KR20230017207A

KR20230017207A - 항-cd103 항체

Info

Publication number: KR20230017207A
Application number: KR1020227041805A
Authority: KR
Inventors: 브루인 마르코 데; 클라스 얀-데렉 콜; 한스 빌헬름 네이만; 에넨남 한스 반; 두에인호벤 산더르 마르티누스 요하네스 반
Original assignee: 사이로파 비.브이.; 리엑스유니버시테이트 그로닝겐; 아카데미쉬 지에케누이스 그로닝겐
Priority date: 2020-04-30
Filing date: 2021-04-30
Publication date: 2023-02-03
Also published as: EP4143227A2; BR112022022045A2; IL297806A; US20230183354A1; WO2021219871A3; CN115996951A; CA3176894A1; MX2022013633A; WO2021219871A2; JP2023524464A; AU2021265205A1

Abstract

본 발명은 항-CD103 항체뿐만 아니라 질환의 진단, 예후예측, 모니터링 및 치료에서의 이러한 항체의 용도에 관한 것이다.

Description

항-CD103 항체

관련 출원

본 출원은 2020년 4월 30일자로 출원된 미국 특허 가출원 제62/704,258호의 우선권을 주장하며, 이는 그 전문이 참조에 의해 본 명세서에 원용된다.

발명의 기술 분야

CD103(인테그린 αE)은 고유판(lamina propria) T 세포, 상피 수지상 세포, 고유판-유래 수지상 세포 및 말초 림프구의 작은 서브세트의 하위집단에서 발현된 I형 막 단백질이다. T_reg 세포는 높은 수준의 CD103을 발현한다. 성숙 CD103 단백질은 이황화 결합에 의해 연결된 상태로 남아 있는 150kD(C-말단) 사슬 및 25kD(N-말단) 사슬의 2개의 사슬로 절단될 수 있다. β7 인테그린과 결합하여, CD103는 인간 점막 림프구-1 항원으로 알려진 E-카드헤린 결합 인테그린을 나타내는 αE/β7 이종이량체를 형성한다.

면역 관문 단백질 및 면역 반응에서의 이의 역할에 대한 확인 및 이해는 암 요법의 돌파구를 나타낸다. 이러한 발견으로, 생산적인 항암 반응을 자극하는 데 효과가 없는 것으로 밝혀진 암세포에 지시된 T-세포를 활성화하려는 시도에서 면역 관문 경로를 차단하는 데 노력이 집중되었다. CTLA-4에 결합하고 이를 기능적으로 차단하는 항체인 이필리무맙은, 2011년 미국 식품의약국(US Food and Drug Administration: FDA)에서 전이성 흑색종의 치료제로 승인되었다. 이필리무맙에 이어, 많은 암세포 예정사-리간드 1(programmed death-ligand 1: PD-L1)에서 발견되는 예정 세포사-1(programmed cell death-1: PD-1) 수용체를 표적으로 하는 항체 및 이의 리간드도 승인되었다. 이러한 관문 저해제는 암 요법에 혁명을 가져왔다.

면역 관문 경로를 표적으로 하는 면역요법으로 인한 상당한 임상적 이점에도 불구하고, 대다수의 암 환자는 관문 저해제에 반응하지 않는다. 특히 연구는 종양 환경으로 제한된 기능적 T 세포 침윤을 보이는 환자에서 관문 저해가 충분하지 않을 수 있음을 시사한다. 더욱이, T 세포는 종양 덩어리를 둘러싼 조직에 축적될 수 있지만, 이들은 종양 세포 자체와 상호작용하지 않을 수 있다.

T 세포-특이적 케모카인을 생산하고 공동자극 또는 저해성 신호와 함께 항원을 제시하는 능력을 통해, 종양-관련 항원 제시 세포는 항-종양 효과기 면역을 형성하는 데 가장 적합하다. 조직-상주 수지상 세포는 기능적으로 특수화된 2개의 서브세트로 이루어진다: CD8⁺ T 세포에 대한 세포-관련 항원의 프라이밍 및 교차-제시에 참여하는 CD103⁺-CD8⁺ DC 및 CD4⁺ 헬퍼 T 세포 반응을 유도하는 데 더 강력한 CD11b⁺ DC. CD103⁺-CD8⁺ DC 계통에 의한 I형 인터페론 생산은 종양 항원에 대한 자발적 T 세포 프라이밍을 제어한다. 따라서, 종양-관련 골수성 구획의 구성은 관문 차단에 대한 종양 반응에서 중요한 역할을 할 가능성이 있다.

CD103⁺ 종양-침윤성 T 림프구와 암 환자의 개선된 임상 결과에 대해 보고된 연관성은 암-특이적 림프구의 발현 특성 및 향후의 면역요법에 대한 이들의 의미에 대한 명확하고 포괄적인 이해가 필요함을 강조한다.

제1 양태에서, 본 발명은 아래에 명시된 구조적 및 기능적 특징을 포함하는 항-CD103 항체 및 이의 항원 결합 단편을 제공한다.

다양한 실시형태에서, 본 발명은 다음을 포함하는 인간 CD103에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다:

a. 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 서열번호 1과 1개, 2개 또는 3개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1,

b. 서열번호 2의 아미노산 서열 또는 서열번호 2와 1개, 2개 또는 3개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2,

c. 서열번호 3의 아미노산 서열 또는 서열번호 3과 1개, 2개 또는 3개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3,

d. 서열번호 4의 아미노산 서열 또는 서열번호 4와 1개, 2개 또는 3개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1,

e. 서열번호 5의 아미노산 서열 또는 서열번호 5와 1개, 2개 또는 3개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2, 및

f. 서열번호 6의 아미노산 서열 또는 서열번호 6과 1개, 2개 또는 3개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3;

또는

g. 서열번호 9의 아미노산 서열 또는 서열번호 9와 1개, 2개 또는 3개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1,

h. 서열번호 10의 아미노산 서열 또는 서열번호 10과 1개, 2개 또는 3개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2,

i. 서열번호 11의 아미노산 서열 또는 서열번호 11과 1개, 2개 또는 3개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3,

j. 서열번호 12의 아미노산 서열 또는 서열번호 12와 1개, 2개 또는 3개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1,

k. 서열번호 13의 아미노산 서열 또는 서열번호 13과 1개, 2개 또는 3개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2, 및

l. 서열번호 14의 아미노산 서열 또는 서열번호 14와 1개, 2개 또는 3개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3;

또는

m. 서열번호 17의 아미노산 서열 또는 서열번호 17과 1개, 2개 또는 3개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1,

n. 서열번호 18의 아미노산 서열 또는 서열번호 18과 1개, 2개 또는 3개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2,

o. 서열번호 19의 아미노산 서열 또는 서열번호 19와 1개, 2개 또는 3개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3,

p. 서열번호 20의 아미노산 서열 또는 서열번호 20과 1개, 2개 또는 3개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1,

q. 서열번호 21의 아미노산 서열 또는 서열번호 21과 1개, 2개 또는 3개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2, 및

r. 서열번호 22의 아미노산 서열 또는 서열번호 22와 1개, 2개 또는 3개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3;

또는

s. 서열번호 25의 아미노산 서열 또는 서열번호 25와 1개, 2개 또는 3개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1,

t. 서열번호 26의 아미노산 서열 또는 서열번호 26과 1개, 2개 또는 3개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2,

u. 서열번호 27의 아미노산 서열 또는 서열번호 27과 1개, 2개 또는 3개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3,

v. 서열번호 28의 아미노산 서열 또는 서열번호 28과 1개, 2개 또는 3개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1,

w. 서열번호 29의 아미노산 서열 또는 서열번호 29와 1개, 2개 또는 3개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2, 및

x. 서열번호 30의 아미노산 서열 또는 서열번호 30과 1개, 2개 또는 3개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3;

또는

y. 서열번호 33의 아미노산 서열 또는 서열번호 33과 1개, 2개 또는 3개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1,

z. 서열번호 34의 아미노산 서열 또는 서열번호 34와 1개, 2개 또는 3개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2,

aa. 서열번호 35의 아미노산 서열 또는 서열번호 35와 1개, 2개 또는 3개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3,

bb. 서열번호 36의 아미노산 서열 또는 서열번호 36과 1개, 2개 또는 3개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1,

cc. 서열번호 37의 아미노산 서열 또는 서열번호 37과 1개, 2개 또는 3개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2, 및

dd. 서열번호 38의 아미노산 서열 또는 서열번호 38과 1개, 2개 또는 3개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3.

일 실시형태에서, 본 발명은 다음을 포함하는 인간 CD103에 결합하는 항체를 제공한다:

a. 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1,

b. 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2,

c. 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3,

d. 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1,

e. 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2, 및

f. 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3.

a. 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1,

b. 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2,

c. 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3,

d. 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1,

e. 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2, 및

f. 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3.

a. 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1,

b. 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2,

c. 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3,

d. 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1,

e. 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2, 및

f. 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3.

a. 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1,

b. 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2,

c. 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3,

d. 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1,

e. 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2, 및

f. 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3.

a. 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1,

b. 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2,

c. 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3,

d. 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1,

e. 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2, 및

f. 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3.

a. 서열번호 1과 1개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1,

b. 서열번호 2와 1개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2,

c. 서열번호 3과 1개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3,

d. 서열번호 4와 1개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1,

e. 서열번호 5와 1개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2, 및

f. 서열번호 6과 1개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3.

a. 서열번호 9와 1개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1,

b. 서열번호 10과 1개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2,

c. 서열번호 11과 1개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3,

d. 서열번호 12와 1개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1,

e. 서열번호 13과 1개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2, 및

f. 서열번호 14와 1개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3.

a. 서열번호 17과 1개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1,

b. 서열번호 18과 1개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2,

c. 서열번호 19와 1개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3,

d. 서열번호 20과 1개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1,

e. 서열번호 21과 1개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2, 및

f. 서열번호 22와 1개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3.

a. 서열번호 25와 1개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1,

b. 서열번호 26과 1개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2,

c. 서열번호 27과 1개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3,

d. 서열번호 28과 1개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1,

e. 서열번호 29와 1개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2, 및

f. 서열번호 30과 1개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3.

a. 서열번호 33과 1개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1,

b. 서열번호 34와 1개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2,

c. 서열번호 35와 1개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3,

d. 서열번호 36과 1개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1,

e. 서열번호 37과 1개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2, 및

f. 서열번호 38과 1개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3.

a. 서열번호 1와 2개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1,

b. 서열번호 2와 2개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2,

c. 서열번호 3과 2개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3,

d. 서열번호 4와 2개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1,

e. 서열번호 5와 2개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2, 및

f. 서열번호 6과 2개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3.

a. 서열번호 9와 2개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1,

b. 서열번호 10과 2개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2,

c. 서열번호 11과 2개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3,

d. 서열번호 12와 2개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1,

e. 서열번호 13과 2개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2, 및

f. 서열번호 14와 2개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3.

a. 서열번호 17과 2개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1,

b. 서열번호 18과 2개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2,

c. 서열번호 19와 2개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3,

d. 서열번호 20과 2개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1,

e. 서열번호 21과 2개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2, 및

f. 서열번호 22와 2개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3.

a. 서열번호 25와 2개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1,

b. 서열번호 26과 2개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2,

c. 서열번호 27과 2개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3,

d. 서열번호 28과 2개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1,

e. 서열번호 29와 2개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2, 및

f. 서열번호 30과 2개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3.

a. 서열번호 33과 2개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1,

b. 서열번호 34와 2개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2,

c. 서열번호 35와 2개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3,

d. 서열번호 36과 2개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1,

e. 서열번호 37과 2개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2, 및

f. 서열번호 38과 2개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3.

a. 서열번호 1과 3개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1,

b. 서열번호 2와 3개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2,

c. 서열번호 3과 3개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3,

d. 서열번호 4와 3개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1,

e. 서열번호 5와 3개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2, 및

f. 서열번호 6과 3개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3.

a. 서열번호 9와 3개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1,

b. 서열번호 10과 3개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2,

c. 서열번호 11과 3개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3,

d. 서열번호 12와 3개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1,

e. 서열번호 13과 3개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2, 및

f. 서열번호 14와 3개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3.

a. 서열번호 17과 3개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1,

b. 서열번호 18과 3개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2,

c. 서열번호 19와 3개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3,

d. 서열번호 20과 3개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1,

e. 서열번호 21과 3개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2, 및

f. 서열번호 22와 3개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3.

a. 서열번호 25와 3개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1,

b. 서열번호 26과 3개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2,

c. 서열번호 27과 3개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3,

d. 서열번호 28과 3개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1,

e. 서열번호 29와 3개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2, 및

f. 서열번호 30과 3개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3.

a. 서열번호 33과 3개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1,

b. 서열번호 34와 3개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2,

c. 서열번호 35와 3개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3,

d. 서열번호 36과 3개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1,

e. 서열번호 37과 3개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2, 및

f. 서열번호 38과 3개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3.

다양한 다른 실시형태에서, 본 발명은 다음을 포함하는 인간 CD103에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다:

a. 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편의 중쇄 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편의 경쇄; 또는

b. 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편의 중쇄 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편의 경쇄; 또는

c. 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편의 중쇄 및 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편의 경쇄; 또는

d. 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편의 중쇄 및 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편의 경쇄; 또는

e. 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편의 중쇄 및 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편의 경쇄;

또는 각 경우에 주어진 서열번호에 대해 적어도 95%(보다 바람직하게는 97% 또는 99%)의 서열 유사성 또는 동일성을 갖는 서열이며, 이러한 서열의 임의의 차이는 서열번호 내 CDR 서열의 일부가 아닌 아미노산에 국한된다.

일 실시형태에서, 본 발명은 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 항체의 중쇄 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 항체의 경쇄를 포함하는 인간 CD103에 결합하는 항체를 제공한다.

일 실시형태에서, 본 발명은 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 항체의 중쇄 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 항체의 경쇄를 포함하는 인간 CD103에 결합하는 항체를 제공한다.

일 실시형태에서, 본 발명은 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 항체의 중쇄 및 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 항체의 경쇄를 포함하는 인간 CD103에 결합하는 항체를 제공한다.

일 실시형태에서, 본 발명은 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 항체의 중쇄 및 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 항체의 경쇄를 포함하는 인간 CD103에 결합하는 항체를 제공한다.

일 실시형태에서, 본 발명은 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 항체의 중쇄 및 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 항체의 경쇄를 포함하는 인간 CD103에 결합하는 항체를 제공한다.

일 실시형태에서, 본 발명은 서열번호 7에 대해 적어도 95%(보다 바람직하게는 97% 또는 가장 바람직하게는 99%)의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 항체의 중쇄로서, 이러한 서열의 임의의 차이는 서열번호 7 내 CDR 서열의 일부가 아닌 아미노산에 국한되는, 상기 중쇄 및 서열번호 8에 대해 적어도 95%(보다 바람직하게는 97% 또는 가장 바람직하게는 99%)의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 항체의 경쇄로서, 이러한 서열의 임의의 차이는 서열번호 8 내 CDR 서열의 일부가 아닌 아미노산에 국한되는, 상기 경쇄를 포함하는 인간 CD103에 결합하는 항체를 제공한다.

일 실시형태에서, 본 발명은 서열번호 15에 대해 적어도 95%(보다 바람직하게는 97% 또는 가장 바람직하게는 99%)의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 항체의 중쇄로서, 이러한 서열의 임의의 차이는 서열번호 15 내 CDR 서열의 일부가 아닌 아미노산에 국한되는, 상기 중쇄 및 서열번호 16에 대해 적어도 95%(보다 바람직하게는 97% 또는 가장 바람직하게는 99%)의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 항체의 경쇄로서, 이러한 서열의 임의의 차이는 서열번호 16 내 CDR 서열의 일부가 아닌 아미노산에 국한되는, 상기 경쇄를 포함하는 인간 CD103에 결합하는 항체를 제공한다.

일 실시형태에서, 본 발명은 서열번호 23에 대해 적어도 95%(보다 바람직하게는 97% 또는 가장 바람직하게는 99%)의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 항체의 중쇄로서, 이러한 서열의 임의의 차이는 서열번호 23 내 CDR 서열의 일부가 아닌 아미노산에 국한되는, 상기 중쇄 및 서열번호 24에 대해 적어도 95%(보다 바람직하게는 97% 또는 가장 바람직하게는 99%)의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 항체의 경쇄로서, 이러한 서열의 임의의 차이는 서열번호 24 내 CDR 서열의 일부가 아닌 아미노산에 국한되는, 상기 경쇄를 포함하는 인간 CD103에 결합하는 항체를 제공한다.

일 실시형태에서, 본 발명은 서열번호 31에 대해 적어도 95%(보다 바람직하게는 97% 또는 가장 바람직하게는 99%)의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 항체의 중쇄로서, 이러한 서열의 임의의 차이는 서열번호 31 내 CDR 서열의 일부가 아닌 아미노산에 국한되는, 상기 중쇄 및 서열번호 32에 대해 적어도 95%(보다 바람직하게는 97% 또는 가장 바람직하게는 99%)의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 항체의 경쇄로서, 이러한 서열의 임의의 차이는 서열번호 32 내 CDR 서열의 일부가 아닌 아미노산에 국한되는, 상기 경쇄를 포함하는 인간 CD103에 결합하는 항체를 제공한다.

일 실시형태에서, 본 발명은 서열번호 39에 대해 적어도 95%(보다 바람직하게는 97% 또는 가장 바람직하게는 99%)의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 항체의 중쇄로서, 이러한 서열의 임의의 차이는 서열번호 39 내 CDR 서열의 일부가 아닌 아미노산에 국한되는, 상기 중쇄 및 서열번호 40에 대해 적어도 95%(보다 바람직하게는 97% 또는 가장 바람직하게는 99%)의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 항체의 경쇄로서, 이러한 서열의 임의의 차이는 서열번호 40 내 CDR 서열의 일부가 아닌 아미노산에 국한되는, 상기 경쇄를 포함하는 인간 CD103에 결합하는 항체를 제공한다.

이러한 맥락에서, "서열 유사성"은 보존적 변화의 정도와 합해진 동일성의 정도를 기반으로 한다. "서열 유사성"의 백분율은 즉 동일하거나 또는 보존적으로 변경된 아미노산 또는 뉴클레오타이드의 백분율, 즉, "서열 유사성" = 서열 동일성 백분율) + 보존적 변화 백분율)이다. 따라서, 본 발명의 목적을 위해, "보존적 변화" 및 "동일성"은 더 넓은 용어 "유사성"의 종으로 간주된다. 따라서, 서열 "유사성"이라는 용어가 사용될 때마다, 이는 서열 "동일성" 및 "보존적 변화"를 포함한다. 소정의 실시형태에 따르면, 보존적 변화는 무시되고, 서열 유사성 백분율은 서열 동일성 백분율을 지칭한다. 소정의 실시형태에서, 참조된 서열 동일성 백분율에 의해 허용되는 서열의 변화는 모두 또는 거의 모두 보존적 변화이며; 즉, 서열이 90% 동일한 경우, 나머지 10%는 모두 또는 거의 모두 보존적 변화이다. 용어 "거의 모두"는 이러한 맥락에서 허용되는 서열 변화의 적어도 75%, 보다 바람직하게는 적어도 85%, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 90%, 가장 바람직하게는 적어도 95%가 보존적 변화임을 지칭한다. 항체 중쇄 및/또는 경쇄의 소정의 실시형태에서, 허용되는 서열 변화는 CDR이 아니라 프레임워크 영역 내에 있다.

임의의 위의 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 용어가 본 명세서에 정의된 바와 같이 단리될 수 있다.

임의의 위의 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 용어가 본 명세서에 정의된 바와 같이 재조합 항체이다.

임의의 위의 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 용어가 본 명세서에 정의된 바와 같이 전장 항체이다.

본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 다양한 종으로부터 얻을 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체는 토끼, 마우스, 래트, 기니피그, 닭, 염소, 양, 당나귀, 인간, 라마 또는 낙타 서열 또는 이러한 서열의 조합(소위 키메라 항체)인 면역글로불린 서열을 포함할 수 있다. 가장 바람직하게는, 항체 또는 항원 결합 단편은 인간 항체 또는 항원 결합 단편이다. 가장 바람직하게는, 항체 또는 항원 결합 단편은 인간화된 항체 또는 항원 결합 단편이다.

용어 항체는 (i) V_L, V_H, C_L및 C_H1 도메인으로 이루어진 1가 단편인 Fab 단편; (ii) 힌지 영역에서 이황화 브리지에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (iii) V_H및 C_H1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 암의 V_L및 V_H 도메인으로 이루어진 Fv 단편, (v) VH 도메인으로 이루어진 dAb 단편(Ward et al., (1989) Nature 341:544-546); 및 (vi) 단리된 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하여, 항원에 결합하는 능력을 보유하는 항원-결합 부분, 즉, "항원 결합 부위"(예를 들어, 단편, 하위서열, 상보성 결정 영역(CDR))를 포함한다. 단일 사슬 항체는 또한 용어 "항체"에 참조로 포함된다. 바람직한 치료적 항체는 온전한 IgG 항체이다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "온전한 IgG"는 인식된 면역글로불린 감마 유전자에 의해 실질적으로 암호화되는 항체의 클래스에 속하는 폴리펩타이드를 의미한다. 인간에서, 이 클래스는 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함한다. 마우스에서, 이 클래스는 IgG1, IgG2a, IgG2b 및 IgG3을 포함한다. 항체의 IgG 클래스에서 알려진 Ig 도메인은 V_H, Cγ1, Cγ2, Cγ3, V_L및 C_L이다.

임의의 위의 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함하는 인간 또는 인간화된 항체이다. 일 실시형태에서, 항체는 IgG이다. 바람직한 실시형태에서, 항체는 IgG1, IgG2 또는 IgG4 및 바람직하게는 인간 IgG1, IgG2 또는 IgG4이다.

일 실시형태에서, 본 발명의 항-CD103 항체는 위에 언급된 바와 같은 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄를 갖는 전장 항체 구조를 포함하되, 각 경쇄는 인간 카파 경쇄 또는 인간 람다 경쇄 불변 도메인을 포함하고; 각 중쇄는 인간 IgG1 불변 영역을 포함한다.

일 실시형태에서, 본 발명의 항-CD103 항체는 위에 언급된 바와 같은 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄를 갖는 전장 항체 구조를 포함하되, 각 경쇄는 인간 카파 경쇄 또는 인간 람다 경쇄 불변 도메인을 포함하고; 각 중쇄는 인간 IgG2 불변 영역을 포함한다.

일 실시형태에서, 본 발명의 항-CD103 항체는 위에 언급된 바와 같은 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄를 갖는 전장 항체 구조를 포함하되, 각 경쇄는 인간 카파 경쇄 또는 인간 람다 경쇄 불변 도메인을 포함하고; 각 중쇄는 인간 IgG4 불변 영역을 포함한다.

소정의 실시형태에서, 본 발명의 항-CD103 항체는 생체내 이미징 연구를 위한 적어도 하나의 진단적 표지에 접합될 수 있다. 소정의 실시형태에서, 본 발명의 항-CD103 항체의 항원 결합 단편은 생체내 이미징 연구를 위한 적어도 하나의 진단적 표지에 접합될 수 있다. 소정의 실시형태에서, 본 발명의 항-CD103 항체는 적어도 1종의 치료제에 접합될 수 있다. 소정의 실시형태에서, 본 발명의 항-CD103 항체의 항원 결합 단편은 적어도 1종의 치료제에 접합될 수 있다. 일 실시형태에서, 치료제는 제2 항체 또는 이의 단편이다. 일 실시형태에서, 치료제는 제2 항체이다. 일 실시형태에서, 치료제는 면역조절제이다. 일 실시형태에서, 치료제는 호르몬이다. 일 실시형태에서, 치료제는 세포독성제이다. 일 실시형태에서, 치료제는 효소이다. 일 실시형태에서, 치료제는 방사성 핵종이다. 일 실시형태에서, 치료제는 적어도 1종의 면역조절제에 접합된 제2 항체이다. 일 실시형태에서, 치료제는 적어도 1종의 한 효소에 접합된 제2 항체이다. 일 실시형태에서, 치료제는 적어도 1종의 방사성 표지에 접합된 제2 항체이다. 일 실시형태에서, 치료제는 적어도 1종의 호르몬에 접합된 제2 항체이다. 일 실시형태에서, 치료제는 적어도 1종의 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 접합된 제2 항체이다. 일 실시형태에서, 치료제는 적어도 1종의 세포독성제에 접합된 제2 항체이다. 일 실시형태에서, 치료제는 이들의 조합에 접합된 제2 항체이다. 일 실시형태에서, 치료제는 제2 항체 또는 이의 단편, 면역조절제, 호르몬, 세포독성제, 효소, 방사성 핵종 중 어느 하나의 조합 또는 적어도 1종의 면역조절제, 효소, 방사성 표지, 호르몬, 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 세포독성제에 접합된 제2 항체이다. 또 다른 실시형태에서, 진단적 표지는 PET 이미징에 적용 가능한 것이다. 또 다른 실시형태에서, 진단적 표지는 단일-광자 방출 컴퓨터 단층촬영(SPECT) 이미징에 적용 가능한 것이다. 또 다른 실시형태에서, 진단적 표지는 MRI에 적용 가능한 것이다. 또 다른 실시형태에서, 진단적 표지는 광학 이미징에 적용 가능한 것이다. 또 다른 실시형태에서, 진단적 표지는 (광)음향 이미징 등에 적용 가능한 것, 예컨대, ¹¹C, ¹³N, ¹⁵O, ^99mTc, ⁶¹Cu, ⁶²Cu, ⁶⁴Cu, ⁶⁷Cu, ¹⁸F, ¹⁹F, ⁶⁶Ga, ⁶⁷Ga, ⁶⁸Ga, ⁷²Ga, ¹²³I, ¹²⁴I, ¹¹¹In, ¹⁷⁷Lu, ⁴⁴Sc, ⁴⁷Sc, ⁸⁶Y, ⁸⁸Y, ⁹⁰Y, ⁴⁵Ti, ⁸⁹Zr, 인도사이아닌 그린, IRDye 800CW, 플루오레세인(FITC), 자성(예를 들어, 산화철) 나노입자이다. 이 목록은 제한하기 위한 것은 아니다.

본 발명은 또한 본 발명의 항-CD103 항체 또는 항원 결합 단편 중 어느 하나를 암호화하는 단리된 핵산을 제공한다.

본 발명은 또한 본 발명의 하나 이상의 핵산을 포함하는 발현 벡터를 제공한다. 발현 벡터는 숙주 세포에서 표적 핵산의 전사에 필요한 조절 요소를 포함하는 DNA 분자이다. 전형적으로, 표적 핵산은 구성적 또는 유도성 프로모터, 조직-특이적 조절 요소 및 인핸서 요소를 포함하는 소정의 조절 요소의 제어하에 놓인다. 이러한 표적 핵산은 조절 요소가 유전자의 발현을 제어할 때 조절 요소에 "작동 가능하게 연결된다"고 한다.

이러한 단리된 핵산 및 이를 포함하는 발현 벡터는 재조합 숙주 세포에서 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 발현시키기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 본 발명의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.

본 발명은 또한 본 발명의 항-CD103 항체 또는 항원 결합 단편 중 어느 하나를 포함하는 용기 또는 주사 장치를 제공한다.

본 발명은 또한 다음을 포함하는 본 발명의 항-CD103 항체 또는 항원 결합 단편을 생산하는 방법을 제공한다: 본 발명의 항체(또는 이의 항원 결합 단편)의 중쇄 및/또는 경쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 숙주 세포를 폴리뉴클레오타이드의 발현에 유리한 조건하에 배양하는 단계; 및 선택적으로, 숙주 세포 및/또는 배양 배지로부터 항체 또는 항원 결합 단편을 회수하는 단계. 일 실시형태에서, 중쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및 경쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 단일 벡터에 있다. 또 다른 실시형태에서, 중쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및 경쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 상이한 벡터에 있다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 조직 또는 다른 생물학적 시료를 영상화하는 방법에 관한 것이다. 이러한 방법은 생물학적 시료를 항-CD103 항체와 접촉시키는 단계 및 생물학적 시료에 존재하는 CD103에 대한 항체의 결합의 존재 또는 양을 검출하는 단계를 포함한다. 따라서, 항-CD103 항체는 조영제로서 사용된다.

관련 양태에서, 본 발명은 항-CD103 항체 및 진단적 표지를 포함하는 조영제를 생산하는 방법에 관한 것이다. 이러한 방법은 항-CD103 항체와 진단적 표지 사이에 공유적 회합을 형성하는 단계를 포함한다. 대안적으로, 이러한 방법은 항-CD103 항체와 진단적 표지 사이에 비공유적 회합을 형성하는 단계를 포함한다. 방사성 표지의 경우, 동위원소는 방사성 금속의 고정화를 위한 제1 작용기 및 항체에 대한 공유적 부착을 위한 제2 작용기를 포함하는 이작용성 킬레이트제를 사용하여 킬레이트화될 수 있다. 이러한 킬레이트제의 예는 DOTA, NOTA, TRITA, TETA, TACN, 사이클렌, 사이클람, 호모사이클렌, EDTA, DTPA, DOTP 및 NOTMP를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 작용화된 버전의 킬레이트제는 보호되거나 또는 보호되지 않은 설피드릴 모이어티, 보호되거나 또는 보호되지 않은 아민 모이어티, 보호되거나 또는 보호되지 않은 하이드록실 모이어티, 1차 아민-반응성 모이어티, 설피드릴-반응성 모이어티, 광반응성 모이어티, 카복실-반응성 모이어티, 아르기닌-반응성 모이어티 및 카보닐-반응성 모이어티로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있는 말단 기능 모이어티를 제공하는 연결 화학을 제공한다. 작용화된 버전의 킬레이트제는 말단 기능 모이어티(즉, 보호된 설피드릴 모이어티)를 제공하는 연결 화학을 제공한다. 작용화된 버전의 킬레이트제는 말단 기능 모이어티(즉, 보호되지 않은 설피드릴 모이어티)를 제공하는 연결 화학을 제공한다. 작용화된 버전의 킬레이트제는 말단 기능 모이어티(즉, 보호된 아민 모이어티)를 제공하는 연결 화학을 제공한다. 작용화된 버전의 킬레이트제는 말단 기능 모이어티(즉, 보호되지 않은 아민 모이어티)를 제공하는 연결 화학을 제공한다. 작용화된 버전의 킬레이트제는 말단 기능 모이어티(즉, 보호된 하이드록실 모이어티)를 제공하는 연결 화학을 제공한다. 작용화된 버전의 킬레이트제는 말단 기능 모이어티(즉, 보호되지 않은 하이드록실 모이어티)를 제공하는 연결 화학을 제공한다. 작용화된 버전의 킬레이트제는 말단 기능 모이어티(즉, 아민-반응성 모이어티)를 제공하는 연결 화학을 제공한다. 작용화된 버전의 킬레이트제는 말단 기능 모이어티(즉, 설피드릴-반응성 모이어티)를 제공하는 연결 화학을 제공한다. 작용화된 버전의 킬레이트제는 말단 기능 모이어티(즉, 광반응성 모이어티)를 제공하는 연결 화학을 제공한다. 작용화된 버전의 킬레이트제는 말단 기능 모이어티(즉, 카복실-반응성 모이어티)를 제공하는 연결 화학을 제공한다. 작용화된 버전의 킬레이트제는 말단 기능 모이어티(즉, 아르기닌-반응성 모이어티)를 제공하는 연결 화학을 제공한다. 작용화된 버전의 킬레이트제는 말단 기능 모이어티(즉, 카보닐-반응성 모이어티)를 제공하는 연결 화학을 제공한다. 환원제가 이황화 연결을 방사성 표지에 결합하는 유리 티올로 전환시키는 직접 표지 접근법도 또한 상정된다.

다양한 실시형태에서, 진단적 표지는 효소, 핵산, 형광단, 바이오틴, 아비딘, 스트렙타비딘, 디곡시게닌, 말토스, 올리고히스티딘, 2,4-다이나이트로벤젠, 페닐아르세네이트, 금속, 펩타이드 태그, 형광성 또는 착색된 마이크로스피어, 형광성 입자 및 착색된 라텍스 입자로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 이 목록은 제한하기 위한 것은 아니다. 다양한 실시형태에서, 진단적 표지는 효소이다. 다양한 실시형태에서, 진단적 표지는 핵산이다. 다양한 실시형태에서, 진단적 표지는 형광단이다. 다양한 실시형태에서, 진단적 표지는 바이오틴이다. 다양한 실시형태에서, 진단적 표지는 아비딘이다. 다양한 실시형태에서, 진단적 표지는 스트렙타비딘이다. 다양한 실시형태에서, 진단적 표지는 디곡시게닌이다. 다양한 실시형태에서, 진단적 표지는 말토스이다. 다양한 실시형태에서, 진단적 표지는 올리고히스티딘이다. 다양한 실시형태에서, 진단적 표지는 2,4-다이나이트로벤젠이다. 다양한 실시형태에서, 진단적 표지는 페닐아르세네이트이다. 다양한 실시형태에서, 진단적 표지는 금속이다. 다양한 실시형태에서, 진단적 표지는 펩타이드 태그이다. 다양한 실시형태에서, 진단적 표지는 형광성 마이크로스피어이다. 다양한 실시형태에서, 진단적 표지는 착색된 마이크로스피어이다. 다양한 실시형태에서, 진단적 표지는 형광성 입자이다. 다양한 실시형태에서, 진단적 표지는 착색된 라텍스 입자이다. 이러한 표지는 말레이미드, 알킬 할라이드, 아릴 할라이드, 알파-할로아실, 활성화된 아릴, 피리딜 이황화, 카보닐, 카복실, 티올, 티오에스터, 이황화, N-하이드록시-석신이미드 또는 고리형 티오락톤 등을 포함하는 교차링커에 의해 항체에 접합될 수 있다.

소정의 실시형태에서, 생물학적 시료는 생체(living body) 내 조직이며, 방법은 생체내 이미징 방법이다. 소정의 실시형태에서, 생물학적 시료는 생체 내 조직이며, 방법은 PET 이미징과 같은 생체내 이미징 방법이다. 소정의 실시형태에서, 생물학적 시료는 생체 내 조직이며, 방법은 생체내 이미징 방법인 단일-광자 방출 컴퓨터 단층촬영(SPECT) 이미징이다. 소정의 실시형태에서, 생물학적 시료는 생체 내 조직이며, 방법은 생체내 이미징 방법인 MRI이다. 이러한 방법에서, 항-CD103 항체는 사용되는 이미징 방법론의 요구 사항에 따라 검출 가능하게 표지된다. 적합한 진단적 표지는 본 명세서에 기재되어 있으며, ¹¹C, ¹³N, ¹⁵O, ^99mTc, ⁶¹Cu, ⁶²Cu, ⁶⁴Cu, ⁶⁷Cu, ¹⁸F, ¹⁹F, ⁶⁶Ga, ⁶⁷Ga, ⁶⁸Ga, ⁷²Ga, ¹²³I, ¹²⁴I, ¹¹¹In, ¹⁷⁷Lu, ⁴⁴Sc, ⁴⁷Sc, ⁸⁶Y, ⁸⁸Y, ⁹⁰Y, ⁴⁵Ti, ⁸⁹Zr, 인도사이아닌 그린, IRDye 800CW, 플루오레세인(FITC) 및 자성(예를 들어, 산화철) 나노입자를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.

다양한 실시형태에서, 조영제로서 사용되는 항-CD103 항체는 동족 수용체 E-카드헤린에 결합하는 CD103를 차단한다. 다양한 실시형태에서, 조영제로서 사용되는 항-CD103 항체는 동족 수용체 E-카드헤린에 결합하는 CD103를 차단하지 않는다. 다양한 실시형태에서, 조영제로서 사용되는 항-CD103 항체는 동족 수용체 E-카드헤린에 결합하는 CD103를 부분적으로 차단한다. 이러한 유형의 항-CD103 항체 각각의 예는 하기에 기재되어 있다.

다양한 실시형태에서, 조직 또는 다른 생물학적 시료를 영상화하는 방법은 조영제로서 본 발명의 항체를 사용한다.

다양한 실시형태에서, 조직 또는 다른 생물학적 시료를 영상화하는 방법은 조영제로서 본 발명의 항체의 항원 결합 단편을 사용한다.

다양한 실시형태에서, 조직 또는 다른 생물학적 시료를 영상화하는 방법은 조영제로서 다음을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 사용한다:

또는

다양한 다른 실시형태에서, 조직 또는 다른 생물학적 시료를 영상화하는 방법은 조영제로서,

또는 각 경우에 주어진 서열번호에 대해 적어도 95%(보다 바람직하게는 97% 또는 99%)의 서열 유사성 또는 동일성을 갖는 서열을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 사용하며, 이러한 서열의 임의의 차이는 서열번호 내 CDR 서열의 일부가 아닌 아미노산에 국한된다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 항-CD103 항체를 치료제로서 사용하는 방법에 관한 것이다. 관련 양태에서, 본 발명은 약제의 제조에서의 본 발명의 항-CD103 항체의 용도에 관한 것이다. 또 다른 관련 양태에서, 본 발명은 CD103 신호전달을 억제하기 위해 본 발명의 항-CD103 항체를 사용하는 방법에 관한 것이다. 또 다른 관련 양태에서, 본 발명은 E-카드헤린에 대한 CD103 결합을 차단하기 위해 본 발명의 항-CD103 항체를 사용하는 방법에 관한 것이다.

