투여, 병변내 투여, 또는 피하("SC") 투여, 또는 서방형 장치의 이식, 예를 들어, 미니-삼투압 펌프, 데포 제형 등을 포함한다. 일부 실시예에서, 본 개시의 방법은 본 개시의 AAV 벡터, 또는 이의 약학적 조성물을 정맥내, 근육내, 동맥내, 신장내, 요도내, 심장내, 관상내, 심근내, 피내, 경막외, 피하, 복강내, 뇌실내, 이온영동 또는 두개내 투여로 투여하는 단계를 포함한다.

특히, 본 발명의 rAAV의 투여는 rAAV 재조합 벡터를 동물의 표적 조직 내로 수송할 임의의 물리적 방법을 사용함으로써 달성될 수 있다. 투여는 심장 내로의 주사를 포함하나 이에 한정되지 않는다.

일부 실시예에서, 본 개시의 방법은 심장내 전달을 포함한다. 주입 펌프를 사용하여 특수 캐뉼라, 카테터, 주사기/바늘을 사용하여 주입이 수행될 수 있다. 투여는 유효량의 rAAV 비리온, 또는 rAAV 비리온을 포함하는 약학적 조성물의 심장으로의 전달을 포함할 수 있다. 이들은, 예를 들어, 정맥내, 근육내, 동맥내, 신장내, 요도내, 심장내, 관상내, 심근내, 피내, 경막외, 피하, 복강내, 뇌실내, 이온영동 또는 두개내 투여를 통해 달성될 수 있다. 본 개시의 조성물은 추가로 정맥내 투여될 수 있다.

본원에 개시된 치료 방법은 심실 비대, 심실 빈맥, 경증 NYHA 점수 I-II 공통, 운동 불내성, 및 협심증을 포함하지만 이에 한정되지 않는 하나 이상의 증상을 감소 및/또는 예방할 수 있다.

예

예 1: 전임상 생체활성 및 효능

도 1 내지 도 4에 예시된 벡터를 배양된 심근 세포(예를 들어, 유도된 다능성 줄기 세포 심근 세포, iPSC-CM)를 사용하여 시험관 내에서 시험한다. MLP의 발현을 면역형광법 및 웨스턴 블롯법에 의해 평가한다. 인산화 검정은 단백질 키나아제 C-알파(PKC-A) 자가인산화의 감소를 밝혀낸다.

선택된 벡터를 심근병증의 MLP-결핍 또는 MLP-돌연변이 마우스 모델(예: C58G 녹인(KI) 모델 또는 W4R KI 모델)을 사용하여 생체 내에서 시험한다. 효능은 심장초음파검사를 사용하여 좌심실 박출 계수(LVEF) 및/또는 좌심실 말기 확장기 치수(LVED)를 측정하고, 전체 심장 무게 감소( 예 : 경골 길이로 정규화됨), dP/dt_max, dP/dt_min의 좌심실 성능의 침습적 혈역학적 평가, 및 이완 상수 Tau, 또는 조직학적 평가 시 좌심실 및/또는 우심실 비대증 감소에 의해 결정된다. 추가적으로, 마우스 모델에서의 생체 내 효능은 심방 나트륨이뇨 인자(Nppa) 유전자 발현, 뇌 나트륨이뇨 펩티드(Nppb) 유전자 발현, 및 베타-미오신 중쇄 단백질 발현을 포함하지만 이에 한정되지 않는 바이오마커를 측정함으로써 평가된다. 생리학적 효능은 단백질 키나아제 C-알파(PKC-A) 활성, 심장 내 인산화된 MLP, 유비퀴틴 프로테아좀 분해 활성에 대한 시험에 의해 결정된다. 치료에 반응하여 정규화 또는 완화가 AAV 벡터에 대해 관찰된다.

예 2: 인간 심근세포에서의 단백질 발현

도 1 내지 도 4에 도시된 벡터를 대조군 세포주(CHO-Lec2; 도 5a) 및 배양된 심근세포(분화된 AC16 세포주; 도 5b)를 사용하여 시험관 내에서 시험하였다. 근육 LIM 단백질(MLP;CSRP3에 의해 암호화된 단백질)의 발현을 웨스턴 블롯에 의해 평가하였다.

