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KR20230018377A - 아포지질단백질 e (apoe) irna 제제 조성물 및 이의 사용 방법 - Google Patents

아포지질단백질 e (apoe) irna 제제 조성물 및 이의 사용 방법 Download PDF

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KR20230018377A
KR20230018377A KR1020227041277A KR20227041277A KR20230018377A KR 20230018377 A KR20230018377 A KR 20230018377A KR 1020227041277 A KR1020227041277 A KR 1020227041277A KR 20227041277 A KR20227041277 A KR 20227041277A KR 20230018377 A KR20230018377 A KR 20230018377A
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KR
South Korea
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nucleotides
nucleotide
dsrna
strand
antisense strand
Prior art date
Application number
KR1020227041277A
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English (en)
Inventor
브렛 리 보스트윅
하이옌 펭
제임스 디. 맥키닌치
애덤 카스토레노
마크 케이. 슈레겔
Original Assignee
알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 filed Critical 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드
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Abstract

본원 개시내용은 이중 가닥 리보핵산(dsRNAi) 제제 및 APOE 유전자를 표적화하는 조성물 뿐만 아니라 상기 dsRNAi 제제 및 조성물을 사용하여 APOE 유전자의 발현을 억제하는 방법 및 APOE-관련 신경변성 질환 또는 장애, 예를 들어, 알츠하이머 질환 및 파킨슨 질환을 갖는 대상체를 치료하는 방법에 관한 것이다.

Description

아포지단백질 E(ApoE) iRNA 제제 조성물 및 이의 사용 방법
관련 출원
본 출원은 2020년 4월 27일자로 출원된 미국 가출원 번호 제63/015,867호에 대한 우선권을 주장하며, 이의 전문은 본원에 참조로 포함된다.
서열 목록
본 출원은 ASCII 형식으로 전자적으로 제출된 서열 목록을 포함하고, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 2021년 4월 20일자로 생성된 상기 ASCII 복사본은 파일명이 121301_11220_SL.TXT이며, 크기가 200,944 바이트이다.
아포지단백질 E 유전자는 18개 아미노산 신호 펩타이드의 절단 후 299개 아미노산으로 구성된 당단백질인 아포지단백질 E(APOE) 단백질을 암호화한다. 3개의 상응하는 대립유전자에 의해 암호화된 APOE2, APOE3, 및 APOE4의 3개의 통상의 이소형의 APOE가 있다. 3개의 APOE 이소형인 ApoE ε2(APOE2), ApoE ε3(APOE3), ApoE ε4(APOE4)는 아미노산 위치 112와 158에서만 서로 상이하고; APOE2는 Cys112와 Cys158을 갖고, APOE3는 Cys112와 Arg 158을 갖고, APOE4는 Arg112와 Arg158을 갖는다. APOE는 광범위하게 발현되지만 주로 간세포와 중추신경계(CNS)의 신경아교세포에서 말초적으로 발현된다.
말초에서, APOE는 지질 항상성에서 기능한다. 이들 지단백질 입자는 혈뇌 장벽을 통과할 수 없고; 연구는 성상세포 및 미세아교세포에 의해 방출되는 apoE 함유 입자가 뇌 apoE의 주요 공급원임을 보여주었다(참조: Bjorkhem I, et al. (1998) J Lipid Research 39(8):1594-1600; Pitas RE, et al. (1987) Biochimica Biophysica Acta. 13;917(1):148-161; Krasemann S, et al. (2017) Immunity. 47(3):566-581.e9. doi:10.1016/j.immuni.2017.08.008). 뇌에서, APOE는 지질 수송, 시냅스 무결성 및 가소성, 당 대사, 신경염증 및 뇌혈관 무결성을 포함한 다수의 경로를 조절한다. 예를 들어, 일단 APOE가 세포로부터 분비되면, 여러 수송체(예를 들어, ATB-결합 카세트 수송체)는 콜레스테롤과 인지질을 초기 APOE로 전달하여 지단백 입자를 형성하고 APOE는 이후 LDL 수용체(LDLR) 계열 구성원과 같은 APOE 수용체에 결합하여 뉴런에 분포한다. 또한, 간 이식 후 수용자의 뇌척수액(CSF) ApoE 표현형이 아닌 혈청 APOE 표현형이 공여자의 것으로 완전히 전환되는 것으로 관찰되었다. 또한, 성상세포는 다른 공급원에서 유래한 APOE와 명백한 성질을 갖는 고밀도 지단백질(HDL) 유사 입자에서 APOE를 생성한다(참조: 예를 들어, Morikawa, et al., Neurobiol Dis.. Jun-Jul 2005;19(1-2): 66-76). 따라서, CSF의 APOE는 혈장 풀에서 유래될 수 없으므로 국소적으로 합성되어야 한다(참조: Linton MF, et al. (1991) J Clin Invest. 88(1):270-281. doi:10.1172/JCI115288).
APOE 유전자의 다형성은 다중 단백질병증과 관련이 있다. APOE 다형성과 질환 간에 가장 잘 확립된 연관성은 APOE 유전자형과 알츠하이머 질환(AD) 간에 있고, 이는 65세 이후에 증상이 발생하는 후기 발병 알츠하이머 질환의 주요 위험 결정 인자인 것으로 나타났다. 추가로, Haltzman 연구실로부터 최근 연구는 ε4 대립유전자 보유가 질환 진행을 상당히 가속화하였고(p=0.02), 하나의 ε4 대립유전자는 비보유자와 비교하여 진행률을 14%, 2개의 ε4 대립유전자는 진행률을 23%까지 증가시키는 것으로 나타났다(참조: Holtzman, et al. (2017) Nature 549:523). AD는 노인 치매의 주요 원인이며, 이의 병리학적 특징은 신경세포 손실 및 신경교 활성화와 함께 아밀로드 플라크로서의 세포외 아밀로이드-β(Aβ) 응집체 및 신경섬유 엉킴으로서의 세포내 과인산화된 tau 응집체의 침착을 포함한다. 후기 발병 AD를 갖는 개체가 전체 AD 집단의 95% 이상을 차지함에 따라 AD에서 APOE의 역할을 규명하기 위한 다양한 노력이 진행되고 있다.
보다 구체적으로, APOE4의 1개의 카피를 갖는 대상체는 AD 발병 위험이 3배 초과이고, APOE4의 2개의 카피를 갖는 대상체는 AD 발병 위험이 12배 초과로 증가한 반면, APOE2의 2개 카피는 AD 발병으로부터 대상체를 보호한다(참조: Reiman EM, et al. (2020) Nature Communications 11 (1); 667). 또한, 3건의 APOE 녹아웃 인간 사례가 보고되었고, 이들 대상체 중 누구도 병원 방문 당시(40-60세) 치매를 경험하지 못하였다(참조: Ghiselli, et al. (1981) Science 214(4526):1239; Mak, et al. (2014) JAMA Neurol 71:1228; 및 Lohse, et al. (1992) J Lipid Res. (11):1583). 3건 중 1건의 사례(40세 연령의 남성)에서, MRI 및 뇌척수액(CSF) 바이오마커 시험은 온전한 뇌 구조와 정상 범위의 Tau 및 p-Tau 수준으로 신경변성의 징후를 입증하지 못하였다. 추가로, 최근 사례 연구에서는 ApoE3의 크라이스트처치(Christchurch) 돌연변이가 보존된 인지 기능 및 PET에 의한 제한된 타우병증에 의해 입증된 바와 같이 프레세닐린 1 구동 치매를 다시 보호할 수 있음을 보여주었다. 크라이스트처치 돌연변이의 존재는 HSPG 및 LDL 수용체에 결합하는 ApoE3의 기능 상실을 유도하였고, 환자는 III형 고지단백혈증을 갖지만 심혈관 질환은 없었다(참조: Arboleda-Velasquez, et al. (2019) Nature Medicien 25:1680).
또한, ApoE4의 증가된 발현이 아밀로이드 축적 및 신경성 이영양증을 가속화하는 ApoE 유도성 아밀로이드 마우스 모델에서 입증되었고(참조: Liu, et al. (2017) Neuron 96:1024) 및 Huynh, et al. (Neuron (2017) 96:1013)), APOE4의 안티센스 억제는 유전자전이 아밀로이드 전구체 단백질(APP)/프레세닐린 1(PS1-21) 마우스에서 보호성임을 입증하였다. 또한, 타우병증 마우스 모델에서 ApoE4의 결실은 신경변성을 보호하고(참조: Holtzman, et al. (2017) Nature 549:523), APOE4를 발현하지만 APOE가 무효화되어 유도 만능 줄기 세포로부터 유래된 인간 뉴런에서 APOE4 발현의 재도입은 APOE4로부터 독성 효과를 얻는 것으로 나타났다(참조: Wang, et al. (2018) Nat Medicine 24:647). 또한, APOE4의 발현을 마우스의 간으로 제한하면 여전히 인지 능력에 영향을 미칠 수 있고 혈뇌 장벽을 손상시키고 신경염증을 증가시킬 수 있는 것으로 나타났다(alzforum.org/news/research-news/apoe-has-hand-Alzheimer' ss-beyond-av-beyond-brain).
현재, AD와 같은 APOE-관련 신경변성 질환을 갖는 대상체에 대한 치유 또는 예방 치료가 없고, 지지 및 증상 관리가 치료의 핵심이다. 따라서, 신경변성 질환을 갖거나 발병할 위험이 있는 대상체를 치료하기 위한 조성물 및 방법이 당업계에 필요하다.
본원 개시내용은 아포지단백질 E(APOE) 유전자의 RNA 전사체의 RNA-유도된 사일런싱 복합체(RISC)-매개된 절단에 영향을 미치는 RNAi 제제 조성물을 제공한다. APOE 유전자는 세포, 예를 들어, 인간과 같은 대상체 내 세포 내에 존재할 수 있다. 본원 개시내용은 또한 APOE 유전자의 발현을 억제하기 위해 또는 APOE 유전자, 예를 들어, 병원성 APOE 대립유전자, 즉, APOE4의 발현을 억제 또는 감소시키는 것이 이득이 되는 대상체, 예를 들어, APOE-관련 신경변성 질환, 예를 들어, 아밀로이드-β-매개된 질환 또는 tau-매개된 질환을 앓거나 앓기 쉬운 대상체를 치료하기 위해 본원 개시내용의 RNAi 제제 조성물을 사용하는 방법을 제공한다. 특히, 본원의 RNAi 제제 조성물은 APOE-관련 신경변성 질환의 치료를 위해 CNS 내의 성상세포에 의한 특유의 APOE 발현에 영향을 미칠 수 있다.
따라서, 하나의 양상에서, 본원 개시내용은 아포지단백질 E(APOE) 유전자의 발현을 억제하기 위한 이중 가닥 리보핵산(RNAi) 제제를 제공하고, 여기서, 상기 RNAi 제제는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, 여기서, 안티센스 가닥은 표 2-5 및 7-10 중 어느 하나에 열거된 안티센스 서열 중 어느 하나와 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 (즉, 3, 2, 1 또는 0개의 뉴클레오타이드가 상이한) 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는 상보성 영역을 포함한다. 특정 양태에서, 안티센스 가닥은 표 2-5 및 7-10 중 어느 하나에 열거된 안티센스 서열 중 어느 하나의 적어도 15개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 상보성 영역을 포함한다. 특정 양태에서, 안티센스 가닥은 표 7 및 8 중 어느 하나에 열거된 안티센스 서열 중 어느 하나의 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는 상보성 영역을 포함한다. 특정 양태에서, 안티센스 가닥은 표 9 및 표 10 중 어느 하나에 열거된 안티센스 서열 중 어느 하나의 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는 상보성 영역을 포함한다. 특정 양태에서, 안티센스 가닥은 표 2-5 및 7-10 중 어느 하나에 열거된 안티센스 서열 중 어느 하나의 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 (즉, 3, 2, 1 또는 0개의 뉴클레오타이드가 상이한) 적어도 19개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는 상보성 영역을 포함한다. 특정 양태에서, 안티센스 가닥은 표 7 및 8 중 어느 하나에 열거된 안티센스 서열 중 어느 하나의 적어도 19개의 연속 뉴클레오타이드(즉, 3, 2, 1 또는 0개의 뉴클레오타이드가 상이한)를 포함하는 상보성 영역을 포함한다. 특정 양태에서, 안티센스 가닥은 표 9 및 표 10 중 어느 하나에 열거된 안티센스 서열 중 어느 하나의 적어도 19개의 연속 뉴클레오타이드(즉, 3, 2, 1 또는 0개의 뉴클레오타이드가 상이한)를 포함하는 상보성 영역을 포함한다. 특정 양태에서, 안티센스 가닥은 표 2-5 및 7-10 중 어느 하나에 열거된 안티센스 서열 중 어느 하나의 적어도 19개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 상보성 영역을 포함한다. 특정 양태에서, 안티센스 가닥은 표 7 및 8 중 어느 하나에 열거된 안티센스 서열 중 어느 하나의 적어도 19개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는 상보성 영역을 포함한다. 특정 양태에서, 안티센스 가닥은 표 9 및 표 10 중 어느 하나에 열거된 안티센스 서열 중 어느 하나의 적어도 19개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는 상보성 영역을 포함한다. 특정 양태에서, 정렬된(비교된) 서열 사이의 티민-대-우라실 또는 우라실-대-티민 차이는 정렬된(비교된) 서열 사이에서 상이한 뉴클레오티드로서 계수되지 않는다.
일부 양태에서, 제제는 임의로 링커 또는 캐리어를 통해 하나 이상의 내부 뉴클레오타이드 위치에 접합된 하나 이상의 친유성 모이어티를 포함한다.
다른 양태에서, 제제는 간 조직을 표적화하는 표적화 리간드, 예를 들어 링커 또는 캐리어를 통해 이중 가닥 RNAi 제제에 임의로 접합된 하나 이상의 GalNAc 유도체를 추가로 포함한다.
또 다른 양태에서, 제제는 임의로 링커 또는 캐리어 및 간 조직을 표적화하는 표적화 리간드를 통해 하나 이상의 내부 뉴클레오타이드 위치에 접합된 하나 이상의 친유성 모이어티, 예를 들어 링커 또는 캐리어를 통해 이중 가닥 RNAi 제제에 임의로 접합된 하나 이상의 GalNAc 유도체를 추가로 포함한다.
특정 양태에서, 이중 가닥 RNAi 제제는 APOE2 대립유전자, APOE3 대립유전자 및 APOE4 대립유전자의 발현을 억제한다. 다른 양태에서, 이중 가닥 RNAi 제제는 APOE4의 발현을 억제하지만 APOE2 및 APOE3의 발현을 실질적으로 억제하지 않으며, 예를 들어 APOE2 및 APOE3의 발현은 약 10% 이하로 억제된다.
본원 개시내용의 또 다른 양상은 아포지단백질 E(APOE) 유전자의 발현을 억제하기 위한 이중 가닥 RNAi 제제를 제공하고, 여기서, 상기 dsRNA 제제는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, 여기서, 상기 센스 가닥은 표 2-5 및 7-10에 제시된 센스 가닥 서열 중 어느 하나와 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 (즉, 3, 2, 1 또는 0개의 뉴클레오타이드가 상이한) 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하고; 상기 안티센스 가닥은 표 2-5 및 7-10에 제시된 안티센스 가닥 뉴클레오타이드 서열 중 어느 하나와 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함한다. 특정 양태에서, 센스 가닥은 표 2-5 및 7-10에 제시된 센스 가닥 서열 중 어느 하나의 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하고; 안티센스 가닥은 표 2-5 및 7-10에 제시된 안티센스 가닥 뉴클레오타이드 서열 중 어느 하나의 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함한다. 특정 양태에서, 센스 가닥은 표 7 및 8에 제시된 센스 가닥 서열 중 어느 하나의 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하고; 안티센스 가닥은 표 7 및 8에 제시된 안티센스 가닥 뉴클레오타이드 서열 중 어느 하나의 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함한다. 특정 양태에서, 센스 가닥은 표 9 및 표 10에 제시된 센스 가닥 서열 중 어느 하나의 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하고; 안티센스 가닥은 표 9 및 표 10에 제시된 안티센스 가닥 뉴클레오타이드 서열 중 어느 하나의 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함한다. 특정 양태에서, 센스 가닥은 표 2-5 및 7-10에 제시된 센스 가닥 서열 중 어느 하나의 적어도 19개의 연속 뉴클레오타이드(즉, 3, 2, 1 또는 0개의 뉴클레오타이드가 상이한)를 포함하고; 안티센스 가닥은 표 2-5 및 7-10에 제시된 안티센스 가닥 뉴클레오타이드 서열 중 어느 하나의 적어도 19개의 연속 뉴클레오타이드(즉, 3, 2, 1 또는 0개의 뉴클레오타이드가 상이한)를 포함한다. 특정 양태에서, 센스 가닥은 표 7 및 8에 제시된 센스 가닥 서열 중 어느 하나의 적어도 19개의 연속 뉴클레오타이드(즉, 3, 2, 1 또는 0개의 뉴클레오타이드가 상이한)를 포함하고; 안티센스 가닥은 표 7 및 8에 제시된 안티센스 가닥 뉴클레오타이드 서열 중 어느 하나의 적어도 19개의 연속 뉴클레오타이드(즉, 3, 2, 1 또는 0개의 뉴클레오타이드가 상이한)를 포함한다. 특정 양태에서, 센스 가닥은 표 9 및 표 10에 제시된 센스 가닥 서열 중 어느 하나의 적어도 19개의 연속 뉴클레오타이드(즉, 3, 2, 1 또는 0개의 뉴클레오타이드가 상이한)를 포함하고; 안티센스 가닥은 표 9 및 표 10에 제시된 안티센스 가닥 뉴클레오타이드 서열 중 어느 하나의 적어도 19개의 연속 뉴클레오타이드(즉, 3, 2, 1 또는 0개의 뉴클레오타이드가 상이한)를 포함한다.
일부 양태에서, 제제는 임의로 링커 또는 캐리어를 통해 하나 이상의 내부 뉴클레오타이드 위치에 접합된 하나 이상의 친유성 모이어티를 포함한다.
다른 양태에서, 제제는 간 조직을 표적화하는 표적화 리간드, 예를 들어 링커 또는 캐리어를 통해 이중 가닥 RNAi 제제에 임의로 접합된 하나 이상의 GalNAc 유도체를 추가로 포함한다.
또 다른 양태에서, 제제는 임의로 링커 또는 캐리어, 및 간 조직을 표적화하는 표적화 리간드를 통해 하나 이상의 내부 뉴클레오타이드 위치에 접합된 하나 이상의 친유성 모이어티, 예를 들어 링커 또는 캐리어를 통해 이중 가닥 RNAi 제제에 임의로 접합된 하나 이상의 GalNAc 유도체를 추가로 포함한다.
특정 양태에서, 이중 가닥 RNAi 제제는 APOE2 대립유전자, APOE3 대립유전자 및 APOE4 대립유전자의 발현을 억제한다. 다른 양태에서, 이중 가닥 RNAi 제제는 APOE4의 발현을 억제하지만 APOE2 및 APOE3의 발현을 실질적으로 억제하지 않으며, 예를 들어 APOE2 및 APOE3의 발현은 약 10% 이하로 억제된다.
본원 개시내용의 추가의 양상은 아포지단백질 E(APOE) 유전자의 발현을 억제하기 위한 이중 가닥 RNAi 제제를 제공하고, 여기서, 상기 dsRNA 제제는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, 여기서, 센스 가닥은 서열번호 1, 3, 5, 7, 또는 9의 뉴클레오타이드 서열, 또는 서열번호 1, 3, 5, 7, 또는 9 중 어느 하나의 전체 뉴클레오타이드 서열과 적어도 90% 뉴클레오타이드 서열 동일성, 예를 들어, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열 중 어느 하나와 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 (즉, 3, 2, 1 또는 0개의 뉴클레오타이드가 상이한) 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하고, 서열번호 1, 3, 5, 7, 및 9의 임의의 티민에 대해 우라실의 치환 (정렬된 서열을 비교하는 경우)은 서열번호 1, 3, 5, 7 및 9의 뉴클레오타이드 서열 또는 서열번호 1, 3, 5, 7 또는 9 중 어느 하나의 전체 뉴클레오타이드 서열과 적어도 90% 뉴클레오타이드 서열 동일성, 예를 들어, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열 중 어느 하나의 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 (즉, 3, 2, 1 또는 0개의 뉴클레오타이드가 상이한) 것에 기여하는 차이로서 계수하지 않고; 안티센스 가닥이 서열번호 2, 4, 6, 8, 또는 10의 뉴클레오타이드 서열 또는 서열번호 2, 4, 6, 8, 또는 10 중 어느 하나의 전체 뉴클레오타이드 서열과 적어도 90% 뉴클레오타이드 서열 동일성, 예를 들어, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열 중 어느 하나와 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하고, 서열번호 2, 4, 6, 8 및 10의 임의의 티민에 대해 우라실의 치환 (정렬된 서열을 비교하는 경우)은 서열번호 2, 4, 6, 8, 및 10의 뉴클레오타이드 서열 또는 서열번호 2, 4, 6, 8 또는 10 중 어느 하나의 전체 뉴클레오타이드 서열과 적어도 90% 뉴클레오타이드 서열 동일성, 예를 들어, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열 중 어느 하나와 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 것에 기여하는 차이로서 계수하지 않고, 센스 가닥 및 안티센스 가닥의 적어도 하나가 임의로 링커 또는 캐리어를 통해 하나 이상의 내부 뉴클레오타이드 위치에 접합된 하나 이상의 친유성 모이어티를 포함한다.
일양태에서, APOE에 표적화된 이중 가닥 RNAi 제제는 표 2-5 및 7-10에서 듀플렉스의 센스 가닥 뉴클레오타이드 서열의 뉴클레오타이드 서열과 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 (즉, 3, 2, 1 또는 0개의 뉴클레오타이드가 상이한) 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는 센스 가닥을 포함한다. 일양태에서, APOE에 표적화된 이중 가닥 RNAi 제제는 표 7 및 8에서 듀플렉스의 센스 가닥 뉴클레오타이드 서열의 뉴클레오타이드 서열과 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 (즉, 3, 2, 1 또는 0개의 뉴클레오타이드가 상이한) 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는 센스 가닥을 포함한다. 일양태에서, APOE에 표적화된 이중 가닥 RNAi 제제는 표 9 및 표 10에서 듀플렉스의 센스 가닥 뉴클레오타이드 서열의 뉴클레오타이드 서열과 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 (즉, 3, 2, 1 또는 0개의 뉴클레오타이드가 상이한) 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는 센스 가닥을 포함한다.
일양태에서, APOE에 표적화된 이중 가닥 RNAi 제제는 표 2-5 및 7-10 중 하나에서 듀플렉스의 어느 하나의 안티센스 뉴클레오타이드 서열과 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 (즉, 3, 2, 1 또는 0개의 뉴클레오타이드가 상이한) 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는 안티센스 가닥을 포함한다. 일양태에서, APOE에 표적화된 이중 가닥 RNAi 제제는 표 7 및 8 중 하나에서 듀플렉스의 안티센스 뉴클레오타이드 서열과 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 (즉, 3, 2, 1 또는 0개의 뉴클레오타이드가 상이한) 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는 안티센스 가닥을 포함한다. 일양태에서, APOE에 표적화된 이중 가닥 RNAi 제제는 표 9 및 표 10 중 하나에서 듀플렉스의 안티센스 뉴클레오타이드 서열과 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 (즉, 3, 2, 1 또는 0개의 뉴클레오타이드가 상이한) 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는 안티센스 가닥을 포함한다.
일양태에서, APOE에 표적화된 이중 가닥 RNAi 제제는 서열번호 1의 뉴클레오타이드 50-113, 59-97, 59-90, 107-177, 107-153, 124-153, 198-240, 203-240, 209-240, 283-378, 283-312, 307-378, 322-369, 330-357, 394-419, 568-600, 568-594, 841-879, 900-926, 997-1055, 1002-1044, 1014-1044, 1019-1044, 1120-1166, 1130-1166, 1130-1155의 뉴클레오타이드 서열 중 어느 하나와 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 (즉, 3, 1, 2 또는 0개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한) 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하고, 안티센스 가닥은 서열번호 2의 상응하는 뉴클레오타이드 서열로부터 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함한다.
일양태에서, APOE에 표적화된 이중 가닥 RNAi 제제는 서열번호 1의 뉴클레오타이드 59-90, 330-357, 568-594, 1019-1044, 1130-1155의 뉴클레오타이드 서열 중 어느 하나와 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 (즉, 3, 2, 1 또는 0개의 뉴클레오타이드가 상이한) 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는 센스 가닥을 포함하고, 안티센스 가닥은 서열번호 2의 상응하는 뉴클레오타이드 서열로부터의 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함한다.
일양태에서, APOE에 표적화된 이중 가닥 RNAi 제제는 서열번호 1의 뉴클레오타이드 57-79, 62-84, 75-97, 86-108, 207-229, 213-235, 218-240, 898-920, 1128-1150, 637-659의 뉴클레오타이드 서열 중 어느 하나와 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 (즉, 3, 2, 1 또는 0개의 뉴클레오타이드가 상이한) 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는 센스 가닥을 포함하고, 안티센스 가닥은 서열번호 2의 상응하는 뉴클레오타이드 서열로부터의 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함한다.
또 다른 양태에서, APOE에 표적화된 이중 가닥 RNAi 제제는 서열번호 1의 뉴클레오타이드 57-79, 62-84, 207-229, 1128-1150의 뉴클레오타이드 서열 중 어느 하나와 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 (즉, 3, 2, 1 또는 0개의 뉴클레오타이드가 상이한) 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는 센스 가닥을 포함하고, 안티센스 가닥은 서열번호 2의 상응하는 뉴클레오타이드 서열로부터의 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함한다.
일양태에서, APOE에 표적화된 이중 가닥 RNAi 제제는 AD-1204704, AD-1204705, AD-1204705, AD-1204706 AD-1204707, AD-1204708, AD-1204709, AD-1204710, AD-1204711, AD-1204712, 및 AD-1204713으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 듀플렉스의 안티센스 가닥 뉴클레오타이드 서열 중 어느 하나와 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 (즉, 3, 2, 1 또는 0개의 뉴클레오타이드가 상이한) 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는 안티센스 가닥을 포함한다.
일양태에서, APOE에 표적화된 이중 가닥 RNAi 제제는 AD-1204704, AD-1204705, AD-1204708, 및 AD-1204712로 이루어진 그룹으로부터 선택된 듀플렉스의 안티센스 가닥 뉴클레오타이드 서열 중 어느 하나와 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 (즉, 3, 2, 1 또는 0개의 뉴클레오타이드가 상이한) 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는 안티센스 가닥을 포함한다.
일부 양태에서, 제제는 간 조직을 표적화하는 표적화 리간드, 예를 들어 링커 또는 캐리어를 통해 이중 가닥 RNAi 제제에 임의로 접합된 하나 이상의 GalNAc 유도체를 추가로 포함한다.
본 발명의 특정 양태에서, 이중 가닥 RNAi 제제는 APOE2 대립유전자, APOE3 대립유전자 및 APOE4 대립유전자의 발현을 억제한다. 다른 양태에서, 이중 가닥 RNAi 제제는 APOE4의 발현을 억제하지만 APOE2 및 APOE3의 발현을 실질적으로 억제하지 않으며, 예를 들어 APOE2 및 APOE3의 발현은 약 10% 이하로 억제된다.
임의로, 이중 가닥 RNAi 제제는 적어도 하나의 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다.
특정 양태에서, 친유성 모이어티의 친유성은 logKow에 의한 측정 시 0을 초과한다.
일부 양태에서, 이중 가닥 RNAi 제제의 소수성은 이중 가닥 RNAi 제제의 혈장 단백질 결합 검정에서 미결합된 분획에 의한 측정 시 0.2를 초과한다. 관련 양태에서, 혈장 단백질 결합 검정은 인간 혈청 알부민 단백질을 사용한 전기영동 이동성 이동 검정(electrophoretic mobility shift assay)이다.
특정 양태에서, 실질적으로 모든 센스 가닥의 모든 뉴클레오타이드는 변형된 뉴클레오타이드이다. 임의로, 센스 가닥의 모든 뉴클레오타이드는 변형된 뉴클레오타이드이다.
일부 양태에서, 안티센스 가닥의 실질적으로 모든 뉴클레오타이드는 변형된 뉴클레오타이드이다. 임의로, 안티센스 가닥의 모든 뉴클레오타이드는 변형된 뉴클레오타이드이다.
임의로, 센스 가닥의 모든 뉴클레오타이드 및 안티센스 가닥의 모든 뉴클레오타이드는 변형된 뉴클레오타이드이다.
일양태에서, 변형된 뉴클레오타이드 중 적어도 하나는 데옥시-뉴클레오타이드, 3'-말단 데옥시-티미딘(dT) 뉴클레오타이드, 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오타이드, 2'-플루오로 변형된 뉴클레오타이드, 2'-데옥시-변형된 뉴클레오타이드, 잠긴 뉴클레오타이드, 잠김 해제된 뉴클레오타이드, 형태적으로 제한된 뉴클레오타이드, 속박된 에틸 뉴클레오타이드, 무염기 뉴클레오타이드, 2'-아미노-변형된 뉴클레오타이드, 2'-O-알릴-변형된 뉴클레오타이드, 2'-C-알킬-변형된 뉴클레오타이드, 2'-하이드록실-변형된 뉴클레오타이드, 2'-메톡시에틸 변형된 뉴클레오타이드, 2'-O-알킬-변형된 뉴클레오타이드, 모르폴리노 뉴클레오타이드, 포스포르아미데이트, 비-천연 염기 포함 뉴클레오타이드, 테트라하이드로피란 변형된 뉴클레오타이드, 1,5-언하이드로헥시톨 변형된 뉴클레오타이드, 사이클로헥세닐 변형된 뉴클레오타이드, 포스포로티오에이트 그룹을 포함하는 뉴클레오타이드, 5'-메틸포스포네이트 그룹을 포함하는 뉴클레오타이드, 5'-포스페이트 또는 5'-포스페이트 모사체를 포함하는 뉴클레오타이드, 비닐 포스포네이트를 포함하는 뉴클레오타이드, 아데노신-글리콜 핵산(GNA)을 포함하는 뉴클레오타이드, 티미딘-글리콜 핵산(GNA) S-이성체를 포함하는 뉴클레오타이드, 2-하이드록시메틸-테트라하이드로푸란-5-포스페이트를 포함하는 뉴클레오타이드, 2'-데옥시티미딘-3'-포스페이트를 포함하는 뉴클레오타이드, 2'-데옥시구아노신-3'-포스페이트를 포함하는 뉴클레오타이드, 또는 콜레스테릴 유도체 및 도데칸산 비스데실아미드 그룹에 연결된 말단 뉴클레오타이드이다.
관련 양태에서, 변형된 뉴클레오타이드는 2'-데옥시-2'-플루오로 변형된 뉴클레오타이드, 2'-데옥시-변형된 뉴클레오타이드, 3'-말단 데옥시-티민 뉴클레오타이드(dT), 잠긴 뉴클레오타이드, 무염기 뉴클레오타이드, 2'-아미노-변형된 뉴클레오타이드, 2'-알킬-변형된 뉴클레오타이드, 모르폴리노 뉴클레오타이드, 포스포르아미데이트, 또는 비-천연 염기 포함 뉴클레오타이드이다.
일양태에서, 변형된 뉴클레오타이드는 3'-말단 데옥시-티미딘 뉴클레오타이드(dT)의 짧은 서열을 포함한다.
또 다른 양태에서, 뉴클레오타이드 상의 변형은 2'-O-메틸, 2' 플루오로 및 GNA 변형이다.
추가의 양태에서, 이중 가닥 RNAi 제제는 적어도 하나의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결을 포함한다. 임의로, 이중 가닥 RNAi 제제는 6-8개(예를 들어, 6, 7, 또는 8개) 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결을 포함한다.
특정 양태에서, 상보성 영역은 길이가 적어도 17개의 뉴클레오타이드이다. 임의로 상보성 영역은 길이가 19-23개의 뉴클레오타이드이다. 임의로, 상보성 영역은 길이가 19개의 뉴클레오타이드이다.
일양태에서, 각각의 가닥은 길이가 30개 이하의 뉴클레오타이드이다.
또 다른 양태에서, 적어도 하나의 가닥은 적어도 1개의 뉴클레오타이드의 3' 오버행을 포함한다. 임의로, 적어도 하나의 가닥은 적어도 2개의 뉴클레오타이드의 3' 오버행을 포함한다.
특정 양태에서, 이중 가닥 RNAi 제제는 친유성 리간드, 예를 들어, 1가 또는 분지형 2가 또는 3가 링커를 통해 센스 가닥의 3' 말단에 접합된 C16 리간드를 추가로 포함한다. 특정 양태에서, 이중 가닥 RNAi 제제는 친유성 리간드, 예를 들어, 1가 또는 분지형 2가 또는 3가 링커를 통해 내부 뉴클레오타이드 위치에 접합된 C16 리간드를 추가로 포함한다.
일양태에서, 리간드는
Figure pct00001
이며, 여기서, B는 뉴클레오타이드 염기 또는 뉴클레오타이드 염기 유사체이고, 임의로 B는 아데닌, 구아닌, 시토신, 티민 또는 우라실이다.
다른 양태에서, 제제는 간 조직을 표적화하는 표적화 리간드, 예를 들어 링커 또는 캐리어를 통해 이중 가닥 RNAi 제제에 임의로 접합된 하나 이상의 GalNAc 유도체를 추가로 포함한다.
또 다른 양태에서, 제제는 친유성 리간드, 예를 들어 1가 또는 분지형 2가 또는 3가 링커를 통해 내부 뉴클레오타이드 위치에 접합된 C16 리간드, 및 간 조직을 표적화하는 표적화 리간드, 예를 들어, 1가 또는 분지형 2가 또는 3가 링커를 통해 센스 가닥의 3' 말단에 접합된 하나 이상의 GalNAc 유도체를 추가로 포함한다.
또 다른 양태에서, APOE에 대한 상보성 영역은 표 2-5 및 7-10 중 어느 하나에서 안티센스 서열 중 어느 하나를 포함한다. 특정 양태에서, APOE에 대한 상보성 영역은 표 7 및 8 중 어느 하나에서 안티센스 서열 중 어느 하나를 포함한다. 특정 양태에서, APOE에 대한 상보성 영역은 표 9 및 표 10 중 어느 하나에서 안티센스 서열 중 어느 하나를 포함한다.
추가의 양태에서, APOE에 대한 상보성 영역은 표 2-5 및 7-10 중 어느 하나에서 안티센스 서열 중 어느 하나의 것이다. 특정 양태에서, APOE에 대한 상보성 영역은 표 7 및 8 중 어느 하나에서 안티센스 서열 중 어느 하나의 것이다. 일부 양태에서, 내부 뉴클레오타이드 위치는 상기 가닥의 각각의 말단으로부터 말단 2개의 위치를 제외하고는 모든 위치를 포함한다. 특정 양태에서, APOE에 대한 상보성 영역은 표 9 및 표 10 중 어느 하나에서 안티센스 서열 중 어느 하나의 것이다. 일부 양태에서, 내부 뉴클레오타이드 위치는 상기 가닥의 각각의 말단으로부터 말단 2개의 위치를 제외하고는 모든 위치를 포함한다.
관련된 양태에서, 내부 위치는 상기 가닥의 각각의 말단으로부터 말단 3개의 위치를 제외하고는 모든 위치를 포함한다. 임의로, 내부 위치는 센스 가닥의 절단 부위 영역을 배제한다.
일부 양태에서, 내부 위치는 센스 가닥의 5'-말단으로부터 계수하여 위치 9-12를 배제한다. 특정 양태에서, 센스 가닥은 길이가 21개의 뉴클레오타이드이다.
다른 양태에서, 내부 위치는 센스 가닥의 3'-말단으로부터 계수하여 위치 11-13을 배제한다. 임의로, 내부 위치는 안티센스 가닥의 절단 부위 영역을 배제한다. 특정 양태에서, 센스 가닥은 길이가 21개의 뉴클레오타이드이다.
일부 양태에서, 내부 위치는 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 계수하여 위치 12-14를 배제한다. 특정 양태에서, 안티센스 가닥은 길이가 23개의 뉴클레오타이드이다.
또 다른 양태에서, 내부 위치는 3'-말단으로부터 계수하여 센스 가닥 상의 위치 11-13, 및 5'-말단으로부터 계수하여 안티센스 가닥 상의 위치 12-14를 배제한다. 특정 양태에서, 센스 가닥은 길이가 21개의 뉴클레오타이드이고, 안티센스 가닥은 길이가 23개의 뉴클레오타이드이다.
추가의 양태에서, 하나 이상의 친유성 모이어티는 하기의 내부 위치 중 하나 이상에 접합된다: 각각의 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여 센스 가닥 상의 위치 4-8 및 13-18 및 안티센스 가닥 상의 위치 6-10 및 15-18. 임의로, 하나 이상의 친유성 모이어티는 하기의 내부 위치 중 하나 이상에 접합된다: 각각의 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여 센스 가닥 상의 위치 5, 6, 7, 15 및 17 및 안티센스 가닥 상의 위치 15 및 17. 특정 양태에서, 센스 가닥은 길이가 21개의 뉴클레오타이드이고, 안티센스 가닥은 길이가 23개의 뉴클레오타이드이다.
특정 양태에서, 친유성 모이어티는 지방족, 지환족 또는 다중지환족 화합물이다. 임의로, 친유성 모이어티는 지질, 콜레스테롤, 레틴산, 콜산, 아다만탄 아세트산, 1-피렌 부티르산, 디하이드로테스토스테론, 1,3-비스-O(헥사데실)글리세롤, 게라닐옥시헥산올, 헥사데실글리세롤, 보르네올, 멘톨, 1,3-프로판디올, 헵타데실 그룹, 팔미트산, 미리스트산, O3-(올레오일)리토콜산, O3-(올레오일)콜렌산, 디메톡시트리틸, 또는 페녹사진이다.
일부 양태에서, 친유성 모이어티는 포화 또는 불포화 C4-C30 탄화수소 쇄, 및 하이드록실, 아민, 카복실산, 설포네이트, 포스페이트, 티올, 아지드 또는 알킨으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 임의의 작용기를 포함한다.
특정 양태에서, 친유성 모이어티는 포화 또는 불포화 C6-C18 탄화수소 쇄를 포함한다. 임의로, 친유성 모이어티는 포화 또는 불포화 C16 탄화수소 쇄를 포함한다. 관련 양태에서, 친유성 모이어티는 내부 위치(들)에서 하나 이상의 뉴클레오타이드(들)를 대체하는 캐리어를 통해 접합된다. 특정 양태에서, 캐리어는 피롤리디닐, 파라졸리닐, 피라졸리디닐, 이미다졸리닐, 이미다졸리디닐, 피페리디닐, 피페라지닐, [1,3]디옥솔라닐, 옥사졸리디닐, 이속사졸리디닐, 모르폴리닐, 티아졸리디닐, 이소티아졸리디닐, 퀴녹살리닐, 피리다지노닐, 테트라하이드로푸라닐, 또는 데칼리닐이거나; 세리놀 골격 또는 디에탄올아민 골격을 기반으로 하는 비환형 모이어티이다.
일부 양태에서, 친유성 모이어티는 에테르, 티오에테르, 우레아, 카보네이트, 아민, 아미드, 말레이미드-티오에테르, 디설파이드, 포스포디에스테르, 설폰아미드 연결, 클릭 반응의 생성물 또는 카바메이트를 포함하는 링커를 통해 이중 가닥 RNAi 제제에 접합된다.
일양태에서, 친유성 모이어티는 뉴클레오염기, 당 모이어티 또는 뉴클레오사이드 간 연결에 접합된다.
또 다른 양태에서, 이중 가닥 RNAi 제제는 안티센스 가닥의 5'-말단에 포스페이트 또는 포스페이트 모사체를 추가로 포함한다. 임의로, 포스페이트 모사체는 5'-비닐 포스포네이트(VP)이다.
특정 양태에서, 이중 가닥 RNAi 제제는 CNS 조직으로의 전달을 매개하는 수용체를 표적화하는 표적화 리간드, 예를 들어, 친수성 리간드를 추가로 포함한다. 특정 양태에서, 표적화 리간드는 C16 리간드이다.
일부 양태에서, 이중 가닥 RNAi 제제는 뇌 조직, 예를 들어, 선조체를 표적화하는 표적화 리간드를 추가로 포함한다.
일부 양태에서, 이중 가닥 RNAi 제제는 간 조직, 예를 들어, 간세포를 표적화하는 표적화 리간드를 추가로 포함한다.
일양태에서, 친유성 모이어티 또는 표적화 리간드는 DNA, RNA, 디설파이드, 아미드, 관능화된 모노사카라이드 또는 갈락토사민, 글루코사민, 글루코스, 갈락토스, 만노스 또는 이들의 조합의 올리고뉴클레오타이드인 바이오-링커를 통해 접합된다.
관련 양태에서, 센스 가닥의 3' 말단은 아민을 갖는 사이클릭 그룹인 말단 캡을 통해 보호되고, 상기 사이클릭 그룹은 피롤리디닐, 피라졸리닐, 피라졸리디닐, 이미다졸리닐, 이미다졸리디닐, 피페리디닐, 피페라지닐, [1,3]디옥솔라닐, 옥사졸리디닐, 이속사졸리디닐, 모르폴리닐, 티아졸리디닐, 이소티아졸리디닐, 퀴녹살리닐, 피리다지노닐, 테트라하이드로푸라닐 또는 데칼리닐이다.
일양태에서, RNAi 제제는 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오타이드, 2'-플루오로 변형된 뉴클레오타이드, 글리콜 핵산(GNA)을 포함하는 뉴클레오타이드, 또는 비닐 포스포네이트를 포함하는 뉴클레오타이드인, 적어도 하나의 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다. 임의로, RNAi 제제는 하기 변형 각각의 적어도 하나를 포함한다: 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오타이드, 2'-플루오로 변형된 뉴클레오타이드, 글리콜 핵산(GNA)을 포함하는 뉴클레오타이드 및 비닐 포스포네이트를 포함하는 뉴클레오타이드.
또 다른 양태에서, RNAi 제제는 하기 표 2-5 및 7-10에 제공된 바와 같은 변형된 뉴클레오타이드의 패턴을 포함하고, 여기서 2'-C16, 2'-O-메틸, GNA, 포스포로티오에이트 및 2'-플루오로 변형의 위치는, 표시된 RNAi 제제의 개별 뉴클레오타이드 염기 서열과 관계 없다. 일양태에서, RNAi 제제는 하기 표 7 및 8에 제공된 바와 같은 변형된 뉴클레오타이드의 패턴을 포함하고, 여기서 2'-C16, 2'-O-메틸, GNA, 포스포로티오에이트 및 2'-플루오로 변형의 위치는, 표시된 RNAi 제제의 개별 뉴클레오타이드 염기 서열과 관계 없다. 일양태에서, RNAi 제제는 하기 표 9 및 표 10에 제공된 바와 같은 변형된 뉴클레오타이드의 패턴을 포함하고, 여기서 2'-C16, 2'-O-메틸, GNA, 포스포로티오에이트 및 2'-플루오로 변형의 위치는, 표시된 RNAi 제제의 개별 뉴클레오타이드 염기 서열과 관계 없다.
본원 개시내용의 또 다른 양상은 APOE 유전자의 발현을 억제하기 위한 이중 가닥 RNAi 제제를 제공하고, 여기서 이중 가닥 RNAi 제제는 안티센스 가닥에 상보적인 센스 가닥을 포함하고, 여기서 안티센스 가닥은 APOE를 암호화하는 mRNA의 일부에 상보적인 영역을 포함하고, 여기서 각 가닥은 길이가 약 14 내지 약 30개의 뉴클레오타이드이고, 이중 가닥 RNAi 제제는 화학식 III으로 나타낸다:　
센스:　
Figure pct00002
안티센스:　
Figure pct00003
여기서:
i, j, k, 및 l은 각각 독립적으로 0 또는 1이고;
p, p', q, 및 q'는 각각 독립적으로 0 내지 6이고;
각각의 Na 및 Na'는 독립적으로, 변형되거나 변형되지 않거나 이의 조합인 0-25개의 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타내고, 각각의 서열은 적어도 2개의 상이하게 변형된 뉴클레오타이드를 포함하고;
각각의 Nb 및 Nb'는 독립적으로, 변형되거나 변형되지 않거나 이의 조합인 0-10개의 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타내고;
각각의 np, np', nq, 및 nq'는 이의 각각이 존재하거나 존재하지 않을 수 있고 독립적으로 오버행 뉴클레오타이드를 나타내고;
XXX, YYY, ZZZ, X'X'X', Y'Y'Y' 및 Z'Z'Z'는 각각 독립적으로 3개의 연속 뉴클레오타이드 상의 3개의 동일한 변형의 하나의 모티프를 나타내고;
Nb에 대한 변형은 Y에 대한 변형과 상이하고, Nb'에 대한 변형은 Y'에 대한 변형과 상이하고;
여기서, 센스 가닥은 적어도 하나의 리간드에 접합된다.
일양태에서, i는 0이거나; j는 0이거나; i는 1이거나; j는 1이거나; i와 j 둘 다는 0이거나; i와 j 둘 다는 1이다.
또 다른 양태에서, k는 0이거나; l은 0이거나; k는 1이거나; l는 1이거나; k와 l 둘 다는 0이거나; k와 l 둘 다는 1이다.
특정 양태에서, XXX는 X'X'X'에 상보적이고, YYY는 Y'Y'Y'에 상보적이고, ZZZ는 Z'Z'Z'에 상보적이다.
특정 양태에서, 이중 가닥 RNAi 제제는 APOE2 대립유전자, APOE3 대립유전자 및 APOE4 대립유전자의 발현을 억제한다. 다른 양태에서, 이중 가닥 RNAi 제제는 APOE4의 발현을 억제하지만 APOE2 및 APOE3의 발현을 실질적으로 억제하지 않으며, 예를 들어 APOE2 및 APOE3의 발현은 약 10% 이하로 억제된다.
또 다른 양태에서, YYY 모티프는 센스 가닥의 절단 부위에서 또는 이의 부근에 존재한다.
추가의 양태에서, Y'Y'Y' 모티프는 5' 말단으로부터 안티센스 가닥의 11, 12 및 13 위치에 존재한다. 임의로, Y'는 2'-O-메틸이다.
일부 양태에서, 화학식 III은 화학식 IIIa로 나타낸다:
센스:
Figure pct00004
안티센스:
Figure pct00005
또 다른 양태에서, 화학식 III은 화학식 IIIb로 나타낸다:
센스:
Figure pct00006
안티센스:
Figure pct00007
여기서 각각의 Nb 및 Nb'는 독립적으로 1-5개의 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타낸다.
추가의 양태에서, 화학식 III은 화학식 IIIb로 나타낸다:
센스:
Figure pct00008
안티센스:
Figure pct00009
여기서 각각의 Nb 및 Nb'는 독립적으로 1-5개의 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타낸다.
특정 양태에서, 화학식 III은 화학식 IIId로 나타낸다:
센스:
Figure pct00010
안티센스:
Figure pct00011
여기서, 각각의 Nb 및 Nb'는 독립적으로 1-5개 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타내고, 각각의 Na 및 Na'는 독립적으로 2-10개 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타낸다.
또 다른 양태에서, 이중 가닥 영역은 길이가 15-30개의 뉴클레오타이드 쌍이다. 임의로, 이중 가닥 영역은 길이가 17-23개의 뉴클레오타이드 쌍이다.
특정 양태에서, 이중 가닥 영역은 길이가 17-25개의 뉴클레오타이드 쌍이다. 임의로, 이중 가닥 영역은 길이가 23-27개의 뉴클레오타이드 쌍이다.
일부 양태에서, 이중 가닥 영역은 길이가 19-21개의 뉴클레오타이드 쌍이다. 임의로, 이중 가닥 영역은 길이가 21-23개의 뉴클레오타이드 쌍이다.
특정 양태에서, 각각의 가닥은 15-30개의 뉴클레오타이드를 갖는다. 임의로, 각각의 가닥은 19-30개의 뉴클레오타이드를 갖는다. 임의로, 각각의 가닥은 19-23개의 뉴클레오타이드를 갖는다.
특정 양태에서, 이중 가닥 영역은 길이가 19-21개의 뉴클레오타이드 쌍이고, 각각의 가닥은 19-23개의 뉴클레오타이드를 갖는다.
또 다른 양태에서, RNAi 제제의 뉴클레오타이드 상의 변형은 LNA, 글리콜 핵산(GNA), HNA, CeNA, 2'-메톡시에틸, 2'-O-알킬, 2'-O-알릴, 2'-C-알릴, 2'-플루오로, 2'-데옥시 또는 2'-하이드록실 및 이들의 조합이다. 임의로, 뉴클레오타이드 상의 변형은 2'-O-메틸, 2'-플루오로 또는 GNA, 및 이들의 조합을 포함한다. 관련된 양태에서, 뉴클레오타이드 상의 변형은 2'-O-메틸 또는 2'-플루오로 변형이다.
일양태에서, RNAi 제제는 2가 또는 3가 분지형 링커를 통해 부착된 하나 이상의 친유성, 예를 들어 C16 모이어티이거나 이를 포함하는 리간드를 포함한다.
다른 양태에서, 제제는 간 조직을 표적화하는 표적화 리간드, 예를 들어 하나 이상의 GalNAc 유도체를 추가로 포함한다.
또 다른 양태에서, 제제는 친유성 리간드, 예를 들어, 1가 또는 분지형 2가 또는 3가 링커를 통해 센스 가닥의 3' 말단에 접합된 C16 리간드, 및 간 조직을 표적화하는 표적화 리간드, 예를 들어, 1가 또는 분지형 2가 또는 3가 링커를 통해 센스 가닥의 3' 말단에 접합된 하나 이상의 GalNAc 유도체를 추가로 포함한다.
특정 양태에서, 리간드는 센스 가닥의 3' 말단에 부착된다.
일부 양태에서, RNAi 제제는 적어도 하나의 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드 간 연결을 추가로 포함한다. 관련 양태에서, 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드 간 연결은 하나의 가닥의 3'-말단에 있다. 임의로, 가닥은 안티센스 가닥이다. 또 다른 양태에서, 가닥은 센스 가닥이다. 관련 양태에서, 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드 간 연결은 하나의 가닥의 5'-말단에 있다. 임의로, 가닥은 안티센스 가닥이다. 또 다른 양태에서, 가닥은 센스 가닥이다.
또 다른 양태에서, 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드 간 연결은 하나의 가닥의 5'- 및 3'-말단 둘 다에 있다. 임의로, 가닥은 안티센스 가닥이다. 또 다른 양태에서, 가닥은 센스 가닥이다.
추가의 양태에서, RNAi 제제 듀플렉스의 안티센스 가닥의 5'-말단의 1 위치에서 염기쌍은 A:U 염기쌍이다.
특정 양태에서, Y 뉴클레오타이드는 2'-플루오로 변형을 포함한다.
일부 양태에서, Y' 뉴클레오타이드는 2'-O-메틸 변형을 포함한다.
특정 양태에서, p' > 0이다. 임의로, p'=2이다.
일부 양태에서, q'=0, p=0, q=0, 및 p' 오버행 뉴클레오타이드는 표적 mRNA에 상보적이다.
특정 양태에서, q'=0, p=0, q=0, 및 p' 오버행 뉴클레오타이드는 표적 mRNA에 비-상보적이다.
일양태에서, RNAi 제제의 센스 가닥은 총 21개의 뉴클레오타이드를 갖고, 안티센스 가닥은 총 23개의 뉴클레오타이드를 갖는다.
또 다른 양태에서I, 적어도 하나의 np'는 포스포로티오에이트 연결을 통해 이웃하는 뉴클레오타이드에 연결된다. 임의로, 모든 np'는 포스포로티오에이트 연결을 통해 이웃하는 뉴클레오타이드에 연결된다.
특정 양태에서, 본원 개시내용의 APOE RNAi 제제는 표 2-5 및 7-10에 열거된 것들 중 하나이다. 특정 양태에서, 본원 개시내용의 APOE RNAi 제제는 표 7 및 8에 열거된 것들 중 하나이다. 일부 양태에서, 센스 가닥의 모든 뉴클레오타이드 및 안티센스 가닥의 모든 뉴클레오타이드는 변형을 포함한다. 특정 양태에서, 본원 개시내용의 APOE RNAi 제제는 표 9 및 표 10에 열거된 것들 중 하나이다. 일부 양태에서, 센스 가닥의 모든 뉴클레오타이드 및 안티센스 가닥의 모든 뉴클레오타이드는 변형을 포함한다.
본원 개시내용의 또 다른 양상은 세포에서 APOE 유전자의 발현을 억제하기 위한 이중 가닥 RNAi 제제를 제공하고, 여기서 이중 가닥 RNAi 제제는 안티센스 가닥에 상보적인 센스 가닥을 포함하고, 여기서 안티센스 가닥은 APOE 유전자를 암호화하는 mRNA의 일부에 상보적인 영역을 포함하고, 여기서 각 가닥은 길이가 약 14 내지 약 30개의 뉴클레오타이드이고, 이중 가닥 RNAi 제제는 화학식 III으로 나타낸다:　
센스:
Figure pct00012
안티센스:
Figure pct00013
여기서:
i, j, k, 및 l은 각각 독립적으로 0 또는 1이고;
p, p', q, 및 q'는 각각 독립적으로 0 내지 6이고;
각각의 Na 및 Na'는 독립적으로, 변형되거나 변형되지 않거나 이의 조합인 0-25개의 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타내고, 각각의 서열은 적어도 2개의 상이하게 변형된 뉴클레오타이드를 포함하고;
각각의 Nb 및 Nb'는 독립적으로, 변형되거나 변형되지 않거나 이의 조합인 0-10개의 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타내고;
각각의 np, np', nq, 및 nq'는 이의 각각이 존재하거나 존재하지 않을 수 있고 독립적으로 오버행 뉴클레오타이드를 나타내고;
XXX, YYY, ZZZ, X'X'X', Y'Y'Y', 및 Z'Z'Z' 각각은 독립적으로 3개의 연속 뉴클레오타이드 상에 3개의 동일한 변형의 하나의 모티프를 나타내고, 여기서 상기 변형은 2'-O-메틸 또는 2'-플루오로 변형이고;
Nb에 대한 변형은 Y에 대한 변형과 상이하고, Nb'에 대한 변형은 Y'에 대한 변형과 상이하고;
여기서 상기 센스 가닥은 적어도 하나의 리간드에 접합되고, 임의로 리간드는 하나 이상의 친유성, 예를 들어, C16, 리간드 및/또는 하나 이상의 GalNAc 유도체이다.
특정 양태에서, 이중 가닥 RNAi 제제는 APOE2 대립유전자, APOE3 대립유전자 및 APOE4 대립유전자의 발현을 억제한다. 다른 양태에서, 이중 가닥 RNAi 제제는 APOE4의 발현을 억제하지만 APOE2 및 APOE3의 발현을 실질적으로 억제하지 않으며, 예를 들어 APOE2 및 APOE3의 발현은 약 10% 이하로 억제된다.
본원 개시내용의 추가의 양상은 세포에서 APOE 유전자의 발현을 억제하기 위한 이중 가닥 RNAi 제제를 제공하고, 여기서 이중 가닥 RNAi 제제는 안티센스 가닥에 상보적인 센스 가닥을 포함하고, 여기서 안티센스 가닥은 APOE를 암호화하는 mRNA의 일부에 상보적인 영역을 포함하고, 여기서 각 가닥은 약 14 내지 약 30개의 뉴클레오타이드 길이이고, 이중 가닥 RNAi 제제는 화학식 III으로 나타낸다:　
센스:
Figure pct00014
안티센스:
Figure pct00015
여기서:
i, j, k, 및 l은 각각 독립적으로 0 또는 1이고;
각각의 np, nq, 및 nq'는 이의 각각이 존재하거나 존재하지 않을 수 있고 독립적으로 오버행 뉴클레오타이드를 나타내고;
p, q, 및 q'는 각각 독립적으로 0 내지 6이고;
np' > 0이고 적어도 하나의 np'는 포스포로티오에이트 연결을 통해 이웃하는 뉴클레오타이드에 연결되고;
각각의 Na 및 Na'는 독립적으로, 변형되거나 변형되지 않거나 이의 조합인 0-25개의 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타내고, 각각의 서열은 적어도 2개의 상이하게 변형된 뉴클레오타이드를 포함하고;
각각의 Nb 및 Nb'는 독립적으로, 변형되거나 변형되지 않거나 이의 조합인 0-10개의 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타내고;
XXX, YYY, ZZZ, X'X'X', Y'Y'Y', 및 Z'Z'Z' 각각은 독립적으로 3개의 연속 뉴클레오타이드 상에 3개의 동일한 변형의 하나의 모티프를 나타내고, 여기서 상기 변형은 2'-O-메틸, 글리콜 핵산(GNA) 또는 2'-플루오로 변형이고;
Nb에 대한 변형은 Y에 대한 변형과 상이하고, Nb'에 대한 변형은 Y'에 대한 변형과 상이하고;
여기서 상기 센스 가닥은 적어도 하나의 리간드에 접합되고, 임의로 리간드는 하나 이상의 친유성, 예를 들어, C16, 리간드 및/또는 하나 이상의 GalNAc 유도체이다.
특정 양태에서, 이중 가닥 RNAi 제제는 APOE2 대립유전자, APOE3 대립유전자 및 APOE4 대립유전자의 발현을 억제한다. 다른 양태에서, 이중 가닥 RNAi 제제는 APOE4의 발현을 억제하지만 APOE2 및 APOE3의 발현을 실질적으로 억제하지 않으며, 예를 들어 APOE2 및 APOE3의 발현은 약 10% 이하로 억제된다.
본원 개시내용의 또 다른 양상은 세포에서 APOE 유전자의 발현을 억제하기 위한 이중 가닥 RNAi 제제를 제공하고, 여기서 이중 가닥 RNAi 제제는 안티센스 가닥에 상보적인 센스 가닥을 포함하고, 여기서 안티센스 가닥은 APOE를 암호화하는 mRNA의 일부에 상보적인 영역(서열번호 1, 또는 서열번호 1의 전체 뉴클레오타이드 서열과 적어도 90% 뉴클레오타이드 서열 동일성, 예를 들어, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열)을 포함하고, 여기서 각 가닥은 길이가 약 14 내지 약 30개의 뉴클레오타이드이고, 이중 가닥 RNAi 제제는 화학식 III으로 나타낸다:
센스:　
Figure pct00016
안티센스:　
Figure pct00017
여기서:
i, j, k, 및 l은 각각 독립적으로 0 또는 1이고;
각각의 np, nq, 및 nq'는 이의 각각이 존재하거나 존재하지 않을 수 있고 독립적으로 오버행 뉴클레오타이드를 나타내고;
p, q, 및 q'는 각각 독립적으로 0 내지 6이고;
np' > 0이고 적어도 하나의 np'는 포스포로티오에이트 연결을 통해 이웃하는 뉴클레오타이드에 연결되고;
각각의 Na 및 Na'는 독립적으로, 변형되거나 변형되지 않거나 이의 조합인 0-25개의 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타내고, 각각의 서열은 적어도 2개의 상이하게 변형된 뉴클레오타이드를 포함하고;
각각의 Nb 및 Nb'는 독립적으로, 변형되거나 변형되지 않거나 이의 조합인 0-10개의 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타내고;
XXX, YYY, ZZZ, X'X'X', Y'Y'Y', 및 Z'Z'Z' 각각은 독립적으로 3개의 연속 뉴클레오타이드 상에 3개의 동일한 변형의 하나의 모티프를 나타내고, 여기서 상기 변형은 2'-O-메틸 또는 2'-플루오로 변형이고;
Nb에 대한 변형은 Y에 대한 변형과 상이하고, Nb'에 대한 변형은 Y'에 대한 변형과 상이하고;
여기서 상기 센스 가닥은 적어도 하나의 리간드에 접합되고; 임의로 리간드는 하나 이상의 친유성, 예를 들어, C16, 리간드 및/또는 하나 이상의 GalNAc 유도체이다.
특정 양태에서, 이중 가닥 RNAi 제제는 APOE2 대립유전자, APOE3 대립유전자 및 APOE4 대립유전자의 발현을 억제한다. 다른 양태에서, 이중 가닥 RNAi 제제는 APOE4의 발현을 억제하지만 APOE2 및 APOE3의 발현을 실질적으로 억제하지 않으며, 예를 들어 APOE2 및 APOE3의 발현은 약 10% 이하로 억제된다.
본원 개시내용의 또 다른 양상은 세포에서 APOE 유전자의 발현을 억제하기 위한 이중 가닥 RNAi 제제를 제공하고, 여기서 이중 가닥 RNAi 제제는 안티센스 가닥에 상보적인 센스 가닥을 포함하고, 여기서 안티센스 가닥은 APOE를 암호화하는 mRNA의 일부에 상보적인 영역(서열번호 1, 또는 서열번호 1의 전체 뉴클레오타이드 서열과 적어도 90% 뉴클레오타이드 서열 동일성, 예를 들어, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열)을 포함하고, 여기서 각 가닥은 길이가 약 14 내지 약 30개의 뉴클레오타이드이고, 이중 가닥 RNAi 제제는 화학식 III으로 나타낸다:
센스:
Figure pct00018
안티센스:
Figure pct00019
여기서:
i, j, k, 및 l은 각각 독립적으로 0 또는 1이고;
각각의 np, nq, 및 nq'는 이의 각각이 존재하거나 존재하지 않을 수 있고 독립적으로 오버행 뉴클레오타이드를 나타내고;
p, q, 및 q'는 각각 독립적으로 0 내지 6이고;
np' > 0이고 적어도 하나의 np'는 포스포로티오에이트 연결을 통해 이웃하는 뉴클레오타이드에 연결되고;
각각의 Na 및 Na'는 독립적으로, 변형되거나 변형되지 않거나 이의 조합인 0-25개의 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타내고, 각각의 서열은 적어도 2개의 상이하게 변형된 뉴클레오타이드를 포함하고;
각각의 Nb 및 Nb'는 독립적으로, 변형되거나 변형되지 않거나 이의 조합인 0-10개의 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타내고;
XXX, YYY, ZZZ, X'X'X', Y'Y'Y', 및 Z'Z'Z' 각각은 독립적으로 3개의 연속 뉴클레오타이드 상에 3개의 동일한 변형의 하나의 모티프를 나타내고, 여기서 상기 변형은 2'-O-메틸 또는 2'-플루오로 변형이고;
Nb에 대한 변형은 Y에 대한 변형과 상이하고, Nb′에 대한 변형은 Y'에 대한 변형과 상이하고;
여기서 센스 가닥은 적어도 하나의 포스포로티오에이트 연결을 포함하고;
여기서 상기 센스 가닥은 적어도 하나의 리간드에 접합되고, 임의로 리간드는 하나 이상의 친유성, 예를 들어, C16, 리간드 및/또는 하나 이상의 GalNAc 유도체이다.
특정 양태에서, 이중 가닥 RNAi 제제는 APOE2 대립유전자, APOE3 대립유전자 및 APOE4 대립유전자의 발현을 억제한다. 다른 양태에서, 이중 가닥 RNAi 제제는 APOE4의 발현을 억제하지만 APOE2 및 APOE3의 발현을 실질적으로 억제하지 않으며, 예를 들어 APOE2 및 APOE3의 발현은 약 10% 이하로 억제된다.
본원 개시내용의 또 다른 양상은 세포에서 APOE 유전자의 발현을 억제하기 위한 이중 가닥 RNAi 제제를 제공하고, 여기서 이중 가닥 RNAi 제제는 안티센스 가닥에 상보적인 센스 가닥을 포함하고, 여기서 안티센스 가닥은 APOE를 암호화하는 mRNA의 일부에 상보적인 영역(서열번호 1, 또는 서열번호 1의 전체 뉴클레오타이드 서열과 적어도 90% 뉴클레오타이드 서열 동일성, 예를 들어, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열)을 포함하고, 여기서 각 가닥은 길이가 약 14 내지 약 30개의 뉴클레오타이드이고, 이중 가닥 RNAi 제제는 화학식 III으로 나타낸다:　
센스:　
Figure pct00020
안티센스:
Figure pct00021
여기서:
각각의 np, nq, 및 nq'는 이의 각각이 존재하거나 존재하지 않을 수 있고 독립적으로 오버행 뉴클레오타이드를 나타내고;
p, q, 및 q'는 각각 독립적으로 0 내지 6이고;
np' > 0이고 적어도 하나의 np'는 포스포로티오에이트 연결을 통해 이웃하는 뉴클레오타이드에 연결되고;
각각의 Na 및 Na'는 독립적으로, 변형되거나 변형되지 않거나 이의 조합인 0-25개의 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타내고, 각각의 서열은 적어도 2개의 상이하게 변형된 뉴클레오타이드를 포함하고;
YYY 및 Y'Y'Y' 각각은 독립적으로 3개의 연속 뉴클레오타이드 상에 3개의 동일한 변형의 하나의 모티프를 나타내고, 여기서 상기 변형은 2'-O-메틸 또는 2'-플루오로 변형이고;
여기서 센스 가닥은 적어도 하나의 포스포로티오에이트 연결을 포함하고;
여기서 센스 가닥은 적어도 하나의 리간드에 접합되고, 임의로 리간드는 하나 이상의 친유성, 예를 들어, C16, 리간드 및/또는 하나 이상의 GalNAc 유도체이다.
특정 양태에서, 이중 가닥 RNAi 제제는 APOE2 대립유전자, APOE3 대립유전자 및 APOE4 대립유전자의 발현을 억제한다. 다른 양태에서, 이중 가닥 RNAi 제제는 APOE4의 발현을 억제하지만 APOE2 및 APOE3의 발현을 실질적으로 억제하지 않으며, 예를 들어 APOE2 및 APOE3의 발현은 약 10% 이하로 억제된다.
본원 개시내용의 추가의 양상은 APOE 유전자의 발현을 억제하기 위한 이중 가닥 RNAi 제제를 제공하고, 여기서 APOE에 표적화된 이중 가닥 RNAi 제제는 이중 가닥 영역을 형성하는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, 여기서 센스 가닥은 서열번호 1, 3, 5, 7 및 9의 뉴클레오타이드 서열 또는 서열번호 1, 3, 5, 7 또는 9 중 어느 하나의 전체 뉴클레오타이드 서열과 적어도 90% 뉴클레오타이드 서열 동일성, 예를 들어, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열 중 어느 하나와 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 (즉, 3, 2, 1 또는 0개의 뉴클레오타이드가 상이한) 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하고, 안티센스 가닥은 서열번호 2, 4, 6, 8 및 10의 뉴클레오타이드 서열 또는 서열번호 2, 4, 6, 8 및 10 중 어느 하나의 전체 뉴클레오타이드 서열과 적어도 90% 뉴클레오타이드 서열 동일성, 예를 들어, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열 중 어느 하나와 3개 이하의 뉴클레오타드가 상이한 (즉, 3, 2, 1 또는 0개의 뉴클레오타이드가 상이한) 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하고; 여기서 서열번호 1 내지 10에서 제공된 서열 중 우라실의 임의의 티민으로의 치환 (정렬된 서열과 비교하는 경우)은 서열번호 1-10에 제공된 뉴클레오타이드 서열 중 어느 하나와 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 것에 기여하는 차이로서 계수하지 않고, 여기서 센스 가닥의 실질적으로 모든 뉴클레오타이드는 2'-O-메틸 변형, GNA 또는 2'-플루오로 변형인 변형을 포함하고, 여기서 센스 가닥은 5'-말단에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결을 포함하고, 안티센스 가닥의 실질적으로 모든 뉴클레오타이드는 2'-O-메틸 변형 및 2'-플루오로 변형으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 변형을 포함하고, 여기서 안티센스 가닥은 5'-말단에 2개의 포스포티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 및 3'-말단에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결을 포함하고, 여기서 센스 가닥은 하나 이상의 친유성, 예를 들어, 임의로 간 표적화 리간드를 추가로 포함하는 C16 리간드, 예를 들어, 하나 이상의 GalNAc 유도체를 포함하는 리간드에 접합된다.
특정 양태에서, 이중 가닥 RNAi 제제는 APOE2 대립유전자, APOE3 대립유전자 및 APOE4 대립유전자의 발현을 억제한다. 다른 양태에서, 이중 가닥 RNAi 제제는 APOE4의 발현을 억제하지만 APOE2 및 APOE3의 발현을 실질적으로 억제하지 않으며, 예를 들어 APOE2 및 APOE3의 발현은 약 10% 이하로 억제된다.
본원 개시내용의 또 다른 양상은 APOE 유전자의 발현을 억제하기 위한 이중 가닥 RNAi 제제를 제공하고, 여기서 APOE에 표적화된 이중 가닥 RNAi 제제는 이중 가닥 영역을 형성하는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, 여기서 센스 가닥은 서열번호 1, 3, 5, 7 및 9의 뉴클레오타이드 서열 또는 서열번호 1, 3, 5, 7 또는 9 중 어느 하나의 전체 뉴클레오타이드 서열과 적어도 90% 뉴클레오타이드 서열 동일성, 예를 들어, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열 중 어느 하나와 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 (즉, 3, 2, 1 또는 0개의 뉴클레오타이드가 상이한) 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하고, 안티센스 가닥은 서열번호 2, 4, 6, 8 및 10의 뉴클레오타이드 서열 또는 서열번호 2, 4, 6, 8 및 10 중 어느 하나의 전체 뉴클레오타이드 서열과 적어도 90% 뉴클레오타이드 서열 동일성, 예를 들어, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열 중 어느 하나와 3개 이하의 뉴클레오타드가 상이한 (즉, 3, 2, 1 또는 0개의 뉴클레오타이드가 상이한) 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하고; 여기서 서열번호 1 내지 10에서 제공된 서열 중 우라실의 임의의 티민으로의 치환 (정렬된 서열과 비교하는 경우)은 서열번호 1-10에 제공된 뉴클레오타이드 서열 중 어느 하나와 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 것에 기여하는 차이로서 계수하지 않고, 여기서 센스 가닥은 적어도 하나의 3'-말단 데옥시-티미딘 뉴클레오타이드(dT)를 포함하고, 안티센스 가닥은 적어도 하나의 3'-말단 데옥시-티미딘 뉴클레오타이드(dT)를 포함한다.
특정 양태에서, 이중 가닥 RNAi 제제는 APOE2 대립유전자, APOE3 대립유전자 및 APOE4 대립유전자의 발현을 억제한다. 다른 양태에서, 이중 가닥 RNAi 제제는 APOE4의 발현을 억제하지만 APOE2 및 APOE3의 발현을 실질적으로 억제하지 않으며, 예를 들어 APOE2 및 APOE3의 발현은 약 10% 이하로 억제된다.
일양태에서, 센스 가닥의 모든 뉴클레오타이드 및 안티센스 가닥의 모든 뉴클레오타이드는 변형된 뉴클레오타이드이다.
또 다른 양태에서, 각각의 가닥은 19-30개의 뉴클레오타이드를 갖는다.
특정 양태에서, RNAi 제제의 안티센스 가닥은 5' 영역 또는 이의 전구체의 처음 9개의 뉴클레오타이드 위치 내의 듀플렉스의 적어도 하나의 열 불안정화 변형을 포함한다. 임의로, 듀플렉스의 열 불안정화 변형은 하기 중 하나 이상이다:
Figure pct00022
여기서, B는 뉴클레오염기이다.
본원 개시내용의 또 다른 양상은 본원 개시내용의 이중 가닥 RNAi 제제를 함유하는 세포를 제공한다.
본원 개시내용의 추가적인 양상은 본원 개시내용의 이중 가닥 RNAi 제제를 포함하는 APOE 유전자의 발현을 억제하기 위한 약제학적 조성물을 제공한다.
일양태에서, 이중 가닥 RNAi 제제는 비완충 용액으로 투여된다. 임의로, 비완충 용액은 식염수 또는 물이다.