일 실시형태에서, 방법은 CD103 신호전달-매개성 병태의 치료를 필요로 하는 개체에서 CD103 신호전달-매개성 병태를 치료하기 위한 것이며, 해당 방법은 유효량의 본 발명의 항-CD103 항체를 개체에게 투여하는 단계를 포함하되, 항-CD103 항체는 선택적으로 세포독성제에 커플링된다.

일 실시형태에서, 방법은 CD103 신호전달-매개성 병태의 치료를 필요로 하는 개체에서 CD103 신호전달-매개성 병태를 치료하기 위한 것이며, 해당 방법은 유효량의 본 발명의 항-CD103 항체의 항원 결합 단편을 개체에게 투여하는 단계를 포함하되, 항-CD103 항체는 선택적으로 세포독성제에 커플링된다.

일 실시형태에서, 방법은 CD103 신호전달-매개성 병태의 치료를 필요로 하는 개체에서 CD103 신호전달-매개성 병태를 예방하기 위한 것이며, 해당 방법은 유효량의 본 발명의 항-CD103 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 개체에게 투여하는 단계를 포함하되, 항-CD103 항체는 선택적으로 세포독성제에 커플링된다.

일 실시형태에서, 방법은 CD103 신호전달-매개성 병태의 치료를 필요로 하는 개체에서 CD103 신호전달-매개성 병태를 예방하기 위한 것이며, 해당 방법은 유효량의 본 발명의 항-CD103 항체의 항원 결합 단편을 개체에게 투여하는 단계를 포함하되, 항-CD103 항체는 선택적으로 세포독성제에 커플링된다.

또 다른 실시형태에서, 방법은 세포에서 CD103 신호전달을 저해하기 위한 것이며, 해당 방법은 세포를 본 발명의 항-CD103 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 접촉시키는 단계를 포함한다.

또 다른 실시형태에서, 방법은 세포 상에 존재하는 E-카드헤린에 대한 CD103 결합을 저해하기 위한 것이며, 해당 방법은 세포를 본 발명의 항-CD103 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 접촉시키는 단계를 포함한다.

또 다른 실시형태에서, 방법은 개체에서 CD103-발현 세포를 고갈시키기 위한 것이며, 해당 방법은 유효량의 본 발명의 항-CD103 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 개체에게 투여하는 단계를 포함하되, 항-CD103 항체는 선택적으로 세포독성제에 커플링된다.

또 다른 실시형태에서, 방법은 털세포 백혈병, HCLv, 장 및 장외 림프종, 장질환-관련 T-세포 림프종(enteropathy-associated T-cell lymphoma: EATL), T-림프아구성 백혈병/림프종(T-lymphoblastic leukemia/lymphoma: T-ALL), T-세포 전림프구성 백혈병(T-cell prolymphocytic leukemia: T-PLL), 성인 T 세포 백혈병/림프종(adult T cell leukemia/lymphoma: ATLL), 균상 식육종(mycosis fungoides: MF), 역형성 대세포 림프종(anaplastic large cell lymphoma: ALCL), 피부 T-세포 림프종(cutaneous T-cell lymphoma: CTCL), 세자리 증후군(Sezary Syndrome: SS), 알츠하이머병, 파킨슨병, 다발성 경화증, IgM 다발성신경병증, 중증 근무력증, 아토피성 피부염, 알레르기, 천식, 전신 염증성 반응 증후군(systemic inflammatory response syndrome: SIRS), 패혈증, 패혈성 쇼크, 죽상동맥 경화증, 셀리악병, 피부근염, 경피증, 간질성 방광염, 이식 거부, 이식편-대-숙주병, 아이카디-구티에레스 증후군(Aicardi-Goutieres Syndrome), 허친슨 길포드 조로증 증후군(Hutchison Guilford progeria syndrome), 싱글톤-메르텐 증후군(Singleton-Merten Syndrome), 프로테오솜-관련 자가염증성 증후군, SAVI(STING-associated vasculopathy with onset in infancy: 유아기에 발병하는 STING-관련 혈관병증), CANDLE(Chronic Atypical Neutrophilic Dermatosis with Lipodystrophy and Elevated Temperature: 지방이영양증 및 온도 상승을 동반한 만성 비정형 호중구 피부병) 증후군, 동창 홍반성 루푸스, 전신 홍반성 루푸스, 류마티스성 관절염, 소아 류마티스성 관절염, 베게너병, 염증성 장 질환(예를 들어, 궤양성 대장염, 크론병), 특발성 혈소판 감소성 자반병, 혈전성 혈소판 감소성 자반병, 자가면역 혈소판감소증, 다발성 경화증, 건선, IgA 신장병증, IgM 다발성신경병증, 사구체신염, 자가면역 심근염, 중증 근무력증, 혈관염, 1형 당뇨병, 2형 당뇨병, 쇼그렌 증후군, X-연관 망상 색소이상증, 다발성 근염, 척추연골 이형성증 및 연령-관련 황반변성으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질환의 치료 또는 예방을 필요로 하는 개체에서 이들 질환을 치료 또는 예방하기 위한 방법에 대한 것이며, 해당 방법은 유효량의 본 발명의 항-CD103 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 개체에게 투여하는 단계를 포함하되, 항-CD103 항체는 선택적으로 세포독성제에 커플링된다.

또 다른 실시형태에서, 방법은 털세포 백혈병, HCLv, 장 및 장외 림프종, 장질환-관련 T-세포 림프종(EATL), T-림프아구성 백혈병/림프종(T-ALL), T-세포 전림프구성 백혈병(T-PLL), 성인 T 세포 백혈병/림프종(ATLL), 균상 식육종(MF), 역형성 대세포 림프종 ALCL, 피부 T-세포 림프종(CTCL), 세자리 증후군(SS), 알츠하이머병, 파킨슨병, 다발성 경화증, IgM 다발성신경병증, 중증 근무력증, 아토피성 피부염, 알레르기, 천식, 전신 염증성 반응 증후군(SIRS), 패혈증, 패혈성 쇼크, 죽상동맥 경화증, 셀리악병, 피부근염, 경피증, 간질성 방광염, 이식 거부, 이식편-대-숙주병, 아이카디-구티에레스 증후군, 허친슨 길포드 조로증 증후군, 싱글톤-메르텐 증후군, 프로테오솜-관련 자가염증성 증후군, SAVI(유아기에 발병하는 STING-관련 혈관병증), CANDLE(지방이영양증 및 온도 상승을 동반한 만성 비정형 호중구 피부병) 증후군, 동창 홍반성 루푸스, 전신 홍반성 루푸스, 류마티스성 관절염, 소아 류마티스성 관절염, 베게너병, 염증성 장 질환(예를 들어, 궤양성 대장염, 크론병), 특발성 혈소판 감소성 자반병, 혈전성 혈소판 감소성 자반병, 자가면역 혈소판감소증, 다발성 경화증, 건선, IgA 신장병증, IgM 다발성신경병증, 사구체신염, 자가면역 심근염, 중증 근무력증, 혈관염, 1형 당뇨병, 2형 당뇨병, 쇼그렌 증후군, X-연관 망상 색소이상증, 다발성 근염, 척추연골 이형성증 및 연령-관련 황반변성으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질환의 치료를 필요로 하는 개체에서 이들 질환을 치료하는 방법에 관한 것이며, 해당 방법은 유효량의 본 발명의 항-CD103 항체를 개체에게 투여하는 단계를 포함하되, 항-CD103 항체는 선택적으로 세포독성제에 커플링된다.

또 다른 실시형태에서, 방법은 털세포 백혈병, HCLv, 장 및 장외 림프종, 장질환-관련 T-세포 림프종(EATL), T-림프아구성 백혈병/림프종(T-ALL), T-세포 전림프구성 백혈병(T-PLL), 성인 T 세포 백혈병/림프종(ATLL), 균상 식육종(MF), 역형성 대세포 림프종 ALCL, 피부 T-세포 림프종(CTCL), 세자리 증후군(SS), 알츠하이머병, 파킨슨병, 다발성 경화증, IgM 다발성신경병증, 중증 근무력증, 아토피성 피부염, 알레르기, 천식, 전신 염증성 반응 증후군(SIRS), 패혈증, 패혈성 쇼크, 죽상동맥 경화증, 셀리악병, 피부근염, 경피증, 간질성 방광염, 이식 거부, 이식편-대-숙주병, 아이카디-구티에레스 증후군, 허친슨 길포드 조로증 증후군, 싱글톤-메르텐 증후군, 프로테오솜-관련 자가염증성 증후군, SAVI(유아기에 발병하는 STING-관련 혈관병증), CANDLE(지방이영양증 및 온도 상승을 동반한 만성 비정형 호중구 피부병) 증후군, 동창 홍반성 루푸스, 전신 홍반성 루푸스, 류마티스성 관절염, 소아 류마티스성 관절염, 베게너병, 염증성 장 질환(예를 들어, 궤양성 대장염, 크론병), 특발성 혈소판 감소성 자반병, 혈전성 혈소판 감소성 자반병, 자가면역 혈소판감소증, 다발성 경화증, 건선, IgA 신장병증, IgM 다발성신경병증, 사구체신염, 자가면역 심근염, 중증 근무력증, 혈관염, 1형 당뇨병, 2형 당뇨병, 쇼그렌 증후군, X-연관 망상 색소이상증, 다발성 근염, 척추연골 이형성증 및 연령-관련 황반변성으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질환의 예방을 필요로 하는 개체에서 이들 질환을 예방하는 방법에 관한 것이며, 해당 방법은 유효량의 본 발명의 항-CD103 항체를 개체에게 투여하는 단계를 포함하되, 항-CD103 항체는 선택적으로 세포독성제에 커플링된다.

다양한 실시형태에서, 이러한 방법은 본 발명의 항체를 사용한다.

다양한 실시형태에서, 이러한 방법은 본 발명의 항체의 항원 결합 단편을 사용한다.

다양한 실시형태에서, 이러한 방법은 다음을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 사용한다:

또는

본 발명은 기술된 것 이외의 실시형태가 가능하며, 다양한 방식으로 실시되고 수행될 수 있음을 이해하여야 한다. 또한, 본 명세서에 사용된 어구 및 전문 용어뿐만 아니라 요약은 설명을 위한 것이며, 제한하는 것으로 간주되어서는 안 됨을 이해하여야 한다. 이와 같이, 당업자는 본 개시내용이 기반으로 하는 개념이 본 발명의 여러 목적을 수행하기 위한 다른 구조, 방법 및 시스템의 설계를 위한 기초로서 쉽게 이용될 수 있음을 이해할 것이다. 따라서, 청구범위가 본 발명의 사상 및 범주를 벗어나지 않는 한 이러한 동등한 구성을 포함하는 것으로 간주되는 것이 중요하다.

도 1: CHO.K1-hCD103/h베타7, CHO.K1-rhCD103/rh베타7 및 CHO.K1-h알파4/h베타7에 대한 항-hCD103 mAb의 세포 ELISA 결합 데이터.
도 2: 상이한 hCD103 VL 및 VH 서열에 대한 계통수(phylogenetic tree).
도 3: CHO.K1.hCD103/h베타7, CHO.K1 및 재조합 인간 CD103/베타7에 대한 hCD103.01A, hCD103.05A, hCD103.06A, Fab.hCD103.01.C1, Fab.hCD103.05.C1 및 Fab.hCD103.06.C1의 CELISA 결합 데이터.
도 4: CHO.K1.hCD103/h베타7에 대한 AF647-hCD103.01A, AF647-hCD103.05A, AF647-hCD103.06A, AF647-Fab.hCD103.01.C1, AF647-Fab.hCD103.05.C1 및 AF647-Fab.hCD103.06.C1 각각의 세포 결합.
도 5: 대조군 항체 또는 항-hCD103 mAb를 이용한 CD8 및 CD103에 대한 종양 소화물(tumor digest)의 대표적인 염색.
도 6: CD3+ 세포(총 T-세포 집단), CD3+ CD103+ CD8+ 세포(T-세포 하위집단) 및 CD33+ 세포(골수성 집단)에 대한 항-hCD103 mAb 후보의 결합. N = 10의 상이한 종양 소화물.
도 7: 대조 시약 또는 항-hCD103 Fab를 이용한 CD8 및 CD103에 대한 종양 소화물의 염색. 상단의 2개의 행은 모 Fab(표지되지 않음)를 사용한 염색 및 2차 항-Fab 시약을 사용한 검출을 보여주는 반면, 하단의 행은 AF647 접합된 Fab를 사용한 염색 및 직접 판독 결과를 보여준다.
도 8: mAb 간의 친화도 및 경쟁의 차이를 연구하기 위해, CD103+ CD8+ T 세포가 본 발명의 CD103 mAb 또는 상업용 CD103 mAb(클론 BerACT-8, 비디 사이언스(BD bioscience))와 함께 사전 인큐베이션된 후, 형광 표지된 대응물과 함께 인큐베이션되었다. 형광 표지된 mAb의 결합 백분율은 유세포 분석을 사용하여 결정되었다. 최대 결합은 100%로 설정되었다.
도 9: 항-hCD103 mAb 및 대조군의 존재하에 재조합 E-카드헤린에 대한 CD103+ T 세포 결합. 항체는 재조합 E-카드헤린과 함께 인큐베이션되기 전 세포와 함께 사전 인큐베이션되거나(왼쪽 막대 세트, 처리 전) 또는 세포는 먼저 재조합 E-카드헤린과 함께 인큐베이션된 후 mAb가 첨가되었다(오른쪽 막대 세트, 처리).
도 10: CHO.K1-hCD103/h베타7에 대한 Df-접합 및 모 항-hCD103 mAb(후보 hCD103.01A 및 hCD103.05A) 또는 Fab 단편(후보 Fab.hCD103.01.C1 및 Fab.hCD103.05.C1)의 결합.
도 11: 상이한 ⁸⁹Zr 수준에서 ⁸⁹Zr-표지된 항-hCD103 mAb(후보 hCD103.01A 및 hCD103.05A)의 방사화학적 순도(radiochemical purity).
도 12: CHO.K1-hCD103/h베타7(적색) 및 CHO.K1(청색)에 대한 ⁸⁹Zr-표지된 항-hCD103 mAb(후보 hCD103.01A 및 hCD103.05A)의 결합. 결합은 ⁸⁹Zr-mAb 결합 활성의 양으로 측정되었다.
도 13a 내지 도 13e: CHO.K1-hCD103/h베타7 또는 CHO.K1 WT 보유 마우스(도 13c 및 도 13d)의 혈액 대 표적 조직에서 ⁸⁹Zr-hCD103.01A 및 ⁸⁹Zr-hCD103.05A(도 13a)에 대한 PET 이미징 프로토콜, PET 이미징 2D 시각화(관상(coronal))(도 13b), ⁸⁹Zr-hCD103.01A, 및 ⁸⁹Zr-hCD103.05A, 및 ⁸⁹Zr-hCD103.01A 및 ⁸⁹Zr-hCD103.05A 수준의 표적 대 혈액 비 및 비교 조직 분포 비(13E). 여기서, 종양(표적)은 각각 CHO.K1-hCD103/h베타7(적색 및 녹색) 또는 CHO.K1 WT(회색)를 의미한다. CHO.K1 WT 보유 마우스에 비특이적 대조군 그룹으로서 ⁸⁹Zr-hCD103.01A가 주사되었다.
도 14: 주사 후 제6일에 CHO.K1-hCD103/h베타7 또는 CHO.K1 WT 보유 마우스(n=3)에서 ⁸⁹Zr-hCD103.01A 및 ⁸⁹Zr-hCD103.05A에 대한 체내분포 결과. 여기서, 종양은 각각 CHO.K1-hCD103/h베타7(적색 또는 녹색) 또는 CHO.K1(회색)을 의미한다. CHO.K1 WT 보유 마우스에 비특이적 대조군 그룹으로서 ⁸⁹Zr-hCD103.01A가 주사되었다.
도 15: 주사 후 24시간에 CHO.K1-hCD103/h베타7(n=2) 또는 CHO.K1 WT 보유 마우스(n= 3)에서 ⁸⁹Zr-Fab.hCD103.01.C1 및 ⁸⁹Zr-Fab.hCD103.05.C1에 대한 체내분포 결과. 여기서, 종양은 각각 CHO.K1-hCD103/h베타7(적색 또는 녹색) 또는 CHO.K1 WT(회색)를 의미한다. CHO.K1 WT 보유 마우스에 비특이적 대조군 그룹으로서 ⁸⁹Zr-Fab.hCD103.01.C1이 주사되었다.

모든 형태는 아니지만 대부분의 암 면역요법은 암세포에서 우선적으로 또는 선택적으로 발현되며 세포 표면 상의 주요 면역적합성 분자(major histocompatibility molecules: MHC)를 통해 제시되는 항원에 대한 T 세포-기반 면역 반응의 유도에 의존한다. 이러한 작용 방식은 아마도 예정사-1(PD-1) 또는 이의 리간드(PD-L1)를 차단하는 단일클론 항체를 이용한 치료에 대한 높은 종양 돌연변이 부담(tumor mutational burden: TMB)을 가진 환자의 격렬한 반응에 의해 가장 잘 예시될 것이다. 면역요법의 가능성을 더 많은 환자에게 확장시키기 위한 노력의 일환으로, 현재 다양한 유형의 암에 대해 2000개 이상의 (조합) 면역요법 시험이 시작되었다. 이러한 과다한 치료 옵션을 고려할 때, 약물 개발, 치료 결정 및 치료적 효과 평가를 안내할 수 있는 바이오마커가 시급히 필요하다.

성공적인 면역요법의 특징은 종양 덩어리(종양-침윤성 림프구(tumor-infiltrating lymphocyte: TIL)) 내의 T 세포의 활성 및 수의 증가이다. 따라서, 종양 병변에서 TIL "부하"는 면역요법을 위한 환자의 선택 및 모니터링을 지원하는 매력적인 바이오마커를 나타낸다. 불행히도, TIL에는 광범위한 레퍼토리가 있으며, 종양 내의 모든 T 세포가 항암 면역 반응에 관여하는 것은 아니다. 최근 몇 년 동안, 인테그린 서브유닛 CD103은 식도암, 흑색종, 폐암, 유방암, 방광암 및 모든 부인과 암을 포함하는 상피 악성종양 전반에 걸쳐 예후예측적 이익을 위한 TIL의 마커로 등장하였다. 중요하게는, CD103⁺ TIL은 이전에 종양에서 항암 효과와 관련된 CD39⁺, PD-1⁺및 CD137⁺ TIL 집단을 포함한다. 기계론적 연구는 또한 CD103이 동족 표적에 대한 T 세포의 특이적 활성화 후 유도되며, CD103⁺ 세포는 흑색종, 식도 편평 세포 암종 및 비소세포 폐암 환자에서의 성공적인 항-PD-1 치료 동안 상당히 확장되었음을 입증하였다. 마지막으로, CD103은 종양의 다른 면역 세포 집단에는 없기 때문에, 우수한 세포 특이성을 제공한다. 종합하면, 종양내 CD103 검출은 TIL 부하 및 면역요법에 대한 반응을 결정하기 위한 우수한 바이오마커를 제공할 수 있다.

TIL 부하를 평가하기 위한 현재의 표준은 조직 생검에 대한 면역조직화학(immunohistochemistry: IHC)을 통한 것이다. 그러나, 병변에 대한 열악한 접근성, 환자의 부담, 병변 내부와 병변 사이의 종양 이질성 및 샘플링 오류와 같은 생검-기반 기법과 관련된 것으로 알려진 몇 가지 장애가 있다. 또한, 현재의 기술을 사용하여 시간 경과에 따라 종양 병변에서 T-세포 침윤을 추적하는 것은 어렵거나/불가능하다. 이러한 장애를 극복하고 환자의 모든 종양 병변 및 독성-민감성 기관에서 TIL 부하에 대한 정보를 얻기 위해, 비침습적 전신 이미징 기법이 적용될 수 있다. 양전자 방출 단층촬영(Positron emission tomography: PET)은 호르몬 및 성장 인자 수용체의 발현과 같은 종양 특성의 반복적이고 비침습적인 임상 평가를 가능하게 하는 분자 이미징 기법이다. PET는 높은 공간 분해능, 민감도 및 이미징 신호를 정량할 수 있는 가능성을 특징으로 한다. PET는 적합하게 민감한 방사성 의약품을 사용할 수 있다면 종양에서 CD103⁺ 세포 특이적 모니터링을 가능하게 할 수 있다. 따라서, 여기에서는 방사성 의약품 사용에 적합한 다양한 항-CD103 특이적 항체의 개발에 대해 설명한다.

진단적/예후예측적 표적에 더하여, CD103는 또한 다양한 질환에서 치료 표적을 제공한다. 예를 들어, CD103은 T 세포, 장 상피내 림프구 및 고유판 림프구를 포함하는 림프구의 여러 서브세트에서 발현된다. CD103와 E-카드헤린 사이의 상호작용은 림프구가 상피 세포에 부착되도록 한다. E-카드헤린이 상피 세포에서 구성적으로 발현되는 반면, CD103의 발현은 시험관내에서 염증 자극 시 T 세포에서 유도된다. CD103의 차단은 염증성 장 질환과 같은 CD8+ 및 Th9 세포의 확장과 관련된 장애 및 동종이식 거부와 특히 관련이 있다. CD103은 또한 수지상 세포에 의해 그리고 이러한 세포의 악성 형태를 비롯한 다양한 T 세포 유형에서 발현된다. 추가적으로, 종양-관련 CD103+ CD8 T 세포는 면역관용 표현형(tolerogenic phenotype)을 가질 수 있고, CD103+ DC는 면역조절성 분자의 발현을 나타내며, IL-10, TGF-β, IL-35 및 인돌아민 2,3-다이옥시게네이스(IDO)와 같은 면역억제성 인자를 생성하여 T 세포 무반응(anergy), 및 세포자멸사 및 Treg의 유도를 유발한다.

따라서, CD103에 결합하고 CD103와 E-카드헤린 사이의 상호작용을 방해하는 분자는 질환에 대한 약물 후보이다. 마찬가지로, CD103에 결합하는 분자는, 예를 들어, 항체-약물 접합체의 일부로 사용되어 치료적 목적을 위해 CD103-발현 세포를 고갈시킬 수 있다.

정의

본 발명이 더 쉽게 이해될 수 있도록, 소정의 기술 및 과학 용어가 아래에 구체적으로 정의되어 있다. 본 문서의 다른 곳에서 달리 구체적으로 정의되지 않으면, 본 명세서에 사용된 모든 다른 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 당해 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 갖는다.

첨부된 청구범위를 포함하여 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 단어의 단수 형태는 달리 문맥이 명확하게 표시하지 않는 한 이들의 상응하는 복수의 언급을 포함한다.

"투여" 및 "치료"는 이것이 동물, 인간, 실험 대상체, 세포, 조직, 기관 또는 생물학적 유체에 적용될 때, 외인성 약제, 치료제, 진단제 또는 조성물에 대한 동물, 인간, 대상체, 세포, 조직, 기관 또는 생물학적 유체의 접촉을 지칭한다. 세포의 처리는 세포에 대한 시약의 접촉뿐만 아니라 유체가 세포와 접촉하는 경우 유체에 대한 시약의 접촉도 포함한다. "투여" 및 "치료"는 또한, 예를 들어, 시약, 진단적, 결합 화합물에 의한 세포 또는 또 다른 세포의 시험관내 및 생체외 처리를 의미한다.

"치료하다" 또는 "치료하는"은 본 발명의 임의의 항체 또는 항원-결합 단편을 포함하는 조성물과 같은 치료제를 작용제가 치료적 활성을 갖는 하나 이상의 질환 증상을 갖거나 또는 질환을 갖는 것으로 의심되는 대상체 또는 환자에게 내부적으로 또는 외부적으로 투여하는 것을 의미한다. 전형적으로, 작용제는 임의의 임상적으로 측정 가능한 정도에 의해 이러한 증상(들)의 퇴행을 유도하거나 또는 진행을 저해함으로써 치료되는 대상체 또는 집단에서 하나 이상의 질환 증상을 완화시키는 데 효과적인 양으로 투여된다. 임의의 특정 질환 증상을 완화시키는 데 효과적인 치료제의 양은 환자의 질환 상태, 연령 및 체중, 및 대상체에서 목적하는 반응을 이끌어내는 약물의 능력과 같은 인자에 따라 달라질 수 있다. 질환 증상이 완화되었는지 여부는 해당 증상의 중증도 또는 진행 상태를 평가하기 위해 의사 또는 다른 숙련된 건강관리 제공자가 전형적으로 사용하는 임의의 임상 측정에 의해 평가될 수 있다.

단백질의 "재조합 발현"은 본 명세서에서 "재조합 단백질"로 지칭되는 단백질을 생성하기 위한 숙주 유기체에서의 외인성 유전자의 전사 및 번역을 의미한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "양전자 방출 단층촬영(PET)"은 질환의 진단을 보조하기 위해 의료 분야에서 사용되는 핵 이미징 기법을 지칭한다. PET는 의사가 다른 이미징 기법으로는 얻을 수 없는 인체의 많은 기능을 사진으로 만듦으로써 환자의 전체를 한번에 검사할 수 있도록 한다. 이와 관련하여, PET는 단순히 외형이 아닌 신체가 어떻게 작용하는지(생리학 또는 기능)를 이미지로 표시한다. PET 이미징 응용 분야에는 종양학, 심장학 및 신경학 분야가 포함된다. PET에서는, 본 명세서에서 방사성 의약품으로 지칭되는 단기 양전자-방출 동위원소가 환자에게 주사된다. 이러한 방사성 약물이 환자에게 투여되면, 이들은 안정적인 대응물과 관련된 생리학적 경로에 따라 신체 내에 분포한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "SPECT"는 감마선을 이용한 핵의학 단층 이미징 기법인 "단일-광자 방출 컴퓨터 단층촬영(Single-Photon Emission Computed Tomography)"을 지칭한다. 이는 감마 카메라를 이용한 종래의 핵의학 평면 이미징과 매우 유사하며, 진정한 3D 정보를 제공할 수 있다. 이러한 정보는 전형적으로 환자에 대한 단면의 조각으로 제공되지만, 필요에 따라 자유롭게 형식을 바꾸거나 또는 조작될 수 있다. 기본 기법은 일반적으로 혈류로의 주사를 통해 감마-방출 방사성 동위원소(방사성 핵종이라고 함)를 환자에게 전달해야 한다.

용어 "검출 가능한 표지"는 명세서 또는 청구범위의 목적을 위해 본 개시내용에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 간접적으로 또는 직접적으로 부착된 표지 분자를 의미하되, 표지 분자는 그것이 혼입된 항체의 검출을 용이하게 한다. 따라서, "검출 가능한 표지"는 "표지 분자"와 동의어로 사용된다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "조영제"는 동물 또는 인간 대상체의 세포 또는 조직 또는 시험관내 조건하의 세포 또는 조직에서 표지 및 이에 대한 부착물의 위치 표시를 제공하는 데 유용한 표지 모이어티를 지칭한다. 작용제는 형광, 발광, 방사능과 같은 검출 가능한 신호를 제공하거나 또는 MRI 이미징 등과 같은 방법에 의해 검출될 수 있는 것을 포함할 수 있지만, 본 개시내용의 프로브 및 사용 방법의 맥락에서, 용어 "조영제"는 특히 ⁶⁴Cu, ⁶⁷Cu, ⁸⁹Zr, ¹²⁴l, ⁸⁶Y, ⁹⁰Y, ¹¹¹ln, ^123/131l, ¹⁷⁷Lu, ¹⁸F, ^99mTc 등과 같지만 이들로 제한되지 않는, 예컨대, PET 또는 SPECT 이미징 기술에 의해 검출 가능한 표지를 지칭한다. 본 개시내용의 면역접합체 프로브의 가장 바람직한 실시형태에서, 표지제는 89-지르코늄(Zr)이지만, PET-생성 이미지를 제공하기 위해 글리피칸-3 표적화 항체 또는 항체 단편에 부착되거나 또는 접합될 수 있는 임의의 금속 동위원소(또는 임의의 다른 PET-호환성 표지제)가 사용될 수 있는 것으로 상정된다.

용어 "생물학적 시료"는 유기체(예를 들어, 인간 환자) 또는 유기체의 구성요소(예를 들어, 세포)로부터의 조직, 유체 또는 기타 샘플을 지칭한다. 샘플은 임의의 생물학적 조직 또는 유체일 수 있다. 시료는 환자로부터 유래되는 샘플인 "임상 샘플"일 수 있다. 이러한 시료는 가래, 혈액, 혈액 세포(예를 들어, 백혈구), 양수, 혈장, 골수 및 조직 또는 미세 침 생검 샘플, 소변, 복막액 및 흉막액 또는 이들로부터의 세포를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 생물학적 시료는 또한 조직학적 목적으로 채취된 조직 또는 조직의 절편(예컨대, 동결 또는 파라핀-포매 절편)을 포함할 수 있다. 생물학적 시료는 또한 "환자 샘플"로도 지칭될 수 있다.

소정의 실시형태에서, 생물학적 시료는 생물 내의 또는 생물로부터 제거된 종양일 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "종양"은 악성 또는 양성 여부에 관계없이 모든 신생물 세포 성장 및 증식, 및 모든 전암성 및 암성 세포 및 조직을 지칭한다. 용어 "암" 및 "암성"은 전형적으로 조절되지 않은 세포 성장을 특징으로 하는 포유동물의 생리학적 조건을 지칭하거나 또는 설명한다. 특히 본 개시내용의 프로브 및 조성물은 간암 세포(간세포 암종), 특히 글리피칸-3 막-결합 단백질의 에피토프를 보유하는 이러한 세포의 검출에 가장 유리하다.

항-CD103 항체 및 이의 항원-결합 단편

본 발명은 인간 CD103에 결합하는 항체 및 이러한 항체의 용도를 제공한다. 본 발명은 인간 CD103에 결합하는 항원-결합 단편 및 이러한 단편의 용도를 제공한다. 일부 실시형태에서, 항-CD103 항체는 단리된 것이다.

항체가 폴리펩타이드 서열(예를 들어, 인간 CD103)에 특이적으로 결합하는지 여부는 당업계에 공지된 임의의 검정을 사용하여 결정될 수 있다. 결합 친화도를 결정하기 위해 당업계에 공지된 검정의 예는 표면 플라즈몬 공명(예를 들어, BIACORE) 또는 유사한 기법(예를 들어, KinExa 또는 OCTET)을 포함한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "항체"는 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 임의의 형태의 항체를 지칭한다. 용어 항체는 (i) V_L, V_H, C_L및 C_H1 도메인으로 이루어진 1가 단편인 Fab 단편; (ii) 힌지 영역에서 이황화 브리지에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (iii) V_H및 C_H1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 암의 V_L및 V_H 도메인으로 이루어진 Fv 단편, (v) VH 도메인으로 이루어진 dAb 단편(Ward et al., (1989) Nature 341:544-546); 및 (vi) 단리된 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하여, 항원에 결합하는 능력을 보유하는 항원-결합 부분, 즉, "항원 결합 부위"(예를 들어, 단편, 하위서열, 상보성 결정 영역(CDR))를 포함한다. 단일 사슬 항체는 또한 용어 "항체"에 참조로 포함된다. 바람직한 치료적 항체는 온전한 IgG 항체이다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "온전한 IgG"는 인식된 면역글로불린 감마 유전자에 의해 실질적으로 암호화되는 항체 클래스에 속하는 폴리펩타이드를 의미한다. 인간에서, 이 클래스는 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함한다. 마우스에서, 이 클래스는 IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3을 포함한다. 항체의 IgG 클래스에서 알려진 Ig 도메인은 V_H, Cγ1, Cγ2, Cγ3, V_L및 C_L이다.

본 발명은 항-CD103 항원-결합 단편 및 이의 사용 방법을 포함한다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "전장 항체"는 IgG의 경우 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함하는 2가 분자이다. 각 중쇄는 V_H 도메인에 이어 불변 도메인(C_H1), 힌지 영역 및 2개 이상의 불변(C_H2및 C_H3) 도메인을 포함하는 반면; 각 경쇄는 하나의 V_L 도메인 및 하나의 불변(C_L) 도메인을 포함한다. IgM의 경우, 전장 항체는 각각의 면역글로불린 단량체가 중쇄 및 경쇄로 형성된 2개의 항원 결합 부위를 갖는 5개 또는 6개의 연결된 면역글로불린을 포함하는 10가 또는 12가 분자이다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 달리 지시되지 않는 한, "항체 단편" 또는 "항원-결합 단편"은 항체의 항원-결합 단편, 즉, 전장 항체에 의해 결합된 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체 단편, 예를 들어, 하나 이상의 CDR 영역을 보유하는 단편을 지칭한다. 항원-결합 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')₂및 Fv 단편; 다이어바디; 선형 항체; 단일쇄 항체 분자, 예를 들어, sc-Fv; 나노바디 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이성 항체를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.

본 발명은 항-CD103 Fab 단편 및 이의 사용 방법을 포함한다. "Fab 단편"은 하나의 경쇄 및 C_H1과 하나의 중쇄의 가변 영역으로 구성된다. Fab 분자의 중쇄는 또 다른 중쇄 분자와 이황화 결합을 형성할 수 없다. "Fab 단편"은 항체의 파파인 절단의 생성물일 수 있다.

본 발명은 Fc 영역 및 이의 사용 방법을 포함하는, 항-CD103 항체 및 이의 항원-결합 단편을 포함한다. "Fc" 영역은 항체의 C_H3 및 C_H2 도메인을 포함하는 2개의 중쇄 단편을 포함한다. 2개의 중쇄 단편은 2개 이상의 이황화 결합에 의해 그리고 C_H3 도메인의 소수성 상호작용에 의해 함께 유지된다.

본 발명은 항-CD103 Fab' 단편 및 이의 사용 방법을 포함한다. "Fab' 단편"은 하나의 경쇄 및 V_H도메인과 C_H1 도메인, 또한 사슬간 이황화 결합이 2개의 Fab' 단편의 2개의 중쇄 사이에 형성되어 F(ab')₂분자를 형성할 수 있는 C_H1과 C_H2도메인 사이의 영역을 포함하는 하나의 중쇄의 부분 또는 단편을 포함한다.

본 발명은 항-CD103 F(ab')₂ 단편 및 이의 사용 방법을 포함한다. "F(ab')₂단편"은 2개의 경쇄 및 사슬간 이황화 결합이 2개의 중쇄 사이에 형성되도록 C_H1과 C_H2 도메인 사이에 불변 영역의 일부를 포함하는 2개의 중쇄를 포함한다. 따라서, F(ab')₂단편은 2개의 중쇄 사이의 이황화 결합에 의해 함께 유지되는 2개의 Fab' 단편으로 구성된다. "F(ab')₂단편"은 항체의 펩신 절단의 생성물일 수 있다.

본 발명은 항-CD103 Fv 단편 및 이의 사용 방법을 포함한다. "Fv 영역"은 중쇄 및 경쇄 둘 다로부터의 가변 영역을 포함하지만 불변 영역은 결여되어 있다.

본 발명은 항-CD103 scFv 단편 및 이의 사용 방법을 포함한다. 용어 "단일쇄 Fv" 또는 "scFv" 항체는 항체의 V_H및 V_L 도메인을 포함하는 항체 단편을 지칭하되, 이러한 도메인은 단일 폴리펩타이드 사슬에 존재한다. 일반적으로, Fv 폴리펩타이드는 V_H와 V_L 도메인 사이에 폴리펩타이드 링커를 추가로 포함하며, 이는 scFv가 항원-결합을 위한 목적하는 구조를 형성할 수 있게 한다. scFv에 대한 검토는 문헌[Pluckthun (1994) The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp. 269-315]을 참조한다. 또한, 국제 공개 번호 제WO 88/01649호 및 미국 특허 제4,946,778호 및 제5,260,203호를 참조한다.

본 발명은 항-CD103 도메인 항체 및 이의 사용 방법을 포함한다. "도메인 항체"는 중쇄의 가변 또는 경쇄의 가변 영역만을 포함하는 면역학적으로 기능적인 면역글로불린 단편이다. 일부 경우에, 2개 이상의 V_H영역은 펩타이드 링커와 공유적으로 연결되어 2가 도메인 항체를 생성한다. 2가 도메인 항체의 2개의 V_H 영역은 동일하거나 또는 상이한 항원을 표적으로 할 수 있다.

본 발명은 항-CD103 2가 항체 및 이의 사용 방법을 포함한다. "2가 항체"는 2개의 항원-결합 부위를 포함한다. 일부 경우에, 2개의 결합 부위는 동일한 항원 특이성을 갖는다. 그러나, 2가 항체는 이중특이성일 수 있다(아래 참조).

본 발명은 항-CD103 다이어바디 및 이의 사용 방법을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "다이어바디"는 2개의 항원-결합 부위를 갖는 작은 항체 단편을 지칭하며, 이 단편은 동일한 폴리펩타이드 사슬(V_H-V_L또는 V_L-V_H)에서 경쇄 가변 도메인(V_L)에 연결된 중쇄 가변 도메인(V_H)을 포함한다. 동일한 사슬 상에서 2개의 도메인 사이에서 쌍을 이루기에 너무 짧은 링커를 사용함으로써, 도메인은 또 다른 사슬의 상보적 도메인과 쌍을 이루고 2개의 항원-결합 부위를 생성하도록 유도된다. 다이어바디는, 예를 들어, EP 404,097; WO 93/11161; 및 문헌[Holliger et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448]에 보다 충분하게 기술되어 있다. 듀오바디는 문헌[Labrijn et al., 2013, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 110 (13): 5145-5150]에 기술되어 있다. 조작된 항체 변이체에 대한 검토는 일반적으로 문헌[Holliger and Hudson(2005) Nat. Biotechnol. 23:1126-1136]을 참조한다.