도 5a는 형질도입된 CHO-Lec2에서 CSRP3 발현을 보여준다. 도 5b는 형질도입된 심근세포(분화된 AC16 세포주 - Sigma-Aldrich® cat# SCC109)에서 CSRP3 발현을 보여준다. 세포를 각 벡터로부터 3E5 MOI로 형질도입하고; 6일 후에 세포를 용해시키고, 항-CSRP3 다클론 항체를 사용하여 웨스턴 블롯을 수행하였다 (Thermo-Fisher® PA5-29155 1:1000).

CSRP3 이식유전자로부터의 MLP 단백질의 발현은 hTNNT2("hTnT") 프로모터가 사용되는 경우보다 MHCK7 프로모터가 사용되는 경우 더 높다. AAV 벡터의 AAV9 및 AAVrh74 혈청형 모두 심근세포 세포주를 형질도입할 수 있다. MLP 단백질의 발현은 도 5b의 데이터에 기초하여 AAV9 벡터의 경우보다 AAVrh74 벡터가 명백히 더 높다.

SEQUENCE LISTING <110> Spacecraft Seven, LLC <120> CSRP3 (CYSTEINE AND GLYCINE RICH PROTEIN 3) GENE THERAPY <130> ROPA-020/01WO 329592-22266 <150> US 63/061,727 <151> 2020-08-05 <160> 86 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 194 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Pro Asn Trp Gly Gly Gly Ala Lys Cys Gly Ala Cys Glu Lys Thr 1 5 10 15 Val Tyr His Ala Glu Glu Ile Gln Cys Asn Gly Arg Ser Phe His Lys 20 25 30 Thr Cys Phe His Cys Met Ala Cys Arg Lys Ala Leu Asp Ser Thr Thr 35 40 45 Val Ala Ala His Glu Ser Glu Ile Tyr Cys Lys Val Cys Tyr Gly Arg 50 55 60 Arg Tyr Gly Pro Lys Gly Ile Gly Tyr Gly Gln Gly Ala Gly Cys Leu 65 70 75 80 Ser Thr Asp Thr Gly Glu His Leu Gly Leu Gln Phe Gln Gln Ser Pro 85 90 95 Lys Pro Ala Arg Ser Val Thr Thr Ser Asn Pro Ser Lys Phe Thr Ala 100 105 110 Lys Phe Gly Glu Ser Glu Lys Cys Pro Arg Cys Gly Lys Ser Val Tyr 115 120 125 Ala Ala Glu Lys Val Met Gly Gly Gly Lys Pro Trp His Lys Thr Cys 130 135 140 Phe Arg Cys Ala Ile Cys Gly Lys Ser Leu Glu Ser Thr Asn Val Thr 145 150 155 160 Asp Lys Asp Gly Glu Leu Tyr Cys Lys Val Cys Tyr Ala Lys Asn Phe 165 170 175 Gly Pro Thr Gly Ile Gly Phe Gly Gly Leu Thr Gln Gln Val Glu Lys 180 185 190 Lys Glu <210> 2 <211> 150 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Pro Asn Trp Gly Gly Gly Ala Lys Cys Gly Ala Cys Glu Lys Thr 1 5 10 15 Val Tyr His Ala Glu Glu Ile Gln Cys Asn Gly Arg Ser Phe His Lys 20 25 30 Thr Cys Phe His Cys Ser Pro Gln Ser Arg His Ala Gln Leu Pro Pro 35 40 45 Ala Thr Leu Pro Asn Ser Leu Arg Ser Leu Glu Ser Pro Arg Ser Ala 50 55 60 Leu Asp Val Ala Ser Gln Ser Met Leu Leu Arg Arg Leu Trp Glu Val 65 70 75 80 Ala Ser Leu Gly Thr Arg Pro Val Ser Ala Val Pro Ser Val Gly Arg 85 90 95 Val Trp Ser Pro Gln Met Ser Leu Thr Lys Met Gly Asn Phe Ile Ala 100 105 110 Lys Phe Ala Met Pro Lys Ile Leu Ala Pro Arg Val Leu Gly Leu Glu 115 120 125 Ala Leu His Asn Lys Trp Lys Arg Lys Asn Glu Glu Val Arg Arg Phe 130 135 140 Ser Asp Phe Leu Arg Ala 145 150 <210> 3 <211> 39 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Met Pro Asn Trp Gly Gly Gly Ala Lys Cys Gly Ala Cys Glu Lys Thr 1 5 10 15 Val Tyr His Ala Glu Glu Ile Gln Cys Asn Gly Arg Ser Phe His Lys 20 25 30 Thr Cys Phe His Cys Leu Cys 35 <210> 4 <211> 58 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Pro Asn Trp Gly Gly Gly Ala Lys Cys Gly Ala Cys Glu Lys Thr 1 5 10 15 Val Tyr His Ala Glu Glu Ile Gln Cys Asn Gly Arg Ser Phe His Lys 20 25 30 Thr Cys Phe His Cys Thr Leu Ala Gln Asp Leu Phe Pro Leu Cys His 35 40 45 Leu Trp Glu Glu Ser Gly Val His Lys Cys 50 55 <210> 5 <211> 582 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 