또 다른 양태에서, 이중 가닥 RNAi 제제는 완충 용액으로 투여된다. 임으로, 완충 용액은 아세테이트, 시트레이트, 프롤라민, 카보네이트 또는 포스페이트, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 또 다른 양태에서, 완충 용액은 포스페이트 완충 식염수(PBS)이다.
본원 개시내용의 또 다른 양상은 본원 개시내용의 이중 가닥 RNAi 제제 및 지질 제형을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
일양태에서, 지질 제형은 지질 나노입자(LNP)를 포함한다.
본원 개시내용의 추가의 양상은 세포에서 APOE 유전자의 발현을 억제하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 (a) 세포를 본원 개시내용의 이중 가닥 RNAi 제제 또는 본원 개시내용의 약제학적 조성물과 접촉시키는 단계; 및 (b) 단계 (a)에서 생산된 세포를 APOE 유전자의 mRNA 전사체의 분해를 수득하기에 충분한 시간 동안 유지하여 세포에서 APOE 유전자의 발현을 억제하는 단계를 포함한다.
일양태에서, 세포는 대상체 내에 있다. 임의로, 대상체는 인간이다.
특정 양태에서, 대상체는 레서스 몽키(rhesus monkey), 시노몰구스 몽키(cynomolgous monkey), 마우스 또는 래트이다.
특정 양태에서, 인간 대상체는 APOE-관련 신경변성 질환, 예를 들어, 아밀로이드-β-매개된 질환, 예를 들어, 알츠하이머 질환, 다운 증후군 및 대뇌 아밀로이드 혈관병증, 또는 tau-매개된 질환, 예를 들어, 1차 타우병증, 예를 들어, 전두측두엽 치매(FTD), 진행성 핵상 마비(PSP), 척수기저 변성(CBD), 픽 질환(PiD), 구상 신경교 타우병증(GGT), 파킨슨 질환을 동반한 전두측두엽 치매(FTDP, FTDP-17), 만성 외상성 뇌병증(CTE), 권투선수 치매, 전두측두엽 변성(FTLD), 호은성 곡물병(AGD: Argyrophilic grain disease) 및 1차 연령 관련 타우병증(PART), 또는 2차 타우병증, 예를 들어, AD, 크로이츠펠트 야콥 질환, 다운 증후군 및 가족성 영국 치매를 앓는다.
특정 양태에서, 방법은 콜린에스테라제 억제제 및/또는 메만틴과 같은 추가 치료학적 제제를 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
특정 양태에서, 이중 가닥 RNAi 제제는 약 0.01　mg/kg 내지 약 50 mg/kg의 용량으로 투여된다.
일부 양태에서, 이중 가닥 RNAi 제제는 대상체에 척수강내로 투여된다.
일양태에서, 방법은 뇌(예를 들어, 선조체) 또는 척추 조직에서 APOE 유전자의 발현을 감소시킨다. 임의로, 뇌 또는 척추 조직은 선조체, 피질, 소뇌, 경추, 요추 또는 흉추이다.
일부 양태에서, 이중 가닥 RNAi 제제는 피하로 대상체에게 투여된다.
일양태에서, 방법은 간에서 APOE 유전자의 발현을 감소시킨다.
다른 양태에서, 방법은 간 및 뇌에서 APOE 유전자의 발현을 감소시킨다.
본원 개시내용의 또 다른 양상은 대상체에서 APOE의 발현을 억제하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 대상체에게 치료학적 유효량의 본원 개시내용의 이중 가닥 RNAi 제제 또는 본원 개시내용의 약제학적 조성물을 투여하여 대상체에서 APOE의 발현을 억제하는 단계를 포함한다.
본원 개시내용의 추가의 양상은 대상체에서 장애 또는 APOE-관련 신경변성 질환 또는 장애를 치료하거나 예방하기 위한 방법을 제공하고, 상기 방법은 대상체에게 치료학적 유효량의 본원 개시내용의 이중 가닥 RNAi 제제 또는 본원 개시내용의 약제학적 조성물을 투여하여 대상체에서 APOE-관련 신경변성 질환 또는 장애를 치료하거나 예방하는 단계를 포함한다.
특정 양태에서, APOE-관련 신경변성 질환은 아밀로이드-β-매개된 질환, 예를 들어, 알츠하이머 질환, 다운 증후군 및 대뇌 아밀로이드 혈관병증으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아밀로이드-β-매개된 질환이다.
특정 양태에서, APOE-관련 신경변성 질환은 tau-매개된 질환, 예를 들어, 1차 타우병증 또는 2차 타우병증이다.
특정 양태에서, 1차 타우병증은 전두측두엽 치매(FTD), 진행성 핵상 마비(PSP), 코르디코기저 변성(CBD), 픽 질환(PiD), 구상 신경교 타우병증(GGT), 파킨슨병을 동반한 전두측두엽 치매(FTDP, FTDP-17), 만성 외상성 뇌병증(CTE), 권투선수 치매, 전두측두엽 변성(FTLD), 호은성 곡물 질환(AGD) 및 1차 연령 관련 타우병증(PART)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
특정 양태에서, 2차 타우병증은 AD, 크로이츠펠트 야콥 질환, 다운 증후군 및 가족성 영국 치매로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
본원 개시내용의 또 다른 양상은 본원 개시내용의 방법을 수행하기 위한 키트를 제공하고, 키트는 a) 본원 개시내용의 이중 가닥 RNAi 제제, 및 b) 사용 지침서, 및 c) 임의로, 대상체에게 이중 가닥 RNAi 제제에 투여하기 위한 장치를 포함한다.
본원 개시내용의 추가의 양상은 APOE 유전자의 발현을 억제하기 위한 이중 가닥 리보핵산(RNAi) 제제를 제공하고, 여기서 RNAi 제제는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 갖고, 여기서 안티센스 가닥은 표 2-5 및 7-10의 안티센스 가닥 뉴클레오염기 서열 중 어느 하나와 3개 이하의 뉴클레오타이드와 상이한 (즉, 3, 2, 1 또는 0개의 뉴클레오타이드가 상이한) 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드, 예를 들어, 적어도 15개의 뉴클레오타이드 (즉, 3, 2, 1, 또는 0개의 뉴클레오타이드가 상이한), 적어도 19개의 뉴클레오타이드 (즉, 3, 2, 1 또는 0개의 뉴클레오타이드가 상이한)를 포함하는 상보성 영역을 포함한다. 일양태에서, RNAi 제제는 하기 변형 중 하나 이상을 포함한다: 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오타이드, 2'-플루오로 변형된 뉴클레오타이드, 2'-C-알킬-변형된 뉴클레오타이드, 글리콜 핵산(GNA)을 포함하는 뉴클레오타이드, 포스포로티오에이트(PS) 및 비닐 포스포네이트(VP). 임의로, RNAi 제제는 하기 변형 각각의 적어도 하나를 포함한다: 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오타이드, 2'-플루오로 변형된 뉴클레오타이드, 2'-C-알킬-변형된 뉴클레오타이드, 글리콜 핵산(GNA)을 포함하는 뉴클레오타이드, 포스포로티오에이트 및 비닐 포스포네이트(VP).
특정 양태에서, 이중 가닥 RNAi 제제는 APOE2 대립유전자, APOE3 대립유전자 및 APOE4 대립유전자의 발현을 억제한다. 다른 양태에서, 이중 가닥 RNAi 제제는 APOE4의 발현을 억제하지만 APOE2 및 APOE3의 발현을 실질적으로 억제하지 않으며, 예를 들어 APOE2 및 APOE3의 발현은 약 10% 이하로 억제된다.
또 다른 양태에서, RNAi 제제는 4개 이상의 PS 변형, 임의로 6 내지 10개의 PS 변형, 임의로 8개의 PS 변형을 포함한다.
추가 양태에서, RNAi 제제의 센스 가닥 및 안티센스 가닥 각각은 5'-말단 및 3'-말단을 갖고, RNAi 제제는 RNAi 제제의 센스 및 안티센스 가닥 각각의 3'- 및 5'-말단 각각으로부터 끝에서 두번째 및 최종 뉴클레오타이드 간 연결 각각에 위치하는 8개의 PS 변형을 포함한다.
또 다른 양태에서, RNAi 제제의 센스 가닥 및 안티센스 가닥 각각은 5'-말단 및 3'-말단을 포함하고, RNAi 제제는 GNA를 포함하는 단지 하나의 뉴클레오타이드를 포함한다. 임의로, GNA를 포함하는 뉴클레오타이드는 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 7번째 뉴클레오염기 잔기에서 안티센스 가닥 상에 위치한다.
추가의 양태에서, RNAi 제제의 센스 가닥 및 안티센스 가닥 각각은 5'-말단 및 3'-말단을 포함하고, RNAi 제제는 1 내지 4개의 2'-C-알킬-변형된 뉴클레오타이드를 포함한다. 임의로, 2'-C-알킬-변형된 뉴클레오타이드는 2'-C16-변형된 뉴클레오타이드이다. 임의로, RNAi 제제는 단일 2'- C-알킬, 예를 들어, C16-변형된 뉴클레오타이드를 포함한다. 임의로, 단일 2'-C-알킬, 예를 들어 C16-변형된 뉴클레오타이드는 센스 가닥의 5'-말단으로부터 6번째 뉴클레오염기 위치에서 센스 가닥 상에 위치한다.
또 다른 양태에서, RNAi 제제의 센스 가닥 및 안티센스 가닥 각각은 5'-말단 및 3'-말단을 포함하고, RNAi 제제는 2개 이상의 2'-플루오로 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다. 임의로, RNAi 제제의 센스 가닥 및 안티센스 가닥 각각은 2개 이상의 2'-플루오로 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다. 임의로, 2'-플루오로 변형된 뉴클레오타이드는 센스 가닥의 5'-말단으로부터 뉴클레오염기 위치 7, 9, 10 및 11에서 센스 가닥상에 그리고 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 뉴클레오염기 위치 2, 14 및 16에서 안티센스 가닥 상에 위치한다.
추가의 양태에서, RNAi 제제의 센스 가닥 및 안티센스 가닥 각각은 5'-말단 및 3'-말단을 포함하고, RNAi 제제는 하나 이상의 VP 변형을 포함한다. 임의로, RNAi 제제는 안티센스 가닥의 5'-말단에 단일 VP 변형을 포함한다.
또 다른 양태에서, RNAi 제제의 센스 가닥 및 안티센스 가닥 각각은 5'-말단 및 3'-말단을 포함하고, RNAi 제제는 2개 이상의 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다. 임의로, RNAi 제제는 2'-플루오로, 2'-C-알킬 또는 글리콜 핵산(GNA)에 의해 변형되지 않은 모든 뉴클레오염기 위치에서 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다. 임의로, 2개 이상의 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오타이드는 센스 가닥의 5'-말단으로부터 위치 1, 2, 3, 4, 5, 8, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 및 21에서 센스 가닥 상에 그리고 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 위치 1, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 17, 18, 19, 20, 21, 22 및 23에서 안티센스 가닥 상에 위치한다.
하나의 양상에서, 본 발명은 성상세포 내 APOE 유전자의 발현을 억제하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 성상세포를 본 발명의 dsRNA 제제 또는 약제학적 조성물과 접촉시키는 단계; 및 APOE 유전자의 mRNA 전사체의 분해를 수득하기에 충분한 시간 동안 생성된 성상세포를 유지함으로써 성상세포에서 APOE 유전자의 발현을 억제하는 단계를 포함한다.
특정 양태에서, 세포는 대상체, 예를 들어, 인간 대상체 내에 있다.
일부 양태에서, 성상세포와 접촉시키는 단계는 약제학적 조성물의 척추강내 투여에 의한 것이다.
특정 양태에서, dsRNA 제제의 안티센스 가닥은 AD-1204704, AD-1204705, AD-1204708, 및 AD-1204712로 이루어진 그룹으로부터 선택된 듀플렉스의 안티센스 가닥 뉴클레오타이드 서열 중 어느 하나와 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함한다.
도 1a는 투여 후 14일째에 뇌실내 주사(ICV)에 의한 지적된 듀플렉스 또는 인공 CSF(aCSF) 대조군의 단일 300 μg 용량을 투여받은 동형접합 인간화 APOE 녹인 마우스의 뇌의 우측 반구(BRH)에 잔류하는 APOE mRNA의 퍼센트를 나타내는 그래프이다.
도 1b는 투여 후 14일째에 뇌실내 주사(ICV)에 의한 지적된 듀플렉스 또는 인공 CSF(aCSF) 대조군의 단일 300 μg 용량을 투여받은 동형접합 인간화 APOE 녹인 마우스의 간에 잔류하는 APOE mRNA의 퍼센트를 나타내는 그래프이다.
도 2는 제제 AD-1204704, AD-1204705, AD-1204705, AD-1204706 AD-1204707, AD-1204708, AD-1204709, AD-1204710, AD-1204711, AD-1204712, 및 AD-1204713의 시험관내 활성과 제제의 생체내 활성의 상관관계를 도시하는 그래프이다.
본원 개시내용은 유전자의 RNA 전사체의 RNA-유도된 사일런싱 복합체 (RISC)-매개된 절단에 영향을 미치는 RNAi 조성물을 제공한다. APOE 유전자는 세포, 예를 들어, 인간과 같은 대상체 내 세포 내에 존재할 수 있다. 본원 개시내용은 또한 APOE 유전자의 발현을 억제하기 위해 또는 APOE 유전자, 예를 들어, 병원성 APOE 대립유전자, 즉, APOE4의 발현을 억제 또는 감소시키는 것이 이득이 되는 장애, 예를 들어, APOE-관련 신경변성 질환, 예를 들어, 아밀로이드-β-매개된 질환 또는 tau-매개된 질환을 갖는 대상체를 치료하기 위해 본원 개시내용의 RNAi 조성물을 사용하는 방법을 제공한다.
본원 개시내용의 RNAi 제제는 길이가 약 30개 이하인 뉴클레오타이드, 예를 들어, 길이가 15-30, 15-29, 15-28, 15-27, 15-26, 15-25, 15-24, 15-23, 15-22, 15-21, 15-20, 15-19, 15-18, 15-17, 18-30, 18-29, 18-28, 18-27, 18-26, 18-25, 18-24, 18-23, 18-22, 18-21, 18-20, 19-30, 19-29, 19-28, 19-27, 19-26, 19-25, 19-24, 19-23, 19-22, 19-21, 19-20, 20-30, 20-29, 20-28, 20-27, 20-26, 20-25, 20-24,20-23, 20-22, 20-21, 21-30, 21-29, 21-28, 21-27, 21-26, 21-25, 21-24, 21-23, 또는 21-22개의 뉴클레오타이드인 영역을 갖는 RNA 가닥(안티센스 가닥)을 포함하고, 상기 영역은 실질적으로 APOE 유전자의 mRNA 전사체의 적어도 일부에 상보적이다. 특정 양태에서, 본원 개시내용의 RNAi 제제는 길이가 21-23개의 뉴클레오타이드인 영역을 갖는 RNA 가닥(안티센스 가닥)을 포함하고, 상기 영역은 실질적으로 APOE 유전자의 mRNA 전사체의 적어도 일부에 상보적이다.
특정 양태에서, 본원 개시내용의 RNAi 제제는 길이가 66개 이하의 뉴클레오타이드, 예를 들어, 길이가 36-66, 26-36, 25-36, 31-60, 22-43, 27-53개의 뉴클레오타이드인 보다 긴 길이를 포함할 수 있는 RNA 가닥(안티센스 가닥)을 포함하고, APOE 유전자의 mRNA 전사체의 적어도 일부에 실질적으로 상보적인 적어도 19개의 연속 뉴클레오타이드의 영역을 갖는다. 보다 긴 길이의 안티센스 가닥을 갖는 이들 iRNA 제제는 바람직하게 길이가 20-60개의 뉴클레오타이드인 제2 RNA 가닥(센스 가닥)을 포함하고, 여기서, 센스 및 안티센스 가닥은 18-30개의 연속 뉴클레오타이드의 듀플렉스를 형성한다.
이들 RNAi 제제의 사용은 포유류에서 APOE 유전자의 mRNA의 표적화된 분해를 가능하게 한다. 따라서, 이들 RNAi 제제를 포함하는 방법 및 조성물은 APOE 단백질의 수준 또는 활성 감소가 이득이 되는 대상체, 예를 들어 APOE-관련 신경변성 질환, 예를 들어, 아밀로이드-β-매개된 질환 또는 tau-매개된 질환을 갖는 대상체를 치료하는데 유용하다.
하기의 상세한 설명은 APOE 유전자의 발현을 억제하기 위한 RNAi 제제를 함유하는 조성물을 제조하고 사용하는 방법뿐만 아니라 유전자의 발현의 억제 또는 감소가 이득이 되는 질환 및 장애를 갖는 대상체를 치료하기 위한 조성물 및 방법을 개시한다.
I. 정의
본원 개시내용이 보다 용이하게 이해될 수 있도록 하기 위해, 특정 용어를 먼저 정의한다. 또한, 파라미터의 값 또는 값의 범위가 언급될 때마다, 언급된 값의 중간 값 및 범위도 본원 개시내용의 일부인 것으로 의도된다는 점에 유의해야 한다.
단수형 관사("a" 및 "an")는 본원에서 하나 또는 하나 초과(즉, 적어도 하나)의 해당 관사의 문법적 대상을 지칭하는데 사용된다. 예를 들어, "요소"는 하나의 요소 또는 하나 초과의 요소, 예를 들어, 복수의 요소를 의미한다.
용어 "포함하는"은 문구 "을 포함하지만 이에 제한되지 않는"을 의미하기 위해 본원에 사용되고 이와 상호교환적으로 사용된다. 용어 "또는"은 달리 명백하게 지적되지 않는 경우, 용어 "및/또는"을 의미하기 위해 본원에 사용되고 이와 상호교환적으로 사용된다.
용어 "약"은 당업계에서 전형적인 허용되는 범위 내에 있음을 의미하기 위해 본운에 사용된다. 예를 들어, "약"은 평균으로부터 약 2 표준 편차로서 이해될 수 있다. 특정 양태에서, 약은 ±10%를 의미한다. 특정 양태에서, 약은 ±5%를 의미한다. 약이 일련의 숫자 또는 범위 앞에 존재하는 경우, "약"은 일련의 또는 범위 내 각 숫자를 수식할 수 있는 것으로 이해된다.
숫자 또는 일련의 숫자 앞의 "적어도", "이상", 또는 "이상"이라는 용어는 "적어도"라는 용어에 인접한 숫자와 문맥상 분명한 바와 같이 논리적으로 포함될 수 있는 모든 후속 숫자 또는 정수를 포함하는 것으로 이해된다. 예를 들어, 핵산 분자 내 뉴클레오타이드의 수는 정수이어야 한다. 예를 들어, "21개의 뉴클레오타이드 핵산 분자의 적어도 18개의 뉴클레오타이드"는 18, 19, 20, 또는 21개의 뉴클레오타이드가 지적된 성질을 가짐을 의미한다. 적어도가 일련의 숫자 또는 범위 앞에 존재하는 경우, "적어도"는 일련의 또는 범위 내 각 숫자를 수식할 수 있는 것으로 이해된다.
본원에 사용된 바와 같은 "이하" 또는 "미만"은 구문에 인접한 값으로 이해되고, 문맥상 논리적으로 0까지 논리적으로 낮은 값 또는 정수로서 이해된다. 예를 들어, "2개 이하의 뉴클레오타이드"의 오버행을 갖는 듀플렉스는 2, 1, 또는 0개의 뉴클레오타이드 오버행을 갖는다. "이하"가 일련의 숫자 또는 범위 앞에 존재하는 경우, "이하"는 일련의 또는 범위 내 각 숫자를 수식할 수 있는 것으로 이해된다.
본원에 사용된 바와 같이, 검출 방법은 존재하는 분석물의 양이 방법의 검출 수준 미만인 결정을 포함할 수 있다.
지정된 표적 부위와 센스 또는 안티센스 가닥에 대한 뉴클레오타이드 서열 간에 충돌이 있는 경우, 지정된 서열이 우선한다.
화학 구조와 화학명 간이 충돌이 있는 경우, 화학 구조가 우선한다.
"아포지단백질 E", "알츠하이머 질환 2", "LPG" 및 "LDLCQ5"로도 알려진 용어 "APOE" 또는 "APOE"는 APOE 단백질을 암호화하는 잘 알려진 유전자를 지칭한다. APOE는 몸 전체, 주로 간에서 합성되고 지질 수송 단백질로서 기능하며 저밀도 지단백질(LDL) 수용체에 대한 주요 리간드이다. APOE는 콜레스테롤 대사 및 심혈관 질환에서 역할을 하는 것으로 나타났고, 보다 최근에는, 알츠하이머 질환의 주요 위험 인자로 부상하였고, 다른 신경변성 질환의 병리와 관련이 있다.
APOE의 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열은 예를 들어, GenBank 승인 번호. NM_000041.4(호모 사피엔스(Homo sapiens) APOE, 서열번호 1, 역 상보체, 서열번호 2); GenBank 승인 번호 NM_001270681.1(라투스 노르베기쿠스(Rattus norvegicus) APOE, 서열번호 3; 역 상보체, 서열번호 4); GenBank 승인 번호 NM_001305843.1(무스 무스쿨루스(Mus musculus) APOE, 서열번호 5, 역 상보체, 서열번호 6); GenBank 승인 번호 XM_028839202.1(마카카 물라타(Macaca mulatta) APOE, 서열번호 7, 역 상보체, 서열번호 8); 및 GenBank 승인 번호 XM_005589554.2(마카카 파시쿨라리스(Macaca fascicularis) APOE, 서열번호 9, 역 상보체, 서열번호 10)에서 찾을 수 있다.
APOE 서열의 추가의 예는 예를 들어, 대중에게 가용한 데이터베이스, 예를 들어, GenBank, OMIM, 및 UniProt에서 찾을 수 있다. APOE에 대한 추가의 정보는 예를 들어, www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/348에서 찾을 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 APOE는 또한 예를 들어, ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/?term=APOE[gene]에서 SNP 데이터베이스에 제공된 인간 APOE의 변이체를 포함하는 APOE 유전자의 변이를 지칭한다.
인간 APOE 유전자는 3개의 가장 통상적인 변이체, APOE2 (또한 APOE*ε2 또는 ε2; Cys112, Cys158로서 지칭됨), APOE3(또한 APOE*ε3 또는 ε3; Cys112, Arg 158로서 지칭됨), 및 APOE4(또한 APOE*ε4 또는 ε4 (Arg112, Arg158)로서 지칭됨)를 유도하는 2개의 단일 뉴클레오타이드 다형태를 포함한다. GenBank 승인 번호 NM_000041.4(호모 사피엔스(Homo sapiens) APOE, 서열번호 1, 역 상보체, 서열번호 2)는 APOE*ε3(APOE3) 변이체의 뉴클레오타이드 서열이고; APOE*ε2(APOE2) 변이체는 서열번호 1의 뉴클레오타이드 595>T에서 단일 뉴클레오타이드 변화를 갖고, APOE*ε4(APOE4) 변이체는 서열번호 1의 뉴클레오타이드 457T>C에서 단일 뉴클레오타이드 변화를 갖는다.
본원에 특정되지 않는 경우, 용어 "APOE", "ApoE" 등은 3개의 APOE 변이체 또는 대립유전자 중 임의의 하나 이상을 지칭하는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 본원에서 사용되는 용어 "APOE 유전자"는 APOE2 대립유전자, APOE3 대립유전자 및/또는 APOE4 대립유전자"를 지칭하는 반면, 용어 "APOE4 대립유전자" 등은 APOE4 대립유전자만을 지칭한다.
본원에 사용된 "표적 서열"은 1차 전사 생성물의 RNA 처리 생성물인 mRNA를 포함하는 APOE 유전자의 전사 동안 형성된 mRNA 분자의 뉴클레오타이드 서열의 연속 부분을 지칭한다. 일양태에서, 서열의 표적 부분은 APOE 유전자의 전사 동안 형성된 mRNA 분자의 뉴클레오타이드 서열 부분에서 또는 그 부분 근처에서 iRNA-지시된 절단을 위한 기질로 작용하기에 충분히 길 것이다.
표적 서열은 길이가 약 15-30개의 뉴클레오타이드이다. 예를 들어, 표적 서열은 길이가 약 15-30개의 뉴클레오타이드, 15-29, 15-28, 15-27, 15-26, 15-25, 15-24, 15-23, 15-22, 15-21, 15-20, 15-19, 15-18, 15-17, 18-30, 18-29, 18-28, 18-27, 18-26, 18-25, 18-24, 18-23, 18-22, 18-21, 18-20, 19-30, 19-29, 19-28, 19-27, 19-26, 19-25, 19-24, 19-23, 19-22, 19-21, 19-20, 20-30, 20-29, 20-28, 20-27, 20-26, 20-25, 20-24,20-23, 20-22, 20-21, 21-30, 21-29, 21-28, 21-27, 21-26, 21-25, 21-24, 21-23, 또는 21-22개의 뉴클레오타이드일 수 있다. 특정 양태에서, 표적 서열은 길이가 19-23개의 뉴클레오타이드, 임의로 길이가 21-23개의 뉴클레오타이드이다. 상기 언급된 범위 및 길이의 중간 범위 및 길이는 또한 본원 개시내용의 일부인 것으로 고려된다.
본원에 사용된 용어 "서열을 포함하는 가닥"은 표준 뉴클레오타이드 명명법을 사용하여 언급된 서열에 의해 기재된 뉴클레오타이드 쇄를 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 지칭한다.
"G," "C," "A," "T", 및 "U"는 각각 일반적으로 변형된 또는 비변형된 뉴클레오타이드와 관련하여 각각 염기로서 구아닌, 시토신, 아데닌, 티미딘 및 우라실을 포함하는 뉴클레오타이드를 의미한다. 그러나, 용어 "리보뉴클레오타이드" 또는 "뉴클레오타이드"는 또한 하기에 추가로 상세히 설명되는 바와 같이, 변형된 뉴클레오타이드, 또는 대용 치환 모이어티(예를 들어, 표 1 참조)를 지칭할 수 있음이 이해될 것이다. 통상의 숙련가는 구아닌, 시토신, 아데닌, 티미딘 및 우라실이 이러한 대체 모이어티를 보유하는 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드의 염기쌍 형성 성질을 실질적으로 변경하지 않고 다른 모이어티로 대체될 수 있음을 잘 알고 있다. 예를 들어, 제한 없이, 이노신을 이의 염기로서 포함하는 뉴클레오타이드는 아데닌, 시토신 또는 우라실을 포함하는 뉴클레오타이드와 염기쌍을 형성할 수 있다. 따라서, 우라실, 구아닌 또는 아데닌을 포함하는 뉴클레오타이드는, 예를 들어 이노신을 포유하는 뉴클레오타이드에 의해 본원 개시내용에서 특성화된 dsRNA의 뉴클레오타이드 서열에서 대체될 수 있다. 또 다른 예에서, 올리고뉴클레오타이드의 어느 곳에서나 아데닌 및 시토신은 각각 구아닌 및 우라실로 대체되어 표적 mRNA와 G-U 워블 염기쌍을 형성할 수 있다. 이러한 대체 모이어티를 포함하는 서열은 본원 개시내용에서 특성화된 조성물 및 방법에 적합하다.
본원에서 상호교환적으로 사용되는 바와 같은 "iRNA", "RNAi 제제", "iRNA 제제", "RNA 간섭 제제"라는 용어는, 본원에 정의된 바와 같은 RNA를 함유하고 RNA 유도된 사일런싱 복합체(RISC) 경로를 통한 RNA 전사체의 표적화된 절단을 매개하는 제제를 지칭한다. RNA 간섭(RNAi)은 mRNA의 서열 특이적 분해를 지시하는 공정이다. RNAi는 세포, 예를 들어, 포유동물 대상체와 같은 대상체 내 세포에서 APOE의 발현을 조절, 예를 들어, 억제한다.
일양태에서, 본원 개시내용의 RNAi 제제는 표적 RNA 서열, 예를 들어, APOE 표적 mRNA 서열과 상호작용하여 표적 RNA의 절단을 지시하는 단일 가닥 RNAi를 포함한다. 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만 세포 내로 도입된 긴 이중 가닥 RNA는 다이서(Dicer)로 알려진 III형 엔도뉴클레아제에 의해 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하는 이중 가닥 짧은 간섭 RNA(siRNA)로 분해되는 것으로 여겨진다(참조: Sharp et al. (2001) Genes Dev. 15:485). 리보뉴클레아제 III형 효소인 다이서는 이들 dsRNA를 특징적인 2개의 염기 3' 오버행을 갖는 19-23개 염기쌍의 짧은 간섭 RNA로 가공한다(참조: Bernstein, et al., (2001) Nature 409:363). 이어서, 이들 siRNA는 하나 이상의 헬리카제가 siRNA 듀플렉스를 푸는 RNA 유도된 사일런싱 복합체(RISC)에 통합되어 상보적 안티센스 가닥이 표적 인지를 안내할 수 있게 한다(참조: Nykanen, et al., (2001) Cell 107:309). 적절한 표적 mRNA에 결합하면 RISC 내의 하나 이상의 엔도뉴클레아제는 표적을 절단하여 사일런싱을 유도한다(참조: Elbashir, et al., (2001) Genes Dev. 15:188). 따라서, 하나의 양상에서 본원 개시내용은 세포 내에서 생성되고 RISC 복합체의 형성을 촉진하여 표적 유전자, 즉, APOE 유전자의 사일런싱을 수행하는 단일 가닥 RNA(ssRNA) (siRNA 듀플렉스의 안티센스 가닥)에 관한 것이다. 따라서, 용어 "siRNA"는 또한 상기 기재된 바와 같은 iRNA를 지칭하기 위해 본원에 사용된다.
또 다른 양태에서, RNAi 제제는 표적 mRNA를 억제하기 위해 세포 또는 유기체 내로 도입되는 단일 가닥 RNA일 수 있다. 단일 가닥 RNAi 제제는 RISC 엔도뉴클레아제인 Argonaute 2에 결합하고 이어서 표적 mRNA를 절단한다. 단일 가닥 siRNA는 일반적으로 15-30개의 뉴클레오타이드이고 화학적으로 변형된다. 단일 가닥 RNA의 디자인 및 시험은 미국 특허 제8,101,348호 및 문헌(참조: Lima et al., (2012) Cell 150:883-894)에 기재되어 있고 이들 각각의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다. 본원에 기재된 임의의 안티센스 뉴클레오타이드는 본원에 기재된 바와 같거나 문헌(참조: Lima et al., (2012) Cell 150:883-894)에 기재된 방법에 의해 화학적으로 변형된 바와 같은 단일 가닥 siRNA로서 사용될 수 있다.
또 다른 양태에서, 본원 개시내용의 조성물 및 방법에 사용하기 위한 "RNAi 제제"는 이중 가닥 RNA이고, 본원에서 "이중 가닥 RNAi 제제", "이중 가닥 RNA (dsRNA) 분자", "dsRNA 제제" 또는 "dsRNA"로서 지칭된다. 용어 "dsRNA"는 표적 RNA, 즉, APOE 유전자에 대해 "센스" 및 "안티센스" 배향을 갖는 것으로 지칭되는, 2개의 역평행 및 실질적으로 상보적인 핵산 가닥을 포함하는 듀플렉스 구조를 갖는 리보핵산 분자의 복합체를 지칭한다. 본원 개시내용의 일부 양태에서, 이중 가닥 RNA(dsRNA)는 본원에서 RNA 간섭 또는 RNAi로 지칭되는 전사후 유전자 사일런싱 기전을 통해 표적 RNA, 예를 들어 mRNA의 분해를 촉발한다.
일반적으로, dsRNA 분자는 리보뉴클레오타이드를 포함할 수 있지만, 본원에 상세히 기재된 바와 같이, 각각 또는 양쪽 가닥은 또한 하나 이상의 비-리보뉴클레오타이드, 예를 들어, 데옥시리보뉴클레오타이드, 변형된 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 또한, 본원에 사용된 바와 같은 "RNAi 제제"는 화학적 변형을 갖는 리보뉴클레오타이드를 포함할 수 있고; RNAi 제제는 다중 뉴클레오타이드에서 실질적인 변형을 포함할 수 있다. 본원에 사용된 용어 "변형된 뉴클레오타이드"는 독립적으로 변형된 당 모이어티, 변형된 뉴클레오타이드 간 연결, 또는 변형된 뉴클레오염기를 갖는 뉴클레오타이드를 지칭한다. 따라서, 용어 변형된 뉴클레오타이드는 뉴클레오사이드 간 연결, 당 모이어티 또는 뉴클레오염기에 대한, 예를 들어 작용기 또는 원자의 치환, 추가 또는 제거를 포함한다. 본원 개시내용의 제제에 사용하기에 적합한 변형은 본원에 개시되거나 당업계에 공지된 모든 유형의 변형을 포함한다. siRNA 유형의 분자에 사용된 바와 같은 임의의 상기 변형은 본원 명세서 및 청구범위의 목적을 위해 "RNAi 제제"에 의해 포괄된다.
본원 개시내용의 특정 양태에서, RNAi 제제 내 존재하는 경우 데옥시-뉴클레오타이드 - 이는 천연적으로 존재하는 형태의 뉴클레오타이드로서 인지됨 - 의 내포는 변형된 뉴클레오타이드를 구성하는 것으로 고려될 수 있다.
듀플렉스 영역은 RISC 경로를 통해 목적하는 표적 RNA의 특이적 분해를 가능하게 하는 임의의 길이를 가질 수 있고, 길이가 약 15-36 염기쌍, 예를 들어, 길이가 약 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 또는 36개 염기쌍, 예를 들어, 길이가 약 15-30, 15-29, 15-28, 15-27, 15-26, 15-25, 15-24, 15-23, 15-22, 15-21, 15-20, 15-19, 15-18, 15-17, 18-30, 18-29, 18-28, 18-27, 18-26, 18-25, 18-24, 18-23, 18-22, 18-21, 18-20, 19-30, 19-29, 19-28, 19-27, 19-26, 19-25, 19-24, 19-23, 19-22, 19-21, 19-20, 20-30, 20-29, 20-28, 20-27, 20-26, 20-25, 20-24,20-23, 20-22, 20-21, 21-30, 21-29, 21-28, 21-27, 21-26, 21-25, 21-24, 21-23, 또는 21-22개 염기쌍 범위일 수 있다. 특정 양태에서, 듀플렉스 영역은 길이가 19-21개 염기쌍, 예를 들어, 길이가 21개 염기쌍이다. 상기 언급된 범위 및 길이의 중간 범위 및 길이는 또한 본원 개시내용의 일부인 것으로 고려된다.
듀플렉스 구조를 형성하는 2개의 가닥은 하나의 더 큰 RNA 분자의 상이한 부분일 수 있거나, 이들은 별도의 RNA 분자일 수 있다. 2개의 가닥이 하나의 더 큰 분자의 일부이고, 따라서 듀플렉스 구조를 형성하는 한 가닥의 3'-말단과 각각의 다른 가닥의 5'-말단 사이에 연속적인 뉴클레오타이드 쇄로 연결되어 있는 경우, 연결 RNA 쇄는 "헤어핀 루프"로서 지칭된다. 헤어핀 루프는 적어도 하나의 쌍을 형성하지 않는 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 헤어핀 루프는 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 20개, 적어도 23개 이상의 쌍을 형성하지 않은 뉴클레오타이들 또는 dsRNA의 표적 부위에 지시되지 않는 뉴클레오타이드들을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 헤어핀 루프는 10개 이하의 뉴클레오타이드일 수 있다. 일부 양태에서, 헤어핀 루프는 8개 이하의 쌍을 형성하지 않는 뉴클레오타이드일 수 있다. 일부 양태에서, 헤어핀 루프는 4-10개의 쌍을 형성하지 않는 뉴클레오타이드일 수 있다. 일부 양태에서, 헤어핀 루프는 4-8개의 뉴클레오타이드일 수 있다.
dsRNA의 2개의 실질적으로 상보성인 가닥이 별도의 RNA 분자로 구성되는 경우, 이들 분자는 공유적으로 연결될 필요는 없지만 공유적으로 연결될 수 있다. 2개의 가닥이 듀플렉스 구조를 형성하는 한 가닥의 3'-말단과 각각의 다른 가닥의 5'-말단 사이에 연속적인 뉴클레오타이드 쇄 이외의 다른 수단에 의해 공유적으로 연결되어 있는 특정 양태에서, 연결 구조는 "링커"로서 지칭된다(본원의 다른 곳에 정의된 특정 다른 구조가 또한 "링커"로서 지칭될 수 있다는 것이 주지된다 하더라도). RNA 가닥은 동일하거나 상이한 수의 뉴클레오타이드를 가질 수 있다. 염기쌍의 최대 수는 dsRNA의 최단 가닥 마이너스(minus) 듀플렉스에 존재하는 임의의 오버행에서 뉴클레오타이드의 수이다. 듀플렉스 구조 이외에, RNAi는 하나 이상의 뉴클레오타이드 오버행을 포함할 수 있다. RNAi 제제의 일양태에서, 적어도 하나의 가닥은 적어도 1개의 뉴클레오타이드의 3' 오버행을 포함한다. 또 다른 양태에서, 적어도 하나의 가닥은 적어도 2개의 뉴클레오타이드, 예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15개의 뉴클레오타이드의 3' 오버행을 포함한다. 다른 양태에서, RNAi 제제의 적어도 하나의 가닥은 적어도 1개의 뉴클레오타이드의 5' 오버행을 포함한다. 특정 양태에서, 적어도 하나의 가닥은 적어도 2개의 뉴클레오타이드, 예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15개의 뉴클레오타이드의 5' 오버행을 포함한다. 여전히 다른 양태에서, RNAi 제제의 하나의 가닥의 3' 및 5' 말단 둘 다는 적어도 1개의 뉴클레오타이드의 오버행을 포함한다.
일양태에서, 본원 개시내용의 RNAi 제제는 dsRNA이고, 이의 각각의 가닥은 독립적으로 19-23개의 뉴클레오타이드를 포함하고, 표적 RNA 서열, 예를 들어, APOE 표적 mRNA 서열과 상호작용하여 표적 RNA의 절단을 지시한다.
본원에 사용된 용어 "뉴클레오타이드 오버행"은 RNAi 제제의 듀플렉스 구조, 예를 들어, dsRNA로부터 돌출된 적어도 하나의 쌍을 형성하지 않은 뉴클레오타이드를 지칭한다. 예를 들어, dsRNA의 한 가닥의 3'-말단이 다른 가닥의 5'-말단을 넘어 확장되거나 그 반대의 경우, 뉴클레오타이드 오버행이 있다. dsRNA는 적어도 하나의 뉴클레오타이드의 오버행을 포함할 수 있고; 대안적으로 오버행은 적어도 2개의 뉴클레오타이드, 적어도 3개의 뉴클레오타이드, 적어도 4개의 뉴클레오타이드, 적어도 5개의 뉴클레오타이드 또는 그 이상을 포함할 수 있다. 뉴클레오타이드 오버행은 데옥시뉴클레오타이드/뉴클레오사이드를 포함하는 뉴클레오타이드/뉴클레오사이드 유사체를 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 오버행(들)은 센스 가닥, 안티센스 가닥, 또는 이들의 임의의 조합 상에 있을 수 있다. 또한, 오버행의 뉴클레오타이드(들)는 dsRNA의 안티센스 또는 센스 가닥의 5'-말단, 3'-말단 또는 양쪽 말단 상에 존재할 수 있다.
일양태에서, dsRNA의 안티센스 가닥은 3'-말단 또는 5'-말단에 1-10개의 뉴클레오타이드, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 뉴클레오타이드를 갖는다. 일양태에서, dsRNA의 센스 가닥은 3'-말단 또는 5'-말단에 1-10개의 뉴클레오타이드, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 뉴클레오타이드를 갖는다. 또 다른 양태에서, 오버행에서 하나 이상의 뉴클레오타이드는 뉴클레오사이드 티오포스페이트로 대체된다.
특정 양태에서, dsRNA의 안티센스 가닥은 3'-말단 또는 5'-말단에 1-10개의 뉴클레오타이드, 예를 들어, 0-3, 1-3, 2-4, 2-5, 4-10, 5-10개, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 뉴클레오타이드 오버행을 갖는다. 일양태에서, dsRNA의 센스 가닥은 3'-말단 또는 5'-말단에 1-10개의 뉴클레오타이드, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 뉴클레오타이드를 갖는다. 또 다른 양태에서, 오버행에서 하나 이상의 뉴클레오타이드는 뉴클레오사이드 티오포스페이트로 대체된다.
특정 양태에서, 센스 가닥 또는 안티센스 가닥 상의 오버행은 10개보다 긴, 예를 들어 1-30개의 뉴클레오타이드, 2-30개의 뉴클레오타이드, 10-30개의 뉴클레오타이드, 또는 10-15개의 뉴클레오타이드의 길이 보다 긴 연장된 길이를 포함할 수 있다. 특정 양태에서, 연장된 오버행은 듀플렉스의 센스 가닥 상에 있다. 특정 양태에서, 연장된 오버행은 듀플렉스의 센스 가닥의 3' 말단 상에 존재한다. 특정 양태에서, 연장된 오버행은 듀플렉스의 센스 가닥의 5' 말단 상에 존재한다. 특정 양태에서, 연장된 오버행은 듀플렉스의 안티센스 가닥 상에 있다. 특정 양태에서, 연장된 오버행은 듀플렉스의 안티센스 가닥의 3' 말단 상에 존재한다. 특정 양태에서, 연장된 오버행은 듀플렉스의 안티센스 가닥의 5' 말단 상에 존재한다. 특정 양태에서, 오버행에서 하나 이상의 뉴클레오타이드는 뉴클레오사이드 티오포스페이트로 대체된다. 특정 양태에서, 오버행은 생리학적 조건 하에 안정한 헤어핀 구조를 형성할 수 있도록 자체 상보성인 부분을 포함한다.
dsRNA와 관련하여 본원에 사용된 바와 같은 용어 "평활" 또는 "평활 말단"은 dsRNA의 소정의 말단에서 쌍을 형성하지 않은 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체가 없는, 즉 뉴클레오타이드 오버행이 없음을 의미한다. dsRNA의 말단 중 하나 또는 둘 다는 평활 말단일 수 있다. dsRNA의 말단 둘 다가 평활 말단인 경우, dsRNA는 평활 말단인 것으로 일컬어진다. 명백하게, "평활 말단화된" dsRNA는 양 말단이 평활 말단인 dsRNA이고, 즉 분자의 어느 말단에도 뉴클레오타이드 오버행이 없다. 가장 흔하게, 상기 분자는 이의 전체 길이에 걸쳐 이중 가닥일 것이다.
용어 "안티센스 가닥" 또는 "가이드 가닥"은 RNAi 제제의 가닥, 예를 들어, 표적 서열, 예를 들어, APOE mRNA에 실질적으로 상보적인 영역을 포함하는 dsRNA를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "상보성 영역"은 본원에 정의된 바와 같은 서열, 예를 들어 표적 서열, 예를 들어, APOE 뉴클레오타이드 서열에 실질적으로 상보적인 안티센스 가닥 상의 영역을 지칭한다. 상보성 영역이 표적 서열에 완전히 상보성이지 않은 경우, 미스매치는 분자의 내부 또는 말단 영역에 있을 수 있다. 일반적으로, 가장 허용되는 미스매치는 말단 영역, 예를 들어 RNAi 제제의 5'- 또는 3'-말단의 5, 4, 3 또는 2개의 뉴클레오타이드 내에 있다.
본원에 사용된 용어 "센스 가닥" 또는 "패신저 가닥"은 용어가 본원에 정의된 바와 같은 안티센스 가닥의 영역에 실질적으로 상보적인 영역을 포함하는 RNAi 제제의 가닥을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "절단 영역"은 절단 부위에 바로 인접하여 위치하는 영역을 지칭한다. 절단 부위는 절단이 일어나는 표적 상의 부위이다. 일부 양태에서, 절단 영역은 절단 부위의 어느 하나의 말단 상에 그리고 이에 바로 인접하여 3개의 염기를 포함한다. 일부 양태에서, 절단 영역은 절단 부위의 어느 하나의 말단 상에 그리고 이에 바로 인접하여 2개의 염기를 포함한다. 일부 양태에서, 절단 부위는 구체적으로 안티센스 가닥의 뉴클레오타이드 10 및 11에 의해 결합된 부위에 존재하고, 절단 영역은 뉴클레오타이드 11, 12 및 13을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이 그리고 달리 지적되지 않는 경우, 용어 "상보성"은 제2 뉴클레오타이드 서열과 관련하여 제1 뉴클레오타이드 서열을 기재하기 위해 사용되는 경우, 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 제1 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드와 특정 조건 하에 하이드리드화하여 듀플렉스 구조를 형성하는 능력을 지칭한다.
RNAi 제제 내, 예를 들어, 본원에 기재된 dsRNA 내 상보성 서열은 제1 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드와 하나 또는 둘 다의 뉴클레오타이드 서열의 전체 길이에 걸쳐 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드의 염기쌍 형성을 포함한다. 상기 서열은 본원에서 서로에 대해 "완전한 상보성"으로서 언급될 수 있다. 그러나, 제1 서열이 본원의 제2 서열과 관련하여 "실질적으로 상보성"으로서 지칭되는 경우, 2개의 서열은 완전히 상보성일 수 있거나, 이들은 30개 이하의 염기쌍의 듀플렉스에 대한 하이브리드화 시 하나 이상, 그러나 일반적으로 5, 4, 3, 또는 2개 이하의 미스매칭된 염기쌍을 형성할 수 있고, 이들의 궁극적인 적용, 예를 들어, RISC 경로를 통한 유전자 발현의 억제와 가장 관련된 조건 하에 하이브리드화하는 능력을 보유한다. 그러나, 2개의 올리고뉴클레오타이드가 하이브리드화시 하나 이상의 단일 가닥 오버행을 형성하도록 디자인된 경우, 상기 오버행은 상보성 결정과 관련하여 미스매치로서 간주되지 않는다. 예를 들어, 보다 긴 올리고뉴클레오타이드가 보다 짧은 올리고뉴클레오타이드에 완전히 상보성인 21개의 뉴클레오타이드의 서열을 포함하는, 길이가 21개의 뉴클레오타이드인 하나의 올리고뉴클레오타이드 및 길이가 23개의 뉴클레오타이드인 또 다른 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 dsRNA는 본원에 기재된 목적을 위해 "완전히 상보성"으로서 여전히 언급될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "상보성" 서열은 또한 하이브리드화하는 이들의 능력과 관련하여 상기 요건이 충족되는 한, 비-왓슨-클릭 염기쌍(non-Watson-Crick base pairs) 또는 비-천연 및 변형된 뉴클레오타이드로부터 형성된 염기쌍을 포함하거나 이들로부터 전적으로 형성될 수 있다. 상기 비-왓슨-클릭 염기쌍은 G:U 워블 또는 후그슈타인 염기쌍 형성을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본원에서 용어 "상보성", "완전히 상보성" 및 "실질적으로 상보성"은 이들의 사용과 관련된 내용으로부터 이해되는 바와 같이 dsRNA의 센스 가닥과 안티센스 가닥과 같은 2개의 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 간의 염기 매칭 또는 RNAi 제제의 안티센스 가닥과 표적 서열 간의 염기 매칭과 관련하여 사용될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, 전령 RNA(mRNA)의 "적어도 일부와 실질적으로 상보성"인 폴리뉴클레오타이드는 관심 대상의 mRNA(예를 들어, APOE를 암호화하는 mRNA)의 연속 부분에 실질적으로 상보성인 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다. 예를 들어, 폴리뉴클레오타이드는 서열이 APOE를 암호화하는 mRNA의 비-중단 부분에 실질적으로 상보성인 경우 APOE mRNA의 적어도 일부에 상보성이다.
따라서, 일부 양태에서, 본원에 개시된 안티센스 가닥 폴리뉴클레오타이드는 표적 APOE 서열에 완전히 상보성이다. 다른 양태에서, 본원에 개시된 안티센스 가닥 폴리뉴클레오타이드는 표적 APOE 서열에 실질적으로 상보성이고, APOE에 대한 서열번호 1, 3, 5, 7 또는 9의 뉴클레오타이드 서열 또는 APOE에 대한 서열번호 1, 3, 5, 7 또는 9의 단편의 등가 영역의 전체 길이에 걸쳐 적어도 약 80% 상보성, 예를 들어, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99% 상보성인 연속 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
다른 양태에서, 본원에 개시된 안티센스 폴리뉴클레오타이드는 표적 APOE 서열과 실질적으로 상보성이고, APOE에 대한 표 2-5 및 7-10 중 어느 하나에서 센스 가닥 뉴클레오타이드 서열 중 어느 하나, 또는 APOE에 대한 표 2-5 및 7-10 중 어느 하나에서 센스 가닥 뉴클레오타이드 서열 중 어느 하나의 단편에 대해 이의 전체 길이에 걸쳐 적어도 약 80% 상보성, 예를 들어, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99% 상보성인 연속 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일양태에서, 본원 개시내용의 RNAi 제제는 안티센스 폴리뉴클레오타이드에 실질적으로 상보성이고 이어서 표적 APOC 서열과 동일한 센스 가닥을 포함하고, 여기서 센스 가닥 폴리뉴클레오타이드가 서열 번호 2, 4, 6, 8, 또는 10의 뉴클레오타이드 서열의 등가 영역 또는 서열번호 2, 4, 6, 8, 또는 10 또는 12 중 어느 하나의 단편에 대한 이의 전체 길이에 걸쳐 적어도 약 80% 상보성, 예를 들어, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99% 상보성인 연속 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일양태에서, APOE 유전자의 발현의 적어도 부분적 억제는 제1 세포 또는 세포 그룹과 실질적으로 동일하지만 처리되지 않은 제2 세포 또는 세포 그룹 (대조군 세포)와 비교하여, APOE 유전자가 전사되고 APOE 유전자의 발현이 억제되도록 처리되거나 처리된 제1 세포 또는 세포 그룹으로부터 단리되거나 여기에서 검출될 수 있는 APOE 양의 감소에 의해 평가된다. 억제 정도는 하기의 관점에서 표시될 수 있다:
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본원에 사용된 dsRNA와 같은 "RNAi 제제와 세포의 접촉"이라는 문구는 임의의 가능한 수단에 의해 세포를 접촉시키는 것을 포함한다. 세포와 RNAi 제제의 접촉은 시험관내 세포와 RNAi 제제를 접촉시키는 것 또는 생체내 세포와 RNAi 제제를 접촉시키는 것을 포함한다. 상기 접촉은 직접적으로 또는 간접적으로 수행될 수 있다. 따라서, 예를 들어, RNAi 제제는 방법을 수행하는 개체에 의해 세포와 물리적 접촉에 놓일 수 있거나, 대안적으로, RNAi 제제는 후속적으로 세포와 접촉하도록 허용하거나 야기할 상황에 놓일 수 있다.
시험관내 세포와의 접촉은 예를 들어, 상기 세포를 RNAi 제제로 항온처리함으로써 수행될 수 있다. 생체내 세포와의 접촉은, 예를 들어, RNAi 제제를 세포가 위치한 조직에 또는 이의 부근에 주사함으로써 또는 RNAi 제제를 임의로 척수강내, 유리체내 또는 다른 주사를 통해 또 다른 영역, 예를 들어, 중추신경계(CNS)로 또는 혈류 또는 피하 공간으로 주사하여 제제가 후속적으로 접촉될 세포가 위치한 조직에 도달하도록함으로써 수행될 수 있다. 예를 들어, RNAi 제제는 관심 대상의 부위, 예를 들어, CNS에서 RNAi 제제를 지시하거나 달리 안정화시키는 리간드, 예를 들어, 하기에 기재되고 추가로 예를 들어, 본원에 참조로 포함된 PCT/US2019/031170에 상세히 기재된 친유성 모이어티 또는 모이어티들을 함유할 수 있거나 이에 커플링될 수 있다. 일부 양태에서, RNAi 제제는 관심 부위, 예를 들어 간에서 RNAi 제제를 지시하거나 달리 안정화시키는 리간드, 예를 들어 하기 기재된 바와 같은 하나 이상의 GalNAc 유도체를 함유하거나 이에 커플링될 수 있다. 다른 양태에서, RNAi 제제는 친유성 모이어티 또는 모이어티들 및 하나 이상의 GalNAc 유도체를 함유하거나 이에 커플링될 수 있다. 시험관내 및 생체내 접촉 방법의 조합도 가능하다. 예를 들어, 세포는 또한 RNAi 제제와 시험관내 접촉될 수 있고, 후속적으로 대상체에 이식될 수 있다.
일양태에서, 세포를 RNAi 제제와 접촉시키는 것은 세포 내로의 흡수(uptake) 또는 흡수(absorption)를 촉진하거나 수행함으로써 "RNAi 제제를 세포 내로 "도입" 또는 "전달하는 것"을 포함한다. RNAi 제제의 흡수(absorption) 또는 흡수(uptake)는 비보조 확산 또는 활성 세포 과정을 통해, 또는 보조제 또는 장치에 의해 일어날 수 있다. RNAi 제제의 세포 내로의 도입은 시험관내 또는 생체내일 수 있다. 예를 들어, 생체내 도입을 위해, RNAi 제제는 조직 부위에 주사될 수 있거나 전신 투여될 수 있다. 세포 내로의 시험관내 도입은 전기천공 및 지질감염과 같은 당업계에 공지된 방법을 포함한다. 추가의 접근법은 하기 본원에 기재되어 있거나 당업계에 공지되어 있다.
용어 "친유성" 또는 "친유성 모이어티"는 광범위하게 지질에 대해 친화성을 갖는 임의의 화합물 또는 화학적 모이어티를 지칭한다. 친유성 모이어티의 친유성을 특징 분석하기 위한 한 가지 방법은 옥탄올-물 분배 계수 logKow이며, 여기서 Kow는 평형 상태에서 2상 시스템의 수성 상에서 이의 농도에 대한 옥탄올 상에서의 화학물질 농도의 비율이다. 옥탄올-물 분배 계수는 물질의 실험실에서 측정된 성질이다. 그러나, 제1 원리 또는 경험적 방법을 사용하여 계산된 화학물질의 구조적 성분에 기인하는 계수를 사용하여 예측할 수도 있다(참조: 예를 들어, Tetko et al., J. Chem. Inf. Comput. Sci. 41:1407-21 (2001), 이의 전문이 본원에 참조로 포함됨). 이것은 물보다 비수성 또는 유성 환경을 선호하는 물질의 경향(즉, 이의 친수성/친유성 균형)의 열역학 척도를 제공한다. 원칙적으로, 화학 물질은 logKow가 0을 초과할 때 특징이 친유성이다. 전형적으로, 친유성 모이어티는 1 초과, 1.5 초과, 2 초과, 3 초과, 4 초과, 5 초과 또는 10 초과의 logKow를 보유한다. 예를 들어, 6-아미노 헥산올의 logKow는 대략 0.7인 것으로 예상된다. 동일한 방법을 사용하여, 콜레스테릴 N-(헥산-6-올) 카바메이트의 logKow는 10.7인 것으로 예상된다.
분자의 친유성은 이것이 갖는 관능성 그룹과 관련하여 변화할 수 있다. 예를 들어, 친유성 모이어티의 말단에 하이드록실 그룹 또는 아민 그룹의 첨가는 친유성 모이어티의 분배 계수(예를 들어, logKow) 값을 증가 또는 감소시킬 수 있다.
대안적으로, 하나 이상의 친유성 모이어티에 접합된 이중 가닥 RNAi 제제의 소수성은 이의 단백질 결합 특징에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, 특정 양태에서, 이중 가닥 RNAi 제제의 혈장 단백질 결합 검정에서 결합되지 않은 분획은 이중 가닥 RNAi 제제의 상대적 소수성과 양의 상관관계가 있는 것으로 결정될 수 있고, 이는 이어서 이중 가닥 RNAi 제제의 사일런싱 활성과 양의 상관관계가 있을 수 있다.
일양태에서, 결정된 혈장 단백질 결합 검정은 인간 혈청 알부민 단백질을 사용한 전기영동 운동 전환 검정(EMSA)이다. 상기 결합 검정의 예시적인 프로토콜은, 예를 들어, PCT/US2019/031170에 상세히 기재되어 있다. 결합 검정에서 비결합 dsRNA의 분획에 의해 측정된 이중 가닥 RNAi 제제의 소수성은 dsRNA의 증진된 생체내 전달에 대해 0.15 초과이거나, 0.2 초과이거나, 0.25 초과이거나, 0.3 초과이거나, 0.35 초과이거나, 0.4 초과이거나, 0.45 초과이거나, 0.5 초과이다.
따라서, 이중 가닥 RNAi 제제의 내부 위치(들)로 친유성 모이어티의 접합은 siRNA의 증진된 생체내 전달을 위한 최적의 소수성을 제공한다.
용어 "지질 나노입자" 또는 "LNP"는 핵산 분자, 예를 들어 RNAi 제제 또는 RNAi 제제가 전사되는 플라스미드와 같은 약제학적 활성 분자를 캡슐화하는 지질 층을 포함하는 소포이다. LNP는 예를 들어, 미국 특허 제6,858,225호, 제6,815,432호, 제8,158,601호, 및 제8,058,069호에 기재되어 있고, 이의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
본원에 사용된 "대상체"는 영장류(예를 들어, 인간, 비인간 영장류, 예를 들어, 몽키 및 침팬지) 또는 비영장류(예를 들어, 래트 또는 마우스)를 포함하는 포유류와 같은 동물이다. 바람직한 양태에서, 대상체는 인간, 예를 들어 APOE 발현의 감소가 이득이 되는 질환, 장애 또는 병태에 대해 치료 또는 평가되는 인간; APOE 발현의 감소가 이득이 되는 질환, 장애 또는 병태에 대한 위험에 처한 인간; APOE 발현의 감소가 이득이 되는 질환, 장애 또는 병태를 갖는 인간; 또는 본원에 기재된 바와 같이 APOE 발현의 감소가 이득이 되는 질환, 장애 또는 병태에 대해 치료받은 인간이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "치료하는" 또는 "치료"는 APOE 유전자 발현 또는 APOE 단백질 생산, 예를 들어 APOE와 관련된 하나 이상의 징후 또는 증상, 예를 들어, APOE-관련 신경변성 질환, 예를 들어 아밀로이드-β-매개된 질환, 예를 들어 알츠하이머 질환, 다운 증후군, 대뇌 아밀로이드 혈관병증 또는 tau-매개된 질병, 예를 들어 전두측두엽 치매, 진행성 핵상 마비(PSP), 척수기저 변성(CBD), 픽 질환(PiD), 만성 외상성 뇌병증(CTE), 전두측두엽 치매(FTD, FTDP-17), 전두측두엽 변성(FTLD)과 같은 1차 타우병증, 과민성 곡물 질환(AGD), 1차 연령 관련 타우병증(PART) 및 구상 신경교 타우병증(GGT), 또는 2차 타우병증, 예를 들어 AD, 크로이츠펠트 야콥 질환, 다운 증후군, 가족성 영국 치매, 및 권투선수 치매의 경감 또는 개선을 포함하지만 이에 제한되지 않는 유익한 또는 목적하는 결과를 지칭한다. "치료"는 또한 치료의 부재하에 예상된 생존률과 비교하여 생존을 연장시킴을 의미할 수 있다.
대상체에서 APOE의 수준 또는 질환 마커 또는 증상과 관련하여 용어 "보다 낮은"은 상기 수준에서 통계적으로 유의적인 감소를 지칭한다. 감소는 예를 들어, 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, %, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상일 수 있다. 특정 양태에서, 감소는 적어도 20%이다. 특정 양태에서, 감소는 질환 마커, 예를 들어, 단백질 또는 유전자 발현 수준에서 적어도 50%이다. 대상체에서 APOE 수준과 관련하여 "보다 낮은"은 바람직하게 상기 장애가 없는 개체에 대한 정상 범위 내에 있는 것으로서 허용되는 수준으로 하향된다. 특정 양태에서, "저하"는 질환을 앓고 있는 대상체에 대한 마커 또는 증상의 수준과 개체에 대한 정상 범위 내에서 허용되는 수준, 예를 들어 비만인 개체와 정상 범위 내에서 허용되는 체중을 갖는 개체간의 체중에서의 감소 수준에서의 차이에서의 감소이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 저하시키는 것은 뉴클레오타이드 반복 확장을 갖는 APOE 유전자의 mRNA 수준을 저하시키거나 주로 저하시키는 것을 지칭할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, APOE 유전자의 발현 또는 APOE 단백질 생산의 감소가 이득이 되는 질환, 장애 또는 병태와 관련하여 본원에 사용된 "예방" 또는 "예방하는"은 대상체가 이러한 질환, 장애 또는 병태와 관련된 증상, 예를 들어 APOE-관련 신경변성 질환의 증상을 발병할 가능성에서의 감소를 지칭한다. 질환, 장애 또는 병태 발병의 실패 또는 그러한 질환, 장애 또는 병태와 관련된 증상의 발병 감소(예를 들어, 상기 질환 또는 장애에 대한 임상적으로 허용되는 스케일에서 적어도 약 10% 감소), 또는 지증상의 지연(예를 들어, 일, 주, 월 또는 년)은 효과적인 예방으로 간주된다.
본원에 사용된 용어 "APOE-관련 신경변성 질환" 또는 "APOE-관련 신경변성 장애"는 APOE의 발현 및/또는 활성의 감소가 이득이 되는 임의의 질환 또는 장애로서 이해된다. 예시적인 APOE-관련 신경변성 질환은 아밀로이드-β-매개된 질환, 예를 들어, 알츠하이머 질환, 다운 증후군 및 대뇌 아밀로이드 혈관병증 , 및 tau-매개된 질환, 예를 들어, 1차 타우병증, 예를 들어, 전두측두엽 치매(FTD), 진행성 핵상 마비(PSP), 척수기저 변성(CBD), 픽 질환(PiD), 구상 신경교 타우병증(GGT), 파킨슨 질환을 동반한 전두측두엽 치매(FTDP, FTDP-17), 만성 외상성 뇌병증(CTE), 권투선수 치매, 전두측두엽 변성(FTLD), 호은성 곡물 질환(AGD) 및 1차 연령 관련 타우병증(PART), 및 2차 타우병증, 예를 들어, AD, 크로이츠펠트 야콥 질환, 다운 증후군 및 가족성 영국 치매를 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "아밀로이드-β-매개된 질환"은 아밀로이드-β의 세포외 축적으로 인해 뇌 조직에 아밀로이드 플라크의 형성을 유발하는 장애이다. 예시적인 아밀로이드-β-매개된 질환은 알츠하이머 질환, 다운 증후군 및 대뇌 아밀로이드 혈관병증(CAA)을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "tau-매개된 질환"은 tau 단백질이 신경원섬유 엉킴으로 응집되어 발생하는 장애이다. 엉킴은 tau의 과인산화에 의해 형성되어 단백질이 미세소관 및 응집체로부터 해리되도록 한다. 타우병증은 병리학이 주로 tau 응집에 의해 구동되는 "1차 타우병증" 및 또 다른 요인이 질환을 구동시키는 "2차 타우병증(예를 들어, 알츠하이머 질환에서 아밀로이드-β 플라크)으로 나누어질 수 있고, 타우병증의 존재는 질환 진행을 악화시킨다. 1차 타우병증의 예는 전두측두엽 치매(FTD), 진행성 핵상 마비(PSP), 코르디코기저 변성(CBD), 픽 질환(PiD), 구상 신경교 타우병증(GGT), 파킨슨병을 동반한 전두측두엽 치매(FTDP, FTDP-17), 만성 외상성 뇌병증(CTE), 권투선수 치매, 호은성 곡물 질환(AGD) 및 1차 연령 관련 타우병증(PART)을 포함한다. 1차 타우병증의 예는 AD, 크로이츠펠트 야콥 질환, 다운증후군 및 가족성 영국 치매를 포함한다.
APOE 다형태는 다중 타우병증과 관련되어 있다. APOE4 대립유전자는 MAPT 돌연변이를 갖는 환자의 전두측두엽 치매(FTD)에서 신경변성을 가속화하고 발병 연령을 저하시키는 것으로 밝혀졌다(참조: Koriath, C. et al. (2019) Alzheimers Dement 11:277-280). 또한 APOE4의 존재는 반복적인 머리 충격에 노출이 적은 축구 선수의 부검 뇌에서(참조: Verscaj, C. et al. (2017) Neurology 88 (16) Supplement S9.001) 및 권투선수의 뇌에서(참조: Jordan, B.D. et al. (1997) JAMA 278(2): 136-140) 더 진행된 만성 외상성 뇌병증(CTE)과 관련이 있다. APOE4 대립유전자의 존재는 또한 크로이츠펠트-야콥 질환(CJD)의 위험 증가와 관련이 있는 반면, APOE3 대립유전자의 존재는 크로이츠펠트-야콥 질환(CJD)에 대한 감수성에 대한 보호와 관련이 있다(참조: Wei, Y. et al. (2013) J Clinical Neuroscience 21(3): 390-394).
또한, 쉬(Shi) 등은 FTD의 P301S 마우스 모델에서 APOE4가 존재할 때 APOE2, APOE3 또는 APOE 녹아웃이 존재할 때와 비교할 때 tau 수준, 뇌 위축 및 신경염증이 현저하게 증가했음을 기재하였다(참조: Shi et al., (2017) Nature 549: 523-527). 파킨슨증이 있는 FTD에서 발견되는 P301L 돌연변이를 가진 인간 tau를 발현하는 마우스 모델을 사용한 또 다른 연구에서, 과인산화된 tau, tau 응집, 행동 이상은 APOE2 배경에서 악화되었다(참조: Zhao, N. et al., (2018) Nat Commun 9:4388). 차오(Zhao) 등은 APOE ε2/ε2 유전자형과 진행성 핵상 마비(PSP) 및 피질기저핵 변성의 확인된 사례에서 타우병 위험과의 연관성을 추가로 확인하여 APOE2가 아밀로이드 병리가 존재할 때 보호할 수 있고 APOE2는 아밀로이드 병리의 부재하에 tau 병리의 중증도 증가와 관련이 있음을 시사한다.
"알츠하이머 질환"("AD")은 일반적으로 천천히 시작하여 시간경과에 따라 점차적으로 악화되는 만성 신경변성 질환이다. 가장 통상적인 조기 증상은 최근 사건을 기억하기가 어렵다. 질병이 진행됨에 따라 증상은 언어 문제, 방향 감각 상실(쉽게 길을 잃는 것을 포함), 기분 변화, 동기 상실, 자기를 관리하지 않음 및 행동 문제를 포함할 수 있다. 사람들의 병태가 저하됨에 따라, 이들은 가족과 사회에서 이탈하게된다. 점진적으로, 신체 기능은 상실되어 결국에 사망하게 된다.
신경병리학적으로, AD는 대뇌 피질 및 특정 피질 하부 영역에서 뉴런 및 시냅스의 손실을 특징으로 한다. 상기 손실은 측두엽 및 두정엽, 전두엽 피질 및 대상회 부분의 변성을 포함하여 환부 영역의 총체적 위축을 초래한다. 변성은 청반과 같은 뇌간 핵에도 존재한다. MRI와 PET를 사용한 연구에서는 AD를 갖는 사람들에서 환자가 경미한 인지 장애에서 알츠하이머 질환으로 진행함에 따라 건강한 노인의 유사한 이미지와 비교했을 때 특정 뇌 영역의 크기 감소를 기록하였다.
아밀로이드 플라크와 신경원섬유 엉킴 둘 다는 AD에 걸린 사람들의 뇌에서 현미경으로 명확하게 가시적일 수 있다. 플라크는 베타-아밀로이드 펩타이드와 뉴런 외부 및 주변의 세포 물질의 조밀하고 대부분 불용성 침착물이다. 엉킴(신경원섬유 엉킴)은 과인산화되어 세포 자체 내부에 축적되는 미세소관 관련 단백질 tau의 응집체이다. 많은 노인들이 노화의 결과로 일부 플라크와 엉킴이 발생하지만, AD를 갖는 사람들의 뇌는 측두엽과 같은 특정 뇌 영역에 더 많은 수의 플라크와 엉킴을 갖는다. 루이소체는 AD를 갖는 사람들의 뇌에서 희귀하지 않다.
국립 신경 및 의사 소통 장애 및 뇌졸중 연구소(NINCDS)와 알츠하이머 질환 및 관련 장애 협회(ADRDA, 현재 알츠하이머 협회로 공지됨)는 1984년 가장 통상적으로 사용되는 NINCDS-ADRDA 알츠하이머 진단 기준을 수립하였고, 2007년에 광범위하게 업데이트되었다. 이들 진단 기준은 AD 가능성 또는 개연성이 있는 임상 진단을 위해 신경심리학적 시험에 의해 인지 장애 및 의심되는 치매 증후군의 존재를 확인하도록 요구한다. 확실한 진단을 위해서는 뇌 조직의 현미경 검사를 포함한 조직병리학적 확인이 필요하다. 진단 기준과 명확한 조직병리학적 확인 사이에 우수한 통계학적 신뢰성과 타당성이 나타났다. 기억력, 언어, 지각 능력, 주의력, 운동 능력, 방향성, 문제 해결 및 실행 기능 능력과 같은 8가지 지적 도메인이 AD에서 가장 통상적으로 손상된다. 이들 도메인은 미국 정신과 협회에서 발행한 정신 장애 진단 및 통계 매뉴얼(DSM-IV-TR)에 나열된 NINCDS-ADRDA 알츠하이머 진단 기준과 균등하다.
현재, AD 환자를 치료하는 데 사용할 수 있는 약물은 콜린에스테라제 억제제와 메만틴을 포함한다. 이들 약물은 기억력, 사고력 및 언어와 관련된 증상을 치료하여 환자의 삶의 질을 향상시킬 수 있지만 이들은 질환의 진행이나 감소율을 변화시키지 않는다.
AD의 원인은 잘 이해되고 있지 않지만 위에서 논의한 바와 같이 APOE4의 존재는 65세 이후에 증상이 발생하는 후기 발병 알츠하이머 질환(AD)의 주요 위험 결정 요인인 것으로 나타났고, 아밀로이드-β-매개된 질환(AD) 및 tau-매개된 질환의 비-인간 동물 모델에서 수많은 연구는 APOE, 예를 들어 APOE4를 억제하는 것이 아밀로이드 플라크의 형성 및 인지 능력에 유익한 효과를 갖는다는 것을 입증하였다.
삼염색체성 21로도 알려진 "다운 증후군"("DS")은 21번 염색체의 세 번째 카피 전체 또는 일부의 존재로 인해 발생하는 유전학적 오더(order)이다. DS는 지적 장애, 특징적인 얼굴 모양, 유아기의 약한 근육 톤과 관련된 평생 상태이며 DS를 가진 사람들은 종종 인지 능력의 점진적인 감소를 경험한다. 세 번째 21번 염색체는 여분의 아밀로이드 아밀로이드-β 플라크의 축적 및 결과적으로 조기 발병 알츠하이머 질환(AD)의 위험이 50% 초과로 증가된 위험을 유도하는 전구체 단백질(APP) 유전자와 과도한 아밀로이드 생산을 갖는다. DS에서 3배로 증가하는 또 다른 유전자는 DYRK1A이고, 이는 tau의 대안적 스플라이싱에 영향을 미쳐 비정상적인 과인산화를 위해 tau를 프라이밍하고 신경원섬유 변성을 촉진시킨다(참조: Hartley D. et al. (2016) Alzheimers Dement 11(6): 700-709). AD가 있는 DS 개체는 아밀로이드 플라크, tau 신경원섬유 엉킴, 산화적 손상 및 뉴런 손실을 포함하는 일반 AD 환자와 유사한 신경병리학적 변화를 갖는다. DS 개체의 뇌척수액에서 아밀로이드와 tau 둘 다의 상승된 수준이 발견된다(참조: Lee, N.C. et al. (2017) Neurology and Therapy 6: 69-81).