전형적으로, 어떤 식으로든 변형된 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편은 활성이 몰 기준으로 발현될 때 (모 항체와 비교할 때) 결합 활성의 적어도 10%를 보유한다. 바람직하게는, 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편은 모 항체로서 CD103 결합 친화도의 적어도 20%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 이상을 유지한다. 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편은 이의 생물학적 활성을 실질적으로 변경하지 않는 보존적 또는 비-보존적 아미노산 치환(항체의 "보존적 변이체" 또는 "기능 보존된 변이체"로 지칭됨)을 포함할 수 있는 것으로 의도된다.

본 발명은 단리된 항-CD103 항체 및 이의 항원-결합 단편 및 이의 사용 방법을 포함한다. 본 명세서에서, 용어 "단리된"은 이러한 생물학적 분자의 완전한 부재 또는 물, 완충액 또는 염의 부재 또는 항체 또는 단편을 포함하는 약제학적 제형의 성분을 지칭하는 것으로 의도되지 않는다. "단리된" 항체, 항원-결합 단편, 핵산 등은 자연 환경의 하나 이상의 구성요소로부터 확인 및 분리되고/되거나 회수된 것이다. 바람직한 실시형태에서, 항체, 항원-결합 단편, 핵산 등은 75중량% 이상, 보다 바람직하게는 90중량% 이상, 훨씬 더 바람직하게는 95중량% 이상, 훨씬 더 바람직하게는 98중량% 이상으로 정제된다. 따라서, "단리된" 생물학적 분자는 이들이 생산되는 세포 또는 세포 배양물로부터의 다른 생물학적 분자가 적어도 부분적으로 없다. 이러한 생물학적 분자는 핵산, 단백질, 지질, 탄수화물 또는 세포 찌꺼기 및 성장 배지와 같은 기타 물질을 포함한다. 단리된 항체 또는 항원-결합 단편은 숙주 세포 또는 이의 성장 배지로부터의 생물학적 분자와 같은 발현 시스템 구성요소가 추가로 적어도 부분적으로 없을 수 있다.

본 발명은 항-CD103 키메라 항체(예를 들어, 인간 불변 도메인/마우스 가변 도메인) 및 이의 사용 방법을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "키메라 항체"는 제1 항체로부터의 가변 도메인 및 제2 항체로부터의 불변 도메인을 갖는 항체이며, 여기서 제1 및 제2 항체는 상이한 종으로부터 유래한다(미국 특허 제4,816,567호; 및 문헌[Morrison et al., (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855]). 전형적으로, 가변 도메인은 설치류와 같은 실험 동물("모 항체")로부터의 항체로부터 얻어지고, 불변 도메인 서열은 인간 항체로부터 얻어지므로, 생성된 키메라 항체는 모(예를 들어, 마우스) 항체보다 인간 대상체에서 부정적인 면역 반응을 유발할 가능성이 적을 것이다.

본 발명은 항-CD103 인간화된 항체 및 이의 항원-결합 단편(예를 들어, 인간화된 래트 또는 마우스 항체) 및 이의 사용 방법을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "인간화된 항체"는 인간 및 비인간(예를 들어, 마우스 또는 래트) 항체 둘 다로부터의 서열을 포함하는 항체의 형태를 지칭한다. 일반적으로, 인간화된 항체는 적어도 1개, 전형적으로 2개의 가변 도메인을 실질적으로 포함할 것이며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프는 비인간 면역글로불린의 것에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 프레임워크(FR) 영역은 인간 면역글로불린 서열의 것이다. 인간화된 항체는 선택적으로 인간 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 인간화된 항체에 대한 보다 상세한 내용은, 예를 들어, 문헌[Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Reichmann et al., Nature, 332:323-329 (1988); Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992); 및 Clark, Immunol. Today 21: 397-402 (2000)]을 참조한다.

일반적으로, 기본 항체 구조 단위는 사량체를 포함한다. 각각의 사량체는 폴리펩타이드 사슬의 2개의 동일한 쌍을 포함하며, 각 쌍은 하나의 "경쇄"(약 25kDa) 및 하나의 "중쇄"(약 50kDa 내지 70kDa)를 갖는다. 각 사슬의 아미노-말단 부분은 항원 인식을 주로 담당하는 약 100개 내지 110개 이상의 아미노산의 가변 영역을 포함한다. 중쇄의 카복시-말단 부분은 효과기 기능을 주로 담당하는 불변 영역을 정의할 수 있다. 전형적으로, 인간 경쇄는 카파 및 람다 경쇄로 분류된다. 또한, 인간 중쇄는 전형적으로 뮤, 델타, 감마, 알파 또는 엡실론으로 분류되고, 항체의 아이소타입을 각각 IgM, IgD, IgG, IgA 및 IgE로 정의한다. 경쇄 및 중쇄 내에서, 가변 및 불변 영역은 약 12개 이상의 아미노산의 "J" 영역에 의해 연결되고, 중쇄는 또한 약 10개 이상의 아미노산의 "D" 영역을 포함한다. 일반적으로, 문헌[Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y.(1989)] 참조.

각 경쇄/중쇄 쌍의 가변 영역은 항체 결합 부위를 형성한다. 따라서, 일반적으로, 온전한 항체는 2개의 결합 부위를 갖는다. 이작용성 또는 이중특이성 항체를 제외하고, 2개의 결합 부위는 일반적으로 동일하다.

전형적으로, 중쇄 및 경쇄 둘 다의 가변 도메인은 상대적으로 보존된 프레임워크 영역(FR) 내에 위치한 상보성 결정 영역(CDR)이라고도 하는 3개의 초가변 영역을 포함한다. CDR은 일반적으로 프레임워크 영역에 의해 정렬되어, 특정 에피토프에 대한 결합할 수 있다. 일반적으로, N-말단에서 C-말단까지, 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 둘 다는 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4를 포함한다. 각 도메인에 대한 아미노산의 할당은 일반적으로 문헌[Sequences of Proteins of Immunological Interest, Kabat, et al.; National Institutes of Health, Bethesda, MD; 5^th ed.; NIH Publ. No. 91-3242 (1991); Kabat (1978) Adv. Prot. Chem. 32:1-75; Kabat, et al., (1977) J. Biol. Chem. 252:6609-6616; Chothia, et al., (1987) J Mol. Biol. 196:901-917 또는 Chothia, et al., (1989) Nature 342:878-883]의 정의에 따른다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "초가변 영역"은 항원-결합을 담당하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 아미노산 잔기를 지칭한다. 초가변 영역은 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"(즉, 경쇄 가변 도메인의 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3 및 중쇄 가변 도메인의 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3)로부터의 아미노산 잔기를 포함한다. 문헌[Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.](서열에 의해 항체의 CDR 영역을 정의함) 참조; 또한, 문헌[Chothia and Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196: 901-917](구조에 의해 항체의 CDR 영역을 정의함) 참조. 본 명세서에서 사용되는 용어 "프레임워크" 또는 "FR" 잔기는 본 명세서에서 CDR 잔기로 정의된 초가변 영역 잔기 이외의 가변 도메인 잔기를 지칭한다.

"단리된 핵산 분자" 또는 "단리된 폴리뉴클레오타이드"는 단리된 폴리뉴클레오타이드가 자연에서 발견되거나 또는 자연에서 결합되어 있지 않은 폴리뉴클레오타이드에 결합되어 있는 폴리뉴클레오타이드의 전부 또는 일부와 관련되지 않은 게놈, mRNA, cDNA 또는 합성 기원의 DNA 또는 RNA 또는 이들의 일부 조합을 의미한다. 이 개시내용의 목적을 위해, 명시된 뉴클레오타이드 서열을 "포함하는 핵산 분자"는 온전한 염색체를 포함하지 않는 것이 이해되어야 한다. 명시된 핵산 서열을 "포함하는" 단리된 핵산 분자는 명시된 서열에 더하여 최대 10개 또는 심지어 최대 20개 이상의 다른 단백질 또는 이의 일부 또는 단편에 대한 코딩 서열을 포함할 수 있거나, 또는 인용된 핵산 서열의 코딩 영역의 발현을 제어하는 작동 가능하게 연결된 조절 서열을 포함할 수 있고/있거나, 벡터 서열을 포함할 수 있다.

어구 "제어 서열"은 특정 숙주 유기체에서 작동 가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필수적인 DNA 서열을 지칭한다. 원핵생물에 적합한 제어 서열은, 예를 들어, 프로모터, 선택적으로, 작동자 서열 및 리보솜 결합 부위를 포함한다. 진핵생물 세포는 프로모터, 폴리아데닐화 신호 및 인핸서를 사용하는 것으로 알려져 있다.

핵산 또는 폴리뉴클레오타이드는 또 다른 핵산 서열과 기능적 관계에 놓여있을 때 "작동 가능하게 연결된다". 예를 들어, 프리서열(presequence) 또는 분비 리더에 대한 DNA는 폴리펩타이드의 분비에 참여하는 프리단백질로 발현되는 경우 폴리펩타이드에 대한 DNA에 작동 가능하게 연결되거나; 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 미치는 경우 코딩 서열에 작동 가능하게 연결되거나; 또는 리보솜 결합 부위는 번역을 용이하게 하도록 위치되는 경우 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된다. 항상 그런 것은 아니지만, 일반적으로, "작동 가능하게 연결된"은 연결되는 DNA 서열이 연속적이고, 분비 리더의 경우 연속적이며 판독 단계에 있음을 의미한다. 그러나, 인핸서는 연속적일 필요가 없다. 연결은 편리한 제한 부위에서 결찰에 의해 달성된다. 이러한 부위가 존재하지 않는 경우, 합성 올리고뉴클레오타이드 수용체(adaptor) 또는 링커가 통상적인 관행에 따라 사용된다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 표현 "세포", "세포주" 및 "세포 배양물"은 상호교환적으로 사용되며, 이러한 모든 명칭은 자손을 포함한다. 따라서, 단어 "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"는 전달 횟수에 관계없이 1차 대상 세포 및 이로부터 유래되는 배양물을 포함한다. 의도적이거나 또는 의도적이지 않은 돌연변이로 인해 모든 자손이 정확히 동일한 DNA 함량을 갖지 않을 것이라는 것도 또한 이해된다. 원래대로 형질전환된 세포에 대해 스크리닝된 것과 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이체 자손이 포함된다. 구별되는 명칭이 의도되는 경우, 이는 문맥에서 명확할 것이다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "생식세포계열 서열"은 재배열되지 않은 면역글로불린 DNA 서열의 서열을 지칭한다. 재배열되지 않은 면역글로불린 서열의 임의의 적합한 공급원이 사용될 수 있다. 인간 생식세포계열 서열은, 예를 들어, 미국 국립보건원(United States National Institutes of Health)의 국립 관절염 및 근골격계 및 피부병에 대한 웹사이트의 JOINSOLVER 생식세포계열 데이터베이스로부터 얻을 수 있다. 마우스 생식세포계열 서열은, 예를 들어, 문헌[Giudicelli et al. (2005) Nucleic Acids Res. 33: D256-D261]에 기술되어 있는 바와 같이 얻을 수 있다.

결합 친화도

예로서 그리고 제한 없이, 본 명세서에 개시된 항체는 표면 플라즈몬 공명(예를 들어, BIACORE) 또는 유사한 기법(예를 들어, KinExa 또는 생물층 간섭계(OCTET))에 의해 결정된 바와 같이 10×10^-9M 이하의 K_D 값으로 인간 CD103에 2가 결합할 수 있다. 일 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 항체는 약 5-10×10^-9M의 K_D 값으로 인간 CD103에 2가 결합할 수 있다. Kd 값은 표면 플라즈몬 공명(예를 들어, BIACORE)에 의해 결정될 수 있다. Kd 값은 유사한 기법(예를 들어, KinExa 또는 OCTET)에 의해 결정될 수 있다. 예로서 그리고 제한 없이, 본 명세서에 개시된 항원-결합 단편은 표면 플라즈몬 공명(예를 들어, BIACORE) 또는 유사한 기법(예를 들어, KinExa 또는 생물층 간섭계(OCTET))에 의해 10×10^-9M 이하의 K_D 값으로 인간 CD103에 2가 결합할 수 있다. 일 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 항원-결합 단편은 약 5-10×10^-9M의 K_D 값으로 인간 CD103에 2가 결합할 수 있다. Kd 값은 표면 플라즈몬 공명(예를 들어, BIACORE)에 의해 결정될 수 있다. Kd 값은 유사한 기법(예를 들어, KinExa 또는 OCTET)에 의해 결정될 수 있다. 친화도는 K_D = k_off/k_on으로 계산된다(k_off는 해리 속도 상수이고, K_on은 결합 속도 상수이며, K_D는 평형 상수임). 친화도는 다양한 농도(c)에서 표지된 리간드의 결합된 분율(r)을 측정함으로써 평형 상태에서 결정될 수 있다. 데이터는 Scatchard 방정식을 사용하여 그래프로 만들어질 수 있다: r/c = K(n-r): 여기에서, r = 결합된 리간드의 몰/평형 상태에서 수용체의 몰; c = 평형 상태에서 자유 리간드 농도; K = 평형 결합 상수; 및 n = 수용체 분자당 리간드 결합 부위의 수. 그래프 분석에 의해, r/c는 Y-축에 그리고 r은 X-축에 플로팅되므로, Scatchard 플롯이 생성된다. Scatchard 분석에 의한 항체 친화도 측정은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 문헌[van Erp et al., J. Immunoassay 12: 425-43, 1991; Nelson and Griswold, Comput. Methods Programs Biomed. 27: 65-8, 1988] 참조.

항체 및 이의 항원-결합 단편을 제조하는 방법

따라서, 본 발명은 항체 또는 단편의 발현에 유리한 조건하에서 항체 또는 단편을 발현하는 하이브리도마 세포를 배양하는 단계 및 선택적으로 하이브리도마 및/또는 성장 배지(예를 들어, 세포 배양 배지)로부터 항체 또는 단편을 단리하는 단계를 포함하는, 본 발명의 항-CD103 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제조하는 방법을 포함한다.

본 명세서에 개시된 항-CD103 항체는 또한 (예를 들어, 대장균/T7 발현 시스템, 포유동물 세포 발현 시스템 또는 하등 진핵생물 발현 시스템에서) 재조합적으로 생산될 수 있다. 이 실시형태에서, 본 발명의 항체 면역글로불린 분자(예를 들어, V_H또는 V_L)를 암호화하는 핵산은 pET-기반 플라스미드에 삽입되고, 대장균/T7 시스템에서 발현될 수 있다. 예를 들어, 본 발명은 T7 프로모터에 작동 가능하게 연결된 면역글로불린 사슬을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 또한 포함하는 세포에서 T7 RNA 폴리머레이스를 발현시키는 단계를 포함하는, 숙주 세포(예를 들어, 세균 숙주 세포, 예컨대, 대장균, 예컨대, BL21 또는 BL21DE3)에서 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 이의 면역글로불린 사슬을 발현시키는 방법을 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 실시형태에서, 대장균과 같은 세균 숙주 세포는 lac 프로모터에 작동 가능하게 연결된 T7 RNA 폴리머레이스 유전자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하며, 폴리머레이스 및 사슬의 발현은 IPTG(아이소프로필-베타-D-티오갈락토피라노사이드)와 함께 숙주 세포의 인큐베이션에 의해 유도된다.

당업계에 공지된 재조합 항체를 생산하는 여러 방법이 있다. 항체의 재조합 생산 방법의 한 예는 미국 특허 제4,816,567호에 개시되어 있다.

형질전환은 폴리뉴클레오타이드를 숙주 세포에 도입하기 위한 임의의 공지된 방법에 의해 이루어질 수 있다. 이종 폴리뉴클레오타이드를 포유동물 세포에 도입하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 덱스트란-매개성 형질감염, 칼슘 포스페이트 침전, 폴리브렌-매개성 형질감염, 원형질체 융합, 전기천공, 리포솜 내 폴리뉴클레오타이드(들)의 캡슐화, 유전자총(biolistic) 주사 및 DNA의 핵으로의 직접 미세주사를 포함한다. 또한, 핵산 분자는 바이러스 벡터에 의해 포유동물 세포에 도입될 수 있다. 세포를 형질전환시키는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 미국 특허 제4,399,216호; 제4,912,040호; 제4,740,461호 및 제4,959,455호 참조.

따라서, 본 발명은 항체 또는 단편의 하나 이상의 면역글로불린 사슬(예를 들어, 중쇄 및/또는 경쇄 면역글로불린 사슬)을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 도입하는 단계; 이러한 발현에 유리한 조건하에서 숙주 세포(예를 들어, CHO 또는 피키아(Pichia) 또는 피키아 파스토리스(Pichia pastoris))를 배양하는 단계 및 선택적으로 숙주 세포 및/또는 숙주 세포가 성장하는 배지로부터 항체 또는 단편 또는 사슬을 단리하는 단계를 포함하는, 본 발명의 항-CD103 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 이의 면역글로불린 사슬을 제조하기 위한 재조합 방법을 포함한다.

항-CD103 항체는 또한 미국 특허 제6,331,415호에 제시된 임의의 방법에 의해 합성될 수 있다.

본 명세서에 개시된 항체 또는 단편 또는 면역글로불린 사슬의 발현을 위한 숙주로서 포유동물 세포를 비롯한 진핵생물 및 원핵생물 숙주 세포는 당업계에 잘 알려져 있으며, 아메리칸 타입 컬처 콜렉션(American Type Culture Collection: ATCC)으로부터 입수 가능한 많은 불멸화된 세포주를 포함한다. 이들은 특히 차이니즈 햄스터 난소(Chinese hamster ovary: CHO) 세포, NSO, SP2 세포, HeLa 세포, 베이비 햄스터 신장(baby hamster kidney: BHK) 세포, 원숭이 신장 세포(monkey kidney cell: COS), 인간 간세포 암종 세포(예를 들어, Hep G2), A549 세포, 3T3 세포, HEK-293 세포 및 다른 여러 세포주를 포함한다. 포유동물 숙주 세포는 인간, 마우스, 래트, 개, 원숭이, 돼지, 염소, 소, 말 및 햄스터 세포를 포함한다. 어떤 세포주가 높은 발현 수준을 갖는지를 결정함으로써 특정 선호도의 세포주가 선택된다. 사용될 수 있는 다른 세포주는 곤충 세포주, 예컨대, Sf9 세포, 양서류 세포, 세균 세포, 식물 세포 및 진균 세포이다. 진균 세포는 효모 및, 예를 들어, 피키아 파스토리스, 피키아 핀란디카(Pichia finlandica), 피키아 트레할로필라(Pichia trehalophila), 피키아 코클라마에(Pichia koclamae), 피키아 멤브라나에파시엔스(Pichia membranaefaciens), 피키아 미누타(Pichia minuta)(오가테아 미누타(Ogataea minuta), 피키아 린드네리(Pichia lindneri)), 피키아 오푼티아에(Pichia opuntiae), 피키아 써모톨레란스(Pichia thermotolerans), 피키아 살릭타리아(Pichia salictaria), 피키아 구에르쿰(Pichia guercuum), 피키아 파이페리(Pichia pijperi), 피키아 스티프티스(Pichia stiptis), 피키아 메탄올리카(Pichia methanolica), 피키아 종, 사카로마이세스 세레비시아에(Saccharomyces cerevisiae), 사카로마이세스 종(Saccharomyces sp.), 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha), 클루이베로마이세스 종(Kluyveromyces sp.), 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 아스퍼질러스 니둘란스(Aspergillus nidulans), 아스퍼질러스 니게르(Aspergillus niger), 아스퍼질러스 오리자에(Aspergillus oryzae), 트리코더마 레에세이(Trichoderma reesei), 클로스포리움 룩크노웬스(Chrysosporium lucknowense), 푸사리움 종(Fusarium sp.), 푸사리움 그라미네움(Fusarium gramineum), 푸사리움 베네나툼(Fusarium venenatum), 피스코미트렐라 파텐스(Physcomitrella patens) 및 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa)를 포함하는 사상균 세포를 포함한다. 피키아 종, 임의의 사카로마이세스 종, 한세눌라 폴리모르파, 임의의 클루이베로마이세스 종, 칸디다 알비칸스, 임의의 아스퍼질러스 종, 트리코더마 레에세이, 클로스포리움 룩크노웬스, 임의의 푸사리움 종, 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica) 및 뉴로스포라 크라사. 중쇄 또는 항원-결합 부분 또는 이의 단편 및/또는 경쇄 또는 이의 항원-결합 단편을 암호화하는 재조합 발현 벡터가 포유동물 숙주 세포에 도입될 때, 항체는 숙주 세포에서 항체 또는 단편 또는 사슬의 발현 또는 숙주 세포가 성장하는 배양 배지로의 분비를 허용하기에 충분한 시간 동안 숙주 세포를 배양함으로써 생산된다.

항체 및 이의 항원-결합 단편 및 면역글로불린 사슬은 표준 단백질 정제 방법을 사용하여 배양 배지로부터 회수될 수 있다. 또한, 생산 세포주로부터 본 발명의 항체 및 이의 항원-결합 단편 및 면역글로불린 사슬(또는 이로부터의 다른 모이어티)의 발현은 다수의 공지된 기법을 사용하여 향상될 수 있다. 예를 들어, 글루타민 합성효소 유전자 발현 시스템(GS 시스템)은 소정의 조건하에서 발현을 향상시키기 위한 일반적인 접근법이다. GS 시스템은 유럽 특허 제0216846호, 제0256055호, 제0323997호 및 제0338841호와 관련하여 전체적으로 또는 부분적으로 논의된다. 따라서, 본 발명의 실시형태에서, 포유동물 숙주 세포(예를 들어, CHO)는 글루타민 합성효소 유전자가 결여되어 있으며, 배지에서 글루타민의 부재하에 성장하지만, 면역글로불린 사슬을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 숙주 세포에서 유전자의 결여를 보완하는 글루타민 합성효소 유전자를 포함한다.

본 발명은 항체 또는 단편을 포함하는 샘플을 정제 배지(예를 들어, 양이온 교환 배지, 음이온 교환 배지, 소수성 교환 배지, 친화도 정제 배지(예를 들어, 단백질-A, 단백질-G, 단백질-A/G, 단백질-L))에 도입하는 단계 및 배지에 결합하지 않는 상기 샘플의 통과 분획(flow-through fraction)으로부터 정제된 항체 또는 단편을 수집하거나; 또는 통과 분획을 버리고, 배지로부터 결합된 항체 또는 단편을 용리시켜 용리액을 수집하는 단계를 포함하는, 본 발명의 항-CD103 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 정제하는 방법을 포함한다. 본 발명의 실시형태에서, 배지는 샘플이 적용되는 칼럼에 있다. 본 발명의 실시형태에서, 정제 방법은 숙주 세포에서 항체 또는 단편의 재조합 발현 후에 수행되며, 예를 들어, 숙주 세포는 먼저 용해되고, 선택적으로 용해물은 배지에서 정제 전에 불용성 물질이 정제된다.

일반적으로, 특히 세포주 또는 형질전환 동물에서 생산된 당단백질은 세포주 또는 형질전환 동물에서 생산된 당단백질에 특징적인 글리코실화 패턴을 가질 것이다. 따라서, 항체의 특정 글리코실화 패턴은 항체를 생산하는 데 사용되는 특정 세포주 또는 형질전환 동물에 따라 달라질 것이다. 그러나, 본 명세서에 제공된 핵산 분자에 의해 암호화되거나 또는 본 명세서에 제공된 아미노산 서열을 포함하는 모든 항체는 항체가 가질 수 있는 글리코실화 패턴과 무관하게 본 발명을 포함한다. 유사하게는, 특정 실시형태에서, 퓨코실화되지 않은 N-글리칸만을 포함하는 글리코실화 패턴을 갖는 항체가 유리할 수 있으며, 이는 이러한 항체가 전형적으로 시험관내 및 생체내 모두에서 이의 퓨코실화된 대응물보다 더 강력한 효능을 나타내었기 때문이다(예를 들어, 문헌[Shinkawa et al., J. Biol. Chem. 278: 3466-3473 (2003)]; 미국 특허 제6,946,292호 및 제7,214,775호 참조). 이러한 퓨코실화되지 않은 N-글리칸을 갖는 항체는 탄수화물 구조가 인간 혈청 IgG에 존재하는 집단의 정상적인 구성요소이기 때문에 면역원성일 가능성이 없다.

본 발명은 본 명세서에 개시된 항-CD103 항체의 항-CD103 항원-결합 단편을 추가로 포함한다. 항체 단편은, 예를 들어, 펩신에 의한 IgG의 효소적 절단에 의해 생산될 수 있는 F(ab)₂ 단편을 포함한다. Fab 단편은, 예를 들어, F(ab)₂를 다이티오트레이톨 또는 머캅토에틸아민으로 환원시킴으로써 생산될 수 있다.

면역글로불린은 중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라 상이한 클래스로 지정될 수 있다. 일부 실시형태에서, 상이한 불변 도메인이 본 명세서에 제공된 CDR로부터 유래되는 인간화된 V_L및 V_H 영역에 부착될 수 있다. 면역글로불린에는 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM의 적어도 5개의 주요 클래스가 있으며, 이들 중 몇몇은 하위클래스(아이소타입), 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4; IgA1 및 IgA2로 더 나뉠 수 있다. 본 발명은 항체 및 항체의 임의의 이러한 클래스 또는 하위클래스의 항원-결합 단편을 포함한다.

일 실시형태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 중쇄 불변 영역, 예를 들어, 인간 불변 영역, 예컨대, γ1, γ2, γ3 또는 γ4 인간 중쇄 불변 영역 또는 이들의 변이체를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 경쇄 불변 영역, 예를 들어, 인간 경쇄 불변 영역, 예컨대, 람다 또는 카파 인간 경쇄 영역 또는 이들의 변이체를 포함한다. 예로서 그리고 제한 없이, 인간 중쇄 불변 영역은 γ4일 수 있고, 인간 경쇄 불변 영역은 카파일 수 있다. 대안적인 실시형태에서, 항체의 Fc 영역은 Ser228Pro 돌연변이가 있는 γ4이다(Schuurman, J et. al., Mol. Immunol. 38: 1-8, 2001).

일 실시형태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 IgG1 하위유형의 중쇄 불변 영역을 포함한다. 일 실시형태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 IgG2 하위유형의 중쇄 불변 영역을 포함한다. 일 실시형태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 IgG4 하위유형의 중쇄 불변 영역을 포함한다.

항체 조작

항-CD103 항체 및 이의 항원-결합 단편이 항체, 예를 들어, 항체 또는 단편의 특성을 개선하기 위해 가변 도메인 내 프레임워크 잔기에 대한 변형을 포함하도록 조작된 항체인 실시형태가 추가로 포함된다. 전형적으로, 이러한 프레임워크 변형은 항체 또는 단편의 면역원성을 감소시키기 위해 이루어진다. 이는 일반적으로 모(예를 들어, 설치류) 항체 또는 단편의 가변 도메인(즉, 프레임워크 잔기)에 있는 비-CDR 잔기를 항체가 사용될 종의 면역 레퍼토리로부터의 유사한 잔기, 예를 들어, 인간 치료제의 경우 인간 잔기로 대체함으로써 달성된다. 이러한 항체 또는 단편은 "인간화된" 항체 또는 단편으로 지칭된다. 일부 경우에, 조작된(예를 들어, 인간화된) 항체의 친화도를 증가시키거나 또는 특이성을 변경하는 것이 바람직하다. 하나의 접근법은 하나 이상의 프레임워크 잔기를 상응하는 생식세포계열 서열로 돌연변이시키는 것이다. 보다 구체적으로, 체세포 돌연변이를 겪은 항체 또는 단편은 항체가 유래된 생식세포계열 서열과 다른 프레임워크 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 잔기는 항체 또는 단편 프레임워크 서열을 항체 또는 단편이 유래된 생식세포계열 서열과 비교함으로써 확인될 수 있다. 또 다른 접근법은, 예를 들어, 프레임워크 잔기를 대체하는 과정에서 손실되었을 수 있는 결합 친화력을 복원하기 위해 조작된(예를 들어, 인간화된) 항체의 하나 이상의 위치에서 원래의 모(예를 들어, 설치류) 잔기로 되돌아가는 것이다(예를 들어, 미국 특허 제5,693,762호, 미국 특허 제5,585,089호 및 미국 특허 제5,530,101호 참조).

소정의 실시형태에서, 항-CD103 항체 및 이의 항원-결합 단편은 이의 특성을 개선하기 위해 프레임워크 및/또는 CDR에 변형을 포함하도록 조작(예를 들어, 인간화)된다. 이러한 조작된 변화는 분자 모델링을 기반으로 할 수 있다. 모(비인간) 항체 서열의 가변 영역에 대한 분자 모델은 항체의 구조적 특징을 이해하기 위해 구성될 수 있으며, 항원과 상호작용할 수 있는 항체의 잠재적인 영역을 확인하는 데 사용될 수 있다. 종래의 CDR은 면역글로불린 서열의 정렬 및 가변 영역의 식별에 기반한다(Kabat et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Kabat, et al.; National Institutes of Health, Bethesda, MD; 5^th ed.; NIH Publ. No. 91-3242; Kabat (1978) Adv. Prot. Chem. 32:1-75; Kabat, et al., (1977) J. Biol. Chem. 252:6609-6616). Chothia와 동료들은 항체의 결정 구조에 있는 루프의 형태 및 제안된 초가변 루프를 주의 깊게 조사하였다(Chothia, et al., (1987) J Mol. Biol. 196:901-917 또는 Chothia, et al., (1989) Nature 342:878-883). "CDR" 및 "초가변 루프"로 분류된 영역 간에는 차이가 있다. 이후의 연구(Raghunathan et al, (2012) J. Mol Recog. 25, 3, 103-113)는 여러 항체-항원 결정 복합체를 분석하고, 항체의 항원 결합 영역이 반드시 "CDR" 잔기 또는 "초가변" 루프에 대해 엄격하게 일치하는 것은 아님을 관찰하였다. 비인간 항체의 가변 영역에 대한 분자 모델은 잠재적으로 항원에 결합할 수 있는 영역의 선택을 안내하는 데 사용될 수 있다. 실제로 모델에 기반한 잠재적인 항원 결합 영역은 종래의 "CDR" 또는 "초가변" 루프와 상이하다. Discovery Studio(BIOVIA, 다쏘 시스템즈(Dassault Systems))와 같은 상용의 과학 소프트웨어가 분자 모델링에 사용될 수 있다. 인간 프레임워크는 프레임워크와 CDR 둘 다에서 비인간 서열과 가장 잘 일치하는 것을 기준으로 선택될 수 있다. VH의 FR4(프레임워크 4)의 경우, 인간 생식세포계열에 대한 VJ 영역이 상응하는 비인간 영역과 비교된다.　VL의 FR4(프레임워크 4)의 경우, 인간 생식세포계열 서열의 J-카파 및 J-람다 영역이 상응하는 비인간 영역과 비교된다. 적합한 인간 프레임워크가 확인되면, CDR은 선택된 인간 프레임워크에 이식된다. 일부 경우에, VL-VH 인터페이스의 소정의 잔기가 비인간(모) 서열에서와 같이 유지될 수 있다. 분자 모델은 또한 잠재적으로 CDR 형태를 변경하여 항원에 결합할 수 있는 잔기를 확인하는 데 사용될 수 있다. 일부 경우에, 이러한 잔기가 비인간(모) 서열에서와 같이 유지된다. 분자 모델은 글리코실화, 탈아마이드화 및 산화와 같은 원치 않는 효과를 초래할 수 있는 용매에 노출된 아미노산을 확인하는 데에도 사용될 수 있다. 이러한 잠재적인 문제를 제거/최소화하기 위해 설계 단계 초기에 개발 가능성 필터가 도입될 수 있다.

또 다른 유형의 프레임워크 변형은 T 세포 에피토프를 제거하여 항체의 잠재적인 면역원성을 감소시키기 위해 프레임워크 영역 또는 심지어 하나 이상의 CDR 영역 내에서 하나 이상의 잔기를 돌연변이시키는 것을 포함한다. 이 접근법은 "탈면역화"로도 지칭되며, 미국 특허 제7,125,689호에 더 상세히 기술되어 있다.

특정 실시형태에서, 탈아마이드화 또는 이성질체화를 피하기 위해 최종 항체의 더 큰 화학적 안정성을 제공하기 위하여 노출된 측쇄를 포함하는 소정의 아미노산을 또 다른 아미노산 잔기로 변경하는 것이 바람직할 것이다. 아스파라긴의 탈아마이드화는 NG, DG, NG, NS, NA, NT, QG 또는 QS 서열에서 발생할 수 있으며, 폴리펩타이드 사슬에 꼬임(kin)을 도입하고 이의 안정성을 감소시키는(아이소아스파르트산 효과) 아이소아스파르트산 잔기를 생성할 수 있다. 이성질체화는 DG, DS, DA 또는 DT 서열에서 발생할 수 있다. 소정의 실시형태에서, 본 개시내용의 항체는 탈아마이드화 또는 아스파라긴 이성질현상(isomerism) 부위를 포함하지 않는다.

예를 들어, 아스파라긴(Asn) 잔기는 Gln 또는 Ala로 변경되어 특히 CDR 내에서 임의의 Asn-Gly 서열에서 아이소아스파테이트의 형성 가능성을 감소시킬 수 있다. 유사한 문제가 Asp-Gly 서열에서 발생할 수 있다(Reissner and Aswad (2003) Cell. Mol. Life Sci. 60:1281). 아이소아스파테이트 형성은 표적 항원에 대한 항체의 결합을 약화시키거나 완전히 없앨 수 있다. 문헌[Presta (2005) J. Allergy Clin. Immunol. 116:731 at 734] 참조. 일 실시형태에서, 아스파라긴은 글루타민(Gln)으로 변경된다. 또한, 아스파라긴(Asn) 또는 글루타민(Gln) 잔기에 인접한 아미노산을 변경하여 아스파라긴 또는 글루타민에 인접한 작은 아미노산이 발생할 때 더 큰 비율로 발생하는 탈아마이드화 가능성을 줄이는 것이 바람직할 수 있다. 문헌[Bischoff & Kolbe(1994) J. Chromatog. 662:261] 참조. 또한, CDR의 임의의 메티오닌 잔기(전형적으로 용매에 노출된 Met)는 메티오닌 황이 산화될 가능성을 줄이기 위해 Lys, Leu, Ala 또는 Phe 또는 기타 아미노산으로 변경될 수 있으며, 이는 항원-결합 친화도를 감소시키고 또한 최종 항체 제제에서의 분자 이질성에 기여할 수 있다. Id. 추가적으로, 잠재적인 절단 가능한 Asn-Pro 펩타이드 결합을 방지 또는 최소화하기 위해, CDR에서 발견되는 임의의 Asn-Pro 조합을 Gln-Pro, Ala-Pro 또는 Asn-Ala로 변경하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 치환을 갖는 항체는 이어서 CD103에 대한 항체의 친화도 또는 특이성 또는 기타 목적하는 생물학적 활성을 허용할 수 없는 수준으로 감소시키지 않는지 확인하기 위해 스크리닝된다.

또 다른 유형의 프레임워크 변형은 응집을 방지하기 위해 프레임워크 영역 내의 하나 이상의 잔기를 돌연변이시키는 것을 포함한다. 응집에 대한 항체의 위험은 공간적 응집 성향을 사용하여 평가될 수 있다 - 문헌[Chennamsetty, N et al (2010) J. Phys. Chem. 114, 6614-6624] 참조. 해당 방법은 각 원자에 대한 용매 접근가능 영역(Solvent Accessible Area: SAA)의 계산을 필요로 한다. 그런 다음, 분자 응집 점수가 모든 원자 점수의 합으로 계산된다. 분자의 주어진 반경 및 크기에 대해, 이는 전체적인 응집 경향의 대략적인 지표이다. 응집 점수가 높은 잔기는 점수가 낮은 잔기(예를 들어, 보다 친수성인 아미노산)로 대체된다.

Fc 영역의 항체 조작

본 명세서에 개시된 항체(예를 들어, 인간화된 항체) 및 이의 항원-결합 단편은 또한 전형적으로 혈청 반감기, 보체 고정, Fc 수용체 결합 및/또는 효과기 기능(예를 들어, 항원-의존적 세포독성)과 같은 항체의 하나 이상의 특성을 변경하기 위해 Fc 영역 내에 변형을 포함하도록 조작될 수 있다. 또한, 본 명세서에 개시된 항체 및 이의 항원-결합 단편은 화학적으로 변형될 수 있거나(예를 들어, 하나 이상의 화학적 모이어티가 항체에 부착될 수 있음) 또는 항체 또는 단편의 하나 이상의 특성을 변경하기 위해 다시 이의 글리코실화를 변경하도록 변형될 수 있다. 이들 실시형태 각각은 아래에서 더 상세히 설명된다. Fc 영역의 잔기의 넘버링은 Kabat의 EU 인덱스 넘버링이다.