atgccaaact ggggcggagg cgcaaaatgt ggagcctgtg aaaagaccgt ctaccatgca 60 gaagaaatcc agtgcaatgg aaggagtttc cacaagacgt gtttccactg catggcctgc 120 aggaaggctc ttgacagcac gacagtcgcg gctcatgagt cggagatcta ctgcaaggtg 180 tgctatgggc gcagatatgg ccccaaaggg atcgggtatg gacaaggcgc tggctgtctc 240 agcacagaca cgggcgagca tctcggcctg cagttccaac agtccccaaa gccggcacgc 300 tcagttacca ccagcaaccc ttccaaattc actgcgaagt ttggagagtc cgagaagtgc 360 cctcgatgtg gcaagtcagt ctatgctgct gagaaggtta tgggaggtgg caagccttgg 420 cacaagacct gtttccgctg tgccatctgt gggaagagtc tggagtccac aaatgtcact 480 gacaaagatg gggaacttta ttgcaaagtt tgctatgcca aaaattttgg ccccacgggt 540 attgggtttg gaggccttac acaacaagtg gaaaagaaag aa 582 <210> 6 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Kozak sequence motif <400> 6 gccaccatgg 10 <210> 7 <211> 588 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide encoding an MLP with Kozak sequence <400> 7 gccaccatgc caaactgggg cggaggcgca aaatgtggag cctgtgaaaa gaccgtctac 60 catgcagaag aaatccagtg caatggaagg agtttccaca agacgtgttt ccactgcatg 120 gcctgcagga aggctcttga cagcacgaca gtcgcggctc atgagtcgga gatctactgc 180 aaggtgtgct atgggcgcag atatggcccc aaagggatcg ggtatggaca aggcgctggc 240 tgtctcagca cagacacggg cgagcatctc ggcctgcagt tccaacagtc cccaaagccg 300 gcacgctcag ttaccaccag caacccttcc aaattcactg cgaagtttgg agagtccgag 360 aagtgccctc gatgtggcaa gtcagtctat gctgctgaga aggttatggg aggtggcaag 420 ccttggcaca agacctgttt ccgctgtgcc atctgtggga agagtctgga gtccacaaat 480 gtcactgaca aagatgggga actttattgc aaagtttgct atgccaaaaa ttttggcccc 540 acgggtattg ggtttggagg ccttacacaa caagtggaaa agaaagaa 588 <210> 8 <211> 2152 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - MHCK7-CSRP3 expression cassette <400> 8 acccttcaga ttaaaaataa ctgaggtaag ggcctgggta ggggaggtgg tgtgagacgc 60 tcctgtctct cctctatctg cccatcggcc ctttggggag gaggaatgtg cccaaggact 120 aaaaaaaggc catggagcca gaggggcgag ggcaacagac ctttcatggg caaaccttgg 180 ggccctgctg tctagcatgc cccactacgg gtctaggctg cccatgtaag gaggcaaggc 240 ctggggacac ccgagatgcc tggttataat taacccagac atgtggctgc cccccccccc 300 ccaacacctg ctgcctctaa aaataaccct gtccctggtg gatcccctgc atgcgaagat 360 cttcgaacaa ggctgtgggg gactgagggc aggctgtaac aggcttgggg gccagggctt 420 atacgtgcct gggactccca aagtattact gttccatgtt cccggcgaag ggccagctgt 480 cccccgccag ctagactcag cacttagttt aggaaccagt gagcaagtca gcccttgggg 540 cagcccatac aaggccatgg ggctgggcaa gctgcacgcc tgggtccggg gtgggcacgg 600 tgcccgggca acgagctgaa 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tgcttcccgt atggctttca ttttctcctc 1500 cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg tggcccgttg tcaggcaacg 1560 tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact ggttggggca ttgccaccac 1620 ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct attgccacgg cggaactcat 1680 cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg ttgggcactg acaattccgt 1740 ggtgttgtcg gggaaatcat cgtcctttcc ttggctgctc gcctgtgttg ccacctggat 1800 tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc aatccagcgg accttccttc 1860 ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt cgccttcgcc ctcagacgag 1920 tcggatctcc ctttgggccg cctccccgca ctgcccgggt ggcatccctg tgacccctcc 1980 ccagtgcctc tcctggccct ggaagttgcc actccagtgc ccaccagcct tgtcctaata 2040 aaattaagtt gcatcatttt gtctgactag gtgtccttct ataatattat ggggtggagg 2100 ggggtggtat ggagcaaggg gcccaagttg ggaagaaacc tgtagggcct gc 2152 <210> 9 <211> 1925 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in lab - hTnT-CSRP3 expression cassette <400> 9 ctcagtccat taggagccag tagcctggaa gatgtcttta cccccagcat cagttcaagt 60 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cctcgatgtg gcaagtcagt ctatgctgct gagaaggtta tgggaggtgg 960 caagccttgg cacaagacct gtttccgctg tgccatctgt gggaagagtc tggagtccac 1020 aaatgtcact gacaaagatg gggaacttta ttgcaaagtt tgctatgcca aaaattttgg 1080 ccccacgggt attgggtttg gaggccttac acaacaagtg gaaaagaaag aatgatcaac 1140 ctctggatta caaaatttgt gaaagattga ctggtattct taactatgtt gctcctttta 1200 cgctatgtgg atacgctgct ttaatgcctt tgtatcatgc tattgcttcc cgtatggctt 1260 tcattttctc ctccttgtat aaatcctggt tgctgtctct ttatgaggag ttgtggcccg 1320 ttgtcaggca acgtggcgtg gtgtgcactg tgtttgctga cgcaaccccc actggttggg 1380 gcattgccac cacctgtcag ctcctttccg ggactttcgc tttccccctc cctattgcca 1440 cggcggaact catcgccgcc tgccttgccc gctgctggac aggggctcgg ctgttgggca 1500 ctgacaattc cgtggtgttg tcggggaaat catcgtcctt tccttggctg ctcgcctgtg 1560 ttgccacctg gattctgcgc gggacgtcct tctgctacgt cccttcggcc ctcaatccag 1620 cggaccttcc ttcccgcggc ctgctgccgg ctctgcggcc tcttccgcgt cttcgccttc 1680 gccctcagac gagtcggatc tccctttggg ccgcctcccc gcactgcccg ggtggcatcc 1740 ctgtgacccc 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Made in Lab - mutated woodchuck hepatitis regulatory element <400> 62 aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60 ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120 atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180 tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240 ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300 attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360 ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaaatcat cgtcctttcc ttggctgctc 420 gcctgtgttg ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480 aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540 cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgc 589 <210> 63 <211> 588 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - mutated woodchuck hepatitis regulatory element <400> 63 tcaacctctg gattacaaaa tttgtgaaag attgactggt attcttaact atgttgctcc 60 ttttacgcta tgtggatacg ctgctttaat 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aacggccggg gtctggtgct tcctggctac aagtacctcg gacccttcaa cggactcgac 180 aagggggagc ccgtcaacgc ggcggacgca gcggccctcg agcacgacaa ggcctacgac 240 cagcagctcc aagcgggtga caatccgtac ctgcggtata atcacgccga cgccgagttt 300 caggagcgtc tgcaagaaga tacgtctttt gggggcaacc tcgggcgcgc agtcttccag 360 gccaaaaagc gggttctcga acctctgggc ctggttgaat cgccggttaa gacggctcct 420 ggaaagaaga gaccggtaga gccatcaccc cagcgctctc cagactcctc tacgggcatc 480 ggcaagaaag gccagcagcc cgcaaaaaag agactcaatt ttgggcagac tggcgactca 