"대뇌 아밀로이드 혈관병증"("CAA")은 아밀로이드 플라크가 중소 혈관의 벽 및 뇌의 특정 영역에 침착되는 혈관병증의 한 형태이다. 아밀로이드 플라크는 뇌 세포를 손상시키고 뇌의 여러 부분을 손상시킨다. 또한, 혈관의 아밀로이드 침착물은 혈관에 유연성을 제공하는 근육 및 탄성 섬유를 대체하여 쉽게 파손되도록 한다. CAA는 치매, 두개내 출혈 및 일시적인 신경학적 사건을 유발할 수 있다. CAA는 알츠하이머 질환의 형태학적 특징 중 하나로 인지되어 왔다. 아밀로이드-β 전구체 단백질(APP) 유전자의 돌연변이는 유전적 CAA의 가장 흔한 원인이다(참조: Desimone C.V. et al. (2017) J Am Coll Cardiol 70(9): 1173-1182).
픽 질환, 진행성 핵상 마비(PSP) 및 척수기저근 변성(CBD)과 같은 질환을 포함하는 "전두측두엽 치매"("FTD"). FTD는 65세 연령 미만 환자의 일반적인 유형의 치매이고, 행동, 집행 기능 또는 언어의 점진적인 감소를 특징으로 하는 신경변성 질환 그룹을 포함한다. FTD에서, 뇌의 전두엽과 측두엽의 신경세포가 소실되고, 따라서 FTD는 전두측두엽 변성(FTLD)이라고도 한다. 미세소관 관련 단백질 tau(MAPT) 유전자의 돌연변이와 tau의 축적은 픽 질환, 진행성 핵상 마비(PSP) 및 척수기저핵 변성(CBD)을 포함한 FTD의 여러 서브타입에서 발견된다.
"픽 질환"은 두정엽이 더 잘 보존되는 전두엽, 측두엽 및 대상회(cingulate gyri)의 현저한 칼날 위축을 특징으로 한다.
"피질기저 변성"("CBD")은 등쪽 전두엽 피질, 보조 운동 영역, 롤란트주위 피질 및 피질 하부 핵에서 세포의 우세한 손실을 특징으로 한다.
"진행성 핵상 마비"("PSP")는 정면 볼록의 위축과 관련이 있고; 피질 하부 위축은 담창구, 시상하핵, 뇌간핵 수준에서 중증이다(참조: Olney, N.T. et al. (2017) Neurol Clin 35(2): 339-374).
"구형 신경교 타우병증"("GGT")은 4개-반복체 tau 이소형을 포함하는 성상세포 및 희소돌기아교세포에 광범위한 구형 내포물을 갖는 희귀한 전두측두엽 변성(FLD) 유형이다. 이들 사례는 기본 tau 병리 및 신경변성의중증도 및 분포와 상관관계가 있는 다양한 임상 증상과 관련이 있다(참조: Ahmed, Z. et al. (2013) Acta Neuropathol 126(4): 537-544).
"파킨슨증을 동반한 전두측두엽 치매"("FTDP")는 움직임에도 영향을 미치는 덜 통상적인 유형의 FTD이다. 17번 염색체는 FTDP(FTDP-17)와 연결되어 있는 것으로 밝혀졌고, 17번 염색체의 미세소관 관련 단백질 tau(MAPT)에 대한 돌연변이는 가족성 FTDP-17을 가진 많은 친족에서 발견되었다. MAPT의 돌연변이로 인한 FTDP-17은 25-65세 사이에 시작되며 침투율은 100%에 가깝다. 증상은 집행 기능부전 및 변경된 성격 및 행동을 포함하며, 실어증 및 파킨슨증은 많은 개체에서 발생한다(참조: Boeve, B.F. et al. (2008) Arch Neurol 65(4): 460-464).
"만성 외상성 뇌병증"("CTE")은 많은 운동선수, 특히 축구 선수에서 발견되는 반복적인 경미한 외상성 뇌 손상으로 인해 쇠약해지는 신경변성 질환이다. CTE의 신경병리학적 시그니처는 고랑과 혈관주위 영역, 미세아교세포증 및 성상세포증에 인산화된 tau의 축적을 포함하고; 초기 단계에서 일부 tau 침작물로부터 질환은 후기 단계에서 전반적인 뇌 위축으로 진행할 수 있다. CTE는 단기 기억력 결핍 및 경미한 공격성과 같은 경미한 증상에서 편집증 및 파킨슨증을 포함한 진행된 언어 결핍 및 정신병 증상에 이르기까지 수년에 걸쳐 진행할 수 있다(참조: Fesharaki-Zadeh, A.(2019) Front Neurol 10:713).
"권투선수 치매"는 복싱에서 머리에 반복적으로 타격을 가해 인지 및 운동 기능이 심하게 손상되는 CTE의 한 형태이다(참조: Castellani. R.J et al. (2017) J Alzheimers Dis 60(4): 1209-1221).
"호은성 곡물 질환"("AGD")은 매우 빈번한 산발성 타우병증이고, 여러 연구에서 알츠하이머 질환 후 두 번째로 가장 통상적인 신경변성 질환이다. AGD는 호은성 곡물(AG)이라고 지칭되는 신경 과정에서 작은 스핀들 또는 쉼표 모양의 은염색 양성 병변을 특징으로 하는 후기 발병 신경변성 질환이다. 인산화된-tau는 AG 주요 성분이다. 가장 통상적인 AGD 증상은 천천히 진행되는 기억상실 및 경미한 인지 손상이고, 높은 유병률의 신경정신병적 증상을 수반한다. 현저한 임상적 특성이 없기 때문에 AGD는 단지 흔히 3지 병리학적 특징에 따라 사후 진단된다(참조: Rodriguez, R.D. et al.(2015) Dement Neuropsychol 9(1): 2-8).
"1차 연령 관련 타우병증"("PART")은 인지 기능이 정상이거나 약간만 손상된 노인 개체의 뇌에서 통상적으로 사후에 관찰되는 병리학이다. PART 뇌에는 알츠하이머 질환과 구별할 수 없는 tau 신경원섬유 엉킴을 갖지만 아밀로이드-β 플라크는 없다(참조: Crary, J.F. et al. (2014) Acta Neuropathol 128(6): 755-66).
"크로이츠펠트 야콥 질환"("CJD")은 전염성 해면상 뇌병증(TSE) 또는 프리온 질환으로 공지된 인간 및 동물 질환 계열에 속한다. "단백질"과 "감염성"에서 유래된 프리온은 사람들에서는 CJD를 동물에서는 TSE를 유발한다. 해면상은 감염된 뇌의 특징적인 외관을 지칭하고 현미경으로 검사할 때 해면과 유사해질 때까지 구멍으로 채워지게 된다. CJD는 희귀하고 변성이며 치명적인 뇌 장애로, 일반적으로 노년기에 나타나며 빠른 경과를 보인다. 전형적인 증상의 발병은 약 60세에 발생하고 약 70%의 개체가 1년 이내에 사망한다. 질환의 초기 단계에서, 사람들은 기억력 감퇴, 행동 변화, 협조 결핍 및 시각 장애를 가질 수 있다. 질병이 진행됨에 따라 정신 쇠퇴가 현저해지고 비자발적 움직임, 실명, 사지 쇠약, 혼수 상태가 발생할 수 있다. 프리온 플라크 외에도, tau 병리학은 CJD 환자의 여러 뇌 영역에서 관찰되며, 광범위한 타우병리학을 가진 환자의 뇌척수액에서도 총 tau 단백질을 상승시켰다(참조: Kovacs, G.G et al. (2017) Brain Pathol 3: 332- 344).
"가족성 영국 치매"("FBD")는 치매, 경련성 사지마비 및 소뇌 운동실조증을 포함하는 임상 양상을 갖는 대규모 영국 혈통의 영향을 받은 구성원에서 처음으로 보고된 대뇌 아밀로이드 혈관병증의 유형이다. FBD는 BRI2 유전자 내 돌연변이에 의해 유발된다. FBD의 아밀로이드 플라크는 아밀로이드-Bri로 구성되고, tau 양성 신경 원섬유 엉킴은 아밀로이드-Bri 병변의 영향을 받는 영역에서 발견된다. FBD에서 tau의 면역블롯팅은 알츠하이머 질환의 tau 패턴과 유사하다(참조: Holton J.L. et al. (2001) Am J Patho 2: 515-526).
본원에 사용된 "치료학적 유효량"은 APOE-관련 신경변성 질환을 갖는 대상체에게 투여될 때 질환의 치료에 영향을 미치기에 충분한 RNAi 제제의 양을 포함하는 것으로 의도된다(예를 들어, 기존 질환 또는 질환의 하나 이상의 증상을 감소, 완화 또는 유지함으로서). "치료학적 유효량"은 RNAi 제제, 제제가 투여되는 방식, 질환 및 중증도, 병력, 연령, 체중, 가족력, 유전적 구성, 경우에 따라 선행 또는 병용 치료의 유형 및 치료될 대상체의 기타 개별적인 특징에 따라 다양할 수 있다.
본원에 사용된 "예방학적 유효량"은 APOE 관련 신경변성 장애를 갖는 대상체에게 투여될 때 질환 또는 상기 질환의 하나 이상의 증상을 예방하거나 개선하기에에 충분한 RNAi 제제의 양을 포함하는 것으로 의도된다. 질환의 개선은 질환 과정을 서행시키거나 후기 발병 질환의 중증도를 감소시킴을 포함한다. "예방학적 유효량"은 RNAi 제제, 제제가 투여되는 방식, 질환 위험 정도, 병력, 연령, 체중, 가족력, 유전적 구성, 경우에 따라 선행 또는 병용 치료의 유형 및 치료될 환자의 기타 개별적인 특징에 따라 다양할 수 있다.
"치료학적 유효량" 또는 "예방학적 유효량"은 또한 임의의 치료에 적용할 수 있는 합리적인 이득/위험 비율로 일부 목적하는 국소 또는 전신 효과를 생성하는 RNAi 제제의 양을 포함한다. 본원 개시내용의 방법에 사용되는 iRNA 제제는 그러한 치료에 적용할 수 있는 합리적인 이득/위험 비율을 생성하기에 충분한 양으로 투여될 수 있다.
본원에서 사용되는 문구 "약제학적으로 허용되는"이란, 완전한 의학적 판단의 범위 내에서, 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응 또는 다른 문제 또는 합병증 없이, 합리적인 이익/위험 비율에 적합한, 인간 대상체 및 동물 대상체의 조직과의 접촉에 사용하기에 적합한 화합물, 물질, 조성물 및/또는 투여 형태를 지칭하기 위해 사용된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "약제학적으로 허용되는 담체"는 신체의 하나의 기관 또는 부위로부터 신체의 또 다른 기관 또는 일부로 본원의 화합물을 운반하거나 수송하는데 관여하는, 약제학적으로 허용되는 물질, 조성물 또는 비히클, 예를 들어, 액체 또는 고체 충전제, 희석제, 부형제, 제조 보조제(예를 들어, 윤활제, 탈크 마그네슘, 칼슘 또는 아연 스테아레이트, 또는 스테아르산), 또는 용매 캡슐화 물질을 의미한다. 각각의 담체는 제형의 다른 성분과 상용성일수 있고 치료받는 대상체에게 해를 끼치지 않는다는 의미에서 "허용되는"이어야 한다. 약제학적으로 허용되는 담체로서 작용할 수 있는 물질의 일부 예는 다음을 포함한다: (1) 당, 예를 들어, 락토스, 글루코스 및 슈크로스; (2) 전분, 예를 들어, 옥수수 전분 및 감자 전분; (3) 셀룰로스, 및 이의 유도체, 예를 들어, 나트륨 카복시메틸 셀룰로스, 에틸 셀룰로스 및 셀룰로스 아세테이트; (4) 분말 트라가칸트; (5) 맥아; (6) 겔라틴; (7) 윤활제, 예를 들어, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 라우릴 설페이트 및 탈크; (8) 부형제, 예를 들어, 코코아 버터 및 좌제 왁스; (9) 오일, 예를 들어, 땅콩유, 면화씨유, 잇꽃유, 참깨유, 올리브유, 옥수수유 및 대두유; (10) 글리콜, 예를 들어, 프로필렌 글리콜; (11) 폴리올, 예를 들어, 글리세린, 소르비톨, 만니톨 및 폴리에틸렌 글리콜 ; (12) 에스테르, 예를 들어, 에틸 올레에이트 및 에틸 라우레이트; (13) 한천; (14) 완충제, 예를 들어, 수산화마그네슘 및 수산화알루미늄; (15) 알긴산; (16) 발열원 부재 물; (17) 등장성 식염수; (18) 링거 용액; (19) 에틸 알콜; (20) pH 완충액; (21) 폴리에스테르, 폴리카보네이트 및/또는 다중무수물; (22) 벌크제, 예를 들어, 폴리펩타이드 및 아미노산; (23) 혈청 성분, 예를 들어, 혈청 알부민, HDL 및 LDL; 및 (22) 약제학적 제형에 사용되는 다른 비독성 상용성 물질.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "샘플"은 대상체로부터 단리된 유사한 체액, 세포 또는 조직뿐만 아니라 대상체 내에 존재하는 체액, 세포 또는 조직의 집합체를 포함한다. 생물학적 유체의 예는 혈액, 혈청 및 장액, 혈장, 뇌척수액, 안액, 림프, 소변, 타액 등을 포함한다. 조직 샘플은 조직, 기관 또는 국소 영역으로부터의 샘플을 포함할 수 있다. 예를 들어, 샘플은 특정 기관, 기관의 일부 또는 해당 기관 내의 체액이나 세포로부터 유래할 수 있다. 특정 양태에서, 샘플은 뇌로부터 유래될 수 있다(예를 들어, 전체 뇌 또는 뇌의 특정 분절, 예를 들어, 선조체 또는 뇌 내의 특정 유형의 세포, 예를 들어, 뉴런 및 신경아교 세포 (성상세포, 희소돌기아교세포, 미세아교세포). 다른 양태에서, "대상체로부터 유래된 샘플"은 대상체로부터 유래된 간 조직(또는 이의 서브성분)을 지칭한다. 일부 양태에서, "대상체로부터 유래된 샘플"은 대상체로부터 수득된 혈액 또는 이로부터 유래된 혈장 또는 혈청을 지칭한다. 추가의 양태에서, "대상체로부터 유래된 샘플"은 대상체로부터 유래된 뇌 조직(또는 이의 서브성분) 또는 망막 조직(또는 이의 서브성분)을 지칭한다.
II. 본원 개시내용의 RNAi 제제
본원에 개시된 것은 APOE 유전자의 발현을 억제하는 RNAi 제제이다. 일부 양태에서, 본원에 제공된 RNAi 제제는 APOE2 대립유전자, APOE3 대립유전자 및 APOE4 대립유전자의 발현을 억제한다. 다른 양태에서, 본원에 제공된 RNAi 제제는 APOE4 대립유전자의 발현을 억제하고, 예를 들어, RNAi 제제는 APOE2 대립유전자 또는 APOE3 대립유전자의 발현을 실질적으로 억제하지 않고, 예를 들어 APOE2 및 APOE3의 발현의 억제는 약 10% 이하이다. 일양태에서, RNAi 제제는 세포 내, 예를 들어, 대상체, 예를 들어, 포유류, 예를 들어, APOE-관련 신경변성 질환, 예를 들어, 아밀로이드-β-매개된 질환, 예를 들어, 알츠하이머 질환, 다운 증후군 및 대뇌 아밀로이드 혈관병증 및 tau-매개된 질환, 예를 들어, 1차 타우병증, 예를 들어, 전두측두엽 치매(FTD), 진행성 핵상 마비(PSP), 척수기저 변성(CBD), 픽 질환(PiD), 구상 신경교 타우병증(GGT), 파킨슨증을 동반한 전두측두엽 치매(FTDP, FTDP-17), 만성 외상성 뇌병증(CTE), 권투선수 치매, 전두측두엽 변성(FTLD), 호은성 곡물 질환(AGD) 및 1차 연령 관련 타우병증(PART), 또는 2차 타우병증, 예를 들어, AD, 크로이츠펠트 야콥 질환, 다운 증후군 및 가족성 영국 치매를 갖는 인간의 세포 내 APOE 유전자의 발현을 억제하기 위한 이중 가닥 리보핵산(dsRNA) 분자를 포함한다. dsRNA는 APOE 유전자의 발현에서 형성된 mRNA의 적어도 일부에 상보성인 상보성 영역을 갖는 안티센스 가닥을 포함한다. 상보성 영역은 길이가 약 15-30개의 뉴클레오타이드이다. APOE 유전자를 발현하는 세포와의 접촉시, 상기 RNAi 제제는 APOE 유전자(예를 들어, 인간 유전자, 영장류 유전자, 비-영장류 유전자)의 발현을 예를 들어, PCR 또는 측쇄 DNA(bDNA) 기반 방법에 의해 또는 단백질 기반 방법에 의해, 예를 들어, 웨스턴 블롯팅 또는 유동 세포측정 기술을 사용한 면역형광 분석에 의한 검정시 적어도 50%까지 억제한다. 일양태에서, 녹다운 수준은 하기 실시예 1에 제공된 이중-루시퍼라제 검정 방법을 사용하여 인간 신경모세포종 BE(2)-C 세포에서 10nM 농도의 siRNA에서 검정된다.
dsRNA는 상보성인 2개의 RNA 가닥을 포함하고, 하이브리드화하여 dsRNA가 사용되는 조건 하에 듀플렉스 구조를 형성한다. dsRNA의 하나의 가닥(안티센스 가닥)은 표적 서열과 실질적으로 상보적이고 일반적인 완전히 상보적인 상보성 영역을 포함한다. 표적 서열은 APOE 유전자의 발현 동안에 형성된 mRNA의 서열로부터 유래할 수 있다. 다른 가닥(안티센스 가닥)은 안티센스 가닥에 상보적인 영역을 포함하여, 2개의 가닥은 적합한 조건 하에 조합되는 경우 하이브리드화하여 듀플렉스 구조를 형성한다. 본원 다른 곳에 기재되고 당업계에 공지된 바와 같이, dsRNA의 상보성 서열은 또한 별개의 올리고뉴클레오타이드 상에 존재하는 것과는 대조적으로 단일 핵산 분자의 자가-상보성 영역으로서 포함될 수 있다.
일반적으로, 듀플렉스 구조는 길이가 15 내지 30개 염기쌍, 예를 들어, 길이가 15-29, 15-28, 15-27, 15-26, 15-25, 15-24, 15-23, 15-22, 15-21, 15-20, 15-19, 15-18, 15-17, 18-30, 18-29, 18-28, 18-27, 18-26, 18-25, 18-24, 18-23, 18-22, 18-21, 18-20, 19-30, 19-29, 19-28, 19-27, 19-26, 19-25, 19-24, 19-23, 19-22, 19-21, 19-20, 20-30, 20-29, 20-28, 20-27, 20-26, 20-25, 20-24,20-23, 20-22, 20-21, 21-30, 21-29, 21-28, 21-27, 21-26, 21-25, 21-24, 21-23, 또는 21-22개 염기쌍이다. 특정 바람직한 양태에서, 듀플렉스 구조는 길이가 18 내지 25개 염기쌍, 예를 들어, 길이가 18-25, 18-24, 18-23, 18-22, 18-21, 18-20, 19-25, 19-24, 19-23, 19-22, 19-21, 19-20, 20-25, 20-24,20-23, 20-22, 20-21, 21-25, 21-24, 21-23, 21-22, 22-25, 22-24, 22-23, 23-25, 23-24 또는 24-25개 염기쌍, 예를 들어, 길이가 19-21개 염기쌍이다. 상기 언급된 범위 및 길이의 중간 범위 및 길이는 또한 본원 개시내용의 일부인 것으로 고려된다.
유사하게, 표적 서열에 대한 상보성 영역은 길이가 15 내지 30개의 뉴클레오타이드, 예를 들어, 길이가 15-29, 15-28, 15-27, 15-26, 15-25, 15-24, 15-23, 15-22, 15-21, 15-20, 15-19, 15-18, 15-17, 18-30, 18-29, 18-28, 18-27, 18-26, 18-25, 18-24, 18-23, 18-22, 18-21, 18-20, 19-30, 19-29, 19-28, 19-27, 19-26, 19-25, 19-24, 19-23, 19-22, 19-21, 19-20, 20-30, 20-29, 20-28, 20-27, 20-26, 20-25, 20-24,20-23, 20-22, 20-21, 21-30, 21-29, 21-28, 21-27, 21-26, 21-25, 21-24, 21-23, 또는 21-22개의 뉴클레오타이드, 예를 들어, 길이가 19-23개의 뉴클레오타이드이다. 상기 언급된 범위 및 길이의 중간 범위 및 길이는 또한 본원 개시내용의 일부인 것으로 고려된다.
일부 양태에서, dsRNA는 길이가 15 내지 23개의 뉴클레오타이드 또는 길이가 25 내지 30개의 뉴클레오타이드이다. 일반적으로, dsRNA는 다이서 효소에 대한 기질로서 작용하기에 충분히 길다. 예를 들어, 약 21-23개의 뉴클레오타이드보다 긴 dsRNA가 다이서에 대한 기질로 작용할 수 있다는 것은 당업계에 널리 공지되어 있다. 당업자가 또한 인지하는 바와 같이, 절단을 위해 표적화된 RNA의 영역은 가장 흔히 보다 큰 RNA 분자, 종종 mRNA 분자의 일부일 것이다. 관련되는 경우, mRNA 표적의 "일부"는 그것이 RNAi-지시된 절단(즉, RISC 경로를 통한 절단)을 위한 기질이 되도록 하기에 충분한 길이의 mRNA 표적의 연속 서열이다.
당업자는 또한 듀플렉스 영역이 dsRNA의 1차 기능성 부분이고, 예를 들어, 듀플렉스 영역은 약 15 내지 36개 염기쌍, 예를 들어, 15-29, 15-28, 15-27, 15-26, 15-25, 15-24, 15-23, 15-22, 15-21, 15-20, 15-19, 15-18, 15-17, 18-30, 18-29, 18-28, 18-27, 18-26, 18-25, 18-24, 18-23, 18-22, 18-21, 18-20, 19-30, 19-29, 19-28, 19-27, 19-26, 19-25, 19-24, 19-23, 19-22, 19-21, 19-20, 20-30, 20-29, 20-28, 20-27, 20-26, 20-25, 20-24,20-23, 20-22, 20-21, 21-30, 21-29, 21-28, 21-27, 21-26, 21-25, 21-24, 21-23, 또는 21-22개 염기쌍임을 인지할 것이다. 따라서, 일양태에서, 절단을 위해 목적하는 RNA를 표적화하는, 예를 들어 15-30개 염기쌍의 기능성 듀플렉스로 가공되는 정도로, 30개 초과의 염기쌍의 듀플렉스 영역을 갖는 RNA 분자 또는 RNA 분자의 복합체는 dsRNA이다. 따라서, 당업자는 일양태에서 miRNA가 dsRNA임을 인지할 것이다. 또 다른 양태에서, dsRNA는 천연적으로 존재하는 miRNA가 아니다. 또 다른 양태에서, APOE 발현을 표적화하기 위해 유용한 RNAi 제제는 보다 큰 dsRNA의 절단에 의해 표적 세포에서 생성되지 않는다.
본원에 기재된 바와 같은 dsRNA는 추가로 하나 이상의 단일 가닥 뉴클레오타이드 오버행, 예를 들어, 1, 2, 3, 또는 4개의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 뉴클레오타이드 오버행은 데옥시뉴클레오타이드/뉴클레오사이드를 포함하는 뉴클레오타이드/뉴클레오사이드 유사체를 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 오버행(들)은 센스 가닥, 안티센스 가닥, 또는 이들의 임의의 조합 상에 있을 수 있다. 또한, 오버행의 뉴클레오타이드(들)는 dsRNA의 안티센스 또는 센스 가닥의 5'-말단, 3'-말단 또는 양쪽 말단 상에 존재할 수 있다.
dsRNA는 당업계에 공지된 표준 방법에 의해 합성될 수 있다.
하나의 양상에서, 본원 개시내용의 dsRNA는 적어도 2개의 뉴클레오타이드 서열, 센스 서열 및 안티센스 서열을 포함한다. APOE에 대한 센스 가닥 서열은 표 2-5 및 7-10 중 어느 하나에 제공된 서열 그룹으로부터 선택될 수 있고, 센스 가닥의 안티센스 가닥의 상응하는 뉴클레오타이드 서열은 표 2-5 및 7-10 중 어느 하나의 서열 그룹으로부터 선택될 수 있다. 상기 양상에서, 2개의 서열 중 하나는 2개의 서열 중 다른 하나와 상보적이고, 서열 중 하나는 실질적으로APOE 유전자의 발현에서 생성된 mRNA의 서열에 상보적이다. 이와 같이, 상기 양상에서, dsRNA는 2개의 올리고뉴클레오타이드를 포함하고, 여기서, 하나의 올리고뉴클레오타이드는 표 2-5 및 7-10 중 어느 하나에서 센스 가닥(패신저 가닥)으로서 기재되고, 제2 올리고뉴클레오타이드는 표 2-5 및 7-10 중 어느 하나에서 센스 가닥의 상응하는 안티센스 가닥(가이드 가닥)으로서 기재된다.
일양태에서, dsRNA의 실질적으로 상보성인 서열은 별도의 올리고뉴클레오타이드 상에 포함된다. 또 다른 양태에서, dsRNA의 실질적으로 상보성인 서열은 단일 올리고뉴클레오타이드 상에 포함된다.
표 3, 5, 8, 및 10에서 서열이 변형되거나 접합된 서열로서 기재되고 표 2, 4, 7, 및 9에서 서열이 비변형된 것으로 기재되지만, 본원 개시내용의 RNAi 제제의 RNA, 예를 들어, 본원 개시내용의 dsRNA는 비변형되거나 비접합되거나 본원에 기재된 것과 상이하게 변형되거나 접합된 표 2-5 및 7-10 중 어느 하나에서 제시된 서열 중 어느 하나를 포함할 수 있는 것으로 이해된다. 하나 이상의 친유성 리간드 및/또는 하나 이상의 GalNAc 리간드가 본 출원에서 제공된 RNAi 제제의 임의의 위치에 포함될 수 있다.
당업자는 약 20 내지 23개 염기쌍, 예를 들어, 21개 염기쌍의 듀플렉스 구조를 갖는 dsRNA가 RNA 간섭을 유도하는데 특히 효과적인 것으로 환영받고 있음을 잘 알고 있다(참조: Elbashir et al., (2001) EMBO J., 20:6877-6888). 그러나, 다른 당업자들은 보다 짧거나 보다 긴 RNA 듀플렉스 구조가 또한 효과적일 수 있음을 밝혔다(참조: Chu and Rana (2007) RNA 14:1714-1719; Kim et al. (2005) Nat Biotech 23:222-226). 상기 기재된 양태에서, 본원에 제공된 올리고뉴클레오타이드 서열의 특성에 의해, 본원에 기재된 dsRNA는 최소로 21개의 뉴클레오타이드 길이의 적어도 하나의 가닥을 포함할 수 있다. 보다 짧은 듀플렉스 마이너스 하나 또는 양 말단 상의 단지 소수의 뉴클레오타이드가 상기된 dsRNA와 비교하여 유사하게 효과적일 수 있음이 합리적으로 예상될 수 있다. 따라서, 본원에 제공된 서열 중 하나로부터 유래된 적어도 15, 16, 17, 18, 19, 20개 또는 그 이상의 연속 뉴클레오타이드를 갖고, Cos7 및 10 nM 농도의 RNA 제제를 사용한 시험관내 검정 및 본원의 실시예에 제공된 바와 같은 PCR 검정을 사용하여 완전한 서열을 포함하는 10, 15, 20, 25, 또는 30% 이하의 억제까지 APOE 유전자의 발현을 억제하는 이들의 능력이 상이한 dsRNA는 본원 개시내용 범위 내에 있는 것으로 고려된다.
또한, 본원에 기재된 RNA는 RISC 매개된 절단에 민감한 APOE 전사체에서 부위(들)을 동정한다. 이와 같이 본원 개시내용은 상기 부위(들)내를 표적화하는 RNAi 제제를 추가로 특징으로 한다. 본원에 사용된 바와 같이, RNAi 제제는 RNAi 제제가 상기 특정 부위 내 어느 곳에서의 전사체의 절단을 촉진시키는 경우 RNA 전사체의 특정 부위 내를 표적화하는 것으로 일컬어진다. 상기 RNAi 제제는 일반적으로 APOE 유전자에서 선택된 서열에 연속하는 영역으로부터 취해진 추가의 뉴클레오타이드 서열에 커플링된 본원에 제공된 서열의 하나로부터 적어도 약 15개의 연속 뉴클레오타이드, 바람직하게 적어도 19개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
본원에 기재된 바와 같은 RNAi 제제는 표적 서열과 하나 이상의 미스매치를 함유할 수 있다. 일양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 RNAi 제제는 3개 이하의 미스매치(즉, 3, 2, 1, 또는 0개 미스매치)를 함유한다. 일양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 RNAi 제제는 2개 이하의 미스매치를 함유한다. 일양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 RNAi 제제는 1개 이하의 미스매치를 함유한다. 일양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 RNAi 제제는 0개의 미스매치를 함유한다. 특정 양태에서, RNAi 제제의 안티센스 가닥이 표적 서열과 미스매치를 함유하는 경우, 상기 미스매치는 임의로 상보성 영역의 5'- 또는 3'-말단으로부터 마지막 5개의 뉴클레오타이드 내에 있는 것으로 제한될 수 있다. 예를 들어, 상기 양태에서, 23개의 뉴클레오타이드 RNAi 제제에 대해, APOE 유전자의 영역에 상보적인 가닥은 일반적으로 중앙 13개의 뉴클레오타이드 내에 임의의 미스매치를 함유하지 않는다. 본원에 기재된 방법 또는 당업계에 공지된 방법을 사용하여, 표적 서열과 미스매치를 함유하는 RNAi 제제가 APOE 유전자의 발현을 억제하는데 효과적인지를 결정할 수 있다. APOE 유전자의 발현을 억제하는데 있어서 미스매치를 갖는 RNAi 제제의 효능의 고려는 중요하고, 특히 APOE 유전자 내 상보성의 특정 영역이 집단 내 다형태 서열 변화를 갖는 것으로 공지된 경우 그러하다.
III. 본원 개시내용의 변형된 RNAi 제제
일양태에서, 본원 개시내용의 RNAi, 예를 들어 dsRNA의 RNA는 변형되지 않고, 예를 들어 당업계에 공지되고 본원에 기재된 화학적 변형 또는 접합을 포함하지 않는다. 바람직한 양태에서, 본원 개시내용의 iRNA, 예를 들어, dsRNA의 RNA는 화학적으로 변형되어 안정성 또는 다른 이로운 특징을 증진시킨다. 본원 개시내용의 특정 양태에서, 본원 개시내용의 RNAi 제제의 실질적으로 모든 뉴클레오타이드는 변형된다. 본원 개시내용의 다른 양태에서, 본원 개시내용의 RNAi 제제의 모든 뉴클레오타이드는 변형된다. "실질적으로 모든 뉴클레오타이드가 변형된다"는 본원 개시내용의 RNAi 제제는 대부분이 변형되지만 그러나 완전히 변형되지는 않으며 5, 4, 3, 2 또는 1개 이하의 변형되지 않은 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 본원 개시내용의 여전히 다른 양태에서, 본원 개시내용의 RNAi 제제는 5, 4, 3, 2 또는 1개 이하의 변형된 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
본원 개시내용에서 특징으로 하는 핵산은 문헌(참조: "Current protocols in nucleic acid chemistry," Beaucage, S.L. et al. (Edrs.), John Wiley & Sons, Inc., New York, NY, USA, 이는 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 것들과 같이 당업계에서 널리 확립된 방법에 의해 합성되거나 변형될 수 있다. 변형은 예를 들어, 말단 변형, 예를 들어, 5'-말단 변형(인산화, 접합, 역위 연결) 또는 3'-말단 변형(접합, DNA 뉴클레오타이드, 역위 연결 등); 염기 변형, 예를 들어, 안정화 염기, 또는 파트너의 확장된 레퍼토리와 염기쌍을 형성하는 염기로의 대체, 염기의 제거(무염기 뉴클레오타이드), 또는 접합된 염기; 당 변형(예를 들어, 2'-위치 또는 4'-위치에서) 또는 당의 대체; 또는 포스포디에스테르 연결의 변형 또는 대체를 포함하는 골격 변형을 포함한다. 본원에 기재된 양태에 유용한 RNAi 제제의 특정 예는 변형된 골격을 함유하거나 어떠한 천연 뉴클레오타이드 간 연결을 함유하지 않는 RNA를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 변형된 골격을 갖는 RNA는 무엇 보다 골격 내 인 원자를 갖지 않는 것들을 포함한다. 본 명세서의 목적을 위해서 및 당업계에서 때로 언급되는 바와 같이, 이들의 뉴클레오타이드 간 골격 내 인 원자를 갖지 않는 변형된 RNA는 또한 올리고뉴클레오타이드인 것으로 고려될 수 있다. 일부 양태에서, 변형된 RNAi는 이의 뉴클레오사이드 간 골격 내 인 원자를 갖는다.
변형된 RNA 골격은 예를 들어, 포스포로티오에이트, 키랄 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포트리에스테르, 아미노알킬포스포트리에스테르, 3'-알킬렌 포스포네이트 및 키랄 포스포네이트를 포함하는 메틸 및 다른 알킬 포스포네이트, 포스피네이트, 3'-아미노 포스포르아미데이트 및 아미노알킬포스포르아미데이트를 포함하는 포스포르아미데이트, 티오노포스포르아미데이트, 티오노알킬포스포네이트, 티오노알킬포스포트리에스테르, 및 정상 3'-5' 연결을 갖는 보라노포스페이트, 이들의 2'-5' 연결된 유사체, 및 뉴클레오사이드 유닛의 인접한 쌍이 3'-5'에서 5'-3'로 연결되거나, 2'-5'에서 5'-2'로 연결된 역위 극성을 갖는 것들을 포함한다. 다양한 염, 예를 들어, 나트륨 염, 혼합 염 및 유리된 산 형태가 또한 포함된다.
상기 인-함유 연결의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허는 미국 특허 제3,687,808호; 제4,469,863호; 제4,476,301호; 제5,023,243호; 제5,177,195호; 제5,188,897호; 제5,264,423호; 제5,276,019호; 제5,278,302호; 제5,286,717호; 제5,321,131호; 제5,399,676호; 제5,405,939호; 제5,453,496호; 제5,455,233호; 제5,466,677호; 제5,476,925호; 제5,519,126호; 제5,536,821호; 제5,541,316호; 제5,550,111호; 제5,563,253호; 제5,571,799호; 제5,587,361호; 제5,625,050호; 제6,028,188호; 제6,124,445호; 제6,160,109호; 제6,169,170호; 제6,172,209호; 제6, 6,239,265호; 제6,277,603호; 제6,326,199호; 제6,346,614호; 제6,444,423호; 제6,531,590호; 제6,534,639호; 제6,608,035호; 제6,683,167호; 제6,858,715호; 제6,867,294호; 제6,878,805호; 제7,015,315호; 제7,041,816호; 제7,273,933호; 제7,321,029호; 및 미국 특허 제RE39,464호를 포함하지만 이에 제한되지 않고, 이들 각각의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
본원에서 인 원자를 포함하지 않는 변형된 RNA 골격은 단쇄 알킬 또는 사이클로알킬 뉴클레오사이드 간 연결, 혼합 헤테로원자 및 알킬 또는 사이클로알킬 뉴클레오사이드 간 연결, 또는 하나 이상의 단쇄 헤테로원자 또는 헤테로사이클릭 뉴클레오사이드 간 연결에 의해 형성된 골격을 갖는다. 이들은 모르폴리노 연결(부분적으로 뉴클레오사이드의 당 부분으로부터 형성된); 실록산 골격; 설파이드, 설폭사이드 및 설폰 골격; 포름아세틸 및 티오포름아세틸 골격; 메틸렌 포름아세틸 및 티오포름아세틸 골격; 알켄 함유 골격; 설파메이트 골격; 메틸렌이미노 및 메틸렌하이드라지노 골격; 설포네이트 및 설폰아미드 골격; 아미드 골격; 및 혼합 N, O, S 및 CH2 성분 부분을 갖는 기타의 것들을 갖는 것들을 포함한다.
상기 올리고뉴클레오타이드의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허는 미국 특허 제5,034,506호; 제5,166,315호; 제5,185,444호; 제5,214,134호; 제5,216,141호; 제5,235,033호; 제5,64,562호; 제5,264,564호; 제5,405,938호; 제5,434,257호; 제5,466,677호; 제5,470,967호; 제5,489,677호; 제5,541,307호; 제5,561,225호; 제5,596,086호; 제5,602,240호; 제5,608,046호; 제5,610,289호; 제5,618,704호; 제5,623,070호; 제5,663,312호; 제5,633,360호; 제5,677,437호; 및 제5,677,439호를 포함하지만 이에 제한되지 않고, 이들의 각각의 전문은 본원에 참조로 포함된다.
다른 양태에서, 적합한 RNA 모사체는 당 및 뉴클레오사이드 간 연결, 즉, 뉴클레오타이드 유닛의 골격 둘 다가 신규 그룹으로 대체된 RNAi 제제에서 사용하기 위해 고려된다. 염기 유닛은 적당한 핵산 표적 화합물과의 하이브리드화를 위해 유지된다. 우수한 하이브리드화 성질을 갖는 것으로 나타난 RNA 모사체인 하나의 상기 올리고머 화합물은 펩타이드 핵산(PNA)으로서 지칭된다. PNA 화합물에서, RNA의 당 골격은 아미드 함유 골격, 특히 아미노에틸글라이신 골격으로 대체된다. 뉴클레오염기는 보유되고 직접적으로 또는 간접적으로 골격의 아미드 부분의 아자 질소 원자에 결합된다. PNA 화합물의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허는 미국 특허 제5,539,082호; 제5,714,331호; 및 제5,719,262호를 포함하지만 이에 제한되지 않고, 이들 각각의 전문은 본원에 참조로 포함된다. 본원 개시내용의 RNAi 제제에 사용하기 위해 적합한 추가의 PNA 화합물은 예를 들어, 문헌(참조: Nielsen et al., Science, 1991, 254, 1497-1500)에 기재되어 있다.
본원 개시내용에서 특징으로 하는 일부 양태는 포스포로티오에이트 골격, 및 헤테로원자 골격 및 특히 미국 특허 제5,489,677호의 --CH2--NH--CH2-, --CH2--N(CH3)--O--CH2--[메틸렌 (메틸아미노) 또는 MMI 골격으로서 공지된], --CH2--O--N(CH3)--CH2--, --CH2--N(CH3)--N(CH3)--CH2-- 및 --N(CH3)--CH2--CH2-- 및 상기 언급된 미국 특허 제5,602,240호의 아미드 골격을 갖는 올리고뉴클레오타이드를 갖는 RNA를 포함한다. 일부 양태에서, 본원에 특징으로 하는 RNA는 상기 언급된 미국 특허 제5,034,506호의 모르폴리노 골격 구조를 갖는다. 고유 포스포디에스테르 골격은 O-P(O)(OH)-OCH2-로서 나타낼 수 있다.
변형된 RNA는 또한 하나 이상의 치환된 당 모이어티를 함유할 수 있다. RNAi 제제, 예를 들어, 본원에서 특징으로 하는 dsRNA는 2'-위치에서 하기 중 하나를 포함할 수 있다: OH; F; O-, S-, 또는 N-알킬; O-, S-, 또는 N-알케닐; O-, S- 또는 N-알키닐; 또는 O-알킬-O-알킬 중 하나를 포함할 수 있고, 여기서, 알킬, 알케닐 및 알키닐은 치환되거나 치환되지 않은 C1 내지 C10 알킬 또는 C2 내지 C10 알케닐 및 알키닐일 수 있다. 예시적인 적합한 변형은 O[(CH2)nO] mCH3, O(CH2).nOCH3, O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3, O(CH2)nONH2, 및 O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2를 포함하고, 여기서, n 및 m은 1 내지 약 10이다. 다른 양태에서, dsRNA는 2' 위치에서 하기 중 하나를 포함한다: C1 내지 C10 저급 알킬, 치환된 저급 알킬, 알크아릴, 아르알킬, O-알크아릴 또는 O-아르알킬, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, 헤테로사이클로알킬, 헤테로사이클로알크아릴, 아미노알킬아미노, 폴리알킬아미노, 치환된 실릴, RNA 절단 그룹, 리포터 그룹, 삽입제, RNAi 제제의 약동학 성질을 개선시키기 위한 그룹, 또는 RNAi 제제의 약력학 성질을 개선시키기 위한 그룹, 및 유사한 성질을 갖는 기타 치환체 중 하나를 포함한다. 일부 양태에서, 변형은 2'-메톡시에톡시(2'-O--CH2CH2OCH3, 또한 2'-O-(2-메톡시에틸) 또는 2'-MOE로서 공지됨) (참조: Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78:486-504), 즉, 알콕시-알콕시 그룹을 포함한다. 또 다른 예시적인 변형은 하기에서 본원의 실시예에 기재된 바와 같이 2'-DMAOE로서도 공지된 2'-디메틸아미노옥시에톡시, 즉, O(CH2)2ON(CH3)2 그룹, 및 2'-디메틸아미노에톡시에톡시(또한 당업계에서 2'-O-디메틸아미노에톡시에틸 또는 2'-DMAEOE로서 공지됨), 즉, 2'-O--CH2--O--CH2--N(CH2)2이다. 추가의 예시적인 변형은 다음을 포함한다: 5'-Me-2'-F 뉴클레오타이드, 5'-Me-2'-OMe 뉴클레오타이드, 5'-Me-2'-데옥시뉴클레오타이드, (이들 3개의 계열 중 R 및 S 이성체 둘 다); 2'-알콕시알킬; 및 2'-NMA(N-메틸아세트아미드).
기타 변형은 2'-메톡시(2'-OCH3), 2'-아미노프로폭시(2'-OCH2CH2CH2NH2), 2'-O-헥사데실 및 2'-플루오로(2'-F)를 포함한다. 유사한 변형은 또한 RNAi 제제의 RNA 상의 다른 위치, 특히 3' 말단 뉴클레오타이드 상의 당의 3' 위치 또는 2'-5' 연결된 dsRNA 및 5' 말단 뉴클레오타이드의 5' 위치에서 이루어질 수 있다. RNAi 제제는 또한 펜토푸라노실 당 대신에 사이클로부틸 모이어티와 같은 당 모사체를 가질 수 있다. 상기 변형된 당 구조의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허는 미국 특허 제4,981,957호; 제5,118,800호; 제5,319,080호; 제5,359,044호; 제5,393,878호; 제5,446,137호; 제5,466,786호; 제5,514,785호; 제5,519,134호; 제5,567,811호; 제5,576,427호; 제5,591,722호; 제5,597,909호; 제5,610,300호; 제5,627,053호; 제5,639,873호; 제5,646,265호; 제5,658,873호; 제5,670,633호; 및 제5,700,920호를 포함하지만 이에 제한되지 않고, 이들의 특정 부분은 일반적으로 본원에서 소유된다. 이전 문헌의 각각의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
본원 개시내용의 RNAi 제제는 또한 뉴클레오염기(흔히 단순히 "염기"로서 언급되는) 변형 또는 치환을 포함할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 "비변형된" 또는 "천연" 뉴클레오염기는 퓨린 염기 아데닌(A) 및 구아닌(G), 및 피리미딘 염기 티민(T), 시토신(C) 및 우라실(U)을 포함한다. 변형된 뉴클레오염기는 5-메틸시토신(5-me-C), 5-하이드록시메틸 시토신, 크산틴, 하이포산틴, 2-아미노아데닌, 아데닌 및 구아닌의 6-메틸 및 기타 알킬 유도체, 아데닌 및 구아닌의 2-프로필 및 기타 알킬 유도체, 2-티오우라실, 2-티오티민 및 2-티오시토신, 5-할로우라실 및 시토신, 5-프로피닐 우라실 및 시토신, 6-아조 우라실, 시토신 및 티민, 5-우라실(슈도우라실), 4-티오우라실, 8-할로, 8-아미노, 8-티올, 8-티오알킬, 8-하이드록실 및 기타 8-치환된 아데닌 및 구아닌, 5-할로, 특히 5-브로모, 5-트리플루오로메틸 및 기타 5-치환된 우라실 및 시토신, 7-메틸구아닌 및 7-메틸아데닌, 8-아자구아닌 및 8-아자아데닌, 7-데아자구아닌 및 7-다아자아데닌 및 3-데아자구아닌 및 3-데아자아데닌과 같은 다른 합성 및 천연 뉴클레오염기를 포함한다. 추가의 뉴클레오염기는 미국 특허 제3,687,808호에 기재된 것들, 문헌(참조: Modified Nucleosides in Biochemistry, Biotechnology and Medicine, Herdewijn, P. ed. Wiley-VCH, 2008)에 기재된 것들; 문헌(참조: The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, pages 858-859, Kroschwitz, J. L, ed. John Wiley & Sons, 1990)에 기재된 것들, 문헌(참조: Englisch et al., (1991) Angewandte Chemie, International Edition, 30:613)에 기재된 것들, 및 문헌(참조: Sanghvi, Y S., Chapter 15, dsRNA Research and Applications, pages 289-302, Crooke, S. T. and Lebleu, B., Ed., CRC Press, 1993)에 기재된 것들을 포함한다. 특정 이들 뉴클레오염기는 특히 본원 개시내용에서 특성화된 올리고머 화합물의 결합 친화성을 증가시키기 위해 유용하다. 이들은 2-아미노프로필아데닌, 5-프로필우라실 및 5-프로피닐시토신을 포함하는, 5-치환된 피리미딘, 6-아자피리미딘 및 N-2, N-6 및 0-6개 치환된 퓨린을 포함한다. 5-메틸시토신 치환은 0.6-1.2℃까지 핵산 듀플렉스 안정성을 증가시키는 것으로 나타났고(참조: Sanghvi, Y. S., Crooke, S. T. and Lebleu, B., Eds., dsRNA Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278) 예시적으로 염기 치환이며, 보다 더 특히 2'-O-메톡시에틸 당 변형과 조합되는 경우이다.
상기 특정 주지된 변형된 뉴클레오염기 및 기타 변형된 뉴클레오염기의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허는 상기 주지된 미국 특허 제3,687,808호, 제4,845,205호; 제5,130,302호; 제5,134,066호; 제5,175,273호; 제5,367,066호; 제5,432,272호; 제5,457,187호; 제5,459,255호; 제5,484,908호; 제5,502,177호; 제5,525,711호; 제5,552,540호; 제5,587,469호; 제5,594,121호, 제5,596,091호; 제5,614,617호; 제5,681,941호; 제5,750,692호; 제6,015,886호; 제6,147,200호; 제6,166,197호; 제6,222,025호; 제6,235,887호; 제6,380,368호; 제6,528,640호; 제6,639,062호; 제6,617,438호; 제7,045,610호; 제7,427,672호; 및 제7,495,088호를 포함하지만 이에 제한되지 않고 이들 각각의 전문은 본원에 참조로 포함된다.
일부 양태에서, 본원 개시내용의 RNAi 제제는 또한 하나 이상의 바이사이클릭 당 모이어티를 포함하도록 변형될 수 있다. "바이사이클릭 당"은 인접하거나 인접하지 않은 것에 관계없이 2개의 탄소의 브릿징에 의해 형성된 환에 의해 변형된 푸라노실 환이다. "바이사이클릭 뉴클레오사이드"("BNA")는 인접하거나 인접해 있지 않든 상관 없이 2개의 탄소 원자를 브릿징하여 바이사이클릭 환 시스템을 형성함으로써 형성된 환을 포함하는 당 모이어티를 갖는 뉴클레오사이드이다. 특정 양태에서, 브릿지는 당 환의 4'-탄소 및 2'-탄소를 2'-비환형 (acyclic) 산소 원자를 통해 연결한다. 따라서, 일부 양태에서, 본 발명의 제제는 하나 이상의 잠금 핵산(LNA)을 포함할 수 있다. 잠김 핵산은 변형된 리보스 모이어티를 갖는 뉴클레오타이드이고, 여기서, 상기 리보스 모이어티는 2' 및 4' 탄소를 연결하는 여분의 브릿지를 포함한다. 다른 말로, LNA은 4'-CH2-O-2' 브릿지를 포함하는 바이사이클릭 당 모이어티를 포함하는 뉴클레오타이드이다. 상기 구조는 3'-엔도 구조 형태에서 리보스를 효과적으로 잠군다. siRNA로의 잠김 핵산의 첨가는 혈청에서 siRNA 안정성을 증가시키고 오프-표적 효과를 감소시키는 것으로 나타났다(참조: Elmen, J. et al., (2005) Nucleic Acids Research 33(1):439-447; Mook, OR. et al., (2007) Mol Canc Ther 6(3):833-843; Grunweller, A. et al., (2003) Nucleic Acids Research 31(12):3185-3193). 본 발명의 폴리뉴클레오타이드에 사용하기 위한 바이사이클릭 뉴클레오사이드의 예는 4'와 2' 리보실 고리 원자 사이에 브릿지를 포함하는 뉴클레오사이드를 제한 없이 포함한다. 특정 양태에서, 본 발명의 안티센스 폴리뉴클레오타이드 제제는 4'에서 2'로의 브릿지를 포함하는 하나 이상의 바이사이클릭 뉴클레오사이드를 포함한다.
잠긴 뉴클레오사이드는 구조(입체화학 생략)
Figure pct00024
로 나타낼 수 있고, 여기서, B는 뉴클레오염기 또는 변형된 뉴클레오염기이고 L은 2'-탄소를 리보스 환의 4'-탄소에 연결하는 연결 그룹이다. 상기 4'에서 2'로 브릿지된 바이사이클릭 뉴클레오사이드의 예는 4'-(CH2)-O-2'(LNA); 4'-(CH2)-S-2'; 4'-(CH2)2-O-2'(ENA); 4'-CH(CH3)-O-2' (또한 "속박된 에틸" 또는 "cEt"로서 언급됨) 및 4'-CH(CH2OCH3)-O-2'(및 이의 유사체; 예를 들어, 미국 특허 제7,399,845호 참조); 4'-C(CH3)(CH3)-O-2' (및 이의 유사체; 예를 들어, 미국 특허 제8,278,283호 참조); 4'-CH2-N(OCH3)-2' (및 이의 유사체; 예를 들어, 미국 특허 제8,278,425호 참조); 4'-CH2-O-N(CH3)-2' (예를 들어, 미국 특허 제2004/0171570호 참조); R이 H, C1-C12 알킬 또는 질소 보호 그룹인 4'-CH2-N(R)-O-2' (예를 들어, 미국 특허 제7,427,672호 참조); 4'-CH2-C(H)(CH3)-2' (예를 들어, 참조: Chattopadhyaya et al., J. Org. Chem., 2009, 74, 118-134); 및 4'-CH2-C(CH2)-2' (및 이의 유사체; 예를 들어, 미국 특허 제8,278,426호 참조)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 이전 문헌의 각각의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
잠김 핵산 뉴클레오타이드의 제조를 교시하는 추가의 대표적인 미국 특허 및 미국 특허 공개 공보는 하기를 포함하지만 이에 제한되지 않는다: 이들 각각의 전문이 본원에 참조로 포함된 미국 특허 제6,268,490호; 제6,525,191호; 제6,670,461호; 제6,770,748호; 제6,794,499호; 제6,998,484호; 제7,053,207호; 제7,034,133호; 제7,084,125호; 제7,399,845호; 제7,427,672호; 제7,569,686호; 제7,741,457호; 제8,022,193호; 제8,030,467호; 제8,278,425호; 제8,278,426호; 제8,278,283호; 미국 공개 공보 제2008/0039618호; 및 미국 공개 공보 제2009/0012281호.
임의의 전술한 바이사이클릭 뉴클레오사이드는 예를 들어 α-L-리보푸라노스 및 β-D-리보푸라노스를 포함하는 하나 이상의 입체화학적 당 배열을 갖도록 제조될 수 있다(WO 99/14226 참조).
본원 개시내용의 RNAi 제제는 또한 하나 이상의 속박된 에틸 뉴클레오타이드를 포함하도록 변형될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 "속박된 에틸 뉴클레오타이드" 또는 "cEt"는 4'-CH(CH3)-O-2' 브릿지를 포함하는 바이사이클릭 당 모이어티를 포함하는 잠김 핵산이다. 일양태에서, 속박된 에틸 뉴클레오타이드는 본원에서 "S-cEt"로 지칭되는 S 형태로 있다.
본원 개시내용의 RNAi 제제는 또한 하나 이상의 "형태적으로 제한된 뉴클레오타이드"("CRN")를 포함할 수 있다. CRN은 리보스의 C2' 및 C4' 탄소 또는 리보스의 C3 및 -C5' 탄소를 연결하는 링커를 갖는 뉴클레오타이드 유사체이다. CRN은 리보스 환을 안정한 형태로 잠그고 mRNA에 대한 하이브리드화 친화성을 증가시킨다. 링커는 안정성과 친화성을 위한 최적의 위치에 산소를 배치하여 리보스 환 퍼커링(puckering)을 감소시키는 데 충분한 길이이다.
특정 상기 주지된 CRN의 제조를 교시하는 대표적인 공개 공보는 미국 특허 공개 공보 제2013/0190383호; 및 공개공보 WO 2013/036868을 포함하지만 이에 제한되지 않고, 이들 각각의 전문은 본원에 참조로 포함된다.
일부 양태에서, 본원 개시내용의 RNAi 제제는 UNA(잠김 해제된 핵산) 뉴클레오타이드인 하나 이상의 단량체를 포함한다. UNA는 잠김 해제된 비환형 핵산이고, 여기서 당의 임의의 결합은 제거되었고 잠김 해제된 "당" 잔기를 형성한다. 하나의 예에서, UNA는 또한 C1'-C4' 사이의 결합(즉, C1'과 C4' 탄소 사이의 공유 탄소-산소-탄소 결합)이 제거된 단량체를 포괄한다. 또 다른 예에서, 당의 C2'-C3' 결합(즉, C2'와 C3' 탄소 사이의 공유 탄소-탄소 결합)이 제거되었다(참조: Nuc. Acids Symp. Series, 52, 133-134 (2008) and Fluiter et al., Mol. Biosyst., 2009, 10, 1039, 이는 본원에 참조로 포함됨).
UNA의 제조를 교시하는 대표적인 미국 공개 공보는 미국 특허 314,227호; 및 미국 특허 공개 공보 제2013/0096289호; 제2013/0011922호; 및 제2011/0313020호를 포함하지만 이에 제한되지 않고, 이들 각각의 전문은 본원에 참조로 포함된다.
RNA 분자의 말단으로 잠재적으로 안정화된 변형은 N- (아세틸아미노카프로일)-4-하이드록시프롤리놀(Hyp-C6-NHAc), N-(카프로일-4-하이드록시피롤리놀 (Hyp-C6), N-(아세틸-4-하이드록시프롤리놀(Hyp-NHAc), 티미딘-2'-0-데옥시티미딘 (에테르), N-(아미노카프로일)-4-하이드록시프롤리놀(Hyp-C6-아미노), 2-도코사노일-우리딘-3"-포스페이트, 역위 염기 dT(idT) 등을 포함할 수 있다. 상기 변형의 개시내용은 WO 2011/005861에서 찾을 수 있다.
본원 개시내용의 RNAi 제제의 기타 변형은 RNAi 제제의 안티센스 가닥 상의 5' 포스페이트 또는 5' 포스페이트 모사체, 예를 들어, 5'-말단 포스페이트 또는 포스페이트 모사체를 포함한다. 적합한 포스페이트 모사체는 예를 들어, 미국 특허 공개 공보 제2012/0157511호에 기재되어 있고, 이의 전문은 본원에 참조로 포함된다.
A. 본원 개시내용 모티프를 포함하는 변형된 RNAi 제제
본원 개시내용의 특정 양상에서, 본원 개시내용의 이중 가닥 RNAi 제제는 예를 들어, 이의 전문이 본원에 참조로 포함된 WO2013/075035에 기재된 것과 같은 화학적 변형을 갖는 제제를 포함한다. 본원 및 WO2013/075035에 나타낸 바와 같이, 보다 우수한 결과는 RNAi 제제의 센스 가닥 또는 안티센스 가닥으로, 특히 절단 부위에서 또는 이의 부근에서 3개의 연속 뉴클레오타이드 상에 3개의 동일한 변형의 하나 이상의 모티프를 도입함에 의해 수득될 수 있다. 일부 양태에서, RNAi 제제의 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 다르게는 완전히 변형될 수 있다. 이들 모티프의 도입은 경우에 따라 센스 또는 안티센스 가닥의 변형 패턴을 방해한다. RNAi 제제는 임의로 친유성 리간드, 예를 들어, 센스 가닥 상의 C16 리간드와 접합될 수 있다. RNAi 제제는 임의로 예를 들어, 안티센스 가닥의 하나 이상의 잔기 상에서 (S)-글리콜 핵산(GNA) 변형으로 변형될 수 있다. 수득한 RNAi 제제는 보다 우수한 유전자 사일런싱 활성을 제공한다.
따라서, 본원 개시내용은 표적 유전자(즉, APOE 유전자)의 발현을 생체내 억제할 수 있는 이중 가닥 RNAi 제제를 제공한다. RNAi 제제는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함한다. RNAi 제제의 각각의 가닥은 길이가 15-30개의 뉴클레오타이드일 수 있다. 예를 들어, 각각의 가닥은 길이가 16-30개의 뉴클레오타이드, 길이가 17-30개의 뉴클레오타이드, 길이가 25-30개의 뉴클레오타이드, 길이가 27-30개의 뉴클레오타이드, 길이가 17-23개의 뉴클레오타이드, 길이가 17-21개의 뉴클레오타이드, 길이가 17-19개의 뉴클레오타이드, 길이가 19-25개의 뉴클레오타이드, 길이가 19-23개의 뉴클레오타이드, 길이가 19-21개의 뉴클레오타이드, 길이가 21-25개의 뉴클레오타이드, 또는 길이가 21-23개의 뉴클레오타이드일 수 있다. 특정 양태에서, 각각의 가닥은 길이가 19-23개의 뉴클레오타이드이다.
센스 가닥 및 안티센스 가닥은 전형적으로 듀플렉스 이중 가닥 RNA("dsRNA")를 형성하며, 이는 본원에서 "RNAi 제제"로서도 지칭된다. RNAi 제제의 듀플렉스 영역은 길이가 15-30개의 뉴클레오타이드 쌍일 수 있다. 예를 들어, 듀플렉스 영역은 길이가 16-30개의 뉴클레오타이드 쌍, 길이가 17-30개의 뉴클레오타이드 쌍, 길이가 27-30개의 뉴클레오타이드 쌍, 길이가 17-23개의 뉴클레오타이드 쌍, 길이가 17-21개의 뉴클레오타이드 쌍, 길이가 17-19개의 뉴클레오타이드 쌍, 길이가 19-25개의 뉴클레오타이드 쌍, 길이가 19-23개의 뉴클레오타이드 쌍, 길이가 19-21개의 뉴클레오타이드 쌍, 길이가 21-25개의 뉴클레오타이드 쌍, 또는 길이가 21-23개의 뉴클레오타이드 쌍일 수 있다. 또 다른 예에서, 듀플렉스 영역은 길이가 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 및 27개인 뉴클레오타이드로부터 선택된다. 바람직한 양태에서, 듀플렉스 영역은 길이가 19-21개의 뉴클레오타이드 쌍이다.
일양태에서, dsRNAi 제제는 가닥 하나 또는 둘 다의 3'-말단, 5'-말단 또는 말단 둘 다에서 하나 이상의 오버행 영역 또는 캡핑 그룹을 함유할 수 있다. 오버행은 길이가 1-6개의 뉴클레오타이드, 예를 들어, 길이가 2-6개의 뉴클레오타이드, 길이가 1-5개의 뉴클레오타이드, 길이가 2-5개의 뉴클레오타이드, 길이가 1-4개의 뉴클레오타이드, 길이가 2-4개의 뉴클레오타이드, 길이가 1-3개의 뉴클레오타이드, 길이가 2-3개의 뉴클레오타이드, 또는 길이가 1-2개의 뉴클레오타이드일 수 있다. 바람직한 양태에서, 뉴클레오타이드 오버행 영역은 길이가 2개의 뉴클레오타이드이다. 오버행은 한 가닥이 다른 가닥보다 길거나 동일한 길이의 두 가닥이 엇갈려서 생긴 결과일 수 있다. 오버행은 표적 mRNA와 미스매치를 형성할 수 있거나 이것은 표적화된 유전자 서열에 상보적일 수 있거나 다른 서열일 수 있다. 제1 및 제2 가닥은 또한 예를 들어 추가 염기에 의해 연결되어 헤어핀을 형성하거나 다른 비염기 링커에 의해 연결될 수 있다.
일양태에서, RNAi 제제의 오버행 영역 내의 뉴클레오타이드는 각각 독립적으로 2-F, 2'-O-메틸, 티미딘(T) 및 이들의 임의의 조합과 같은 변형된 2'-당을 포함하지만 이에 제한되지 않는 변형되거나 변형되지 않을 수 있다.
예를 들어, TT는 어느 한 가닥의 어느 한 말단에 대해 오버행 서열일 수 있다. 오버행은 표적 mRNA와 미스매치를 형성할 수 있거나 이것은 표적화된 유전자 서열에 상보적일 수 있거나 다른 서열일 수 있다.
RNAi 제제의 센스 가닥, 안티센스 가닥 또는 가닥 둘 다에서 5'- 또는 3'- 오버행은 인산화될 수 있다. 일부 양태에서, 오버행 영역(들)은 2개의 뉴클레오타이드 사이에 포스포로티오에이트를 갖는 2개의 뉴클레오타이드를 함유하고, 여기서 2개의 뉴클레오타이드는 동일하거나 상이할 수 있다. 일양태에서, 오버행은 센스 가닥, 안티센스 가닥 또는 가닥 둘 다의 3'-말단에 존재한다. 일양태에서, 상기 3'-오버행은 안티센스 가닥에 존재한다. 일양태에서, 상기 3'-오버행은 센스 가닥에 존재한다.
RNAi 제제는 전체 안정성에 영향을 미치지 않으면서 RNAi의 간섭 활성을 강화할 수 있는 단일 오버행만을 포함할 수 있다. 예를 들어, 단일 가닥 오버행은 센스 가닥의 3'-말단 또는 대안적으로 안티센스 가닥의 3'-말단에 위치할 수 있다. RNAi는 또한 안티센스 가닥의 5'-말단 (또는 센스 가닥의 3'-말단) 또는 그 반대로 위치한 평활 말단을 가질 수 있다. 일반적으로, RNAi의 안티센스 가닥은 3'-말단에서 뉴클레오타이드 오버행을 갖고, 5'-말단은 평활 말단이다. 이론에 의해 국한시키고자 하는 것은 아니지만, 안티센스 가닥의 5'- 말단에서 및 안티센스 가닥의 3'-말단 오버행에서 비대칭 평활 말단은 RISC 공정으로의 가이드 안내 로딩을 선호한다.
일양태에서, RNAi 제제는 19개의 뉴클레오타이드 길이의 이중 말단 평활말단체이고, 여기서 센스 가닥은 5' 말단으로부터 위치 7, 8, 9에서 3개의 연속 뉴클레오타이드 상의 3개의 2'-F 변형의 적어도 하나의 모티프를 포함한다. 안티센스 가닥은 5' 말단으로부터 위치 11, 12, 13에 있는 3개의 연속 뉴클레오타이드 상의 3개의 2'-O-메틸 변형의 적어도 하나의 모티프를 포함한다.
또 다른 양태에서, RNAi 제제는 20개의 뉴클레오타이드 길이의 이중 말단 평활말단체이고, 여기서 센스 가닥은 5' 말단으로부터 위치 8, 9, 10에서 3개의 연속 뉴클레오타이드 상의 적어도 3개의 2'-F 변형의 적어도 하나의 모티프를 포함한다. 안티센스 가닥은 5' 말단으로부터 위치 11, 12, 13에 있는 3개의 연속 뉴클레오타이드 상의 3개의 2'-O-메틸 변형의 적어도 하나의 모티프를 포함한다.
여전히 다른 양태에서, RNAi 제제는 21개의 뉴클레오타이드 길이의 이중 말단 평활말단체이고, 여기서 센스 가닥은 5' 말단으로부터 위치 9, 10, 11에서 3개의 연속 뉴클레오타이드 상의 3개의 2'-F 변형의 적어도 하나의 모티프를 포함한다. 안티센스 가닥은 5' 말단으로부터 위치 11, 12, 13에 있는 3개의 연속 뉴클레오타이드 상의 3개의 2'-O-메틸 변형의 적어도 하나의 모티프를 포함한다.
일양태에서, RNAi 제제는 21개의 뉴클레오타이드 센스 가닥 및 23개의 뉴클레오타이드 안티센스 가닥을 포함하고, 여기서 센스 가닥은 5' 말단으로부터 위치 9, 10, 11에서 3개의 연속 뉴클레오타이드 상의 3개의 2'-F 변형의 적어도 하나의 모티프를 포함하고; 안티센스 가닥은 5' 말단으로부터 위치 11, 12, 13에서 3개의 연속 뉴클레오타이드 상의 3개의 2'-O-메틸 변형의 적어도 하나의 모티프를 포함하고, RNAi 제제의 하나의 말단은 평활 말단이고 다른 말단은 2개의 뉴클레오타이드 오버행을 포함한다. 바람직하게, 2개의 뉴클레오타이드 오버행은 안티센스 가닥의 3'-말단에 있다. 2개의 뉴클레오타이드 오버행이 안티센스 가닥의 3'-말단에 있는 경우, 말단 3개의 뉴클레오타이드 사이의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결일 수 있고, 3개의 뉴클레오타이드 중 2개는 오버행 뉴클레오타이드이고, 3번째의 뉴클레오타이드는 오버행 뉴클레오타이드 옆에 쌍을 형성한 뉴클레오타이드이다. 일양태에서, RNAi 제제는 추가로 센스 가닥의 5'-말단에서 및 안티센스 가닥의 5'-말단 둘 다에서 말단 3개의 뉴클레오타이드 사이에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결을 갖는다. 일양태에서, 모티프의 일부인 뉴클레오타이드를 포함하는 RNAi 제제의 센스 가닥 및 안티센스 가닥의 모든 뉴클레오타이드는 변형된 뉴클레오타이드이다. 일양태에서, 각각의 잔기는 독립적으로 예를 들어, 교호(alternating) 모티프에서 2'-O-메틸 또는 2'-플루오로로 변형된다. 임의로, RNAi 제제는 리간드(예를 들어, 친유성 리간드, 임의로 C16 리간드)를 추가로 포함한다.
일양태에서, RNAi 제제는 센스 및 안티센스 가닥을 포함하고, 여기서 센스 가닥은 길이가 25-30개의 뉴클레오타이드 잔기이고, 여기서 5' 말단 뉴클레오타이드(위치 1)로부터 출발하여 제1 가닥의 위치 1 내지 23은 적어도 8개의 리보뉴클레오타이드를 포함하고; 안티센스 가닥은 길이가 36-66개의 뉴클레오타이드 잔기이고, 3' 말단 뉴클레오타이드에서 시작하여 센스 가닥의 위치 1-23과 쌍을 형성하는 위치에 적어도 8개의 리보뉴클레오타이드를 포함하여 듀플렉스를 형성하고; 안티센스 가닥의 적어도 3' 말단 뉴클레오타이드는 센스 가닥과 쌍을 형성하지 않고, 최대 6개의 연속 3' 말단 뉴클레오타이드가 센스 가닥과 쌍을 형성하지 않아 1-6개의 뉴클레오타이드의 3' 단일 가닥 오버행을 형성하고; 여기서 안티센스 가닥의 5' 말단은 센스 가닥과 쌍을 형성하지 않는 10-30개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하여 10-30개의 뉴클레오타이드 단일 가닥 5' 오버행을 형성하고; 여기서 적어도 센스 가닥 5' 말단 및 3' 말단 뉴클레오타이드는 센스 가닥과 안티센스 가닥이 최대 상보성을 위해 정렬될 때 안티센스 가닥의 뉴클레오타이드와 염기쌍을 형성하여 센스 가닥과 안티센스 가닥 사이에 실질적으로 듀플렉스 영역을 형성하고; 안티센스 가닥은 이중 가닥 핵산이 포유동물 세포 내로 도입될 때 표적 유전자 발현을 감소시키기 위해 안티센스 가닥 길이의 적어도 19개의 리보뉴클레오타이드를 따라 표적 RNA에 충분히 상보성이며; 센스 가닥은 3개의 연속적인 뉴클레오타이드 상에 3개의 2'-F 변형의 적어도 하나의 모티프를 포함하고, 모티프 중 적어도 하나는 절단 부위에서 또는 그 부근에 존재한다. 안티센스 가닥은 안티센스 절단 부위에서 또는 그 부근에 있는 3개의 연속 뉴클레오타이드 상의 3개의 2'-O-메틸 변형의 적어도 하나의 모티프를 포함한다.
일양태에서, RNAi 제제는 센스 및 안티센스 가닥을 포함하고, 여기서 RNAi 제제는 적어도 25개 및 최대 29개의 뉴클레오타이드인 길이를 갖는 제1 가닥 및 5' 말단으로부터 위치 11, 12, 13에서 3개의 연속 뉴클레오타이드 상의 3개의 2'-O-메틸 변형의 적어도 하나의 모티프를 갖는 최대 30개의 뉴클레오타이드인 길이를 갖는 제2 가닥을 포함하고; 여기서 제1 가닥의 3' 말단과 제2 가닥의 5' 말단은 평활 말단을 형성하고 제2 가닥은 제1 가닥보다 이의 3' 말단에서 1-4개의 뉴클레오타이드 더 길며, 여기서 듀플렉스 영역은 적어도 25개의 뉴클레오타이드 길이이고, 제2 가닥은 제2 가닥 길이의 적어도 19개의 뉴클레오타이드를 따라 표적 mRNA에 충분히 상보적이어서 RNAi 제제가 포유동물 세포 내로 도입될 때 표적 유전자 발현을 감소시키고, 여기서 RNAi 제제의 다이서 절단이 우선적으로 제2 가닥의 3'-말단을 포함하는 siRNA를 생성하여 포유류에서 표적 유전자의 발현을 감소시킨다. 임의로, 상기 RNAi 제제는 추가로 리간드를 포함한다.
일양태에서, RNAi 제제의 센스 가닥은 3개의 연속 뉴클레오타이드 상에서 3개의 동일한 변형의 적어도 하나의 모티프를 포함하고, 여기서 모티프 중 하나는 센스 가닥 내 절단 부위에 존재한다.
일양태에서, RNAi 제제의 안티센스 가닥은 또한 3개의 연속 뉴클레오타이드 상에서 3개의 동일한 변형의 적어도 하나의 모티프를 포함할 수 있고, 여기서 모티프 중 하나는 안티센스 가닥 내 절단 부위에 또는 그 부근에 존재한다.
17-23개의 뉴클레오타이드 길이의 듀플렉스 영역을 갖는 RNAi 제제에 대해, 안티센스 가닥의 절단 부위는 전형적으로 5'-말단으로부터 10, 11 및 12 위치 주변에 있다. 따라서 3개의 동일한 변형의 모티프는 안티센스 가닥의 9, 10, 11 위치; 10, 11, 12 위치; 11, 12, 13 위치; 12, 13, 14 위치; 또는 13, 14, 15 위치에 존재할 수 있고, 계수는 안티센스 가닥의 5'-말단에서 첫 번째 뉴클레오타이드에서 개시하거나, 계수는 안티센스 말단의 5'-말단에서 듀플렉스 영역 내 첫 번째 쌍을 형성하는 뉴클레오타이드에서 개시한다. 안티센스 가닥 내 절단 부위는 또한 5'-말단으로부터 RNAi의 듀플렉스 영역의 길이에 따라 변화할 수 있다.