본 명세서에 개시된 항체 및 이의 항원-결합 단편은 또한 변경된 효과기 기능을 제공하기 위해 변형된(또는 차단된) Fc 영역을 갖는 항체 및 단편을 포함한다. 예를 들어, 미국 특허 제5,624,821호; WO2003/086310; WO2005/120571; WO2006/0057702 참조. 이러한 변형은 면역 시스템의 다양한 반응을 향상시키거나 또는 억제하는 데 사용될 수 있으며, 진단 및 요법에 유익한 효과를 줄 수 있다. Fc 영역의 변경은 아미노산 변화(치환, 결실 및 삽입), 글리코실화 또는 탈글리코실화 및 다중 Fc 영역의 추가를 포함한다. Fc에 대한 변경은 또한 치료적 항체에서 항체의 반감기를 변경하여 투여 빈도를 줄일 수 있으므로, 편의성이 증가되고 물질의 사용이 감소된다. 문헌[Presta (2005) J. Allergy Clin. Immunol. 116:731 at 734-35] 참조.

일 실시형태에서, 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편은 중쇄 불변 영역의 힌지 영역에서 228번 위치(S228P; EU 인덱스; 서열번호 66)에 상응하는 위치에 세린에서 프롤린으로의 돌연변이를 포함하는 IgG4 아이소타입 항체 또는 단편이다. 이 돌연변이는 힌지 영역에서 중쇄간 이황화 브리지의 이질성을 없애는 것으로 보고되었다(Angal et al(1993). Mol. Immunol. 30:105-108; 241번 위치는 Kabat 넘버링 시스템을 기반으로 함).

본 발명의 일 실시형태에서, CH1의 힌지 영역은 힌지 영역의 시스테인 잔기의 수가 증가 또는 감소되도록 변형된다. 이 접근법은 미국 특허 제5,677,425호에 추가로 기술되어 있다. 예를 들어, 경쇄 및 중쇄의 조립을 촉진하거나 또는 항체의 안정성을 증가 또는 감소시키기 위해 CH1의 힌지 영역의 시스테인 잔기의 수가 변경된다.

또 다른 실시형태에서, 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편의 Fc 힌지 영역은 항체 또는 단편의 생물학적 반감기를 감소시키도록 돌연변이된다. 보다 구체적으로, 항체 또는 단편이 천연 Fc-힌지 도메인 SpA 결합에 비해 손상된 스타필로코실 단백질 A(Staphylococcyl protein A: SpA) 결합을 갖도록 하나 이상의 아미노산 돌연변이가 Fc-힌지 단편의 CH2-CH3 도메인 인터페이스 영역에 도입된다. 이 접근법은 미국 특허 제6,165,745호에 더 상세히 기술되어 있다.

또 다른 실시형태에서, 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편은 이의 생물학적 반감기를 증가시키도록 변형된다. 다양한 접근법이 가능하다. 예를 들어, 미국 특허 제6,277,375호에 기술되어 있는 바와 같이 다음 돌연변이 중 하나 이상이 도입될 수 있다: T252L, T254S, T256F. 대안적으로, 생물학적 반감기를 증가시키기 위해, 항체는 미국 특허 제5,869,046호 및 제6,121,022호에 기술되어 있는 바와 같이 IgG의 Fc 영역의 CH2 도메인의 2개의 루프로부터 취해진 샐비지 수용체(salvage receptor) 결합 에피토프를 포함하도록 CH1 또는 CL 영역 내에서 변경될 수 있다.

또 다른 실시형태에서, Fc 영역은 항체 또는 항원-결합 단편의 효과기 기능(들)을 변경하기 위해 적어도 하나의 아미노산 잔기를 상이한 아미노산 잔기로 대체함으로써 변경된다. 예를 들어, 234번, 235번, 236번, 237번, 297번, 318번, 320번 및 322번 아미노산 잔기로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산이 항체가 효과기 리간드에 대한 변경된 친화도를 갖고 모 항체의 항원-결합 능력을 보유하도록 상이한 아미노산 잔기로 대체될 수 있다. 친화도가 변경된 효과기 리간드는, 예를 들어, Fc 수용체 또는 보체의 C1 구성요소일 수 있다. 이 접근법은 미국 특허 제5,624,821호 및 제5,648,260호에 더 상세히 기술되어 있다.

또 다른 예에서, 329번, 331번 및 322번 아미노산 잔기로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산이 항체가 변경된 C1q 결합을 갖고/갖거나 보체 의존적 세포독성(complement dependent cytotoxicity: CDC)이 감소 또는 제거되도록 상이한 아미노산 잔기로 대체될 수 있다. 이 접근법은 미국 특허 제6,194,551호에 더 상세히 기술되어 있다.

또 다른 예에서, 231번 및 239번 아미노산 위치 내의 하나 이상의 아미노산 잔기가 변경되어 보체를 고정하는 항체의 능력을 변경한다. 이 접근법은 PCT 공개 WO 94/29351에 추가로 기술되어 있다.

바람직하게는 항체, 가장 바람직하게는 IgG 항체 또는 이의 단편인 본 발명의 단백질은 FcγR 결합 특성(결합 특성의 예는 결합 특이성, 평형 해리 상수(K_D), 해리 및 결합 속도(각각 k_off및 k_on), 결합 친화도 및/또는 결합력을 포함하지만 이들로 제한되지 않음)이 (예를 들어, 변형되지 않은 항체에 비해) 변경될 수 있고, 소정의 변경이 다소 바람직하다. 평형 해리 상수(K_D)는 k_off/k_on으로 정의되며, K_a는 K_D의 역수라는 것이 당업계에 공지되어 있다.

이의 리간드에 대한 Fc 영역의 친화도 및 결합 특성은 평형 방법(예를 들어, 효소 결합 면역 흡착 검정(ELISA) 또는 방사선 면역검정(RIA)) 또는 동역학(예를 들어, BIACORE®, Octet®, 또는 KinExa®, 분석) 및 다른 방법, 예컨대, 간접 결합 검정, 경쟁 저해 검정, 형광 공명 에너지 전달(FRET), 겔 전기영동 및 크로마토그래피(예를 들어, 겔 여과)를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 Fc-FcγR 상호작용, 즉, FcγR에 대한 Fc 영역의 특이적 결합을 결정하기 위해 당업계에 공지된 다양한 시험관내 검정 방법(생화학 또는 면역학 기반 검정)에 의해 결정될 수 있다. 이러한 방법 및 기타 방법은 검사되는 하나 이상의 구성요소에 대한 표지를 사용할 수 있고/있거나 발색, 형광, 발광 또는 동위원소 표지를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 다양한 검출 방법을 사용할 수 있다.

소정의 실시형태에서, 본 발명의 단백질은 하나 이상의 인간 FcγR에 결합한다. 소정의 실시형태에서, 본 발명의 단백질은 야생형 인간 IgG1 중쇄 불변 도메인(서열번호 119) Fc 영역을 갖는 동등한 단백질보다 적어도 10-배, 바람직하게는 적어도 30-배, 보다 바람직하게는 적어도 100-배 미만의 친화도로 FcγRI, FcγRIIB, FcγRIIC, FcγRIIIA-F158 및 FcγRIIIA-V158로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 인간 FcγR에 결합한다. 소정의 실시형태에서, 본 발명의 단백질은 야생형 인간 IgG1 중쇄 불변 도메인(서열번호 119) Fc 영역을 갖는 동등한 단백질보다 적어도 10-배, 바람직하게는 적어도 30-배, 보다 바람직하게는 적어도 100-배 미만의 친화도로 인간 FcγRI에 결합한다. 소정의 실시형태에서, 본 발명의 단백질은 야생형 인간 IgG1 중쇄 불변 도메인(서열번호 119) Fc 영역을 갖는 동등한 단백질보다 적어도 10-배, 바람직하게는 적어도 30-배, 보다 바람직하게는 적어도 100-배 미만의 친화도로 인간 FcγRIIB에 결합한다. 소정의 실시형태에서, 본 발명의 단백질은 야생형 인간 IgG1 중쇄 불변 도메인(서열번호 119) Fc 영역을 갖는 동등한 단백질보다 적어도 10-배, 바람직하게는 적어도 30-배, 보다 바람직하게는 적어도 100-배 미만의 친화도로 인간 FcγRIIC에 결합한다. 소정의 실시형태에서, 본 발명의 단백질은 야생형 인간 IgG1 중쇄 불변 도메인(서열번호 119) Fc 영역을 갖는 동등한 단백질보다 적어도 10-배, 바람직하게는 적어도 30-배, 보다 바람직하게는 적어도 100-배 미만의 친화도로 인간 FcγRIIIA-F158에 결합한다. 소정의 실시형태에서, 본 발명의 단백질은 야생형 인간 IgG1 중쇄 불변 도메인(서열번호 119) Fc 영역을 갖는 동등한 단백질보다 적어도 10-배, 바람직하게는 적어도 30-배, 보다 바람직하게는 적어도 100-배 미만의 친화도로 인간 FcγRIIIA-V158에 결합한다. 소정의 실시형태에서, 본 발명의 단백질은 야생형 인간 IgG4 중쇄 불변 도메인(서열번호 66) Fc 영역을 갖는 동등한 단백질보다 적어도 10-배, 바람직하게는 적어도 30-배, 보다 바람직하게는 적어도 100-배 미만의 친화도로 FcγRI, FcγRIIB, FcγRIIC, FcγRIIIA-F158 및 FcγRIIIA-V158로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 인간 FcγR에 결합한다. 소정의 실시형태에서, 본 발명의 단백질은 야생형 인간 IgG4 중쇄 불변 도메인(서열번호 66) Fc 영역을 갖는 동등한 단백질보다 적어도 10-배, 바람직하게는 적어도 30-배, 보다 바람직하게는 적어도 100-배 미만의 친화도로 인간 FcγRI에 결합한다. 소정의 실시형태에서, 본 발명의 단백질은 야생형 인간 IgG4 중쇄 불변 도메인(서열번호 66) Fc 영역을 갖는 동등한 단백질보다 적어도 10-배, 바람직하게는 적어도 30-배, 보다 바람직하게는 적어도 100-배 미만의 친화도로 인간 FcγRIIB에 결합한다. 소정의 실시형태에서, 본 발명의 단백질은 야생형 인간 IgG4 중쇄 불변 도메인(서열번호 66) Fc 영역을 갖는 동등한 단백질보다 적어도 10-배, 바람직하게는 적어도 30-배, 보다 바람직하게는 적어도 100-배 미만의 친화도로 인간 FcγRIIC에 결합한다. 소정의 실시형태에서, 본 발명의 단백질은 야생형 인간 IgG4 중쇄 불변 도메인(서열번호 66) Fc 영역을 갖는 동등한 단백질보다 적어도 10-배, 바람직하게는 적어도 30-배, 보다 바람직하게는 적어도 100-배 미만의 친화도로 인간 FcγRIIIA-F158에 결합한다. 소정의 실시형태에서, 본 발명의 단백질은 야생형 인간 IgG4 중쇄 불변 도메인(서열번호 66) Fc 영역을 갖는 동등한 단백질보다 적어도 10-배, 바람직하게는 적어도 30-배, 보다 바람직하게는 적어도 100-배 미만의 친화도로 인간 FcγRIIIA-V158에 결합한다.

다양한 실시형태에서, 본 발명의 단백질은 면역글로불린 C2 영역 및 면역글로불린 C3 영역 및 면역글로불린 힌지 영역을 포함하는 면역글로불린 Fc 영역을 포함한다. 예로서, 면역글로불린 Fc 영역은 IgG Fc 영역, IgE Fc 영역 또는 IgA Fc 영역일 수 있다. 소정의 바람직한 실시형태에서, 단백질은 2개의 면역글로불린 Fc 영역을 포함하며, 각 면역글로불린 Fc 영역은 면역글로불린 C2 영역 및 면역글로불린 C3 영역 및 면역글로불린 힌지 영역을 포함하되, 면역글로불린 Fc 영역 중 하나의 힌지 영역은 이량체 Fc 구조를 형성하기 위해 다른 면역글로불린 Fc 영역의 힌지 영역에 결합된다. 가장 바람직하게는, 이러한 단백질은 인간 또는 인간화된 IgG 단백질이다.

소정의 실시형태에서, 본 발명의 단백질은 돌연변이된 IgG4 Fc 영역을 포함하며, 바람직하게는 단백질은 이량체 Fc 구조를 형성하기 위해 2개의 돌연변이된 IgG4 Fc 영역을 포함하는 IgG이다. 예로서, 돌연변이된 IgG4 Fc 영역은 표 3에 인용된 돌연변이 또는 돌연변이 조합 중 하나를 포함할 수 있다. 이 표에 언급된 불변 영역의 넘버링 시스템은 Kabat 등(1991, NIH Publication 91-3242, National Technical Information Service, Springfield, VA)에 제시된 바와 같은 EU 인덱스 넘버링 시스템이다. 표에서, 첫 번째 문자와 숫자는 변형되지 않은 아미노산 및 이의 위치를 나타내고, 두 번째 문자는 상기 위치에서 치환된 아미노산을 나타낸다. 하나 이상의 돌연변이 조합을 포함하는 항목의 경우, 조합의 각 돌연변이는 "/"로 구분된다. 결실은 "Δ"로 표시된다.

소정의 실시형태에서, 본 발명의 단백질은 돌연변이된 IgG1 Fc 영역을 포함하며, 바람직하게는 단백질은 이량체 Fc 구조를 형성하기 위해 2개의 돌연변이된 IgG1 Fc 영역을 포함하는 IgG이다. 예로서, 돌연변이된 IgG1 Fc 영역은 표 4에 언급된 돌연변이 중 하나를 포함할 수 있다. 이 표에 언급된 불변 영역의 넘버링 시스템은 Kabat 등(1991, NIH Publication 91-3242, National Technical Information Service, Springfield, VA)에 제시된 바와 같은 EU 인덱스 넘버링 시스템이다. 표에서, 첫 번째 문자와 숫자는 변형되지 않은 아미노산 및 이의 위치를 나타내고, 두 번째 문자는 상기 위치에서 치환된 아미노산을 나타낸다.

소정의 실시형태에서, 돌연변이된 IgG1 Fc 영역은 표 5에 언급된 돌연변이 조합 중 하나를 포함할 수 있다. 이 표에 언급된 불변 영역의 넘버링 시스템은 Kabat 등(1991, NIH Publication 91-3242, National Technical Information Service, Springfield, VA)에 제시된 바와 같은 EU 인덱스 넘버링 시스템이다. 표에서, 첫 번째 문자와 숫자는 변형되지 않은 아미노산 및 이의 위치를 나타내고, 두 번째 문자는 상기 위치에서 치환된 아미노산을 나타낸다. 하나 이상의 돌연변이의 각 조합에 대해, 조합의 각 돌연변이는 "/"로 구분되고, 결실은 "Δ"로 표시된다.

소정의 실시형태에서, 본 발명의 단백질은 야생형 또는 돌연변이된 IgG2 Fc 영역을 포함하며, 바람직하게는 단백질은 이량체 Fc 구조를 형성하기 위해 2개의 야생형 또는 돌연변이된 IgG2 Fc 영역을 포함하는 IgG이다. 돌연변이된 IgG2 Fc 영역은 표 6에 인용된 돌연변이 또는 돌연변이 조합 중 하나를 포함할 수 있다. 이 표에 언급된 불변 영역의 넘버링 시스템은 Kabat 등(1991, NIH Publication 91-3242, National Technical Information Service, Springfield, VA)에 제시된 바와 같은 EU 인덱스 넘버링 시스템이다. 표에서, 첫 번째 문자와 숫자는 변형되지 않은 아미노산 및 이의 위치를 나타내고, 두 번째 문자는 상기 위치에서 치환된 아미노산을 나타낸다. 하나 이상의 돌연변이 조합을 포함하는 항목의 경우, 조합의 각 돌연변이는 "/"로 구분된다.

변형된 글리코실화를 갖는 항체의 생산

또 다른 실시형태에서, 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편은 특정 글리코실화 패턴을 포함한다. 예를 들어, 탈퓨코실화된(afucosylated) 또는 탈글리코실화된(aglycosylated) 항체 또는 단편을 만들 수 있다(즉, 항체는 각각 퓨코스 또는 글리코실화가 결여되어 있음). 항체 또는 단편의 글리코실화 패턴은, 예를 들어, CD103 항원에 대한 항체 또는 단편의 친화도 또는 결합력을 증가시키도록 변경될 수 있다. 이러한 변형은, 예를 들어, 항체 또는 단편 서열 내의 하나 이상의 글리코실화 부위를 변경시킴으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 가변 영역 프레임워크 글리코실화 부위를 제거하여 해당 부위에서 글리코실화를 제거하는 하나 이상의 아미노산 치환이 이루어질 수 있다. 이러한 탈글리코실화는 항원에 대한 항체 또는 단편의 친화도 또는 결합력을 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제5,714,350호 및 제6,350,861호 참조.

본 명세서에 개시된 항체 및 항원-결합 단편은 하등 진핵생물 숙주 세포, 특히 진균 숙주 세포, 예컨대, 효모 및 사상균에서 생산된 것들을 추가로 포함할 수 있으며, 포유동물-유사 또는 인간-유사 글리코실화 패턴을 갖는 당단백질을 생산하도록 유전적으로 조작되었다(예를 들어, 문헌[Choi et al, (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. 100: 5022-5027; Hamilton et al., (2003) Science 301: 1244-1246; Hamilton et al., (2006) Science 313: 1441-1443; Nett et al., Yeast 28(3):237-52 (2011); Hamilton et al., Curr Opin Biotechnol. 18(5): 387-92(2007)] 참조). 현재 사용되는 포유동물 세포주에 비해 이러한 유전적으로 변형된 숙주 세포의 특별한 이점은 특정 N-글리칸 구조가 우세한 당단백질의 조성이 생성될 수 있도록 세포에서 생산되는 당단백질의 글리코실화 프로파일을 제어하는 능력이다(예를 들어, 미국 특허 제7,029,872호 및 미국 특허 제7,449,308호 참조). 이러한 유전적으로 변형된 숙주 세포는 주로 특정 N-글리칸 구조를 갖는 항체를 생산하는 데 사용되었다(예를 들어, 문헌[Li et al., (2006) Nat. Biotechnol. 24: 210-215] 참조).

특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 항체 및 이의 항원-결합 단편은 GlcNAc_(1-4)Man₃GlcNAc₂; Gal_(1-4)GlcNAc_(1-4)Man₃GlcNAc₂; NANA_(1-4)Gal_(1-4)GlcNAc_(1-4)Man₃GlcNAc₂와 같은 N-글리칸을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 양분형(bisected) 및 다중안테나형(multiantennary) 종을 비롯한 퓨코실화 및 비퓨코실화 하이브리드 및 복합 N-글리칸을 포함하는 하등 진핵생물 숙주 세포에서 생산된 것들을 추가로 포함한다.

특정 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항체 및 이의 항원-결합 단편은 GlcNAcMan₅GlcNAc₂; GalGlcNAcMan₅GlcNAc₂; 및 NANAGalGlcNAcMan₅GlcNAc₂로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 하이브리드 N-글리칸을 갖는 항체 또는 단편을 포함할 수 있다. 특정 양태에서, 하이브리드 N-글리칸은 조성물에서 우세한 N-글리칸 종이다.

특정 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항체 및 이의 항원-결합 단편은 GlcNAcMan₃GlcNAc₂; GalGlcNAcMan₃GlcNAc₂; NANAGalGlcNAcMan₃GlcNAc₂; GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂; GalGlcNAc₂Man₃GlcNAc₂; Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂; NANAGal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂; 및 NANA₂Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 복합 N-글리칸을 갖는 항체 및 단편을 포함한다. 특정 양태에서, 복합 N-글리칸은 조성물에서 우세한 N-글리칸 종이다. 추가의 양태에서, 복합 N-글리칸은 조성물에서 복합 N-글리칸의 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100%를 포함하는 특정 N-글리칸 종이다. 일 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항체 및 이의 항원 결합 단편은 복합 N-글리칸을 포함하되, 복합 N-글리칸의 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100%는 NANA₂Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂ 구조를 포함하고, 이러한 구조는 탈퓨코실화된다. 이러한 구조는, 예를 들어, 조작된 피키아 파스토리스 숙주 세포에서 생산될 수 있다.

특정 실시형태에서, N-글리칸은 퓨코실화된다. 일반적으로, 퓨코스는 N-글리칸의 환원 말단에서 GlcNAc와 α1,3-연결, N-글리칸의 환원 말단에서 GlcNAc와 α1,6-연결, N-글리칸의 비환원 말단에서 Gal과 α1,2-연결, N-글리칸의 비환원 말단에서 GlcNac와 α1,3-연결 또는 N-글리칸의 비환원 말단에서 GlcNAc와 α1,4-연결에 있다.

따라서, 위의 당단백질 조성물의 특정 양태에서, 글리코폼(glycoform)는 Man₅GlcNAc₂(Fuc), GlcNAcMan₅GlcNAc₂(Fuc), Man₃GlcNAc₂(Fuc), GlcNAcMan₃GlcNAc₂(Fuc), GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂(Fuc), GalGlcNAc₂Man₃GlcNAc₂(Fuc), Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂(Fuc), NANAGal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂(Fuc) 및 NANA₂Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂(Fuc)로 이루어진 군으로부터 선택되는 글리코폼을 생산하기 위해 α1,3-연결 또는 α1,6-연결 퓨코스에 있거나; GlcNAc(Fuc)Man₅GlcNAc₂, GlcNAc(Fuc)Man₃GlcNAc₂, GlcNAc₂(Fuc_1-2)Man₃GlcNAc₂, GalGlcNAc₂(Fuc_1-2)Man₃GlcNAc₂, Gal₂GlcNAc₂(Fuc1-2)Man3GlcNAc2, NANAGal2GlcNAc2(Fuc_1-2)Man₃GlcNAc₂및 NANA₂Gal₂GlcNAc₂(Fuc_1-2)Man₃GlcNAc₂로 이루어진 군으로부터 선택되는 글리코폼을 생산하기 위해 α1,3-연결 또는 α1,4-연결 퓨코스에 있거나; 또는 Gal(Fuc)GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂, Gal₂(Fuc_1-2)GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂, NANAGal₂(Fuc_1-2)GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂및 NANA₂Gal₂(Fuc_1-2)GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂로 이루어진 군으로부터 선택되는 글리코폼을 생산하기 위해 α1,2-연결 퓨코스에 있다.

추가의 양태에서, 항체(예를 들어, 인간화된 항체) 또는 이의 항원-결합 단편은 Man₈GlcNAc₂, Man₇GlcNAc₂, Man₆GlcNAc₂, Man₅GlcNAc₂, Man₄GlcNAc₂,또는 Man₃GlcNAc₂ N-글리칸 구조로 이루어진 N-글리칸을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 고급 만노스 N-글리칸을 포함한다.

위의 추가의 양태에서, 복합 N-글리칸은 퓨코실화 및 비퓨코실화 양분형 및 다중안테나형 종을 추가로 포함한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "N-글리칸" 및 "글리코폼"는 상호교환적으로 사용되며, N-연결된 올리고당, 예를 들어, 아스파라긴-N-아세틸글루코사민 연결에 의해 폴리펩타이드의 아스파라긴 잔기에 부착된 것을 지칭한다. N-연결된 당단백질은 단백질 내 아스파라긴 잔기의 아마이드 질소에 연결된 N-아세틸글루코사민 잔기를 포함한다. 당단백질에서 발견되는 우세한 당은 글루코스, 갈락토스, 만노스, 퓨코스, N-아세틸갈락토사민(GalNAc), N-아세틸글루코사민(GlcNAc) 및 시알산(예를 들어, N-아세틸-뉴라민산(NANA))이다. 당 그룹의 처리는 ER의 내강에서 동시 번역적으로 발생하며, N-연결된 당단백질에 대한 골지 기구에서 번역 후 계속된다.

N-글리칸은 Man₃GlcNAc₂("Man"은 만노스를 지칭하고; "Glc"는 글루코스를 지칭하며; 및 "NAc"는 N-아세틸을 지칭하고; GlcNAc는 N-아세틸글루코사민을 지칭함)의 일반적인 오당류 코어를 갖는다. 일반적으로, N-글리칸 구조는 비환원 말단이 왼쪽에 있고, 환원 말단이 오른쪽에 있다. N-글리칸의 환원 말단은 단백질 상의 글리코실화 부위를 포함하는 Asn 잔기에 부착된 말단이다. N-글리칸은 "트라이만노스 코어", "오당류 코어" 또는 "파우시만노스 코어"로도 지칭되는 Man₃GlcNAc₂("Man3") 코어 구조에 추가되는 말초 당(예를 들어, GlcNAc, 갈락토스, 퓨코스 및 시알산)을 포함하는 가지(안테나)의 수에 따라 다르다. N-글리칸은 이들의 분지형 구성성분에 따라 분류된다(예를 들어, 고급 만노스, 복합 또는 하이브리드). "고급 만노스" 유형의 N-글리칸은 5개 이상의 만노스 잔기를 갖는다. "복합" 유형의 N-글리칸은 전형적으로 "트라이만노스" 코어의 1,3 만노스 암에 부착된 적어도 하나의 GlcNAc 및 1,6 만노스 암에 부착된 적어도 하나의 GlcNAc를 갖는다. 복합 N-글리칸은 또한 시알산 또는 유도체로 선택적으로 변형된 갈락토스("Gal") 또는 N-아세틸갈락토사민("GalNAc") 잔기를 가질 수 있다(예를 들어, "NANA" 또는 "NeuAc", 여기서 "Neu"는 뉴라민산을 지칭하고, "Ac"는 아세틸을 지칭함). 복합 N-글리칸은 또한 "양분형" GlcNAc 및 코어 퓨코스("Fuc")를 포함하는 사슬내 치환을 가질 수 있다. 복합 N-글리칸은 또한 종종 "다중 안테나성 글리칸"으로 지칭되는 "트라이만노스 코어"에 다중 안테나를 가질 수 있다. "하이브리드" N-글리칸은 트라이만노스 코어의 1,3 만노스 암의 말단에 적어도 하나의 GlcNAc를 갖고, 트라이만노스 코어의 1,6 만노스 암에 0개 이상의 만노스를 갖는다. 다양한 N-글리칸은 또한 "글리코폼"으로도 지칭된다.

복합 N-글리칸과 관련하여, 용어 "G-2", "G-1", "G0", "G1", "G2", "A1" 및 "A2"는 다음을 의미한다. "G-2"는 Man₃GlcNAc₂를 특징으로 할 수 있는 N-글리칸 구조를 지칭하고; 용어 "G-1"은 GlcNAcMan₃GlcNAc₂를 특징으로 할 수 있는 N-글리칸 구조를 지칭하며; 용어 "G0"는 GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂를 특징으로 할 수 있는 N-글리칸 구조를 지칭하고; 용어 "G1"은 GalGlcNAc₂Man₃GlcNAc₂를 특징으로 할 수 있는 N-글리칸 구조를 지칭하며; 용어 "G2"는 Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂를 특징으로 할 수 있는 N-글리칸 구조를 지칭하고; 용어 "A1"은 NANAGal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂를 특징으로 할 수 있는 N-글리칸 구조를 지칭하며; 용어 "A2"는 NANA₂Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂를 특징으로 할 수 있는 N-글리칸 구조를 지칭한다. 달리 지시되지 않는 한, 용어 G-2", "G-1", "G0", "G1", "G2", "A1" 및 "A2"는 N-글리칸의 환원 말단에서 GlcNAc 잔기에 부착된 퓨코스가 결여되어 있는 N-글리칸 종을 지칭한다. 용어가 "F"를 포함하는 경우, "F"는 N-글리칸 종이 N-글리칸의 환원 말단에서 GlcNAc 잔기에 퓨코스 잔기를 포함함을 나타낸다. 예를 들어, G0F, G1F, G2F, A1F 및 A2F는 모두 N-글리칸이 N-글리칸의 환원 말단에서 GlcNAc 잔기에 부착된 퓨코스 잔기를 추가로 포함함을 나타낸다. 효모 및 사상균과 같은 하등 진핵생물은 일반적으로 퓨코스를 생산하는 N-글리칸을 생산하지 않는다.

다중안테나형 N-글리칸과 관련하여, 용어 "다중안테나형 N-글리칸"은 N-글리칸의 1,6 암 또는 1,3 암의 비환원 말단을 포함하는 만노스 잔기 상의 GlcNAc 잔기 또는 N-글리칸의 1,6 암 및 1,3 암의 비환원 말단을 포함하는 각각의 만노스 잔기 상의 GlcNAc 잔기를 추가로 포함하는 N-글리칸을 지칭한다. 따라서, 다중안테나형 N-글리칸은 GlcNAc_(2-4)Man₃GlcNAc₂, Gal_(1-4)GlcNAc_(2-4)Man₃GlcNAc₂또는 NANA_(1-4)Gal_(1-4)GlcNAc_(2-4)Man₃GlcNAc₂의 화학식을 특징으로 할 수 있다. 용어 "1-4"는 1개, 2개, 3개 또는 4개의 잔기를 지칭한다.

양분형 N-글리칸과 관련하여, 용어 "양분형 N-글리칸"은 N-글리칸의 환원 말단에서 GlcNAc 잔기가 만노스 잔기에 연결된 N-글리칸을 지칭한다. 양분형 N-글리칸은 GlcNAc₃Man₃GlcNAc₂의 화학식을 특징으로 할 수 있되, 각각의 만노스 잔기는 이의 비환원 말단에서 GlcNAc 잔기에 연결되어 있다. 대조적으로, 다중안테나형 N-글리칸이 GlcNAc₃Man₃GlcNAc₂로 특징지어지는 경우, 화학식은 2개의 GlcNAc 잔기가 N-글리칸의 2개의 암 중 하나의 비환원 말단에서 만노스 잔기에 연결되어 있고, 하나의 GlcNAc 잔기가 N-글리칸의 다른 암의 비환원 말단에서 만노스 잔기에 연결되어 있음을 나타낸다.

소정의 실시형태에서, 본 발명의 단백질은 탈글리코실화된 Fc 영역을 포함한다. 예로서, IgG1 Fc 영역은 잔기 N297을 결실 또는 치환함으로써 탈글리코실화될 수 있다.

항체의 물리적 특성

본 명세서에 개시된 항체 및 이의 항원-결합 단편은 경쇄 또는 중쇄 면역글로불린 가변 영역에 하나 이상의 글리코실화 부위를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 글리코실화 부위는 변경된 항원-결합으로 인해 항체 또는 단편의 면역원성을 증가시키거나 또는 항체의 pK를 변경시킬 수 있다(Marshall et al. (1972) Annu Rev Biochem 41:673-702; Gala and Morrison (2004) J Immunol 172:5489-94; Wallick et al (1988) J Exp Med 168:1099-109; Spiro (2002) Glycobiology 12:43R-56R; Parekh et al (1985) Nature 316:452-7; Mimura et al. (2000) Mol Immunol 37:697-706). 글리코실화는 N-X-S/T 서열을 포함하는 모티프에서 발생하는 것으로 알려져 있다.

각각의 항체 또는 항원-결합 단편은 일반적으로 6 내지 9.5의 pH 범위에 속하는 고유한 등전점(isoelectric point: pI)을 가질 것이다. IgG1 항체의 pI는 전형적으로 7 내지 9.5의 pH 범위 내에 속하고, IgG4 항체의 pI는 전형적으로 6 내지 8의 pH 범위 내에 속한다.

각각의 항체 또는 항원-결합 단편은 특징적인 용융 온도를 가질 것이며, 더 높은 용융 온도는 생체내에서 더 큰 전체 안정성을 나타낸다(Krishnamurthy R and Manning MC (2002) Curr Pharm Biotechnol 3:361-71). 일반적으로, T_M1(초기 언폴딩 온도)은 60℃ 이상, 65℃ 이상 또는 70℃ 이상일 수 있다. 항체 또는 단편의 용융점은 시차 주사 열량계(Chen et al (2003) Pharm Res 20:1952-60; Ghirlando et al (1999) Immunol Lett 68:47-52) 또는 원편광 이색성(circular dichroism)(Murray et al. (2002) J. Chromatogr Sci 40:343-9)을 사용하여 측정될 수 있다.

추가 실시형태에서, 빠르게 분해되지 않는 항체 및 이의 항원-결합 단편이 선택된다. 항체 또는 단편의 분해는 모세관 전기영동(capillary electrophoresis: CE) 및 MALDI-MS(Alexander AJ and Hughes DE (1995) Anal Chem 67:3626-32)를 사용하여 측정될 수 있다.

추가 실시형태에서, 원치 않는 면역 반응 및/또는 변경되거나 또는 바람직하지 않은 약동학적 특성의 촉발을 야기할 수 있는 최소한의 응집 효과를 갖는 항체 및 이의 항원-결합 단편이 선택된다. 일반적으로, 항체 및 단편은 25% 이하, 20% 이하, 15% 이하, 10% 이하 또는 5% 이하의 응집이 허용 가능하다. 응집은 크기-배제 칼럼(SEC), 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 및 광산란을 비롯한 여러 기법에 의해 측정될 수 있다.

항체 접합체

본 명세서에 개시된 항-CD103 항체는 또한 화학적 모이어티에 접합될 수 있다. 본 명세서에 개시된 항-CD103 항원-결합 단편도 또한 화학적 모이어티에 접합될 수 있다. 화학적 모이어티는 특히 중합체일 수 있다. 화학적 모이어티는 특히 방사성뉴클레오타이드일 수 있다. 화학적 모이어티는 특히 세포독성 인자일 수 있다. 특정 실시형태에서, 화학적 모이어티는 대상체의 체내에서 항체 또는 단편의 반감기를 증가시키는 중합체이다. 적합한 중합체는 친수성 중합체를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 이러한 친수성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)(예를 들어, 분자량이 2kDa, 5kDa, 10kDa, 12kDa, 20kDa, 30kDa 또는 40kDa인 PEG)을 포함할 수 있지만 이들로 제한되지 않는다. 이러한 친수성 중합체는 덱스트란을 포함할 수 있지만 이들로 제한되지 않는다. 이러한 친수성 중합체는 모노메톡시폴리에틸렌 글리콜(mPEG)을 포함할 수 있지만 이들로 제한되지 않는다. 문헌[Lee, et al., (1999) (Bioconj. Chem. 10:973-981)]은 PEG 접합된 단일쇄 항체를 개시하고 있다. 문헌[Wen, et al., (2001) (Bioconj. Chem. 12:545-553)]은 방사성 금속 킬레이트제(다이에틸렌트라이아민펜타아세트산(DTPA))에 부착된 PEG와의 접합 항체를 개시하고 있다.

본 명세서에 개시된 항체 및 이의 항원-결합 단편은 또한 ⁹⁹Tc,^99mTc, ⁸⁶Y, ⁸⁸Y, ⁹⁰Y, ¹¹¹In, ³²P, ¹⁴C,¹²³I, ¹²⁴I, ¹²⁵I, ³H, ¹³¹I, ¹¹C, ¹⁵O, ¹³N, ¹⁸F, ¹⁹F, ³⁵S, ⁵¹Cr, ⁵⁷To, ²²⁶Ra, ⁶⁰Co, ⁵⁹Fe, ⁵⁷Se, ¹⁵²Eu, ⁶¹Cu, ⁶²Cu, ⁶⁴Cu, ⁶⁷Cu, ⁶⁶Ga, ⁶⁷Ga, ⁶⁸Ga, ⁷²Ga, ⁴⁵Ti, ⁸⁹Zr, ²¹⁷Ci, ²¹¹At, ²¹²Pb, ¹⁷⁷Lu, ⁴⁴Sc, ⁴⁷Sc, ¹⁰⁹Pd, ²³⁴Th 및 ⁴⁰K, ¹⁵⁷Gd, ⁵⁵Mn, ⁵²Tr 및 ⁵⁶Fe와 같은 표지와 접합될 수 있다.

본 명세서에 개시된 항체는 또한, 예를 들어, 이의 생물학적(예를 들어, 혈청) 반감기를 증가시키기 위해 PEG화될 수 있다. 본 명세서에 개시된 항원-결합 단편은 또한 PEG화될 수 있다. 항체 또는 단편을 PEG화시키기 위해, 항체 또는 단편은 전형적으로 하나 이상의 PEG기가 항체 또는 항체 단편에 부착되는 조건하에서 PEG의 반응성 에스터 또는 알데하이드 유도체와 같은 반응성 형태의 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 반응한다. 특정 실시형태에서, PEG화는 반응성 PEG 분자(또는 유사한 반응성 수용성 중합체)와의 아실화 반응 또는 알킬화 반응을 통해 수행된다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "폴리에틸렌 글리콜"은 모노(C1-C10) 알콕시- 또는 아릴옥시-폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜-말레이미드와 같은 다른 단백질을 유도체화하는 데 사용된 임의의 형태의 PEG를 포함하도록 의도된다. 소정의 실시형태에서, PEG화되는 항체 또는 단편은 탈글리코실화된 항체 또는 단편이다. 단백질을 PEG화하는 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 본 발명의 항체에 적용될 수 있다. 예를 들어, EP 0 154 316 및 EP 0 401 384 참조.

본 명세서에 개시된 항체는 또한 형광성 표지와 접합될 수 있다. 본 명세서에 개시된 항체는 또한 화학발광 표지와 접합될 수 있다. 본 명세서에 개시된 항원-결합 단편은 또한 형광성 표지와 접합될 수 있다. 본 명세서에 개시된 항원-결합 단편은 또한 화학발광 표지와 접합될 수 있다. 이는 형광단, 예컨대, 희토류 킬레이트, 플루오레세인 및 이의 유도체, 로다민 및 이의 유도체, 아이소티오사이아네이트, 피코에리트린, 피코사이아닌, 알로피코사이아닌, o-프탈알데하이드, 플루오레스카민, ¹⁵²Eu, 단실, 움벨리페론, 루시페린, 루미날 표지, 아이소루미날 표지, 방향족 아크리디움 에스터 표지, 이미다졸 표지, 아크리디뮴염 표지, 옥살레이트 에스터 표지, 에쿼린 표지, 2,3-다이하이드로프탈라진다이온, 바이오틴/아비딘, 스핀 표지 및 안정적인 자유 라디칼을 포함한다.