540 gagtcagtcc ccgaccctca accaatcgga gaaccaccag caggcccctc tggtctggga 600 tctggtacaa tggctgcagg cggtggcgct ccaatggcag acaataacga aggcgccgac 660 ggagtgggta gttcctcagg aaattggcat tgcgattcca catggctggg cgacagagtc 720 atcaccacca gcacccgcac ctgggccctg cccacctaca acaaccacct ctacaagcaa 780 atctccaacg ggacctcggg aggaagcacc aacgacaaca cctacttcgg ctacagcacc 840 ccctgggggt attttgactt caacagattc cactgccact tttcaccacg tgactggcag 900 cgactcatca acaacaactg gggattccgg cccaagaggc tcaacttcaa gctcttcaac 960 atccaagtca aggaggtcac gcagaatgaa ggcaccaaga ccatcgccaa taaccttacc 1020 agcacgattc aggtctttac ggactcggaa taccagctcc cgtacgtgct cggctcggcg 1080 caccagggct gcctgcctcc gttcccggcg gacgtcttca tgattcctca gtacgggtac 1140 ctgactctga acaatggcag tcaggctgtg ggccggtcgt ccttctactg cctggagtac 1200 tttccttctc aaatgctgag aacgggcaac aactttgaat tcagctacaa cttcgaggac 1260 gtgcccttcc acagcagcta cgcgcacagc cagagcctgg accggctgat gaaccctctc 1320 atcgaccagt acttgtacta cctgtcccgg actcaaagca cgggcggtac tgcaggaact 1380 cagcagttgc tattttctca ggccgggcct aacaacatgt cggctcaggc caagaactgg 1440 ctacccggtc cctgctaccg gcagcaacgc gtctccacga cactgtcgca gaacaacaac 1500 agcaactttg cctggacggg tgccaccaag tatcatctga atggcagaga ctctctggtg 1560 aatcctggcg ttgccatggc tacccacaag gacgacgaag agcgattttt tccatccagc 1620 ggagtcttaa tgtttgggaa acagggagct ggaaaagaca acgtggacta tagcagcgtg 1680 atgctaacca gcgaggaaga aataaagacc accaacccag tggccacaga acagtacggc 1740 gtggtggccg ataacctgca acagcaaaac gccgctccta ttgtaggggc cgtcaatagt 1800 caaggagcct tacctggcat ggtgtggcag aaccgggacg tgtacctgca gggtcccatc 1860 tgggccaaga ttcctcatac ggacggcaac tttcatccct cgccgctgat gggaggcttt 1920 ggactgaagc atccgcctcc tcagatcctg attaaaaaca cacctgttcc cgcggatcct 1980 ccgaccacct tcaatcaggc caagctggct tctttcatca cgcagtacag taccggccag 2040 gtcagcgtgg agatcgagtg ggagctgcag aaggagaaca gcaaacgctg gaacccagag 2100 attcagtaca cttccaacta ctacaaatct acaaatgtgg actttgctgt caatactgag 2160 ggtacttatt ccgagcctcg ccccattggc acccgttacc tcacccgtaa tctgtaa 2217 <210> 81 <211> 535 <212> PRT <213> Non-human primate adeno-associated virus <400> 81 Met Ala Ala Gly Gly Gly Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala 1 5 10 15 Asp Gly Val Gly Ser Ser Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp 20 25 30 Leu Gly Asp Arg Val Ile Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro 35 40 45 Thr Tyr Asn Asn His Leu Tyr Lys Gln Ile Ser Asn Gly Thr Ser Gly 50 55 60 Gly Ser Thr Asn Asp Asn Thr Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly 65 70 75 80 Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp 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Claims

발현 카세트 및 선택적으로 측부에 위치하는 아데노-연관 바이러스(AAV) 역위 말단 반복체(ITR)를 포함하는, 폴리뉴클레오티드로서, 상기 폴리뉴클레오티드는 프로모터에 작동 가능하게 연결된, 근육 LIM 단백질(MLP) 또는 이의 기능적 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
제1항에 있어서, 프로모터는 심장-특이적 프로모터인, 폴리뉴클레오티드.
제1항 또는 제2항에 있어서, 프로모터는 근육-특이적 프로모터인, 폴리뉴클레오티드.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 프로모터는 심근세포-특이적 프로모터인, 폴리뉴클레오티드.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 프로모터는 MHCK7 프로모터인, 폴리뉴클레오티드.