RNAi 제제의 센스 가닥은 가닥의 절단 부위에서 3개의 연속 뉴클레오타이드 상에 3개의 동일한 변형의 적어도 하나의 모티프를 포함할 수 있고; 안티센스 가닥은 가닥의 절단 부위에서 또는 그 근처에서 3개의 연속 뉴클레오타이드 상에 3개의 동일한 변형의 적어도 하나의 모티프를 가질 수 있다. 센스 가닥과 안티센스 가닥이 dsRNA 듀플렉스를 형성할 때, 센스 가닥과 안티센스 가닥은 센스 가닥상에 3개의 뉴클레오타이드의 하나의 모티프와 안티센스 가닥상에 3개의 뉴클레오타이드 하나의 모티프가 적어도 하나의 뉴클레오타이드 중복을 갖도록 정렬될 수 있고, 즉, 상기 센스 가닥에서 모티프의 3개의 뉴클레오타이드의 적어도 하나는 안티센스 가닥에서 모티프의 3개의 뉴클레오타이드의 적어도 하나와 염기쌍을 형성한다. 대안적으로, 적어도 2개의 뉴클레오타이드는 중복될 수 있거나, 모든 3개의 뉴클레오타이드는 중복될 수 있다.
일양태에서, RNAi 제제의 센스 가닥은 3개의 연속 뉴클레오타이드 상에 3개의 동일한 변형의 하나 초과의 모티프를 포함할 수 있다. 제1 모티프는 가닥의 절단 부위에 또는 그 부근에 존재할 수 있고, 다른 모티프는 윙(wing) 변형일 수 있다. 본원에서 용어 "윙 변형"은 동일한 가닥의 절단 부위에 또는 그 부근에 모티프로부터 분리된 가닥의 다른 부분에 존재하는 모티프를 지칭한다. 윙 변형은 첫 번째 모티프에 인접하거나 적어도 하나 이상의 뉴클레오타이드에 의해 분리된다. 모티프가 서로 바로 인접해 있는 경우, 모티프의 화학은 서로 구별되며, 모티프가 하나 이상의 뉴클레오티드에 의해 분리되어 있는 경우 상기 화학과 동일하거나 상이할 수 있다. 2개 이상의 윙 변형이 존재할 수 있다. 예를 들어, 2개의 윙 변형이 존재하는 경우, 각각의 윙 변형은 절단 부위에 또는 그 부근에 있는 첫 번째 모티프에 대해 하나의 말단에 존재하거나 리드(lead) 모티프의 어느 한 측면상에 존재할 수 있다.
센스 가닥과 마찬가지로, RNAi 제제의 안티센스 가닥은 3개의 연속 뉴클레오타이드 상에 3개의 동일한 변형의 하나 초과의 모티프를 함유할 수 있으며, 모티프 중 적어도 하나는 가닥의 절단 부위에 또는 그 근처에 존재한다. 상기 안티센스 가닥은 또한 센스 가닥에 존재할 수 있는 윙 변형과 유사한 정렬로 하나 이상의 윙 변형을 포함할 수 있다.
일양태에서, RNAi 제제의 센스 가닥 또는 안티센스 가닥 상의 윙 변형은 전형적으로 가닥의 3'-말단, 5'-말단, 또는 양쪽 말단에서 처음 1개 또는 2개의 말단 뉴클레오타이드를 포함하지 않는다.
또 다른 양태에서, RNAi 제제의 센스 가닥 또는 안티센스 가닥 상의 윙 변형은 전형적으로 가닥의 3'-말단, 5'-말단, 또는 양쪽 말단에서 듀플렉스 영역 내 처음 1개 또는 2개의 쌍형성 뉴클레오타이드를 포함하지 않는다.
RNAi 제제의 센스 가닥 및 안티센스 가닥이 각각 적어도 하나의 윙 변형을 포함하는 경우, 윙 변형은 듀플렉스 영역의 동일한 말단에 가해질 수 있고 1개, 2개 또는 3개의 뉴클레오티드의 중복을 가질 수 있다.
RNAi 제제의 센스 가닥 및 안티센스 가닥이 각각 적어도 2개의 윙 변형을 포함하는 경우, 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 한 가닥의 2개의 변형이 각각 1개, 2개 또는 3개의 뉴클레오타이드가 중복된 듀플렉스 영역의 하나의 말단상에 가해지고; 하나의 가닥으로부터 각각 2개의 변형이 1개, 2개 또는 3개의 뉴클레오타이드를 갖는 듀플렉스 영역의 다른 말단에 가해지도록 하고; 한 가닥의 2개의 변형은 듀플렉스 영역에서 1개, 2개 또는 3개의 뉴클레오티드를 갖는 리드 모티프의 각 측면에 가해지도록 정렬될 수 있다.
일양태에서, RNAi 제제는 표적과, 듀플렉스 내 및 이의 조합으로 미스매치(들)를 포함한다. 미스매치는 오버행 영역 또는 듀플렉스 영역에서 발생할 수 있다. 염기쌍은 해리 또는 용융을 촉진하는 경향에 따라 순위가 매겨질 수 있다(예를 들어, 특정 쌍형성의 결합 또는 해리의 자유 에너지에 따라 가장 간단한 접근법은 개별 쌍을 기준으로 쌍을 검사하는 것이만 다음 이웃 또는 유사한 분석이 사용될 수도 있다). 해리를 촉진시키는 측면에서: A:U는 G:C 보다 선호되고; G:U는 G:C 보다 바람지하고; I:C는 G:C 보다 바람직하다(I=이노신). 미스매치, 예를 들어, 비-카노니칼 또는 카노니칼 이외의 쌍형성(본원의 다른 곳에 기재된 바와 같이)은 카노니칼(A:T, A:U, G:C) 쌍형성 보다 바람직하고; 범용 염기를 포함하는 쌍형성은 카노니칼 쌍형성 보다 바람직하다.
일양태에서, RNAi 제제는 A:U, G:U, I:C, 및 예를 들어, 듀플렉스의 5'-말단에서 안티센스 가닥의 해리를 촉진시키기 위해 비-카노니칼 또는 카노니칼 이외의 쌍형성 또는 범용 염기를 포함하는 쌍형성의 미스매치된 쌍의 그룹으로부터 독립적으로 선택된 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터의 듀플렉스 영역 내 처음 1, 2, 3, 4 또는 5개 염기쌍 중 적어도 하나를 포함한다.
일양태에서, 안티센스 가닥 내 5'-말단으로부터 듀플렉스 영역 내의 1 위치에 있는 뉴클레오타이드는 A, dA, dU, U, 및 dT로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 대안적으로, 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터의 듀플렉스 영역 내 처음 1개, 2개 또는 3개의 염기쌍의 적어도 하나는 AU 염기쌍이다. 예를 들어, 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 듀플렉스 영역 내 처음 염기쌍은 AU 염기쌍이다.
또 다른 양태에서, 센스 가닥의 3'-말단에 뉴클레오타이드는 데옥시-티미딘(dT)이다. 또 다른 양태에서, 안티센스 가닥의 3'-말단에 뉴클레오타이드는 데옥시-티미딘(dT)이다. 일양태에서, 센스 또는 안티센스 가닥의 3'-말단 상에 데옥시-티미딘 뉴클레오타이드, 예를 들어, 2개의 dT 뉴클레오타이드의 짧은 서열이 있다.
일양태에서, 센스 가닥 서열은 화학식 I로 나타낼 수 있다:
Figure pct00025
여기서:
i 및 j는 각각 독립적으로 0 또는 1이고;
p 및 q는 각각 독립적으로 0 내지 6이고;
각각의 Na는 독립적으로 0-25개 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타내고, 각각의 서열은 적어도 2개의 상이하게 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함하고;
각각의 Nb는 독립적으로 0-10개의 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타내고;
각각의 np 및 nq는 독립적으로 오버행 뉴클레오타이드를 나타내고;
여기서 Nb 및 Y는 동일한 변형을 갖지 않고;
XXX, YYY, 및 ZZZ 각각은 독립적으로 3개의 연속 뉴클레오타이드 상에 3개의 동일한 변형의 하나의 모티프를 나타낸다. 바람직하게 YYY는 모든 2'-F 변형된 뉴클레오타이드이다.
일양태에서, Na 또는 Nb는 교호 패턴의 변형을 포함한다.
일양태에서, YYY 모티프는 센스 가닥의 절단 부위에서 또는 이의 부근에 존재한다. 예를 들어, 상기 RNAi 제제가 17-23개의 뉴클레오타이드 길이의 듀플렉스 영역을 갖는 경우, YYY 모티프는 센스 가닥의 절단 부위에 또는 이의 부근에 존재할 수 있고(예를 들어, 위치 6, 7, 8, 7, 8, 9, 8, 9, 10, 9, 10, 11, 10, 11,12 또는 11, 12, 13에 존재할 수 있다), 계수는 처음 뉴클레오타이드에서 5'-말단으로부터 개시하거나; 임의로 계수는 듀플렉스 영역 내 처음 쌍형성 뉴클레오타이드에서 5'-말단으로부터 개시한다.
일양태에서, i는 1이고, j는 0이거나, i는 0이고 j는 1이거나, i와 j 둘 다는 1이다. 센스 가닥은 따라서 하기의 화학식으로 나타낼 수 있다:
Figure pct00026
Figure pct00027
또는
Figure pct00028
센스 가닥이 화학식 Ib로 나타내는 경우, Nb는 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2, 또는 0개의 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타낸다.
각각의 Na는 독립적으로 2-20, 2-15 또는 2-10개의 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타낼 수 있다.
센스 가닥이 화학식 Ic로 나타내는 경우, Nb는 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2, 또는 0개의 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타낸다. 각각의 Na는 독립적으로 2-20, 2-15 또는 2-10개의 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타낼 수 있다.
센스 가닥이 화학식 Id로 나타내는 경우, 각각의 Nb는 독립적으로 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2, 또는 0개의 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타낸다. 바람직하게, Nb는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6이다. 각각의 Na는 독립적으로 2-20, 2-15 또는 2-10개의 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타낼 수 있다.
X, Y 및 Z 각각은 서로 동일하거나 상이할 수 있다.
다른 양태에서, i는 0이고, j는 0이고, 센스 가닥은 하기 화학으로 나타낼 수 있다:
Figure pct00029
센스 가닥이 화학식 Ia로 나타내는 경우, 각각의 Na는 독립적으로 2-20, 2-15, 또는 2-10개의 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타낼 수 있다.
일양태에서, RNAi의 안티센스 가닥 서열은 화학식 II로 나타낼 수 있다:
Figure pct00030
상기 식에서,
K 및 l은 각각 독립적으로 0 또는 1이고;
p' 및 q'는 각각 독립적으로 0 내지 6이고;
각각의 Na'는 독립적으로 0-25개 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타내고, 각각의 서열은 적어도 2개의 상이하게 변형된 뉴클레오타이드를 포함하고;
각각의 Nb'는 독립적으로 0-10개의 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타내고;
각각의 np' 및 nq'는 독립적으로 오버행 뉴클레오타이드를 나타내고;
여기서 Nb' 및 Y'는 동일한 변형을 갖지 않고;
X'X'X', Y'Y'Y', 및 Z'Z'Z'는 각각 독립적으로 3개의 연속 뉴클레오타이드 상의 3개의 동일한 변형의 하나의 모티프를 나타낸다.
일양태에서, Na' 또는 Nb'는 교호 패턴의 변형을 포함한다.
Y'Y'Y' 모티프는 안티센스 가닥의 절단 부위에 또는 이의 부근에 존재한다. 예를 들어, RNAi 제제가 17-23개의 뉴클레오타이드 길이의 듀플렉스 영역을 갖는 경우, Y'Y'Y' 모티프는 안티센스 가닥의 위치 9, 10, 11; 10, 11, 12; 11, 12, 13; 12, 13, 14; 또는 13, 14, 15에 존재할 수 있고, 계수는 처음 뉴클레오타이드에서, 5'-말단으로부터 개시하거나; 임의로 계수는 듀플렉스 영역 내 처음 쌍형성 뉴클레오타이드에서 5'-말단으로부터 개시한다. 바람직하게, Y'Y'Y' 모티프는 위치 11, 12, 13에 존재한다.
일양태에서, Y'Y'Y' 모티프는 모든 2'-OMe 변형된 뉴클레오타이드이다.
일양태에서, k는 1이고, l은 0이거나, k는 0이고 l은 1이거나, k 및 l 둘 다는 1이다.
안티센스 가닥은 따라서 하기의 화학식으로 나타낼 수 있다:
Figure pct00031
Figure pct00032
또는
Figure pct00033
안티센스 가닥이 화학식 IIb로 나타내는 경우, Nb'는 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2, 또는 0개의 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타낸다. 각각의 Na'는 독립적으로 2-20, 2-15 또는 2-10개의 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타낸다.
안티센스 가닥이 화학식 IIc로 나타내는 경우, Nb'는 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2, 또는 0개의 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타낸다. 각각의 Na'는 독립적으로 2-20, 2-15 또는 2-10개의 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타낸다.
안티센스 가닥이 화학식 IId로 나타내는 경우, 각각의 Nb'는 독립적으로 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2, 또는 0개의 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타낸다. 각각의 Na'는 독립적으로 2-20, 2-15 또는 2-10개의 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타낸다. 바람직하게, Nb는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6이다.
다른 양태에서, k는 0이고, l은 0이고, 안티센스 가닥은 하기 화학으로 나타낼 수 있다:
Figure pct00034
안티센스 가닥이 화학식 IIa로 나타내는 경우, 각각의 Na'는 독립적으로 2-20, 2-15, 또는 2-10개의 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타낸다.
X', Y' 및 Z' 각각은 서로 동일하거나 상이할 수 있다.
센스 가닥 및 안티센스 가닥의 각각의 뉴클레오타이드는 LNA, HNA, CeNA, 2'-메톡시에틸, 2'-O-메틸, 2'-O-알릴, 2'-C-알릴, 2'-하이드록실, 또는 2'-플루오로로 독립적으로 변형될 수 있다. 예를 들어, 센스 가닥 및 안티센스 가닥의 각각의 뉴클레오타이드는 독립적으로 2'-O-메틸 또는 2'-플루오로로 변형된다. 각각의 X, Y, Z, X', Y' 및 Z'는 특히 2'-O-메틸 변형 또는 2'-플루오로 변형을 나타낼 수 있다.
일양태에서, RNAi 제제의 센스 가닥은 듀플렉스 영역이 21개 nt인 경우 가닥의 9, 10 및 11 위치에 존재하는 YYY 모티프를 함유할 수 있고, 계수는 5'-말단으로부터의 처음 뉴클레오타이드로부터 개시하거나 임의로 계수는 5'-말단으로부터 듀플렉스 영역 내 처음 쌍형성 뉴클레오타이드에서 개시하고; Y는 2'-F 변형을 나타낸다. 센스 가닥은 추가로 듀플렉스 영역의 반대 말단에 윙 변형으로서 XXX 모티프 또는 ZZZ 모티프를 포함할 수 있고; XXX 및 ZZZ는 각각 독립적으로 2'-OMe 변형 또는 2'-F 변형을 나타낸다.
일양태에서, 안티센스 가닥은 가닥의 위치 11, 12, 13에 존재하는 Y'Y'Y' 모티프를 함유할 수 있고, 계수는 5'-말단으로부터의 처음 뉴클레오타이드로부터 개시하거나 임의로 계수는 5'-말단으로부터 듀플렉스 영역 내 처음 쌍형성 뉴클레오타이드에서 개시하고; Y'는 2'-O-메틸 변형을 나타낸다. 안티센스 가닥은 추가로 듀플렉스 영역의 반대 말단에 윙 변형으로서 X'X'X' 모티프 또는 Z'Z'Z' 모티프를 함유할 수 있고; X'X'X' 및 Z'Z'Z'는 각각 독립적으로 2'-OMe 변형 또는 2'-F 변형을 나타낸다.
상기 화학식 Ia, Ib, Ic, 및 Id 중 어느 하나에 의해 나타낸 센스 가닥은 각각 화학식 IIa, IIb, IIc, 및 IId 중 어느 하나에 의해 나타낸 안티센스 가닥과 듀플렉스를 형성한다.
따라서, 본원 개시내용의 방법에 사용하기 위한 RNAi 제제는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함할 수 있고, 각각의 가닥은 14 내지 30개의 뉴클레오타이드를 갖고, iRNA 듀플렉스는 화학식 III에 의해 나타낸다:
센스:
Figure pct00035
안티센스:
Figure pct00036
여기서:
i, j, k, 및 l은 각각 독립적으로 0 또는 1이고;
p, p', q, 및 q'는 각각 독립적으로 0 내지 6이고;
각각의 Na 및 Na'는 독립적으로 0-25개 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타내고, 각각의 서열은 적어도 2개의 상이하게 변형된 뉴클레오타이드를 포함하고;
각각의 Nb 및 Nb'는 독립적으로 0-10개의 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타내고;
여기서,
각각의 np', np, nq', 및 nq는 이의 각각이 존재하거나 존재하지 않을 수 있고 독립적으로 오버행 뉴클레오타이드를 나타내고;
XXX, YYY, ZZZ, X'X'X', Y'Y'Y' 및 Z'Z'Z'는 각각 독립적으로 3개의 연속 뉴클레오타이드 상의 3개의 동일한 변형의 하나의 모티프를 나타낸다.
일양태에서, i는 0이고, j는 0이거나; i는 1이고 j는 0이거나; i는 0이고, j는 1이거나; i와 j 둘 다는 0이거나; i와 j 둘 다는 1이다. 또 다른 양태에서, k는 0이고, l는 is 0이거나; k는 1이고, l는 0이거나; k는 0이고, l는 1이거나; k와및 I 둘 다는 0이거나; k와 I 둘 다는 1이다.
RNAi 듀플렉스를 형성하는 센스 가닥 및 안티센스 가닥의 예시적인 조합은 하기 화학식을 포함한다:
Figure pct00037
RNAi 제제가 화학식 IIIa로 나타내는 경우, 각각의 Na는 독립적으로 2-20, 2-15, 또는 2-10개의 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타낸다.
RNAi 제제가 화학식 IIIb로 나타내는 경우, 각각의 Nb는 독립적으로 1-10, 1-7, 1-5, 또는 1-4개의 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타낸다. 각각의 Na는 독립적으로 2-20, 2-15 또는 2-10개의 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타낸다.
RNAi 제제가 화학식 IIIc로 나타내는 경우, 각각의 Nb, Nb'는 독립적으로 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2, 또는 0개의 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타낸다. 각각의 Na는 독립적으로 2-20, 2-15 또는 2-10개의 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타낸다.
RNAi 제제가 화학식 IIId로 나타내는 경우, 각각의 Nb, Nb'는 독립적으로 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2, 또는 0개의 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타낸다. 각각의 Na, Na'는 독립적으로 2-20, 2-15 또는 2-10개의 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타낸다. 각각의 Na, Na', Nb 및 Nb'는 독립적으로 교호 패턴의 변형을 포함한다.
일양태에서, RNAi 제제가 화학식 IIId로 나타낸 경우, Na 변형은 2'-O-메틸 또는 2'-플루오로 변형이다. 또 다른 양태에서, RNAi 제제가 화학식 IIId로 나타낸 경우, Na 변형은 2'-O-메틸 또는 2'-플루오로 변형이고, np' > 0이고 적어도 하나의 np'는 인접 뉴클레오타이드에 포스포로티오에이트 연결을 통해 연결된다. 여전히 다른 양태에서, RNAi 제제가 화학식 IIId로 나타낸 경우, Na 변형은 2'-O-메틸 또는 2'-플루오로 변형이고, np' > 0이고 적어도 하나의 np'는 인접 뉴클레오타이드에 포스포로티오에이트 연결을 통해 연결되고, 센스 가닥은 2가 또는 3가 측쇄 링커를 통해 부착된 하나 이상의 C16 (또는 관련된) 모이어티에 접합된다(하기된 바와 같이). 또 다른 양태에서, RNAi 제제가 화학식 IIId로 나타낸 경우, Na 변형은 2'-O-메틸 또는 2'-플루오로 변형이고, np' > 0이고 적어도 하나의 np'는 인접 뉴클레오타이드에 포스포로티오에이트 연결을 통해 연결되고, 센스 가닥은 적어도 하나의 포스포로티오에이트 연결을 포함하고, 센스 가닥은 임의로 2가 또는 3가 측쇄 링커를 통해 부착된 하나 이상의 친유성, 예를 들어, C16 (또는 관련된) 모이어티에 접합된다.
일양태에서, RNAi 제제가 화학식 IIIa로 나타낸 경우, Na 변형은 2'-O-메틸 또는 2'-플루오로 변형이고, np' > 0이고 적어도 하나의 np'는 인접 뉴클레오타이드에 포스포로티오에이트 연결을 통해 연결되고, 센스 가닥은 적어도 하나의 포스포로티오에이트 연결을 포함하고, 센스 가닥은 2가 또는 3가 측쇄 링커를 통해 부착된 하나 이상의 친유성, 예를 들어, C16 (또는 관련된) 된다.
일양태에서, RNAi 제제는 화학식 III, IIIa, IIIb, IIIc, 및 IIId로 나타낸 적어도 2개의 듀플렉스를 함유하는 다량체이고, 여기서 상기 듀플렉스는 링커에 의해 연결된다. 링커는 절단 가능하거나 절단 가능하지 않을 수 있다. 임의로, 다량체는 추가로 리간드를 포함한다. 듀플렉스 각각은 동일한 유전자 또는 2개의 상이한 유전자를 표적화할 수 있거나; 듀플렉스 각각은 2개의 상이한 표적 부위에서 동일한 유전자를 표적화할 수 있다.
일양태에서, RNAi 제제는 화학식 III, IIIa, IIIb, IIIc, 및 IIId로 나타낸 적어도 3개, 4개, 5개, 6개 이상의 듀플렉스를 함유하는 다량체이고, 여기서 듀플렉스는 링커에 의해 연결된다. 링커는 절단 가능하거나 절단 가능하지 않을 수 있다. 임의로, 다량체는 추가로 리간드를 포함한다. 듀플렉스 각각은 동일한 유전자 또는 2개의 상이한 유전자를 표적화할 수 있거나; 듀플렉스 각각은 2개의 상이한 표적 부위에서 동일한 유전자를 표적화할 수 있다.
일양태에서, 화학식 III, IIIa, IIIb, IIIc, 및 IIId로 나타낸 2개의 RNAi 제제는 5' 말단, 및 3' 말단의 하나 또는 둘 다에서 서로 연결되고, 임의로 리간드에 접합된다. 제제의 각각은 동일한 유전자 또는 2개의 상이한 유전자를 표적화할 수 있거나; 제제의 각각은 2개의 상이한 표적 부위에서 동일한 유전자를 표적화할 수 있다.
다양한 공보는 본원 개시내용의 방법에 사용될 수 있는 다량체 RNAi 제제를 기재한다. 상기 공개 공보는 WO2007/091269, WO2010/141511, WO2007/117686, WO2009/014887, 및 WO2011/031520; 및 US 7858769을 포함하고, 이들 각각의 전문은 본원에 참조로 포함된다.
특정 양태에서, 본원 개시내용의 조성물 및 방법은 본원에 기재된 바와 같은 RNAi 제제의 비닐 포스포네이트(VP) 변형을 포함한다. 예시적인 양태에서, 본원 개시내용의 5'-비닐 포스포네이트 변형된 뉴클레오타이드는 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00038
여기서, X는 O 또는 S이고;
R은 수소, 하이드록시, 플루오로, 또는 C1-20알콕시(예를 들어, 메톡시 또는 n-헥사데실옥시)이고;
R5'는 =C(H)-P(O)(OH)2이고, C5' 탄소와 R5' 사이에 이중 결합은 E 또는 Z 배향(예를 들어, E 배향)으로 있고;
B는 뉴클레오염기 또는 변형된 뉴클레오염기이고, 임의로, 여기서, B는 아데닌, 구아닌, 시토신, 티민 또는 우라실이다.
본원 개시내용의 비닐 포스포네이트는 본원 개시내용의 dsRNA의 안티센스 또는 센스 가닥에 부착될 수 있다. 특정 양태에서, 본원 개시내용의 비닐 포스포네이트는 임의로 dsRNA의 안티센스 가닥의 5' 말단에서 dsRNA의 안티센스 가닥에 부착된다.
비닐 포스포네이트 변형은 또한 본원 개시내용의 조성물 및 방법을 위해 고려된다. 예시적인 비닐 포스페이트 구조는 이전의 구조를 포함하고, 여기서, R5'는 =C(H)-P(O)(OH)2이고, C5' 탄소와 R5'사이에 이중 결합은 E 또는 Z 배향(예를 들어, E 배향)으로 있다.
E. 열적 불안정화 변형
특정 양태에서, dsRNA 분자는 안티센스 가닥의 씨드 영역 내(즉, 안티센스 가닥의 5'-말단의 위치 2 내지 9에서) 열 불안정화 변형을 혼입시켜 오프-표적 유전자 사일런싱을 감소시키거나 억제함에 의해 RNA 간섭을 위해 최적화될 수 있다. 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여 처음 9개의 뉴클레오타이드 위치 내 듀플렉스의 적어도 하나의 열 불안정화 변형을 포함하는 안티센스 가닥을 갖는 dsRNA가 오프-표적 유전자 사일런싱 활성을 감소시키는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 일부 양태에서, 안티센스 가닥은 안티센스 가닥의 5' 영역의 처음 9개의 뉴클레오타이드 위치 내 듀플렉스의 적어도 하나(예를 들어, 1, 2, 3, 4 또는 5개 이상)의 열 불안정화 변형을 포함한다. 일부 양태에서, 듀플렉스의 하나 이상의 열 불안정화 변형(들)은 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 위치 2 내지 9, 또는 바람직하게 위치 4 내지 8에 위치한다. 일부 추가의 양태에서, 듀플렉스의 하나 이상의 열 불안정화 변형(들)은 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 위치 6, 7 또는 8에 위치한다. 여전히 일부 추가의 양태에서, 듀플렉스의 열 불안정화 변형은 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 위치 7에 위치한다. 용어 "열 불안정화 변형(들)은 보다 낮은 전체 용융 온도(Tm) (바람직하게, 상기 변형(들)을 갖지 않는 dsRNA의 Tm 보다 1, 2, 3 또는 4도 낮은 Tm)을 갖는 dsRNA를 생성시키는 변형(들)을 포함한다. 일부 양태에서, 듀플렉스의 열 불안정화 변형은 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 위치 2, 3, 4, 5 또는 9에 위치한다.
열 불안정화 변형은 무염기 변형; 반대 가닥 내 반대 뉴클레오타이드와의 미스매치; 및 2'-데옥시 변형, 비환형 뉴클레오타이드, 예를 들어, 잠김 해제된 핵산(UNA), 및 글리콜 핵산(GNA)과 같은 당 변형을 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다.
예시된 무염기 변형은 하기를 포함하지만 이에 제한되지 않는다:
Figure pct00039
여기서, R는 H, Me, Et 또는 OMe이고, R'는 H, Me, Et 또는 OMe이고, R"는 H, Me, Et 또는 OMe이다.
Figure pct00040
여기서 B는 변형되거나 변형되지 않은 뉴클레오염기이다.
예시된 당 변형은 하기를 포함하지만 이에 제한되지 않는다:
Figure pct00041
Figure pct00042
Figure pct00043
Figure pct00044
여기서 B는 변형되거나 변형되지 않은 뉴클레오염기이다.
일부 양태에서, 듀플렉스의 열 불안정화 변형은 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된다:
Figure pct00045
여기서 B는 변형되거나 변형되지 않은 뉴클레오염기이고 각각의 구조 상에 별표는 R, S 또는 라세믹을 나타낸다.
용어 "비환형 뉴클레오타이드"는 비환형 리보스 당을 갖는 임의의 뉴클레오타이드를 지칭하고, 예를 들어, 여기서, 리보스 탄소 간의 임의의 결합(예를 들어, C1'-C2', C2'-C3', C3'-C4', C4'-O4', 또는 C1'-O4')은 부재이거나 리보스 탄소 또는 산소(예를 들어, C1', C2', C3', C4' 또는 O4') 중 적어도 하나는 독립적으로 또는 조합으로 뉴클레오타이드가 부재이다. 일부 양태에서, 비환형 뉴클레오타이드는
Figure pct00046
또는
Figure pct00047
이고, 여기서 B는 변형되거나 변형되지 않은 뉴클레오염기이고, R1 및 R2는 독립적으로 H, 할로겐, OR3, 또는 알킬이고; R3은 H, 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아르알킬, 헤테로아릴 또는 당이다. 용어 "UNA"는 잠김 해제된 비환형 핵산이고, 여기서 당의 임의의 결합은 제거되었고 잠김 해제된 "당" 잔기를 형성한다. 하나의 예에서, UNA는 또한 C1'-C4' 사이의 결합(즉, C1'과 C4' 탄소 사이의 공유 탄소-산소-탄소 결합)이 제거된 단량체를 포괄한다. 또 다른 예에서, 당의 C2'-C3' 결합(즉, C2'와 C3' 탄소 사이의 공유 탄소-탄소 결합)은 제거된다(참조: Mikhailov et. al., Tetrahedron Letters, 26 (17): 2059 (1985); and Fluiter et al., Mol. Biosyst., 10: 1039 (2009), 이의 전문이 본원에 참조로 포함됨). 비환형 유도체는 왓슨-크릭 쌍형성에 영향을 주는 것 없이 보다 큰 골격 가요성을 제공한다. 비환형 뉴클레오타이드는 2'-5' 또는 3'-5' 연결을 통해 연결될 수 있다.
용어 'GNA'는 DNA 또는 RNA와 유사하지만 포스포디에스테르 결합에 의해 연결된 반복 글리세롤 유닛으로 구성된다는 점에서 이의 "골격"의 조성이 상이한 중합체인 글리콜 핵산을 지칭한다:
Figure pct00048
듀플렉스의 열 불안정화 변형은 dsRNA 듀플렉스 내 열 불안정화 뉴클레오타이드와 반대 가닥 내 반대 뉴클레오타이드 간의 미스매치 (즉, 비상보성 염기쌍)일 수 있다. 예시적인 미스매치 염기쌍은 G:G, G:A, G:U, G:T, A:A, A:C, C:C, C:U, C:T, U:U, T:T, U:T, 또는 이의 조합을 포함한다. 당업계에 공지된 다른 미스매치 염기쌍 형성은 또한 본 발명에 적합할 수 있다. 미스매치는 천연적으로 존재하는 뉴클레오타이드 또는 변형된 뉴클레오타이드인 뉴클레오타이드 간에 존재할 수 있고, 즉, 미스매치 염기쌍 형성은 뉴클레오타이드의 리보스 당에 대한 변형과는 무관하게 각각의 뉴클레오타이드로부터의 뉴클레오염기 사이에 존재할 수 있다. 특정 양태에서, dsRNA 분자는 2'-데옥시 뉴클레오염기인, 미스매치 쌍형성에서 적어도 하나의 뉴클레오염기를 포함하고; 예를 들어, 2'-데옥시 뉴클레오염기는 센스 가닥 내에 있다.
일부 양태에서, 안티센스 가닥의 씨드 영역 내 듀플렉스의 열적으로 불안정화 변형은 하기와 같은 표적 mRNA 상의 상보성 염기로의 손상된 W-C H-결합을 갖는 뉴클레오타이드를 포함한다:
Figure pct00049
무염기 뉴클레오타이드, 비환형 뉴클레오타이드 변형(UNA 및 GNA를 포함함) 및 미스매치 변형의 보다 많은 예는 이의 전문이 본원에 참조로 포함된 WO 2011/133876에 상세히 기재되었다.
열 불안정화 변형은 또한 반대 염기와 수소 결합을 형성하는 능력이 감소되거나 폐지된 범용 염기, 및 포스페이트 변형을 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 듀플렉스의 열 불안정화 변형은 반대 가닥의 염기와 수소 결합을 형성하는 능력이 손상되거나 완전히 폐지된 뉴클레오염기 변형과 같은 비카노니칼 염기를 갖는 뉴클레오타이드를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 이들 뉴클레오염기 변형은 이의 전문이 본원에 참조로 포함된 WO 2010/0011895에 기재된 바와 같이 dsRNA 듀플렉스의 중심 영역의 불안정화에 대해 평가되었다. 예시적인 뉴클레오염기 변형은 다음과 같다:
Figure pct00050
일부 양태에서, 안티센스 가닥의 씨드 영역 내 듀플렉스의 열적으로 불안정화 변형은 하기와 같은 표적 mRNA 상의 염기와 상보성인 하나 이상의 a-뉴클레오타이드를 포함한다:
Figure pct00051
여기서 R은 H, OH, OCH3, F, NH2, NHMe, NMe2 또는 O-알킬이다.
천연 포스포디에스테르 연결과 비교하여 dsRNA 듀플렉스의 열 안정성을 감소시키는 것으로 공지된 예시적 포스페이트 변형은 다음과 같다:
Figure pct00052
(여기서, R은 알킬이다)
R 그룹에 대한 알킬은 C1-C6알킬일 수 있다. R 그룹에 대한 특이적 알킬은 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 펜틸 및 헥실을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
뉴클레오염기의 기능적 역할의 관점에서 당업자가 인지하는 바와 같이 본원 개시내용의 RNAi 제제의 특이성을 한정하고, 뉴클레오염기 변형은 예를 들어, 불안정화 변형을 본원 개시내용의 RNAi 제제로 도입하기 위해, 예를 들어, 오프-표적 효과에 상대적으로 온-표적 효과를 증진시킬 목적을 위해 본원에 기재된 바와 같이 다양한 방식으로 수행될 수 있고, 다양한 범위의 변형이 가용하고 일반적으로 본원 개시내용의 RNAi 제제 상에 존재시 비-뉴클레오염기 변형, 예를 들어, 폴리리보뉴클레오타이드의 당 그룹 또는 포스페이트 골격에 대한 변형에 대해 보다 큰 경향이 있다. 상기 변형은 본원 개시내용의 다른 섹션에서 보다 상세히 기재되고 명백하게 본원 개시내용의 RNAi 제제에 대해 고려되고, 상기된 또는 본원의 다른 곳에 기재된 바와 같은 본래의 뉴클레오염기 또는 변형된 뉴클레오염기를 소유한다.
열 불안정화 변형을 포함하는 안티센스 가닥에 추가로, dsRNA는 또한 하나 이상의 안정화 변형을 포함할 수 있다. 예를 들어, dsRNA는 적어도 2개(예를 들어, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 이상)의 안정화 변형을 포함할 수 있다. 제한 없이, 안정화 변형은 모두 하나의 가닥에 존재할 수 있다. 일부 양태에서, 센스 및 안티센스 가닥 둘 다는 적어도 2개의 안정화 변형을 포함한다. 안정화 변형은 센스 가닥 또는 안티센스 가닥의 임의의 뉴클레오타이드 상에 존재할 수 있다. 예를 들어, 안정화 변형은 센스 가닥 또는 안티센스 가닥 상의 모든 뉴클레오타이드상에 존재할 수 있거나; 각각의 안정화 변형은 센스 가닥 또는 안티센스 가닥 상의 교호 패턴으로 존재할 수 있거나; 센스 가닥 또는 안티센스 가닥은 교호 패턴으로 안정화 변형 둘 다를 포함한다. 센스 가닥 상의 안정화 변형의 교호 패턴은 안티센스 가닥과 동일하거나 상이할 수 있고, 센스 가닥 상의 안정화 변형의 교호 패턴은 안티센스 가닥 상의 안정화 변형의 교호 패턴에 상대적인 전환을 가질 수 있다.
일부 양태에서, 안티센스 가닥은 적어도 2개(예를 들어, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 이상)의 안정화 변형을 포함한다. 제한 없이, 안티센스 가닥에서 안정화 변형은 임의의 위치에 존재할 수 있다. 일부 양태에서, 안티센스는 5'-말단으로부터 위치 2, 6, 8, 9, 14, 및 16에서의 안정화 변형을 포함한다. 일부 다른 양태에서, 안티센스는 5'-말단으로부터 위치 2, 6, 14 및 16에서의 안정화 변형을 포함한다. 여전히 일부 다른 양태에서, 안티센스는 5'-말단으로부터 위치 2, 14 및 16에서의 안정화 변형을 포함한다.
일부 양태에서, 안티센스 가닥은 불안정화 변형에 인접하게 적어도 하나의 안정화 변형을 포함한다. 예를 들어, 안정화 변형은 불안정화 변형의 5'-말단 또는 3'-말단에서, 즉, 불안정화 변형의 위치로부터 위치 -1 또는 +1에서의 뉴클레오타이드일 수 있다. 일부 양태에서, 안티센스 가닥은 불안정화 변형의 5'-말단 및 3'-말단 각각에서, 즉 불안정화 변형의 위치로부터 위치 -1 및 +1에서 안정화 변형을 포함한다.
일부 양태에서, 안티센스 가닥은 불안정화 변형의 3'-말단에서, 즉 불안정화 변형의 위치로부터 위치 +1 및 +2에서 적어도 2개의 안정화 변형을 포함한다.
일부 양태에서, 센스 가닥은 적어도 2개(예를 들어, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 이상)의 안정화 변형을 포함한다. 제한 없이, 센스 가닥에서 안정화 변형은 임의의 위치에 존재할 수 있다. 일부 양태에서, 센스 가닥은 5'-말단으로부터 위치 7, 10 및 11에서의 안정화 변형을 포함한다. 일부 다른 양태에서, 센스 가닥은 5'-말단으로부터 위치 7, 9, 10 및 11에서의 안정화 변형을 포함한다. 일부 양태에서, 센스 가닥은 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 계수하여, 안티센스 가닥의 위치 11, 12, 및 15에 반대 또는 상보적인 위치에서의 안정화 변형을 포함한다. 일부 다른 양태에서, 센스 가닥은 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 계수하여, 안티센스 가닥의 위치 11, 12, 13 및 15에 반대 또는 상보적인 위치에서 안정화 변형을 포함한다. 일부 양태에서, 센스 가닥은 2, 3, 또는 4개의 안정화 변형을 포함한다.
일부 양태에서, 센스 가닥은 안티센스 가닥에서 듀플렉스의 열 불안정화 변형과 반대 또는 상보적인 위치에서 안정화 변형을 포함하지 않는다.
예시적인 열적으로 안정화 변형은 2'-플루오로 변형을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 다른 열적으로 안정화 변형은 LNA를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
일부 양태에서, 본원 개시내용의 dsRNA는 적어도 4개(예를 들어, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 또는 그 이상)의 2'-플루오로 뉴클레오타이드를 포함한다. 제한 없이, 2'-플루오로 뉴클레오타이드는 하나 가닥에 존재할 수 있다. 일부 양태에서, 센스 및 안티센스 가닥 둘 다는 적어도 2개의 2'-플루오로 뉴클레오타이드를 포함한다. 2'-플루오로 변형은 센스 가닥 또는 안티센스 가닥의 임의의 뉴클레오타이드 상에 존재할 수 있다. 예를 들어, 2'-플루오로 변형은 센스 가닥 또는 안티센스 가닥 상의 모든 뉴클레오타이드상에 존재할 수 있거나; 각각의 2'-플루오로 변형은 센스 가닥 또는 안티센스 가닥 상의 교호 패턴으로 존재할 수 있거나; 센스 가닥 또는 안티센스 가닥은 교호 패턴으로 2'-플루오로 변형 둘 다를 포함한다. 센스 가닥 상의 2'-플루오로 변형의 교호 패턴은 안티센스 가닥과 동일하거나 상이할 수 있고, 센스 가닥 상의 2'-플루오로 변형의 교호 패턴은 안티센스 가닥 상의 2'-플루오로 변형의 교호 패턴에 상대적인 전환을 가질 수 있다.
일부 양태에서, 안티센스 가닥은 적어도 2개(예를 들어, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 이상)의 2'-플루오로 뉴클레오타이드를 포함한다. 제한 없이, 안티센스 가닥에서 2'-플루오로 변형은 임의의 위치에 존재할 수 있다. 일부 양태에서, 안티센스는 5'-말단으로부터 위치 2, 6, 8, 9, 14 및 16에서 2'-플루오로 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 다른 양태에서, 안티센스는 5'-말단으로부터 위치 2, 6, 14 및 16에서 2'-플루오로 뉴클레오타이드를 포함한다. 여전히 일부 다른 양태에서, 안티센스는 5'-말단으로부터 위치 2, 14 및 16에서 2'-플루오로 뉴클레오타이드를 포함한다.
일부 양태에서, 안티센스 가닥은 불안정화 변형에 인접하게 적어도 하나의 2'-플루오로 뉴클레오타이드를 포함한다. 예를 들어, 2'-플루오로 뉴클레오타이드는 불안정화 변형의 5'-말단 또는 3'-말단에서, 즉, 불안정화 변형의 위치로부터 위치 -1 또는 +1에서의 뉴클레오타이드일 수 있다. 일부 양태에서, 안티센스 가닥은 불안정화 변형의 5'-말단 및 3'-말단 각각에서, 즉 불안정화 변형의 위치로부터 위치 -1 및 +1에서 2'-플루오로 뉴클레오타이드를 포함한다.
일부 양태에서, 안티센스 가닥은 불안정화 변형의 3'-말단에서, 즉 불안정화 변형의 위치로부터 위치 +1 및 +2에서 적어도 2개의 2'-플루오로 뉴클레오타이드를 포함한다.
일부 양태에서, 센스 가닥은 적어도 2개(예를 들어, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 이상)의 2'-플루오로 뉴클레오타이드를 포함한다. 제한 없이, 센스 가닥에서 2'-플루오로 변형은 임의의 위치에 존재할 수 있다. 일부 양태에서, 안티센스는 5'-말단으로부터 위치 7, 10 및 11에서 2'-플루오로 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 다른 양태에서, 센스 가닥은 5'-말단으로부터 위치 7, 9, 10 및 11에서 2'-플루오로 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 양태에서, 센스 가닥은 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 계수하여, 안티센스 가닥의 위치 11, 12, 및 15에 반대 또는 상보적인 위치에서 2'-플루오로 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 다른 양태에서, 센스 가닥은 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 계수하여, 안티센스 가닥의 위치 11, 12, 13 및 15에 반대 또는 상보적인 위치에서 2'-플루오로 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 양태에서, 센스 가닥은 2, 3, 또는 4개의 2'-플루오로 뉴클레오타이드를 포함한다.
일부 양태에서, 센스 가닥은 안티센스 가닥에서 듀플렉스의 열 불안정화 변형과 반대 또는 상보적인 위치에서 2'-플루오로 뉴클레오타이드를 포함하지 않는다.
일부 양태에서, 본원 개시내용의 dsRNA 분자는 21개의 뉴클레오타이드(nt) 센스 가닥 및 23개의 뉴클레오타이드(nt) 안티센스를 포함하고, 여기서 상기 안티센스 가닥은 적어도 하나의 열 불안정화 뉴클레오타이드를 포함하고, 여기서 적어도 하나의 열 불안정화 뉴클레오타이드는 안티센스 가닥의 씨드 영역 내에 (즉, 안티센스 가닥의 5'-말단의 위치 2-9에서) 존재하고, 여기서 dsRNA의 하나의 말단은 평활 말단이고, 다른 말단은 2nt 오버행을 포함하고, 여기서 dsRNA는 임의로 추가로 하기의 특징 중 적어도 하나 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6개 또는 모두 7개)를 갖는다: (i) 안티센스는 2, 3, 4, 5 또는 6개의 2'-플루오로 변형을 포함하고; (ii) 안티센스는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결을 포함하고; (iii) 센스 가닥은 리간드와 접합되고; (iv) 센스 가닥은 2, 3, 4 또는 5개의 2'-플루오로 변형을 포함하고; (v) 센스 가닥은 1, 2, 3, 4 또는 5개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결을 포함하고; (vi) dsRNA는 적어도 4개의 2'-플루오로 변형을 포함하고; (vii) dsRNA는 안티센스 가닥의 5'-말단에서 평활 말단을 포함한다. 바람직하게, 2nt 오버행은 안티센스의 3'-말단에 있다.
일부 양태에서, 본원 개시내용의 dsRNAi 제제는 센스 및 안티센스 가닥을 포함하고, 여기서 센스 가닥은 길이가 25-30개의 뉴클레오타이드 잔기이고, 여기서 5' 말단 뉴클레오타이드(위치 1)로부터 출발하여 상기 센스 가닥의 위치 1 내지 23은 적어도 8개의 리보뉴클레오타이드를 포함하고; 안티센스 가닥은 길이가 36-66개의 뉴클레오타이드 잔기이고, 3' 말단 뉴클레오타이드에서 시작하여 센스 가닥의 위치 1-23과 쌍을 형성하는 위치에 적어도 8개의 리보뉴클레오타이드를 포함하여 듀플렉스를 형성하고; 안티센스 가닥의 적어도 3' 말단 뉴클레오타이드는 센스 가닥과 쌍을 형성하지 않고, 최대 6개의 연속 3' 말단 뉴클레오타이드가 센스 가닥과 쌍을 형성하지 않아 1-6개의 뉴클레오타이드의 3' 단일 가닥 오버행을 형성하고; 여기서 안티센스 가닥의 5' 말단은 센스 가닥과 쌍을 형성하지 않는 10-30개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하여 10-30개의 뉴클레오타이드 단일 가닥 5' 오버행을 형성하고; 여기서 적어도 센스 가닥 5' 말단 및 3' 말단 뉴클레오타이드는 센스 가닥과 안티센스 가닥이 최대 상보성을 위해 정렬될 때 안티센스 가닥의 뉴클레오타이드와 염기쌍을 형성하여 센스 가닥과 안티센스 가닥 사이에 실질적으로 듀플렉스 영역을 형성하고; 안티센스 가닥은 상기 이중 가닥 핵산이 포유동물 세포 내로 도입될 때 표적 유전자 발현을 감소시키기 위해 안티센스 가닥 길이의 적어도 19개의 리보뉴클레오티드를 따라 표적 RNA에 충분히 상보적이며; 안티센스 가닥은 적어도 하나의 열 불안정화 뉴클레오타이드를 포함하고, 여기서 적어도 하나의 불안정화 뉴클레오타이드는 안티센스 가닥의 씨드 영역 내(즉, 안티센스 가닥의 5'-말단의 위치 2-9에서)에 있다. 예를 들어, 열 불안정화 뉴클레오타이드는 센스 가닥의 5'-말단의 위치 14-17에 반대 또는 상보적인 위치 사이에 존재하고 여기서 dsRNA는 임의로 추가로 하기의 특징 중 적어도 하나(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6개 또는 모두 7개)를 갖는다: (i) 안티센스는 2, 3, 4, 5 또는 6개의 2'-플루오로 변형을 포함하고; (ii) 안티센스는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결을 포함하고; (iii) 센스 가닥은 리간드와 접합되고; (iv) 센스 가닥은 2, 3, 4 또는 5개의 2'-플루오로 변형을 포함하고; (v) 센스 가닥은 1, 2, 3, 4 또는 5개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결을 포함하고; (vi) dsRNA는 적어도 4개의 2'-플루오로 변형을 포함하고; (vii) dsRNA는 12-30개의 뉴클레오타이드 쌍 길이의 듀플렉스 영역을 포함한다.
일부 양태에서, 본원 개시내용의 dsRNA 분자는 센스 및 안티센스 가닥을 포함하고, 상기 dsRNA 분자는 적어도 25개 및 최대 29개의 뉴클레오타이드인 길이를 갖는 센스 가닥 및 센스 가닥과 최대 30개의 뉴클레오타이드인 길이를 갖는 안티센스 가닥은 5' 말단으로부터 위치 11에서 효소 분해에 민감할 수 있는 변형된 뉴클레오타이드를 포함하고, 여기서 상기 센스 가닥의 3' 말단 및 상기 안티센스 가닥의 5' 말단은 평활 말단을 형성하고, 상기 안티센스 가닥은 센스 가닥 보다 이의 3' 말단에서 1 내지 4개의 뉴클레오타이드 보다 길고, 여기서 적어도 25개의 뉴클레오타이드 길이인 듀플렉스 영역 및 상기 안티센스 가닥은 상기 dsRNA 분자가 포유동물 세포에 도입되는 경우 표적 유전자 발현을 감소시키기 위해 적어도 19nt의 상기 안티센스 가닥 길이를 따라 표적 mRNA에 충분히 상보적이고, 여기서 상기 dsRNA의 다이서 절단은 상기 안티센스 가닥의 상기 3' 말단을 포함하는 siRNA를 유도하여 포유류에서 표적 유전자의 발현을 감소시키고, 여기서 상기 안티센스 가닥은 적어도 하나의 열 불안정화 뉴클레오타이드를 포함하고, 여기서 적어도 하나의 열 불안정화 뉴클레오타이드는 안티센스 가닥의 씨드 영역 내 (즉. 안티센스 가닥의 5'-말단의 위치 2-9에서)에 있고, 여기서 dsRNA는 임의로 추가로 하기의 특징 중 적어도 1개 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 모두 7개)를 갖는다: (i) 안티센스는 2, 3, 4, 5 또는 6개의 2'-플루오로 변형을 포함하고; (ii) 안티센스는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결을 포함하고; (iii) 센스 가닥은 리간드와 접합되고; (iv) 센스 가닥은 2, 3, 4 또는 5개의 2'-플루오로 변형을 포함하고; (v) 센스 가닥은 1, 2, 3, 4 또는 5개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결을 포함하고; (vi) dsRNA는 적어도 4개의 2'-플루오로 변형을 포함하고; (vii) dsRNA는 12-29개의 뉴클레오타이드 쌍 길이의 듀플렉스 영역을 갖는다.
일부 양태에서, dsRNA 분자의 센스 가닥 및 안티센스 가닥에서 모든 뉴클레오타이드는 변형될 수 있다. 각각의 뉴클레오타이드는 비-연결 포스페이트 산소의 하나 또는 둘 다 또는 연결 포스페이트 산소의 하나 이상의 하나 이상의 변경; 리보스 당의 성분, 예를 들어, 리보스 당 상에 2' 하이드록실의 변경; 포스페이트 모이어티의 "탈포스포" 링커로의 다수의 대체; 천연적으로 존재하는 염기의 변형 또는 대체; 및 리보스-포스페이트 골격의 대체 또는 변형을 포함할 수 있는 동일하거나 상이한 변형으로 변형될 수 있다.
핵산은 서브유닛의 중합체임으로, 많은 변형은 핵산 내 반복되는 위치에서 일어나고, 예를 들어, 염기 또는 포스페이트 모이어티의 변형, 또는 포스페이트 모이어티의 비-연결 O가 있다. 일부 경우에 핵산의 모든 대상 위치에서 변형이 일어나지만 많은 경우에는 일어나지 않을 것이다. 예를 들어, 변형은 3' 또는 5' 말단 위치에서만 발생할 수 있고, 말단 영역, 예를 들어 말단 뉴클레오타이드 상의 위치 또는 가닥의 마지막 2, 3, 4, 5, 또는 10개의 뉴클레오타이드에서만 발생할 수 있다. 변형은 이중 가닥 영역, 단일 가닥 영역 또는 둘 다에서 발생할 수 있다. 변형은 RNA의 이중 가닥 영역에서만 발생할 수 있거나 RNA의 단일 가닥 영역에서만 발생할 수 있다. 예를 들어, 비-연결 O 위치에서 포스포로티오에이트 변형은 한쪽 또는 양쪽 말단에서만 발생할 수 있고, 말단 영역, 예를 들어, 말단 뉴클레오타이드 상의 위치에서 또는 가닥의 마지막 2, 3, 4, 5, 또는 10개의 뉴클레오타이드에서만 발생할 수 있거나, 이중 가닥 및 단일 가닥 영역, 특히 말단에서 발생할 수 있다. 5'-말단 또는 말단들은 인산화될 수 있다.
예를 들어, 안정성을 증진시키거나, 오버행에 특정 염기를 포함하거나, 변형된 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 대용물을 단일 가닥 오버행, 예를 들어 5'- 또는 3'-오버행에 포함하거나, 둘 다에 포함하는 것이 가능할 수 있다. 예를 들어, 오버행에 퓨린 뉴클레오타이드를 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 일부 양태에서 3' 또는 5' 오버행의 염기 모두 또는 일부는 예를 들어 본원에 기재된 변형으로 변형될 수 있다. 변형은, 예를 들어 당업계에 공지된 변형을 갖는 리보스 당의 2' 위치에서의 변형의 사용, 예를 들어 데옥시리보뉴클레오타이드, 2'-데옥시-2'-플루오로(2'-F) 또는 뉴클레오염기의 리보당 대신 변형된 2'-O-메틸의 사용, 및 포스페이트 그룹에서의 변형, 예를 들어 포스포로티오에이트 변형의 사용을 포함할 수 있다. 오버행은 표적 서열과 상동성일 필요는 없다.
일부 양태에서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥의 각각의 잔기는 LNA, HNA, CeNA, 2'-메톡시에틸, 2'-O-메틸, 2'-O-알릴, 2'-C-알릴, 2'-데옥시, 또는 2'-플루오로로 독립적으로 변형된다. 가닥은 하나 초과의 변형을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥의 각각의 잔기는 독립적으로 2'-O-메틸 또는 2'-플루오로로 변형된다. 이들 변형은 안티센스 가닥 내 존재하는 듀플렉스의 적어도 하나의 열 불안정화 변형에 추가로 있는 것으로 이해되어야만 한다.
적어도 2개의 상이한 변형은 전형적으로 센스 가닥 및 안티센스 가닥 상에 존재한다. 상기 2개의 변형은 2'-데옥시, 2'-O-메틸 또는 2'-플루오로 변형, 비환형 뉴클레오타이드 또는 기타일 수 있다. 일부 양태에서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥 각각은 2'-O-메틸 또는 2'-데옥시로부터 선택된 2개의 상이하게 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 양태에서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥의 각각의 잔기는 독립적으로 2'-O-메틸 뉴클레오타이드, 2'-데옥시 뉴클레오타이드, 2´-데옥시-2'-플루오로 뉴클레오타이드, 2'-O-N-메틸아세트아미도 (2'-O-NMA) 뉴클레오타이드, 2'-O-디메틸아미노에톡시에틸 (2'-O-DMAEOE) 뉴클레오타이드, 2'-O-아미노프로필(2'-O-AP) 뉴클레오타이드 또는 2'-ara-F 뉴클레오타이드로 변형된다. 다시, 이들 변형은 안티센스 가닥 내 존재하는 듀플렉스의 적어도 하나의 열 불안정화 변형에 추가로 있는 것으로 이해되어야만 한다.
일부 양태에서, 본원 개시내용의 dsRNA 분자는 특히 B1, B2, B3, B1', B2', B3', B4' 영역에서 교호 패턴의 변형을 포함한다. 본원에 사용된 용어 "교호 모티프" 또는 "교호 패턴"은 하나 이상의 변형을 갖는 모티프를 지칭하며, 각각의 변형은 한 가닥의 교호 뉴클레오타이드 상에서 발생한다. 교호 뉴클레오타이드는 하나 걸러 뉴클레오타이드 하나 또는 3개의 뉴클레오타이드 당 하나 또는 유사한 패턴을 지칭할 수 있다. 예를 들어, A, B 및 C 각각이 뉴클레오타이드에 대한 하나의 유형의 변형을 나타내는 경우, 교호 모티프는 "ABABABABABAB…," "AABBAABBAABB…," "AABAABAABAAB…," "AAABAAABAAAB…," "AAABBBAAABBB…," 또는 "ABCABCABCABC…" 등일 수 있다. 교호 모티프에 포함된 변형의 유형은 동일하거나 상이할 수 있다. 예를 들어, A, B, C, D 각각이 뉴클레오타이드 상에 하나 유형의 변형을 나타내는 경우, 교호 패턴, 즉, 하나 걸러 뉴클레오타이드 상의 변형은 동일할 수 있지만, 센스 가닥 또는 안티센스 가닥 각각은 교호 모티프, 예를 들어 "ABABAB…", "ACACAC…" "BDBDBD…" 또는 "CDCDCD…" 등 내 여러 변형의 가능성으로부터 선택될 수 있다.
일부 양태에서, 본원 개시내용의 dsRNA 분자는 전환된 안티센스 가닥 상의 교호 모티프에 대한 변형 패턴에 비해 센스 가닥 상의 교호 모티프에 대한 변형 패턴을 포함한다. 전환(shift)은 센스 가닥의 뉴클레오타이드의 변형된 그룹이 안티센스 가닥의 뉴클레오타이드의 상이하게 변형된 그룹에 상응하도록할 수 있고 그 반대의 경우도 마찬가지일 수 있다. 예를 들어, 센스 가닥이 dsRNA 듀플렉스 내 안티센스 가닥과 쌍을 형성하는 경우, 센스 가닥 내 교호 모티프는 가닥의 5'-3'로 "ABABAB"로 개시할 수 있고 안티센스 가닥 내 교호 모티프는 듀프렉스 영역 내 가닥의 3'에서 5'로 "BABABA"로 개시할 수 있다. 또 다른 예로서, 센스 가닥 내 교호 모티프는 가닥의 5'-3'로 "AABBAABB"로 개시할 수 있고, 안티센스 가닥 내 교호 모티프는 듀플렉스 영역 내 가닥의 3'에서 5'로 "BBAABBAA"로 개시할 수 있어 센스 가닥과 안티센스 가닥 사이의 변형 패턴의 완전하거나 부분적인 전환이 있다.
본원 개시내용의 dsRNA 분자는 적어도 하나의 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드 간 연결을 추가로 포함할 수 있다. 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형은 가닥의 임의의 위치에서 센스 가닥, 안티센스 가닥 또는 가닥 둘 다의 임의의 뉴클레오타이드 상에서 발생할 수 있다. 예를 들어, 뉴클레오타이드 간 연결 변형은 센스 가닥 또는 안티센스 가닥 상의 모든 뉴클레오타이드에서 발생할 수 있거나; 각각의 뉴클레오타이드 간 연결 변형은 센스 가닥 또는 안티센스 가닥 상의 교호 패턴으로 발생할 수 있거나; 센스 가닥 또는 안티센스 가닥은 교호 패턴으로 뉴클레오타이드 간 연결 변형 둘 다를 포함한다. 센스 가닥 상의 뉴클레오타이드 간 연결 변형의 교호 패턴은 안티센스 가닥과 동일하거나 상이할 수 있고, 센스 가닥 상의 뉴클레오타이드 간 연결 변형의 교호 패턴은 안티센스 가닥 상의 뉴클레오타이드 간 연결 변형의 교호 패턴에 상대적인 전환을 가질 수 있다.
일부 양태에서, dsRNA 분자는 오버행 영역에 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형을 포함한다. 예를 들어, 오버행 영역은 2개의 뉴클레오타이드 사이에 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드 간 연결을 갖는 2개의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 뉴클레오타이드 간 연결 변형은 또한 듀플렉스 영역 내의 말단 쌍형성 뉴클레오타이드와 오버행 뉴클레오타이드를 연결하기 위해 수행될 수 있다. 예를 들어, 적어도 2, 3, 4개, 또는 모든 오버행 뉴클레오타이드는 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드 간 연결을 통해 연결될 수 있고, 임의로 오버행 뉴클레오타이드 옆에 있는 쌍형성 뉴클레오타이드와 오버행 뉴클레오타이드를 연결하는 추가의 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드 간 연결일 수 있다. 예를 들어, 말단 3개의 뉴클레오타이드 사이에 적어도 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결이 있을 수 있고, 여기서 3개의 뉴클레오타이드 중 2개는 오버행 뉴클레오타이드이고 세 번째는 오버행 뉴클레오타이드 옆의 쌍형성 뉴클레오타이드이다. 바람직하게, 이들 말단 3개의 뉴클레오타이드는 안티센스 가닥의 3'-말단에 있을 수 있다.
일부 양태에서, dsRNA 분자의 센스 가닥은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 또는 16개 포스페이트 뉴클레오타이드 간 연결에 의해 분리된 2 내지 10개의 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드 간 연결의 1 내지 10개 블록을 포함하고, 여기서, 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드 간 연결 중 하나가 올리고뉴클레오타이드 서열 내 임의의 위치에 위치하고, 상기 센스 가닥은 포스포로티오에이트, 메틸포스포네이트 및 포스페이트 뉴클레오타이드 간 연결의 임의의 조합을 포함하는 안티센스 가닥 또는 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 또는 포스페이트 연결을 포함하는 안티센스 가닥과 쌍을 형성한다.
일부 양태에서, dsRNA 분자의 안티센스 가닥은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 또는 18개 포스페이트 뉴클레오타이드 간 연결에 의해 분리된 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드 간 연결의 2개 블록을 포함하고, 여기서, 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드 간 연결 중 하나가 올리고뉴클레오타이드 서열 내 임의의 위치에 위치하고, 상기 안티센스 가닥은 포스포로티오에이트, 메틸포스포네이트 및 포스페이트 뉴클레오타이드 간 연결의 임의의 조합을 포함하는 센스 가닥 또는 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 또는 포스페이트 연결을 포함하는 안티센스 가닥과 쌍을 형성한다.
일부 양태에서, dsRNA 분자의 안티센스 가닥은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 또는 16개 포스페이트 뉴클레오타이드 간 연결에 의해 분리된 3개의 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드 간 연결의 2개 블록을 포함하고, 여기서, 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드 간 연결 중 하나가 올리고뉴클레오타이드 서열 내 임의의 위치에 위치하고, 상기 안티센스 가닥은 포스포로티오에이트, 메틸포스포네이트 및 포스페이트 뉴클레오타이드 간 연결의 임의의 조합을 포함하는 센스 가닥 또는 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 또는 포스페이트 연결을 포함하는 안티센스 가닥과 쌍을 형성한다.
일부 양태에서, dsRNA 분자의 안티센스 가닥은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 또는 14개 포스페이트 뉴클레오타이드 간 연결에 의해 분리된 4개의 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드 간 연결의 2개 블록을 포함하고, 여기서, 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드 간 연결 중 하나가 올리고뉴클레오타이드 서열 내 임의의 위치에 위치하고, 상기 안티센스 가닥은 포스포로티오에이트, 메틸포스포네이트 및 포스페이트 뉴클레오타이드 간 연결의 임의의 조합을 포함하는 센스 가닥 또는 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 또는 포스페이트 연결을 포함하는 안티센스 가닥과 쌍을 형성한다.
일부 양태에서, dsRNA 분자의 안티센스 가닥은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12개 포스페이트 뉴클레오타이드 간 연결에 의해 분리된 5개의 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드 간 연결의 2개 블록을 포함하고, 여기서, 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드 간 연결 중 하나가 올리고뉴클레오타이드 서열 내 임의의 위치에 위치하고, 상기 안티센스 가닥은 포스포로티오에이트, 메틸포스포네이트 및 포스페이트 뉴클레오타이드 간 연결의 임의의 조합을 포함하는 센스 가닥 또는 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 또는 포스페이트 연결을 포함하는 안티센스 가닥과 쌍을 형성한다.
일부 양태에서, dsRNA 분자의 안티센스 가닥은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 포스페이트 뉴클레오타이드 간 연결에 의해 분리된 6개의 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드 간 연결의 2개 블록을 포함하고, 여기서, 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드 간 연결 중 하나가 올리고뉴클레오타이드 서열 내 임의의 위치에 위치하고, 상기 안티센스 가닥은 포스포로티오에이트, 메틸포스포네이트 및 포스페이트 뉴클레오타이드 간 연결의 임의의 조합을 포함하는 센스 가닥 또는 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 또는 포스페이트 연결을 포함하는 안티센스 가닥과 쌍을 형성한다.
일부 양태에서, dsRNA 분자의 안티센스 가닥은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8개 포스페이트 뉴클레오타이드 간 연결에 의해 분리된 7개의 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드 간 연결의 2개 블록을 포함하고, 여기서, 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드 간 연결 중 하나가 올리고뉴클레오타이드 서열 내 임의의 위치에 위치하고, 상기 안티센스 가닥은 포스포로티오에이트, 메틸포스포네이트 및 포스페이트 뉴클레오타이드 간 연결의 임의의 조합을 포함하는 센스 가닥 또는 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 또는 포스페이트 연결을 포함하는 안티센스 가닥과 쌍을 형성한다.
일부 양태에서, dsRNA 분자의 안티센스 가닥은 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개 포스페이트 뉴클레오타이드 간 연결에 의해 분리된 8개의 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드 간 연결의 2개 블록을 포함하고, 여기서, 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드 간 연결 중 하나가 올리고뉴클레오타이드 서열 내 임의의 위치에 위치하고, 상기 안티센스 가닥은 포스포로티오에이트, 메틸포스포네이트 및 포스페이트 뉴클레오타이드 간 연결의 임의의 조합을 포함하는 센스 가닥 또는 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 또는 포스페이트 연결을 포함하는 안티센스 가닥과 쌍을 형성한다.
일부 양태에서, dsRNA 분자의 안티센스 가닥은 1, 2, 3, 또는 4개 포스페이트 뉴클레오타이드 간 연결에 의해 분리된 9개의 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드 간 연결의 2개 블록을 포함하고, 여기서, 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드 간 연결 중 하나가 올리고뉴클레오타이드 서열 내 임의의 위치에 위치하고, 상기 안티센스 가닥은 포스포로티오에이트, 메틸포스포네이트 및 포스페이트 뉴클레오타이드 간 연결의 임의의 조합을 포함하는 센스 가닥 또는 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 또는 포스페이트 연결을 포함하는 안티센스 가닥과 쌍을 형성한다.
일부 양태에서, 본원 개시내용의 dsRNA 분자는 추가로 센스 또는 안티센스 가닥의 말단 위치(들) 1 내지 10 내에 하나 이상의 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형을 포함한다. 예를 들어, 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 뉴클레오타이드는 센스 또는 안티센스 가닥의 하나의 말단 또는 말단 둘 다에서 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드 간 연결을 통해 연결될 수 있다.
일부 양태에서, 본원 개시내용의 dsRNA 분자는 추가로 센스 또는 안티센스 가닥의 각각의 듀플렉스의 내부 영역의 1 내지 10 내에 하나 이상의 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형을 포함한다. 예를 들어, 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 뉴클레오타이드는 센스 가닥의 5'-말단으로부터 계수하여 듀플렉스 영역의 위치 8 내지 16에서 포스포로티오에이트 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드 간 연결을 통해 연결될 수 있고; dsRNA 분자는 임의로 추가로 말단 위치(들)의 1 내지 10 내에 하나 이상의 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형을 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 본원 개시내용의 dsRNA 분자는 추가로 센스 가닥(5'-말단으로부터 계수하여)의 위치 1-5 내 1 내지 5개의 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형(들) 및 위치 18-23 내 1 내지 5개의 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형(들) 및 안티센스 가닥 (5'-말단으로부터 계수하여)의 위치 1 및 2에서 1 내지 5개의 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형 및 위치 18-23 내 1 내지 5개를 포함한다.
일부 양태에서, 본원 개시내용의 dsRNA 분자는 추가로 센스 가닥(5'-말단으로부터 계수하여)의 위치 1-5 내 1개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형 및 위치 18-23 내 1개의 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형 및 안티센스 가닥 (5'-말단으로부터 계수하여)의 위치 1 및 2에서 1개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형 및 위치 18-23 내 2개의 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형을 포함한다.
일부 양태에서, 본원 개시내용의 dsRNA 분자는 추가로 센스 가닥(5'-말단으로부터 계수하여)의 위치 1-5 내 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형들 및 위치 18-23 내 1개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형 및 안티센스 가닥 (5'-말단으로부터 계수하여)의 위치 1 및 2에서 1개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형 및 위치 18-23 내 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형을 포함한다.
일부 양태에서, 본원 개시내용의 dsRNA 분자는 추가로 센스 가닥(5'-말단으로부터 계수하여)의 위치 1-5 내 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형들 및 위치 18-23 내 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형 및 안티센스 가닥 (5'-말단으로부터 계수하여)의 위치 1 및 2에서 1개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형 및 위치 18-23 내 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형들을 포함한다.
일부 양태에서, 본원 개시내용의 dsRNA 분자는 추가로 센스 가닥(5'-말단으로부터 계수하여)의 위치 1-5 내 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형들 및 위치 18-23 내 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형들 및 안티센스 가닥 (5'-말단으로부터 계수하여)의 위치 1 및 2에서 1개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형 및 위치 18-23 내 1개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형을 포함한다.
일부 양태에서, 본원 개시내용의 dsRNA 분자는 추가로 센스 가닥(5'-말단으로부터 계수하여)의 위치 1-5 내 1개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형 및 위치 18-23 내 1개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형 및 안티센스 가닥 (5'-말단으로부터 계수하여)의 위치 1 및 2에서 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형들 및 위치 18-23 내 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형들을 포함한다.
일부 양태에서, 본원 개시내용의 dsRNA 분자는 추가로 센스 가닥(5'-말단으로부터 계수하여)의 위치 1-5 내 1개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형 및 위치 18-23 내 1개 및 안티센스 가닥 (5'-말단으로부터 계수하여)의 위치 1 및 2에서 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형 및 위치 18-23 내 1개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형을 포함한다.
일부 양태에서, 본원 개시내용의 dsRNA 분자는 추가로 센스 가닥(5'-말단으로부터 계수하여)의 위치 1-5 내 1개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형 및 안티센스 가닥 (5'-말단으로부터 계수하여)의 위치 1 및 2에서 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형들 및 위치 18-23 내 1개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형을 포함한다.
일부 양태에서, 본원 개시내용의 dsRNA 분자는 추가로 센스 가닥(5'-말단으로부터 계수하여)의 위치 1-5 내 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형들 및 안티센스 가닥 (5'-말단으로부터 계수하여)의 위치 1 및 2에서 1개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형 및 위치 18-23 내 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형들을 포함한다.
일부 양태에서, 본원 개시내용의 dsRNA 분자는 추가로 센스 가닥(5'-말단으로부터 계수하여)의 위치 1-5 내 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형들 및 위치 18-23 내 1개 및 안티센스 가닥 (5'-말단으로부터 계수하여)의 위치 1 및 2에서 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형들 및 위치 18-23 내 1개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형을 포함한다.
일부 양태에서, 본원 개시내용의 dsRNA 분자는 추가로 센스 가닥(5'-말단으로부터 계수하여)의 위치 1-5 내 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형들 및 위치 18-23 내 1개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형 및 안티센스 가닥 (5'-말단으로부터 계수하여)의 위치 1 및 2에서 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형들 및 위치 18-23 내 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형들을 포함한다.
일부 양태에서, 본원 개시내용의 dsRNA 분자는 추가로 센스 가닥(5'-말단으로부터 계수하여)의 위치 1-5 내 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형들 및 위치 18-23 내 1개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형 및 안티센스 가닥 (5'-말단으로부터 계수하여)의 위치 1 및 2에서 1개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형 및 위치 18-23 내 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형을 포함한다.
일부 양태에서, 본원 개시내용의 dsRNA 분자는 추가로 센스 가닥(5'-말단으로부터 계수하여)의 위치 1 및 2에서 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형들 및 위치 20 및 21에서 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형들 및 안티센스 가닥 (5'-말단으로부터 계수하여)의 위치 1에서 1개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형 및 위치 21에서 1개를 포함한다.
일부 양태에서, 본원 개시내용의 dsRNA 분자는 추가로 센스 가닥(5'-말단으로부터 계수하여)의 위치 1에서 1개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형 및 위치 21에서 1개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형 및 안티센스 가닥 (5'-말단으로부터 계수하여)의 위치 1 및 2에서 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형들 및 위치 20 및 21에서 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형들을 포함한다.
일부 양태에서, 본원 개시내용의 dsRNA 분자는 추가로 센스 가닥(5'-말단으로부터 계수하여)의 위치 1 및 2에서 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형들 및 위치 21 및 22에서 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형들 및 안티센스 가닥 (5'-말단으로부터 계수하여)의 위치 1에서 1개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형 및 위치 21에서 1개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형을 포함한다.
일부 양태에서, 본원 개시내용의 dsRNA 분자는 추가로 센스 가닥(5'-말단으로부터 계수하여)의 위치 1에서 1개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형 및 위치 21에서 1개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형 및 안티센스 가닥 (5'-말단으로부터 계수하여)의 위치 1 및 2에서 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형들 및 위치 21 및 22에서 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형들을 포함한다.
일부 양태에서, 본원 개시내용의 dsRNA 분자는 추가로 센스 가닥(5'-말단으로부터 계수하여)의 위치 1 및 2에서 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형들 및 위치 22 및 23에서 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형들 및 안티센스 가닥 (5'-말단으로부터 계수하여)의 위치 1에서 1개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형 및 위치 21에서 1개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형을 포함한다.