본 발명의 항체는 또한 세포독성제에 접합될 수 있다. 본 발명의 항체의 항원-결합 단편도 또한 세포독성제에 접합될 수 있다. 본 발명의 항체 및 이의 항원-결합 단편은 또한 아우리스타틴 F, 파클리탁셀, 도세탁셀, 빈크리스틴, CC-1065, SN-38, 토포테칸, 모폴리노 독소루비신, 리속신, 사이아노모폴리노 독소루비신, 돌라스타틴-10, 에키노마이신, 콤브레타스타틴, 칼리키아미신, 메이탄신, DM-1, 네트롭신, 디프테리아 독소, 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa) 외독소 A 사슬, 리신(ricin) A 사슬, 아브린 A 사슬, 모덱신 A 사슬, 알파-사르신, 알레우리테스 포르디이(Aleurites fordii) 단백질 및 화합물(예를 들어, 지방산), 다이안틴 단백질, 피토라카 아메리카나(Phytoiacca americana) 단백질 PAPI, PAPII 및 PAP-S, 모모르디카 카란티아(momordica charantia) 저해제, 쿠르신, 크로틴, 사포나리아 오피시날리스(saponaria officinalis) 저해제, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신 및 에노마이신과 같은 세포독성제에 접합될 수 있다. 이 목록은 제한하기 위한 것은 아니다. 본 발명의 항체는 아우리스타틴 F에 접합될 수 있다. 본 발명의 항체는 파클리탁셀에 접합될 수 있다. 본 발명의 항체는 도세탁셀에 접합될 수 있다. 본 발명의 항체는 빈크리스틴에 접합될 수 있다. 본 발명의 항체는 CC-1065에 접합될 수 있다. 본 발명의 항체는 SN-38에 접합될 수 있다. 본 발명의 항체는 토포테칸에 접합될 수 있다. 본 발명의 항체는 모폴리노 독소루비신에 접합될 수 있다. 본 발명의 항체는 리속신에 접합될 수 있다. 본 발명의 항체는 사이아노모폴리노 독소루비신에 접합될 수 있다. 본 발명의 항체는 돌라스타틴-10에 접합될 수 있다. 본 발명의 항체는 에키노마이신에 접합될 수 있다. 본 발명의 항체는 콤브레타스타틴에 접합될 수 있다. 본 발명의 항체는 칼리키아미신에 접합될 수 있다. 본 발명의 항체는 메이탄신에 접합될 수 있다. 본 발명의 항체는 DM-1에 접합될 수 있다. 본 발명의 항체는 네트롭신에 접합될 수 있다. 본 발명의 항체는 디프테리아 독소에 접합될 수 있다. 본 발명의 항체는 슈도모나스 아에루기노사 외독소 A 사슬에 접합될 수 있다. 본 발명의 항체는 리신 A 사슬에 접합될 수 있다. 본 발명의 항체는 아브린 A 사슬에 접합될 수 있다. 본 발명의 항체는 모덱신 A 사슬에 접합될 수 있다. 본 발명의 항체는 알파-사르신에 접합될 수 있다. 본 발명의 항체는 알레우리테스 포르디이 단백질 및 화합물(예를 들어, 지방산)에 접합될 수 있다. 본 발명의 항체는 다이안틴 단백질에 접합될 수 있다. 본 발명의 항체는 피토라카 아메리카나 단백질 PAPI에 접합될 수 있다. 본 발명의 항체는 피토라카 아메리카나 단백질 PAPII에 접합될 수 있다. 본 발명의 항체는 피토라카 아메리카나 단백질 PAP-S에 접합될 수 있다. 본 발명의 항체는 모모르디카 카란티아 저해제에 접합될 수 있다. 본 발명의 항체는 쿠르신에 접합될 수 있다. 본 발명의 항체는 크로틴에 접합될 수 있다. 본 발명의 항체는 사포나리아 오피시날리스 저해제에 접합될 수 있다. 본 발명의 항체는 미토겔린에 접합될 수 있다. 본 발명의 항체는 레스트릭토신에 접합될 수 있다. 본 발명의 항체는 페노마이신에 접합될 수 있다. 본 발명의 항체는 에노마이신에 접합될 수 있다. 본 발명의 항체의 항원-결합 단편은 아우리스타틴 F에 접합될 수 있다. 본 발명의 항체의 항원-결합 단편은 파클리탁셀에 접합될 수 있다. 본 발명의 항체의 항원-결합 단편은 도세탁셀에 접합될 수 있다. 본 발명의 항체의 항원-결합 단편은 빈크리스틴에 접합될 수 있다. 본 발명의 항체의 항원-결합 단편은 CC-1065에 접합될 수 있다. 본 발명의 항체의 항원-결합 단편은 SN-38에 접합될 수 있다. 본 발명의 항체의 항원-결합 단편은 토포테칸에 접합될 수 있다. 본 발명의 항체의 항원-결합 단편은 모폴리노 독소루비신에 접합될 수 있다. 본 발명의 항체는 리속신에 접합될 수 있다. 본 발명의 항체의 항원-결합 단편은 사이아노모폴리노 독소루비신에 접합될 수 있다. 본 발명의 항체의 항원-결합 단편은 돌라스타틴-10에 접합될 수 있다. 본 발명의 항체의 항원-결합 단편은 에키노마이신에 접합될 수 있다. 본 발명의 항체의 항원-결합 단편은 콤브레타스타틴에 접합될 수 있다. 본 발명의 항체의 항원-결합 단편은 칼리키아미신에 접합될 수 있다. 본 발명의 항체의 항원-결합 단편은 메이탄신에 접합될 수 있다. 본 발명의 항체의 항원-결합 단편은 DM-1에 접합될 수 있다. 본 발명의 항체의 항원-결합 단편은 네트롭신에 접합될 수 있다. 본 발명의 항체의 항원-결합 단편은 디프테리아 독소에 접합될 수 있다. 본 발명의 항체의 항원-결합 단편은 슈도모나스 아에루기노사 외독소 A 사슬에 접합될 수 있다. 본 발명의 항체는 리신 A 사슬에 접합될 수 있다. 본 발명의 항체의 항원-결합 단편은 아브린 A 사슬에 접합될 수 있다. 본 발명의 항체의 항원-결합 단편은 모덱신 A 사슬에 접합될 수 있다. 본 발명의 항체의 항원-결합 단편은 알파-사르신에 접합될 수 있다. 본 발명의 항체의 항원-결합 단편은 알레우리테스 포르디이 단백질 및 화합물(예를 들어, 지방산)에 접합될 수 있다. 본 발명의 항체의 항원-결합 단편은 다이안틴 단백질에 접합될 수 있다. 본 발명의 항체의 항원-결합 단편은 피토라카 아메리카나 단백질 PAPI에 접합될 수 있다. 본 발명의 항체의 항원-결합 단편은 피토라카 아메리카나 단백질 PAPII에 접합될 수 있다. 본 발명의 항체의 항원-결합 단편은 피토라카 아메리카나 단백질 PAP-S에 접합될 수 있다. 본 발명의 항체의 항원-결합 단편은 모모르디카 카란티아 저해제에 접합될 수 있다. 본 발명의 항체의 항원-결합 단편은 쿠르신에 접합될 수 있다. 본 발명의 항체의 항원-결합 단편은 크로틴에 접합될 수 있다. 본 발명의 항체의 항원-결합 단편은 사포나리아 오피시날리스 저해제에 접합될 수 있다. 본 발명의 항체의 항원-결합 단편은 미토겔린에 접합될 수 있다. 본 발명의 항체의 항원-결합 단편은 레스트릭토신에 접합될 수 있다. 본 발명의 항체의 항원-결합 단편은 페노마이신에 접합될 수 있다. 본 발명의 항체의 항원-결합 단편은 에노마이신에 접합될 수 있다.

본 발명의 항체는 또한 항암제에 접합될 수 있다. 본 발명의 항체는 또한 에를로티닙(TARCEVA®, 제넨테크(Genentech)/오에스아이 팜.(OSI Pharm.)), 도세탁셀(TAXOTERE®, 사노피-아벤티스(Sanofi-Aventis)), 5-FU(플루오로우라실, 5-플루오로우라실, CAS 번호 51-21-8), 젬시타빈(GEMZAR®, 릴리(Lilly)), PD-0325901(CAS 번호 391210-10-9, 화이자(Pfizer)), 시스플라틴(시스-다이아민, 다이클로로플라티늄(II), CAS 번호 15663-27-1), 카보플라틴(CAS 번호 41575-94-4), 파클리탁셀(TAXOL®, 브리스톨-마이어스 스큅 온콜로지(Bristol-Myers Squibb Oncology)(뉴저지주 프린스톤 소재)), 트라스투주맙(HERCEPTIN®, 제넨테크), 테모졸로마이드(4-메틸-5-옥소-2,3,4,6,8-펜트아자바이사이클로 [4.3.0] 노나-2,7,9-트라이엔-9-카복사마이드, CAS 번호 85622-93-1, TEMODAR®, TEMODAL®, 쉐링 푸라우(Schering Plough)), 타목시펜((Z)-2-[4-(1,2-다이페닐뷰트-1-엔일)페녹시]-N,N-다이메틸에탄아민, NOLVADEX®, ISTUBAL®, VALODEX®) 및 독소루비신(ADRIAMYCIN®)과 같은 항암제에 접합될 수 있다. 추가적인 상업적으로 또는 임상적으로 이용 가능한 항암제는 옥살리 플라틴(ELOXATIN®, 사노피), 보르테조밉(VELCADE®, 밀레니엄 팜.(Millennium Pharm.)), 수텐트(SUNITINIB®, SU11248, 화이자), 레트로졸(FEMARA®, 노바티스(Novartis)), 이마티닙 메실레이트(GLEEVEC®, 노바티스), XL-518(Mek 저해제, 엑셀리시스(Exelixis), WO 2007/044515), ARRY-886(Mek 저해제, AZD6244, 어레이 바이오파마(Array BioPharma), 아스트라 제네카(Astra Zeneca)), SF-1126(PI3K 저해제, 세마포어 파마슈티칼스(Semafore Pharmaceuticals)), BEZ-235(PI3K 저해제, 노바티스), XL-147(PI3K 저해제, 엑셀리시스), PTK787/ZK 222584(노바티스), 풀베스트란트(FASLODEX®, 아스트라 제네카), 레우코보린(폴린산), 라파마이신(시롤리무스, RAPAMUNE®, 와이어스(Wyeth)), 라파티닙(TYKERB®, GSK572016, 글락소 스미스 클라인(Glaxo Smith Kline)), 로나파닙(SARASAR™, SCH 66336, 쉐링 푸라우), 소라페닙(NEXAVAR®, BAY43-9006, 바이엘 랩스(Bayer Labs)), 게피티닙(IRESSA®, 아스트라 제네카), 이리노테칸(CAMPTOSAR®, CPT-11, 화이자), 티피파닙(ZARNESTRA™, 존슨 앤 존슨(Johnson & Johnson)), ABRAXANE™(크레모포르-프리), 파클리탁셀의 알부민-조작된 나노입자 제형(아메리칸 파마슈티칼 파트너스(American Pharmaceutical Partners), 일리노이주 샴버그 소재), 반데타닙(rINN, ZD6474, ZACTIMA®, 아스트라 제네카), 클로람부실, AG1478, AG1571(SU 5271; 슈겐(Sugen)), 템시롤리무스(TORISEL®, 와이어스), 파조파닙(글락소 스미스 클라인), 칸포스파마이드(TELCYTA®, 텔릭(Telik)), 티오테파 및 사이클로포스파마이드(CYTOXAN®, NEOSAR®); 비노렐빈(NAVELBINE®); 카페시타빈(XELODA®, 로슈(Roche)), 타목시펜(NOLVADEX®, 타목시펜 시트레이트 포함), FARESTON®(토레미핀 시트레이트) MEGASE®(메게스트롤 아세테이트), AROMASIN®(엑세메스테인; 화이자), 포르메스타니, 파드로졸, RIVISOR®(보로졸), FEMARA®(레트로졸; 노바티스) 및 ARIMIDEX®(아나스트로졸; 아스트라 제네카)를 포함한다. 이 목록은 제한하기 위한 것은 아니다.

본 발명의 항체의 항원-결합 단편도 또한 항암제에 접합될 수 있다. 본 발명의 항체의 항원-결합 단편은 또한 에를로티닙(TARCEVA®, 제넨테크/오에스아이 팜.), 도세탁셀(TAXOTERE®, 사노피-아벤티스), 5-FU(플루오로우라실, 5-플루오로우라실, CAS 번호 51-21-8), 젬시타빈(GEMZAR®, 릴리), PD-0325901(CAS 번호 391210-10-9, 화이자), 시스플라틴(시스-다이아민, 다이클로로플라티늄(II), CAS 번호 15663-27-1), 카보플라틴(CAS 번호 41575-94-4), 파클리탁셀(TAXOL®, 브리스톨-마이어스 스큅 온콜로지, 뉴저지주 프린스톤 소재), 트라스투주맙(HERCEPTIN®, 제넨테크), 테모졸로마이드(4-메틸-5-옥소-2,3,4,6,8-펜트아자바이사이클로 [4.3.0] 노나-2,7,9-트라이엔-9-카복사마이드, CAS 번호 85622-93-1, TEMODAR®, TEMODAL®, 쉐링 푸라우), 타목시펜((Z)-2-[4-(1,2-다이페닐뷰트-1-엔일)페녹시]-N,N-다이메틸에탄아민, NOLVADEX®, ISTUBAL®, VALODEX®), 및 독소루비신(ADRIAMYCIN®)과 같은 항암제에 접합될 수 있다. 추가적인 상업적으로 또는 임상적으로 이용 가능한 항암제는 옥살리 플라틴(ELOXATIN®, 사노피), 보르테조밉(VELCADE®, 밀레니엄 팜.), 수텐트(SUNITINIB®, SU11248, 화이자), 레트로졸(FEMARA®, 노바티스), 이마티닙 메실레이트(GLEEVEC®, 노바티스), XL-518(Mek 저해제, 엑셀리시스, WO 2007/044515), ARRY-886(Mek 저해제, AZD6244, 어레이 바이오파마, 아스트라 제네카), SF-1126(PI3K 저해제, 세마포어 파마슈티칼스), BEZ-235(PI3K 저해제, 노바티스), XL-147(PI3K 저해제, 엑셀리시스), PTK787/ZK 222584(노바티스), 풀베스트란트(FASLODEX®, 아스트라 제네카), 레우코보린(폴린산), 라파마이신(시롤리무스, RAPAMUNE®, 와이어스), 라파티닙(TYKERB®, GSK572016, 글락소 스미스 클라인), 로나파닙(SARASAR™, SCH 66336, 쉐링 푸라우), 소라페닙(NEXAVAR®, BAY43-9006, 바이엘 랩스), 게피티닙(IRESSA®, 아스트라 제네카), 이리노테칸(CAMPTOSAR®, CPT-11, 화이자), 티피파닙(ZARNESTRA™, 존슨 앤 존슨), ABRAXANE™(크레모포르-프리), 파클리탁셀(아메리칸 파마슈티칼 파트너스, 일리노이주 샴버그 소재)의 알부민-조작된 나노입자 제형, 반데타닙(rINN, ZD6474, ZACTIMA®, 아스트라 제네카), 클로람부실, AG1478, AG1571(SU 5271; 슈겐), 템시롤리무스(TORISEL®, 와이어스), 파조파닙(글락소 스미스 클라인), 칸포스파마이드(TELCYTA®, 텔릭), 티오테파 및 사이클로포스파마이드(CYTOXAN®, NEOSAR®); 비노렐빈(NAVELBINE®; 카페시타빈(XELODA®, 로슈), 타목시펜(NOLVADEX®, 타목시펜 시트레이트, FARESTON®(토레미핀 시트레이트) MEGASE®(메게스트롤 아세테이트), AROMASIN®(엑세메스테인; 화이자), 포르메스타니, 파드로졸, RIVISOR®(보로졸), FEMARA®(레트로졸; 노바티스) 및 ARIMIDEX®(아나스트로졸; 아스트라 제네카) 포함)를 포함한다. 이 목록은 제한하기 위한 것은 아니다.

본 명세서의 항체 및 항원-결합 단편은 상자성 킬레이트, 마이크로입자, 초상자성 입자를 사용하여 검출 가능하게 표지될 수 있으며; 초음파 기포, 마이크로입자, 마이크로스피어, 에멀션 등에 혼입된다.

금속 킬레이트제(들)는 상자성 금속에 대한 리간드로서 작용하며 이와 복합체를 형성하는 하나 이상의 극성기를 갖는 분자이다. 적합한 킬레이트제는 당업계에 공지되어 있으며, 메틸렌 포스폰산기, 메틸렌 카보하이드록사민산기, 카복시에틸리덴기 또는 카복시메틸렌기를 갖는 산을 포함한다. 킬레이트제의 예는 다이에틸렌트라이아민펜타아세트산(DTPA), 1,4,7,10-테트라아자사이클로-테트라데케인-1,4,7,10-테트라아세트산(DOTA), 1-치환된 1,4,7-트라이카복시메틸-1,4,7,10-테트라아자사이클로도데케인(DO3A), 에틸렌다이아민테트라아세트산(EDTA) 및 1,4,8,11-테트라-아자사이클로테트라데케인-1,4,8,11-테트라아세트산(TETA)을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 추가적인 킬레이트 리간드는 5-C1-EHPG, 5Br-EHPG, 5-Me-EHPG, 5t-Bu-EHPG 및 5sec-Bu-EHPG를 비롯한 에틸렌 비스-(2-하이드록시-페닐글리신)(EHPG) 및 이의 유도체; 다이벤조-DTPA, 페닐-DTPA, 다이페닐-DTPA, 벤질-DTPA 및 다이벤질 DTPA를 비롯한 벤조다이에틸렌트라이아민 펜타아세트산(벤조-DTPA) 및 이의 유도체; 비스-2(하이드록시벤질)-에틸렌-다이아민다이아세트산(HBED) 및 이의 유도체; 적어도 3개의 탄소 원자, 보다 바람직하게는 적어도 6개, 적어도 2개의 헤테로원자(O 및/또는 N)를 포함하며, 하나의 고리 또는 헤테로 고리 요소에 함께 결합된 2개 또는 3개의 고리로 구성될 수 있는 거대고리형 화합물의 클래스, 예를 들어, 벤조-DOTA, 다이벤조-DOTA 및 벤조-NOTA(여기서, NOTA는 1,4,7-트라이아자사이클로노네인 N,N',N''-트라이아세트산임), 벤조-TETA, 벤조-DOTMA(여기서, DOTMA는 1,4,7,10-테트라아자사이클로테트라데케인-1,4,7,10-테트라(메틸 테트라아세트산)임) 및 벤조-TETMA(여기서, TETMA는 1,4,8,11-테트라아자사이클로테트라데케인-1,4,8,11-(메틸 테트라아세트산)임); 1,3-프로필렌-다이아민테트라아세트산(PDTA) 및 트라이에틸렌테트라아민헥사아세트산(TTHA)의 유도체; 1,5,10-N,N',N''-트리스(2,3-다이하이드록시벤조일)-트라이카테콜레이트(LICAM)의 유도체; 및 1,3,5-N,N',N''-트리스(2,3-다이하이드록시벤조일) 미노메틸벤젠(MECAM)이다. 본 발명에 의해 상정되는 대표적인 킬레이트제 및 킬레이트기의 예는 WO 98/18496, WO 86/06605, WO 91/03200, WO 95/28179, WO 96/23526, WO 97/36619, PCT/US98/01473, PCT/US98/20182 및 미국 특허 제4,899,755호, 미국 특허 제5,474,756호, 미국 특허 제5,846,519호 및 미국 특허 제6,143,274호에 기술되어 있으며, 이들 모두 참조에 의해 본 명세서에 원용된다.

문헌[Hunter, et al., (1962) Nature 144:945; David, et al., (1974) Biochemistry 13:1014; Pain, et al., (1981) J. Immunol. Meth. 40:219; 및 Nygren, J., (1982) Histochem. and Cytochem. 30:407]에 기술되어 있는 방법을 비롯한 본 발명의 항체 및 이의 항원-결합 단편을 다양한 모이어티에 접합시키기 위한 당업계에 공지된 임의의 방법이 사용될 수 있다. 항체 및 단편을 접합시키는 방법은 통상적이며, 당업계에 매우 잘 알려져 있다.

화학적 가교제(cross-linker)는 다음의 기준으로 분류될 수 있다:

1. 작용기 및 화학적 특이성;

2. 가교-브리지(cross-bridge)의 길이 및 조성;

3. 가교 그룹이 유사한지(동종 이작용성) 또는 상이한지(헤테로이작용성) 여부;

4. 그룹이 화학적으로 또는 광화학적으로 반응하는지 여부;

5. 시약이 절단 가능한지 여부; 및

6. 시약이 방사성 표지되거나 또는 또 다른 표지로 태깅될 수 있는지 여부.

가교제를 사용하여 표적화될 수 있는 항체 및 표지 상의 반응성 그룹은 1차 아민, 카보닐, 탄수화물 및 카복실산을 포함한다. 또한, 많은 반응성 그룹이 광반응성 페닐 아자이드와 같은 가교제를 사용하여 비선택적으로 커플링될 수 있다. 적합한 시약에 대해, 참조에 의해 본 명세서에 원용되어 있는 문헌[피어스 2003-2004 Applications Handbook and Catalog # 1600926]을 참조한다.

최적의 가교제-대-표적 몰 비를 결정하기 위해 많은 인자가 고려되어야 한다. 용도에 따라, 접합의 정도는 중요한 요인이다. 예를 들어, 면역원 접합체를 제조할 때, 일반적으로 항원의 면역원성을 증가시키기 위해 고도의 접합이 요구된다. 그러나, 항체 또는 효소에 접합시킬 때, 단백질의 생물학적 활성이 유지되도록 하기 위해서는 낮거나 중간 수준의 접합이 최적일 수 있다. 단백질 표면 상의 반응성 그룹의 수를 고려하는 것도 또한 중요하다. 표적 그룹이 많은 경우, 낮은 가교제-대-단백질 비가 사용될 수 있다. 제한된 수의 잠재적인 표적에 대해, 더 높은 가교제-대-단백질 비가 필요할 수 있다. 이는 분자량이 작은 단백질의 경우 그램당 더 많은 가교제를 의미한다.

특정 상호작용과 관련된 단백질의 구조적 변화는 또한 상호작용 전후에 가교 연구를 수행함으로써 분석될 수 있다. 비교는 상이한 암-길이 가교제를 사용하고, 접합의 성공을 분석함으로써 이루어진다. 상이한 반응성 그룹 및/또는 스페이서 암을 갖는 가교제의 사용은 장애 아미노산이 가교에 이용 가능하도록 단백질의 형태가 변할 때 바람직할 수 있다.

반응성 말단을 연결하는 다양한 길이의 스페이서 암 또는 브리지와 함께 가교제가 이용 가능하다. 브리지의 가장 명백한 속성은 연결될 모이어티의 입체적 고려사항을 처리하는 능력이다. 입체 효과는 가교를 위한 잠재적인 반응 부위 사이의 거리를 지시하기 때문에, 상호작용을 위해 다양한 길이의 브리지가 고려될 수 있다. 더 짧은 스페이서 암은 종종 분자간 가교 연구에서 사용되는 반면, 분자간 가교는 더 긴 스페이서 암을 포함하는 가교제에서 선호된다.

가교제 내에 중합체 부분(예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜("PEG") 동종중합체, 폴리프로필렌 글리콜 동종중합체, 다른 알킬-폴리에틸렌 옥사이드, 비스-폴리에틸렌 옥사이드 및 폴리(알킬렌 옥사이드)의 공중합체 또는 블록 공중합체)을 포함시키는 것은 소정의 상황에서 유리할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제5,643,575호, 제5,672,662호, 제5,705,153호, 제5,730,990호, 제5,902,588호 및 제5,932,462호; 및 문헌[Topchieva et al., Bioconjug. Chem. 6: 380-8, 1995] 참조. 예를 들어, 미국 특허 제5,672,662호는 PEG 중합체 부분 및 단일 에스터 연결을 포함하는 이작용성 가교제를 개시하고 있다. 이러한 분자는 물에서 약 10분 내지 25분의 반감기를 제공한다고 한다.

가교제를 설계하는 것은 사용될 기능적 모이어티의 선택을 포함한다. 기능적 모이어티의 선택은 전적으로 가교될 종에서 이용 가능한 표적 부위에 의존한다. 일부 종(예를 들어, 단백질)은 표적화(예를 들어, 라이신 ε-아미노기, 시스테인 설피드릴기, 글루탐산 카복실기 등)에 이용 가능한 여러 부위를 제공할 수 있으며, 특정 기능적 모이어티의 선택은 관심 생물학적 특성(예를 들어, 항체의 결합 친화도, 효소의 촉매 활성 등)을 가장 잘 보존하기 위해 경험적으로 이루어질 수 있다.

아민기를 통한 커플링

이미도에스터 및 N-하이드록시석신이미딜("NHS") 에스터는 전형적으로 아민-특이적 기능적 모이어티로서 사용된다. NHS 에스터는 1차 또는 2차 아민과 반응하여 안정적인 생성물을 생산한다. 커플링은 생리학적 pH에서 효율적이며, NHS-에스터 가교제는 이미데이트 대응물보다 용액에서 더 안정적이다. 동종 이작용성 NHS-에스터 접합은 일반적으로 1-단계 또는 2-단계 반응에서 아민-함유 단백질을 가교하는데 사용된다. 1차 아민은 NHS-에스터의 주요 표적이다. 단백질의 N-말단에 존재하는 접근 가능한 α-아민기는 NHS-에스터와 반응하여 아마이드를 형성한다. 그러나, 단백질 상의 α-아민이 항상 이용 가능한 것은 아니기 때문에, 아미노산 측쇄와의 반응이 중요해진다. 5개의 아미노산은 측쇄에 질소를 가지고 있지만, 라이신의 ε-아미노기만이 NHS-에스터와 크게 반응한다. 공유 아마이드 결합은 NHS-에스터 가교제가 1차 아민과 반응하여 N-하이드록시석신이미드를 방출할 때 형성된다.

설피드릴기를 통한 커플링

말레이미드, 알킬 및 아릴 할라이드, α-할로아실 및 피리딜 다이설파이드는 전형적으로 설피드릴-특이적 기능적 모이어티로서 사용된다. 말레이미드기는 반응 혼합물이 pH가 pH 6.5 내지 7.5로 유지될 때 설피드릴기에 특이적이다. pH 7에서, 말레이미드와 설피드릴의 반응은 아민과의 반응보다 1000-배 빠르다. 말레이미드는 타이로신, 히스티딘 또는 메티오닌과 반응하지 않는다. 유리 설피드릴이 충분한 양으로 존재하지 않는 경우, 이들은 종종 이용 가능한 이황화 결합의 환원에 의해 생성될 수 있다.

카복실기를 통한 커플링

카보다이이미드는 카복실을 1차 아민 또는 하이드라지드에 커플링시켜, 아마이드 또는 하이드라존 결합을 형성한다. 카보다이이미드는 카보다이이미드와 결합되는 분자 사이에 가교가 형성되지 않는다는 점에서 다른 접합 반응과 다르며; 오히려, 이용 가능한 카복실기와 이용 가능한 아민기 사이에 펩타이드 결합이 형성된다. 단백질의 카복시 말단뿐만 아니라 글루탐산 및 아스파르트산 측쇄가 표적화될 수 있다. 과량의 가교제가 존재하면, 단백질이 카복실과 아민을 모두 포함하기 때문에 중합이 발생할 수 있다. 가교가 형성되지 않고 아마이드 결합은 펩타이드 결합과 동일하기 때문에, 단백질의 파괴 없이 가교의 역전은 불가능하다.

비선택적 표지

광친화성 시약은 화학적으로 불활성이지만 자외선 또는 가시광선에 노출되었을 때 반응성이 되는 화합물이다. 아릴아자이드는 250㎚ 내지 460㎚의 파장에서 광분해되어 반응성 아릴 나이트렌을 형성하는 광친화성 시약이다. 아릴 나이트렌은 비선택적으로 반응하여 공유 결합을 형성한다. 환원제는 아지도기를 환원시킬 수 있으므로 주의해서 사용되어야 한다.

카보닐 특이적 가교제

카보닐(알데하이드 및 케톤)은 pH 5 내지 7에서 아민 및 하이드라지드와 반응한다. 하이드라지드와의 반응은 아민과의 반응보다 빨라 부위-특이적 가교에 유용하다. 카보닐은 단백질에 쉽게 존재하지 않지만; 소듐 메타페리오데이트를 사용하여 당 모이어티를 약간 산화시키면 인접한 하이드록실이 알데하이드 또는 케톤으로 전환될 것이다.

실험 및 진단적 용도

본 명세서에 개시된 항-CD103 항체는 친화성 정제제로 사용될 수 있다. 본 명세서에 개시된 항-CD103 항원-결합 단편은 친화성 정제제로 사용될 수 있다. 이 과정에서, 항-CD103 항체 및 이의 항원-결합 단편은 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 Sephadex, 유리 또는 아가로스 수지 또는 여과지와 같은 고체상에 고정화된다. 고정화된 항체 또는 단편은 정제될 CD103 단백질을 포함하는 샘플(또는 이의 단편)과 접촉되고, 그 후 지지체는 고정화된 항체 또는 단편에 결합되는 CD103 단백질을 제외한 샘플 내의 실질적으로 모든 물질을 제거할 적합한 용매로 세척된다. 마지막으로, 지지체는 결합된 CD103(예를 들어, 단백질 A)을 용리시키는 용매로 세척된다. 이러한 고정화된 항체 및 단편은 본 발명의 일부를 형성한다.

예를 들어, 웨스턴 블롯 및 본 명세서에서 논의된 다른 면역검정을 수행하는 데 유용한 2차 항체를 생성하기 위한 항원이 추가로 제공된다.

항-CD103 항체(예를 들어, 인간화된 항체) 및 이의 항원-결합 단편은 또한 CD103 단백질에 대한 진단적 검정, 예를 들어, 특정 세포, 조직 또는 혈청, 예를 들어, 단핵구, 대식세포, 호중구, 호염기구, 호산구 및 수지상 세포와 같은 골수성 세포에서의 발현을 검출하는 데 유용할 수 있다. 이러한 진단적 방법은 다양한 질환 진단에 유용할 수 있다.

본 발명은 본 명세서에 개시된 항-CD103 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 사용을 포함하는 ELISA 검정(효소-결합 면역흡착 검정)을 포함한다.

예를 들어, 이러한 방법은 다음 단계를 포함한다:

(a) 항-CD103 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로 기질(예를 들어, 미세역가 플레이트 웰, 예를 들어, 플라스틱 플레이트의 표면)을 코팅하는 단계;

(b) CD103의 존재에 대해 테스트할 샘플을 기질에 적용하는 단계;

(c) 샘플 내 결합되지 않은 물질이 제거되도록 플레이트를 세척하는 단계;

(d) CD103 항원에도 특이적인 검출 가능하게 표지된 항체(예를 들어, 효소-연결된 항체)를 적용하는 단계;

(e) 결합되지 않은 표지된 항체가 제거되도록 기질을 세척하는 단계;

(f) 표지된 항체가 효소에 결합된 경우, 효소에 의해 형광성 신호로 변환되는 화학물질을 적용하는 단계; 및

(g) 표지된 항체의 존재를 검출하는 단계.

기질과 관련된 표지의 검출은 CD103 단백질의 존재를 나타낸다.

추가 실시형태에서, 표지된 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 검출 가능한 색상 변화를 생성하기 위해 ABTS(예를 들어, 2,2'-아지노-비스(3-에틸벤즈티아졸린-6-설폰산)) 또는 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘과 반응하는 퍼옥시데이스로 표지된다. 대안적으로, 표지된 항체 또는 단편은 섬광제의 존재하에 섬광 계수기에 의해 검출될 수 있는 검출 가능한 방사성 동위원소(예를 들어, ³H)로 표지된다.

본 발명의 항-CD103 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 웨스턴 블롯 또는 면역-단백질 블롯 절차에서 사용될 수 있다. 이러한 절차는 본 발명의 일부를 형성하며, 예를 들어 다음을 포함한다:

(1) 선택적으로 당업계에 공지된 방법(예를 들어, 반건조 블로팅 또는 탱크 블로팅)을 사용하여 CD103의 존재에 대해 테스트될 샘플로부터(예를 들어, 샘플에서 단백질의 PAGE 또는 SDS-PAGE 전기영동 분리로부터) 단백질을 막 또는 다른 고체 기질로 옮기고; 결합된 CD103 또는 이의 단편의 존재에 대해 테스트될 막 또는 다른 고체 기질을 본 발명의 항-CD103 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 접촉시키는 단계.

(2) 결합되지 않은 항-CD103 항체 또는 단편 및 기타 결합되지 않은 물질을 제거하기 위해 막을 1회 이상 세척하는 단계; 및

(3) 결합된 항-CD103 항체 또는 단편을 검출하는 단계.

이러한 막은 비변성 PAGE(폴리아크릴아마이드 겔 전기영동) 겔 또는 SDS-PAGE(소듐 도데실 설페이트 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동) 겔에서 CD103의 존재하에 테스트될 단백질이 옮겨지는(예를 들어, 겔에서 전기영동 분리 후) 나이트로셀룰로스 또는 바이닐-기반(예를 들어, 폴리바이닐리덴 플루오라이드(PVDF)) 막의 형태를 취할 수 있다. 막을 항-CD103 항체 또는 단편과 접촉시키기 전, 막은 막 상의 비특이적 단백질 결합 부위에 결합하기 위해, 예를 들어, 무지방 분유 등으로 선택적으로 차단된다.

결합된 항체 또는 단편의 검출은 CD103 단백질이 막 또는 기질 및 샘플에 존재함을 나타낸다. 결합된 항체 또는 단편의 검출은 항체 또는 단편을 검출 가능하게 표지된 2차 항체(항-면역글로불린 항체)와 결합시킨 다음 2차 항체의 존재를 검출함으로써 이루어질 수 있다.

본 명세서에 개시된 항-CD103 항체 및 이의 항원-결합 단편은 또한 면역조직화학을 위해 사용될 수 있다. 이러한 방법은 본 발명의 일부를 형성하며, 예를 들어, 다음을 포함한다:

(1) CD103 단백질의 존재하에 테스트될 세포(예를 들어, 단핵구, 대식세포, 호중구, 호염기구, 호산구 및 수지상 세포와 같은 골수성 세포를 포함하는 샘플)를 본 발명의 항-CD103 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 접촉시키는 단계; 및

(2) 세포 상에서 또는 내에서 항체 또는 단편을 검출하는 단계.

항체 또는 단편 자체가 검출 가능하게 표지된 경우, 이는 직접 검출될 수 있다. 대안적으로, 항체 또는 단편은 검출되는 검출 가능하게 표지된 2차 항체에 의해 결합될 수 있다.

본 명세서에 개시된 소정의 항-CD103 항체 및 이의 항원-결합 단편은 또한 생체내 종양 이미징을 위해 사용될 수 있다. 이러한 방법은 방사성 표지된 항-CD103 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 CD103 발현과 관련된 종양(예를 들어, 종양 세포 표면 에, 예를 들어, CD103를 발현함)의 존재에 대해 테스트될 환자의 신체에 주사한 후, 예를 들어, 종양에 결합된 고농도의 항체 또는 단편을 포함하는 장소에서 표지된 항체 또는 단편의 존재를 검출하기 위한 환자 신체의 핵 이미징을 포함할 수 있다. 장소의 검출은 CD103⁺ 종양 및 종양 세포의 존재를 나타낸다.

이미징 기법은 SPECT 이미징(단일 광자 방출 컴퓨터 단층촬영) 또는 PET 이미징(양전자 방출 단층촬영)을 포함한다. 표지는, 예를 들어, SPECT 이미징과 함께, 예를 들어, 아이오다인-123(¹²³I) 및 테크네튬-99m(^99mTc) 또는, 예를 들어, PET 이미징 또는 인듐-111과 함께 ¹¹C, ¹³N, ¹⁵O 또는 ¹⁸F를 포함한다(예를 들어, 문헌[Gordon et al., (2005) International Rev. Neurobiol. 67:385-440] 참조).

약제학적 조성물 및 투여 및 치료적 용도

본 발명의 항체는 CD103 신호전달을 저해할 수 있으므로, 본 발명의 하나의 양태에서, 본 명세서에 개시된 소정의 항체는 소정의 병태 및 질환을 치료 또는 예방하기 위한 후보이다. 본 발명은 병태 또는 질환의 경과가 CD103 신호전달에 의해 영향을 받을 수 있는 병태 및 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 방법은 치료학적 유효량의 본 발명의 항체를 이러한 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.