제5항에 있어서, 상기 MHCK7 프로모터는 서열번호 31과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 공유하는, 폴리뉴클레오티드.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 프로모터는 심장 트로포닌 T(hTNNT2) 프로모터인, 폴리뉴클레오티드.
제7항에 있어서, hTNNT2 프로모터는 서열번호 32과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 공유하는, 폴리뉴클레오티드.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발현 카세트는 심장 트로포닌 T(hTNNT2) 유전자의 엑손 1을 포함하고, 선택적으로 hTNNT2 프로모터 및 엑손 1은 서열번호 32과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 함께 공유하는, 폴리뉴클레오티드.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 프로모터는 유비쿼터스 프로모터, 선택적으로 CMV 프로모터 또는 CAG 프로모터인, 폴리뉴클레오티드.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발현 카세트는 폴리A 신호를 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
제11항에 있어서, 폴리A 신호는 인간 성장 호르몬(hGH) 폴리A인, 폴리뉴클레오티드.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발현 카세트는 마멋 간염 바이러스 전사후 조절 요소(WPRE), 선택적으로 WPRE(x)를 포함하는, 발현 카세트.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 근육 LIM 단백질(MLP) 또는 이의 기능성 변이체는 MLP인, 폴리뉴클레오티드.
제14항에 있어서, 상기 MLP는 인간 MLP인, 폴리뉴클레오티드.
제14항 또는 제15항에 있어서, 상기 MLP는 MLP 이소형 A인, 폴리뉴클레오티드.
제15항 또는 제16항에 있어서, 상기 MLP는
MPNWGGGAKCGACEKTVYHAEEIQCNGRSFHKTCFHCMACRKALDSTTVAAHESEIYCKVCYGRRYGPKGIGYGQGAGCLSTDTGEHLGLQFQQSPKPARSVTTSNPSKFTAKFGESEKCPRCGKSVYAAEKVMGGGKPWHKTCFRCAICGKSLESTNVTDKDGELYCKVCYAKNFGPTGIGFGGLTQQVEKKE
(서열번호 1)과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 공유하는, 폴리뉴클레오티드.
제14항 또는 제15항에 있어서, 상기 MLP는 MLP 이소형 B인, 폴리뉴클레오티드.
제15항 또는 제18항에 있어서, 상기 MLP는
MPNWGGGAKCGACEKTVYHAEEIQCNGRSFHKTCFHCSPQSRHAQLPPATLPNSLRSLESPRSALDVASQSMLLRRLWEVASLGTRPVSAVPSVGRVWSPQMSLTKMGNFIAKFAMPKILAPRVLGLEALHNKWKRKNEEVRRFSDFLRA
(서열번호 2)과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 공유하는, 폴리뉴클레오티드.
제15항에 있어서, 상기 MLP는
MPNWGGGAKCGACEKTVYHAEEIQCNGRSFHKTCFHCLC
(서열번호 3)과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 공유하는, 폴리뉴클레오티드.
제15항에 있어서, 상기 MLP는
MPNWGGGAKCGACEKTVYHAEEIQCNGRSFHKTCFHCTLAQDLFPLCHLWEESGVHKC
(서열번호 4)과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 공유하는, 폴리뉴클레오티드.
제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, MLP를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 시스테인 및 글리신 풍부 단백질 3(CSRP3) 폴리뉴클레오티드인, 폴리뉴클레오티드.
제22항에 있어서, 상기 CSRP3 폴리뉴클레오티드는 인간 CSRP3 폴리뉴클레오티드인, 폴리뉴클레오티드.
제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, MLP를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은
ATGCCAAACTGGGGCGGAGGCGCAAAATGTGGAGCCTGTGAAAAGACCGTCTACCATGCAGAAGAAATCCAGTGCAATGGAAGGAGTTTCCACAAGACGTGTTTCCACTGCATGGCCTGCAGGAAGGCTCTTGACAGCACGACAGTCGCGGCTCATGAGTCGGAGATCTACTGCAAGGTGTGCTATGGGCGCAGATATGGCCCCAAAGGGATCGGGTATGGACAAGGCGCTGGCTGTCTCAGCACAGACACGGGCGAGCATCTCGGCCTGCAGTTCCAACAGTCCCCAAAGCCGGCACGCTCAGTTACCACCAGCAACCCTTCCAAATTCACTGCGAAGTTTGGAGAGTCCGAGAAGTGCCCTCGATGTGGCAAGTCAGTCTATGCTGCTGAGAAGGTTATGGGAGGTGGCAAGCCTTGGCACAAGACCTGTTTCCGCTGTGCCATCTGTGGGAAGAGTCTGGAGTCCACAAATGTCACTGACAAAGATGGGGAACTTTATTGCAAAGTTTGCTATGCCAAAAATTTTGGCCCCACGGGTATTGGGTTTGGAGGCCTTACACAACAAGTGGAAAAGAAAGAA
(서열번호 5)과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 공유하는, 폴리뉴클레오티드.