일부 양태에서, 본원 개시내용의 dsRNA 분자는 추가로 센스 가닥(5'-말단으로부터 계수하여)의 위치 1에서 1개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형 및 위치 21에서 1개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형 및 안티센스 가닥 (5'-말단으로부터 계수하여)의 위치 1 및 2에서 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형들 및 위치 23에서 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형들을 포함한다.
일부 양태에서, 본원 개시내용의 화합물은 골격 키랄 중심 패턴을 포함한다. 일부 양태에서, 골격 키랄 중심의 공통 패턴은 Sp 배위에서 적어도 5개의 뉴클레오타이드 간 연결을 포함한다. 일부 양태에서, 골격 키랄 중심의 공통 패턴은 Sp 배위에서 적어도 6개의 뉴클레오타이드 간 연결을 포함한다. 일부 양태에서, 골격 키랄 중심의 공통 패턴은 Sp 배위에서 적어도 7개의 뉴클레오타이드 간 연결을 포함한다. 일부 양태에서, 골격 키랄 중심의 공통 패턴은 Sp 배위에서 적어도 8개의 뉴클레오타이드 간 연결을 포함한다. 일부 양태에서, 골격 키랄 중심의 공통 패턴은 Sp 배위에서 적어도 9개의 뉴클레오타이드 간 연결을 포함한다. 일부 양태에서, 골격 키랄 중심의 공통 패턴은 Sp 배위에서 적어도 10개의 뉴클레오타이드 간 연결을 포함한다. 일부 양태에서, 골격 키랄 중심의 공통 패턴은 Sp 배위에서 적어도 11개의 뉴클레오타이드 간 연결을 포함한다. 일부 양태에서, 골격 키랄 중심의 공통 패턴은 Sp 배위에서 적어도 12개의 뉴클레오타이드 간 연결을 포함한다. 일부 양태에서, 골격 키랄 중심의 공통 패턴은 Sp 배위에서 적어도 13개의 뉴클레오타이드 간 연결을 포함한다. 일부 양태에서, 골격 키랄 중심의 공통 패턴은 Sp 배위에서 적어도 14개의 뉴클레오타이드 간 연결을 포함한다. 일부 양태에서, 골격 키랄 중심의 공통 패턴은 Sp 배위에서 적어도 15개의 뉴클레오타이드 간 연결을 포함한다. 일부 양태에서, 골격 키랄 중심의 공통 패턴은 Sp 배위에서 적어도 16개의 뉴클레오타이드 간 연결을 포함한다. 일부 양태에서, 골격 키랄 중심의 공통 패턴은 Sp 배위에서 적어도 17개의 뉴클레오타이드 간 연결을 포함한다. 일부 양태에서, 골격 키랄 중심의 공통 패턴은 Sp 배위에서 적어도 18개의 뉴클레오타이드 간 연결을 포함한다. 일부 양태에서, 골격 키랄 중심의 공통 패턴은 Sp 배위에서 적어도 19개의 뉴클레오타이드 간 연결을 포함한다. 일부 양태에서, 골격 키랄 중심의 공통 패턴은 Rp 배위에서 8개 이하의 뉴클레오타이드 간 연결을 포함한다. 일부 양태에서, 골격 키랄 중심의 공통 패턴은 Rp 배위에서 7개 이하의 뉴클레오타이드 간 연결을 포함한다. 일부 양태에서, 골격 키랄 중심의 공통 패턴은 Rp 배위에서 6개 이하의 뉴클레오타이드 간 연결을 포함한다. 일부 양태에서, 골격 키랄 중심의 공통 패턴은 Rp 배위에서 5개 이하의 뉴클레오타이드 간 연결을 포함한다. 일부 양태에서, 골격 키랄 중심의 공통 패턴은 Rp 배위에서 4개 이하의 뉴클레오타이드 간 연결을 포함한다. 일부 양태에서, 골격 키랄 중심의 공통 패턴은 Rp 배위에서 3개 이하의 뉴클레오타이드 간 연결을 포함한다. 일부 양태에서, 골격 키랄 중심의 공통 패턴은 Rp 배위에서 2개 이하의 뉴클레오타이드 간 연결을 포함한다. 일부 양태에서, 골격 키랄 중심의 공통 패턴은 Rp 배위에서 1개 이하의 뉴클레오타이드 간 연결을 포함한다. 일부 양태에서, 골격 키랄 중심의 공통 패턴은 키랄이 아닌 (비제한저인 예로서, 포스포디에스테르) 8개 이하의 뉴클레오타이드 간 연결을 포함한다. 일부 양태에서, 골격 키랄 중심의 공통 패턴은 키랄이 아닌 7개 이하의 뉴클레오타이드 간 연결을 포함한다. 일부 양태에서, 골격 키랄 중심의 공통 패턴은 키랄이 아닌 6개 이하의 뉴클레오타이드 간 연결을 포함한다. 일부 양태에서, 골격 키랄 중심의 공통 패턴은 키랄이 아닌 5개 이하의 뉴클레오타이드 간 연결을 포함한다. 일부 양태에서, 골격 키랄 중심의 공통 패턴은 키랄이 아닌 4개 이하의 뉴클레오타이드 간 연결을 포함한다. 일부 양태에서, 골격 키랄 중심의 공통 패턴은 키랄이 아닌 3개 이하의 뉴클레오타이드 간 연결을 포함한다. 일부 양태에서, 골격 키랄 중심의 공통 패턴은 키랄이 아닌 2개 이하의 뉴클레오타이드 간 연결을 포함한다. 일부 양태에서, 골격 키랄 중심의 공통 패턴은 키랄이 아닌 1개 이하의 뉴클레오타이드 간 연결을 포함한다. 일부 양태에서, 골격 키랄 중심의 공통 패턴은 Sp 배위에서 적어도 10개의 뉴클레오타이드 간 연결 및 키랄이 아닌 8개 이하의 뉴클레오타이드 간 연결을 포함한다. 일부 양태에서, 골격 키랄 중심의 공통 패턴은 Sp 배위에서 적어도 11개의 뉴클레오타이드 간 연결 및 키랄이 아닌 7개 이하의 뉴클레오타이드 간 연결을 포함한다. 일부 양태에서, 골격 키랄 중심의 공통 패턴은 Sp 배위에서 적어도 12개의 뉴클레오타이드 간 연결 및 키랄이 아닌 6개 이하의 뉴클레오타이드 간 연결을 포함한다. 일부 양태에서, 골격 키랄 중심의 공통 패턴은 Sp 배위에서 적어도 13개의 뉴클레오타이드 간 연결 및 키랄이 아닌 6개 이하의 뉴클레오타이드 간 연결을 포함한다. 일부 양태에서, 골격 키랄 중심의 공통 패턴은 Sp 배위에서 적어도 14개의 뉴클레오타이드 간 연결 및 키랄이 아닌 5개 이하의 뉴클레오타이드 간 연결을 포함한다. 일부 양태에서, 골격 키랄 중심의 공통 패턴은 Sp 배위에서 적어도 15개의 뉴클레오타이드 간 연결 및 키랄이 아닌 4개 이하의 뉴클레오타이드 간 연결을 포함한다. 일부 양태에서, Sp 배위에서 뉴클레오타이드 간 연결은 임의로 연속성이거나 연속성이 아니다. 일부 양태에서, Rp 배위에서 뉴클레오타이드 간 연결은 임의로 연속성이거나 연속성이 아니다. 일부 양태에서, 키랄이 아닌 뉴클레오타이드 간 연결은 임의로 연속성이거나 연속성이 아니다.
일부 양태에서, 본원 개시내용의 화합물은 블록을 포함하고 이는 입체화학 블록이다. 일부 양태에서, 블록은 블록의 각각의 뉴클레오타이드 간 연결이 Rp인 Rp 블록이다. 일부 양태에서, 5'-블록은 Rp 블록이다. 일부 양태에서, 3'-블록은 Rp 블록이다. 일부 양태에서, 블록은 블록의 각각의 뉴클레오타이드 간 연결이 Sp인 Sp 블록이다. 일부 양태에서, 5'-블록은 Sp 블록이다. 일부 양태에서, 3'-블록은 Sp 블록이다. 일부 양태에서, 제공된 올리고뉴클레오타이드는 Rp 및 Sp 블록 둘 다를 포함한다. 일부 양태에서, 제공된 올리고뉴클레오타이드는 Sp 블록이 아닌 하나 이상의 Rp를 포함한다. 일부 양태에서, 제공된 올리고뉴클레오타이드는 Rp 블록이 아닌 하나 이상의 Sp를 포함한다. 일부 양태에서, 제공된 올리고뉴클레오타이드는 하나 이상의 PO 블록을 포함하고, 여기서 각각의 뉴클레오타이드 간 연결은 천연 포스페이트 연결이다.
일부 양태에서, 본원 개시내용의 화합물은 5'-블록을 포함하고 이는 Sp 블록이고, 여기서 각각의 당 모이어티는 2'-F 변형을 포함한다. 일부 양태에서, 5'-블록은 Sp 블록이고, 여기서, 뉴클레오타이드 간 연결 각각은 변형된 뉴클레오타이드 간 연결이고, 각각의 당 모이어티는 2'-F 변형을 포함한다. 일부 양태에서, 5'-블록은 Sp 블록이고, 여기서, 뉴클레오타이드 간 연결 각각은 포스포로티오에이트 연결이고, 각각의 당 모이어티는 2'-F 변형을 포함한다. 일부 양태에서, 5'-블록은 4개 이상의 뉴클레오사이드 유닛을 포함한다. 일부 양태에서, 5'-블록은 5개 이상의 뉴클레오사이드 유닛을 포함한다. 일부 양태에서, 5'-블록은 6개 이상의 뉴클레오사이드 유닛을 포함한다. 일부 양태에서, 5'-블록은 7개 이상의 뉴클레오사이드 유닛을 포함한다. 일부 양태에서, 3'-블록은 Sp 블록이고, 여기서 각각의 당 모이어티는 2'-F 변형을 포함한다. 일부 양태에서, 3'-블록은 Sp 블록이고, 여기서, 뉴클레오타이드 간 연결 각각은 변형된 뉴클레오타이드 간 연결이고, 각각의 당 모이어티는 2'-F 변형을 포함한다. 일부 양태에서, 3'-블록은 Sp 블록이고, 여기서, 뉴클레오타이드 간 연결 각각은 포스포로티오에이트 연결이고, 각각의 당 모이어티는 2'-F 변형을 포함한다. 일부 양태에서, 3'-블록은 4개 이상의 뉴클레오사이드 유닛을 포함한다. 일부 양태에서, 3'-블록은 5개 이상의 뉴클레오사이드 유닛을 포함한다. 일부 양태에서, 3'-블록은 6개 이상의 뉴클레오사이드 유닛을 포함한다. 일부 양태에서, 3'-블록은 7개 이상의 뉴클레오사이드 유닛을 포함한다.
일부 양태에서, 본원 개시내용의 화합물은 특정 영역에서 한 유형의 뉴클레오사이드 또는 올리고뉴클레오타이드에 이어서 특정 유형의 뉴클레오타이드 간 연결, 예를 들어, 천연 포스페이트 연결, 변형된 뉴클레오타이드 간 연결, Rp 키랄 뉴클레오타이드 간 연결, Sp 키랄 뉴클레오타이드 간 연결 등을 포함한다. 일부 양태에서, A에 이어서 Sp가 있다. 일부 양태에서, A에 이어서 Rp가 있다. 일부 양태에서, A에 이어서 천연 포스페이트 연결(PO)이 있다. 일부 양태에서, U에 이어서 Sp가 있다. 일부 양태에서, U에 이어서 Rp가 있다. 일부 양태에서, U에 이어서 천연 포스페이트 연결(PO)이 있다. 일부 양태에서, C에 이어서 Sp가 있다. 일부 양태에서, C에 이어서 Rp가 있다. 일부 양태에서, C에 이어서 천연 포스페이트 연결(PO)이 있다. 일부 양태에서, G에 이어서 Sp가 있다. 일부 양태에서, G에 이어서 Rp가 있다. 일부 양태에서, G에 이어서 천연 포스페이트 연결(PO)이 있다. 일부 양태에서, C 및 U에 이어서 Sp가 있다. 일부 양태에서, C 및 U에 이어서 Rp가 있다. 일부 양태에서, C 및 U에 이어서 천연 포스페이트 연결(PO)이 있다. 일부 양태에서, A 및 G에 이어서 Sp가 있다. 일부 양태에서, A 및 G에 이어서 Rp가 있다.
일부 양태에서, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 위치 21 및 22 사이에 및 뉴클레오타이드 22 및 23 사이에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결을 포함하고, 여기서 안티센스 가닥은 안티센스 가닥의 씨드 영역 내에 (즉, 안티센스 가닥의 5'-말단의 위치 2-9에서) 위치한 듀플렉스의 적어도 하나의 열 불안정화 변형을 포함하고, 여기서 dsRNA는 임의로 추가로 하니의 특징 중 적어도 하나(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 모두 8개)를 갖는다: (i) 안티센스는 2, 3, 4, 5 또는 6개의 2'-플루오로 변형을 포함하고; (ii) 안티센스는 3, 4 또는 5개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결을 포함하고; (iii) 센스 가닥은 리간드와 접합되고; (iv) 센스 가닥은 2, 3, 4 또는 5개의 2'-플루오로 변형을 포함하고; (v) 센스 가닥은 1, 2, 3, 4 또는 5개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결을 포함하고; (vi) dsRNA는 적어도 4개의 2'-플루오로 변형을 포함하고; (vii) dsRNA는 12 내지 40개의 뉴클레오타이드 쌍 길이의 듀플렉스 영역을 포함하고; (viii) dsRNA는 안티센스 가닥의 5'-말단에서 평활 말단을 갖는다.
일부 양태에서, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 위치 1 및 2 사이에 및 뉴클레오타이드 2 및 3 사이에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결을 포함하고, 여기서 안티센스 가닥은 안티센스 가닥의 씨드 영역 내에 (즉, 안티센스 가닥의 5'-말단의 위치 2-9에서) 위치한 듀플렉스의 적어도 하나의 열 불안정화 변형을 포함하고, 여기서 dsRNA는 임의로 추가로 하니의 특징 중 적어도 하나 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 모두 8개)를 갖는다: (i) 안티센스는 2, 3, 4, 5 또는 6개의 2'-플루오로 변형을 포함하고; (ii) 센스 가닥은 리간드와 접합되고; (iii) 센스 가닥은 2, 3, 4 또는 5개의 2'-플루오로 변형을 포함하고; (iv) 센스 가닥은 1, 2, 3, 4 또는 5개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결을 포함하고; (v) dsRNA는 적어도 4개의 2'-플루오로 변형을 포함하고; (vi) dsRNA는 12 내지 40개의 뉴클레오타이드 쌍 길이의 듀플렉스 영역을 포함하고; (vii) dsRNA는 12 내지 40개의 뉴클레오타이드 쌍 길이의 듀플렉스 영역을 포함하고; (viii) dsRNA는 안티센스 가닥의 5'-말단에서 평활 말단을 갖는다.
일부 양태에서, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 위치 1 및 2 사이에 및 뉴클레오타이드 2 및 3 사이에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결을 포함하고, 여기서 안티센스 가닥은 안티센스 가닥의 씨드 영역 내에 (즉, 안티센스 가닥의 5'-말단의 위치 2-9에서) 위치한 듀플렉스의 적어도 하나의 열 불안정화 변형을 포함하고, 여기서 dsRNA는 임의로 추가로 하니의 특징 중 적어도 하나 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 모두 8개)를 갖는다: (i) 안티센스는 2, 3, 4, 5 또는 6개의 2'-플루오로 변형을 포함하고; (ii) 안티센스는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결을 포함하고; (iii) 센스 가닥은 리간드와 접합되고; (iv) 센스 가닥은 2, 3, 4 또는 5개의 2'-플루오로 변형을 포함하고; (v) 센스 가닥은 3, 4 또는 5개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결을 포함하고; (vi) dsRNA는 적어도 4개의 2'-플루오로 변형을 포함하고; (vii) dsRNA는 12 내지 40개의 뉴클레오타이드 쌍 길이의 듀플렉스 영역을 포함하고; (viii) dsRNA는 안티센스 가닥의 5'-말단에서 평활 말단을 갖는다.
일부 양태에서, 센스 가닥은 뉴클레오타이드 위치 1 및 2 사이에 및 뉴클레오타이드 2 및 3 사이에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결을 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 위치 1 및 2 사이에, 뉴클레오타이드 위치 2 및 3 사이에, 뉴클레오타이드 위치 21 및 22 사이에 및 뉴클레오타이드 위치 22 및 23 사이에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결을 포함하고, 여기서 안티센스 가닥은 안티센스 가닥의 씨드 영역 내에 (즉, 안티센스 가닥의 5'-말단의 위치 2-9에서) 위치한 듀플렉스의 적어도 하나의 열 불안정화 변형을 포함하고, 여기서 dsRNA는 임의로 추가로 하니의 특징 중 적어도 하나 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7개 모두)를 갖는다: (i) 안티센스는 2, 3, 4, 5 또는 6개의 2'-플루오로 변형을 포함하고; (ii) 센스 가닥은 리간드와 접합되고; (iii) 센스 가닥은 2, 3, 4 또는 5개의 2'-플루오로 변형을 포함하고; (iv) 센스 가닥은 3, 4 또는 5개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결을 포함하고; (v) dsRNA는 적어도 4개의 2'-플루오로 변형을 포함하고; (vi) dsRNA는 12 내지 40개의 뉴클레오타이드 쌍 길이의 듀플렉스 영역을 포함하고; (vii) dsRNA는 안티센스 가닥의 5'-말단에서 평활 말단을 갖는다.
일부 양태에서, 본원 개시내용의 dsRNA 분자는 표적과, 듀플렉스 내 및 이의 조합으로 미스매치(들)를 포함한다. 미스매치는 오버행 영역 또는 듀플렉스 영역에서 발생할 수 있다. 염기쌍은 해리 또는 용융을 촉진하는 경향에 따라 순위가 매겨질 수 있다(예를 들어, 특정 쌍형성의 결합 또는 해리의 자유 에너지에 따라 가장 간단한 접근법은 개별 쌍을 기준으로 쌍을 검사하는 것이만 다음 이웃 또는 유사한 분석이 사용될 수도 있다). 해리를 촉진시키는 측면에서: A:U는 G:C 보다 선호되고; G:U는 G:C 보다 바람지하고; I:C는 G:C 보다 바람직하다(I=이노신). 미스매치, 예를 들어, 비-카노니칼 또는 카노니칼 이외의 쌍형성(본원의 다른 곳에 기재된 바와 같이)은 카노니칼(A:T, A:U, G:C) 쌍형성 보다 바람직하고; 범용 염기를 포함하는 쌍형성은 카노니칼 쌍형성 보다 바람직하다.
일부 양태에서, 본원 개시내용의 dsRNA 분자는 A:U, G:U, I:C, 및 예를 들어, 듀플렉스의 5'-말단에서 안티센스 가닥의 해리를 촉진시키기 위해 비-카노니칼 또는 카노니칼 이외의 쌍형성 또는 범용 염기를 포함하는 쌍형성의 미스매치된 쌍의 그룹으로부터 독립적으로 선택될 수 있는 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 듀플렉스 영역 내 처음 1, 2, 3, 4 또는 5개 염기쌍 중 적어도 하나를 포함한다.
일부 양태에서, 안티센스 가닥 내 5'-말단으로부터 듀플렉스 영역 내의 1 위치에 있는 뉴클레오타이드는 A, dA, dU, U, 및 dT로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 대안적으로, 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터의 듀플렉스 영역 내 처음 1, 2 또는 3개의 염기쌍의 적어도 하나는 AU 염기쌍이다. 예를 들어, 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 듀플렉스 영역 내 처음 염기쌍은 AU 염기쌍이다.
단일 가닥 또는 이중 가닥 올리고뉴클레오타이드의 임의의 위치에서 4'-변형된 또는 5'-변형된 뉴클레오타이드의 디뉴클레오타이드의 포스포티에스테르(PO), 포스포로티오에이트(PS), 또는 포스포로디티오에이트(PS2) 연결의 3'-말단으로의 도입이 뉴클레오타이드 연결에 대한 입체 효과를 나타낼 수 있어 뉴클레아제에 대해 이를 보호하거나 안정화시킬 수 있는 것으로 밝혀졌다.
일부 양태에서, 5'-변형된 뉴클레오사이드는 단일 가닥 또는 이중 가닥 siRNA의 임의의 위치에서 디뉴클레오타이드의 3'-말단에 도입된다. 예를 들어, 5'-알킬화된 뉴클레오사이드는 단일 가닥 또는 이중 가닥 siRNA의 임의의 위치에서 디뉴클레오타이드의 3'-말단에 도입될 수 있다. 리보스 당의 5' 위치에서 알킬 그룹은 라세믹 또는 키랄적으로 순수한 R 또는 S 이성체일 수 있다. 예시적인 5'-알킬화된 뉴클레오사이드는 5'-메틸 뉴클레오사이드이다. 5'-메틸은 라세믹 또는 키랄적으로 순수한 R 또는 S 이성체일 수 있다.
일부 양태에서, 4'-변형된 뉴클레오사이드는 단일 가닥 또는 이중 가닥 siRNA의 임의의 위치에서 디뉴클레오타이드의 3'-말단에 도입된다. 예를 들어, 4'-알킬화된 뉴클레오사이드는 단일 가닥 또는 이중 가닥 siRNA의 임의의 위치에서 디뉴클레오타이드의 3'-말단에 도입될 수 있다. 리보스 당의 4' 위치에서 알킬 그룹은 라세믹 또는 키랄적으로 순수한 R 또는 S 이성체일 수 있다. 예시적인 4'-알킬화된 뉴클레오사이드는 4'-메틸 뉴클레오사이드이다. 4'-메틸은 라세믹 또는 키랄적으로 순수한 R 또는 S 이성체일 수 있다. 대안적으로, 4'-O-알킬화된 뉴클레오사이드는 단일 가닥 또는 이중 가닥 siRNA의 임의의 위치에서 디뉴클레오타이드의 3'-말단에 도입될 수 있다. 리보스 당의 4'-O-아킬은 라세믹 또는 키랄적으로 순수한 R 또는 S 이성체일 수 있다. 예시적인 4'-O-알킬화된 뉴클레오사이드는 4'-O-메틸 뉴클레오사이드이다. 4'-O-메틸은 라세믹 또는 키랄적으로 순수한 R 또는 S 이성체일 수 있다.
일부 양태에서, 5'-알킬화된 뉴클레오사이드는 dsRNA의 센스 가닥 또는 안티센스 가닥 상의 임의의 위치에 도입되고 상기 변형은 dsRNA의 효능을 유지하거나 개선시킨다. 5'-알킬은 라세믹 또는 키랄적으로 순수한 R 또는 S 이성체일 수 있다. 예시적인 5'-알킬화된 뉴클레오사이드는 5'-메틸 뉴클레오사이드이다. 5'-메틸은 라세믹 또는 키랄적으로 순수한 R 또는 S 이성체일 수 있다.
일부 양태에서, 4'-알킬화된 뉴클레오사이드는 dsRNA의 센스 가닥 또는 안티센스 가닥 상의 임의의 위치에 도입되고 상기 변형은 dsRNA의 효능을 유지하거나 개선시킨다. 4'-알킬은 라세믹 또는 키랄적으로 순수한 R 또는 S 이성체일 수 있다. 예시적인 4'-알킬화된 뉴클레오사이드는 4'-메틸 뉴클레오사이드이다. 4'-메틸은 라세믹 또는 키랄적으로 순수한 R 또는 S 이성체일 수 있다.
일부 양태에서, 4'-O-알킬화된 뉴클레오사이드는 dsRNA의 센스 가닥 또는 안티센스 가닥 상의 임의의 위치에 도입되고 상기 변형은 dsRNA의 효능을 유지하거나 개선시킨다. 5'-알킬은 라세믹 또는 키랄적으로 순수한 R 또는 S 이성체일 수 있다. 예시적인 4'-O-알킬화된 뉴클레오사이드는 4'-O-메틸 뉴클레오사이드이다. 4'-O-메틸은 라세믹 또는 키랄적으로 순수한 R 또는 S 이성체일 수 있다.
일부 양태에서, 본원 개시내용의 dsRNA 분자는 2'-5' 연결(2'-H, 2'-OH 및 2'-OMe와 함께 및 P=O 또는 P=S와 함께)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 2'-5' 연결 변형을 사용하여 뉴클레아제 내성을 촉진시키거나 센스 가닥의 안티센스 가닥으로의 결합을 억제할 수 있거나 센스 가닥의 5' 말단에서 사용하여 RISC에 의한 센스 가닥 활성화를 회피할 수 있다.
또 다른 양태에서, 본원 개시내용의 dsRNA 분자는 L 당 (예를 들어, 리보스, 2'-H, 2'-OH 및 2'-OMe를 갖는 L-아라비노스)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 이들 L 당 변형을 사용하여 뉴클레아제 내성을 촉진시키거나 센스 가닥의 안티센스 가닥으로의 결합을 억제할 수 있거나 센스 가닥의 5' 말단에서 사용하여 RISC에 의한 센스 가닥 활성화를 회피할 수 있다.
다양한 공개 공보는 모두 본원 개시내용의 dsRNA와 함께 사용될 수 있는 다량체 siRNA를 기재한다. 상기 공개 공보는 이들의 전문이 본원에 참조로 포함되는 WO2007/091269, US 7858769, WO2010/141511, WO2007/117686, WO2009/014887, 및 WO2011/031520을 포함한다.
하기에 보다 상세히 기재된 바와 같이, 하나 이상의 탄수화물 모이어티의 RNAi 제제로의 접합을 함유하는 RNAi 제제는 RNAi 제제의 하나 이상의 성질을 최적화할 수 있다. 많은 경우에, 탄수화물 모이어티는 iRNA 제제의 변형된 서브유닛에 부착된다. 예를 들어, dsRNA 제제의 하나 이상의 리보뉴클레오타이드 서브유닛의 리보스 당은 또 다른 모이어티, 예를 들어 탄수화물 리간드가 부착된 비-탄수화물(바람직하게는 사이클릭) 캐리어로 대체될 수 있다. 서브유닛의 리보스 당이 그렇게 대체된 리보뉴클레오타이드 서브유닛은 본원에서 리보스 대체 변형 서브유닛(RRMS)으로 지칭된다. 환형 담체는 카보사이클릭 환 시스템일 수 있고, 즉, 모든 환 원자는 탄소 원자 또는 헤테로사이클릭 환 시스템이고, 즉 하나 이상의 환 원자는 헤테로원자, 예를 들어 질소, 산소, 황일 수 있다. 사이클릭 담체는 모노사이클릭 환 시스템일 수 있거나, 2개 이상의 환, 예를 들어, 융합된 환을 함유할 수 있다. 사이클릭 담체는 완전히 포화된 환 시스템일 수 있거나, 이것은 하나 이상의 이중 결합을 함유할 수 있다.
리간드는 캐리어를 통해 폴리뉴클레오타이드에 부착될 수 있다. 담체는 (i) 적어도 하나의 "골격 부착점", 바람직하게는 2개의 "골격 부착점" 및 (ii) 적어도 하나의 "테더링 부착점"을 포함한다. 본원에 사용된 "골격 부착점"은 관능 그룹, 예를 들어, 하이드록실 그룹, 또는 일반적으로 이를 위해 가용한 결합을 지칭하고 이는 골격, 예를 들어, 리보핵산의 포스페이트, 또는 변형된 포스페이트, 예를 들어 황 함유 골격으로 담체의 혼입을 위해 적합하다. 일부 양태에서 "테더링 부착점"(TAP)은 선택된 모이어티를 연결하는, 사이클릭 담체의 구성 환 원자, 예를 들어, 탄소 원자 또는 헤테로원자(골격 부착점을 제공하는 원자와 구별됨)를 지칭한다. 모이어티는 예를 들어, 탄수화물, 예를 들어, 모노사카라이드, 디사카라이드, 트리사카라이드, 테트라사카라이드, 올리고사카라이드 및 폴리사카라이드일 수 있다. 임의로 선택된 모이어티는 사이클릭 캐리어로의 삽입 테더에 의해 연결된다. 따라서, 사이클릭 담체는 종종 관능 그룹, 예를 들어 아미노 그룹을 포함하거나, 일반적으로 다른 화학적 실체, 예를 들어 구성 환에 대한 리간드의 도입 또는 테더링에 적합한 결합을 제공한다.
RNAi 제제는 캐리어를 통해 리간드에 접합될 수 있고, 여기서 캐리어는 사이클릭 그룹 또는 비환형 그룹일 수 있고; 바람직하게는, 사이클릭 그룹은 피롤리디닐, 피라졸리닐, 피라졸리디닐, 이미다졸리닐, 이미다졸리디닐, 피페리디닐, 피페라지닐, [1,3]디옥솔란, 옥사졸리디닐, 이속사졸리디닐, 모르폴리닐, 티아졸리디닐, 이소티아졸리디닐, 퀴녹살리닐, 피리다지노닐, 테트라하이드로푸릴 및 데칼린로부터 선택되고; 바람직하게는, 비환형 그룹은 세리놀 골격 또는 디에탄올아민 골격으로부터 선택된다.
특정 구체적 양태에서, 본 발명의 방법에 사용하기 위한 RNAi 제제는 표 2-5 및 7-10 중 어느 하나에 열거된 제제의 그룹으로부터 선택된 제제이다. 이들 제제는 하나 이상의 친유성 모이어티, 하나 이상의 GalNAc 유도체, 또는 하나 이상의 친유성 모이어티와 하나 이상의 GalNAc 유도체 둘 다와 같은 리간드를 추가로 포함할 수 있다.
IV. 리간드에 접합된 iRNA
본 발명의 iRNA의 RNA의 또 다른 변형은 iRNA의 활성, 세포 분포, 또는 예를 들어, iRNA의 세포로의 세포 흡수를 증진시키는 하나 이상의 리간드, 모이어티 또는 접합체를 iRNA에 화학적으로 연결하는 것을 포함한다. 상기 모이어티는 콜레스테롤 모이어티(참조: Letsinger et al., Proc. Natl. Acid. Sci. USA, 1989, 86: 6553-6556)와 같은 지질 모이어티, 콜산(참조: Manoharan et al., Biorg. Med. Chem. Let., 1994, 4:1053-1060), 티오에테르, 예를 들어, 베릴-S-트리틸티올(참조: Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660:306-309; Manoharan et al., Biorg. Med. Chem. Let., 1993, 3:2765-2770), 티오콜레스테롤(참조: Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20:533-538), 지방족 쇄, 예를 들어, 도데칸디올 또는 운데실 잔기(참조: Saison-Behmoaras et al., EMBO J, 1991, 10:1111-1118; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259:327-330; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75:49-54), 인지질, 예를 들어, 디-헥사데실-rac-글리세롤 또는 트리에틸-암모늄 1,2-디-O-헥사데실-rac-글리세로-3-포스포네이트(참조: Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651-3654; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18:3777-3783), 폴리아민 또는 폴리에틸렌 글리콜 쇄(참조: Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14:969-973), 또는 아다만탄 아세트산(참조: Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651-3654), 팔미틸 모이어티(참조: Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264:229-237), 또는 옥타데실아민 또는 헥실아미노-카보닐옥시콜레스테롤 모이어티 (참조: Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277:923-937)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
특정 양태에서, 리간드는 이것이 도입되는 iRNA 제제의 분포, 표적화 또는 수명을 변경시킨다. 일부 양태에서 리간드는 예를 들어, 리간드가 부재인 종과 비교하여 선택된 표적, 예를 들어 분자, 세포 또는 세포 유형, 구획, 예를 들어 세포 또는 기관 구획, 조직, 기관 또는 신체의 영역에 대해 증진된 친화성을 제공한다. 전형적인 리간드는 듀플렉스된 핵산에서 듀플렉스 쌍형성에 관여하지 않는다.
리간드는 단백질(예를 들어, 인간 혈청 알부민(HSA), 저밀도 지단백질(LDL) 또는 글로불린); 탄수화물(예를 들어, 덱스트란, 풀루란, 키틴, 키토산, 이눌린, 사이클로덱스트린 또는 히알루론산); 또는 지질과 같은 천연적으로 존재하는 물질을 포함할 수 있다. 리간드는 또한 합성 중합체, 예를 들어 합성 폴리아미노산과 같은 재조합 또는 합성 분자일 수 있다. 폴리아미노산의 예는 폴리라이신(PLL), 폴리　L-아스파르트산, 폴리 L-글루탐산, 스티렌-말레산 무수물 공중합체, 폴리(L-락타이드-코-글리콜화된) 공중합체, 디비닐 에테르-말레산 무수물 공중합체, N-(2-하이드록시프로필)메타크릴아미드 공중합체(HMPA), 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리비닐 알콜(PVA), 폴리우레탄, 폴리(2-에틸아크릴산), N-이소프로필아크릴아미드 중합체 또는 폴리포스파진을 포함한다. 폴리아민의 예는 다음을 포함한다: 폴리에틸렌이민, 폴리라이신(PLL), 스퍼민, 스퍼미딘, 폴리아민, 슈도펩타이드-폴리아민, 펩티도모사체 폴리아민, 덴드리머 폴리아민, 아르기닌, 아미딘, 프로타민, 양이온성 지질, 양이온성 포르피린, 폴리아민의 4급 염, 또는 α 나선 펩타이드.
리간드는 또한 표적화 그룹, 예를 들어, 세포 또는 조직 표적화제, 예를 들어, 렉틴, 당단백질, 지질 또는 단백질, 예를 들어, 신경교 세포와 같은 특정 세포 유형에 결합하는 항체를 포함할 수 있다. 표적화 그룹은 티로트로핀, 멜라노트로핀, 렉틴, 당단백질, 계면활성제 단백질 A, 뮤신 탄수화물, 다가 락토스, 다가 갈락토스, N-아세틸-갈락토스아민, N-아세틸-글루코사민 다가 만노스, 다가 푸코스, 글리코실화된 폴리아미노산, 다가 갈락토스, 트랜스페린, 비스포스포네이트, 폴리글루타메이트, 폴리아스파르테이트, 지질, 콜레스테롤, 스테로이드, 담즙산, 폴레이트, 비타민 B12, 비오틴, 또는 RGD 펩타이드 또는 RGD 펩타이드 모사체일 수 있다. 특정 양태에서, 리간드는 다가 갈락토스, 예를 들어, N-아세틸-갈락토사민이다.
리간드의 다른 예는 염료, 삽입제(예를 들어, 아크리딘), 가교 결합제(예를 들어, 소랄렌, 미토마이신 C), 포르피린(TPPC4, 텍사피린, 사피린), 폴리사이클릭 방향족 탄화수소(예를 들어, 페나진, 디하이드로페나진), 인공 엔도뉴클레아제(예를 들어, EDTA), 친지성 분자, 예를 들어, 콜레스테롤, 콜린산, 아다만탄 아세트산, 1-피렌 부티르산, 디하이드로테스토스테론, 1,3-비스-O(헥사데실)글리세롤, 게라닐옥시헥실 그룹, 헥사데실글리세롤, 보르네올, 멘톨, 1,3-프로판디올, 헵타데실 그룹, 팔미트산, 미리스트산, O3-(올레오일)리토콜산, O3-(올레오일)콜렌산, 디메톡시트리틸 또는 페녹사진) 및 펩타이드 접합체(예를 들어, 안테나페디아 펩타이드, Tat 펩타이드), 알킬화제, 포스페이트, 아미노, 머캅토, PEG(예를 들어, PEG-40K), MPEG, [MPEG]2, 폴리아미노, 알킬, 치환된 알킬, 방사성 표지된 마커, 효소, 합텐(예를 들어, 비오틴), 수송/흡수 촉진제(예를 들어, 아스피린, 비타민 E, 폴산), 합성 리보뉴클레아제(예를 들어, 이미다졸, 비심 이다졸, 히스타민, 이미다졸 클러스터, 아크리딘-이미다졸 접합체, 테트라아자마크로사이클의 Eu3+ 복합체), 디니트로페닐, HRP 또는 AP를 포함한다.
리간드는 단백질, 예를 들어, 당단백질, 또는 펩타이드, 예를 들어 공동-리간드에 대한 특이적 친화성을 갖는 분자, 또는 항체, 예를 들어, 뇌 세포 또는 신경교 세포와 같은 특정 세포 유형에 결합하는 항체일 수 있다. 리간드는 또한 호르몬 및 호르몬 수용체를 포함할 수 있다. 이들은 또한 비-펩타이드 종, 예를 들어, 지질, 렉틴, 탄수화물, 비타민, 조인자, 다가 락토스, 다가 갈락토스, N-아세틸-갈락토사민, N-아세틸-글루코사민 다가 만노스 또는 다가 푸코스를 포함할 수 있다. 리간드는 예를 들어 리포폴리사카라이드, p38 MAP 키나제의 활성화제 또는 NF-κB의 활성화제일 수 있다.
리간드는, 예를 들어 세포의 세포골격을 붕괴시킴으로써, 예를 들어, 세포의 미세소관, 마이크로필라멘트 또는 중간 필라멘트를 붕괴시킴으로써 iRNA 제제의 세포로의 흡수를 증가시킬 수 있는 물질, 예를 들어 약물일 수 있다. 약물은, 예를 들어 탁손, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 사이토칼라신, 노코다졸, 자플라키놀리드, 라트룬쿨린 A, 팔로이딘, 스윈홀리드 A, 인다노신 또는 미오세르빈일 수 있다.
일부 양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 iRNA에 부착된 리간드는 약동학적 조절제(PK 조절제)로서 작용한다. PK 조절제는 친유성체, 담즙산, 스테로이드, 인지질 유사체, 펩타이드, 단백질 결합제, PEG, 비타민 등을 포함한다. 예시적인 PK 조절제는 콜레스테롤, 지방산, 콜산, 리토콜산, 디알킬글리세리드, 디아실글리세리드, 인지질, 스핑고지질, 나프록센, 이부프로펜, 비타민 E, 비오틴 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 다수의 포스포로티오에이트 연결을 포함하는 올리고뉴클레오타이드는 또한 혈청 단백질에 결합하는 것으로 공지되어 있고, 따라서, 짧은 올리고뉴클레오타이드, 예를 들어, 골격 내 다수의 포스포로티오에이트 연결을 포함하는 약 5개 염기, 10개 염기, 15개 염기 또는 20개 염기의 올리고뉴클레오티드도 본 발명에 리간드로서(예를 들어, PK 조절 리간드로서) 적용될 수 있다. 추가로, 혈청 성분 (예를 들어, 혈청 단백질)에 결합하는 압타머는 또한 본원에 기재된 양태에서 PK 조절 리간드로서 사용하기 위해 적합하다.
본 발명의 리간드-접합된 iRNA는 올리고뉴클레오타이드 상으로 연결 분자의 부착으로부터 유래된 것과 같은 펜던트 관능기를 함유한 올리고뉴클레오타이드의 사용에 의해 합성될 수 있다. 상기 반응성 올리고뉴클레오타이드는 상업적으로 가용한 리간드, 임의의 다양한 보호기를 보유하는 합성된 리간드, 또는 이에 부착된 연결 모이어티를 갖는 리간드와 직접 반응할 수 있다.
본 발명의 접합체에 사용되는 올리고뉴클레오타이드는 널리 공지된 고체상 합성 기술을 통해 편리하고 통상적으로 제조될 수 있다. 상기 합성을 위한 기구는 여러 판매업자에 의해 시판되고 있고, 예를 들어, Applied Biosystems®(Foster City, Calif.)을 포함한다. 당업계에 공지된 상기 합성을 위한 임의의 다른 수단은 추가로 또는 대안적으로 사용될 수 있다. 또한 다른 올리고뉴클레오타이드, 예를 들어, 포스포로티오에이트 및 알킬화된 유도체를 제조하기 위한 유사한 기술을 사용하는 것이 공지되어 있다.
본 발명의 리간드-접합된 올리고뉴클레오타이드 및 리간드-분자 보유 서열-특이적 연결된 뉴클레오사이드에서, 올리고뉴클레오타이드 및 올리고뉴클레오사이드는 표준 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오사이드 전구체, 또는 이미 연결 모이어티를 보유하는 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오사이드 접합 전구체, 이미 리간드 분자를 보유하는 리간드-뉴클레오타이드 또는 뉴클레오사이드-접합체 전구체, 또는 비-뉴클레오사이드 리간드-보유 빌딩 블록을 사용하여 적합한 DNA 합성기 상에서 제조될 수 있다.
이미 연결 모이어티를 보유하는 뉴클레오타이드-접합체 전구체를 사용하는 경우, 서열 특이적 연결된 뉴클레오사이드의 합성은 전형적으로 완료되고 리간드 분자는 연결 오이어티와 반응하여 리간드-접합 올리고뉴클레오타이드를 형성한다. 일부 양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 또는 연결된 뉴클레오사이드는 상업적으로 입수가능하고 올리고뉴클레오타이드 합성에 통상적으로 사용되는 표준 포스포르아미디트 및 비표준 포스포르아미디트에 추가하여 리간드-뉴클레오사이드 접합체로부터 유래된 포스포르아미디트를 사용하여 자동화된 합성기에 의해 합성된다.
A. 지질 접합체
특정 양태에서, 리간드 또는 접합체는 지질 또는 지질 기반 분자이다. 상기 지질 또는 지질 기반 분자는 전형적으로 혈청 단백질, 예를 들어 인간 혈청 알부민(HSA)에 결합할 수 있다. HSA 결합 리간드는 표적 조직, 예를 들어 신체의 비-콩팥 표적 조직으로의 접합체의 분포를 가능하게 한다. 예를 들어, 표적 조직은 간의 실질 세포를 포함하는 간일 수 있다. HSA에 결합할 수 있는 다른 분자는 또한 리간드로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 나프록센 또는 아스피린이 사용될 수 있다. 지질 또는 지질-기반 리간드는 (a) 접합체의 분해에 대한 내성을 증가시킬 수 있거나, (b) 표적 세포 또는 세포막으로의 표적화 또는 수송을 증가시킬 수 있거나, (c) 혈청 단백질, 예를 들어, HSA로의 결합을 조정하기 위해 사용될 수 있다.
지질 기반 리간드를 사용하여 접합체의 표적 조직으로의 결합을 조절, 예를 들어, 제어(예를 들어, 억제)할 수 있다. 예를 들어, 보다 강하게 HSA에 결합하는 지질 또는 지질 기반 리간드는 콩팥으로 표적화될 가능성이 적고 따라서 신체로부터 제거될 가능성이 적다. HSA에 덜 강하게 결합하는 지질 또는 지질 기반 리간드를 사용하여 접합체를 콩팥에 표적화시킬 수 있다.
특정 양태에서, 지질 기반 리간드는 HSA에 결합한다. 예를 들어, 리간드는 충분한 친화성으로 HSA에 결합하여 비-콩팥 조직으로의 접합체의 분포는 증진될 수 있다. 그러나, 친화성은 전형적으로 HSA-리간드 결합이 역행될 수 없을 정도로 강하지 않다.
특정 양태에서, 지질 기반 리간드는 HSA에 약하게 결합하거나 전혀 결합하지 않아 접합체의 콩팥으로의 분포는 증진된다. 콩팥 세포에 표적화하는 다른 모이어티는 또한 지질 기반 리간드 대신에 또는 이에 추가로 사용될 수 있다.
특정 양태에서, 지질 기반 리간드는 HSA에 약하게 결합하거나 전혀 결합하지 않아 접합체의 콩팥으로의 분포는 증진된다. 콩팥 세포에 표적화하는 다른 모이어티는 또한 지질 기반 리간드 대신에 또는 이에 추가로 사용될 수 있다.
또 다른 양상에서, 리간드는 모이어티, 예를 들어, 표적 세포, 예를 들어, 증식 세포에 의해 흡수되는 비타민이다. 이들은 특히 예를 들어 악성 또는 비악성 유형의 원치 않는 세포 증식을 특징으로 하는 장애, 예를 들어 암세포를 치료하는 데 유용하다. 예시적인 비타민은 비타민 A, E, 및 K를 포함한다. 다른 예시적인 비타민은 B 비타민, 예를 들어, 폴산, B12, 리보플라빈, 비오틴, 피리독살 또는 암 세포에 의해 흡수되는 다른 비타민 또는 영양물을 포함한다. 또한 HSA 및 저밀도 지단백질(LDL)이 포함된다.
B. 세포 투과 제제
또 다른 양상에서, 리간드는 세포 투과 제제, 예를 들어 나선 세포 투과 제제이다. 특정 양태에서, 상기 제제는 양친매성이다. 예시적인 제제는 tat 또는 안테노페디아와 같은 펩타이드이다. 제제가 펩타이드인 경우, 이는 펩티딜모사체, 인버토머, 비펩타이드 또는 슈도-펩타이드 연결 및 D-아미노산의 사용을 포함하여 변형될 수 있다. 나선 제제는 전형적으로 α-나선 제제이고 친유성 및 소유성(lipophobic) 상을 가질 수 있다.
리간드는 펩타이드 또는 펩티도모사체일 수 있다. 펩티도모사체 (또한 본원에서 올리고펩티도모사체)는 천연 펩타이드와 유사한 한정된 3차원 구조로 폴딩할 수 있는 분자이다. iRNA 제제로의 펩타이드 및 펩티도모사체의 접착은 예를 들어, 세포 인지 및 흡착을 증진시킴에 의해 iRNA의 약동학적 분포에 영향을 미칠 수 있다. 펩타이드 또는 펩티도모사체 모이어티는 약 5-50개 아미노산 길이, 예를 들어, 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50개 아미노산 길이일 수 있다.
펩타이드 또는 펩티도모사체는 예를 들어, 세포 투과 펩타이드, 양이온성 펩타이드, 양친매성 펩타이드 또는 소수성 펩타이드(예를 들어, 주로 Tyr, Trp, 또는 Phe로 이루어진)일 수 있다. 펩타이드 모사체는 덴드리머 펩타이드, 속박된 펩타이드 또는 가교결합된 펩타이드일 수 있다. 또 다른 대안에서, 펩타이드 모이어티는 소수성 막 전좌 서열(MTS)을 포함할 수 있다. 예시적인 소수성 MTS-함유 펩타이드는 아미노산 서열 AAVALLPAVLLALLAP(서열번호 11)를 갖는 RFGF이다. 소수성 MTS를 함유하는 RFGF 유사체(예를 들어, 아미노산 서열 AALLPVLLAAP(서열번호 12))은 또한 표적화 모이어티일 수 있다. 펩타이드 모이어티는 세포막에 걸쳐 펩타이드, 올리고뉴클레오타이드 및 단백질을 포함하는 대형 극성 분자를 운반할 수 있는 "전달" 펩타이드일 수 있다. 예를 들어, HIV Tat 단백질로부터의 서열 (GRKKRRQRRRPPQ (서열번호 13)) 및 드로소필라 안테나페디아(Drosophila Antennapedia) 단백질(RQIKIWFQNRRMKWKK (서열번호 14))는 전달 펩타이드로서 기능할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 펩타이드 또는 펩티도모사체는 DNA의 무작위 서열에 의해 암호화될 수 있고, 예를 들어, 파아지-디스플레이 라이브러리 또는 하나-비드-하나-화합물(OBOC) 조합 라이브러리로 부터 동정된 펩타이드이다(참조: Lam et al., Nature, 354:82-84, 1991). 전형적으로, 혼입된 단량체 유닛을 통한 dsRNA 제제에 테더링된 펩타이드 또는 펩티도모사체는 아르기닌-글라이신-아스파르트산 (RGD)-펩타이드 또는 RGD 모사체와 같은 세포 표적화 펩타이드이다. 펩타이드 모이어티는 길이가 약 5개 아미노산 내지 약 40개 아미노산 범위일 수 있다. 펩타이드 모이어티는 예를 들어, 안정성을 증가시키거나 형태적 성질을 지시하기 위해 구조적 변형을 가질 수 있다. 하기된 임의의 구조적 변형이 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물 및 방법에 사용하기 위한 RGD 펩타이드는 선형 또는 사이클릭일 수 있고, 변형되어, 예를 들어, 글리코실화되거나 메틸화되어 특이적 조직(들)로의 표적화를 촉진시킬 수 있다. RGD-함유 펩타이드 및 펩티도모사체는 합성 RGD 모사체 뿐만 아니라 D-아미노산을 포함할 수 있다. RGD에 추가로, 당업자는 인테그린 리간드를 표적화하는 다른 모이어티를 사용할 수 있다. 상기 리간드의 바람직한 접합체는 PECAM-1 또는 VEGF를 표적화한다.
RGD 펩타이드 모이어티를 사용하여 특정 세포 유형, 예를 들어, 종양 세포, 예를 들어, 내피 종양 세포 또는 유방암 종양 세포를 표적화할 수 있다(참조: Zitzmann et al., Cancer Res., 62:5139-43, 2002). RGD 펩타이드는 폐, 콩팥, 비장 또는 간을 포함하는 다양한 다른 조직의 종양으로 dsRNA 제제의 표적화를 용이하게 할 수 있다(참조: Aoki et al., Cancer Gene Therapy 8:783-787, 2001). 전형적으로, RGD 펩타이드는 iRNA 제제의 콩팥으로의 표적화를 용이하게 한다. RGD 펩타이드는 선형 또는 사이클릭일 수 있고, 특이적 조직으로의 표적화를 용이하게 하기 위해 변형, 예를 들어, 당화 또는 메틸화될 수 있다. 예를 들어, 당화된 RGD 펩타이드는 iRNA 제제를 αVß3을 발현하는 종양 세포로 전달할 수 있다(참조: Haubner et al., Jour. Nucl. Med., 42:326-336, 2001).
"세포 투과 펩타이드"는 세포, 예를 들어, 미생물 세포, 예를 들어, 세균 또는 진균류 세포 또는 포유동물 세포, 예를 들어, 인간 세포를 투과할 수 있다. 미생물 세포-투과 펩타이드는 예를 들어, α-나선 선형 펩타이드(예를 들어, LL-37 또는 세로핀 P1), 디설파이드 결합-함유 펩타이드(예를 들어, α -데펜신, β-데페닌 또는 박테네신), 또는 단지 하나 또는 2개의 주요 아미노산을 함유하는 펩타이드(예를 들어, PR-39 또는 인돌리시딘)일 수 있다. 세포 투과 펩타이드는 또한 핵 국소화 신호 (NLS)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 세포 투과 펩타이드는 HIV-1 gp41의 융합 펩타이드 도메인 및 SV40 대형 T 항원의 NLS로부터 유래된 MPG와 같은 이분형 양친매성 펩타이드일 수 있다(참조: Simeoni et al., Nucl. Acids Res. 31:2717-2724, 2003).
C. 탄수화물 접합체
본 발명의 조성물 및 방법의 일부 양태에서, iRNA는 추가로 탄수화물을 포함한다. 탄수화물 접합된 iRNA는 본원에 기재된 바와 같이 생체내 치료학적 사용을 위해 적합한 조성물 뿐만 아니라 핵산의 생체내 전달을 위해 유리하다. 본원에 사용된 바와 같은, "탄수화물"은 각각의 탄소 원자에 결합된 산소, 질소 또는 황 원자와 함께 적어도 6개의 탄소 원자를 갖는 하나 이상의 모노사카라이드 유닛(선형, 측쇄 또는 사이클릭일 수 있는)으로 구성된 탄수화물 자체인 화합물; 또는 각각의 탄소원자에 결합된 산소, 질소 또는 황 원자와 함께 각각 어도 6개 탄소 원자를 갖는 하나 이상의 모노사카라이드 유닛(선형, 측쇄 또는 사이클릭일 수 있는)으로 구성된 탄수화물 모이어티를 일부로서 갖는 화합물을 언급한다. 대표적인 탄수화물은 당 (모노-, 디-, 트리-, 및 약 4, 5, 6, 7, 8 또는 9개의 모노사카라이드 유닛을 함유하는 올리고사카라이드) 및 폴리사카라이드, 예를 들어, 전분, 글리코겐, 셀룰로스 및 폴리사카라이드 검을 포함한다. 특이적 모노사카라이드는 C5 이상(예를 들어, C5, C6, C7, 또는 C8) 당을 포함하고; 디사카라이드 및 트리사카라이드는 2개 또는 3개의 모노사카라이드 유닛(예를 들어, C5, C6, C7, 또는 C8)을 갖는 당을 포함한다.
특정 양태에서, 탄수화물 접합체는 모노사카라이드를 포함한다.
특정 양태에서, 모노사카라이드는 N-아세틸갈락토사민(GalNAc)이다. 하나 이상의 N-아세틸갈락토스아민(GalNAc) 유도체를 포함하는 GalNAc 접합체는 예를 들어, US 8,106,022에 기재되어 있고, 이의 전문은 본원에 참조로 포함된다. 일부 양태에서, GalNAc 접합체는 iRNA를 특정 세포로 표적화하는 리간드로서 작용한다. 일부 양태에서, GalNAc 접합체는 예를 들어, 간 세포(예를 들어, 간 세포 (hepatocyte))의 아시알로당단백질(asialoglycoprotein) 수용체에 대해 리간드로서 작용함에 의해 iRNA를 간 세포로 표적화한다.
일부 양태에서, 탄수화물 접합체는 하나 이상의 GalNAc 유도체를 포함한다. GalNAc 유도체는 링커, 예를 들어, 2가 또는 3가 측쇄 링커를 통해 부착될 수 있다. 일부 양태에서, GalNAc 접합체는 센스 가닥의 3' 말단에 접합된다. 일부 양태에서, GalNAc 접합체는 링커, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 링커를 통해 iRNA 제제에(예를 들어, 센스 가닥의 3' 말단에) 접합된다. 일부 양태에서, GalNAc 접합체는 센스 가닥의 5' 말단에 접합된다. 일부 양태에서, GalNAc 접합체는 링커, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 링커를 통해 iRNA 제제에(예를 들어, 센스 가닥의 5' 말단에) 접합된다.
본 발명의 특정 양태에서, GalNAc 또는 GalNAc 유도체는 1가 링커를 통해 본 발명의 iRNA 제제에 부착된다. 일부 양태에서, GalNAc 또는 GalNAc 유도체는 2가 링커를 통해 본 발명의 iRNA 제제에 부착된다. 본 발명의 또 다른 양태에서, GalNAc 또는 GalNAc 유도체는 3가 링커를 통해 본 발명의 iRNA 제제에 부착된다. 본 발명의 다른 구현에에서, GalNAc 또는 GalNAc 유도체는 4가 링커를 통해 본 발명의 iRNA 제제에 부착된다.
특정 양태에서, 본 발명의 이중 가닥 RNAi 제제는 iRNA 제제에 부착된 하나의 GalNAc 또는 GalNAc 유도체를 포함한다. 특정 양태에서, 본 발명의 이중 가닥 RNAi 제제는 다수의 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 또는 6개) GalNAc 또는 GalNAc 유도체를 포함하고, 각각은 독립적으로 다수의 1가 링커를 통해 이중 가닥 RNAi 제제의 다수의 뉴클레오타이드에 부착되어 있다.
일부 양태에서, 예를 들어, 본 발명의 iRNA 제제의 2개의 가닥이 한 가닥의 3'-말단과 각각의 다른 가닥의 5'-말단 사이에 중단되지 않은 뉴클레오타이드 쇄에 의해 연결되어 다수의 쌍을 형성하지 않은 뉴클레오타이드를 포함하는 헤어핀 루프를 형성하는 하나의 더 큰 분자의 일부인 경우, 헤어핀 루프 내의 각각의 쌍을 형성하지 않은 뉴클레오타이드는 1가 링커를 통해 부착된 GalNAc 또는 GalNAc 유도체를 독립적으로 포함할 수 있다. 헤어핀 루프는 또한 듀플렉스의 하나의 가닥에 연장된 오버행에 의해 형성될 수 있다.
일부 양태에서, 예를 들어, 본 발명의 iRNA 제제의 2개의 가닥이 한 가닥의 3'-말단과 각각의 다른 가닥의 5'-말단 사이에 중단되지 않은 뉴클레오타이드 쇄에 의해 연결되어 다수의 쌍을 형성하지 않은 뉴클레오타이드를 포함하는 헤어핀 루프를 형성하는 하나의 더 큰 분자의 일부인 경우, 헤어핀 루프 내의 각각의 쌍을 형성하지 않은 뉴클레오타이드는 1가 링커를 통해 부착된 GalNAc 또는 GalNAc 유도체를 독립적으로 포함할 수 있다. 헤어핀 루프는 또한 듀플렉스의 하나의 가닥에 연장된 오버행에 의해 형성될 수 있다.
일부 양태에서, GalNAc 접합체는 하기 화합물이다:
Figure pct00053
화학식 II
일부 양태에서, RNAi 제제는 하기의 도식에 나타낸 바와 같이 링커를 통해 탄수화물 접합체에 부착되고, 여기서 X는 O 또는 S이다:
Figure pct00054
일부 양태에서, RNAi 제제는 표 1에 정의된 바와 같이 L96에 접합되고 하기에 나타낸다:
Figure pct00055
특정 양태에서, 본 발명의 조성물 및 방법에 사용하기 위한 탄수화물 접합체는 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된다:
Figure pct00056
화학식 II
Figure pct00057
화학식 III
Figure pct00058
화학식 IV
Figure pct00059
화학식 V
Figure pct00060
화학식 VI
Figure pct00061
화학식 VII
Figure pct00062
화학식 VIII
Figure pct00063
화학식 IX
Figure pct00064
화학식 X
Figure pct00065
화학식 XI
Figure pct00066
화학식 XII
Figure pct00067
화학식 XIII
Figure pct00068
화학식 XIV
Figure pct00069
화학식 XV
Figure pct00070
화학식 XVI
Figure pct00071
화학식 XVII
Figure pct00072
화학식 XVIII
Figure pct00073
화학식 XIX
Figure pct00074
화학식 XX
Figure pct00075
화학식 XXI
Figure pct00076
화학식 XXII
Figure pct00077
화학식 XXIII
Figure pct00078
화학식 XXIV (여기서, Y는 O 또는 S이고, n은 3 내지 6이다)
Figure pct00079
화학식 XXV (여기서, Y는 O 또는 S이고, n은 3 내지 6이다)
Figure pct00080
화학식 XXVI;
Figure pct00081
화학식 XXVII (여기서, X는 O 또는 S이다)
Figure pct00082
Figure pct00083
화학식 XXVII; 화학식 XXIX;
Figure pct00084
Figure pct00085
화학식 XXX; 화학식 XXXI;
Figure pct00086
, 및
Figure pct00087
화학식 XXXII; 화학식 XXXIII
Figure pct00088
화학식 XXXIV
특정 양태에서, 본 발명의 조성물 및 방법에 사용하기 위한 탄수화물 접합체는 모노사카라이드이다. 특정 양태에서, 모노사카라이드는 N-아세틸갈락토사민, 예를 들어,
Figure pct00089
화학식 II
본원에 기재된 양태에 사용하기 위한 또 다른 대표적인 탄수화물 접합체는 다음을 포함하지만 이에 제한되지 않는다:
Figure pct00090
(화학식 XXXVI)
X 또는 Y 중 하나가 올리고뉴클레오타이드인 경우, 다른 하나는 수소이다.
일부 양태에서, 적합한 리간드는 이의 전문이 본원에 참조로 포함된 WO 2019/055633에 기재된 리간드이다. 일양태에서, 리간드는 하기의 구조를 포함한다:
Figure pct00091
특정 양태에서, 본원 개시내용의 RNAi 제제는 상기 GalNAc 리간드가 현재 본원 개시내용의 바람직한 척수강내/CNS 전달 경로(들)에 대해 제한된 값인 것으로 계획되어 있지만 GalNAc 리간드를 포함할 수 있다.
본 발명의 특정 양태에서, GalNAc 또는 GalNAc 유도체는 1가 링커를 통해 본 발명의 iRNA 제제에 부착된다. 일부 양태에서, GalNAc 또는 GalNAc 유도체는 2가 링커를 통해 본 발명의 iRNA 제제에 부착된다. 본 발명의 또 다른 양태에서, GalNAc 또는 GalNAc 유도체는 3가 링커를 통해 본 발명의 iRNA 제제에 부착된다. 본 발명의 다른 구현에에서, GalNAc 또는 GalNAc 유도체는 4가 링커를 통해 본 발명의 iRNA 제제에 부착된다.
특정 양태에서, 본 발명의 이중 가닥 RNAi 제제는 iRNA 제제, 예를 들어 dsRNA 제제의 센스 가닥의 5' 말단, 또는 본원에 기재된 바와 같은 이중 표적화 RNAi 제제의 하나 또는 둘 다의 센스 가닥의 5' 말단에 부착된 하나의 GalNAc 또는 GalNAc 유도체를 포함한다. 특정 양태에서, 본 발명의 이중 가닥 RNAi 제제는 다수의 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 또는 6개) GalNAc 또는 GalNAc 유도체를 포함하고, 각각은 독립적으로 다수의 1가 링커를 통해 이중 가닥 RNAi 제제의 다수의 뉴클레오타이드에 부착되어 있다.
일부 양태에서, 예를 들어, 본 발명의 iRNA 제제의 2개의 가닥이 한 가닥의 3'-말단과 각각의 다른 가닥의 5'-말단 사이에 중단되지 않은 뉴클레오타이드 쇄에 의해 연결되어 다수의 쌍을 형성하지 않은 뉴클레오타이드를 포함하는 헤어핀 루프를 형성하는 하나의 더 큰 분자의 일부인 경우, 헤어핀 루프 내의 각각의 쌍을 형성하지 않은 뉴클레오타이드는 1가 링커를 통해 부착된 GalNAc 또는 GalNAc 유도체를 독립적으로 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 탄수화물 접합체는 추가로 상기된 바와 같은 하나 이상의 추가의 리간드, 이에 제한되지 않지만 예를 들어, PK 조절제 또는 세포 투과 펩타이드를 포함한다.
본 발명에 사용하기 위해 적합한 추가의 탄수화물 접합체 및 링커는 WO 2014/179620 및 WO 2014/179627에 기재된 것들을 포함하고, 이의 각각의 전문은 본원에 참조로 포함된다.
D. 링커
일부 양태에서, 본원에 기재된 접합체 또는 리간드는 절단될 수 있거나 절단되지 않을 수 있는 다양한 링커를 사용하여 iRNA 올리고뉴클레오타이드에 부착될 수 있다.
용어 "링커" 또는 "연결 그룹"은 화합물의 두 부분을 연결하는, 예를 들어 화합물의 두 부분을 공유적으로 부착시키는 유기 모이어티를 의미한다. 링커는 전형적으로 직접적인 결합 또는 산소 또는 황과 같은 원자, 유닛, 예를 들어 NR8, C(O), C(O)NH, SO, SO2, SO2NH 또는 원자 쇄를 포함하고, 이제 제한되지 않지만 예를 들어, 치환되거나 비치환된 알킬, 치환되거나 비치환된 알케닐, 치환되거나 비치환된 알키닐, 아릴알킬, 아릴알케닐, 아릴알키닐, 헤테로아릴알킬, 헤테로아릴알케닐, 헤테로아릴알키닐, 헤테로사이클릴알킬, 헤테로사이클릴알케닐, 헤테로사이클릴알키닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로사이클릴, 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 알킬아릴알킬, 알킬아릴알케닐, 알킬아릴알키닐, 알케닐아릴알킬, 알케닐아릴알케닐, 알케닐아릴알키닐, 알키닐아릴알킬, 알키닐아릴알케닐, 알키닐아릴알키닐, 알킬헤테로아릴알킬, 알킬헤테로아릴알케닐, 알킬헤테로아릴알키닐, 알케닐헤테로아릴알킬, 알케닐헤테로아릴알케닐, 알케닐헤테로아릴알키닐, 알키닐헤테로아릴알킬, 알키닐헤테로아릴알케닐, 알키닐헤테로아릴알키닐, 알킬헤테로사이클릴알킬, 알킬헤테로사이클릴알케닐, 알킬헤테로사이클릴알키닐, 알케닐헤테로사이클릴알킬, 알케닐헤테로사이클릴알케닐, 알케닐헤테로사이클릴알키닐, 알키닐헤테로사이클릴알킬, 알키닐헤테로사이클릴알케닐, 알키닐헤테로사이클릴알키닐, 알킬아릴, 알케닐아릴, 알키닐아릴, 알킬헤테로아릴, 알케닐헤테로아릴, 알키닐헤테로아릴를 포함하고, 여기서 하나 이상의 메틸렌은 O, S, S(O), SO2, N(R8), C(O), 치환되거나 비치환된 아릴, 치환되거나 비치환된 헤테로아릴, 또는 치환되거나 비치환된 헤테로사이클릭에 의해 중단되거나 말단화될 수 있고; 여기서, R8은 수소, 아실, 지방족 또는 치환된 지방족이다. 특정 양태에서, 링커는 약 1-24개 원자, 2-24, 3-24, 4-24, 5-24, 6-24, 6-18, 7-18, 8-18개 원자, 7-17, 8-17, 6-16, 7-17, 또는 8-16개 원자이다.
절단 가능한 연결 그룹은 세포 외부에서 충분히 안정할 수 있지만 표적 세포로 진입이 절단되어 링커가 함께 유지하고 있는 2개의 부분을 방출시키는 그룹이다. 바람직한 양태에서, 절단 가능한 연결 그룹은 대상체의 혈액에서 또는 제2 참조 조건 (예를 들어, 혈액 또는 혈청 중에서 발견되는 조건을 모방하거나 나타내는 것으로 선택될 수 있는) 하에 보다 표적 세포에서 또는 제1 참조 조건 (예를 들어, 세포내 조건을 모방하거나 나타내도록 선택될 수 있는)하에서 적어도 약 10배, 20배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배 이상 또는 적어도 약 100배 신속하게 절단된다.
절단 가능한 연결 그룹은 절단제, 예를 들어, pH, 산화환원 전위 또는 분해 분자의 존재에 민감할 수 있다. 일반적으로, 절단제는 혈청 또는 혈액에서 보다 세포 내부에서 보다 높은 수준 또는 활성인 상태로 보다 만연되어 있거나 발견된다. 상기 분해제의 예는 다음을 포함한다: 특정 기질에 대해 선택되거나 어떠한 기질 특이성을 갖지 않는 산화환원제로서, 이는 예를 들어, 산화 또는 환원 효소 또는 환원제, 예를 들어, 환원에 의해 산화환원 절단 가능한 연결 그룹을 분해시킬 수 있는 세포에 존재하는 머캅탄을 포함하는 산화환원제; 에스테라제; 엔도좀 또는 산성 환경을 생성시킬 수 있는 제제, 예를 들어, 5 이하의 pH를 유도하는 것들; 일반산으로서 작용함에 의해 산 절단 가능한 연결 그룹을 가수분해시키거나 분해할 수 있는 효소, 펩티다제(이는 기질 특이적일 수 있다), 및 포스파타제.
절단 가능한 연결 그룹, 예를 들어, 디설파이드 결합은 pH에 민감할 수 있다. 인간 혈청의 pH는 7.4이고, 평균 세포내 pH는 약간 보다 낮아 약 7.1-7.3이다. 엔도좀은 5.5-6.0의 범위에서 보다 산성의 pH를 갖고, 리소좀은 약 5.0에서 심지어 보다 산성의 pH를 갖는다. 일부 링커는 바람직한 pH에서 절단되어 세포 내부의 리간드로부터 양이온성 지질을 방출하거나 세포의 목적하는 구획으로 양이온성 지질을 방출하는 절단 가능한 연결 그룹을 갖는다.
링커는 특정 효소에 의해 절단될 수 있는 절단 가능한 연결 그룹을 포함할 수 있다. 링커로 혼입된 절단 가능한 연결 그룹의 유형은 표적화될 세포에 의존할 수 있다. 예를 들어, 간-표적화 리간드는 에스테르 그룹을 포함하는 링커를 통해 양이온성 지질에 연결될 수 있다. 간 세포에는 에스테라제가 풍부하고, 따라서 링커는 에스테라제가 풍부하지 않은 세포 유형에서 보다 간 세포에서 보다 효율적으로 절단된다. 에스테라제가 풍부한 다른 세포 유형은 폐, 신피질 및 고환의 세포를 포함한다.
펩타이드 결합을 함유하는 링커는 간 세포 및 활막세포와 같은 펩티다제가 풍부한 세포 유형을 표적화하는 경우 사용될 수 있다.