인테그린 패밀리 이종이량체는 T-세포 활성화, 귀소(homing) 및 효과기 기능의 전달에서 다양하고 중복되는 역할을 한다. CD103 인테그린 이종이량체는 처음에 척추동물의 장 점막의 T 세포에서의 발현에 의해 확인되었으며, 이는 95% 초과의 장 상피내 림프구(intestinal intraepithelial lymphocyte: iIEL) 및 약 40%의 고유판 림프구에 의해 높은 수준으로 발현되었다. CD103는 상피 세포-특이적 리간드인 E-카드헤린을 인식한다. 정상적인 마우스 및 인간에서, 장 상피 내에 상주하는 CD8+ T 세포는 높은 수준의 CD103를 발현하고, CD103는 상피내 림프구, 종양 침윤 림프구 및 소정의 수지상 세포에서 광범위하게 발현된다. 이전의 연구는 CD103가 종양 세포에서 이의 리간드인 E-카드헤린과 상호작용하여 용해성 과립 분극화 및 세포외 배출을 촉발함으로써 종양-특이적 침윤 림프구로 인한 세포 용해에서 중요한 역할을 한다는 것을 보여주었다. 또한, CD103와 E-카드헤린의 결찰은 종양 세포에 대한 T 세포의 부착을 촉진하고, 활성화된 세포독성 T 세포에서 공동 자극을 유도한다. 이러한 발견은 CD103가 종양 면역 향상을 위한 표적이 될 수 있음을 시사한다.

다양한 실시형태에서, 본 발명의 항체는 E-카드헤린에 대한 결합을 차단하고; CD103+ 세포를 고갈시키고; CD103+CD8+ 효과기 세포를 고갈시키는 데 사용되며; 및/또는 조직-상주 기억 T 세포(T_RM)를 고갈시키는 데 사용된다.

본 발명은 또한 유효량의 본 발명의 하나 이상의 항체를 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, CD103 신호전달-매개성 병태를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, CD103 신호전달-매개성 병태는 자가면역, 염증성 또는 신경퇴행성 병태 또는 암이다(문헌[Rayburn, E. R. et al., Mol Cell Pharmacol.2009; 1(1): 29-43 및 Urbanska, A.M. et al., Cell Biochem Biophys.2015 Jul;72(3):757-69] 참조).

동종이식 거부반응에서의 CD103

이식 신장 절제술 시료의 FACS 분석은 거부 에피소드를 겪고 있는 동종이식편에 침투된 CD8 효과기의 주요 서브세트가 높은 수준의 CD103를 발현함을 나타났다. 흥미롭게도, CD103+CD8+ 효과기는 만성 동종이식 신장병증의 맥락에서 거부 에피소드를 겪고 있는 신장 동종이식에서 가장 풍부하다. 중요하게는, CD103+CD8+ 효과기는 말초 림프구 구획(즉, 말초 혈액 림프구)에 존재하지 않으므로, 종래의 면역 모니터링 접근법에 의해 검출할 수 없다. 그러나, CD103 mRNA는 거부 에피소드 동안 CD103+CD8+ 효과기의 소관내 국부화와 일치하는 임상 거부반응을 동반한 신장 동종이식편 수용자의 소변으로부터 단리된 세포에 의해 발현된다. 위에서 언급된 임상적 관찰은 CD8 효과기 집단에 의한 이식편 상피 구획의의 파괴를 촉진하는 CD103의 핵심 역할과 일치하며, CD103 발현이 이식편 상피 요소의 CD8-매개성 파괴에 필요하다는 가설을 뒷받침한다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 본 발명의 항체는 동종이식 거부반응의 치료에 사용될 수 있다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 본 발명의 항체는 동종이식 거부반응의 예방에 사용될 수 있다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 본 발명의 항원 결합 단편은 동종이식 거부반응의 치료에 사용될 수 있다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 본 발명의 항원 결합 단편은 동종이식 거부반응의 예방에 사용될 수 있다.

조직-상주 기억 T 세포

피부 만성 염증, 특히 건선 및 FDE의 재발은 이전에 영향을 받은 부위에서 자주 발생하는 것으로 오랫동안 알려져 왔다. 따라서, 면역학적 기억은 염증성 장애의 발적 반응성 및 만성화에 관여하는 것으로 제안되었다. T_RM 세포의 눈에 띄는 특징(말초 조직에서의 장기 생존 및 낮은 이동)과 관련하여, 피부 T_RM 세포가 염증성 피부 장애의 재발에 능동적으로 참여할 수 있다는 것이 제안되었다.

건선 병변의 1차 발병은 종종 이전에 회복된 부위에서 재발이 이어지며, 국부 상주 기억 T 세포가 이의 발병 및 발적에 역할을 하는 것으로 제안되었다. 건선 병변에서 CD8⁺ T 세포는 고도로 활성화되어 많은 양의 CD69 및 CD103를 발현한다. 대조적으로, 말초 혈액에서 이러한 단백질을 구성적으로 발현하는 T 세포는 거의 없고, 또한, T_EM 세포는 혈관 어드레신 E-셀렉틴과 상호작용하며 감염 또는 공격 중에 피부로 이동한다는 것이 분명하다. 보다 중요하게는, 최근의 연구는 TCRαβ⁺ 상주 T 세포가 건선 회복 부위, 심지어 정상으로 보이는 피부에서도 축적되며, IL-17 및 IFN-γ를 생성하여 건선형 반응을 촉발할 수 있음을 보여준다. 이러한 발견은 건선의 발병에서 병변-상주 T 세포의 중요한 역할을 뒷받침한다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 본 발명의 항체는 건선의 치료에 사용될 수 있다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 본 발명의 항체는 건선의 예방에 사용될 수 있다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 본 발명의 항원 결합 단편은 건선의 치료에 사용될 수 있다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 본 발명의 항원 결합 단편은 건선의 예방에 사용될 수 있다.

염증성 장 질환 및 CD103

장 염증 및 자가면역을 유도하는 것으로 점차 인식되고 있는 중요한 병리학적 과정은 조절 T-세포(Treg) 풀의 질적 또는 양적 결함에 대한 이차적인 면역 항상성의 상실이다. Treg는 발달 기원에 기초하여 흉선 Treg(thymic Treg: tTreg) 또는 말초 유도성 Treg(peripherally induced Treg: pTreg)의 2개의 그룹으로 크게 나뉠 수 있다. T 세포는 형질전환 성장 인자 β(TGF-β)의 존재하에 T-세포 수용체(TCR) 공동자극에 의해 Foxp3-발현 CD4+CD25+Treg로 전환될 수 있다.14 TGF-β, IL-2 및 레티노산(RA)의 존재하에 미경험 CD4+ T 세포가 항원과 만났을 때 장-관련 림프구 조직(gut-associated lymphoid tissue: GALT)에서 pTreg 전환이 향상되었다.15 16 이는 TGF-β를 생산 또는 활성화하고 RA를 제공하도록 장 미세환경에 의해 제어된 CD103+DC에 의해 촉진된다.17 18 CD103 발현의 부재하에, DC는 Treg 발달을 유도하지 못하며 전염증성 사이토카인을 생산하지 못한다. UC 환자에서, 결장 CD4⁺ T 세포에서의 CD103 발현은 전염증성 Th1, Th17 및 Th1/Th17 사이토카인의 증가된 생산과 관련이 있으며, UC 환자에서 CD103⁺ DC는 Th1/Th2/Th17 세포 반응을 유발하는 능력이 있는 것으로 보고되었다. 따라서, 인테그린 표적화의 효능은 대장염 유발성 CD103⁺ 수지상 세포의 제거 및 림프구 동원의 차단으로 설명될 수 있다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 본 발명의 항체는 염증성 장 질환의 치료에 사용될 수 있다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 본 발명의 항체는 염증성 장 질환의 예방에 사용될 수 있다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 본 발명의 항원 결합 단편은 염증성 장 질환의 치료에 사용될 수 있다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 본 발명의 항원 결합 단편은 염증성 장 질환의 예방에 사용될 수 있다.

CD103+ 림프증식성 장애

유세포 분석 면역표현형은 B-세포 만성 림프구성 백혈병(chronic lymphocytic leukemia: CLL), 외투 세포 림프종(mantle cell lymphoma: MCL) 및 털세포 백혈병(hairy cell leukemia: HCL)을 비롯한 B-세포 림프증식성 장애(B-cell lymphoproliferative disorder: BC-LPD)의 진단에 중요하다. 저등급 B-세포 림프증식성 과정의 진단적 평가에서, CD103 양성의 입증은 털세포 백혈병(HCL) 또는 이의 변이형 HCLv의 진단을 나타낸다.

이러한 B-세포 장애 외에도, CD103 양성은 또한 T 세포 신생물의 서브세트의 특징이다. T 세포 신생물의 현재 세계보건기구(World Health Organization) 분류 내에서 대부분의 개체를 나타내는 184건의 사례에 대한 한 연구에서, 위장관 림프종의 46%, 성인 T 세포 백혈병/림프종의 40% 및 기타 신생물의 6.9%가 CD103 양성을 나타내었다. 마찬가지로, 모구 형질세포양 수지상 세포 신생물(Blastic Plasmacytoid Dendritic Cell Neoplasm: BPDCN)은 CD103를 발현한다.

본 명세서에 기재된 바와 같은 본 발명의 항체는 림프증식성 장애의 치료에 사용될 수 있다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 본 발명의 항원 결합 단편은 림프증식성 장애의 치료에 사용될 수 있다. 본 발명의 항체를 사용하여 치료될 수 있는 CD103을 발현하는 림프증식성 장애는 털세포 백혈병, HCLv, 장 및 장외 림프종, 장질환-관련 T-세포 림프종(EATL), T-림프아구성 백혈병/림프종(T-ALL), T-세포 전림프구성 백혈병(T-PLL), 성인 T 세포 백혈병/림프종(ATLL), 균상 식육종(MF), 역형성 대세포 림프종 ALCL, 피부 T-세포 림프종(CTCL) 및 모구 형질세포양 수지상 세포 신생물을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.

종양발생에서 CD103

종양-관련 CD103+ CD8 T 세포는 CTLA-4 및 IL-10의 발현이 증가되고 IFN-γ, TNF-α 및 그랜자임의 발현이 감소된 면역관용 표현형을 갖는 것으로 보고되었다. 더욱이, CD103는 CD4+ 조절 세포의 마커로서 기술되었으며, 면역관용 DC에 존재한다. 보고에 따르면 마우스에서 CD103+ CD8 T 세포를 감소시키는 항-CD103 항체에 의한 CD103의 직접 표적화는 B16 흑색종 및 MC38 CRC 모델에서 치료적 효과를 제공한다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 본 발명의 항체는 종양발생의 치료에 사용될 수 있다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 본 발명의 항체는 종양발생의 예방에 사용될 수 있다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 본 발명의 항원 결합 단편은 종양발생의 치료에 사용될 수 있다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 본 발명의 항원 결합 단편은 종양발생의 예방에 사용될 수 있다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 본 발명의 항체는 종양발생의 진행을 완화시키는 데 사용될 수 있다.

본 발명의 CD103 항체의 치료적 적용

본 발명은 세포에서 CD103 신호전달을 저해하기 위한 본 발명의 하나 이상의 항체의 용도를 제공한다.

본 발명은 E-카드헤린 및 E-카드헤린-발현 세포에 대한 CD103 결합을 저해하기 위한 본 발명의 하나 이상의 항체의 용도를 제공한다.

본 발명은 CD103-매개성 병태의 치료를 위한 본 발명의 하나 이상의 항체의 용도를 추가로 제공한다.

본 발명은 CD103-발현 세포를 고갈시키기 위한 본 발명의 하나 이상의 항체의 용도를 제공한다.

본 발명은 전술한 용도 중 하나를 위한 약제의 제조에서의 본 발명의 하나 이상의 항체의 용도를 추가로 제공한다.

본 명세서에 기재된 바와 같은 본 발명의 항체는 CD103 신호전달의 조절이 치료적 이점을 제공할 수 있는 다양한 질환을 치료하는 데 유용할 수 있다. 일부 양태에서, 본 발명의 화합물은 CD103 신호전달을 저해하며, 아토피성 피부염, 알레르기, 천식, 전신 염증성 반응 증후군(SIRS), 패혈증, 패혈성 쇼크, 죽상동맥 경화증, 셀리악병, 피부근염, 경피증, 간질성 방광염, 이식 거부, 이식편-대-숙주병, 아이카디-구티에레스 증후군, 허친슨 길포드 조로증 증후군, 싱글톤-메르텐 증후군, 프로테오솜-관련 자가염증성 증후군, SAVI(유아기에 발병하는 STING-관련 혈관병증), CANDLE(지방이영양증 및 온도 상승을 동반한 만성 비정형 호중구 피부병) 증후군, 동창 홍반성 루푸스, 전신 홍반성 루푸스, 류마티스성 관절염, 소아 류마티스성 관절염, 베게너병, 염증성 장 질환(예를 들어, 궤양성 대장염, 크론병), 특발성 혈소판 감소성 자반병, 혈전성 혈소판 감소성 자반병, 자가면역 혈소판감소증, 다발성 경화증, 건선, IgA 신장병증, IgM 다발성신경병증, 사구체신염, 자가면역 심근염, 중증 근무력증, 혈관염, 1형 당뇨병, 2형 당뇨병, 쇼그렌 증후군, X-연관 망상 색소이상증, 다발성 근염, 척추연골 이형성증, 연령-관련 황반변성, 알츠하이머병 및 파킨슨병으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질환을 치료하는 데 유용할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 화합물은 아이카디-구티에레스 증후군, X-연관 망상 색소이상증, 피부근염, 전신 홍반성 루푸스, 류마티스성 관절염, 다발성 경화증 또는 I형 또는 II형 당뇨병을 치료하는 데 유용하다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 본 발명의 항체는 바람직하게는 염증성 장 질환의 치료에 사용된다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 본 발명의 항체는 바람직하게는 건선의 치료에 사용된다.

본 발명은 치료학적 유효량의 본 발명의 하나 이상의 항체를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 자가면역 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 자가면역 질환은 I형 인터페론병증(예를 들어, 아이카디-구티에레스 증후군, 쇼그렌 증후군, 싱글톤-메르텐 증후군, 프로테오솜-관련 자가염증성 증후군, SAVI(유아기에 발병하는 STING-관련 혈관병증), CANDLE 증후군, 동창 홍반성 루푸스, 전신 홍반성 루푸스, 척추연골 이형성증), 류마티스성 관절염, 소아 류마티스성 관절염, 특발성 혈소판 감소성 자반병, 자가면역 심근염, 혈전성 혈소판 감소성 자반병, 자가면역 혈소판감소증, 건선, 1형 당뇨병 또는 2형 당뇨병일 수 있다.

본 발명은 치료학적 유효량의 본 발명의 하나 이상의 항체를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 염증성 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 염증성 질환은 아토피성 피부염, 알레르기, 천식, 전신 염증성 반응 증후군(SIRS), 패혈증, 패혈성 쇼크, 죽상동맥 경화증, 셀리악병, 피부근염, 경피증, 간질성 방광염, 이식 거부, 이식편-대-숙주병, 아이카디-구티에레스 증후군, 허친슨 길포드 조로증 증후군, 싱글톤-메르텐 증후군, 프로테오솜-관련 자가염증성 증후군, SAVI(유아기에 발병하는 STING-관련 혈관병증), CANDLE(지방이영양증 및 온도 상승을 동반한 만성 비정형 호중구 피부병) 증후군, 동창 홍반성 루푸스, 전신 홍반성 루푸스, 류마티스성 관절염, 소아 류마티스성 관절염, 베게너병, 염증성 장 질환(예를 들어, 궤양성 대장염, 크론병), 특발성 혈소판 감소성 자반병, 혈전성 혈소판 감소성 자반병, 자가면역 혈소판감소증, 다발성 경화증, 건선, IgA 신장병증, IgM 다발성신경병증, 사구체신염, 자가면역 심근염, 중증 근무력증, 혈관염, 1형 당뇨병, 2형 당뇨병, 쇼그렌 증후군, X-연관 망상 색소이상증, 다발성 근염, 척추연골 이형성증, 연령-관련 황반변성, 알츠하이머병 및 파킨슨병으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 화합물은 아이카디-구티에레스 증후군, X-연관 망상 색소이상증, 피부근염, 전신 홍반성 루푸스, 류마티스성 관절염, 다발성 경화증 또는 I형 또는 II형 당뇨병을 치료하는 데 유용하다.

본 발명은 치료학적 유효량의 본 발명의 하나 이상의 항체를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 신경퇴행성 질환을 치료하는 방법을 추가로 제공한다. 예를 들어, 신경퇴행성 질환은 알츠하이머병, 파킨슨병, 다발성 경화증, IgM 다발성신경병증 또는 중증 근무력증일 수 있다.

본 발명은 CD103를 발현하는 악성종양을 치료하는 방법을 추가로 제공한다. 예를 들어, 악성종양은 T-세포 및 B-세포 림프종, 특히 털세포 백혈병, HCLv, 장 및 장외 림프종, 장질환-관련 T-세포 림프종(EATL), T-림프아구성 백혈병/림프종(T-ALL), T-세포 전림프구성 백혈병(T-PLL), 성인 T 세포 백혈병/림프종(ATLL), 균상 식육종(MF), 역형성 대세포 림프종 ALCL, 피부 T-세포 림프종(CTCL), 세자리 증후군(SS)일 수 있다.

본 발명의 항-CD103 항체 및 항원-결합 단편의 약제학적 또는 멸균 조성물을 제조하기 위해, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제와 혼합된다. 예를 들어, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences and U.S. Pharmacopeia: National Formulary, Mack Publishing Company, Easton, PA (1984)] 참조.

치료제 및 진단제의 제형은, 예를 들어, 동결건조된 분말, 슬러리, 수용액 또는 현탁액의 형태로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 안정화제와 혼합함으로써 제조될 수 있다(예를 들어, 문헌[Hardman, et al. (2001) Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw-Hill, New York, NY; Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams, and Wilkins, New York, NY; Avis, et al. (eds.) (1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Marcel Dekker, NY; Lieberman, et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Marcel Dekker, NY; Lieberman, et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Marcel Dekker, NY; Weiner and Kotkoskie (2000) Excipient Toxicity and Safety, Marcel Dekker, Inc., New York, NY] 참조).

단독으로 또는 또 다른 치료제와 조합하여 투여되는 본 발명의 항체의 독성 및 치료적 효능은, 예를 들어, LD₅₀(집단의 50%에 치명적인 용량) 및 ED₅₀(집단의 50%에 치료적으로 유효한 용량)을 결정하기 위해 세포 배양물 또는 실험 동물에서 표준 약제학적 절차에 의해 결정될 수 있다. 독성 효과와 치료적 효과 사이의 용량 비는 치료 지수(LD₅₀/ED₅₀)이다. 이러한 세포 배양 검정 및 동물 연구로부터 얻은 데이터는 인간에서 사용하기 위한 다양한 투여량을 제형화하는 데 사용될 수 있다. 이러한 화합물의 투여량은 바람직하게는 독성이 거의 없거나 또는 전혀 없는 ED₅₀을 포함하는 다양한 순환 농도 내에 있다. 투여량은 사용되는 투여 형태 및 투여 경로에 따라 이러한 범위 내에서 달라질 수 있다.

추가 실시형태에서, 문헌[Physicians' Desk Reference 2003 (Thomson Healthcare; 57th edition (November 1, 2002))]에 따라 본 발명의 항-CD103 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 함께 대상체에게 투여되는 추가의 치료제가 있다.

투여 방식은 다양할 수 있다. 투여 경로는 경구, 직장, 경점막, 장, 비경구; 근육내, 피하, 피내, 골수내, 경막내, 직접 뇌실내, 정맥내, 복강내, 비강내, 안구내, 흡입, 취입, 국소, 피부, 경피 또는 동맥내를 포함한다.

특정 실시형태에서, 본 발명의 항-CD103 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 주사에 의한 것과 같은 침습적 경로에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 추가 실시형태에서, 항-CD103 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 이의 약제학적 조성물은 정맥내로, 피하로, 근육내로, 동맥내로, 종양내로 또는 흡입, 에어로졸 전달에 의해 투여된다. 비-침습적 경로에 의한 투여(예를 들어, 경구; 예를 들어, 알약, 캡슐 또는 정제로)도 또한 본 발명의 범위 내에 있다.

본 발명은 임의의 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편 또는 이의 약제학적 조성물을 함유하고 있는 용기(예를 들어, 캡 또는 크로마토그래피 칼럼, 중공 보어 바늘 또는 주사기 실린더를 구비한, 예를 들어, 플라스틱 또는 유리 바이알)를 제공한다. 본 발명은 또한 임의의 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편 또는 이의 약제학적 조성물을 함유하고 있는 주사 장치를 제공한다. 주사 장치는 비경구 경로, 예를 들어, 근육내, 피하 또는 정맥내를 통해 환자의 신체에 물질을 도입하는 장치이다. 예를 들어, 주사 장치는, 예를 들어, 주사될 유체(예를 들어, 항체 또는 단편 또는 이의 약제학적 조성물)를 담기 위한 실린더 또는 통, 유체의 주사를 위해 피부 및/또는 혈관을 뚫기 위한 바늘; 및 바늘 보어를 통해 유체를 실린더 밖으로 밀어내기 위한 플런저를 포함하는 주사기(예를 들어, 약제학적 조성물로 미리 채워진, 예컨대, 자기 주사기)일 수 있다. 본 발명의 실시형태에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 이의 약제학적 조성물을 함유하고 있는 주사 장치는 정맥내(IV) 주사 장치이다. 이러한 장치는 캐뉼라 또는 투관침(trocar)/바늘을 통해 환자의 신체에 도입되는 유체(예를 들어, 식염수; 또는 NaCl, 소듐 락테이트, KCl, CaCl₂ 및 선택적으로 글루코스를 함유하는 젖산 링거 용액)를 담기 위한 백 또는 저장소에 부착될 수 있는 튜브에 부착될 수 있는 캐뉼라 또는 투관침/바늘에 항체 또는 단편 또는 이의 약제학적 조성물을 포함한다. 본 발명의 실시형태에서, 항체 또는 단편 또는 이의 약제학적 조성물은 일단 투관침 및 캐뉼라가 대상체의 정맥에 삽입되고 투관침이 삽입된 캐뉼라로부터 제거되면 장치 내로 도입될 수 있다. IV 장치는, 예를 들어, 말초 정맥(예를 들어, 손 또는 팔); 상대 정맥 또는 하대 정맥, 또는 심장의 우심방 내(예를 들어, 중앙 IV); 또는 쇄골하, 내경 정맥 또는 대퇴 정맥으로 삽입되고, 예를 들어, 상대 정맥 또는 우심방(예를 들어, 중심 정맥 선)에 도달할 때까지 심장을 향해 들어갈 수 있다. 본 발명의 실시형태에서, 주사 장치는 자기 주사기; 제트 주사기 또는 외부 주입 펌프이다. 제트 주사기는 항체 또는 단편 또는 이의 약제학적 조성물을 환자의 신체에 도입하기 위해 표피를 관통하는 고압의 좁은 액체 제트를 사용한다. 외부 주입 펌프는 항체 또는 단편 또는 이의 약제학적 조성물을 제어된 양으로 환자의 신체에 전달하는 의료 장치이다. 외부 주입 펌프는 전기적으로 또는 기계적으로 전원을 공급받을 수 있다. 상이한 펌프는 상이한 방식으로 작동하며, 예를 들어, 주사기 펌프는 주사기의 저장소에 유체를 담고 있고 움직일 수 있는 피스톤이 유체 전달을 제어하며, 탄성 펌프는 신축성 있는 풍선 저장소에 유체를 담고 있고 풍선의 탄성 벽으로부터의 압력이 유체 전달을 유도한다. 연동 펌프에서, 롤러 세트는 유연한 튜브의 한 토막을 아래로 눌러 유체를 앞으로 밀어낸다. 다중-채널 펌프에서, 유체는 여러 저장소로부터 여러 속도로 전달될 수 있다.

본 명세서에 개시된 약제학적 조성물은 또한 무바늘 피하 주사 장치; 예컨대, 미국 특허 제6,620,135호; 제6,096,002호; 제5,399,163호; 제5,383,851호; 제5,312,335호; 제5,064,413호; 제4,941,880호; 제4,790,824호 또는 제4,596,556호에 개시된 장치로 투여될 수 있다. 약제학적 조성물을 함유하고 있는 이러한 무바늘 장치는 또한 본 발명의 일부이다. 본 명세서에 개시된 약제학적 조성물은 또한 주입에 의해 투여될 수 있다. 약제학적 조성물을 투여하기 위한 잘 알려진 이식물 및 모듈의 예는 제어된 속도로 약물을 분배하기 위한 이식형 미세 주입 펌프를 개시하고 있는 미국 특허 제4,487,603호; 정확한 주입 속도로 약물을 전달하기 위한 약물 주입 펌프를 개시하고 있는 미국 특허 제4,447,233호; 지속적인 약물 전달을 위한 가변 흐름 이식형 주입 장치를 개시하고 있는 미국 특허 제4,447,224호; 다중-챔버 구획을 갖는 삼투성 약물 전달 시스템을 개시하고 있는 미국 특허 제4,439,196호에 개시된 것들을 포함한다. 많은 다른 이러한 이식물, 전달 시스템 및 모듈은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 본 발명의 약제학적 조성물을 포함하는 것들은 본 발명의 범위 내에 있다.

대안적으로, 본 발명의 항-CD103 항체 또는 항원-결합 단편을 전신 방식보다는 국부적으로, 예를 들어, 항체 또는 단편을 종양에 직접 주사함으로써 투여할 수 있다. 또한, 표적화된 약물 전달 시스템, 예를 들어, 종양을 표적으로 하는, 예를 들어, 조직-특이적 항체로 코팅된 리포솜에 항체 또는 단편을 투여할 수 있다. 리포솜은 병든 조직을 표적으로 하여 선택적으로 흡수될 것이다. 이러한 방법 및 리포솜은 본 발명의 일부이다.

투여 양생법은 치료적 항체 또는 항원-결합 단편의 혈청 또는 조직 교체율, 증상의 수준, 치료적 항체의 면역원성 및 생물학적 매트릭스에서 표적 세포의 접근성을 포함하는 여러 인자에 따라 달라진다. 바람직하게는, 투여 양생법은 표적 질환 상태를 개선시키기에 충분한 치료적 항체 또는 단편을 전달하는 동시에 바람직하지 않은 부작용을 최소화한다. 따라서, 전달되는 생물학적 제제의 양은 부분적으로 특정 치료적 항체 및 치료되는 병태의 중증도에 따라 다르다. 치료적 항체 또는 단편의 적절한 용량을 선택하기 위한 지침이 이용 가능하다(예를 들어, 문헌[Wawrzynczak (1996) Antibody Therapy, Bios Scientific Pub. Ltd, Oxfordshire, UK; Kresina (ed.) (1991) Monoclonal Antibodies, Cytokines and Arthritis, Marcel Dekker, New York, NY; Bach (ed.) (1993) Monoclonal Antibodies and Peptide Therapy in Autoimmune Diseases, Marcel Dekker, New York, NY; Baert, et al. (2003) New Engl. J. Med. 348:601-608; Milgrom et al. (1999) New Engl. J. Med. 341:1966-1973; Slamon et al. (2001) New Engl. J. Med. 344:783-792; Beniaminovitz et al. (2000) New Engl. J. Med. 342:613-619; Ghosh et al. (2003) New Engl. J. Med. 348:24-32; Lipsky et al. (2000) New Engl. J. Med. 343:1594-1602] 참조).

적절한 용량의 결정은, 예를 들어, 치료에 영향을 미치는 것으로 당업계에 알려지거나 또는 의심되는 매개변수 또는 인자를 이용하여 임상의에 의해 이루어진다. 일반적으로, 용량은 최적의 용량보다 다소 적은 양으로 시작하고, 이후에 임의의 부정적인 부작용에 비해 목적하는 또는 최적의 효과가 달성될 때까지 적은 양으로 증가된다. 중요한 진단적 측정은, 예를 들어, 염증의 증상 또는 생성되는 염증성 사이토카인의 수준을 포함한다. 일반적으로, 사용될 생물학적 제제는 치료를 위해 표적화되는 동물과 동일한 종으로부터 유래되어 시약에 대한 임의의 면역 반응을 최소화하는 것이 바람직하다. 인간 대상체의 경우, 예를 들어, 인간화된 및 완전한 인간 항체가 바람직할 수 있다.

본 명세서에 개시된 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 연속 주입에 의해 또는, 예를 들어, 매일, 매주 1회 내지 7회, 매주, 격주로, 매월, 격월로, 분기별로, 반년마다, 매년 등으로 투여되는 용량에 의해 제공될 수 있다. 용량은, 예를 들어, 정맥내로, 피하로, 국소로, 경구로, 비강으로, 직장으로, 근육내로, 뇌내로, 척수내로 또는 흡입에 의해 제공될 수 있다. 총 주간 용량은 일반적으로 적어도 0.05 ㎍/㎏ 체중, 보다 일반적으로 적어도 0.2 ㎍/㎏, 0.5 ㎍/㎏, 1 ㎍/㎏, 10 ㎍/㎏, 100 ㎍/㎏, 0.25 ㎎/㎏, 1.0 ㎎/㎏, 2.0 ㎎/㎏, 5.0 ㎎/㎖, 10 ㎎/㎏, 25 ㎎/㎏, 50 ㎎/㎏ 체중 이상이다(예를 들어, 문헌[Yang, et al. (2003) New Engl. J. Med. 349:427-434; Herold, et al. (2002) New Engl. J. Med. 346:1692-1698; Liu, et al. (1999) J. Neurol. Neurosurg. Psych. 67: 451-456; Portielji, et al. (20003) Cancer Immunol. Immunother. 52: 151-144] 참조). 대상체의 혈청에서 항-CD103 항체의 미리 결정된 표적 농도를 달성하기 위해 0.1 ㎍/㎖, 0.3 ㎍/㎖, 1 ㎍/㎖, 3 ㎍/㎖, 10 ㎍/㎖, 30 ㎍/㎖, 100 ㎍/㎖, 300 ㎍/㎖ 이상과 같은 용량이 또한 제공될 수 있다. 다른 실시형태에서, 본 발명의 항-CD103 항체는 10 ㎎/대상체, 20 ㎎/대상체, 50 ㎎/대상체, 80 ㎎/대상체, 100 ㎎/대상체, 200 ㎎/대상체, 500 ㎎/대상체, 1000 ㎎/대상체 또는 2500 ㎎/대상체로 매주, 격주, "4주마다", 매월, 격월 또는 분기별 기준으로, 예를 들어, 피하 또는 정맥내로 투여된다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "유효량"은 단독으로 또는 추가적인 치료제와 조합하여 세포, 조직 또는 대상체에 투여될 때 질환, 예를 들어, 암의 하나 이상의 증상 또는 암의 진행에서 측정 가능한 개선을 일으키는 데 효과적인 본 발명의 항-CD103 또는 이의 항원-결합 단편의 양을 지칭한다. 유효한 용량은 추가로 증상, 예를 들어, 종양 수축 또는 제거, 종양 성장의 결여, 증가된 생존 시간의 적어도 부분적인 개선을 초래하기에 충분한 항체 또는 단편의 양을 지칭한다. 단독으로 투여되는 개별 활성 성분에 적용될 때, 유효한 용량은 해당 성분 단독을 지칭한다. 조합하여 적용될 때, 유효한 용량은 병용, 연속 또는 동시 투여 여부에 관계없이 치료적 효과를 나타내는 활성 성분의 합해진 양을 지칭한다. 유효량의 치료제는 진단적 척도 또는 매개변수를 적어도 10%; 일반적으로 적어도 20%; 바람직하게는 적어도 약 30%; 보다 바람직하게는 적어도 40%, 가장 바람직하게는 적어도 50%까지 개선시킬 것이다. 질환의 중증도를 평가하기 위해 주관적 척도가 사용되는 경우, 유효량은 또한 주관적 척도의 개선을 가져올 수 있다.

키트

본 명세서에서 논의된 바와 같은 약제학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 치료제를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 하나 이상의 추가적인 구성요소와 함께 본 명세서에서 논의된 바와 같은 바와 같은 항-CD103 항체 또는 항원-결합 단편을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 하나 이상의 구성요소를 포함하는 키트가 추가로 제공된다. 항체 또는 단편 및/또는 치료제는 순수한 조성물로서 또는 약제학적으로 허용 가능한 담체와 함께 약제학적 조성물에 제형화될 수 있다.

일 실시형태에서, 키트는 하나의 용기(예를 들어, 멸균 유리 또는 플라스틱 바이알)에 본 발명의 항-CD103 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 이의 약제학적 조성물 및/또는 또 다른 용기(예를 들어, 멸균 유리 또는 플라스틱 바이알)에 치료제 및 이의 약제학적 조성물을 포함한다.

또 다른 실시형태에서, 키트는 하나의 공통 용기에 선택적으로 약제학적 조성물로 선택적으로 함께 제형화된 하나 이상의 치료제와 조합하여, 약제학적으로 허용 가능한 담체와 함께 본 발명의 항-CD103 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 본 발명의 조합물을 포함한다.

키트가 대상체에게 비경구 투여하기 위한 약제학적 조성물을 포함하는 경우, 키트는 이러한 투여를 수행하기 위한 장치를 포함할 수 있다. 예를 들어, 키트는 하나 이상의 피하 바늘 또는 위에 논의된 바와 같은 다른 주사 장치를 포함할 수 있다.

키트는 키트 내에 약제학적 조성물 및 투약 형태에 관한 정보를 포함하는 패키지 삽입물을 포함할 수 있다. 일반적으로, 이러한 정보는 동봉된 약제학적 조성물 및 투약 형태를 효과적으로 안전하게 사용함에 있어서 환자 및 의사에게 도움을 준다. 예를 들어, 본 발명의 조합물에 관한 다음 정보가 삽입물로 공급될 수 있다: 약동학, 약력학, 임상 연구, 효능 매개변수, 적응증 및 용법, 금기사항, 경고, 주의사항, 이상 반응, 과다복용, 적절한 투여량 및 투여, 공급되는 방법, 적절한 보관 조건, 참고사항, 제조업자/유통업자 정보 및 특허 정보.

검출 키트

예를 들어, ELISA(샌드위치-유형 또는 경쟁 포맷)와 같은 면역검정을 포함하는 다양한 검출 검정에 사용하기 위한 하나 이상의 이러한 시약을 포함하는 진단 또는 검출 시약 및 키트가 또한 제공된다. 키트의 구성요소는 고체 지지체에 미리 부착될 수 있거나 또는 키트 사용 시 고체 지지체의 표면에 적용될 수 있다. 본 발명의 일부 실시형태에서, 신호 생성 수단은 본 발명의 항체 또는 단편과 사전 회합될 수 있거나 또는 사용 전 하나 이상의 구성요소, 예를 들어, 완충액, 항체-효소 접합체, 효소 기질 등과의 조합을 필요로 할 수 있다. 키트는 또한 추가적인 시약, 예를 들어, 고체상 표면에 대한 비특이적 결합을 감소시키기 위한 차단 시약, 세척 시약, 효소 기질 등을 포함할 수 있다. 고체상 표면은 튜브, 비드, 미세역가 플레이트, 마이크로스피어 또는 단백질, 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 고정시키기에 적합한 기타 물질의 형태일 수 있다. 특정 양태에서, 화학발광 또는 발색 생성물의 형성 또는 화학발광 또는 발색 기질의 환원을 촉매하는 효소는 신호 생성 수단의 구성요소이다. 이러한 효소는 당업계에 잘 알려져 있다. 키트는 본 명세서에 기재된 임의의 포획제 및 검출 시약을 포함할 수 있다. 선택적으로, 키트는 또한 본 발명의 방법을 수행하기 위한 지침을 포함할 수 있다.

본 명세서에 개시된 검출 키트는 또한 본 명세서에 개시된 항체, 펩타이드, 항원-결합 단편 또는 폴리뉴클레오타이드 중 적어도 하나 및 검출 시약으로서 조성물을 사용하기 위한 지침을 포함하여 제조될 수 있다. 이러한 키트에 사용하기 위한 용기는 전형적으로 적어도 하나의 바이알, 테스트 튜브, 플라스크, 병, 주사기 또는 하나 이상의 검출 조성물(들)이 배치되고 바람직하게는 적합하게 분취될 수 있는 다른 적합한 용기를 포함할 수 있다. 본 명세서에 개시된 키트는 또한 전형적으로, 예를 들어, 목적하는 바이알(들)을 보관하는 주입 또는 취입 성형 플라스틱 용기와 같이 상업적 판매를 위해 엄중히 밀폐된 바이알(들)을 담기 위한 수단을 포함할 것이다. 방사성 표지, 발색, 형광 또는 기타 유형의 검출 가능한 표지 또는 검출 수단이 키트 내에 포함되는 경우, 표지제는 검출 또는 치료적 조성물 자체와 동일한 용기에 제공될 수 있거나 또는 대안적으로 이 제2 조성물이 배치되고 적합하게 분취될 수 있는 제2 별개의 용기 수단에 배치될 수 있다. 대안적으로, 검출 시약 및 표지는 단일 용기 수단으로 제조될 수 있으며, 대부분의 경우 키트는 또한 전형적으로 상업적 판매 및/또는 편리한 패키징 및 전달을 위해 엄중히 밀폐된 바이알(들)을 담기 위한 수단을 포함할 것이다.

일반적인 방법

분자 생물학의 표준 방법이 문헌[Sambrook, Fritsch and Maniatis (1982 & 1989 2^nd Edition, 2001 3^rd Edition) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Sambrook and Russell (2001) Molecular Cloning, 3 ^rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Wu (1993) Recombinant DNA, Vol. 217, Academic Press, San Diego, CA)]에 설명되어 있다. 표준 방법은 또한 문헌[Ausbel, et al. (2001) Current Protocols in Molecular Biology, Vols.1-4, John Wiley and Sons, Inc. New York, NY]에 나타나 있으며, 이는 세균 세포에서의 클로닝 및 DNA 돌연변이유발(Vol. 1), 포유동물 세포 및 효모에서의 클로닝(Vol. 2), 당접합체 및 단백질 발현(Vol. 3) 및 생물정보학(Vol. 4)을 설명하고 있다.