제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, MLP를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은
ATGCCCAATTGGGGTGGAGGAGCTAAATGTGGAGCTTGTGAAAAAACAGTTTATCATGCTGAAGAAATTCAATGTAATGGAAGATCTTTTCATAAAACATGTTTTCATTGTATGGCTTGTAGAAAAGCACTTGATTCTACAACTGTTGCAGCACATGAAAGTGAAATCTATTGTAAAGTATGTTATGGAAGAAGATATGGACCAAAAGGAATTGGATATGGACAAGGAGCAGGATGTCTTTCTACAGATACTGGAGAACATTTGGGATTGCAATTTCAACAAAGTCCTAAACCAGCTAGATCTGTTACAACAAGTAATCCATCAAAATTTACTGCTAAATTTGGAGAATCCGAAAAATGTCCTAGATGTGGAAAATCAGTATATGCTGCTGAAAAAGTTATGGGAGGTGGAAAACCATGGCATAAGACATGTTTTAGATGTGCAATTTGTGGTAAATCTTTGGAATCTACAAATGTTACAGATAAAGATGGAGAATTGTATTGTAAAGTTTGTTATGCTAAAAATTTTGGACCTACAGGTATAGGATTTGGAGGTTTGACACAACAAGTTGAAAAAAAAGAA
(서열번호 7)과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 공유하는, 폴리뉴클레오티드.
제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 적어도 약 2.4 kb, 최대 약 2.6 kb, 또는 약 2.4 kb 내지 약 2.6 kb를 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 적어도 약 3.0 kb, 최대 약 3.3 kb, 또는 약 3.0 kb 내지 약 3.3 kb를 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 적어도 약 2.4 kb, 적어도 약 2.6 kb, 적어도 약 3.0 kb, 적어도 약 3.3 kb, 적어도 약 3.5 kb, 적어도 약 3.7 kb, 적어도 약 3.9 kb, 적어도 약 4.1 kb, 또는 적어도 약 4.3 kb를 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 적어도 약 2.6 kb, 적어도 약 3.0 kb, 최대 약 3.3 kb, 최대 약 3.5 kb, 최대 약 3.7 kb, 최대 약 3.9 kb, 최대 약 4.1 kb, 최대 약 4.3 kb, 또는 최대 약 4.5 kb를 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발현 카세트는 서열번호 8-11 중 어느 하나와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 공유하는, 폴리뉴클레오티드.
제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 12-15 중 어느 하나와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 공유하는, 폴리뉴클레오티드.
제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발현 카세트는 5' 및 3' 역위 말단 반복(ITR), 선택적으로 AAV2 ITR, 선택적으로 서열번호 20-26 중 어느 하나와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 공유하는 ITR이 측면에 위치하는, 폴리뉴클레오티드.
제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드는 자가-상보적인, 폴리뉴클레오티드.
제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드는 발현 카세트 및 발현 카세트의 역 상보체를 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
제34항에 있어서, 상기 발현 카세트 및 상기 발현 카세트의 역 상보체는 5' 및 3' 역위 말단 반복(ITR), 선택적으로 AAV2 ITR, 선택적으로 서열번호 23 또는 서열번호 26와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 공유하는 ITR이 측면에 위치하는, 폴리뉴클레오티드.
제1항 내지 제35항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 유전자 요법 벡터.
제36항에 있어서, 유전자 요법 벡터는 재조합 아데노-연관 바이러스(rAAV) 벡터인, 벡터.
제37항에 있어서, rAAV 벡터는 AAV9 또는 이의 기능적 변이체인, 벡터.
제38항에 있어서, rAAV 벡터는 서열번호 77 중 어느 하나와 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 공유하는 캡시드 단백질을 포함하는, 벡터.