일반적으로, 후보 절단 가능한 연결 그룹의 적합성은 후보 연결 그룹을 절단하는 분해제(또는 조건)의 능력을 시험함으로써 평가될 수 있다. 또한 혈액 내에서 또는 다른 비표적 조직과 접촉할 때 절단에 저항하는 능력에 대해 후보 절단 가능한 연결 그룹을 테스트하는 것이 바람직할 수 있다. 따라서, 당업자는 제1 조건과 제2 조건 사이의 절단에 대한 상대적인 감수성을 결정할 수 있고, 여기서 제1 조건은 표적 세포에서 절단을 나타내도록 선택되고, 제2 조건은 다른 조직 또는 생물학적 유체, 예를 들어 혈액 또는 혈청 내 절단을 나타내도록 선택된다. 평가는 무세포 시스템, 세포, 세포 배양물, 기관 또는 조직 배양물 또는 전체 동물에서 수행될 수 있다. 무세포 또는 배양 조건에서 초기 평가를 수행하고 전체 동물에서 추가의 평가에 의해 확인하기 위해 유용할 수 있다. 바람직한 양태에서, 유용한 후보 화합물은 혈액 또는 혈청 (또는 세포외 조건을 모방하도록 선택된 시험관내 조건 하에)과 비교하여 세포(또는 세포내 조건을 모방하도록 선택된 시험관내 조건 하에)에서 적어도 약 2, 4, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 약 100배 이상 신속하게 절단된다.
i. 산화환원 절단 가능한 연결 그룹
특정 양태에서, 절단 가능한 연결 그룹은 환원 또는 산화시 절단되는 산화환원 절단 가능한 연결 그룹이다. 환원 절단 가능한 연결 그룹의 예는 디설파이드 연결 그룹(-S-S-)이다. 후보 절단 가능한 연결 그룹이 적합한 "환원적으로 절단 가능한 연결 그룹"인지 또는 예를 들어 특정 iRNA 모이어티 및 특정 표적화제와 함께 사용하기에 적합한지의 여부를 결정하기 위해, 당업자는 본원에 기재된 방법을 살펴볼 수 있다. 예를 들어, 후보물은 세포, 예를 들어 표적 세포에서 관찰되는 절단 속도를 모방하는 당업계에 공지된 시약을 사용하여 디티오트레이톨(DTT) 또는 기타 환원제를 사용한 항온처리에 의해 평가될 수 있다. 후보물은 또한 혈액 또는 혈청 조건을 모방하도록 선택된 조건 하에서 평가될 수 있다. 하나에서, 후보 화합물은 혈액에서 최대 약 10%까지 절단된다. 다른 양태에서, 유용한 후보 화합물은 혈액 (또는 세포외 조건을 모방하도록 선택된 시험관내 조건 하에)과 비교하여 세포 (또는 세포내 조건을 모방하도록 선택된 시험관내 조건 하에)에서 적어도 약 2, 4, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 약 100배 보다 신속하게 분해된다. 후보 화합물의 절단 속도는 세포내 배지를 모방하도록 선택된 조건 및 세포외 배지를 모방하도록 선택된 조건과 비교하여 표준 효소 동역학 검정을 사용하여 결정될 수 있다.
ii. 포스페이트 기반 절단 가능한 연결 그룹
특정 양태에서, 절단 가능한 링커는 포스페이트 기반 절단 가능한 연결 그룹을 포함한다. 포스페이트 기반 절단 가능한 연결 그룹은 포스페이트 그룹을 분해하거나 가수분해하는 제제에 의해 절단된다. 세포에서 포스페이트 그룹을 절단하는 제제의 예는 세포 내 포스파타제와 같은 효소이다. 포스페이트 기반 연결 그룹의 예는 -O-P(O)(ORk)-O-, -O-P(S)(ORk)-O-, -O-P(S)(SRk)-O-, -S-P(O)(ORk)-O-, -O-P(O)(ORk)-S-, -S-P(O)(ORk)-S-, -O-P(S)(ORk)-S-, -S-P(S)(ORk)-O-, -O-P(O)(Rk)-O-, -O-P(S)(Rk)-O-, -S-P(O)(Rk)-O-, -S-P(S)(Rk)-O-, -S-P(O)(Rk)-S-, -O-P(S)( Rk)-S-이다. 예시적인 양태는 -O-P(O)(OH)-O-, -O-P(S)(OH)-O-, -O-P(S)(SH)-O-, -S-P(O)(OH)-O-, -O-P(O)(OH)-S-, -S-P(O)(OH)-S-, -O-P(S)(OH)-S-, -S-P(S)(OH)-O-, -O-P(O)(H)-O-, -O-P(S)(H)-O-, -S-P(O)(H)-O, -S-P(S)(H)-O-, -S-P(O)(H)-S-, 및 -O-P(S)(H)-S-이고. 여기서, 각각의 존재에서 Rk는 독립적으로, C1-C20 알킬, C1-C20 할로알킬, C6-C10 아릴 또는 C7-C12 아르알킬일 수 있다. 특정 바람직한 양태에서, 포스페이트 기반 연결 그룹은 -O-P(O)(OH)-O-이다. 이들 후보물은 상기된 것들과 유사한 방법을 사용하여 평가될 수 있다.
iii. 산 절단 가능한 연결 그룹
특정 양태에서, 절단 가능한 링커는 산 절단 가능한 연결 그룹을 포함한다. 산 절단 가능한 연결 그룹은 산성 조건 하에 절단되는 연결 그룹이다. 바람직한 양태에서, 산 절단 가능한 연결 그룹은 pH가 약 6.5 이하(예를 들어, 약 6.0, 5,75, 5.5, 5.25, 5.0 이하)인 산성 환경에서 또는 일반 산으로서 작용할 수 있는 효소와 같은 제제에 의해 절단된다. 세포에서 엔도좀 및 리소좀과 같은 특정 낮은 pH 기관은 산 절단 가능한 연결 그룹에 대한 절단 환경을 제공할 수 있다. 산 절단 가능한 연결 그룹의 예는 하이드라존, 에스테르, 및 아미노산의 에스테르를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 산 절단 가능한 그룹은 화학식 -C=NN-, C(O)O, 또는 -OC(O)를 가질 수 있다. 바람직한 양태는 에스테르의 산소에 부착된 탄소 (알콕시 그룹)가 아릴 그룹, 치환된 알킬 그룹 또는 3급 알킬 그룹, 예를 들어, 디메틸 펜틸 또는 t-부틸인 경우이다. 이들 후보물은 상기된 것들과 유사한 방법을 사용하여 평가될 수 있다.
iv. 에스테르-기반 절단 가능한 연결 그룹
특정 양태에서, 절단 가능한 링커는 에스테르 기반 절단 가능한 연결 그룹을 포함한다. 에스테르 기반 절단 가능한 연결 그룹은 세포내 에스테라제 및 아미다제와 같은 효소에 의해 절단된다. 에스테르 기반 절단 가능한 연결 그룹의 예는 알킬렌, 알케닐렌 및 알키닐렌 그룹의 에스테르를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 에스테르 절단 가능한 연결 그룹은 일반식 -C(O)O- 또는 -OC(O)-를 갖는다. 이들 후보물은 상기된 것들과 유사한 방법을 사용하여 평가될 수 있다.
v. 펩타이드 기반 절단 가능한 연결 그룹
여전히 또 다른 양태에서, 절단 가능한 링커는 펩타이드 기반 절단 가능한 연결 그룹을 포함한다. 펩타이드 기반 절단 가능한 연결 그룹은 세포에서 펩티다제 및 프로테아제와 같은 효소에 의해 절단된다. 펩타이드 기반 절단 가능한 연결 그룹은 아미노산 사이에 형성된 펩타이드 결합이고 올리고펩타이드 (예를 들어, 디펩타이드, 트리펩타이드 등) 및 폴리펩타이드를 생성한다. 펩타이드 기반 절단 가능한 그룹은 아미드 그룹(-C(O)NH-)을 포함하지 않는다. 아미드 그룹은 임의의 알킬렌, 알케닐렌 또는 알키넬렌 사이에 형성될 수 있다. 펩타이드 결합은 아미노산 사이에 형성된 특별한 유형의 아미드 결합이고 펩타이드 및 단백질을 생성한다. 펩타이드 기반 절단 그룹은 일반적으로 펩타이드 및 단백질을 생성하는 아미노산 사이에 형성된 펩타이드 결합(즉, 아미드 결합)으로 제한되고, 전체 아미드 작용기를 포함하지 않는다. 펩타이드-기반 절단 가능한 연결 그룹은 일반 화학식 - NHCHRAC(O)NHCHRBC(O)-를 갖고, 여기서, RA 및 Rb는 2개의 인접한 아미노산의 R 그룹이다. 이들 후보물은 상기된 것들과 유사한 방법을 사용하여 평가될 수 있다.
일부 양태에서, 본 발명의 iRNA는 링커를 통해 탄수화물에 접합된다. 본 발명의 조성물 및 방법의 링커와 iRNA 탄수화물 접합체의 비제한적인 예는 다음을 포함하지만 이에 제한되지 않는다:
Figure pct00092
(화학식 XXXVII),
Figure pct00093
(화학식 XXXVIII),
Figure pct00094
(화학식 XXXIX),
Figure pct00095
(화학식 XL),
Figure pct00096
(화학식 XLI),
Figure pct00097
(화학식 XLII),
Figure pct00098
(화학식 XLIII), 및
Figure pct00099
(화학식 XLIV)
여기서 X나 Y 중 하나가 올리고뉴클레오타이드이면 다른 하나는 수소이다.
본 발명의 조성물 및 방법의 특정 양태에서, 리간드는 2가 또는 3가 측쇄 링커를 통해 부착된 하나 이상의 "GalNAc" (N-아세틸갈락토사민) 유도체이다.　
특정 양태에서, 본 발명의 dsRNA는 임의의 화학식 (XLV) 내지 (XLVI)으로 나타낸 구조의 그룹으로부터 선택된 2가 또는 3가 측쇄 링커에 접합된다:
화학식 XXXXV 화학식 XLVI
Figure pct00100
Figure pct00101
화학식 XLVII 화학식 XLVIII
상기 식에서,
q2A, q2B, q3A, q3B, q4A, q4B, q5A, q5B 및 q5C는 독립적으로 각각 0 내지 20을 나타내고, 여기서, 반복 단위는 동일하거나 상이할 수 있고;
P2A, P2B, P3A, P3B, P4A, P4B, P5A, P5B, P5C, T2A, T2B, T3A, T3B, T4A, T4B, T4A, T5B, T5C는 각각 독립적으로 부재이거나 CO, NH, O, S, OC(O), NHC(O), CH2, CH2NH 또는 CH2O이고;
Q2A, Q2B, Q3A, Q3B, Q4A, Q4B, Q5A, Q5B, Q5C는 각각 독립적으로 부재이거나, 알킬렌, 치환된 알킬렌이고, 여기서 하나 이상의 메틸렌은 O, S, S(O), SO2, N(RN), C(R')=C(R"), C≡C 또는 C(O) 중 하나 이상에 의해 중단되거나 말단화될 있고;
R2A, R2B, R3A, R3B, R4A, R4B, R5A, R5B, R5C은 각각 독립적으로 부재이거나, NH, O, S, CH2, C(O)O, C(O)NH, NHCH(Ra)C(O), -C(O)-CH(Ra)-NH-, CO, CH=N-O,
Figure pct00102
Figure pct00103
또는 헤테로사이클릴이고;
L2A, L2B, L3A, L3B, L4A, L4B, L5A, L5B 및 L5C는 리간드, 즉, 각각 독립적으로 모노사카라이드(예를 들어, GalNAc), 디사카라이드, 트리사카라이드, 테트라사카라이드, 올리고사카라이드 또는 폴리사카라이드이고; Ra는 H 또는 아미노산 측쇄이다.3가 접합 GalNAc 유도체는 특히 화학식 XLIX의 것들과 같은 표적 유전자의 발현을 억제하기 위한 RNAi 제제와 함께 사용하기 위해 유용하다:
화학식 XLIX
Figure pct00104
여기서 L5A, L5B 및 L5C는 GalNAc 유도체와 같은 모노사카라이드를 나타낸다.
GalNAc 유도체를 접합시키는 적합한 2가 및 3가 측쇄 링커 그룹의 예는 화학식 II, VII, XI, X, 및 XIII로서 상기된 구조를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
RNA 접합체의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허는 미국 특허 제4,828,979호; 제4,948,882호; 제5,218,105호; 제5,525,465호; 제5,541,313호; 제5,545,730호; 제5,552,538호; 제5,578,717호, 제5,580,731호; 제5,591,584호; 제5,109,124호; 제5,118,802호; 제5,138,045호; 제5,414,077호; 제5,486,603호; 제5,512,439호; 제5,578,718호; 제5,608,046호; 제4,587,044호; 제4,605,735호; 제4,667,025호; 제4,762,779호; 제4,789,737호; 제4,824,941호; 제4,835,263호; 제4,876,335호; 제4,904,582호; 제4,958,013호; 제5,082,830호; 제5,112,963호; 제5,214,136호; 제5,082,830호; 제5,112,963호; 제5,214,136호; 제5,245,022호; 제5,254,469호; 제5,258,506호; 제5,262,536호; 제5,272,250호; 제5,292,873호; 제5,317,098호; 제5,371,241호, 제5,391,723호; 제5,416,203호, 제5,451,463호; 제5,510,475호; 제5,512,667호; 제5,514,785호; 제5,565,552호; 제5,567,810호; 제5,574,142호; 제5,585,481호; 제5,587,371호; 제5,595,726호; 제5,597,696호; 제5,599,923호; 제5,599,928호; 제5,688,941호; 제6,294,664호; 제6,320,017호; 제6,576,752호; 제6,783,931호; 제6,900,297호; 제7,037,646호; 및 제8,106,022호를 포함하지만 이에 제한되지 않고, 이들 각각의 전문은 본원에 참조로 포함된다.
주어진 화합물의 모든 위치가 균일하게 변형될 필요는 없고, 실제로 상기한 변형 중 하나 이상은 단일 화합물 또는 심지어 iRNA 내의 단일 뉴클레오시드에 도입될 수 있다. 본 발명은 또한 키메라 화합물인 iRNA 화합물을 포함한다.
본 발명과 관련하여 "키메라" iRNA 화합물 또는 "키메라"는 iRNA 화합물, 바람직하게 dsRNA 제제이고 이는 2개 이상의 화학적으로 특유의 영역을 함유하고, 이들 각각은 적어도 하나의 단량체 유닛, 즉 dsRNA 화합물의 경우에 뉴클레오타이드로 구성된다. 이들 iRNA는 전형적으로 적어도 하나의 영역을 함유하고, 여기서, 상기 RNA는 iRNA에 뉴클레아제 분해에 대해 증가된 내성, 표적 핵산에 대한 증가된 세포 취득 또는 증가된 결합 친화성을 부여하도록 변형된다. iRNA의 추가의 영역은 RNA:DNA 또는 RNA:RNA 하이브리드를 절단할 수 있는 효소에 대한 기질로서 작용할 수 있다. 예를 들어, RNase H는 RNA:DNA 듀플렉스의 RNA 가닥을 절단하는 세포 엔도뉴클레아제이다. RNase H의 활성화는 따라서 RNA 표적을 절단하여 유전자 발현의 iRNA 억제의 효율을 증진시킨다. 결과적으로, 상응하는 결과는 흔히 키메라 dsRNA가 사용되는 경우 동일한 표적 영역에 하이브리드화하는포스포로티오에이트 데옥시 dsRNA와 비교하여, 보다 짧은 iRNA를 사용하여 수득될 수 있다. RNA 표적의 절단은 통상적으로 겔 전기영동 및 필요한 경우, 당업계에 공지된 연합된 핵산 하이브리드화 기술에 의해 검출될 수 있다.
특정 경우에, iRNA의 RNA는 비-리간드 그룹에 의해 변형될 수 있다. 다수의 비-리간드 분자는 iRNA에 접합되어 iRNA의 활성, 세포 분포 또는 세포 취득을 증진시키고, 상기 접합을 수행하기 위한 과정은 과학 문헌에서 가용하다. 상기 비-리간드 모이어티는 지질 모이어티, 예를 들어, 콜레스테롤(참조: Kubo, T. et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 2007, 365(1):54-61; Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86:6553), 콜산(참조: Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1994, 4:1053), 티오에테르, 예를들어, 헥실-S-트리틸티올(참조: Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660:306; Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3:2765), 티오콜레스테롤 (Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20:533), 지방족 쇄, 예를 들어, 도데칸디올 또는 운데실 잔기(참조: Saison-Behmoaras et al., EMBO J., 1991, 10:111; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259:327; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75:49), 인지질, 예를 들어, 디-헥사데실-rac-글리세롤 또는 트리에틸암모늄 1,2-디-O-헥사데실-rac-글리세로-3-H-포스포네이트(참조: Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18:3777), 폴리아민 또는 폴리에틸렌 글리콜 쇄(참조: Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14:969), 또는 아다만탄 아세트산(참조: Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651), 팔미틸 모이어티(참조: Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264:229), 또는 옥타데실아민 또는 헥실아미노-카보닐-옥시콜레스테롤 모이어티(참조: Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277:923)를 포함하였다. 상기 RNA 접합체의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허는 상기 열거되어 있다. 전형적인 접합 프로토콜은 서열의 하나 이상의 위치에서 아미노링커를 함유하는 RNA의 합성을 포함한다. 아미노 그룹은 이어서 적당한 커플링 또는 활성화 시약을 사용하여 접합된 분자와 반응시킨다. 접합 반응은 고체 지지체에 여전히 결합된 RNA를 사용하거나 용액 상에서 RNA의 절단 후 수행될 수 있다. HPLC에 의한 RNA 접합체의 정제는 전형적으로 순수한 접합체를 제공한다.
V. APOE 녹다운의 생체내 시험
하나 이상의 인간 APOE 이소형(APOE2, APOE3 및 APOE4)을 발현하는 유전자전이 마우스를 포함하는 인간 APOE 녹인 마우스 모델이 생성되었고(참조: 예를 들어, Trommer, et al. (2005) Neuroreport 15:2655-2658 참조) 본원에 제공된 RNAi 제제의 생체내 효능을 입증하기 위해 사용될 수 있다.
APOE-관련 신경변성 질환(예를 들어, 알츠하이머 질환)의 마우스 모델도 생성되었으며 여기에 제공된 RNAi 제제의 생체 내 효능을 입증하는 데 추가로 사용할 수 있다. 이러한 모델은 인간 APOE의 하나 이상의 이소형의 유전자전이 발현을, 일부 경우는 병원성 돌연변이(예를 들어, 스웨덴 돌연변이(KM670/671NL))를 포함하는 인간 아밀로이드 전구체 단백질(APP)의 항시성 또는 유도성 발현, 예를 들어, 과발현과 조합할 수 있으며, 일부 경우에서 병원성 돌연변이(예를 들어, L166P) 돌연변이를 포함하는 인간 프레세닐린 1(PS1)의 항시성 또는 유도성 발현, 예를 들어 과발현(참조: 예를 들어: Huynh, et al. (2017) Neuron 96: 1013-1023), 및/또는 일부 경우에 병원성 돌연변이(예를 들어, P301S 돌연변이)를 포함하는 1N4R 인간 tau 단백질의 항시성 또는 유도성 발현, 예를 들어 과발현(참조: Shi, et al. (2017) Nature 549: 523-527)과 조합할 수 있다.
VI. 본원 개시내용의 RNAi 제제의 전달
본원 개시내용의 RNAi 제제의 세포, 예를 들어, 대상체, 예를 들어, 인간 대상체(예를 들어, APOE-관련 신경변성 장애, 예를 들어, 아밀로이드-β-매개된 질환, 예를 들어, 알츠하이머 질환, 다운 증후군 및 대뇌 아밀로이드 혈관병증 또는 tau-매개된 질환, 예를 들어, 1차 타우병증, 예를 들어, 전두측두엽 치매(FTD), 진행성 핵상 마비(PSP), 척수기저 변성(CBD), 픽 질환(PiD), 구상 신경교 타우병증(GGT), 파킨슨증을 동반한 전두측두엽 치매(FTDP, FTDP-17), 만성 외상성 뇌병증(CTE), 권투선수 치매, 전두측두엽 변성(FTLD), 호은성 곡물 질환(AGD) 및 1차 연령 관련 타우병증(PART), 또는 2차 타우병증, 예를 들어, AD, 크로이츠펠트 야콥 질환, 다운 증후군 및 가족성 영국 치매를 갖는 대상체와 같은 이를 필요로 하는 대상체) 내 세포로의 전달은 다수의 상이한 방식으로 성취될 수 있다. 예를 들어, 전달은 세포를 본원 개시내용의 RNAi 제제와 시험관내 또는 생체내 접촉시킴에 의해 수행될 수 있다. 생체내 전달은 또한 RNAi 제제, 예를 들어, dsRNA를 포함하는 조성물을 대상체에게 투여함에 의해 직접적으로 수행될 수 있다. 대안적으로, 생체내 전달은 RNAi 제제를 암호화하고 이의 발현을 지시하는 하나 이상의 벡터를 투여함에 의해 간접적으로 수행될 수 있다. 이들 대안은 추가로 하기에서 논의된다.
일반적으로, 핵산 분자를 전달(시험관내 또는 생체내)하는 임의의 방법은 본원 개시내용의 RNAi 제제와 함께 사용하기 위해 채택될 수 있다(참조: 예를 들어, Akhtar S. and Julian RL. (1992) Trends Cell. Biol. 2(5):139-144 및 WO94/02595, 이의 전문은 본원에 참조로 포함된다). 생체내 전달을 위해, RNAi 제제를 전달하기 위해 고려할 인자들은 예를 들어, 전달된 제제의 생물학적 안정성, 비-특이적 효과의 예방, 및 표적 조직에서 전달된 제제의 축적을 포함한다. RNAi 제제의 비특이적 효과는 국소 투여에 의해, 예를 들어, 조직으로의 직접적인 주사 또는 이식에 의해 또는 국소적으로 제제를 투여함에 의해 최소화될 수 있다. 치료 부위로의 국소 투여는 제제의 국소 농도를 최대화하고, 다르게는 제제에 의해 방해될 수 있거나 제제를 분해시킬 수 있는 전신 조직으로의 제제의 노출을 제한하고, 보다 낮은 총 용량의 RNAi 제제가 투여될 수 있게 한다. 여러 연구는 RNAi 제제가 국소로 투여되는 경우 유전자 생성물의 성공적인 녹다운을 보여주었다. 예를 들어, 시노몰구스 몽키에서 유리체내 주사에 의해 VEGF dsRNA의 안내 전달(참조: Tolentino, MJ. et al., (2004) Retina 24:132-138) 및 마우스에서 망막하 주사(참조: Reich, SJ. et al. (2003) Mol. Vis. 9:210-216)는 둘 다 노화 관련 황반 변성의 실험 모델에서 신생혈관을 예방하는 것으로 나타났다. 추가로, 마우스에서 dsRNA의 직접적인 종양내 주사는 종양 용적을 감소시키고(참조: Pille, J. et al. (2005) Mol. Ther. 11:267-274) 종양 보유 마우스의 생존률을 연장시킬 수 있다(참조: Kim, WJ. et al., (2006) Mol. Ther. 14:343-350; Li, S. et al., (2007) Mol. Ther. 15:515-523). RNA 간섭은 직접적인 주사에 의해 CNS로 (Dorn, G. et al., (2004) Nucleic Acids 32:e49; Tan, PH. et al. (2005) Gene Ther. 12:59-66; Makimura, H. et a.l (2002) BMC Neurosci. 3:18; Shishkina, GT., et al. (2004) Neuroscience 129:521-528; Thakker, ER., et al. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101:17270-17275; Akaneya,Y., et al. (2005) J. Neurophysiol. 93:594-602) 및 비강내 투여에 의해 폐로(참조: Howard, KA. et al., (2006) Mol. Ther. 14:476-484; Zhang, X. et al., (2004) J. Biol. Chem. 279:10677-10684; Bitko, V. et al., (2005) Nat. Med. 11:50-55)의 국소 전달로 성공하였다. 질환의 치료를 위한 RNAi 제제의 전신 투여를 위해, RNA는 변형될 수 있거나 대안적으로 약물 전달 시스템을 사용하여 전달될 수 있고; 방법 둘 다는 엔도- 및 엑소-뉴클레아제에 의해 생체내 dsRNA의 신속한 분해를 방지하는 작용을 한다. RNA 또는 약제학적 담체의 변형은 또한 RNAi 제제의 표적 조직으로의 표적화를 가능하게 하고 바람직하지 못한 오프-표적 효과를 회피한다(예를 들어, 이론에 의해 국한시키고자 하는 것은 아니지만, 본원에 기재된 바와 같은 GNA의 사용은 dsRNA의 씨드 영역을 불안정화시키는 동정되었고, 상기 오프-표적 효과가 상기 씨드 영역 불안정화에 의해 유의적으로 약해짐에 따라서 오프-표적에 비해 온-표적 효과를 위한 상기 dsRNA의 증진된 선호도를 유도한다). RNAi 제제는 콜레스테롤과 같은 친유성 그룹으로의 화학적 접합에 의해 변형되어 세포 흡수를 증진시키고 분해를 방지할 수 있다. 예를 들어, 친유성 콜레스테롤 모이어티에 접합된 ApoB에 대해 지시된 RNAi 제제는 마우스에 전신 주사하고 간과 공장 둘 다에서 apoB mRNA의 녹다운을 유도하였다(참조: Soutschek, J., et al (2004) Nature 432:173-178). RNAi 제제의 압타머로의 접합은 전립선암의 마우스 모델에서 종양 성장을 억제하고 종양 퇴행을 매개하는 것으로 나타났다(참조: McNamara, JO. et al., (2006) Nat. Biotechnol. 24:1005-1015). 대안적 양태에서, RNAi 제제는 나노입자, 덴드리머, 중합체, 리포좀 또는 양이온성 전달 시스템과 같은 약물 전달 시스템을 사용하여 전달될 수 있다. 양으로 하전된 양이온성 전달 시스템은 분자 RNAi 제제(음으로 하전된)의 결합을 촉진시키고 또한 음으로 하전된 세포막에서 상호작용을 증진시켜 세포에 의한 RNAi 제제의 효율적인 흡수를 가능하게 한다. 양이온성 지질, 덴드리머 또는 중합체는 iRNA에 결합될 수 있거나 iRNA가 내장된 소포 또는 마이셀을 형성하도록 유도될 수 있다(참조: 예를 들어, Kim SH, et al (2008) Journal of Controlled Release 129(2):107-116). 소포 또는 마이셀의 형성은 전신 투여되는 경우 RNAi 제제의 분해를 추가로 방지한다. 양이온성-RNAi 제제 복합체를 제조하고 투여하기 위한 방법은 능히 당업자의 능력 범위 내에 있다(참조: 예를 들어, Sorensen, DR., et al. (2003) J. Mol. Biol 327:761-766; Verma, UN. et al., (2003) Clin. Cancer Res. 9:1291-1300; Arnold, AS et al. (2007) J. Hypertens. 25:197-205, 이는 이들의 전문이 본원에 참조로 포함된다). RNAi 제제의 전신 전달을 위해 유용한 약물 전달 시스템의 일부 비제한적인 예는 DOTAP(상기 참조: Sorensen, DR., et al (2003), supra; Verma, UN, et al (2003)), 올리고펙타민, "고체 핵산 지질 입자"(참조: Zimmermann, TS, et al (2006) Nature 441:111-114), 카디오리핀(참조: Chien, PY, et al (2005) Cancer Gene Ther. 12:321-328; Pal, A, et al (2005) Int J. Oncol. 26:1087-1091), 폴리에틸렌이민(참조: Bonnet ME, et al (2008) Pharm. Res. Aug 16 Epub ahead of print; Aigner, A. (2006) J. Biomed. Biotechnol. 71659), Arg-Gly-Asp (RGD) 펩타이드(참조: Liu, S. (2006) Mol. Pharm. 3:472-487), 및 폴리아미도아민(참조: Tomalia, DA, et al (2007) Biochem. Soc. Trans. 35:61-67; Yoo, H., et al (1999) Pharm. Res. 16:1799-1804)을 포함한다. 일부 양태에서, RNAi 제제는 전신 투여를 위해 사이클로덱스트린과 복합체를 형성한다. RNAi 제제 및 사이클로덱스트린의 약제학적 조성물을 투여하기 위한 방법은 이의 전문이 본원에 참조로 포함된 미국 특허 제7,427,605호에서 찾을 수 있다.
본원 개시내용의 특정 양상은 세포에서 APOE 표적 유전자의 발현을 감소시키는 방법으로서, 상기 세포를 본원 개시내용의 이중 가닥 RNAi 제제와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다. 일양태에서, 세포는 간 세포, 임의로 간세포이다. 일양태에서, 세포는 간외 세포, 임의로 CNS 세포이다.
본원 개시내용의 특정 양상은 대상체에서 APOE 표적 유전자의 발현을 감소시키는 방법으로서, 상기 대상체에 본원 개시내용의 이중 가닥 RNAi 제제를 투여하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.
본원 개시내용의 또 다른 양상은 APOE 관련 신경변성 장애를 갖는 대상체를 치료하는 방법으로서, 상기 대상체에게 본원 개시내용의 치료학적 유효량의 이중 가닥 이중 가닥 RNAi 제제를 투여하여 상기 대상체를 치료함을 포함하는 방법에 관한 것이다. 본원 개시내용의 방법에 의해 치료될 수 있는 예시적인 CNS 장애는
아밀로이드-β-매개된 질환, 예를 들어, 알츠하이머 질환, 다운 증후군 및 대뇌 아밀로이드 혈관병증, 및 tau-매개된 질환, 예를 들어, 1차 타우병증, 예를 들어, 전두측두엽 치매(FTD), 진행성 핵상 마비(PSP), 척수기저 변성(CBD), 픽 질환(PiD), 구상 신경교 타우병증(GGT), 파킨슨증을 동반한 전두측두엽 치매(FTDP, FTDP-17), 만성 외상성 뇌병증(CTE), 권투선수 치매, 전두측두엽 변성(FTLD), 호은성 곡물 질환(AGD) 및 1차 연령 관련 타우병증(PART), 및 2차 타우병증, 예를 들어, AD, 크로이츠펠트 야콥 질환, 다운 증후군 및 가족성 영국 치매를 포함한다. 일양태에서, 이중 가닥 RNAi 제제는 피하로 투여된다.
일양태에서, 이중 가닥 RNAi 제제는 척수강내로 투여된다. 이중 가닥 RNAi 제제의 척수강내 투여에 의해, 상기 방법은 뇌(예를 들어, 선조체) 또는 척추 조직, 예를 들어, 피질, 소뇌, 경추, 요추 및 흉추에서 APOE 표적 유전자의 발현을 감소시킬 수 있다.
설명의 용이함을 위해 본 섹션에서 조성물 및 방법은 변형된 siRNA 화합물과 관련하여 주로 논의된다. 그러나, 이들 제형, 조성물 및 방법은 다른 siRNA 화합물, 예를 들어, 비변형 siRNA 화합물과 함께 실시될 수 있고, 이러한 실시는 본원 개시내용 내에 있는 것으로 이해될 수 있다. RNAi 제제를 포함하는 조성물은 다양한 경로에 의해 대상체에 전달될 수 있다. 예시적인 경로는 척수강내, 정맥내, 국소, 직장, 항문, 질, 비강, 폐 및 안구를 포함한다.
본원 개시내용의 RNAi 제제는 투여에 적합한 약제학적 조성물에 혼입될 수 있다. 이러한 조성물은 전형적으로 하나 이상의 종의 RNAi 제제 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "약제학적으로 허용되는 담체"는 약제학적 투여에 적합한 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항균제 및 항진균제, 등장성 제제 및 흡수 지연제 등을 포함하는 것으로 의도된다. 약제학적 활성 물질에 대한 상기 매질 및 제제의 사용은 당업계에 널리 공지되어 있다. 임의의 종래 매질 또는 제제가 활성 화합물에 적합하지 않은 경우를 제외하고는 상기 조성물에서의 이의 사용이 고려된다. 보충 활성 화합물은 또한 조성물에 혼입될 수 있다.
본원 개시내용의 약제학적 조성물은 국소 또는 전신 치료가 바람직한지의 여부 및 치료될 부위에 따라 다양한 방식으로 투여될 수 있다. 투여는 국소(안과, 질, 직장, 비강, 경피 포함), 경구 또는 비경구일 수 있다. 비경구 투여는 정맥내 점적, 피하, 복강내 또는 근육내 주사, 또는 척수강내 또는 뇌실내 투여를 포함한다.
투여 경로 및 부위는 표적화를 증진시키기 위해 선택될 수 있다. 예를 들어, 근육 세포를 표적화하기 위해, 관심 대상의 근육으로 근육내 주사는 논리적 선택이다. 폐 세포는 에어로졸 형태로 RNAi 제제를 투여함에 의해 표적화될 수 있다. 혈관 내피 세포는 볼룬 카테터에 RNAi 제제를 코팅하고 RNA를 기계적으로 도입함으로써 표적화될 수 있다.
국소 투여용의 제형은 경피 패치, 연고, 로션, 크림, 겔, 적가제, 좌제, 분무, 액체, 산제를 포함할 수 있다. 통상적인 약제학적 캐리어, 수성 분말 또는 오일 기제, 증점제 등이 필요하거나 요구될 수 있다. 코팅된 콘돔, 글로브 등이 또한 유용할 수 있다.
경구 투여용 조성물은 분말 또는 과립, 물, 시럽, 엘릭시르 또는 비수성 매질 중 현탁액 또는 용액, 정제, 캡슐, 로젠지 또는 트로키를 포함한다. 정제의 경우에, 사용될 수 있는 담체는 락토스, 나트륨 시트레이트 및 인산의 염을 포함한다. 정제에는 전분과 같은 다양한 붕해제와 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 라우릴 설페이트 및 활석과 같은 윤활제가 일반적으로 사용된다. 캡슐 형태의 경구 투여를 위해, 유용한 희석제는 락토스 및 고분자량의 폴리에틸렌 글리콜이다. 수성 현탁액이 경구 사용을 위해 요구되는 경우, 핵산 조성물은 유화제 및 현탁제와 배합될 수 있다. 경우에 따라, 특정 감미제 및/또는 향제가 첨가될 수 있다.
척수강내 또는 뇌실내 투여용 조성물은 완충제, 희석제 및 기타 적합한 첨가제를 또한 함유할 수 있는 멸균 수용액을 포함할 수 있다.
비경구 투여를 위한 제형은 완충제, 희석제 및 기타 적합한 첨가제를 또한 함유할 수 있는 멸균 수용액을 포함할 수 있다. 심실내 주사는 예를 들어 저장소에 부착된 심실내 카테터에 의해 촉진될 수 있다. 정맥내 사용의 경우, 용질의 총 농도를 제어하여 제제가 등장성이 되도록 할 수 있다.
일양태에서, siRNA 화합물, 예를 들어 이중 가닥 siRNA 화합물, 또는 ssiRNA 화합물, 조성물의 투여는 비경구, 예를 들어, 정맥내(예를 들어, 볼루스로서 또는 확산성 주입으로서), 피내, 복강내, 근육내, 척수강내, 뇌실내, 두개내, 피하, 경점막, 협측, 설하, 내시경, 직장, 구강, 질, 국소, 폐, 비강내, 요도 또는 안구이다. 투여는 대상체 또는 다른 인간, 예를 들어 의료 제공자에 의해 제공될 수 있다. 약물은 측정된 용량으로 제공되거나 계량된 용량을 전달하는 분배기로 제공될 수 있다. 선택된 전달 방식은 하기에 보다 상세하게 논의된다.
척추강내 투여.
일양태에서, 이중 가닥 RNAi 제제는 척추강내 주사(즉, 뇌 및 척수 조직을 담고 있는 척수액으로의 주사)에 의해 전달된다. 척수액에 RNAi 작용제의 척수강내 주사는 볼루스 주사 또는 피부 아래에 이식될 수 있는 미니펌프를 통해 수행되어 siRNA를 척수액으로 규칙적이고 일정하게 전달할 수 있다. 맥락막 신경총에서 생성되는 척수액의 순환은 척수 및 후근 신경절 주위를 따라 아래로, 이어서 소뇌를 지나 피질을 거쳐 지주막 과립으로 흐르며, 여기서 유체가 CNS를 빠져나갈 수 있고 주사된 화합물의 크기, 안정성 및 용해도에 따라 척수강내로 전달된 분자는 CNS 전체에 걸쳐 표적을 공략할 수 있다.
일부 양태에서, 척수강내 투여는 펌프를 통해서이다. 펌프는 수술적으로 이식된 삼투압 펌프일 수 있다. 일양태에서, 삼투압 펌프는 척수강내 투여를 용이하게 하기 위해 척수관의 지주막하 공간으로 이식된다.
일부 양태에서, 척수강내 투여는 일정 용적의 약제를 함유하는 저장소, 및 저장소에 함유된 약제의 일부를 전달하도록 구성된 펌프를 포함하는 약제용 척수강내 전달 시스템을 통해서이다. 상기 척수강내 전달 시스템에 대한 더 자세한 내용은 WO 2015/116658에서 찾을 수 있으며, 이는 그 전문이 참조로 포함된다.
척수강내 주사된 RNAi 제제의 양은 하나의 표적 유전자로부터 또 다른 표적 유전자에 따라 다양할 수 있고 적용되어야 하는 적절한 양은 각각의 표적 유전자에 대해 개별적으로 결정되어야 할 수 있다. 전형적으로, 상기 양은 10 μg 내지 2 mg, 바람직하게 50 μg 내지 1500 μg, 보다 바람직하게 100 μg 내지 1000 μg의 범위이다.
본원 개시내용의 벡터 암호화된 RNAi 제제
APOE 유전자를 표적화하는 RNAi 제제는 DNA 또는 RNA 벡터에 삽입된 전사 유닛으로부터 발현될 수 있다(참조: 예를 들어, Couture, A, et al., TIG. (1996), 12:5-10; WO 00/22113, WO 00/22114, 및 US 6,054,299). 발현은 바람직하게 사용된 특정 작제물 및 표적 조직 또는 세포 유형에 따라 지속된다(수개월 또는 그 이상). 이들 전이유전자는 선형 작제물, 환형 플라스미드 또는 바이러스 벡터로서 도입될 수 있고, 이는 통합 또는 비-통합 벡터일 수 있다. 전이유전자는 또한 염색체외 플라스미드로서 이것이 유전될 수 있도록 작제될 수 있다(참조: Gassmann, et al., (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:1292).
RNAi 제제의 개별 가닥 또는 가닥들은 발현 벡터 상의 프로모터로부터 전사될 수 있다. 예를 들어, dsRNA를 생성하기 위해 2개의 별도의 가닥이 발현되어야 하는 경우, 2개의 별도의 발현 벡터가 표적 세포 내로 (예를 들어, 형질감염 또는 감염에 의해) 동시 도입될 수 있다. 대안적으로, dsRNA의 각각의 개별 가닥은 동일한 발현 플라스미드에 둘 다 위치한 프로모터에 의해 전사될 수 있다. 일양태에서, dsRNA는 dsRNA가 스템 및 루프 구조를 갖도록 링커 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 연결된 역위 반복 폴리뉴클레오티드로서 발현된다.
RNAi 제제 발현 벡터는 일반적으로 DNA 플라스미드 또는 바이러스 벡터이다. 진핵 세포와 상용성인 발현 벡터, 바람직하게 영양 세포와 상용성인 것들을 사용하여 본원에 기재된 바와 같은 RNAi 제제의 발현을 위한 재조합 작제물을 생성할 수 있다. RNAi 제제 발현 벡터의 전달은 예를 들어 정맥내 또는 근육내 투여, 환자로부터 추출된 표적 세포에 투여한 후 환자에게 재도입함에 의해, 또는 목적하는 표적 세포로의 도입을 허용하는 임의의 다른 수단에 의해 전신적일 수 있다.
본원에 기재된 방법 및 조성물을 사용하여 사용될 수 있는 바이러스 벡터는 (a) 아데노바이러스 벡터; (b) 렌티바이러스 벡터, 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스 등을 포함하지만 이에 제힌되지 않는 레트로바이러스 벡터; (c) 아데노 관련 바이러스 벡터; (d) 헤르페스 심플렉스 바이러스 벡터; (e) SV 40 벡터; (f) 폴리오마 바이러스 벡터; (g) 파필로마 바이러스 벡터; (h) 피코나바이러스 벡터; (i) 폭스 바이러스 벡터, 예를 들어, 오르토폭스, 예를 들어, 백시니아 바이러스 벡터 또는 아비폭스, 예를 들어. 카나리 폭스 또는 파울 폭스; 및 (j) 헬퍼 의존성 또는 거트리스(gutless) 아데노바이러스를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 복제 결함 바이러스가 또한 유리할 수 있다. 상이한 벡터는 세포의 게놈에 도입되거나 도입되지 않는다. 작제물은 경우에 따라 형질감염을 위한 바이러스 서열을 포함할 수 있다. 대안적으로, 작제물은 에피좀 복제할 수 있는 벡터, 예를 들어, EPV 및 EBV 벡터에 도입될 수 있다. RNAi 제제의 재조합 발현을 위한 작제물은 일반적으로 표적 세포에서 RNAi 제제의 발현을 확실히 하기 위해 조절 요소, 예를 들어, 프로모터, 인핸서 등을 필요로 한다. 벡터 및 작제물을 위해 고려할 다른 양상은 당업계에 공지되어 있다.
VII. 본 발명의 약제학적 조성물
본원 개시내용은 또한 본원 개시내용의 RNAi 제제를 포함하는 약제학적 조성물 및 제형을 포함한다. 일양태에서, 본원에서는 본원에 기재된 바와 같은 RNAi 제제 및 약제학적으로 허용되는 담체를 함유하는 약제학적 조성물이 제공된다. RNAi 제제를 함유하는 약제학적 조성물은 APOE의 발현 또는 활성과 관련된 질환 또는 장애, 예를 들어, APOE-관련 신경변성 질환, 예를 들어, 아밀로이드-β-매개된 질환, 예를 들어, 알츠하이머 질환, 다운 증후군 및 대뇌 아밀로이드 혈관병증, tau-매개된 질환, 예를 들어, 1차 타우병증, 예를 들어, 전두측두엽 치매(FTD), 진행성 핵상 마비(PSP), 척수기저 변성(CBD), 픽 질환(PiD), 구상 신경교 타우병증(GGT), 파킨슨증을 동반한 전두측두엽 치매(FTDP, FTDP-17), 만성 외상성 뇌병증(CTE), 권투선수 치매, 전두측두엽 변성(FTLD), 호은성 곡물 질환(AGD) 및 1차 연령 관련 타우병증(PART), 또는 2차 타우병증, 예를 들어, AD, 크로이츠펠트 야콥 질환, 다운 증후군 및 가족성 영국 치매를 치료하기 위해 유용하다.
상기 약제학적 조성물은 전달 방식을 기준으로 제형화된다. 하나의 예는 비경구 전달을 통한, 예를 들어 정맥내(IV), 근육내(IM) 또는 피하(subQ) 전달에 의한 전신 투여용으로 제형화된 조성물이다. 또 다른 예는 예를 들어 척추강내 또는 유리체내 주사 경로에 의해, 임의로 뇌(예를 들어, 선조체)로의 주입, 예를 들어 연속 펌프 주입에 의해 CNS로의 직접 전달을 위해 제형화된 조성물이다.
일부 양태에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 발열원 부재 또는 비-발열원성이다.
본원 개시내용의 약제학적 조성물은 APOE 유전자의 발현을 억제하기에 충분한 용량으로 투여될 수 있다. 일반적으로, 본원 개시내용의 RNAi의 적합한 용량은 하루 수용자의 체중 킬로그램 당 약 0.001 내지 약 200.0 밀리그램의 범위이고, 일반적으로 하루 체중 킬로그램 당 약 1 내지 50 mg 범위이다.
반복 투여 용법은 정기적 기준으로, 예를 들어, 매월 내지 6개월 마다 1회 치료학적 양의 RNAi 제제의 투여를 포함할 수 있다. 특정 양태에서, RNAi 제제는 약 분기당 1회(즉, 약 3개월마다 1회) 내지 연간 약 2회 투여된다.
초기 치료 용법(예를 들어, 로딩 용량) 후, 치료제는 덜 빈번한 기준으로 투여될 수 있다.
다른 양태에서, 약제학적 조성물의 단일 용량은 장기간 지속되어 후속 용량은 1, 2, 3, 또는 4개월 이하의 간격으로 투여될 수 있다. 본원 개시내용의 일부 양태에서, 본원 개시내용의 약제학적 조성물의 단일 용량은 1개월 마다 1회 투여된다. 본원 개시내용의 다른 양태에서, 본원 개시내용의 약제학적 조성물의 단일 용량은 분기 당 1회 내지 연간 2회 투여된다.
당업자는 질환 또는 장애의 중증도, 이전의 치료, 대상체의 일반 건강 및/또는 연령 및 존재하는 다른 질환을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 대상체를 효과적으로 치료하기 위해 요구되는 용량 및 타이밍에 영향을 줄 수 있임을 인지한다. 또한, 치료학적 유효량의 조성물을 사용한 대상체의 치료는 단일 치료 또는 일련의 치료를 포함할 수 있다.
마우스 유전학의 발전으로 APOE의 발현의 감소가 이득이 되는 다양한 APOE-관련 신경변성 질환의 연구를 위해 다수의 마우스 모델을 생성하였다. 이러한 모델은 RNAi 제제의 생체 내 시험과 치료학적 유효량을 결정하기 위해 사용될 수 있다. 적합한 마우스 모델은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어 본원의 다른 곳에 기재된 마우스 모델을 포함한다.
본원 개시내용의 약제학적 조성물은 국소 또는 전신 치료가 바람직한지의 여부 및 치료될 부위에 따라 다양한 방식으로 투여될 수 있다. 투여는 국소(예를 들어, 경피 패치에 의함), 폐, 예를 들어 분무기를 포함하는 분말 또는 에어로졸의 흡입 또는 통기에 의해; 기관내, 비강내, 표피 및 경피, 경구 또는 비경구 투여일 수 있다. 비경구 투여는 정맥내, 동맥내, 피하, 복강내 또는 근육내 주사 또는 주입; 예를 들어 이식된 장치를 통한 피하; 또는 두개내, 예를 들어 실질내, 척추강내 또는 뇌실내 투여에 의한 것을 포함한다.
RNAi 제제는 간, CNS(예를 들어, 뇌의 뉴런, 신경교 또는 혈관 조직) 또는 간 및 CNS 둘 다와 같은 특정 조직을 표적화하는 방식으로 전달될 수 있다.
국소 투여용의 약제학적 조성물 및 제형은 경피 패치, 연고, 로션, 크림, 겔, 적가제, 좌제, 분무, 액체 및 산제를 포함할 수 있다. 통상적인 약제학적 담체, 수성 분말 또는 오일 기제, 증점제 등이 필요하거나 요구될 수 있다. 코팅된 콘돔, 글로브 등이 또한 유용할 수 있다. 적합한 국소 제형은 본원 개시내용에 특성화된 RNAi 제제가 지질, 리포좀, 지방산, 지방산 에스테르, 스테로이드, 킬레이트화제 및 계면활성제와 같은 국소 전달제와 혼합되어 있는 것들을 포함한다. 적합한 지질 및 리포좀은 중성(예를 들어, 디올레오일포스파티딜 DOPE 에탄올아민, 디미리스토일포스파티딜 콜린 DMPC, 디스테아롤리포스파티딜 콜린), 음이온성(예를 들어, 디미리스토일포스파티딜 글리세롤 DMPG) 및 양이온성(예를 들어, 디올레오일테트라메틸아미노프로필 DOTAP 및 디올레오일포스파티딜 에탄올아민 DOTMA)을 포함한다. 본원 개시내용에 특성화된 RNAi 제제는 리포좀 내에 캡슐화될 수 있거나 이것과 특히 양이온성 리포좀과 복합체를 형성할 수 있다. 대안적으로, RNAi 제제는 지질, 특히 양이온성 지질과 복합체화될 수 있다. 적합한 지방산 및 에스테르는 아라키돈산, 올레산, 에이코산산, 라우르산, 카프릴산, 카프르산, 미리스트산, 팔미트산, 스테아르산, 리놀레산, 리놀렌산, 디카프레이트, 트리카프레이트, 모노올레인, 디라우린, 글리세릴 1-모노카프레이트, 1-도데실아자시클로헵탄-2-온, 아실카르니틴, 아실콜린 또는 C1-20 알킬 에스테르(예를 들어, 이소프로필미리스테이트 IPM), 모노글리세리드, 디글리세리드 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 국소 제형은 본원에 참조로 포함된 미국 특허 제6,747,014호에 상세히 기재되어 있다.
A. 막 분자 어셈블리를 포함하는 RNAi 제제 제형
본원 개시내용의 조성물 및 방법에 사용하기 위한 RNAi 제제는 막 분자 어셈블리, 예를 들어, 리포좀 또는 마이셀에서의 전달을 위해 제형화될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "리포좀"은 적어도 하나의 이중층, 예를 들어, 하나의 이중층 또는 다수의 이중층에 배열된 양친매성 지질로 구성된 소포를 지칭한다. 리포좀은 친유성 물질과 수성 내부로 형성된 막을 갖는 단층 및 다중층 소포를 포함한다. 수성 부분은 RNAi 제제 조성물을 함유한다. 친유성 물질은 전형적으로 RNAi 제제 조성물을 포함하지 않지만, 일부 예에서는 그럴 수 있는 수성 외부로부터 수성 내부를 단리한다. 리포좀은 활성 성분을 작용 부위로 전이 및 전달하는데 유용하다. 리포좀 막은 구조적으로 생물학적 막과 유사하기 때문에 리포좀이 조직에 적용되는 경우, 리포좀 이중층은 세포막의 이중층과 융합된다. 리포좀과 세포의 병합이 진행됨에 따라, RNAi 제제를 포함하는 내부 수성 내용물은 RNAi 제제가 표적 RNA에 특이적으로 결합할 수 있고 RNAi를 매개할 수 있는 세포로 전달된다. 일부 경우에, 리포좀은 또한 특이적으로 표적화되고, 예를 들어, RNAi 제제를 특정 세포 유형으로 지시한다.
RNAi 제제를 함유하는 리포좀은 다양한 방법에 의해 제조될 수 있다. 하나의 예에서, 리포좀의 지질 성분은 세제에 용해되어 마이셀은 지질 성분과 형성으로 형성된다. 예를 들어, 지질 성분은 양친매성 양이온성 지질 또는 지질 접합체일 수 있다. 세제는 높은 임계 마이셀 농도를 가질 수 있고 비이온성일 수 있다. 예시적인 세제는 콜레이트, CHAPS, 옥틸글루코사이드, 데옥시콜레이트 및 라우로일 사르코신을 포함한다. 이어서 RNAi 제제는 지질 성분을 포함하는 마이셀에 첨가한다. 지질 상의 양이온성 그룹은 RNAi 제제와 상호작용하고 RNAi 제제 주변에 서 응축하여 리포좀을 형성한다. 응축 후 세제는 예를 들어 투석에 의해 제거되어 RNAi 제제의 리포솜 제제를 생성한다.
필요한 경우 응축을 보조하는 담체 화합물이 응축 반응 동안, 예를 들어 제어된 첨가에 의해 첨가될 수 있다. 예를 들어, 담체 화합물은 핵산 이외의 중합체(예를 들어, 스퍼민 또는 스퍼미딘)일 수 있다. pH는 또한 응축을 선호하도록 조정될 수 있다.
전달 비히클의 구조적 성분으로서 폴리뉴클레오타이드/양이온성 지질 복합체를 포함하는 안정한 폴리뉴클레오타이드 전달 비히클을 제조하는 방법은 예를 들어, WO 96/37194에 추가로 기재되어 있으며, 이의 전문은 본원에 참조로 포함된다. 리포좀 형성은 또한 문헌(참조: Felgner, P. L. et al., (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8:7413-7417; United States Patent No. 4,897,355; United States Patent No. 5,171,678; Bangham et al., (1965) M. Mol. Biol. 23:238; Olson et al., (1979) Biochim. Biophys. Acta 557:9; Szoka et al., (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. 75: 4194; Mayhew et al., (1984) Biochim. Biophys. Acta 775:169; Kim et al., (1983) Biochim. Biophys. Acta 728:339; 및 Fukunaga et al., (1984) Endocrinol. 115:757)에 기재된 예시적 방법의 하나 이상의 양상을 포함할 수 있다. 전달 비히클로서 사용하기에 적절한 크기의 지질 응집체를 제조하기 위해 일반적으로 사용되는 기술은 초음파 처리 및 동결-해동 및 압출을 포함한다(참조: 예를 들어, Mayer et al., (1986) Biochim. Biophys. Acta 858:161). 미세유동화는 일관되게 작고(50 내지 200 nM) 비교적 균일한 응집체가 필요한 경우 사용할 수 있다(참조: Mayhew et al., (1984) Biochim. Biophys. Acta 775:169). 이들 방법은 RNAi 제제를 리포좀으로 팩키징하는데 용이하게 적용된다.
리포좀은 2개의 광범위 부류로 분류된다. 양이온성 리포좀은 안정한 복합체를 형성하기 위해 음으로 하전된 핵산 분자와 상호작용하는 양으로 하전된 리포좀이다. 양으로 하전된 핵산/리포좀 복합체는 음으로 하전된 세포 표면에 결합하고 엔도좀에 내재화된다. 엔도좀 내 산성 pH로 인해, 리포좀은 붕괴되어, 이들의 내용물을 세포질로 방출한다(참조: Wang et al. (1987) Biochem. Biophys. Res. Commun., 147:980-985).
pH 민감성이거나 음으로 하전된 리포좀은 이들과의 복합체 보다는 핵산을 포집한다. 핵산과 지질 둘 다는 유사하게 하전되기 때문에 복합체 형성보다는 반발이 일어난다. 그럼에도 불구하고, 일부 핵산은 이들 리포좀의 수성 내부에 포집된다. pH 민감성 리포좀은 티미딘 키나제 유전자를 암호화하는 핵산을 배양 중의 세포 단층으로 전달하기 위해 사용되어 왔다. 외인성 유전자의 발현은 표적 세포에서 검출되었다(참조: Zhou et al. (1992) Journal of Controlled Release, 19:269-274).
하나의 주요 유형의 리포좀 조성물은 천연적으로 유래된 포스파티딜콜린 이외의 다른 인지질을 포함한다. 예를 들어, 중성 리포좀 조성물은 디미리스토일 포스파티딜콜린(DMPC) 또는 디팔미토일 포스파티딜콜린(DPPC)으로부터 형성될 수 있다. 음이온성 리포좀 조성물은 일반적으로 디미리스토일 포스파티딜글리세롤로부터 형성되는 반면, 음이온성 융합 리포좀은 주로 디올레오일 포스파티딜에탄올아민(DOPE)으로부터 형성된다. 또 다른 유형의 리포좀 조성물은 예를 들어, 대두 PC 및 계란 PC와 같은 포스파티딜콜린(PC)으로 부터 형성된다. 또 다른 유형은 인지질 또는 포스파티딜콜린 또는 콜레스테롤의 혼합물로부터 형성된다.
리포좀을 시험관내 및 생체내 도입하기 위한 다른 방법의 예는 문헌(미국 특허 제5,283,185호; 미국 특허 제5,171,678호; WO 94/00569; WO 93/24640; WO 91/16024; Felgner, (1994) J. Biol. Chem. 269:2550; Nabel, (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. 90:11307; Nabel, (1992) Human Gene Ther. 3:649; Gershon, (1993) Biochem. 32:7143; 및 Strauss, (1992) EMBO J. 11:417)을 포함한다.
비이온성 리포좀 시스템은 또한 피부, 특히 비이온성 계면활성제 및 콜레스테롤을 포함하는 시스템으로의 약물 전달에서의 유용성을 결정하기 위해 조사되었다. NovasomeTM I(글리세릴 딜라우레이트/콜레스테롤/폴리옥시에틸렌-10-스테아릴 에테르) 및 NovasomeTM II(글리세릴 디스테아레이트/콜레스테롤/폴리옥시에틸렌-10-스테아릴 에테르)를 포함하는 비이온성 리포좀 제형은 마우스 피부의 진피로 사이클로스포린-A를 전달하기 위해 사용되었다. 결과는 이러한 비이온성 리포좀 시스템이 피부의 다른 층에 사이클로스포린 A의 침착을 촉진하는 데 효과적임을 나타냈다(참조: Hu et al., (1994) S.T.P.Pharma. Sci., 4(6):466).
리포좀은 또한 "입체적으로 안정화된" 리포좀을 포함하며, 이 용어는 본원에서 사용되는 바와 같이, 리포좀에 혼입될 때 이러한 특수화된 지질이 결여된 리포좀에 비해 순환 수명을 증진시키는 하나 이상의 특수화된 지질을 포함하는 리포좀을 지칭한다. 입체적으로 안정화된 리포좀의 예는 리포좀(A)의 소포 형성 지질 부분의 일부가 모노시알로강글리오사이드 GM1과 같은 하나 이상의 당지질을 포함하거나 (B)는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 모이어티와 같은 하나 이상의 친수성 중합체로 유도체화된다. 임의의 특정 이론에 국한시키고자 하는 것은 아니지만, 당업계에서 적어도 강글리오사이드, 스핑고마이엘린 또는 PEG 유도체화된 지질을 함유하는 적어도 입체적으로 안정화된 리포좀을 위해, 이들 입체적으로 안정화된 리포좀의 증진된 순환 반감기는세망내피 시스템(RES)의 세포로의 감소된 흡수로부터 유래한다(참조: Allen et al., (1987) FEBS Letters, 223:42; Wu et al., (1993) Cancer Research, 53:3765).
하나 이상의 당지질을 포함하는 다양한 리포좀은 당업계에 공지되어 있다. 문헌(참조: Papahadjopoulos et al. (Ann. N.Y. Acad. Sci., (1987), 507:64)은 리포좀의 혈액 반감기를 개선시키는 reported the ability of 모노시알로강글리오사이드 GM1, 갈락토세레브로사이드 설페이트 및 포스파티딜이노시톨의 능력을 보고하였다. 이들 발견은 문헌(참조: Gabizon et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., (1988), 85,:6949)에 의해 설명되었다. 둘 다 알렌(Allen) 등의 것인 미국 특허 제4,837,028호 및 WO 88/04924는 (1) 스핑고마이엘린 및 (2) 강글리오사이드 GM1 또는 갈락토세레브로사이드 설페이트 에스테르를 포함하는 리포좀을 기재한다. 미국 특허 제5,543,152호(Webb et al.)는 스핑고마이엘린을 포함하는 리포좀을 기재한다. 1,2-sn-디미리스토일포스파티딜콜린을 포함하는 리포좀은 WO 97/13499 (Lim et al)에 기재되어 있다.
일양태에서, 양이온성 리포좀이 사용된다. 양이온성 리포좀은 세포 막에 융합할 수 있는 이점을 갖는다. 비-양이온성 리포좀은 원형질막과 효율적으로 융합할 수 없지만, 생체내 대식세포에 의해 흡수되고 RNAi 제제를 대식세포에 전달하기 위해 사용될 수 있다.
리포좀의 추가의 이점은 다음을 포함한다: 천연 인지질로부터 수득된 리포좀은 생체적합성 및 생분해성이고; 리포좀에는 광범위한 수용성 및 지용성 약물이 혼입될 수 있고; 리포좀은 대사 및 분해로부터 이들의 내부 격실에서 캡슐화된 RNAi 제제를 보호할 수 있다(참조: Rosoff, in "Pharmaceutical Dosage Forms," Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, volume 1, p. 245). 리포좀 제형의 제조에서 중요한 고려사항은 지질 표면 전하, 소포 크기 및 리포좀의 수성 용적이다.
양으로 하전된 합성 양이온성 지질, N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드(DOTMA)는 핵산과 자발적으로 상호작용하여 조직 배양 세포의 세포 막의 음으로 하전된 지질과 융합하여 RNAi 제제를 전달할 수 있는 지질-핵산 복합체를 형성하는 작은 리포좀을 형성시키기 위해 사용될 수 있다(참조: 예를 들어, DOTMA 및 DNA와의 이의 사용에 대해 Felgner, P. L. et al., (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8:7413-7417, 및 미국 특허 제4,897,355호).
DOTMA 유사체, 1,2-비스(올레오일옥시)-3-(트리메틸암모니아)프로판 (DOTAP)은 인지질과 배합되어 사용되어 DNA-복합 소포를 형성할 수 있다. Lipofectin™ (Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, Md.)은 음으로 하전된 폴리뉴클레오타이드와 자발적으로 상호작용하여 복합체를 형성하는 양으로 하전된 DOTMA 리포좀을 포함하는 생 조직 배양 세포로 고도의 음이온성 핵산의 전달을 위한 효과적인 제제이다. 충분히 양으로 하전된 리포좀이 사용되는 경우, 수득한 복합체 상의 총 전하는 또한 양성이다. 상기 방식으로 제조된 양으로 하전된 복합체는 음으로 하전된 세포 표면에 자발적으로 부착하고 세포질막과 융합하여 효율적으로 기능성 핵산을 예를 들어, 조직 배양 세포로 전달한다. 또 다른 시판되는 양이온성 지질, 1,2-비스(올레오일옥시)-3,3-(트리메틸암모니아)프로판("DOTAP") (Boehringer Mannheim, Indianapolis, Indiana)은 올레오일 모이어티가 에테르 연결 보다는 차라리 에스테르에 의해 연결되어 있다는 점에서 DOTMA와 상이하다.
다른 보고된 양이온성 지질 화합물은 예를 들어, 2개 유형의 지질 중 하나에 접합되고, 5-카복시스퍼밀글라이신 디옥타올레오일아미드("DOGS") (Transfectam™, Promega, Madison, Wisconsin) 및 디팔미토일포스파티딜에탄올아민 5-카복시스퍼밀-아미드("DPPES")과 같은 화합물을 포함하는, 카복시스퍼민을 포함하는 다양한 모이어티에 접합된 것들을 포함한다(참조: 예를 들어, 미국 특허 제5,171,678호).
또 다른 양이온성 지질 접합체는 DOPE와 배합된 리포좀으로 제형화된 콜레스테롤("DC-Chol")을 사용한 지질의 유도체화를 포함한다(참조: Gao, X. and Huang, L., (1991) Biochim. Biophys. Res. Commun. 179:280). 폴리라이신을 DOPE에 접합시킴에 의해 제조된 리포폴리라이신은 혈청의 존재하의 형질감염을 위해 효과적인 것으로 보고되었다(참조: Zhou, X. et al., (1991) Biochim. Biophys. Acta 1065:8). 특정 세포주에 대해, 접합된 양이온성 지질을 함유하는 이들 리포좀은 DOTMA-함유 조성물 보다 낮은 독성을 나타내고 보다 효율적인 형질감염을 제공하는 것으로 알려져 있다. 기타 시판되는 양이온성 지질 제품은 DMRIE 및 DMRIE-HP(Vical, La Jolla, California) 및 리포펙타민(DOSPA)(Life Technology, Inc., Gaithersburg, Maryland)을 포함한다. 올리고뉴클레오타이드의 전달을 위해 적합한 다른 양이온성 지질은 WO 98/39359 및 WO 96/37194에 기재된다.
리포좀 제형은 특히 국소 투여를 위해 적합하고 리포좀은 다른 제형 보다 여러 이점들을 제공한다. 이러한 이점들은 투여된 약물의 높은 전신 흡수와 관련된 부작용 감소, 목적하는 표적에서 투여된 약물의 증가된 축적, 및 RNAi 제제를 피부에 투여하는 능력을 포함한다. 일부 구현에서, 리포좀은 RNAi 제제를 상피 세포에 전달하고 또한 RNAi 제제의 진피 조직, 예를 들어 피부로의 투과를 증진시키기 위해 사용된다. 예를 들어, 리포좀은 국소적으로 적용될 수 있다. 리포좀으로서 제형화된 약물의 피부로의 국소 전달은 보고되었다(참조: 예를 들어, Weiner et al., (1992) Journal of Drug Targeting, vol. 2,405-410 and du Plessis et al., (1992) Antiviral Research, 18:259-265; Mannino, R. J. and Fould-Fogerite, S., (1998) Biotechniques 6:682-690; Itani, T. et al., (1987) Gene 56:267-276; Nicolau, C. et al. (1987) Meth. Enzymol. 149:157-176; Straubinger, R. M. and Papahadjopoulos, D. (1983) Meth. Enzymol. 101:512-527; Wang, C. Y. and Huang, L., (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7851-7855).
비이온성 리포좀 시스템은 또한 피부, 특히 비이온성 계면활성제 및 콜레스테롤을 포함하는 시스템으로의 약물 전달에서의 유용성을 결정하기 위해 조사되었다. Novasome I(글리세릴 딜라우레이트/콜레스테롤/폴리옥시에틸렌-10-스테아릴 에테르) 및 Novasome II(글리세릴 디스테아레이트/콜레스테롤/폴리옥시에틸렌-10-스테아릴 에테르)를 포함하는 비이온성 리포좀 제형은 마우스 피부의 진피로 약물을 전달하기 위해 사용되었다. RNAi 제제를 사용한 상기 제형은 피부 장애를 치료하기 위해 유용하다.
RNAi 제제를 포함하는 리포좀은 고도로 변형 가능하게 제조될 수 있다. 이러한 변형성은 리포좀의 평균 반경보다 작은 기공을 통해 리포좀을 투과시킬 수 있다. 예를 들어, 트랜스페로좀은 일종의 변형될 수 있는 리포좀이다. 트랜스페로좀은 표면 엣지 활성화인자, 일반적으로 계면활성제를 표준 리포좀 조성물에 첨가함에 의해 제조될 수 있다. RNAi 제제를 포함하는 트랜스페로좀은 예를 들어 피부의 각질형성세포에 RNAi 제제를 전달하기 위해 감염에 의해 피하로 전달될 수 있다. 온전한 포유동물 피부를 통과하기 위해 지질 소포는 적합한 경피 농도구배의 영향 하에 각각 직경이 50 nm 미만인 일련의 미세 공극을 통과해야 한다. 또한, 지질 성질로 인해 이러한 트랜스페로좀은 자가 최적화(예를 들어, 피부에서 공극 형태에 적응), 자가 복구가 가능하고 흔히 단편화 및 자가 로딩 없이 이들의 표적에 도달할 수 있다.
본원 개시내용에 적용 가능한 다른 제형은 2008년 1월 2일에 출원된 미국 가출원 번호 제61/018,616호; 2008년 1월 2일에 출원된 제61/018,611호; 2008년 3월 26일에 출원된 제61/039,748호; 2008년 4월 22일에 출원된 제61/047,087호 및 2008년 5월 8일에 출원된 제61/051,528호에 기재되어 있다. 2007년 10월 3일자로 출원된 PCT 출원 번호 PCT/US2007/080331은 또한 본원 개시내용에 따를 수 있는 제형을 기재한다.
트랜스퍼좀, 또 다른 유형의 리포좀은 약물 전달 비히클을 위한 매력적인 후보인 고도로 변형 가능한 지질 응집체이다. 트랜스퍼좀은 변형이 매우 커서 액적보다 작은 공극을 통해 쉽게 투과할 수 있는 지질 액적으로서 기재될 수 있다. 트랜스퍼좀은 이들이 사용되는 환경에 적응할 수 있고, 예를 들어, 이들은 자가 최적화(피부의 공극 형태에 적응), 자가 복구하고, 흔히 단편화 없이 이들의 표적에 도달하고 종종 자가 로딩한다. 트랜스퍼좀을 제조하기 위해 표면 엣지 활성화제, 일반적으로 계면활성제를 표준 리포솜 조성물에 첨가할 수 있다. 트랜스퍼좀은 혈청 알부민을 피부에 전달하기 위해 사용되었다. 혈청 알부민의 트랜스퍼좀 매개 전달은 혈청 알부민을 함유한 용액의 피하 주사만큼 효과적인 것으로 나타났다.
계면활성제는 본원에 기재된 것과 같은 제형, 특히 에멀젼(마이크로에멀젼 포함) 및 리포좀에 광범위하게 적용된다. 천연 및 합성 계면활성제의 많은 다양한 유형의 성질을 분류하고 순위를 매기는 가장 일반적인 방법은 친수성/친유성 균형(HLB)을 사용하는 것이다. 친수성 그룹("헤드"로서도 공지된)의 특성은 제형에 사용되는 다양한 계면활성제를 분류하는 데 가장 유용한 수단을 제공한다(참조: Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, p. 285).
계면활성제 분자가 이온화되지 않으면 비이온성 계면활성제로 분류된다. 비이온성 계면활성제는 약제 및 화장품에 광범위하게 적용되며 광범위한 pH 값에서 사용할 수 있다. 일반적으로 이들의 HLB 값은 이들의 구조에 의존하여 2 내지 약 18 범위이다. 비이온성 계면활성제는 에틸렌 글리콜 에스테르, 프로필렌 글리콜 에스테르, 글리세릴 에스테르, 폴리글리세릴 에스테르, 소르비탄 에스테르, 슈크로스 에스테르, 및 에톡실화된 에스테르와 같은 비이온성 에스테르를 포함한다. 지방 알콜 에톡실레이트, 프로폭실화된 알콜 및 에톡실화된/프로폭실화된 블록 중합체와 같은 비이온성 알칸올아미드 및 에테르도 상기 부류에 포함된다. 폴리옥시에틸렌 계면활성제는 비이온성 계면활성제 부류의 가장 대중적인 구성원이다.
계면활성제 분자가 물에 용해되거나 분산될 때 음전하를 띠면 계면활성제는 음이온성으로 분류된다. 음이온성 계면활성제는 비누와 같은 카복실레이트, 아실 락틸레이트, 아미노산의 아실 아미드, 황산의 에스테르, 예를 들어, 알킬 설페이트 및 에톡실화된 알킬 설페이트, 설포네이트, 예를 들어, 알킬 벤젠 설포네이트, 아실 이세티오네이트, 아실 타우레이트 및 설포숙시네이트, 및 포스페이트를 포함한다. 음이온성 계면활성제 부류의 가장 중요한 구성원은 알킬 설페이트와 비누이다.
계면활성제 분자가 물에 용해되거나 분산될 때 양전하를 띠면 계면활성제는 양이온성으로 분류된다. 양이온성 계면활성제는 4차 암모늄 염 및 에톡실화된 아민을 포함한다. 4급 암모늄 염은 상기 부류의 가장 널리 사용되는 구성원이다.
계면활성제 분자가 양전하 또는 음전하를 운반하는 능력을 갖는 경우, 계면활성제는 양쪽성으로 분류된다. 양쪽성 계면활성제는 아크릴산 유도체, 치환된 알킬아미드, N-알킬베타인 및 포스파타이드를 포함한다.
약품, 제형 및 에멀젼 중에 계면활성제의 용도가 검토되었다(참조: Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, p. 285).
본원 개시내용의 방법에 사용하기 위한 RNAi 제제는 또한 마이셀 제형으로서 제공될 수 있다. "마이셀"은 분자의 모든 소수성 부분이 안쪽으로 향하고 친수성 부분이 주변 수성상과 접촉한 상태로 남아있도록 양친매성 분자가 구형 구조로 배열된 특정 유형의 분자 어셈블리로 본원에서 정의된다. 환경이 소수성인 경우 반대 배열이 존재한다.
경피막을 통한 전달에 적합한 혼합 마이셀 제형은 siRNA 조성물의 수용액, 알칼리 금속 C8 내지 C22 알킬 설페이트 및 마이셀 형성 화합물을 혼합하여 제조할 수 있다. 예시적인 마이셀 형성 화합물은 렉시틴, 하이알루론산, 하이알루론산의 약제학적으로 허용되는 염, 글리콜산, 락트산, 카모마일 추출물, 오이 추출물, 올레산, 리놀레산, 리놀렌산, 모노올레인, 모노올레에이트, 모노라우레이트, 보리지 오일, 달맞이꽃 오일, 멘톨, 트리하이드록시 옥소 콜라닐 글라이신 및 이의 약제학적으로 허용되는 염, 글리세린, 폴리글리세린, 라이신, 폴리라이신, 트리올레인, 폴리옥시에틸렌 에테르 및 이의 유사체, 폴리도칸올 알킬 에테르 및 이의 유사체, 케노데옥시콜레이트, 데옥시콜레이트, 및 이들의 혼합물을 포함한다. 마이셀 형성 화합물은 동시에 또는 알칼리 금속 알킬 설페이트의 첨가 후 첨가될 수 있다. 혼합 마이셀은 성분들의 실질적으로 임의의 종류의 혼합으로 형성되지만 왕성한 혼합으로 보다 작은 크기의 마이셀을 제공한다.
하나의 방법에서, siRNA 조성물 및 적어도 알칼리 금속 알킬 설페이트를 함유하는 제1 마이셀 조성물이 제조된다. 이어서, 제1 마이셀 조성물을 3종 이상의 마이셀 형성 화합물과 혼합하여 혼합 마이셀 조성물을 형성한다. 또 다른 방법에서, 마이셀 조성물은 siRNA 조성물, 알칼리 금속 알킬 설페이트 및 마이셀 형성 화합물 중 하나 이상을 혼합한 후, 왕성한 혼합과 함께 나머지 마이셀 형성 화합물을 첨가함으로써 제조된다.
페놀 또는 m-크레졸을 혼합 마이셀 조성물에 첨가하여 제형을 안정화하고 세균 성장으로부터 보호할 수 있다. 대안적으로, 페놀 또는 m-크레졸이 마이셀 형성 성분과 함께 첨가될 수 있다. 혼합 마이셀 조성물의 형성 후에 글리세린과 같은 등장제를 첨가할 수도 있다.
마이셀 제형을 분무로 전달하기 위해 제형을 에어로졸 분배기에 넣고 분배기에 추진제를 충전할 수 있다. 압력하에 있는 추진제는 분배기에 액체 형태로 있다. 성분의 비율은 수성 및 추진제 상이 하나가 되도록 조정되고, 즉, 하나의 상이 있다. 2개의 상이 있는 경우, 내용물의 일부를 예를 들어, 계량 밸브를 통해 분배하기 전에 분배기를 흔들 필요가 있다. 분배된 용량의 약제는 미세 분말로 계량된 밸브로부터 추진된다.
추진제는 수소-함유 클로로플루오로카본, 수소-함유 플루오로카본, 디메틸 에테르 및 디에틸 에테르를 포함할 수 있다. 특정 양태에서, HFA 134a (1,1,1,2 테트라플루오로에탄)가 사용될 수 있다.
필수 성분들의 특이적 농도는 상대적으로 직접적인 실험에 의해 결정될 수 있다. 구강을 통한 흡수의 경우, 위장관을 통한 주사 또는 투여에 대해 투여량을, 예를 들어 적어도 2배 또는 3배로 증가시키는 것이 종종 바람직할 수 있다.
지질 입자
RNAi 제제, 예를 들어, 본원 개시내용의 dsRNA는 액체 제형, 예를 들어, LNP 또는 기타 핵산-지질 입자에 완전히 캡슐화될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "LNP"는 안정한 핵산-지질 입자를 지칭한다. LNP는 전형적으로 양이온성 지질, 비-양이온성 지질 및 입자의 응집을 방지하는 지질(예를 들어, PEG-지질 접합체)을 포함한다. LNP는 이들이 정맥내(i.v.) 주사 후 연장된 순환 수명을 나타내고 말단 부위(예를 들어, 투여 부위에서 물리적으로 분리된 부위)에 축적되기 때문에 전신 적용에 매우 유용하다. LNP는 WO 00/03683에 제시된 캡슐화된 응축 제제-핵산 복합체를 포함하는 "pSPLP"를 포함한다. 본원 개시내용의 입자는 전형적으로 약 50 nm 내지 약 150 nm, 보다 전형적으로 약 60 nm 내지 약 130 nm, 보다 전형적으로 약 70 nm 내지 약 110 nm, 가장 전형적으로 약 70 nm 내지 약 90 nm의 평균 직경을 갖고, 실질적으로 무독성이다. 또한, 본원 개시내용의 핵산-지질 입자에 존재할 때 핵산은 뉴클레아제에 의한 분해에 대해 수용액에서 저항성이다. 핵산-지질 입자 및 이의 제조 방법은 예를 들어, 미국 특허 제5,976,567호; 제5,981,501호; 제6,534,484호; 제6,586,410호; 제6,815,432호; 미국 특허 공개 공보 제2010/0324120호 및 WO 96/40964에 기재되어 있다.