면역침전, 크로마토그래피, 전기영동, 원심분리 및 결정화를 포함하는 단백질 정제를 위한 방법이 설명되어 있다(Coligan, et al. (2000) Current Protocols in Protein Science, Vol. 1, John Wiley and Sons, Inc., New York). 화학적 분석, 화학적 변형, 번역 후 변형, 융합 단백질의 생산, 단백질의 글리코실화가 설명되어 있다(예를 들어, 문헌[Coligan, et al. (2000) Current Protocols in Protein Science, Vol. 2, John Wiley and Sons, Inc., New York; Ausubel, et al. (2001) Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 3, John Wiley and Sons, Inc., NY, NY, pp. 16.0.5-16.22.17; Sigma-Aldrich, Co. (2001) Products for Life Science Research, St. Louis, MO; pp. 45-89; Amersham Pharmacia Biotech (2001) BioDirectory, Piscataway, N.J., pp. 384-391] 참조). 다중클론 및 단일클론 항체의 생산, 정제 및 단편화가 설명되어 있다(Coligan, et al. (2001) Current Protcols in Immunology, Vol. 1, John Wiley and Sons, Inc., New York; Harlow and Lane (1999) Using Antibodies, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; 상기 Harlow and Lane). 리간드/수용체 상호작용을 특성화하기 위한 표준 기법이 이용 가능하다(예를 들어, 문헌[Coligan, et al. (2001) Current Protocols in Immunology, Vol. 4, John Wiley, Inc., New York] 참조).

단일클론, 다중클론 및 인간화된 항체가 제조될 수 있다(예를 들어, 문헌[Sheperd and Dean (eds.) (2000) Monoclonal Antibodies, Oxford Univ. Press, New York, NY; Kontermann and Dubel (eds.) (2001) Antibody Engineering, Springer-Verlag, New York; Harlow and Lane (1988) Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, pp. 139-243; Carpenter, et al. (2000) J. Immunol. 165:6205; He, et al. (1998) J. Immunol. 160:1029; Tang et al. (1999) J. Biol. Chem. 274:27371-27378; Baca et al. (1997) J. Biol. Chem. 272:10678-10684; Chothia et al. (1989) Nature 342:877-883; Foote and Winter (1992) J. Mol. Biol. 224:487-499]; 미국 특허 제6,329,511호 참조).

인간화에 대한 대안은 형질전환 마우스에서 파지 또는 인간 항체 라이브러리에 디스플레이된 인간 항체 라이브러리를 사용하는 것이다(Vaughan et al. (1996) Nature Biotechnol. 14:309-314; Barbas (1995) Nature Medicine 1:837-839; Mendez et al. (1997) Nature Genetics 15:146-156; Hoogenboom and Chames (2000) Immunol. Today 21:371-377; Barbas et al. (2001) Phage Display: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; Kay et al. (1996) Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual, Academic Press, San Diego, CA; de Bruin et al. (1999) Nature Biotechnol. 17:397-399).

단일 사슬 항체 및 다이어바디가 설명되어 있다(예를 들어, 문헌[Malecki et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:213-218; Conrath et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:7346-7350; Desmyter et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:26285-26290; Hudson and Kortt (1999) J. Immunol. Methods 231:177-189]; 및 미국 특허 제4,946,778호 참조). 이작용성 항체가 제공된다(예를 들어, 문헌[Mack, et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7021-7025; Carter (2001) J. Immunol. Methods 248:7-15; Volkel, et al. (2001) Protein Engineering 14:815-823; Segal, et al. (2001) J. Immunol. Methods 248:1-6; Brennan, et al. (1985) Science 229:81-83; Raso, et al. (1997) J. Biol. Chem. 272:27623; Morrison (1985) Science 229:1202-1207; Traunecker, et al. (1991) EMBO J. 10:3655-3659]; 및 미국 특허 제5,932,448호, 제5,532,210호 및 제6,129,914호 참조).

이중특이성 항체가 또한 제공된다(예를 들어, 문헌[Azzoni et al. (1998) J. Immunol. 161:3493; Kita et al. (1999) J. Immunol. 162:6901; Merchant et al. (2000) J. Biol. Chem. 74:9115; Pandey et al. (2000) J. Biol. Chem. 275:38633; Zheng et al. (2001) J. Biol Chem. 276:12999; Propst et al. (2000) J. Immunol. 165:2214; Long (1999) Ann. Rev. Immunol. 17:875] 참조).

항원의 정제는 항체의 생성에 필요하지 않다. 동물은 관심 항원을 보유하는 세포로 면역화될 수 있다. 그런 다음, 비장세포가 면역화된 동물로부터 단리될 수 있고, 비장세포는 골수종 세포주와 융합되어 하이브리도마를 생산할 수 있다(예를 들어, 문헌[Meyaard et al. (1997) Immunity 7:283-290; Wright et al. (2000) Immunity 13:233-242; Preston et al., supra; Kaithamana et al. (1999) J. Immunol. 163:5157-5164] 참조).

항체는, 예를 들어, 작은 약물 분자, 효소, 리포솜, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)에 접합될 수 있다. 항체는 치료, 진단, 키트 또는 기타 목적에 유용하며, 예를 들어, 염료, 방사성 동위원소, 효소 또는 금속, 예를 들어, 콜로이드성 금에 결합된 항체를 포함한다(예를 들어, 문헌[Le Doussal et al. (1991) J. Immunol. 146:169-175; Gibellini et al. (1998) J. Immunol. 160:3891-3898; Hsing and Bishop (1999) J. Immunol. 162:2804-2811; Everts et al. (2002) J. Immunol. 168:883-889] 참조).

형광 활성화 세포 분류(fluorescence activated cell sorting: FACS)를 포함하는 유세포 분석을 위한 방법이 이용 가능하다(예를 들어, 문헌[Owens, et al. (1994) Flow Cytometry Principles for Clinical Laboratory Practice, John Wiley and Sons, Hoboken, NJ; Givan (2001) Flow Cytometry, 2 ^nd ed.; Wiley-Liss, Hoboken, NJ; Shapiro (2003) Practical Flow Cytometry, John Wiley and Sons, Hoboken, NJ] 참조). 예를 들어, 진단 시약으로 사용하기 위한 핵산 프라이머 및 프로브, 폴리펩타이드 및 항체를 포함하는 핵산 변형에 적합한 형광성 시약이 이용 가능하다(Molecular Probes (2003) Catalogue, Molecular Probes, Inc., Eugene, OR; Sigma-Aldrich (2003) Catalogue, St. Louis, MO).

면역계의 조직학의 표준 방법이 설명되어 있다(예를 들어, 문헌[Muller-Harmelink (ed.) (1986) Human Thymus: Histopathology and Pathology, Springer Verlag, New York, NY; Hiatt, et al. (2000) Color Atlas of Histology, Lippincott, Williams, and Wilkins, Phila, PA; Louis, et al. (2002) Basic Histology: Text and Atlas, McGraw-Hill, New York, NY] 참조).

예를 들어, 항원 단편, 리더 서열, 단백질 접힘, 기능적 도메인, 글리코실화 부위 및 서열 정렬을 결정하기 위한 소프트웨어 패키지 및 데이터베이스가 이용 가능하다(예를 들어, GenBank, Vector NTI® Suite(인포맥스, 인크(Informax, Inc), 메릴랜드주 베서스다 소재); GCG 위스콘신 패키지(엑설리스, 인크.(Accelrys, Inc.), 캘리포니아주 샌디에고 소재); DeCypher®(타임로직 코포레이션(TimeLogic Corp.), 네바다주 크리스탈 베이 소재); 문헌[Menne, et al. (2000) Bioinformatics 16: 741-742; Menne, et al. (2000) Bioinformatics Applications Note 16:741-742; Wren, et al. (2002) Comput. Methods Programs Biomed. 68:177-181; von Heijne (1983) Eur. J. Biochem. 133:17-21; von Heijne (1986) Nucleic Acids Res. 14:4683-4690] 참조).

실시예

하기 실시예는 본 발명을 예시한다. 이들 실시예는 결코 본 발명의 범위를 제한하려는 의도가 아니다.

실시예 1: 시약

하기 실시예에 사용된 시약 및 항체의 세부 사항은 표 1에 제공되어 있다:

실시예 2: 1차 물질 및 세포주

차이니즈 햄스터 난소(CHO)-K1 세포 및 인간 선암종 세포주 MCF7를 아메리칸 타입 컬처 콜렉션(ATCC)으로부터 입수하였다. 세포를 미생물 오염 및 마이코플라스마에 대한 스크리닝이 수행될 때까지 격리하였으며, 음성으로 판명되었다. CHO-K1 세포를 DMEM/F12(깁코(Gibco)), 1% PenStrep(깁코), 5% NCBS(바이오웨스트(Biowest))에서 성장시키고, 37℃에서 5% CO₂가 있는 가습 분위기에서 인큐베이션하였다. MCF7 세포를 EMEM(ATCC), 1% PenStrep(깁코), 10% FBS(깁코)에서 성장시키고, 37℃에서 5% CO₂가 있는 가습 분위기에서 인큐베이션하였다. CHO-K1 세포를 인간 인테그린 알파E(UniProt P38570) 및 인간 인테그린 베타 7(UniProt P26010)의 전장 오픈 리딩 프레임을 각각 암호화하는 pCI-neo 및 pcDNA3.1(+)-하이그로 벡터로 형질감염시킴으로써 CHO-K1.hCD103/h베타7 세포주를 생성하였다. 겐타마이신(50 ㎍/㎖, 깁코) 및 하이그로마이신 B(50 ㎍/㎖, 인비트로젠(Invitrogen))이 보충된 CHO 배지에서 한계 희석에 의해 안정적인 클론을 얻었다. CHO-K1 세포를 인간 인테그린 알파4(UniProt P13612) 및 인간 인테그린 베타 7의 전장 오픈 리딩 프레임을 각각 암호화하는 pCI-neo 및 pcDNA3.1(+)-하이그로 벡터로 일시적으로 형질감염시켜 CHO-K1.h알파4/h베타7 발현 세포를 생성하였다. CHO-K1 세포를 레서스 인테그린 알파E(UniProt H9Z8N2) 및 레서스 인테그린 베타 7(NCBI XP_015007317.1)의 전장 오픈 리딩 프레임을 각각 암호화하는 pCI-neo 및 pcDNA3.1(+)-하이그로 벡터로 일시적으로 형질감염시켜 CHO-K1.rhCD103/rh베타7 발현 세포를 생성하였다.

인간 비소세포 폐암세포주 A549를 아메리칸 타입 컬처 콜렉션(ATCC)으로부터 입수하였다. 세포를 미생물 오염 및 마이코플라스마에 대한 스크리닝이 수행될 때까지 격리하였으며, 음성으로 판명되었다. 세포를 CHO-K1의 경우 DMEM/F-12, GlutaMAX™ 보충제 + 5% FCS + 25mM HEPES에서 그리고 A549의 경우 RPMI + 10% FCS에서 성장시키고, 37℃에서 5% CO₂가 있는 가습 분위기에서 인큐베이션하였다. A549 세포주는 플라스미드 암호화 가이드 RNA, 완전 기능 CAS9 카세트 및 GFP(플라스미드 pSpCas9(BB)-2A-GFP(PX458)(Ran et al. Nature Protocols 8:2281-2308(2013))(애드진(Addgene) 플라스미드 # 48138; n2t.net/addgene:48138;RRID:Addgene_48138))를 사용하여 비리포솜 형질감염(퓨젠(Fugene))에 의해 CDH1(E-카드헤린)을 넉아웃시켰다. Moflo Astrios 분류기(베크만 쿨터(Beckman Coulter))를 사용하여 GFP-양성 단일-세포 클론을 단리하였다. 중단(disruption)은 indel을 추적하는 Sanger 시퀀싱에 의해 확인하였다.

CD103 양성 T 세포를 다음과 같이 생성하였다. 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 사전 동의(informed consent)(상킨(Sanquin)) 후 건강한 지원자로부터의 버피 코트의 Ficoll-Paque 밀도 구배 원심분리(Ficoll-Paque PLUS, 지이 헬스케어 라이프 사이언시스(GE Healthcare Life Sciences), 미국, 매사추세츠주 말러버 소재)를 통해 단리하였다. 다음으로, 표준 프로토콜(써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific))에 따라 MagniSort™ 인간 CD8 T 세포 농축 키트를 사용하여 CD8 양성 T 세포를 음성으로 선택하였다. 그 후, 세포를 10 ㎍/㎖ PHA, 6000 U/㎖ IL-2 및 10 ng/㎖ 재조합 TGFβ로 자극하고, 10% FCS 및 페니실린/스트렙토마이신(100 U/㎖)이 보충된 RPMI에서 배양하였다. 세포를 적어도 10일 동안 배양하여 80%를 초과하는 CD103 양성 CD8 세포를 얻었다.

종양 감축술(cytoreductive surgery)을 받은 난소암 환자로부터 신선한 종양 물질을 얻었다. 메스를 사용하여 대략 1㎣의 종양 조각을 절단하고, 37℃에서 30분 동안 또는 실온에서 밤새 효소 소화(1 ㎎/㎖ 콜라게네이스 IV형(라이프 테크놀로지스(Life technologies)), 31 U/㎖ rhDNase(Pulmozyme, 제넨테크, 미국 캘리포니아주 소재) 및 10% FCS가 보충된 RPMI)시켰다. 그 후, 나머지 종양 조각을 포함하는 소화 배지를 70㎛ 세포 여과기(코닝(Corning), 네덜란드 암스테르담 소재)로 여과하였다. 유세포 분석을 위해, 세포를 펠릿화하고, 세척하고, 추후 사용할 때까지 동결보존하였다.

면역적합 Balb/c 및 C57/BL6 마우스로부터의 비장 및 Balb/c 마우스로부터의 흉선을 수집한 후, 플런저가 있는 70㎛ 여과기에서 조직을 갈았다. 적혈구 용해 완충액(바이오레전드(Biolegend))을 사용하여 적혈구를 제거하였다. 세포를 펠릿화하고, 세척하고, 추후 사용할 때까지 동결보존하였다.

실시예 3: 단일클론 항체 생성

인간 CD103 항체를 생성하기 위해, 인간 CD103(인테그린 알파-E) 및 인간 인테그린 베타-7의 전장 오픈 리딩 프레임을 암호화하는 cDNA 플라스미드 작제물로 마우스를 면역화시켰다. pCI-neo 및 pcDNA3.1(+)을 맞춤 기반으로 합성하고, 진아트(GeneArt)/써모피셔(독일 레겐스부르크 소재)로부터 입수하였다. 엔비고(Envigo)(네덜란드 호르스트 소재)에서 제조업체의 지침에 따라 Helios 유전자 총(바이오래드(BioRad), 미국 캘리포니아주 에르쿨레스 소재) 및 DNA 코팅된 금 총알(바이오래드)을 사용하여 유전자 총 면역화에 의해 마우스를 면역화시켰다. 간략하게는, 1㎛ 금 입자를 pCI-neo-hCD103 및 pcDNA3.1(+)-h베타7 cDNA, 및 마우스 Flt3L 및 마우스 GM-CSF용 상업용 발현 벡터(둘 다 알데브론(Aldevron) 제품)로 1:1:1:1 비로 코팅하였다. 총 50㎍의 플라스미드 DNA를 사용하여 25㎎의 금 입자를 코팅하였다. 구체적으로, 7주 내지 8주령의 암컷 BALB/C 마우스(할란(Harlan))를 양쪽 귀에 3회 투여 주기로 유전자 총을 사용하여 귀에서 면역화시켰다.

항체 역가를 CHO-K1.hCD103/h베타7 안정적인 세포주를 사용하여 세포 ELISA("CELISA")에 의해 평가하였다. 세포를 96-웰 넓적 바닥 조직 배양 플레이트에 8×10⁴개 세포/웰로 시딩하고, 세포층이 컨플루언트될 때까지 37℃, 5% CO2 및 95% 습도에서 배양하였다. 세포를 희석된 마우스 혈청의 각 샘플과 함께 37℃, 5% CO2 및 95% 습도에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 다음으로, 세포를 포스페이트 완충 식염수(PBS)/0.05% Tween-20(PBS-T)으로 세척하고, 염소-항-마우스 IgG-HRP 접합체(써던 바이오테크(Southern Biotech))와 함께 37℃, 5% CO2 및 95% 습도에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 세포를 PBS-T로 3회 세척하고, 항-hCD103/h베타7 면역반응성을 TMB 안정화 색원체(인비트로젠)로 시각화하였다. 0.5M H₂SO₄로 반응을 중지시키고, 450㎚ 및 610㎚에서 흡광도를 판독하였다. 항-hCD103/h베타7 역가는 2회의 DNA 면역화 후 검출된 바와 같이 각각의 개별 마우스 혈청 샘플에서 1:2500보다 더 높았다. 모든 마우스를 마지막으로 세 번째 면역화시키고, 4일 후에 희생시켰다. 적혈구가 고갈된 비장 및 림프절 세포 집단을 공개된 프로토콜에 따라 준비하였다.

항-hCD103 항체 생산 B-세포를 선택하기 위해, 바람직하게는 원숭이 CD103에 교차-반응성을 갖는 hCD103에 특이적으로 결합하는 항체를 발현하는 B-세포에 우선적으로 결합하는 선택 전략을 설계하고 개발하였다. 사이노몰구스 CD103 서열이 알려지지 않았기 때문에, 레서스 CD103을 사용하여 교차-반응성 연구를 수행하였다. hCD103/h베타7 면역화된 마우스로부터의 비장세포 및 림프구를 T25 배양 플라스크에 시딩된 hCD103 음성 MCF-7과 함께 인큐베이션하고, 30 Gray에서 방사선 조사하였다. 1시간 후, 플라스크를 앞뒤로 움직여서 결합되지 않은 세포를 부드럽게 제거하였다. 그런 다음, 결합되지 않은 세포를 포함하는 배지를 방사선 조사된 CHO-K1.h알파4/h베타7 세포(일시적 형질감염)를 포함하는 새로운 T25 플라스크로 옮겼다. h베타7-반응성 B-세포를 음성적으로 선택하기 위해 얼음 위에서 이 절차를 한번 더 반복하였다. 다음으로, 결합되지 않은 B-세포를 포함하는 배지를 30Gy로 방사선 조사된 CHO-K1.hCD103/h베타7 세포와 함께 인큐베이션하였다. 얼음에서 1.5시간 인큐베이션 후, 결합되지 않은 세포를 배양 배지를 사용하여 여러 세척 단계로 제거하였다. 그 후, 림프구가 결합된 CHO-K1.hCD103/h베타7 세포가 담긴 T25 플라스크를 트립신-EDTA(시그마(Sigma))로 수확하였다. 선택된 B-세포를 96-웰 넓적 바닥조직 배양 플레이트의 최종 부피 200㎕의 배지에서 10%(v/v) T-세포 상청액 및 50,000개의 방사선 조사된(25Gy) EL-4 B5 피더 세포와 혼합하였다. 제4일에, 세포 배양 배지를 교체하였다. 제8일에, 아래에 설명된 바와 같이 세포 ELISA에 의해 hCD103/h베타7 반응성에 대해 상청액을 스크리닝하였다. CHO-K1.hCD103/h베타7, CHO.K1.rhCD103/rh베타7(일시적 형질감염) 및 CHO-K1.h알파4/h베타7(일시적 형질감염)을 96-웰 넓적 바닥조직 배양 플레이트에서 배양 배지(10% 소 태아 혈청(하이클론(Hyclone)) 및 80 U Pen/Strep(깁코)이 보충된 DMEM-F12(깁코))에 시딩하고, 컨플루언트될 때까지 37℃, 5% CO2 및 95% 습도에서 배양하였다. 그 후, 배양 배지를 제거하고, 세포를 B-세포 배양물로부터의 상청액과 함께 37℃, 5% CO₂및 95% 습도에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 다음으로, 세포를 PBS-T로 세척하고, 염소-항-마우스 IgG-HRP 접합체(써던 바이오테크)와 함께 37℃, 5% CO2 및 95% 습도에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 세포를 PBS-T로 3회 세척하고, 항-hCD103/h베타7 및 항-h알파4/h베타7 면역반응성을 TMB 안정화된 색원체(인비트로젠)로 시각화하였다. 0.5M H₂SO₄로 반응을 중지시키고, 450㎚ 및 610㎚에서 흡광도를 판독하였다.

h알파4/h베타7에 반응하지 않았거나 또는 최소한으로 반응한 hCD103/h베타7 반응성 상청액으로부터의 B-세포 클론을 약간의 편차가 있는 공개된 절차에 따라 미니 전기세포융합(electrofusion)에 의해 불멸화하였다(Steenbakkers et al. (1992) Mol. Biol. Rep. 19: 125). 간략하게는, B-세포를 전기세포융합 일정몰 완충액(Electrofusion Isomolar Buffer)(에펜도르프(Eppendorf))에서 10⁶ Sp2/0-Ag14 뮤린 골수종 세포(ATCC CRL-1581)와 혼합하였다. 50㎕ 융합 챔버에서 15초, 1㎒, 23 Vrms AC의 교호 전기장에 이어 10as, 180볼트 DC의 정사각형의 고자기장 DC 펄스 및 다시 15초, 1㎒, 23 Vrms AC의 교호 전기장에 의해 전기세포융합을 수행하였다. 챔버의 내용물을 하이브리도마 선택 배지로 옮기고, 한계 희석 조건하에 96-웰 플레이트에 플레이팅하였다. 전기세포융합 후 제8일에, 하이브리도마 상청액을 위에 설명된 바와 같이 세포 ELISA에 의해 hCD103/h베타7, rhCD103/rh베타7 및 h알파4/h베타7 결합 활성에 대해 스크리닝하였다. CD103에 특이적으로 결합하는 상청액에서 항체를 분비하는 하이브리도마를 -180℃(-1 배취)에서 동결시키고, 무결성과 안정성을 보호하기 위해 한계 희석으로 서브클로닝하였다. 안정적인 하이브리도마를 세포층 컨플루언트될 때까지 -180℃(-LD1 배취)에서 동결시켰다.

선택된 안정적인 하이브리도마를 무혈청 배지에서 7일 동안 배양하고; 상청액을 수확하고, 항체를 제조업체의 지침(지이 헬스케어)에 따라 MabSelect Sure 단백질 A 수지를 사용하여 정제하였다. 분광광도계를 사용하여 항체 농도를 정량화하였다. 항체 단량체성은 SEC-HPLC에 의해 평가하였다. 하이브리도마 배양물의 상청액을 사용하여 하이브리도마를 아이소타이핑하였다. 간단히 말해서, 공통 마우스 아이소타입 및 경쇄 각각에 대해 고정화된 염소-항-마우스 항체 밴드를 갖는 딥스틱(dipstick)을 기반으로 하는 마우스 단일클론 항체 아이소타이핑 키트(바이오래드)를 사용하여 아이소타이핑을 수행하였다. 회수된 항체는 모두 마우스 IgG1으로 확인되었다. 항체 서열은 다음 방법을 사용하여 레이크파마(미국 캘리포니아주 소재)에서 수행된 마우스 IgG1 하이브리도마 물질의 가변 영역의 시퀀싱에 의해 규명되었고: 하이브리도마 세포의 총 RNA를 추출하였고, 이는 cDNA 합성을 가능하게 하였다. TOPO(써모 피셔 사이언티픽) 벡터에서 양성 단편의 클로닝을 가능하게 하는 cDNA 말단의 빠른 증폭(Rapid Amplification of cDNA End: RACE)을 수행하였다. TOPO 클론을 시퀀싱하고, VBASE2를 사용하여 서열에 주석을 달았다.

mAb 발견 캠페인은 인테그린 이종이량체 hCD103/h베타7의 인간 CD103(인테그린 알파-E) 도메인에 대한 특이적 결합을 나타내는 6개의 상이한 mAb 후보를 산출하였다. 6개의 선택된 후보를 하이브리도마로부터 생산하고 정제하였다. 도 1은 CHO.K1-hCD103/h베타7, CHO.K1-rhCD103/rh베타7 및 CHO.K1-h알파4/h베타7에 대한 정제된 항-hCD103 mAb의 세포 결합 데이터를 나타낸다. 형질감염된 CHO-K1 세포주에 의한 인테그린 이종이량체의 발현을 인테그린 인간 CD103, 인테그린 인간 알파-4 및 인테그린 인간 베타-7에 대한 상업용 mAb에 의해 확인하였다. 선택된 하이브리도마를 시퀀싱하고, Discovery Studio를 사용하여 계통수를 구축하였으며(도 2), 이는 모든 VH 및 VL 서열이 서로 다른 유사성으로 고유함을 보여준다. 나타낸 바와 같이, 항체는 hCD103에 대한 결합은 나타내지만, h베타7에 대한 결합은 나타내지 않는다. 레서스CD103/rh베타7에 대한 결합은 후보마다 상이하다.

실시예 4: 항-hCD103 Fab 단편의 생성

항-hCD103 Fab 후보를 이뮤노프리사이즈(ImmunoPrecise)(네덜란드 오스 소재)에서 생산하였다. 후보 hCD103.01A, hCD103.05A 및 hCD103.06A의 VH 및 VL 도메인의 DNA 서열을 암호화하는 합성 벡터를 합성한 후, 이뮤노프리사이즈의 인간 IgG1-Fab-K 벡터 및 인간 카파 경쇄 벡터에 각각 클로닝한 후, HEK293 세포를 형질감염시켰다. 수확된 상청액으로부터의 Fab 단편을 CaptureSelect IgG-CH1 친화성 매트릭스를 사용하여 내독소가 없는 정제에 의해 정제하였다. 분광광도계를 사용하여 Fab 농도를 정량화하고, SDS-PAGE 및 HP-SEC에 의해 Fab 순도를 평가하였다. 내독소 수준은 LAL 검정에 의해 결정하였다.

실시예 5: mAb 및 Fab의 형광 표지

Fab 및 mAb를 6x 몰 과량의 Alexa Fluor 647-NHS(써모 사이언티픽)와 접합시켰다. 간략하게는, mAb/Fab를 Zeba 7K MWCO 스핀 칼럼을 사용하여 0.2M 소듐 바이카보네이트(pH 8.3)로 재완충시켰다. 6-배 몰 과량의 Alexa Fluor 647-NHS(DMSO 중 10㎎/㎖ 스톡)를 첨가하였다. 실온의 암소에서 1시간 동안 반응시켰다. 미반응 Alexa Fluor-NHS를 Zeba 7K MWCO 스핀 칼럼을 사용하여 제거하였다. 항체 및 AF647 농도를 각각 280㎚ 및 650㎚에서 분광광도계를 사용하여 측정하였다. 잔여 미반응 AF647의 양을 이중 검출기 시스템(280㎚ 및 650㎚)을 사용하여 HP-SEC에 의해 결정하였다. mAb당 +/- 4 염료 및 Fab당 +/- 2-3 염료의 표지 수율이 관찰되었다.

실시예 6: 인간 CD103/베타7을 발현하는 CHO 세포에 대한 면역반응성

표지되지 않은 mAb 및 Fab를 앞서 설명한 바와 같이 CELISA에 의해 CHO.K1-hCD103/h베타7에 대한 세포 결합에 대해 분석하였다. 다음으로, CHO.K1-hCD103/h베타7 및 CHO.K1에 대한 AF647 표지된 mAb/Fab의 결합 프로파일을 결정하기 위해 유세포 분석을 사용하여 세포 결합 실험을 수행하였다. 1×10⁵ 개의 분리된 세포를 mAb/Fab와 함께 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 세척 후, 세포를 1% BSA/DPBS/1xDAPI에 재현탁시키고, FACS-CantoII(비디 사이언시스)에서 분석하였다.

도 3은 세포 ELISA에서 다양한 표지되지 않은 mAb/Fab의 결합 데이터를 나타낸다. hCD103.01 mAb/Fab 및 hCD103.05 mAb의 CHO.K1.hCD103/베타7 및 재조합 hCD103/베타7 모두에 대한 강력한 결합, hCD103.05 Fab의 CHO.K1.hCD103/베타7 및 재조합 hCD103/베타7 모두에 대한 다소 감소된 결합 및 hCD103.06 mAb/Fab의 재조합 hCD103/베타7(아크로 바이오시스템즈(Acro Biosystems))에 대한 약한/최소 결합, 반면 hCD103.06 mAb의 CHO.K1.hCD103/h베타7에 대한 강한 결합.

도 4는 유세포 분석에서 다양한 AF647-표지된 mAb/Fab의 결합 데이터를 나타낸다. 형질감염되지 않은 CHO.K1에서는 mAb 및 Fab 시약의 용량 의존적 결합이 관찰되지 않았다(데이터 미도시).

실시예 7: 재조합 인간 CD103/베타7에 대한 면역반응성

인간 CD103/베타7에 대한 면역반응성을 재조합 hCD103/h베타7 Fc-단백질(아크로-바이오시스템즈)이 코팅된 96-웰 MaxiSorp 넓적 바닥플레이트를 사용하여 ELISA에 의해 평가하였다. 단백질 코팅된 96-웰 플레이트를 단백질을 함유하지 않은 차단 완충액(피어스(Pierce))에서 37℃에서 1.5시간 동안 차단시켰다. 플레이트를 세척하고, PBS 중 0.1% Tween-20 중 mAb/Fab와 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 다음으로, 플레이트를 PBS-T로 세척하고, PBS 중 0.1% Tween-20 중 mAb의 경우 염소-항-마우스 IgG-HRP 접합체(써던 바이오테크) 및 Fab 단편의 경우 염소-항-인간 Fab-HRP 접합체(잭슨 이뮤노 리서치(Jackson Immuno Research))와 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 웰을 PBS-T로 3회 세척하고, 항-hCD103 면역반응성을 TMB 안정화된 색원체(인비트로젠)로 시각화하였다. 0.5M H2SO4로 반응을 중지시키고, 450㎚ 및 610㎚에서 흡광도를 판독하였다.

실시예 8: 유세포 분석

종양 소화물에서 항-CD103 mAb 및 Fab 단편의 결합 검정을 위해, 샘플을 다수의 분취량으로 나누고, live/dead 마커 및 인간 CD3, CD8α, CD33 및 CD103에 대한 상업용 항체 또는 CD3, CD8α, CD33에 대한 상업용 항체 및 본 발명의 항-CD103 mAb 또는 Fab를 2차 검출 시약과 함께 사용하여 염색하였다. 항-CD103과 뮤린 CD103 양성 T 세포의 결합 검정을 위해, 비장 및 흉선 단일 세포 현탁액을 다수의 분취량으로 나누고, live/dead 마커 및 뮤린 CD8 및 CD103에 대한 상업용 항체를 사용하여 염색하였다. 추가적인 분취량은 관련 아이소타입 대조군 또는 형광성 마이너스 원 대조군("FMO(fluorescence minus one)" 대조군은 모든 형광단에서 하나의 형광단을 빼고 염색된 세포이며; 관련 아이소타입 대조군은 직접적으로 표지된 비특이적 아이소타입 항체 또는 2차 검출 시약과 결합된 비특이적 아이소타입 항체를 포함함)으로 염색하였다. 형광 표지된 mAb의 결합 백분율을 유세포 분석을 사용하여 결정하였다. 최대 결합은 100%로 설정하였다. BD FACSVerse(비디 사이언시스)에서 측정을 수행하였다. FlowJo v10(트리 스타(Tree Star))로 데이터 분석을 수행하고, 표면 수용체 수준을 평균 형광 강도(mean fluorescent intensity: MFI)로 나타내었다.

생체외 인간 종양 소화물을 사용하여, 항-CD103 mAb를 CD3+ CD8+ T 세포에 게이팅하는 유세포 분석에서 일상적으로 사용되는 벤치마크 상업용 항-CD103 mAb(비디 사이언스)에 대해 평가하였다. 항-CD103 mAb는 상업용 항-CD103 mAb에 대해 관찰된 것과 동일한 빈도로 CD103+ CD8+ T 세포 하위집단을 쉽게 식별하였다(도 5). 이들 소화물에서 CD4+ T 세포 또는 CD33+(골수성) 세포에 대한 결합은 검출되지 않았다. 10명의 독립적인 환자에서 CD103+ CD8+ T 세포 하위집단에 대한 mAb 결합은 클론 01A에 대해 가장 높은 반면, 클론 03A는 가장 낮은 결합을 보였다(도 6). 추가적으로, mAb 결합 데이터와 일치하게, 항체 클론 01A, 05A 및 06A로부터의 재조합 Fab 단편은 각각 Fab.hCD103.01.C1에 대한 CD103+ CD8+ T 세포 하위집단에 대해 가장 강력한 결합을 나타낸 반면, Fab.hCD103.06.C1은 인간 종양 소화물에서 가장 낮은 결합을 나타내었다(도 7).

mAb 간의 친화도 및 경쟁의 차이를 평가하기 위해, CD103+ CD8+ T 세포를 FACS 배지에서 본 발명의 항-CD103 mAb 또는 상업용 항-CD103 mAb와 함께 4℃에서 1시간 동안 사전 인큐베이션한 후, 형광 표지된 대응물과 함께 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 형광 표지된 mAb의 결합 백분율을 유세포 분석을 사용하여 결정하였다. 최대 결합은 100%로 설정하였다.

유세포 분석을 사용하여 CD103 mAb 클론이 뮤린 CD103+ T 세포와 교차 반응하는지 여부를 결정하였다. 마우스 비장 및 흉선을 상업용 항-마우스 CD103 mAb를 사용하여 CD103의 발현에 대해 조사하였다. CD8 세포의 대략 절반은 CD103에 대해 양성이었다. 그러나, 항-인간 CD103 mAb 클론은 뮤린 CD103에 대한 특이적 결합을 나타내지 않았다(데이터 미제시). 경쟁 검정은 클론 03A 및 06A를 제외하고 본 발명의 패널에서 대부분의 mAb의 결합이 상업용 CD103 mAb의 결합을 저해하며 그 반대도 마찬가지임을 밝혀내었으며, 이는 CD103의 동일한 영역에 대한 결합을 나타낸다(도 8). 그럼에도 불구하고, 결합 특성의 차이가 관찰되었다. 클론 01A 및 02A는 경쟁 검정에서 대부분의 다른 mAb 클론의 결합을 차단한 반면, 클론 03A, 05A, 06A 및 07A는 그렇지 않았으며, 이는 별개의 결합 에피토프를 시사한다. 추가적으로, 형광 표지된 05A, 06A 및 07A는 동일한 클론으로 포화된 후 결합을 나타내었으며, 이는 더 낮은 결합 친화도를 나타낸다.

항-CD103 mAb 및 Fab 단편의 내재화 및 해리, CD103의 막 전환율(membranous turnover)을 이전에 기술된 프로토콜을 사용하여 결정하였다. 간략하게는, CHO.K1-hCD103/h베타7 세포 또는 CD103 양성 T 세포를 얼음 위에서 항-CD103 mAb 및 Fab 단편(20 ㎍/㎖의 최종 농도)으로 염색하였다. 염색 후; 1) 세포를 얼음 냉각된 FACS 완충액으로 세척하고, FACS 배지에 1:50으로 희석된 2차 항체와 함께 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션하여 표면 발현을 측정하였다. 2) 세포를 얼음 냉각된 FACS 완충액으로 세척하고, 37℃에서 4시간 동안 배양 배지에서 인큐베이션하고, 이후에 2차 항체는 표면 결합된 CD103 mAb 또는 Fab 단편에만 결합하기 때문에, 4℃에서 1시간 동안 2차 항체와 함께 인큐베이션하여 내재화되지 않은 CD103-항체 복합체를 측정하였다. 3) 세포를 얼음 냉각된 FACS 완충액으로 세척하고, 37℃에서 4시간 동안 배양 배지에서 인큐베이션한 후, CD103 mAb 또는 Fab 단편과 함께 다시 인큐베이션하고 이어서 2차 항체와 인큐베이션하여 내재화되지 않은 재출현(reappeared) 수용체 및 수용체의 가능한 드노보(de novo) 합성을 측정하였다. 각 처리 조건에 대해 중복 샘플을 측정하고, 2차 항체의 백그라운드 형광 및 비특이적 결합에 대해 보정하였다. BD FACSVerse 또는 BD Accuri C6(비디 사이언시스)에서 측정을 수행하였다. FlowJo v10(트리 스타)으로 데이터 분석을 수행하였으며, 표면 수용체 발현을 평균 형광 강도(MFI)로 나타내었다. 37℃에서 4시간 인큐베이션하면 세포 표면에 결합된 남아있는 mAb 및 Fab 단편의 양이 달라진다. 감소는 내재화된 mAb 및 Fab 단편을 나타낼 수 있다. 그러나, 직접 표지된 mAb 및 Fab 단편을 사용하여 동일한 실험을 수행한 결과, 세포 표면에 남아있는 mAb 또는 Fab 단편의 감소는 해리로 인한 것으로 나타났다. 참고로, CD103 표면 발현 수준은 mAb 또는 Fab 단편과의 인큐베이션에 의해 약간만 변경되었다(데이터 미제시).