제37항에 있어서, rAAV 벡터는 AAVrh10 또는 이의 기능적 변이체인, 벡터.
제40항에 있어서, rAAV 벡터는 서열번호 79 중 어느 하나와 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 공유하는 캡시드 단백질을 포함하는, 벡터.
제37항에 있어서, rAAV 벡터는 AAV6 또는 이의 기능적 변이체인, 벡터.
제42항에 있어서, rAAV 벡터는 서열번호 78 중 어느 하나와 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 공유하는 캡시드 단백질을 포함하는, 벡터.
제37항에 있어서, rAAV 벡터는 AAVrh74 또는 이의 기능적 변이체인, 벡터.
제44항에 있어서, rAAV 벡터는 서열번호 80 중 어느 하나와 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 공유하는 캡시드 단백질을 포함하는, 벡터.
제36항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV 벡터는 자가-상보적 AAV 벡터인, 벡터.
제35항 내지 제46항 중 어느 한 항의 벡터를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 질환 또는 장애의 치료 및/또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 이를 치료 및/또는 예방하는 방법.
제47항에 있어서, 질환 또는 장애는 심장 장애인, 방법.
제47항 또는 제48항에 있어서, 질환 또는 장애는 심부전인, 방법.
제47항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 질환 또는 장애는 비대성 심근병증인, 방법.
제47항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 질환 또는 장애는 확장성 심근병증인, 방법.
제47항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 포유동물인, 방법.
제52항에 있어서, 상기 대상체는 영장류인, 방법.
제53항에 있어서, 대상체는 인간인, 방법.
제45항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 서열번호 1의 서열을 갖는 인간 MLP를 암호화하는 인간 CSRP3에 대해, C58G, L44P, S54R, E55G, 및/또는 K69R로부터 선택된 아미노산 치환을 유발하는 CSRP3 유전자에 돌연변이를 갖는, 방법.
제47항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 벡터는 정맥내 주사, 심장내 주사, 심장내 주입, 및/또는 심장 카테터 삽입에 의해 투여되는, 방법.
제47항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여는 MLP 발현을 적어도 약 5%만큼 증가시키는, 방법.
제47항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여는 MLP 발현을 적어도 약 30%만큼 증가시키는, 방법.
제47항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여는 MLP 발현을 적어도 약 70%만큼 증가시키는, 방법.
제47항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여는 MLP 발현을 약 5% 내지 약 10%만큼 증가시키는, 방법.
제47항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여는 MLP 발현을 약 30% 내지 약 50%만큼 증가시키는, 방법.
제47항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여는 MLP 발현을 약 70% 내지 약 100%만큼 증가시키는, 방법.
제47항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 질환 또는 장애를 치료 및/또는 예방하는, 방법.
제36항 내지 제46항 중 어느 한 항의 벡터를 포함하는 약학적 조성물.
제34항 내지 제46항 중 어느 한 항의 벡터 또는 제64항의 약학적 조성물, 및 선택적으로 사용 지침을 포함하는 키트.
선택적으로 제47항 내지 제63항 중 어느 한 항의 방법에 따라, 질환 또는 장애를 치료하는 데 있어서 제36항 내지 제46항 중 어느 한 항의 조성물의 사용.
선택적으로 제47항 내지 제63항 중 어느 한 항의 방법에 따라, 질환 또는 장애를 치료하는 데 사용하기 위한, 제36항 내지 제46항 중 어느 한 항에 따른 조성물.
제36항 내지 제46항 중 어느 한 항의 벡터와 세포를 접촉시키는 단계를 포함하는, 근육 LIM 단백질(MLP) 또는 이의 기능적 변이체를 발현하는 방법.
제68항에 있어서, 세포는 심근세포인, 방법.
제69항에 있어서, 상기 심근 세포는 인간 심근세포인, 방법.
제68항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터는 MHCK7 프로모터이고, 상기 MLP의 발현 수준은 hTNNT2 프로모터를 갖는 벡터로 형질도입된 세포에서의 MLP의 발현 수준보다 적어도 2배 더 큰, 방법.
제68항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터는 MHCK7 프로모터이고, 상기 MLP의 발현 수준은 hTNNT2 프로모터를 갖는 벡터로 형질도입된 세포에서의 MLP의 발현 수준보다 2배 내지 10배 더 큰, 방법.