일양태에서, 지질 대 약물 비(질량/질량 비)(예를 들어, 지질 대 dsRNA 비)는 약 1:1 내지 약 50:1, 약 1:1 내지 약 25:1, 약 3:1 내지 약 15:1, 약 4:1 내지 약 10:1, 약 5:1 내지 약 9:1, 또는 약 6:1 내지 약 9:1의 범위에 있다. 상기 언급된 범위의 중간 범위는 또한 본원 개시내용의 일부인 것으로 고려된다.
RNAi 제제의 전달을 위한 특정 특이적 LNP 제형은 당업계에 보고되었고, 예를 들어, 본원에 참조로 포함된 WO 2008/042973에 기재된 바와 같이 "LNP01" 제형을 포함한다.
추가의 예시적인 지질-dsRNA 제형은 하기의 표에서 확인된다.
Figure pct00105
Figure pct00106
DSPC: 디스테아로일포스파티딜콜린
DPPC: 디팔미토일포스파티딜콜린
PEG-DMG: PEG-디디미리스토일 글리세롤 (C14-PEG, 또는 PEG-C14) (평균 분자량이 2000인 PEG)
PEG-DSG: PEG-디스티릴 글리세롤 (C18-PEG, 또는 PEG-C18) (평균 분자량이 2000인 PEG)
PEG-cDMA: PEG-카바모일-1,2-디미리스틸옥시프로필아민 (평균 분자량이 2000인 PEG)
SNALP (1,2-딜리놀레닐옥시-N,N-디메틸아미노프로판 (DLinDMA))을 포함하는 제형은 본원에 참조로 포함된 WO 2009/127060에 기재되어 있다.
XTC를 포함하는 제형은 WO 2010/088537에 기재되어 있고, 이의 전문은 본원에 참조로 포함된다.
MC3을 포함하는 제형은 예를 들어, 미국 특허 공개 공보 제 2010/0324120호에 기재되어 있고, 이의 전문은 본원에 참조로 포함된다.
ALNY-100을 포함하는 제형은 WO 2010/054406에 기재되어 있고, 이의 전문은 본원에 참조로 포함된다.
C12-200을 포함하는 제형은 WO 2010/129709에 기재되어 있고, 이의 전문은 본원에 참조로 포함된다.
경구 투여를 위한 조성물 및 제형은 분말 또는 과립, 미세미립자, 나노미립자, 물 또는 비수성 매질 중 현탁액 또는 용액, 캡슐, 겔 캡슐, 사쉐, 정제 또는 소형정제를 포함한다. 증점제, 향미제, 희석제, 유화제, 분산 보조제 또는 결합제가 바람직할 수 있다. 일부 양태에서, 경구 제형은 본원 개시내용에서 특성화된 dsRNA가 하나 이상의 투과 증진제 계면활성제 및 킬레이트제와 함께 투여되는 제형이다. 적합한 계면활성제는 지방산 또는 에스테르 또는 이의 염, 담즙산 또는 이의 염을 포함한다. 적합한 담즙산/염은 케노데옥시콜산(CDCA) 및 우르소데옥시케노데옥시콜산(UDCA), 콜산, 데하이드로콜산, 데옥시콜산, 글루콜산, 글리콜산, 글리코데옥시콜산, 타우로콜산, 타우로데옥시콜산, 나트륨 타우로-24,25-디하이드로-푸시데이트 및 나트륨 글리코디하이드로푸시데이트를 포함한다. 적합한 지방산은 아라키돈산, 운데칸산, 올레산, 라우르산, 카프릴산, 카프르산, 미리스트산, 팔미트산, 스테아르산, 리놀레산, 리놀렌산, 디카프레이트, 트리카프레이트, 모노올레인, 디라우린, 글리세릴 1-모노카프레이트, 1-도데실아자시클로헵탄-2-온, 아실카르니틴, 아실콜린, 또는 모노글리세리드, 디글리세리드 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염(예를 들어, 나트륨)을 포함한다. 일부 양태에서, 투과 증진제들의 조합이 사용되고, 예를 들어, 담즙산/염과 조합된 지방산/염이 사용된다. 하나의 예시적인 조합은 라우르산, 카프르산 및 UDCA의 나트륨 염이다. 추가의 투과 증진제는 폴리옥시에틸렌-9-라우릴 에테르, 폴리옥시에틸렌-20-세틸 에테르를 포함한다. 본원 개시내용에서 특성화된 DsRNA는 분무된 건조 입자 또는 마이크로 또는 나노입자를 형성하도록 복합체화된 입자를 포함하는 과립 형태로 경구적으로 전달될 수 있다. dsRNA 복합 제제는 폴리아미노산; 폴리이민; 폴리아크릴레이트; 폴리알킬아크릴레이트, 폴리옥시에탄, 폴리알킬시아노아크릴레이트; 양이온화된 젤라틴, 알부민, 전분, 아크릴레이트, 폴리에틸렌글리콜(PEG) 및 전분; 폴리알킬시아노아크릴레이트; DEAE 유도체화된 폴리이민, 꽃가루, 셀룰로스 및 전분을 포함한다. 적합한 복합 제제는 키토산, N-트리메틸키토산, 폴리-L-리신, 폴리히스티딘, 폴리오르니틴, 폴리스퍼민, 프로타민, 폴리비닐피리딘, 폴리티오디에틸아미노메틸에틸렌 P(TDAE), 폴리아미노스티렌(예를 들어, p-아미노), 폴리(메틸시아노아크릴레이트), 폴리(에틸시아노아크릴레이트), 폴리(부틸시아노아크릴레이트), 폴리(이소부틸시아노아크릴레이트), 폴리(이소헥실시아노아크릴레이트), DEAE-메타크릴레이트, DEAE-헥실아크릴레이트, DEAE-아크릴아미드, DEAE-알부민 및 DEAE-덱스트란, 폴리메틸아크릴레이트, 폴리헥실아크릴레이트, 폴리(D,L-락트산), 폴리(DL-락트산-코-글리콜산(PLGA), 알기네이트 및 폴리에틸렌글리콜(PEG)을 포함한다. dsRNA에 대한 제형 및 이들의 제조는 미국 특허 제6,887,906호, 미국 공개 공보 제2003/0027780호, 및 미국 특허 제6,747,014호에 상세히 기재되어 있고 이들 각각은 본원에 참조로 포함된다.
비경구, 실질내(뇌로), 척수강내, 뇌실내 또는 간내 투여를 위한 조성물 및 제형은 완충제, 희석제 및 이에 제한되지 않지만 투과 증진제, 담체 화합물와 같은 기타 적합한 첨가제 및 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 또한 함유할 수 있는 멸균 수용액을 포함할 수 있다.
본원 개시내용의 약제학적 조성물은 용제, 에멀젼 및 리포좀 함유 제형을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 이들 조성물은 미리 형성된 액체, 자가-유화 고체 및 자가-유화 반고체를 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 성분으로부터 생성될 수 있다. APP 관련 질환 또는 장애를 치료하는 경우 뇌를 표적화하는 제형이 특히 바람직하다.
유닛 투여 형태로 편리하게 제시될 수 있는 본원 개시내용의 약제학적 제형은 제약 산업에 널리 공지된 통상적인 기술에 따라 제조될 수 있다. 상기 기술은 활성 성분을 약제학적 담체(들) 또는 부형제(들)과 회합시키는 단계를 포함한다. 일반적으로, 제형은 액체 담체 또는 미분된 고체 담체 또는 둘 다와 활성 성분을 균일하게 및 친밀하게 연합시키고 이어서 필요하다면 생성물을 성형함에 의해 제조된다.
본원 개시내용의 조성물은 이에 제한되지 않지만 정제, 캡슐, 겔 캡슐, 액체 시럽, 연질 겔, 좌제 및 관장제와 같은 임의의 많은 가능한 투여 형태로 제형화될 수 있다. 본원 개시내용의 조성물은 또한 수성, 비-수성 또는 혼합 매질 중에 현탁제로서 제형화될 수 있다. 수성 현탁제는 예를 들어 나트륨 카복시메틸셀룰로스, 소르비톨 또는 덱스트란을 포함하는 현탁제의 점도를 증가시키는 물질을 추가로 함유할 수 있다. 현탁액은 또한 안정화제를 함유할 수 있다.
추가의 제형
i. 에멀젼
본원 개시내용의 조성물은 에멀젼으로서 제조되고 제형화될 수 있다. 에멀젼은 전형적으로 일반적으로 직경이 0.1 μm를 초과하는 액적의 형태로 또 다른 액체에 분산된 하나의 액체의 이종성 시스템이다(참조: 예를 들어, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199; Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Volume 1, p. 245; Block in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 2, p. 335; Higuchi et al., in Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985, p. 301). 에멀젼은 흔히 서로 친밀하게 혼합되고 분산된 2개의 불혼화성 액체 상을 포함하는 2상 시스템이다. 일반적으로, 에멀젼은 유중수(w/o) 또는 수중유 (o/w) 종류일 수 있다. 수성상이 미세하게 나누어져 미세한 액적으로서 벌크 오일상으로 분산되는 경우, 생성된 조성물은 유중수(w/o) 에멀젼으로 불리운다. 대안적으로 오일상이 미세하게 나누어져 미세한 액적으로서 벌크 오일상으로 분산되는 경우, 생성된 조성물은 수중유(o/w) 에멀젼으로 불리운다. 에멀젼은 분산상 외에 추가 성분을 함유할 수 있으며, 수성상, 오일상 또는 별도의 상으로 자체적으로 용액으로 존재할 수 있는 활성 약물을 함유할 수 있다. 유화제, 안정화제, 염료 및 항산화제와 같은 약제학적 부형제는 또한 필요에 따라 에멀젼에 존재할 수 있다. 약제학적 에멀젼은 또한 예를 들어 유중수중유(o/w/o) 및 수중유중수 (w/o/w) 에멀젼의 경우에 2개 이상의 상으로 구성된 다중 에멀젼일 수 있다. 이러한 복합 제형은 종종 단순 이원 에멀젼이 제공하지 않는 특정 이점을 제공한다. o/w 에멀젼의 개별 오일 액적이 작은 물 액적을 내포하는 다중 에멀젼은 w/o/w 에멀젼을 구성한다. 마찬가지로, 오일 연속 상으로 안정화된 물의 구체에 내포된 오일 액적 시스템은 o/w/o 에멀젼을 제공한다.
에멀젼은 거의 열역학 안정성이 없음을 특징으로 한다. 흔히, 에멀젼의 분산 또는 불연속 상은 외부 또는 연속 상으로 잘 분산되고 유화제 또는 제형의 점도를 통해 이러한 형태로 유지된다. 에멀젼의 상 중 어느 하나는 에멀젼 유형의 연고 기제 및 크림의 경우에서와 같이 반고체 또는 고체일 수 있다. 에멀젼을 안정화시키는 다른 수단은 에멀젼의 어느 하나의 상에 도입될 수 있는 유화제의 사용을 수반한다. 유화제는 광범위하게 합성 계면활성제, 천연 유화제, 흡수 기제, 미세 분산 고체의 4가지 범주로 분류될 수 있다(참조: 예를 들어, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199).
표면 활성제라고도 하는 합성 계면활성제는 에멀젼 제형에 광범위하게 적용할 수 있으며 문헌에서 검토되었다(참조: 예를 들어, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 285; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, volume 1, p. 199). 계면활성제는 전형적으로 양친매성이고 친수성 및 소수성 부분을 포함한다. 계면활성제의 친수성 대 소수성 특성의 비율을 친수성/친유성 균형(HLB)이라고 하며 제형의 제조에서 계면활성제를 분류하고 선택하는 데 유용한 도구이다. 계면활성제는 친수성 그룹의 성질에 따라 비이온성, 음이온성, 양이온성 및 양쪽성의 상이한 부류로 분류될 수 있다(참조: 예를 들어, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 285).
에멀젼 제형에 사용되는 천연적으로 존재하는 유화제는 라놀린, 밀랍, 포스파타이드, 렉시틴 및 아카시아를 포함한다. 흡수 기제는 물을 흡수하여 w/o 에멀젼을 형성하면서도 무수 라놀린 및 친수성 바셀린(petrolatum)과 같은 반고체 농도를 유지할 수 있는 친수성을 가지고 있다. 미분된 고체는 특히 계면활성제 및 점성 제제와 조합하여 우수한 유화제로서 사용되었다. 이들은 중금속 수산화물과 같은 극성 무기 고체, 벤토나이트, 아타풀기트, 헥토라이트, 카올린, 몬모릴로나이트, 콜로이드성 알루미늄 실리케이트 및 콜로이드성 마그네슘 알루미늄 실리케이트와 같은 비팽윤성 점토, 안료 및 탄소 또는 글리세릴 트리스테아레이트와 같은 비극성 고체를 포함한다.
다양한 비-유화 재료는 또한 에멀젼 제형에 포함되고, 에멀젼의 성질에 기여한다. 이들은 지방, 오일, 왁스, 지방산, 지방 알코올, 지방 에스테르, 보습제, 친수성 콜로이드, 방부제 및 항산화제를 포함한다(참조: Block, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 335; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199).
친수성 콜로이드 또는 하이드로콜로이드는 천연적으로 존재하는 검 및 합성 중합체, 예를 들어 폴리사카라이드(예를 들어, 아카시아, 한천, 알긴산, 카라기난, 구아 검, 카라야 검 및 트라가칸트), 셀룰로스 유도체(예를 들어, 카복시메틸셀룰로스 및 카복시프로필셀룰로스) 및 합성 중합체(예를 들어, 카보머, 셀룰로오스 에테르 및 카르복시비닐 중합체)를 포함한다. 이들은 물에 분산되거나 팽창하여 분산상 액적 주위에 강한 계면 필름을 형성하고 외부 상의 점도를 증가시켜 에멀젼을 안정화하는 콜로이드 용액을 형성한다.
에멀젼은 종종 미생물의 성장을 용이하게 지원할 수 있는 탄수화물, 단백질, 스테롤 및 포스파티드와 같은 많은 성분을 포함하기 때문에 이러한 제형은 종종 보존제가 혼입된다. 에멀젼 제형에 포함된 일반적으로 사용되는 보존제는 메틸 파라벤, 프로필 파라벤, 4차 암모늄 염, 벤잘코늄 클로라이드, p-히드록시벤조산의 에스테르 및 붕산을 포함한다. 항산화제는 또한 제형의 악화를 방지하기 위해 일반적으로 에멀젼 제형에 첨가된다. 사용되는 항산화제는 토코페롤, 알킬 갈레이트, 부틸화된 하이드록시아니솔, 부틸화된 하이드록시톨루엔과 같은 자유 라디칼 소거제 또는 아스코르브산 및 나트륨 메타바이설피트와 같은 환원제 및 시트르산, 타르타르산 및 렉시틴과 같은 항산화 상승작용제일 수 있다.
피부과, 경구 및 비경구 경로를 통한 에멀젼 제형의 적용 및 제조 방법은 문헌에서 검토되었다(참조: 예를 들어, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199). 경구 전달용 에멀젼 제형은 제형이 용이할 뿐만 아니라 흡수 및 생체이용률 측면에서 효능 때문에 매우 널리 사용되어 왔다(참조: 예를 들어, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 245; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199). 미네랄-오일 기반 완하제, 지용성 비타민 및 고지방 영양 제제는 일반적으로 o/w 에멀젼으로 경구 투여되는 물질 중에 있다.
ii. 마이크로에멀젼
본원 개시내용의 일양태에서, iRNA 제제 및 핵산의 조성물은 마이크로에멀젼으로서 제형화된다. 마이크로에멀젼은 물, 오일 및 단일 광학 등방성 및 열역학적으로 안정한 액체 용액인 양친매성 시스템으로 정의할 수 있다(참조: 예를 들어, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 245). 전형적으로, 마이크로에멀젼은 먼저 수성 계면활성제 용액에 오일을 분산시킨 다음 충분한 양의 제4 성분, 일반적으로 중간 쇄 길이의 알콜을 첨가하여 투명한 시스템을 형성함으로써 제조되는 시스템이다. 따라서, 마이크로에멀젼은 또한 표면 활성 분자의 계면 필름에 의해 안정화되는 두 개의 불혼화성 액체의 열역학적으로 안정하고 등방성으로 투명한 분산액으로 기재되었다(참조: Leung and Shah, in: Controlled Release of Drugs: Polymers and Aggregate Systems, Rosoff, M., Ed., 1989, VCH Publishers, New York, pages 185-215). 마이크로에멀젼은 일반적으로 오일, 물, 계면활성제, 보조계면활성제 및 전해질을 포함하는 3 내지 5개 성분의 조합을 통해 제조된다. 마이크로에멀젼이 유중수(w/o) 또는 수중유(o/w) 유형인지 여부는 사용된 오일 및 계면활성제의 성질, 및 계면활성제 분자의 극성 헤드와 탄화수소 꼬리의 구조 및 기하학적 팩킹에 따라 상이하다(참조: Schott, in Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985, p. 271).
위상 다이아그램을 활용하는 현상학적 접근법은 광범위하여 연구되었고 마이크로에멀젼을 제형화하는 방법의 포괄적 지식을 당업자에게 제공하였다(참조: 예를 들어, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 245; Block, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 335). 통상적인 에멀젼과 비교하여 마이크로에멀젼은 자발적으로 형성되는 열역학적으로 안정적인 액적의 제형에서 수불용성 약물을 가용화하는 이점을 제공한다.
마이크로에멀젼의 제조에 사용되는 계면활성제는 단독으로 또는 보조계면활성제와 조합된, 이온성 계면활성제, 비이온성 계면활성제, Brij 96, 폴리옥시에틸렌 올레일 에테르, 폴리글리세롤 지방산 에스테르, 테트라글리세롤 모노라우레이트(ML310), 테트라글리세롤 모노올레에이트(MO310), 헥사글리세롤 모노올레에이트(PO310), 헥사글리세롤 펜타올레에이트(PO500), 데카글리세롤 모노카프레이트(MCA750), 데카글리세롤 모노올레에이트(MO750), 데카글리세롤 세퀴올레에이트(SO750), 데카글리세롤 데카올레에이트(DAO750)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일반적으로 에탄올, 1-프로판올, 1-부탄올과 같은 단쇄 알콜인 보조계면활성제는 계면활성제 필름에 침투하여 결과적으로 계면활성제 분자 사이에 생성된 보이드(void) 공간으로 인해 무질서한 필름을 생성함으로써 계면 유동성을 증가시키는 작용을 한다. 그러나 마이크로에멀젼은 보조계면활성제를 사용하지 않고 제조될 수 있으며 무알콜 자가-유화 마이크로에멀젼 시스템은 당업계에 공지되어 있다. 수성상은 전형적으로 물, 약물의 수용액, 글리세롤, PEG300, PEG400, 폴리글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 에틸렌 글리콜의 유도체일 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 오일상은 Captex 300, Captex 355, Capmul MCM, 지방산 에스테르, 중쇄(C8-C12) 모노, 디 및 트리-글리세리드, 폴리옥시에틸화된 글리세릴 지방산 에스테르, 지방 알콜, 폴리글리콜화된 글리세리드, 포화된 폴리글리콜화된 C8-C10 글리세리드, 식물성 오일 및 실리콘 오일을 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다.
마이크로에멀젼은 특히 약물 가용화 및 약물의 증진된 흡수의 관점에서 관심 대상이다. 지질 기반 마이크로에멀젼(o/w 및 w/o 둘 다)은 펩타이드를 포함한 약물의 경구 생체이용률을 증진시키기 위해 제안되었다(참조: 예를 들어, 미국 특허 제6,191,105호; 제7,063,860호; 제7,070,802호; 제7,157,099호; Constantinides et al., Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385-1390; Ritschel, Meth. Find. Exp. Clin. Pharmacol., 1993, 13, 205). 마이크로에멀젼은 개선된 약물 가용화, 효소 가수분해로부터 약물의 보호, 계면활성제에 의한 막 유동성 및 투과성 변경으로 인한 약물 흡수의 가능한 증진, 제조 용이성, 고체 투여 형태에 대한 경구 투여의 용이성, 개선된 임상 효능 및 감소된 독성의 이점을 제공한다(참조: 예를 들어, 미국 특허 제6,191,105호; 제7,063,860호; 제7,070,802호; 제7,157,099호; Constantinides et al., Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385; Ho et al., J. Pharm. Sci., 1996, 85, 138-143). 흔히 마이크로에멀젼은 이들의 성분이 주위 온도에서 함께 합쳐지는 경우 자발적으로 형성될 수 있다. 이것은 특히 열 불안정성 약물, 펩타이드 또는 RNAi 제제를 제형화할 때 유리할 수 있다. 마이크로에멀젼은 또한 화장품 및 제약 적용 둘 다에서 활성 성분의 경피 전달에 효과적이었다. 본원 개시내용의 마이크로에멀젼 조성물 및 제형은 위장관으로부터 RNAi 제제 및 핵산의 증가된 전신 흡수를 촉진할 뿐만 아니라 RNAi 제제 및 핵산의 국소 세포 흡수를 개선시킬 것으로 예상된다.
본원 개시내용의 마이크로에멀젼은 또한 제형의 성질을 개선하고 본원 개시내용의 RNAi 제제 및 핵산의 흡수를 증진시키기 위해 소르비탄 모노스테아레이트(그릴 3), 라브라솔 및 투과 증진제와 같은 추가 성분 및 첨가제를 함유할 수 있다. 본원 개시내용의 마이크로에멀젼에 사용되는 투과 증진제는 5개의 광범위 카테고리--계면활성제, 지방산, 담즙염, 킬레이팅제, 및 비-킬레이팅 비-계면활성제 중 하나에 속하는 것으로서 분류될 수 있다(참조: Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p. 92). 이들 부류의 각각은 상기에서 논의되었다.
iii. 마이크로입자
본원 개시내용의 RNAi 제제는 입자, 예를 들어, 마이크로입자에 혼입될 수 있다. 마이크로입자는 분무 건조에 의해 생성될 수 있지만 또한 동결건조, 증발, 유동층 건조, 진공 건조 또는 이러한 기술의 조합을 비롯한 다른 방법에 의해 생성될 수도 있다.
iv. 투과 증진제
일양태에서, 본원 개시내용은 핵산, 특히 RNAi 제제를 동물의 피부에 효율적으로 전달하기 위해 다양한 투과 증진제를 사용한다. 대부분의 약물은 이온화된 및 비이온화된 형태 둘 다로 용액 중에 존재한다. 그러나, 일반적으로 지용성 또는 친유성 약물만이 용이하게 세포막을 통과한다. 비친유성 약물이라도 통과될 막이 투과 증진제로 처리되는 경우 세포막을 통과할 수 있다는 것이 발견되었다. 세포막을 통한 비친유성 약물의 확산을 돕는 것 외에도 투과 증진제는 또한 친유성 약물의 투과성을 증진시킨다.
투과 증진제는 5가지 광범위한 카테고리 중 하나, 즉 계면활성제, 지방산, 담즙염, 킬레이팅제 및 비-킬레이팅 비-계면활성제 중 하나에 속하는 것으로 분류될 수 있다(참조: 예를 들어, Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p.92). 상기 언급된 부류의 침투 증진제 각각은 하기에 보다 상세하게 기재한다.
계면활성제 (또는 "표면 활성제")는 수용액에 용해되는 경우 수용액과 또 다른 액체 간의 표면 장력 또는 계면 장력을 감소시켜 그 결과 점막을 통한 RNAi 제제의 흡수를 증진시키는 화학적 실체이다. 담즙염 및 지방산에 추가로, 이들 투과 증진제는 예를 들어, 나트륨 라우릴 설페이트, 폴리옥시에틸렌-9-라우릴 에테르 및 폴리옥시에틸렌-20-세틸 에테르를 포함한다(참조: 예를 들어, Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p.92); and perfluorochemical emulsions, such as FC-43. Takahashi et al., J. Pharm. Pharmacol., 1988, 40, 252).
투과 증강제로 작용하는 다양한 지방산 및 이들의 유도체는 예를 들어 올레산, 라우르산, 카프르산(n-데칸산), 미리스트산, 팔미트산, 스테아르산, 리놀레산, 리놀렌산, 디카프레이트, 트리카프레이트, 모노올레인(1-모노올레오일-rac-글리세롤), 디라우린, 카프릴산, 아라키돈산, 글리세롤 1-모노카프레이트, 1-도데실아자사이클로헵탄-2-온, 아실카르니틴, 아실콜린, 이들의 C1-20 알킬 에스테르(예를 들어, 메틸, 이소프로필 및 t-부틸), 및 이들의 모노- 및 디-글리세리드(즉, 올레에이트, 라우레이트, 카프레이트, 미리스테이트, 팔미테이트, 스테아레이트, 리놀레에이트 등)을 포함한다(참조: 예를 들어, Touitou, E., et al. Enhancement in Drug Delivery, CRC Press, Danvers, MA, 2006; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p.92; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; El Hariri et al., J. Pharm. Pharmacol., 1992, 44, 651-654).
담즙의 생리학적 역할은 지질과 지방 가용성 비타민의 분산 및 흡수 촉진을 포함한다(참조: 예를 들어, Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002; Brunton, Chapter 38 in: Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 9th Ed., Hardman et al. Eds., McGraw-Hill, New York, 1996, pp. 934-935). 다양한 천연 담즙염, 및 이들의 합성 유도체는 투과 증진제로서 작용한다. 따라서, 용어 "담즙염"은 이들의 임의의 합성 유도체 뿐만 아니라 담즙의 임의의 천연적으로 존재하는 성분을 포함한다. 적합한 담즙염은, 예를 들어, 콜산(또는 이의 약제학적으로 허용되는 나트륨 염, 나트륨 콜레이트), 데하이드로콜산(나트륨 데하이드로콜레이트), 데옥시콜산(나트륨 데옥시콜레이트), 글루콜산(나트륨 글루콜레이트), 글리콜산(나트륨 글리코콜레이트), 글리코데옥시콜산(나트륨 글리코데옥시콜레이트), 타우로콜산(나트륨 타우로콜레이트), 타우로데옥시콜산(나트륨 타우로데옥시콜레이트), 케노데옥시콜산(나트륨 케노데옥시콜레이트), 우르소데옥시콜산(UDCA), 나트륨 타우로-24,25-디하이드로-푸시데이트(STDHF), 나트륨 글리코디하이드로푸시데이트 및 폴리옥시에틸렌-9-라우릴 에테르(POE)를 포함한다(참조: 예를 들어, Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, page 92, Swinyard, Chapter 39 In: Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1990, pages 782-783, Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Sys 1990, 7, 1-33; Yamamoto et al., J. Pharm. Exp. Ther., 1992, 263, 25; Yamashita et al., J. Pharm. Sci., 1990, 79, 579-583).
본원 개시내용과 관련하여 사용되는 킬레이팅제는 금속 이온과 복합체를 형성하여 용액으로부터 금속 이온을 제거하여 그 결과 점막을 통한 RNAi 제제의 흡수를 증진시키는 화합물로서 정의될 수 있다. 본원 개시내용에서 투과 증진제로서의 이들의 용도와 관련하여, 킬레이팅제는 대부분의 특징 분석된 DNA 뉴클레아제가 촉매를 위해 2가 금속 이온을 필요로함에 따라서 킬레이팅제에 의해 억제되기 때문에 DNase 억제제로서 작용한다는 추가의 이점을 갖는다(참조: Jarrett, J. Chromatogr., 1993, 618, 315-339). 적합한 킬레이팅제는 이나트륨 에틸렌디아민테트라아세테이트(EDTA), 시트르산, 살리실레이트(예를 들어, 나트륨 살리실레이트, 5-메톡시살리실레이트 및 호모바닐레이트), 콜라겐의 N-아실 유도체, 라우레스-9 및 베타-디케톤(엔아민)의 N-아미노 아실 유도체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다(참조: 예를 들어, Katdare, A. et al., Excipient development for pharmaceutical, biotechnology, and drug delivery, CRC Press, Danvers, MA, 2006; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, page 92; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; Buur et al., J. Control Rel., 1990, 14, 43-51).
본원에 사용된 바와 같이, 비-킬레이팅 비-계면활성제 투과 증진 화합물은 킬레이팅제 또는 계면활성제로서 미미한 활성을 나타내지만 그럼에도 불구하고 소화 점막을 통한 RNAi 제제의 흡수를 증진시키는 화합물로 정의될 수 있다(참조: 예를 들어, Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33). 상기 부류의 투과 증진제는 예를 들어, 불포화 사이클릭 우레아, 1-알킬- 및 1-알케닐아자사이클로-알카논 유도체(참조: Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, page 92); 및 비-스테로이드성 항-염증성 제제, 예를 들어, 디클로페낙 나트륨, 인도메타신 및 페닐부타존(참조: Yamashita et al., J. Pharm. Pharmacol., 1987, 39, 621-626)을 포함한다.
세포 수준에서 RNAi 제제의 흡수를 증진시키는 제제는 또한 본원 개시내용의 약제 및 기타 조성물에 첨가될 수 있다. 예를 들어, 양이온성 지질, 예를 들어, 리포펙틴(참조: Junichi et al, 미국 특허 제5,705,188호), 양이온성 글리세롤 유도체, 및 다가양이온성 분자, 예를 들어, 폴리라이신(WO 97/30731)은 또한 dsRNA의 세포 흡수를 증진시키는 것으로 공지되어 있다.
에틸렌 글리콜 및 프로필렌 글리콜과 같은 글리콜, 2-피롤과 같은 피롤, 아존, 및 리모넨 및 멘톤과 같은 테르펜을 포함하는 다른 제제를 활용하여 투여된 핵산의 투과를 증진시킬 수 있다.
vi. 부형제
담체 화합물과 대조적으로, "약제학적 담체" 또는 "부형제"는 하나 이상의 핵산을 동물에게 전달하기 위한 약제학적으로 허용되는 용매, 현탁제, 또는 임의의 다른 약리학적 불활성 비히클이다. 부형제는 액체 또는 고체일 수 있고 주어진 약제학적 조성물의 핵산 및 기타 성분과 조합될 때 목적하는 벌크, 일관성 등을 제공하기 위해 계획된 투여 방식을 염두에 두고 선택된다. 전형적인 약제학적 담체는 결합제(예를 들어, 사전 젤라틴화된 옥수수 전분, 폴리비닐피롤리돈 또는 하이드록시프로필 메틸셀룰로스 등); 충전제(예를 들어, 락토스 및 기타 당, 미세결정질 셀룰로스, 펙틴, 젤라틴, 황산칼슘, 에틸 셀룰로스, 폴리아크릴레이트 또는 인산수소칼슘 등); 윤활제(예를 들어, 마그네슘 스테아레이트, 활석, 실리카, 콜로이드성 이산화규소, 스테아르산, 금속 스테아레이트, 수소화된 식물성 오일, 옥수수 전분, 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 벤조에이트, 나트륨 아세테이트 등); 붕해제(예를 들어, 전분, 나트륨 전분 글리콜레이트 등); 및 습윤제(예를 들어, 나트륨 라우릴 설페이트 등)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
핵산과 해롭게 반응하지 않는 비경구 투여가 아닌 투여를 위해 적합한 약제학적으로 허용되는 유기 또는 무기 부형제를 또한 사용하여 본원 개시내용의 조성물을 제형화할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체는 물, 염 용액, 알콜, 폴리에틸렌 글리콜, 젤라틴, 락토스, 아밀로스, 마그네슘 스테아레이트, 활석, 규산, 점성 파라핀, 하이드록시메틸셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
핵산의 국소 투여를 위한 제형은 멸균 및 비멸균 수용액, 알콜과 같은 일반적인 용매 중의 비수성 용액, 또는 액체 또는 고체 오일 기제 중의 핵산 용액을 포함할 수 있다. 용액은 또한 완충제, 희석제 및 기타 적합한 첨가제를 함유할 수 있다. 핵산과 해롭게 반응하지 않는 비경구 투여가 아닌 투여를 위해 적합한 약제학적으로 허용되는 유기 또는 무기 부형제가 사용될 수 있다.
적합한 약제학적으로 허용되는 부형제는 물, 염 용액, 알콜, 폴리에틸렌 글리콜, 젤라틴, 락토스, 아밀로스, 마그네슘 스테아레이트, 활석, 규산, 점성 파라핀, 하이드록시메틸셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
vii. 다른 성분
본원 개시내용의 조성물은 약제학적 조성물에서 통상적으로 발견되는 다른 부가 성분을 당업계에 확립된 사용 수준으로 추가로 함유할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 조성물은 예를 들어 항소양제, 수렴제, 국소 마취제 또는 항염증제와 같은 추가의 상용성 약제학적 활성 물질을 함유할 수 있거나 본원 개시내용의 조성물의 다양한 투여 형태를 물리적으로 제형화하는 데 유용한 추가 물질, 예를 들어, 염료, 향미제, 방부제, 항산화제, 불투명화제, 증점제 및 안정화제를 함유할 수 있다. 그러나, 이러한 물질은 첨가될 때 본원 개시내용의 조성물의 성분의 생물학적 활성을 과도하게 방해해서는 안 된다. 제형은 멸균화될 수 있고, 경우에 따라, 보조제, 예를 들어 윤활제, 방부제, 안정화제, 습윤제, 유화제, 삼투압에 영향을 미치는 염, 완충제, 착색제, 향미제 또는 방향 물질 등과 혼합될 수 있고, 이들은 제형의 핵산(들)과 해롭게 상호 작용하지 않는다.
수성 현탁액은 예를 들어 나트륨 카복시메틸셀룰로스, 소르비톨 또는 덱스트란을 포함하는 현탁액의 점도를 증가시키는 물질을 함유할 수 있다. 현탁액은 또한 안정화제를 함유할 수 있다.
일부 양태에서, 본원 개시내용에서 특성화된 약제학적 조성물은 (a) 하나 이상의 RNAi 제제 및 (b) 비-RNAi 기전에 의해 기능하고 APOE 관련 신경변성 장애를 치료하는데 유용한 하나 이상의 제제를 포함한다. 이러한 제제의 예는 SSRI, 벤라팍신, 부프로피온 및 비정형 항정신병제를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
상기 화합물의 독성 및 치료학적 효능은 예를 들어, LD50(집단의 50%에 치명적인 용량) 및 ED50(집단의 50%에 예방학적으로 효과적인 용량)을 결정하기 위한 세포 배양물 또는 실험 동물 중에서 표준 약제학적 과정에 의해 결정될 수 있다. 독성 및 치료학적 효과 사이의 용량비가 치료 지수이며, 이는 LD50/ED50 비율로 나타낼 수 있다. 높은 치료학적 지수를 나타내는 화합물이 바람직하다.
세포 배양물 검정 및 동물 연구로부터 수득된 데이터는 인간에서 사용하기 위한 용량 범위를 제형화하는데 사용될 수 있다. 본원 개시내용에서 특성화된 조성물의 용량은 일반적으로 독성이 거의 없는 ED50을 포함하는 순환 농도 범위 내에 있다. 용량은 사용되는 투여 형태 및 사용된 투여 경로에 의존하여 상기 범위 내에서 다양할 수 있다. 본원 개시내용에서 특성화된 방법에 사용되는 임의의 화합물에 대해, 치료학적 유효량은 세포 배양 검정으로부터 초기에 평가될 수 있다. 용량은 동물 모델에서 제형화하여 화합물의 순환 혈장 농도 범위를 성취하거나 적절한 경우 세포 배양물 중에서 결정된 바와 같이 IC50(즉, 증상의 절반-최대 억제를 성취하는 시험 화합물의 농도)을 포함하는 표적 서열의 폴리펩타이드 생성물의 순환 혈장 농도 범위(예를 들어, 폴리펩타이드의 감소된 농도를 성취하는)를 성취할 수 있다. 상기 정보를 사용하여 보다 정확하게 인간에서 유용한 용량을 보다 정확하게 결정할 수 있다. 혈장 내 수준은, 예를 들어, 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 측정될 수 있다.
상기 논의된 바와 같이 이들의 투여에 추가로, 본원 개시내용에서 특성화된 RNAi 제제는 뉴클레오타이드 반복 발현에 의해 매개되는 병리학적 과정의 치료에서 효과적인 다른 공지된 제제와 조합하여 투여될 수 있다. 어떠한 경우에도, 투여 의사는 당업계에 공지되거나 본원에 기재된 효능의 표준 측정을 사용하여 관찰된 결과에 기초하여 RNAi 제제 투여의 양 및 타이밍을 조정할 수 있다.
VIII. 키트
특정 양상에서, 본원 개시내용은 siRNA 화합물, 예를 들어, 이중 가닥 siRNA 화합물 또는 ssiRNA 화합물(예를 들어, 전구체, 예를 들어, ssiRNA 화합물로 가공될 수 있는 보다 큰 siRNA 화합물, 또는 siRNA 화합물, 예를 들어, 이중 가닥 siRNA 화합물, 또는 ssiRNA 화합물, 또는 이의 전구체를 암호화하는 DNA)의 약제학적 제형을 함유하는 적합한 컨테이너를 포함하는 키트를 제공한다. 특정 양태에서, 약제학적 제형의 개별 성분은 하나의 컨테이너에 제공될 수 있다. 대안적으로, 약제학적 제형의 성분을 2개 이상의 컨테이너, 예를 들어 siRNA 화합물 제제를 위한 하나의 컨테이너 및 담체 화합물을 위한 적어도 하나의 컨테이너에 별도로 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 키트는 단일 박스에 하나 이상의 컨테이너와 같은 다양한 구성으로 팩키징될 수 있다. 예를 들어 키트와 함께 제공된 지침에 따라 다양한 성분들이 조합될 수 있다. 성분들은, 예를 들어, 약제학적 조성물을 제조 및 투여하기 위해 본원에 기재된 방법에 따라 조합될 수 있다. 키트는 또한 전달 장치를 포함할 수 있다.
IX. APOE 발현을 억제하기 위한 방법
본원 개시내용은 또한 세포에서 APOE 유전자의 발현을 억제하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 세포를 RNAi 제제, 예를 들어, 이중 가닥 RNA 제제와 세포에서 APOE의 발현을 억제하는 유효량으로 접촉시켜 세포에서 APOE의 발현을 억제하는 단계를 포함한다. 본원 개시내용의 특정 양태에서, APOE는 우선적으로 CNS(예를 들어, 뇌) 세포에서 억제된다. 본원 개시내용의 다른 양태에서, APOE는 우선적으로 간(예를 들어, 간 세포)에서 억제된다. 본원 개시내용의 특정 양태에서, APOE는 CNS(예를 들어, 뇌) 세포에서 및 간(예를 들어, 간세포) 세포에서 억제된다.
일부 양태에서, APOE2의 발현은 억제된다. 일부 양태에서, APOE3의 발현은 억제된다. 일부 양태에서, APOE4의 발현은 억제된다. 일부 양태에서, APOE2 및 APOE3의 발현은 억제된다. 일부 양태에서, APOE2, APOE3 및 APOE4의 발현은 억제된다. 일부 양태에서, APOE4의 발현은 억제되고, APOE2 및 APOE3의 발현은 실질적으로 억제되지 않고, 예를 들어, APOE2 및 APOE3의 발현은 10% 이하까지 억제된다.
세포와 iRNA 제제, 예를 들어, 이중 가닥 RNA 제제의 접촉은 시험관내 또는 생체내 수행될 수 있다. 세포와 iRNA 제제의 생체내 접촉은 대상체, 예를 들어, 인간 대상체 내 세포 또는 세포 그룹과 iRNA 제제를 접촉시키는 단계를 포함한다. 세포와 접촉시키는 시험관내 및 생체내 접촉 방법의 조합도 가능하다.
세포와의 접촉은 상기 논의된 바와 같이 직접적이거나 간접적일 수 있다. 추가로, 세포의 접촉은 본원에 기재되거나 당업계에 공지된 임의의 리간드를 포함하는 표적화 리간드를 통해 성취될 수 있다. 일부 양태에서, 표적화 리간드는 탄수화물 모이어티, 예를 들어 GalNAc 리간드, 또는 RNAi 제제를 관심 대상의 부위로 지시하는 임의의 다른 리간드이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "억제하는"은 "감소시키는", "사일런싱", "하향조절하는", "억제하는(suppressing)", 및 기타 유사 용어와 상호교환적으로 사용되고, 임의의 억제 수준을 포함한다. 특정 양태에서, 예를 들어, 본원 개시내용의 RNAi 제제에 대한 억제 수준은 세포 배양 조건에서 평가될 수 있고, 여기서 세포 배양에서 세포는 10 nM 이하, 1nM 이하 등의 세포 부근 농도에서 LipofectamineTM-매개된 형질감염을 통해 형질감염된다. 소정의 RNAi 제제의 녹다운은 세포 배양물에서 전처리된 수준 대 세포 배양물에서 후처리된 수준의 비교를 통해 결정될 수 있고, 임의로 스크램블된 또는 다른 형태의 대조군 RNAi 제제와 병행하여 처리된 세포와 비교하기도 한다. 예를 들어, 바람직하게는 50% 이상의 세포 배양에서의 녹다운은 "억제하는" 또는 "감소시키는", "하향조절하는" 또는 "억제하는(suppressing)" 등이 발생했음을 나타내는 것으로 식별될 수 있다. 표적화된 mRNA 또는 암호화된 단백질 수준의 평가(따라서 본원 개시내용의 RNAi 제제에 의해 유발된 "억제하는" 정도 등)는 또한 당업계에 기술된 바와 같이 적절하게 제어된 조건 하에서 본원 개시내용의 RNAi 제제에 대한 생체내 시스템에서 평가될 수 있음이 명백히 고려된다.
본원에 사용된 "APOE 유전자의 발현을 억제하는" 또는 "APOE의 발현을 억제하는"이라는 문구는 임의의 APOE 유전자(예를 들어, 마우스 APOE 유전자, 래트 APOE 유전자, 몽키 APOE 유전자 또는 인간 APOE 유전자) 및 APOE 단백질을 암호화하는 APOE 유전자의 변이체 또는 돌연변이체의 발현 억제를 포함한다. 따라서, APOE 유전자는 유전학적으로 조작된 세포, 세포 그룹, 또는 유기체의 맥락에서 야생형 APOE 유전자, 돌연변이체 APOE 유전자, 또는 유전자전이 APOE 유전자일 수 있다.
"APOE 유전자의 발현을 억제하는"은 APOE 유전자의 임의의 억제 수준, 예를 들어 APOE 유전자의 발현의 적어도 부분적 억제, 예를 들어 적어도 20%의 억제를 포함한다. 특정 양태에서, 억제는 적어도 30%, 적어도 40%, 바람직하게 적어도 50%, 적어도 약 60%, 적어도 70%, 적어도 약 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%; 또는 검정 방법의 검출 수준 미만이다.
APOE 유전자의 발현은 APOE 유전자 발현과 관련된 임의의 변수의 수준, 예를 들어, APOE mRNA 수준 또는 APOE 단백질 수준, 또는 예를 들어, 아밀로이드 또는 tau 침착물의 수준에 기초하여 평가될 수 있다.
억제는 대조군 수준과 비교하여 이러한 변수 중 하나 이상의 절대적 또는 상대적 수준의 감소로 평가될 수 있다. 대조군 수준은 당업계에서 사용되는 임의의 유형의 대조군 수준, 예를 들어, 투여 전 수준, 처리되지 않거나 대조군(예를 들어, 완충제만의 대조군 또는 불활성 제제 대조군)으로 처리된 유사 대상체, 세포 또는 샘플로부터 결정된 수준일 수 있다.
본원 개시내용의 방법의 일부 양태에서, APOE 유전자의 발현은 적어도 20%, 30%, 40%, 바람직하게 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%, 또는 검정의 검출 수준 미만으로 억제된다. 특정 양태에서, 방법은 APOE, 예를 들어, HTT의 발현을 감소시키는 제제로 대상체를 치료한 후 임상적으로 관련된 결과에 의해 입증된 바와 같이, APOE 발현의 임상적으로 관련된 억제를 포함한다.
APOE 유전자의 발현의 억제는 APOE 유전자가 전사되고, 처리된 (예를 들어, 세포 또는 세포들과 본원 개시내용의 iRNA를 접촉시킴에 의해 또는 본원 개시내용의 iRNA 제제를 세포가 존재하거나 존재했던 대상체에게 투여함에 의해) 제1 세포 또는 세포 그룹(상기 세포는 예를 들어, 대상체로부터 유래된 샘플 중에 존재할 수 있다)에 의해 발현되는 mRNA의 양의 감소에 의해 나타나 APOE 유전자의 발현은 제1 세포 또는 세포 그룹과 실질적으로 동일하지만 처리되지 않은 제2 세포 또는 세포 그룹(RNAi 제제로 처리되지 않거나 관심 대상의 유전자에 표적화된 RNAi 제제로 처리되지 않은 대조군 세포)과 비교하여 HTT 유전자의 발현은 억제된다. 억제 정도는 하기의 관점에서 표시될 수 있다:
Figure pct00107
다른 양태에서, APOE 유전자의 발현 억제는 APOE 유전자 발현, 예를 들어 APOE 단백질 발현에 기능적으로 연결된 파라미터의 감소의 관점에서 평가될 수 있다. APOE 유전자 사일런싱은 발현 작제물로부터 내인성 또는 이종성인 APOE를 발현하는 임의의 세포에서, 그리고 당업계에 공지된 임의의 검정에 의해 결정될 수 있다.
APOE 단백질의 발현 억제는 세포 또는 세포 그룹에 의해 발현되는 APOE 단백질의 수준(예를 들어, 대상체로부터 유래된 샘플에서 발현된 단백질 수준)의 감소로 나타날 수 있다. 상기 설명한 바와 같이, mRNA 억제의 평가를 위해, 처리된 세포 또는 세포 그룹에서 단백질 발현 수준의 억제는 대조군 세포 또는 세포 그룹에서 단백질 수준의 퍼센트로서 유사하게 표현될 수 있다.
APOE 유전자의 발현 억제를 평가하기 위해 사용할 수 있는 대조군 세포 또는 세포 그룹은 아직 본원 개시내용의 RNAi 제제와 접촉되지 않은 세포, 또는 세포 그룹을 포함한다. 예를 들어, 대조군 세포 또는 세포 그룹은 RNAi 제제를 사용한 대상체의 치료 전에 개별 대상체(예를 들어, 인간 또는 동물 대상체)로부터 유래될 수 있다.
세포 또는 세포 그룹에 의해 발현되는 APOE mRNA의 수준은 mRNA 발현을 평가하기 위해 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 결정할 수 있다. 일양태에서, 샘플에서 APOE의 발현 수준은 전사된 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 일부, 예를 들어 APOE 유전자의 mRNA를 검출함으로써 결정된다. RNA는 예를 들어 산 페놀/구아니딘 이소티오시아네이트 추출(RNAzol B; Biogenesis), RNeasyTM RNA 제조 키트(Qiagen®) 또는 PAXgeneTM(PreAnalytixTM, Switzerland)을 사용함을 포함하는 RNA 추출 기술을 사용하여 세포로부터 추출될 수 있다. 리보핵산 하이브리드화를 사용하는 전형적인 검정 포맷은 핵 전개-온 검정, RT-PCR, RNase 보호 검정, 노던 블롯팅, 동일계 하이브리드화 및 마이크로어레이 분석을 포함한다. 순환 APOE mRNA는 WO2012/177906에 기재된 방법을 사용하여 검출할 수 있으며, 이의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
일부 양태에서, APOE의 발현 수준은 핵산 프로브를 사용하여 결정된다. 본원에 사용된 용어 "프로브"는 특정 APOE 핵산 또는 단백질, 또는 이의 단편에 선택적으로 결합할 수 있는 임의의 분자를 지칭한다. 프로브는 당업자에 의해 합성될 수 있거나 적당한 생물학적 제제로부터 유래할 수 있다. 프로브는 특이적으로 표지되도록 디자인될 수 있다. 프로브로서 사용될 수 있는 분자의 예는 RNA, DNA, 단백질, 항체 및 유기 분자를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
단리된 mRNA는 서던 또는 노던 분석, 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 분석 및 프로브 어레이를 포함하지만 이에 제한되지 않는 하이브리드화 또는 증폭 검정에 사용할 수 있다. mRNA 수준의 결정을 위한 한 가지 방법은 단리된 mRNA를 APOE mRNA에 하이브리드화할 수 있는 핵산 분자(프로브)와 접촉시키는 단계를 포함한다. 일양태에서, mRNA는 예를 들어 아가로스 겔 상에서 단리된 mRNA를 전개시키고 겔로부터의 mRNA를 전달함으로써 니트로셀룰로스와 같은 막 상에 전달하여 고체 상 표면에고정화되고 프로브와 접촉시킨다. 대안적 양태에서, 프로브(들)는 고체 표면 상에 고정화시키고, 상기 mRNA는, 예를 들어, Affymetrix® 유전자 칩 어레이에서 프로브(들)과 접촉시킨다. 당업자는 APOE mRNA의 수준을 결정하는 데 사용하기 위해 공지된 mRNA 검출 방법을 용이하게 채택할 수 있다.
샘플 중에 APOE의 발현 수준을 결정하기 위한 대안적 방법은 예를 들어, RT-PCR(문헌(참조: Mullis, 1987, 미국 특허 제4,683,202호)에 제시된 실험 양태), 리가제 연쇄 반응(참조: Barany (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:189-193), 자가 지속적 서열 복제(참조: Guatelli et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878), 전사 증폭 시스템(참조: Kwoh et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177), Q-베타 레플리카제(참조: Lizardi et al. (1988) Bio/Technology 6:1197), 롤링 서클 복제(참조: Lizardi et al., 미국 특허 제5,854,033호) 또는 임의의 다른 핵산 증폭 방법에 이어서 당업자에게 널리 공지된 기술을 사용한 증폭된 분자의 검출에 의해 샘플 중에 예를 들어, mRNA의 핵산 증폭 또는 역전사 효소(cDNA를 제조하기 위해)의 공정을 포함한다. 이들 검출 기획은 핵산 분자가 매우 적은 수로 존재하는 경우 핵산 분자의 검출에 특히 유용하다. 본원 개시내용의 특정 양상에서, APOE의 발현 수준은 정량적 형광원성 RT-PCR(즉, TaqMan™ 시스템), Dual-Glo® 루시퍼라제 검정에 의해, 또는 APOE 발현 또는 mRNA 수준의 측정을 위해 당업계에서 인지된 다른 방법에 의해 결정된다.
APOE mRNA의 발현 수준은 막 블롯(예를 들어, 노던, 서던, 도트 등과 같은 하이브리드화 분석에 사용된 바와 같은), 또는 마이크로웰, 샘플 튜브, 겔, 비드 또는 섬유(또는 결합된 핵산을 포함하는 임의의 고체 지지체)를 사용하여 모니터링될 수 있다. 본원에 참조로 포함된 미국 특허 제5,770,722호, 제5,874,219호, 제5,744,305호, 제5,677,195호 및 제5,445,934호를 참조한다. APOE 발현 수준의 결정은 또한 용액 중에 핵산 프로브를 사용함을 포함할 수 있다.
일부 양태에서, mRNA 발현의 수준은 측쇄 DNA (bDNA) 검정 또는 실시간 PCR(qPCR)을 사용하여 평가된다. 이들 PCR 방법의 사용은 본원에 제공된 실시예에 기재되고 예시된다. 상기 방법은 또한 APOE 핵산의 검출을 위해 사용될 수 있다.
APOE 단백질 발현의 수준은 단백질 수준의 측정을 위해 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 이러한 방법은 예를 들어 전기영동, 모세관 전기영동, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC), 박층 크로마토그래피(TLC), 과확산 크로마토그래피, 유체 또는 겔 침전 반응, 흡수 분광법, 비색 검정, 분광광도측정 검정, 유동 세포측정, 면역확산(단일 또는 이중), 면역전기영동, 웨스턴 블롯팅, 방사선면역검정(RIA), 효소 결합된 면역흡착 검정(ELISA), 면역형광 검정, 전기화학발광 검정 등을 포함한다. 상기 검정은 또한 APOE 단백질의 존재 또는 복제를 나타내는 단백질의 검출을 위해 사용될 수 있다.
일부 양태에서, APOE-관련 질환의 치료에서 본원 개시내용의 방법의 효능은 APOE mRNA 수준의 감소에 의해 (예를 들어, 뇌 생검 또는 기타 다른 것에 의한 APOE 수준에 대한 CSF 샘플의 평가에 의해) 평가된다.
일부 양태에서, APOE-관련 질환의 치료에서 본원 개시내용의 방법의 효능은 APOE mRNA 수준의 감소에 의해 (예를 들어, 뇌 생검 또는 기타 다른 것에 의한 APOE 수준에 대한 간 샘플의 평가에 의해) 평가된다.
본원 개시내용의 방법의 일부 양태에서, RNAi 제제는 대상체 내의 특정 부위에 iRNA가 전달되도록 대상체에게 투여된다. APOE의 발현 억제는 대상체 내 특정 부위로부터 유체 또는 조직으로부터 유래된 샘플, 예를 들어, CNS 세포에서 APOE mRNA 또는 APOE 단백질의 수준 또는 수준에서의 변화의 측정을 사용하여 평가될 수 있다. 특정 양태에서, 방법은 APOE, 예를 들어, HTT의 발현을 감소시키는 제제로 대상체를 치료한 후 임상적으로 관련된 결과에 의해 입증된 바와 같이, APOE 발현의 임상적으로 관련된 억제를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 분석물의 수준을 검출하거나 결정하는 용어는 물질, 예를 들어 단백질, RNA가 존재하는지 여부를 결정하기 위한 단계를 수행하는 것을 의미하는 것으로 이해된다. 본원에 사용된 바와 같이, 검출 또는 결정 방법은 사용된 방법에 대한 검출 수준 미만인 임의의 분석물 수준의 검출 또는 측정을 포함한다.
X. APOE-관련 신경변성 질환을 치료하거나 예방하는 방법
본원 개시내용은 또한 세포에서 APOE 발현을 감소 또는 억제하기 위해 본원 개시내용의 RNAi 제제 또는 본원 개시내용의 RNAi 제제를 함유하는 조성물을 사용하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 세포를 본원 개시내용의 dsRNA와 접촉시키는 단계 및 APOE 유전자의 mRNA 전사체의 분해를 수득하기에 충분한 시간 동안 세포를 유지함으로써 세포에서 APOE 유전자의 발현을 억제하는 단계를 포함한다. 유전자 발현에서의 감소는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 평가될 수 있다. 예를 들어, APOE의 발현 감소는 당업자에게 일상적인 방법, 예를 들어 노던 블롯팅, qRT-PCR을 사용하여 APOE의 mRNA 발현 수준을 결정함에 의해 또는 웨스턴 블롯팅, 면역학적 기술과 같은 당업자에게 일상적인 방법을 사용하여 APOE의 단백질 수준을 결정함에 의해 결정될 수 있다.
본원 개시내용의 방법에서, 세포는 시험관내 또는 생체내 접촉될 수 있고, 즉, 상기 세포는 대상체 내에 있을 수 있다.
본원 개시내용의 방법을 사용한 치료에 적합한 세포는 APOE 유전자를 발현하는 임의의 세포일 수 있다. 본원 개시내용의 방법에 사용하기에 적합한 세포는 포유동물 세포, 예를 들어 영장류 세포(예를 들어, 인간 세포 또는 비-인간 영장류 세포, 예를 들어 몽키 세포 또는 침팬지 세포), 비-영장류 세포(예를 들어, 래트 세포 또는 마우스 세포)일 수 있다. 일양태에서, 세포는 인간 세포, 예를 들어, 인간 CNS 세포이다. 일양태에서, 세포는 인간 세포, 예를 들어, 인간 간 세포이다. 일양태에서, 세포는 인간 세포, 예를 들어, 인간 CNS 세포 및 인간 간 세포이다.
APOE 발현은 세포에서 적어도 약 30, 40, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 약 100%, 즉, 검출 수준 미만으로 억제된다. 바람직한 양태에서, APOE 발현은 적어도 50%까지 억제된다.
본원 개시내용의 생체내 방법은 RNAi 제제를 함유하는 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함할 수 있고, 여기서 RNAi 제제는 치료될 포유류의 APOE 유전자의 RNA 전사체의 적어도 일부에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 치료될 유기체가 인간과 같은 포유류인 경우, 조성물은 경구, 복막내, 또는 두개내(예를 들어, 뇌실내, 실질내 및 척수강내), 정맥내, 근육내, 유리체내, 피하, 경피, 기도(에어로졸 ), 비강, 직장 및 국소(협측 및 설하 포함) 투여를 포함하는 비경구 경로를 포함하지만 이에 제한되지 않는 당업계에 공지된 임의의 수단에 의해 투여될 수 있다. 특정 양태에서, 조성물은 정맥내 주입 또는 주사에 의해 투여된다. 특정 양태에서, 조성물은 피하 주사에 의해 투여된다. 특정 양태에서, 조성물은 척수강내 주사에 의해 투여된다.
일부 양태에서, 투여는 데포 주사를 통해서이다. 데포 주사는 장기간 동안 일정한 방식으로 RNAi 제제를 방출할 수 있다. 따라서, 데포 주사는 목적하는 효과, 예를 들어 목적하는 APOE 억제, 또는 치료학적 또는 예방학적 효과를 수득하기 위해 필요한 투여 빈도를 감소시킬 수 있다. 데포 주사는 또한 보다 일관된 혈청 농도를 제공할 수 있다. 데포 주사는 피하 주사 또는 근육내 주사를 포함할 수 있다. 바람직한 양태에서, 데포 주사는 피하 주사이다.
일부 양태에서, 투여는 펌프를 통해서이다. 펌프는 외용 펌프 또는 수술적으로 이식된 펌프일 수 있다. 특정 양태에서, 펌프는 피하 이식된 삼투압 펌프이다. 다른 양태에서, 펌프는 주입 펌프이다. 주입 펌프는 두개내, 정맥내, 피하, 동맥 또는 경막외 주입을 위해 사용될 수 있다. 바람직한 양태에서, 주입 펌프는 피하 주입 펌프이다. 다른 양태에서, 펌프는 RNAi 제제를 CNS에 전달하는 수술적으로 이식된 펌프이다.
투여 방식은 국소 또는 전신 치료가 요구되는지 및 치료될 영역에 기초하여 선택될 수 있다. 투여 경로 및 부위는 표적화를 증진시키기 위해 선택될 수 있다.
하나의 양상에서, 본원 개시내용은 또한 포유류 내 APOE 유전자의 발현을 억제하기 위한 방법을 제공한다. 상기 방법은 포유류의 세포에서 APOE 유전자를 표적화하는 dsRNA를 포함하는 조성물을 포유류에 투여하는 단계 및 APOE 유전자의 mRNA 전사체의 분해를 수득하여 세포에서 APOE 유전자의 발현을 억제하기에 충분한 시간 동안 포유류를 유지하는 단계를 포함한다. 유전자 발현에서의 감소는 당업계에 공지된 임의의 방법 및 본원에 기재된 방법, 예를 들어, qRT-PCR에 의해 평가될 수 있다. 단백질 생성에서의 감소는 당업계에 공지된 임의의 방법, 예를 들어, 본원에 기재된 방법, 예를 들어, ELISA에 의해 평가될 수 있다. 일양태에서, CNS 생검 샘플 또는 뇌척수액(CSF) 샘플은 APOE 유전자 또는 단백질 발현(또는 이에 따른 프록시)의 감소를 모니터링하기 위한 조직 물질로서 작용한다.
본원 개시내용은 이를 필요로 하는 대상체의 치료 방법을 추가로 제공한다. 본원 개시내용의 치료 방법은 치료학적 유효량의 APOE 유전자를 표적화하는 RNAi 제제로 본원 개시내용의 RNAi 제제 또는 aAPOE 유전자를 표적화하는 RNAi 제제를 포함하는 약제학적 조성물을 대상체, 예를 들어, APOE 발현의 억제가 이득이 되는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
또한, 본원 개시내용은 APOE-관련 신경변성 질환 또는 장애, 예를 들어, 아밀로이드-β-매개된 질환, 예를 들어, 알츠하이머 질환, 다운 증후군 및 대뇌 아밀로이드 혈관병증 또는 tau-매개된 질환, 예를 들어, 1차 타우병증, 예를 들어, 전두측두엽 치매(FTD), 진행성 핵상 마비(PSP), 척수기저 변성(CBD), 픽 질환(PiD), 구상 신경교 타우병증(GGT), 파킨슨증을 동반한 전두측두엽 치매(FTDP, FTDP-17), 만성 외상성 뇌병증(CTE), 권투선수 치매, 전두측두엽 변성(FTLD), 호은성 곡물 질환(AGD) 및 1차 연령 관련 타우병증(PART), 또는 2차 타우병증, 예를 들어, AD, 크로이츠펠트 야콥 질환, 다운 증후군 및 가족성 영국 치매를 예방하거나, 치료하거나 이의 진행을 억제하는 방법을 제공한다.
상기 방법은 치료학적 유효량의 임의의 RNAi 제제, 예를 들어, dsRNA 제제, 또는 본원에 제공된 약제학적 조성물을 대상체에게 투여함으로써 대상체에서 APOE-관련 신경변성 질환 또는 장애를 예방하거나, 치료하거나 이의 진행을 억제하는 것을 포함한다.
본원 개시내용의 RNAi 제제는 "유리된 RNAi 제제"로서 투여될 수 있다. 유리된 RNAi 제제는 약제학적 조성물의 부재하에 투여된다. 나출된 RNAi 제제는 적합한 완충 용액 중에 있을 수 있다. 완충 용액은 아세테이트, 시트레이트, 프롤라민, 카보네이트 또는 포스페이트, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 일양태에서, 완충 용액은 포스페이트 완충 식염수(PBS)이다. RNAi 제제를 함유하는 완충 용액의 pH 및 삼투압은 대상체에게 투여하기에 적합하도록 조정될 수 있다.
대안적으로, 본원 개시내용의 RNAi 제제는 dsRNA 리포좀 제형과 같은 약제학적 조성물로서 투여될 수 있다.
APOE 유전자 발현의 감소 또는 억제가 이득이 되는 대상체는 APOE-관련 신경변성 질환을 갖는 대상체이다.
본원 개시내용은 추가로 APOE 발현의 감소 및/또는 억제가 이득이 되는 대상체, 예를 들어 APOE 관련 신경변성 장애를 갖는 대상체를 다른 약제 또는 다른 치료학적 방법, 예를 들어, 이들 장애를 치료하기 위해 현재 사용되는 것들과 같은 공지된 약제 또는 공지된 치료학적 방법과 조합하여 치료하기 위한 RNAi 제제 또는 이의 약제학적 조성물의 사용 방법을 제공한다. 예를 들어, 특정 양태에서, APOE를 표적화하는 RNAi 제제는, 예를 들어, 본원의 다른 곳에 기재되거나 당업계에 달리 공지된 바와 같은 APOE 관련 신경변성 장애를 치료하는 데 유용한 제제와 조합하여 투여된다. 예를 들어, APOE 발현의 감소가 이득이 되는 대상체, 예를 들어 APOE 관련 신경변성 장애를 갖는 대상체를 치료하기에 적합한 추가 제제는 APOE의 증상을 치료하기 위해 현재 사용되는 제제를 포함할 수 있다. RNAi 제제 및 추가의 치료학적 제제는 동시에 또는 동일한 조합으로 투여, 예를 들어, 척수강내로 투여될 수 있거나, 추가의 치료학적 제제는 별도의 조성물의 일부로서 또는 별도의 시간에 및/또는 당업계에 공지되거나 본원에 기재된 또 다른 방법에 의해 투여될 수 있다.
일양태에서, 방법은 표적 APOE 유전자의 발현이 감소되도록 본원에서 특성화된는 조성물을 적어도 1개월 동안 투여하는 것을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 발현은 적어도 2개월, 3개월, 또는 6개월 동안 감소된다.
바람직하게는, 본원에 특성화된 방법 및 조성물에 유용한 RNAi 제제는 표적 APOE 유전자의 RNA(1차 또는 가공)를 특이적으로 표적화한다. RNAi를 사용한 이들 유전자의 발현을 억제하기 위한 조성물 및 방법은 본원에 기재된 바와 같이 제조되고 수행될 수 있다.
본원 개시내용의 방법에 따른 dsRNA의 투여는 APOE 관련 신경변성 장애를 갖는 환자에서 이러한 질환 또는 장애의 중증도, 징후, 증상 또는 마커의 감소를 유도할 수 있다. 상기 맥락에서 "감소"는 이러한 수준에서 통계학적으로 유의적이거나 임상적으로 유의적인 감소를 의미한다. 감소는, 예를 들어, 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 약 100%일 수 있다.
질환의 치료 또는 예방의 효능은 예를 들어 질병 진행, 질환 완화, 증상 중증도, 통증 감소, 삶의 질, 치료 효과를 유지하는 데 필요한 약물의 용량, 질환 마커의 수준 또는 예방을 위해 치료되거나 표적화된 소정의 질환에 적절한 임의의 다른 측정 가능한 파라미터를 측정함에 의해 평가될 수 있다. 이러한 파라미터 중 어느 하나 또는 파라미터의 임의의 조합을 측정함으로써 치료 또는 예방의 효능을 모니터링하는 것은 당업자의 능력 범위 내에 있다. 예를 들어, APOE 관련 신경변성 장애의 치료 효능은 예를 들어 대상체의 인지, 학습 및/또는 기억력의 주기적 모니터링에 의해 평가될 수 있다. 이후 판독값과 초기 판독값의 비교는 의사에게 치료가 효과적인지의 징후를 제공한다. 이러한 파라미터 중 어느 하나 또는 파라미터의 임의의 조합을 측정함으로써 치료 또는 예방의 효능을 모니터링하는 것은 당업자의 능력 범위 내에 있다. APOE를 표적화하는 RNAi 제제 또는 이의 약제학적 조성물의 투여와 관련하여, APOE 관련 신경변성 장애 "에 대해 효과적인"은 임상적으로 적절한 방식으로의 투여가 환자의 적어도 통계학적으로 유의적인 부분에 대해 이로운 효과, 예를 들어, 증상의 개선, 치유, 질환의 감소, 수명 연장, 삶의 질 개선 또는 APOE 관련 신경변성 장애 및 관련 원인 치료에 정통한 의사가 일반적으로 양성으로 인정하는 기타 효과를 유도함을 지적한다.
치료 또는 예방 효과는 질환 상태의 하나 이상의 파라미터에서 통계학적으로 유의적인 개선이 있거나 그렇지 않으면 예상되는 증상이 악화되거나 발병하지 않음으로써 명백하다. 하나의 예로서, 질환의 측정 가능한 파라미터에서 적어도 10%, 및 바람직하게는 적어도 20%, 30%, 40%, 50% 또는 그 이상의 유리한 변화는 효과적인 치료를 나타낼 수 있다. 소정의 RNAi 제제 약물 또는 상기 약물의 제형에 대한 효능은 또한 당업계에 공지된 바와 같은 소정의 질환에 대한 실험 동물 모델을 사용하여 판단될 수 있다. 실험 동물 모델을 사용하는 경우, 치료 효능은 마커 또는 증상에서 통계학적으로 유의적인 감소가 관찰되는 경우 입증된다.
대안적으로, 효능은 임상적으로 허용되는 질환 중증도 등급화 스케일을 기준으로 하는 진단에 대해 당업자에 의해 결정된 바와 같은 질환 중증도의 감소에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, 적절한 스케일을 사용하여 측정된 질환의 중증도의 감소를 초래하는 임의의 양성 변화는 본원에 기재된 바와 같은 RNAi 제제 또는 RNAi 제제 제형을 사용한 적절한 치료를 나타낸다.
대상체는 치료학적 양의 dsRNA, 예를 들어, 약 0.01 mg/kg 내지 약 200 mg/kg을 투여받을 수 있다.
RNAi 제제는 규칙적으로 일정 기간 동안 척수강내로, 유리체내 주사를 통해 또는 정맥내 주입에 의해 투여될 수 있다. 특정 양태에서, 초기 치료 용법 후, 치료는 덜 빈번한 기반으로 투여될 수 있다. RNAi 제제의 투여는 예를 들어, 세포, 조직, 혈액, CSF 샘플 또는 환자의 다른 구획에서 APOE 수준을 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 적어도 약 99% 이상까지 감소시킬 수 있다. 바람직한 양태에서, RNAi 제제의 투여는 예를 들어 세포, 조직, 혈액, CSF 샘플 또는 환자의 다른 구획에서 APOE 수준을 적어도 50%까지 감소시킬 수 있다.
전체 용량의 RNAi 제제를 투여하기 전에 환자에게 5% 주입 반응과 같은 보다 적은 용량을 투여하고 알레르기 반응과 같은 부작용에 대해 모니터링될 수 있다. 또 다른 예에서, 환자는 증가된 사이토킨(예를 들어, TNF-알파 또는 INF-알파) 수준과 같은 원치 않는 면역자극 효과에 대해 모니터링될 수 있다.
대안적으로, RNAi 제제는 피하, 즉 피하 주사에 의해 투여될 수 있다. 하나 이상의 주사를 사용하여 목적하는 용량, 예를 들어, 매월 용량의 RNAi 제제를 대상체에게 전달할 수 있다. 주사는 일정 기간 동안 반복될 수 있다. 투여는 정기적 기반으로 반복될 수 있다. 특정 양태에서, 초기 치료 용법 후, 치료는 덜 빈번한 기반으로 투여될 수 있다. 반복-용량 용법은 예를 들어 매월 또는 분기 1회로의 연장, 1년에 2회, 1년에 1회와 같이 정기적으로 치료학적 양의 RNAi 제제의 투여를 포함할 수 있다. 특정 양태에서, RNAi 제제는 약 1개월에 1회 내지 약 분기별 1회(즉, 약 3개월 마다 1회) 투여된다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야의 통상적인 숙련가에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것들과 유사하거나 등가인 방법 및 재료가 본 발명에서 특성화된 RNAi 제제 및 방법의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 재료가 하기에 기재되어 있다. 본원에서 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허 및 기타 참조 문헌은 그 내용 전체가 참조로 포함된다. 상기 문헌들과 내용상 상충하는 경우가 발생하는 경우에는, 정의를 포함하는 본 명세서가 우선할 것이다. 추가로, 상기 재료, 방법 및 예는 단지 예시적인 것이고 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
비공식적 서열 목록이 이와 함께 제출되고 제출된 명세서의 일부를 형성한다.
실시예
실시예 1. RNAi 제제 디자인, 합성, 선택, 및 시험관내 평가
본 실시예는 APOE RNAi 제제의 디자인, 합성, 선택 및 시험관내 평가를 위한 방법을 기재한다.
시약 공급원
시약의 공급원이 여기에 구체적으로 주어지지 않는 경우, 상기 시약은 분자 생물학에 적용하기 위한 품질/순도 표준에서 분자 생물학 시약 공급업체로부터 수득될 수 있다.
생물정보학
인간 아포지단백질 E(APOE; 인간 NCBI refseqID NM_000041.4; NCBI GeneID: 348)를 표적화하는 siRNA 세트는 커스텀 R 및 Python 스크립트를 사용하여 디자인하였다. 인간 NM_000041 REFSEQ mRNA 버전 4는 1166개의 뉴클레오타이드 길이를 갖는다.
APOE 단일 가닥 및 듀플렉스는 당업계에 공지된 통상적인 방법을 사용하여 제조하였다. 변형되지 않은 APOE 센스 및 안티센스 가닥 서열의 상세한 목록은 표 2 및 4에 나타내고 변형된 APOE 센스 및 안티센스 가닥 서열의 상세한 목록은 표 3 및 5에 나타낸다.