실시예 9: CD103+ T 세포 부착 검정

CD103+ T 세포 부착 검정을 다음과 같이 수행하였다. 실험 하루 전, 96 웰 플레이트를 1mM Ca²⁺및 Mg²⁺를 포함하는 둘베코의 PBS(DPBS)에서 2 ㎍/㎖의 100㎕ 재조합 E-카드헤린으로 4℃에서 밤새 코팅하였다. 다음으로, 웰을 DPBS 중 1% 소 혈청 알부민(BSA)을 사용하여 적어도 1시간 동안 차단하였다. CD103+ T 세포를 앞서 설명된 바와 같이(3) CFSE(써모 피셔 사이언티픽)로 표지하고, RPMI + 10% FCS + 1mM Mn²⁺에 재현탁시켰다. CFSE 표지된 세포를 10 ㎍/㎖ 항체 또는 Fab 단편과 함께 얼음 위에서 30분 동안 사전 인큐베이션한 후 E-카드헤린 코팅된 웰(50,000개 세포/웰)에서 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하거나 또는 세포를 37℃에서 30분 동안 E-카드헤린 코팅된 웰로 직접 옮긴 다음, 37℃에서 30분 동안 10 ㎍/㎖ 항체 또는 Fab 단편을 처리하였다.

A549 야생형 및 E-카드헤린 넉아웃 세포를 사용하는 부착 검정을 위해, 실험 하루 전, 종양 세포(30,000개 세포/웰)를 96 웰 플레이트에 시딩하였다. 다음으로, CFSE 표지된 CD103+ T 세포를 10 ㎍/㎖ 항체와 함께 얼음 위에서 30분 동안 사전 인큐베이션한 후, 종양 세포가 시딩된 웰에서 37℃에서 60분 동안 인큐베이션하였다.

인큐베이션 후, 결합되지 않은 세포를 플레이트를 뒤집고 DPBS로 세척하여 제거하였다. 마지막으로, 세포를 DPBS 중 3.7% 포르말린을 사용하여 고정시켰다. 종래의 형광 현미경(Invitrogen™ EVOS™ FL 이미징 시스템)을 사용하여 이미지를 캡처하였다. 결합된 T 세포를 Image J 소프트웨어 분석(1.50v)을 사용하여 정량화하였다.

도 9에 도시된 바와 같이, CD103 mAb 클론 01A, 02A, 03A 및 07A는 T 세포 결합의 가장 강력한 저해를 나타낸 반면, 06A는 E-카드헤린에 대한 결합을 부분적으로 저해하였다. 클론 05A는 CD103-매개성 T 세포 부착을 방해하지 않는 유일한 클론이었다. Fab.hCD103.01.C1, Fab.hCD103.05.C1 및 Fab.hCD103.06.C1에 대해 유사한 효과가 관찰되었다(데이터 미제시). A549 종양 세포에서 CDH1(E-카드헤린)의 CRISPR-넉아웃은 CD103+ T 세포 부착을 감소시켰지만, E-카드헤린 야생형 및 E-카드헤린-넉아웃 세포에서는 본 발명의 CD103 mAb의 명확한 효과가 관찰되지 않았다.

실시예 10: 세포 기반 ELISA

절차 하루 전, CD103/β7 형질감염된 CHO 세포(30,000개 세포/웰)를 96 웰 플레이트에 시딩하였다. 그 후, CD103 mAb, Fab 단편 및 아이소타입 대조군의 연속 희석액을 96-웰 플레이트의 각 웰에 첨가하고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 웰을 PBS로 세척하고, 토끼 항-마우스/IgG-HRP(1:4000, 다코(Dako)) 또는 Fab 특이적 염소 항-인간/IgG-HRP(1:4000; 시그마 알드리치(Sigma Aldrich))와 함께 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 다음으로, 웰을 PBS로 세척하고, TMB 기질(KPL)을 첨가하였다. 1M HCl 용액을 첨가하여 발색 반응을 중지시키고, 마이크로플레이트 판독기(써모 사이언티픽)에 의해 흡광도를 측정하였다.

실시예 11: ⁸⁹ Zr-hCD103.01A, ⁸⁹ Zr-hCD103.05A, ⁸⁹ Zr-Fab.hCD103.01.C1 및 ⁸⁹ Zr-hCD103.05.C1 추적자 개발 및 품질 관리

hCD103.01A, hCD103.05A,Fab.hCD103.01.C1 및 Fab.hCD103.05.C1을 3-배 또는 4-배 몰 과량의 TFP-N-Suc-desferal-Fe(디에프, 에이비엑스 게엠베하(Df, ABX GmbH), 독일 함부르크 소재)와 함께 인큐베이션한 후, 임상 등급 ⁸⁹Zr(퍼킨 엘머(Perkin Elmer), 네덜란드 그로닝겐 소재)을 사용하여 ⁸⁹Zr-표지를 수행하였다. 250 MBq/㎎ 내지 1000 MBq/㎎ 범위의 항체 또는 Fab 단편 ㎎당 다양한 양의 ⁸⁹Zr을 사용하여 달성 가능한 최대 비방사능(specific activity)을 결정하였다. 트라이클로로아세트산(TCA) 침전 테스트에 의해 방사화학적 순도(RCP)를 평가하였다. ⁸⁹Zr-Fab.hCD103.01.C1 및 Fab.hCD103.05.C1에 대한 방사화학적 순도는 테스트된 세 가지 ⁸⁹Zr 수준(250MBq, 500MBq 및 750MBq ⁸⁹Zr)에 대해 96% 초과였다. Df-mAb 및 Df-Fab 접합체를 크기 배제 초고성능 액체 크로마토그래피(SE-UPLC)에 의해 응집 및 단편화에 대해 확인하였다. Waters SE-UPLC 시스템에는 이중 파장 흡광도 검출기, 인라인 방사능 검출기 및 TSK-GEL G3000SWXL 칼럼(제이에스비(JSB), 네덜란드 에인트호벤 소재)가 장착되어 있다.

2개의 Df-접합된 CD103 mAb 및 Fab 단편의 CD103 결합 친화도는 변형되지 않은 대응물과 유사하였다(도 10). 또한, Df-접합된 mAb 및 Fab 단편 모두 추가 정제 없이 95% 초과의 방사화학적 순도의 500MBq ⁸⁹Zr/㎎의 비방사능을 달성하였다(도 11). 이와 같이, 이러한 추적자는 10㎍(PET 이미징)만큼 적은 양 또는 체내분포 연구에 사용되는 경우 훨씬 더 적은 양으로 PET 이미징에 적합하다. 시험관내에서, hCD103.01A 및 hCD103.05A는 CD103 형질감염된 CHO-K1 모델 세포주(CHO.K1-hCD103/h베타7)에 대해 특이적 결합을 나타내었지만, CHO-K1 야생형 세포(CHO.WT)에 대해서는 그렇지 않았다(도 12).

실시예 12: 동물 연구

도 13a는 ⁸⁹Zr-hCD103.01A 및 ⁸⁹Zr-hCD103.05A에 대한 예시적인 PET 이미징 프로토콜을 도시한다. 수컷 누드 마우스(BALB/cOlaHsd-Foxn1nu, 엔비고, 네덜란드 소재)에 피하로(sc) CHO.K1 또는 CHO.CD103(300㎕의 1:1 PBS 및 높은 성장 인자 Matrigel(비디 사이언시스, 네덜란드 브레다 소재) 중 5×10⁶)을 접종하였다. 이종이식편을 적어도 200㎣까지 성장시켰다. mAb를 사용한 microPET 이미징을 위해, 이종이식편-보유 마우스(그룹당 n = 3)에 8.7±0.48㎍ ⁸⁹Zr-CD103.01A 또는 8.76±0.42㎍ ⁸⁹Zr-CD103.05A를 음경 정맥을 통해 정맥내로(iv) 주사하였다. 주사 후(post injection: pi) 제1일, 제3일 및 제6일에 Focus 220 PET 스캐너(씨티아이 시에멘스(CTI Siemens))를 사용하여 MicroPET 스캔을 수행한 후 최종 스캔 후 생체외 체내분포 분석을 수행하였다. Fab 단편을 사용한 체내분포 실험을 위해, 이종이식편-보유 마우스(그룹당 n = 2 또는 3)에 약 10㎍ ⁸⁹Zr-Fab.hCD103.01.C1 또는 ⁸⁹Zr-Fab.hCD103.05.C1을 음경 정맥을 통해 정맥내로(iv) 주사한 후 24시간 후에 생체외 체내분포 분석을 수행하였다.

스캔을 재구성하고, AMIDE(v1.0.4, 스탠포드 대학, 미국 캘리포니아주 스탠포드 소재)를 사용하여 생체내 정량화를 수행하였다. MicroPET 데이터는 평균 표준 흡수값(mean standardized uptake value: SUVmean)으로 나타내었다. 관심 영역(Region of interest: ROI)은 1 g/㎖ 조직 밀도를 가정하여 생체외 중량을 기준으로 종양에 대해 그렸다. 혈액 풀 측정을 위해, 심장의 중앙에 고정된 크기의 구를 그렸고, 간 및 비장의 경우 장기의 대표적인 부분에 고정된 크기의 타원체 ROI를 그렸다. 최종 스캔 후, 마우스를 희생시키고, 관심 장기를 체내분포 연구를 위해 수집하였다. 주입된 추적자의 장기 및 표준은 보정된 웰 유형 LKB-1282-Compu-gamma 시스템(LKB WALLAC)에서 계수 및 칭량하였다. 붕괴 보정 후, 생체외 조직 활성은 조직 그램당 주입된 용량의 백분율(ID/g %)로 나타내었다.

CHO.K1-hCD103/h베타7에서의 CD103 막 발현은 TIL에서의 CD103 발현과 유사하다(데이터 미제시). CHO.K1-hCD103/h베타7 종양 보유 마우스의 PET 스캔은 ⁸⁹Zr-hCD103.01A 및 ⁸⁹Zr-hCD103.05A의 종양 흡수가 시간 경과에 따라 증가하였으며(도 13b), 주사 후 제6일에 가장 높은 종양 및 최소 백그라운드 기관 흡수가 관찰되었음(중앙 평균 표준 흡수값(SUV_mean) 종양: 2.7, 중앙 SUV_mean 혈액: ⁸⁹Zr-hCD103.01A의 경우 0.9 및 중앙 SUV_mean 종양: 3.0, 중앙 SUV_mean 혈액: ⁸⁹Zr-hCD103.05A의 경우 0.9; 도 13c, 도 13d 및 도 13e)을 보여주었다. ⁸⁹Zr-hCD103.01A는 비특이적 대조군 그룹으로 사용된 CHO.K1 WT 이종이식편(SUVmean 종양: 1.5, SUVmean 혈액: 1.4)에서 축적을 나타내지 않았다. 유사하게는, 제6일에 생체외 체내분포 분석은 높은 CD103 특이적 ⁸⁹Zr-hCD103.01A 및 ⁸⁹Zr-hCD103.05A 종양 흡수(CHO.K1-hCD103/h베타7의 경우 각각 17.0 및 32.8 조직 그램당 주입된 용량의 백분율(ID/g %) 대 CHO.K1 WT의 경우 7.8 ID/g %) 및 주요 싱크 기관은 없음(도 14)을 보여주었다. Fab 단편의 경우, 주사 후 24시간 후 생체외 체내분포 분석은 CD103 특이적 ⁸⁹Zr-Fab.hCD103.01.C1 및 ⁸⁹Zr-Fab.hCD103.05.C1 종양 흡수(CHO.K1-hCD103/h베타7의 경우 각각 2.44 및 1.27 ID/g % 대 CHO.K1 WT의 경우 0.64 ID/g %)를 보여주었다(도 15).

실시예 13: 치료를 모니터링하기 위한 CD103 표적화 방사성 의약품의 사용

(면역)요법의 시작 전에, 'CD103 PET' 스캔을 단독으로 또는 저선량 CT 스캔과 조합하여 수행하였다. CD103 방사성 의약품의 흡수량을 정량화하였다. CD103 PET-CT 스캔은 (면역)요법 동안 간격을 두고 반복 및 정량화될 수 있다. 기준선 흡수, 치료 중 흡수 또는 기준선으로부터 치료로 인한 흡수의 변화를 임상의사 결정(clinical decision)을 가이드하는 데 사용하였다. 여기에는 요법의 지속, 요법의 중단 또는 용량-조정을 포함할 수 있지만 이들로 제한되지 않는다.

실시예 14: 서열

실시예 15: 참고문헌

본 명세서에 인용된 모든 참고문헌은 각각의 개별 간행물, 데이터베이스 항목(예를 들어, Genbank 서열 또는 GeneID 항목), 특허 출원 또는 특허가 참조에 의해 원용되는 것으로 구체적이고 개별적으로 표시되는 것과 동일한 정도로 참조에 의해 원용된다. 참조에 의한 이 원용 진술은 37 C.F.R.§1.57(b)(1)에 따라 각각의 모든 개별 간행물, 데이터베이스 항목(예를 들어, Genbank 서열 또는 GeneID 항목), 특허 출원 또는 특허와 관련되며, 이들 각각은 이러한 인용이 참조에 의한 원용에 대한 전용 진술에 바로 인접하지 않은 경우에도 37 C.F.R.§1.57(b)(2)를 준수하여 명확하게 확인되는 것으로 출원인에 의해 의도된 것이다. 만약 있는 경우, 명세서 내에 참조에 의한 원용에 대한 전용 진술을 포함하는 것은 참조에 의한 원용에 대한 이러한 일반적인 진술을 어떤 식으로든 약화시키지 않는다. 본 명세서에서 참고문헌의 인용은 참조가 적절한 선행 기술임을 인정하는 것이 아니며, 이러한 간행물 또는 문서의 내용 또는 날짜에 대한 어떠한 인정을 의미하는 것이 아니다. 참조가 본 명세서에 제공된 정의와 충돌하는 청구된 용어에 대한 정의를 제공하는 경우, 본 명세서에 제공된 정의는 청구된 발명을 해석하는 데 사용되어야 한다.

본 발명은 당업자가 그것을 만들고 사용할 수 있도록 충분히 상세하게 설명되고 예시되었지만, 본 발명의 정신 및 범주를 벗어나지 않고 다양한 대안, 수정 및 개선이 명백해야 한다. 본 명세서에 제공된 예는 바람직한 실시형태를 대표하고 예시적이며 본 발명의 범위를 제한하려는 의도가 아니다. 이의 수정 및 다른 용도는 당업자에 의해 이루어질 것이다. 이러한 수정은 본 발명의 정신에 포함되며 청구 범위에 의해 정의된다.

본 발명의 범위 및 정신을 벗어나지 않고 본 명세서에 개시된 발명에 다양한 대체 및 수정이 이루어질 수 있음이 당업자에게 명백할 것이다.

본 명세서에 언급된 모든 특허 출원, 특허, 간행물 및 기타 참고문헌은 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자의 수준을 나타내며 각각 참조에 의해 본 명세서에 원용된다. 본 명세서에 인용된 참고문헌은 청구된 발명에 대한 선행 기술로 인정되지 않는다.

달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 상충하는 경우 정의를 포함한 본 명세서가 우선한다.

명세서 및 청구범위 모두에서 단수형의 사용은 본 명세서에서 달리 나타내거나 또는 문맥에 의해 명백히 모순되지 않는 한 단수 및 복수 둘 다를 포함하는 것으로 해석되어야 한다. "화학식의 존재(being of a chemical formula)", "포함하는(including)" 및 "함유하는(containing)"의 경우와 같이 용어 "포함하는(comprising)", "갖는(having)", "존재(being of)"는 달리 명시되지 않는 한 개방 용어(즉, 의미 "포함하지만 이들로 제한되지 않는")으로 해석되어야 한다. 추가적으로, "포함하는" 또는 또 다른 개방형 용어가 실시형태에서 사용될 때마다, 동일한 실시형태는 중간 용어 "본질적으로 이루어지는(consisting essentially of)" 또는 폐쇄형 용어 "이루어지는(consisting of)"을 사용하여 보다 좁게 청구될 수 있음을 이해하여야 한다.

용어 "약", "대략" 또는 "대략적인"은, 숫자 값과 관련하여 사용될 때 값의 집합 또는 범위가 포함됨을 의미한다. 예를 들어, "약 X"는 X의 ±20%, ±10%, ±5%, ±2%, ±1%, ±0.5%, ±0.2% 또는 ±0.1%인 값의 범위를 포함하되, X는 숫자 값이다. 일 실시형태에서, 용어 "약"은 명시된 값보다 10% 더 많거나 또는 적은 값의 범위를 지칭한다. 또 다른 실시형태에서, 용어 "약"은 명시된 값보다 5% 더 많거나 또는 적은 값의 범위를 지칭한다. 또 다른 실시형태에서, 용어 "약"은 명시된 값보다 1% 더 많거나 또는 적은 값의 범위를 지칭한다.

값 범위의 인용은 본 명세서에서 달리 나타내지 않는 한 범위 내에 속하는 각각의 별개의 값을 개별적으로 언급하는 속기 방법으로서의 역할을 할 뿐이며, 각각의 별개의 값은 본 명세서에서 개별적으로 인용된 것처럼 명세서에 원용된다. 본 명세서에서 사용되는 범위는 달리 명시되지 않는 한 범위의 두 가지 한계를 포함한다. 예를 들어, 용어 "X와 Y 사이" 및 "X 내지 Y의 범위"는 X와 Y 및 그 사이의 정수를 포함한다. 한편, 본 개시내용에서 일련의 개별 값을 언급하는 경우, 본 개시내용에서는 두 개의 개별 값 중 임의의 값을 두 끝점으로 포함하는 임의의 범위도 또한 구상된다. 예를 들어, 표현 "약 100㎎, 200㎎ 또는 400㎎의 용량"은 또한 "100㎎ 내지 200㎎ 범위의 용량", "200㎎ 내지 400㎎ 범위의 용량" 또는 "100㎎ 내지 400㎎ 범위의 용량"을 의미할 수 있다.

본 명세서에 예시적으로 설명된 본 발명은 본 명세서에 구체적으로 개시되지 않은 임의의 요소 또는 요소들, 제한 또는 제한들 없이 실시될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 본 명세서의 각각의 경우에서 용어 "포함하는", "본질적으로 이루어지는" 및 "이루어지는"은 다른 두 용어 중 하나로 대체될 수 있다. 사용된 용어 및 표현은 제한이 아닌 설명의 용어로 사용되었으며, 이러한 용어 및 표현의 사용에서 표시 및 설명된 기능 또는 그 일부의 등가물을 배제하려는 의도는 없지만 청구된 발명의 범위 내에서 다양한 수정이 가능함을 인정한다. 따라서, 본 발명이 바람직한 실시형태 및 선택적인 특징에 의해 구체적으로 개시되었지만, 본 명세서에 개시된 개념의 수정 및 변형은 당업자에 의해 이루어질 수 있으며, 이러한 수정 및 변형은 첨부된 청구범위에 의해 정의된 바와 같이 본 발명의 범위 내에 있어야 한다.

SEQUENCE LISTING <110> SAIROPA B.V. RIJKSUNIVERSITEIT GRONINGEN ACADEMISCH ZIEKENHUIS GRONINGEN <120> ANTI-CD103 ANTIBODIES <130> WO 2021/219871 <140> PCT/EP2021/061450 <141> 2021-04-30 <150> US 62/704,258 <151> 2020-04-30 <160> 45 <170> BiSSAP 1.3.6 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: hCD103.01A heavy chain CDR1 (amino acid sequence) <400> 1 Gly Asp Ser Ile Thr Ser Gly Tyr 1 5 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: hCD103.01A heavy chain CDR2 (amino acid sequence) <400> 2 Ile Thr Tyr Ser Gly Ser Thr 1 5 <210> 3 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: hCD103.01A heavy chain CDR3 (amino acid sequence) <400> 3 Thr Arg His Tyr Tyr Gly Ser Asp Ala Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 4 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: hCD103.01A light chain CDR1 (amino acid sequence) <400> 4 Gln Asp Val Ser Ile Ala 1 5 <210> 5 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: hCD103.01A light chain 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310 315 320 Ser Asp Leu Leu Val Gly Ala Pro Met Gln Ser Thr Ile Arg Glu Glu 325 330 335 Gly Arg Val Phe Val Tyr Ile Asn Ser Gly Ser Gly Ala Val Met Asn 340 345 350 Ala Met Glu Thr Asn Leu Val Gly Ser Asp Lys Tyr Ala Ala Arg Phe 355 360 365 Gly Glu Ser Ile Val Asn Leu Gly Asp Ile Asp Asn Asp Gly Phe Glu 370 375 380 Asp Val Ala Ile Gly Ala Pro Gln Glu Asp Asp Leu Gln Gly Ala Ile 385 390 395 400 Tyr Ile Tyr Asn Gly Arg Ala Asp Gly Ile Ser Ser Thr Phe Ser Gln 405 410 415 Arg Ile Glu Gly Leu Gln Ile Ser Lys Ser Leu Ser Met Phe Gly Gln 420 425 430 Ser Ile Ser Gly Gln Ile Asp Ala Asp Asn Asn Gly Tyr Val Asp Val 435 440 445 Ala Val Gly Ala Phe Arg Ser Asp Ser Ala Val Leu Leu Arg Thr Arg 450 455 460 Pro Val Val Ile Val Asp Ala Ser Leu Ser His Pro Glu Ser Val Asn 465 470 475 480 Arg Thr Lys Phe Asp Cys Val Glu Asn Gly Trp Pro Ser Val Cys Ile 485 490 495 Asp Leu Thr Leu Cys Phe Ser Tyr Lys Gly Lys Glu Val Pro Gly Tyr 500 505 510 Ile Val Leu Phe Tyr Asn Met Ser Leu Asp Val Asn Arg Lys Ala Glu 515 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730 735 Arg Ala Glu Glu Asp Leu Ser Ile Thr Val His Ala Thr Cys Glu Asn 740 745 750 Glu Glu Glu Met Asp Asn Leu Lys His Ser Arg Val Thr Val Ala Ile 755 760 765 Pro Leu Lys Tyr Glu Val Lys Leu Thr Val His Gly Phe Val Asn Pro 770 775 780 Thr Ser Phe Val Tyr Gly Ser Asn Asp Glu Asn Glu Pro Glu Thr Cys 785 790 795 800 Met Val Glu Lys Met Asn Leu Thr Phe His Val Ile Asn Thr Gly Asn 805 810 815 Ser Met Ala Pro Asn Val Ser Val Glu Ile Met Val Pro Asn Ser Phe 820 825 830 Ser Pro Gln Thr Asp Lys Leu Phe Asn Ile Leu Asp Val Gln Thr Thr 835 840 845 Thr Gly Glu Cys His Phe Glu Asn Tyr Gln Arg Val Cys Ala Leu Glu 850 855 860 Gln Gln Lys Ser Ala Met Gln Thr Leu Lys Gly Ile Val Arg Phe Leu 865 870 875 880 Ser Lys Thr Asp Lys Arg Leu Leu Tyr Cys Ile Lys Ala Asp Pro His 885 890 895 Cys Leu Asn Phe Leu Cys Asn Phe Gly Lys Met Glu Ser Gly Lys Glu 900 905 910 Ala Ser Val His Ile Gln Leu Glu Gly Arg Pro Ser Ile Leu Glu Met 915 920 925 Asp Glu Thr Ser Ala Leu Lys Phe Glu Ile Arg Ala Thr Gly Phe Pro 930 935 940 Glu Pro Asn Pro Arg Val Ile Glu Leu Asn Lys Asp Glu Asn Val Ala 945 950 955 960 His Val Leu Leu Glu Gly Leu His His Gln Arg Pro Lys Arg Tyr Phe 965 970 975 Thr Ile Val Ile Ile Ser Ser Ser Leu Leu Leu Gly Leu Ile Val Leu 980 985 990 Leu Leu Ile Ser Tyr Val Met Trp Lys Ala Gly Phe Phe Lys Arg Gln 995 1000 1005 Tyr Lys Ser Ile Leu Gln Glu Glu Asn Arg Arg Asp Ser Trp Ser Tyr 1010 1015 1020 Ile Asn Ser Lys Ser Asn Asp Asp 1025 1030

Claims

인간 CD103에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 다음 중 하나 이상 및 선택적으로 각각을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편:
a. 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 서열번호 1과 1개, 2개 또는 3개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1,
b. 서열번호 2의 아미노산 서열 또는 서열번호 2와 1개, 2개 또는 3개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2,
c. 서열번호 3의 아미노산 서열 또는 서열번호 3과 1개, 2개 또는 3개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3,
d. 서열번호 4의 아미노산 서열 또는 서열번호 4와 1개, 2개 또는 3개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1,
e. 서열번호 5의 아미노산 서열 또는 서열번호 5와 1개, 2개 또는 3개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2, 및
f. 서열번호 6의 아미노산 서열 또는 서열번호 6과 1개, 2개 또는 3개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3.
인간 CD103에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 다음 중 하나 이상 및 선택적으로 각각을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편:
a. 서열번호 9의 아미노산 서열 또는 서열번호 9와 1개, 2개 또는 3개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1,
b. 서열번호 10의 아미노산 서열 또는 서열번호 10과 1개, 2개 또는 3개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2,
c. 서열번호 11의 아미노산 서열 또는 서열번호 11과 1개, 2개 또는 3개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3,
d. 서열번호 12의 아미노산 서열 또는 서열번호 12와 1개, 2개 또는 3개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1,
e. 서열번호 13의 아미노산 서열 또는 서열번호 13과 1개, 2개 또는 3개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2, 및
f. 서열번호 14의 아미노산 서열 또는 서열번호 14와 1개, 2개 또는 3개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3.
인간 CD103에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 다음 중 하나 이상 및 선택적으로 각각을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편:
a. 서열번호 17의 아미노산 서열 또는 서열번호 17과 1개, 2개 또는 3개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1,
b. 서열번호 18의 아미노산 서열 또는 서열번호 18과 1개, 2개 또는 3개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2,
c. 서열번호 19의 아미노산 서열 또는 서열번호 19와 1개, 2개 또는 3개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3,
d. 서열번호 20의 아미노산 서열 또는 서열번호 20과 1개, 2개 또는 3개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1,
e. 서열번호 21의 아미노산 서열 또는 서열번호 21과 1개, 2개 또는 3개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2, 및
f. 서열번호 22의 아미노산 서열 또는 서열번호 22와 1개, 2개 또는 3개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3.
인간 CD103에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 다음 중 하나 이상 및 선택적으로 각각을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편:
a. 서열번호 25의 아미노산 서열 또는 서열번호 25와 1개, 2개 또는 3개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1,
b. 서열번호 26의 아미노산 서열 또는 서열번호 26과 1개, 2개 또는 3개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2,
c. 서열번호 27의 아미노산 서열 또는 서열번호 27과 1개, 2개 또는 3개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3,
d. 서열번호 28의 아미노산 서열 또는 서열번호 28과 1개, 2개 또는 3개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1,
e. 서열번호 29의 아미노산 서열 또는 서열번호 29와 1개, 2개 또는 3개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2, 및
f. 서열번호 30의 아미노산 서열 또는 서열번호 30과 1개, 2개 또는 3개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3.
인간 CD103에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 다음 중 하나 이상 및 선택적으로 각각을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편:
a. 서열번호 33의 아미노산 서열 또는 서열번호 33과 1개, 2개 또는 3개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1,
b. 서열번호 34의 아미노산 서열 또는 서열번호 34와 1개, 2개 또는 3개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2,
c. 서열번호 35의 아미노산 서열 또는 서열번호 35와 1개, 2개 또는 3개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3,
d. 서열번호 36의 아미노산 서열 또는 서열번호 36과 1개, 2개 또는 3개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1,
e. 서열번호 37의 아미노산 서열 또는 서열번호 37과 1개, 2개 또는 3개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2, 및
f. 서열번호 38의 아미노산 서열 또는 서열번호 38과 1개, 2개 또는 3개의 보존적 치환이 다른 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3.
인간 CD103에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편의 중쇄는 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 항체 또는 항원 결합 단편의 경쇄는 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
인간 CD103에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편의 중쇄는 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 항체 또는 항원 결합 단편의 경쇄는 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
인간 CD103에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편의 중쇄는 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 항체 또는 항원 결합 단편의 경쇄는 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
인간 CD103에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편의 중쇄는 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 항체 또는 항원 결합 단편의 경쇄는 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
인간 CD103에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편의 중쇄는 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 항체 또는 항원 결합 단편의 경쇄는 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 온전한 IgG인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 scFv, Fab 또는 F(ab')₂인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 야생형 또는 돌연변이된 IgG2 Fc 영역을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 돌연변이된 IgG1 Fc 영역을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 돌연변이된 IgG4 Fc 영역을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서, 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 항체와 동일한 인간 CD103의 에피토프에 결합하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 인간화된, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
하나 이상의 핵산으로서, 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 항체를 암호화하는 하나 이상의 핵산.
발현 시스템으로서, 숙주 세포에서 항체를 발현하도록 구성된 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 항체를 암호화하는 하나 이상의 핵산 및 이에 작동 가능하게 연결된 조절 서열을 포함하는, 발현 시스템.
숙주 세포로서, 제19항의 발현 시스템을 포함하는, 숙주 세포.
제20항에 있어서, 세균 세포, 인간 세포, 포유동물 세포, 피키아 세포, 식물 세포, HEK293 세포 또는 차이니즈 햄스터 난소 세포인, 숙주 세포.
조성물로서, 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 항원 결합 단편 및 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제를 포함하는, 조성물.
항체 또는 항원 결합 단편을 생산하는 방법으로서,
폴리뉴클레오타이드의 발현에 유리한 조건하에서 제1항 내지 제17항의 항체 또는 항원 결합 단편 중 어느 하나의 중쇄를 및/또는 경쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계; 및 선택적으로 상기 숙주 세포 및/또는 배양 배지로부터 상기 항체 또는 항원 결합 단편을 회수하는 단계를 포함하는, 항체 또는 항원 결합 단편을 생산하는 방법.
생물학적 시료에서 CD103의 존재를 검출하는 방법으로서,
상기 시료를 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 항-CD103 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 접촉시키는 단계를 포함하는 단계; 및
상기 생물학적 시료에 존재하는 CD103과의 복합체에서 항체 또는 항원 결합 단편의 결합의 존재 또는 양을 검출하는 단계로서, 상기 복합체의 검출은 상기 생물학적 시료에 존재하는 CD103의 존재 또는 양을 나타내는, 상기 검출하는 단계
를 포함하는, 생물학적 시료에서 CD103의 존재를 검출하는 방법.
제24항에 있어서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 진단적 표지를 포함하는, 생물학적 시료에서 CD103의 존재를 검출하는 방법.
제25항에 있어서, 상기 검출 단계는 PET 이미징, 단일-광자 방출 컴퓨터 단층촬영(single-photon emission computed tomography: SPECT) 이미징, MRI, 광학 이미징 또는 (광)음향 이미징을 수행하는 단계를 포함하는, 생물학적 시료에서 CD103의 존재를 검출하는 방법.
제26항에 있어서, 상기 진단적 표지는 ¹¹C, ¹³N, ¹⁵O, ^99mTc, ⁶¹Cu, ⁶²Cu, ⁶⁴Cu, ⁶⁷Cu, ¹⁸F, ¹⁹F, ⁶⁶Ga, ⁶⁷Ga, ⁶⁸Ga, ⁷²Ga, ¹²³I, ¹²⁴I, ¹¹¹In, ¹⁷⁷Lu, ⁴⁴Sc, ⁴⁷Sc, ⁸⁶Y, ⁸⁸Y, ⁹⁰Y, ⁴⁵Ti, ⁸⁹Zr, 인도사이아닌 그린, IRDye 800CW, 플루오레세인(FITC) 및 자성(예를 들어, 산화철) 나노입자로 이루어진 군으로부터 선택되는, 생물학적 시료에서 CD103의 존재를 검출하는 방법.
제23항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 E-카드헤린에 대한 CD103 결합을 차단하지 않는, 생물학적 시료에서 CD103의 존재를 검출하는 방법.
제23항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편 적어도 부분적으로 E-카드헤린에 대한 CD103 결합을 차단하는, 생물학적 시료에서 CD103의 존재를 검출하는 방법.
제23항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 항원 결합 단편인, 생물학적 시료에서 CD103의 존재를 검출하는 방법.
제23항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 검출하는 단계는 상기 복합체를 검출하기 위한 생체내 이미징 방법을 포함하는, 생물학적 시료에서 CD103의 존재를 검출하는 방법.
제31항에 있어서, 상기 검출 단계는 종양에서 상기 복합체를 검출하기 위한 생체내 이미징 방법을 포함하는, 생물학적 시료에서 CD103의 존재를 검출하는 방법.
조영제로서,
검출 가능하게 표지된 항-CD103 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는, 조영제.
제33항에 있어서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 E-카드헤린에 대한 CD103 결합을 차단하지 않는, 조영제.
제33항에 있어서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 E-카드헤린에 대한 CD103 결합을 적어도 부분적으로 차단하는, 조영제.
제33항에 있어서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 항원 결합 단편인, 조영제.
제33항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 ¹¹C, ¹³N, ¹⁵O, ^99mTc, ⁶¹Cu, ⁶²Cu, ⁶⁴Cu, ⁶⁷Cu, ¹⁸F, ¹⁹F, ⁶⁶Ga, ⁶⁷Ga, ⁶⁸Ga, ⁷²Ga, ¹²³I, ¹²⁴I, ¹¹¹In, ¹⁷⁷Lu, ⁴⁴Sc, ⁴⁷Sc, ⁸⁶Y, ⁸⁸Y, ⁹⁰Y, ⁴⁵Ti, ⁸⁹Zr, 인도사이아닌 그린, IRDye 800CW, 플루오레세인(FITC) 및 자성(예를 들어, 산화철) 나노입자로 이루어진 군으로부터 선택되는 표지에 의해 검출 가능하게 표지되는, 조영제.
CD103 신호전달-매개성 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 개체에서 CD103 신호전달-매개성 병태를 치료 또는 예방하는 방법으로서,
유효량의 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 항-CD103 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 상기 개체에게 투여하는 단계를 포함하되, 상기 항-CD103 항체는 선택적으로 세포독성제에 커플링되는, CD103 신호전달-매개성 병태를 치료 또는 예방하는 방법.
세포에서 CD103 신호전달을 저해하는 방법으로서,
상기 세포를 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 항-CD103 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 접촉시키는 단계를 포함하는, 세포에서 CD103 신호전달을 저해하는 방법.
세포 상에 존재하는 E-카드헤린에 대한 CD103 결합을 저해하는 방법으로서,
상기 세포를 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 항-CD103 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 접촉시키는 단계를 포함하는, 세포 상에 존재하는 E-카드헤린에 대한 CD103 결합을 저해하는 방법.
개체에서 CD103-발현 세포를 고갈시키는 방법으로서,
유효량의 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 항-CD103 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 상기 개체에게 투여하는 단계를 포함하되, 상기 항-CD103 항체는 선택적으로 세포독성제에 커플링되는, 개체에서 CD103-발현 세포를 고갈시키는 방법.
털세포 백혈병, HCLv, 장 및 장외 림프종, 장질환-관련 T-세포 림프종(enteropathy-associated T-cell lymphoma: EATL), T-림프아구성 백혈병/림프종(T-lymphoblastic leukemia/lymphoma: T-ALL), T-세포 전림프구성 백혈병(T-cell prolymphocytic leukemia: T-PLL), 성인 T 세포 백혈병/림프종(adult T cell leukemia/lymphoma: ATLL), 균상 식육종(mycosis fungoides: MF), 역형성 대세포 림프종 ALCL, 피부 T-세포 림프종(cutaneous T-cell lymphoma: CTCL), 세자리 증후군(Sezary Syndrome: SS), 알츠하이머병, 파킨슨병, 다발성 경화증, IgM 다발성신경병증, 중증 근무력증, 아토피성 피부염, 알레르기, 천식, 전신 염증성 반응 증후군(systemic inflammatory response syndrome: SIRS), 패혈증, 패혈성 쇼크, 죽상동맥 경화증, 셀리악병, 피부근염, 경피증, 간질성 방광염, 이식 거부, 이식편-대-숙주병, 아이카디-구티에레스 증후군, 허친슨 길포드 조로증 증후군, 싱글톤-메르텐 증후군, 프로테오솜-관련 자가염증성 증후군, SAVI(STING- associated vasculopathy with onset in infancy: 유아기에 발병하는 STING-관련 혈관병증), CANDLE(Chronic Atypical Neutrophilic Dermatosis with Lipodystrophy and Elevated Temperature: 지방이영양증 및 온도 상승을 동반한 만성 비정형 호중구 피부병) 증후군, 동창 홍반성 루푸스, 전신 홍반성 루푸스, 류마티스성 관절염, 소아 류마티스성 관절염, 베게너병, 염증성 장 질환(예를 들어, 궤양성 대장염, 크론병), 특발성 혈소판 감소성 자반병, 혈전성 혈소판 감소성 자반병, 자가면역 혈소판감소증, 다발성 경화증, 건선, IgA 신장병증, IgM 다발성신경병증, 사구체신염, 자가면역 심근염, 중증 근무력증, 혈관염, 1형 당뇨병, 2형 당뇨병, 쇼그렌 증후군, X-연관 망상 색소이상증, 다발성 근염, 척추연골 이형성증 및 연령-관련 황반변성으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질환의 치료 또는 예방을 필요로 하는 개체에서 이들 질환을 치료 또는 예방하는 방법으로서,
유효량의 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 항-CD103 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 상기 개체에게 투여하는 단계를 포함하되, 상기 항-CD103 항체는 선택적으로 세포독성제에 커플링되는, 질환을 치료 또는 예방하는 방법.