표 7은 병원성 APOE4 대립유전자를 표적화하는 표 2의 해당 제제의 변형되지 않은 APOE 센스 및 안티센스 가닥 서열의 상세한 목록을 제공하고 표 8은 병원성 APOE4 대립 유전자를 표적화하는 표 3의 해당 제제의 변형된 APOE 센스 및 안티센스 가닥 서열의 상세한 목록을 제공한다.
siRNA 합성
siRNA는 당업계에 공지된 통상적인 방법을 사용하여 합성하고 어닐링하였다. 간략하게, siRNA 서열은 고체 지지체 상에 포스포르아미디트 화학을 사용한 Mermade 192 합성기(BioAutomation)를 사용하여 1μmol 스케일상에서 합성하였다. 고체 지지체는 커스텀 GalNAc 리간드(3'-GalNAc 접합체), 범용 고체 지지체(AM Chemicals) 또는 관심 대상의 제1 뉴클레오타이드가 부하된 제어된 공극 유리 (500-1000Å)이다. 보조 합성 시약 및 표준 2-시아노에틸 포스포르아미디트 단량체(2'-데옥시-2'-플루오로, 2'-O-메틸, RNA, DNA)는 Thermo-Fisher(Milwaukee, WI), Hongene(China), 또는 Chemgenes(Wilmington, MA, USA)로부터 수득한다. 추가의 포스포르아미디트 단량체는 상업적 공급업체로부터 조달하거나, 인-하우스 준비하거나, 다양한 CMO로부터 커스텀 합성을 사용하여 조달하였다. 포스포르아미디트는 아세토니트릴 또는 9:1 아세토니트릴:DMF에서 100 mM의 농도로 제조되었고 400초의 반응 시간으로 5-에틸티오-1H-테트라졸(ETT, 아세토니트릴 중 0.25 M)을 사용하여 커플링되었다. 포스포로티오에이트 연결은 무수 아세토니트릴/피리딘(9:1 v/v) 중에서 3-((디메틸아미노-메틸리덴)아미노)-3H-1,2,4-디티아졸-3-티온(DDTT, Chemgenes (Wilmington, MA, USA)에서 입수)의 100 mM 용액을 사용하여 생성되었다. 산화 시간은 5분이었다. 모든 서열은 DMT 그룹의 최종 제거("DMT 오프")로 합성되었다.
고체상 합성이 완료되면, 고체 지지된 올리고리보뉴클레오타이드를 실온에서 약 2시간 동안 96웰 플레이트에서 300 μL의 메틸아민(40% 수성)으로 처리하여 고체 지지체로부터 절단을 제공하고 후속적으로 모든 추가 염기 불안정한 보호 그룹을 제거하였다. 3급-부틸 디메틸 실릴(TBDMS) 그룹으로 보호된 임의의 천연 리보뉴클레오타이드 연결(2'-OH)을 포함하는 서열의 경우, TEA.3HF(트리에틸아민 트리히드로플루오라이드)를 사용하여 두 번째 탈보호 단계를 수행하였다. 수성 메틸아민의 각 올리고뉴클레오타이드 용액에 200 μL의 디메틸 설폭사이드(DMSO) 및 300 μL의 TEA.3HF를 첨가하고 용액을 60℃에서 약 30분 동안 항온처리하였다. 항온처리 후, 플레이트를 실온이 되도록 하고 1 mL의 9:1 아세톤트릴:에탄올 또는 1:1 에탄올:이소프로판올을 첨가하여 조 올리고뉴클레오타이드를 침전시켰다. 그런 다음 플레이트를 4℃에서 45분 동안 원심분리하고 상등액을 다중 채널 피펫을 사용하여 조심스럽게 따라내었다. 올리고뉴클레오타이드 펠릿을 20 mM NaOAc에 재현탁시키고 이어서 자동샘플러, UV 검출기, 전도도 측정기 및 분획 수집기가 장착된 Agilent LC 시스템에서 HiTrap 크기 배제 컬럼(5 mL, GE Healthcare)을 사용하여 탈염하였다. 탈염된 샘플은 96웰 플레이트에서 수거하였고, 이어서 LC-MS 및 UV 분광측정기에 의해 분석하여 각각 물질의 실체를 확인하고 이의 양을 정량하였다.
단일 가닥의 듀플렉싱은 Tecan 액체 핸들링 로봇 상에서 수행하였다. 센스 및 안티센스 단일 가닥을 96웰 플레이트의 1x PBS에서 10 μM의 최종 농도로 등몰비로 결합하고, 플레이트를 밀봉하고, 100℃에서 10분 동안 항온처리한 다음, 2-3시간 동안 서서히 실온으로 복귀하도록 방치하였다. 각각의 듀플렉스의 농도 및 실체를 확인하였고 이어서 후속적으로 시험관내 스크리닝 검정을 위해 사용하였다.
세포 배양 및 형질감염
세포는 각각의 siRNA 듀플렉스의 4개 복사체와 함께 웰당 5 μL의 siRNA 듀플렉스에 대한 웰(Invitrogen, Carlsbad CA. cat # 13778-150)당 4.9 μL의 Opti-MEM + 0.1 μL의 RNAiMAX를 96-웰 플레이트에 첨가함에 의해 형질감염시키고, 15분 동안 실온에서 항온처리하였다. 이어서, ~1.5 x104개 세포를 함유하는 40 μL의 MEDIA를 siRNA 혼합물에 첨가하였다. 세포는 RNA 정제 전에 24시간 동안 항온처리하였다. 실험은 10 nM에서 수행하였다. EMEM(Gibco 카탈로그 번호 30)을 사용하여 인간 간종 Hep3B 세포(ATCC HB-8064)에서 형질감염 실험을 수행하였다.
DYNABEADS mRNA 단리 키트를 사용한 총 RNA 단리
RNA는 DYNABEAD(Invitrogen, cat#61012)를 사용한 BioTek-EL406 플랫폼 상에서 자동화 프로토콜을 사용하여 단리하였다. 간략하게, 70 μL의 용해/결합 완충액 및 3 μL의 자기 비드를 함유하는 10 μL의 용해 완충액을 세포를 갖는 플레이트에 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 10분 동안 전자기 진탕기 상에서 항온처리한 다음, 자기 비드를 포획하고 상등액을 제거하였다. 그런 다음 비드 결합된 RNA를 150 μL 세척 완충액 A로 2회 세척하고 세척 완충액 B로 1회 세척하였다. 이어서 비드를 150 μL의 용출 완충액으로 세척하고 다시 포획하고 상등액을 제거하였다.
ABI 고성능 cDNA 역전사 키트(Applied Biosystems, Foster City, CA, Cat #4368813)를 사용한 cDNA 합성
반응당 1μL의 10X 완충액, 0.4μL의 25X dNTP, 1μL의 10x 무작위 프라이머, 0.5μL의 역전사효소, 0.5μL의 RNase 억제제 및 6.6μL의 H2O를 함유하는 10μL의 마스터 혼합물을 상기 단리된 RNA에 첨가하였다. 플레이트는 밀봉시키고, 혼합하고, 실온에서 10분 동안 전자기 진탕기 상에서 항온처리하고, 이어서 37℃에서 2시간 항온처리하였다.
실시간 PCR
2μL의 cDNA를 384웰 플레이트(Roche cat # 04887301001)에서 웰당 0.5μL의 인간 또는 마우스 GAPDH TaqMan 프로브(ThermoFisher cat 4352934E 또는 4351309)와 0.5μL의 적절한 APOE 프로브(시판되는, 예를 들어, Thermo Fisher로부터) 및 5μL 라이트사이클러 480 프로브 마스터 혼합물(Roche cat # 04887301001)을 함유하는 마스터 혼합물에 첨가하였다. 실시간 PCR은 라이트사이클러480 실시간 PCR 시스템(Roche)에서 수행하였다. 각각의 듀플렉스는 N=4로 시험하였고 데이터를 비표적화 대조군 siRNA로 형질감염된 세포에 대해 정규화하였다. 상대적 배수 변화를 계산하기 위해, 실시간 데이터를 ΔΔCt 방법을 사용하여 분석하고 비표적화 대조군 siRNA로 형질감염된 세포로 수행된 검정에 대해 정규화하였다.
표 5의 제제를 사용하여 Hep3B 세포에서 단일 용량 스크리닝의 결과는 표 6에 제공된다.
Figure pct00108
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실시예 2. 유전자전이 마우스에서 생체내 평가
본 실시예는 알츠하이머 질환의 APPPS1-21 유전자전이 마우스 모델에서 APOE RNAi 제제의 생체내 평가 방법을 기재한다. 이들 마우스는 스웨덴 돌연변이 (KM670/671NL)를 갖는 인간 아밀로이드 전구체 단백질(APP) cDNA 및 L166P 돌연변이를 갖는 돌연변이체 PS1을 과발현한다. 이들 마우스의 내인성 ApoE 유전자는 인간 APOE3 대립유전자 또는 인간 APOE4 대립유전자로 대체되었다(참조: Huynh, et al. (2017) Neuron 96: 1013-1023).
실시예 1에서 디자인되고 검정된 선택된 dsRNA 제제의 능력은 이들 동물의 뇌 및 간에서 APOE 발현 수준, 예를 들어 APOE2, APOE3 및 APOE4 발현 수준을 감소시키는 능력에 대해 평가된다.
간단히 말해서, 한배새끼는 관심 대상인 dsRNA 제제의 단일 용량 또는 위약을 척수강내 또는 피하로 투여된다. 투여 2주 후, 동물을 희생시키고, 대뇌 피질, 척수, 간, 비장 및 경부 림프절을 포함하는 혈액 및 조직 샘플을 수거한다.
APOE mRNA 수준에 대한 APOE 표적화 dsRNA 제제의 투여 효과를 결정하기 위해 qRT-PCR에 의해 피질 및 간 샘플에서 mRNA 수준을 결정한다.
상기 마우스 모델에서 알츠하이머 질환의 병리학에 대한 APOE를 표적화하는 제제의 투여 효과는 또한 문헌(참조: Huynh, et al. (상기 참조))에 기재된 바와 같이 평가된다.
한배새끼는 출생 시 및 8주령에 척수강내 또는 피하로 관심 대상의 dsRNA 제제 또는 위약의 2회 용량을 투여받는다. 투여 16주 후, 동물을 희생시키고, 대뇌 피질, 척수, 간, 비장 및 경부 림프절을 포함하는 혈액 및 조직 샘플을 수거하고, 적당히 가공한다.
Aβ 플라크의 침착, Aβ의 축적, 총 신경염 이영양증, 플라크 크기 및 플라크분포에 대한 dsRNA 제제의 효과를 평가한다. 간략하게, 조직 샘플의 면역형광 분석을 위해, 고정 후 적어도 24시간 동안 슈크로스에 침지시킨 후 마이크로톰을 사용하여 전두엽 피질에서 미측 해마(우측 반구)까지 일련의 관상 분절을 수거한다. 각 뇌의 우측 반구에서 3개의 해마 함유 분절을 X34 염료로 염색하여 원섬유 플라크를 가시화하거나 아밀로이드-β(예를 들어, 82E1) 및 해당 형광 표지된 2차 항체에 대한 상업적으로 이용 가능한 항체로 염색한다. 분석을 위해, 염색된 분절을 공초점 현미경으로 20배 배율로 스캔한다. 플라크 클러스터를 포함하는 무작위 윈도우는 모든 분절에 대해 z 평면에서 동일한 두께에 걸쳐 캡처한다. 적합한 소프트웨어를 사용하여, 마커의 용적을 동일한 임계값하에 정량한다. 각각의 데이터 포인트는 하나의 단일 동물의 세 가지 개별 조직 분절의 평균값을 나타낸다.
실시예 3. 인간화된 APOE 마우스에서 생체내 평가
상기 연구를 위한 인간화된 ApoE4 녹인 마우스(Jax에서 구입; 스톡 # 027894)는 표준 기술을 사용하여 마우스 Apoe 유전자의 엑손 2, 3 및 대부분의 엑손 4를 엑손 2, 3 및 4 (및 일부 3' UTR 서열)을 포함하는 인간 APOE4 유전자 서열로 대체하여 생성되었다.
0일째에 관심 대상의 듀플렉스의 생체내 효능을 평가하기 위해, 9-12주령의 수컷 및 암컷의 케타민/크실라진 마취된 동형접합성 인간화된 APOE 녹인 마우스에 단일 300 μg 용량의 AD-1204704, AD-1204705, AD-1204705, AD-1204706 AD-1204707, AD-1204708, AD-1204709, AD-1204710, AD-1204711, AD-1204712, 또는 AD-1204713, 또는 인공 CSF(aCSF) 대조군을 25μl 해밀턴 주사기(Hamilton syringe) 및 커스텀 각도의 3.5mm 바늘을 사용하는 뇌심실내 주사(ICV)에 의해 우심실로 투여하였다.
표 9는 병원성 본 실시예에 사용되는 제제의 변형되지 않은 APOE 센스 및 안티센스 가닥 서열의 상세한 목록을 제공하고 표 10은 본 실시예에 사용되는 제제의 변형된 APOE 센스 및 안티센스 가닥 서열의 상세한 목록을 제공한다.
투여 후 14일에, 동물을 희생시키고, 뇌 및 간의 양쪽 반구를 수거하여 액체 질소에서 급속 냉동시켰다. 조직에서 mRNA를 추출하여 RT-QPCR 방법으로 분석하였다.
상기 분석 결과는 도 1a 및 도 1b에 제공되고, 단일 300 mg 용량의 AD-1204704, AD-1204705, AD-1204708, 또는 AD-1204712가 말초 APOE 발현에 대한 보다 적은 효과(도 1b)와 함께 뇌에서 APOE 발현(도 1a)을 녹다운시킴을 입증한다.
도 2는 시험관내 제제의 활성과 생체내 제제의 활성 간의 상관관계를 도시한다. 구체적으로, Hep3B 세포(10 nM에서)에서 80% 초과의 녹다운을 나타낸 45개의 듀플렉스 중에서, 시험관내 스크리닝에서 동정된 상위 4개의 듀플렉스는 생체내에서 최고의 활성을 보여주었다(원형으로 표시된 제제, 즉 AD-1204704, AD- 1204705, AD-1204708 또는 AD-1204712).
Figure pct00143
Figure pct00144
SEQUENCE LISTING <110> ALNYLAM PHARMACEUTICALS, INC. BOSTWICK, Bret Lee PENG, Haiyan MCININCH, James D. CASTORENO, Adam SCHLEGEL, Mark K. <120> APOLIPOPROTEIN E (APOE) IRNA AGENT COMPOSITIONS AND METHODS OF USE THEREOF <130> 121301-11220 <140> <141> <150> 63/015,867 <151> 2020-04-27 <160> 739 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1166 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 ctactcagcc ccagcggagg tgaaggacgt ccttccccag gagccgactg gccaatcaca 60 ggcaggaaga tgaaggttct gtgggctgcg ttgctggtca cattcctggc aggatgccag 120 gccaaggtgg agcaagcggt ggagacagag ccggagcccg agctgcgcca gcagaccgag 180 tggcagagcg gccagcgctg ggaactggca ctgggtcgct tttgggatta cctgcgctgg 240 gtgcagacac tgtctgagca ggtgcaggag gagctgctca gctcccaggt cacccaggaa 300 ctgagggcgc tgatggacga gaccatgaag gagttgaagg cctacaaatc ggaactggag 360 gaacaactga ccccggtggc ggaggagacg cgggcacggc tgtccaagga gctgcaggcg 420 gcgcaggccc ggctgggcgc ggacatggag gacgtgtgcg gccgcctggt gcagtaccgc 480 ggcgaggtgc aggccatgct cggccagagc accgaggagc tgcgggtgcg cctcgcctcc 540 cacctgcgca agctgcgtaa gcggctcctc cgcgatgccg atgacctgca gaagcgcctg 600 gcagtgtacc aggccggggc ccgcgagggc 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gaggcgggcc tggaaggcct cggcctgcag gcgtatctgc 300 tgggcctgct cctccagctt ggcgcgcacc tccgccacct gctccttcac ctcgtccagg 360 cggtcgcggg tccggctgcc catctcctcc atccgcgcgc gcagccgctc gccccaggcc 420 tgggcccgct cctgtagcgg ctggccggcc agggagccca cagtggcggc ccgcacgcgg 480 ccctgttcca ccaggggccc caggcgctcg cggatggcgc tgaggccgcg ctcggcgccc 540 tcgcgggccc cggcctggta cactgccagg cgcttctgca ggtcatcggc atcgcggagg 600 agccgcttac gcagcttgcg caggtgggag gcgaggcgca cccgcagctc ctcggtgctc 660 tggccgagca tggcctgcac ctcgccgcgg tactgcacca ggcggccgca cacgtcctcc 720 atgtccgcgc ccagccgggc ctgcgccgcc tgcagctcct tggacagccg tgcccgcgtc 780 tcctccgcca ccggggtcag ttgttcctcc agttccgatt tgtaggcctt caactccttc 840 atggtctcgt ccatcagcgc cctcagttcc tgggtgacct gggagctgag cagctcctcc 900 tgcacctgct cagacagtgt ctgcacccag cgcaggtaat cccaaaagcg acccagtgcc 960 agttcccagc gctggccgct ctgccactcg gtctgctggc gcagctcggg ctccggctct 1020 gtctccaccg cttgctccac cttggcctgg catcctgcca ggaatgtgac cagcaacgca 1080 gcccacagaa ccttcatctt cctgcctgtg 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cagctcccag ggctggccgc tctgcccctc agcctgctgg cgaagctcgg gttccgtctc 1020 tggctccacc ggttgctcca ccttggcctg gcatcctgcc aggaatgtga ccagcaacgc 1080 agcccacaga accttcatct tcctgcctgt gattggccag tctggaggcc agggcttccc 1140 gaggtcccag ctacactttc tagaggcccc tgagctcat 1179 <210> 9 <211> 1179 <212> DNA <213> Macaca fascicularis <400> 9 atgagctcag gcgcctctag aaagtgtagc tgggacctcg ggaagccctg gcctccagac 60 tggccaatca caggcaggaa gatgaaggtt ctgtgggctg cgttgctggt cacattcctg 120 gcaggatgcc aggccaaggt ggagcaaccg gtggagccag agacggaacc cgagcttcgc 180 cagcaggctg aggggcagag cggccagccc tgggagctgg cactgggtcg cttttgggat 240 tacctgcgct gggtgcagac actgtctgag caggtgcagg aggagctgct cagcccccag 300 gtcacccagg aactgacgac gctgatggat gagaccatga aggagttgaa ggcctacaaa 360 tcggaactgg aggaacagct gagcccggtg gcggaggaga cgcgggcacg gctgtccaag 420 gagctgcagg cggcgcaggc ccggctgggt gccgacatgg aggacgtgcg cagccgcctg 480 gtgcagtacc gcagcgaggt gcaggccatg ctgggccaga gtaccgagga gctgcgggcg 540 cgcctcgcct cccacctgcg caagctgcgc aagcggctcc tccgcgatgc tgatgacctg 600 cagaagcgcc tggcagtgta tcaggccggg gcccgcgagg gcgccgagcg cggggtcagc 660 gccatccgcg agcgcctggg acccctggtg gagcagggcc gcgtgcgggc cgccactgtg 720 ggctccctgg ccagccagcc gcttcaggag cgggcccagg ccttgggtga gcggcttcgc 780 gcacggatgg aggagatggg cagccggacc cgcgaccgcc tggacgaggt gaaggagcag 840 gtggcggagg tgcgcgccaa gctggaggaa caggcccagc agataagcct gcaggccgag 900 gccttccagg cccgcctcaa gagctggttc gagcccctcg tggaagatat gcagcgccag 960 tgggctgggc tggtggagaa ggtgcaggct gccgtgggcg ccagcaccgc ccctgtgccc 1020 agcgacaatc actgaacgcc caggcctaca gccatgcgac ccgactccac cccatgcctc 1080 ctctctccgc tcagcctgca gcgggagacc ctgtccccgc cccagccgtc ctccaggggt 1140 gggccctagt ttaataaaga ttcgccaagt ttcaccgca 1179 <210> 10 <211> 1179 <212> DNA <213> Macaca fascicularis <400> 10 tgcggtgaaa cttggcgaat ctttattaaa ctagggccca cccctggagg acggctgggg 60 cggggacagg gtctcccgct gcaggctgag cggagagagg aggcatgggg tggagtcggg 120 tcgcatggct gtaggcctgg gcgttcagtg attgtcgctg ggcacagggg cggtgctggc 180 gcccacggca 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26 aagguggagc aagcggugga u 21 <210> 27 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 27 caagcggugg agacagagcc u 21 <210> 28 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 28 gguggagaca gagccggagc u 21 <210> 29 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 29 cccgagcugc gccagcagac u 21 <210> 30 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 30 gcugcgccag cagaccgagu u 21 <210> 31 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 31 ccagcagacc gaguggcaga u 21 <210> 32 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 32 cagcgcuggg aacuggcacu u 21 <210> 33 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 33 cugggaacug gcacuggguc u 21 <210> 34 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 34 aacuggcacu gggucgcuuu u 21 <210> 35 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 35 cacugggucg cuuuugggau u 21 <210> 36 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 36 gucgcuuuug ggauuaccug u 21 <210> 37 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 37 uuuugggauu accugcgcug u 21 <210> 38 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 38 cugcgcuggg ugcagacacu u 21 <210> 39 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 39 ugggugcaga cacugucuga u 21 <210> 40 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 40 cagacacugu cugagcaggu u 21 <210> 41 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 41 caggaggagc ugcucagcuc u 21 <210> 42 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 42 cugcucagcu cccaggucac u 21 <210> 43 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 43 ucccagguca cccaggaacu u 21 <210> 44 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 44 acccaggaac ugagggcgcu u 21 <210> 45 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 45 ugagggcgcu gauggacgag u 21 <210> 46 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 46 gcgcugaugg acgagaccau u 21 <210> 47 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 47 gacgagacca ugaaggaguu u 21 <210> 48 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source 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<400> 53 gaggaacaac ugaccccggu u 21 <210> 54 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 54 cgcgggcacg gcuguccaag u 21 <210> 55 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 55 gcacggcugu ccaaggagcu u 21 <210> 56 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 56 gcuguccaag gagcugcagg u 21 <210> 57 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 57 gcccggcugg gcgcggacau u 21 <210> 58 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 58 cugggcgcgg acauggagga u 21 <210> 59 <211> 21 <212> RNA <213> 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Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 64 gacauggagg acgugcgcgg u 21 <210> 65 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 65 acauggagga cgugcgcggc u 21 <210> 66 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 66 cauggaggac gugcgcggcc u 21 <210> 67 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 67 auggaggacg ugcgcggccg u 21 <210> 68 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 68 uggaggacgu gcgcggccgc u 21 <210> 69 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 69 ggaggacgug 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oligonucleotide" <400> 80 gccaugcucg gccagagcac u 21 <210> 81 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 81 ggccagagca ccgaggagcu u 21 <210> 82 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 82 gcugcgggug cgccucgccu u 21 <210> 83 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 83 gugcgccucg ccucccaccu u 21 <210> 84 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 84 cgccucccac cugcgcaagc u 21 <210> 85 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 85 cccaccugcg caagcugcgu u 21 <210> 86 <211> 21 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96 gagcgcggcc ucagcgccau u 21 <210> 97 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 97 cggccucagc gccauccgcg u 21 <210> 98 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 98 agcgccaucc gcgagcgccu u 21 <210> 99 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 99 uggggccccu gguggaacag u 21 <210> 100 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 100 ccccuggugg aacagggccg u 21 <210> 101 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 101 cgcgugcggg ccgccacugu u 21 <210> 102 <211> 21 <212> RNA <213> 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of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 107 cgcgaccgcc uggacgaggu u 21 <210> 108 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 108 gccuggacga ggugaaggag u 21 <210> 109 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 109 gacgagguga aggagcaggu u 21 <210> 110 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 110 ggaggugcgc gccaagcugg u 21 <210> 111 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 111 cgcgccaagc uggaggagca u 21 <210> 112 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 112 caggcccagc agauacgccu u 21 <210> 113 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 113 ccagcagaua cgccugcagg u 21 <210> 114 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 114 cgccugcagg ccgaggccuu u 21 <210> 115 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 115 gcaggccgag gccuuccagg u 21 <210> 116 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 116 ccgaggccuu ccaggcccgc u 21 <210> 117 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 117 gccuuccagg cccgccucaa u 21 <210> 118 <211> 21 <212> RNA <213> 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of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 123 ggaagacaug cagcgccagu u 21 <210> 124 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 124 gccgggcugg uggagaaggu u 21 <210> 125 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 125 gcugguggag aaggugcagg u 21 <210> 126 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 126 accagcgccg ccccugugcc u 21 <210> 127 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 127 gccccugugc ccagcgacaa u 21 <210> 128 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 128 ugugcccagc gacaaucacu u 21 <210> 129 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 129 cagcgacaau cacugaacgc u 21 <210> 130 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 130 caaucacuga acgccgaagc u 21 <210> 131 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 131 acugaacgcc gaagccugca u 21 <210> 132 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 132 acgccgaagc cugcagccau u 21 <210> 133 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 133 gaagccugca gccaugcgac u 21 <210> 134 <211> 21 <212> RNA <213> 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of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 139 cuccugccuc cgcgcagccu u 21 <210> 140 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 140 gccuccgcgc agccugcagc u 21 <210> 141 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 141 ccuguccccg ccccagccgu u 21 <210> 142 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 142 cccgccccag ccguccuccu u 21 <210> 143 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 143 cccagccguc cuccuggggu u 21 <210> 144 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 144 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Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 176 agagcugagc agcuccuccu gca 23 <210> 177 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 177 agugaccugg gagcugagca gcu 23 <210> 178 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 178 aaguuccugg gugaccuggg agc 23 <210> 179 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 179 aagcgcccuc aguuccuggg uga 23 <210> 180 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 180 acucguccau cagcgcccuc agu 23 <210> 181 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 181 aauggucucg uccaucagcg ccc 23 <210> 182 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 182 aaacuccuuc auggucucgu cca 23 <210> 183 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 183 agccuucaac uccuucaugg ucu 23 <210> 184 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 184 aauuuguagg ccuucaacuc cuu 23 <210> 185 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 185 aaguuccgau uuguaggccu uca 23 <210> 186 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 186 auuccuccag uuccgauuug uag 23 <210> 187 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 187 aaguuguucc uccaguuccg auu 23 <210> 188 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 188 aaccgggguc aguuguuccu cca 23 <210> 189 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 189 acuuggacag ccgugcccgc guc 23 <210> 190 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 190 aagcuccuug gacagccgug ccc 23 <210> 191 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 191 accugcagcu ccuuggacag ccg 23 <210> 192 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source 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Synthetic oligonucleotide" <400> 197 agcgcacguc cuccaugucc gcg 23 <210> 198 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 198 acgcgcacgu ccuccauguc cgc 23 <210> 199 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 199 accgcgcacg uccuccaugu ccg 23 <210> 200 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 200 agccgcgcac guccuccaug ucc 23 <210> 201 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 201 aggccgcgca cguccuccau guc 23 <210> 202 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 202 acggccgcgc 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/note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 213 accgcgguac ugcaccaggc ggc 23 <210> 214 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 214 accgagcaug gccugcaccu cgc 23 <210> 215 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 215 agugcucugg ccgagcaugg ccu 23 <210> 216 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 216 aagcuccucg gugcucuggc cga 23 <210> 217 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 217 aaggcgaggc gcacccgcag cuc 23 <210> 218 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 218 aaggugggag gcgaggcgca ccc 23 <210> 219 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 219 agcuugcgca ggugggaggc gag 23 <210> 220 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 220 aacgcagcuu gcgcaggugg gag 23 <210> 221 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 221 acgcuuacgc agcuugcgca ggu 23 <210> 222 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 222 aaggagccgc uuacgcagcu ugc 23 <210> 223 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 223 aaucgcggag gagccgcuua cgc 23 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Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 234 acuguuccac caggggcccc agg 23 <210> 235 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 235 acggcccugu uccaccaggg gcc 23 <210> 236 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 236 aacaguggcg gcccgcacgc ggc 23 <210> 237 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 237 aagggagccc acaguggcgg ccc 23 <210> 238 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 238 aguagcggcu ggccggccag gga 23 <210> 239 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 239 acgcuccugu agcggcuggc cgg 23 <210> 240 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 240 agggcccgcu ccuguagcgg cug 23 <210> 241 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 241 acccaucucc uccauccgcg cgc 23 <210> 242 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 242 aaccucgucc aggcggucgc ggg 23 <210> 243 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 243 acuccuucac cucguccagg cgg 23 <210> 244 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 244 aaccugcucc uucaccucgu cca 23 <210> 245 <211> 23 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Synthetic oligonucleotide" <400> 255 aggggcucga accagcucuu gag 23 <210> 256 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 256 acaugucuuc caccaggggc ucg 23 <210> 257 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 257 acgcugcaug ucuuccacca ggg 23 <210> 258 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 258 aacuggcgcu gcaugucuuc cac 23 <210> 259 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 259 aaccuucucc accagcccgg ccc 23 <210> 260 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 260 accugcaccu 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oligonucleotide" <400> 276 aacggcuggg gcggggacag ggu 23 <210> 277 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 277 aaggaggacg gcuggggcgg gga 23 <210> 278 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 278 aaccccagga ggacggcugg ggc 23 <210> 279 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 279 aaacuagggu ccaccccagg agg 23 <210> 280 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 280 auauuaaacu aggguccacc cca 23 <210> 281 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 281 aaucuuuauu aaacuagggu cca 23 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Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 292 gcuggucaca uuccuggcag u 21 <210> 293 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 293 ucacauuccu ggcaggaugc u 21 <210> 294 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 294 uggcaggaug ccaggccaag u 21 <210> 295 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 295 caggccaagg uggagcaagc u 21 <210> 296 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 296 aagguggagc aagcggugga u 21 <210> 297 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 297 caagcggugg 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Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 308 cugcgcuggg ugcagacacu u 21 <210> 309 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 309 ugggugcaga cacugucuga u 21 <210> 310 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 310 cagacacugu cugagcaggu u 21 <210> 311 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 311 caggaggagc ugcucagcuc u 21 <210> 312 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 312 cugcucagcu cccaggucac u 21 <210> 313 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 313 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of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 324 cgcgggcacg gcuguccaag u 21 <210> 325 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 325 gcacggcugu ccaaggagcu u 21 <210> 326 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 326 gcuguccaag gagcugcagg u 21 <210> 327 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 327 gcccggcugg gcgcggacau u 21 <210> 328 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 328 cugggcgcgg acauggagga u 21 <210> 329 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 329 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of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 340 gaggacgugc gcggccgccu u 21 <210> 341 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 341 aggacgugcg cggccgccug u 21 <210> 342 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 342 ggacgugcgc ggccgccugg u 21 <210> 343 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 343 gacgugcgcg gccgccuggu u 21 <210> 344 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 344 acgugcgcgg ccgccuggug u 21 <210> 345 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 345 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of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 356 cugcgcaagc ugcguaagcg u 21 <210> 357 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 357 aagcugcgua agcggcuccu u 21 <210> 358 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 358 guaagcggcu ccuccgcgau u 21 <210> 359 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 359 ggcuccuccg cgaugccgau u 21 <210> 360 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 360 cuccgcgaug ccgaugaccu u 21 <210> 361 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 361 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of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 372 gccgccacug ugggcucccu u 21 <210> 373 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 373 ccuggccggc cagccgcuac u 21 <210> 374 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 374 ggccagccgc uacaggagcg u 21 <210> 375 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 375 gccgcuacag gagcgggccc u 21 <210> 376 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 376 gcgcggaugg aggagauggg u 21 <210> 377 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 377 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of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 388 ccaggcccgc cucaagagcu u 21 <210> 389 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 389 ccgccucaag agcugguucg u 21 <210> 390 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 390 caagagcugg uucgagcccc u 21 <210> 391 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 391 agccccuggu ggaagacaug u 21 <210> 392 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 392 cugguggaag acaugcagcg u 21 <210> 393 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 393 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Synthetic oligonucleotide" <400> 441 acagguaauc ccaaaagcga ccc 23 <210> 442 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 442 acagcgcagg uaaucccaaa agc 23 <210> 443 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 443 aagugucugc acccagcgca ggu 23 <210> 444 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 444 aucagacagu gucugcaccc agc 23 <210> 445 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 445 aaccugcuca gacagugucu gca 23 <210> 446 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 446 agagcugagc 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/note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 457 aaguuguucc uccaguuccg auu 23 <210> 458 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 458 aaccgggguc aguuguuccu cca 23 <210> 459 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 459 acuuggacag ccgugcccgc guc 23 <210> 460 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 460 aagcuccuug gacagccgug ccc 23 <210> 461 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 461 accugcagcu ccuuggacag ccg 23 <210> 462 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 462 aauguccgcg cccagccggg ccu 23 <210> 463 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 463 auccuccaug uccgcgccca gcc 23 <210> 464 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 464 agcacguccu ccauguccgc gcc 23 <210> 465 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 465 acacacgucc uccauguccg cgc 23 <210> 466 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 466 acgcacgucc uccauguccg cgc 23 <210> 467 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 467 agcgcacguc cuccaugucc gcg 23 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Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 478 aaccaggcgg ccgcgcacgu ccu 23 <210> 479 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 479 acaccaggcg gccgcgcacg ucc 23 <210> 480 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 480 agcaccaggc ggccgcgcac guc 23 <210> 481 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 481 augcaccagg cggccgcgca cgu 23 <210> 482 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 482 aguacugcac caggcggccg cac 23 <210> 483 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 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Synthetic oligonucleotide" <400> 499 augguacacu gccaggcgcu ucu 23 <210> 500 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 500 accggccugg uacacugcca ggc 23 <210> 501 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 501 aauggcgcug aggccgcgcu cgg 23 <210> 502 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 502 acgcggaugg cgcugaggcc gcg 23 <210> 503 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 503 aaggcgcucg cggauggcgc uga 23 <210> 504 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 504 acuguuccac 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Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 536 augcaggcuu cggcguucag uga 23 <210> 537 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 537 aauggcugca ggcuucggcg uuc 23 <210> 538 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 538 agucgcaugg cugcaggcuu cgg 23 <210> 539 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 539 acgugggguc gcauggcugc agg 23 <210> 540 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 540 aacggggugg cguggggucg cau 23 <210> 541 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 541 agaggcacgg gguggcgugg ggu 23 <210> 542 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 542 aaggcaggag gcacggggug gcg 23 <210> 543 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 543 agcgcggagg caggaggcac ggg 23 <210> 544 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 544 aaggcugcgc ggaggcagga ggc 23 <210> 545 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 545 agcugcaggc ugcgcggagg cag 23 <210> 546 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 546 aacggcuggg gcggggacag ggu 23 <210> 547 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 547 aaggaggacg gcuggggcgg gga 23 <210> 548 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 548 aaccccagga ggacggcugg ggc 23 <210> 549 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 549 aaacuagggu ccaccccagg agg 23 <210> 550 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 550 auauuaaacu aggguccacc cca 23 <210> 551 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 551 aaucuuuauu aaacuagggu cca 23 <210> 552 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 552 aggugaaucu uuauuaaacu agg 23 <210> 553 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 553 aaacuuggug aaucuuuauu aaa 23 <210> 554 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 554 agcgugaaac uuggugaauc uuu 23 <210> 555 <211> 23 <212> DNA <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Target sequence" <400> 555 ctggccaatc acaggcagga aga 23 <210> 556 <211> 23 <212> DNA <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Target sequence" <400> 556 cacaggcagg aagatgaagg ttc 23 <210> 557 <211> 23 <212> DNA <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Target sequence" <400> 557 gcaggaagat gaaggttctg tgg 23 <210> 558 <211> 23 <212> DNA <213> Unknown 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sequence" <400> 564 cctggcagga tgccaggcca agg 23 <210> 565 <211> 23 <212> DNA <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Target sequence" <400> 565 gccaggccaa ggtggagcaa gcg 23 <210> 566 <211> 23 <212> DNA <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Target sequence" <400> 566 ccaaggtgga gcaagcggtg gag 23 <210> 567 <211> 23 <212> DNA <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Target sequence" <400> 567 agcaagcggt ggagacagag ccg 23 <210> 568 <211> 23 <212> DNA <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Target sequence" <400> 568 gcggtggaga cagagccgga gcc 23 <210> 569 <211> 23 <212> DNA <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Target sequence" <400> 569 agcccgagct gcgccagcag acc 23 <210> 570 <211> 23 <212> DNA <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Target sequence" <400> 570 gagctgcgcc agcagaccga gtg 23 <210> 571 <211> 23 <212> DNA <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Target sequence" <400> 571 cgccagcaga ccgagtggca gag 23 <210> 572 <211> 23 <212> DNA <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Target sequence" <400> 572 gccagcgctg ggaactggca ctg 23 <210> 573 <211> 23 <212> DNA <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Target sequence" <400> 573 cgctgggaac tggcactggg tcg 23 <210> 574 <211> 23 <212> DNA <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Target sequence" <400> 574 ggaactggca ctgggtcgct ttt 23 <210> 575 <211> 23 <212> DNA <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Target sequence" <400> 575 ggcactgggt cgcttttggg att 23 <210> 576 <211> 23 <212> DNA <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Target sequence" <400> 576 gggtcgcttt tgggattacc tgc 23 <210> 577 <211> 23 <212> DNA <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Target sequence" <400> 577 gcttttggga ttacctgcgc tgg 23 <210> 578 <211> 23 <212> DNA <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Target sequence" <400> 578 acctgcgctg ggtgcagaca ctg 23 <210> 579 <211> 23 <212> DNA <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Target sequence" <400> 579 gctgggtgca gacactgtct gag 23 <210> 580 <211> 23 <212> DNA <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Target sequence" <400> 580 tgcagacact gtctgagcag gtg 23 <210> 581 <211> 23 <212> DNA <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Target sequence" <400> 581 tgcaggagga gctgctcagc tcc 23 <210> 582 <211> 23 <212> DNA <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Target sequence" <400> 582 agctgctcag ctcccaggtc acc 23 <210> 583 <211> 23 <212> DNA <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Target sequence" <400> 583 gctcccaggt cacccaggaa ctg 23 <210> 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Target sequence" <400> 622 gagctgcggg tgcgcctcgc ctc 23 <210> 623 <211> 23 <212> DNA <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Target sequence" <400> 623 gggtgcgcct cgcctcccac ctg 23 <210> 624 <211> 23 <212> DNA <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Target sequence" <400> 624 ctcgcctccc acctgcgcaa gct 23 <210> 625 <211> 23 <212> DNA <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Target sequence" <400> 625 ctcccacctg cgcaagctgc gta 23 <210> 626 <211> 23 <212> DNA <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Target sequence" <400> 626 acctgcgcaa gctgcgtaag cgg 23 <210> 627 <211> 23 <212> DNA <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Target sequence" <400> 627 gcaagctgcg taagcggctc ctc 23 <210> 628 <211> 23 <212> DNA <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Target sequence" <400> 628 gcgtaagcgg ctcctccgcg atg 23 <210> 629 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Target sequence" <400> 667 ccgcccctgt gcccagcgac aat 23 <210> 668 <211> 23 <212> DNA <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Target sequence" <400> 668 cctgtgccca gcgacaatca ctg 23 <210> 669 <211> 23 <212> DNA <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Target sequence" <400> 669 cccagcgaca atcactgaac gcc 23 <210> 670 <211> 23 <212> DNA <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Target sequence" <400> 670 gacaatcact gaacgccgaa gcc 23 <210> 671 <211> 23 <212> DNA <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Target sequence" <400> 671 tcactgaacg ccgaagcctg cag 23 <210> 672 <211> 23 <212> DNA <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Target sequence" <400> 672 gaacgccgaa gcctgcagcc atg 23 <210> 673 <211> 23 <212> DNA <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Target sequence" <400> 673 ccgaagcctg cagccatgcg acc 23 <210> 674 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Synthetic oligonucleotide" <400> 708 uaucuuuauu aaacuagggu cca 23 <210> 709 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 709 ucgcggaugg cgcugaggcc gcg 23 <210> 710 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 710 caggcaggaa gaugaagguu a 21 <210> 711 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 711 aggaagauga agguucugug a 21 <210> 712 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 712 uucugugggc ugcguugcug a 21 <210> 713 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 713 gcguugcugg ucacauuccu a 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Claims (123)

  1. APOE의 발현을 억제하기 위한 이중 가닥 리보핵산(dsRNA) 제제로서, 여기서 상기 dsRNA 제제가 이중 가닥 영역을 형성하는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, 상기 센스 가닥이 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열의 일부 또는 서열번호 1의 전체 뉴클레오타이드 서열과 적어도 90% 뉴클레오타이드 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열의 0 또는 1개의 미스매치를 갖는 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 상기 안티센스 가닥이 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열의 상응하는 부분 또는 서열번호 2의 전체 뉴클레오타이드 서열과 적어도 90% 뉴클레오타이드 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열의 0 또는 1개의 미스매치를 갖는 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 이중 가닥 리보핵산(dsRNA) 제제.
  2. 제1항에 있어서, 상기 dsRNA 제제가 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, 상기 센스 가닥이 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열의 일부 또는 서열번호 1의 전체 뉴클레오타이드 서열과 적어도 90% 뉴클레오타이드 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열의 0 또는 1개의 미스매치를 갖는 적어도 17개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 상기 안티센스 가닥이 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열의 상응하는 부분 또는 서열번호 2의 전체 뉴클레오타이드 서열과 적어도 90% 뉴클레오타이드 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열의 0 또는 1개의 미스매치를 갖는 적어도 17개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, dsRNA 제제.
  3. 제1항에 있어서, 상기 dsRNA 제제가 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, 상기 센스 가닥이 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열의 일부 또는 서열번호 1의 전체 뉴클레오타이드 서열과 적어도 90% 뉴클레오타이드 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열의 0 또는 1개의 미스매치를 갖는 적어도 19개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 상기 안티센스 가닥이 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열의 상응하는 부분 또는 서열번호 2의 전체 뉴클레오타이드 서열과 적어도 90% 뉴클레오타이드 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열의 0 또는 1개의 미스매치를 갖는 적어도 19개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, dsRNA 제제.
  4. 제1항에 있어서, 상기 dsRNA 제제가 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, 상기 센스 가닥이 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열의 일부 또는 서열번호 1의 전체 뉴클레오타이드 서열과 적어도 90% 뉴클레오타이드 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열의 0 또는 1개의 미스매치를 갖는 적어도 21개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 상기 안티센스 가닥이 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열의 상응하는 부분 또는 서열번호 2의 전체 뉴클레오타이드 서열과 적어도 90% 뉴클레오타이드 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열의 0 또는 1개의 미스매치를 갖는 적어도 21개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, dsRNA 제제.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 센스 가닥 및/또는 상기 안티센스 가닥이 표 2-5 및 7-10 중 어느 하나에서 센스 가닥 및/또는 안티센스 가닥으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 센스 가닥 및/또는 안티센스 가닥인, dsRNA 제제.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 센스 가닥이 서열번호 1의 뉴클레오타이드 57-79, 62-84, 75-97, 86-108, 207-229, 213-235, 218-240, 898-920, 1128-1150, 637-659의 뉴클레오타이드 서열 중 어느 하나와 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하고, 상기 안티센스 가닥이 서열번호 2의 상응하는 뉴클레오타이드 서열로부터의 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는, dsRNA 제제.
  7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 센스 가닥이 서열번호 1의 뉴클레오타이드 57-79, 62-84, 207-229, 1128-1150의 뉴클레오타이드 서열 중 어느 하나와 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하고, 상기 안티센스 가닥이 서열번호 2의 상응하는 뉴클레오타이드 서열로부터의 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는, dsRNA 제제.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 안티센스 가닥이 AD-1204704, AD-1204705, AD-1204705, AD-1204706, AD-1204707, AD-1204708, AD-1204709, AD-1204710, AD-1204711, AD-1204712, 및 AD-1204713으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 듀플렉스의 안티센스 가닥 뉴클레오타이드 서열 중 어느 하나와 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는, dsRNA 제제.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 안티센스 가닥이 AD-1204704, AD-1204705, AD-1204708, 및 AD-1204712로 이루어진 그룹으로부터 선택된 듀플렉스의 안티센스 가닥 뉴클레오타이드 서열 중 어느 하나와 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는, dsRNA 제제.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, APOE4의 발현을 억제하지만 APOE2의 발현 및 APOE의 발현을 실질적으로 억제하지 않는, dsRNA 제제.
  11. 제10항에 있어서, 상기 센스 가닥 및/또는 상기 안티센스 가닥이 표 7 및 8 중 어느 하나에서 임의의 센스 가닥 및 안티센스 가닥으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 센스 가닥 및/또는 안티센스 가닥인, dsRNA 제제.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 센스 가닥, 상기 안티센스 가닥 또는 상기 센스 가닥 및 상기 안티센스 가닥 둘 다가 하나 이상의 친유성 모이어티에 접합되는, dsRNA 제제.
  13. 제12항에 있어서, 상기 친유성 모이어티가 상기 dsRNA 제제의 이중 가닥 영역에서 하나 이상의 위치에 접합되는, dsRNA 제제.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서, 상기 친유성 모이어티가 링커 또는 캐리어를 통해 접합되는, dsRNA 제제.
  15. 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 친유성 모이어티의 친유도가 logKow에 의한 측정 시 0을 초과하는, dsRNA 제제.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이중 가닥 RNAi 제제의 소수성이 상기 이중 가닥 RNAi 제제의 혈장 단백질 결합 검정에서 미결합된 분획에 의한 측정 시 0.2를 초과하는, dsRNA 제제.
  17. 제16항에 있어서, 상기 혈장 단백질 결합 검정이 인간 혈청 알부민 단백질을 사용한 전기영동 이동성 이동 검정(electrophoretic mobility shift assay)인, dsRNA 제제.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 dsRNA 제제가 적어도 하나의 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는, dsRNA 제제.
  19. 제18항에 있어서, 상기 센스 가닥의 5개 이하의 뉴클레오타이드 및 상기 안티센스 가닥의 5개 이하의 뉴클레오타이드가 변형되지 않은 뉴클레오타이드인, dsRNA 제제.
  20. 제18항에 있어서, 상기 센스 가닥의 모든 뉴클레오타이드 및 상기 안티센스 가닥의 모든 뉴클레오타이드가 변형을 포함하는, dsRNA 제제.
  21. 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 뉴클레오타이드 중 적어도 하나가 데옥시-뉴클레오타이드, 3'-말단 데옥시-티미딘(dT) 뉴클레오타이드, 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오타이드, 2'-플루오로 변형된 뉴클레오타이드, 2'-데옥시-변형된 뉴클레오타이드, 잠긴 뉴클레오타이드, 잠김 해제된 뉴클레오타이드, 형태적으로 제한된 뉴클레오타이드, 속박된 에틸 뉴클레오타이드, 무염기 뉴클레오타이드, 2'-아미노-변형된 뉴클레오타이드, 2'-O-알릴-변형된 뉴클레오타이드, 2'-C-알킬-변형된 뉴클레오타이드, 2'-하이드록실-변형된 뉴클레오타이드, 2'-메톡시에틸 변형된 뉴클레오타이드, 2'-O-알킬-변형된 뉴클레오타이드, 모르폴리노 뉴클레오타이드, 포스포르아미데이트, 비-천연 염기 포함 뉴클레오타이드, 테트라하이드로피란 변형된 뉴클레오타이드, 1,5-언하이드로헥시톨 변형된 뉴클레오타이드, 사이클로헥세닐 변형된 뉴클레오타이드, 포스포로티오에이트 그룹을 포함하는 뉴클레오타이드, 5'-메틸포스포네이트 그룹을 포함하는 뉴클레오타이드, 5'-포스페이트 또는 5'-포스페이트 모사체를 포함하는 뉴클레오타이드, 비닐 포스포네이트를 포함하는 뉴클레오타이드, 아데노신-글리콜 핵산(GNA)을 포함하는 뉴클레오타이드, 티미딘-글리콜 핵산(GNA) S-이성체를 포함하는 뉴클레오타이드, 2-하이드록시메틸-테트라하이드로푸란-5-포스페이트를 포함하는 뉴클레오타이드, 2'-데옥시티미딘-3'-포스페이트를 포함하는 뉴클레오타이드, 2'-데옥시구아노신-3'-포스페이트를 포함하는 뉴클레오타이드, 및 콜레스테릴 유도체 및 도데칸산 비스데실아미드 그룹에 연결된 말단 뉴클레오타이드; 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, dsRNA 제제.
  22. 제21항에 있어서, 상기 변형된 뉴클레오타이드가 2'-데옥시-2'-플루오로 변형된 뉴클레오타이드, 2'-데옥시-변형된 뉴클레오타이드, 3'-말단 데옥시-티미딘 뉴클레오타이드(dT), 잠긴 뉴클레오타이드, 무염기 뉴클레오타이드, 2'-아미노-변형된 뉴클레오타이드, 2'-알킬-변형된 뉴클레오타이드, 모르폴리노 뉴클레오타이드, 포스포르아미데이트, 및 비-천연 염기 포함 뉴클레오타이드로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, dsRNA 제제.
  23. 제21항에 있어서, 상기 변형된 뉴클레오타이드가 3'-말단 데옥시-티미딘 뉴클레오타이드(dT)의 짧은 서열을 포함하는, dsRNA 제제.
  24. 제21항에 있어서, 상기 뉴클레오타이드 상의 변형이 2'-O-메틸, GNA 및 2'플루오로 변형인, dsRNA 제제.
  25. 제21항에 있어서, 적어도 하나의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결을 추가로 포함하는, dsRNA 제제.
  26. 제25항에 있어서, 상기 dsRNA 제제가 6-8개 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결을 포함하는, dsRNA 제제.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 가닥이 길이가 30개 이하의 뉴클레오타이드인, dsRNA 제제.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 가닥이 적어도 1개의 뉴클레오타이드의 3' 오버행을 포함하는, dsRNA 제제.
  29. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 가닥이 적어도 2개의 뉴클레오타이드의 3' 오버행을 포함하는, dsRNA 제제.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이중 가닥 영역이 길이가 15-30개의 뉴클레오타이드 쌍인, dsRNA 제제.
  31. 제30항에 있어서, 상기 이중 가닥 영역이 길이가 17-23개의 뉴클레오타이드 쌍인, dsRNA 제제.
  32. 제30항에 있어서, 상기 이중 가닥 영역이 길이가 17-25개의 뉴클레오타이드 쌍인, dsRNA 제제.
  33. 제30항에 있어서, 상기 이중 가닥 영역이 길이가 23-27개의 뉴클레오타이드 쌍인, dsRNA 제제.
  34. 제30항에 있어서, 상기 이중 가닥 영역이 길이가 19-21개의 뉴클레오타이드 쌍인, dsRNA 제제.
  35. 제30항에 있어서, 상기 이중 가닥 영역이 길이가 21-23개의 뉴클레오타이드 쌍인, dsRNA 제제.
  36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 가닥이 19-30개의 뉴클레오타이드를 갖는, dsRNA 제제.
  37. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 가닥이 19-23개의 뉴클레오타이드를 갖는, dsRNA 제제.
  38. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 가닥이 21-23개의 뉴클레오타이드를 갖는, dsRNA 제제.
  39. 제12항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 친유성 모이어티가 적어도 하나의 가닥 상에 하나 이상의 내부 위치에 접합되는, dsRNA 제제.
  40. 제39항에 있어서, 상기 하나 이상의 친유성 모이어티가 링커 또는 캐리어를 통해 적어도 하나의 가닥 상의 하나 이상의 내부 위치에 접합되는, dsRNA 제제.
  41. 제40항에 있어서, 상기 내부 위치가 상기 적어도 하나의 각각의 말단으로부터 말단 2개의 위치를 제외하고는 모든 위치를 포함하는, dsRNA 제제.
  42. 제40항에 있어서, 상기 내부 위치가 상기 적어도 하나의 가닥의 각각의 말단으로부터 말단 3개의 위치를 제외하고는 모든 위치를 포함하는, dsRNA 제제.
  43. 제40항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 내부 위치가 상기 센스 가닥의 절단 부위 영역을 배제하는, dsRNA 제제.
  44. 제43항에 있어서, 상기 내부 위치가 상기 센스 가닥의 5'-말단으로부터 계수하여 위치 9-12를 제외하고는 모든 위치를 포함하는, dsRNA 제제.
  45. 제43항에 있어서, 상기 내부 위치가 상기 센스 가닥의 3'-말단으로부터 계수하여 위치 11-13을 제외하고는 모든 위치를 포함하는, dsRNA 제제.
  46. 제40항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 내부 위치가 상기 안티센스 가닥의 절단 부위 영역을 배제하는, dsRNA 제제.
  47. 제46항에 있어서, 상기 내부 위치가 상기 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 계수하여 위치 12-14를 제외하고는 모든 위치를 포함하는, dsRNA 제제.
  48. 제40항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 내부 위치가 3'-말단으로부터 계수하여 상기 센스 가닥 상의 위치 11-13, 및 5'-말단으로부터 계수하여 상기 안티센스 가닥 상의 위치 12-14를 제외하고는 모든 위치를 포함하는, dsRNA 제제.
  49. 제12항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 친유성 모이어티가 각각의 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여 상기 센스 가닥 상의 위치 4-8 및 13-18 및 상기 안티센스 가닥 상의 위치 6-10 및 15-18로 이루어진 그룹으로부터 선택된 상기 내부 위치 중 하나 이상에 접합되는, dsRNA 제제.
  50. 제49항에 있어서, 상기 하나 이상의 친유성 모이어티가 각각의 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여 상기 센스 가닥 상의 위치 5, 6, 7, 15 및 17 및 상기 안티센스 가닥 상의 위치 15 및 17로 이루어진 그룹으로부터 선택된 내부 위치 중 하나 이상에 접합되는, dsRNA 제제.
  51. 제13항에 있어서, 상기 이중 가닥 영역에서 위치가 상기 센스 가닥의 절단 부위 영역을 배제하는, dsRNA 제제.
  52. 제12항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 센스 가닥이 길이가 21개의 뉴클레오타이드이고, 상기 안티센스 가닥이 길이가 23개의 뉴클레오타이드이고, 상기 친유성 모이어티가 상기 센스 가닥의 위치 21, 위치 20, 위치 15, 위치 1, 위치 7, 위치 6, 또는 위치 2 또는 상기 안티센스 가닥의 위치 16에 접합되는, dsRNA 제제.
  53. 제52항에 있어서, 상기 친유성 모이어티가 상기 센스 가닥의 위치 21, 위치 20, 위치 15, 위치 1, 또는 위치 7에 접합되는, dsRNA 제제.
  54. 제52항에 있어서, 상기 친유성 모이어티가 상기 센스 가닥의 위치 21, 위치 20, 또는 위치 15에 접합되는, dsRNA 제제.
  55. 제52항에 있어서, 상기 친유성 모이어티가 상기 센스 가닥의 위치 20 또는 위치 15에 접합되는, dsRNA 제제.
  56. 제52항에 있어서, 상기 친유성 모이어티가 상기 안티센스 가닥의 위치 16에 접합되는, dsRNA 제제.
  57. 제12항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 친유성 모이어티가 지방족, 지환족 또는 폴리지환족 화합물인, dsRNA 제제.
  58. 제57항에 있어서, 상기 친유성 모이어티가 지질, 콜레스테롤, 레틴산, 콜산, 아다만탄 아세트산, 1-피렌 부티르산, 디하이드로테스토스테론, 1,3-비스-O(헥사데실)글리세롤, 게라닐옥시헥산올, 헥사데실글리세롤, 보르네올, 멘톨, 1,3-프로판디올, 헵타데실 그룹, 팔미트산, 미리스트산, O3-(올레오일)리토콜산, O3-(올레오일)콜렌산, 디메톡시트리틸, 또는 페녹사진으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, dsRNA 제제.
  59. 제58항에 있어서, 상기 친유성 모이어티가 포화 또는 불포화 C4-C30 탄화수소 쇄, 및 하이드록실, 아민, 카복실산, 설포네이트, 포스페이트, 티올, 아지드 및 알킨으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 임의의 작용기를 포함하는, dsRNA 제제.
  60. 제59항에 있어서, 상기 친유성 모이어티가 포화 또는 불포화 C6-C18 탄화수소 쇄를 포함하는, dsRNA 제제.
  61. 제59항에 있어서, 상기 친유성 모이어티가 포화 또는 불포화 C16 탄화수소 쇄를 포함하는, dsRNA 제제.
  62. 제61항에 있어서, 상기 포화 또는 불포화 C16 탄화수소 쇄가 상기 가닥의 5'-말단으로부터 계수하여 위치 6에 접합되는, dsRNA 제제.
  63. 제12항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 친유성 모이어티가 상기 내부 위치(들) 또는 상기 이중 가닥 영역에서 하나 이상의 뉴클레오타이드(들)를 대체하는 캐리어를 통해 접합되는, dsRNA 제제.
  64. 제63항에 있어서, 상기 캐리어가 피롤리디닐, 파라졸리닐, 피라졸리디닐, 이미다졸리닐, 이미다졸리디닐, 피페리디닐, 피페라지닐, [1,3]디옥솔라닐, 옥사졸리디닐, 이속사졸리디닐, 모르폴리닐, 티아졸리디닐, 이소티아졸리디닐, 퀴녹살리닐, 피리다지노닐, 테트라하이드로푸라닐, 및 데칼리닐로 이루어진 그룹으로부터 선택된 사이클릭 그룹이거나; 세리놀 골격 또는 디에탄올아민 골격을 기반으로 하는 비환형 모이어티인, dsRNA 제제.
  65. 제12항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 친유성 모이어티가 에테르, 티오에테르, 우레아, 카보네이트, 아민, 아미드, 말레이미드-티오에테르, 디설파이드, 포스포디에스테르, 설폰아미드 연결, 클릭 반응의 생성물 또는 카바메이트를 포함하는 링커를 통해 이중 가닥 dsRNA 제제에 접합되는, dsRNA 제제.
  66. 제12항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 친유성 모이어티가 뉴클레오염기, 당 모이어티 또는 뉴클레오사이드 간 연결에 접합되는, 이중 가닥 iRNA 제제.
  67. 제12항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 친유성 모이어티 또는 표적화 리간드가 DNA, RNA, 디설파이드, 아미드, 관능화된 모노사카라이드 또는 갈락토사민, 글루코사민, 글루코스, 갈락토스, 만노스 및 이의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 생-절단 가능한 링커를 통해 접합되는, dsRNA 제제.
  68. 제12항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 센스 가닥의 3' 말단이 아민을 갖는 사이클릭 그룹인 말단 캡을 통해 보호되고, 상기 사이클릭 그룹이 피롤리디닐, 피라졸리닐, 피라졸리디닐, 이미다졸리닐, 이미다졸리디닐, 피페리디닐, 피페라지닐, [1,3]디옥솔라닐, 옥사졸리디닐, 이속사졸리디닐, 모르폴리닐, 티아졸리디닐, 이소티아졸리디닐, 퀴녹살리닐, 피리다지노닐, 테트라하이드로푸라닐 및 데칼리닐로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, dsRNA 제제.
  69. 제12항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 간 조직을 표적화하는 표적화 리간드를 추가로 포함하는, dsRNA 제제.
  70. 제69항에 있어서, 상기 표적화 리간드가 GalNAc 접합체인, dsRNA 제제.
  71. 제1항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서,
    Sp 배위로 연결 인 원자를 갖는, 안티센스 가닥의 3' 말단에서 제1 뉴클레오타이드 간 연결로 존재하는 말단 키랄 변형,
    Rp 배위로 연결 인 원자를 갖는, 안티센스 가닥의 5' 말단에서 제1 뉴클레오타이드 간 연결로 존재하는 말단 키랄 변형, 및
    Rp 배위 또는 Sp 배위 중 하나로 연결 인 원자를 갖는, 센스 가닥의 5' 말단에서 제1 뉴클레오타이드 간 연결로 존재하는 말단 키랄 변형을 추가로 포함하는, dsRNA 제제.
  72. 제1항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서,
    Sp 배위로 연결 인 원자를 갖는, 안티센스 가닥의 3' 말단에서 제1 및 제2 뉴클레오타이드 간 연결로 존재하는 말단 키랄 변형,
    Rp 배위로 연결 인 원자를 갖는, 안티센스 가닥의 5' 말단에서 제1 뉴클레오타이드 간 연결로 존재하는 말단 키랄 변형, 및
    Rp 또는 Sp 배위 중 하나로 연결 인 원자를 갖는, 센스 가닥의 5' 말단에서 제1 뉴클레오타이드 간 연결로 존재하는 말단 키랄 변형을 추가로 포함하는, dsRNA 제제.
  73. 제1항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서,
    Sp 배위로 연결 인 원자를 갖는, 안티센스 가닥의 3' 말단에서 제1, 제2 및 제3 뉴클레오타이드 간 연결로 존재하는 말단 키랄 변형,
    Rp 배위로 연결 인 원자를 갖는, 안티센스 가닥의 5' 말단에서 제1 뉴클레오타이드 간 연결로 존재하는 말단 키랄 변형, 및
    Rp 또는 Sp 배위 중 하나로 연결 인 원자를 갖는, 센스 가닥의 5' 말단에서 제1 뉴클레오타이드 간 연결로 존재하는 말단 키랄 변형을 추가로 포함하는, dsRNA 제제.
  74. 제1항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서,
    Sp 배위로 연결 인 원자를 갖는, 안티센스 가닥의 3' 말단에서 제1 및 제2 뉴클레오타이드 간 연결로 존재하는 말단 키랄 변형,
    Rp 배위로 연결 인 원자를 갖는, 안티센스 가닥의 3' 말단에서 제3 뉴클레오타이드 간 연결로 존재하는 말단 키랄 변형,
    Rp 배위로 연결 인 원자를 갖는, 안티센스 가닥의 5' 말단에서 제1 뉴클레오타이드 간 연결로 존재하는 말단 키랄 변형, 및
    Rp 또는 Sp 배위 중 하나로 연결 인 원자를 갖는, 센스 가닥의 5' 말단에서 제1 뉴클레오타이드 간 연결로 존재하는 말단 키랄 변형을 추가로 포함하는, dsRNA 제제.
  75. 제1항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서,
    Sp 배위로 연결 인 원자를 갖는, 안티센스 가닥의 3' 말단에서 제1 및 제2 뉴클레오타이드 간 연결로 존재하는 말단 키랄 변형,
    Rp 배위로 연결 인 원자를 갖는, 안티센스 가닥의 5' 말단에서 제1 및 제2 뉴클레오타이드 간 연결로 존재하는 말단 키랄 변형, 및
    Rp 또는 Sp 배위 중 하나로 연결 인 원자를 갖는, 센스 가닥의 5' 말단에서 제1 뉴클레오타이드 간 연결로 존재하는 말단 키랄 변형을 추가로 포함하는, dsRNA 제제.
  76. 제1항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 안티센스 가닥의 5'-말단에 포스페이트 또는 포스페이트 모사체를 추가로 포함하는, dsRNA 제제.
  77. 제76항에 있어서, 상기 포스페이트 모사체가 5'-비닐 포스포네이트(VP)인, dsRNA 제제.
  78. 제1항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 듀플렉스의 안티센스 가닥의 5'-말단의 1 위치에서 염기쌍이 AU 염기쌍인, dsRNA 제제.
  79. 제1항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 센스 가닥이 총 21개의 뉴클레오타이드를 갖고, 상기 안티센스 가닥이 총 23개의 뉴클레오타이드를 갖는, dsRNA 제제.
  80. 제1항 내지 제79항 중 어느 한 항의 dsRNA 제제를 함유하는 세포.
  81. 제1항 내지 제79항 중 어느 한 항의 dsRNA 제제를 포함하는, APOE를 암호화하는 유전자의 발현을 억제하기 위한 약제학적 조성물.
  82. 제1항 내지 제79항 중 어느 한 항의 dsRNA 제제 및 지질 제형을 포함하는 약제학적 조성물.
  83. 세포 내 APOE의 발현을 억제하는 방법으로서, 상기 방법이
    (a) 상기 세포를 제1항 내지 제79항 중 어느 한 항의 dsRNA 제제 또는 제81항 또는 제82항의 약제학적 조성물과 접촉시키는 단계; 및
    (b) 단계 (a)에서 생성된 세포를 APOE 유전자의 mRNA 전사체의 분해를 수득하기에 충분한 시간 동안 유지시켜 상기 세포 내 APOE 유전자의 발현을 억제하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  84. 제83항에 있어서, 상기 세포가 대상체 내에 있는, 방법.
  85. 제84항에 있어서, 상기 대상체가 인간인, 방법.
  86. 제83항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 APOE의 발현이 적어도 50%까지 억제되는, 방법.
  87. 제85항에 있어서, 상기 대상체가 APOE-관련 신경변성 질환을 위한 적어도 하나의 진단학적 기준을 충족시키는, 방법.
  88. 제85항에 있어서, 상기 대상체가 APOE-관련 신경변성 질환으로 진단된 적이 있는, 방법.
  89. 제88항에 있어서, 상기 APOE-관련 신경변성 질환이 아밀로이드-β-매개된 질환인, 방법.
  90. 제89항에 있어서, 상기 아밀로이드-β-매개된 질환이 알츠하이머 질환(AD), 다운 증후군 및 대뇌 아밀로이드 혈관병증으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  91. 제89항에 있어서, 상기 APOE-관련 신경변성 질환이 tau-매개된 질환인, 방법.
  92. 제91항에 있어서, 상기 tau-매개된 질환이 1차 타우병증 또는 2차 타우병증인, 방법.
  93. 제92항에 있어서, 상기 1차 타우병증이 전두측두엽 치매(FTD), 진행성 핵상 마비(PSP), 코르디코기저 변성(CBD), 픽 질환(PiD), 구상 신경교 타우병증(GGT), 파킨슨병을 동반한 전두측두엽 치매(FTDP, FTDP-17), 만성 외상성 뇌병증(CTE), 권투선수 치매, 전두측두엽 변성(FTLD), 호은성 곡물 질환(AGD: Argyrophilic grain disease) 및 1차 연령 관련 타우병증(PART)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  94. 제92항에 있어서, 상기 2차 타우병증이 AD, 크로이츠펠트 야콥 질환, 다운 증후군 및 가족성 영국 치매로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  95. APOE-관련 신경변성 질환으로 진단된 대상체를 치료하는 방법으로서, 상기 방법이, 치료학적 유효량의 제1항 내지 제79항 중 어느 한 항의 dsRNA 제제 또는 제81항 또는 제82항의 약제학적 조성물을 상기 대상체에게 투여하여 상기 대상체를 치료하는 단계를 포함하는, 방법.
  96. 제95항에 있어서, 상기 대상체가 인간인, 방법.
  97. 제95항에 있어서, 치료가 상기 질환의 적어도 하나의 징후 또는 증상의 개선을 포함하는, 방법.
  98. 제96항에 있어서, 치료가 상기 질환의 진행의 예방을 포함하는, 방법.
  99. 제95항에 있어서, 상기 대상체가 APOE-관련 신경변성 질환으로 진단된 적이 있는, 방법.
  100. 제98항에 있어서, 상기 APOE-관련 신경변성 질환이 아밀로이드-β-매개된 질환인, 방법.
  101. 제100항에 있어서, 상기 아밀로이드-β-매개된 질환이 알츠하이머 질환, 다운 증후군 및 대뇌 아밀로이드 혈관병증으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  102. 제98항에 있어서, 상기 APOE-관련 신경변성 질환이 tau-매개된 질환인, 방법.
  103. 제102항에 있어서, 상기 tau-매개된 질환이 1차 타우병증 또는 2차 타우병증인, 방법.
  104. 제103항에 있어서, 상기 1차 타우병증이 전두측두엽 치매(FTD), 진행성 핵상 마비(PSP), 코르디코기저 변성(CBD), 픽 질환(PiD), 구상 신경교 타우병증(GGT), 파킨슨병을 동반한 전두측두엽 치매(FTDP, FTDP-17), 만성 외상성 뇌병증(CTE), 권투선수 치매, 전두측두엽 변성(FTLD), 호은성 곡물 질환(AGD) 및 1차 연령 관련 타우병증(PART)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  105. 제103항에 있어서, 상기 2차 타우병증이 AD, 크로이츠펠트 야콥 질환, 다운 증후군 및 가족성 영국 치매로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  106. APOE-관련 신경변성 질환에 대한 적어도 하나의 진단학적 기준을 충족하는 대상체에서 APOE-관련 신경변성 질환의 발병을 예방하는 방법으로서, 상기 방법이 상기 대상체에게 치료학적 유효량의 제1항 내지 제79항 중 어느 한 항의 dsRNA 제제 또는 제81항 또는 제82항의 약제학적 조성물을 투여하여 APOE-관련 신경변성 질환에 대한 적어도 하나의 진단학적 기준을 충족하는 대상체에서 APOE-관련 신경변성 질환의 발병을 예방하는 단계를 포함하는, 방법.
  107. 제106항에 있어서, 상기 대상체가 인간인, 방법.
  108. 제106항에 있어서, 상기 대상체가 APOE-관련 신경변성 질환으로 진단된 적이 있는, 방법.
  109. 제106항에 있어서, 상기 APOE-관련 신경변성 질환이 아밀로이드-β-매개된 질환인, 방법.
  110. 제105항에 있어서, 상기 아밀로이드-β-매개된 질환이 알츠하이머 질환, 다운 증후군 및 대뇌 아밀로이드 혈관병증으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  111. 제106항에 있어서, 상기 APOE-관련 신경변성 질환이 tau-매개된 질환인, 방법.
  112. 제111항에 있어서, 상기 tau-매개된 질환이 1차 타우병증 또는 2차 타우병증인, 방법.
  113. 제112항에 있어서, 상기 1차 타우병증이 전두측두엽 치매(FTD), 진행성 핵상 마비(PSP), 코르디코기저 변성(CBD), 픽 질환(PiD), 구상 신경교 타우병증(GGT), 파킨슨병을 동반한 전두측두엽 치매(FTDP, FTDP-17), 만성 외상성 뇌병증(CTE), 권투선수 치매, 전두측두엽 변성(FTLD), 호은성 곡물 질환(AGD) 및 1차 연령 관련 타우병증(PART)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  114. 제112항에 있어서, 상기 2차 타우병증이 AD, 크로이츠펠트 야콥 질환, 다운 증후군 및 가족성 영국 치매로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  115. 제95항 내지 제114항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 dsRNA 제제가 상기 대상체에게 약 0.01 mg/kg 내지 약 50 mg/kg의 용량으로 투여되는, 방법.
  116. 제95항 내지 제115항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 dsRNA 제제가 상기 대상체에게 척수강내로 투여되는, 방법.
  117. 제95항 내지 제116항 중 어느 한 항에 있어서, APOE2, APOE3, 및 APOE4 단백질 중 하나 이상의 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  118. 제95항 내지 제117항 중 어느 한 항에 있어서, APOE 관련 신경변성 장애의 치료 또는 예방에 적합한 추가의 제제를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  119. 성상세포 내 APOE 유전자의 발현을 억제하는 방법으로서, 상기 방법이
    (a) 상기 성상세포를 제1항 내지 제79항 중 어느 한 항의 dsRNA 제제 또는 제81항 또는 제82항의 약제학적 조성물과 접촉시키는 단계; 및
    (b) 단계 (a)에서 생성된 성상세포를 APOE 유전자의 mRNA 전사체의 분해를 수득하기에 충분한 시간 동안 유지시켜 상기 성상세포 내 APOE 유전자의 발현을 억제하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  120. 제119항에 있어서, 상기 성상세포가 대상체 내에 있는, 방법.
  121. 제120항에 있어서, 상기 대상체가 인간인, 방법.
  122. 제119항 내지 제121항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 성상세포와의 접촉이 상기 약제학적 조성물의 척수강내 투여에 의한 것인, 방법.
  123. 제119항 내지 제122항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 dsRNA 제제의 안티센스 가닥이 AD-1204704, AD-1204705, AD-1204708, 및 AD-1204712로 이루어진 그룹으로부터 선택된 듀플렉스의 안티센스 가닥 뉴클레오타이드 서열 중 어느 하나와 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는, 방법.
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